JP7445251B2 - アルツハイマー病予防剤又は治療剤、アルツハイマー病予防用又は治療用組成物、及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アルツハイマー病予防剤又は治療剤、そのスクリーニング方法、及びアルツハイマー病予防用又は治療用組成物に関する。
本願は、２０１７年１２月２８日に、日本に出願された特願２０１７－２５４８８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１７年１２月２８日に、日本に出願された特願２０１７－２５４８８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
アルツハイマー病（以下、「ＡＤ」ともいう。）は、認知症の６０－７０％を占め、先進国において最も金銭的コストが高い疾患となっている。ＡＤの病態発症機構としては、アミロイドβ（以下、「Ａβ」ともいう。）の産出上昇又は分解不全による、Ａβ蓄積を開始点とするアミロイドカスケード仮説が最も支持されている。
Ａβは、分子量約４ｋＤの小さな蛋白質で３８－４３個のアミノ酸からなり、アミロイド前駆蛋白（ＡＰＰ）からセクレターゼにより切り出されて産出される。主要なＡβの分子種として、アミノ酸数の違いにより、Ａβ４０とＡβ４２が存在する。これらのうち、Ａβ４２は、高い凝集性を有することから、より強い病原性を有することが知られている。
ＡＤに対する治療剤開発において、様々な取組みがなされている（非特許文献１参照。
）。例えば、非特許文献１では、ヒトｉＰＳ細胞から分化させた前脳マーカーを発現した神経細胞を用いた抗Ａβ薬のスクリーニング方法が記載されている。
）。例えば、非特許文献１では、ヒトｉＰＳ細胞から分化させた前脳マーカーを発現した神経細胞を用いた抗Ａβ薬のスクリーニング方法が記載されている。
PLoS One. 2011;6(9):e25788. doi: 10.1371/journal.pone.0025788. Epub 2011 Sep 30. Anti-Aβdrug screening platform using human iPS cell-derived neurons for the treatment of Alzheimer's disease. Yahata N., et al.
ＡＤに対する根本的治療剤は、現在のところ見つかっておらず、対症療法のみにとどまっているのが現状である。これまでＡＤの根本治療剤として、セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ免疫療法等の臨床研究が行われてきた。しかしながら、被験者に対する不十分な有効性や強い副作用のため、いずれも中止に追い込まれている。
したがって、ＡＤの根本的治療剤開発のためには、今までにはない、新たな観点・標的分子から創薬を行う必要がある。
したがって、ＡＤの根本的治療剤開発のためには、今までにはない、新たな観点・標的分子から創薬を行う必要がある。
そこで本発明は、新たな作用機序に基づく、アルツハイマー病予防剤又は治療剤、そのスクリーニング方法、及びアルツハイマー病予防用又は治療用組成物を提供することを目的とする。
発明者らは、ＧＭ１ガングリオシド（以下、「ＧＭ１」ともいう。）患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた神経幹細胞を用いたスクリーニング系が、アルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法に用いられることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。
［２］Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。
［３］下記一般式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。
［２］Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。
［３］下記一般式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。
［一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はシクロアルキル基を表す。Ｘは、単結合、又は２価の連結基を表す。ｎは、０、１、又は２を表す。Ｒ３は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ４は、水素原子、又は炭素数１～５のアルキル基を表す。Ｒ５は、水素原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。Ｒ６は、水素原子、水酸基、シアノ基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
［４］［１］～［３］のいずれか一つに記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、アルツハイマー病予防用又は治療用組成物。
［５］ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を用いることを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
［６］評価対象化合物を、培養されたＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞に接触させて、前記神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積量の変化を評価する工程を含む［５］に記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
［７］前記ＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた細胞である［６］に記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
［４］［１］～［３］のいずれか一つに記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、アルツハイマー病予防用又は治療用組成物。
［５］ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を用いることを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
［６］評価対象化合物を、培養されたＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞に接触させて、前記神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積量の変化を評価する工程を含む［５］に記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
［７］前記ＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた細胞である［６］に記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
本発明により、新たな作用機序を有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供することができる。
［アルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法］
近年、ＡＤ患者の神経細胞膜表面における脂質ラフトに存在するＧＭ１ガングリオシドが、ＡＤにおけるＡβの重合を促進し、病態形成に深く関わっていることが明らかとなってきた（Hoshino T, Mahmood MI, Mori K, Matsuzaki K. J Phys Chem B. 2013 Jul 11;117(27):8085-94.参照。）。
近年、ＡＤ患者の神経細胞膜表面における脂質ラフトに存在するＧＭ１ガングリオシドが、ＡＤにおけるＡβの重合を促進し、病態形成に深く関わっていることが明らかとなってきた（Hoshino T, Mahmood MI, Mori K, Matsuzaki K. J Phys Chem B. 2013 Jul 11;117(27):8085-94.参照。）。
ＧＭ１ガングリオシドは、糖脂質の一種であり、細胞のシグナル伝達などに関与する分子である。このＧＭ１が関与する疾患として、ＧＭ１ガングリオシドーシスが知られている。
ＧＭ１ガングリオシドーシスはライソゾーム病の１つであり、ＧＭ１ガングリオシドの加水分解に関与する酵素の欠損・異常によって、ＧＭ１が特に神経系（脳）に蓄積してしまう先天性代謝異常症である。
ＧＭ１ガングリオシドーシスは、発症時期と臨床経過により、乳児型、若年型、成人型に分類される。特に乳児型は生後３～６ヶ月までに発達の遅れが見られ、生後１年を過ぎるまでにほとんどの患児が、除脳硬直など重度の神経障害を示すようになり、通常３～４歳までに死亡する。
ＧＭ１ガングリオシドーシスは、発症時期と臨床経過により、乳児型、若年型、成人型に分類される。特に乳児型は生後３～６ヶ月までに発達の遅れが見られ、生後１年を過ぎるまでにほとんどの患児が、除脳硬直など重度の神経障害を示すようになり、通常３～４歳までに死亡する。
実施例において後述するように、発明者らは、ＧＭ１ガングリオシドーシスとアルツハイマー病との間に関係性があることを見出した。
即ち、本発明のアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を用いる。
即ち、本発明のアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を用いる。
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、評価対象化合物を、培養されたＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞に接触させて、前記神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積量の変化を評価する工程を含むアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、評価対象化合物を、培養されたＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞に接触させて、前記神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積量の変化を評価する工程を含むアルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本実施形態において、例えば、化合物ライブラリーを、培養されたＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞の培地に添加し、前記神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドに対する影響を検討する。より具体的には、例えば、ウェルプレートに前記神経幹細胞を播種し、化合物ライブラリーの存在下で１～５日間程度培養する。
患者の脳から神経系細胞を採取することは困難であることから、前記ＧＭ１ガングリオシドーシス神経幹細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた細胞であることが好ましい。
ＧＭ１患者由来の細胞としては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血液細胞、線維芽細胞等が挙げられ、線維芽細胞が好ましい。ＧＭ１患者由来細胞からｉＰＳ細胞への初期化方法、及びｉＰＳ細胞から神経幹細胞への分化方法については定法に従う。
ＧＭ１患者由来の細胞としては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血液細胞、線維芽細胞等が挙げられ、線維芽細胞が好ましい。ＧＭ１患者由来細胞からｉＰＳ細胞への初期化方法、及びｉＰＳ細胞から神経幹細胞への分化方法については定法に従う。
ＧＭ１ガングリオシドの蓄積量の変化を評価する方法としては、実施例にて後述するように、ＧＭ１ガングリオシドに対して親和性を有する物質を用いて、フローサイトメトリーやウエスタンブロット等により、定性・定量評価する方法が挙げられる。
係る工程により見いだされた化合物に対して、Ａβの発現を評価する等、ＡＤの治療効果を評価する工程を有していてもよい。
Ａβの発現評価としては、ＡＤ患者由来神経幹細胞を、ＧＭ１抑制化合物ととともに培養を行い、培地中のＡβ４２とＡβ４０の比率を定量する方法が挙げられる。
Ａβの発現評価としては、ＡＤ患者由来神経幹細胞を、ＧＭ１抑制化合物ととともに培養を行い、培地中のＡβ４２とＡβ４０の比率を定量する方法が挙げられる。
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、後述するアルツハイマー病モデル動物に評価対象化合物を投与する、アルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、後述するアルツハイマー病モデル動物に評価対象化合物を投与する、アルツハイマー病予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本実施形態において、例えば、後述するアルツハイマー病モデル動物に、経口投与又は腹腔内投与等の非経口投与で評価対象化合物を投与する。続いて、脳組織におけるアミロイド沈着を評価する。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られるアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１蓄積を、直接もしくは間接的に抑制することによりＡＤの治療効果を発揮しうる化合物であることが好ましい。すなわち、かかるＡＤ治療候補化合物を有効成分とするＡＤ治療剤は、蓄積したＧＭ１を直接除去する、ＧＭ１の凝集を抑制する、ＧＭ１の合成を阻害する、ＧＭ１の分解を促進するなどの作用により、ＧＭ１の蓄積を、直接的又は間接的に抑制しＡＤの治療効果を発揮するものであることが好ましい。
［アルツハイマー病予防剤又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
これらのアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
１実施形態において、本発明は、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
これらのアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
［一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はシクロアルキル基を表す。Ｘは、単結合、又は２価の連結基を表す。ｎは、０、１、又は２を表す。Ｒ３は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ４は、水素原子、又は炭素数１～５のアルキル基を表す。Ｒ５は、水素原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。Ｒ６は、水素原子、水酸基、シアノ基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
Ｒ１及びＲ２における、炭素数１～５のアルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２におけるアリール基としては、炭素数６～１８であるものが好ましく、炭素数６～１０であるものがより好ましく、具体的にはフェニル基が特に好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるアラルキル基としては、炭素数１～５のアルキレン基と上記Ｒ１及びＲ２におけるアリール基とが結合したものが好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるシクロアルキル基としては、炭素数３～８のモノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましく、具体的には、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２におけるアリール基としては、炭素数６～１８であるものが好ましく、炭素数６～１０であるものがより好ましく、具体的にはフェニル基が特に好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるアラルキル基としては、炭素数１～５のアルキレン基と上記Ｒ１及びＲ２におけるアリール基とが結合したものが好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるシクロアルキル基としては、炭素数３～８のモノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましく、具体的には、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン等が挙げられる。
Ｘにおける２価の連結基としては、アルキレン基、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
Ｒ３における炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４における炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４における炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ５における炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ５における炭素数１～５のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、Ｒ１及びＲ２において上述した炭素数１～５のアルキル基と同様のものが挙げられる。
Ｒ５における炭素数１～５のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、Ｒ１及びＲ２において上述した炭素数１～５のアルキル基と同様のものが挙げられる。
Ｒ６における炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、シクロアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ６における炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ６における炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
上述した中でも、Ｘとしては、単結合が好ましく、ｎは１が好ましく、Ｒ３～Ｒ５は水素原子が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記一般式（１－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、好ましい。
［一般式（１－１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はシクロアルキル基を表す。Ｘは、単結合、又は２価の連結基を表す。Ｒ６は、水素原子、水酸基、シアノ基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
上述した中でも、Ｒ６としては、水酸基が好ましく、Ｒ１及びＲ２としては、炭素数１～５のアルキル基が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記式（１－１－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
［一般式（２）中、Ｒ１０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。ｎ１０及びｎ１１は、それぞれ独立して、０～４の整数を表す。Ｒ１２及びＲ１３が、それぞれ複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。
ｎ１２は、０～４の整数を表す。Ｒ１４が、複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。］
ｎ１２は、０～４の整数を表す。Ｒ１４が、複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。］
Ｒ１０における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１１において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のチオアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１４におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、及び炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ１２及びＲ１３において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１１において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のチオアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１４におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、及び炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ１２及びＲ１３において上述したものと同様のものが挙げられる。
上述した中でも、Ｒ１３及びＲ１４としては、水素原子が好ましく、ｎ１０は１が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記一般式（２－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、好ましい。
［一般式（２－１）中、Ｒ１０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
上述した中でも、Ｒ１０としては、アルキレン基が好ましい。Ｒ１０におけるアルキレン基としては、炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基から１個の水素原子を除いた基が好ましい。炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記一般式（２－１－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、更に好ましい。
［一般式（２－１－１）中、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
上述した中でも、Ｒ１１としては、炭素数１～５のアルキル基、又は炭素数１～５のヒドロキシアルキル基が好ましい。Ｒ１２としては、ハロゲン原子、又は炭素数１～５のチオアルキル基が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記式（２－１－１－１）又は（２－１－１－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（３）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
［一般式（３）中、Ｒ２０は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ２１及びＲ２４は、それぞれ独立して、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ２２及びＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のハロアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基を表す。］
Ｒ２０における、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２１及びＲ２４における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、及び炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、炭素数１～５のハロアルキル基としては、フッ化アルキル基、塩化アルキル基、臭化アルキル基が挙げられ、Ｒ１及びＲ２において上述したアルキル基から、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子に置き換えられたものが挙げられる。
Ｒ２１及びＲ２４における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、及び炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、炭素数１～５のハロアルキル基としては、フッ化アルキル基、塩化アルキル基、臭化アルキル基が挙げられ、Ｒ１及びＲ２において上述したアルキル基から、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子に置き換えられたものが挙げられる。
上述した中でも、Ｒ２０としては、炭素数１～５のアルキル基、又はアラルキル基が好ましい。Ｒ２０におけるアラルキル基としては、炭素数１～５のアルキレン基とフェニル基とが結合したものが好ましい。
Ｒ２１及びＲ２４としては、単結合又は－Ｏ－が好ましい。
Ｒ２２及びＲ２３としては、水素原子又はトリフルオロメチル基が好ましい。
Ｒ２１及びＲ２４としては、単結合又は－Ｏ－が好ましい。
Ｒ２２及びＲ２３としては、水素原子又はトリフルオロメチル基が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記式（３－１）又は（３－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（４）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
［一般式（４）中、Ｒ３０及びＲ３１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、又はアラルキル基を表す。実線と点線の二重線部分は単結合又は二重結合を表す。］
Ｒ３０及びＲ３１において、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、及びアラルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
上述した中でも、Ｒ３０及びＲ３１としては、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、水酸基が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記式（４－１）又は（４－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（５）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供する。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
このアルツハイマー病予防剤又は治療剤は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としても提供できる。
［一般式（５）中、Ｒ４０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ４１～Ｒ４３は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、又はアラルキル基を表す。］
Ｒ４０における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４１～Ｒ４３におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、及びアラルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４１～Ｒ４３におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、及びアラルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
上述した中でも、Ｒ４０としては、アルキレン基が好ましい。Ｒ４０におけるアルキレン基としては、炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基から１個の水素原子を除いた基が好ましい。炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４１～Ｒ４３としては、水素原子、ハロゲン原子が好ましい。
Ｒ４１～Ｒ４３としては、水素原子、ハロゲン原子が好ましい。
本実施形態のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、下記式（５－１）又は（５－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
本発明のアルツハイマー病予防剤又は治療剤としては、上記化合物をフリー体の形態で用いてもよく、薬学的に許容される塩の形態で用いてもよい。また、フリー体の溶媒和物の形態で用いてもよく、塩の溶媒和物の形態で用いてもよい。
塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
［アルツハイマー病の予防用又は治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上記のアルツハイマー病の予防剤又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、アルツハイマー病の予防用又は治療用組成物を提供する。
このアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物としても提供できる。
１実施形態において、本発明は、上記のアルツハイマー病の予防剤又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、アルツハイマー病の予防用又は治療用組成物を提供する。
このアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物としても提供できる。
本実施形態のアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
本実施形態のアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物は、更に添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
（投与方法）
アルツハイマー病の予防剤又は治療剤、又はアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
アルツハイマー病の予防剤又は治療剤、又はアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
（投与量）
アルツハイマー病の予防剤又は治療剤、又はアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
アルツハイマー病の予防剤又は治療剤、又はアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療のための、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。
一実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療のための、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。
一実施形態において、本発明は、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を、予防又は治療を必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病の予防又は治療方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の予防剤又は治療剤、又はアルツハイマー病の予防用又は治療用組成物を製造するためのAmodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用を提供する。
［アルツハイマー病モデル動物］
本発明の評価に用いるアルツハイマー病モデル動物は、β-Galactosidase（以下、β－ｇａｌともいう。）遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記β－ｇａｌ遺伝子がコードするβ－ｇａｌタンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、前記β－ｇａｌ遺伝子又は前記β－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域に変異が導入されている非ヒト哺乳動物である。
本発明の評価に用いるアルツハイマー病モデル動物は、β-Galactosidase（以下、β－ｇａｌともいう。）遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記β－ｇａｌ遺伝子がコードするβ－ｇａｌタンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、前記β－ｇａｌ遺伝子又は前記β－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域に変異が導入されている非ヒト哺乳動物である。
β－ｇａｌタンパク質は、様々な生体分子の加水分解の役割を果たすリソソームに存在する酵素である。ＧＭ１ガングリオシドは、β－ｇａｌタンパク質の基質であり、脳に豊富に存在する。そのため、β－ｇａｌの抑制又は喪失により、ＧＭ１ガングリオシドの蓄積を導く。
β－ｇａｌタンパク質の機能が喪失しているとは、β－ｇａｌタンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。β－ｇａｌタンパク質の機能が抑制されているとは、β－ｇａｌタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。
β－ｇａｌタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、β－ｇａｌタンパク質の機能の抑制の程度は、モデル動物と、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較して、モデル動物にアルツハイマー病と認められる状態（コントロールとの差異）が表れる程度であればよい。
アルツハイマー病と認められる状態の指標としては、アミロイドタンパク質（Ａβ４０及び４２）の脳における沈着が挙げられる。
β－ｇａｌタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、β－ｇａｌタンパク質の機能の抑制の程度は、モデル動物と、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較して、モデル動物にアルツハイマー病と認められる状態（コントロールとの差異）が表れる程度であればよい。
アルツハイマー病と認められる状態の指標としては、アミロイドタンパク質（Ａβ４０及び４２）の脳における沈着が挙げられる。
β－ｇａｌタンパク質の機能の抑制又は喪失は、β－ｇａｌ遺伝子の発現が抑制もしくは喪失することによっても生じ得る。β－ｇａｌ遺伝子の発現が喪失しているとは、モデル動物となる動物において、β－ｇａｌ遺伝子産物が喪失していることをいう。β－ｇａｌ遺伝子の発現が抑制しているとは、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、β－ｇａｌ遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。
β－ｇａｌ遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、上記に示すようなアルツハイマー病と認められる状態が表れる程度であればよい。β－ｇａｌ遺伝子の発現の抑制は、β－ｇａｌ遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
β－ｇａｌ遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、上記に示すようなアルツハイマー病と認められる状態が表れる程度であればよい。β－ｇａｌ遺伝子の発現の抑制は、β－ｇａｌ遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
本発明の評価に用いるモデル動物は、β－ｇａｌ遺伝子又はβ－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域に変異が導入されてなることが好ましい。
導入される変異は、β－ｇａｌ遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記β－ｇａｌ遺伝子がコードするβ－ｇａｌタンパク質の機能を抑制若しくは喪失させるものであればよい。
導入される変異は、β－ｇａｌ遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記β－ｇａｌ遺伝子がコードするβ－ｇａｌタンパク質の機能を抑制若しくは喪失させるものであればよい。
上記β－ｇａｌ遺伝子とは、β－ｇａｌタンパク質をコードする領域であるエクソンのほか、β－ｇａｌ遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記β－ｇａｌ遺伝子がコードするβ－ｇａｌタンパク質の機能を抑制若しくは喪失させることができる場合にはイントロンも含まれる。
β－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域とは、β－ｇａｌ遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
β－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域とは、β－ｇａｌ遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
β－ｇａｌタンパク質の機能の喪失は、例えばβ－ｇａｌ遺伝子に変異を導入し、β－ｇａｌ遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。β－ｇａｌ遺伝子の発現能の抑制又は喪失は、例えば、β－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域に変異を導入することにより生じさせることができる。
β－ｇａｌ遺伝子又はβ－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、β－ｇａｌ遺伝子又はβ－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。β－ｇａｌ遺伝子の一部が欠失している場合、欠失は１つ以上のエクソンの欠失であることが好ましい。これらの変異を導入することは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
β－ｇａｌ遺伝子又はβ－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、β－ｇａｌ遺伝子又はβ－ｇａｌ遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。β－ｇａｌ遺伝子の一部が欠失している場合、欠失は１つ以上のエクソンの欠失であることが好ましい。これらの変異を導入することは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
β－ｇａｌ遺伝子変異としては、ヒトβ－ｇａｌタンパク質において、Ｅ１８６Ａ、Ｐ１０Ｌ、Ｒ２０１Ｃ、Ｃ１２７Ｙ、Ｗ１６１Ｇ、Ｑ２５５Ｈ，Ｒ３５１Ｘ、Ｓ５３２Ｇ、Ｒ１４８Ｓ等の変異が挙げられる。
後述する実施例において示すように、β－ｇａｌノックアウトマウスとアルツハイマー病モデルマウスを掛けあわせたマウスでは、アミロイドの沈着が促進されていることが確認されている。
したがって、本発明の評価に用いるアルツハイマー病モデル動物は、更に、ヒトプリセニリン１（ＰＳ１）のエクソン９の欠損、Ｍ１４６Ｌ変異、Ｌ２８５Ｖ変異、ヒトＰＳ２のＮ１４１Ｉ変異、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、及びＶ７１７Ｉロンドン型変異からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有することが好ましく、ヒトプリセニリン１（ＰＳ１）のＭ１４６Ｌ変異、及びＬ２８５Ｖ変異、並びに、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、Ｖ７１７Ｉロンドン型変異の５種類の変異を有することがより好ましい。
したがって、本発明の評価に用いるアルツハイマー病モデル動物は、更に、ヒトプリセニリン１（ＰＳ１）のエクソン９の欠損、Ｍ１４６Ｌ変異、Ｌ２８５Ｖ変異、ヒトＰＳ２のＮ１４１Ｉ変異、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、及びＶ７１７Ｉロンドン型変異からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有することが好ましく、ヒトプリセニリン１（ＰＳ１）のＭ１４６Ｌ変異、及びＬ２８５Ｖ変異、並びに、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、Ｖ７１７Ｉロンドン型変異の５種類の変異を有することがより好ましい。
非ヒト哺乳動物としては、特に制限されないが、げっ歯類に分類される動物であることが好ましい。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコが挙げられる。
本発明の評価に係るモデル動物は、アルツハイマー病のメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に用いることができる。
以下、実験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
［実験例１］
［皮膚由来線維芽細胞の樹立］
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を樹立した。
患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、初期化遺伝子を導入するために線維芽細胞を増殖させた。
［皮膚由来線維芽細胞の樹立］
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を樹立した。
患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、初期化遺伝子を導入するために線維芽細胞を増殖させた。
［iPS細胞の樹立及び維持］
N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法により、樹立したヒト由来線維芽細胞からｉＰＳ細胞を樹立した。
具体的には、感染１日前に、６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５×１０５個のヒト線維芽細胞を播種し、その後、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを、ＭＯＩ(multiplicity of infection)３にて、細胞に感染させた。Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むＳｅＶベクターについては、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法に従い作製した。感染７日後、感染させた線維芽細胞を、トリプシンを用いて回収し、６０ｍｍのシャーレ当たり５．４×１０４個の細胞、又は１００ｍｍのシャーレ当たり１～２×１０５個の細胞をＭＭＣ処理したＭＥＦフィーダー細胞上に播種した。翌日、ヒトｉＰＳ細胞培地に置き換え、感染３０日後まで培養を継続し、コロニーを回収した。
N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法により、樹立したヒト由来線維芽細胞からｉＰＳ細胞を樹立した。
具体的には、感染１日前に、６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５×１０５個のヒト線維芽細胞を播種し、その後、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを、ＭＯＩ(multiplicity of infection)３にて、細胞に感染させた。Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むＳｅＶベクターについては、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法に従い作製した。感染７日後、感染させた線維芽細胞を、トリプシンを用いて回収し、６０ｍｍのシャーレ当たり５．４×１０４個の細胞、又は１００ｍｍのシャーレ当たり１～２×１０５個の細胞をＭＭＣ処理したＭＥＦフィーダー細胞上に播種した。翌日、ヒトｉＰＳ細胞培地に置き換え、感染３０日後まで培養を継続し、コロニーを回収した。
２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換物（ＫＳＲ，インビトロゲン）、２ｍＭのＬ-グルタミン、１×１０－４Ｍの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，シグマ）、１×１０－４Ｍの２－メルカプトエタノール（シグマ）、０．５％のペニシリンとストレプトマイシン（日本，ナカライテスク）、及び５ｎｇ／ｍＬの基本線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ，和光，日本）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ）を含有するヒトｉＰＳ培地を用いて、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理したＭＥＦフィーダー細胞上で、ヒトｉＰＳ細胞を維持した。
［神経幹細胞（Neural Stem Cell:NSC）への分化］
分化誘導開始の前日に、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)をコーティングした６穴プレートに、ヒトｉＰＳ細胞を２．５×１０５～３×１０５個/ウェルの密度で播種し、ヒトｉＰＳ培地で培養した。翌日（誘導開始日：Day 0）、ヒトｉＰＳ培地を除去して、PSC Neural Induction Medium(Thermo Fisher Scientific）に入れ替えた。引き続き、２日に１回の頻度で、PSC Neural Induction Mediumにて培地交換を行いながら、培養開始後７日目(Day 7)まで培養を行い、ＮＳＣを誘導した。誘導されたＮＳＣは、培地を除き、StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞をはがし、Neural Expansion Medium(Thermo Fisher Scientific)に細胞を懸濁後、Geltrexにてコーティングした100mm細胞培養用シャーレへ播種した。この時点の細胞をP0NSC（継代数ゼロのNSC）とし、以後、適宜この培地にてNSCを増やし、実験に使用した。
分化誘導開始の前日に、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)をコーティングした６穴プレートに、ヒトｉＰＳ細胞を２．５×１０５～３×１０５個/ウェルの密度で播種し、ヒトｉＰＳ培地で培養した。翌日（誘導開始日：Day 0）、ヒトｉＰＳ培地を除去して、PSC Neural Induction Medium(Thermo Fisher Scientific）に入れ替えた。引き続き、２日に１回の頻度で、PSC Neural Induction Mediumにて培地交換を行いながら、培養開始後７日目(Day 7)まで培養を行い、ＮＳＣを誘導した。誘導されたＮＳＣは、培地を除き、StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞をはがし、Neural Expansion Medium(Thermo Fisher Scientific)に細胞を懸濁後、Geltrexにてコーティングした100mm細胞培養用シャーレへ播種した。この時点の細胞をP0NSC（継代数ゼロのNSC）とし、以後、適宜この培地にてNSCを増やし、実験に使用した。
［実験例２］
＜FITC-CTBを用いたＧＭ１蓄積の可視化＞
健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、４％パラホルムアルデヒドにて固定後、０．１％ TritonX-100/PBSにて透過処理し、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行った。その後、FITC-CTB（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）と抗Nestin抗体（神経幹細胞に特異的に発現している分子：神経幹細胞のマーカー）を用いて、多重染色を行った。図１に結果を示す。
Nestin染色においては、健常者、ＧＭ患者、いずれのNSCにおいても強い染色が認められ、神経幹細胞への分化が確認された（図１，下段）。一方、FITC-CTBにおいては，健常者ではほとんど染色が認められなかったが、ＧＭ１患者においては，強い染色が認められた（図１，上段）。
これらの結果から、ＧＭ１患者由来神経幹細胞では、ＧＭ１が蓄積していることが確認された。
＜FITC-CTBを用いたＧＭ１蓄積の可視化＞
健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、４％パラホルムアルデヒドにて固定後、０．１％ TritonX-100/PBSにて透過処理し、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行った。その後、FITC-CTB（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）と抗Nestin抗体（神経幹細胞に特異的に発現している分子：神経幹細胞のマーカー）を用いて、多重染色を行った。図１に結果を示す。
Nestin染色においては、健常者、ＧＭ患者、いずれのNSCにおいても強い染色が認められ、神経幹細胞への分化が確認された（図１，下段）。一方、FITC-CTBにおいては，健常者ではほとんど染色が認められなかったが、ＧＭ１患者においては，強い染色が認められた（図１，上段）。
これらの結果から、ＧＭ１患者由来神経幹細胞では、ＧＭ１が蓄積していることが確認された。
［実験例３］
アルツハイマー病患者の脳におけるＧＭ１ガングリオシドの量は、健常者の脳におけるＧＭ１ガングリオシドの量よりも多いと報告されている。発明者らは、アルツハイマー病由来の神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの代謝状態を検討した。第一に、患者由来の神経幹細胞のβ－ｇａｌ活性を調べたところ、アルツハイマー病患者由来の神経幹細胞のβ－ｇａｌ活性は、健常者由来の神経幹細胞と比較して、低下していたことが確認された（図２Ａ）参照。）。図２Ａ中、２０１Ｂ７及び４０９Ｂ２は、健常者由来の神経幹細胞を示し、Ａ１３８及びＡ１５４は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞を示し、Ａ２３２＃３－１及びＡ２３２＃２－２は、アルツハイマー病由来の神経幹細胞を示す。また、図２Ａ中、Ｓｏｌは、不溶性画分を、Ｓｕｐは、可溶性画分を意味する。本実験例において不溶性画分・可用性画分におけるβ－ｇａｌ活性に差はないことを示している。
アルツハイマー病患者の脳におけるＧＭ１ガングリオシドの量は、健常者の脳におけるＧＭ１ガングリオシドの量よりも多いと報告されている。発明者らは、アルツハイマー病由来の神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの代謝状態を検討した。第一に、患者由来の神経幹細胞のβ－ｇａｌ活性を調べたところ、アルツハイマー病患者由来の神経幹細胞のβ－ｇａｌ活性は、健常者由来の神経幹細胞と比較して、低下していたことが確認された（図２Ａ）参照。）。図２Ａ中、２０１Ｂ７及び４０９Ｂ２は、健常者由来の神経幹細胞を示し、Ａ１３８及びＡ１５４は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞を示し、Ａ２３２＃３－１及びＡ２３２＃２－２は、アルツハイマー病由来の神経幹細胞を示す。また、図２Ａ中、Ｓｏｌは、不溶性画分を、Ｓｕｐは、可溶性画分を意味する。本実験例において不溶性画分・可用性画分におけるβ－ｇａｌ活性に差はないことを示している。
更に、発明者らは、ＡＰＰの過剰発現が、β－ｇａｌ活性に及ぼす影響を検討した。健常者由来の神経幹細胞に、コントロールベクター又はＡＰＰ過剰発現ベクターを導入し、β－ｇａｌ活性を測定した。コントロールベクターを導入した神経幹細胞と比較して、ＡＰＰ過剰発現ベクターを導入した神経幹細胞において、β－ｇａｌ活性が低下していたことが確認された（図２Ｂ参照。）。
更に、発明者らは、患者由来の神経幹細胞における、ＧＭ１ガングリオシドの蓄積を検討した（図２Ｃ、図２Ｄ参照。）。図２Ｃは、細胞全体におけるＧＭ１ガングリオシド量を示したグラフであり、図２Ｄは、脂質ラフト画分におけるＧＭ１ガングリオシド量を示したグラフである。
アルツハイマー病由来の神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの量は、健常者由来の神経幹細胞における量より多いことが確認された。特に、脂質ラフト画分での差が大きかった。β－ｇａｌがＧＭ１ガングリオシドの分解に関与しているという知見もあり、これらのことから、アルツハイマー病由来の神経幹細胞においては、β－ｇａｌ活性が低下しており、これにより、ＧＭ１ガングリオシドが蓄積するものと示唆された。
アルツハイマー病由来の神経幹細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの量は、健常者由来の神経幹細胞における量より多いことが確認された。特に、脂質ラフト画分での差が大きかった。β－ｇａｌがＧＭ１ガングリオシドの分解に関与しているという知見もあり、これらのことから、アルツハイマー病由来の神経幹細胞においては、β－ｇａｌ活性が低下しており、これにより、ＧＭ１ガングリオシドが蓄積するものと示唆された。
［実験例４］
ＧＭ１ガングリオシドの減少が、Ａβの代謝に影響するかどうかを確認するため、β－ｇａｌタンパク質を神経幹細胞内に過剰発現させた（図３Ａ～Ｄ参照。）。図３中、Ｃｏｎｔｒｏｌは、コントロールベクターを導入した神経幹細胞を示し、ＧＬＢ１ ＯＥは、β－ｇａｌタンパク質過剰発現ベクターを導入した神経幹細胞を示す。図３Ｂに示されるように、アルツハイマー病由来の神経幹細胞におけるβ－ｇａｌタンパク質の過剰発現より、Ａβ４２の量が減少したことが確認された。
ＧＭ１ガングリオシドの減少が、Ａβの代謝に影響するかどうかを確認するため、β－ｇａｌタンパク質を神経幹細胞内に過剰発現させた（図３Ａ～Ｄ参照。）。図３中、Ｃｏｎｔｒｏｌは、コントロールベクターを導入した神経幹細胞を示し、ＧＬＢ１ ＯＥは、β－ｇａｌタンパク質過剰発現ベクターを導入した神経幹細胞を示す。図３Ｂに示されるように、アルツハイマー病由来の神経幹細胞におけるβ－ｇａｌタンパク質の過剰発現より、Ａβ４２の量が減少したことが確認された。
Ａβ４２を処理することにより、細胞死が誘導されるという知見がある。そこで、発明者らは、健常者由来の神経幹細胞及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞、それぞれにおけるＡβ４２に対する感受性を比較検討した（図３Ｅ参照。）。図３Ｅの凡例中、２０１Ｂ７ＮＳＣは、健常者由来の神経幹細胞を示し、Ａ１３８ＮＳＣは、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞を示し、２０１Ｂ７＋ＧＭ１は、ＧＭ１ガングリオシドで処理された健常者由来の神経幹細胞を示す。
細胞生存率アッセイの結果、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞は、健常者由来の神経幹細胞よりもＡβ４２に対する感受性が高いことが確認された。更に、ＧＭ１ガングリオシドで処理された健常者由来の神経幹細胞におけるＡβ４２に対する感受性は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞と類似した傾向を示すことが確認された。
これらのことから、ＧＭ１ガングリオシドは、神経幹細胞におけるＡβの生産に影響を及ぼすことが示唆された。
細胞生存率アッセイの結果、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞は、健常者由来の神経幹細胞よりもＡβ４２に対する感受性が高いことが確認された。更に、ＧＭ１ガングリオシドで処理された健常者由来の神経幹細胞におけるＡβ４２に対する感受性は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来の神経幹細胞と類似した傾向を示すことが確認された。
これらのことから、ＧＭ１ガングリオシドは、神経幹細胞におけるＡβの生産に影響を及ぼすことが示唆された。
［実験例５］
出生後、C57BL/6NCr SlcをバックグランウドとしたＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウス（ＢＫＯマウス：β－ｇａｌの完全欠損マウス, β－ｇａｌ（－／－））の脳からＡβを抽出し定量した（図４Ａ～Ｄ参照。）。図４中、ＷＴは、正常マウスを示し、ＢＫＯは、前述したＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウスを示し、５×ＦＡＤは、ヒトプリセニリン１（ＰＳ１）のＭ１４６Ｌ変異、及びＬ２８５Ｖ変異、並びに、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、Ｖ７１７Ｉロンドン型変異の５種類の変異を有するアルツハイマー病モデルマウスを示し、ＢＫＯ／５×ＦＡＤは、ＢＫＯと５×ＦＡＤを掛けあわせたマウスを示す。
図４Ａ及びＢは、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）抽出画分における可溶性Ａβの定量結果を示し、図４Ｃ及びＤは、Guanidin-HCl抽出画分における不溶性Ａβの定量結果を示す。
ＷＴと比較して、ＢＫＯでは、Ａβ４０及び４２が増加傾向にあることが示された。また、Guanidin-HCl抽出画分において、５×ＦＡＤと比較して、ＢＫＯ／５×ＦＡＤでは、Ａβ４０及び４２が有意に増加しており、ＢＫＯマウスと５×ＦＡＤの掛け合わせにより、アミロイドの沈着が促進されていることが確認された。
出生後、C57BL/6NCr SlcをバックグランウドとしたＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウス（ＢＫＯマウス：β－ｇａｌの完全欠損マウス, β－ｇａｌ（－／－））の脳からＡβを抽出し定量した（図４Ａ～Ｄ参照。）。図４中、ＷＴは、正常マウスを示し、ＢＫＯは、前述したＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウスを示し、５×ＦＡＤは、ヒトプリセニリン１（ＰＳ１）のＭ１４６Ｌ変異、及びＬ２８５Ｖ変異、並びに、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、Ｖ７１７Ｉロンドン型変異の５種類の変異を有するアルツハイマー病モデルマウスを示し、ＢＫＯ／５×ＦＡＤは、ＢＫＯと５×ＦＡＤを掛けあわせたマウスを示す。
図４Ａ及びＢは、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）抽出画分における可溶性Ａβの定量結果を示し、図４Ｃ及びＤは、Guanidin-HCl抽出画分における不溶性Ａβの定量結果を示す。
ＷＴと比較して、ＢＫＯでは、Ａβ４０及び４２が増加傾向にあることが示された。また、Guanidin-HCl抽出画分において、５×ＦＡＤと比較して、ＢＫＯ／５×ＦＡＤでは、Ａβ４０及び４２が有意に増加しており、ＢＫＯマウスと５×ＦＡＤの掛け合わせにより、アミロイドの沈着が促進されていることが確認された。
出生後、C57BL/6NCr SlcのＷＴ、ＢＫＯ、５×ＦＡＤ、ＢＫＯ／５×ＦＡＤの脳から切片を作製した。抗Ａβ抗体（クローン：4G8）を用いて、切片を免疫染色した。結果を図４Ｅに示す。図４Ａ～Ｄの結果と同様、アミロイドの沈着量の多さは、ＢＫＯ／５×ＦＡＤ、５×ＦＡＤ、ＢＫＯ、ＷＴの順であることが確認された。
［実験例６］
＜イメージングサイトメーターを用いた薬剤スクリーニングによる化合物の評価＞
以下の要領で、アルツハイマー病治療剤のスクリーニングを行った。
９６ウェルプレートをＧｅｌｔｒｅｘにてコーティング後、Ｎｅｕｒａｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した、健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、５×１０４／ウェルの密度で播種した。その後、既知薬剤ライブラリーの化合物を、各々のウェルに最終濃度５μＭになるように添加し、72時間培養を行った。その後、４％パラホルムアルデヒドにて固定、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳにて透過処理、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、ＦＩＴＣ－ＣＴＢ（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（細胞の核を染色する試薬）、ＣｅｌｌＭａｓｋ（細胞膜を染色する試薬）を使い、蛍光染色した。
各ウェルの蛍光強度を、イメージングサイトメーター（IN Cell Analyzer 6000）を用いて画像を取得し、IN Cell Developer Toolbox プロトコールを用いて、細胞当たりのGM1ガングリオシド量を算出した。
表１に検討を行った化合物の結果を示す。
＜イメージングサイトメーターを用いた薬剤スクリーニングによる化合物の評価＞
以下の要領で、アルツハイマー病治療剤のスクリーニングを行った。
９６ウェルプレートをＧｅｌｔｒｅｘにてコーティング後、Ｎｅｕｒａｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した、健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、５×１０４／ウェルの密度で播種した。その後、既知薬剤ライブラリーの化合物を、各々のウェルに最終濃度５μＭになるように添加し、72時間培養を行った。その後、４％パラホルムアルデヒドにて固定、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳにて透過処理、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、ＦＩＴＣ－ＣＴＢ（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（細胞の核を染色する試薬）、ＣｅｌｌＭａｓｋ（細胞膜を染色する試薬）を使い、蛍光染色した。
各ウェルの蛍光強度を、イメージングサイトメーター（IN Cell Analyzer 6000）を用いて画像を取得し、IN Cell Developer Toolbox プロトコールを用いて、細胞当たりのGM1ガングリオシド量を算出した。
表１に検討を行った化合物の結果を示す。
検討を行った化合物のうち、ＧＭ１抑制化合物としてヒットしたいくつかの化合物における薬剤処理後の神経幹細胞の染色像を、図５、図６に示す。
ヒットした化合物においては，薬剤を添加していない例（図５ｂ・下段，図６ｅ・下段）と比較して、ＣＴＢの蛍光が低下しており、ＧＭ１の蓄積が抑制されていることが確認された（図５ｃならびにｄ，図６ｆからｇ、いずれも下段）。
ヒットした化合物においては，薬剤を添加していない例（図５ｂ・下段，図６ｅ・下段）と比較して、ＣＴＢの蛍光が低下しており、ＧＭ１の蓄積が抑制されていることが確認された（図５ｃならびにｄ，図６ｆからｇ、いずれも下段）。
［実験例７］
＜ＧＭ１蓄積を低下させるヒット薬剤の培地中（細胞外）Ａβに対する効果＞
Geltrexをコーティングした６ウェルプレートに、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、２×１０６個/ウェルの密度で播種し、ヒット薬剤を最終濃度５μＭになるように加え、７２時間培養した。７２時間後、細胞上清を回収し、４００ｇ・１０分間遠心した上清を解析用サンプルとした。これらの解析用サンプルを、Human/Rat βAmyloid（42）ELISA Kit wako、High Sensitive（WAKO）、Human/Rat βAmyloid（40）ELISA Kit wako II（WAKO）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて、Ａβ４２、Ａβ４０、それぞれを測定した。これらの測定結果より、Ｔｏｔａｌ Ａβ（Ａβ４２+Ａβ４０）ならびにＡβ４２／Ａβ４０比（Ａβ４２÷Ａβ４０）を算出した。結果を図７、図８に示す。
＜ＧＭ１蓄積を低下させるヒット薬剤の培地中（細胞外）Ａβに対する効果＞
Geltrexをコーティングした６ウェルプレートに、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、２×１０６個/ウェルの密度で播種し、ヒット薬剤を最終濃度５μＭになるように加え、７２時間培養した。７２時間後、細胞上清を回収し、４００ｇ・１０分間遠心した上清を解析用サンプルとした。これらの解析用サンプルを、Human/Rat βAmyloid（42）ELISA Kit wako、High Sensitive（WAKO）、Human/Rat βAmyloid（40）ELISA Kit wako II（WAKO）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて、Ａβ４２、Ａβ４０、それぞれを測定した。これらの測定結果より、Ｔｏｔａｌ Ａβ（Ａβ４２+Ａβ４０）ならびにＡβ４２／Ａβ４０比（Ａβ４２÷Ａβ４０）を算出した。結果を図７、図８に示す。
アルツハイマー病患者由来の神経幹細胞の培地中におけるＡβ４２／Ａβ４０及び細胞内におけるＡβ４２／Ａβ４０は、健常者に比較して高い値を示した（図７および８の下段）。
ＧＭ１抑制化合物の処理により、アルツハイマー病患者由来の神経幹細胞の培地中及び細胞内におけるＴｏｔａｌ ＡβならびにＡβ４２／Ａβ４０比を低下することが確認された（図７c，図８f）。
ＧＭ１抑制化合物の処理により、アルツハイマー病患者由来の神経幹細胞の培地中及び細胞内におけるＴｏｔａｌ ＡβならびにＡβ４２／Ａβ４０比を低下することが確認された（図７c，図８f）。
［実験例８］
＜ＧＭ１抑制化合物投与後のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウスの脳における、ＧＭ１ガングリオシド量の変化＞
ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウス（ＢＫＯマウス：β-Galactosidaseの完全欠損マウス, β－Ｇａｌ（－／－）へ、出生後P9からP15の6日間、Amodiaquine (40mg/kg)、Thiethylperanzine (6mg/kg)を、１日２回、腹腔内に投与した。なお、陽性対象として、薬液にＰＢＳを用い、同様の操作を行った。また、陰性対象として、薬液にＰＢＳ、マウスとしてβ－Ｇａｌ（＋/－）のものを用いて、同様の操作を行った。その後、マウス脳をOCTコンパウンドにて包埋し、５μｍの厚さで切片を作製した。切片は４％パラホルムアルデヒドにて固定後、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、Alexa Fluor488-CTB、Hoechst 33342にて蛍光染色を行った。また、マウス脳を、Svennerholm and Fredmanの抽出法に基づいてスフィンゴ脂質を分画・精製し、試料とし、これらの試料をAgilent6460 Triple Quadrupole LC/MSにて解析し、脳内ＧＭ１を定量した。蛍光染色の結果を図９に示す。
＜ＧＭ１抑制化合物投与後のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウスの脳における、ＧＭ１ガングリオシド量の変化＞
ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウス（ＢＫＯマウス：β-Galactosidaseの完全欠損マウス, β－Ｇａｌ（－／－）へ、出生後P9からP15の6日間、Amodiaquine (40mg/kg)、Thiethylperanzine (6mg/kg)を、１日２回、腹腔内に投与した。なお、陽性対象として、薬液にＰＢＳを用い、同様の操作を行った。また、陰性対象として、薬液にＰＢＳ、マウスとしてβ－Ｇａｌ（＋/－）のものを用いて、同様の操作を行った。その後、マウス脳をOCTコンパウンドにて包埋し、５μｍの厚さで切片を作製した。切片は４％パラホルムアルデヒドにて固定後、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、Alexa Fluor488-CTB、Hoechst 33342にて蛍光染色を行った。また、マウス脳を、Svennerholm and Fredmanの抽出法に基づいてスフィンゴ脂質を分画・精製し、試料とし、これらの試料をAgilent6460 Triple Quadrupole LC/MSにて解析し、脳内ＧＭ１を定量した。蛍光染色の結果を図９に示す。
陰性対象では、CTBの蛍光がほとんど見られなかった（図９ａ・上段）。一方、陽性対象では、CTBの蛍光が強く、GM1の蓄積が確認された（図９ｂ・上段）。一方で、ＧＭ１抑制化合物による処理を行ったいずれにおいても、CTBの蛍光は強く抑制されており、ＧＭ１の蓄積が抑制されていることが確認された（図９c，d，いずれも上段）。ＧＭ１の定量結果を図１０に示す。
陰性対象と比較して、陽性対象では、ＧＭ１ガングリオシド量の増加が確認された。一方，薬液処理したいずれにおいても、陽性対象と比べて、ＧＭ１ガングリオシド量が低下していることが確認された。
［実験例９］
＜ＧＭ１抑制化合物投与後のアルツハイマー病モデルマウスの脳における、Ａβ量の変化＞
出生後３か月の５×ＦＡＤマウスにAmodiaquine (40mg/kg) 、Thiethylperanzine (6mg/kg)を、1日2回、腹腔内に３か月間連続投与した。なお、陽性対象として、薬液にＰＢＳを用い、同様の操作を行った。その後、各マウスの脳からＡβを抽出し定量した（図１１Ａ～Ｄ参照。）。
図１１Ａ及びＢは、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）抽出画分における可溶性Ａβの定量結果を示し、図１１Ｃ及びＤは、Guanidin-HCl抽出画分における不溶性Ａβの定量結果を示す。
ＰＢＳ投与群と比較して、Amodiaquine 投与群、及びThiethylperanzine投与群では、Ａβ４０及び４２が減少していることが確認された。
＜ＧＭ１抑制化合物投与後のアルツハイマー病モデルマウスの脳における、Ａβ量の変化＞
出生後３か月の５×ＦＡＤマウスにAmodiaquine (40mg/kg) 、Thiethylperanzine (6mg/kg)を、1日2回、腹腔内に３か月間連続投与した。なお、陽性対象として、薬液にＰＢＳを用い、同様の操作を行った。その後、各マウスの脳からＡβを抽出し定量した（図１１Ａ～Ｄ参照。）。
図１１Ａ及びＢは、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）抽出画分における可溶性Ａβの定量結果を示し、図１１Ｃ及びＤは、Guanidin-HCl抽出画分における不溶性Ａβの定量結果を示す。
ＰＢＳ投与群と比較して、Amodiaquine 投与群、及びThiethylperanzine投与群では、Ａβ４０及び４２が減少していることが確認された。
また、連続投与後の各マウスの脳から切片を作製した。抗Ａβ抗体（クローン：4G8）を用いて、切片を免疫染色した。結果を図１１Ｅに示す。図１１Ａ～Ｄの結果と同様、Amodiaquine 投与群、及びThiethylperanzine投与群では、Ａβ４０及び４２が減少していることが確認された。
［実験例１０］
＜ＧＭ１抑制化合物添加によるオートファジーへの影響＞
ガングリオシドの合成及び分解過程を図１２に示す。GM1、GM2、GM3の各ガングリオシドは、単糖及びN-アセチルノイラミン酸の連続的付加により生成される。また、ガングリオシドの分解は、ライソゾーム中のグリコシダーゼが段階的に作用することにより行われる。図１２における（１）～（７）は、各反応において作用する酵素を示している。
図１３は、NEU1 及びβ-GLUの発現が候補化合物による処理により増加することを示している。正常(201B7)及び疾患由来 (A138 #1-3)のiPS細胞から分化して得られた神経幹細胞をウェルに播種し、 Amodiaquine又はThiethylperanzineを5μMになるようにそれぞれ添加し、72時間培養を行った。培養後、RNAを単離し、各酵素遺伝子の発現量の解析を行った。図１３中、－は、無添加サンプルを示し、amoは、Amodiaquine添加サンプルを示し、thieは、Thiethylperanzine添加サンプルを示す。
本結果により、ＧＭ１抑制化合物の作用により、ライソゾーム中におけるガングリオシドの分解を促進し、オートファジーを活性化させることが示唆された。
＜ＧＭ１抑制化合物添加によるオートファジーへの影響＞
ガングリオシドの合成及び分解過程を図１２に示す。GM1、GM2、GM3の各ガングリオシドは、単糖及びN-アセチルノイラミン酸の連続的付加により生成される。また、ガングリオシドの分解は、ライソゾーム中のグリコシダーゼが段階的に作用することにより行われる。図１２における（１）～（７）は、各反応において作用する酵素を示している。
図１３は、NEU1 及びβ-GLUの発現が候補化合物による処理により増加することを示している。正常(201B7)及び疾患由来 (A138 #1-3)のiPS細胞から分化して得られた神経幹細胞をウェルに播種し、 Amodiaquine又はThiethylperanzineを5μMになるようにそれぞれ添加し、72時間培養を行った。培養後、RNAを単離し、各酵素遺伝子の発現量の解析を行った。図１３中、－は、無添加サンプルを示し、amoは、Amodiaquine添加サンプルを示し、thieは、Thiethylperanzine添加サンプルを示す。
本結果により、ＧＭ１抑制化合物の作用により、ライソゾーム中におけるガングリオシドの分解を促進し、オートファジーを活性化させることが示唆された。
本発明により、新たな作用機序を有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤を提供することができる。
Claims (3)
- ＧＭ１ガングリオシドの細胞内蓄積を有するアルツハイマー病予防剤又は治療剤であって、
Sertindole（セルチンドール）を有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病予防剤又は治療剤。 - 請求項１に記載のアルツハイマー病予防剤又は治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、アルツハイマー病予防用又は治療用組成物。
- ＧＭ１ガングリオシドの細胞内蓄積を有するアルツハイマー病に対するSertindole（セルチンドール）の治療効果の判断を補助する方法であって、
Sertindole（セルチンドール）を有効成分として含有するアルツハイマー病治療剤を投与された患者由来の細胞における、投与前後のＧＭ１ガングリオシドの細胞内蓄積量を測定し、その蓄積量が減少している場合には治療効果のある可能性が高いと評価することを含む、方法。
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