KR20210095649A - 신경 변성, 심근 변성 및 리소좀 축적 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

신경 변성, 심근 변성 및 리소좀 축적 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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샤르벨 무사
크리스티안 울프
발라라만 칼루부
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조지타운 유니버시티
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Abstract

본 발명은 대상체에서 신경 변성 질환, 심근 변성 및 리소좀 축적 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

신경 변성, 심근 변성 및 리소좀 축적 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2018 년 11 월 20 일에 출원된 미국 가출원 제62/769,791호를 우선권 주장하며, 이의 전문은 참고로 본 명세서에 포함된다.
신경 변성 질환에는 진행성 신경계 기능 장애와 관련된 유전성 및 산발성 장애가 포함된다. 이러한 질병은 신경 세포 또는 신경 세포 기능의 진행성 악화를 특징으로 한다. 미국인 네 명 중 한 명은 그들의 생애에서 신경 변성 증상을 발병하는 것으로 추정되고 있다. 그러나 일반적으로 증상을 유발하는 기본 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있으며, 신경 변성 질환을 예방 또는 치료하기 위해 이용할 수 있는 효과적인 치료 옵션은 거의 없다.
리소좀 축적 장애는 가장 치명적인 유전 질환의 일부를 나타내며, 이들 장애의 치료법을 개발할 필요성은 거의 충족되지 않고 있다. 이들 질병의 대부분은 중추 신경계(CNS)에 손상을 주지만, 손상의 원인이 되는 메커니즘은 거의 알려지지 않고 있다. 리소좀 축적 장애의 발생률은 드물지만(약 1: 100,000 미만의 개체가 영향을 받지만), 리소좀 축적 장애는 어린 나이에, 많게는 출생 후 수개월 또는 수년 이내에 사망하는 소아에게 주로 영향을 미친다. 다른 많은 소아들은 특정의 리소좀 축적 장애의 다양한 증상으로 수년간 고생하다 사망하고 있다.
해결하려는 과제
본 발명에서는 대상체에서 신경 변성 질환, 심근 변성 및 리소좀 축적 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명에서는 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00001
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
과제의 해결 수단
본 발명에서는 또한 대상체에서 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 앓고 있거나 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환이 발병할 위험이 있는 대상체에게 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
Figure pct00002
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
또한 뉴런에서의 독성 단백질 응집을 억제 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 뉴런을 하기 학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다:
Figure pct00003
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
또한 대상체에서의 리소좀 축적 장애(LSD)를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 LSD를 갖거나 LSD가 발병할 위험이 있는 대상체에게 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다:
Figure pct00004
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
본 출원은 다음 도면을 포함한다. 도면은 조성물 및 방법의 특정 실시형태 및/또는 특징을 예시하고, 조성물 및 방법에 대한 임의의 설명(들)을 보충하는 것을 의도하고 있다. 서면에 의한 설명이 그러한 경우이다는 것을 명시적으로 나타내지 않는 한, 도면은 조성물 및 방법의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도 1(좌측 패널과 중앙 패널)은, 16 시간의 치료 후, 젖산 탈수소효소(LDH)의 감소와 (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT)의 증가에 의해 각각 증명되는 바와 같이, 대조군에 비해, 1 μM BK41043으로 처리된 B35 세포에서 신경 보호 효과가 관찰되었음을 나타낸다. 도 1(우측 패널)은 5시간의 치료 후 BK40143의 농도가 감소함에 따라 LDH가 감소함으로써 세포 생존율이 단계적으로 증가했음을 나타낸다.
도 2는 pTau(좌측 패널) 또는 α-시누클레인(우측 패널)으로 24 시간 형질 감염하고, BK41043으로 5 시간 처리한 후 B35 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 세포 사멸을 반영하여 배지에서 측정된 탈수소효소(LDH)는 BK40143의 유무에 관계없이 대조군과 타우 또는 α-시누클레인을 발현하는 세포 사이에 차이가 없으며, 이는 이 화합물이 독성 또는 세포 사멸을 초래하지 않음을 나타낸다.
도 3은 24 시간 형질 감염 후 pTau(181)의 레벨을 나타내며(좌측 패널, 스튜던트 t-검정: 쌍을 이루지 않음, 두 가닥 꼬리를 가짐, *p <0.05, *** p <0.01), 또한 BK41043은 pTau 형질 감염된 B35 세포의 pTau(181) 레벨을 감소함을 나타낸다(우측 패널, n = 6, ANOVA: 통상, 일 방향, Dunnett의 다중 비교 검정, p <0.05, ****p <0.0001).
도 4는 24 시간 형질 감염 후 α-시누클레인 레벨을 나타내며(좌측 패널), 또한 BK41043은 α-시누클레인 형질 감염된 B35 세포에서 α-시누클레인이 감소함을 나타낸다(우측 패널). 스튜던트 t-검정: 쌍을 이루지 않음, 세 가닥의 꼬리를 가짐, *p <0.05, **p <0.0, n = 6). 10uM-1mM 범위의 BK40143의 용량은 이 세포 배양 모델에서 알파-시누클레인 레벨을 감소시키는 것으로 보인다.
도 5는 BK40197로 5 시간 처리한 후 B35 세포의 세포 생존율을 나타낸다.
도 6은 BK40143이 7 일 처리한 후 타우 발현 트랜스제닉 마우스에서 pTau(181)를 감소시킴을 나타낸다. pTau(181)의 레벨은 ELISA를 통해 측정하였다. 스튜던트 t-검정: 짝을 이루지 않음, 세 가닥의 꼬리를 가짐, Welch 보정, *p <0.05, ***p <0.01
도 7은 BK-40143(1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg 또는 5.0 mg/kg)에 의한 처리는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 rTG4510 트랜스제닉 마우스(n = 4)에서 pTau(231)(AT180) 레벨에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
도 8은 타우(HT7)는 1.25 mg/kg 및 2.5 mg/kg에서 BK-41043으로 7 일간 처리한 후 타우 트랜스제닉 마우스에서 현저하게 감소되었음을 나타낸다. 스튜던트 t-검정: 짝을 이루지 않음, 두 가닥의 꼬리를 가짐, Welch 보정, *p <0.05, ***p <0.01, n = 4
도 9는 BK-40143(1.25 mg/kg 또는 2.5 mg/kg)으로 처리하면 인산화(활성) DDR1(pMCK10)의 검출에 의해 측정되는 바와 같이 DDR1의 생체내 억제가 발생함을 나타낸다. 이 데이터는 BK40143이 생체 내에서 DDR을 강력하게 억제한다는 것을 나타낸다.
도 10은 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg의 BK-40143으로 처리한 후 CamP301L 마우스에서 pTau(191)가 감소되었음을 나타낸다. 스튜던트 t-검정: 짝을 이루지 않음, Welch 보정, 한 가닥의 꼬리를 가짐, *p>0.05. p=0.02, n=4.
도 11a는 1mM 및 100uM의 BK40196이 형질 감염된 B35 세포에서의 알파-시누클레인 레벨을 상당히 감소시켰음을 나타낸다.
도 11b는 BK40197이 형질 감염된 B35 세포에서 알파-시누클레인 레벨을 유의하게 감소시키지 않음을 나타낸다.
도 12a 내지 12d는 BK40143이 A53T 마우스에서 알파-시누클레인을 현저하게 감소시킨다는 것을 나타낸다. 수컷 및 암컷 12개월령 A53T 마우스를 2.5mg/kg의 BK40143로 연속 21 일간 복강내 처리하였다. 도 12a는 인간 알파-시누클레인에 대한 ELISA가 DMSO 처리된 대조군 A53T 마우스에 비해 BK40143 처리된 동물에서 알파-시누클레인 레벨의 현저한 39% 감소를 나타낸다. C57BL/6J 마우스를 대조군으로 사용하였고 검출 가능한(N.D.) 인간 알파-시누클레인을 나타내지 않았다. 도 12b는 BK40143이 도파민의 전체적인 레벨(30%)을 증가시킨다는 것을 나타낸다. BK40143은 A53T 마우스에서 도파민 대사산물인 호모바닐산(HVA)의 레벨을 증가시켰으며, 이는 더 많은 도파민 회전을 나타내어 더 양호한 도파민 신경 전달을 초래할 수 있음을 나타낸다. 도 12c 및 12d는 ELISA에서 보이는 알파-시누클레인의 40% 감소를 반영한 알파-시누클레인에 대한 면역 블롯이다.
도 13은 BK40143이 A53T 마우스에서 운동 속도를 개선한다는 것을 나타낸다. A53T 마우스는 60 분 임상에서 전체적인 자발 운동 능력에 대한 오픈 필드 시험에서 시험하였다. 마우스는 이동한 합계 거리 또는 이동에 소비된 합계 시간에 차이를 나타내지 않았지만, 움직임의 속도는 BK40143 치료로 현저하게 증가하였다.
도 14a 내지 14e는 BK40143이 Src 또는 Abl이 아닌 DDR(약 50%)을 선택적으로 비활성화하지만 rTG4510 타우패티 마우스 모델에서 인산화된 타우를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 수컷 및 암컷, 3개월령 rTG4530 마우스를 1.25mg/kg, 2.5mg/kg 또는 5mg/kg의 BK40143 또는 DMSO로 연속 7일간 복강내 투여하였다. 도 14a, 활성화된(인산화된) DDR1에 대한 면역 블롯 프로빙(immunoblot probing)은 5 mg/kg이 아닌 1.25 및 2.5 mg/kg의 BK40143이 DDR1을 비활성화하였음을 증명한다. 도 14b, 활성화된 Src에 대한 면역 블롯 프로빙은 BK40143이 이러한 티로신키나제에 관여하지 않았음을 증명한다. 도 14c, 활성화된 Abl에 대한 면역 블롯 프로빙은 BK40143이 이러한 티로신키나제에 관여하지 않았음을 입증한다. 도 14d, 인산화된 타우(AT8)에 대한 면역 블롯 프로빙은 BK40143의 3가지 용량 모두가 동일한 마우스에서 인산화된 타우의 레벨을 41 내지 49% 감소시켰으며, 이는 DDR 억제가 pTau 감소와 동시에 일어난다는 것을 증명한다. 도 14e는 인산화된 타우(AT181)에 대한 ELISA이며, 이것은 2.5mg/kg의 BK40143이 인산화된 타우를 현저하게 감소시켰음을 나타낸다.
도 15a 내지 15f는 BK40143이 아밀로이드, 인산화된 타우를 현저하게 감소시키고 트랜스제닉 APP 마우스에서 DDR1을 비활성화시킨다는 것을 나타낸다. 수컷 및 암컷, 7 개월령 APP 마우스를 1.25 및 2.5mg/kg의 BK40143 또는 DMSO로 연속 21일간 복강내 투여하였다. 도 15a는 세포외 아밀로이드-베타(6E10)를 응집시키기 위한 면역 블롯이며, 이것은 1.25 및 2.5 mg/kg의 BK40143이 아밀로이드-베타 플라크를 현저하게 감소시켰다는 것을 입증한다. 도 15b는 인산화된 DDR1에 대한 면역 블롯 프로빙이며, 이것은 1.25 및 2.5mg/kg의 BK40143이 각각 DDR1을 40% 및 31% 비활성화했음을 증명한다. 도 15c는 활성화된(인산화된 Abl(245)에 대한 프로빙이며, 이는 BK40143이 Abl에 관여하지 않았음을 증명한다. 15d 및 15e는 1.25 및 2.5mg/kg의 BK40143이 ELISA를 통해 가용성 인간 아밀로이드-베타를 현저하게 감소시켰지만, 불용성 아밀로이드-베타를 현저하게 감소시키지는 않았음을 나타낸다. 도 15f는 2.5mg/kg의 BK40143이 인간 인산화된 타우(Ser396)를 80% 이상 현저하게 감소시켰음을 나타낸다.
도 16은 BK40143이 APP 마우스의 인지를 위한 Morris Water Maze 시험에서 성능을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 측정에는 플랫폼 엔트리 수(좌측 패널), 첫 번째 엔트리까지의 대기 시간(중앙 패널), 및 플랫폼으로의 첫 번째 엔트리 전에 이동한 거리(우측 패널)를 포함한다. 그룹 간에 현저한 차이는 없었지만, 1.25mg/kg의 BK는 플랫폼 엔트리의 수가 많고, 첫 번째 엔트리까지의 대기 시간이 짧아지고, 플랫폼으로의 첫 번째 엔트리전에 이동한 거리가 짧아짐에 따라 성능이 향상되는 경향을 나타냈다.
도 17은 BK40143이 APP 마우스의 해마에서 세포 사멸을 일으키지 않음을 나타낸다. 대표적인 20um 해마 섹션은 nissl 물질로 염색하였다(좌측 패널). DMSO, 1.25mg/kg 및 2.5mg/kg의 BK40143의 4배 및 20배 영상이 나타난다(좌측 패널). 평균 염색 강도는 모든 4배 영상에서 nissl 염색의 총량으로서 imagej 소프트웨어에서 정량화하였다(우측 패널).
본 명세서에서는 대상체에서 신경 변성 질환, 심근 변성 질환, 프리온 질환, 또는 리소좀 축적 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
화합물
일부 예에서, 본 명세서에 기재된 화합물 부류는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00005
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이다.
또한 화학식 I에서, Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
또한 화학식 I에서, R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
추가적으로, 화학식 I에서, R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
또한 화학식 I에서, R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고; n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
화학식 I의 일부 예에서, Y는 R1로 치환된 벤질이다:
Figure pct00006
.
화학식 I의 일부 예에서, Y는 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질이다:
Figure pct00007
.
화학식 I의 일부 예에서, Z는 NR3R4이며, R3은 벤질 또는 H이며, R4는 벤질 또는 H이며, Y는 R1로 치환된 벤질이다:
Figure pct00008
.
화학식 I의 일부 예에서, Z는 NR3R4이며, R3는 벤질 또는 H이며, R4는 벤질 또는 H이며, Y는 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질이다:
Figure pct00009
.
화학식 I의 일부 예에서, Z는 모르폴리닐이며 Y는 R1로 치환된 벤질이다:
Figure pct00010
.
화학식 I의 일부 예에서, Z는 모르폴리닐이며 Y는 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질이다:
Figure pct00011
.
화학식 I의 화합물은 화합물 1(BK40197)이다:
Figure pct00012
4-(2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘-7-일)모르폴린
다른 화학식 I의 화합물은 화합물 2(BK40193)이다:
Figure pct00013
N-페닐-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b)피리딘-7-아민
화학식 I의 일부 예에서, 화합물은 하나 이상의 할로겐 원자를 포함하지 않는다. 화학식 I의 일부 예에서, Y는 2-m-톨루일이다. 화학식 I의 일부 예에서, Z는 헤테로사이클릴이다. 화학식 I의 일부 예에서, Z는 모르폴린-1-일이다. 화학식 I의 일부 예에서, R3은 H이고 R4는 비치환된 페닐이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 알킬, 알케닐 및 알키닐은 직쇄 및 분지쇄 1가 치환기를 포함한다. 그의 예는 메틸, 에틸, 이소부틸, 3-부티닐 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C1-C20 알킬, C2-C20 알 케닐 및 C2-C20 알키닐을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐 및 C2-C4 알키닐을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 알콕시는 단일의 말단 에테르 결합을 통해 결합된 알킬기이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 히드록시는 화학식 -OH로 표시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 아민 또는 아미노는 화학식 ―NR3R4로 표시되며, 여기서 R3 및 R4는 각각 상술한 수소, 알킬, 사이클로알킬, 할로겐화 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기와 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치환기일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 알콕시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 카르보닐 분자는 치환 또는 비치환될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 치환은 알콕시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 카르보닐의 주쇄에 부착된 위치에 알콕시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 카르보닐기의 첨가, 예를 들어, 수소를 이들 분자 중 하나로 대체를 포함한다. 치환기의 예는 히드록시, 할로겐(예를 들어, F, Br, Cl 또는 I) 및 카르복실기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 반대로, 본 명세서에서 사용되는 용어 비치환은 치환, 예를 들어 직쇄 데칸-(CH2)9-CH3) 없이, 알콕시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 카르보닐이 포화 레벨에 적합하는 수소의 완전한 보체를 가짐을 나타낸다.
헤테로알킬, 헤테로 알케닐 및 헤테로알키닐은 알킬, 알케닐 및 알키닐과 유사하게 정의되지만, 골격 내에 O, S 또는 N 헤테로 원자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C1-C20 헤테로알킬, C2-C20 헤테로알케닐 및 C2-C20 헤테로알키닐을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위에는 C1-C12 헤테로알킬, C2-C12 헤테로알케닐, C2-C12 헤테로알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C2-C6 헤테로알케닐, C2-C6 헤테로알키닐, C1-C4 헤테로알킬, C2-C4 헤테로알케닐 및 C2-C4 헤테로알키닐을 포함한다.
용어 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 사이클로알키닐은 단일의 사이클릭 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 사이클릭 알킬기를 포함한다. 그의 예로는 사이클로헥실, 사이클로펜틸에틸 및 아다만타닐을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C3-C20 사이클로알킬, C3-C20 사이클로알케닐 및 C3-C20 사이클로알키닐을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C5-C12 사이클로알킬, C5-C12 사이클로알케닐, C5-C12 사이클로알키닐, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 사이클로알케닐 및 C5-C6 사이클로알키닐을 포함한다.
용어 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알케닐 및 헤테로사이클로알키닐은 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 사이클로알키닐과 유사하게 정의되지만, 사이클릭 골격 내에 O, S 또는 N 헤테로 원자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C3-C20 헤테로사이클로 알킬, C3-C20 헤테로사이클로알케닐 및 C3-C20 헤테로사이클로알키닐을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C5-C12 헤테로사이클로알킬, C5-C12 헤테로사이클로 알케닐, C5-C12 헤테로사이클로알키닐, C5-C6 헤테로사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클로 알케닐 및 C5-C6 헤테로사이클로 알키닐을 포함한다.
아릴 분자는 예를 들어, 단일 및 이중의 공유 결합이 교대로 구성되어 있는 경우와 동일한 번호의 비편재화된 전자에 의해 연결된 하나 이상의 평면 세트, 일반적으로 6 개의 탄소 원자를 도입한, 사이클릭 탄화수소를 포함한다. 아릴 분자의 예는 벤젠이다. 헤테로아릴 분자는 O, N 또는 S와 같은 원자의 주 고리 사슬을 따라 치환을 포함한다. 헤테로 원자가 도입되면, 5 개의 원자 세트, 예를 들어 4개의 탄소와 헤테로 원자는 방향족계를 만들 수 있다. 헤테로아릴 분자의 예에는 푸란, 피롤, 티오펜, 이마다졸, 옥사졸, 피리딘 및 피라진을 포함한다. 아릴 및 헤테로아릴 분자는 또한 추가적인 융합 고리, 예를 들어 벤조푸란, 인돌, 벤조티오펜, 나프탈렌, 안트라센 및 퀴놀린을 포함할 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 분자는 달리 언급하지 않는 한 고리의 임의의 위치에 부착될 수 있다.
임의 선택적으로, 화학식 I을 갖는 화합물은 Abl, PDGFRα, PDGFRβ, DDR 1, DDR2, cKIT, 아르기나제 II, Src, Fyn, VEGFR 및 Zac로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체 티로신 키나제를 억제하는 티로신 키나제 억제제이다. 일부 예에서, 화학식 I을 갖는 화합물은 Abl, PDGFRα, PDGFRβ, DDR1, DDR2, cKIT, 아르기나제 II, Src, Fyn 또는 VEGR 또는 Zac를 선택적으로 억제한다. 일부 예에서, 화학식 I을 갖는 화합물은 DDR 1 및/또는 DDR2를 억제한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 약제학적으로 허용되는 염은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비에 적합하고 있는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 제공되는 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 니롤티닙, 보수티닙, 파조파닙의 약제학적으로 허용되는 염 및 화학식 I의 화합물은 적합한 무기 및 유기산 및 염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 비독성 산 부가 염의 예는 염산, 브롬화 수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산으로, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 구연산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로 또는 이온교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄 설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌 설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼셀페이트, 3-페닐프로 피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타타레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 트리플루오로 아세트산, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 화합물은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 화합물은 실시예에서 제공된 것들을 포함하여 다양한 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 이들 방법 중 적어도 일부는 합성 유기 화학 분야에 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 화합물은 용이하게 입수 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 최적의 반응 조건은 사용되는 특정 반응물이나 용매에 따라 달라질 수 있지만, 그러한 조건은 통상의 최적화 절차에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
화학식 I의 변형에는 각 화합물에 대해 설명된 다양한 구성 성분의 가산, 감산 또는 이동이 포함된다. 유사하게, 하나 이상의 키랄 중심이 분자에 존재하는 경우, 모든 가능한 키랄 변이체가 포함된다. 또한 화합물의 합성에는 다양한 화학기의 보호 및 탈보호를 포함할 수 있다. 보호 및 탈보호의 사용 및 적절한 보호기의 선택은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 보호기의 화학은 예를 들어 Wuts, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 5th. Ed., Wiley & Sons, 2014에서 볼 수 있으며, 이의 전문은 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 화합물을 생성하기 위한 반응은 유기 합성 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있는 용매 중에서 수행될 수 있다. 용매는 반응이 수행되는 조건, 즉 온도 및 압력 하에서 출발 물질(반응물), 중간체 또는 생성물과 실질적으로 비반응성일 수 있다. 반응은 하나의 용매 또는 하나 이상의 용매의 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 생성물 또는 중간체의 형성은 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 방법에 따라 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 생성물 형성은 핵 자기 공명 분광법(예를 들어, 1H 또는 13C), 적외선 분광법, 분광 광도법(예를 들어, UV-가시광) 등의 분광학적 수단, 또는 질량 분석법, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 박층 크로마토그래피 등의 크로마토그래피에 의해 모니터링할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 화합물은 혈액-뇌 장벽 투과성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 임의 선택적으로, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 화합물은 화합물(들)의 혈액 뇌 장벽 투과성을 향상시키는 제제와 함께 투여될 수 있다.
신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법
본 명세서에서는 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 신경 변성 질환 또는 장애는 중추 신경계의 신경 변성 질환일 수 있다. 이들 질환은, 이로 한정되지 않지만, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, TDP-43을 동반한 전두측두엽 치매를 포함한 TDP-43 상, 17번 염색체와 관련된 전측두엽 치매, 아밀로이드증, 픽병, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, α-시누클레이노패시(예를 들어, 파킨슨 병, 루이체 질환), 다발성 경화증, 다계통 위축증을 포함한 글리아 세포질 봉입체, 만성 외상성 뇌병증, 타우패시, 진행성 핵상 마비 및 코르티코 기저 변성증을 포함한다. 신경 변성 질환은 또한 외상성 뇌 손상, 뇌졸중 또는 감염, 예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염(예를 들어, HIV, 단순 헤르페스 바이러스(HSV))에 의해 유발된 이차 신경 변성 질환일 수 있다.
심근 변성 질환 또는 장애는, 이에 한정되지 않지만, 이영양증(예를 들어, 근이영양증), 근육 병증(예를 들어, 네말린 근육 병증, 멀티/미니 코어 근육 병증, 중심핵 근육 병증, 미토콘드리아 근육 병증, 대사성 근육 병증 등) 또는 근긴장증(예를 들어, 선천성 근긴장증, 선천성 이상 근긴장증 또는 근긴장성 이영양증)을 포함한다.
프리온 질환 또는 장애는, 이에 한정되지 않지만, 크로이츠 펠트-야콥병, 변종 크로이츠 펠트-야콥병, 게르스트만 슈트라우슬러 샤잉커 증후군, 치사성 가족성 불면증, 쿠루(Kuru), 소 해면상 뇌병증, 만성 소모성 질환 및 스크래피(Scrapie) 등을 포함한다.
상기 방법은 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 앓고 있거나, 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다:
Figure pct00014
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
일부 방법에서, 화학식 I을 갖는 화합물은 하나 이상의 할로겐 원자를 포함하지 않는다. 일부 방법에서, Y는 화학식 I을 갖는 화합물에서 2-m-톨루일이다. 일부 방법에서, Z는 화학식 I을 갖는 화합물에서 헤테로사이클릴이다. 일부 방법에서, Z는 화학식 I을 갖는 화합물에서 모르폴린-1-일이다. 일부 방법에서, R3은 H이고 R4는 화학식 I을 갖는 화합물에서 비치환된 페닐이다.
일부 방법에서는, Y가 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00015
.
일부 방법에서는, Y가 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00016
.
일부 방법에서는, Z가 NR3R4이고, R3이 벤질 또는 H이고, R4가 벤질 또는 H이고, Y가 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00017
.
일부 방법에서는, Z가 NR3R4이고, R3이 벤질 또는 H이고, R4가 벤질 또는 H이고, Y가 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00018
.
일부 방법에서는, Z가 모트폴리닐이고, Y가 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00019
.
일부 방법에서는, Z가 모트폴리닐이고, Y가 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00020
.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에 사용될 수 있는 화학식 I의 예는 다음 화합물을 포함한다:
Figure pct00021
화합물 1(BK40197)
Figure pct00022
화합물 2(BK40143)
본 명세서에서 제공된 방법은 임의 선택적으로 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 갖거나 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환이 발생할 위험이 있는 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 당업자는 다음 검사 중 하나 이상, 즉 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 갖거나 발병 위험이 있는 대상체를 진단하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 유전자 검사(예를 들어, TDP-43 유전자의 돌연변이 확인) 또는 가족 분석(예를 들어, 가족력), 중추 신경계 영상(예를 들어, 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영), 뇌파 검사, 임상적 또는 행동적 검사(예를 들어, 근육 약화, 떨림, 보행 또는 기억 평가) 또는 실험실 검사를 이용할 수 있다.
상기 방법은 임의 선택적으로 대상체에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 제2 치료제는 레바도파, 도파민 작용제, 항콜린제, 콜린제(예를 들어, 5- 하이드록시 트립타민(5-HT) 억제제), 모노아민 산화효소 억제제, COMT 억제제, 도네페질, 메만틴, 리스페리돈, 아만타딘, 리바스티그민, NMDA 길항제, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 릴루졸, 항정신병제, 항우울제, 글루코 코르티코이드(예를 들어, 프레드니손), 티로신키나제 억제제(예를 들어, 닐로티닙, 보스티닙, 이마티닙, 파조파닙 등) 및 테트라베나진으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제2 치료제 또는 치료법은 화학식 I을 갖는 화합물의 투여 전, 동시에 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
티로신 키나제 억제제를 제2 치료제로 투여하는 방법에서, 티로신키나제 억제제는 화학식 I의 화합물에 의해 억제되는 티로신 키나제 수용체를 억제하지 않는 티로신 키나제 억제제일 수 있거나, 화학식 I의 화합물에 비하여 티로신 키나제 수용체에 대한 선택성이 감소하고 있다.
또한 본 명세서에서는 뉴런에서의 독성 단백질의 응집을 억제 또는 방지하는 방법 및/또는 뉴런을 변성으로부터 구하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용 된 억제, 감소 또는 감소에 대한 언급은 대조군 레벨에 비하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 변화를 포함한다.
방법은 뉴런을 유효량의 화학식 I의 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 임의 선택적으로, 화학식 I을 갖는 화합물은 화합물 1 또는 화합물 2이다. 독성 단백질 응집체는 임의 선택적으로 아밀로이드 생성 단백질, 알파-시누클레인, 타우 또는 TDP-43 중의 하나 이상을 포함한다. 아밀로이드 생성 단백질은 응집하는 능력을 갖는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 아밀로이드 생성 단백질의 예는 β-아밀로이드이다. 접촉은 생체 내 또는 생체외에서 수행된다. 생체 내 방법은 독성 단백질 응집체를 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 유용하며, 또한 하기 기재된 바와 같이 화학식 I의 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 시험관내 방법은 예를 들어 이식 전에 신경 세포를 치료하는 데 유용하다. 이러한 경우, 화학식 I의 화합물은 일반적으로 배양 배지에 첨가된다. 임의 선택적으로, 표적 뉴런은 전술한 바와 같이 제2 치료제와 접촉된다.
리소좀 축적 장애의 치료 또는 예방 방법
또한 대상체에서 LSD를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 방법은 LSD를 갖거나 LSD가 발생할 위험이 있는 대상체에게 유효량의 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함한다:
Figure pct00023
I
상기 식에서,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
일부 방법에서, 화학식 I을 갖는 화합물은 하나 이상의 할로겐 원자를 포함하지 않는다. 일부 방법에서, Y는 화학식 I을 갖는 화합물에서 2-m-톨루일이다. 일부 방법에서 Z는 화학식 I을 갖는 화합물에서 헤테로사이클릴이다. 일부 방법에서, Z는 화학식 I을 갖는 화합물에서 모르폴린-1-일이다. 일부 방법에서, R3은 H이고 R4는 화학식 I을 갖는 화합물에서 비치환된 페닐이다.
일부 방법에서, Y가 R1로 치환된 벤질인 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00024
.
일부 방법에서는, Y가 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질인 화학식 I을 갖는 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00025
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일부 방법에서는, Z가 NR3R4이고, R3이 벤질 또는 H이고, R4가 벤질 또는 H이고, Y가 R1로 치환된 벤질인 화학식 I을 갖는 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00026
.
일부 방법에서는, Z가 NR3R4이고, R3이 벤질 또는 H이고, R4가 벤질 또는 H이고, Y가 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질인 화학식 I을 갖는 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00027
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일부 방법에서는, Z가 모르폴리닐이고, Y가 R1로 치환된 벤질인 화학식 I을 갖는 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00028
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일부 방법에서는, Z가 모르폴리닐이고, Y가 메타 위치에서 R1로 치환된 벤질인 화학식 I을 갖는 화합물이 대상체에게 투여된다:
Figure pct00029
.
LSD를 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있는 화학식 I의 예는 다음 화합물을 포함한다:
Figure pct00030
화합물 1
Figure pct00031
화합물 2
임의 선택적으로, 화학식 I의 화합물은 Abl, PDGFRα, PDGFRβ, DDR1, DDR2, cKIT, 아르기나제 II, Src, Fyn, VEGFR 및 Zac로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체 티로신 키나제를 억제한다. 일부 예에서, 화학식 I의 화합물은 Abl, PDGFRα, PDGFRβ, DDR 1, DDR2, cKIT, 아르기나제 II, Src, Fyn 또는 VEGR 또는 Zac를 선택적으로 억제한다. 일부 예에서, 화학식 I을 갖는 화합물은 DDR 1 및/또는 DDR2를 억제한다. 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 화합물 1 또는 화합물 2는 DDR1 및/또는 DDR2를 억제하는데 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, 화학식 I을 갖는 화합물, 예를 들어 화합물 1 또는 화합물 2는 DDR 1 또는 DDR2를 선택적으로 억제한다.
LSD는 리소좀 기능의 결함에 기인하는 선천성 대사 장애이다. 대부분의 경우 LSD는 리소좀에 존재하는 지질과 당 단백질의 분해를 담당하는 특정 효소의 결핍으로 인해 발생한다. 경우에 따라서는, 결함이 있는 비효소 리소좀 단백질 또는 리소좀 생합성에 관여하는 비-리소좀 단백질이 LSD를 유발한다. 분해되지 않은 대사산물의 진행성 리소좀 축적은 일반화된 세포 및 조직 기능 장애를 초래하므로, 다중 전신계 병리를 초래한다. 본 명세서에서 제공된 방법을 사용하여 치료 또는 예방할 수 있는 LSD는, 이에 한정되지 않지만, 점액 다당류증 I 형(예를 들어, 헐러 증후군, 헐러-샤이에 증후군 및 샤이에 증후군), 점액 다당류증 I 형(예를 들어, 헌터 증후군), 점액 다당류증 III 형(예를 들어, 산필리포 증후군 A, 산필리포 증후군 B, 산필리포 증후군 C 및 산필리포 증후군 D), 점액 다당류증 IV 형(예를 들어, 모르퀴오 증후군 A 및 모르퀴오 증후군 B), 점액 다당류증 VI 형(예를 들어, 마로토-라미 증후군), 점액 다당류증 VII형(예를 들어, 슬라이 증후군), 점액 다당류증 IX형(예를 들어, 나토위찌 증후군), 가성 헐러 다발성이영양증, 테이-삭스병, 고셰병, 니만-피크병, 푸코시드 축적증, 갈락토시알리도시스, 글로보이드 세포 백질이영양증, GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증, α-만노시드증, 이염성 백질이영양증 및 폼페병을 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 LSD는 리소좀 클리어런스를 촉진하는 방법이 제거 감소와 관련된 질병 또는 장애의 예이다.
또한 대상체의 하나 이상의 세포에서 리소좀 클리어런스를 촉진하는 방법으로서, 리소좀 클리어런스의 감소와 관련된 장애를 가진 대상체에게 유효량의 화학식 I을 갖는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 임의 선택적으로, 화학식 I을 갖는 화합물은 화합물 1 또는 화합물 2이다. 전체를 통해 사용되는 바와 같이, 리소좀 클리어런스는 축적된 지질, 단백질, 당 단백질 또는 이들의 조합이 대상체에서 하나 이상의 세포의 리소좀에서 대사되거나 분해되는 프로세스이다. 리소좀 클리어런스의 감소는 대조군과 비교하여, 예를 들어 건강한 대상체의 하나 이상의 세포에서 리소좀 클리어런스와 비교하여, 대상체의 하나 이상의 세포의 리소좀에서 지질, 단백질 및/또는 당 단백질의 분해의 감소를 의미한다. 리소좀 클리어런스 감소와 관련된 모든 장애는 이에 제한되지 않지만, 전반을 통해 명시된 LSD 중 어느 것을 포함하는, 본 명세서에서 제공되는 방법을 사용하여 치료할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 촉진 또는 증가에 대한 언급은 대조군 레벨과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 400% 이상의 변화를 의미한다. 임의 선택적으로, 리소좀 클리어런스를 촉진하면 대상체에서 하나 이상의 세포의 리소좀 내의 기존의 응집체 중의 지질, 단백질, 당 단백질 또는 이들의 조합의 양을 감소시킨다. 임의 선택적으로, 리소좀 클리어런스를 촉진하면 대상체에서 하나 이상의 세포의 리소좀 중에서 지질, 단백질, 당 단백질 또는 이들의 조합을 포함하는 응집체의 형성을 억제하거나 방지한다. 임의 선택적으로, 리소좀 클리어런스를 촉진하면, 대조군과 비교하여, 대상체의 하나 이상의 세포에서 지질, 단백질, 당 단백질 또는 이들의 조합을 분해하거나 대사하는데 필요한 시간의 양을 감소시킨다.
임의 선택적으로, 본 명세서에서 제공되는 방법에서, 화학식 I을 갖는 화합물의 유효량은 대조군과 비교하여 대상체의 하나 이상의 세포에서 독성물질의 응집 또는 축적을 억제하거나 방지한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 저하, 감소 또는 억제에 대한 언급은 대조군 레벨에 비하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 변화를 포함한다. 이러한 용어는 대상체의 하나 이상의 세포에서 독성 물질의 완전한 제거를 포함할 수 있지만, 반드시 포함하지는 않는다. 임의 선택적으로, 하나 이상의 세포는 대상체의 뇌 세포, 하나 이상의 말초 조직 내의 세포, 또는 이들의 조합이다. 임의 선택적으로, 뇌 세포는 뉴런 및/또는 아교세포일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법에서, 세포 내에 응집되거나 축적될 수 있는 독성 물질은 지질, 단백질 또는 당 단백질 중 하나 이상일 수 있다. 독성 물질(들)은 대상체의 하나 이상의 세포에서 세포 손상 및/또는 세포 사멸을 증가시킬 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법에서, 독성 물질(들)은 대상체의 리소좀 또는 하나 이상의 세포 내의 다른 장소에 위치할 수 있다. 예를 들어, 제한되지는 않지만, 대상체의 세포에서 지질의 축적을 특징으로 하는 LSD는, 이제 제한되지 않지만, 스핑고리피드증(고쉐 및 니만-피크병 포함), 강글리오시드증(테이-삭스병 포함), 백혈구 영양 장애; 점액 다당류증(헌터 증후군 및 헐러병 포함), 당 단백질 축장 장애, 뮤코리피드증 및 글리코겐 축적병 유형 II(폼페병)을 포함한다.
스핑고리피도스에 축적되는 지질 및 당 단백질는 뇌와 적혈구의 스핑고 미엘린(니만-피크); 뇌 심장 및 신장에서 세라마이드 트리헥소사이드를 포함한 당지질(파브리병); 희돌기세포 에서 갈락토세레브로시드(크라베 병); 적혈구, 비장 및 간에서 글루코세레브로사이드(고셔병); 뉴런의 GM2 강글리오사이드(테이-삭스병) 및 샌드호프 병; GM1 강글리오사이드; 및 신경 조직의 황산염 화합물(이염색성 백질 위축증)을 포함한다.
리소좀 축적 질환에는 또한 하나 이상의 리소좀 효소, 예를 들어, α-L-이두로니데이트가 결핍된 점액 다당류증(MP)이 포함된다(헐러병, 샤이에 증후군 및 헐러-샤이에 증후군); 이두로네이트 설페이트(헌터병), 헤파란 설페이트(산피리포 A형), N-아세틸-α-D-글루코사민(산필리포 B형), CoA-α-글루코사미니드-N-아세텔티트랜퍼(산필리포 C형), N-아세틸-α-D-글루코사미니드-6-설페이트(산필리포 D형 및 모르쿠오 증후군 A형), B-갈락토스(모르쿠오 증후군 B형) 및 N-아세틸에갈라토사민(마로테아우스-라미병)을 포함하지만, 이들 MPs 질병은 모두 헤파란 설페이트, 더마탄설페이트 또는 케라탄 설페이트의 리소좀 축적의 결과이다. 글리코겐 축적 질환(즉 폼페병)은 리소좀 내에 당과 인산화 당이 축적되어 발생한다.
본 명세서에서 제공되는 방법은 선택적으로 LSD를 가진 대상을 선택하는 것을 포함한다. 당업자는 LSD로 대상체를 진단하는 방법을 알고 있다. 예를 들어 다음 검사 중 하나 이상을 사용할 수 있다: 유전자 검사(예를 들어, LSD와 관련된 돌연변이 확인) 또는 가족 분석(예를 들어, 가족력, 부모의 유전자 검사), 중추 신경계 영상(예를 들어, 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영), 임상적 또는 행동적 테스트(예를 들어, 기분 장애, 공격성 및/또는 인지 이상을 식별하기 위한 평가), 또는 임상 검사(예를 들어, 대사산물의 비정상적 레벨 또는 효소 결핍을 확인하기 위한 혈액 및/또는 소변 검사).
본 명세서에서 제공되는 방법은 선택적으로 유효량의 제2 치료제 또는 치료법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 제2 치료제 또는 치료법은 화학식 I의 화합물의 투여 전, 동시에 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 제2 치료제 또는 치료법은 효소, 조혈 줄기 세포, 골수 이식, 유전자 치료 또는 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 한정적이지는 않지만, 효소 결핍증과 관련된 LSD를 효소로 처리하여 대상체에서 결핍 효소의 양을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 이미글루세라제(Cerezyme®), 벨라글루세라제 알파(VPRIV®) 또는 탈리글루세라제 알파(Elelyso®)와 같은 재조합 효소를 사용한 효소 보충 요법(ERT)은 제1 형 고셔 병을 치료하기 위한 제2 치료제로 사용될 수 있다. 글리코실 세라마이드 신타제를 억제하는 소분자, 예를 들어 미글루스타트 및 엘리글루스타트는 I형 고셔병 치료에도 사용할 수 있다. 대상체에 의해 생성된 결함있는 효소를 안정화시키기 위해 샤페론으로서 기능하는 작은 분자, 또는 대상체에서 일반적으로 효소에 의해 처리되는 하나 이상의 기질의 양을 감소시키는 작은 분자도 사용할 수 있다.
LSD의 증상을 감소시키는 하나 이상의 치료제를 투여할 수도 있다. 예를 들어, 가바펜틴 또는 라모트리진과 같은 항간질제를 사용하여 대상체의 발작을 예방할 수 있다. 항생제는 폐렴과 같은 세균 감염증을 치료하는데 사용할 수 있다. 다른 제제에는 항염증제(예를 들어, NSAID 및 항염증 스테로이드) 및 근육 이완제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 투석, 물리 요법 및 외과 수술도 또한 LSD를 치료하기 위한 요법으로서 본 명세서에서 고려되고 있다.
LSD를 치료 또는 예방하기 위한 일부 방법에 있어서, 제2 치료제는 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 닐로티닙, 보스티닙, 이마티닙, 파조파닙 등)일 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 티로신 키나제 및 화학식 I의 화합물이 대상체에게 투여된다. 티로신 키나아제를 제2 치료제로 투여하는 방법에 있어서, 티로신 키나제는 화학식 I의 화합물과 비교하여 하나 이상의 수용체 티로신 키나제에 대한 선택성이 다른 티로신 키나제 억제제일 수 있다.
약제학적 조성물
전체를 통해 사용되는 용어 유효량은 예를 들어, 뉴런에서의 독성 단백질 응집을 억제 또는 예방하거나 리소좀 클리어런스를 촉진하는 등, 원하는 생리적 반응을 생성하는데 필요한 임의의 양으로 정의된다.
본 명세서에 기재된 임의의 화합물, 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 예시적인 투여량은 하루에 활성 화합물 약 0.5 내지 약 200 mg/kg 체중의 용량을 포함하고, 이는 하루에 1회 내지 4회와 같이 단일 용량 또는 개별 분할 용량의 형태로 투여될 수 있다. 대안적으로, 하루에 활성 화합물 약 0.5 내지 약 150 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 0.5 내지 100 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 0.5 내지 약 75 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 0.5 내지 약 50 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 0.5 내지 약 25 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 1 내지 약 50 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 1 내지 약 40 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 1 내지 약 30 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 1 내지 약 30 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 30 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 20 mg/kg 체중, 하루에 활성 화합물 약 10 mg/kg 체중, 또는 하루에 활성 화합물 약 5 mg/kg 체중일 수 있다.
임의 선택적으로, 투여량은 약 10 mg/kg 미만이며, 약 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1.25, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 mg/kg 미만 또는 이들 양 사이의 임의의 용량일 수 있다. 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg의 범위일 수 있다. 당업자는 억제제 및 이를 투여 받는 대상체의 특정의 특성에 기초하여 하기 기재된 바와 같이 투여량을 조정할 것이다.
조성물은 화학식 I의 화합물의 단일 단위 용량, 예를 들어, 화합물 1 또는 화합물 2, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 약 50 mg/kg 이하, 40 mg/kg 이하, 30 mg/kg 이하, 20 mg/kg 이하, 10 mg/kg 이하, 약 5mg/kg 이하, 약 2.5mg/kg 이하, 또는 약 1.5 mg/kg 이하의 단일 단위 용량을 포함할 수 있다. 화학식 I을 갖는 화합물의 하나 또는 다중의 단일 단위 용량, 예를 들어, 화합물 1 또는 화합물 2의 다중의 단일 단위 용량을 포함하는 패키지가 제공된다. 패키지는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 제2 치료제의 단일 또는 다중의 단위 용량을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 화학식 I을 갖는 화합물 중 하나 이상을 투여하기 위한 유효량 및 스케쥴은 경험적으로 결정할 수 있고, 그러한 결정을 내리는 것은 당해 분야의 기술의 범위내에 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향을 받는(예를 들어, 감소되거나 지연되는) 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 투여량은 원하지 않는 교차 반응, 원하지 않는 세포 사멸 등과 같은 실질적인 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 억제제의 유형, 종, 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 대상체의 성별 및 식사, 투여 방식 및 시간, 배설 속도, 약물의 조합 및 특정 증상의 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 금기 사항이 발생한 경우는 개개의 의사가 투여량을 조절할 수 있다. 투여량은 변할 할 수 있으며, 매일 1 회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 화학식 I을 갖는 화합물 및 다른 작용제는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 이들은 예를 들어, 치료학적 유효량의 화학식 I을 갖는 하나 이상의 화합물 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 용어 담체는, 화합물 또는 조성물과 조합시킨 경우에, 그의 의도된 용도 또는 목적을 위한 화합물 또는 조성물의 제조, 저장, 투여, 전달, 유효성, 선택성 또는 기타 임의의 특징을 보조 또는 촉진하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체의 부작용을 최소화하도록 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는, 이에 제한되지 않지만, 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 인공 대뇌 척수액, 덱스트로스 및 물을 포함하는 멸균 생체 적합성 약제학적 담체를 포함한다.
의도된 투여 방식에 따라, 약제학적 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 예를 들어, 정제, 좌약, 알약, 캡슐, 분말, 액체 또는 현탁액과 같은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 바람직하게는 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 조성물은 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 약제 또는 이의 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체와 조합시켜 포함하고, 추가로, 다른 의약품, 약학적 제제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 것은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질을 의미하며, 이는 허용할 수 없는 생물학적 효과를 일으키거나, 그것이 함유된 약제학적 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고, 선택된 약제와 함께 개체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 담체는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 가용화제, 지질, 안정제 또는 약제학적 제제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 다른 물질을 포함한다. 조성물에 사용하기 위한 담체의 선택은 조성물에 대한 의도된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 이들 물질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 담체 및 제형의 제조는 예를 들면 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Loyd V. Allen et al, editors, Pharmaceutical Press(2012)에 기술되어 있다.
생리학적으로 허용되는 담체의 예는 인산염 완충제, 구연산염 완충제 및 다른 유기산을 가진 완충제 등의 완충제; 아스코르브 산을 포함한 항산화제; 저분자량(잔기 약 10개 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린 등의 단백질; 폴리비닐 피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올; 나트륨 등의 염 형성 반대 이온; 및/또는 트윈®(ICI, Inc.; Bridgewater, 뉴저지), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICSTM(BASF; Florham Park, 뉴저지) 등의 비이온성 계면 활성제를 포함한다.
비경구 주사에 적합한 본 명세서에 기재된 역제(들)를 함유하는 조성물은 생리학적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예를 들어, 올리브 오일) 및 에틸올레이트 등의 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하여, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하여, 또는 계면 활성제를 사용하여 유지할 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제 등의 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 예를 들어 파라벤, 클로로 부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 촉진할 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등이 또한 포함될 수 있다. 주사 가능한 약학적 제형의 흡수 지연은 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 초래할 수 있다.
본원에 기재된 화합물 또는 이의 유도체의 경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 환약, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 제형에서, 본 명세서에 기재된 화합물 또는 이의 유도체는 구연산 나트륨 또는 인산이칼슘과 같은 하나 이상의 불활성 통상적인 부형제(또는 담체), 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스, 수크로스, 포도당, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예를 들어 카르복시 메틸 셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수 크로스 및 아카시아, (c) 보습제, 예를 들어 글리세롤, (d) 붕해제, 예를 들어 한천, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정의 복합 규산염 및 탄산나트륨, (e) 용액 지연제, 예를 들어 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예를 들어 4 차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어 세틸알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 윤활제, 예를 들어 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴설페이트, 또는 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토오스 또는 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로 사용될 수 있다.
정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립과 같은 고체 제형은 장용 코팅 및 당업계에 공지된 다른 코팅과 같은 외피로 제조될 수 있다. 이들은 불투명화제를 함유할 수 있고, 또한 활성 화합물 또는 화합물을 장의 특정의 부분에서 지연된 방식으로 방출하도록 조성될 수 있다. 사용할 수 있는 임베딩 조성물의 예는 고분자 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한 적절한 경우 하나 이상의 상기 언급된 부형제와 함께 마이크로 캡슐화된 형태일 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물은 약제학적 조성물에 혼입될 수 있으며, 이는 포유동물에게 이러한 화합물을 즉시 방출 또는 전달을 가능하게 한다. 본 명세서에 기재된 화합물은 또한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있으며, 이는 며칠, 몇 주 또는 한 달 이상의 기간에 걸쳐 포유동물에게 이들 화합물의 변형 방출, 예를 들어 지연 방출 또는 연장 방출(예를 들어, 지속 방출 또는 제어 방출)을 가능하게 한다. 이러한 제형은 예를 들어 미국특허 제5,968,895호 및 제6,180,608호에 기재되어 있으며, 그렇지 않으면 당업계에 공지되어 있다. 당업계에 공지된 임의의 약제학적으로 허용되는, 지연 방출 또는 지속 방출 제형이 고려된다.
본 명세서에 기재된 화합물 또는 이의 유도체의 경구 투여를 위한 액체 제형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물에 더하여, 액체 제형은 물 또는 기타 용매, 가용화제 등 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 유화제, 예를 들어 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 땅콩유, 옥수수 배아유, 올리브유, 피마자유, 참기름, 글리세롤, 테트라히드로퍼푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
이러한 불활성 희석제 외에도, 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 향료 또는 방향제 등의 추가 제제를 포함할 수 있다.
조성물은 국소적 또는 전신적 치료가 요망되는지에 따라 및 치료 대상 부위에 따라 다양한 방식으로 투여된다. 조성물은 경구, 비경구, 정맥내, 복강내, 두개내, 척추강내, 척수강내, 뇌실내, 근육내, 피하, 체강내 또는 경피를 포함하는 임의의 여러 투여 경로를 통해 투여된다. 약제학적 조성물은 또한 예를 들어 국소 적용 또는 국소 주사에 의해 치료가 필요한 부위에 국소적으로 전달될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 투여 방법에 대한 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
전체를 통하여, 치료하다, 치료하는 및 치료는 신경 변성 질환, 심근 변성 질환, 프리온 질환 또는 리소좀 축적 질환 중의 하나 이상의 효과 또는 증상을 감소 또는 지연시키는 방법을 지칭한다. 대상체는 질병 또는 장애로 진단될 수 있다. 치료는 단순히 증상보다는 근본적인 병리를 경감하는 방법을 의미할 수도 있다. 대상체에 대한 투여의 효과는, 이에 한정되지 않지만, 질병의 하나 이상의 증상의 경감, 질병의 중증도 감소, 질병의 완전한 절제, 또는 하나 이상의 증상의 발병 또는 악화의 지연의 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법은 치료 전의 대상체에 비하여, 또는 대조 대상체 또는 대조군 값에 비하여, 대상체의 질병의 하나 이상의 증상이 약 10% 감소하는 경우 치료로 간주된다. 따라서, 감소는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 이들 사이의 임의의 감소량일 수 있다.
전체를 통해 사용되는 바와 같이, 대상체는 개체를 의미한다. 대상체는 성인 대상체 또는 소아 대상체일 수 있다. 소아 대상체는 출생부터 18세까지의 연령 범위가 포함된다. 따라서, 약 10세 미만, 5세 미만, 2세, 생후 1세, 생후 6 개월, 생후 3 개월, 생후 1 개월, 생후 1 주 또는 생후 1 일의 소아 대상체도 대상체로 포함된다. 바람직하게는, 대상체는 영장류와 같은 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 인간이 아닌 영장류도 대상체이다. 대상체라는 용어는 사육 동물, 예를 들어 고양이, 개 등, 가축(예를 들면, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등) 및 실험 동물(예를 들면, 흰 족제비, 친칠라, 마우스, 토끼, 래트, 게르빌루스쥐, 기니피그 등)을 포함한다. 따라서, 수의학적 용도 및 의학적 제형이 본 명세서에서 고려된다.
개시된 방법 및 조성물의 생성물과 함께 사용되거나, 이의 제조에 사용될 수 있는 물질, 조성물 및 구성 요소가 개시된다. 이러한 및 기타 물질은 본 명세서에서 개시되며, 이들 물질의 조합, 서브 세트, 상호 작용, 그룹 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 구체적인 참조는 명시적으로 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 본 명세서에서 구체적으로 고려되고 설명된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되고 방법에 포함된 여러 분자에 대해 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의되는 경우, 방법의 모든 조합과 순열, 및 가능한 변형은 특별히 반대로 지시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 서브 세트 또는 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 이 개념은, 이에 제한되지 않지만, 개시된 조성물을 사용하는 방법의 단계를 포함하는 본 개시의 모든 측면에 적용된다. 따라서 수행할 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이들 추가 단계의 각각은 임의의 특정 방법 단계 또는 개시된 방법의 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있으며, 이러한 각각의 조합 또는 조합의 서브 세트는 구체적으로 고려되며 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에 인용된 간행물 및 이들이 인용된 자료는 그 전체가 본 명세서에 구체적으로 참고로 포함된다.
실시예
티에노[3,2-b]피리딘 유도체의 합성 및 특성화
일반적 정보
시판되는 7-클로로-2-요오도티에노[3,2-b]피리딘(1), m-톨릴보론산(2), 아닐린(4), m-아니시딘(5), 모르폴린(6), 시약, 촉매 및 용매를 추가 정제없이 구입한 그대로 사용하였다. NMR 스펙트럼은 중수소화된 용매 중에서 400MHz(1H NMR) 및 100MHz(13C NMR)에서 얻었다. 반응 생성물은 하기 기재된 바와 같이 실리카 겔(입자 크기 40-63 μm) 상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
합성 방법 및 화합물 특성화
티에노[3,2-b]피리딘 화합물 7-10의 합성
Figure pct00032
Figure pct00033
7-클로로-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘(3). 15 mL의 톨루엔 중에 7-클로로-2-요오도티에노[3,2-b]피리딘(1)(500 mg, 1.69mmol), 3-메틸페닐보론산(2)(230 mg, 1.69mmol), 팔라듐(II) 아세테이트(19mg, 0.084mmol), 트리페닐포스핀(44mg, 0.169mmol) 및 탄산 세슘(1.101g, 3.38mmol)의 혼합물을 환류 하에 24 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 물과 디클로로 메탄 사이에 분배시켰다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 헥산-에틸 아세테이트(8 : 2)를 이동상으로서 사용하는 실리카겔 상의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 화합물 3은 무색 고체로서 72% 수율로 수득되었다(315 mg, 1.21 mmol). Rf = 0.2 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 8.54 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.55 - 7.52 (m, 2H), 7.34 (dd, J = 7.8, 7.8 Hz, 1H), 7.23 (m, 1H), 7.21 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 2.42 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 158.2, 149.6, 148.2, 139.0, 137.6, 133.2, 133.0, 130.4, 129.2, 127.3, 123.8, 120.8, 118.6, 21.5; 분석 계산치 C14H10ClNS: C, 64.74; H, 3.88; N, 5.39. 실측치: C, 64.76; H, 4.05; N, 5.28.
친핵성 방향족 치환 반응의 일반적인 수순
5mL 압력 용기에 7-클로로-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘(3)(0.3mmol), 아민(0.6mmol) 및 DMSO(1.0mL)를 투입하였다. 다음에 압력 용기를 100℃ 오일 배스에 넣고 16 시간 내지 4 일간 교반하였다. 1H NMR 분석을 기반으로 완전한 전환이 이루어진 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하고 물로 세척하였다. 조합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공에서 제거하였다. 조생성물을 하기 기재된 바와 같이 이동상으로서 헥산-에틸 아세테이트를 사용하는 실리카겔 상의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure pct00034
BK-40143
N -페닐-2-(m-톨릴)티에노[3,2- b ]피리딘-7-아민(7). 상술한 일반적 수순에 따라 100℃에서 16 시간 후 1mL의 DMSO 중에서 7-클로로-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘(78mg, 0.3mmol) 및 아닐린(56 mg, 0.6 mmol)으로부터 94% 수율(89mg, 0.282mmol)의 무색 고체로서 화합물 7을 얻었다. R f = 0.2 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.38 (m, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.57 - 7.50 (m, 2H), 7.43 - 7.38 (m, 2H), 7.37 - 7.23 (m, 3H), 7.21 - 7.17 (m, 2H), 6.90 (m, 1H), 6.15 (s, 1H), 2.43 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 158.5, 148.9, 146.5, 145.9, 139.4, 139.0, 133.7, 129.9, 129.7, 129.6, 129.1, 127.3, 124.8, 123.8, 122.7, 122.5, 121.6, 120.7, 102.6, 21.6; 분석 계산치 C20H16N2S: C, 75.92; H, 5.10; N, 8.85. 실측치: C, 75.71; H, 5.32; N, 9.11.
Figure pct00035
BK40195
N -(3-메톡시페닐)-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘-7-아민(8). 상술한 일반적 수순에 따라 100℃에서 16 시간 후 1mL의 DMSO 중에서 7-클로로-2-(m-톨릴)티에노 [3,2-b]피리딘(78mg, 0.3mmol) 및 m-아니시딘(74mg, 0.6mmol)으로부터 92% 수율(95 mg, 0.276 mmol)의 무색 고체로서 화합물 8을 얻었다. R f = 0.2 (헥산/EtOAc, 2:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.41 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.58 - 7.51 (m, 2H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.21 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 7.9, 2.4 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 7.8, 7.7 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 7.9, 2.5 Hz, 1H), 6.07 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.44 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 160.8, 158.6, 148.9, 146.5, 145.6, 140.7, 139.0, 133.7, 130.5, 130.0, 129.1, 127.3, 123.8, 121.7, 120.9, 114.5, 110.1, 108.1, 103.0, 55.5, 21.6; 분석 계산치 C21H18N2OS: C, 72.80; H, 5.24; N, 8.09. 실측치: C, 72.53; H, 5.61; N, 8.19.
Figure pct00036
BK40197
4-(2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘-7-일)모르폴린(9). 상술한 일반적 수순에 따라 100℃에서 4일 후 1mL의 DMSO 중에서 7-클로로-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘(78mg, 0.3mmol) 및 모르폴린(52mg, 0.6mmol)으로부터 98% 수율의 무색 고체로서 화합물 9를 얻었다. R f = 0.2 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.48 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.59 - 7.52 (m, 2H), 7.34 (dd, J = 7.9, 7.8 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 7.9, 2.1 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.03 - 3.85 (m, 4H), 3.54 - 3.39 (m, 4H), 2.43 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 158.8, 153.0, 149.0, 146.6, 139.0, 133.6, 129.9, 129.1, 127.2, 123.7, 123.4, 121.4, 105.9, 66.9, 49.7, 21.6; 분석 계산치 C18H18N2OS: C, 69.65; H, 5.85; N, 9.02. 실측치: C, 69.89; H, 5.72; N, 9.38.
Figure pct00037
BK40196
3-((2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘-7-일)아미노)페놀(10). 무수 디클로로메탄(3mL) 중의 N-(3-메톡시페닐)-2-(m-톨릴)티에노[3,2-b]피리딘-7-아민(8)(69mg, 0.2mmol)의 용액에 불활성 대기하에 -78℃에서 삼브롬화 붕소(4 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 교반하고 반응 온도가 0℃에 도달하도록 하였다. 1M HCl로 급냉한 후, 조반응 혼합물을 EtOAc로 추출하고 물로 세척하였다. 조합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공에서 제거하였다. 조생성물을 이동상으로서 DCM-MeOH(19:1)를 사용하는 실리카 겔상의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 화합물 10은 무색 고체로서 97% 수율(64 mg, 0.194 mmol)로 얻었다. R f = 0.4 (DCM/MeOH, 9:1); 1H NMR (399 MHz, 메탄올-d 4) δ = 8.22 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.61 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.34 - 7.31 (m, 2H), 6.93 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 6.88 (m, 1H), 6.85 - 6.79 (m, 2H), 2.44 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, 메탄올-d 4) δ = 160.1, 154.7, 153.5, 149.5, 141.1, 140.7, 139.5, 133.3, 132.4, 131.9, 131.7, 130.5, 128.2, 125.0, 117.4, 115.7, 114.9, 113.5, 102.7, 21.3; 분석 계산치 C20H16N2OS: C, 72.26; H, 4.85; N, 8.43. 실측치: C, 72.29; H, 4.97; N, 8.61.
세포 배양
래트 신경 아세포종 B35 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 수정 이글 배지(DMEM)에서 증식시키고, 37℃에서 5% CO2와 함께 배양하였다. 실험을 위해, 세포를 12-웰 플레이트(Cat.# 150628, ThermoFisher, Waltham, MA)로 옮기고, 적어도 70% 합류점으로 증식하였다. 일시적 형질 감염은 Fugene HD 형질 감염 시약(Cat.# E2311, Promega, Madison WI)을 사용하여 3㎍ P301L 타우(Cat.# 30145, Addgene) cDNA 또는 3㎍ 인간 α-시누클레인 cDNA로 24 시간 동안 수행하였다. 세포를 DMSO 또는 동등한 5uL의 DMSO에 용해된 1mM, 100μM, 10μM, 1μM, 0.1μM, 0.01μM 및 0.001μM로 5 시간 동안 처리하였다. 세포 배양 배지를 수집하고 세포를 나트륨-트리스, EDTA, NP-40(STEN) 완충액을 사용하여 회수하였다. 10,000 x g에서 20 분 동안 4℃에서 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 세포 생존율은 락테이트 탈수소 효소 분석(Cat.# 88954, Thermofisher) 및 MTT 분석(Cat.# V13154, Thermofisher)을 통해 측정하였다. 배양 배지를 제거하고 0.2ml 1x STEN 버퍼(50mM 트리스(pH 7.6), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.2% NP-40, 0.2% BSA, 20mM PMSF 및 프로테아제 칵테일 억제제)를 세포층에 첨가하여 단백질을 추출하고, 얼음 위에서 10 분 동안 배양하였다. 웰의 바닥을 긁어 내고 얼음 위에서 추가로 10 분 동안 배양하였다. 세포 용해물을 수집하고 -80℃에서 보관하고 추가의 분석에 사용하였다.
약물 준비
분자량 310.1 및 316.4 g/mol을 갖는 화합물 1(BK40197) 및 화합물 2(BK40143)를 각각 디메틸설폭사이드(DMSO) 중에서 최종 농도 100μM, 10μM, 1μM, 0.1μM, 0.01μM 및 0.001μM로 희석하였다. 약물은 -80℃에 보관하였다.
MTT 분석
세포 생존율을 측정하기 위해, 세포를 50μL의 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 함유하는 500 μL의 둘베코 수정 이글 배지(DMEM)로 37℃ 및 5% CO2에서 4 시간 동안 배양하였다. 배지는 125 uL의 배지가 남도록 흡인하였다. 포르마잔 염을 250 uL의 DMSO에 용해시켰다. 125 uL의 배지와 MTT, 및 570 nm에서 250 uL의 DMSO를 함유하는 블랭크에 대해 흡광도를 판독하였다.
젖산 탈수소 효소(LDH) 분석
세포 독성은 최초 투여 5 시간 후에 약물에 노출한 후, 손상된 세포로부터 세포 배지로 방출되는 세포질 효소인 LDH를 평가하여 정량적으로 측정하였다. 세포 배양 배지를 수집하고 분취액을 젖산 및 NAD+와 결합시켰다. LDH는 젖산을 피루베이트로 전환하여 NADH를 생성하는 반응을 촉매한다. 다음에 NADH는 테트라졸륨염(INT)을 적색 포르마잔 생성물로 환원한다. 배지중의 LDH 양은 490nm에서 측정된 포르마잔의 양에 비례한다. 기기로부터 배경 신호를 측정하기 위한 680 nm에서의 흡광도는 490 nm에서의 흡광도에서 차감하여 LDH 활성을 계산하였다.
세포 배양 형질 감염 및 치료
래트 신경 아세포종 B35 세포로 α-시누클레인의 일시적인 형질 감염을 수행하기 위해 FuGene® HD 형질 감염 시약(Promega Corporation, Madison, WI)을 사용하였다. 세포는 12 웰 접시에서 배양하였다. 12μg의 cDNA, 2% FBS를 함유하는 540μg의 DMEM 및 60μl의 FuGene® HD 형질 감염 시약을 포함하는 혼합물을 10분 동안 배양하였다. 세포를 24 시간 동안 50μl의 FuGene® HD 형질 감염 시약/DNA 혼합물로 처리하였다. 형질 감염 후 세포를 수거하고, 배지를 흡인하고, 세포를 200ul의 나트륨 트리스 EDTA NP40(STEN) 용해 완충액으로 처리한 다음 플레이트를 긁어내고, 1.5ml 원심분리관에 수집하였다.
마우스 처리
(a) 마우스 흉선 세포 항원 1, 테타, Thy1, 프로모터의 조절하에 스웨덴(K670N/M671L, Dutch E693Q 및 Iowa D694N 돌연변이)을 함유하는 신경 유래 인간 APP 유전자, 770 이소형을 발현하는 TgAPP 마우스(Davis 등 "아밀로이드 베타-단백질 전구체의 낮은 레벨의 혈관성 더치/아이오와 돌연변이 형태를 발현하는 트랜스 제닉 마우스에서 아밀로이드 베타 단백질의 조기 발병 및 강력한 대뇌 미세 혈관 축적", 생화학 저널. 279(19): 20296-20306 (2004)); (b) 인간 P301L 타우를 발현하고 인간 4-반복 미세관 관련 단백질 타우(4R0NTau P301L)의 P301L 돌연변이 변이체의 발현을 지시하는 tet-반응성 요소(TRE 또는 tetO) 및 마우스 프리온 단백질 프로모터 서열(PrP 또는 Prnp)을 갖는 rTg4510 마우스(Santacruz 등, "신경 변성 마우스 모델에서 타우 억제는 기억 기능을 향상시킴", Science 309 (5733): 476-48 (2005)) 또는 (c) 프리온 프로모터의 제어 하에 트레오닌(A53T) 인간 α-시누클레인에 돌연변이 아르기닌을 발현하는 TgA53T 마우스(Giasson 등, "A53T 인간 알파-시누클레인을 발현하는 마우스에서 중증 운동 장애가 있는 신경 알파-시누클레인 병", Neuron 34(4): 521-533 (2002))에 대해 실험을 수행하였다. 마우스는 BK40143(BK)(조지타운 대학, 의약 화학 프로그램), 닐로티닙(닐로)(Cat.# S1033, Selleckchem Inc., Houston, TX), 보수티닙(보스)(Cat.# S1014, Selleckchem Inc.), 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 1.25mg/kg, 2.5mg/kg 또는 5.0 mg/kg의 BK+ Nilo, BK + Bos 또는 Nilo + Bos의 결합 용액(Cat.# D128-500, Fisher Scientific, Hampton, NH) 또는 동등한 용량의 DMSO만 매일 복강내 주사의 치료를 받았다. 치료 기간은 도면 범례에 지정된 바와 같이 연속 7 일 또는 연속 21 일이었다.
Xmap
Xmap 기술은 두 개의 형광 염료로 내부적으로 코딩된 자기 마이크로스피어를 사용한다. 이들 두 가지 염료의 정확한 조합에 의해, 샘플 내에서 복수의 단백질을 측정하였다. 이들 구의 각각은 특정의 포획 항체로 코팅된다. 포획 항체는 검출 항체와 리포터 분자에 결합하여 비드의 표면에서 반응을 완료한다. 5mg/kg, 2.5mg/kg 및 1.25mg/kg의 BK40143 또는 DMSO로 처리된 트랜스제닉 Tg4510 마우스로부터의 25μl의 가용성 뇌 조직 용해물을 25μl의 검출 항체 용액, 및 다음의 분획물: 인간 포스포- 타우(181)을 함유하는 25μl의 혼합 비드 용액으로 실온에서 밤새(16 내지 20 시간) 배양하였다. 플레이트를 철저하게 세척한 후, 샘플을 25μl의 스트렙타비딘-피코에리트린과 함께 배양하고, 각 웰에 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 다음에 샘플을 세척하고 100ul의 시스액(sheath fluid)에 현탁시켰다. 재현탁 후, 샘플은 Xponent 소프트웨어를 사용하여 MAGPIX에서 실행하였다. MFI(중간 형광 강도) 데이터는 샘플 중의 분석물 농도를 계산하기 위한 5-파라미터 로지스틱 또는 스플라인 커브-피팅법을 사용하여 분석하였다.
단백질 추출
DMSO로 처리된 마우스와 비교한 처리된 마우스의 뇌를 STEN 용해 완충액 [50mM 나트륨 트리스(pH 7.6), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.2% NP-40, 0.2% BSA, 20mM PMSF 및 프로테아제 칵테일 억제제]으로 균질화하고, 10,000g으로 48℃에서 20 분간 원심분리하고, 가용성 단백질 분획을 함유하는 상청액을 수집하였다. 상청액은 SDS-NuPAGE 비스-트리스 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 ELISA상의 웨스턴 블롯(WB)에 의해 분석하였다.
약물동태 연구
C57BL/6J 마우스에 BK의 복강내 주입으로 한번 주입하였다. 뇌 및 혈청은 2, 4, 6 또는 12 시간에 수집하였다(약물 당 n = 18, 용량 및 시점 당 n = 3). 비히클(DMSO)을 주입한 동물을 백그라운드 감산에 사용하였다. 약물의 저장 용액(각각 약 1mg/mL)을 메탄올/디클로로메탄(50:50) 중에서 제조하였다. 각 표준에 대한 계단 희석은 연구용으로 메탄올/HPLC 등급 물(50:50)에서 별도로 생성하였다. 검량선 표준 및 품질 샘플(QC)의 준비는 블랭크 샘플에 스톡 용액을 혼합하여 수행하였다. 혈청 및 뇌 샘플은 -80℃에서 보관한 다음, 준비의 전에 실온으로 해동하였다. 해동된 혈청 샘플(20 uL)을 100 uL의 물이 들어있는 튜브에 수혈하였다. 500 uL 추출 용매, 아세토니트릴/메탄올(50:50)을 샘플에 첨가하였다. 혼합물을 와류시키고 20분간 얼음에 배양하여 단백질의 침전을 가속화시켰다. 배양 후, 샘플을 다시 와류시키고 13,000rpm으로 4℃에서 20 분간 원심분리하였다. 다음에, 상층액을 수집하여 새로운 튜브로 옮기고, 스피드 백(speed vac)을 사용하여 건조하고 200 uL의 메탄올/물(50:50)로 재구성하였다. 혼합물을 다시 13,000 rpm으로 4℃에서 20 분간 회전시켰다. 다음에, 상청액을 질량 분석 샘플 튜브 캡에 수집하고, 질량 분석기에서 실행하였다. 뇌의 경우 각 동물로부터 해동된 뇌 샘플의 작은 섹션을 평평한 바닥 튜브로 옮겼다. 200 uL의 메탄올/물(90:10)을 첨가하고, 조직을 균질화하였다. 다음에, 아세토니트릴을 혼합물에 첨가하여 단백질의 침전을 촉진시켰다. 다음에 혼합물을 얼음 위에서 10 분간 배양하였다. 배양 후, 샘플을 13,000rpm으로 4℃에서 20 분간 와류 및 원심분리하였다. 다음에, 상청액을 수집하고 새로운 튜브로 옮기고, 스피드 백을 사용하여 건조시키고, 200 uL의 메탄올/물(50:50)로 재구성하였다. 혼합물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20 분간 원심분리하였다. 상청액을 질량 분석 샘플 튜브 캡에 수집하고 질량 분석계로 실행하였다. 샘플은 멀티블 리액션 모니터링(MRM) 모드에서 작동하는 트리플 사중극 질량 분석기(Xevo-TQ-S, Waters Corporation)를 구비한 Acquity UPLC BEH C18 1.7μm, 2.1 x 50mm 컬럼에서 온라인으로 분리하였다. 샘플 콘 전압과 충돌 에너지는 두 분석물에 대하여 최적화하여, MassLynx 소프트웨어(Waters Corporation)의 "IntelliStart"기능을 사용하여 부모 및 딸 이온에 대한 최대 이온 강도를 얻었다. 기기의 매개 변수를 최적화하여 부모 이온[m/z = 438.25] 및 딸 이온[m/z = 357.33]에 대한 이온화의 최대 특이성과 감도를 얻었다. 분석물에 대한 모든 MRM Q1/Q3 이온 쌍의 신호 강도는 MRM 기반 정량화를 위한 가장 강한 전구체 및 프래그먼트 이온 쌍을 확실하게 선택할 수 있도록 순위를 매겼다. 이 접근법에 의해 각 프래그먼트 이온 종의 생성을 최대화한 원뿔 전압 및 충돌 에너지가 선택되었다. 6 내지 8점 검량선으로 분석을 수행하고, 샘플 큐(sample queue)를 무작위로 추출하고 용매 블랭크를 주입하여 샘플 캐리오버를 평가하였다. MRM 데이터는 TargetLynx 4.1을 사용하여 처리하였다. 분석물의 상대 정량값은 내부 표준의 피크 면적에 대해 정규화된 샘플의 전이 피크 면적의 비율을 계산하여 결정하였다.
조직 수집 및 단백질 추출
동물은 자일라진 및 케타민의 혼합물(1:8)로 깊이 마취시키고, 500μl의 전혈을 심장 천자를 통해 채취하고, 2000 Х g으로 원심분리하여 혈액 세포를 침전시키고 혈청을 수집하였다. 혈관에서 남아 있는 혈액을 씻어 내고 오염을 줄이기 위해, 동물을 25ml의 1X 인산염 완충 식염수(PBS)로 5 분간 관류시켰다. 뇌를 수집하고 1.0 ml 1x STEN 완충액으로 균질화하였다. 균질화된 샘플을 4℃에서 20분 동안 12,000 x g에서 원심분리하고, 상청액(가용성 단백질 분획)을 수집하여 -80℃에서 보관하였다. 상등액을 제거한 후 불용성 단백질을 추출하였다. 조직 펠렛을 1X STEN 완충액으로 세척하였다. 펠렛은 750ul의 70% 포름산에 재현탁시키고, 실온에서 30 분간 배양한 다음, 4℃에서 1 시간 28,000 g에서 원심분리하였다. 상청액은 "불용성 분획"으로 수집되었다. 70% 포름산 분획의 샘플은 -80℃에 보관하였다. 사용 직전에 1M 트리스-염기(1:20)로 중화하였다. 단백질 레벨은 제조업체의 지침에 따라 Pierce BCA 단백질 분석(ThermoFisher, 23225)을 사용하여 정량화하였다.
면역 블롯 분석
마우스 뇌 용해물로부터 추출한 가용성 및 불용성 단백질을 SDS NuPAGE 비스-트리스 겔(Cat.# NP0301BOX, Invitrogen)에서 분석하고, (1:1000) 마우스 모노클로날 AT180(Cat.# MN1040, ThermoFisher) 및 (1:1000) 마우스 모노클로날 AT8(Cat.# MN1020, ThermoFisher)로 인산화된 타우, (1:3000) 마우스 모노클로날 타우-5 항체로 전체 타우, (1:250) 토끼 폴리클로날 MCK10(Cat.# PA5-64780, ThermoFisher)로 인산화 DDR1, (1:5000) 토끼 폴리클로날(Cat.# PA3-16717, ThermoFisher)로 유비퀴틴, (1:1000) 토끼 모노클로날(Cat. #mAb 12994, Cell Signaling, Danvers, MA)로 Atg5, (1:1000) 토끼 모노클로날(Cat. #mAb 3495, Cell Signaling)로 Beclin-1 및 (1:8000) 토끼 폴리클로날(Cat. # MAB1501R, EMDMillipore, Burlington, MA)로 액틴에 대해 프로빙하였다. AmershamTM Imager 600(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)에서 Super SignalTM West Dura Extended Duration Substrate(Cat. # 37071, ThermoFisher)를 사용하여 블롯을 시각화하였다. 웨스턴 블롯은 Image J 소프트웨어를 사용하여 덴시토메트리(densitometry)로 정량화하였다.
효소 결합 면역 측정(ELISA)
인간 α-시누클레인 및 p-타우 ELISA는 실온에서 50μl의 1차 항체(3 시간) 및 100μl의 항-토끼 2차 항체(30 분)로 검출된 50μl(1μg/μl)의 세포 용해물을 사용하여 수행하였다. α-시누클레인 레벨은 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 특이 적 ELISA(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 측정하였다. 타우는 제조업체의 프로토콜에 따라 세린 396에서 특정의 타우를 사용하여 측정하였다. 각 샘플은 복제되었다.
전체 타우, AB40 및 AB42(Millipore Cat # HNABTMAG 60K)에 대한 ELISA는 Milliplexed ELISA를 사용하여 수행하였다. 상기 설명한 바와 같이 Xmap 기술은 두 개의 형광 염료로 내부적으로 코딩된 자성 마이크로스피어를 사용한다. 이들 두 가지 염료의 정확한 조합을 통해, 복수의 단백질을 샘플 내에서 동시에 측정한다. 이러한 구의 각각은 특정의 포획 항체로 코팅한다. 포획 항체는 검출 항체와 리포터 분자에 결합하고, 비드 표면에서 반응을 완료한다. 기준선과 52 주에 위약과 레스베라트롤을 포함한 모든 샘플은 동일한 시약을 사용하여 병행하여 분석하였다. 총 25μl의 가용성 단백질을 전체 타우, AB40 및 AB42를 포함하는 혼합 비드 용액 25μl와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 샘플을 25μl 검출 항체 용액과 함께 실온에서 1.5 시간 배양하였다. 스트렙타비딘-피코에리트린(25μl)을 25μl의 검출 항체 용액을 포함하는 각 웰에 첨가하였다. 다음에, 샘플을 세척하고 100μl의 시스 유체에 현탁시켰다. 다음에, Xponent 소프트웨어를 사용하여 MAGPIX에서 샘플을 분석하였다. 중앙치 형광 강도(MFI) 데이터는 샘플에서 분석물 농도를 계산하기 위해 5-파라미터 로지스틱 또는 스플라인 커브-피팅법을 사용하여 분석하였다. 특정의 p-Tau ser396(Invitrogen, KHB7031), 인간 타우 thr181(Invitrogen, KHO0631) 및 Aβ1-42(Invitrogen, KHB3442)는 제조업체의 프로토콜에 따라 1XSTEN 완충액 중의 중뇌 용해물로부터 조직 가용성 추출물에 대해 수행하였다(상기 참조).
거동
Rotarod: 마우스는 마우스 별로 개개의 타이머가 장착된 가속 로드(Cat.# 76-0770, Panlab, Harvard Apparatus)에 두었다. 마우스는 4 회 시험, 3 회 시험 및 1 회 시험을 통해 테스트하였다. 마우스는 적어도 5분 동안 분당 4 회전(rpm)으로 로드에 머물도록 훈련시킨 다음, 속도는 300 초에 걸쳐 서서히 40rpm으로 증가하고, 낙하할 때까지의 대기 시간을 측정하였다.
오픈 필드: 마우스를 오픈 필드 아레나 장치(25cm x 25cm)에 60 분간 두었다.
동물은 아레나 바닥을 따라 광전지 빔으로 추적하였다. 데이터를 수집하고 60 분 동안의 총 이동거리(cm), 총 이동시간(초) 및 속도(거리/시간)에 대해 분석하였다. 중앙 구역은 장치의 중앙 및 중앙 구역 항목, 중앙 구역 이동 거리(cm)에 (25cm x 25cm)로 소프트웨어에서 디지털 방식으로 정의하였다. 60 분간의 시험 중에 중앙 구역에서 소비한 시간(초)을 기록하였다.
Morris Water Maze: 물 미로 장치는 25℃에서 유지되는 물로 채워진 직경 4 피트의 풀(San Diego Instruments)로 구성하고, 흰색 페인트로 불투명하게 만들고, 디지털 방식으로 4 개의 사분면 구역(ANYMaze 소프트웨어, San Diego Instruments)으로 나누었다. 풀을 둘러싼 벽에 여분의 미로 시각적 큐를 걸어두고, 숨겨진 플랫폼(직경 4 인치)이 '플랫폼 구역' 중앙의 수면 1cm 아래에 침전하였다. 훈련은 4 일 동안 하루에 3회의 시험으로 구성되어 5 일째에 프로브 시험으로 이어졌다. 마우스는 3 개의 엔트리 포인트 중 하나(비플랫폼 사분면 구역 당 하나씩)에서 풀에 도입하고, 모든 엔트리 포인트를 1일 동안 사용하였다. 플랫폼의 위치는 전체 교육 기간 동안 일정하게 유지하였다. 플랫폼을 찾기 위해 마우스에게 60 초를 주었다. 제거하기 전에 10 초 동안 플랫폼에 머물렀다. 60 초 이내에 플랫폼을 찾지 못한 마우스는 미로로부터 제거하기 전에 10 초 동안 플랫폼에 두었다. 5 일째의 프로브 시험에서, 플랫폼을 제거하고, 추적 소프트웨어(ANYMaze)를 사용하여 플랫폼, 플랫폼 사분면 구역, 수영 속도 및 수영 경로를 찾기 위한 대기 시간을 기록하였다. 이 훈련 및 프로브 시험 패러다임은 치료 전과 치료 후 수행하였다.
마블 매설 시험: 마블 매립 시험은 이전에 설명한 바와 같이 [35] 수정하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 직경 15mm의 마블 20 개를 2배 크기의 래트 케이지에 부드럽게 포장된 5cm 깊이의 옥수수 속대 침구의 표면에 각각 4 개의 마블 5 줄로 4cm 간격으로 배치하였다. 마우스를 케이지에 30 분 동안 홀로 방치하였다. 치료를 알지 못한 관찰자는 매설된 마블의 수를 카운트하였다. 크기의 3 분의 2 이상 매설되어 있는 모든 마블을 카운트하였다. 각 마우스는 처치 전 및 처치 후 한 번 평가하고, 데이터는 동물 당 매설 마블의 비율의 평균±SEM으로 보고되었다. Kuskal-Wallis 검정에 이어 Wilcoxon 사후 검정을 사용하여 약물 또는 DMSO로 처리된 마우스에서 마블 매설의 통계적 유의성을 결정하였다.
통계 분석
모든 통계 분석은 GraphPad Prism, 버전 8.0(GraphPad 소프트웨어사)을 사용하여 수행하였다. 마우스와 관련된 실험의 경우, 각 실험에 사용된 샘플 크기(n) 및 여성: 남성 비율은 도면의 범례에 표시되어 있다. 세포주를 사용하는 실험의 경우, 독립적인 생물학적 복제의 수가 보고된다(N). 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. 두 그룹의 평균을 비교하면, 양측 스튜던트 t 검정 또는 Welch t 검정을 수행하였다. 복수의 그룹의 평균을 비교하면, 일원 배리언스 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 다중 비교 사후 검정이 수행되었다. 별표 또는 파운드 기호는 그룹 간 또는 그룹 내의 실제 p-값 유의성(* <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001)을 나타낸다. 개개의 도면의 범례에 기록되어 있다.
결과
도 1(좌측 패널과 중간 패널)에서 볼 수 있듯이, 16 시간 치료 후, 신경 보호 효과는, 대조군과 비교하여, LDH의 감소 및 MTT의 증가에 의해 각각 입증되는 바와 같이, 1 μM BK41043으로 처리된 B35 세포에서 관찰되었다. 도 1(우측 패널)은, 5 시간의 치료 후, BK40143의 농도가 감소함에 따라 LDH가 감소함으로써 세포 생존율이 단계적으로 증가했음을 나타낸다.
도 2는 pTau(좌측 패널) 또는 α-시누클레인(우측 패널)으로 24 시간 형질 감염하고, BK41043으로 5 시간 처리한 후 B35 세포의 세포 생존율을 나타낸다.
B35 세포를 완전 배지에서 증식시키고, 제조업체의 지침에 따라 FuGene HD 형질 감염 시약을 사용하여 인간 돌연변이 타우 및 알파-시누클레인에 대해 cDNA로 형질 감염시켰다. 24 시간에서 형질 감염은 ELISA를 통해 형질 감염되지 않은 세포에 비해 훨씬 더 많은 양의 포스포-타우 및 알파-시누 클레인을 생성하였다. 도 3은 24 시간 형질 감염 후 pTau(181)의 레벨을 나타내며, 또한 BK41043이 pTau 형질 감염된 B35 세포의 pTau(181) 레벨을 컨트롤 레벨까지 감소함을 나타낸다. 이는 실험 중에 독성이 증가하지 않았음을 나타내는 LDH 레벨의 변화없이 발생하였다. 도 4는 24 시간 형질 감염 후 α-시누클레인 레벨을 나타내며(좌측 패널), 또한 BK41043이 α-시누클레인 형질 감염된 B35 세포에서 α-시누클레인이 감소함을 나타낸다(우측 패널).
도 5는 BK40197로 5 시간 처리한 후 B35 세포의 세포 생존율을 나타낸다.
도 6은 BK40143이 7 일 처리한 후 타우 발현 트랜스제닉 마우스에서 pTau(181)를 감소시킴을 나타낸다. pTau(181)의 레벨은 ELISA를 통해 측정하였다.
도 7은 BK-40143(1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg 또는 5.0 mg/kg)에 의한 처리는 트랜스제닉 마우스에서 pTau(231)(AT180) 레벨에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
도 8은 타우(HT7)가 1.25 mg/kg 및 2.5 mg/kg에서 BK-41043으로 7 일간 처리한 후 타우 트랜스제닉 마우스에서 현저하게 감소되었음을 나타낸다.
도 9는 BK-40143(1.25 mg/kg 또는 2.5 mg/kg)으로 처리하면 인산화 DDR1(pMCK10)의 검출에 의해 측정되는 바와 같이 DDR1의 생체내 억제가 발생함을 나타낸다.
도 10은 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg의 BK-40143으로 처리한 후 CamP301L 마우스에서 pTau가 감소되었음을 나타낸다.
도 11에 나타낸 바와 같이, BK40196은 고농도에서 알파-시누클레인을 감소시켰고, BK40197은 알파-시누클레인을 감소시키지 않았다. 1mM 및 100uM의 BK40196은 형질 감염된 B35 세포에서 알파-시누클레인 레벨을 유의하게 감소시켰다(도 11a). BK40197은 형질 감염된 B35 세포에서 알파-시누클레인 레벨을 감소시키는 능력을 나타내지 않았다(도 11b).
도 12a에 나타낸 바와 같이, BK-40143은, DMSO 처리 대조군 A53T 마우스에 비해서, A53T 마우스에서 알파-시누클레인을 현저하게 감소시켰다. C57BL/6J 마우스를 대조군으로 사용하였고, 검출 가능한(N.D.) 인간 알파-시누클레인을 나타내지 않았다. 도 12b는 BK-40143이 도파민의 전체적인 레벨을 미미하게(약 30%) 증가시킨다는 것을 나타낸다. 그러나 BK40143은 A53T 마우스에서 도파민 대사산물인 호모바닐산(HVA)의 레벨을 증가시켰으며, 이는 더 많은 도파민 회전을 나타내어 더 양호한 도파민 신경 전달을 초래할 수 있음을 나타낸다. 알파-시누클레인(ThermoFisher, MA1-12874)에 대한 도 12c 및 12d에 나타낸 면역 블롯은 ELISA에서 볼 수 있는 알파-시누클레인의 40% 감소를 반영하였다.
동물 연구는 또한 BK-40143이 A53T 마우스에서 운동 속도를 향상시키는 것으로 나타났다. A53T 마우스는 60 분 동안의 전체 운동 능력에 대한 오픈 필드 시험에서 시험하였다. 마우스는 총 이동 거리 또는 총 이동 시간에 차이가 없었지만, BK-40143 치료로 움직임의 속도가 크게 증가하였다(도 13). 이것은 BK 후 HVA의 레벨의 증가로 표시되는 더 양호한 도파민 신경 전달의 반영일 수 있다(도 12b).
또한 BK40143은 DDR을 선택적으로 비활성화하지만 Src 또는 Abl은 비활성화하지 않고 rTG4510 타우 병증 마우스 모델에서 인산화된 타우를 감소시키는 것으로 나타났다. 수컷 및 암컷, 3 개월령 rTG4530 마우스를 연속 7 일 동안 1.25mg/kg, 2.5mg/kg 또는 5mg/kg의 BK40143 또는 DMSO로 복강내로 투여하였다.
도 14a의 활성화된(인산화된) DDR1에 대한 면역 블롯 프로빙(immunoblot probing)은 5 mg/kg이 아닌 1.25 및 2.5 mg/kg의 BK40143이 DDR1을 비활성화하였음을 증명한다. 도 14b의 활성화된 Src에 대한 면역 블롯 프로빙은 BK40143이 이러한 티로신키나제에 관여하지 않았음을 증명한다. 도 14c의 활성화된 Abl에 대한 면역 블롯 프로빙은 BK40143이 이러한 티로신키나제, 즉 DDR1에 관여하지 않았음을 입증한다. 인산화된 타우(AT8)를 프로빙할 때, 도 14d는 BK40143의 3가지 용량 모두가 인산화된 타우의 레벨을 41 내지 49% 감소시켰음을 나타낸다. 도 14e에 나타낸 바와 같이, 인산화된 타우(AT181)에 대한 ELISA는 2.5mg/kg의 BK40143이 인산화된 타우를 현저하게 감소시켰음을 나타낸다.
BK40143은 또한 아밀로이드, 인산화된 타우 및 비활성화된 DDR1을 현저하게 감소시켰다. 수컷 및 암컷, 7 개월령 APP 마우스를 21일 연속 1.25 및 2.5mg/kg의 BK40143 또는 DMSO로 복강내로 투여하였다. 세포외 아밀로이드-베타(6E10)를 응집시키기 위한 면역 블롯은 1.25 및 2.5 mg/kg의 BK40143이 아밀로이드-베타 플라크를 현저하게 감소시켰다는 것을 입증한다(도 15a). 인산화된 DDR1에 대한 면역 블롯 프로빙은 1.25 및 2.5mg/kg의 BK40143이 각각 DDR1을 40% 및 31% 비활성화했음을 증명한다(도 15b). 활성화된(인산화된) Abl(245)에 대한 프로빙은 BK40143이 Abl에 관여하지 않았음을 증명한다(도 15c). 15d 및 15e는 1.25 및 2.5mg/kg의 BK40143이 ELISA를 통해 가용성 인간 아밀로이드-베타를 현저하게 감소시켰지만, 불용성 아밀로이드-베타를 현저하게 감소시키지는 않았음을 나타낸다. 또한 2.5mg/kg의 BK40143이 인간 인산화된 타우(Ser396)를 80% 이상 현저하게 감소시켰음을 나타낸다(도 15f).
또한 BK40143은 APP 마우스의 인지를 위한 Morris Water Maze 테스트에서 성능을 향상시킬 수 있음을 보여준다. APP 마우스는 표적 플랫폼을 찾는 능력에 대해 처리 후 Morris Water Maze에서 시험하였다. 측정에는 플랫폼 엔트리 수(도 16, 좌측 패널), 첫 번째 엔트리까지의 대기 시간(도 16, 중앙 패널), 및 플랫폼으로의 첫 번째 엔트리 전에 이동한 거리(도 16, 우측 패널)를 포함한다. 그룹 간에 현저한 차이는 없었지만, 1.25mg/kg의 BK40143은 플랫폼 엔트리의 수가 많고, 첫 번째 엔트리까지의 대기 시간이 짧아지고, 플랫폼으로의 첫 번째 엔트리전에 이동한 거리가 짧아짐에 따라 성능이 향상되는 경향을 나타냈다(도 16).
연구에 따르면 BK40143은 APP 마우스의 해마에서 세포 사멸을 유발하지 않은 것으로 나타냈다. 대표적인 20um 해마 섹션은 nissl 물질로 염색하였다. DMSO, 1.25mg/kg 및 2.5mg/kg의 BK40143의 4배 및 20배 영상이 도 17에 나타나 있다(좌측 패널). 평균 염색 강도는 모든 4배 영상에서 nissl 염색의 총량으로서 imagej 소프트웨어에서 정량화하였다(도 17, 우측 패널).
이들 데이터는 화학식 I의 화합물, 예를 들어 BK41043 또는 BK40197은 신경 변성 장애, 심근 변성 장애 또는 리소좀 축적 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다는 것을 제안한다.

Claims (39)

  1. 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00038
    I
    상기 식에서,
    X는 N 또는 CH이고;
    Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
    R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
    R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
    Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
    R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
    n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하나 이상의 할로겐 원자를 포함하지 않는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, Y가 2-m-톨루일인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, Z가 헤테로사이클릴인, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, Z가 모르폴린-1-일인, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 화합물:
    Figure pct00039
    .
  7. 제1항에 있어서, R3이 H이고 R4가 비치환된 페닐인, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 화합물:
    Figure pct00040
    .
  9. 대상체에서 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 중추 신경계의 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환을 앓고 있거나 중추 신경계의 신경 변성 질환, 심근 변성 질환 또는 프리온 질환이 발병할 위험이 있는 대상체에게 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00041
    I
    상기 식에서,
    X는 N 또는 CH이고;
    Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
    R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
    R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
    Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
    R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
    n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00042
    .
  11. 제9항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00043
    .
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 혈액 뇌 장벽을 투과하는, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중추 신경계의 신경 변성 질환이 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, α-시누클레이노패시 및 타우패시로부터 선택되는, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 전신적으로 투여되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 화합물이 경구로 투여되는, 방법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 10 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는, 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 5 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는, 방법.
  18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 2.5 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는, 방법.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 매일 투여되는, 방법.
  20. 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 약제학적 조성물 중에 있는, 방법.
  21. 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2 치료제가 레바도파, 도파민 작용제, 항콜린제, 모노아민 산화효소 억제제, COMT 억제제, 아만타딘, 도네페질, 메만틴, 리스페리돈, 리바스티그민, NMDA 길항제, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 릴루졸, 항정신병제, 항우울제 및 테트라베나진으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 뉴런에서의 독성 단백질 응집을 억제 또는 예방하는 방법으로서, 뉴런을 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00044
    I
    상기 식에서,
    X는 N 또는 CH이고;
    Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
    R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
    R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
    Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
    R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
    n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
  24. 제23항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00045
    .
  25. 제23항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00046
    .
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 아밀로이드 생성 단백질, 알파-시누클레인, 타우 및 TDP-43로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 생체외에서 수행되는, 방법.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 수행되는, 방법.
  29. 대상체에서의 리소좀 축적 질환(LSD)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, LSD를 갖는 대상체에게 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    Figure pct00047
    I
    상기 식에서,
    X는 N 또는 CH이고;
    Y는 R1로 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴; 또는 R1로 치환 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴, 또는 N-메틸피페라지닐이고;
    R1은 -(CH2)n-R2, -(CH2)n-C(O)-R2, 또는 -O(CH2)n-R2이고;
    R2는 -H, -CN, 할로겐, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3 알킬아미노, 디-C1-3 알킬아미노, 하이드록실-C1-3 알킬아미노, 카르복시-C1-3 알킬아미노, C3-6 사이클로알킬-C1-3 알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록실피롤리디닐, 하이드록실-C1-3 알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3 알킬피페리디닐, 디-C1-3 알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3 알킬피페라지닐, C1-4 알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르폴리닐이고;
    Z는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 또는 NR3R4이고;
    R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 또는 비치환된 페닐이고;
    n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
  30. 제29항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00048
    .
  31. 제29항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00049
    .
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 축적 질환이 헐러 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 샤이에 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군 A, 산필리포 증후군 B, 산필리포 증후군 C, 산필리포 증후군 D, 모르퀴오 증후군 A, 모르퀴오 증후군 B, 마로토-라미 증후군, 슬라이 증후군, 나토위찌 증후군, 가성 헐러 다발성이영양증, 테이-삭스병, 고셰병, 니만-피크병, 푸코시드 축적증, 갈락토시알리도시스, 글로보이드 세포 백질이영양증, GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증, α-만노시드증, 이염성 백질이영양증, 니만-피크 AB병 및 폼페병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 소아 대상체인, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효량의 화합물이 대상체의 하나 이상의 세포에서 독성 물질 응집을 억제하거나 방지하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 뇌 세포, 대상체의 하나 이상의 말초 조직 내의 세포, 또는 이들의 조합인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 뇌 세포가 뉴런 및/또는 아교 세포인, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효량이 약 10 mg/kg 미만인, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제 또는 치료법을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 제2 치료제 또는 치료법이 효소 대체 요법, 유전자 요법, 조혈 줄기 세포 이식 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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