KR20200010311A - 알츠하이머병의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
알츠하이머병(AD) 병인에서 신규한 경로 STAT1-CH25H를 표적화함으로써, 구체적으로 STAT1 저해제, CH25H 저해제, 또는 25-OHC 저해제, 예를 들어, 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제 저해제, 예컨대 심바스타틴의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써, 대상에서 AD를 치료하거나 그의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법이 개시된다.
Description
본 발명은 일반적으로 약제학적 제제(agent) 및 그의 질환 치료를 위한 약제학적 제제의 용도, 구체적으로 신호전달 및 전사 활성 인자 1(STAT1: signal transducer and activator of transcription 1), 콜레스테롤 25-하이드록실라제(CH25H), 및 25-하이드록실화 콜레스테롤(25-OHC)을 표적화하고 저해하는 약제학적 제제; 및 아밀로이드 베타 침착을 감소시킴에 의한 생리학적 병태의 관리, 특히 중추 신경계 장애, 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 다른 질환을 포함하는 다양한 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 약제학적 제제의 용도의 분야에 관한 것이다.
우리 인구의 수명이 증가함에 따라, 알츠하이머병(AD)은 전세계적으로 만연한 건강 문제가 되고 있다. AD 환자는 그들의 기억력, 지남력, 판단력, 및 논리력에 있어서 인지 저하를 겪는다(문헌[Tanzi and Bertram 2005]). 전형적으로, 질환 발생에서 사망에 이르는 최종 단계까지는 약 10 년이 소요된다. 현재까지는 이용가능한 치료 또는 예방 요법이 없다.
아밀로이드 전구체 단백질의 대사물질인 Αβ 단백질(이하 APP라고 지칭함)의 침착은, 뇌에서의 그들의 독성과 함께, AD의 발생에 있어서 주요 원인 인자인 것으로 생각된다(문헌[Selkoe 2001]). Αβ는 AD 환자에서 발견되는 노인반에서 확인된 단백질 구성요소이다(문헌[Ikeda, Wong et al. 1987], 문헌[Cole, Masliah et al. 1991]). 생물학적으로, Αβ는 아밀로이드-β 전구체 단백질(APP)의 순차적 절단을 통해 생성되며, 이는 상이한 크기의 단편을 생성한다. 약제학적 연구는 AD의 발생에 기여하는 가장 병원성인 형태로서 Αβ42를 확인하였다(문헌[Roher, Chaney et al. 1996], 문헌[Morelli, Prat et al. 1999]). Αβ42의 생성은 APP의 β- 및 후속의 γ- 절단으로부터의 결과이다(문헌[Citron 2010], 문헌[De Strooper, Vassar et al. 2010]). 이러한 불용성 Αβ42 단편은 세포외 공간에서 응집하여 병변을 형성한다. 몇가지 증거는 Αβ42의 가용성 올리고머가 심지어 더 독성임을 시사한다. Αβ42의 존재는 시냅스 활동에 영향을 준다. Αβ42의 축적은 잠재적으로 비정상적인 네트워크 활성 및 시냅스 저하를 유도할 수 있을 것이다(문헌[Palop and Mucke 2009]).
형질전환 마우스 모델에서의 전임상 연구에서는 AD 및 프리온 질환 양자 모두의 예방에 있어서 면역요법이 우수한 효능을 가진 것으로 나타났다(문헌[Wisniewski 2012]). Αβ가 AD에서 중추적 분자임을 알게 됨으로써, 소분자 또는 면역요법을 통한 Αβ의 근본적 제거를 위해 몇몇 전략이 개발되어 왔다(문헌[Tabira 2011], 문헌[Huang and Mucke 2012], 문헌[Ozudogru and Lippa 2012], 문헌[Delrieu, Ousset et al. 2014]). Αβ-지향 면역화가 AD의 마우스 모델에서 유망한 결과를 나타냈지만, 인간에 대한 효과적인 요법으로의 이행은 여전히 난제이다.
능동 백신접종 시험에서, 능동 면역화를 받은 개체는 비-면역화 대조군에 비해 병변 부하의 유의적인 감소 및 현저하게 감소된 Αβ를 나타냈다. 고무적인 결과와 무관하게, 치료군은 장기 생존, 중증 치매가 발생하기까지의 시간, 및 인지 기능에 있어서 개선을 나타내지 않았다(문헌[Holmes, Boche et al. 2008]). Αβ를 표적화하는 수동 면역화의 최근의 2개의 대규모 III 상 시험 또한 결국 임상적 이익의 증거 없이 종료되었다(문헌[Doody, Thomas et al. 2014], 문헌[Salloway, Sperling et al. 2014]). 그러므로, AD에 대한 새롭고 신규한 치료 또는 예방 요법을 찾는 것이 바람직하다.
발명의 요약
일 태양에서 본 발명은, STAT1 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법이다. 일 실시 형태에서, STAT1 저해제는 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체이다. 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 IL-6 또는 IL6 수용체에 대한 항체이다. 또 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제이다. 또 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1 인산화를 감소시키는 제제이다. 추가의 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1의 핵 내로의 전위(translocation)를 방지하는 제제이다. 추가의 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1에 대한 RNAi 제제이다.
다른 태양에서 본 발명은, CH25H 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, CH25H 저해제는 STAT1 저해제이다. 다른 실시 형태에서, CH25H 저해제는 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체인 STAT1 저해제이다. 또 다른 실시 형태에서, CH25H 저해제는 IL-6 또는 IL6 수용체에 대한 항체인 STAT1 저해제이다. 또 다른 실시 형태에서, CH25H 저해제는 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제인 STAT1 저해제이다. 추가의 실시 형태에서, CH25H 저해제는 STAT1 인산화를 감소시키는 제제인 STAT1 저해제이다. 추가의 실시 형태에서, CH25H 저해제는 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제인 STAT1 저해제이다. 추가의 실시 형태에서, CH25H 저해제는 STAT1에 대한 RNAi 제제인 STAT1 저해제이다.
다른 태양에서 본 발명은, 25-OHC 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법이다. 일 실시 형태에서, 25-OHC 저해제는 CH25H 저해제 또는 STAT1 저해제이다. 다른 실시 형태에서, 25-OHC 저해제는 25-OHC의 유사체(analog)이다. 또 다른 실시 형태에서, 25-OHC 저해제는 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제 저해제, 예를 들어, 심바스타틴이다.
다른 태양에서 본 발명은, STAT1 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법이다. 일 실시 형태에서, STAT1 저해제는 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체이다. 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 IL-6 또는 IL-6 수용체에 대한 항체이다. 또 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제이다. 또 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1 인산화를 감소시키는 제제이다. 추가의 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제이다. 추가의 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1에 대한 RNAi 제제이다.
또 다른 태양에서 본 발명은, CH25H 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법이다. 일부 실시 형태에서, CH25H 저해제는 STAT1 저해제이다. 일 실시 형태에서, STAT1 저해제는 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체이다. 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 IL-6 또는 IL-6 수용체에 대한 항체이다. 또 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제이다. 또 다른 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1 인산화를 감소시키는 제제이다. 추가의 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제이다. 추가의 실시 형태에서, STAT1 저해제는 STAT1에 대한 RNAi 제제이다.
또 다른 태양에서 본 발명은, 25-OHC 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 25-OHC 저해제는 CH25H 저해제 또는 STAT1 저해제이다. 다른 실시 형태에서, 25-OHC 저해제는 25-OHC의 유사체이다. 또 다른 실시 형태에서, 25-OHC 저해제는 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제 저해제, 예를 들어, 심바스타틴이다.
또 다른 실시 형태에서 본 발명은, 유전체 편집 도구(genome editing tool)를 제공하는 단계; 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 및 전체 STAT1 유전자, STAT1 유전자의 인산화 부위, STAT1 유전자의 프로모터 영역, 또는 STAT1 유전자의 SH2 도메인을 결실(deleting)시킴으로써 STAT1 유전자를 편집하는 단계에 의해 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 유전체 편집 도구는 CRISPR-CAS9 시스템이다.
또 다른 태양에서 본 발명은, 유전체 편집 도구를 제공하는 단계; 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 및 전체 CH25H 유전자, CH25H 유전자의 히스틴 클러스터 영역, 또는 CH25H 유전자의 프로모터 영역을 결실시킴으로써 CH25H 유전자를 편집하는 단계에 의해 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 유전체 편집 도구는 CRISPR-CAS9 시스템이다.
추가의 태양에서 본 발명은, 유전체 편집 도구를 제공하는 단계; 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 전체 STAT1 유전자, STAT1 유전자의 인산화 부위, STAT1 유전자의 프로모터 영역, 또는 STAT1 유전자의 SH2 도메인을 결실시킴으로써 STAT1 유전자를 편집하는 단계에 의해 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 유전체 편집 도구는 CRISPR-CAS9 시스템이다.
추가의 태양에서 본 발명은, 유전체 편집 도구를 제공하는 단계; 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 전체 CH25H 유전자, CH25H 유전자의 히스틴 클러스터 영역, 또는 CH25H 유전자의 프로모터 영역을 결실시킴으로써 CH25H 유전자를 편집하는 단계에 의해 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 유전체 편집 도구는 CRISPR-CAS9 시스템이다.
발명의 상세한 설명
본 개시는 부분적으로, STAT1-조절 CH25H 발현이 알츠하이머병(AD)의 병인에 영향을 준다는 새로운 의외의 발견에 기초한다. 본 발명자들은 CH25H가 STAT1의 다운스트림 표적이며, STAT1 및 그의 표적 CH25H가 AD 발생 중에 Αβ 침착을 촉진한다는 것을 발견하였다. 뇌에서 STAT1의 유전자 결손이 Αβ 침착을 지연시켰으므로, AD 환자에서 검출되는 더 많은 양의 인산화 STAT1(pSTAT1)은 AD 발생에 있어서의 원인 이벤트였다. CH25H는 콜레스테롤을 25-OHC로 전환시키는 효소이다. 25-OHC의 독특한 특징 중 하나는 그것이 혈액-뇌-장벽(BBB: Blood-Brain-Barrier)을 통과할 수 있다는 것이며, 현재 임상 시험 중인 다수의 약물이 BBB 투과에 문제가 있으므로, 이는 약물 개발에 유익할 수 있다. 본 발명자들은 AD 병인에 대한 CH25H 또는 25-OHC의 효과를 입증하였다. CH25H 녹아웃 마우스는 Αβ 침착이 감소되었으며, 이는 STAT1 녹아웃과 유사하였다. 반면에, 25-OHC의 투여는 뇌에서 Αβ 침착을 부스팅하였다.
Αβ 침착을 조절하기 위한 이펙터로서 25-OHC를 생성하는, 적어도 부분적으로 STAT1-CH25H 축에 관련된 질환 또는 의학적 병태를 치료하거나 예방하는 방법 및 수단이 본 명세서에 기재된다. 이러한 질환 또는 의학적 병태에서는, STAT1-CH25H의 활성이 향상됨으로써 Αβ 침착의 증가를 유발한다. STAT1-CH25H 활성의 향상은, 1) 증가된 STAT1 인산화; 2) 증가된 STAT1 또는 CH25H의 발현; 3) CH25H에 대한 기질로서 증가된 콜레스테롤에 기인할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 치료 및 예방을 위한 길항제는 화학물질, 소분자, 의약품, 비-코딩 RNA, 안티센스 뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 또는 항체 또는 그의 부분일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 길항제는 치료적 유효량으로 투여된다.
본 명세서에서 본 발명은 대상의 뇌 세포 내의 Αβ 침착에 관련된 질환 또는 의학적 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 질환 또는 의학적 병태는 Αβ의 비정상적인 생성, 수송, 또는 제거에 기인한다. 다른 실시 형태에서, 질환 또는 의학적 병태는 IFNα, IFN-β, IFN-γ, IL-6 패밀리 사이토카인, 또는 급성 또는 만성 염증의 병태와 같으나 이로 제한되지 않는 인자에 의해 야기되는 STAT1-CH25H 경로의 증가된 활성에 기인한다. 추가의 실시 형태에서, 질환 또는 의학적 병태는 대상에서 높은 콜레스테롤 양에 의해 야기되는 25-OHC의 증가된 양에 기인한다.
본 발명자들은 STAT1 신호전달의 차단, STAT1 발현의 폐지, 또는 CH25H의 결손이 감소된 Αβ 병변을 동반하여 AD의 병인을 약화시킨다는 것을 발견하였다. 배양된 세포에서 25-OHC의 화학적 유사체 또한 APP를 감소시켰다. 본 명세서의 치료 방법은 STAT1 또는 CH25H 신호전달, 발현, 또는 활성을 조절하는 제제, 예를 들어, 25-OHC 활성을 차단하거나 25-OHC 분해를 촉진하는 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특히, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하기 위한 방법 및 수단을 제공한다.
따라서, 일 태양에서 본 발명은, STAT1, 그의 다운스트림 표적 CH25H, 또는 25-하이드록실화 콜레스테롤(25-OHC)을 저해함으로써 대상의 뇌에서 AD와 같은 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 일 태양에서 본 발명은, STAT1, 그의 다운스트림 표적 CH25H, 또는 25-하이드록실화 콜레스테롤(25-OHC)을 저해함으로써 대상의 뇌에서 AD와 같은 질환의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법에 관한 것이다.
다른 태양에서 본 발명은, STAT1, 그의 다운스트림 표적 CH25H, 또는 25-하이드록실화 콜레스테롤(25-OHC)을 저해함으로써 대상의 뇌에서 아밀로이드-베타(Αβ) 침착을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
다른 태양에서 본 발명은, STAT1, 그의 다운스트림 표적 CH25H, 또는 25-하이드록실화 콜레스테롤(25-OHC)을 저해함으로써 대상의 뇌에서 아밀로이드-베타(Αβ) 침착의 축적을 예방하거나 지연시키는 방법에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 상기 방법에서의 STAT1의 저해는 STAT1 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함에 의한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상"은, 동물, 바람직하게 포유류, 가장 바람직하게 인간을 의미한다. 일부 경우에는, 소정의 바이오마커의 존재 또는 부재에 따라 상이한 하위군으로 대상을 분류할 수 있다. 다른 경우에는, 소정의 바이오마커의 양이 임계치 미만인지 또는 초과인지에 기초하여 대상을 상이한 하위군으로 분류할 수 있다. 어느 경우이든, 이어서 본 발명에서의 치료에 대해 하위군을 포함시키거나 배제할 수 있다.
일부 실시 형태에서, STAT1 저해제는 활성 제제, 예를 들어, 화합물, 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 또는 핵산의 약제학적 유효량, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이다.
"부형제", "담체", "약제학적으로 허용되는 부형제", "약제학적으로 허용되는 담체", 또는 유사한 용어는, 본 발명의 조성물 또는 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 허용되고 STAT1 저해제 조성물 또는 제형이 투여될 환자, 동물, 조직, 또는 세포에 과도하게 유해하지 않은 하나 이상의 구성요소(들) 또는 성분(들)을 의미한다.
STAT1 저해제에 관하여 용어 "약제학적 유효량", "유효 용량" 등은, 목적하는 반응, 예를 들어, 그것이 투여되는 대상, 예를 들어, 인간에서 Aβ 침착의 감소를 도출하거나, AD의 분자 또는 세포 파라미터 또는 임상 병태 또는 증상의 검출가능한 조절 또는 완화에 충분한 STAT1 저해제의 양을 의미한다. 예를 들어, 인간 치료 용도를 위한 유효량은 하루에 투여되는 STAT1 저해제의 단일 용량 또는 2회 이상의 하위용량일 수 있거나, 그것을 소정의 기간에 걸쳐, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 약 7 일 내지 약 1 년에 걸쳐 다중 용량으로서 투여할 수 있다.
치료적 유효량의 결정은 본 명세서에 제공된 상세한 개시에 비추어 당업자의 역량 범위 내에 있다. 예를 들어, 치료적 유효량 또는 유효용량은 초기에 시험관내 및 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 다른 예를 들어, 목적하는 농도 또는 역가를 달성하기 위해 동물 모델에서 유효용량을 제형화할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 활성 성분의 독성은 시험관내에서, 세포 배양 또는 실험 동물에서, 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이들 시험관내 및 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터를 인간에서의 사용을 위한 다양한 투여량의 제형화에 사용할 수 있다. 채용되는 투여형 및 이용되는 투여 경로에 따라 투여량이 변동될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 및 투여량은 환자의 병태의 관점에서 개별적인 의사에 의해 선택될 수 있다.
생물학적 효과를 유도하거나 억제하기에 충분한 활성 성분의 혈액 수준(최소 유효 농도, MEC)으로 투여량 및 간격을 개별적으로 조정할 수 있다. MEC는 각각의 제제에 대해 변동될 것이나, 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하기 위해 필요한 투여량은 개별적인 특징 및 투여 경로에 의존할 것이다. 검출 검정을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다. 치료할 병태의 중증도 및 반응성에 따라 투여는 단일 투여 또는 복수의 투여일 수 있으며, 치료의 코스는 수일 내지 수주 또는 치유가 이루어지거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속된다. 투여될 조성물의 양은 물론, 예를 들어, 치료하는 대상, 통증의 중증도, 투여 방식, 및 처방하는 의사의 판단에 의존할 것이다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, STAT1 저해제의 약제학적 유효량은 인간에서 약 0.02 mg/kg/일 내지 약 0.03 mg/kg/일 만큼 낮고, 약 2 mg/kg/일 내지 약 3 mg/kg/일 만큼 높을 수 있다. 일부 실시 형태에서, Αβ 침착이 더 중증이 됨에 따라 유효량은 3 mg/kg/일보다 더 높을 수 있다. 다른 실시 형태에서, 유효량은 STAT1 저해제가 Αβ 침착의 발병의 예방 또는 지연을 위해 사용되는 경우보다 STAT1 저해제가 치료를 위해 사용되는 경우에 더 높을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 투여량 및 투여 일정은 또한 치료할 인간 대상의 성별에 의존할 수 있다. 일부 경우에, 일부 여성 환자는 STAT1 치료에 더 취약할 수 있으므로, 남성 환자보다 투여량이 더 작을 수 있고 투여 일정이 덜 빈번할 수 있다. 다른 경우에, 일부 여성 환자는 STAT1 치료에 대해 더 민감성일 수 있으므로, 남성 환자보다 투여량이 더 작을 수 있고 투여 일정이 덜 빈번할 수 있다.
일부 실시 형태에서는, Αβ 침착을 검출할 수 있기 전에 바람직하게 상당히 일찍 투여를 시작할 수 있다. 다른 실시 형태에서는, Αβ 침착이 검출된 후이지만 임의의 AD의 임상 증상이 관찰될 수 있기 전에 투여를 시작할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서는, AD의 임상 증상이 관찰될 수 있게 된 후에 투여를 시작할 수 있다. 일부 경우에 투여는 단일 용량에 대한 것일 수 있다. 다른 경우에 투여는 다중 용량, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6회의 용량에 대한 것일 수 있다. 투여는 의사가 필요하다고 생각하는 횟수 만큼 계속될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 투여 일정과 투여량은 관련될 수 있다. 일례를 들어, 제1 투여 사이의 기간이 AD의 임상 증상이 관찰될 수 있기 전에 일찍 시작된 경우, 각각의 투여에 대한 투여량은 AD의 임상 증상이 관찰될 수 있게 된 후에 제1 용량이 투여되는 경우의 투여량보다 더 작을 수 있다. 다른 예를 들어, 투여가 빈번한 경우, 예를 들어, 매 12 시간마다 1회인 경우, 각각의 투여에 대한 투여량은 투여가 덜 빈번한 경우, 예를 들어, 매 24 시간마다 1회인 경우의 투여량보다 더 작을 수 있다.
본 명세서에 개시된 치료 방법 또는 다른 방법에서 STAT1 저해제를 사용하는 것과 관련하여 "사용하다", "치료하다", "치료", "다루다" 등과 같은 용어는, 예를 들어, 본 명세서 또는 본 명세서에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이, STAT1 저해제가 대상에게 투여되거나, 대상의 조직에 전달되거나, 생체내 또는 시험관내에서 조직, 세포, 또는 무세포 시스템과 접촉됨을 의미한다. 전형적으로 이러한 사용 또는 치료는, 예를 들어, (1) 치료하는 병태 또는 증상의 검출가능한 개선 또는 완화, (2) 관련 생체분자, 치료 세포 집단, 또는 병리학적 세포 집단의 활성, 수준, 또는 갯수의 검출가능한 조절, (3) 병태의 진행의 지체 또는 그의 발병의 지연, 또는 병태의 증상(들)의 중증도의 감소, 또는 (4) 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 검출가능한 반응을 유발한다. 임의의 이러한 완화는 일시적일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 수시간, 예를 들어, 약 1 내지 24 시간, 또는 적어도 수일, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 동안 지속될 수 있거나, 완화는 장기적일 수 있으며, 예를 들어, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 35, 42, 49, 56 내지 약 60 일, 또는 그 이상 동안 지속될 수 있거나, 완화는 영구적일 수 있다. 치료는 질환 또는 증상의 진행을 지체시킬 수 있거나, 그것은 그의 중증도를 감소시킬 수 있으며, 예를 들어, 적어도 일부 대상에서 질환 또는 증상의 발병이 충분한 양의 STAT1 저해제로 치료하지 않은 대상에 비교하여 약 1-24 시간, 약 2-10 일, 약 2-30 일 동안, 또는 약 1-5 년 동안 지연될 수 있다. 따라서, STAT1 저해제를 이용하는 치료 또는 사용은, 적합한 대조군, 예를 들어, 치료하지 않은 대조군에 비교하여, 전형적으로 표적 이펙터 또는 서프레서 세포 집단, 인터류킨, 사이토카인, 케모카인, 면역글로불린의 수준, 활성, 또는 상대량의 조절과 같은 관련 면역 파라미터의 검출가능한 조절을 유발한다. STAT1 저해제 치료는 또한 관련 전사 인자, 효소, 세포 생물학적 활성의 수준 또는 활성, 또는 질환의 병인적(etiological) 제제의 수준 또는 활성의 조절을 야기할 수 있다. STAT1 저해제를 이용하는 치료를 사용하여 질환, 증상, 또는 합병증의 발병을 지연 또는 예방하거나, 기존 질환, 병태, 증상, 또는 합병증의 진행을 완화 또는 지체시키거나, 질환, 병태, 증상, 또는 합병증, 예를 들어, AD에서의 Αβ 침착의 제거를 용이하게 할 수 있다.
"완화하다", "완화", "개선" 등은, 대상에서, 또는 적어도 소수의 대상에서, 예를 들어, 적어도 약 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100% 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이에 대한 범위로 일어나는 개선과 일치하는 검출가능한 개선 또는 검출가능한 변화를 의미한다. 이러한 개선 또는 변화는 STAT1 저해제로 치료하지 않은 대상에 비교하여 치료한 대상에서 관찰될 수 있으며, 여기에서 치료하지 않은 대상은 동일하거나 유사한 질환, 병태, 증상 등을 가지거나 이들이 발생하기 쉬운 대상이다. 질환, 병태, 증상, 또는 검정 파라미터의 완화는 주관적으로 또는 객관적으로, 예를 들어, 대상(들)에 의한 자가 평가에 의해, 임상의의 평가에 의해, 또는 예를 들어, 삶의 질 평가, 질환(들) 또는 병태(들)의 지체된 진행, 질환(들) 또는 병태(들)의 감소된 중증도, 생체분자(들), 세포(들)의 수준 또는 활성(들)에 대한 적합한 검정(들)을 포함하는 적절한 검정 또는 측정을 수행함으로써, 또는 대상 내의 세포 이동의 검출에 의해 결정될 수 있다. 완화는 일시적이거나 장기적이거나 영구적일 수 있거나, 그것은 STAT1 저해제가 대상에게 투여되거나 본 명세서 또는 인용된 참고문헌에 기재된 검정 또는 다른 방법에 사용되는 중의 또는 그 후의 관련 시간에, 예를 들어, STAT1 저해제의 투여 또는 사용으로부터 약 1 시간 이내 내지 대상(들)이 STAT1 저해제를 받은 후 약 3, 6, 9 개월 이상에 가변적일 수 있다.
예를 들어, 증상, 분자의 수준 또는 생물학적 활성, 세포 반응, 세포 활성 등의 "조절"은, 세포, 수준 또는 활성 등이 검출가능하게 증가되거나 감소됨을 의미한다. 이러한 증가 또는 감소는 STAT1 저해제로 치료하지 않은 대상에 비교하여 치료한 대상에서 관찰될 수 있으며, 여기에서 치료하지 않은 대상은 동일하거나 유사한 질환, 병태, 증상 등을 가지거나 이들이 발생하기 쉬운 대상이다. 이러한 증가 또는 감소는 적어도 약 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상 또는 대략 이들 값 중 임의의 2개 사이에 대한 임의의 범위 이내일 수 있다. 조절은 주관적으로 또는 객관적으로, 예를 들어, 대상의 자가 평가에 의해, 임상의의 평가에 의해, 또는 예를 들어, 삶의 질 평가, 또는 대상 내의 분자, 세포, 또는 세포 이동의 수준 또는 활성에 대한 적합한 검정을 포함하는 적절한 검정 또는 측정을 수행함으로써 결정될 수 있다. 조절은 일시적이거나 장기적이거나 영구적일 수 있거나, 그것은 STAT1 저해제가 대상에게 투여되거나 본 명세서 또는 인용된 참고문헌에 기재된 검정 또는 다른 방법에 사용되는 중의 또는 그 후의 관련 시간에, 예를 들어, STAT1 저해제의 투여 또는 사용으로부터 약 1 시간 이내 내지 대상(들)이 STAT1 저해제를 받은 후 약 3, 6, 9 개월 이상에 가변적일 수 있다.
본 개시 내의 다양한 위치에서, 예를 들어, 임의의 개시된 실시 형태에서, 또는 청구범위에서, 하나 이상의 명시된 구성요소, 요소, 또는 단계를 "포함하는" 화합물, 조성물, 제형, 또는 방법이 언급된다. 본 발명의 실시 형태는 또한 그러한 명시된 구성요소, 요소, 또는 단계이거나 이들로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성되는 그러한 화합물, 조성물, 제형, 또는 방법을 구체적으로 포함한다. 용어 "포함하는", "~으로 구성된", 및 "~으로 본질적으로 구성된"은 미국 특허법 하에 그들의 통상적으로 인정되는 의미를 가진다. 예를 들어, 구성요소 또는 단계를 "포함하는" 개시된 조성물 또는 방법은 개방형이며 그들은 그러한 조성물 또는 방법에 더하여 부가적인 구성요소(들) 또는 단계(들)를 포함하거나 그렇게 해석된다. 마찬가지로, 구성요소 또는 단계로 "구성된" 개시된 조성물 또는 방법은 폐쇄형이며 그들은 상당한 양의 부가적인 구성요소(들) 또는 부가적인 단계(들)를 가진 그러한 조성물 또는 방법을 포함하거나 그렇게 해석되지 않을 것이다.
일부 경우에, STAT1의 활성화에 인터페론이 필요하고 인터페론의 저해는 STAT1의 활성화를 방지하거나 감소시킬 것이므로, STAT1 저해제는 인터페론에 대한 항체일 수 있다. 인터페론 항체의 예는 인터페론-γ에 대한 인간화 단클론 항체인 폰톨리주맙(예정된 상표명 HuZAF)이다. 항체 활성의 제조 및 검정 방법이 당업계에 일반적으로 알려져 있으므로, 당업자는 인터페론에 대한 유사한 항체를 제조하고 인터페론에 대한 그의 저해 효과에 대해 스크리닝할 수 있다.
일부 경우에, STAT1의 활성화에 인터페론 수용체가 필요하고 인터페론 수용체의 저해는 STAT1의 활성화를 방지하거나 감소시킬 것이므로, STAT1 저해제는 인터페론 수용체에 대한 항체일 수 있다. 인터페론 수용체 항체의 예는 유형 I 인터페론(IFN) 수용체 1을 표적화하는 인간 단클론 항체인 아니프롤루맙이다. 항체 활성의 제조 및 검정 방법이 당업계에 일반적으로 알려져 있으므로, 당업자는 인터페론 수용체에 대한 유사한 항체를 제조하고 인터페론 수용체에 대한 그의 저해 효과에 대해 스크리닝할 수 있다.
일부 경우에, STAT1의 활성화에 IL6이 필요하고 인터페론의 저해는 STAT1의 활성화를 방지하거나 감소시킬 것이므로, STAT1 저해제는 IL6에 대한 항체일 수 있다. IL-6 항체의 예는 IL-6에 대한 키메라(인간 및 마우스 단백질로부터 제조됨) 단클론 항체인 실툭시맙이다. 항체 활성의 제조 및 검정 방법이 당업계에 일반적으로 알려져 있으므로, 당업자는 IL-6에 대한 유사한 항체를 제조하고 IL-6에 대한 그의 저해 효과에 대해 스크리닝할 수 있다.
일부 경우에, STAT1의 활성화에 인터페론 수용체가 필요하고 IL-6 수용체(IL-6R)의 저해는 STAT1의 활성화를 방지하거나 감소시킬 것이므로, STAT1 저해제는 IL-6 수용체에 대한 항체일 수 있다. IL-6 수용체 항체의 예는 인터류킨-6 수용체에 대한 인간화 단클론 항체인 토실리주마이다. 항체 활성의 제조 및 검정 방법이 당업계에 일반적으로 알려져 있으므로, 당업자는 IL-6R에 대한 유사한 항체를 제조하고 IL-6R에 대한 그의 저해 효과에 대해 스크리닝할 수 있다.
또 다른 경우에, JAK1 및 JAK3은 STAT 신호전달을 활성화하는 잘 알려진 업스트림 키나제이므로, STAT1 저해제는 JAK1 또는 JAK3을 저해하는 제제일 수 있다. JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제는 소분자, 예를 들어, JAK1 저해제로 사용되는 필고티닙, JAK3 저해제로는 토파시티닙일 수 있다.
또 다른 경우에, STAT1 저해제는 STAT1 인산화를 감소시키는 제제일 수 있다. STAT1 인산화를 감소시키는 이러한 제제는 STAT 인산화를 저해하는 것으로 보고된 FLLL32일 수 있다.
또 다른 경우에, STAT1 저해제는 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제일 수 있다. STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 이러한 제제는 홍역 바이러스 단백질 P 및 V일 수 있다.
추가의 경우에, STAT1 저해제는 STAT1에 대한 RNAi 제제이다. 이러한 RNAi 제제는 STAT1을 표적화하는 임의의 SiRNA, 예를 들어, ThermoSisher Scientific으로부터의 제품 105153일 수 있다. 특이적 표적에 대한 siRNA의 제조 방법이 당업계에 일반적으로 알려져 있으므로, 당업자는 STAT1을 표적화하는 다른 siRNA 제제를 제조할 수 있다.
추가의 경우에, AD의 치료, 예방, 또는 발병의 지연을 위한 방법으로서, 유전체 편집 도구를 사용하여 신경 세포 내의 전체 STAT1 유전자, STAT1 유전자의 인산화 부위, STAT1 유전자의 프로모터 영역, 또는 STAT1 유전자의 SH2 도메인을 결실시킬 수 있다. 유전체 편집 도구는, 그것이 STAT1 유전자의 특이적 영역을 표적화하기 위해 사용될 수 있고 관심 세포에 전달될 수 있는 한, 임의의 유전체 편집 도구일 수 있다. 이러한 유전체 편집 도구의 일례는 문헌[Ran, F. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Nature (2015)]에 기재된 바와 같은 CRISPR-CAS9 시스템이다. 이러한 유전체 편집 도구의 다른 예는 문헌[Zetsche et al., Cpfl Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell (2015)]에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cpfl 시스템이다.
다른 실시 형태에서, 상기 방법에서의 CH25H의 저해는 CH25H 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함에 의한다. 일부 실시 형태에서, STAT1은 CH25H를 활성화하고 STAT1의 저해는 STAT1이 CH25H를 활성화하는 것을 불가능하게 하므로, CH25H 저해제는 STAT1 저해제이다. STAT1 저해제는 본 출원에 개시된 임의의 STAT1 저해제일 수 있다.
다른 실시 형태에서, AD의 치료, 예방, 또는 발병의 지연을 위한 방법으로서, 유전체 편집 도구를 사용하여 신경 세포 내의 전체 CH25H 유전자, CH25H 유전자의 히스틴 클러스터 영역, 또는 CH25H 유전자의 프로모터 영역을 결실시킬 수 있다. 유전체 편집 도구는, 그것이 CH25H 유전자의 특이적 영역을 표적화하기 위해 사용될 수 있고 관심 세포에 전달될 수 있는 한, 임의의 유전체 편집 도구일 수 있다. 이러한 유전체 편집 도구의 일례는 문헌[Ran, F. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Nature (2015)]에 기재된 바와 같은 CRISPR-CAS9 시스템이다. 이러한 유전체 편집 도구의 다른 예는 문헌[Zetsche et al., Cpfl Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell (2015)]에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cpfl 시스템이다.
다른 실시 형태에서, 상기 방법에서의 25-OHC의 저해는 25-OHC 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여함에 의한다.
일부 경우에, CH25H 및 STAT1은 25-OHC에 대해 업스트림에 있고 CH25H 또는 STAT1의 저해는 CH25H가 25-OHC를 생성하는 것을 불가능하게 하므로, 25-OHC 저해제는 CH25H 저해제 또는 STAT1 저해제일 수 있다. 다른 경우에, 25-OHC 저해제는 25-OHC의 유사체일 수 있다. 또 다른 경우에, 25-OHC 저해제는 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제 저해제일 수 있다. HMG-CoA 리덕타제 저해제의 일례는 심바스타틴이다.
본 출원 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시 형태가 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단순히 편의성 및 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 경직된 제한으로서 해석되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위와 더불어 그 범위 이내의 개별적인 수치 값들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위와 더불어, 그 범위 이내의 개별적인 숫자들, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 무관하게 적용된다.
명확성을 위해 별도의 실시 형태와 관련하여 기재되는 본 발명의 소정의 특징은 또한 단일 실시 형태로 조합되어 제공될 수 있다는 것이 인정된다. 역으로, 간결성을 위해 단일 실시 형태와 관련하여 기재되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 또는 적합한 바와 같이 본 발명의 임의의 다른 기재된 실시 형태로 제공될 수 있다. 다양한 실시 형태와 관련하여 기재된 소정의 특징은, 실시 형태가 그러한 요소 없이는 작동이 불가능하지 않는 한, 그러한 실시 형태의 본질적인 특징으로서 간주되어서는 안된다.
본 발명은 변동될 수 있는 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시 형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 의도가 아니다.
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도 1a 및 1b는 알츠하이머병을 가진 환자에서 상승된 수준의 인산화된 STAT1이 검출됨을 나타내는 영상이다. 도 1a는 3명의 AD 환자(증례-1, 증례-2, 및 증례-3) 및 건강한 사람(대조군)으로부터의 뇌 조직에서 인산화된 STAT1(pSTAT1)의 염색을 나타내는 4개의 영상을 나타낸다. 도 1b는 pSTAT1 염색의 형태학을 예시하기 위해 확대된 영상을 나타내며, 이 형태학은 핵 내의 pSTAT1의 축적을 시사한다. 직사각형 프레임 내의 염색을 참조한다.
도 2a-2e는 뇌에서 STAT1 유전자 결핍이 아밀로이드-베타 침착을 약화시킴을 나타내는 영상 및 그래프이다. 도 2a는 AD의 마우스 모델(APP/PS1 마우스) 및 STAT1 결핍을 가진 AD 마우스(APP/PS/STAT1-/-)에서 아밀로이드-베타(Αβ)의 염색의 영상을 나타낸다. 뇌 절편은 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻었다. 영상은 전뇌 절편과 더불어 더 높은 배율로 해마 영역에서 Αβ의 염색을 나타낸다. 도 2b는 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻어진 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 갯수를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 2c는 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스에서 각각 얻어진 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 영역을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 2d는 월령 3 월의 야생형, APP/PS1, 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻어진 뇌 조직의 TBS 추출물 중의 Αβ42의 Elisa 측정을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 2e는 월령 3 월의 야생형, APP/PS1, 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻어진 뇌 조직의 포름산 추출물 중의 Αβ42의 Elisa 측정을 도시하는 그래프를 나타낸다. *는 0.05 미만의 P 값을 의미한다.
도 3a 및 3b는 STAT1 다운스트림 표적으로서의 CH25H의 확인을 도시하는 그래프를 나타낸다. 구체적으로, 도 3a는 배수 변화가 1.5 초과이고 p 값이 0.05 미만인 차별적으로 발현된 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석을 도시하는 히트맵(heatmap)을 나타내며, 각각의 유전자형에 2개의 생물학적 반복을 사용하였다. 도 3b는 데이비드 기능 해석 클러스터링(David functional annotation clustering)에 의한 차별적으로 발현된 유전자의 경로 분석을 도시하는 파이 맵(pie map)을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 각각 STAT1 결핍 마우스에서 CH25H가 감소됨을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. 구체적으로, 도 4a는 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌에서 CH25H mRNA 수준의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 도 4b는 3 쌍의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌 균질물 중의 CH25H, STAT1, 및 α-투불린의 웨스턴 블롯의 결과를 도시하는 영상을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 STAT1이 CH25H 프로모터에 물리적으로 결합함을 도시하는 그래프를 나타낸다. 구체적으로, 도 5a는 CH25H 유전자 및 그의 프로모터의 개략적 표현을 나타낸다. 도 5b는 크로마틴 히스톤 면역침강법(ChIP) 실험의 결과를 도시하는 그래프를 나타내며, 여기에서 CH25H 프로모터를 함유하는 DNA 단편은 STAT1 항체 풀 다운(pull down)에 의해 강화되었고 이러한 강화는 야생형(WT) 마우스의 것에 비교하여 STAT1 KO(STAT1-/-) 마우스로부터의 샘플에서 약화되었다.
도 6a 및 6b는 뇌에서 STAT1 결핍은 감소된 25-OHC를 유발함을 도시하는 그래프를 나타낸다. 구체적으로, 도 6a는 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스에서 총 뇌 콜레스테롤 수준의 측정 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 각각의 군에 대해 n=3이다. 도 6b는 도 6a에서 콜레스테롤 측정에 사용된 동일한 마우스에서 25-OHC 수준의 측정 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 7은 STAT1-/-마우스의 엑소좀 분획에서 전장 APP 단백질이 감소됨을 도시하는 영상을 나타낸다. APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터의 뇌 조직을 균질화하고, 후-핵 분획(post-nuclear fraction)에 5%-45% 수크로스 구배 원심분리를 적용하였다. 10개의 분획을 수집하고 Triton-100으로 가용화하였다. 분획들을 웨스턴 블롯에 사용하였으며, APP 및 엑소좀 마커 플로틸린1에 대해 블로팅하였다.
도 8a-8c는 25-OHC를 이용하는 치료는 엑소좀 APP를 감소시켰지만 세포내 APP를 증가시킴을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. APP 과발현을 가진 SH-SY5Y 세포를 상이한 투여량의 25-OHC로 처리하였다. 도 8a는 엑소좀 정제를 위한 배지를 수집하고 정제된 엑소좀을 용해시킴으로써 제조한 샘플로부터의 APP를 이용하는 웨스턴 블롯의 결과를 도시하는 영상을 나타낸다. 도 8b는 세포내 APP 수준을 평가하기 위해 세포 용해물을 수집함으로써 제조한 샘플로부터의 APP를 이용하는 웨스턴 블롯의 결과를 도시하는 영상을 나타낸다. 도 8c는 대조군 및 25-OHC 처리 세포에서 표면 APP의 FACS 분석의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 9는 25-OHC로 처리한 후에 엑소좀에서 증가된 Αβ42를 도시하는 그래프를 나타낸다. 상이한 농도의 25-OHC로 처리한 세포 배양 배지로부터 수집된 엑소좀 내의 Αβ42의 ELISA 측정. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. *p<0.05.
도 1Oa-1Oc는 25-OHC로 처리한 후에 세포 내부의 APP의 증가된 체류 시간을 도시하는 영상을 나타낸다. 도 10a는 FITC-접합 항체 표지 표면 APP에 의해 추적된 APP 분자의 수송을 도시하는 영상을 나타낸다. 상이한 시점에 세포를 고정하여 특이적 시간에 APP의 분포를 점검하였다. 도 10b는 대조군 세포에서 시간에 따른 APP 전위를 나타내는 저속 촬영 비디오의 스냅사진의 영상을 나타낸다. 도 10c는 25-OHC 처리 세포에서 APP 전위를 나타내는 저속 촬영 비디오의 스냅사진의 영상을 나타낸다.
도 11a, 11b, 및 11c는 APP/PS1 마우스에서 25-OHC의 주사가 Αβ 침착을 촉진했음을 도시하는 영상 및 그래프를 나타낸다. 도 11a는 아밀로이드-베타에 대해 언급된 뇌 조직 절편의 영상을 나타낸다. 월령 2 월의 마우스에 25-OHC 또는 대조군으로서의 식염수를 1 개월의 지속기간 동안 격일로 주사하였다. 이들 마우스로부터의 뇌를 절편화하고 아밀로이드-베타에 대해 염색하였다. 데이터는 3 쌍의 식염수 또는 25-OHC 주사 마우스를 대표한다. 도 11b 및 11c는 각각 식염수 대조군 및 25-OHC 마우스로부터 얻어진 전뇌(도 11b) 및 해마(도 11c)의 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 갯수를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 12a-12e는 CH25H KO 마우스의 생성을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. 도 12a는 CH25H 유전자 및 2개의 표적화 sgRNA의 개략도이다. 도 12b는 2개의 표적화 sgRNA의 DNA 서열을 나타낸다. 도 12c는 CH25H 녹 아웃 마우스에서 CH25H 유전자의 결실을 나타내는 서열분석 결과를 도시한다. 도 12d는 각각 WT(534 bp) 및 KO(488 bp) 밴드의 유전자형 검사 결과를 도시하는 영상을 나타낸다. 도 12e는 각각 WT 및 CH25H KO 마우스에서 CH25H RNA 수준의 실시간 PCR 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 CH25H KO 마우스에서 Αβ 병변 침착이 감소됨을 도시하는 영상 및 그래프를 나타낸다. 도 13a는 AD의 마우스 모델(APP/PS1 마우스) 및 CH25H 결핍을 가진 AD 마우스(APP/PS/CH25H-/-)에서 아밀로이드-베타의 염색을 나타내는 영상이다. 각각 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/CH25H-/- 마우스로부터 뇌 절편을 얻었다. 영상은 전뇌 절편과 더불어 더 높은 배율로 해마 영역에서 아밀로이드-베타의 염색을 나타낸다. 도 13b 및 13c는 각각 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/CH25H-/- 마우스로부터 얻어진 전뇌(도 13b) 및 해마(도 13c)의 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 갯수를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 14는 APP/PS1 마우스에서 CH25H 유전자 결핍이 학습 및 기억을 개선함을 도시하는 그래프를 나타낸다. APP/PS1(n=11) 및 APP/PS/CH25H-/-(n=8) 마우스를 수중 미로에 대해 훈련시켰다. 5 일의 훈련 중에 숨겨진 플랫폼의 위치를 찾는 데에 소요된 평균 시간을 기록한다. x-축은 일수이고 y-축는 마우스가 수중 미로에서 플랫폼을 찾는 데에 소요된 시간이다.
도 15는 상이한 투여량의 프레드니솔론 트리메틸아세테이트 또는 심바스타틴과 함께 25-OHC로 처리한 세포에서 APP의 웨스턴 블롯 결과의 영상을 나타낸다. 심바스타틴은 강력한 25-OHC 저해제로서 작용한다. SH-SY5Y 세포를 상이한 투여량의 프레드니솔론 트리메틸아세테이트 또는 심바스타틴과 함께 25-OHC로 처리하였다. 24 h 후에 세포를 용해시키고 APP에 대해 블로팅하였다.
도 16a, 16b, 16c, 및 16d는 Αβ 침착의 차이가 APP 발현 수준 또는 APP를 절단하는 세크레타제의 차이에 기인하지 않음을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 16a는 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌에서 APP mRNA 수준의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 16b, 16c, 및 16d는 Adam 10(도 16b), BACEl(도 16c), 및 니카스트린(도 16d), 즉, 각각 APP의 α, β, 및 γ 세크레타제의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 3개의 그래프를 나타낸다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 17a 및 17b는 미세아교 세포의 식세포 능력이 WT와 STAT1 결핍 마우스 사이에서 유사함을 도시하는 영상 및 그래프를 나타낸다. 도 17a는 형광 비드와 함께 인큐베이션한 WT 또는 STAT1 결핍 마우스로부터의 미세아교 세포의 영상을 나타낸다. 인큐베이션으로부터 5 min 후에 세포를 고정하고 내재화된 비드에 대해 영상화하였다. WT 및 KO 배지는 각각 WT 또는 KO 미세아교 세포로부터의 배지이다. 도 17b는 내재화된 비드의 정량화 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 17c는 WT 및 STAT1 결핍 마우스에서 SV2A의 실시간 PCR 측정을 도시하는 차트이다. 도 17d는 WT 및 STAT1 결핍 마우스에서 CCR2의 실시간 PCR 측정을 도시하는 차트이다.
도 18a, 18b, 18c, 및 18d는 각각 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌 조직에서 CH25H(도 18a) 및 다른 알려진 콜레스테롤 하이드록실라제 Cyp46a1(도 18b), Cyp7b1(도 18c), 및 Cyp7a1(도 18d)의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 4개의 그래프를 나타낸다. 결과는 다른 콜레스테롤 하이드록실라제 Cyp46a1, Cyp7b1, 및 Cyp7a1이 STAT1 결핍에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다.
도 19a-19f는 STAT1 결핍이 일반적 지질 대사작용에 영향을 주지 않았음을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. 도 19a는 각각 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스(각각의 군에 대해 n=5)의 체중을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 19b는 각각 APP/PS1 및 APP/PSI/STAT1-/- 마우스의 간 절편의 오일-레드-O(Oil-red-0) 염색의 영상을 나타낸다. 영상은 3 쌍의 마우스를 대표한다. 도 19c, 19d, 19e, 및 19f는 각각 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스에서 LPL, ABCA1, APOE, HMGCR의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 4개의 그래프를 나타낸다.
도 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f, 및 20g는 KCl 처리 후의 즉시 초기 유전자(immediate early gene)의 유도를 측정하기 위해 50 mM의 KCl로 30 min 동안 처리한 후에 WT 또는 STAT1 KO 마우스로부터 얻은 1차 신경 배양물에서 c-fos(도 20a), zif268(도 20b), BDNF-IV(도 20c), BDNF-IX(도 20d), Gadd45b(도 20e), Npas4(도 20f), 및 CH25H(도 20g)의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 결과는 STAT1 결핍이 기저 신경 활성을 변화시키지 않았음을 나타낸다.
도 1a 및 1b는 알츠하이머병을 가진 환자에서 상승된 수준의 인산화된 STAT1이 검출됨을 나타내는 영상이다. 도 1a는 3명의 AD 환자(증례-1, 증례-2, 및 증례-3) 및 건강한 사람(대조군)으로부터의 뇌 조직에서 인산화된 STAT1(pSTAT1)의 염색을 나타내는 4개의 영상을 나타낸다. 도 1b는 pSTAT1 염색의 형태학을 예시하기 위해 확대된 영상을 나타내며, 이 형태학은 핵 내의 pSTAT1의 축적을 시사한다. 직사각형 프레임 내의 염색을 참조한다.
도 2a-2e는 뇌에서 STAT1 유전자 결핍이 아밀로이드-베타 침착을 약화시킴을 나타내는 영상 및 그래프이다. 도 2a는 AD의 마우스 모델(APP/PS1 마우스) 및 STAT1 결핍을 가진 AD 마우스(APP/PS/STAT1-/-)에서 아밀로이드-베타(Αβ)의 염색의 영상을 나타낸다. 뇌 절편은 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻었다. 영상은 전뇌 절편과 더불어 더 높은 배율로 해마 영역에서 Αβ의 염색을 나타낸다. 도 2b는 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻어진 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 갯수를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 2c는 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스에서 각각 얻어진 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 영역을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 2d는 월령 3 월의 야생형, APP/PS1, 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻어진 뇌 조직의 TBS 추출물 중의 Αβ42의 Elisa 측정을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 2e는 월령 3 월의 야생형, APP/PS1, 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터 각각 얻어진 뇌 조직의 포름산 추출물 중의 Αβ42의 Elisa 측정을 도시하는 그래프를 나타낸다. *는 0.05 미만의 P 값을 의미한다.
도 3a 및 3b는 STAT1 다운스트림 표적으로서의 CH25H의 확인을 도시하는 그래프를 나타낸다. 구체적으로, 도 3a는 배수 변화가 1.5 초과이고 p 값이 0.05 미만인 차별적으로 발현된 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석을 도시하는 히트맵(heatmap)을 나타내며, 각각의 유전자형에 2개의 생물학적 반복을 사용하였다. 도 3b는 데이비드 기능 해석 클러스터링(David functional annotation clustering)에 의한 차별적으로 발현된 유전자의 경로 분석을 도시하는 파이 맵(pie map)을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 각각 STAT1 결핍 마우스에서 CH25H가 감소됨을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. 구체적으로, 도 4a는 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌에서 CH25H mRNA 수준의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 도 4b는 3 쌍의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌 균질물 중의 CH25H, STAT1, 및 α-투불린의 웨스턴 블롯의 결과를 도시하는 영상을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 STAT1이 CH25H 프로모터에 물리적으로 결합함을 도시하는 그래프를 나타낸다. 구체적으로, 도 5a는 CH25H 유전자 및 그의 프로모터의 개략적 표현을 나타낸다. 도 5b는 크로마틴 히스톤 면역침강법(ChIP) 실험의 결과를 도시하는 그래프를 나타내며, 여기에서 CH25H 프로모터를 함유하는 DNA 단편은 STAT1 항체 풀 다운(pull down)에 의해 강화되었고 이러한 강화는 야생형(WT) 마우스의 것에 비교하여 STAT1 KO(STAT1-/-) 마우스로부터의 샘플에서 약화되었다.
도 6a 및 6b는 뇌에서 STAT1 결핍은 감소된 25-OHC를 유발함을 도시하는 그래프를 나타낸다. 구체적으로, 도 6a는 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스에서 총 뇌 콜레스테롤 수준의 측정 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 각각의 군에 대해 n=3이다. 도 6b는 도 6a에서 콜레스테롤 측정에 사용된 동일한 마우스에서 25-OHC 수준의 측정 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 7은 STAT1-/-마우스의 엑소좀 분획에서 전장 APP 단백질이 감소됨을 도시하는 영상을 나타낸다. APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터의 뇌 조직을 균질화하고, 후-핵 분획(post-nuclear fraction)에 5%-45% 수크로스 구배 원심분리를 적용하였다. 10개의 분획을 수집하고 Triton-100으로 가용화하였다. 분획들을 웨스턴 블롯에 사용하였으며, APP 및 엑소좀 마커 플로틸린1에 대해 블로팅하였다.
도 8a-8c는 25-OHC를 이용하는 치료는 엑소좀 APP를 감소시켰지만 세포내 APP를 증가시킴을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. APP 과발현을 가진 SH-SY5Y 세포를 상이한 투여량의 25-OHC로 처리하였다. 도 8a는 엑소좀 정제를 위한 배지를 수집하고 정제된 엑소좀을 용해시킴으로써 제조한 샘플로부터의 APP를 이용하는 웨스턴 블롯의 결과를 도시하는 영상을 나타낸다. 도 8b는 세포내 APP 수준을 평가하기 위해 세포 용해물을 수집함으로써 제조한 샘플로부터의 APP를 이용하는 웨스턴 블롯의 결과를 도시하는 영상을 나타낸다. 도 8c는 대조군 및 25-OHC 처리 세포에서 표면 APP의 FACS 분석의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 9는 25-OHC로 처리한 후에 엑소좀에서 증가된 Αβ42를 도시하는 그래프를 나타낸다. 상이한 농도의 25-OHC로 처리한 세포 배양 배지로부터 수집된 엑소좀 내의 Αβ42의 ELISA 측정. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. *p<0.05.
도 1Oa-1Oc는 25-OHC로 처리한 후에 세포 내부의 APP의 증가된 체류 시간을 도시하는 영상을 나타낸다. 도 10a는 FITC-접합 항체 표지 표면 APP에 의해 추적된 APP 분자의 수송을 도시하는 영상을 나타낸다. 상이한 시점에 세포를 고정하여 특이적 시간에 APP의 분포를 점검하였다. 도 10b는 대조군 세포에서 시간에 따른 APP 전위를 나타내는 저속 촬영 비디오의 스냅사진의 영상을 나타낸다. 도 10c는 25-OHC 처리 세포에서 APP 전위를 나타내는 저속 촬영 비디오의 스냅사진의 영상을 나타낸다.
도 11a, 11b, 및 11c는 APP/PS1 마우스에서 25-OHC의 주사가 Αβ 침착을 촉진했음을 도시하는 영상 및 그래프를 나타낸다. 도 11a는 아밀로이드-베타에 대해 언급된 뇌 조직 절편의 영상을 나타낸다. 월령 2 월의 마우스에 25-OHC 또는 대조군으로서의 식염수를 1 개월의 지속기간 동안 격일로 주사하였다. 이들 마우스로부터의 뇌를 절편화하고 아밀로이드-베타에 대해 염색하였다. 데이터는 3 쌍의 식염수 또는 25-OHC 주사 마우스를 대표한다. 도 11b 및 11c는 각각 식염수 대조군 및 25-OHC 마우스로부터 얻어진 전뇌(도 11b) 및 해마(도 11c)의 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 갯수를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 12a-12e는 CH25H KO 마우스의 생성을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. 도 12a는 CH25H 유전자 및 2개의 표적화 sgRNA의 개략도이다. 도 12b는 2개의 표적화 sgRNA의 DNA 서열을 나타낸다. 도 12c는 CH25H 녹 아웃 마우스에서 CH25H 유전자의 결실을 나타내는 서열분석 결과를 도시한다. 도 12d는 각각 WT(534 bp) 및 KO(488 bp) 밴드의 유전자형 검사 결과를 도시하는 영상을 나타낸다. 도 12e는 각각 WT 및 CH25H KO 마우스에서 CH25H RNA 수준의 실시간 PCR 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 CH25H KO 마우스에서 Αβ 병변 침착이 감소됨을 도시하는 영상 및 그래프를 나타낸다. 도 13a는 AD의 마우스 모델(APP/PS1 마우스) 및 CH25H 결핍을 가진 AD 마우스(APP/PS/CH25H-/-)에서 아밀로이드-베타의 염색을 나타내는 영상이다. 각각 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/CH25H-/- 마우스로부터 뇌 절편을 얻었다. 영상은 전뇌 절편과 더불어 더 높은 배율로 해마 영역에서 아밀로이드-베타의 염색을 나타낸다. 도 13b 및 13c는 각각 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/CH25H-/- 마우스로부터 얻어진 전뇌(도 13b) 및 해마(도 13c)의 5개의 연속적인 절편에서 Αβ 병변 갯수를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 14는 APP/PS1 마우스에서 CH25H 유전자 결핍이 학습 및 기억을 개선함을 도시하는 그래프를 나타낸다. APP/PS1(n=11) 및 APP/PS/CH25H-/-(n=8) 마우스를 수중 미로에 대해 훈련시켰다. 5 일의 훈련 중에 숨겨진 플랫폼의 위치를 찾는 데에 소요된 평균 시간을 기록한다. x-축은 일수이고 y-축는 마우스가 수중 미로에서 플랫폼을 찾는 데에 소요된 시간이다.
도 15는 상이한 투여량의 프레드니솔론 트리메틸아세테이트 또는 심바스타틴과 함께 25-OHC로 처리한 세포에서 APP의 웨스턴 블롯 결과의 영상을 나타낸다. 심바스타틴은 강력한 25-OHC 저해제로서 작용한다. SH-SY5Y 세포를 상이한 투여량의 프레드니솔론 트리메틸아세테이트 또는 심바스타틴과 함께 25-OHC로 처리하였다. 24 h 후에 세포를 용해시키고 APP에 대해 블로팅하였다.
도 16a, 16b, 16c, 및 16d는 Αβ 침착의 차이가 APP 발현 수준 또는 APP를 절단하는 세크레타제의 차이에 기인하지 않음을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 16a는 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌에서 APP mRNA 수준의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 16b, 16c, 및 16d는 Adam 10(도 16b), BACEl(도 16c), 및 니카스트린(도 16d), 즉, 각각 APP의 α, β, 및 γ 세크레타제의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 3개의 그래프를 나타낸다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 17a 및 17b는 미세아교 세포의 식세포 능력이 WT와 STAT1 결핍 마우스 사이에서 유사함을 도시하는 영상 및 그래프를 나타낸다. 도 17a는 형광 비드와 함께 인큐베이션한 WT 또는 STAT1 결핍 마우스로부터의 미세아교 세포의 영상을 나타낸다. 인큐베이션으로부터 5 min 후에 세포를 고정하고 내재화된 비드에 대해 영상화하였다. WT 및 KO 배지는 각각 WT 또는 KO 미세아교 세포로부터의 배지이다. 도 17b는 내재화된 비드의 정량화 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 17c는 WT 및 STAT1 결핍 마우스에서 SV2A의 실시간 PCR 측정을 도시하는 차트이다. 도 17d는 WT 및 STAT1 결핍 마우스에서 CCR2의 실시간 PCR 측정을 도시하는 차트이다.
도 18a, 18b, 18c, 및 18d는 각각 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스의 뇌 조직에서 CH25H(도 18a) 및 다른 알려진 콜레스테롤 하이드록실라제 Cyp46a1(도 18b), Cyp7b1(도 18c), 및 Cyp7a1(도 18d)의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 4개의 그래프를 나타낸다. 결과는 다른 콜레스테롤 하이드록실라제 Cyp46a1, Cyp7b1, 및 Cyp7a1이 STAT1 결핍에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다.
도 19a-19f는 STAT1 결핍이 일반적 지질 대사작용에 영향을 주지 않았음을 도시하는 그래프 및 영상을 나타낸다. 도 19a는 각각 월령 3 월의 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스(각각의 군에 대해 n=5)의 체중을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 19b는 각각 APP/PS1 및 APP/PSI/STAT1-/- 마우스의 간 절편의 오일-레드-O(Oil-red-0) 염색의 영상을 나타낸다. 영상은 3 쌍의 마우스를 대표한다. 도 19c, 19d, 19e, 및 19f는 각각 APP/PS1 및 APP/PS1/STAT1-/- 마우스에서 LPL, ABCA1, APOE, HMGCR의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 4개의 그래프를 나타낸다.
도 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f, 및 20g는 KCl 처리 후의 즉시 초기 유전자(immediate early gene)의 유도를 측정하기 위해 50 mM의 KCl로 30 min 동안 처리한 후에 WT 또는 STAT1 KO 마우스로부터 얻은 1차 신경 배양물에서 c-fos(도 20a), zif268(도 20b), BDNF-IV(도 20c), BDNF-IX(도 20d), Gadd45b(도 20e), Npas4(도 20f), 및 CH25H(도 20g)의 실시간 PCR 정량화의 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다. 결과는 STAT1 결핍이 기저 신경 활성을 변화시키지 않았음을 나타낸다.
개시된 주제의 실시예가 하기 기술되어 있다. 개시된 주제의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명, 도면, 실시예, 및 청구범위로부터 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 것들과 실질적으로 유사하거나 등가인 방법 및 재료를 현재 개시된 주제의 실시 또는 시험에 사용할 수 있다. 예시적인 방법 및 재료를 이제 하기와 같이 기재한다.
실시예
방법
마우스
APP/PS1 5XFAD 마우스는 Jackson lab으로부터 구매하였고 STAT1 결핍 마우스는 Daved Levy에 의해 제공되었다. CH25H KO 마우스는 crisper/cas9 방법에 의해 생성되었다. Cas9 단백질을 발현시키기 위해 사용된 pST1374-Cas9-N-NLS-flag-linker 플라스미드(Addgene ID44758)는 이전에 기재되었다(문헌[Zhou et al., 2014]). Ch25h 유전자 서열은 UCSC 유전체 브라우저 웹사이트(http://genome.ucsc.edu/)로부터 다운로드하였다. 2개의 sgRNA 올리고를 합성하고 pUC57-sgRNA 작제물에 어닐링하였다. 시험관내 전사는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Zhou et al., 2014]). Cas9 mRNA 및 sgRNA를 C57BL6/J의 배경에 주입하였다. APP/PS1 마우스를 CH25H-/- 마우스와 교배하여 APP/PS1 유전자 및 CH25H에 대한 WT 또는 KO 대립유전자를 지닌 후손을 생성하였다. APP/PS1 마우스를 STAT1-/- 마우스와 교배하여 APP/PS1 유전자 및 STAT1에 대한 WT 또는 KO 대립유전자를 지닌 후손을 생성하였다. 모든 마우스는 C57BL/6 유전자 배경 상에 있었으며 싱가폴 국립 대학교에서 특정 병원체 부재 조건(specific-pathogen-free condition) 하에 사육하였다. 모든 실험은 월령 3-4 월의 마우스로 수행하였으며, NUS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.
조직 용해물 제조 및 수크로스 구배
마우스 뇌를 칭량하고 9배 부피의 TBS 중에 균질화하였다. 생성되는 균질물을 lOOO g에서 15 min 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 후 핵 분획으로서 상청액을 취하였다. 5%-45% 수크로스 구배에 후 핵 분획을 신중하게 놓고 147,000 g에서 16 시간 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상단으로부터 하단까지 각각의 분획으로서 1 ml를 취하였다. 막 관련 단백질을 용해시키기 위해 각각의 분획에 0.1%의 최종 농도에 도달하도록 Triton을 첨가하였다. 생성되는 샘플을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
엑소좀 제조
인간 APP를 과발현하는 SH-SY5Y 세포를 10% FBS를 가진 DMEM 중에 배양하였다. 엑소좀 제조 하루 전에, 혈청 엑소좀의 오염을 방지하기 위해 배지를 블랭크 DMEM으로 교환하였다. 배지 교환으로부터 24 시간 후에, 배지를 수집하고 200 g에서 5 min 동안 회전시켜 부유 세포를 펠렛으로 침강시켰다. 무세포 배지를 100,000 g에서 l h 동안 4 ℃에서 추가로 원심분리하고, 엑소좀을 함유하는 펠렛을 RIPA 완충제에 용해시켰다.
마이크로어레이 분석
마이크로어레이 분석은 Molecular Genomics에 의해 제공되는 Affymetrix 마이크로어레이 시스템(Affymetrix)을 사용하여 수행하였다. 데이터 분석은 GeneSpring 소프트웨어로 수행하였다. 중간 분류 엄격성(medium classification stringency)의 내정값 설정을 사용하는 데이비드 기능 해석 클러스터링 웹사이트(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)에서, 차별적으로 발현되는 유전자를 입력으로 사용하였다. 클러스터링의 결과를 파이 그래프에 다시 플로팅하였다.
조직학적 분석
조직을 4% 파라포름알데히드 중에 고정하고, 탈수시키고, 투과시키고, 파라핀 포매하였다. 절편(5 ㎛)을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 일반적 형태학을 평가하였다. 면역형광(IF) 또는 면역조직화학(HC)의 경우, 절편을 재수화시키고 Αβ에 대한 1차 항체(Cell signaling)로 염색한 후에, 형광-접합 2차 항체(Invitrogen)와 함께 인큐베이션하였다. 오일 레드 O 염색의 경우, 간을 Tissue Tek(Electron Microscopy Sciences)에 포매하고 -80 ℃에서 냉동시켰다. 10 ㎛ 두께의 절편을 절단하고 dH20로 수화시킨 후, 오일 레드 O 작업 용액(60% 이소프로판올 중의 0.3% 오일 레드 O(Sigma)) 중에 l h 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 슬라이드로부터 떨어지는 이소프로판올이 투명할 때까지 슬라이드를 60% 이소프로판올에 3회 신속하게 세척하였다. 이어서, 슬라이드를 H20로 세척하고 헤마톡실린으로 대조 염색하였다.
실시간 PCR
제조업체의 설명서에 따라 Trizol 시약(Invitrogen)으로 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 상보적 DNA(cDNA)는 Superscript 역전사효소(Invitrogen)로 합성하였다. SYBR qPCR 키트(KAPA)를 이용하는 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에 의해 유전자 발현을 측정하였다. Actib, Gapdh, 또는 Rn18S를 내부 대조군으로 사용하였다. 프라이머 서열은 요청시에 이용가능하다.
ELISA
제조업체의 설명서에 따라 ELISA 키트(Millipore)로 Αβ42의 정량화를 실행하였다.
크로마틴 면역침강 검정
APP/PS1 또는 APP/PS1/STAT1-/- 마우스로부터의 뇌 반구의 절반을 9배 부피의 TBS 중에 균질화하여 뇌 균질물을 얻었다. 포름알데히드를 1%의 최종 농도로 10 min 동안 첨가한 후에 글리신으로 켄칭(quenching)함으로써 가교결합을 수행하였다. 균질물을 저장성 완충제로 처리한 후에 핵 용해 완충제로 처리하여 크로마틴을 방출시켰다. 초음파처리에 의해 크로마틴을 단편화하고, 단백질 G 비드로 예비정제(preclear)하고, 이어서 항-STAT1 항체(Santa Cruz) 또는 정상 토끼 IgG(Santa Cruz)로 4 ℃에서 밤새 침전시켰다. 세척 및 용출 후에, 65 ℃에서 8 hr 동안 인큐베이션함으로써 가교결합 역전을 실행하였다. 이전에 기재된 바와 같이 용출된 DNA를 정제하고 CH25H 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR에 의해 분석하였다.
통계
GraphPad Prism 6.01을 사용하는 스튜던트 t 검정에 의해 통계적 유의성을 결정하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의적인 것으로 간주하였다. 임상 점수의 p 값은 다중 비교를 위한 일방 다영역 분산 분석(ANOVA: one-way multiple-range analysis of variance)에 의해 결정하였다. 달리 명시되지 않는 한, 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차(평균 ± SEM)로서 제공되었다.
실시예 1 Stat1 녹아웃 마우스는 Αβ 침착이 감소되었다
본 발명자들은 STAT1의 발현이 연령 일치 대조군(aged matched control) 증례보다 AD 증례에서 더 높았음을 입증하였다(도 1a 및 1b). 도 1a에서, 인산화된 STAT1(pSTAT1)의 염색이 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다. 반면에, 동일한 도 1a 및 도 1b의 증례-1의 사진의 확대된 스냅사진에 나타낸 바와 같이, 3개의 증례 각각에서는 pSTAT1의 훨씬 더 많은 염색이 관찰되었다.
STAT1 경로의 활성화가 AD의 병인에 대해 인과관계가 있는지, 또는 AD의 후기에 신경-염증의 결과였는지를 이해하기 위해, 본 발명자들은 STAT1-/- 마우스를 APP/PS1 마우스와 교배하여 STAT1-/- 배경을 가진 AD 마우스를 생성하였다. APP/PS1/STAT1-/- 마우스, 및 APP/PS1 유전자형의 그들의 동배 대조군을 3-4 개월까지 유지하고 Αβ 침착의 조직학적 시험을 위해 희생시켰다. 의외로, 본 발명자들은 Stat1-/- 마우스에서 Αβ 갯수와 더불어 Αβ가 점유하는 면적의 일관된 감소를 발견하였다(도 2a 및 2b). 본 발명자들이 TBS 또는 포름산 추출 중의 Αβ42를 측정할 때 유사한 결과가 관찰되었다(도 2c 및 2d). 추가로, Αβ의 감소는 APP 발현 수준, 또는 APP를 절단하는 세크레타제의 변화에 기인하지 않았다(도 16a 및 16b).
실시예 2 Stat1-KO 마우스에서의 감소된 Αβ 침착은 그의 다운스트림 표적 CH25H의 감소에 기인했다
본 발명자들의 마이크로어레이 데이터는 AD 병태에서의 STAT1-조절 유전자로서 CH25H를 확인했다(도 3a 및 3b). 추가로, 본 발명자들은 CH25H에 대한 STAT1의 조절 효과를 실시간 PCR, 웨스턴 블롯, 및 ChIP 검정에 의해 확인하였다(도 4a, 4b, 5a, 5b). 실시간 PCR 결과를 도시하는 도 4a에 나타낸 바와 같이, CH25H mRNA 발현은 STAT1 결핍 마우스에서 유의적으로 감소되었다. 웨스턴 블롯 결과를 도시하는 도 4b에 나타낸 바와 같이, CH25H 단백질 수준 또한 STAT1 결핍 마우스에서 유의적으로 감소되었다. 도 5a 및 5b에서 ChIP 검정으로부터의 결과 또한 STAT1 결핍 마우스에서 더 적은 STAT1이 CH25H 유전자 프로모터 서열에 결합하고 있었음을 나타냈다. STAT1 결핍 마우스에서 25-OHC의 감소된 수준은 STAT1-CH25H 축이 뇌 25-OHC 수준을 제어한다는 개념을 추가로 지지했다(도 6a-6b).
실시예 3 엑소좀에서 STAT1-CH25H 조절 25-OHC는 APP 분비에 영향을 준다
APP 단백질의 세포 국소화를 시험하기 위해 마우스 뇌 균질물을 수크로스 구배에 의해 분획화하였다. 약술하면, 엑소좀 마커인 플로틸린1에 대해 강화된 최고 밀도를 가진 분획을 제외하고는, APP의 분포 패턴은 5XFAD와 5XFAD/STAT1-/- 마우스 사이에서 유사하였다. 이 분획에서는 STAT1-/- 마우스가 유의적으로 더 많은 양의 APP를 가졌다(도 7).
엑소좀 APP의 차이가 25-OHC에 기인하는지를 추가로 점검하기 위해, 본 발명자들은 APP 과발현 SH-SY5Y 세포주를 사용하였다. 상이한 투여량의 25-OHC로 세포를 처리하고, 배지로부터 세포 용해물 및 엑소좀 양자 모두를 수집하였다. 25-OHC는 세포 APP를 증가시키는 반면에 엑소좀 APP를 감소시키는 용량 의존적 효과를 나타냈다(도 8a 및 8b). 도 8a에 나타낸 바와 같이, 25-OHC의 투여량이 증가함에 따라, 더 적은 APP가 엑소좀 분획에서 발견되었다. 반면에, 25-OHC의 투여량이 증가함에 따라, 더 많은 APP가 세포 용해물 분획에서 발견되었다.
표면 APP의 FACS 분석 또한 25-OHC가 세포 표면 상의 APP의 양을 증가시켰음을 규명하였다(도 8c). 25-OHC 처리 후에 APP를 과발현하는 세포의 세포 표면 상에서 더 많은 양의 APP가 검출되었다.
추가로, 본 발명자들은 25-OHC로 처리한 후에 엑소좀에서 Αβ42가 증가했음을 발견하였다. 상이한 농도의 25-OHC로 처리한 세포 배양 배지를 수집하고 배지로부터 수집된 엑소좀 중의 Αβ42를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 증가된 25-OHC 농도로 처리한 세포로부터의 배지에서 증가된 Αβ42가 검출되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
실시예 4 25-OHC는 세포 내의 APP의 체류 시간을 증가시켰다
25-OHC 처리 후의 세포 APP의 증가에는 다중의 기전이 기여할 수 있다. 그러나, 본 발명자들의 마우스 데이터는 APP의 합성 및 분해 양자 모두가 정상이었음을 시사하였다: APP의 발현이 유사했고, APP 절단을 위한 효소 또한 유사했다(도 16a 및 16b). 도 16a에 나타낸 바와 같이, APP의 발현 수준은 STAT1 결핍에 무관하게 유사했다. 도 16b에 나타낸 바와 같이, AdamlO, BACE1, 및 니카스트린, 즉, 각각 APP의 α, β, 및 γ 세크레타제의 발현 수준 또한 STAT1 결핍에 무관하게 유사했다.
본 발명자들은 계속해서 APP 단백질의 수송을 점검하였다. 표면 APP를 항체로 표지하고, 세포를 인큐베이터에 다시 넣고, 염색을 위해 상이한 시점에 고정하였다. 처리하지 않은 세포에서는 APP가 신속하게 세포 내의 특이적 구획으로 갔고 6 시간 이내에 신호가 사라진 반면에, 25-OHC 처리 세포에서는 APP의 수송이 더 느렸다(도 10a). 저속촬영 영상은 처리하지 않은 세포에서는 APP가 특이적 구획으로 클러스터링되는 반면에 25-OHC 처리 세포에서는 APP가 시험의 시간 이내에 여전히 균일하게 분포되었음을 명확하게 나타냈다(도 10b).
실시예 5 CH25H KO는 AD 병인을 지연시키는 STAT1 KO의 표현형을 개괄하였다
본 발명자들은 AD 병인에서의 CH25H KO의 효과를 연구하였다. CH25H를 표적화하는 SgRNA를 설계하였으며, sgRNA1은 서열 번호 1이고 sg RNA2는 서열 번호 2이다. 도 12a 및 12b를 참조한다. CH25H 유전자의 엑손에서 46개의 염기쌍(bp)이 결실되어(도 12c 참조) CH25H 녹아웃(KO) 마우스를 생성하도록, 2개의 sg RNA를 이용하여, crisper/cas9 방법에 의해 CH25H 유전자를 녹 아웃시켰다.
CH25H KO 마우스에서, CH25H 유전자의 46 bp 단편의 결실이 검출되었으며, 488 bp 밴드는 결실된 CH25H 유전자이고 534 bp는 야생형 유전자이다. CH25H KO 마우스에서 CH25H mRNA의 발현이 유의적으로 감소되었다(도 12e).
일단 5XFAD 마우스에 교배되면, CH25H KO는 STAT1 KO와 유사한 표현형을 나타냈다. 면역염색 및 Elisa 정량화 양자 모두에서 Αβ가 크게 감소하였다(각각 도 13a, 13b, 및 13c). 역으로, 25-OHC를 주사한 마우스는 유의적으로 많은 양의 Αβ를 가졌다(도 11a, 11b, 및 11c).
감소된 Αβ의 인지력에 대한 효과를 시험하기 위해, 수중 미로에 의해 마우스를 시험하였다. 5XFAD 마우스는 물 밑의 플랫폼의 위치를 찾는 것을 서서히 학습한 반면에, CH25H KO 마우스는 플랫폼을 찾는 데에 유의적으로(p<0.05) 적은 시간이 소요되었으며, 이는 그들이 학습 및 기억 과제를 더 잘 수행했음을 나타낸다(도 14).
실시예 6 심바스타틴은 25-OHC-유도 APP 축적을 저해한다
본 발명자들은 잠재적 25-OHC 저해제에 대해 다수의 소분자를 스크리닝하였으며, 심바스타틴이 세포 APP의 25-OHC 유도 증가를 차단했음을 발견하였다. 그 효과는 10 nM에 불과한 심바스타틴에 의해 관찰될 수 있었으며, 이는 세포독성 효과를 야기할 수 있는 투여량보다 훨씬 더 낮았다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 25-OHC 처리는 증가된 APP 수준을 유발했다.
그러나, 심바스타틴 처리는 25-OHC 처리에 의해 유도된 증가된 APP 수준을 감소시킬 수 있었다. 반면에, 프레드니솔론 트리메틸아세테이트 처리는 25-OHC에 의해 유도된 증가된 APP 수준에 효과가 없었다. 따라서, 심바스타틴은 25-OHC에 대한 강력한 저해제였다.
실시예 7 WT와 STAT1 결핍 미세아교 세포 사이에서 식세포작용이 유사했다
WT 또는 STAT1-/- 미세아교 세포를 형광 비드와 함께 인큐베이션하여 그들의 식세포 능력을 시험하였다. 배지 중에 분비된 인자의 효과를 시험하기 위해, 양자 모두의 세포를 WT 세포로부터의 배지 또는 STAT1-/- 세포로부터의 배지 중에 유지하였다. 영상화 및 정량화는 시험한 모든 조건에서 식세포작용이 유사했음을 나타냈다(도 17a 및 17b). 본 발명자들은 또한 식세포작용 과정에 관여하는 주요 유전자인 SV2a 및 CCR2의 mRNA를 측정하였다. 그들의 발현 수준은 APP/PS1과 APP/PS1/STAT1-/- 사이에서 유사하였다(도 17c 및 도 17d).
실시예 8 CH25H는 STAT1 의존성 콜레스테롤 하이드록실라제였다
본 발명자들은 CH25H, Cyp46al, Cyp7b1, 및 Cyp7a1을 포함하는, 상이한 위치에서 콜레스테롤에 하이드록시 기를 첨가하는 몇몇 알려진 콜레스테롤 하이드록실라제를 시험하였다. 본 발명자들이 시험한 효소 중에서, CH25H의 발현만 유의적으로 감소했으므로 CH25H만 STAT1 의존성 발현 패턴을 나타냈다(도 18a, 18b, 18c, 및 18d).
실시예 9 STAT1 결핍은 일반적 대사 결함을 야기하지 않았다
CH25H는 원래 콜레스테롤 대사작용을 조절하는 것으로 알려졌다. 그러나, 본 발명자들이 체중, 간 내의 지질 침착, 및 지질 대사작용에 관여하는 주요 효소를 비교했을 때, WT와 STAT1-/- 마우스 사이에 유의적인 변화가 없었다(도 19a-19f). 도 19a에 나타낸 바와 같이, APP/PS1과 APP/PS1/STAT1-/- 마우스 사이에 체중의 유의적인 차이가 없었다. 도 19b에 나타낸 바와 같이, APP/PS1과 APP/PS1/STAT1-/- 마우스 사이에 간 세포 내의 지질 침착의 유의적인 차이가 없었다. 추가로, 도 19c-19f에 나타낸 바와 같이, APP/PS1과 APP/PS1/STAT1-/- 마우스 사이에 LPL, ABCA1, APOE, HMGCR을 포함하는 주요 효소의 발현의 유의적인 차이가 없었다.
실시예 10 STAT1 결핍은 즉시 초기 유전자의 유도에 의해 측정되는 신경 활성을 변경하지 않았다.
WT 또는 STAT1-/- 마우스로부터의 1차 해마 뉴런을 배양한 후에 50 mM KCl로 처리하였다. 신경 활성에 대한 마커로서 cfos, Zif268, BDNF-IV, BDNF-IX, Gadd45b, Npas4, 및 Ch25h를 포함하는 즉시 초기 유전자 중 일부의 유도를 RT-PCR에 의해 측정하였다. 도 20a-20g에 나타낸 바와 같이, WT 및 STAT1-/- 뉴런 양자 모두는 유사한 정도로 이들 유전자를 유도할 수 있었다.
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Claims (48)
- STAT1 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법.
- 제1항에 있어서,
STAT1 저해제가 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체인 방법. - 제1항에 있어서,
STAT1 저해제가 IL-6 또는 IL6 수용체에 대한 항체인 방법. - 제1항에 있어서,
STAT1 저해제가 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제(agent)인 방법. - 제1항에 있어서,
STAT1 저해제가 STAT1 인산화를 감소시키는 제제인 방법. - 제1항에 있어서,
STAT1 저해제가 STAT1의 핵 내로의 전위(translocation)를 방지하는 제제인 방법. - 제1항에 있어서,
STAT1 저해제가 STAT1에 대한 RNAi 제제인 방법. - CH25H 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법.
- 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1 저해제인 방법. - 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체인 STAT1 저해제인 방법. - 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 IL-6 또는 IL6 수용체에 대한 항체인 STAT1 저해제인 방법. - 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1 인산화를 감소시키는 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 제8항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1에 대한 RNAi 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 25-OHC 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법.
- 제16항에 있어서,
25-OHC 저해제가 CH25H 저해제 또는 STAT1 저해제인 방법. - 제16항에 있어서,
25-OHC 저해제가 25-OHC의 유사체(analog)인 방법. - 제16항에 있어서,
25-OHC 저해제가 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제 저해제인 방법. - 제19항에 있어서,
HMG-CoA 리덕타제 저해제가 심바스타틴인 방법. - STAT1 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법.
- 제21항에 있어서,
STAT1 저해제가 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체인 방법. - 제21항에 있어서,
STAT1 저해제가 IL-6 또는 IL-6 수용체에 대한 항체인 방법. - 제21항에 있어서,
STAT1 저해제가 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제인 방법. - 제21항에 있어서,
STAT1 저해제가 STAT1 인산화를 감소시키는 제제인 방법. - 제21항에 있어서,
STAT1 저해제가 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제인 방법. - 제21항에 있어서,
STAT1 저해제가 STAT1에 대한 RNAi 제제인 방법. - CH25H 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법.
- 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1 저해제인 방법. - 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 IFN 또는 IFN 수용체에 대한 항체인 STAT1 저해제인 방법. - 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 IL-6 또는 IL-6 수용체에 대한 항체인 STAT1 저해제인 방법. - 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 JAK1 및 JAK3을 저해하는 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1 인산화를 감소시키는 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1의 핵 내로의 전위를 방지하는 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 제28항에 있어서,
CH25H 저해제가 STAT1에 대한 RNAi 제제인 STAT1 저해제인 방법. - 25-OHC 저해제의 약제학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법.
- 제36항에 있어서,
25-OHC 저해제가 CH25H 저해제 또는 STAT1 저해제인 방법. - 제36항에 있어서,
25-OHC 저해제가 25-OHC의 유사체인 방법. - 제36항에 있어서,
25-OHC 저해제가 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제 저해제인 방법. - 제39항에 있어서,
HMG-CoA 리덕타제 저해제가 심바스타틴인 방법. - a. 유전체 편집 도구(genome editing tool)를 제공하는 단계;
b. 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 및
c. 전체 STAT1 유전자, STAT1 유전자의 인산화 부위, STAT1 유전자의 프로모터 영역, 또는 STAT1 유전자의 SH2 도메인을 결실(deleting)시킴으로써 STAT1 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법. - 제41항에 있어서,
유전체 편집 도구가 CRISPR-CAS9 시스템인 방법. - a. 유전체 편집 도구를 제공하는 단계;
b. 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 및
c. 전체 CH25H 유전자, CH25H 유전자의 히스틴 클러스터 영역, 또는 CH25H 유전자의 프로모터 영역을 결실시킴으로써 CH25H 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)을 치료하는 방법. - 제43항에 있어서,
유전체 편집 도구가 CRISPR-CAS9 시스템인 방법. - a. 유전체 편집 도구를 제공하는 단계;
b. 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 및
c. 전체 STAT1 유전자, STAT1 유전자의 인산화 부위, STAT1 유전자의 프로모터 영역, 또는 STAT1 유전자의 SH2 도메인을 결실시킴으로써 STAT1 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법. - 제45항에 있어서,
유전체 편집 도구가 CRISPR-CAS9 시스템인 방법. - a. 유전체 편집 도구를 제공하는 단계;
b. 유전체 편집 도구를 신경 세포에 전달하는 단계; 및
c. 전체 CH25H 유전자, CH25H 유전자의 히스틴 클러스터 영역, 또는 CH25H 유전자의 프로모터 영역을 결실시킴으로써 CH25H 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병(AD)의 발병을 예방하거나 지연시키는 방법. - 제47항에 있어서,
유전체 편집 도구가 CRISPR-CAS9 시스템인 방법.
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