CN114341103B - 作为可用来治疗神经疾病的逆运体稳定剂的氨基胍腙 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的氨基胍腙衍生物，其可有效作为逆运体稳定剂并用作神经保护药物。本发明还涉及包含其的药物组合物以及其在治疗和诊断中的应用。

Description

作为可用来治疗神经疾病的逆运体稳定剂的氨基胍腙
发明概述
本发明涉及新的氨基胍腙衍生物，其可有效作为逆运体(retromer)稳定剂并用作神经保护药物。本发明还涉及包含其的药物组合物以及其在治疗和诊断中的应用。
技术背景
内吞途径(Huotari和Helenius，2011)包括质膜受体和配体的主要回收回路、用于消化(大)分子和外源性大颗粒的降解系统、以及用于从前者到后者回路运输未分选的流体和膜组件的晚期内体(LE)介导的饲养途径(feeder pathway)。神经元中功能失调的内吞膜运输常见于神经退行性疾病(NDD)中，导致功能失调的蛋白质和细胞器的积累、神经元易损性和细胞死亡(Schreij、Fon等人，2016)。
逆运体复合物(retromer complex)(Seaman，2005)是一种多模块蛋白质组装，参与从内体中提取货物并将其输送到反式高尔基网络(TGN)(Seaman，2004)；并且参与货物从内体到细胞表面的回收(Temkin、Lauffer等人，2011)。其三聚体货物识别核心(CRC)(Hierro、Rojas等人，2007)与待运输的跨膜蛋白结合。CRC由液泡蛋白分选相关蛋白26(VPS26)和VPS29组成，它们组装到VPS35骨架上。
NDD中的逆运体功能失调可能导致货物异常加工成神经毒性片段(Bhalla、Vetanovetz等人，2012)，内体-溶酶体系统中蛋白酶驱动的蛋白质寡聚体和聚集体的降解减少(Futerman和van Meer，2004)，自噬体形成及功能性受损(Zavodszky、Seaman等人，2014)，细胞内神经毒性聚集体的播种和细胞间传播增加(Walker、Diamond等人，2013)以及小胶质细胞吞噬受体减少(Lucin、O'Brien等人，2013)。
增加的逆运体水平增强了细胞中的货物运输和转运(Small、Kent等人，2005)。CRC蛋白之间更强的相互作用可以稳定逆运体(Norwood、Shaw等人，2011)并且应该提高其功能性。最近的一个计算机模拟筛选针对结合于VPS35和VPS29之间的界面处的逆运体稳定剂(Mecozzi、Berman等人，2014)。噻吩连接的双异硫脲R55(1)被鉴别为能够结合于VPS35-VPS29界面处的药理学伴侣(Convertino、Das等人，2016)。R55在体外稳定CMC(CMC的变性温度增加≈10℃)，提高神经元培养物中的VPS35(≈180％)和VPS26水平(≈150％)，并且在高达50μM时无毒性(Mecozzi、Berman等人，2014)。R55降低野生型和APP突变的海马神经元中Aβ40(高达44％)和Aβ42(高达39％)的水平(Mecozzi、Berman等人，2014)。
存在对新型逆运体稳定剂的需求，该逆运体稳定剂是有效的并且可有价值地用于治疗和预防多种神经疾病，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等。
发明内容
本发明的一个目的是提供有效作为逆运体稳定剂的新化合物。
本发明的又一个目的是提供本发明的新化合物在诊断和治疗中的应用，特别是在诸如肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等的神经疾病的治疗中的应用。
本发明的再一个目的是提供包含本发明的新化合物的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的新化合物的方法。
附图说明
图1示出Neuro2a细胞中R55对VPS35的生化作用。直方图显示平均(±s.d.)值(每组n＝3)。**P<0.01，使用学生t检验确定。
图2示出G93A小鼠中的VPS35、VPS29和VPS26水平。A，来自WT和G93A小鼠的腰部SC的腹角中VPS35+NeuN+推定运动神经元(MN)的共聚焦堆叠的最大投影(30、60和90天，n＝4/时间点)。标记了VPS26和NeuN的相邻切片在B中示出(30、60和90天，n＝4/时间点)。面板C示出在20、60和100天(n＝4/时间点)的来自WT和G93A小鼠的腰部SC提取物中VPS35和β-肌动蛋白的WB。归一化VPS35水平(对比WT的比率)的定量(平均值±s.d.)在面板C的直方图中示出。D示出第100天的来自WT和G93A小鼠的SC中VPS26b和β-微管蛋白的代表性WB。归一化VPS26b水平(对比WT的比率)的定量(平均值±s.d.)在面板的直方图中示出(n＝5WT，n＝6G93A)。E，在100天的来自WT和G93A小鼠的SC中VPS29水平的WB。归一化VPS29水平(对比WT的比率)的定量(平均值±s.d.)在面板的直方图中示出(每组n＝6)。面板F示出来自WT(在第60天取样，n＝4)和G93A小鼠(30、60和90天，n＝3/时间点)的腰部SC的Vps35、Vps26和Vps29mRNA通过实时PCR的定量(对比WT的比率)。使用双向方差分析和Bonferroni多重比较检验来分析面板C的数据。使用双尾学生检验来确定面板D和E中的统计显著性。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板F的数据。**p<0.01；***p<0.001。面板B中的比例尺，80μm。
图3示出未转染的、pcDNA3.1(+)SOD1G93A(1μg/孔)-pCAAG-GFP(0.2μg/孔)转染的、pcDNA3.1(+)SOD1G93A(1μg/孔)-pCAAG-GFP(0.2μg/孔)+2a(10μM)转染的和pCAAG-GFP(1.2μg/孔)转染的Neuro2a(4x104细胞/孔)中GFP和Golgin97的合并的共聚焦堆叠。在未转染的细胞(n＝83)、G93A-GFP(n＝88)、G93A-GFP+2a(n＝84)和GFP(n＝109)中按照正常、中等或碎片化对高尔基体进行形态学分析。面板A的直方图显示每个条件来自4个独立实验的高尔基体亚类表示为高尔基体构建体总数的百分比(平均值±s.d.)。对来自未处理的Neuro2a细胞(3x105细胞/孔)和用pcDNA3.1(+)SOD1G93A(2μg/孔)-pCAAG-GFP(0.5μg/孔)或用pCAAG-GFP(2μg/孔)转染的细胞的等量细胞裂解物进行SDS-PAGE并用针对Golgin97和β-肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。定量(对比未处理的细胞的平均倍数变化±s.d.)在左侧面板中示出(n＝3/组)。B示出细胞活力，表示为如下处理的细胞与未转染的Neuro2a细胞(n＝19孔)相比的平均比率：pCMV-LacZ(1.25μg/孔，n＝19孔)、pcDNA3.1(+)SOD1G93A(1.25μg/孔，n＝19孔)、pcDNA3.1(+)SOD1G93A(1.25μg/孔)+2a(10μM，n＝24孔)和化合物2a(10μM，n＝17)，(4x104细胞/孔)。用H2O2(200μM，16孔，4x104细胞/孔)处理Neuro2a细胞获得阳性对照。数据(平均值±s.d.)源自3个独立实验。面板C示出如下转染的细胞的细胞活力(对比未处理的Neuro2a的比率)：pCMV-LacZ+pcCDNA3.1-VPS35(1μg/孔+0.25μg/孔)、pcDNA3.1(+)SOD1G93A+pCMV-LacZ(1μg/孔+0.25μg/孔)和pcDNA3.1(+)SOD1G93A+pcCDNA3.1(+)VPS35(1μg/孔+0.25μg/孔)，(4x104细胞/孔)。直方图示出源自3个独立实验(n＝17/组)的平均值(±s.d.)。面板D示出接受以下条件的细胞的细胞活力(对比未处理的Neuro2a的比率)：pCMV-LacZ(1μg/孔)与乱序或Sh56质粒(每孔0.25μg)一起、pcDNA3.1(+)SOD1G93A(1μg/孔)与乱序或Sh56质粒(0.25μg/孔)一起并且与或不与先导物2a(10μM)一起，(n＝20/组，来自3个独立实验，4x104细胞/孔)。面板E示出接受如面板D所绘制的实验的处理和条件的Neuro2a(4x104细胞/孔)中的LDH测定。通过测量上清液中释放的LDH的量来计算细胞毒性(平均％±s.d.)(n≥9孔/组，来自3个独立实验)。使用双向方差分析和Bonferroni多重比较检验来分析面板A的数据。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板B-E的数据。*p<0.05，***p<0.001，n.s.不显著。A中的比例尺，10μm。
图4示出用VPS35的短干扰质粒转染的细胞中的VPS35水平。Neuro2a细胞(3x105细胞/孔)用乱序或用商业VPS35RNAi质粒(Sh56、Sh58和Sh59，2μg/孔)转染。通过对转染后48小时采样的RNA进行实时PCR分析来评估敲低。A中的直方图示出归一化的Vps35mRNA水平(平均值±s.d.)，报告为对比未处理的细胞的比率(n＝3/组)。进行WB以验证在接受乱序或VPS35RNAi质粒的细胞中VPS35的敲低。面板B中的黑色分隔线表示来自同一滤膜(filter)的裁剪的泳道。归一化的VPS35蛋白质水平的定量(平均值±s.d.)报告为与未处理细胞的比率，在C中示出(n＝3/组)。平行培养物(3x105细胞/孔)用pCAAG-GFP质粒与乱序(D)或Sh56(E)质粒一起转染，并对GFP和VPS35进行标记。E中的箭头表示接受Sh56质粒的GFP+细胞中的VPS35免疫反应性。E中的箭头表示来自同一图场的GFP-，其以正常水平表达VPS35(n＝3/组)。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析数据。*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001。
图5.化合物2a在Neuro2a细胞中稳定VPS35水平。面板A示出放线菌酮(CHX)追踪测定，用于确定Neuro2a细胞中VPS35的降解率(3x105细胞/孔)。细胞用溶媒或2a(10μM)处理24小时，然后用CHX(10μg/mL)追踪2、4和8小时。A示出溶媒和化合物2a处理的Neuro2a细胞中VPS35和β-肌动蛋白水平的代表性WB。归一化的VPS35水平的定量(平均归一化比率±s.e.m.，在0时间建立)在面板B中示出(每组n＝8)。C，接受化合物2a的Neuro2a细胞中Vps35、Vps26和Vps29mRNA的定量实时PCR(每组n＝8，来自3个独立实验，10μM持续48小时，3x105细胞/孔)，直方图报告了对比溶媒处理的细胞的比率。使用双向方差分析和Bonferroni多重比较检验来分析面板B中绘制的数据。使用双尾学生检验来确定C中的统计显著性。**p<0.01。
图6示出2a在中枢神经系统中的穿透性。面板A示出每天注射10mg/kg的2a并在1、7、15和30天采样的C57BL/6J小鼠的大脑摄取的时间进程(每个时间点n＝4)。数据表示为平均值(±s.d.)。B示出来自每天注射：溶媒、R55/1和2a(10mg/kg，持续7天)的C57BL/6J小鼠SC提取物中的VPS35和β-肌动蛋白的代表性WB。黑色分隔线标记从平行滤膜裁剪的泳道。归一化VPS35水平的定量(对比溶媒处理的小鼠的比率)在面板直方图中示出(每个点代表单个小鼠)。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析数据。
图7A示出2a在Neuro2a细胞和原代神经元培养物中的毒性。细胞存活的非线性拟合分析表明化合物2a的LD50为257.9μM。数据(平均值±s.d.)从来自3个独立实验的n＝24孔/组得出，其中Neuro2a细胞接受递增量的2a持续48小时。用H2O2处理Neuro2a细胞(200μM持续48小时，4x104细胞/孔，n＝24孔，来自3个独立实验)而建立的阳性对照在面板的直方图中示出。面板B和C示出来自代表性微电极阵列生物芯片的同一电极的神经元活动记录，该生物芯片铺有用浓度为1μM(B)和100μM(C)的2a处理的原代皮层神经元(3x105皮层神经元/芯片，n＝4芯片)。神经元接受递增的量的2a(1、3、10、30和100μM)，每5分钟记录一次。D，放电活动的定量报告为在暴露于低浓度的2a(1μM)的神经元中测量的尖峰数的倍数变化(平均值±s.e.m.)。面板E显示先导化合物不会逆转H2O2诱导的细胞死亡。面板中的直方图示出在接受H2O2与或不与以下化合物：2a、2c、2d和2g(10μM)一起的Neuro2a中建立的细胞存活的定量(相比未处理的倍数变化，平均值±s.d.)。48小时后收获细胞并建立细胞存活率(n＝3个独立实验，每个实验由6个重复组成)。接受H2O2的细胞和接受H2O2+先导物的细胞之间的差异不显著。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析数据。
图8示出2a在G93A小鼠中抵消运动神经元变性的能力。面板A示出在溶媒处理的WT小鼠(n＝10)、溶媒处理的G93A小鼠(n＝15)、2a处理的WT小鼠(n＝10)和2a处理的G93A小鼠(n＝16)(10mg/kg，每天)中每3天测量的体重曲线。数据显示为平均值±s.e.m.。B，在溶媒和先导物2a处理的WT小鼠(每组n＝10)中在转棒装置的旋转杆上的掉落潜伏期。C，在溶媒和先导物2a处理的G93A小鼠(每组n＝15)中的掉落潜伏期。数据报告为平均值±s.e.m.。D，来自溶媒处理的WT小鼠、溶媒处理的G93A小鼠和先导物2a处理的G93A小鼠(10mg/kg，在第100天取样)的腰椎SC切片，对NeuN进行标记。在SC的腹角中进行定量，对推定运动神经元进行评分(点代表单个动物；线示出平均值和s.e.m.)。E，腰部SC切片上对ChAT的IHC。SC的腹角中的ChAT+/切片的定量在面板E的直方图中示出(每个点代表单个动物；线显示平均值和s.e.m.)。使用双尾学生检验来确定面板C中绘制的数据的统计显著性。使用双向方差分析和Bonferroni多重比较检验来分析面板B和C的数据。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板D和E的数据。*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001，n.s.不显著。比例尺50μm。
图9显示2a保护G93A小鼠免于神经变性。面板A示出代表性的横向半薄坐骨切片，显示了接受溶媒的WT小鼠的正常纤维(低放大倍数在左侧示出，高放大倍数在右侧示出)。面板B示出来自接受溶媒的代表性G93A小鼠的图像(高放大倍数图像中的箭头显示变性纤维)。面板C示出接受化合物2a(10mg/kg)的G93a小鼠的代表性图像，展示了纤维变性显著减少。变性纤维的定量绘制在面板D的直方图中。每个符号代表单个动物，而直方图示出平均值±s.d.。(*P<0.05，使用单向方差分析和Tukey多重比较确定)。
图10显示了源自2a处理的G93A小鼠的神经中髓鞘脱失的减少。面板A-C示出在第100天取样的来自溶媒处理的WT(A)、溶媒处理的G93A小鼠(B)和2a处理的G93A小鼠(C)的坐骨神经矢状切面上的Luxol Fast Blue(LFB)染色(治疗方案：10mg/kg每天)。LFB覆盖区域的定量(平均值±s.d.)报告为溶媒处理的WT小鼠的比率，并在面板D中示出(每个点代表单个动物)。对NF-M和MBP进行标记的平行切片分在面板E中示出(每组≥5)。溶媒处理的G93A小鼠中的箭头示出溶媒处理的G93A小鼠的纤维中受损的髓鞘。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板D的数据。*p<0.05，***p<0.001。比例尺50μm。
图11.面板A、B、C、D和F示出来自溶媒处理的WT、溶媒处理的G93A和2a(10mg/kg，第100天)处理的G93A小鼠的腰部SC(腹角)的共聚焦堆叠的最大投影(n＝3/组)，对VPS35/NeuN(A)、VPS26/NeuN(B)、CI-MPR/NeuN(C)、分拣蛋白/NeuN(D)和CTSD/NeuN(F)进行了标记。在A中，在选通的NeuN+MN(虚线表示代表性细胞，n≥38/组)中VPS35(Alexafluor 488)的平均荧光强度(MFI)报告为平均任意单位(a.u.±s.e.m.)。落射荧光标度在面板中示出。在选通的NeuN+MN(虚线表示代表性细胞，n≥40/组)中定量的VPS26(Alexafluor488)的平均MFI(a.u.±s.e.m.)在B中示出。落射荧光标度在面板中示出。NeuN+MN(n≥35细胞/组)中CI-MPR MFI的平均MFI(Alexafluor 488，a.u.±s.e.m.)在C中示出。落射荧光标度在面板中示出。在选通的NeuN+MN(虚线表示代表性细胞，n≥32细胞/组)中定量的平均分拣蛋白MFI水平(Alexafluor 488，a.u.±s.e.m.)在D中示出。落射荧光标度在面板中示出。E示出CTSD(重(46-50KDa)和轻(28-30KDa)链)的代表性WB。蛋白质负载的归一化是通过β-肌动蛋白完成的。E中的直方图显示定量，点表示单个小鼠(线显示平均值+s.e.m.)。在选通的NeuN+MN(虚线表示代表性细胞)中的平均CTSD MFI水平(Alexafluor 488，a.u.±s.e.m.)在F中示出。落射荧光标度在面板中示出。对于NeuN+MN的面积归一化的CTSD斑点的数量在F的直方图中示出(点表示单个动物，n≥16细胞/组)。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板A、B、C、D、E和F的数据。*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001。A、B、D和F的比例尺为30μm；C为25μm。
图12 A示出来自溶媒处理的WT小鼠、溶媒处理的G93A小鼠和2a(10mg/kg，在第100天采样)处理的G93A小鼠(n＝6/组)的SC中VPS35和β-肌动蛋白的代表性WB。报告为相比溶媒处理的WT的比率(平均值±s.d.)的归一化VPS35水平的定量在面板B中示出。C示出从溶媒处理的WT小鼠、溶媒处理的G93A小鼠和2a(10mg/kg，在第100天采样)处理的G93A小鼠获取的SC裂解物中VPS26b和β-肌动蛋白的代表性WB。报告为相比溶媒处理的WT的比率(平均值±s.d.)的归一化VPS26b水平的定量在面板D中示出(n＝6/组)。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析这些数据。
图13.面板A示出在由假手术和硼替佐米(10nM，BTZ)处理的Neuro2a细胞(3x105细胞/孔)所代表的实验对照中和来自溶媒处理的WT小鼠、溶媒处理的G93A小鼠和2a处理的G93A小鼠(10mg/kg，第100天)的腰部SC提取物中的多泛素化蛋白质的代表性WB。蛋白质负载的归一化是通过β-肌动蛋白完成的。面板A中的黑色分隔线显示从独立滤膜裁剪的泳道。B，对于β-肌动蛋白归一化的泳道的集体密度用于定量(平均值±s.d.，点代表单个动物，数据从独立滤膜取样)。C，来自溶媒处理的WT、溶媒处理的G93A和化合物2a处理的G93A小鼠(10mg/kg，在第100天取样)的腰部SC的共聚焦堆叠的最大投影，对泛素(Ubi)和NeuN进行标记(n＝3/组)。在选通Neun+MN中的Ubi(Alexafluor 488)的平均荧光强度(MFI)报告在D中(箭头表示代表性细胞，≥30细胞/组)。落射荧光标度在右侧面板D中示出。E，腹侧MN的共焦堆叠的最大投影，对NeuN和GM130进行标记(共聚焦显微镜的采集步骤：0.4μm)。每个面板中的箭头表示插图中以高倍放大显示的区域。GM130面积和分布的定量在面板E中示出(n＝4/组，≥30细胞/组)。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板B、D和E的数据。*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001。C中比例尺为50μm，E中为20μm。
图14.面板A示出在溶媒和2a处理的G93A小鼠中的掉落潜伏期(10mg/kg，n＝6/组。从第83天到第103天处理)。数据报告为平均值±s.d.。载入了来自溶媒和先导物2a处理的小鼠的腰部SC提取物的blue-native聚丙烯酰胺凝胶的代表性免疫印迹在B中示出。膜在醋酸中孵育以固定蛋白质并用抗huSOD1抗体探测。将等量的蛋白质提取物载入平行SDS-PAGE，在硝酸纤维素滤膜上印迹并用抗β-肌动蛋白抗体探测。黑色分隔线标记从不同滤膜裁剪的泳道。C，来自用假手术或用化合物2a处理的小鼠的SOD1的突变形式的定量(每个点表示单个动物)。面板D的直方图示出在稳定的Neuro2a克隆(克隆7B11)中测量的归一化pHfluorin-LC3。细胞用递增浓度的化合物2a(0.1-100μM)处理48小时，而使用巴佛洛霉素A1(200nM)和Torin-1(250nM)建立对照。通过流式细胞术测定细胞，并计算对于未处理细胞的pHfluorin LC3倍数变化(每组n＝4，点表示单个孔)。使用双尾学生检验来确定A中的统计显著性；使用Mann Whitney检验来确定C中的统计显著性。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来确定D中的统计显著性。
图15.用乱序质粒(0.5μg/孔，A)或用VPS35RNAi质粒(Sh56，0.5μg/孔，B)与编码GFP的质粒一起转染Neuro2a细胞(4x104细胞/孔)，以识别转染的细胞(0.1μg/孔)。24小时后更换生长培养基以诱导饥饿，细胞在无FBS培养基中再保持24小时。细胞在成像前与Lyso-tracker(75nM)一起孵育30分钟。在合并的共聚焦图像上对单个GFP+细胞中LysoTracker覆盖的区域(平均百分比±s.d.)完成定量，数据在C中示出(n＝15细胞/组，3个独立实验)。在转染48小时后，将来自接受乱序或Sh56质粒(2μg/孔，48小时)的Neuro2a细胞(3x105细胞/孔)的蛋白质裂解物进行印迹，并对泛素和β-肌动蛋白进行标记(D)。每个Ubi蛋白泳道的集体密度表示为相对于β-肌动蛋白水平，和平均值±s.d.绘制在面板E的直方图中(n＝3/组)。Neuro2a细胞(4x104细胞/孔)用编码GFP的质粒(0.6μg/孔)或用含有GFP(0.1μg/孔)和pcDNA3.1(+)SOD1G93A(0.5μg/孔)的质粒混合物转染。转染时细胞接受2a(10μM)或溶媒，24小时后，它们被饥饿并在含有或不含2a的无FBS培养基中再保持24小时。细胞在成像前与Lyso-tracker(75nM)一起孵育30分钟。F，对于GFP和Lyso-tracker进行标记的细胞的代表性合并共聚焦图像。每组中Lyso Tracker覆盖的区域的定量(平均百分比±s.d.)在面板G中示出(n≥15细胞，3个独立实验)。使用双尾学生检验来确定面板C和E中的统计显著性。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来分析面板G中绘制的数据。*p<0.05；***p<0.001。比例尺10μm。
图16显示CNI-1494不调节VPS35。面板A示出CNI-1493的分子特征。面板B示出在用CNI-1493或DG004处理48小时(各10μM)的Neuro2a中测量的VPS35的倍数变化。C，在接受LPS(100ng/ml)前1小时，用CNI-1493或2a(10μM)处理原始264.7细胞。LPS递送后4小时收集上清液，并使用标准ELISA检测释放的TNFα。化合物2a不抑制TNFα释放。相反，CNI-1493显著减弱了TNFα的表达。数据表示为独立实验的平均值(±s.d.)(每个实验n＝3)，并使用单向方差分析和Tukey多重比较检验来进行分析。*p<0.05，***p<0.001。
图17.面板A和B示出来自对照(A)和ALS(B)的SC活检的腹角的代表性切片中的alpha-MN中的VPS35免疫反应性。C和D示出来自对照(C)和ALS患者(D)的相邻切片中的alpha-MN中的VPS26。在源自5名ALS患者和4名非神经学对照的活检上，对两种CRC蛋白完成免疫组织化学。面板E示出来自健康志愿者(#8)和ALS患者(#13，携带SOD1Leu144Phe突变)的iPSC衍生MN的代表性培养物中对于VPS35和ISLET1的共聚焦堆叠的最大投影。来自iPSCs衍生的MN培养物(#8SOD1Asn65Ser、#13SOD1Leu144Phe、#27SOD1Asp97Asn以及年龄和性别匹配的健康志愿者#2、#4和#8)的VPS35和β-肌动蛋白的WB在F中示出。面板G示出显示来自健康志愿者(#8)和ALS患者(#27SOD1Asp97Asn)的施用或未施用先导物2a(10μM，持续6天)培养的iPSC衍生MN中对于VPS35和ISLET1的共聚焦堆叠的代表性横截面。面板H示出在用溶媒或2a(10μM，持续6天)处理的iPSC衍生MN中VPS35和β-肌动蛋白的蛋白质印迹。每个泳道代表一个独立的孔，定量绘制在面板的直方图中。使用双尾学生检验来确定面板L和N中的统计显著性。**p<0.01。比例尺：H中为10μm，H’中为25μm，J中为15μm，K中为10μm，并且M中为20μm。
具体实施方式
根据本发明的一方面，本发明涉及式(I)的新化合物
及其的盐，
其中：
R1选自氢和卤素；
R2选自氢、卤素、羟基、烷氧基和烷基；
R3选自氢、卤素、羟基、烷氧基和烷基、芳烷基、芳基、-COOR8、-NHCOR8、-NHSO2R8、-COR9、-NO2和氨基胍腙；
R4选自氢和烷基；
R5选自氢和烷基；
R6选自氢、烷基、芳基和芳烷基；
R7选自氢和烷基；
或者
R5和R6与其相结合的两个氮原子一起形成选自咪唑啉、四氢嘧啶和的苯并咪唑啉的环；
或者
R6和R7各自独立地与其相结合的氮原子一起形成吡咯烷基或哌啶基；
R8选自氢、取代的烷基和芳基；
R9选自由式(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)所组成的组
其中星号(*)代表连接键，
及其盐和溶剂化物。
术语“卤素(halo)”在本文中代表任意的卤素原子，优选为氯和溴，有利地为溴。
术语“烷基”在本文中代表直链或支链的、饱和的C1-C6烷基，优选为C1-C4烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。烷基可被任选地取代，优选为被卤素原子、羟基、C1-C6烷氧基或氨基取代。
术语“烷氧基”在本文中代表直链或支链的、饱和的C1-C6烷氧基，优选为C1-C4烷氧基，诸如甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
术语“芳基”在本文中代表被任选地取代的芳基，优选为被任选地取代的单环芳基，任选地被卤素原子、直链或支链的C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基或氨基取代；所述被任选地取代的芳基优选地选自苯基和甲苯基，诸如对甲苯基。
术语“芳烷基”在本文中代表被任选地取代的芳基，优选为被任选地取代的单环芳基，其通过烷基残基(优选为亚甲基)结合至式(I)；优选的芳烷基是苄基。
根据优选的实施方式，在式(I)的化合物中
R1选自氢和溴；
R2选自氢、溴、羟基、甲氧基、甲基、正丁基和正丁氧基；
R3选自氢、溴、甲氧基、-NO2、苯基、-NHCOCH3、-NHCO-对甲苯基、-NHSO2CH3、-NHSO2-对甲苯基、COOCH3、-CO-R9和氨基胍腙；
R4选自氢和甲基；
R5是氢；
R6选自氢、甲基、正丁基和苄基；
R7是氢，
或者
R5和R6与其相结合的两个氮原子一起形成选自咪唑啉、四氢嘧啶和的苯并咪唑啉的环；
或者
R6和R7与其相结合的氮原子一起形成吡咯烷基或哌啶基；
R9选自由式(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)所组成的组
其中星号(*)代表连接键。
根据本发明的优选化合物是式(I)的化合物，其中：
-R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2a)
-R1是溴并且R2、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2b)
-R2是溴并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2c)
-R2是羟基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2d)
-R2是甲氧基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2e)
-R2是正丁氧基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2f)
-R3是甲基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2g)
-R3是溴并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2h)
-R3是甲氧基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2i)
-R3是硝基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2j)
-R3是苯基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2k)
-R3是乙酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2l)
-R3是对甲基苯甲酰胺基(p-tolylamido)并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2m)
-R3是甲磺酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2n)
-R3是对甲基苯磺酰胺基(p-tosylamido)并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2o)
-R3是甲氧羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2p)
-R3是1-(4'-苯基哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2q)
-R3是氨基胍基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2r)
-R6是正丁基并且R1、R2、R3、R4、R5、R7都是氢(化合物2t)
-R6是苄基并且R1、R2、R3、R4、R5、R7都是氢(化合物2u)
-R6和R7与其相结合的氮原子一起形成吡咯烷基并且R1、R2、R3、R4、R5都是氢(化合物2v)
-R3是对甲基苯磺酰胺基，R6是正丁基并且R1、R2、R4、R5、R7都是氢(化合物2w)
-R5和R6与其相结合的氮原子一起形成咪唑啉基并且R1、R2、R3、R4、R7都是氢(化合物2x)
-R4是甲基，R5和R6与其相结合的氮原子一起形成咪唑啉基并且R1、R2、R3、R7都是氢(化合物2x)
-R5和R6与其相结合的氮原子一起形成苯并咪唑啉基并且R1、R2、R3、R4、R7都是氢(化合物2z)。
此外，根据本发明的优选化合物是式(I)的化合物，其中：
-R3是苄基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2aa)
-R3是2'-氨基乙酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2bb)
-R3是对甲氧基苯甲酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2cc)
-R3是羰基(2-氨基乙氧基)并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2dd)
-R3是羰基(2-(4'-吗啉基)乙氧基)并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2ee)
-R3是N,N-二乙基氨甲酰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2ff)
-R3是N-吗啉基羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2gg)
-R3是1-(4'-甲基哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2hh)
-R3是1-(4'-(3”-硝基苯基)哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2ii)
-R3是1-(4'-(4”-甲氧基苯基)哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2jj)
-R3是1-(4'-(4”-氯代苯基)哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2kk)
-R5和R6与其相结合的氮原子一起形成苯并四氢嘧啶啉基并且R1、R2、R3、R4、R7都是氢(化合物2ll)
-R6和R7与其相结合的氮原子一起形成哌啶基并且R1、R2、R3、R4、R5都是氢(化合物2mm)
最优选的化合物是化合物2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2i、2l、2v和2z。
能够制备式(I)的化合物的任意类型的盐，例如在合成步骤中或者为了纯化的原因，并且所有的盐都包括在本申请的保护范围内。
根据优选的实施方式，式(I)的化合物的盐优选为药学上可接受的盐。
式(I)的化合物能够与各种有机和无机酸形成盐。这样的盐包括与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、甲磺酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、马来酸、苯磺酸、甲苯磺酸形成的那些及其他(例如硝酸盐、磷酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐等)。这样的盐可以如本领域技术人员已知来形成。
优选的盐是盐酸、氢溴酸、氢碘酸和乙酸的盐。
式(I)的化合物可以通过任意适合的合成方法来制备。
在本公开中，即使没有明确说明，式(I)的化合物也可以总是其盐和/或溶剂化物之一的形式。
式(I)的化合物的任意可行的立体异构体以及可行的晶体形式及其盐或溶剂化物也包括在本发明的范围内。
根据本发明的一个方面，本发明涉及制备式(I)的化合物或其盐或溶剂化物之一的方法，该方法包含使式(IV)的化合物
其中R1、R2和R3如上文所定义，与式(V)的化合物
或其盐，其中R4、R5、R6和R3如上文所定义，在适合的溶剂中反应，并且分离由此获得的式(I)的化合物，可任选地纯化和/或可任选地将其转化为其盐或溶剂化物。
起始的式(IV)和(V)的化合物是已知化合物，或者能够通过本领域已知的方法来制备。
它们的制备的实例在下列方案和实验部分中给出。
式(V)的化合物以式(IV)的化合物的量的至少两倍的摩尔量来使用。
根据优选的实施方式，式(V)的化合物以盐化的形式使用，例如以氢溴酸盐、盐酸盐或氢碘酸盐的形式。
上述反应可以在从40℃至反应混合物的回流温度范围内的温度进行，优选为从60℃至反应混合物的回流温度，有利地在80℃。
溶剂优选为低级醇，优选为乙醇。然而，其他溶剂也可以在本发明的方法中使用。
优选地，在上述反应中可以使用催化量的酸，优选为盐酸或乙酸。
反应在几个小时内完成，例如1-12小时。本领域技术人员无论如何完全能够使用常规方法检查反应的进展，例如色谱技术，诸如薄层色谱(TLC)。
式(I)的化合物可以利用常见技术分离，例如通过过滤或者利用恰当的溶剂从反应混合物中萃取。
如有必要或需要，式(I)化合物可通过诸如色谱、结晶等常规技术纯化。
其中R3是氨基胍腙基的式(I)的化合物也可以通过使式(VI)的化合物
代替式(IV)的化合物与上文所定义的式(V)的化合物，在与上文所定义相同的反应条件下反应而制备。
作为比较例，式(VII)的化合物
是通过使式(VIII)的化合物
与上文所定义的式(V)的化合物，在与上文所定义相同的反应条件下反应而制备的。化合物(VIII)作为炎症调控剂在WO95/19767中公开。
在下列合成方案中，虚线代表两个盐化的氮之间的电荷的离域。
合成的试剂和条件在说明书的实验部分中给出。
方案1
试剂和条件：HCl催化，EtOH，80℃，2小时，89％。
方案2
试剂和条件：(a)HCl催化，EtOH，80℃，2小时，89％。
方案3
试剂和条件：(a)THF中的1M BH3，干燥THF，N2，0℃至室温，48小时，86％；(b)MnO2，CHCl3，70℃，16小时，86％；(c)HCl催化，EtOH，80℃，4小时，88％。
方案4
试剂和条件：(a1)MeI，K2CO3，干燥DMF，N2，室温，24小时，60％；(a2)n-BuBr，K2CO3，干燥DMF，N2，85℃，24小时，75％；(b)HCl催化，EtOH，80℃，2至小时，77％(2d)、79％(2e)或80％(2f)。
方案5
试剂和条件：(a)THF中的1M BH3，干燥THF，N2，0℃至室温，80至88％；(b)MnO2，CHCl3，70℃，16小时，77至92％；(c)HCl催化，EtOH，80℃，2至8小时，77(2g)、88％(2h)、81％(2i)或80％(2j)。
化合物2aa(R＝CH2Ph)能够从对应的5-苄基-苯基-1,3-二羧酸9aa，如方案3所示来制备。
方案6
试剂和条件：(a)PhB(OH)2，Pd(PPh3)4，Na2CO3水溶液，二氧六环，105℃，6小时，82％；(b)MnO2，CHCl3，70℃，16小时，81％；(c)HCl催化，EtOH，80℃，8小时，79。
方案7
试剂和条件：(a)TBDMS-Cl，1H-咪唑，CH2Cl2，0℃至室温，3小时；(b)10％Pd/C催化，H2，EtOH，室温，24小时，78％(2步)；(c)酰化剂，TEA，DMAP，CH2Cl2，0℃至室温，1至2小时，89％(10l)或80％(10m)；(d)AcCl，干燥MeOH，N2，0℃，30分钟，94％(8l)或84％(8m)；(e)MnO2，CHCl3，70℃，16小时，88％(7l)或83％(7m)；(f)HCl催化，EtOH，80℃，4至6小时，85％(2l、2m)。
化合物2bb(R＝CH2CH2NH2)和2cc(R＝p-OMePh)能够在步骤c中使用对应的酰化剂，并且分别获得10bb和10cc，如方案7所示来制备。
方案8
试剂和条件：(a)磺酰化剂，吡啶，DMAP，CH2Cl2，0℃至室温，16小时，85％(2o)；(b)AcCl，干燥MeOH，N2，0℃，30分钟，81％(2o)；(c)MnO2，CHCl3，70℃，16小时，68％(2n，3步)或90％(2o)；(d)HCl催化，EtOH，80℃，4小时，83％(2l)或79％(2o)。
方案9
试剂和条件：(a)1.8M NaOH水溶液，MeOH，室温，24小时；(b)THF中的1M BH3，干燥THF，N2，0℃至室温，24小时，54％(2步)；(c)MnO2，CHCl3，70℃，16小时，85％；(d)HCl催化，EtOH，80℃，4小时，71％。
化合物2dd(COOCH2CH2NH2酯)和2ee(R＝2-吗啉基乙基酯)能够通过水解化合物7p并利用N-保护的乙醇胺或N-羟基乙基吗啉使其酯化，如方案9所示来制备。
方案10
试剂和条件：(a)NaOH，水/THF，室温，24小时；(b)4-苯基-哌嗪，EDC，HOBt，TEA，干燥CH2Cl2，N2，室温，24小时，30％(2步)；(c)HCl催化，EtOH，80℃，4小时，72％。
化合物2ff(二乙酰胺)、2gg(吗啉酰胺)、2hh(4'-甲基哌嗪酰胺)、2ii(4'-(3”-硝基苯基)哌嗪酰胺)、2jj(4'-(4”-甲氧基苯基)哌嗪酰胺)和2kk(4'-(4”-氯代苯基)哌嗪酰胺)能够通过利用恰当的酰胺化剂取代N-苯基哌嗪，如方案10所示来制备。
方案11
试剂和条件：(a)HCl催化，EtOH，80℃，4小时，78％。
方案12
试剂和条件：(a)n-BuNH2(14t)、BnNH2(14u)或吡咯烷(14v)，MeOH，室温，72小时，80％(14t)、60％(14u)或89％(14v)；(b)EtOH，80℃，16至小时，53％(2s)、70％(2u)或80％(2t)。
化合物2ll(RX＝-(CH2)5-)能够通过在步骤a中使用哌啶作为酰胺化试剂生成14ll，如方案12所示来制备。
方案13
试剂和条件：(a)EtOH，80℃，16小时，70％
方案14
试剂和条件：(a)EtOH，80℃，16小时，82％(2x、2y)；
化合物2mm(RX＝-(CH2)5-)能够通过在步骤a中使用含四氢吡啶的氨基胍作为氨基胍化试剂生成2mm，如方案14所示来制备。
方案15
试剂和条件：(a)AcOH催化，EtOH，80℃，2小时，66％。
式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在治疗和诊断中的应用是本发明的又一个方面。
式(I)的化合物，尤其是上文所定义的优选化合物，展示了有趣的逆运体稳定剂活性，并且可用于治疗和/或预防多种神经疾病，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等，其中逆运体稳定活性是有益的。
为其在治疗中的应用，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐之一优选地以药物组合物的形式施用。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受盐或溶剂化物之一，优选地与至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂组合。
本发明的组合物包括其中以有效实现其预期目标的量包含本发明的化合物的所有组合物。尽管个体的需要不同，确定各个组分的有效量的最优范围是本领域技术人员已知的。所施用的剂量因此取决于接受者的年龄、健康和体重、治疗的类型、治疗的频率以及预期效果的性质。
典型地，以所治疗的哺乳动物的体重计，化合物能够以1至100mg/kg的剂量，或者其药学上可接受的盐之一的等当量的量，每日口服施用于哺乳动物，特别是人。优选地，口服施用约1至100mg/kg。对于肌内给药，剂量一般为口服剂量的一半。例如，可接受的肌内剂量是约0.5至50mg/kg，更优选为0.1至10mg/kg。
优选地，能够通过口服和肠胃外途径施用的组合物是本领域技术人员已知的，例如，它们可以是下列形式：片剂、糖衣丸、缓释丸剂和胶囊、漱口水、凝胶、液体悬浮液、染发剂、发胶啫喱、洗发剂和其他可以直肠给药的制剂，例如栓剂，以及用于肠胃外、局部或口服给药的可接受溶液，含有约0.01至99％，优选0.25至75％的活性成分。
药物组合物可以通过任意方式施用以实现预期目标。例如，施用可以是肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、透皮、口颊、鞘内、颅内、鼻内或口服。
本发明的药物制剂如本领域技术人员已知的来生产，例如通过常规混合、造粒、糖衣、溶解或冷冻干燥过程。因此，口服用药物制剂可以通过将活性成分与固体赋形剂混合，如果需要和必要，在加入适合的赋形剂后，可任选地通过研磨所得混合物并处理颗粒混合物而获得，以获得片剂或糖衣丸芯。
适合的赋形剂特别是稀释剂和填充剂，诸如糖、纤维素和磷酸钙，以及粘合剂，诸如淀粉、明胶、纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可以添加解聚剂作为上述淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂和海藻酸及其盐。其他有用的赋形剂是自由流动剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其盐和聚乙二醇。如果需要，丸剂和片剂的芯可以具有耐消化液的适合的包衣。为了生产抗消化液的包衣，可以使用本领域技术人员公知的适合的聚合物。
可以口服使用的其他药物组合物包括由明胶制成的硬胶囊，以及由明胶和例如甘油或山梨糖醇的增塑剂制成的密封软胶囊。硬胶囊可以含有颗粒形式的活性成分，其可以与稀释剂、粘合剂和/或润滑剂以及可任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性成分优选溶解或悬浮于适合的液体中，诸如脂肪油或液体石蜡。此外，可以添加稳定剂。
可以直肠使用的可行的药物组合物包括例如栓剂，其由一种以上活性成分与适合的赋形剂的组合组成。这种适合的赋形剂是例如天然或合成甘油三酯或石蜡烃。
适合于肠胃外施用的制剂包括可溶形式的活性成分的水性溶液，优选在水中。此外，能够施用活性成分的悬浮液，诸如适合的可注射油的悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油或合成脂肪酸的酯。水性注射剂可以含有增加悬浮液粘度的物质，诸如山梨糖醇和葡聚糖。可任选地，悬浮液还可以包含稳定剂。
除了以药物组合物的形式施用之外，上述式(I)的化合物也可以作为纯化合物施用。
根据本发明的另一方面，本发明涉及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物之一在治疗和/或预防多种神经疾病中的应用，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等，其中逆运体稳定活性是有益的。
根据本发明的另一方面，本发明涉及本发明的药物组合物在治疗和/或预防多种神经疾病中的应用，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等，其中逆运体稳定活性是有益的。
根据本发明的另一方面，本发明涉及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物之一，用作逆运体稳定剂和用作神经保护剂。
根据本发明的另一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防多种神经疾病的方法，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等，其中逆运体稳定活性是有益的，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物之一、或有效量的根据本发明的药物组合物。
在治疗中，尤其是在诸如上文所公开的神经疾病的治疗和/或预防中，式(I)的化合物可以单独施用，或者与式(I)的另一种化合物和/或与在所述治疗和/或预防中有用的另一种治疗剂组合施用。
根据本发明的另一方面，本发明涉及式(I)的化合物或其盐或溶剂化物之一在诊断中的应用。
根据本发明的另一方面，本发明涉及一种诊断工具，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐之一。
出于说明性而非限制性目的，本发明在以下实验部分中进一步公开。
实验部分
氨基胍腙的生化表征
一些实验证据表明逆运体具有神经保护作用，尤其是在与年龄相关的神经退行性疾病中。例如，在包括帕金森氏病(PD)和阿尔茨海默病(AD)在内的多种疾病中都观察到了这种古老的多聚体复合物的破坏(Small和Petsko，2015)。在PD中，VPS35的突变(D620N)在该疾病的晚发形式中占主导地位(Vilarino-Guell、Wider等人，2011)。此外，在选择性易受AD影响的大脑区域中，VPS35水平显著降低(Small、Kent等人，2005)。
因此，根据本发明合成了新的药理学伴侣，其能够显著增加VPS35的水平，从而显著增加逆运体复合物的水平，将是有希望的化合物，并且测试了它们的神经保护作用。为了在功能上筛选本发明的大多数合成氨基胍腙并确定它们对逆运体复合物的效果，我们用各个合成分子以10μM的浓度孵育Neuro2a细胞。我们在每个实验中使用标准化合物R55(Mecozzi、Berman等人，2014)作为对照，该化合物在孵育48小时后有效地且剂量依赖性地增加VPS35水平(图1A、B)。
对于本发明的每个测试化合物，该测试一式三份进行，在孵育48小时后建立细胞裂解物，并通过蛋白质印迹根据持家基因β-肌动蛋白归一化VPS35水平。我们观察到化合物之间的初步SAR。
大多数本发明的测试化合物能够增加VPS35水平，尽管具有一定的可变性。特别地，化合物2a能够持续增加VPS35水平，重复之间的可变性有限(表1)。
表1显示了来自接受10μM的各个化合物48持续小时的独立培养物(n＝3)的平均倍数变化±s.d.。倍数变化是根据在溶媒处理的细胞中测量的归一化VPS35水平计算的。
表1
x：单次实验，无标准差
作为对比，也以与上述相同的条件测试了化合物(VIII)。测试结果在表2中给出。
化合物 平均倍数变化 标准差
溶媒 1 x
(VIII) 0.600 x
x：单次实验，无标准差
肌萎缩侧索硬化中的逆运体水平
虽然在几种神经退行性疾病中评估了逆运体的作用(Small、Kent等人，2005；Vilarino-Guell、Wider等人，2011)，但对于任何在ALS中的推定作用一无所知。错误折叠的聚集蛋白被认为参与了导致运动神经元(MN)细胞死亡的发病机制(Cleveland，1999)。例如，在大量散发性ALS患者中，TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)被确定为泛素化内含物的核心成分(Arai、Hasegawa等人，2006)。逆运体与AD相关，AD的特征是淀粉样蛋白β斑块和患者大脑中的Aβ蛋白聚集，以及在常染色体显性PD患者中发现VPS35突变(MacLeod、Rhinn等人，2013)。
我们确定了携带hSOD1G93A的小鼠(小鼠品系B6.Cg-Tg(SOD1G93A)1Gur/J，以下称为G93A)及其野生型(WT)仔畜(litter)的MN中的VPS35水平(Gurney、Pu等人，1994)。我们对临床前G93A(第30、60和90天)小鼠的腰部脊髓(SC)中的VPS35免疫反应性进行了评分。切片用标志物NeuN双重标记以识别MN(图2A)。VPS35优先在IV-V层的皮质兴奋性神经元中表达，而抑制性神经元以低水平表达这种蛋白质(Wen、Tang等人，2011)。类似地，在WT脊髓中，我们在真实的腹侧MN中观察到VPS35免疫反应性。有趣的是，G93AMN中的VPS35表达水平显著降低(图2A)。在第30天和第60天，G93A小鼠无症状(Gowing、Philips等人，2008)并且MN尚未退化，正如我们使用神经元标志物NeuN所示。因此，VPS35的损失不能归因于MN的普遍损失。我们接下来证实了，在G93A小鼠VPS26和NeuN双重标记的平行切片中，逆运体的CRC构件减少(图2B)。有趣的是，VPS35和VPS26蛋白质水平的降低并非源于其mRNA水平的降低(图2F)。我们接下来通过对临床前和临床G93A小鼠腰部脊髓的总蛋白质提取物进行蛋白质印迹证实了我们的观察。同样在个实验中，我们注意到VPS35水平在G93A遗传背景中显著降低(图2C)。同样，在第100天采样的G93A腰部SC的蛋白质提取物中，VPS26b和VPS29的水平显著降低(图2D和E)。
逆运体稳定化提高G93A转染细胞的细胞存活
高尔基体的病理改变，例如其碎片化，已在包括ALS的许多神经退行性疾病中得到描述。用编码SOD1的G93A突变形式的质粒转染的Neuro2a细胞显示出高尔基体转运的改变(Soo、Halloran等人，2015)。同样，在ALS小鼠中，高尔基体碎片化先于神经肌肉去神经支配和轴突收缩(van Dis、Kuijpers等人，2014)。我们在存在或不存在化合物2a(10μM)的情况下，用编码人SOD1基因的G93A突变形式(以下称为G93A)的质粒转染Neuro2a细胞。48小时后收获细胞，标记Golgin-97并为反式高尔基体的分布评分。未处理的细胞和接受编码GFP的对照质粒的细胞显示出Golgin-97的紧密分布，而在用G93A质粒转染的细胞中，显示高尔基体复合物的部分或完全碎片化的细胞百分比大大增加。然而，化合物2a的施用显著降低了这些百分比，重建了我们在对照细胞中观察到的Golgin-97分布(图3A)。值得注意的是，接受G93A质粒的细胞中高尔基体的碎片化并不取决于Golgin97表达水平(图3A)。我们推测高尔基体碎片化可能会加剧该细胞系中的细胞死亡。因此，我们测定了用G93A质粒转染的Neuro2a的细胞存活。因此，用G93A质粒或编码LacZ的对照质粒转染细胞。我们还评估了10μM的化合物2a不会在细胞中引起毒性作用。与未处理的细胞相比，对照组(即接受LacZ质粒或化合物2a的细胞)的细胞存活率相似。另一方面，G93A质粒的过度表达影响了Neuro2a的细胞存活。化合物2a的施用显著逆转了这种表型(图3B)。我们接下来的疑问是，我们在接受化合物2a的细胞中观察到的对于细胞存活的拯救是否可能取决于逆运体的功能性。我们进行了进一步的实验，其中我们用编码VPS35的质粒转染细胞，而不是使用化合物2a来促进逆运体稳定。我们用G93A质粒与或不与编码VPS35的质粒一起转染Neuro2a细胞。正如所预期的，接受G93A质粒的Neuro2a中的细胞活力降低，而同时转染G93A和VPS35质粒两者的细胞显著提高了细胞活力。
我们接下来使用另外的质粒在Neuro2a细胞中进行VPS35短干扰，最终目标是降低也接受G93A质粒的细胞中的VPS35水平。我们首先确定了质粒抑制VPS35表达的功效。我们转染了3种不同的旨在干扰Neuro2a细胞中的Vps35mRNA的商业质粒。虽然它们都能够降低VPS35水平，但Sh56质粒导致VPS35mRNA和蛋白质水平降低60％(图4A-C)。此外，VPS35的免疫荧光显示，在转染Sh56-RNAi质粒的Neuro2a细胞中，VPS35免疫反应性显著降低(图4E)
我们接下来用G93A与Sh56或乱序质粒一起转染Neuro2a细胞。Neuro2a细胞中VPS35水平的简单降低不会影响它们的存活。正如所预期的，接受G93A质粒的Neuro2a细胞中的细胞存活降低(图3D)。有趣的是，Sh56在G93A转染细胞中降低VPS35水平，进一步降低了细胞存活，并且最重要的是，显著影响了化合物2a逆转这种表型的能力(图3D)。
我们接下来通过使用LDH-GloTM细胞毒性测定测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放来测定细胞毒性。细胞用编码G93A和Sh56-RNAi序列的质粒与或不与化合物2a一起处理，而上清液用于测量LDH含量。与用编码LacZ的质粒或用LacZ+Sh56质粒转染的细胞相比，G93A的过度表达增加了Neuro2a细胞对LDH的释放(图3E)。在用G93A质粒转染的细胞中，化合物2a显著降低了LDH的释放。另一方面，当细胞接受G93A质粒和Sh56质粒时，LDH释放增加。有趣的是，在用G93A质粒和Sh56质粒转染并用化合物2a处理的Neuro2a细胞中观察到LDH的高释放，进一步证实2a通过靶向逆运体复合物来抵消SOD1G93A介导的细胞毒性(图3E)。
化合物2a在体外增加逆运体复合物的稳定性。我们通过放线菌酮(CHX)追踪测定，通过测量VPS35降解率进一步验证了这一设想。Neuro2a细胞接受溶媒或先导物(lead)2a(10μM)24小时，然后将CHX加入培养基中，并通过蛋白质印迹测量VPS35水平。我们观察到，在CHX处理8小时后，溶媒处理的细胞表现出VPS35水平的下降(～40％)。相反，用先导物2a预处理的细胞保护VPS35免于降解(图5A、B)。与R55的情况一样(Mecozzi、Berman等人，2014)，化合物2a不应影响Neuro2a细胞中CRC基因的转录水平。因此，在用2a(10μM)处理48小时的Neuro2a细胞中，Vps35、Vps26和Vps29的mRNA水平不变(图5C)。
我们接下来的疑问是，化合物2a是否可以穿过大脑的血脑屏障(BBB)。我们对接受每日腹膜内注射化合物2a(10mg/Kg/天)的C57BL6J小鼠进行药代动力学分析。在灌注生理盐水1、7、15和30天后处死小鼠，以避免血液循环和大脑中所含有的化合物的CNS污染，用于通过质谱法测定化合物2a的水平。我们在大脑中检测到大量的化合物2a，证实了化合物2a进入CNS的能力(图6A)。我们接下来在体内研究了逆运体稳定化是否响应于化合物2a处理而发生。如上所述，我们在成年C57BL6J小鼠中腹膜内注射R55和化合物2a。一周后，处死小鼠，通过蛋白质印迹分析蛋白质提取物。虽然用R55处理不会增加SC提取物中的VPS35水平，但化合物2a显著增加了这种水平(≈1.7，图6B)，进一步证实了化合物2a稳定逆运体复合物的能力。
在所有这些实验中，我们没有观察到Neuro2a的细胞毒性以及注射化合物2a的小鼠中的任何不良事件。尽管如此，我们评估了化合物2a的细胞毒性，测量了暴露于递增浓度的2a的Neuro2a细胞的细胞存活。计算出的LD50为～260μM(图7A)，该值比在我们的体外实验中稳定逆运体所需的浓度高得多。我们的方法的最终目标是稳定ALS MN中的逆运体，或者总体来说，在逆运体表达明显减弱的神经元中稳定逆运体。因此，我们通过使用原代神经元培养物结合微电极阵列(MEA)设备检查了神经元中的化合物2a毒性。将来自小鼠E16.5大脑皮质的神经元铺板在MEA上并在培养基中保持14天，以允许自发放电活动的发展。我们记录了接受递增浓度的2a(从1至100μM)的神经元中的尖峰(图7B、C)。低浓度的化合物2a不会改变神经元放电，而我们观察到，当神经元与最高浓度的2a一起孵育时，尖峰略有减少，但并不显著(图7D)。总而言之，考虑到在体外增加VPS35水平所需的低μM逆运体影响浓度，这些结果显示了先导物2a的宽治疗窗口。
我们在基于H2O2诱导的导致DNA断裂和细胞死亡的染色体断裂的分析中测试了化合物2a的特异性。原则上，根据不受逆运体影响的过程，此类DNA损伤是细胞死亡的原因。因此，我们的先导物不应该能够调节接受H2O2的Neuro2a细胞的细胞存活率。我们将Neuro2a细胞与200μM的H2O2以及化合物2a、2c、2d和2g(10μM)一起培养。比较接受H2O2与或不与我们的化合物的细胞之间的细胞存活并没有导致任何显著差异(图7E)，进一步证实了我们的先导物在逆运体上起作用的想法，当然它们不能防止由DNA断裂导致的细胞死亡。
总之，这些结果表明G93A介导的高尔基体改变以及在Neuro2a细胞中观察到的细胞死亡率增加被药理学伴侣2a抵消，其特异作用于逆运体复合物。最后，我们还证明了化合物2a可以在小鼠中穿过BBB。
化合物2a在G93A小鼠中减轻临床损伤和MN细胞死亡
确定化合物2a穿过BBB后，我们开始治疗携带G93A突变形式SOD1的小鼠。从第30天开始，G93A小鼠和它们的WT仔畜每天注射化合物2a(10mg/kg)或溶媒。与接受溶媒处理的小鼠相比，接受2a的小鼠体重略有下降，尽管这种下降没有达到统计显著性(图8A)。然而，接受2a的G93A显示出运动表现的显著改善，这反映在加速转棒测试中掉落潜伏期的增加。事实上，从第80天开始，溶媒处理的G93A的掉落潜伏期逐渐减少。事实上，与第50天记录的值相比，我们在第100天记录到该参数降低了30％(图8C)。接受2a的G93A小鼠随时间进展表现出相当稳定的运动表现，并且与在WT小鼠中测量的值重叠，表明逆运体复合物的稳定能够在体内促进保护作用(图8B、C)。
在第100天处死小鼠，并测定腰部SC以研究MN细胞形态和数量。我们最初对SC的腹角的NeuN+神经元进行评分，以监测真实的运动神经元。接受化合物2a的小鼠的运动神经元数量显著高于溶媒处理的G93A小鼠(图8D)。相应地，对于平行切片上的胆碱乙酰转移酶+(ChAT)运动神经元的数量进行评分，我们观察到了类似的结果(图8E)。
我们接下来对来自接受化合物2a或溶媒的WT对照和G93A小鼠的坐骨神经进行了组织病理学分析。与疾病的晚期阶段一致，第100天的G93A小鼠与它们的WT仔畜相比时显示坐骨神经的轴突变性(图9A、B)。另一方面，用2a处理的G93A小鼠显示出对外周神经纤维的显著保护，这反映在发生变性的纤维减少(图9C、D)。使用与髓鞘的脂蛋白结合的LuxolFast Blue(LFB)染色，我们分析了这些神经的矢状切面中的髓鞘形成。我们观察到，与溶媒处理的G93A小鼠相比，接受化合物2a的G93A小鼠的髓鞘脱失过程显著减弱(图10A-D)。标记髓鞘碱性蛋白(MBP)和中等神经丝(NF-M)的平行切片显示在溶媒处理的G93A小鼠中的髓鞘紊乱，而化合物2a的施用保持了G93A小鼠中髓鞘的完整性(图10E)。因此，我们观察到用化合物2a治疗的G93A小鼠的坐骨神经中纤维变性和髓鞘脱失减少。
我们接下来在第100天处死的小鼠的逆运体蛋白标记的切片中分析了VPS35和NeuN。对腰部腹角的共聚焦堆叠的分析表明，与在溶媒处理的G93A小鼠中测量的强度相比，在接受化合物2a的G93A小鼠中VPS35的荧光强度水平(以MFI测量)显著增加(图11A)。类似地，我们观察到在接受化合物2a的G93A小鼠中VPS26水平增加(图11B)。我们进一步证实了我们观察到化合物2a增加了逆运体的功能的实验发现。阳离子非依赖6-磷酸甘露糖受体(CI-MPR)是逆运体复合物的货物(Arighi等人，2004)，其在VPS26敲除细胞中不稳定(Seaman，2004)。我们观察到与WT仔畜相比，溶媒处理的G93A小鼠的MN中CI-MPR MFI水平显著降低(图11C)。然而，在用先导物2a处理的小鼠的G93A MN中，MFI水平显著增加(图11C)。分拣蛋白(Sortilin)编码属于Vps10家族的受体，并且其与额颞叶痴呆(FTD)有关(Lane，2012)。分拣蛋白与MPR具有功能同源性，并且是另一种关键的逆运体货物(Nielsen等，2001)，它与大脑提取物中的VPS35共免疫沉淀(Muhammad，2008)并在VPS35敲除细胞中下调(Pan，2017)。分拣蛋白MFI水平在溶媒处理的G93A小鼠的MN中显著降低，从而反映了我们先前观察到的CI-MPR的降低。然而，用先导物2a处理显著增加了G93A MN中的分拣蛋白水平(图11D)。
我们接下来研究了组织蛋白酶D(CTSD)在G93A小鼠中的表达和分布，因为已知这种溶酶体酶的运输涉及逆运体复合物(Seaman，2004)。在人类中，CTSD的成熟始于在内质网中转化为pro-CTSD(52kDa)的pre-pro-CTSD。pro-CTSD的回收及其向酸性区室的下游迁移涉及CI-MPR和逆运体通路。在晚期内体中，pro-CTSD被进一步加工成中间形式(48kDa)，最后在溶酶体中转化为成熟的CTSD(34kDa)(Laurent-Matha，2006)。VPS35的失活或VPS26的敲低会影响CTSD的成熟。我们对从溶媒处理的WT、接受溶媒的G93A小鼠和用先导物2a处理的G93A获得的等量的腰椎SC提取物中的CTSD水平进行评分。我们观察到，与WT仔畜相比，成熟CTSD/pro-CTSD比率在溶媒处理的G93A小鼠的SC提取物中略有降低，但不显著。我们没有看到总蛋白裂解物中成熟CTSD的减少，可能是因为在第100天G93A小鼠的神经胶质细胞表达大量的成熟CTSD(图11E)。然而，在先导物2a处理的G93A小鼠中，成熟CTSD的水平显著增加(图11E)。我们接下来通过共聚焦显微镜分析了MN中的CTSD水平。我们观察到这种蛋白酶在溶媒处理的G93A的MN中显著减少，而在用化合物2a处理的G93A小鼠中这些水平增加(图11F)。类似地，在溶媒处理的G93A MN中，腰部NeuN+MN中CTSD+斑点的数量减少，而在化合物2a处理的小鼠中增加(图11F)。这些数据表明，由先导物2a介导的逆运体复合物的稳定化恢复了分拣蛋白和CI-MPR的表达水平，并促进了CTSD的成熟，从而恢复了ALS小鼠的溶酶体健康。
为了最终证明化合物2a可以增加逆运体复合物的稳定性，我们探测了SC提取物的VPS35和VPS26。这些实验进一步证实了2a在G93A小鼠中增加VPS35和VPS26b水平的能力(图12A-D)。
泛素化内含物在sALS和fALS患者的MN以及ALS小鼠的腰部SC中积累(Kabashi，2001)。泛素化蛋白质的高水平可能代表MN对蛋白质错误折叠和聚集的过度反应，以及溶酶体功能的减少。我们通过10％变性PAGE对腰部SC蛋白提取物中的多泛素化蛋白质进行了表征。在我们的实验中，我们包括了来自用能够增加多泛素化的蛋白酶体抑制剂硼替佐米(BTZ)处理的Neuro2a细胞的蛋白质提取物作为实验对照(图13A)。这些印迹的光密度分析表明，溶媒处理的G93A小鼠显示出丰富的多泛素化蛋白质。然而，在用化合物2a处理的小鼠中，多泛素化显著降低(图13A、B)。我们接下来对G93A小鼠腹角MN中的泛素MFI水平进行评分。根据蛋白质印迹获得的数据，溶媒处理的G93A MN中泛素荧光的MFI水平高于化合物2a处理的G93A小鼠中的评分水平，进一步证实了我们和其他人的结果(Saxesa，2009)(图13C和D)。正如之前在Neuro2a细胞中观察到的，G93A质粒的过度表达会影响高尔基体，因此我们通过在腰部切片标记顺式高尔基体基质蛋白GM130来询问在G93A小鼠自己配敏感是否会发生类似的改变。我们观察到，来自溶媒处理的G93A小鼠的很大一部分MN显示出GM130覆盖区域的减少，可能表明该细胞器的碎片化(图13E)。然而，这种现象在化合物2a处理的G93A小鼠的MN中基本逆转(图13E)。
SOD1突变增加了这种蛋白质在细胞中聚集的倾向(Johnston，2000)。我们检查了化合物2a是否可以在体内减少G93A聚集体的积累。从出生后第83天开始，我们每天向G93A小鼠和WT同窝仔畜注射化合物2a(10mg/kg)。我们对溶媒和化合物2a处理的G93A小鼠的运动表现进行评分，直到第103天。接受化合物2a的小鼠表现出运动缺陷的普遍减弱，这证实了我们先前的观察结果(图14A)。在第103天，我们通过blue-native聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SC蛋白提取物，并用抗SOD1抗体探测这些凝胶，我们在G93A小鼠中观察到高分子量涂片，其在WT仔畜中完全不存在。这些高分子量实体的强度在用先导物2a处理的小鼠中降低(图14B、C)。总而言之，化合物2a的逆运体稳定化在体外和体内提高了溶酶体稳态，减少了蛋白质的多泛素化，因此降低了G93A聚集的水平。
这些结果表明，在化合物2a处理的小鼠中，泛素化蛋白(图13A、B)和高分子量SOD1聚集体(图14B、C)均减少。除了增加溶酶体的功能外，我们假设化合物2a还可以增强自噬系统。因此，我们使用基于pH敏感型荧光蛋白(pHfluorin)-LC3的测定来监测活Neuro2a细胞中的自噬过程。我们在我们的实验室建立了Neuro2a稳定细胞克隆(7B11)，其表达微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)和ph敏感的GFP/pH敏感型荧光蛋白(phluorin)。该测定基于流式细胞术，并已使用众所周知的允许建立测定活性的上限和下限的自噬抑制剂(巴佛洛霉素A1)和激活剂(Torin-1)进行验证(未示出)。此外，我们使用巴佛洛霉素A1和Torin-1验证了我们的测定计算Z因子和严格标准化均数差(SSMD)参数的质量(未示出)。
Neuro2a-7B11细胞与递增浓度的化合物2a(0.1-100μM)以及对照分子巴佛洛霉素A1和Torin-1一起孵育。48小时后，通过流式细胞术测量对pH值敏感的GFP/phluorin信号，并计算相比未处理细胞的倍数变化。正如预期的那样，我们观察到通过巴弗洛霉素A1处理阻断自噬体与溶酶体的融合的增强的荧光。另一方面，mTORC1/2抑制剂Torin 1显著减弱了荧光信号(图14D)。GFP/phluorin信号在接受0.1和1μM化合物2a的细胞中没有变化，而我们观察到在用10和100μM处理的细胞中荧光水平的显著降低(图14D)。我们在接受100μM化合物2a的细胞中记录的荧光水平与在用0.25μM的Torin 1处理的细胞中测得的水平没有差异。因此，我们可以设想，我们在化合物2a处理的小鼠中观察到的泛素化蛋白质降解的部分可能涉及自噬系统的直接/间接增强。
我们接下来确定了Neuro2a细胞中VPS35水平的降低是否会影响溶酶体稳态，模拟我们和其他人在ALS小鼠模型中观察到的情况(Cheng，2018)。我们用编码Sh56RNAi的质粒转染Neuro2a细胞以下调VPS35。饥饿24小时后，我们使用Lyso-tracker分析溶酶体。我们观察到在VPS35被Sh56干扰的细胞中溶酶体的扩大和异常分布(图15A-C)。我们接下来评估了多泛素化蛋白质水平在接受VPS35靶向RNAi的Neuro2a细胞中增加了一倍，进一步表明逆运体功能的丧失会改变溶酶体稳态，因此多泛素化蛋白质的积累(图15D、E)。我们的疑问是，G93A质粒是否也会导致类似的溶酶体改变。我们用编码G93A的质粒与或不与化合物2a(10μM)一起转染Neuro2a细胞。饥饿24小时后，我们使用Lyso-tracker监测此类细胞中的溶酶体。仅接受G93A质粒的细胞显示溶酶体增大，尽管用化合物2a的处理显著逆转了这种表型(图15F，G)。
我们观察到以化合物2a为特征的分子结构让人联想到专利化合物CNI-1493(N,N'-双[3,5-双[1(氨基亚氨基甲基)腙]乙基]苯基]癸二酰胺四盐酸盐(CAS登录号164301-51-3))(图16A)。CNI-1493抑制多发性硬化症动物模型中的巨噬细胞活化，从而普遍改善这些小鼠的临床和病理结果(Martiney、Rajan等人，1998)。此外，向G93A小鼠施用CNI-1493延迟了疾病的发作并延长了小鼠的寿命(Dewil、dela Cruz等人，2007)。CNI-1493抑制促炎性细胞因子的产生，这些细胞因子属于伴随多种疾病的神经退行性过程的过多有害信号。特别地，CNI-1493抑制TNFα、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白1α和1β的表达(Bianchi、Bloom等人，1996)。显然，这种化合物调节逆运体的能力从未被分析过。我们首先测试了CNI-1493是否可以在Neuro2a处理细胞中增加VPS35水平，该细胞用此化合物以10μM的浓度处理48小时。然而，VPS35水平在CNI-1493处理的细胞中没有增加，而这种水平被化合物2a增加(图16B)。我们接下来测定了化合物2a在鼠类巨噬细胞样细胞系Raw 264.7中抑制LPS介导的TNFα表达的能力。我们依照Bianchi及其同事发表的实验程序，该程序描述了CNI-1493抑制这种细胞因子的产生的能力(Bianchi、Bloom等人，1996)。将细胞与CNI-1493(10μM)或化合物2a(10μM)一起孵育1小时，然后我们将LPS(100ng/ml)加入培养基中。我们接下来收集细胞的上清液(LPS刺激后4小时)用于评估TNFα水平。接受LPS的原始细胞有效地诱导了TNFα，而CNI-1493显著抑制了这种细胞因子的表达(图16C)。另一方面，接受化合物2a的原始细胞没有显示出任何TNFα的减少，表明2a与CNI-1493的分子途径不同。
在死后ASL样本中和来自熟悉的ALS成纤维细胞的iPSC衍生的MN中VPS35表达的丧 失
我们接下来研究了位于人SC的腹角的死后大脑α-MN中的VPS35(图17A)。VPS35的免疫反应性在源自ALS标本的MN中显著降低，证实了我们在G93A小鼠中进行的较早的观察(图17B)。探测VPS26的平行切片显示ALS样品中这种蛋白质的显著减少(图17C、D)。
我们接下来从携带三个SOD1基因变体(ALS 8：p.Asn65Ser；ALS 13：p.Leu144Phe；ALS 27：p.Asp97Asn)的fALS患者和三个年龄和性别匹配的健康志愿者生成iPSC系。对于OCT3/4、SOX2、NANOG、TRA1-60和SSEA4评估了标记培养物的有效的重编程(未显示)。根据已发表的方案，我们诱导iPSC系获得表达OLIG2+PAX6-的尾部神经上皮祖细胞的表型(Du，2015)。我们分化了这些祖细胞以获得OLIG2-ISLET1+细胞表型。我们对ISLET1+在细胞核总数中的百分比进行了评分，我们观察到在对照和ALS样品之间细胞分化的相似比率(对照：81.6％±9；ALS：81.8％±12)。使用免疫荧光和WB，我们在第33天观察到源自ALS患者的ISLET1+MN中VPS35水平的显著降低(图17E、F)。我们接下来选择一种对照细胞系(#8)和一种ALS细胞系(ALS 27)来施加我们的化合物2a。在我们建立OLIG2+PAX6-祖细胞后，我们开始在培养基中分化包括先导物2a(10μM，6天)的这些细胞。细胞对于ISLET1和VPS35进行标记，并通过共聚焦显微镜，我们对施用或未施用化合物2a的VPS35+斑点进行评分。ALS 27细胞显示相比对照较少的VPS35+斑点，尽管如果用先导物2a处理，对照和ALS都显著增加了这个数字(图17G)。我们接下来通过WB证实了化合物2a增加VPS35蛋白水平的能力(图17H)。这些结果表明2a增加了VPS35水平，因此可用于稳定人类逆运体复合物。
结论
逆运体复合物在真核生物中高度保守，它与包括PD和AD的多种神经退行性疾病有关，但从未在ALS中进行过研究。使用G93A转基因小鼠，我们观察到ALS运动神经元中的CRC蛋白水平显著减少。有趣的是，这种减少发生在任何疾病迹象出现之前，尤其是在运动神经元退化之前。对来自ALS患者的死后SC进行的平行实验进一步表明在腹角的真实的运动神经元中VPS35和VPS26水平的降低。这些结果表明，逆运体失败可以预测这些细胞的退化，因此促进逆运体稳定的策略可以在ALS中起到神经保护作用。化合物2a能够显著提高VPS35水平，从而提高逆运体的功能性。这种化合物在体外和体内挽救了高尔基体碎片化，最重要的是，在接受G93A质粒的Neuro2a细胞系中降低了细胞死亡率。在我们向G93A小鼠注射化合物2a的临床前实验中，我们观察到，通过在体内促进逆运体功能性，我们能够减少MN变性、髓鞘脱失和外周纤维损失。因此，接受化合物2a的G93A小鼠显示出增加的运动性能。此外，运动性能的增加也反映在我们在MN中评分的VPS35和VPS26的水平增加以及两种逆运体货物(即CI-MPR和分拣蛋白)的水平增加上。我们还观察到用化合物2a处理的G93A脊髓中成熟CTSD的显著增加。CTSD和可能的其他溶酶体酶的普遍增加减少了多泛素化蛋白质的积累，这种积累是ALS的病理标志。有趣的是，我们还在这些小鼠中观察到聚集的SOD1减少。这些发现为ALS的治疗开辟了一条新途径。
合成方法
通用程序。在Bruker Avance 400MHz仪器上，以CDCl3、CD3OD或D2O作为溶剂，在400MHz记录1H NMR谱图。以CDCl3、CD3OD或D2O作为溶剂，在101MHz记录13C NMR谱图。耦合常数以赫兹为单位给出，并且四舍五入到最接近的0.1Hz。利用配备了Acquity UPLCTM HSST3色谱柱(2.1mm x 50mm，1.8μm)和SQD检测器的Waters AcquityTM超高效液相色谱系统(Ultra performance LC)收集LC-MS数据。纯化或者通过快速色谱法在硅胶(粒度60μm，230-400目)上、在Kieselgel上进行，或者通过BiotageTM快速色谱仪(Biotage色谱柱Si-25-M(150x 25mm；硅胶(40-63μm)，流速25mL/分钟)进行，或者通过BiotageTM C18反向色谱仪(Biotage色谱柱C18HS(150x 25mm；KP-C18-HS(35-70μm)，流速25mL/分钟)进行。一些最终化合物是使用Waters X-Bridge色谱柱(19mm x 15.0cm，5μm)，通过C18反相半制备型HPLC纯化的。利用Stuart Scientific SMP3熔点仪确定熔点。根据标准程序蒸馏并干燥溶剂，并且需要无水条件的反应在氮气或氩气氛下进行。
取代的间苯二甲酸，还原成醇，通用程序A(8c、8g-j、8p)。在氮气氛下剧烈搅拌取代的间苯二甲酸(2.4-3.3mmol，1eq.)在无水THF(≈1mL/mmol)中的悬浮液并冷却至0℃。1MBH3在THF中的溶液(9.6-13.2mL，4eqs.)在1小时内逐滴加入。使反应混合物缓慢升温至室温，并且再搅拌48小时。向反应混合物中逐滴加入MeOH(7-10mL)，并且在减压下蒸发溶剂。重复MeOH的加入和蒸发(7-10mL x 3次)。然后，在EtOAc(40mL)中溶解粗产物，用饱和NaHCO3(2x 20mL)和盐水(brine)(10mL)清洗。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。所得固态通过快速色谱法在硅胶上纯化(洗脱液混合物：正己烷/EtOAc)，得到对应的纯的取代的1,3-苯二甲醇。
取代的1,3-苯二甲醇，氧化成醛，通用程序B(7c、7g-j、7k-p)。在剧烈搅拌下将二氧化锰(2.5-10mmol，5eqs.)加入取代的1,3-苯二甲醇(0.5-2mmol，1eq.)的氯仿(≈5mL/mmol)溶液中，并将反应混合物加热回流。在回流/搅拌过夜后，将反应混合物冷却至室温，并且通过硅藻土(Celite)垫过滤。垫用CH2Cl2(40mL)彻底清洗，真空浓缩合并的有机相，残留物通过快速色谱法在硅胶上纯化(洗脱液混合物：正己烷/EtOAc)，得到对应的纯的取代的间苯二甲醛。
取代的间苯二甲醛，与氨基胍缩合，通用程序C(2a-z)。将氨基胍盐酸盐(1-2mmol，1eq.)和1N HCl水溶液(3-5滴，催化作用)依次加入温热的、剧烈搅拌的取代的间苯二甲醛(0.5-1mmol，1eq.)在绝对EtOH(≈10mL/mmol)中的溶液。将反应混合物回流2-8小时，并用TLC监测(8:2CH2Cl2:MeOH并加入数滴AcOH)。然后将反应混合物冷却至室温，过滤固体产物，用冷的EtOH(10mL)、Et2O(10mL)清洗，并在真空中干燥以生成对应的纯的作为二盐酸盐的N-未取代的1,3-双-氨基胍基苯二甲腙(1,3-bis-amino guanidine phenyl hydrazine)。
取代的间苯二甲醛，与N-取代的氨基胍缩合，通用程序D(2a-z)。将N-取代的氨基胍盐(0.6-1.8mmol，1eq.)依次加入温热的、剧烈搅拌的取代的间苯二甲醛(0.3-0.9mmol，1eq.)在绝对EtOH(≈7.5mL/mmol)中的溶液。将反应混合物回流8小时，并用TLC监测(8:2CH2Cl2:MeOH并加入数滴AcOH)。然后将反应混合物冷却至室温，过滤固体产物，用冷的EtOH(10mL)、Et2O(10mL)清洗，并在真空中干燥以生成对应的纯的作为二氢卤酸盐的N-取代的1,3-双-氨基胍基苯二甲腙(在一些情况下，需要制备型HPLC分离)。
1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2a)。依照通用程序C的实验方案，以间苯二甲醛(134mg，1mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(221mg，2mmol，1eq.)在绝对乙醇(10mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(280mg，0.88mmol，产率88％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.26(bs,2H,NH),8.32(s,1H,H2),8.22(s,2H,H1’,H3’),8.15-7.58(bs,6H,NH),7.96(d,J＝7.6Hz,2H,H4),7.53(t,J＝7.6Hz,1H,H5)。13C_NMR(100MHz,D2O):δ(ppm)154.7,147.3,133.2,129.2,126.6。MS(ESI+):m/z 247.30[M+H+]。计算的MS，C10H14N8:246.28。
2-溴-1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2b)。依照通用程序C的实验方案，以2-溴-间苯二甲醛(197mg，0.93mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(205mg，1.86mmol，1eq.)在绝对乙醇(9mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(280mg，0.88mmol，产率88％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.22(bs,2H,NH),8.65(s,2H,H1’,H3’),8.38(d,J＝7.7Hz,2H,H4),8.30-7.60(bs,6H,NH),7.51(t,J＝7.7Hz,1H,H5)。13C_NMR(100MHz,D2O):δ(ppm)155.6,146.7,132.9,130.0,126.9。MS(ESI+):m/z 325.29和327.29[M+H+]。计算的MS，C10H13BrN8:324.18和326.18。
1,3-双-(羟甲基)-4-溴苯(8c)。依照通用程序A的实验方案，以4-溴代间苯二甲酸(590mg，2.41mmol，1.0eq.)和THF中的1M BH3(10mL，10.00mmol，≈4eqs.)在THF(2.5mL)中制备标题化合物(455mg，2.10mmol，产率86％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)7.39(m,3H,H2,H5,H6),5.39(t,J＝5.6Hz,2H,OH),4.52(d,J 5.6Hz,4H,H1’,H3’)。MS(ESI+):m/z218.12[M+H+]。计算的MS，C8H9BrO2:217.04。
4-溴代间苯二甲醛(7c)。依照通用程序B的实验方案，以8c(128mg，0.59mmol，1.0eq.)和二氧化锰(257mg，2.95mmol，5eqs.)在氯仿(3mL)中制备标题化合物(108mg，0.51mmol，产率87％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)10.40(s,1H,H1’),10.06(s,1H,H3’),8.42(d,J＝2.09Hz,1H,H2),7.98(dd,J＝2.09Hz,J＝7.88Hz,1H,H6),7.72(d,J＝7.88Hz,1H,H5)。MS(ESI+):m/z 214.16[M+H+]。计算的MS，C8H5BrO2:213.01。
4-溴-1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2c)。依照通用程序C的实验方案，以4-溴-间苯二甲醛(108mg，0.51mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(112mg，1.02mmol，1eq.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(178mg，0.44mmol，产率88％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.40(bs,2H,NH),8.58(d,J＝2.0Hz,1H,H2),8.54(s,1H,H1’),8.20(s,1H,H3’),8.20-7.60(bs,6H,NH),7.98(dd,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,H6),7.78(d,J＝8.4Hz,1H,H5)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)157.0,156.8,146.3,145.8,134.8,134.7,133.8,131.1,128.5,126.5。MS(ESI+):m/z 315.33和317.33[M+H+]。计算的MS，C10H13BrN8:324.18和326.18。
1-羟基-2,4-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2d)。依照通用程序C的实验方案，以7d(132mg，0.87mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(193mg，1.75mmol，1eq.)在绝对乙醇(8mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(224mg，0.67mmol，产率77％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.05(bs,2H,NH),10.95(bs,1H,OH),8.52(s,1H,H,H1’),8.48(d,J＝1.8Hz,1H,H2),8.12(s,1H,H3’),8.20-7.40(bs,6H,NH),7.95(dd,J＝8.6Hz,J＝1.8Hz,1H,H6),7.05(d,J＝8.6Hz,1H,H5)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)158.8,155.7,155.4,148.4,147.4,131.6,129.4,126.1,119.3,117.7。MS(ESI+):m/z 263.37[M+H+]。计算的MS，C10H14N8O:262.28。
4-甲氧基间苯二甲醛(7e)。将MeI(0.13mL，2mmol，1eq.)在氮气氛下加入4-羟基间苯二甲醛7d(150mg，1mmol，1eq.)和K2CO3(420mg，3mmol，1.5eqs.)在干燥DMF(5mL)中的搅拌的混合物中。反应混合物在室温下搅拌24小时，然后在减压下去除溶剂。在EtOAc(30mL)中溶解粗产物，用5％NaOH水溶液(3x 20mL)和盐水(10mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。获得作为白色固体的4-甲氧基间苯二甲醛7e(105mg，0.60mmol，产率60％)，纯度足够，无需进一步纯化即可使用。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.50(s,1H,H1’),10.01(s,1H,H3’),8.35(d,J＝2.0Hz,1H,H2),8.12(dd,J＝2.0Hz,J＝9.1Hz,1H,H6),7.15(d,J＝9.1Hz,1H,H5),4.00(s,3H,OMe)。MS(ESI+):m/z 179.21[M+H+]。计算的MS，C9H8NO3:178.17。
1-甲氧基-2,4-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2e)。依照通用程序C的实验方案，以4-甲氧基间苯二甲醛(75mg，0.46mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(101mg，0.92mmol，1eq.)在绝对乙醇(4.5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(126mg，0.36mmol，产率79％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.12(bs,2H,NH),8.51(s,1H,H1’),8.49(s,1H,H2),8.19(s,1H,H3’),8.20-7.40(m,6H,NH),8.00(d,J＝6.6Hz,1H,H6),7.12(d,J＝6.6Hz,1H,H5),3.92(s,3H,OMe)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)160.1,156.9,147.2,142.7,132.2,127.4,127.0,123.0,114.2,56.2。MS(ESI+):m/z 277.44[M+H+]。计算的MS，C11H16N8O:276.31。
4-正丁氧基间苯二甲醛(7f)。正丁基溴(0.22mL，2mmol，1eq.)在氮气氛下加入7d(150mg，1mmol，1eq.)和K2CO3(420mg，3mmol，1.5eqs.)在干燥DMF(5mL)中的搅拌的混合物中。将反应混合物加热至85℃并搅拌24小时，然后在室温下冷却。在减压下去除溶剂后，在EtOAc(30mL)中溶解粗产物，用5％NaOH水溶液(3x 20mL)和盐水(10mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。获得作为白色固体的4-正丁氧基间苯二甲醛7f(155mg，0.75mmol，产率75％)，纯度足够，无需进一步纯化即可使用。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.50(s,1H,H’),10.00(s,1H,H3’),8.35(d,J＝2.0Hz,1H,H2),8.12(dd,J＝2.0Hz,J＝9.1Hz,1H,H6),7.15(d,J＝9.1Hz,1H,H5),4.23(t,J＝2.4Hz,2H,H4’),1.91(m,2H,H4”),1.56(m,2H,H4”’),1.04(t,J＝7.8Hz,3H,H4””)。MS(ESI+):m/z 221.35[M+H+]。计算的MS，C12H14NO3:220.23。
1-正丁氧基-2,4-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2f)。依照通用程序C的实验方案，以7f(110mg，0.53mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(118mg，1.06mmol，1eq.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(166mg，0.42mmol，产率80％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.12(bs,2H,NH),8.51(s,2H,H1’,H1),8.16(s,1H,H3’),8.20-7.40(bs,6H,NH),8.00(d,J＝8.7Hz,1H,H6),7.12(d,J＝8.7Hz,1H,H5),4.15(t,J＝2.4Hz,2H,H4’),1.80(m,2H,H4”),1.52(m,2H,H4”’),0.99(t,J＝7.8Hz,3H,H4””)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)160.1,156.9,147.2,142.7,132.2,127.4,127.0,123.0,114.2,69.1,31.3,19.3,14.3。MS(ESI+):m/z 319.66[M+H+]。计算的MS，C14H22N8O:318.38。
1,3-双-(羟甲基)-5-甲基苯(8g)。依照通用程序A的实验方案，以5-甲基间苯二甲酸(600mg，3.33mmol，1.0eq.)和THF中的1M BH3(13.3mL，13.3mmol，4eqs.)在THF(3mL)中制备标题化合物(410mg，2.70mmol，产率81％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.96(s,1H,H2),6.80(s,2H,H4),4.62(s,4H,H1’,H3’),3.81(s,3H,Me),2.11(s,2H,OH)。MS(ESI+):m/z153.21[M+H+]。计算的MS，C9H12O2:152.19。
5-甲基间苯二甲醛(7g)。依照通用程序B的实验方案，以8g(200mg，1.32mmol，1.0eq.)和二氧化锰(575mg，6.60mmol，5eqs.)在氯仿(6.5mL)中制备标题化合物(151mg，1.02mmol，产率77％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.15(s,2H,CHO),8.25(s,1H,H2),8.00(s,2H,H4),2.53(s,3H,Me)。MS(ESI+):m/z 149.29[M+H+]。计算的MS，C9H8O2:148.16。
5-甲基-1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2g)。依照通用程序C的实验方案，以7g(104mg，0.70mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(155mg，1.40mmol，1eq.)在绝对乙醇(7mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(179mg，0.54mmol，产率77％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.25(bs,2H,NH),8.21(s,2H,H1’,H3’),8.10(s,1H,H2),8.00-7.50(bs,6H,NH),7.82(s,2H,H4),2.41(s,3H,Me)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)156.9,147.4,139.9,135.2,130.9,125.5,21.4。MS(ESI+):m/z 261.45[M+H+]。计算的MS，C11H16N8:260.28。
1,3-双-(羟甲基)-5-溴苯(8h)。依照通用程序A的实验方案，以5-溴代间苯二甲isophthalic酸(610mg，2.49mmol，1.0eq.)和THF中的1M BH3(10mL，10mmol，≈4eqs.)在THF(2.5mL)中制备标题化合物(475mg，2.19mmol，产率88％)。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)7.43(s,2H,H4),7.28(s,1H,H2),4.67(s,4H,H1’,H3’),1.79(s,2H,OH)。MS(ESI+):m/z 217.20和219.20[M+H+]。计算的MS，C8H9BrO2:216.15和218.15。
5-溴代间苯二甲醛(7h)。依照通用程序B的实验方案，以8h(128mg，0.59mmol，1.0eq.)和二氧化锰(257mg，2.95mmol，5eqs.)在氯仿(3mL)中制备标题化合物(97mg，0.45mmol，产率76％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.06(s,2H,CHO),8.30(t,J＝1.4Hz,1H,H2),8.26(d,J＝1.4Hz,2H,H4)。MS(ESI+):m/z 213.24和215.24[M+H+]。计算的MS，C8H5BrO2:212.12和214.12。
5-溴-1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2h)。依照通用程序C的实验方案，以7h(75mg，0.35mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(78mg，0.70mmol，1eq.)在绝对乙醇(3.5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(133mg，0.33mmol，产率91％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.31(bs,2H,NH),8.27(d,J＝1.2Hz,2H,H4),8.22(t,J＝1.2Hz,1H,H2),8.17(s,2H,H1’,H3’),8.20-7.60(bs,6H,NH)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)156.9,145.8,137.5,132.0,127.8,124.1。MS(ESI+):m/z 327.45和329.45[M+H+]。计算的MS，C10H13BrN8:324.25和326.25。
3,5-双-(羟甲基)-1-甲氧基苯(8i)。依照通用程序A的实验方案，以5-甲氧基间苯二甲酸(550mg，2.80mmol，1.0eq.)和THF中的1M BH3(11.2mL，11.2mmol，4eqs.)在THF(2.8mL)中制备标题化合物(377mg，2.24mmol，产率80％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.96(s,1H,H2),6.80(s,2H,H4),4.62(s,4H,H1’,H3’),3.81(s,3H,Me),2.11(s,2H,OH)。MS(ESI+):m/z 169.21[M+H+]。计算的MS，C9H12O3:168.19。
5-甲氧基间苯二甲醛(7i)。依照通用程序B的实验方案，以8i(330mg，1.97mmol，1.0eq.)和二氧化锰(825mg，9.95mmol，5eqs.)在氯仿(10mL)中制备标题化合物(297mg，1.81mmol，产率92％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.30(s,2H,H1’,H3’),7.96(s,1H,H2),7.61(s,2H,H4),3.99(s,3H,Me)。MS(ESI+):m/z 165.29[M+H+]。计算的MS，C9H8O3:164.16。
1-甲氧基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2i)。依照通用程序C的实验方案，以7i(93mg，0.57mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(125mg，1.14mmol，1eq.)在绝对乙醇(6mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(161mg，0.46mmol，产率81％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.26(bs,2H,NH),8.32(s,1H,H2),8.22(s,2H,H1’,H3’),8.15-7.58(bs,6H,NH),7.96(d,J＝7.6Hz,2H,H4),7.53(t,J＝7.6Hz,1H,H5)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)160.3,155.9,146.3,135.7,120.6,114.7,56.2。MS(ESI+):m/z277.47[M+H+]。计算的MS，C11H16N8O:276.30。
3,5-双-(羟甲基)-1-硝基苯(8j)。依照通用程序A的实验方案，以5-硝基间苯二甲酸(700mg，3.32mmol，1.0eq.)和THF中的1M BH3(13.2mL，13.2mmol，4eqs.)在THF(3mL)中制备标题化合物(504mg，2.75mmol，产率83％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.16(s,2H,H4),7.72(s,1H,H2),4.83(s,4H,H1’,H3’)。MS(ESI+):m/z 184.24[M+H+]。计算的MS，C8H9NO4:183.17。
5-硝基间苯二甲醛(7j)。依照通用程序B的实验方案，以8j(123mg，0.67mmol，1.0eq.)和二氧化锰(291mg，3.395mmol，5eqs.)在氯仿(4mL)中制备标题化合物(94mg，0.53mmol，产率78％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.21(s,2H,H1’,H3’),8.96(s,2H,H4),8.72(s,1H,H2)。MS(ESI+):m/z 180.29[M+H+]。计算的MS，C8H5NO4:179.14。
1-硝基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2j)。依照通用程序C的实验方案，以7j(94mg，0.53mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(117mg，1.06mmol，1eq.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(154mg，0.42mmol，产率80％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.44(bs,2H,NH),8.80(d,J＝1.6Hz,2H,H4),8.75(t,J＝1.6Hz,1H,H2),8.34(s,2H,H1’,H3’),8.25-7.75(bs,6H,NH)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)156.0,149.4,144.5,136.3,132.7,123.2。MS(ESI+):m/z 292.47[M+H+]。计算的MS，C10H13N9O2:291.29。
1,3-双-(羟甲基)-5-苯基苯(8k)。在室温、氮气氛及剧烈搅拌下将2M Na2CO3水溶液(1.86mL，3.72mmol，3eqs.)加入8h(270mg，1.24mmol，1eq.)、苯基硼酸(177mg，1.45mmol，1.2eqs.)和Pd(PPh3)4(143mg，0.124mmol，0.1eqs.)在1,4-二氧六环(8mL)中的混合物中。混合物加热回流并搅拌6小时。在冷却至室温后，然后用EtOAc(40mL)稀释反应混合物，用饱和NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(15mL)清洗。在减压下浓缩有机层，粗产物通过快速色谱纯化(洗脱液：75:25正己烷/EtOAc)以产生作为白色固体的纯的1,3-双-(羟甲基)-5-苯基苯8k(220mg，1.02mmol，产率86％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)7.62(d,J＝7.2Hz,2H,H2”),7.54(s,2H,H4),7.46(t,J＝7.2Hz,2H,H3”),7.38(m,2H,H2,H4”),4.79(s,4H,H1’,H3’),1.86(bs,2H,OH)。MS(ESI+):m/z 215.43[M+H+]。计算的MS，C14H14O2:214.26。
5-苯基间苯二甲醛(7k)。依照通用程序B的实验方案，以8k(170mg，0.79mmol，1.0eq.)和二氧化锰(343mg，3.95mmol，5eqs.)在氯仿(4mL)中制备标题化合物(135mg，0.64mmol，产率81％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.21(s,2H,H1’,H3’),8.39(dd,J＝1.5Hz,2H,H4),8.37(t,J＝1.5Hz,1H,H2),7.71(dd,J＝8.6Hz,J＝1.5Hz,2H,H2”),7.54(dt,J＝8.6Hz,J＝7.3Hz,2H,H3”),7.48(dt,J＝7.3Hz,J＝1.5Hz,1H,H4”)。MS(ESI+):m/z211.31[M+H+]。计算的MS，C14H10O2:210.23。
5-苯基-1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2k)。依照通用程序C的实验方案，以7k(127mg，0.61mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(134mg，1.22mmol，1eq.)在绝对乙醇(6mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(190mg，0.48mmol，产率79％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.35(bs,2H,NH),8.30-8.25(m,5H,H2,H4,H1’,H3’),8.20-7.60(bs,6H,NH),7.83(d,J＝8.4Hz,2H,H2”),7.53(t,J＝8.4Hz,2H,H3”),7.44(t,J＝8.4Hz,1H,H4”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)156.0,146.4,1411.7,139.3,135.1,129.4,128.5,127.5,126.4。MS(ESI+):m/z 323.53[M+H+]。计算的MS，C16H18N8:322.38。
3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-硝基苯(10j)。在室温、搅拌下将1H-咪唑(500mg，7.35mmol，1.5eqs.)和8j(450mg，2.45mmol，1eq.)溶解于CH2Cl2(12mL)中。然后将溶液在0℃下冷却，并以单一份量加入叔丁基二甲基氯硅烷(930mg，6.12mmol，1.25eq.)。反应混合物缓慢升温至室温，并且再搅拌3小时。然后用CH2Cl2(15mL)稀释反应混合物，用5％柠檬酸水溶液(15mL)、5％NaOH水溶液(15mL)和盐水(15mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。获得作为黄色油的粗3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-硝基苯10j，不经过进一步纯化地用于接下来的反应步骤。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.00(s,2H,H4),7.62(s,1H,H2),4.81(s,4H,H1’,H3’),0.98(s,18H,t-Bu),0.1(s,12H,Me)。MS(ESI+):m/z 412.84[M+H+]。计算的MS，C20H37Si2NO4:411.69。
3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-氨基苯(11)。将10％Pd/C(80mg，催化作用)加入10j(797mg，1.93mmol，1eq.)在绝对EtOH(10mL)中的溶液，并在室温、氢气氛下剧烈搅拌反应混合物24小时。然后通过硅藻土路径过滤反应混合物，使用MeOH(50mL)重复清洗。在减压下浓缩之后，粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化(洗脱液混合物：纯CH2Cl2至95:5CH2Cl2/EtOAc)，得到作为浅黄色油的纯的3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-氨基苯11(591mg，1.559mmol，两步产率78％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.68(s,1H,H2),6.59(s,2H,H4),4.65(s,4H,H1’,H3’),4.00(bs,2H,NH),0.98(s,18H,t-Bu),0.1(s,12H,Me)。MS(ESI+):m/z 382.82[M+H+]。计算的MS，C20H39Si2NO2:381.70。
3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-乙酰胺基苯(10l)。在搅拌下，将TEA(0.55mL，4mmol，≈5eqs.)和11(300mg，0.79mmol，1eq.)溶解于CH2Cl2(8mL)。然后，加入乙酸酐(0.22mL，2.36mmol，3eqs.)和二甲基氨基吡啶(刮刀尖端，催化作用)，并在室温下将溶液再搅拌2小时。在用CH2Cl2(15mL)稀释后，溶液用5％柠檬酸水溶液(10mL)、饱和NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。获得作为粗黄色油的3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-乙酰胺苯10l，原样用于接下来的反应步骤。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)7.33(s,2H,H4),7.28(bs,1H,NH),7.08(s,1H,H2),4.74(s,4H,H1’,H3’),2.22(s,3H,CO-Me),0.98(s,18H,t-Bu),0.1(s,12H,Si-Me)。MS(ESI+):m/z 446.88[M+Na+]。计算的MS，C22H41Si2NO3:423.74。
3,5-双-(羟甲基)-1-乙酰胺基苯(8l)。在氮气氛下将化合物10l(350mg，理论上0.79mmol，1eq.)溶解于干燥MeOH(8mL)中。将溶液在0℃下冷却，并在搅拌下加入乙酰氯(30μL，0.39mmol，≈0.5eqs.)。反应混合物在0℃下再搅拌30分钟。然后在减压下去除溶剂，将残留物在丙酮(10mL)中研磨，并且过滤。固体用冷的丙酮(3x 8mL)清洗，以产生作为白色固体的纯的3,5-双-(羟甲基)-1-乙酰胺基苯8l(143mg，0.67mmol，两步产率84％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.92(s,1H,NH),7.45(s,2H,H4),6.90(s,1H,H2),5.18(bs,2H,OH),4.41(s,4H,H1’,H3’),2.00(s,3H,CO-Me)。MS(ESI+):m/z 196.31[M+H+]。计算的MS，C10H13NO3:195.22。
5-乙酰胺基间苯二甲醛(7l)。依照通用程序B的实验方案，以8l(120mg，0.62mmol，1.0eq.)和二氧化锰(268mg，3.10mmol，5eqs.)在氯仿(10mL)中制备标题化合物(104mg，0.54mmol，产率88％)。1H_NMR(400MHz,CD3CN):δ(ppm)10.01(s,2H,H1’,H3’),8.65(bs,1H,NH),8.72(s,2H,H4),8.02(s,1H,H2),2.09(s,3H,CO-Me)。MS(ESI+):m/z 192.23[M+H+]。计算的MS，C10H9NO3:191.19。
1-乙酰胺基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2l)。依照通用程序C的实验方案，以7l(97mg，0.51mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(113mg，1.02mmol，1eq.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(163mg，0.43mmol，产率85％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.18(bs,2H,NH),10.22(s,1H,NH),8.19(s,2H,H1’,H3’),8.17(s,1H,H2),8.00-7.75(m,6H,NH),7.94(s,2H,H4),2.08(s,3H,CO-Me)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)170.2,156.8,147.6,141.2,135.6,122.1,121.4,24.4。MS(ESI+):m/z 326.40[M+Na+]。计算的MS，C12H17N9O:303.33。
3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-对甲基苯甲酰胺基苯(10m)。在0℃、搅拌下，将TEA(0.23mL，1.63mmol，2eq.)和11(310mg，0.82mmol，1eq.)溶解于CH2Cl2(8mL)。然后，加入4-甲基苯甲酰氯(0.14mL，1.06mmol，1.3eqs.)，并在0℃下将溶液再搅拌1小时。在用MeOH(1mL)终止反应并用CH2Cl2(15mL)稀释后，溶液用5％柠檬酸水溶液(10mL)、饱和NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化(洗脱液混合物：纯CH2Cl2至95:5CH2Cl2/EtOAc)，得到作为淡黄色油的纯的3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-氨基(对甲基甲酰基)苯10m(265mg，0.53mmol，产率67％)。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)9.29(bs,1H,NH),7.75(d,J＝8.2Hz,2H,H7)7.59(s,2H,H2),7.18(d,J＝8.2Hz,2H,H8),7.01(s,1H,H1),4.64(s,4H,H3),2.27(s,3H,H6),0.82(s,18H,H5),0.00(s,12H,H4)。MS(ESI+):m/z523.06[M+Na+]。计算的MS，C28H45Si2NO3:499.84。
3,5-双-(羟甲基)-1-对甲基苯甲酰胺基苯(8m)。在氮气氛下将化合物10m(260mg，0.52mmol，1eq)溶解于干燥MeOH(10mL)中。将溶液在0℃下冷却，并在搅拌下加入乙酰氯(20μL，0.26mmol，≈0.5eqs.)。反应混合物在0℃下再搅拌30分钟。然后在减压下去除溶剂，以产生粗的3,5-双-(羟甲基)-1-对甲基苯甲酰胺基苯8m(140mg)，不经过进一步纯化地用于接下来的步骤。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)9.40(bs,1H,NH),7.95(d,J＝8.2Hz,2H,H2”)7.75(s,2H,H4),7.33(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),7.12(s,1H,H2),4.64(s,4H,H1’,H3’),2.42(s,3H,H4”)。MS(ESI+):m/z 272.48[M+H+]。计算的MS，C16H17NO3:271.32。
5-对甲基苯甲酰胺基间苯二甲醛(7m)。依照通用程序B的实验方案，以8m(140mg，0.52mmol，1.0eq.)和二氧化锰(340mg，5.20mmol，10eqs.)在氯仿(10mL)中制备标题化合物(113mg，0.42mmol，产率83％)。1H_NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)10.18(s,2H,H1’,H3’),9.96(bs,1H,NH),8.73(d,J＝4.1Hz,2H,H4),8.22(t,J＝4.1Hz,1H,H2),8.00(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.38(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),2.44(s,3H,H4”)。MS(ESI+):m/z 268.38[M+H+]。计算的MS，C16H13NO3:267.29。
1-对甲基苯甲酰胺基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2m)。依照通用程序C的实验方案，以7m(47mg，0.18mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(41mg，0.37mmol，1eq.)在绝对乙醇(4mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(69mg，0.15mmol，产率83％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.15(bs,2H,NH),10.43(bs,1H,NH),8.23(s,2H,H1’,H3’),8.20(s,1H,H2),8.17(s,2H,H4),7.95(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.83(bs,6H,NH),7.37(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),2.41(s,3H,H4”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)165.9,155.9,146.6,142.4,140.3,134.8,131.9,129.5,128.2,122.9,121.6,21.5。MS(ESI+):m/z 380.50[M+H+]。计算的MS，C18H21N9O:379.43。
3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-甲磺酰胺基苯(10n)。在0℃、搅拌下，将吡啶(0.72mL，0.87mmol，2eqs.)和11(166mg，0.43mmol，1eq.)溶解于CH2Cl2(4mL)。然后，加入4-甲磺酰氯(50μL，0.65mmol，1.5eqs.)，在0℃下将溶液搅拌1小时，并在室温下搅拌15小时。在用CH2Cl2(15mL)稀释后，溶液用水(10mL)和盐水(10mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。粗产物在硅胶上迅速洗脱(洗脱液混合物：98:2CH2Cl2/EtOAc)，得作为淡黄色油的粗的3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-甲磺酰胺基苯10n(200mg)，其不经过进一步纯化地用于接下来的步骤。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)8.44(bs,1H,NH),7.12(s,2H,H4),7.01(s,1H,H2),4.64(s,4H,H1’,H3’),2.84(s,3H,SO2-Me),0.83(s,18H,t-Bu),0.00(s,12H,Si-Me)。MS(ESI+):m/z 460.94[M+H+]。计算的MS，C21H41Si2NO4S:459.80。
3,5-双-(羟甲基)-1-甲磺酰胺基苯(8n)。在氮气氛下将化合物10n(200mg，理论上0.43mmol，1eq.)溶解于干燥MeOH(8mL)中。将溶液在0℃下冷却，并在搅拌下加入乙酰氯(20μL，0.26mmol，≈0.7eqs.)。反应混合物在0℃下再搅拌30分钟。然后在减压下去除溶剂，以产生作为淡棕色固体的粗的3,5-双-(羟甲基)-1-甲磺酰胺基苯8n(100mg)，不经过进一步纯化地用于接下来的步骤。MS(ESI+):m/z 232.41[M+H+]。计算的MS，C9H13NO4S:231.27。
5-甲磺酰胺基间苯二甲醛(7n)。依照通用程序B的实验方案，以8n(100mg，理论上0.43mmol，1.0eq.)和二氧化锰(300mg，4.33mmol，≈10eqs.)在氯仿(6mL)中制备标题化合物(65mg，0.29mmol，三步产率68％)。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)10.02(s,2H,H1’,H3’),9.02(bs,1H,NH),8.09(s,1H,H2),8.01(s,2H,H4),3.01(s,3H,SO2-Me)。MS(ESI+):m/z228.30[M+H+]。计算的MS，C9H9NO4S:227.24。
1-甲磺酰胺基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2n)。依照通用程序C的实验方案，以7n(65mg，0.29mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(63mg，0.58mmol，1eq.)在绝对乙醇(3.5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(100mg，0.24mmol，产率83％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.25(bs,2H,NH),10.01(s,1H,NH),8.24(s,1H,H2),8.21(s,2H,H1’,H3’),7.86(bs,6H,NH),7.60(s,2H,H4),3.10(s,3H,SO2-Me)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)155.9,146.3,149.6,135.4,122.1,121.4,39.98。MS(ESI+):m/z340.50[M+H+]。计算的MS，C11H17N9O2S:339.37。
3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-对甲基苯磺酰胺基苯(10o)。在0℃、搅拌下，将吡啶(0.72mL，0.87mmol，2eqs.)和11(166mg，0.43mmol，1eq.)溶解于CH2Cl2(5mL)。然后，加入对甲基苯磺酰氯(125mg，0.65mmol，1.5eqs.)，在0℃下将溶液搅拌1小时，并在室温下搅拌6小时。在用CH2Cl2(15mL)稀释后，溶液用饱和NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)清洗。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化(洗脱液混合物：纯CH2Cl2至95:5CH2Cl2/EtOAc)，得到作为白色固体的纯的3,5-双-(叔丁基二甲基硅烷氧基甲基)-1-对甲基苯磺酰胺基苯10o(195mg，0.37mmol，产率86％)。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)8.87(bs,1H,NH),7.61(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.22(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),7.06(s,2H,H4),6.93(s,1H,H2),4.60(s,4H,H1’,H3’),2.28(s,3H,Ar-Me),0.85(s,18H,t-Bu),0.00(s,12H,Si-Me)。MS(ESI+):m/z 536.94[M+H+]。计算的MS，C27H45Si2NO4S:535.89。
3,5-双-(羟甲基)-1-对甲基苯磺酰胺基苯(8o)。在氮气氛下将化合物10o(195mg，0.36mmol，1eq.)溶解于干燥MeOH(8mL)中。将溶液在0℃下冷却，并在搅拌下加入乙酰氯(10μL，0.13mmol，≈0.4eqs.)。反应混合物在0℃下再搅拌2小时。然后在减压下去除溶剂，残留物在硅胶上层析(洗脱液混合物：7:3正己烷/EtOAc)以产生作为白色固体的纯的3,5-双-(羟甲基)-1-对甲基苯磺酰胺基苯8o(90mg，0.29mmol，产率81％)。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)8.72(bs,1H,NH),7.57(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.18(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),7.00(s,2H,H4),6.89(s,1H,H2),4.39(s,4H,H1’,H3’),4.03(s,2H,OH),2.22(s,3H,Me)。MS(ESI+):m/z 330.41[M+Na+]。计算的MS，C15H17NO4S:307.36。
5-对甲基苯磺酰胺基间苯二甲醛(7o)。依照通用程序B的实验方案，以8o(90mg，0.29mmol，1.0eq.)和二氧化锰(200mg，2.9mmol，10eqs.)在氯仿(6mL)中制备标题化合物(79mg，0.26mmol，三步产率90％)。1H_NMR(400MHz,丙酮-d6):δ(ppm)9.95(s,2H,H1’,H3’),8.02(s,1H,H2),7.90(s,2H,H4),7.63(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.22(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),2.22(s,3H,Me)。MS(ESI+):m/z 304.39[M+H+]。计算的MS，C15H13NO4S:303.33。
1-对甲基苯磺酰胺基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2o)。依照通用程序C的实验方案，以7o(64mg，0.21mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(46mg，0.42mmol，1eq.)在绝对乙醇(3mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(80mg，0.16mmol，产率76％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.15(bs,2H,NH),10.56(s,1H,NH),8.17(s,1H,H2),8.12(s,2H,H1’,H3’),7.82(bs,6H,NH),7.71(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.46(s,2H,H4),7.36(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),2.34(s,3H,Me)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)155.4,145.8,143.5,138.8,136.6,134.9,129.8,126.8,121.2,120.7,21.0。MS(ESI+):m/z416.56[M+H+]。计算的MS，C17H21N9O2S:415.47。
1,3,5-苯三甲酸单甲酯(9p)。将1.8M NaOH水溶液(9.1mL，16.4mmol，≈2eqs.)在室温下逐滴加入剧烈搅拌的1,3,5-苯三甲酸三甲酯(2.0g，8.0mmol，1eq.)在MeOH(64mL)中的悬浮液中。在室温下继续搅拌5小时，获得澄清的溶液。在减压下蒸发溶剂之后，加入水(25mL)并通过逐滴加入6N HCl水溶液将pH调整至2.0。所得的悬浮液用EtOAc(2x 25mL)萃取。在用水(2x 10mL)和盐水(2x 10mL)清洗后，将合并的有机层在减压下浓缩。粗的1,3,5-苯三甲酸单甲酯9p(1.5g)不经过进一步纯化地用于接下来的步骤。MS(ESI+):m/z 225.22[M+H+]。计算的MS，C10H8O6:224.17。
3,5-双-(羟甲基)-苯甲酸甲酯(8p)。依照通用程序A的实验方案，以9p(1.5mg，理论上6.7mmol，1.0eq.)和THF中的1M BH3(33mL，33mmol，≈5eqs.)在THF(3mL)中制备标题化合物(775mg，3.94mmol，两步产率54％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)7.80(s,2H,H4),7.49(s,1H,H2),4.58(s,4H,H1’,H3’),3.45(s,2H,OH)。MS(ESI+):m/z 197.27[M+H+]。计算的MS，C10H12O4:196.20。
5-甲氧羰基间苯二甲醛(7p)。依照通用程序B的实验方案，以8p(775mg，3.94mmol，1.0eq.)和二氧化锰(1.9g，19.5mmol，≈5eqs.)在氯仿(20mL)中制备标题化合物(645mg，3.35mmol，产率85％)。MS(ESI+):m/z 193.26[M+H+]。计算的MS，C10H8O4:192.17。
1-甲氧羰基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2p)。依照通用程序C的实验方案，以7p(78mg，0.41mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(90mg，0.81mmol，1eq.)在绝对乙醇(4mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(109mg，0.29mmol，产率71％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.30(bs,2H,NH),8.64(s,1H,H2),8.44(s,2H,H1’,H3’),8.30(s,2H,H4),7.91(bs,6H,NH),3.92(s,3H,OMe)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)166.1,156.0,145.7,135.1,131.5,130.7,130.0,53.0。MS(ESI+):m/z 305.33[M+H+]。计算的MS，C12H16N8O2:304.26。
5-羧基间苯二甲醛(12)。将2M NaOH水溶液(0.47mL，0.94mmol，1.05eqs)在室温下、剧烈搅拌下加入7p(174mg，0.90mmol，1eq.)在MeOH(10mL)中的悬浮液中。所得的悬浮液在室温下搅拌24小时。24小时之后，在减压下去除溶剂，粗的5-羧基间苯二甲醛(160mg)不经过进一步纯化地用于接下来的步骤。MS(ESI+):m/z 169.21[M+H+]。计算的MS，C9H6O4:168.14。
5-(N4-苯基哌嗪基)甲酰胺基间苯二甲醛(7q)。在氮气氛下，将HOBt(162mg，1.2mmol，1.25eqs.)和EDC(230mg，1.2mmol，1.25eqs.)在室温下、剧烈搅拌下依次加入粗12(160mg，理论上0.90mmol)在干燥CH2Cl2(10mL)中的悬浮液中。所得混合物在室温下搅拌15分钟，然后依次加入4-苯基1-哌嗪(195mg，1.2mmol，1.25eqs.)和TEA(0.28mL，1.8mmol，2eqs.)。所得溶液在室温下搅拌24小时，然后在减压下浓缩。残留物被EtOAc(20mL)吸收，用5％柠檬酸溶液(5mL)、饱和NaHCO3水溶液(5mL)和盐水(5mL)清洗。在Na2SO4上干燥之后，过滤合并的有机相并在减压下浓缩。在层析纯化(洗脱液混合物：4:6正己烷/AcOEt+1％TEA)之后获得纯的5-(N4-苯基哌嗪基)甲酰胺基间苯二甲醛7q(90mg，0.28mmol，两步产率30％)。1H NMR(400MHz,丙酮-d6):δ:10.15(s,2H,H1’,H3’),8.46(s,1H,H2),8.23(s,2H,H4),7.32(m,2H,H3”’),6.94(m,3H,H2”’,H4”’),3.99(bs,3H,H2”),3.61(bs,1H,H2”),3.30(bs,3H,H3”),3.18(bs,1H,H3”)。MS(ESI+):m/z 323.46[M+H+]。计算的MS，C19H18N2O3:322.36。
5-(N4-苯基哌嗪基)甲酰胺基-3,5-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(2q)。依照通用程序C的实验方案，以7q(90mg，0.28mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(62mg，0.56mmol，1eq.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(110mg，0.20mmol，产率72％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.32(bs,2H,NH),8.35(s,1H,H2),8.25(s,2H,H1’,H3’),8.09(s,2H,H4),7.85(bs,6H,NH),7.32(m,2H,H3”’),7.21(m,2H,H2”’),6.98(m,1H,H4”’),3.92(bs,1H,H2”),3.57(bs,1H,H2”),3.28(bs,1H,H3”),3.17(bs,1H,H3”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)168.5,156.0,145.7,137.3,134.9,129.7,128.2,127.4,121.2。MS(ESI+):m/z 435.63[M+H+]。计算的MS，C21H26N10O:434.58。
1,3,5-三-氨基胍基苯三甲腙三盐酸盐(2r)。依照通用程序C的实验方案，以1,3,5-苯三甲醛(50mg，0.31mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(105mg，0.94mmol，1eq.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(105mg，0.24mmol，产率78％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,D2O):δ(ppm)7.57(s,3H,H1’),7.30(s,3H,H2)。13C_NMR(100MHz,D2O):δ(ppm)154.5,146.3,133.4,127.6。MS(ESI+):m/z 331.53[M+H+]。计算的MS，C12H18N12:330.36。
N1-正丁基氨基胍氢碘酸盐(14t)。将S-甲基异硫代氨基脲二氢碘酸盐13(510mg，2.19mmol，1eq.)溶解于MeOH(6mL)中，并且在室温、搅拌下加入正丁胺(325μL，3.28mmol，1.5eqs.)。在72小时之后，反应混合物在减压下浓缩。获得作为红色油的粗的N1-正丁基氨基胍氢碘酸盐14t(565mg)，不经过进一步纯化地用于接下来的步骤。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.46(bs,1H,NH),7.25(bs,3H,NH),4.69(bs,2H,NH),3.13(s,2H,H1),1.48(m,2H,J＝7Hz,H2)1.28(m,4H,J＝7Hz,H3),0.92(m,3H,J＝7Hz,H4)。MS(ESI+):m/z 131.26[M+H+]。计算的MS，C5H14N4:130.19。
1,3-双-(N3-正丁基氨基)胍基苯二甲腙二氢碘酸盐(2t)。依照通用程序D的实验方案以及制备型HPLC分离(洗脱液混合物：纯水至纯CH3CN)，以间苯二甲醛(110mg，0.82mmol，1.0eq.)和14t(490mg，理论上1.90mmol，1.15eqs.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二氢碘酸盐的标题化合物(265mg，0.44mmol，产率53％，纯度≥95％，淡黄色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)11.44(bs,2H,NH),8.25(m,3H,H1’,H3’,H2),8.21-7.90(bs,4H,NH),8.03(d,J＝8.1Hz,2H,H4),7.57(t,J＝8Hz,1H,H5),3.37(m,4H,H6),1.54(m,4H,H7),1.35(m,4H,H8),0.94(t,J＝7.12Hz,6H,H9)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)154.4,146.5,134.5,129.6,127.5,41.3,31.1,19.7,14.1。MS(ESI+):m/z 359.69[M+H+]。计算的MS，C18H30N8:358.51。
N1-苄基氨基胍氢碘酸盐(14u)。将S-甲基异硫代氨基脲氢碘酸盐13(995mg，4.28mmol，1eq.)溶解于MeOH(8mL)中，并且在室温、搅拌下加入苄基胺(470μL，4.28mmol，1eq.)。在72小时之后，反应混合物在减压下浓缩。在用EtOH/二乙醚重结晶后，获得作为橙色固体的N1-苄基氨基胍氢碘酸盐14u(425mg，1.46mmol，产率34％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.69(bs,1H,NH),7.46-7.20(m,8H,NH,H2,H3,H4),4.76(s,2H,NH2),4.42(s,2H,H1’)。MS(ESI+):m/z 165.27[M+H+]。计算的MS，C8H12N4:164.21。
1,3-双-(N3-苄基氨基)胍基苯二甲腙二氢碘酸盐(2u)。依照通用程序D的实验方案以及制备型HPLC分离(洗脱液混合物：纯水至纯CH3CN)，以间苯二甲醛(50mg，0.37mmol，1.0eq.)和14u(250mg，0.86mmol，1.3eqs.)在绝对乙醇(5mL)中制备作为二氢碘酸盐的标题化合物(177mg，0.26mmol，产率70％，纯度≥95％，淡黄色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)11.60(bs,2H,NH),8.57(m,2H,H4),8.27(m,3H,H2,H1’,H3’),8.05(bs,4H,NH),7.55(t,J＝7.8Hz,1H,H5),7.35(m,10H,H2”,H3”,H4”),4.60(d,J＝5.4Hz,4H,H1”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)154.7,146.9,137.5,134.5,129.6,129.0,1128.0,127.7,127,5,44.5。MS(ESI+):m/z 449.69[M+Na+]。计算的MS，C24H26N8:426.53。
N1-吡咯烷基胍氢碘酸盐(14v)。将S-甲基异硫代氨基脲氢碘酸盐13(1.21g，5.21mmol，1eq.)溶解于MeOH(10mL)中，并且在室温、搅拌下加入吡咯烷(650μL，7.81mmol，1.5eqs.)。在72小时之后，反应混合物在减压下浓缩。通过用EtOAc(20mL)研磨、在减压下浓缩溶剂、用二乙醚(20mL)研磨、过滤并用二乙醚(3x 5mL)清洗，获得粗的N1-吡咯烷基胍氢碘酸盐14v。粗的14v(1.22g，粉色固体)原样用于接下来的反应步骤。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.74(bs,1H,NH),7.22(bs,3H,NH),4.78(bs,2H,NH2),3.30(t,4H,J＝6.4,H1),1.90(m,4H,J＝6.4,H2)。MS(ESI+):m/z 129.22[M+H+]。计算的MS，C5H12N4:128.18。
1,3-双-(N3-吡咯烷基)胍基苯二甲腙二氢碘酸盐(2v)。依照通用程序D的实验方案，以间苯二甲醛(40mg，0.30mmol，1.0eq.)和14v(168mg，0.66mmol，1.1eqs.)在绝对乙醇(3mL)中制备作为二氢碘酸盐的标题化合物(128mg，0.21mmol，产率70％，纯度≥95％，淡黄色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)11.31(bs,2H,NH),8.43(s,2H,H1’,H3’),8.28(s,1H,H2),8.06(d,J＝7.84Hz,2H,H4),7.97(bs,4H,NH),7.57(t,J＝7.84Hz,1H,H5),3.50(t,J＝6.4Hz,8H,H1”),2.00(t,J＝6.4Hz,8H,H2”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)152.3,147.1,134.5,129.8,129.7,127.4,48.1,25.1。MS(ESI+):m/z 355.58[M+H+]。计算的MS，C18H26N8:354.46。
1-对甲基苯甲酰胺基-3,5-双-(N3-正丁基氨基)胍基苯二甲腙二甲酸盐(2w)。依照通用程序D的实验方案以及制备型HPLC分离(洗脱液混合物：纯水至纯MeOH+0.3％甲酸)，以7m(110mg，0.42mmol，1.0eq.)和14t(254mg，0.98mmol，1.2eqs.)在绝对乙醇(7mL)中制备作为二甲酸盐的标题化合物(170mg，0.29mmol，产率69％，纯度≥95％，淡粉色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)10.32(bs,1H,NH),8.64(bs,2H,NH),8.31(s,2H,NH),8.13(s,2H,H1’,H3’),8.08(s,1H,H2),8.05(s,2H,H4),7.93(d,J＝8.2Hz,2H,H2”),7.83(bs,4H,NH),7.36(d,J＝8.2Hz,2H,H3”),3.24(bs,4H,H1”’),2.40(s,3H,H4”),1.53(m,4H,H2”’),1.36(m,4H,H3”’),0.92(t,J＝8.3Hz,6H,H4”’)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)166.2,165.9,144.9,142.3,140.1,132.1,129.4,128.2,122.1,121.8,40.4,31.3,21.5,19.9,14.1。MS(ESI+):m/z 492.70[M+H+]。计算的MS，C26H37N9O:491.64。
1,3-双-(N2N3-咪唑啉基)胍基苯二甲腙二氢溴酸盐(2x)。依照通用程序D的实验方案，以间苯二甲醛(70mg，0.52mmol，1.0eq.)和咪唑啉基氨基胍氢溴酸酸盐(198mg，1.10mmol，1.05eqs.)在绝对乙醇(3.5mL)中制备作为二氢溴酸盐的标题化合物(196mg，0.43mmol，产率82％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)12.42(bs,2H,NH),8.75(bs,4H,NH),8.27(s,2H,H1’,H3’),8.22(s,1H,H2),7.99(d,J＝7.79Hz,2H,H4),7.59(t,J＝7.79Hz,1H,H5),3.77(s,8H,H1”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)δ157.9,148.1,132.9,130.0,129.6,128.0,43.0。MS(ESI+):m/z 295.47[M+H+]。计算的MS，C14H18N8:294.35。
1,3-双-(N1-甲基-N2N3-咪唑啉基)胍基苯二甲腙二氢溴酸盐(2y)。依照通用程序D的实验方案，以间苯二甲醛(70mg，0.52mmol，1.0eq.)和N3-甲基咪唑啉基氨基胍氢溴酸酸盐(213mg，1.10mmol，1.05eqs.)在绝对乙醇(3.5mL)中制备作为二氢溴酸盐的标题化合物(205mg，0.42mmol，产率80％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6/D2O混合物):δ(ppm)8.38(s,1H,H2),8.19(s,2H,H1’,H3’),8.05(d,J＝7.75Hz,2H,H4),7.60(t,J＝7.75Hz,1H,H5),3.81(s,6H,N-Me),3.75(s,8H,H1”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)159.5,144.4,134.5,130.0,129.7,128.3,43.6,22.2。MS(ESI+):m/z 327.49[M+H+]。计算的MS，C16H22N8:326.41。
1,3-双-(N2N3-苯并咪唑啉基)胍基苯二甲腙二乙酸盐(2z)。在室温、搅拌下将N,N'-苯并咪唑基氨基胍(110mg，0.74mmol，1.05eqs.)加入间苯二甲醛(46mg，0.34mmol，1eq.)在绝对EtOH(5mL)中的溶液中。反应混合物加热回流2小时。在冷却至室温并过滤后，收集固体沉淀物，用水(2x 5mL)清洗并干燥，得到作为黄色固体的纯的1,3-双-N2N3-苯并咪唑基胍基苯二甲腙二乙酸盐2z(87mg，0.22mmol，产率66％)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)11.68(bs,4H,NH),8.36(s,1H,H2),8.15(s,2H,H1’,H3’),7.75(d,J＝7.7Hz,2H,H4),7.59(t,1H,J＝7.7Hz,H5),7.33(m,4H,H1”),7.05(m,4H,H2”)。13C_NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm)149.8,146.4,134.8,131.6,129.7,128.9,127.4,123.6,112.6。MS(ESI+):m/z395.55[M+H+]。计算的MS，C22H18N8:394.44。
参考例
1',3'-二甲基-1,3-双-氨基胍基苯二甲腙二盐酸盐(化合物(VIII))。依照通用程序C的实验方案，以1,3-二乙酰基苯(170mg，1.05mmol，1.0eq.)和氨基胍盐酸盐(232mg，2.10mmol，1eq.)在绝对乙醇(10mL)中制备作为二盐酸盐的标题化合物(274mg，0.73mmol，产率70％，纯度≥95％，白色固体)。1H_NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)11.40(bs,2H,NH),8.35(s,1H,H2),8.06(d,J＝9.2Hz,2H,H4),8.15-7.60(bs,6H,NH),7.50(t,J＝9.2Hz,1H,H5),2.41(s,6H,Me)。13C_NMR(100MHz,D2O):δ(ppm)155.3,152.7,136.0,128.6,127.6,124.0,13.3。MS(ESI+):m/z 275.45[M+H+]。计算的MS，C12H18N8:274.33。
生物学
细胞培养
白化小鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞维持在标准培养基(DMEM+2mM谷氨酰胺+10％胎牛血清(FBS))中。以1:3至1:8分割近汇合培养(70-80％)，即以4x10000个细胞每cm2接种并保持在5％CO2中；37℃。使用LTX转染试剂(Thermofisher)根据制造商的说明进行转染。使用以下质粒：pcDNA3.1(+)SOD1G93A、pCAGG GFP、p CMV-LacZ、CMV-VPS35、Sigma MissionshRNA:TRCN000011556(Sh56)、TRCN000011559(Sh59)、TRCN000011558(Sh58)、乱序。/>
根据制造商的建议，使用Cell Counting Kit-8(CCK8)存活试剂盒(96992-Sigma)在96孔板上进行细胞存活实验。在接受含量递增的化合物2a(1、10、50、100、200、500和1000μM)48小时后，在Neuro2a细胞上测试化合物2a的细胞毒性。
使用LDH-GloTM细胞毒性测定(Promega)在96孔板上运行LDH细胞毒性。简而言之，用编码pCMV-LacZ的质粒、pcDNA3.1(+)SOD1G93A与或不与VPS35短干扰质粒(Sh56)或化合物2a(10μM)一起转染Neuro2a细胞。48小时后，根据制造商的建议，将5μL上清液在LDH储存缓冲液(Tris-HCl 200mM，10％甘油，1％BSA，Sigma-Aldrich)中稀释100倍用于确定LDH。用2μL 10％Triton X-100(Sigma-Aldrich)裂解未处理的Neuro2a细胞，获得最大LDH释放对照。在每个实验中，我们计算了％细胞毒性＝(实验LDH释放-培养基背景)/(最大LDH释放对照-培养基背景)，并且我们测试了用200μM H2O2处理细胞的平行阳性对照。
放线菌酮(CHX)测定在接种于6孔板并与化合物2a(10μM)或溶媒一起孵育24小时的Neuro2a细胞上进行。我们接下来添加10μg/mL的CHX(Sigma)，并在0、2、4和8小时收集细胞用于VPS35水平的时间进程测定。
自噬测定是使用表达pHluorin-mKate2标记的人LC3质粒的稳定的Neuro2a细胞克隆完成的，细胞克隆是根据我们公开的方法(Mazzocchi，2016)生成的。转染后，通过400μg/mL G418二硫酸盐溶液(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)选择细胞，并通过有限稀释进一步克隆。通过流式细胞术(Cytoflex-S)评估候选细胞克隆，并选择克隆7B11。测定的质量控制是通过计算用巴佛洛霉素A1(200nM)和Torin-1(250nM)处理的Neuro2a 7B11细胞的Z-因子(>0.5)和SSMD(对于巴佛洛霉素A1>4.7，并且对于Torin<4.7)完成的(7个独立实验)。用化合物2a(0.1-100μM)处理Neuro2a 7B11细胞48小时，然后通过流式细胞术测量活细胞中pHfluorin的MFI水平。
在Neuro2a细胞中筛选氨基胍腙2a-2mm文库
Neuro2a细胞以100000个细胞/孔的浓度接种在12孔多孔板上。细胞与10μM的各个化合物(包括标准R55)一起孵育48小时。然后在PBS 1x中洗涤细胞，并在含有Tris-HCl10mM pH8、EDTA 1mM pH8、NaCl 100mM、NP40 1％和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)1X的缓冲液中裂解。使用细胞刮刀从各个孔中收集总裂解物，用BCA(BCA蛋白质测定，Thermofisher)定量。5μg在预制10％丙烯酰胺凝胶(Biorad)上分离。将蛋白质转移到PVDF膜(Millipore)上并使用以下抗体进行蛋白质印迹：山羊αVPS35(1:1000)、小鼠α-β肌动蛋白(1:10000)。通过化学发光检测试剂盒(PerkinElmer)获得蛋白质的检测。
免疫印迹
从灌注盐水的小鼠中解剖腰部脊髓，并在以下裂解缓冲液中快速匀浆：Tris-HCl10mM pH 8、EDTA pH 8 1mM、NaCl 100mM、NP40 1％以及蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)。使用紧密配合的玻璃Potter组织研磨机(1ml；Wheaton)获得蛋白质提取物，然后在20kHz(10次-1秒)的频率超声处理。来自细胞培养物的蛋白质裂解物是从接受PBS1x洗涤和随后的裂解缓冲液以及之后的超声处理的板中获得的。根据制造商的建议，通过BCA蛋白质测定试剂盒(Thermofisher)测量蛋白质浓度。将10μg蛋白质提取物加载到用于PAGE的10％Mini-PROTEAN TGX Stain-Free预制凝胶(Bio-Rad)。凝胶电泳在100V下进行2小时。根据制造商的说明(Millipore)，将凝胶转移到PVDF膜上。在接受下列一抗并在4℃摇床上过夜之前，用Tris缓冲的盐水中的5％BSA加0.1％Tween-20(TBS-T)封闭印记：山羊α-VPS35 1:800(ab10099，Abcam)；兔α-VPS26b 1:1000(15915-1-AP，ProteinTech)；兔α-VPS29 1:1000(ab236796，Abcam)；小鼠α-β肌动蛋白1:25000(Sigma)；小鼠α-Golgin97 1:1000(Invitrogen)；小鼠α-泛素1:500(Merk)。用TBS-T 1X洗涤几次后，将印迹在恰当的HRP标记的二抗(Bio-Rad)中在室温下孵育1小时。根据制造商的说明使用ClarityMax-ECL(Bio-Rad)获得蛋白质条带的可视化，并在ChemiDoc(Bio-Rad)上获取图像。使用Image Lab6.0.1软件(Bio-Rad)完成定量。
Blue-Native凝胶电泳
G93A小鼠及其WT仔畜每天注射溶媒或化合物2a(10mg/kg，从第83天到第103天)。从盐水灌注的小鼠中解剖的腰部脊髓在Tris-HCl 10mM pH 8、EDTA 1mM pH 8、NaCl100mM、NP40 1％和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)中裂解。使用紧密配合的玻璃Potter组织研磨机(1ml；Wheaton)获得提取物。我们将250μL的各个提取物与100mM碘乙酰胺(Sigma)一起孵育。样品与4x Sample NativePAGE(Thermofisher)样品缓冲液和G-250添加剂(Thermofisher)混合，蛋白质在非变性(native)4-15％Bis-Tris凝胶(Bio-Rad)上用深蓝色阴极缓冲液(Dark Blue Cathode buffer，Thermofisher)在150V分离凝胶长度的1/3。我们用浅蓝色阴极缓冲液替换运行缓冲液以完成运行。在电泳结束时，凝胶用5mM三(2-羧乙基)膦(Sigma)洗涤15分钟，然后将蛋白质转移到硝酸纤维素上并用8％乙酸固定在膜上15分钟。兔α-SOD1(1:2000，Genetex)如上所述孵育过夜。根据制造商的说明使用ClarityMax-ECL(Bio-Rad)进行蛋白质的可视化，并在ChemiDoc(Bio-Rad)上获取图像。
免疫组织化学、免疫荧光和形态计量分析
从ALS患者以及来自目标ALS人类尸体解剖组织核心(Target ALS HumanPostmortem Tissue Core)的非神经对照获得石蜡包埋的SC。切片储存在INSPE组织库中。在再水化和抗原修复之后，切片与多克隆VPS35抗体(1:400 Abcam ab97545)和多克隆VPS26抗体(ab23892 Abcam)一起孵育(载玻片在TRIS EDTA pH＝9中在97℃下通过水浴加热)。过氧化物酶-二氨基联苯胺(DAB)反应用于检测一抗、生物素化抗兔IgG(H+L)(1:500，Vector laboratories)和抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC 1:100，Vectorlaboratories)。一名对疾病状况和病人统计数据不知情的操作员随后对这些切片进行评估。
源自小鼠的切片(冷冻的冰冻切片)或含有细胞的玻璃盖在PBS 1X(Lonza)中洗涤3次(每次5分钟)，并在以下封闭混合物中孵育：PBS 1X/FBS 10％(Invitrogen)、BSA 1mg/mL(Sigma)、TritonX100 0.1％(Sigma)，在室温下保持1小时。根据制造商的说明，抗体在封闭混合物中稀释，并在+4℃下孵育过夜。第二天，切片在PBS中润洗，并且使用在封闭混合物中稀释的荧光二抗——即从未衍生自衍生了一抗的物种(Alexafluor偶联)。载玻片在Hoechst 33342(Sigma)中孵育，用于核复染。必要时，我们通过在10mM柠檬酸钠(pH 6)中煮沸样品5分钟来进行抗原修复。使用以下抗体和工作浓度：兔α-VPS35 1:1000(ab97545Abcam)；兔α-VPS26 1:1000(ab23892 Abcam)；兔α-分拣蛋白1:1000(ab16640 Abcam)；小鼠α-CI-MPR 1:100(Novus bio.NB-300-514)；小鼠α-NeuN 1:800(Millipore MAB377)；小鼠α-泛素1:500(Millipore MAB1510)；小鼠α-Golgin97 1:700(Thermofisher A21270)；兔α-ISLET 1:1000(ab20670 Abcam)；山羊α-ChAT 1:200(Millipore ab144p)；鸡α-GFP 1:1000(Invitrogen)；鸡α-Neurofilament-medium 1:500(Biolegend PCK-593P)；大鼠α-MBP 1:100(由Dr.A.Bolino提供)；小鼠α-GM130 1:100(BD biosciences，610823)；大鼠α-CTSD 1:100(R&D system MAB1029)。恰当时，使用酪酰胺信号放大(TSA，PerkinElmer)以提高单免疫荧光和双免疫荧光的荧光强度。
成像
我们使用带有以下物镜：X20、X40和X63并配备有以下相机：徕卡CCD显微镜DFC3000 G和DMC2900的Olympus BX51，以获得16位光和荧光图像(1296x966像素)。使用Photoshop(Adobe)CS4或NHI-Image J软件(美国国立卫生研究院)合并荧光图像。我们使用带有X40和X64物镜并配备超灵敏HyD检测器的Leica SP8获得共聚焦图像。我们将每个荧光信号记录为方形8位图像(1024x1024像素)。图像经过后处理以生成Z堆叠的最大投影(以0.4-0.8μm步长获取)和Z堆叠的横截面轮廓(以0.3μm步长获取)，并使用Las-X软件进行伪彩色。
酶联免疫吸附测定
用化合物2a、CNI-1493或溶媒处理原始264.7细胞(105/孔)1小时，然后我们施加LPS(100ng/ml)，并在4小时后收集上清液。根据制造商的说明，我们使用具有OptEIATM套件的酶联免疫吸附测定(ELISA)程序检测小鼠TNFα(BD-Biosciences)。根据标准曲线计算TNFα的浓度，并表示为纳克每微升。当细胞因子的浓度低于检测阈值时，它们被假定为0ng/μl。
组织MN中MFI水平的定量
VPS35、VPS26、CI-MPR、分拣蛋白、CTSD和泛素的荧光强度水平是使用NHI-Image J软件(美国国立卫生研究院)根据以下协议计算的：共聚焦图像的堆叠用于生成最大投影(Las-X)，然后由NHI-Image J进行后处理，以从脊髓的腹角裁剪单个NeuN+MN。我们接下来对各个通道进行背景(在仅接受二抗的相邻切片上计算)减除，然后应用NHI-Image J均值滤波器(以2.0像素的半径)计算单个MN中的平均NeuN荧光水平。使用这种方法，我们建立了一个对单个MN进行选通的关注区域(ROI)。在这个选择的ROI上，我们计算了各种蛋白质的平均荧光水平(MFI)。
Neuro2a中高尔基体的形态学评估
根据已发表的方法(Stafa，2012)，在对照或接受G93A质粒与或不与合物2a(10μM)一起的Neuro2a的细胞中评估高尔基体形态。在各个实验中，我们都包括了GFP转染的细胞作为额外的对照。我们使用Golgin97免疫荧光标记反式高尔基体网络膜。我们将高尔基体形态分类如下：正常(极化网络)、中等(部分碎片化)或碎片化(严重碎片化，高尔基体堆叠分散在整个细胞质中)(Stafa 2012)。在各个实验中，细胞在三个盖玻片上随机取样。高尔基体亚类表示为各个实验条件下高尔基体得分总数的百分比。
微电极阵列(MEA)记录
从E16.5C57BL6J胚胎的大脑皮层建立原代神经元培养物。解剖后，将细胞以3x105细胞/MEA的密度在MEA生物芯片(60个电极的MEA生物芯片，电极间距为200μm，电极直径为30μm，带有集成参考电极，Multichannel Systems,GmbH)上铺板，并保持在补充有B27的Neurobasal培养基中14天。在第14天，将神经元培养物暴露于在Krebs-Ringer-Hepes缓冲液(KRH，130mM NaCl、5mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、2mM CaCl2、25mM Hepes、0.6％葡萄糖、1％谷氨酰胺，Sigma)中浓度递增(1、3、10、30和100μM)的先导物2a。使用前置放大器级(MEA-1060-Inv-BC-Standard，增益：55，带宽：300Hz–8kHz，MCS GmbH)、放大和滤波级(FA64S，增益20，带宽：10Hz–6kHz，MCS GmbH)和数据采集设备(采样频率：25kHz)。然后，进行离线信号处理，并通过MC-Rack软件(MCS GmbH)分析原始数据。
实时PCR
根据制造商的建议，裂解从盐水灌注的小鼠解刨的腰椎束或Neuro2a细胞，以使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)(包括脱氧核糖核酸酶(Promega)消化)提取总RNA。根据制造商的说明，我们使用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen)和随机六聚体(Invitrogen)合成了cDNA。LightCycler 480System(Roche)和LightCycler 480 SYBR Green I MasterMix(Roche)用于实时PCR实验。使用持家基因组蛋白H3获得归一化(H3F:5’-GGTGAAGAAACCTCATCGTTACAGGCCTGGTAC-3’H3R:5’-CTGCAAAGCACCAATAGCTGCACTCTGGAAGC-3’)。以下特异引物用于基因表达分析：
VPS35F:5’-GTGCCGTGGTGTGCAGCATCCG-3’
VPS35R:5’-ATGCTGCATCCGCACCCAGAGC-3’
VPS26AF:5’-GCTAAGTATGAAATAATGGATGGGGC-3’
VPS26AR:5’-CTTGTTCACATCTCTCATCGTGGGG-3’
VPS29F:5’-CCAGCACATCCTCTGCACCGGC-3’
VPS29R:5’-CCACGGAATAACTTGGTGTCCGTG-3’
药理学——体内
在从小鼠分离的脑和血液样本中检测化合物2a
健康小鼠每天注射溶媒或化合物2a(10mg/kg)并在1、7、15和30天后处死。生理盐水灌注后，将大脑与头骨分离，小心称重并迅速储存在干冰中。然后，检查大脑(～400mg)是否存在化合物2a。根据Yuan等人2012年报道的方案使用MeOH进行提取。提取后，将各个生物样品重新悬浮在60μl LC/MS级水中，并使用与正模式的TripleTOF 5600+质谱仪(SCIEX)联用的UPLC 1290(Agilent Technologies)通过LC-MS/MS对5μl进行分析。使用WatersACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱(2.1x 10mm，1.7μm)，通过溶剂A(乙腈+0.1％FA)和溶剂B(H2O+0.1％FA)的梯度进行色谱分离。通过使用MultiQuant 2.1软件(SCIEX)绘制峰面积与相应浓度的图来构建校准曲线。
从人类诱导性多能干细胞(hiPSC)产生MN
在圣拉斐尔(San Raffaele)医院，在知情同意后，在局部麻醉下对ALS患者和健康志愿者进行皮肤活检。该方案得到了地方伦理委员会的批准。原代成纤维细胞在含有Glutamax I(GIBCO)的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。人类iPS细胞系是使用在胚胎干细胞(HESC)基质胶(Matrigel)(Corning)上在mTeSR1(Stem Cell Technologies)中保持在无饲养条件下的非整合仙台病毒产生的。MN是按照Du及其同事发表的方案并加以极少改动生成的(Du等人，2015)。简而言之，当hiPSC达到汇合时，它们已使用EDTA分离，并在补充有ROCK抑制剂(StemMACS，Miltenyi Biotec)的mTeSR-1中以1:4铺在基质胶ES涂覆的培养皿上。第二天，培养基更换为化学成分确定的神经培养基：DMEM/F12、1:1比例的Neurobasal培养基、1％B27、0.5％N2(均来自Gibco，ThermoFisher Scientific)、1％P/S(Gibco)、1％Glutamax(Gibco)和0.1mM抗坏血酸(Sigma)。将CHIR99021(3μM，Tocris)、DMH1(2μM，Tocris)和SB431542(2μM，Miltenyi Biotec)加入培养基中。每隔一天更换一次培养基，直到第6天。在第7天，细胞已用分散酶(1U/mL)解离，以1:4分割并在补充有1μM CHIR99021、2μM DMH1、2μM SB431542、RA(视黄酸，0.1μM，Sigma)和SAG(Smoothened Agonist，0.5μM，Calbiochem)的上述基底神经培养基中在低生长因子基质胶(MaGR)上保存6天。在第13天，细胞已用分散酶(1U/mL)解离，以1:4分隔并在补充有3μM CHIR99021、2μM DMH1、2μMSB431542、0.1μM RA、0.5μM SAG和0.5mM丙戊酸(VPA，Tocris)的神经培养基中保存6天。为了诱导MN分化，将细胞用分散酶(1U/mL)解离并在含有0.5μM RA和0.1μM SAG的神经培养基中悬浮培养6天。在第25天，用Accumax(Sigma)将细胞解离成单细胞并铺在MaGR涂覆的板上，在含有0.5μM RA、0.1μM SAG、0.1μM化合物E(Calbiochem)的神经培养基中直到第35天。培养基的一半通常每隔一天更换一次。
动物
小鼠在圣拉斐尔医院小鼠设施(米兰，意大利)保持在无病原体条件下。根据1986年11月24日的欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC)，尽一切努力减少动物的痛苦并减少小鼠的使用数量。所有动物实验方案均经意大利卫生部动物实验伦理审查委员会批准。程序是根据圣拉斐尔科学研究所机构动物护理和使用委员会的指导方针进行的(协议编号693/2015PR)。携带SOD1G93A等位基因的转基因突变SOD1小鼠(品系B6.Cg-Tg(SOD1G93A)1Gur/J)购自Jackson实验室，而用于育种和实验目的的C57BL6J购自Charles River(意大利)。由对治疗和基因型不知情的操作者每天腹膜内注射化合物2a(10mg/kg)。在处死时，小鼠被给予过量的麻醉药物并用生理盐水和随后的在PBS中的pH 7.2的80/100ml 4％多聚甲醛(Sigma)经心脏灌注。脊髓以～6mm厚度冠状切片，并在PBS中的pH 7.2的4％多聚甲醛(Sigma)中在+4℃下后固定12小时。组织在PBS/30％蔗糖(Sigma)中冷冻保护，包埋在OCT包含介质中并在处理前储存在-80℃。在涵盖2.5mm脊髓的区域中，每350μm对腰部脊髓进行12μM切片、标记并获取数字图像。基于初步结果，通过功效分析确定动物群组数。
对坐骨神经的比较研究是在盐水灌注后取出的组织上进行的，并用0.12mol/L磷酸盐缓冲液中的2％戊二醛快速固定，用1％四氧化锇后固定，并包埋在Epon(Fluka)中。半薄切片(1μm厚)用甲苯胺蓝染色并通过光学显微镜(Olympus BX51)检查。用数码相机(Leica DFC300F)使用40X物镜获得来自坐骨神经相应水平的数字化不重叠的半薄切片图像。对从每只小鼠获取的至少5张图像完成定量。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州)对退化神经纤维的数量进行定量。
运动功能
G93A小鼠的运动活动通过转棒进行评估。小鼠在静态转子上习惯化1分钟，在恒定速度(4rpm)下习惯化1分钟，进行两次，然后在连续三天(每天一次)进行的三项试验中测试运动功能。每个试验由三个测试阶段组成，阶段之间有15分钟的间隔。对于每个阶段，将五只小鼠放置在加速的转子(4-40rpm)上并记录掉落潜伏期，单个动物的最大限制设置为900秒。
统计学
我们将数据表示为独立实验的平均值(±平均值的标准误差(s.e.m.)或±标准差(s.d.))。我们使用Kolmogorov-Smirnov检验(对于P值使用Dallas-Wilkinson-Lille)或D'Agostino和Pearson综合正态性检验评估数据的正态性。使用以下检验进行比较：非配对t检验、单向或双向方差分析(ANOVA)检验，然后是Tukey多重比较检验或Bonferroni多重比较检验。使用PRISM5.01(GraphPad Software，La Jolla，美国加利福尼亚州)进行统计分析。低于0.05的值被认为具有统计显著性。
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Claims (12)

1.一种式(I)的化合物
及其盐，选自下列式(I)的化合物，其中
-R1是溴并且R2、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2b)
-R2是溴并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2c)
-R2是甲氧基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2e)
-R2是正丁氧基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2f)
-R3是甲基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2g)
-R3是甲氧基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2i)
-R3是乙酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2l)
-R3是甲磺酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2n)
-R3是对甲基苯磺酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2o)
-R3是甲氧羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2p)
-R3是1-(4'-苯基哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2q)
-R6和R7与其相结合的氮原子一起形成吡咯烷基并且R1、R2、R3、R4、R5都是氢(化合物2v)，或其盐之一。
2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，选自化合物2b、2c、2e、2f、2g、2i、2l和2v。
3.根据权利要求1或2所述的式(I)的化合物，其特征在于所述化合物是其盐之一的形式。
4.一种药物组合物，包含如权利要求1至3的任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的至少一种，以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
5.根据权利要求1至3的任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或诊断的药物中的应用。
6.根据权利要求1至3的任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用作逆运体稳定剂的药物中的应用。
7.根据权利要求1至3的任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用作神经保护剂的药物中的应用。
8.根据权利要求1至3的任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于神经疾病的治疗和/或预防的药物中的应用，所述神经疾病包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)和其他神经疾病，其中逆运体稳定活性是有益的。
9.一种式(I)的化合物及其盐在制备用作逆运体稳定剂的药物中的应用，
所述化合物选自下列式(I)的化合物，其中
-R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2a)
-R1是溴并且R2、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2b)
-R2是溴并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2c)
-R2是羟基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2d)
-R2是甲氧基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2e)
-R2是正丁氧基并且R1、R3、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2f)
-R3是甲基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2g)
-R3是甲氧基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2i)
-R3是乙酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2l)
-R3是甲磺酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2n)
-R3是对甲基苯磺酰胺基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2o)
-R3是甲氧羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2p)
-R3是1-(4'-苯基哌嗪基)羰基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2q)
-R3是氨基胍基并且R1、R2、R4、R5、R6、R7都是氢(化合物2r)
-R6和R7与其相结合的氮原子一起形成吡咯烷基并且R1、R2、R3、R4、R5都是氢(化合物2v)
-R5和R6与其相结合的氮原子一起形成苯并咪唑啉基并且R1、R2、R3、R4、R7都是氢(化合物2z)，或其盐之一。
10.根据权利要求9所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用作神经保护剂的药物中的应用。
11.根据权利要求9所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于神经疾病的治疗和/或预防的药物中的应用，所述神经疾病包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、恰克-马利-杜斯氏症、阿尔兹海默病(AD)、帕金森氏病(PD)和其他神经疾病，其中逆运体稳定活性是有益的。
12.一种制备根据权利要求1至3的任一项所述的式(I)的化合物或其盐之一的方法，所述方法包含使式(IV)的化合物
其中R1、R2和R3如上文所定义，与式(V)的化合物
或其盐，其中R4、R5、R6和R3如上文所定义，在适合的溶剂中反应，并且分离由此获得的式(I)的化合物，可任选地纯化和/或可任选地将其转化为其盐或溶剂化物。
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