JP2018513162A - 筋萎縮の治療に有用な誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】筋萎縮の治療に有用な誘導体の提供。
【解決手段】本発明は、哺乳類の筋萎縮の治療及び／又は予防のため、及び／又は、哺乳類の筋萎縮を抑制するため、及び／又は、加齢に伴うサルコペニア症状の発生の予防又は筋力低下後のリハビリテーションにおいて、筋肉の量及び質の増加を目的として運動を行う哺乳類の筋成長を促進するための医薬品として使用される下記一般式（Ｉ）で表される誘導体又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、水和物、溶媒和物、互変異性体、ラセミ混合物若しくは医薬的に許容される塩に関する。上記筋萎縮は加齢及び／又は薬物療法の影響及び／又は固定及び／又は悪液質に関連したものである。
［化１］

【選択図】なし

Description

本発明は筋萎縮の関連疾患の治療に有用な誘導体に関する。

加齢に関連した移動能力障害は広範囲に健康上の影響をもたらす重大な問題であるが、今日、サルコペニア等、筋力の低下を伴う加齢性疾患及び障害の発症及び進行を遅延させる新たな治療法が明らかに不足している。

ある種の代謝障害や代謝疾患を抱えた高齢者は、ほとんどの場合、筋タンパク質合成の低下（サルコペニア等）、栄養摂取量の減少又は炎症の発生が少なくとも原因の１つとなって除脂肪体重の減少に直面する。除脂肪体重の減少は、疲労、日常生活に必要なタスクを行う能力の低下、骨折リスクの増加、転倒及び入院の増加、代謝（耐糖能、インスリン感受性）及び認知能力の悪化、並びに、生活の質の低下と関連があることが知られている（非特許文献１〜３）。悪液質とは異なり、サルコペニアを患う患者では体重は安定し得るが、筋量の明らかな減少がみられ、一方で典型的には同時に脂肪量の増加が起こる。

多くの因子が筋量の減少に影響を及ぼす。基本的には、固定時にみられるようにタンパク質合成に対する骨格筋の同化抵抗性が確認されるが、これは抵抗運動や食事補給によって少なくとも部分的に改善することができる（非特許文献４）。神経支配の喪失及び酸化的損傷が重要な役割を果たし（非特許文献５及び６）、様々な細胞シグナル経路が関与する筋萎縮を引き起こす可能性があり、これによって、プログラム細胞死（アポトーシス）、タンパク質分解の増加、更には筋再生に関与する細胞の活性化の低下が引き起こされることも示されている。したがって、サルコペニアは、タンパク質の分解と合成とのバランスが崩れた結果であり、この際の上述した各因子の正確な寄与度は検討するモデル又はケースによって異なる。カルパインやカスパーゼ等のカルシウム活性化プロテアーゼのように筋破壊に関与するタンパク質分解系が開示されている（ユビキチン−プロテアソーム系（非特許文献７及び８））。サルコペニアの発症時に同定された各種標的のうち、アトロジン−１（ＭＡＦｂｘともいう）及びＭＵＲＦ−１が増加し、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋが減少することが確認された。

筋肉自体によりオートクリン産生されたミオスタチンは、タンパク質分解を促進し且つタンパク質合成を阻害するよう作用するため、特に重要な因子の１つである。加齢は著しいホルモンの変化を伴うが、ミオスタチンの分泌が増加し（非特許文献９）、その成熟筋肉での発現が萎縮度とともに増加する。増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）としても知られるミオスタチンは、ＴＧＦ−βファミリータンパク質に共通した以下の構造特徴を全て有する：分泌シグナルとして機能する疎水性アミノ末端基、９個の不変システイン残基及びフーリン型タンパク質分解処理部位「ＲＸＸＲ」。上記タンパク質がタンパク質分解により切断されると、Ｃ末端ドメインがミオスタチンの生物学的活性型であるホモ二量体を形成する（非特許文献１０）。複数種の脊椎動物由来のミオスタチンのアミノ酸配列アライメントから、上記タンパク質がヒト、類人猿、ウシ、イヌ、マウス、ラット、シチメンチョウ及びニワトリの間で高度に保存されている（同一性１００％）ことが分かる（非特許文献１１）。その発現は主に骨格筋及び脂肪組織に限られており、そこで骨格筋発達の負の調節因子の機能を示す（非特許文献１２）。

遺伝的にミオスタチンが欠損したマウス及びウシでは、骨格筋量の劇的な増加がみられることが分かっており、したがって、筋成長を抑制するミオスタチンの機能が裏付けられる（非特許文献１３）。いくつかのウシ品種では、筋肥大はウシミオスタチン遺伝子の第三エクソンのミスセンス変異が原因であり（非特許文献１４）、細胞数の増加又は肥厚成長と、細胞サイズの増大又は肥大成長とを伴うため、筋繊維が大きくなり且つ重くなる。

骨格筋の筋量及び筋力の増大は、身体組成、エネルギー消費、グルコース恒常性及びインスリン必要量に正の影響を与える代謝的適応とも関連する。薬理学的及び遺伝学的データから、ミオスタチンがエネルギー代謝を調節すること、及び、その阻害によって、肥満症や糖尿病等の代謝疾患の進行を著しく抑制できることが分かる。例えば、遺伝的にミオスタチンが欠損したマウスは、同齢の野生型マウスと比べて体脂肪蓄積が少なく（非特許文献１５）、脂肪細胞の数及びサイズが減少しているため、ミオスタチンが脂肪生成及び筋形成において重要な機能を有することが明らかである。

現在のサルコペニアの実験的治療法は栄養学的手法、運動、食欲増進剤又はテストステロン等の同化化合物の使用に依存しているが、これらの治療法の効果は満足できるものではなく（非特許文献１６）、副作用を生じる恐れもある。

Ｆｒｏｎｔｅｒａ ＷＲ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｌｌｏｙｄ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｆａｒｎｆｉｅｌｄ ＭＭ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃｈａｉ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＥＤ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｈａｓｓｅｌｇｒｅｎ ＰＯ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｐｕｒｉｎｔｒａｐｉｂａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｌｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｌｅｅ ＬＳ，２０１０，１０：１８３−１９４ Ｗｏｌｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７

本発明は、哺乳類の筋萎縮の治療及び／又は予防に使用される誘導体及びそれを含む医薬組成物に関する。

発明の詳細な説明
したがって、本発明は、哺乳類の筋萎縮の治療及び／又は予防のため、及び／又は、哺乳類の筋萎縮を抑制するため、及び／又は、加齢に伴うサルコペニア症状の発生の予防又は筋力低下後のリハビリテーションにおいて、筋肉の量及び質の増加を目的として運動を行う哺乳類の筋成長を促進するための医薬品として使用される下記一般式（Ｉ）で表される誘導体であって、上記筋萎縮は加齢及び／又は薬物療法の影響及び／又は固定及び／又は悪液質に関連したものである誘導体又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、水和物、溶媒和物、互変異性体、ラセミ混合物若しくは医薬的に許容される塩に関する。

（式中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチルであり、
ｎは１〜２の整数、好ましくは１であり、
Ｒ^３は、
−ＯＨ基、
−Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、好ましくは−ＯＥｔ又は−ＯｉＰｒ、
−Ｏ（Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキル）基、好ましくは−Ｏ−シクロペンチル、
−Ｏ（Ｃ_３−Ｃ_７複素環）基、好ましくは−Ｏ−テトラヒドロピラン−４−イル、
−Ｏ−ヘテロアリール基、好ましくは−Ｏ−ピリジル、
−Ｏ−アリール基、好ましくは−Ｏ−フェニル、
−Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）アリール基、好ましくは−Ｏ−ベンジル、
−ＮＲ^７Ｒ^８基（式中、Ｒ^７は水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、Ｒ^８は、
水素原子、
１以上の窒素原子を含むのが好ましいヘテロアリール基、特にピリダジニル又はピリジル、
−ＮＲ^９Ｒ^１０基（式中、Ｒ^９及びＲ^１０はそれぞれ独立して水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチル）で置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはエチル、
−ＯＲ^１１基（式中、Ｒ^１１は水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチル）で置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはエチルであるか、又は、
Ｒ^７及びＲ^８はそれらに結合した窒素原子とともに、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチルで置換されていてもよい複素環、特にピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン、特にメチルピペラジニルを形成している。）であり、
Ｒ^４は水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、特に−Ｍｅ又は−Ｅｔ、とりわけ−Ｅｔであり、
Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、好ましくはＣｌ又は以下から選択される基である：
−ＣＮ基、
−ＯＨ基、
アルキル基が１以上のハロゲン原子、好ましくはＦで置換されていてもよい−Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、好ましくは−ＯＭｅ、例えば−ＯＣＦ_３又は−ＯＣＨＦ_２、
１以上のハロゲン原子、好ましくはＦで置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチル、例えば−ＣＦ_３、
−Ｏ（Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキル）基、好ましくは−Ｏ−シクロプロピル。）

特に、上記筋萎縮は、プレサルコペニア、サルコペニア又は重症サルコペニア等、加齢に関連したものである。上記筋萎縮は、癌療法等の薬物療法の影響に関連したものであってもよい。上記筋萎縮は、加齢に伴う脱力、事故又は手術（例えば膝又は殿部のプロステーシスの設置）等の原因に特に関わらず、固定に関連したものであってもよい。また、上記筋萎縮は、神経性食欲不振症、癌、心不全、肝不全、腎機能不全、結核又はＡＩＤＳ等の原因に特に関わらず、悪液質に関連したものであってもよい。

具体的に、上記哺乳類は動物又はヒトであってもよく、ヒトであるのが好ましい。

したがって本発明によれば、式（Ｉ）の誘導体は、哺乳類の筋萎縮、特に、プレサルコペニア、サルコペニア又は重症サルコペニア等の加齢、及び／又は、癌療法等の薬物療法の影響、及び／又は、加齢に伴う脱力、事故又は手術（例えば膝又は殿部のプロステーシスの設置）等の原因に特に関わらず、固定、悪液質に関連した筋萎縮、一般的には筋萎縮に関連した病態を治療及び／又は予防する活性を有する。

式（Ｉ）の誘導体は、加齢に伴うサルコペニア症状の発生の予防等において筋肉の量及び質の増加を目的として運動を行う哺乳類、特にヒトの筋成長を促進するのにも有用である。

本発明者らは、本発明に係る誘導体によって、ミオスタチンの遺伝子発現を阻害して、筋細胞でのタンパク質合成を増加させる及び／又はＣ２Ｃ１２細胞の筋管の直径を増大させることができることを見出した。

本発明は更に、哺乳類の筋萎縮の治療及び／又は予防のため、及び／又は、哺乳類の筋萎縮を抑制するため、及び／又は、加齢に伴うサルコペニア症状の発生の予防又は筋力低下後のリハビリテーションにおいて、筋肉の量及び質の増加を目的として運動を行う哺乳類の筋成長を促進するための医薬品を製造するための上述した本発明に係る式（Ｉ）の誘導体の使用に関する。

また、哺乳類の筋萎縮の治療及び／又は予防及び／又は予防的治療及び／又はその発症の遅延のため、及び／又は、哺乳類の筋萎縮を抑制するため、及び／又は、加齢に伴うサルコペニア症状の発生の予防又は筋力低下後のリハビリテーションにおいて、筋肉の量及び質の増加を目的として運動を行う哺乳類の筋成長を促進するための方法であって、投与対象に本発明に係る式（Ｉ）の誘導体を有効量で投与することを含む方法に関する。

上記有効量は、治療する病態の性質及び重症度、投与経路並びに投与対象の体重及び年齢に応じて適合される。一般的には、投与単位は、投与対象がヒトである場合、単回又は複数回投与で１日当たり０．５ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇの範囲で変動する。

有利な実施形態において、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、Ｒ^４が−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくは−Ｅｔであるものである。

別の有利な実施形態において、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、ｎが１であるものである。

更に別の有利な実施形態において、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、Ｒ^５及び／又はＲ^６がハロゲン原子、好ましくは塩素原子であるものである。

更に別の有利な実施形態において、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、Ｒ^５及びＲ^６がそれぞれ独立してハロゲン原子、好ましくはＣｌ、特にいずれも塩素原子であり、Ｒ^４がＣ_１−Ｃ_６アルキル基、特にＥｔであるものである。

別の有利な実施形態において、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、Ｒ^１及びＲ^２がいずれも水素原子であるものである。

更に別の有利な実施形態において、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、Ｒ^３が−ＯＨ基又は−Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、好ましくは−ＯＥｔ又は−ＯｉＰｒであるものである。

特に、本発明において有用な式（Ｉ）の誘導体は、以下の化合物：
（１）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−ブタン酸；
（２）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−メトキシイミノ−ブタン酸；
（３）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−ブタン酸イソプロピル；
（４）５−（３，４−ジクロロフェニル）−５−エトキシイミノ−ペンタン酸；
（５）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−（２−ピリジル）ブタンアミド；
（６）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−（３−ピリジル）ブタンアミド；
（７）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−ピリダジン−３−イル−ブタンアミド；
（８）４−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）−４−エトキシイミノ−ブタンアミド；
（９）（４Ｅ）−４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）ブタンアミド；
（１０）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン−１−オン
から選択される。

特に、一般式（Ｉ）の範囲に含まれる下記化合物（１〜１０）は、先行技術の他の出願に開示されている。

実際、国際公開第２０１０／０１１３０２号には、一般式（Ｉ）の範囲に含まれる化合物１〜１０の合成及びそれらの神経変性疾患治療分野への適用例が開示されているが、筋萎縮に対する活性は開示されていない。したがって、本発明者らは、驚くべきことに、上記公知化合物が哺乳類の筋萎縮に関連した病態の治療及び／又は予防に活性を示すことを見出した。

本発明において、「アリール基」とは、炭素数５〜８の芳香環又は炭素数５〜１４の縮合芳香環を意味する。特に、上記アリール基は、単環式又は二環式基、好ましくはフェニル又はナフチルであってもよい。フェニル基（Ｐｈ）であるのが有利である。

本発明において、「ヘテロアリール基」とは、１以上のヘテロ原子、特に１又は２個の硫黄、窒素又は酸素原子等、特に１以上の窒素原子、を含む炭素数３〜９のあらゆる芳香族炭化水素を意味する。本発明におけるヘテロアリール基は、１以上の縮合環から構成されていてもよい。ヘテロアリール基としては、例えばフリル、イソオキサジル、ピリジル、チアゾリル、ピリミジル、ピリダジニル、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ピラゾールが挙げられる。上記ヘテロアリール基は、ピリダジニル、ピラゾール及びピリジルから選択されるのが有利である。

本発明において、「ハロゲン原子」とは、あらゆるハロゲン原子を意味し、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＦから、特にＦ、Ｃｌ又はＢｒ、特にＦ又はＣｌ、とりわけＣｌ、から選択されるのが好ましいと理解される。

本発明において、「Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基」とは、炭素数１〜６のあらゆる直鎖状又は分岐状アルキル基を意味し、特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられる。メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、イソプロピル（ｉＰｒ）又はｔ−ブチル（ｔＢｕ）、特にメチル、エチル又はイソプロピル、とりわけメチル又はエチルであるのが有利である。

本発明において、「Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキル基」とは、炭素数３〜６のあらゆる飽和炭化水素系環を意味し、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルが挙げられる。シクロペンチル又はシクロヘキシルであるのが有利である。

本発明において、「複素環基」とは、１以上のヘテロ原子（例えば硫黄、窒素又は酸素原子等、特に窒素及び酸素原子）、とりわけ１以上の窒素原子、を含む原子数３〜９のあらゆる飽和環状炭化水素基を意味する。本発明における上記複素環基は、１以上の縮合環から構成されていてもよい。複素環基としては、例えばテトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピロリジン、ピペラジン、ピペリジン、チオラン、オキシラン、オキサン、チアン、チアゾリジン、モルホリンが挙げられる。上記複素環基は、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン及びモルホリンから選択されるのが有利である。

本発明の範囲において、「医薬的に許容される」とは、生物学的にも他の面からも望ましくないものではなく、獣医学用途及びヒト用医薬品に許容される一般に安全で非毒性の医薬組成物の製造に有用であることを意味する。

本発明の範囲において、「化合物の医薬的に許容される塩」とは、本明細書で定義したように医薬的に許容される塩であって、親化合物の所望の薬理活性を有するものを意味する。そのような塩として以下のものが挙げられる。

（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸を用いて形成された酸付加塩；酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシナフトエ酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、２−ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、サリチル酸、コハク酸、ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリメチル酢酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸を用いて形成された酸付加塩；
（２）アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン又はアルミニウムイオン等の金属イオンによって親化合物中の酸性プロトンを置換して形成された塩；有機又は無機塩基に配位した塩。
許容される有機塩基としては、ジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエタノールアミン、トロメタミンが挙げられる。許容される無機塩基としては、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムが挙げられる。

本発明において、「化合物の溶媒和物」とは、本発明に係る化合物に不活性溶媒分子を付加して得られるあらゆる化合物を意味すると理解され、上記溶媒和物はそれら分子の相互引力により形成される。上記溶媒和物として、例えば化合物のアルコラートが挙げられる。水和物は、使用する不活性溶媒が水である場合の溶媒和物である。一、二又は三水和物であってもよい。

本発明において、「互変異性体」とは、互変異性化として知られる可逆化学反応によって相互変換できる本発明に係る化合物のあらゆる構成異性体を意味するものである。ほとんどの場合、上記反応は、二重結合の位置の変化を伴う水素原子の移動によって起こる。互変異性化可能な化合物の溶液中、両互変異性体間の平衡が生じる。その場合、各互変異性体の比は、溶媒、温度及びｐＨの関数である。したがって、互変異性は、ある官能基が別のものへ変換されることであり、ほとんどの場合、水素原子及びπ結合（二重又は三重結合）の同時置換によって起こる。一般的な互変異性体としては、例えばアルデヒド／ケトン−アルコール対、より具体的にはエノール対；アミド−イミド酸；ラクタム−ラクチム；イミン−エナミン；エナミン−エナミンが挙げられる。特に、開放構造の環への変換によってプロトンの移動が達成される際に起こる環鎖互変異性も含まれる。

本発明に係る誘導体は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として投与できる。

上記組成物は、ヒトを含む哺乳類に投与するために処方されてもよい。薬用量は、該当する治療及び状態に応じて変動する。上記医薬組成物は、経口（頬側及び舌下経路等）、直腸、経鼻、局所（経皮等）、腟内、眼内又は非経口（皮下、筋肉内又は静脈内等）等のあらゆる好適な経路で投与するのに好適である。上記医薬組成物は経口投与のために適合されるのが有利である。上記剤形は、当業者に公知の方法を用いて活性成分を適当な医薬的に許容される賦形剤と組み合わせることによって製造できる。

好適な経口投与の単位剤形としては、錠剤、カプセル、散剤、顆粒及び経口水性又は非水性溶液又は懸濁液、食用発泡体、油中水型又は水中油型乳液が挙げられる。固形組成物を錠剤として製造する場合、粉末であるのが好ましい主要活性成分を好適な医薬賦形剤（ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガム等）と混合する。錠剤は、ショ糖等の好適な材料でコーティングしてもよく、活性が延長又は遅延され、所定量の活性成分が連続的に放出されるように処理してもよい。

カプセル中の製剤は、粉末であるのが好ましい活性成分を希釈剤と混合し、得られた混合物をソフト又はハードカプセル（特にゼラチンカプセル）中に注入することにより得られる。カプセルに充填する前に上記組成物に固形の滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はポリエチレングリコール等）を添加できる。カプセル摂取後の薬剤の有効性を向上させるために崩壊剤又は可溶化剤（例えば炭酸カルシウム又は炭酸ナトリウム等）を添加することもできる。

また、必要に応じて、好適なバインダー、滑沢剤及び崩壊剤や着色剤を混合物に添加してもよい。好適なバインダーとしては、例えばデンプン、ゼラチン、天然糖（例えばグルコース又はβ−ラクトース等）、トウモロコシでできた甘味料、合成又は天然ゴム（アカシアガム又はアルギン酸ナトリウム等）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が挙げられる。上記投与剤形において有用な滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられる。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、混合物を顆粒化又は乾式プレスし、滑沢剤及び崩壊剤を添加し、得られた混合物をプレスして錠剤とすることによって処方される。粉末混合物は、適宜添加した活性成分を、希釈剤又は塩基と、場合によってはバインダー（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等）、溶解遅延剤（パラフィン等）、吸収促進剤（第四級塩等）及び／又は吸収剤（例えばベントナイト、カオリン又はリン酸二カルシウム等）と混合して得られる。粉末混合物は、バインダー（例えばシロップ、デンプンペースト、アラビアゴム漿又はセルロース若しくは高分子材料の溶液等）で湿潤化し、篩を通してプレスすることによって顆粒化できる。顆粒は、錠剤の製造に使用する金型にくっつかないようにステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク又は鉱油を添加して滑沢化してもよい。次に、滑沢化した混合物をプレスして錠剤を得る。場合によっては、セラック層、糖又は高分子材料層からなる半透明又は透明保護層が設けられてもよい。他の錠剤と区別できるように色素を上記コーティングに添加してもよい。

シロップ又はエリキシル製剤は、活性成分を甘味料、防腐剤や好適なフレーバー剤及び着色剤とともに含んでいてもよい。一般的には、シロップ製剤は、適当なフレーバー剤とともに水溶液に化合物を溶解して得られるが、エリキシル剤は非毒性アルコール媒体を用いて得られる。

水分散性散剤又は顆粒は、分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁化剤（例えばエトキシ化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビトールエーテル等）との混合物又は矯味剤若しくは甘味料との混合物として活性成分を含んでいてもよい。

直腸投与の場合、直腸温度で溶けるバインダー（カカオ脂又はポリエチレングリコール等）を用いて得られる坐剤を使用する。

非経口、鼻腔内又は眼内投与の場合、薬理学的に適合する分散剤及び／又は湿潤剤を含む水性懸濁液、等張生理食塩水又は滅菌注射溶液を使用する。

活性成分は、場合によっては１以上の添加剤とともに、マイクロカプセルとして処方することもできる。

局所投与に適合した医薬組成物は、クリーム、軟膏、懸濁物、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル又はオイルとして処方してもよい。

賦形剤が固形である経鼻投与に適合した医薬組成物は、粒径が２０〜５００ミクロンの範囲等の粉末を含むが、該粉末が入った容器を鼻の近くに置き、吸入することによって投与される。

膣内投与に適合した医薬組成物は、緩衝液、クリーム、ゲル、ペースト、ムース又はスプレーとして投与してもよい。

有利な実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、相補的又は相乗的効果を示すことが好ましい別の活性成分を更に含む。

この第二の活性成分は、本発明の式（Ｉ）の誘導体と同じ医薬組成物として投与できる。また、同時に又は経時的に別々に投与することもできる。

本発明に係る誘導体は当業者に周知の方法で製造されるが、特に化合物１〜１０を調製する方法は先行技術（国際公開第２０１０／０１１３０２号）に開示されている。

本発明は、非限定的記載として示した以下の図面及び実施例の記載を読めばより理解できるであろう。

濃度１０μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）及び濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１とともに、濃度１０μＭの化合物１についての媒体（コントロール：Ｃｔｒｌ）の存在下での筋繊維径（単位：μｍ）を視覚化したものを表す。

スクリーニングカスケード
スクリーニング試験の展開は、サルコペニアの病態の特徴に基づいて上記文献の検討から開始した。病態生理学的には、この疾患の特徴はタンパク質合成の低下及びタンパク質分解の増加である。したがって、ミオスタチンの遺伝子発現を阻害する化学分子の阻害能及び筋細胞でのタンパク質合成を増加させる化学分子の能力を評価できる試験によって上記各化合物の選別を行った。また、上述した物質のうちのいくつかがＣ２Ｃ１２細胞の筋管の直径を増大させることを示した。

プロトコル：
Ｃ２Ｃ１２細胞でのミオスタチン発現の測定
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７２）を２４ウェルプレートに１ウェル当たり３０，０００細胞の密度で播種し、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、且つ、ウシ胎仔血清（１０％）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養する。４８時間後、筋芽細胞を血清（１０％の代わりに２％）中で５日間部分的に欠乏させて分化誘導する。その後、試験分子又は参照物質（濃度１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１）の存在下、血清を含まないグルコース欠乏培地（１ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ）に細胞を６時間置く。実験終了時に、フェノール及びクロロホルムを用いる従来法でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出する。簡単に説明すると、強酸及びフェノールを含むトリゾール溶液（Ｔ９４２４、Ｓｉｇｍａ）中で細胞を溶解する。クロロホルムの添加後に遠心分離することによってタンパク質からｍＲＮＡを分離する。その後、イソプロパノール中で沈殿させてから、ＲＮＡ及びＤＮＡを含まない超純水に濃度が１μｇ／μＬとなるように懸濁させる。その後、供給メーカー（４３６８８１４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のプロトコルに従ってプライマー及びヌクレオチド混合物の存在下でＡＭＶ酵素を用いてレトロ転写によって１μｇのｍＲＮＡを相補的ＤＮＡへ変換する。酵素ポリメラーゼにより開始される連鎖反応（一般的にＰＣＲという）によって定量的条件下（故に正確な名称はｑＰＣＲ）で遺伝子発現を試験する。７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲを行う。プログラム条件は標準であり、９５℃で１５分を１サイクル行った後、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル行い、最後に６０℃及び９５℃での融解曲線工程を行う。分析サンプルはいずれも、１００ｎｇのｃＤＮＡ、上記酵素を含むｑＰＣＲ緩衝液、インターカレート剤（ＳＹＢＲグリーン）及びオリゴヌクレオチドの混合物、並びに、２個のエクソン配列から戦略的に選択された試験遺伝子の特異的プライマー対（最終濃度２００ｎＭ）を含む。蛍光プローブは二重鎖ＤＮＡに結合し、ＤＮＡに結合した状態で蛍光を一度しか発しない。蛍光閾値は装置のプログラムにより取得できる。ＤＮＡ量によって蛍光プローブが上記閾値を超える場合、「Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（サイクル閾値）」を表す「Ｃｔ」と呼ばれるＰＣＲサイクル番号が得られる。この値が、相対的にＤＮＡを定量する計算の基となる。試料中の初期ＤＮＡ量と未処理コントロールとの比Ｒ（即ちＲ＝２^{−（試料Ｃｔ−コントロールＣｔ）}）を取得し、この測定値を、処理により変調されていないことが分かっているハウスキーピング遺伝子のもの

と比較する。

使用したプライマーを以下の表に記録する。

タンパク質合成
細胞をカウントし、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、且つ、ウシ胎仔血清（１０％）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭ培地を用いて２４ウェルプレートに１ウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種する。４８時間後、筋芽細胞を血清（１０％の代わりに２％）中で５日間部分的に欠乏させて分化誘導する。その後、グルコース又はロイシンを含まない培地（Ｋｒｅｂｓ培地）に細胞を３７℃で１時間置いた後、試験物質又は参照物質（ＩＧＦ−１、１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、２．５μＣｉ／ｍＬの放射性標識ロイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２時間３０分インキュベートする。インキュベート終了時に、上清を取り除き、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で細胞を３０分間溶解する。細胞分画の放射性を測定し、ローリー法で総タンパク質量を測定する。各条件は少なくともｎ＝６で評価し、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）をタンパク質合成促進におけるコントロールとする。結果は、２．５時間インキュベート後のタンパク質１μｇ当たりのｃｐｍ又はコントロール条件に対するパーセンテージで表す。

筋繊維径の評価
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７２）をグリセリン処理した８ウェルプレートに１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で播種し、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、且つ、ウシ胎仔血清（１０％）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭ培地で培養する。

４８時間後、筋芽細胞を血清（１０％の代わりに２％）中で３日間部分的に欠乏させて分化誘導する。その後、試験分子又は参照物質（濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１又は１０μＭのデキサメタゾン）の存在下、血清を含まないグルコース欠乏培地（１ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ）に細胞を３日間置く。培養終了時に、細胞を洗滌し、２．５％グルタルアルデヒド／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ溶液を用いて室温で１時間固定する。細胞層をＤＡＰＩ（細胞核の蛍光標識）で覆う。冷暗所で１６時間貯蔵した後、蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＶｅｒｔ２００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）下でスライドを観察し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ４．１ソフトを用いて画像を解析して繊維径を測定する。

結果：
・ミオスタチン発現への効果（表１）
ミオスタチン発現への効果について、結果は、コントロール細胞での発現と比較した、分子と接触した細胞でのミオスタチン遺伝子発現のパーセンテージとして表す。この比が、参照物質とした濃度１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１について本試験で確認された平均値である７０％よりも小さい又はその付近であれば、物質は活性であると考えられる。

化合物１及び３はミオスタチン発現を著しく阻害する。

・Ｓ６Ｋ１のリン酸化によるタンパク質合成への効果（表２）
タンパク質合成への効果について、結果は、筋細胞でのＳ６Ｋのリン酸化の増加率（パーセンテージ）として表す。このパーセンテージは、参照物質とした濃度１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１について本試験で確認された平均値１２０％より大きければ著しいと考えられる。

化合物１は、濃度０．５μＭで筋細胞でのタンパク質合成を著しく増大させる。

・筋繊維径への化合物１の効果（図１）
Ｃ２Ｃ１２細胞を分化し、分化期間の最後の３日間化合物１で処理する。結果を図１に示す。

予想通り、ＩＧＦ−１での処理によって筋管の直径は著しく増大するが、それに対してデキサメタゾンではこのパラメータが著しく減少する。筋管の直径は、化合物１での処理後に著しく増大する（図１）。

参考文献
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ＷＯ２０１００１１３０２

Claims (9)

1. 哺乳類の筋萎縮の治療及び／又は予防のため、及び／又は、哺乳類の筋萎縮を抑制するため、及び／又は、加齢に伴うサルコペニア症状の発生の予防又は筋力低下後のリハビリテーションにおいて、筋肉の量及び質の増加を目的として運動を行う哺乳類の筋成長を促進するための医薬品として使用される下記一般式（Ｉ）で表される誘導体であって、上記筋萎縮は加齢及び／又は薬物療法の影響及び／又は固定及び／又は悪液質に関連したものである誘導体又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、水和物、溶媒和物、互変異性体、ラセミ混合物若しくは医薬的に許容される塩。
   

   

   （式中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチルであり、
   ｎは１〜２の整数、好ましくは１であり、
   Ｒ^３は、
   −ＯＨ基、
   −Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、好ましくは−ＯＥｔ又は−ＯｉＰｒ、
   −Ｏ（Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキル）基、好ましくは−Ｏ−シクロペンチル、
   −Ｏ（Ｃ_３−Ｃ_７複素環）基、好ましくは−Ｏ−テトラヒドロピラン−４−イル、
   −Ｏ−ヘテロアリール基、好ましくは−Ｏ−ピリジル、
   −Ｏ−アリール基、好ましくは−Ｏ−フェニル、
   −Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）アリール基、好ましくは−Ｏ−ベンジル、
   −ＮＲ^７Ｒ^８基（式中、Ｒ^７は水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、Ｒ^８は、
   水素原子、
   １以上の窒素原子を含むのが好ましいヘテロアリール基、
   −ＮＲ^９Ｒ^１０基（式中、Ｒ^９及びＲ^１０はそれぞれ独立して水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチル）で置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはエチル、
   −ＯＲ^１１基（式中、Ｒ^１１は水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチル）で置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはエチルであるか、又は、
   Ｒ^７及びＲ^８はそれらに結合した窒素原子とともに、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチルで置換されていてもよい複素環、特にピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジンを形成している。）であり、
   Ｒ^４は水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、特に−Ｍｅ又は−Ｅｔであり、
   Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、好ましくはＣｌ又は以下から選択される基である：
   −ＣＮ基、
   −ＯＨ基、
   アルキル基が１以上のハロゲン原子、好ましくはＦで置換されていてもよい−Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、好ましくは−ＯＭｅ、
   １以上のハロゲン原子、好ましくはＦで置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくはメチル、
   −Ｏ（Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキル）基、好ましくは−Ｏ−シクロプロピル。）
2. Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立してハロゲン原子、好ましくはいずれも塩素原子であることを特徴とする請求項１に記載の誘導体。
3. Ｒ^４はＣ_１−Ｃ_６アルキル基、好ましくは−エチルであることを特徴とする請求項１又は２に記載の誘導体。
4. ｎは１であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導体。
5. Ｒ^３は−ＯＨ基又は−Ｏ（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、好ましくは−ＯＥｔ又は−ＯｉＰｒであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の誘導体。
6. Ｒ^１及びＲ^２はいずれも水素原子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の誘導体。
7. 以下の化合物：
   （１）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−ブタン酸；
   （２）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−メトキシイミノ−ブタン酸；
   （３）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−ブタン酸イソプロピル；
   （４）５−（３，４−ジクロロフェニル）−５−エトキシイミノ−ペンタン酸；
   （５）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−（２−ピリジル）ブタンアミド；
   （６）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−（３−ピリジル）ブタンアミド；
   （７）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−ピリダジン−３−イル−ブタンアミド；
   （８）４−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）−４−エトキシイミノ−ブタンアミド；
   （９）（４Ｅ）−４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）ブタンアミド；
   （１０）４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−エトキシイミノ−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン−１−オン
   から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の誘導体。
8. 上記加齢に関連した筋萎縮はプレサルコペニア、サルコペニア又は重症サルコペニアであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導体。
9. 上記哺乳類はヒトであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の誘導体。

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