KR20230131906A - Usp13 억제제 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Usp13 억제제 및 이의 사용 방법 Download PDF

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샤벨 무사
크리스챤 울프
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조지타운 유니버시티
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Abstract

신규 유비퀴틴 특이적 단백질분해효소 13(USP13) 억제제와 이의 사용 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 USP13 억제제는 신경퇴행성 질병 및 암과 같은 USP13 관련 질병의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 또한 본원에 기재된 화합물 및 조성물을 사용하여 세포에서 USP13을 억제하는 방법이 제공된다.

Description

USP13 억제제 및 이의 사용 방법
선행 관련 출원
본 출원은 2021년 1월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 63/137,425의 이익을 주장하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
배경기술
유비퀴틴 연결은 대부분의 세포 과정과 신호 전달 경로에 관여한다. 유비퀴틴 특이적 단백질분해효소(USP)-13(USP13)은 시스테인 의존정 단백질분해효소 수퍼패밀리의 탈유비퀴틴화효소 멤버이다. 구체적으로, USP13은 단백질 기질에서 유비퀴틴을 절단하여 유비퀴틴 매개 단백질 분해를 역전시키는 유비퀴틴 특이적 효소이다. 유비퀴틴은 단백질을 프로테아좀과 리소좀을 포함한 주요 분해 경로에 대해 표적화한다. 흑색종 세포에서, USP13은 유비퀴틴화 및 탈유비퀴틴화를 통해 여러 단백질의 분해를 조절한다. 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화 주기 조절 및 자가포식과 단백질 분해의 개시와 제어에서 USP13의 역할은 세포 항상성과 생존에 필수적이다.
신규 유비퀴틴 특이적 단백질분해효소 13(USP13) 억제제와 이의 사용 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 USP13 억제제는 신경퇴행성 질병 및 암과 같은 USP13 관련 질병의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 또한 본원에 기재된 화합물 및 조성물을 사용하여 세포에서 USP13을 억제하는 방법이 제공된다.
소분자 USP13 억제제는 다음 화학식의 화합물:
및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물을 포함한다. 이들 화합물에서, n은 0, 1 또는 2이고; L은 S, O 또는 NR7이고; X는 S, O, NR8 또는 CR5=CR6이고; Y1, Y2, Y3 및 Y4는 각각 독립적으로 N 또는 CR이고, 이때 R은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 Y1, Y2, Y3 및 Y4 중 적어도 하나는 N이고; R1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이고; 각 R2는 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; R3, R4, R5 및 R6은 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; R7 및 R8은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
선택적으로, 화합물은 아래 나타낸 바와 같은 화학식을 갖는다:
또는 .
선택적으로, 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, ,
, 및 .
본원에 기재된 바와 같은 소분자 USP13 억제제는 또한 다음 화학식의 화합물:
및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 전구약물을 포함하고, 이때 AA는 아미노산 또는 이의 에스테르이고; Ar는 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이고, 이때 AA는 AA의 아미노 기를 통해 Ar에 공유 결합된다. 선택적으로, 아미노산 또는 이의 에스테르는 천연 아미노산 또는 이의 에스테르 또는 비천연 아미노산 또는 이의 에스테르이다.
선택적으로, 화합물은 다음 화학식을 갖는다:
, 이때
Ar은 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이고; R1 및 R2는 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; R3은 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이다.
선택적으로, 화합물은 다음 화학식을 갖는다:
, 이때
n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; R4는 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각 R5는 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
선택적으로, 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 .
또한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 기재된다.
추가로 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 본원에 기재된다.
대상체의 USP13 관련 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 대상체의 USP13 관련 질병을 치료 또는 예방하는 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 USP13 관련 질병을 앓는 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
선택적으로, USP13 관련 질병은 신경퇴행성 질병(예를 들어, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, α-시누클레인병증, 타우병증, 또는 TDP-43의 세포내 축적과 관련된 병리)이다. 상기 방법은 신경퇴행성 질병을 앓는 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 제2 치료제(예를 들어, 레바도파, 도파민 작용제, 항콜린제, 모노아민 산화효소 억제제, COMT 억제제, 아만타딘, 리바스티그민, NMDA 길항제, 콜린에스테라제 억제제, 릴루졸, 항정신병제, 항우울제 또는 테트라베나진)를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로, USP13 관련 질병은 암(예를 들어, 췌장암, 유방암, 뇌암, 폐암, 전립선암, 결장직장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 신경섬유종증 1, 림프종 또는 백혈병)이다. 상기 방법은 암을 앓는 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 제2 치료제(예를 들어, 화학요법제 또는 방사선)를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
세포에서 USP13을 억제하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 세포에서 USP13을 억제하는 방법은 세포를 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다.
세포에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 세포에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 방법은 세포를 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 선택적으로, 접촉은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
하나 이상의 구체예의 세부 사항은 아래 도면 및 설명에 제시된다. 다른 특징, 목적 및 장점이 상세한 설명과 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a-1f는 BK50118-A(도 1a), BK50118-B(도 1b), BK50118-C(도 1c), CL3-514(도 1d), CL3-512(도 1e) 및 CL3-499(도 1f)로 처리된 인간 SHSY5Y 신경모세포종 세포에서 MTT 및 LDH 분석으로부터 얻은 데이터를 보여주는 그래프이다. 그룹당 N=3-4.
도 2a-2f는 BK50118-A(도 2a), BK50118-B(도 2b), BK50118-C(도 2c), CL3-514(도 2d), CL3-512(도 2e) 및 CL3-499(도 2f)로 처리된 인간 SHSY5Y 신경모세포종 세포에서 ELISA를 통한 USP13 활성을 보여주는 그래프이다. 그룹당 N=3-9.
도 3a-3f는 BK50118-A(도 3a), BK50118-B(도 3b), BK50118-C(도 3c), CL3-514(도 3d), CL3-512(도 3e) 및 CL3-499(도 3f)로 처리된 인간 SHSY5Y 신경모세포종 세포에서 알파-시누클레인의 ELISA 수준을 나타낸다. 그룹당 N=3-9.
도 4A-N은 TgA53T 마우스에서 BK50118-C가 알파-시누클레인을 현저하게 감소시켰지만 p-타우 수준은 감소시키지 않음을 보여준다. 수컷 및 암컷 TgA53T 마우스를 7 일 동안 10 mg/Kg 또는 40 mg/Kg의 일일 용량으로 비히클 또는 BK50118-C의 복강내 주사로 처리했다. (A) 상기 마우스에서 4-12% SDS-NuPAGE 겔 상의 액틴에 대한 알파-시누클레인의 수준을 보여주는 중뇌 용해물의 WB. (B) 첫 번째 블롯은 WB 밀도측정이다. 두 번째 및 세 번째 블롯은 IP 알파-시누클레인(syn) 또는 유비퀴틴이다. (C) 알파-시누클레인의 수준 및 (D) BK50118-C 처리 후 ptau396을 보여주는 ELISA. 별표는 해당하는 비히클에 대한 통계적 유의차 * p < 0.05 또는 ** p < 0.01을 나타낸다. 일반적인 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 분석에 사용했다. 그룹당 N = 3-4 마리의 마우스. DAB +니슬 염색. C는 상응하는 비히클(E/G) 또는 (J/L)과 비교하여 피질(F/H) 및 선조체(K/M)에서 알파-시누클레인 수준을 현저하게 감소시켰으며, 이는 피질(I) 및 선조체(N)에서 알파-시누클레인 양성 세포의 정량화에 의해 확인되었다. 양측 스튜던트 t 검정을 분석에 사용했으며, *는 비히클에 대해 p < 0.05를 나타낸다. 그룹당 N = 3-4 마리. 모든 값은 평균 ±SD로 나타난다. 축척 막대: 100 μm (E,F,J,K) 또는 200 μm (G,H,L,M).
도 5A-N은 BK50118-C가 알파-시누클레인 유비퀴틴화를 현저하게 증가시켰지만 TgA53T 마우스의 선조체에서 티로신 수산화효소(TH) 수준에 미치는 영향이 최소였음을 나타낸다. 수컷 및 암컷 TgA53T 마우스를 7 일 동안 40 mg/Kg의 일일 용량으로 비히클 또는 BK50118-C의 복강내 주사로 처리했다. 20 μm 두께의 뇌 절편의 면역화학 분석은 DMSO(A,C,E) 또는 BK50118-C(B,D,F)로 처리된 TgA53T 마우스의 선조체에서 알파-시누클레인, 유비퀴틴화 및 DAPI 염색을 나타냈다. BK50118-C는 알파-시누클레인 유비퀴틴화를 증가시켰으며, 이는 공동 편재화(G)의 광학 밀도에 의해 확인되었다. 면역염색은 비히클 DMSO(H,J,L) 및 BK50118-C(I,K,M)에서 TH 및 DAPI 염색을 보여주었다. BK50118-C는 선조체의 TH 수준에 최소한의 영향을 미쳤고, 이는 광학 밀도(N)의 정량화에 의해 확인되었다. 별표는 통계적 유의차 * p < 0.05를 나타낸다; 분석을 위해 양측 스튜던트 t 검정을 사용했다. 그룹당 N = 3-4 마리의 마우스. 모든 값은 평균 ±SD로 나타난다. 축척 막대: 200 μm.
도 6A-I는 BK50118-C가 TgA53T 마우스에서 세포 생존을 개선했음을 보여준다. 수컷 및 암컷 TgA53T 마우스를 7 일 동안 40 mg/Kg의 일일 용량으로 비히클 또는 BK50118-C의 복강내 주사로 처리했다. 니슬 염색은 BK50118-C가 상응하는 비히클 A), D) 및 G)와 비교하여 피질 B), 선조체 E) 및 흑색질(SN) H)에서 뉴런 수를 현저하게 증가시켰음을 보여주었고, 이는 피질 C), 선조체 F) 및 SN I)에서 니슬+ 세포의 정량화에 의해 확인되었다. 별표는 비히클에 대한 통계적 유의차를 나타낸다. 비히클에 대해 * p<0.05. 양측 스튜던트 t 검정을 분석에 사용했다. 그룹당 N=3-4 마리의 마우스. 모든 값은 평균 ±SD로 나타난다.
유비퀴틴 특이적 단백질분해효소(USP)-13은 기질 또는 단백질에서 유비퀴틴을 절단하는 탈유비퀴틴화효소이다. 흑색종 세포에서, USP13은 유비퀴틴화 및 탈유비퀴틴화를 통해 여러 단백질의 분해를 조절한다. 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화 주기 조절 및 자가포식과 단백질 분해의 개시와 제어에서 USP13의 역할은 세포 항상성과 생존에 필수적이다. 또한, USP13은 사후 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 뇌에서 과발현된다. 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화의 균형은 신경퇴행성 질병에서 독성 단백질 분해에 중요하다. USP13 녹다운은 PD 모델에서 알파-시누클레인 유비퀴틴화 및 제거를 증가시키고 파킨 기능을 조절한다. USP13 녹다운은 AD 모델에서 p-타우 유비퀴틴화를 증가시키고 p-타우 및 Aβ의 제거를 촉진한다. 따라서 USP13은 신경퇴행에서 단백질 제거를 조절하는 데 중요한 역할을 한다.
신규 유비퀴틴 특이적 단백질분해효소 13(USP13) 억제제와 이의 사용 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 USP13 억제제는 신경퇴행성 질병 및 암과 같은 USP13 관련 질병의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 또한 본원에 기재된 화합물 및 조성물을 사용하여 세포에서 USP13을 억제하는 방법이 제공된다.
I. 화합물
본원에 기재된 USP13 억제제의 클래스는 화학식 I:
및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물로 표시된다.
화학식 I에서, n은 0, 1 또는 2이다.
또한 화학식 I에서, L은 S, O 또는 NR7이다.
추가적으로 화학식 I에서, X는 S, O, NR8 또는 CR5=CR6이다.
또한 화학식 I에서, Y1, Y2, Y3 및 Y4는 각각 독립적으로 N 또는 CR이고, 이때 R은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, Y1, Y2, Y3 및 Y4 중 적어도 하나는 N이다. 일부 예에서, Y1, Y2, Y3 및 Y4 중 하나만 N이다.
추가로 화학식 I에서, R1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이다.
또한 화학식 I에서, 각 R2는 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
추가적으로 화학식 I에서, R3, R4, R5 및 R6은 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
추가로 구조 I에서, R7 및 R8은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
일부 경우에, 화학식 I에 따른 화합물은 구조 I-A로 표시된다:
구조 I-A
구조 I-A에서, n, L, X, R1, R2, R3, R4 및 R7은 화학식 I에 대해 위에 정의된 바와 같다.
일부 경우에, 화학식 I에 따른 화합물은 구조 I-B로 표시된다:
.
구조 I-B
구조 I-B에서,n, R1, R2, R3, R4 및 R7은 화학식 I에 대해 위에 정의된 바와 같다. 선택적으로, 구조 I-B에서, n은 0이다. 선택적으로, 구조 I-B에서, R3, R4 및 R7은 각각 수소이다. 선택적으로, 구조 I-B에서, R1은 아릴이다.
일부 경우에, 화학식 I에 따른 화합물은 구조 I-C로 표시된다:
.
구조 I-C
구조 I-C에서, n, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 L은 화학식 I에 대해 위에 정의된 바와 같다. 선택적으로, 구조 I-C에서, n은 0이다. 선택적으로, 구조 I-C에서, R3, R4 및 R6은 각각 수소이다. 선택적으로, 구조 I-C에서, R5는 할로겐(예를 들어, 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도)이다. 선택적으로, 구조 I-C에서, L은 NH 또는 O이다. 선택적으로, 구조 I-C에서, R1은 벤질 또는 페닐이다.
화학식 I의 예는 다음 화합물을 포함한다:
BK50118-A BK50118-B BK50118-C
CL3-499
본원에 기재된 USP13 억제제의 클래스는 화학식 II:
화학식 II
및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물로 표시된다.
화학식 II에서, AA는 아미노산 또는 이의 에스테르이다. 선택적으로, 아미노산 또는 이의 에스테르는 본원에서 천연 아미노산으로도 지칭되는 천연 발생 아미노산 또는 이의 에스테르이다. 선택적으로, 천연 발생 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌, 글리신, 세린, 티로신, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
선택적으로, 아미노산 또는 이의 에스테르는 본원에서 비-천연 아미노산으로도 지칭되는 비천연 아미노산 또는 이의 에스테르이다. 본원에서 사용되는 용어 비천연 아미노산은 20 개의 천연 발생 아미노산 중 하나 이상과 구조 및/또는 전체 형상이 유사한 모든 아미노산 유사 화합물을 포함한다. 예를 들어, 비천연 아미노산의 측쇄는 알킬, 아릴, 아릴 할라이드, 비닐 할라이드, 알킬 할라이드, 아세틸, 케톤, 아지리딘, 니트릴, 니트로, 할라이드, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티오에테르, 에폭사이드, 설폰, 보론산, 보로네이트 에스테르, 보란, 페닐보론산, 티올, 셀레노, 설포닐, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 피리딜, 나프틸, 벤조페논, 시클로옥틴과 같은 제약(constrained) 고리, 티오에스테르, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노, 카르복실산, 알파-케토 카르복실산, 알파 또는 베타 불포화 산 및 아미드, 글리옥실 아미드 또는 유기실란 기 등을 포함할 수 있다. 적합한 비천연 아미노산은 예를 들어 Amino Acids: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Volume 794, Pollegioni and Servi, eds., Springer (2012)에 기재되고, 이는 그 전체가 적어도 비천연 아미노산의 기재와 관련하여 본원에 참조로 포함된다.
아미노산 또는 이의 에스테르의 측쇄는 (R) 또는 (S) 배열(또는 D- 또는 L- 배열)일 수 있다.
또한 화학식 II에서, Ar은 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다.
추가적으로 화학식 II에서, AA는 AA의 아미노 기를 통해 Ar에 공유 결합된다.
일부 경우에, 화학식 II에 따른 화합물은 구조 II-A로 표시된다:
.
구조 II-A
구조 II-A에서, Ar은 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다.
또한 구조 II-A에서, R1 및 R2는 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
추가적으로 구조 II-A에서, R3은 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이다.
일부 경우에, 화학식 II에 따른 화합물은 구조 II-B로 표시된다:
.
구조 II-B
구조 II-B에서, R1, R2 및 R3은 구조 II-A에 대해 위에 정의된 바와 같다.
또한 구조 II-B에서, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
추가적으로 구조 II-B에서, R4는 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로 구조 II-B에서, 각 R5는 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
선택적으로, 구조 II-B에서, R1은 수소이다. 선택적으로, 구조 II-B에서, R2는 메틸이다. 선택적으로, 구조 II-B에서, R3은 치환 또는 비치환 벤질이다. 선택적으로, 구조 II-B에서, R4는 니트로이다. 선택적으로, 구조 II-B에서, n은 0이다.
화학식 II의 예는 다음 화합물을 포함한다:
CL3-512 CL3-514
본원에서 사용되는, 용어 알킬, 알케닐 및 알키닐은 직쇄 및 분지쇄 1가 치환기를 포함한다. 예는 메틸, 에틸, 이소부틸, 3-부티닐 등을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐 및 C2-C20 알키닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐 및 C2-C4 알키닐을 포함한다.
헤테로알킬, 헤테로알케닐 및 헤테로알키닐은 알킬, 알케닐 및 알키닐과 유사하게 정의되지만, 뼈대 내에 O, S 또는 N 헤테로원자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C1-C20 헤테로알킬, C2-C20 헤테로알케닐 및 C2-C20 헤테로알키닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C1-C12 헤테로알킬, C2-C12 헤테로알케닐, C2-C12 헤테로알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C2-C6 헤테로알케닐, C2-C6 헤테로알키닐, C1-C4 헤테로알킬, C2-C4 헤테로알케닐 및 C2-C4 헤테로알키닐을 포함한다.
용어 시클로알킬, 시클로알케닐 및 시클로알키닐은 단일 환형 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 환형 알킬 기를 포함한다. 예는 시클로헥실, 시클로펜틸에틸 및 아다만타닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C3-C20 시클로알킬, C3-C20 시클로알케닐 및 C3-C20 시클로알키닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C5-C12 시클로알킬, C5-C12 시클로알케닐, C5-C12 시클로알키닐, C5-C6 시클로알킬, C5-C6 시클로알케닐 및 C5-C6 시클로알키닐을 포함한다.
용어 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알케닐 및 헤테로시클로알키닐은 시클로알킬, 시클로알케닐 및 시클로알키닐과 유사하게 정의되지만, 환형 뼈대 내에 O, S 또는 N 헤테로원자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C3-C20 헤테로시클로알킬, C3-C20 헤테로시클로알케닐 및 C3-C20 헤테로시클로알키닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C5-C12 헤테로시클로알킬, C5-C12 헤테로시클로알케닐, C5-C12 헤테로시클로알키닐, C5-C6 헤테로시클로알킬, C5-C6 헤테로시클로알케닐 및 C5-C6 헤테로시클로알키닐을 포함한다.
아릴 분자는, 예를 들어, 전형적으로, 교호하는 단일 및 이중 공유 결합으로 구성되는 경우와 동일하게 번호가 매겨진 비편재화된 전자에 의해 연결된 여섯 개의 탄소 원자의 하나 이상의 평면 세트를 포함하는 환형 탄화수소를 포함한다. 아릴 분자의 예는 벤젠이다. 헤테로아릴 분자는 O, N 또는 S와 같은 원자의 주료 환형 사슬을 따라 치환을 포함한다. 헤테로원자가 도입되면, 다섯 개 원자, 예를 들어, 네 개의 탄소 및 한 개의 헤테로원자의 세트가 방향족 시스템을 생성할 수 있다. 헤테로아릴 분자의 예는 푸란, 피롤, 티오펜, 이마다졸, 옥사졸, 피리딘 및 피라진을 포함한다. 아릴 및 헤테로아릴 분자는 또한 추가 접합 고리, 예를 들어 벤조푸란, 인돌, 벤조티오펜, 나프탈렌, 안트라센 및 퀴놀린을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 아릴 및 헤테로아릴 분자는 고리의 임의의 위치에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 알콕시는 단일 말단 에테르 결합을 통해 결합된 알킬 기이다. 본원에서 사용되는 용어 아릴옥시는 단일 말단 에테르 결합을 통해 결합된 아릴 기이다. 마찬가지로, 본원에서 사용되는 용어 알케닐옥시, 알키닐옥시, 헤테로알킬옥시, 헤테로알케닐옥시, 헤테로알키닐옥시, 헤테로아릴옥시, 시클로알킬옥시 및 헤테로시클로알킬옥시는 각각 단일 말단 에테르 결합을 통해 결합된 알케닐옥시, 알키닐옥시, 헤테로알킬옥시, 헤테로알케닐옥시, 헤테로알키닐옥시, 헤테로아릴옥시, 시클로알킬옥시 및 헤테로시클로알킬옥시 기이다.
본원에서 사용되는 용어 히드록시는 화학식 -OH로 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 아민 또는 아미노는 화학식 -NZ1Z2로 표시되며, 이때 Z1 및 Z2는 각각 본원에 기재된 치환 기, 예컨대 위에서 기재된 수소, 알킬, 할로겐화 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클로알킬 또는 헤테로시클로알케닐일 수 있다.
본원에서 사용된 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬 분자는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 치환은 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬의 주요 사슬에 부착된 위치에 대한 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬 기의 첨가, 예를 들어, 이들 분자 중 하나에 의한 수소의 대체를 포함한다. 치환 기의 예는 히드록시, 할로겐(예를 들어, F, Br, Cl 또는 I) 및 카르복실 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 역으로, 본원에서 사용되는 용어 비치환은 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬이 수소의 완전한 보완물을 갖는, 즉치환이 없는 포화 수준에 상응함을 포함하고, 예를 들어 선형 데칸(-(CH2)9-CH3)이다.
II. 화합물 제조 방법
본원에 기재된 화합물은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 화합물은 다양한 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 방법 중 적어도 일부가 합성 유기 화학 분야에 공지되어 있다. 본원에 기재된 화합물은 쉽게 입수 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 최적 반응 조건은 사용된 특정 반응물 또는 용매에 따라 달라질 수 있지만, 이러한 조건은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
화학식 I 및 화학식 II 및 본원에 기재된 화합물에 대한 변형은 각 화합물에 대해 기재된 바와 다양한 구성요소의 같은 첨가, 차감 또는 이동을 포함한다. 유사하게, 하나 이상의 카이랄 중심이 분자에 존재하는 경우, 모든 가능한 카이랄 변형이 포함된다. 추가적으로, 화합물 합성은 다양한 화학 기의 보호 및 탈보호를 포함할 수 있다. 보호 및 탈보호의 사용 및 적절한 보호기의 선택은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 보호기의 화학은 예를 들어 Wuts, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 5th. Ed., Wiley & Sons, 2014에서 발견될 수 있고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 화합물을 생성하기 위한 반응은 유기 합성 분야의 당업자에 의해 선택될 수 있는 용매에서 수행될 수 있다. 용매는 반응이 수행되는 조건, 즉 온도 및 압력 하에서 출발 물질(반응물), 중간체 또는 생성물과 실질적으로 비반응성일 수 있다. 반응은 하나의 용매 또는 하나 초과의 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 생성물 또는 중간체 형성은 당해 분야에 공지인 임의의 적합한 방법에 따라 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 생성물 형성은 분광학적 수단, 예컨대 핵자기 공명 분광법(예를 들어, 1H-NMR 또는 13C-NMR), 적외선 분광법(IR), 분광광도법(예를 들어, UV-가시광선), 또는 질량 분석법(MS) 또는 크로마토그래피, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 박막 크로마토그래피 (TLC)에 의해 모니터링될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 화합물을 합성하기 위한 예시적인 방법은 하기 실시예 1에 제공된다.
III. 약제학적 제제
본원에 기재된 화합물 또는 이의 유도체는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 의도된 투여 방식에 따라, 약제학적 조성물은 바람직하게는 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 제형으로 예를 들어 정제, 좌제, 환제, 캡슐제, 산제, 액제, 에어로솔제 또는 현탁제와 같은 고체, 반고체 또는 액체 제형일 수 있다. 조성물은 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 이의 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체와 조합으로 포함할 것이고, 또한 다른 의약 제제, 제약 제제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 물질을 의미하며, 이는 선택된 화합물과 함께, 허용되지 않는 생물학적 효과를 일으키거나 그것이 포함된 약제학적 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호 작용하지 않고, 개체에 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 담체는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질 또는 약제학적 제제에 사용하기 위한 당업계에 공지된 다른 물질을 포함한다. 조성물에서 사용하기 위한 담체의 선택은 조성물의 의도된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 이들 물질을 함유하는 제제의 제조는 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22d Edition, Loyd et al. eds., Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences (2012)에 기재된다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼 및 다른 유기산과의 버퍼와 같은 버퍼; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 소듐과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 TWEEN®(ICI, Inc.; Bridgewater, New Jersey), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICSTM(BASF; Florham Park, NJ)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
비경구 주사에 적합한 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물 중 하나 이상을 함유하는 조성물은 생리학적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유제 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨데 올리브 오일) 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 보습제, 유화제 및 분배제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 촉진될 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등이 또한 포함될 수 있다. 주사용 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물의 경구 투여를 위한 고체 제형은 캡슐제, 정제, 환제, 산제 및 과립제를 포함한다. 이러한 고체 제형에서, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 유도체는 적어도 하나의 불활성의 통상적인 분형제(또는 담체), 예컨대 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어, 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아, (c) 보습제, 예를 들어, 글리세롤, (d) 붕해제, 예를 들어, 한천, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 복합 실리케이트 및 소듐 카르보네이트, (e) 용액 지연제, 예를 들어 파라핀, (f) 흡수 가속제, 예를 들어 사차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 윤활제, 예를 들어, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 또는 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물이 또한 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로 사용될 수 있다.
정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제와 같은 고체 제형은 장용 코팅 및 당업계에 공지된 다른 것과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이들은 불투명화제를 함유할 수 있고 또한 활성 화합물 또는 화합물들을 장관의 특정 부분에서 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매(embedding) 조성물의 예는 고분자 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한, 적절한 경우, 상기 언급된 부형제 중 하나 이상과 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물의 경구 투여를 위한 액체 제형은 약제학적으로 허용되는 유제, 액제, 현탁제, 시럽제 및 엘릭서제를 포함한다. 활성 화합물 이외에, 액체 제형은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 땅콩유, 옥수수 배아유, 올리브유, 피마자유, 참기름, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
이러한 불활성 희석제 외에, 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 항미제 또는 향료와 같은 추가의 제제를 포함할 수 있다.
현탁액은, 활성 화합물 이외에, 추가 제제, 예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
직장 투여를 위한 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물의 조성물은 선택적으로, 상온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로, 직장 또는 질강에서 녹아서 활성 성분을 방출하는 코코아 버터, 폴리에틸렌글리콜 또는 좌제 왁스와 같은 적합한 비자극성 부형제 또는 담체와 화합물을 혼합하여 제조될 수 있는 좌제이다.
본원에 기재된 화합물 또는 이의 유도체의 국소 투여를 위한 제형은 연고제, 산제, 스프레이제, 흡입제 및 피부 패치제를 포함한다. 본원에 기재된 화합물 또는 이의 유도체는 멸균 조건 하에 생리학적으로 허용되는 담체 및 임의의 보존제, 완충제 또는 필요할 수 있는 추진제와 혼합된다. 안과 제제, 연고제, 산제 및 액제가 또한 조성물의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
선택적으로, 본원에 기재된 화합물은 약물은 약물 데포에 포함될 수 있다. 약물 데포는 원하는 부위(예를 들어, 윤활 관절, 추간판 공간, 척주관, 복부, 환자의 조직 등)에서 이식 및 유지를 용이하게 하는 물리적 구조물을 포함한다. 약물 데포는 이식 부위로부터 최대 약 0.1 cm 내지 약 5 cm의 거리에서 화합물의 최적 농도 구배를 제공할 수 있다. 본원에서 사용되는 데포는 캡슐, 마이크로구체, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 마이크로섬유 입자, 나노구체, 나노입자, 코팅, 매트릭스, 웨이퍼, 알약, 펠렛, 유제, 리포솜, 미셀, 겔, 항체-화합물 접합체, 단백질-화합물 접합체 또는 다른 약제학적 전달 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 데포에 적합한 물질은 바람직하게는 FDA 승인된 또는 GRAS 물질인 약제학적으로 허용되는 생분해성 물질을 포함한다. 이들 물질은 중합체 또는 비중합체, 또한 합성 또는 천연 발생, 또는 이들의 조합일 수 있다. 데포는 선택적으로 약물 펌프를 포함할 수 있다.
조성물은 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 약제학적으로 허용되는 염은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등 없이 대상체의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하고, 이들의 의도된 용도에 효과적일 뿐만 아니라, 가능한 경우, 본원에 기재된 화합물의 쯔비터이온 형태인, 본원에 기재된 화합물의 염 또는 이의 유도체를 지칭한다. 용어 염은 본원에 기재된 화합물의 상대적으로 무독성인 무기 및 유기 산 부가 염을 지칭한다. 이들 염은 화합물의 단리 및 정제 동안 제자리에서 또는 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 산과 별도로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리하여 제조될 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 비설페이트, 니트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올레이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 메탄 설포네이트 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다. 이들은 알칼리 및 알칼리 토류 금속, 예컨대 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등에 기반한 양이온뿐만 아니라, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 무독성 암모늄, 사차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함할 수 있다. (적어도 그 안에 교시된 조성물에 대해 전체가 참조로 본원에 포함되는 S.M. Barge et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66, 1을 참조하라.)
본원에 기재된 화합물 및 조성물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 투여는 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물 및 조성물 또는 본원에 기재된 이의 약제학적으로 허용되는 염을 장애 치료에 효과적인 기간 동안 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물 또는 본원에 기재된 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있고 일일 약 0.0001 내지 약 200 mg/kg 체중의 활성 화합물의 포유동물에 대한 예시적인 투여량을 포함하고, 이는 단일 용량으로 또는 일일 1 내지 4 회와 같이 개별적인 분할된 용량의 형태로 투여될 수 있다. 대안적으로, 투여량은 일일 약 0.01 내지 약 150 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.1 내지 100 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.5 내지 약 75 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.5 내지 약 50 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.05 내지 약 25 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.1 내지 약 25 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 0.5 내지 약 25 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 1 내지 약 20 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 1 내지 약 10 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 20 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 10 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 5 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 2.5 mg/kg 체중의 활성 화합물, 일일 약 1.0 mg/kg 체중의 활성 화합물, 또는 일일 약 0.5 mg/kg 체중의 활성 화합물, 또는 그 안의 유도 가능한 임의의 범위일 수 있다. 선택적으로, 투여량은 일일 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중의 활성 화합물이다. 선택적으로, 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다. 선택적으로, 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg이다.
당업자는 임의의 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도가 다양할 수 있고 사용되는 특정 화합물의 활성, 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 대상체의 종, 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이, 투여 방식 및 시간, 배설 속도, 약물 조합 및 특정 병태의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것임을 이해할 것이다.
제제에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질병 또는 장애의 중증도에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래한 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 또한, 투여 경로에 따라, 당업자는 대상체의 세포, 조직 및/또는 기관에서 원하는 반응 수준에 대한 혈장 농도를 야기하는 용량을 결정하는 방법을 알 것이다.
IV. 사용 방법
대상체의 USP13 관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 본원에 기재된 화합물 또는 조성물 중 하나 이상, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 유효량은, 방법에서 화합물의 양을 기재하기 위해 사용되는 경우, 원하는 약리학적 효과 또는 기타 생물학적 효과를 달성하는 화합물의 양을 지칭한다. 유효량은 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같이 시험관내에서 USP13이 억제되는 화합물의 농도일 수 있다. 시험관내 투여된 농도에 상응하는 대상체의 표적 세포에서의 생체내 농도가 달성되도록 본원에 기재된 하나 이상의 화합물의 일정량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 고려된다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 제한 없이, 소아 및 노인 집단을 포함하는 인간 및 동물, 예를 들어 수의학 적용에서 USP13 관련 질병을 치료하는 데 유용하다.
선택적으로, USP13 관련 질병은 신경퇴행성 질병, 예컨대 중추신경계의 신경퇴행성 질병이다. 이러한 질병은 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, α-시누클레인병증, 타우병증, 또는 TDP-43의 세포내 축적과 관련된 병리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, USP13 관련 질병은 암이다. 본원에서 사용되는 암은 세포가 정상적인 조직 성장보다 더 빠르게 증식하는 임의의 세포 장애를 지칭한다. 증식성 장애는 종양으로도 지칭되는 신생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 신생물은 췌장암, 유방암, 뇌암(예를 들어 교모세포종), 폐암, 전립선암, 결장직장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 신경섬유종증 1 및 백혈병을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 신생물은 고체 신생물(예를 들어 육종 또는 암종) 또는 조혈계에 영향을 미치는 암성 성장(예를 들어 림프종 또는 백혈병)일 수 있다. 다른 증식성 장애는 신경섬유종증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, USP13 관련 질병은 근퇴행성 질병, 프리온 질병 또는 전염성 해면상 뇌병증이다. 본원에 제공된 방법에서, 근퇴행성 질병은 봉입체 근염(IBM), 척수구근 근위축증(SBMA) 및 운동 신경 질환(MND)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 제공된 방법에서, 프리온 질병 또는 전염성 해면상 뇌병증(TSEs)은 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 변형 크로이츠펠트-야콥병(vCJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군, 치사성 가족성 불면증 및 인간의 쿠루를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 동물 프리온 질병은 스크래피, 소 해면상 뇌병증(BSE), 만성 소모성 질병(CWD), 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 유제류 해면상 뇌병증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당업자는 USP13과 연관된 장애가 있는 대상체를 선택하는 방법을 알 것이다. 예를 들어, 비제한적으로, 당업자는 신경퇴행성 질병이 있거나 발병 위험이 있는 대상체를 진단하는 방법을 안다. 예를 들어, 유전자 테스트(예를 들어 TDP-43 유전자의 돌연변이 식별) 또는 가족 분석(예를 들어 가족력), 중추 신경계 영상화(예를 들어 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영), 임상 또는 행동 테스트(예를 들어 근육 약화, 떨림 또는 기억 평가) 및/또는 실험실 테스트를 포함하는 상기 테스트 중 하나 이상이 사용될 수 있다.
USP13은 파킨 및 알파-시누클레인 유비퀴틴화를 독립적으로 조절한다. USP13 녹다운은 알파-시누클레인 유비퀴틴화 및 제거를 증가시키고 파킨 기능을 조절한다. USP13 녹다운은 또한 과인산화 타우(p-타우) 유비퀴틴화를 증가시키고 p-타우 및 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 제거를 촉진한다. p-타우, Aβ 및 알파-시누클레인을 포함하는 신경독성 단백질은 신경퇴행성 질병에 공존하며 USP13을 억제함으로써 동시에 분해될 수 있다. USP13 활성이 감소하면, p-타우, Aβ 및/또는 알파-시누클레인 수준이 또한 감소된다. 따라서, 본원에 기재된 화합물은 또한 세포에서 p-타우, Aβ, 및/또는 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 데 효과적이다. 선택적으로, 본원에 기재된 화합물은 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있다.
본원에 제시된 방법은 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 선택적으로 포함한다. 예를 들어, 신경퇴행성 질병을 치료하기 위해, 제2 치료제는 레바도파, 도파민 작용제, 항콜린제, 모노아민 산화효소 억제제, COMT 억제제, 아만타딘, 리바스티그민, NMDA 길항제, 콜린에스테라제 억제제, 릴루졸, 항정신병제, 항우울제 및 테트라베나진으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 암을 치료하기 위해, 제2 치료제는 예를 들어 화학요법제 또는 방사선일 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 대상체에서의 파킨 활성을 증가시킬 수 있다. 전반적으로 사용된 바와 같이, 대상체에서의 파킨 활성 증가는 대조군과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 100% 이상의 증가일 수 있다. 예를 들어, 파킨 활성 증가는 본원에 기재된 화합물이 투여되지 않은 대상체 또는 대조군 값과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 100% 또는 이를 초과하는 증가일 수 있다.
USP13의 활성 억제 또는 감소의 양은 이것이 효소 활성의 감소로부터 완전한 제거에 이르는 범위일 수 있으므로 완전할 필요는 없다. 예를 들어, 감소는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다. USP13의 활성의 억제 또는 감소는 mRNA 발현 감소, 단백질 발현 감소 및/또는 USP13의 효소 활성 감소로 인한 것일 수 있다.
대상체에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 신경퇴행성 질병, 근퇴행성 질병 또는 프리온 질병 치료 또는 예방 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 중추 신경계의 신경퇴행성 질병, 근퇴행성 질병, 프리온 질병을 앓거나 중추 신경계의 신경퇴행성 질병, 근퇴행성 질병 또는 프리온 질병의 위험이 있는 대상체를 선택하는 것을 선택적으로 포함할 수 있다.
대상체에게 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 또는 예방 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 암에 걸렸거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상체를 선택하는 것을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 조성물의 투여 방식이 아래에 예시된다. 본원에 기재된 화합물은 주사(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내), 연속 정맥내 주입, 피부, 진피, 경피, 구강(예를 들어, 정제, 환제, 물약, 식용 필름 스트립), 이식된 삼투압 펌프, 좌제, 또는 에어로졸 스프레이를 포함하는 임의의 다양한 경로에 의해 전달될 수 있다. 투여 경로는 국소, 진피내, 척수강내, 병변내, 종양내, 방광내, 질내, 안구내, 직장내, 폐내, 두개내, 심실내, 척수내, 진피, 피하, 관절내, 체강 내 배치, 비강 흡입, 폐 흡입, 피부로의 압입(impression) 및 전기천공을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 화합물은 또한 세포에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 데 유용하다. 세포에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 방법은 세포를 유효량의 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상과 접촉시키는 것을 포함한다. 선택적으로, 접촉은 생체 내에서 수행된다. 선택적으로, 접촉은 시험관 내에서 수행된다.
V. 키트
대상체의 USP13 관련 질병(예를 들어 신경퇴행성 질병 또는 암)을 치료 또는 예방하기 위한 키트(의약품 팩으로도 지칭됨)가 또한 본원에 제공된다. 의약품 팩 또는 키트는 약제학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트는 본원에 기재된 임의의 화합물 또는 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 화학식 I 및/또는 화학식 II 중 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 키트는 레바도파, 도파민 작용제, 항콜린제, 모노아민 산화효소 억제제, COMT 억제제, 아만타딘, 리바스티그민, NMDA 길항제, 콜린에스테라제 억제제, 릴루졸, 항정신병제, 항우울제, 테트라베나진, 또는 화학요법제 중 하나 이상과 같은 하나 이상의 추가 제제를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 임의의 화합물 또는 조성물의 구강 제제를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 임의의 화합물 또는 조성물의 정맥내 제제를 포함할 수 있다. 키트는 추가적으로 키트의 사용 지시서(예를 들어, 대상체를 치료하기 위한 지침서), 용기, 화합물 또는 조성물 투여 수단(예를 들어 주사기) 및/또는 담체를 포함할 수 있다.
선택적으로 이러한 용기(들)과 관련된 것은 의약품 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 통지일 수 있으며, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다. 조성물 사용 지침도 포함될 수 있다.
전반적으로 사용된 바와 같이, 치료하다, 치료하는 및 치료는 질병 또는 장애, 예를 들어, 신경퇴행성 질병 또는 암의 하나 이상의 효과 또는 증상을 감소시키거나 지연시키는 방법을 지칭한다. 대상체는 질병 또는 장애로 진단될 수 있다. 치료는 또한 단순히 증상보다는 근본적인 병리를 감소시키는 방법을 지칭할 수 있다. 대상체에 대한 투여의 효과는 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 감소, 질병 또는 장애의 중증도 감소, 질병 또는 장애의 완전한 제거, 또는 하나 이상의 증상의 개시 또는 악화 지연의 효과를 가질 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 개시된 방법은 치료 전의 대상체와 비교할 때 또는 대조군 대상체 또는 대조군 값과 비교할 때 대상체의 질병의 하나 이상의 증상이 약 10% 감소하는 경우 치료인 것으로 간주된다. 따라서, 감소는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 예방하다, 예방하는 또는 예방은 신경퇴행성 질병 또는 장애의 개시, 발생, 중증도 또는 재발을 방지, 지연, 회피, 제거, 미연에 방지, 중단 또는 방해하는 방법을 의미한다. 예를 들어, 개시된 방법은 본원에 기재된 USP13 억제제를 받지 않은 신경퇴행에 민감한 대조군 대상체와 비교하여 신경퇴행에 민감한 대상체의 신경퇴행 또는 신경퇴행의 하나 이상의 증상(예를 들어 진전, 쇠약, 기억 상실, 경직, 강직, 위축)의 개시, 발생, 중증도 또는 재발의 감소 또는 지연이 있는 경우 예방인 것으로 간주된다. 개시된 방법은 또한 치료를 받기 전 대상체의 진행과 비교하여 USP13 억제제를 받은 후 신경퇴행에 민감한 대상체의 신경퇴행 또는 신경퇴행의 하나 이상의 증상의 개시, 발생, 중증도 또는 재발의 감소 또는 지연이 있는 경우 예방인 것으로 간주된다. 따라서, 신경퇴행의 개시, 발생, 중증도 또는 재발의 감소 또는 지연이 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
전반적으로 사용된 바와 같이, 대상체는 개체를 의미한다. 바람직하게는, 대상체는 영장류와 같은 포유동물이고, 더욱 바람직하게는, 인간이다. 비인간 영장류도 대상체이다. 용어 대상체는 사육 동물, 예컨대 고양이, 개 등, 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등) 및 실험 동물(예를 들어, 흰담비, 친칠라, 마우스, 토끼, 래트, 게르빌루스쥐, 기니피그 등)을 포함한다. 따라서, 수의학적 용도 및 의약 제제가 본원에서 고려된다.
본 출원 전체에 걸쳐서, 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 개시내용은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 양태를 추가로 예시하도록 의도되고, 청구범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 개시된 주제에 따른 방법 및 결과를 예시하기 위해 아래에 제시된다. 이들 실시예는 본원에 개시된 주제의 모든 양태를 포함하는 것이 아니라 대표적인 방법 및 결과를 예시하기 위한 것이다. 이들 실시예는 당업자에게 명백한 본원에 기재된 주제의 등가물 및 변형을 배체하려는 의도가 아니다.
실시예 1: USP-13 억제제의 합성
일반 정보
시판되는 7-클로로티에노[3,2-b]피리딘(1), 아닐린(2), 4-클로로-6-플루오로퀴놀린(3), 벤질 알코올(4), 벤질 아민(5), 4-클로로-3-니트로-2H-크로멘-2-온(6), 시약 및 용매는 추가의 정제 없이 구입한 그대로 사용되었다. 메틸 (S)-페닐알라니네이트(7) 및 메틸 (S)-티로시네이트(8)는 이들의 HCl 염으로부터 수성 NaHCO3 및 EtOAc로 추출하여 얻었다. NMR 스펙트럼을 중수소화 용매에서 400 MHz(1H NMR) 및 100 MHz(13C NMR)에서 얻었다. 아래 기재된 바와 같이 반응 생성물을 실리카 겔(입자 크기40-63 μm) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제했다.
합성 방법 및 화합물 특징분석
화합물 BK50118-A, BK50118-B 및 BK50118-C를 아래 나타난 반응식 1에 따라 합성했다.
반응식 1:
반응식 1에 따른 화합물 제조를 위한 일반적 절차가 아래에 제공된다: 달리 언급되지 않는 한 8 mL 압력 용기에 7-클로로티에노[3,2-b]피리딘(1)(0.6 mmol), 아닐린(1.2 mmol) 및 DMSO(1.0 mL)를 채웠다. 이후 압력 용기를 100 ℃ 오일조에 넣고 혼합물을 24 시간 동안 교반했다. 1H NMR 분석에 기초하여 완전한 전환이 달성된 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 추출했다. 조합된 유기층을 물로 추출하고, 소듐 설페이트로 건조하고 용매를 진공에서 제거했다. 아래에 기재된 바와 같이 이동상으로서 헥산-에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제했다.
N -페닐티에노[3,2- b ]피리딘-7-아민 (BK50118-A). 화합물 BK50118-A를 위에 기재된 일반적인 절차에 따라 100 ℃에서 24 시간 후 1 mL의 DMSO 중의 7-클로로티에노[3,2-b]피리딘(101 mg, 0.6 mmol) 및 아닐린(111 mg, 1.2 mmol)으로부터 무색 고체로서 98% 수율(133 mg, 0.59 mmol)로 얻었다. 미정제 생성물을 이동상으로 헥산/EtOAc(1:1)를 사용하는 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. R f = 0.3 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.42 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.45 - 7.37 (m, 2H), 7.32 - 7.25 (m, 2H), 7.19 (m, 1H), 6.92 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 157.8, 148.9, 146.3, 139.4, 129.7, 128.1, 126.5, 124.9, 122.6, 120.8, 102.3.
6-플루오로- N -페닐퀴놀린-4-아민 (BK50118-B). 화합물 BK50118-B를 위에 기재된 일반적인 절차에 따라 100 ℃에서 24 시간 후 1 mL의 DMSO 중의 4-클로로-6-플루오로퀴놀린(109 mg, 0.6 mmol) 및 아닐린(111 mg, 1.2 mmol)으로부터 무색 고체로서 95% 수율(135 mg, 0.57 mmol)로 얻었다. 미정제 생성물을 이동상으로 헥산/EtOAc(1:1)를 사용하는 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. R f = 0.3 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.54 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 9.9, 5.2 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 9.9, 2.7 Hz, 1H), 7.49 - 7.37 (m, 3H), 7.28 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.19 (m, 1H), 7.01 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.59 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 160.2 (d, J = 246.7 Hz), 150.3 (d, J = 2.3 Hz), 147.3 (d, J = 5.0 Hz), 146.4, 139.9, 132.8 (d, J = 9.0 Hz), 129.9, 124.9, 122.7, 120.5 (d, J = 8.5 Hz), 119.4 (d, J = 25.1 Hz), 104.1 (d, J = 23.1 Hz), 103.0; 19F NMR (376 MHz, 클로로포름-d) δ = -114.04 (m).
4-(벤질옥시)-6-플루오로퀴놀린 (BK50118-C). 화합물 BK50118-C를 위에 기재된 일반적인 절차에 따라 100 ℃에서 16 시간 후 4-클로로-6-플루오로퀴놀린(109 mg, 0.6 mmol) 및 벤질 알코올(1 mL)으로부터 무색 고체로서 97% 수율(147 mg, 0.58 mmol)로 얻었다. 미정제 생성물을 이동상으로 헥산/EtOAc(1:1)를 사용하는 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. R f = 0.5 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.70 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.03 (dd, J = 9.5, 5.2 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 9.5, 2.9 Hz, 1H), 7.54 - 7.33 (m, 6H), 6.80 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.27 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ = 160.8 (d, J = 5.1 Hz), 160.2 (d, J = 246.7 Hz), 150.6 (d, J = 2.5 Hz), 146.4 (d, J = 1.2 Hz), 135.5, 131.5 (d, J = 9.0 Hz), 128.9, 128.6, 127.5, 122.2 (d, J = 9.6 Hz), 119.9 (d, J = 25.6 Hz), 105.9 (d, J = 23.4 Hz), 101.7, 70.5; 19F NMR (376 MHz, 클로로포름-d) δ = -113.82 (m).
화합물 CL3-499를 아래 나타난 반응식 2 및 하기 절차에 따라 합성했다.
반응식 2:
8 mL 밀봉 바이알에 4-클로로-6-플루오로퀴놀린(3)(100mg, 0.55 mmol), Pd2(dba)3(10.1 mg, 0.01 mmol, 2 mol %), 1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)이미다졸륨 클로라이드 (TMPCl)(11.3 mg, 0.03 mmol, 6 mol %), NaOt-Bu(169.2 mg, 1.76 mmol), 벤질아민(5)(177 mg, 1.65 mmol) 및 디옥산(1.5 mL)을 채웠다. 이후 바이알을 100 ℃ 오일조에 넣고 56 시간 동안 교반했다. 반응물을 수성 NaHCO3로 퀀칭하고 EtOAc로 추출했다. 조합된 유기층을 소듐 설페이트로 건조하고 용매를 진공에서 제거했다. 미정제 생성물을 헥산-EtOAc(8:2)을 이동상으로 사용하는 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에의해 정제하고 헥산-EtOAc(1:1)로부터 재결정화했다.
N -벤질-6-플루오로퀴놀린-4-아민 (CL3-499). 화합물 CL3-499를 황색 고체로서 81% 수율(112 mg, 0.45 mmol)로 얻었다. R f = 0.16 (헥산/EtOAc, 1:1); 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.51 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 5.8 Hz, J = 5.3 Hz, 1H), 7.43 - 7.31 (m, 7H), 6.47 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.18 (bs, 1H), 4.53 (d, J = 5.2 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) δ 159.7 (d, J = 245.0 Hz), 150.4 (d, J = 2.3 Hz), 149.0 (d, J = 4.7 Hz), 145.5, 137.3, 132.4 (d, J = 8.9 Hz), 128.9, 127.9, 127.5, 119.2 (d, J = 8.6 Hz), 118.8 (d, J = 24.9 Hz), 103.7 (d, J = 22.6 Hz), 99.8, 47.6; 19F NMR (376 MHz, 클로로포름-d) δ -114.97 (m).
화합물 CL3-512 및 CL3-514를 아래 나타난 반응식 3에 따라 합성했다.
반응식 3:
반응식 3에 따른 화합물 제조를 위한 일반적 절차가 아래에 제공된다: 8 mL 바이알에 4-클로로-3-니트로-2H-크로멘-2-온(6), 아미노 에스테르 유도체(7) 또는(8), K2CO3 및 ACN:H2O(6.8 mL, 2.4:1)을 채웠다. 반응 혼합물을 25 ℃에서 2 시간 동안 교반했다. TLC 분석에 기초하여 완전한 전환이 달성된 후, pH를 7로 조정하고 반응 혼합물을 EtOAc로 추출했다. 조합된 유기층을 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고 용매를 진공에서 제거했다. 미정제 생성물을 아래 기재된 바와 같이 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제했다.
( S )-메틸 (3-니트로-2-옥소-2H-크로멘-4-일)-페닐알라니네이트 (CL3-512). 화합물 CL3-512를 위에 기재된 일반적인 절차에 따라 이동상으로서 DCM/MeOH(9:1)를 사용하는 컬럼 정제 후 4-클로로-3-니트로-2H-크로멘-2-온(6)(200 mg, 0.89 mmol), 메틸 (S)-페닐알라니네이트(7)(146.5 mg, 0.89 mmol) 및 K2CO3(246 mg, 1.78 mmol)로부터 무색 고체로서 90% 수율(274 mg, 0.8 mmol)로 얻었다. R f = 0.44 (DCM/MeOH, 9:1); 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.98 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 9.1 Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 9.0 Hz, 7.3 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.21 - 7.13 (m, 5H), 4.57 (bs, 1H), 3.34 (dd, J = 14.1 Hz, 4.5 Hz), 3.29 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 14.1 Hz, 8.7 Hz); 13C NMR (100 MHz, 메탄올-d 4) δ 172.1, 154.9, 151.0, 135.8, 133.8, 128.7, 128.3, 126.9, 124.5, 123.5, 117.2, 116.7, 113.1, 58.8, 53.4, 38.1.
( S )-메틸 (3-니트로-2-옥소-2 H -크로멘-4-일)-티로시네이트 (CL3-514). 화합물 CL3-514를 위에 기재된 일반적인 절차에 따라 이동상으로서 DCM/MeOH(9:1)를 사용하는 컬럼 정제 후 4-클로로-3-니트로-2H-크로멘-2-온(6)(200 mg, 0.89 mmol), 메틸 (S)-티로시네이트(8)(161 mg, 0.89 mmol) 및 K2CO3(246 mg, 1.78 mmol)로부터 무색 고체로서 42% 수율(137.1 mg, 0.37 mmol)로 얻었다. R f = 0.21 (DCM/MeOH, 9:1); 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.78 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.5 Hz, 8.5 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.5 Hz, 8.4 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.40 (bs, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.16 (dd, J = 14.1 Hz, 4.5 Hz, 1H), 3.04 (dd, J = 14.1 Hz, 8.5 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, 메탄올-d 4) δ 173.8, 156.1, 150.5, 135.9, 130.1, 126.3, 123.9, 117.4, 116.0, 114.8, 113.7, 48.4, 38.0, 29.9.
실시예 2: 활성 분석
세포주, 형질주입 및 처리. 인간 SHSY-5Y 신경모세포종 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS) (ThermoFisher) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PenStrep, ThermoFisher)을 포함하는 둘베코 변성 이글 배지(DMEM)(ThermoFisher Scientific; Waltham, MA)에서 배양하고 5% CO2를 포함하는 대기 산소 농도(21%)하에 37℃에서 인큐베이션했다. SHSY-5Y 세포를 20% FBS, 1% PenStrep을 포함하는 Ham's F12와 DMEM(1:1)(ThermoFisher)에서 배양했다. 모든 실험의 시작에서 70-80% 컨플루언스(confluence)에 도달하도록 조정된 밀도로 세포를 플레이팅했다. 신선한 배양 배지 및 약물을 첨가하기 전에 Fugene HD 형질주입 시약(Promega; Madison, WI)을 사용하여 인간 야생형 α-시누클레인으로 SH-SY5Y 세포를 24 시간 동안 일시적으로 형질주입시켰다. 세포를 DMSO에 용해된 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM 및 0.01 μM의 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-499, CL3-512 및 CL3-514 또는 동등한 부피의 DMSO로 5 시간 동안 처리했다.
세포 생존률은 배양 배지(ThermoFisher)에 대한 락테이트 탈수소효소 분석 및 플레이팅된 세포(ThermoFisher)에 대한 MTT 분석을 통해 결정되었다. 동일한 처리 조건의 별도의 샘플을 사용하여, 배양 배지를 제거하고 0.2 ml 1x 소듐-트리스, EDTA, NP-40(STEN) 버퍼(50 mM Tris (pH 7.6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.2 % NP-40, 0.2 %를 Halt 단백질분해효소 및 인산가수분해효소 억제제 용액(ThermoFisher)과 함께 첨가하여 얼음에서 세포를 수확했다. 세포를 세포 스크레퍼로 떼어내고 원심분리기 튜브에 수집하고 4℃에서 30 분 동안 교반하여 인큐베이션했다. 샘플을 -80℃에서 보관하고 추가 분석을 위해 사용했다.
알파-시누클레인 효소 결합 면역흡수 분석법(ELISA). Milliplexed ELISA를 사용하여 전체 인간 알파-시누클레인(Millipore; Burlington, MA)에 대한 ELISA를 수행했다. Briefly, Xmap 기술은 두 가지 형광 염료로 내부적으로 코딩된 자성 미소구체를 사용한다. 이 두 염료의 정확한 조합을 통해, 샘플 내에서 여러 단백질을 동시에 측정한다. 이들 구체 각각은 특이적 포획 항체로 코팅된다. 포획 항체는 검출 항체 및 리포터 분자에 결합하여, 비드의 표면에서 반응을 완료한다.
총 25 μL의 가용성 단백질을 밤새 4 ℃에서 25 μL의 혼합 비드 용액과 함께 인큐베이션했다. 세척 후, 샘플을 25 μL 검출 항체 용액과 1.5 시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 스트렙타비딘-피코에리트린(25 μL)을 25 μL의 검출 항체 용액이 들어 있는 각 웰에 첨가했다. 이후 샘플을 세척하고 100 μL의 시스 유체(sheath fluid)에 현탁했다. 이후 샘플을 Xponent 소프트웨어로 MAGPIX에서 러닝했다. 샘플 중의 분석물 농도를 계산하기 위해 5-파라미터 로지스틱 또는 스플라인 곡선 근사 방법을 사용하여 중간 형광 강도(MFI) 데이터를 분석했다. 1XSTEN 버퍼 중의 중뇌 용해물의 조직 가용성 추출물에 대해 특이적 알파-시누클레인 ELISA를 수행했다. 제조업체의 프로토콜에 따라 위에 기재된 바와 같이 세포 또는 뇌 조직 추출물에 대해 USP13(MyBioSource, Cat # MBS9335287), 인간 알파-시누클레인(Biolegend, Cat # 844101) 및 특이적 p-타우 ser396(Invitrogen, KHB7031)에 대한 ELISA를 수행했다.
웨스턴 블롯 분석. 마우스 중뇌 용해물로부터 가용성 단백질을 추출하기 위해, 조직을 단리하고 1x STEN 버퍼(50 mM Tris (pH 7.6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.2% NP-40, 0.2% BSA, 20 mMPMSF 및 단백질분해효소 칵테일 억제제)에서 균질화하고, 10,000× g로 20 분 동안 4 ℃에서 원심분리하고, 가용성 단백질 분획을 포함하는 상청액을 수집했다. 4-12% SDS NuPAGE Bis-Tris 겔(Invitrogen, NP0301BOX)에서 웨스턴 블롯(WB)에 의해 추출물을 분석했다. 베타-액틴(β-actin)은 단일클론 항체(Emdmillipore, MAB1501R)로 프로브(1:3000)되었다. 인간 알파-시누클레인은 단일클론 항체(Thermo Fisher, AHB0261, Rockford, IL, USA)로 프로브(1:2000)되었다. USP13은 다클론 항체(ThermoFisher, PA5-12014, Rockford, IL, USA)로 프로브(1:1000)되었다. 유비퀴틴은 다클론 항체(Thermo Fisher, PA3-16717, Rockford, IL, USA)로 프로브(1:5000)되었다. WB는 Quantity One 4.6.3 소프트웨어(Bio Rad, Hercules, CA, USA) 및 Image J를 사용하여 밀도측정에 의해 정량화되었다.
면역침전(IP). 마우스 뇌 조직을 1x STEN 버퍼에서 균질화하고, 가용성 분획을 위에 나타난 바와 같이 단리했다. 용해물을 고정화 재조합 단백질 A/G 아가로스(Santa Crutz, sc-2003, Dallas, TX, USA)로 사전 세척하고 2500× g로 1 분 동안 4 ℃에서 원심분리했다. 상청액을 회수하여 단백질 분석으로 정량하고, 총 300 μg 단백질을 세파로스 G 및 일차 항체를 갖는 IgG 대조군의 존재하에 밤새 4 ℃에서 일차 항-알파-시누클레인(1:200, Thermofisher, AHB0261) 마우스 항체 또는 항-유비퀴틴(1:100)(Thermo Fisher, PA3-16717, Rockford, IL, USA) 항체로 인큐베이션했다. Pierce 지침(Pierce #20365, Rockford, IL, USA)에 따라 면역침전물을 2500× g로 3 분 동안 4 ℃에서 원심분리에 의해 수집하고, 최종 세척 단계를 위해 세제가 없는 버퍼를 사용하여 3 분, 2500× g의 스핀으로 PBS에서 5 회 세척하고, 단백질이 용출되었다. IP 후, 샘플을 4-12% SDS-NuPAGE에서 크기 분류하고 0.45 μm 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이후 홀스래디쉬 과산화효소(HRP)-접합 이차 항체를 사용하여 WB 검출을 수행했다.
면역조직학. 동물을 자일라진 및 케타민(1:8)의 혼합물로 깊이 마취하고, 1 분 동안 생리 식염수로 세척한 다음 4% 파라포름알데히드(PFA)로 15-20 분 동안 관류했다. 뇌를 신속하게 해부하고 즉시 4% PFA에서24 시간 동안 4 ℃에서 보관한 다음 4 ℃에서 48 시간 동안 30% 수크로스로 옮겼다. 뇌를 동결 절편기를 사용하여 20μm 두께의 관상 절편으로 절단하고 -20 ℃에서 보관했다.
알파-시누클레인의 유비퀴틴화의 평가를 위해 20 μm 두께의 뇌 절편에 대해 면역조직화학을 수행했다. 사용된 항체는 인간 알파-시누클레인 단일클론 항체(Thermo Fisher, AHB0261, Rockford, IL, USA) 및 유비퀴틴 다클론 항체(Thermo Fisher, PA3-16717, Rockford, IL, USA)였다. 유비퀴틴과 알파-시누클레인의 공동 편재화의 광학 밀도측정이 Image J를 사용하여 측정되었다. 티로신 수산화효소(TH)는 DA 합성에서 제한 효소이므로, TH+ 뉴런에 대한 프로빙은 SN에서 DA 생성 뉴런 및 선조체의 이들의 말단에서 상태 평가에 도움이 될 것이다. 선조체에서 TH+의 형광 염색을 수행하고 선조체 DA 말단의 광학 밀도 측정을 수행했다. 4, 6-디아미디노-2-페닐인돌을 사용한 핵 염색은 제조업체의 프로토콜(Life Technologies, Rockford, IL, USA)에 따라 수행되었다.
20 μm 두께 마우스 뇌 절편에서 알파-시누클레인(Thermo Fisher, AHB0261, Rockford, IL, USA)에 대한 DAB 염색을 수행했고, 니슬로 대조염색한 알파-시누클레인+ 뉴런의 입체학적 계수를 수행했다.
니슬 및 은 염색. 제조업체의 지침에 따라 FD Cresyl Violet Solution™ Regular Strength(FD NeuroTechnologies, Cat PS102-01)을 사용하여 니슬 염색을 수행했다. 제조업체의 지침에 따라 FD NeuroSilver™(FD NeuroTechnologies, Cat PK301)를 사용하여 은 염색을 수행했다.
약동학 연구. C57BL/6 마우스는 단일 복강내 용량(10 mg/kg)의 BK50118-C를 투여 받았다. 뇌 및 혈청 샘플을 1, 2, 3, 4, 8 및 12 시간에 수집했다 (시점당 n = 3). 비히클(DMSO)을 주입한 동물을 배경 차감에 사용했다. 약물의 원액(1 mg/mL) 및 내부 표준을 메탄올에서 제조했다. 캘리브레이터 및 대조군 샘플에 사용된 중간 용액은 메탄올/물(1:1)에서 연속 희석되었다. 검정 곡선 표준 및 품질 샘플(QC)의 제조를 중간 희석액을 블랭크 샘플(뇌 균질액, 혈청)에 혼합하여 수행했다. 내부 표준 작업 용액은 아세토니트릴(ACN)/에틸 아세테이트(4:1)에 희석된 5 ng/mL 농도의 중수소 표지된 BK50118-C-d7을 함유했다. 혈청 및 뇌 샘플을 -80℃에 보관한 다음 준비 전에 실온에서 해동했다. 뇌는 MilliQ 물에서 균질화되었다 (1 mg 뇌: 10 μL 물). 25 μL 수성 샘플을 75 μL 내부 표준 작업 용액과 혼합하여 뇌 및 혈청 샘플 모두에서 단백질을 침전시켰다. 혼합물을 12,300 g에서 5 분 동안 원심분리했다. 그 후, 75 μL의 각 상청액 및 25 μL의 MilliQ 물을 96-웰 PCR 플레이트(Fisher Scientific, Dawsonville, GA,USA)에 피펫팅으로 넣었다.
뇌 조직 및 혈청 샘플 중의 BK50118-C의 농도는 초고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석기(UHPLC-MS/MS)에 의해 측정되었다. 요약하면, UHPLC-MS/MS 시스템은 Elute HTG 이원 구배 UHPLC 펌프, Elute 컬럼 오븐 및 포지티브 모드에서 작동하는 전자분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 EVOQ Elite 삼중 사중극자 질량 분석기(모두 Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)를 포함했다. 샘플을 10-μL 샘플 루프가 장착된 PAL 오토 샘플러(CTC Analytics, Zwingen, Switzerland)의 사용에 의해 주입하고; 샘플은 6 마이크로타이터 플레이트용 PAL 스택 쿨러에 보관되고 +6 ℃에서 작동했다. 시스템은 Compass 2.0/HyStar 4.0 소프트웨어(Bruker)에 의해 제어되었고; 화합물 스크리닝 및 정량화는 TASQ 2.2 데이터 수집 및 처리 소프트웨어(Bruker)에 의해 수행되었다. 질량 분석계에는 Genius 3045 질소/공기 발생기(Peak Scientific Instruments, Inchinnan, Scotland, UK)에 의해 발생한 질소 및 공기가 공급되었다. ESI 파라미터는 다음과 같았다: 프로브 기체 흐름 50, 네뷸라이저 기체 흐름 60, 프로브 온도+400 ℃, 콘 기체 흐름 20, 콘 온도 +350 ℃, CID 기체 Ar 1.5 mTorr. 질량 스펙트럼을 MRM 모드에서 스캐닝하여 테스트 화합물 및 이들의 각 전구체 이온에 대한 최적 충돌 에너지를 발견했다.
크로마토그래피 분리를 위해, YMC-Ultra HT Hydrosphere C18 컬럼(2.0 × 100 mm, 2 μm 입자 크기) 및 YMC-Hydrosphere 2.1 × 5 mm 가드 컬럼(YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan)을 사용했다. 이동상 A는 물 중의 10 mM 암모늄 포르메이트, pH 4.3이었고; 이동상 B는 10% 물, 50% 아세토니트릴 및 40% 이소프로필 알코올 중의 10 mM 암모늄 포르메이트, pH 4.3이었다. 이동상 구배는 다음과 같았다 (분-A/B%): 0 분-50/50, 0.5 분-50/50, 2.0 분-20/80, 3 분-20/80, 3.1 분-50/50, 4.5 분-50/50. 유량은 450 μL/분이었고, 컬럼 온도는 50 ℃로 설정되었다. 샘플 주입 부피는 10 μL이었다.
통계적 및 데이터 분석. 모든 통계적 분석은 GraphPad Prism version 5.0(GraphPad 소프트웨어, Inc, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 두 그룹의 평균 비교에서 양측 스튜던트 t 검정을 사용했다. 일반적인 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어서 Newman-Keuls 또는 Dunnett 비교 사후 검정을 여러 그룹의 평균 비교에 사용했다. 별표는 실제 p-값 유의성(* < 0.05, ** < 0.01, *** < 0.001 및 **** < 0.0001)을 나타내며, N은 그룹당 동물의 수 또는 독립적인 실험(세포 배양)의 수이다. 달리 명시되지 않는 한, 데이터는 평균±SD로 표현된다. USP13 수준에 대한 IC50이 또한 GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad 소프트웨어, Inc, San Diego, CA, USA)을 사용하여 추정되었다.
결과:
다양한 양의 본원에 기재된 화합물로 처리된 인간 SHSY5Y 신경모세포종 세포의 생존률 및 활성 분석을 수행했다. 구체적으로, 인간 SHSY5Y 신경모세포종 세포를 DMSO에 용해된 1mM, 100μM, 10μM, 1μM, 0.1μM 및 0.01μM의 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-499, CL3-512 및 CL3514 또는 동등한 부피의 DMSO로 5 시간 동안 처리했다.
도 1a-1f의 그래프는 BK50118-A(도 1a), BK50118-B(도 1b), BK50118-C(도 1c), CL3-514(도 1d), CL3-512(도 1e) 및 CL3-499(도 1f)로 처리된 세포에서의 MTT 및 LDH 분석을 나타낸다. 그룹당 N=3-4. 도 1a-1f의 데이터는 두 가지 생존률 분석을 사용하여 화합물 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-514, CL3-512 및 CL3-499가 안전하고 1 mM 농도까지 세포 사멸을 일으키지 않음을 나타낸다.
도 2a-2f의 그래프는 BK50118-A(도 2a), BK50118-B(도 2b), BK50118-C(도 2c), CL3-514(도 2d), CL3-512(도 2e) 및 CL3-499(도 2f)로 처리된 세포에서의 ELISA를 통한 USP13 활성을 나타낸다. 그룹당 N=3-9. 도 2a-2f의 데이터는 화합물 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-514, CL3-512 및 CL3-499가 1nM-1mM 농도의 농도 범위 내에서 인간 USP13의 활성을 현저하게 감소시킴을 나타낸다.
SHSY5Y 세포주에서 USP13 활성을 억제하기 위해 필요한 각 화합물의 절반 추정 최대 억제 농도(IC50)를 결정했다 (표 1). 비교 목적으로 스파우틴-1을 또한 평가했다.
표 1
표 1의 데이터는 화합물 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-514, CL3-512 및 CL3-499가 USP-13 활성을 강력하게 억제함을 나타낸다.
도 3a-3f의 그래프는 DMSO에 용해된 1mM, 100μM, 10μM, 1μM, 0.1μM 및 0.01μM의 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-499, CL3-512 및 CL3-514 또는 동등한 부피의 DMSO로 5 시간 동안 처리된 인간 SHSY5Y 신경모세포종 세포에서 ELISA를 통한 알파-시누클레인 수준을 나타낸다. 도 3a-3f의 그래프는 BK50118-A(도 3a), BK50118-B(도 3b), BK50118-C(도 3c), CL3-514(도 3d), CL3-512(도 3e) 및 CL3-499(도 3f)로 처리된 세포에서 알파-시누클레인의 ELISA 수준을 나타낸다. 그룹당 N=3-9. 도 3a-3f의 데이터는 화합물 BK50118-A, BK50118-B, BK50118-C, CL3-514, CL3-512 및 CL3-499가 1 내지 0.1 nM의 농도로 알파-시누클레인의 수준을 현저하게 감소시킴을 나타낸다.
생체내 연구
BK50118-C는 강력한 USP13 억제제이므로, 이 분자의 약동학(PK)을 결정했다. 야생형 C57BL6 마우스에 10 mg/kg BK50118-C 대 DMSO를 주사하고, 뇌 및 혈청을 0, 1, 2, 4, 6, 8 및 12 시간에 단리하고, 물에서 추출하여 질량 분석법으로 검사했다. BK50118-C의 농도는 혈청 및 뇌 모두에서 1 시간에 정점이었고 (Tmax) (표 2), 뇌 및 혈청에서 각각 81.49 nM 및 354.63 nM의 최대 농도(Cmax)에 도달했다. 약물의 생체이용률(AUC, 곡선하 면적)은 뇌 및 혈청에서 각각 164.3 nM×h 및 599.4 nM×h이었다. 제거(T1/2)는 뇌에 대해 2.32 시간 및 혈청에서 1.84 시간이었다. 혈청: 뇌의 비율은 28%에 도달했고, 이는 이 약물이 뇌에 풍부하게 들어감을 나타낸다.
표 2. 10 mg/kg의 중수소화 BK50118-C를 주사한 야생형 마우스(C57B6)에서 측정한 BK50118-C의 약리학적 파라미터 및 조직을 주사 후 12 시간에 걸쳐 수집했다.
BK50118-C는 알파-시누클레인을 감소시키고 알파-시누클레인 유비퀴틴화를 증가시키고 마우스의 뉴런 생존을 개선한다
트랜스제닉 A53T 마우스는 프리온 프로모터의 제어 하에 인간 알파-시누클레인의 아르기닌에서 트레오닌으로의(A53T) 돌연변이를 지니며, 빠르면 3 개월령의 선조체에서 풍부한 알파-시누클레인을 갖는다. 수컷 및 암컷 TgA53T 마우스(15 개월령)를 DMSO 대 10 mg/kg 또는 40 mg/kg BK50118-C의 복강내 주사로 7 일 동안 매일 처리했다. 중뇌 용해물의 WB는 인간 알파-시누클레인이 상기 용량에서 현저하게 감소되었음을 보여주었다 (도4 A, B 첫 번째 블롯). 중뇌 추출물로부터의 알파-시누클레인 단백질의 면역침전에 이어서 유비퀴틴 WB(도 4B, 두 번째 블롯)는 DMSO 및 10 mg/kg BK50118-C에 비해 40 mg/kg BK50118-C에서 증가된 유비퀴틴화를 나타냈다. 중뇌 추출물로부터의 유비퀴틴의 면역침전에 이어서 알파-시누클레인 WB(도 4B, 세 번째 블롯)는 단량체 알파-시누클레인을 나타내지 않았지만 DMSO 및 10 mg/kg BK50118-C에 비해 40 mg/kg BK50118-C에서 알파-시누클레인의 증가된 유비퀴틴화를 나타냈다. 동일한 추출물에서 알파-시누클레인의 ELISA 측정(도 4C)은 인간 알파-시누클레인이 각각 약 30%(10 mg/kg) 및 56%(40 mg/kg) 감소했음을 확인시켰다(도 4C).
TgA53T 마우스는 또한 선조체에서 상승된 타우병증 상태를 보여주었고, 이는 타우병증이 시누클레인병증의 일반적인 특징임을 시사한다. 따라서, 타우 수준이 또한 측정되었다. 쥐과 타우 수준에는 영향이 없었다(도 4D). 20μm 두께의 뇌 절편의 면역염색은 DMSO 처리된 마우스에서 피질(도 4E, G, I) 및 선조체(도 4J, L, N) 모두에서 인간 알파-시누클레인 염색을 나타냈다. BK50118-C 처리(40 mg/kg)는 DMSO와 비교하여 피질(도 4F, H, I) 및 선조체(도 4K, M, I) 모두에서 인간 알파-시누클레인 염색을 현저하게 감소시켰다. 정량화는 BK50118-C(40 mg/kg)가 인간 알파-시누클레인 양성 뉴런의 수를 피질에서 42% 및 선조체에서 40%만큼 현저하게 감소시켰음을 보여주었다(도 4I, N). 피질(도 6C), 선조체(도 6F) 및 SN(도 6I)에서 니슬+ 세포의 정량화에 의해 확인된 바와 같이, 니슬 염색은 BK50118-C가 DMSO(도 6A, D, G)와 비교하여 피질(도 6B, C), 선조체(도 6E, F) 및 흑색질(SN)(도 6H, I)에서 뉴런 수를 현저하게 증가시켰음을 보여주었다.
BK50118-C는 알파-시누클레인 유비퀴틴화를 증가시키고 TgA53T 마우스의 선조체에서 티로신 수산화효소 수준에 미치는 영향을 최소화한다
알파-시누클레인 제거에 대한 BK50118-C의 기계론적 효과를 확인하기 위해, TgA53T 마우스의 선조체에서 면역염색을 수행했다. 인간 알파-시누클레인 염색은 BK50118-C(40 mg/Kg) 처리된 마우스(도 5B)와 비교하여 DMSO(도 5A)에서 인간 알파-시누클레인의 수준을 보여주었다. DMSO 처리된 선조체(도 5C)에서의 유비퀴틴 염색은 40 mg/Kg의 BK50118-C로 처리된 마우스(도 5D)와 비교하여 유비퀴틴의 수준을 보여주었다. BK50118-C(도 5F)와 비교하여 DMSO(도 5E)에서 병합된 알파-시누클레인 및 유비퀴틴 염색은 알파-시누클레인이 BK50118-C로 처리된 마우스에서 유비퀴틴과 함께 공동 편재화됨을 보여주었다. 알파-시누클레인-유비퀴틴 염색의 광학 밀도는 DMSO와 비교하여 마우스에 BK50118-C를 주입했을 때 선조체에서 공동 편재화의 현저한 증가(130%)를 보여주었다(도 5G). TgA53T 마우스의 선조체에서 티로신 수산화효소(TH)의 염색을 또한 수행했다. TH는 도파민(DA)의 전구체인 (L-DOPA)의 합성에서 속도 제한 단계를 촉매화하는 역할을 하는 효소이다. TH의 염색은 SN에서 뉴런을 생성하는 DA 및 선조체의 이들의 말단의 상태 평가에 도움이 될 것이다. TgA53T 마우스의 선조체에서 티로신 수산화효소(TH)의 염색은 DMSO 처리된 마우스(도 5H, J, L, N)와 비교하여 BK50118-C(도 5I, K, M, N)에서 어떠한 눈에 띄는 효과도 나타내지 않았다.
첨부된 청구범위의 화합물 및 방법은 청구항의 몇몇 양태의 예시로서 의도된 및 본원에 기재된 특정 화합물 및 방법 및 본 개시내용의 범위 내에서 기능적으로 동등한 임의의 화합물 및 방법에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본원에 나타나고 셜명된 것 이외의 화합물 및 방법의 다야한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도된다. 또한, 특정한 대표적인 화합물, 방법 및 이들 화합물과 방법의 양태만이 구체적으로 기재되지만, 다른 화합물 및 방법이 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 따라서, 단계, 요소, 구성요소 또는 성분의 조합이 본원에서 명시적으로 언급될 수 있다; 그러나, 명시적으로 언급되지 않더라도 단계, 요소, 구성요소 및 성분의 다른 모든 조합이 포함된다.

Claims (40)

  1. 하기 화학식의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물:

    상기 식에서,
    n은 0, 1 또는 2이고;
    L은 S, O 또는 NR7이고;
    X는 S, O, NR8 또는 CR5=CR6이고;
    Y1, Y2, Y3 및 Y4는 각각 독립적으로 N 또는 CR이고, 이때 R은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, Y1, Y2, Y3 및 Y4 중 적어도 하나는 N이고;
    R1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이고;
    각 R2는 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R3, R4, R5 및 R6은 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    R7 및 R8은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물:
    .
  3. 제2항에 있어서, n은 0인 화합물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, R3, R4 및 R7은 각각 수소인 화합물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 아릴인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물:
    .
  7. 제6항에 있어서, n은 0인 화합물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, R3, R4 및 R6은 각각 수소인 화합물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 할로겐인 화합물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, L은 NH 또는 O인 화합물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 벤질 또는 페닐인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:
    , ,
    , 및 .
  13. 하기 화학식의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물:

    상기 식에서,
    AA는 아미노산 또는 이의 에스테르이고;
    Ar은 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이고,
    이때 AA는 AA의 아미노 기를 통해 Ar에 공유 결합된다.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 또는 이의 에스테르는 천연 아미노산 또는 이의 에스테르인 화합물.
  15. 제13항에 있어서, 아미노산 또는 이의 에스테르는 비천연 아미노산 또는 이의 에스테르인 화합물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식의 화합물:

    상기 식에서,
    Ar은 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이고;
    R1 및 R2는 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    R3은 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이다.
  17. 제16항에 있어서, 하기 화학식의 화합물:

    상기 식에서,
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    R4는 수소, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각 R5는 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, 니트로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
  18. 제17항에 있어서, R1은 수소인 화합물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, R2는 메틸인 화합물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 치환 또는 비치환 벤질인 화합물.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 니트로인 화합물.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, n은 0인 화합물.
  23. 제13항에 있어서, 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:
    및 .
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제24항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  26. 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제24항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 USP13 관련 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, USP13 관련 질병을 앓는 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, USP13 관련 질병은 신경퇴행성 질병인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 신경퇴행성 질병은 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, α-시누클레인병증, 타우병증 또는 TDP-43의 세포내 축적과 관련된 병리인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 제2 치료제는 레바도파, 도파민 작용제, 항콜린제, 모노아민 산화효소 억제제, COMT 억제제, 아만타딘, 리바스티그민, NMDA 길항제, 콜린에스테라제 억제제, 릴루졸, 항정신병제, 항우울제 및 테트라베나진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질병을 앓는 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제26항 또는 제27항에 있어서, USP13 관련 질병은 암인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 암은 췌장암, 유방암, 뇌암, 폐암, 전립선암, 결장직장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 신경섬유종증 1, 림프종 또는 백혈병인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제2 치료제는 화학요법제 또는 방사선인 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 앓는 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 세포를 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 USP13을 억제하는 방법.
  39. 세포를 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 접촉은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 수행되는 방법.
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