KR20070119742A - Ａβ 관련 질환의 치료제 - Google Patents

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히데키 와타나베
프랑수아 버니어
다케히코 미야가와
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에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

Ａβ 관련 질환의 치료제 {A THERAPEUTIC AGENT FOR Aβ RELATED DISORDERS}
본 발명은 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합의, 알츠하이머병 및 다운 증후군과 같은 Aβ-기초 질환의 치료용 약학 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머병 (AD) 또는 알츠하이머 유형의 노인성 치매 (SDAT) 는 진행성 치매 증상과 관계된 신경퇴행성 질환이다. 이들 질환의 치료제로 주로 사용되는 것은 아세틸콜린에스터라제 억제제로 대표되는 증상 개선제이다. 이러한 이유로, 증상 진행 억제제의 개발에 대한 강한 사회적 요구가 있었다. 노인반의 주요 성분 중 하나인 아밀로이드 β 단백질 (Aβ) 의 비정상적 축적에 초점을 맞춘 아밀로이드 가설, 및 타우의 비정상적 인산화로 인한 신경섬유 농축제(neurofibrillary tangle) 형성에 초점을 맞춘 타우 이론을 포함하여, AD 또는 SDAT 의 원인으로 몇 가지 이론이 제안되었다. Aβ 는 약 40 개 아미노산으로 이루어진 펩티드로서, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 을 β- 및 γ-세크리타제에 의해 각각 β- 및 γ-위치에서 절단하여 가공함으로써 생성된다 (1). Aβ 펩티드는 건강한 사람에서도 생성되고, 그 아미노산 서열 (C-말단) 의 길이에 따라 Aβ 37, Aβ38, Aβ39, Aβ40 및 Aβ42 를 포함하는 여러 종들이 있으며, Aβ40 이 주요 종으로 알려져 있다 (2). 선행 연구에 의하면, Aβ42 는 매우 소수성이고 응집하는 경향이 있으며 (즉 β-시트 구조를 형성) (3), Aβ42 축적은 AD, SDAT 또는 다운 증후군의 초기 단계에서 발생하고 이후 Aβ40 축적이 발생한다 (4). 또한 가족성 알츠하이머병 (FAD) 에서 변이된 것으로 알려진 APP, 프레세닐린 1 (PS1) 및 프레세닐린 2 (PS2) 는 Aβ42 생성을 증강시킨다고 보고되었다 (5a, 5b). 이들 발견은 Aβ (특히 Aβ42) 와 AD 또는 SDAT 발병 간의 강한 연관성을 암시한다. 또한 Aβ 가 타우 인산화 및 신경섬유 농축제 형성을 유도한다고 여겨지는데, 이는 신경섬유 농축제 형성이 Aβ 의 타우 유전자도입 마우스 (6) 또는 APP/타우 이중-유전자도입 마우스 (7) 로의 뇌내 주입에 의해 자극받기 때문이다.
아밀로이드 가설을 토대로 제안된 AD 또는 SDAT 치료제로는, Aβ 생성 억제제, Aβ 응집 억제제 및 Aβ 분해/제거 증강제가 포함된다. Aβ 생성 억제제로서, γ-세크리타제-억제 효과를 지닌 화합물이 앞서 발견된 바 있다 (8a, 8b). 그러나 APP 외에도 다른 단백질 (예, Notch) 또한 γ-세크리타제의 기질로 보고되었으며 (9), 기존의 γ-세크리타제 억제제가 Notch 프로세싱에 대한 억제 효과와 항상 연관된 것으로 보고되었다. Notch 는 세포 분화에서 중요한 역할을 하므로, Notch 프로세싱의 억제는 각종 부작용을 유발할 것으로 염려된다 (10a, 10b). 또한 유전자 조작 동물로부터 얻은 결과는, β-세크리타제 절단에 의해 생성되고 γ-위치 절단의 억제에 의해 축적되는 APP 의 C-말단 절편인 APP-C100 (또는 99) 이 그 자체로 세포 독성을 가짐을 암시한다 (11). 또한 γ-세크리타제 절 단에 의해 생성되는 APP 세포내 도메인 (AICD) 은 Notch 세포내 도메인 (NICD) 의 경우처럼 핵으로 이동하여 일부 신호전달을 유발할 가능성이 있음이 제안되었다 (12); 기존의 γ-세크리타제 억제제는 Notch-유도성 부작용을 유발할 뿐만 아니라 APP C-말단 절편의 축적으로 인한 부작용의 발생 가능성이 있다는 위험이 있다.
2001 년에, 이부프로펜을 포함한 일부 비스테로이드계 항염증 약물 (NSAID) 이 Aβ42 생성을 선택적으로 억제한다고 보고되었다 (13, 14). 이들 화합물은 Aβ42 에 대해 선택적인 억제 효과가 있고 또한 Aβ38 생성을 증강시킨다. 더욱이 이들 화합물은 APP/Notch 프로세싱에서 소외되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 어떠한 Notch-억제 효과도 없는 γ-세크리타제 억제제의 발견 가능성을 암시하는 것이다. 일부 NSAID 는 또한 APP 유전자도입 마우스에서 아밀로이드 반 (plaque) 의 형성을 억제하는 것으로 보고되었다. 그러나 Aβ42 생성에 대한 이의 억제 활성은 수십 μM 내지 수백 μM 일 만큼 낮다; Aβ42 생성에 대한 억제 효과만으로는 동물 모델에서 이들 화합물의 효과를 설명하기에 충분치 않다 (15).
참조문헌
Figure 112007080232949-PCT00001
Figure 112007080232949-PCT00002
Figure 112007080232949-PCT00003
본 발명의 목적은 알츠하이머병 및 다운 증후군과 같은 Aβ-기초 질환의 치료를 위한 신개념을 토대로 한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
선행 발견을 고려할 때, 본 발명의 발명자들은 Aβ42 코어 주위의 Aβ40 축적을 통해 아밀로이드 반이 형성되므로, Aβ42 의 생성을 억제할 뿐만 아니라 주요 산물 Aβ40 의 생성을 억제할 수 있는 화합물을 발견하는 것이 바람직하다고 생각하였다. 또한 Aβ37 및 Aβ38 은 그 존재는 알려져 있었지만 그 효과에 관해서는 보고된 바 없었다. 뜻밖에도 본 발명자들은 현재 다른 것에 앞서, Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 에 비해 세포에 대한 독성이 극히 적고 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 응집에 대해 억제 효과를 가짐을 발견하였다. 이러한 발견은 Aβ37 및/또는 Aβ38 생성의 증강이 Aβ40 및 Aβ42 (이하 "Aβ40/42" 라고도 함. 하기 참조) 에 의해 유발되는 세포 손상 및/또는 아밀로이드 반 형성을 억제할 가능성을 암시한다. 상기를 감안하여, 본 발명자들은 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물 또는 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물이 기존의 Aβ42 생성 억제제에 비해 아밀로이드 축적의 억제에 더 효과적이고 더 안전하므로 알츠하이머병의 신규한 치료제를 예비할 수 있다는 가설을 세웠다. 본 발명의 발명자들은 이 가설을 토대로 광범위하고도 집중적인 노력을 기울였다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는 효과가 있는 화합물을 찾는 데 성공하였다. 이러한 결과로부터, Aβ37 생성을 증강시키는 특징이 있는 화합물, 또는 Aβ40/42 생성을 억제할 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 적고 Aβ42 응집에 대해 억제 효과를 나타내는 Aβ37 생성을 증강시키는 특징이 있는 화합물이, 그 화학적 구조와 무관하게 기존의 Aβ42 생성 억제제보다 아밀로이드 축적을 억제하는 데 더 효과적이고 더 안전한 것으로 나타났다. 더욱이, Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ40/42 에 비해 세포에 대한 독성이 극히 적고 Aβ42 응집에 대한 억제 효과를 가지므로, 본 발명의 다른 구현예에서는 Aβ37 및 Aβ38 이 아밀로이드 축적을 억제한다고 여겨진다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 이들 화합물 및 Aβ37 및 Aβ38 이 알츠하이머병 및 다운 증후군과 같은 Aβ-기초 질환 치료의 신개념을 기반으로 한 치료제의 활성 성분으로서 효과적으로 기능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 다음과 같다:
(1) 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 이용하여 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성의 억제 방법.
(2) 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성의 억제 및 Aβ37 생성의 증강 방법.
(3) Aβ37 및/또는 Aβ38 이 생체 또는 이의 일부에서 Aβ42 에 작용하도록 하는 것을 포함하는 Aβ 응집의 억제 방법.
Aβ 응집은 또한 Aβ37 및/또는 Aβ38 을 Aβ40 에 작용하도록 함으로써도 억제할 수 있다.
(4) 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하여 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 포함하는 Aβ 응집의 억제 방법.
(5) 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 Aβ 응집의 억제 방법.
(6) Aβ37 및/또는 Aβ38 이 생체 또는 이의 일부에서 Aβ42 에 작용하도록 하는 것을 포함하는 신경세포 (뉴런) 사멸 방지 방법.
신경세포 사멸은 또한 Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ40 에 작용하도록 함으로써 예방가능하다.
(7) 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하여 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 포함하는 신경세포 사멸 방지 방법.
(8) 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 신경세포 사멸 방지 방법.
(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 생체의 일부가 뇌인 방법.
(10) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 Aβ 응집 억제제.
(11) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 신경세포 사멸 억제제.
(12) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학 조성물.
(13) 상기 (12) 에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료에 사용되는 약학 조성물.
(14) 상기 (13) 에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
(15) 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 Aβ 응집 억제제:
(a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
(16) 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 신경세포 사멸 억제제:
(a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
(17) 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 약학 조성물:
(a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
(18) 상기 (17) 에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료에 사용되는 약학 조성물.
(19) 상기 (18) 에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
(20) 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Aβ 응집 억제제:
(a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
(21) 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 (b) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 Aβ 응집 억제제:
(a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 (stringent conditions) 하에 혼성화하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
(22) 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 신경세포 사멸 억제제:
(a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
(23) 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 (b) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 신경세포 사멸 억제제:
(a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에 혼성화하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
(24) 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물:
(a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
(25) 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 (b) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 약학 조성물:
(a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에 혼성화하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
(26) 상기 (24) 또는 (25) 에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료에 사용되는 약학 조성물.
(27) 상기 (26) 에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
(28) Aβ-기초 질환의 치료를 요하는 포유류에, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 Aβ-기초 질환의 치료 방법.
(29) Aβ-기초 질환의 치료를 요하는 포유류에, 상기 (12), (13), (14), (17), (18), (19), (24), (25), (26) 및 (27) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 따른 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 Aβ-기초 질환의 치료 방법.
(30) 상기 (28) 또는 (29) 에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 방법.
(31) 상기 (28) 또는 (29) 에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
(32) 하기를 포함하는 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 방법:
(a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
(b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 측정함;
(c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양과 비교하여 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키는 후보 화합물을 선별함; 및
(d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
(33) 하기를 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 방법:
(a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
(b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양을 측정함;
(c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양과 비교하여, 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키고 또한 Aβ40 및 Aβ42 의 양을 감소시키는 후보 화합물을 선별함; 및
(d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
(34) 하기를 포함하는 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 스크리닝 방법:
(a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
(b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 측정함;
(c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양과 비교하여 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키는 후보 화합물을 선별함; 및
(d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
(35) 하기를 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 스크리닝 방법:
(a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
(b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양을 측정함;
(c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양과 비교하여, 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키고 또한 Aβ40 및 Aβ42 의 양을 감소시키는 후보 화합물을 선별함; 및
(d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
(36) 상기 (32) 내지 (35) 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 조성물이 β-아밀로이드 전구체 단백질-발현 세포를 포함하는 방법.
(37) 상기 (32) 내지 (35) 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 조성물이 포유류 세포를 포함하는 방법.
(38) 상기 (32) 내지 (35) 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 조성물이 신경세포를 포함하는 방법.
(39) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 콜린에스터라제-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 약학 조성물.
(40) 상기 (39) 에 있어서, 콜린에스터라제-억제 물질이 도네페질 또는 이의 염인 약학 조성물.
(41) 상기 (39) 에 있어서, NMDA 수용체 길항제가 메만틴인 약학 조성물.
(42) 상기 (39) 에 있어서, AMPA 수용체 길항제가 탈람파넬인 약학 조성물.
(43) 상기 (39) 내지 (42) 중 어느 하나에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료제인 약학 조성물.
(44) 상기 (43) 에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
(45) Aβ-기초 질환의 치료를 요하는 포유류에, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량, 및 콜린에스터라제-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 Aβ-기초 질환의 치료 방법.
(46) 상기 (45) 에 있어서, 콜린에스터라제-억제 물질이 도네페질 또는 이의 염인 방법.
(47) 상기 (45) 에 있어서, NMDA 수용체 길항제가 메만틴인 방법.
(48) 상기 (45) 에 있어서, AMPA 수용체 길항제가 탈람파넬인 방법.
(49) 상기 (45) 내지 (48) 중 어느 하나에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 방법
(50) 상기 (45) 내지 (49) 중 어느 하나에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
(51) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 콜린에스터라제-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 키트.
(52) 상기 (51) 에 있어서, 콜린에스터라제-억제 물질이 도네페질 또는 이의 염인 키트.
(53) 상기 (51) 에 있어서, NMDA 수용체 길항제가 메만틴인 키트.
(54) 상기 (51) 에 있어서, AMPA 수용체 길항제가 탈람파넬인 키트.
(55) 상기 (15) 에 있어서, 펩티드 (a) 및 (b) 및 이의 절편이 이의 염 또는 이의 용매화물의 형태인 억제제.
(56) 상기 (16) 에 있어서, 펩티드 (a) 및 (b) 및 이의 절편이 이의 염 또는 이의 용매화물 형태인 억제제.
(57) 상기 (17) 에 있어서, 펩티드 (a) 및 (b) 및 이의 절편이 이의 염 또는 용매화물 형태인 약학 조성물.
(58) 상기 (20) 또는 (21) 에 있어서, 폴리뉴클레오티드(들)이 이의 염 또는 용매화물 형태인 억제제.
(59) 상기 (22) 또는 (23) 에 있어서, 폴리뉴클레오티드(들)이 이의 염 또는 용매화물 형태인 억제제.
(60) 상기 (24) 또는 (25) 에 있어서, 폴리뉴클레오티드(들)이 이의 염 또는 용매화물 형태인 약학 조성물.
[도면의 간단한 설명]
도 1: Aβ1-37, Aβ1-38, Aβ1-40 및 Aβ1-42 (각 10 μM) 에 대한 원편광 이색성 (CD) 측정 결과
수직축은 원편광도를 나타내고 수평축은 측정 파장을 나타낸다. 각 Aβ 시료에 대한 CD 스펙트럼을, 0.9% NaCl 함유 10 mM HEPES 용액에 용해한 직후 (도 1A) 및 1 시간 후 (도 1B), 3 시간 후 (도 1C), 4 시간 후 (도 1D), 1 일 후 (도 1E), 2 일 후 (도 1F), 3 일 후 (도 1G), 4 일 후 (도 1H) 및 5 일 후 (도 1I) 에 얻었다. 220 nm 파장 부근에서 최소인 파형이 β-시트 구조를 나타낸다. 용해 후 1 일째에는, Aβ 시료 중 어느 것도 β-시트 구조가 아니었다 (도 1E). 용해 후 2 일째에, Aβ1-42 만이 β-시트 구조의 특징적 파형을 보였고 (도 1F), 용해 후 5 일째까지 안정적으로 남아있었다 (도 1I). Aβ1-37, Aβ1-38 및 Aβ1-40 은 용해 후 5 일째에도 β-시트 구조 형성을 보이지 않았다 (도 1I).
도 2: Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 과 혼합시 Aβ1-42 에 대한 CD 측정 결과
5 μM Aβ1-42 에 대한 CD 스펙트럼을, 15 μM Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 과 혼합 직후 (도 2A) 및 2 시간 후 (도 2B), 4 시간 후 (도 2C), 6 시간 후 (도 2D), 8 시간 후 (도 2E), 1 일 후 (도 2F), 2 일 후 (도 2G) 및 3 일 후 (도 2H) 에 얻었다. 혼합 후 8 시간까지, 모든 Aβ 시료는 랜덤한 구조를 가진다고 여겨졌다 (도 2E). 용해 후 1 일째로부터, Aβ1-42+완충제만이 β-시트 구조를 나타내었다 (도 2F). Aβ1-40 과 혼합된 시료에서, β-시트 구조를 나타내는 CD 스펙트럼이 2 일 후에 감지되었다 (도 2G). Aβ1-37 또는 Aβ1-38 과 혼합된 시료에서는, β-시트 구조를 나타내는 CD 스펙트럼이 3 일 후에 감지되었다 (도 2H). 특히, Aβ1-37 및 Aβ1-38 은 Aβ1-40 과 비교하여 Aβ1-42 에서 β-시트 구조의 형성을 지연시키는 강한 효과를 가질 수 있음이 암시되었다.
도 3: 티오플라빈 T 의 형광 강도
도 3A
수직축은 티오플라빈 T 의 형광 강도, 즉 β-시트 구조의 함량을 나타낸다. 수평축은 인큐베이션 시간을 나타낸다. 검은색 사각형 (■), 흰색 사각형 (□), 검은색 삼각형 (▲) 및 검은색 원 (●) 은 각각 Aβ1-42, Aβ1-40, Aβ1-38 및 Aβ1-37 을 나타낸다. Aβ1-42 에서, 티오플라빈 T 의 형광 강도는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 증가한 반면, Aβ1-37, Aβ1-38 및 Aβ1-40 은 형광 강도의 증가를 보이지 않았다.
도 3B
이 도면은 Aβ1-42 및 Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 의 1:3 혼합물에 대해 측정된 티오플라빈 T 의 형광 강도를 나타낸다. 수직축은 형광 강도, 즉, β-시트 구조의 함량을 나타낸다. 수평축은 인큐베이션 시간을 나타낸다. 검은색 사각형 (■), 흰색 사각형 (□), 검은색 삼각형 (▲) 및 검은색 원 (●) 은 각각 Aβ1-42+완충제, Aβ1-42+Aβ1-40, Aβ1-42+Aβ1-38 및 Aβ1-42+Aβ1-37 을 나타낸다.
도 3C
이 도면은 도 3B 의 형광 강도 범위 0 ~ 6000000 에서의 확대도를 보여준다.
Aβ1-42 단독과 비교시, β-시트 구조의 형성이 Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 의 존재 하에서 억제되었다. 억제율은 Aβ1-40 의 존재시 보다 Aβ1-37 및 Aβ1-38 의 존재시에 더 컸다. 이러한 결과는 β-시트 구조에 대한 CD 분석 결과와 밀접하게 상호연관되었다.
도 4: 래트 배아 해마-유래 배양 신경세포의 Aβ (25 μM) 의 세포 독성
수직축은 대조군 (Aβ-미처리 군) 의 백분율로 표시된 MTT 활성을 나타낸다. 값이 작을수록 MTT 활성이 낮고 따라서 세포 독성이 더 큼을 의미한다. Aβ1-42 는 MTT 활성의 감소를 보인 반면, Aβ1-37 은 감소를 나타내지 않았다.
도 5: 래트의 초대 배양된 신경세포 배양물의 상청액 내 Aβ종의 MALDI-TOF/MS 분석 결과
도 5A
이 도면은 시험 화합물의 부재 중 신경세포 배양 상청액의 각 Aβ 절편에 대한 MALDI-TOF/MS 분석 결과를 보여준다. 수직축은 강도를 나타내고, 수평축은 분자량을 나타낸다. 검출된 모든 질량 데이타는 기준으로 첨가된 인간 인슐린 및 안지오텐신 III 의 질량 (각각 5807.6 및 931.1) 에 대해 보정되었다. 내부 기준 Aβ12-28 의 검출 강도가 모든 시료에서 동일하다는 가정하에 시료 간의 검출된 Aβ강도의 정규화를 수행하였다.
도 5B
이 도면은 도 5A 에서 분자량 범위 2421 ~ 4565 의 확대도를 보여준다.
도 6: Aβ 절편에 대한 개별 화합물의 효과
개별 피크의 강도를 그 면적을 토대로 수치화하고 비교 전에 내부 기준 Aβ12-28 의 강도로 정규화하였다. 수직축은 각 Aβ 절편의 강도를 나타내고 각 세로칸은 첨가한 시험 화합물을 농도를 나타낸다. 이 도면은 Aβ37 생성이 시험 화합물의 농도에 의존하는 방식으로 증강됨을 나타낸다.
도 6A: 화합물 A
도 6B: 화합물 B (CAS#501907-79-5)
도 6C: 화합물 C (CAS#670250-40-5)
도 7: 래트의 초대 배양된 신경세포 배양물의 상청액 중 Aβ 종의 정량적 ELISA 분석 결과
수직축은 대조군 (약물-미처리 군) 의 백분율로 표시된 매질 내 Aβ의 농도를 나타내고, 수평축은 첨가한 시험 화합물의 농도를 나타낸다. 흰색 사각형 (□) 및 검은색 사각형 (■) 은 각각 Aβ40 및 Aβ42 를 나타낸다. 이 도면은 Aβ40 및 Aβ42 의 생성 모두 시험 화합물의 농도에 의존하는 방식으로 억제됨을 보여준다.
도 7A: 화합물 A
도 7B: 화합물 B (CAS#501907-79-5)
도 7C: 화합물 C (CAS#670250-40-5)
발명의 실시를 위한 최선의 양태
이하, 본 발명의 구현예를 설명한다. 하기 구현예는 본 발명을 단지 예시하는 것이므로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 한 본 발명을 다양한 구현 방식으로 실시할 수 있다.
모든 선행 기술 문헌, 특허 출원 공개 공보, 특허 공보 및 기타 본원에 인용된 특허 문헌은 본원에 참조 병합된다. 또한 본 출원이 우선권을 주장하는 미국 특허 출원 번호 11/111,504 의 명세서, 도면 및 추록도 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
1. 본 발명의 개요
Aβ-기초 질환에서, Aβ40/42 축적이 아밀로이드 반의 형성을 유도하고 상기 질병의 각종 증상을 유발한다고 밝혀졌다. 본 발명은 Aβ37 생성의 증가가 APP 로부터 Aβ40/42 의 γ-세크리타제-매개 생성을 방지하고 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 응집 억제 효과를 가진다는 본 발명자들의 발견에 기초한다. 즉, 본 발명은 알츠하이머병 및 다운 증후군과 같은 Aβ-기초 질환을 치료함에 있어서, 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 또는 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 또는 Aβ37 또는 Aβ38 의 치료적 용도에 관한 것이다.
(1) Aβ37 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ40/42 생성의 억제 방법
본 발명의 발명자들은 Aβ37 생성의 증강이 Aβ40/42 생성을 방지함을 확인하였다. 따라서 본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ40/42 생성의 억제 방법을 제공한다. 상기 본 방법 발명에 있어서, (i) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (ii) 이의 염 및 (iii) 이의 용매화물 (이는 본 발명의 범위 내임) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 또는 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 생성된 Aβ37 의 양을 비교함으로써 수행가능하다.
(2) Aβ40/42 생성의 억제 및 Aβ37 생성의 증강 방법
본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 본 방법 발명에 있어서, (i) Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (ii) 이의 염 및 (iii) 이의 용매화물 (이는 본 발명의 범위 내임) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 또는 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 생성된 각 Aβ 의 양을 비교함으로써 수행가능하다.
(3) Aβ 응집 억제 방법
본 발명의 발명자들은 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ40/42 에 비해 세포에 대한 독성이 극히 적고, Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 응집 억제 효과가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ40/42 에 작용하도록 하는 것을 특징으로 하는 Aβ 응집의 억제 방법을 제공한다. 나아가, (i) Aβ37, (ii) Aβ38, (iii) Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (iv) 이의 염 또는 (v) 이의 용매화물을 함유한 Aβ 응집 억제제 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 본다.
본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 의 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ 응집의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ 응집의 억제 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법에서, (vi) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (vii) Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 (viii) 상기 화합물의 염 및 (ix) 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용할 수 있다. 이들 화합물을 함유한 Aβ 응집 억제제 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 본다.
(4) 신경세포 사멸의 방지 방법
선행 연구는 Aβ 응집이 신경세포 상에 Aβ 침착을 유도하여 신경세포 사멸을 일으킴을 지적하였다. 본 발명의 발명자들은 Aβ37 생성의 증강이 상기 응집 독성과 관계된 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 응집에 대해 억제 효과를 가짐을 확인하였다. 이러한 효과는 Aβ 응집에 의해 유도되는 신경세포 사멸을 방지한다. 따라서 본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ40/42 에 작용하도록 함을 특징으로 하는 신경세포 사멸 방지 방법을 제공한다. 나아가, (i) Aβ37, (ii) Aβ38, (iii) Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (iv) 이의 염 또는 (v) 이의 용매화물을 함유한 신경세포 사멸 억제제 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 본다.
본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 신경세포 사멸 방지 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 신경세포 사멸 방지 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법에서, (vi) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (vii) Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (viii) 상기 화합물의 염 및 (ix) 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용할 수 있다. 이들 화합물을 함유한 신경세포 사멸 억제제 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 본다.
(5) Aβ-기초 질환의 치료 방법
본 발명은 Aβ-기초 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서, "Aβ-기초 질환의 치료" 는 상기 질환의 진행을 예방하거나, 늦추거나 또는 후퇴시키는 것을 포함한다. 본 발명의 치료 방법은 상기 질환의 치료를 요하는 포유류에 (i) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (ii) Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (iii) 상기 화합물의 염 및 (iv) 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유한 약학 조성물의 유효량을 투여함으로써 이루어질 수 있다. Aβ-기초 질환에 사용되는 상기 약학 조성물 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 본다. 상기 약학 조성물은 Aβ-기초 질환의 치료에 매우 효과적인데, 이는 그에 포함된 화합물(들)이 Aβ37 생성을 증강시키는 효과 또는 Aβ37 생성을 증강시키고 Aβ40/42 생성을 억제하는 효과를 갖고, 또한 Aβ37 이 Aβ42 응집 억제 효과를 갖기 때문이다.
다르게는, 상기 질환의 치료를 요하는 포유류에 (v) Aβ37, (vi) Aβ38, (vii) Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (viii) 이의 염 및 (ix) 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 함유한 약학 조성물의 유효량을 투여함으로써 Aβ-기초 질환의 치료 방법을 실시할 수 있다. Aβ-기초 질환에 사용되는 상기 약학 조성물 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 본다. 상기 약학 조성물은 Aβ-기초 질환의 치료에 매우 효과적인데, 이는 함유된 Aβ37, Aβ38, Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이의 염 및 이의 용매화물이 Aβ 응집 억제 효과를 갖기 때문이다.
(6) 병용 치료
본 발명은 병용 치료에 의한 Aβ-기초 질환의 치료 방법을 포함한다. (i) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (ii) Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, (iii) 상기 화합물의 염 및 (iv) 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량, 및 (a) 콜린에스터라제 (ChE)-억제 물질, (b) NMDA (N-메틸-D-아스파르테이트) 수용체 길항제 및 (c) AMPA (α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피온산) 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질의 유효량을 별도로 또는 이들 두 성분을 함유한 단일 약학 조성물 (배합 제형물) 로서 투여함으로써 본 발명을 수행할 수 있다. Aβ-기초 질환의 병용 치료에 사용되는 약학 조성물 또는 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 약학 조성물 또는 키트는 Aβ-기초 질환의 치료제로서 효과적이다. 더욱이, 상기 키트는 병용 치료에 사용되는 약학 조성물의 효능을 탐지 또는 예측하는 데 이용되거나, 또는 병용 치료에 사용되는 약학 조성물로서 적합한 화합물을 동정 또는 스크리닝하는 방법에 이용될 수 있다.
본 발명을 이하 더 자세히 설명한다.
본원에서, "생체" 란 용어는 포유류를 의미하고 "생체의 일부" 란 용어는 중추신경계 (특히 뇌, 척수) 및 생체-유래 조직, 체액 (예, 혈액, 뇌척수액, 림프, 타액 포함) 또는 세포를 포함하는 포유류의 각종 장기를 포괄한다. 생체-유래 세포는 또한 초대 배양된 세포 및 배양 세포주와 같은 배양 세포를 포함한다.
본원에서, "포유류" 란 용어는 인간 또는 비인간 포유류 (예, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 래빗, 돼지, 개, 말, 소, 원숭이) 를 포함하는 포유류로 분류될 수 있는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게, 본원에서 의도하는 포유류는 인간이다.
본원에서, "APP" 란 용어는 β-아밀로이드 전구체 단백질 (βAPP) 을 의미한다. 인간의 경우, 21번 염색체의 긴 팔에 위치한 동일명의 유전자로 암호화되어 있고 그 C-말단 단편에 Aβ 영역을 포함하는 펩티드를 가리킨다.
APP 는 아이소타입(isotype)을 갖는 것으로 알려져 있다. 표 1 은 GenBank 또는 Swiss Prot 에 등록된 인간, 마우스 및 래트 APP 아이소타입의 등록번호(Accession number) 또는 Swiss prot Isoform ID 를 나타낸다. 대표적 아이소타입은 종마다 다르다. 예를 들어, 대표 아이소타입은 인간의 경우 APP770 아미노산 아이소타입, 마우스의 경우 APP695 아미노산 아이소타입, 및 래트의 경우 APP770 아미노산 아이소타입이다.
아이소타입 GenBank 등록번호 (Swiss prot Isoform ID)
cDNA 서열 (SEQ ID NO) 아미노산 서열 (SEQ ID NO)
Human APP695 NM_201414 (SEQ ID NO: 1) NP_958817 (SEQ ID NO: 2) (P05067-4)
Human APP751 NM_201413 (SEQ ID NO: 3) NP_958816 (SEQ ID NO: 4) (P05067-8)
Human APP770 NM_000484 (SEQ ID NO: 5) NP_000475 (SEQ ID NO: 6) (P05067-1)
P05067
마우스 APP695 NM_007471 (SEQ ID NO: 7) NP_031497 (SEQ ID NO: 8) (P12023-2)
마우스 APP751 n/a n/a (P12023-3)
마우스 APP770 AY267348 AAP23169 (P12023-1)
P12023
래트 APP695 n/a n/a (P08592-2)
래트 APP751 n/a n/a (P08592-7)
래트 APP770 NM_019288 (SEQ ID NO: 9) NP_062161 (SEQ ID NO: 10) (P08592-1)
P08592
본원에서, "Aβ" 란 용어는 β-아밀로이드 단백질, 아밀로이드 β 단백질, β-아밀로이드 펩티드, 아밀로이드 β 펩티드 또는 아밀로이드 베타를 의미한다. 예를 들어, Aβ 는 인간 APP695 아미노산 아이소타입에서 약 33 내지 약 44 개 아미노산 잔기로 이루어진 임의의 펩티드를 말하며, 이는 바람직하게는 APP 의 597 내지 640 위치의 아미노산 잔기 모두 또는 일부를 함유하고 APP 로부터 N-말단 단백질분해 및 이후의 C-말단 단백질분해에 의해 생성된다.
본원에서, "γ-세크리타제" 란 용어는 그 막통과 영역 내에서 APP 를 절단(분해)하여 Aβ 생성을 유도하는 다중 분자 복합체 또는 효소를 의미한다.
본원에서 "Aβ37', "Aβ38", "Aβ40" 및 "Aβ42" 으로 표시했을 때, 이는 각각 AβX-37, AβX-38, AβX-40 및 AβX-42 (여기서 X 는 1 ~ 17 의 정수임) 를 의미한다. X 는 바람직하게는 1 또는 11 이므로, 달리 명시하지 않는 한 X 는 1 또는 11 을 나타낸다.
더 구체적으로, 본원에서 "Aβ37" 이란 용어는 37 개 아미노산 잔기로 이루어진 Aβ37 로부터 N-말단 X-1 잔기의 결실에 의해 유도된 펩티드, 즉 아미노산 X - 37 을 포괄하는 펩티드를 가리킨다. "Aβ40/42" 란 용어는 Aβ40 및 Aβ42 를 의미한다. Aβ40 은 40개 아미노산 잔기로 이루어진 Aβ40 으로부터 N-말단 X-1 잔기의 결실에 의해 유도된 펩티드, 즉 아미노산 X - 40 을 포괄하는 펩티드를 가리킨다. Aβ42 는 42 개 아미노산 잔기로 이루어진 Aβ42 로부터 N-말단 X-1 잔기의 결실에 의해 유도된 펩티드, 즉 아미노산 X - 42 를 포괄하는 펩티드를 가리킨다. X 는 1 - 17 정수를 나타내고, 달리 명시하지 않는 한 X 는 1 또는 11 이다.
본원에서, "Aβ37 생성을 증강시키다" 또는 "Aβ37 생성을 증강시키는" 이란 표현은 Aβ37 생성 수준을 증가시키는 효과를 의미한다.
본원에서, "Aβ40/42 생성을 억제하는" 이란 표현은 Aβ40/42 생성 수준을 감소(줄이기)시키거나 Aβ40/42 생성을 중단시키는 효과를 의미한다.
본원에서, "Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는" 효과란 표현은 Aβ40/42 생성 수준을 감소(줄이기)시키거나 Aβ40/42 생성을 중단할 뿐만 아니라 Aβ37 생성 수준을 증가시키는 효과를 의미한다.
본원에서, "Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물" 이란 용어는 Aβ37 생성을 증강시키는 효과가 있는 한 임의의 화합물을 지칭할 수 있다.
본원에서, "Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물" 이란 용어는 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는 효과가 있는 한 임의의 화합물을 지칭할 수 있다.
본원에서, "생성을 억제하는" 및 "억제된 생성" 또는 "생성을 증강시키는" 및 "증강된 생성" 이란 표현은 생성 수준의 재현가능한 변화를 의미한다. 예를 들어, 생성 수준의 변화는, 예컨대 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 또는 40% 이상의 증가 또는 감소를 의미하는 한 임의의 값이 가능하다. Aβ40/42 생성을 억제함에 있어서, Aβ40 또는 Aβ42 생성의 억제는 Aβ40 또는 Aβ42 생성 수준이 감소되거나 (줄거나) 또는 Aβ40 또는 Aβ42 생성이 중단되는 한, 특정 수준에 한정되지 않는다.
본원에서 "화합물" 은, 예컨대 유전자 라이브러리의 발현 산물, 천연 또는 합성 저분자량 화합물 라이브러리, 핵산 (예, 올리고 DNA, 올리고 RNA), 천연 또는 합성 펩티드 라이브러리, 항체, 박테리아에서 배출된 물질 (박테리아 대사에 의해 배출된 물질 포함), 세포 (예, 미생물, 식물 세포 또는 동물 세포) 추출물, 세포 (예, 미생물, 식물 세포 또는 동물 세포) 배양 상청액, 정제 또는 부분 정제 펩티드, 해양 유기체, 식물- 또는 동물-유래 추출물, 토양, 및 무작위 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리에 포함된 하나 이상의 화합물을 일컫는다. 그러한 화합물은 신규하거나 혹은 공지된 화합물일 수 있다. 또한 상기 화합물은 기존의 화학적 수단, 물리적 수단 및/또는 생화학적 수단에 의해 개질될 수 있다. 예를 들어, 직접 화학적 개질 (예, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화) 또는 임의의 화학적 개질을 거쳐 구조 유사체로 전환될 수 있다. 상기 화합물은 또한, 예컨대 화합물에 대한 약리작용단(pharmacophore) 검색 또는 컴퓨터를 이용한 구조 비교 프로그램으로 동정된 것일 수 있다.
본원에서 "유도체" 란 용어는 원 화합물의 부분적 변경에 의해 수득된 화합물을 의미한다. "유도체" 란 용어는 또한 첨가 반응에 의해 수득된 생성물도 포함한다.
본원에서, "염" 이란 용어는 약학적으로 허용가능한 염을 가리키는데, Aβ-기초 질환 치료제로 작용하는 본 발명에 사용되는 화합물 또는 그 동등물, 본 발명에 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물로써 약학적으로 허용가능한 염이 형성될 수 있는 한 한정되지 않는다. 더 구체적으로, 바람직한 예에는 할로겐화 수소산 염 (예, 플루오르화수소산 염, 염화수소산 염, 브롬화수소산 염, 요오드화수소산 염), 무기산 염 (예, 황산 염, 질산 염, 과염소산 염, 인산 염, 탄산 염, 중탄산 염), 유기 카르복실산 염 (예, 아세트산 염, 옥살산 염, 말레산 염, 타르타르산 염, 퓨마르산 염, 시트르산 염), 유기 술폰산 염 (예, 메탄술폰산 염, 트리플루오로메탄술폰산 염, 에탄술폰산 염, 벤젠술폰산 염, 톨루엔술폰산 염, 캄포르술폰산 염), 아미노산 염 (예, 아스파르트산 염, 글루탐산 염), 4차 아민 염, 알칼리 금속 염 (예, 소듐 염, 칼륨 염), 및 알킬리 토금속 염 (예, 마그네슘 염, 칼슘 염) 이 포함된다.
본 발명에 따르면, 화합물, 펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에는, 존재한다면 그 용매화물이 포함된다. 용매화물은 수화물 또는 비수화물일 수 있으며, 바람직하게는 수화물이다. 비수화물로서, 예를 들어 알코올 (예, 메탄올, 에탄올, n-프로판올), 및 디메틸포름아미드를 사용할 수 있다.
2. Aβ37 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ40/42 생성 억제 방법
본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ40/42 생성 억제 방법을 제공한다. 이 방법은 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 이들 화합물을 생체 또는 그 일부 (예, 뇌) 에 투여 혹은 접촉시켜서 Aβ40/42 생성을 억제할 수 있다. 본 발명의 상기 방법은 Aβ37 의 증강된 생성이 Aβ40/42 생성을 억제하는 메커니즘에 기초한다. Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물은 Aβ37 의 생성을 증강시킴으로써 Aβ40/42 생성의 억제를 달성한다.
본원에서, "본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물" 이란 표현은 상기 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포괄한다.
즉, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 하기에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다:
(i) Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물;
(ii) 상기 (i) 의 염;
(iii) 상기 (i) 의 용매화물;
(iv) 상기 (ii) 의 용매화물; 및
(v) 상기 (i) ~ (iv) 의 조합.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 바람직한 예로는, 하기 실시예 부분에 기재된 화합물 및 이의 유도체, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 포함된다. 화합물의 구체적인 예로는 하기가 포함된다:
(E)-N-비페닐-3-일메틸-3-[3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)페닐]-아크릴아미드 (이하 "화합물 A" 라 함);
CAS#501907-79-5 로 표시된 화합물 (이하 "화합물 B" 라 함); 및
CAS#670250-40-5 로 표시된 화합물 (이하 "화합물 C" 라 함).
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ37 생성 증강 효과가 있고, 그 결과 Aβ40/42 생성을 억제하는 특징이 있다. Aβ37 생성을 증강시키거나 Aβ40/42 생성을 억제하는 그 효과의 강도는 본 발명의 유용성에 영향을 주지 않을 것이다.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 추가로 Aβ38 또는 Aβ39 생성 증강 효과를 가진다.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물은, 공지의 화합물인 경우라면 공지의 제조 방법에 의해 제조하거나, 자연 발생적인 화합물인 경우라면 공지의 추출 또는 정제법으로 수득하거나, 또는 시판되는 것인 경우 구입할 수 있다. 나아가, 공지 화합물의 유도체 및 기타 형태를 화학적 방법, 물리적 방법 및/또는 생화학적 방법으로 개질할 수 있다.
상술한 화합물 A, B 및 C 를 실시예 부분에 기재한 방법 등으로 제조할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 또는 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 Aβ37 양을 비교함으로써 행할 수 있다. 자세한 동정 또는 스크리닝 방법은 추후에 "6. 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 동정 또는 스크리닝 방법" 에 기재한다.
3. Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는 방법
본 발명은 생체 또는 그 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 이들 화합물을 생체 또는 그 일부 (예, 뇌) 에 투여하거나 그와 접촉시켜서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있다.
본원에서, "본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물" 이란 표현은 상기 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다.
즉, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물 (즉, 상기 "2. Aβ37 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ40/42 생성 억제 방법" 에 나열된 (i) ~ (v)) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물 외에도, 하기에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다:
(vi) Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물;
(vii) 상기 (vi) 의 염;
(viii) 상기 (vi) 의 용매화물;
(ix) 상기 (vii) 의 용매화물; 및
(x) 상기 (vi) ~ (ix) 의 조합.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 바람직한 예로는, 하기 실시예 부분에 기재된 화합물 및 이의 유도체, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 포함된다. 화합물의 구체적 예로는 하기가 포함된다:
(E)-N-비페닐-3-일메틸-3-[3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)페닐]-아크릴아미드 (이하 "화합물 A" 라 함);
CAS#501907-79-5 로 표시된 화합물 (이하 "화합물 B" 라 함); 및
CAS#670250-40-5 로 표시된 화합물 (이하 "화합물 C" 라 함).
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시키는 효과를 갖는 특징이 있다. Aβ40/42 생성을 억제하는 효과의 강도 및 Aβ37 생성을 증강시키는 효과의 강도는 본 발명의 유용성에 영향을 주지 않을 것이다.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 추가로 Aβ38 또는 Aβ39 생성을 증강시키는 효과를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물은, 공지의 화합물인 경우라면 공지의 제조 방법에 의해 제조하거나, 자연 발생적인 화합물인 경우라면 공지의 추출 또는 정제법으로 수득하거나, 또는 시판되는 것인 경우 구입할 수 있다. 나아가, 공지 화합물의 유도체 및 기타 형태를 화학적 방법, 물리적 방법 및/또는 생화학적 방법으로 개질할 수 있다.
상술한 화합물 A, B 및 C 를 실시예 부분에 기재한 방법 등으로 제조할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 또는 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 각 Aβ 의 양을 비교함으로써 수행할 수 있다. 자세한 동정 또는 스크리닝 방법은 추후에 "6. 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 동정 또는 스크리닝 방법" 에 기재한다.
4. Aβ 응집 억제 방법
상술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ40/42 에 비해 세포에 대한 독성이 극히 적고 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 응집 억제 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서 본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ42 에 작용하도록 함을 특징으로 하는 Aβ 응집의 억제 방법을 제공한다. 이 방법에서, Aβ42 에 작용하도록 허용되는 Aβ37 또는 Aβ38 은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 작용에 의해 생성된 내인성의 것이거나 또는 외인성의 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ38 또는 Aβ39 생성을 증강시키는 효과를 추가로 가질 수 있다. 또한 Aβ37 및 Aβ38 이 동시에 Aβ42 에 작용하도록 할 수도 있다. 나아가, Aβ40 도 Aβ 응집을 유발하므로, Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ40 에 작용하도록 하여 Aβ 응집을 억제할 수 있다. 본원에서 Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ42 에 작용하는 것으로 기재되어 있지만, 유사하게 Aβ40 에도 작용할 수 있다.
상기 "Aβ37 또는 Aβ38 이 Aβ42 에 작용하도록 함" 이란 표현은 Aβ42 를 Aβ37 및/또는 Aβ38 로 처리한다는 의미이다. 이 처리 방법은 제한되지 않고 이 목적상 임의의 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, Aβ42 를 Aβ37 및/또는 Aβ38 과 접촉시키거나, 다르게는, Aβ42 를 Aβ37 및/또는 Aβ38 과 함께 단일계에 놓을 수 있다 (예, 단일 시험관).
본원에서, "내인성" Aβ37 또는 Aβ38 은 생체 또는 그 일부로부터 유래된 Aβ37 또는 Aβ38 을 가리키거나, 다르게는 생체 또는 이의 일부에서 생성된 Aβ37, Aβ38, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합을 가리킨다.
상술한 바와 같이, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 작용에 의해 생체 또는 이의 일부에서 생성된 Aβ37 또는 Aβ38 또한 내인성 Aβ37 또는 Aβ38 에 포함된다. 따라서 상기 방법에서, Aβ 응집 억제제로 사용가능한 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 이용할 수 있다. 상술한 바와 같이, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 작용에 의해 생체 또는 이의 일부에서 생성된 Aβ37 또는 Aβ38 또한 내인성 Aβ37 또는 Aβ38 에 포함된다. 따라서 상기 방법에서, Aβ 응집 억제제로 사용가능한 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 이용할 수 있다.
본원에서, "외인성" Aβ37 또는 Aβ38 은 생체 이외의 임의의 것으로부터 유래되거나 생체 이외의 다른 곳에서 생성된 Aβ37, Aβ38, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합을 말한다. 이는 또한 Aβ37 또는 Aβ38 이, Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합으로부터 제조된 구현예도 포함한다. 외인성 Aβ37 또는 Aβ38 은 이후 "7. Aβ37 또는 Aβ38" 에서 상세히 설명한다.
Aβ37 또는 Aβ38 생성이 증강되면 Aβ 응집이 억제되므로, 본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ 응집의 억제 방법을 포함한다, 유사하게, Aβ37 또는 Aβ38 의 생성이 증강되면 Aβ 응집이 억제되므로, 본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 Aβ 응집의 억제 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 방법에서, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 이용할 수 있다. 상기 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ38 또는 Aβ39 생성의 증강 효과를 추가로 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 화합물을 생체 또는 그 일부 (예, 뇌) 에 투여하거나 그와 접촉시켜서 Aβ37 및/또는 Aβ38 생성을 증강시키거나 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 및/또는 Aβ38 생성을 증강시킴으로써 Aβ 응집을 억제할 수 있다.
본 발명은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 함유한 Aβ 응집 억제제 및 상기 외인성 Aβ37 또는 Aβ38 을 함유한 Aβ 응집 억제제를 포함하며, 양 억제제 모두 Aβ 응집 억제 방법에 사용되는 것이다.
5. 신경세포 사멸 방지 방법
선행 연구는 Aβ 응집이 신경세포 상의 Aβ 침착을 유도하여 신경세포 사멸을 일으킴을 지적하였다. 본 발명의 발명자들은 Aβ37 의 증강된 생성이 상기 응집 독성과 관계된 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 및 Aβ38 이 Aβ42 응집 억제 효과를 가짐을 확인하였다. 이러한 효과는 Aβ 응집에 의한 신경세포 사멸을 막는다. 따라서, 본 발명은 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ42 에 작용하도록 함을 특징으로 하는 신경세포 사멸 방지 방법을 제공한다. 이 방법에서, Aβ42 에 작용하도록 허용된 Aβ37 또는 Aβ38 은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 작용으로 생성되는 내인성의 것이거나 또는 외인성의 것일 수 있다. 상기 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ38 또는 Aβ39 생성의 증강 효과를 추가로 가질 수 있다. 또한 Aβ37 및 Aβ38 이 동시에 Aβ42 에 작용하도록 할 수 있다. 나아가, 신경세포 사멸을 방지하기 위해, Aβ37 및/또는 Aβ38 이 Aβ40 에 작용하도록 할 수 있다. 본원에서 Aβ37 및/또는 Aβ38 은 Aβ42 에 작용한다고 기재되어 있지만, 이는 Aβ40 에도 유사하게 작용할 수 있다.
상기 "Aβ37 또는 Aβ38 이 Aβ42 에 작용하도록 함" 이란 표현은 Aβ42 를 Aβ37 및/또는 Aβ38 로 처리한다는 의미이다. 이 처리 방법은 제한되지 않고 이 목적상 임의의 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, Aβ42 를 Aβ37 및/또는 Aβ38 과 접촉시키거나, 다르게는 Aβ42 를 Aβ37 및/또는 Aβ38 과 함께 단일계에 놓을 수 있다 (예, 단일 시험관).
상술한 바와 같이, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 작용에 의해 생체 또는 이의 일부에서 생성된 Aβ37 또는 Aβ38 또한 내인성 Aβ37 또는 Aβ38 에 포함된다. 따라서 상기 방법에서, 신경세포 사멸 억제제로 사용가능한 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 이용할 수 있다. 상술한 바와 같이, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 작용에 의해 생체 또는 이의 일부에서 생성된 Aβ37 또는 Aβ38 또한 내인성 Aβ37 또는 Aβ38 에 포함된다. 따라서 상기 방법에서, 신경세포 사멸 억제제로 사용가능한 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 이용할 수 있다.
외인성 Aβ37 또는 Aβ38 은 이후 "7. Aβ37 또는 Aβ38" 에서 상세히 설명한다.
Aβ37 또는 Aβ38 생성이 증강되면 Aβ 응집이 억제되므로, 본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 신경세포 사멸 방지 방법을 포함한다, 유사하게, Aβ37 또는 Aβ38 의 생성이 증강되면 Aβ 응집이 억제되므로, 본 발명은 또한 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 Aβ37) 생성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 신경세포 사멸 방지 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 방법에서, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 이용할 수 있다. 상기 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ38 또는 Aβ39 생성의 증강 효과를 추가로 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 화합물을 생체 또는 그 일부 (예, 뇌) 에 투여하거나 그와 접촉시켜서 Aβ37 및/또는 Aβ38 생성을 증강시키거나 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 및/또는 Aβ38 생성을 증강시킴으로써 신경세포 사멸을 방지할 수 있다.
본 발명은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 함유한 신경세포 사멸 억제제 및 상기 외인성 Aβ37 또는 Aβ38 을 함유한 신경세포 사멸 억제제를 포함하며, 양 억제제 모두 신경세포 사멸 방지 방법에 사용되는 것이다.
상술한 신경세포 (뉴런) 은 중추신경계 세포, 예컨대 뇌-유래 신경세포, 바람직하게는 뇌 피질-유래 신경세포를 포함한다. 더욱 바람직하게, 이들 세포는 포유류 유래의 것이다. 유사하게, 뇌 피질-유래 초대 배양된 신경세포 또한 의도하는 신경세포에 포함된다.
6. 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 동정 또는 스크리닝 방법
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 중에서, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물을, 하기에 나타낸 당업계의 표준 동정 또는 스크리닝 방법을 이용하여 그 Aβ37 생성 증강 효과를 동정함으로써 수득할 수도 있다. 또한 유사하게, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 중에서, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물을, 하기에 나타낸 표준 동정 또는 스크리닝 방법을 이용하여 그 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 동정함으로써 수득할 수도 있다. 이러한 방법을 위해, 적은 수의 후보 화합물을 다루는 소규모 기술로부터 다수의 후보 화합물을 다루는 대규모 기술에 이르기까지 필요에 따라 각종 동정 또는 스크리닝 기술을 조정할 수 있다.
후보 화합물이 Aβ37 생성 증강 효과 또는 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 생물학적 조성물을 후보 화합물로 처리하고, APP 의 단백질분해 생성물인 각 Aβ 의 존재 또는 부재 또는 양의 변화를 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 측정 및 비교할 수 있다. 예를 들어, 각 Aβ 의 존재 또는 부재 또는 그 양의 변화를 면역침전법, ELISA (효소-연결 면역흡착 측정법), 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및 방사면역측정법 등의 표준 항체 측정법을 이용하여 측정할 수 있다. 다르게는, 면역침전법을 MALDI-TOF 또는 MALDI-TOF/MS 와 조합할 수 있다. 이러한 측정법에서, 항체 분자를 직접 검출을 위해 표지하거나 (예컨대, 방사성동위원소, 효소, 형광 물질, 화학발광제를 이용) 또는 결합을 탐지하는 2차 항체 또는 시약과 조합하여 사용할 수 있다 (예, 바이오틴 및 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합 아비딘의 조합, 플루오레세인, 로다민 또는 텍사스 레드 등의 형광 화합물과 결합된 2차 항체). 다르게는, 각 Aβ 를 공지 기술을 이용하여, 예컨대 내부 기준으로 얻은 보정 곡선을 이용한 MALDI-TOF/MS (후술함) 에 의해 정량할 수도 있다.
즉, 본 발명은 이하 "본 발명의 동정 방법" 또는 "본 발명의 스크리닝 방법" 이라고도 부르는 하기 (1) 및 (2) 에 설명한 방법을 제공한다.
(1) 본 발명은 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 하기 동정 또는 스크리닝 방법을 제공한다.
하기를 포함하는 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 또는 스크리닝 방법:
(a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
(b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 측정함;
(c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양과 비교하여 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키는 후보 화합물을 선별함; 및
(d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
본 발명의 상기 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 생성된 Aβ37 의 양을 비교함으로써 수행할 수 있다.
(2) 본 발명은 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 하기 동정 또는 스크리닝 방법을 제공한다.
하기를 포함하는 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 또는 스크리닝 방법:
(a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
(b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ40/42 및 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40/42 및 Aβ37 의 양을 측정함;
(c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40/42 및 Aβ37 의 양과 비교하여, 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ40/42 의 양을 감소시키고 또한 Aβ37 의 양을 증가시키는 후보 화합물을 선별함; 및
(d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
본 발명의 상기 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 생성된 각 Aβ (예, Aβ37, Aβ40, Aβ42) 의 양을 비교함으로써 수행할 수 있다.
또한 상기 방법으로 동정한 화합물은 추가로 Aβ38 또는 Aβ39 생성을 증강시킬 수 있다.
본원에서, "접촉" 이란 용어는 후보 화합물의 작용에 의해 생물학적 조성물 중 Aβ37 을 생성하기 위하여 후보 화합물과 생물학적 조성물이 서로 반응하는 것을 의미한다.
"후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양" 또는 "후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40/42 및 Aβ37 의 양" 이란 표현은 대조군으로서의 역할을 의미한다.
"증가시키다" 란 표현은 대조군과 비교하여 후보 화합물과의 접촉에 의해 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양이 증가하는 것을 의미한다.
"감소시키다" 란 표현은 대조군과 비교하여 후보 화합물과의 접촉에 의해 생물학적 조성물 중의 Aβ40/42 의 양이 감소하는 것을 의미한다.
"생물학적 조성물" 이란 용어는, 재구축된 무세포계, 세포, APP 를 과발현하도록 조작된 유전자도입된 비인간 동물 (이하 "APP 유전자도입된 비인간 동물" 이라 함) 및 비(非)유전자도입된 비인간 동물을 포함하여 γ-세크리타제 및 APP 를 함유한 임의의 조성물을 의미한다. 상기 맥락에서 세포는 중추신경계 세포, 예컨대 뇌-유래 신경세포, 바람직하게는 뇌 피질-유래 신경세포, 더 바람직하게는 뇌 피질-유래 초대 배양된 신경세포를 포함하는 신경세포일 수 있다. 이들 세포는 바람직하게는 포유류 유래의 것이다. 상기 초대 배양된 신경세포 및 APP 유전자도입된 비인간 동물의 상세한 제조 방법은 후술한다. "APP-발현 세포" 란 용어는 내재적으로 APP 를 발현시키는 세포 또는 APP 를 발현하도록 강제된 세포를 의미한다.
본 발명의 목적상, γ-세크리타제 및 APP 는 내인성 또는 외인성일 수 있다. 내인성 γ-세크리타제 및 APP 란 생체 또는 이의 일부로부터 유래된 것을 의미하며, 이는 생체 또는 이의 일부에 포함된 채로 존재하거나 또는 세포 용해물의 γ-세크리타제 및 APP 분획일 수 있다. 세포 용해물은 γ-세크리타제- 및 APP-함유 세포로부터, 예를 들어 저장액 또는 세정제를 이용한 용해, 또는 초음파 파괴 또는 물리적 파괴에 의해 제조할 수 있다. 일부의 경우, 세포 용해물에 칼럼과 같은 정제 수단을 행할 수 있다. 외인성 γ-세크리타제 또는 APP 는, APP 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 벡터 또는 γ-세크리타제를 구성하는 각 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 각 벡터를 이용하여 γ-세크리타제 또는 APP 를 발현하도록 조작된 γ-세크리타제- 또는 APP-발현 세포를 의미한다. 다르게는, 이들 γ-세크리타제- 또는 APP-발현 세포로부터의 세포 용해물의 γ-세크리타제 또는 APP 분획을 의미한다. 세포 용해물은 γ-세크리타제- 및 APP-함유 세포로부터, 예컨대 저장액 또는 세정제에 의한 용해, 또는 초음파 파괴 또는 물리적 파괴에 의해 제조할 수 있다. 일부의 경우, 세포 용해물에 칼럼과 같은 정제 수단을 행할 수 있다. 이 목적을 위해 사용되는 벡터(들)은 세포로 트랜스펙션(transfect)되어 일시적 유전자 발현을 유도하거나, 또는 세포성 게놈에 통합되어 안정적 유전자 발현을 보장할 수 있다. 상기 벡터로 트랜스펙션되는 숙주 세포는 유전자 발현이 가능한 것일 수 있다. 포유류 세포의 예로는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 섬유아세포 및 인간 신경교종 세포가 포함된다.
초대 배양된 신경세포의 제조
상술한 바와 같이, 본 발명에서 생물학적 조성물로서 뇌-유래 신경세포, 바람직하게는 뇌 피질-유래 신경세포, 더 바람직하게는 뇌 피질-유래 초대 배양된 신경세포 등의 중추신경계 세포를 포함하는 신경세포를 사용할 수 있다. 뇌 피질-유래 초대 배양된 신경세포의 제법을 이하 예시하나 그 예에 한정되는 것은 아니다.
임신한 동물 (예, 래트, 마우스) 을 에테르 등으로 마취한 후, 태아 (태령 16 내지 21 일) 를 임신 동물로부터 무균 추출하였다. 상기 태아로부터 뇌를 추출하여 빙냉 L-15 배지에 담갔다. 뇌 피질을 실체현미경 하에 수합하였다. 각 뇌 영역 조각을 트립신 및 DNase 를 함유한 효소 용액으로 효소적으로 처리하여 세포를 흩뜨렸다. 말 혈청 등을 첨가하여 효소 반응을 중단시켰다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 배지를 세포 펠렛에 가했다. 이 목적을 위해 사용된 배지는, 예를 들어 해마 신경세포 배양물 및/또는 중추신경계 세포 배양물 (예, 성인 신경세포 배양물) 의 장기간 보존용으로 개발된 무혈청 배지일 수 있으며, 이에는 신경세포의 장기간 생존을 위한 보조 시약이 보충될 수 있다 (Brewer, G. J., J. Neurosci. Methods, 71, 45, 1997, Brewer, G. J., et al., J. Neurosci. Res., 35, 567, 1993). 예를 들어, 1% 내지 5%, 바람직하게는 2% 의 보조 시약이 보충된 NeurobasalTM 배지 (Invitrogen Corporation) 가 바람직하고, 보조 시약으로서 2% B-27 보충물 (Invitrogen Corporation), 0.5 mM L-글루타민, 항생제 및 항진균제로 보충된 NeurobasalTM 배지 (이하 "Neurobasal/B27" 라고도 함) 가 더욱 바람직하다. 특히 2% B-27 보충물, 25 μM 2-머캅토에탄올 (2-ME), 0.5 mM L-글루타민, 항생제 및 항진균제가 보충된 NeurobasalTM 배지 (이하 "Neurobasal/B27/2ME" 라 함) 가 바람직하다. 상기 세포를 피펫팅으로 다시 흩뜨린 다음 여과하여 세포 응집물을 제거함으로써, 신경세포 현탁액을 얻었다. 신경세포 현탁액을 배지로 희석하고 세포를 배양 플레이트에 균일한 밀도로 접종하였다. 세포를 주어진 조건 (예컨대, 5% CO2, 95% 공기 및 37℃ 의 인큐베이터 대기 하) 하에 1일간 배양한 후, 배지를 새로운 상기 Neurobasal/B27/2ME 로 완전히 교체하였다.
유전자도입된 비인간 동물 모델
상술한 바와 같이, 본 발명에서 APP 유전자도입된 비인간 동물을 생물학적 조성물로 사용할 수 있다. 즉, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물이 Aβ37 생성 증강 효과 또는 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 갖는지 여부를 APP 유전자도입된 비인간 동물 모델을 이용한 시험으로 확인할 수 있다. APP 유전자도입된 비인간 동물 모델은 당업계에 공지되어 있고, [J. Neurosci. 21(2), 372-381, 2001 and J. Clin. Invest., 112, 440-449, 2003] 에 기재된 Tg2576 마우스를 예로 들 수 있다. 즉, Tg2576 마우스를 이용한 시험 절차를 하기에 예로 들겠다.
γ-세크리타제 억제제인 N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸)-L-알라닐]-S-페닐글라이신 t-부틸 에스테르 또는 후보 화합물, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 등을 투여받은 Tg2576 마우스의 뇌, 뇌척수액 또는 혈청 중 각 Aβ 양을 측정함으로써 (J. Pharmacol. Exp. Ther. 305, 864-871, 2003), 상기 화합물이 Aβ37 생성 증강 효과 또는 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 갖는지 여부를 평가할 수 있다.
본 발명에서, APP 유전자도입된 비인간 동물은 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 래빗, 개, 고양이, 염소, 소 또는 말을 포함하여 임의의 종일 수 있다.
비(非)유전자도입된 비인간 동물 모델
상술한 바와 같이, 본 발명에서 비유전자도입된 비인간 동물 모델을 생물학적 조성물로서 사용할 수 있다. 즉, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물이 Aβ37 생성 증강 효과 또는 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 갖는지 여부를 비유전자도입된 비인간 동물을 이용한 시험으로 확인할 수 있다. 예로써, 심바스타틴을 투여받은 기니피그의 뇌척수액 중 Aβ 양의 측정 방법 (PNAS, 98, 5856-5861, 2001) 또는 γ-세크리타제 억제제 LY411575 를 투여받은 래트의 뇌척수액 중 Aβ40 의 양의 측정 방법 (JPET, 313, 902-908, 2005) 에 관한 보고가 있다. 따라서 이러한 방법에 따라, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 투여받은 비유전자도입된 비인간 동물 모델 (예, 기니피그, 마우스, 래트) 의 뇌, 뇌척수액 또는 혈액 중 각 Aβ 의 양을 측정함으로써, 후보 화합물이 Aβ37 생성 증강 효과 또는 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 갖는지 여부를 평가할 수 있다.
본 발명의 동정 또는 스크리닝 방법을 예시하기 위해, MALDI-TOF/MS 를 이용한 예를 하기에 제시한다.
MALDI - TOF / MS [ Matrix - Associated Laser Desorption Ionization - Time of Flight/Mass Spectrometry ] 에 의한 Aβ 분석
본원에서, MALDI-TOF/MS 는 예컨대, [Rong Wang, David Sweeney, Sammuel E. Gangy, Sangram S. Sisodia, J. of Biological Chemistry, 271, (50), 31894-31902, 1996, Takeshi Ikeuchi, Georgia Dolios, Seong-Hun Kim, Rong Wang, Sangram S. Sisodia, J. of Biological Chemistry, 278, (9), 7010-7018, 2003, Sascha Weggen, Jason L. Erikson, Pritam Das, Sarah Sagi, Rong Wang, Claus U. Pietrzik, Kirk A. Findlay, Tawnya E. Smith, Michael P. Murphy, Thomas Bulter, David E. Kang, Numa Marquez-sterling, Todd E. Golde, Edward H. Koo, Nature, 414, 212-216, 2001, and Masayasu Okochi, et al., Idenshi Igaku (Gene Medicine), Vol. 7 (1), 12-16, 2003] 에 기재된 대로 수행할 수 있다. 더 구체적으로, MALDI-TOF/MS 를 다음과 같이 수행할 수 있다.
MALDI-TOF/MS 분석에 있어서, 중추신경계, 바람직하게는 뇌-유래 세포, 바람직하게는 뇌 피질-유래 신경세포, 더 바람직하게는 뇌 피질-유래 초대 배양된 신경세포를 사용할 수 있다. 뇌를 비인간 동물로부터 추출하여 추출된 뇌로부터 통상적 방법으로 신경세포를 준비할 수 있다. 이 목적을 위해 사용되는 배지는, 예를 들어 해마 신경세포 배양물 및/또는 중추신경계 세포 배양물 (예, 성인 신경세포 배양물) 의 장기간 보존을 위해 개발된 무혈청 배지로서, 이에는 신경세포의 장기간 생존을 보장하기 위해 보조 시약이 보충될 수 있다 (Brewer, G. J., J. Neurosci. Methods, 71, 45, 1997, Brewer, G. J., et al., J. Neurosci. Res., 35, 567, 1993). 예컨대, 1% ~ 5%, 바람직하게는 2% 의 보조 시약 및 10 ~ 30 μM, 바람직하게는 25 μM 의 2-머캅토에탄올 (2-ME) 이 보충된 NeurobasalTM 배지 (Invitrogen Corporation) 가 그 예이다. 2% B-27 보충물 (Invitrogen Corporation), 25 μM 2-머캅토에탄올 (2-ME), 0.5 mM L-글루타민, 항생제 및 항진균제 (Neurobasal/B27/2ME) 가 보충된 NeurobasalTM 배지 (Invitrogen Corporation) 가 바람직하다. 측정에 사용하기 위해서, 상기 배지는 2-ME 가 없는 것이 바람직하다 (Neurobasal/B27). 세포 배양 수 일 후, 배지를 제거하고 Neurobasal/B27 로 대체한다. 이어서 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO (디메틸 술폭사이드)) 중의 후보 화합물을 Neurobasal/B-27 로 희석하고 세포에 가한 후 혼합한다. 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO) 의 최종 농도를 바람직하게는 1% 이하로 유지한다. 반면 대조군에는 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO) 만을 투여할 수 있다. 후보 화합물 또는 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO) 의 존재 하에 수 일간 배양한 후, 배지 전체 부피를 MALDI-TOF/MS 시료로 사용할 수 있다. 세포 생존율은 공지 방법, 예컨대 후술하는 MTT 측정법으로 평가할 수 있다.
다음으로, Aβ 절편을 예컨대 면역침전법으로 수합할 수 있다. 각 샘플링된 배양 상청액을 수합 및 원심분리하여 세포 절편을 침전시켰다. 상청액에 내부 기준으로서 당업자가 입수할 수 있는 합성 Aβ (예, 합성 Aβ12-28 (Bachem)) 를 보충할 수 있다. 상기 상청액에 당업자가 입수할 수 있는 목적하는 항-Aβ 항체 (바람직하게는 항-Aβ 단일클론 항체, 예컨대 상표명 4G8 클론, Signet Laboratories, Inc) 를 추가로 보충한 후, 통상의 절차에 따라 BSA 등으로 블로킹(block)된 단백질 G- 및/또는 단백질 A-결합 수불용성 수지, 예컨대 세파로스 또는 아가로스 (예, 단백질 G + 단백질 A 아가로스) 를 첨가 및 혼합한다, 이 목적상 사용되는 항-Aβ 항체는 항인간 Aβ 단일클론 항체일 수 있다. 시판되는 항인간 Aβ 단일클론 항체를 사용할 수 있지만, 당업자라면 그러한 항체를 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 동물 (예, 마우스) 을 우선 항원으로서 Aβ 에 공통인 서열로 1 내지 3회 면역화하고, 상기 동물로부터 면역적격 세포를 수합하고 세포 융합 또는 기타 기술로 불멸화하여 단일클론 항체-생성 세포를 수득한다. 수득한 단일클론 항체-생성 세포를 누드 마우스 등에 복막내로 투여한다. 관심 대상 단일클론 항체를 수합된 복막액으로부터 수득할 수 있지만, 항체 제조는 상기 방법에 한정되지 않는다. 항원으로 사용되는 Aβ 서열은 당업자가 적절히 선택가능하다. 또한 항원으로 사용되는 펩티드 단편은 자연 발생적인, 자동 합성기로 합성된, 생화학적으로 APP 로부터 제조된, 혹은 시판되는 펩티드일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
단백질 G- 및/또는 단백질 A-결합 수불용성 수지 (예, 단백질 G + 단백질 A 아가로스) 를 이용한 수합, 통상의 방식으로 세척 및 Aβ 용출에 의해 면역침전된 Aβ 절편을 수득할 수 있다. 용출은 다음과 같이 수행가능하다: 이온교환수로 세정 후, 가능한 한 다량의 액체를 제거하고 Aβ 를 예컨대 0.2% NOG, 2.4% 트리플루오로아세트산 (TFA; PIERCE) 및 48.7% 아세토니트릴 (HPLC 등급, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 함유 용액으로 용출한다. 그러나 용출은 상기 방법에 한정하지 않고 당업자라면 공지 기술을 토대로 Aβ 를 용출시킬 수 있다.
각 Aβ 용출액 및 매트릭스 용액을 질량 분석용 시료 플레이트 상의 동일 위치에 스포팅(spot)하고 실온에서 자연건조시킨 후 질량 분석기로 분석한다. 이 목적상 사용하는 매트릭스 용액은 MALDI-TOS/MS 에 흔히 사용되는 용액, 예컨대 α-시아노-4-히드록시-신남산 (CHCA; BRUKER DALTONICS) 을 포화 농도로 0.2% NOG, 0.1% TFA 및 33% 아세토니트릴에 용해한 다음 인슐린 및 안지오텐신 III 을 질량 표준으로서 그에 첨가하여 제조되는 것일 수 있다. 이러한 물질 외에, 분자량이 분석 대상인 각 Aβ 의 분자량 범위 (약 3,000 ~ 4514) 바깥인 한 임의의 펩티드 또는 화합물을 질량 표준으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 인슐린은 ω-아가톡신 TK (분자량: 5273.0), 인간 아드레노메듈린 2 (분자량: 5100.7) 등으로 대체가능하고, 안지오텐신 III 은 안지오텐신 II (분자량: 1046.2), 인간 엔도키닌 D (분자량: 1574.8) 등으로 대체가능하다.
당업자라면 측정 기계를 위한 작동 절차에 따라 MALDI-TOF/MS 에 의해 Aβ 측정을 용이하게 수행할 수 있다. 이용가능한 기계의 예로는, Voyager-DE (Applied Biosystems), AXIMA (SHIMADZU BIOTECH), ultraflex TOF/TOF (Bruker Daltonics), Ettan MALDI-ToF Pro (amershambiosciences), 및 prOTOF2000 (PerkinElmer) 이 포함되나 이에 한정하지 않는다.
MALDI-TOF/MS 으로 검출된 모든 질량 데이타는 질량 표준의 이론적 질량값으로 교정할 수 있다. MALDI-TOF/MS 의 결과로서, 개별 피크를 스프트웨어로 처리하여 데이타베이스로부터 그 대응 펩티드를 확인할 수 있다. 또한 각 검출 피크의 강도를 수치로 출력하여 이 값을 내부 기준에 대해 정규화할 수 있다. 이렇게 얻은 수치를 각 개별 피크에 대응하는 펩티드의 측정 수준으로 이용할 수 있다.
Aβ37 의 양이 후보 화합물의 존재시에 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO) 만 존재할 때에 비해 증가할 경우, 그 후보 화합물을 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로 동정할 수 있다.
다르게는, 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO) 만 존재할 때에 비해 후보 화합물의 존재시 Aβ40/42 의 양이 감소하고 Aβ37 의 양이 증가한다면, 그 후보 화합물을 Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로 동정할 수 있다.
Aβ 의 분석 및 Aβ 의 응집 능력 분석 방법
상술한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ 응집을 억제할 수 있다. 따라서 본원에서, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 존재 하에 Aβ 의 응집 능력을, Aβ 분석을 위한 하기 방법에 의해 검출, 확인 또는 분석할 수 있다.
Aβ 의 β-시트 구조 형성에 의해 유도된 215 ~ 260 nm 에서의 원편광 이색성 (CD) 스펙트럼의 변화로 Aβ 응집을 조사할 수 있다. Aβ 가 α-헬릭스 또는 β-시트 구조를 형성하면 215 ~ 260 nm 에서의 CD 스펙트럼이 감소한다. 특히 β-시트 구조의 형성은 약 220 nm 부근의 CD 스펙트럼의 감소를 유발하는 것으로 알려져 있다.
다른 구현예에서, 용액 내 Aβ 응집에 대한 간단한 조사를 위해 티오플라빈 T (ThT) 를 Aβ 의 형광 측정에 사용할 수 있다. Aβ-함유 용액에 1 내지 100 μmol/L, 바람직하게는 1 내지 20 μmol/L, 더 바람직하게는 10 μmol/L 의 ThT 를 보충한 직후, 여기 파장 450 nm 및 방출 파장 490 nm 에서 형광을 측정할 수 있다 (Wall J., Schell M., Murphy C., Hrncic R., Stevens F.J., Solomon A. (1999) Thermodynamic instability of human lambda 6 light chains: correlation with fibrillogenicity. Biochemistry . 38(42), 14101-14108). 이 경우 Aβ 응집을 억제할 수 있는 화합물은, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물이 없을 때에 비해 약 220 nm 부근의 CD 스펙트럼의 감소를 방지하거나 ThT 의 존재시 ThT 의 형광 강도의 증가를 방지하는 화합물이다. 본 발명의 동정 또는 스크리닝 방법에서, Aβ 의 응집 능력 감소를 지표로 사용할 수 있다.
Aβ 의 세포 독성 탐지 방법
Aβ 는 β-시트 구조로 전환되면 Aβ 섬유 덩어리를 형성하는 경향이 있고 이는 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ 응집을 억제할 수 있다. 즉, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 β-시트 구조의 형성을 억제하여 Aβ 의 세포 독성을 감소시킬 수 있다. 따라서 본 발명에서, 후보 화합물 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물에 의해 유도된 Aβ 독성의 감소를 탐지하기 위하여, Aβ 를 중추신경계 세포, 바람직하게는 뇌-유래 세포, 바람직하게는 뇌 피질-유래 신경세포, 더 바람직하게는 뇌 피질-유래 초대 배양된 신경세포, 또는 별아교세포와 같은 아교세포, 또는 PC12 등의 확립된 세포주에 첨가한 다음, 세포 손상 측정의 공지된 기술을 이용하여 탐지할 수 있다 (예, MTT 측정법, 또는 LDH 수준, 알라마 블루 또는 트리판 블루를 지표로 이용한 세포 손상 측정법). 이들 세포에 첨가되는 Aβ 는 전장 Aβ 또는 각 Aβ (Aβ37, Aβ38, Aβ40 또는 Aβ42) 가 가능하다. 그 서열이 β-시트 구조를 형성할 수 있는 한 임의 길이의 Aβ 를 이용할 수 있다. 또한 이 목적상 이용되는 Aβ 는 자연 발생적인 것, 완전 합성 또는 부분 합성 (즉, 일부가 자연 발생적인 Aβ 로부터 유래함) 의 것일 수 있다. 자연 발생적인 Aβ 는 당업계에 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 세포에 첨가할 각 Aβ 를, 예컨대 10 mM NaOH 용액에 100 ㎍/ml 로 용해하고, 5 분 후 인산염 완충 식염수 (PBS) 로 500 μM 로 희석할 수 있다.
MTT 측정법은, 각 Aβ 의 존재 하에 MTT 를 이용하여 상기 초대 배양된 신경세포의 세포 독성을 측정한 다음 대조군 (Aβ-미처리 군) 에 대한 비율을 계산함으로써 세포 생존 활성을 비교 및 평가할 수 있게 한다. 예를 들어, 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드 (MTT; SIGMA) 용액을 1 내지 3 일 생장시킨 초대 배양된 신경세포의 배지에 최종 농도 0.4 내지 0.8 mg/ml 로 첨가한다. 37℃ 에서 20 분 내지 1 시간 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 비히클 (예, 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO) 에 용해하고 그 흡광도 (550 nm) 를 측정한다. 이 목적상 사용되는 배지는 예컨대 Neurobasal/B27/2ME 가 바람직하다.
본 발명의 동정 또는 스크리닝 방법에 의해 수득한 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물은 Aβ37 생성 증강 효과 또는 Aβ40/42 생성 억제 및 Aβ37 생성 증강 효과를 가지며; 이는 알츠하이머병 및 다운 증후군과 같은 Aβ-기초 질환의 치료에 유용하다.
7. 외인성 Aβ37 또는 Aβ38
(1) Aβ37 및 Aβ38
본 발명은 각각 Aβ37, Aβ38, 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 Aβ 응집 억제제 및 신경세포 사멸 억제제를 제공한다. 즉, 본 발명은 각각 Aβ37, Aβ38, 이의 변이체, 이의 절편, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합 (이하 "본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물" 이라고도 함) 을 포함하는 Aβ 응집 억제제 및 신경세포 사멸 억제제를 제공한다. 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물에 있어서, Aβ37 은 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다. 마찬가지로, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물에 있어서, Aβ38 은 바람직하게는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다. Aβ37 및 Aβ38 은 이의 염 또는 용매화물 형태일 수 있고, 이들 염 및 용매화물 형태는 본 발명에 사용되는 펩티드 또는 그 동등물의 범위내이다.
인간형 Aβ37
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG (SEQ ID NO: 12)
마우스형 Aβ37
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG (SEQ ID NO: 14)
래트형 Aβ37
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG (SEQ ID NO: 16)
인간형 Aβ38
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG (SEQ ID NO: 18)
마우스형 Aβ38
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG (SEQ ID NO: 20)
래트형 Aβ38
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG (SEQ ID NO: 22)
본원에서 "변이체" 란 용어는 Aβ37 또는 Aβ38 와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 펩티드를 의미한다. 그러한 변이체는 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물에 포함된다. 상기 변이체는 이의 염 또는 용매화물 형태일 수 있으며, 이들 염 및 용매화물 형태 또한 상기 변이체의 범위내이다.
본원에서 "실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 펩티드" 란 표현은 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드) 로부터 하나 이상의 (바람직하게는 하나 또는 수개의) 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열로 이루어지고, Aβ 응집 억제 효과를 갖는 펩티드를 의미한다. 결실, 치환, 삽입 또는 첨가될 수 있는 아미노산 수는, 예를 들어 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 특히 바람직하게는 1 또는 2 이다.
본원에서 "치환" 이란 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드의 활성을 실질적으로 변화시키지 않고 다른 화학적으로 동등한 아미노산 잔기로 대체됨을 의미한다. 그 예로는 하나의 소수성 잔기가 다른 소수성 잔기로 대체되는 것, 하나의 극성 잔기가 동일한 전하의 다른 극성 잔기로 대체되는 것 등이 포함된다. 이들 치환을 가능케하는 기능적으로 동등한 아미노산은 각 아미노산에 대해 당업계에 공지되어 있다. 더 구체적으로, 비극성 (소수성) 아미노산의 예로는 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌 및 메티오닌이 포함된다. 극성 (중성) 아미노산의 예로는 글라이신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 글루타민, 아스파라진 및 시스테인이 포함된다. 양전하 (염기성) 아미노산의 예로는 알지닌, 히스티딘 및 라이신이 포함된다. 마찬가지로, 음전하 (산성) 아미노산의 예로는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다.
본원에서 "절편" 이란 용어는 Aβ37 또는 Aβ38 의 부분적 아미노산 서열로 이루어지고 Aβ 응집 억제 활성을 갖는 펩티드를 의미한다. 더 구체적으로, "절편" 이란 용어는 Aβ37 또는 Aβ38 (바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드) 또는 이의 변이체의 부분적 아미노산 서열로 이루어지고 Aβ 응집 억제 활성을 갖는 펩티드를 의미한다. 이 경우, 부분 아미노산 서열로 이루어진 상기 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 예를 들어 1 내지 15, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 7, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5 이다. 상기 절편은 이의 염 또는 용매화물 형태일 수 있고, 이들 펩티드 또한 상기 절편의 범위 내이다. 이들 절편은 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물은 당사슬(들)이 포함 및 포함되지 않은 것도 추가로 포함한다. 따라서 이들 조건을 만족하는 한, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물의 유래는 인간, 마우스 또는 래트에 한정되지 않고; 비-인간, 비-마우스 및 비-래트 포유류에서 유래된 펩티드도 포함된다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물은 다양한 공지 방법으로 수득가능하다. 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물은 자연 발생적인 것 또는 완전 합성된 것일 수 있다. 또한 부분 합성, 즉 자연 발생적인 펩티드로부터 부분적으로 유래된 것일 수 있다. 자연 발생적인 펩티드의 경우, 생체로부터 세포를 배양한 후 공지 방법, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 세포 및 상청액 분획으로 분리한 다음 상청액 분획을 수합할 수 있다. 상기 배양 상청액에 포함된 펩티드 또는 그 동등물을 공지된 분리 및 정제 기술 (필요에 따라 병용함) 로써 정제할 수 있다. 한편, 합성 펩티드는 통상의 기술, 예컨대 보통 자동 합성기를 이용하는 액상 및 고상 기술에 따라 합성할 수 있다. 이들 펩티드의 화학적 개질 생성물을 통상의 방법으로 합성할 수 있다.
다르게는, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 유전공학적 방법 및/또는 생화학적 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 유전공학적 방법 및/또는 생화학적 방법을 이용할 경우, APP 를 β- 및 γ-위치에서 각각 β- 및 γ-세크리타제로 절단하여 가공함으로써 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 수득가능하다. 더 구체적으로, 생체 또는 APP 유전자도입된 비인간 동물로부터 통상의 방법으로 제조된 APP-발현 세포 또는 이의 세포막 절편을 적절한 단백질분해효소, 바람직하게는 β- 및 γ-세크리타제로 처리하여 원하는 Aβ 종을 생성한다. 이 경우 상술한 목적 펩티드 또는 이의 동등물의 효율적 생성을 보장하기 위해 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 사용할 수도 있다.
(2) Aβ37 및 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 다른 구현예에 따르면, Aβ37 또는 Aβ38 을 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 즉, Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합으로부터 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 생성된 형질전환주를 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양한 후, 발현된 단백질의 분리 및 정제에 흔히 이용되는 기술로 상기 배양물로부터 원하는 펩티드를 분리 및 정제하여 Aβ37 또는 Aβ38 을 제조할 수 있다 (Sambrook and Russell, Molecular Cloning, 3rd edition, CSHL Press). 다르게는, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 래빗 망상적혈구 용해물 또는 E. coli 용해물을 이용하여 무세포 시스템을 기반으로 한 이른바 시험관내 번역 방법에 적용하여 Aβ37 또는 Aβ38 을 제조할 수 있다 (예, "Rapid Translation System" (Roche Applied Science), "Proteios" (TOYOBO)).
본원에서, "Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 란 표현은 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 즉 하기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드:
바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드, 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드,
더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드,
또는 이의 변이체,
또는 이의 절편,
또는 상기 폴리뉴클레오티드의 염 또는 이의 용매화물 또는 이의 조합을 말한다 (이하 "본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물" 이라고도 함). 상술한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물은 이의 염 또는 용매화물 형태일 수 있으며, 이들 염 및 용매화물 형태 또한 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물 범위내인 것으로 본다.
SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 동족체 또는 이의 염 또는 이의 용매화물일 수 있다.
유사하게, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물에 포함되는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드의 동족체, SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드의 동족체, 또는 상기 동족체의 염 또는 이의 용매화물일 수 있다.
유사하게, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물에 포함되는 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드의 일부, SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드의 일부, 또는 상기 부분 폴리뉴클레오티드의 염 또는 이의 용매화물일 수 있다.
본원에서 "폴리뉴클레오티드" 란 용어는 DNA 또는 RNA 를 포함한다.
인간형 Aβ37
Figure 112007080232949-PCT00004
마우스형 Aβ37
Figure 112007080232949-PCT00005
래트형 Aβ37
Figure 112007080232949-PCT00006
인간형 Aβ38
Figure 112007080232949-PCT00007
마우스형 Aβ38
Figure 112007080232949-PCT00008
래트형 Aβ38
Figure 112007080232949-PCT00009
본원에서, "동족체" 란 용어는 Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그러한 동족체는 이의 염 또는 용매화물 형태일 수 있으며, 이들 염 및 용매화물 형태 또한 상기 동족체의 범위 내인 것으로 본다. 상기 동족체는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물에 포함된다.
본원에서 "혼성화하는 폴리뉴클레오티드" 란 표현은, 엄격한 조건 하에, Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는 SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열) 과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 엄격한 조건의 예로는, "2×SSC, 0.1% SDS, 50℃", "2×SSC, 0.1% SDS, 42℃" 및 "1×SSC, 0.1% SDS, 37℃" 가 포함되고, 더욱 엄격한 조건의 예로는, "2×SSC, 0.1% SDS, 65℃", "0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃" 및 "0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃" 가 포함된다. 더 구체적으로, Rapid-Hyb 완충제 (Amersham Life Science) 를 이용할 경우, 다음과 같은 조건이 고려된다: 68℃ 에서 30 분 이상 예비-혼성화, 68℃ 에서 프로브 존재 하에 1 시간 이상 혼성화, 이후 2×SSC, 0.1% SDS, 실온에서 20분간 3 회, 1×SSC, 0.1% SDS, 37℃ 에서 20 분간 3회 및 마지막으로 1×SSC, 0.1% SDS, 50℃ 에서 20 분간 2회 세정함. 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 예로는 SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상 (예, 95% 이상) 의 상동성을 지닌 뉴클레오티드 서열을 함유한 것이 포함된다.
상기 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 GenBank 등록번호는 다음과 같다: 인간 Aβ37 의 경우 NM_000484 (뉴클레오티드 서열) 및 NP_000475 (아미노산 서열); 마우스 Aβ37 의 경우 NM_007471 (뉴클레오티드 서열) 및 NP_031497 (아미노산 서열); 래트 Aβ37 의 경우 NM_019288 (뉴클레오티드 서열) 및 NP_062161 (아미노산 서열); 인간 Aβ38 의 경우 NM_000484 (뉴클레오티드 서열) 및 NP_000475 (아미노산 서열); 마우스 Aβ38 의 경우 NM_007471 (뉴클레오티드 서열) 및 NP_031497 (아미노산 서열); 및 래트 Aβ38 의 경우 NM_019288 (뉴클레오티드 서열) 및 NP_062161 (아미노산 서열).
본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물은 예컨대 자연 발생적이거나 또는 완전 합성된 것일 수 있다. 또한 부분 합성, 즉 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드로부터 부분 유래된 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 수득하기 위한 통상적 방법에는, 유전공학 기술에 흔히 이용되는 기술, 예컨대 부분 아미노산 서열 정보를 토대로 설계된 적당한 DNA 프로브를 이용하여 시판되는 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝 하는 것이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물로 암호화된 펩티드는 Aβ 응집 억제 효과를 가진다. 그러한 Aβ 응집 억제 효과는 "6. 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 동정 또는 스크리닝 방법" 에 상술한 Aβ 의 응집 능력 분석 방법으로 확인할 수 있다. Aβ 응집은 Aβ 침착으로써 신경세포의 세포 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 상기 펩티드를 암호화하는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 또한 Aβ 응집 억제제 또는 신경세포 사멸 억제제로 이용할 수도 있다.
Aβ 응집 억제제 또는 신경세포 사멸 억제제로 사용하기 위해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 단독으로 사용하거나 또는 적절한 벡터에 삽입하거나 시그널 서열 또는 폴리펩티드-안정화 서열 등의 추가적 서열에 연결할 수 있다.
이 목적상, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 센다이(Sendai) 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지미드, 및 코스미드를 포함하는 공지 벡터를 이용할 수 있다.
8. 약학 조성물
본 발명은 Aβ-기초 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 질환의 치료를 요하는 포유류에, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량을 투여함으로써 수행할 수 있다. 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유한 약학 조성물을 포함한다.
다르게는, 상기 질환의 치료를 요하는 포유류에, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물, 즉 Aβ37 또는 Aβ38, 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 펩티드의 변이체 또는 이의 절편, 또는 이의 염 또는 이의 용매화물 또는 이의 조합의 유효량을 투여함으로써 본 발명의 Aβ-기초 질환 치료 방법을 수행할 수 있다.
다르게는, 상기 질환의 치료를 요하는 포유류에, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물, 즉 Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합의 유효량을 투여함으로써 상기 방법을 수행할 수 있다. 상기 목적상 이용되는 Aβ37 또는 Aβ38 은 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 함유한 펩티드, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 14 또는 16 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 SEQ ID NO: 18, 20 또는 22 중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 펩티드의 변이체 또는 이의 절편이다.
상기 방법에서, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물은 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 17, 19 또는 21 중 임의의 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 동족체, 또는 이의 염 또는 이의 용매화물 또는 이의 조합이며, 이를 유효량으로 투여할 수 있다.
본 발명은 활성 성분으로서 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 함유한 약학 조성물을 포함한다.
본원에서, "본 발명의 약학 조성물" 이란 표현은, 활성 성분으로서 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 함유한 약학 조성물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물은 Aβ-기초 질환의 치료제로 유용하다.
활성 성분으로의 사용을 위해, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물은 전구약물 형태를 취할 수 있다
본원에서 "전구약물" 이란 용어는 "약물의 활성 종" (전구약물과 관련하여 "약물" 을 의미함) 의 불활성 형태를 의미하며, 이는 생체이용률을 향상시키고 부작용을 줄이는 등의 목적으로 화학적으로 개질된 것이다. 전구약물은 채내에 흡수된 후 활성 종으로 대사되어 그 효능을 발휘하게 된다. 따라서 "전구약물" 이란 용어는 해당 "약물"보다는 내재 활성이 적지만 생물계에 투여되면 자발적인 화학 반응, 효소-촉매 반응 또는 대사 반응의 결과로 "약물" 물질을 만드는 임의의 화합물, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 상기 목적상, 다양한 유형의 전구약물, 예컨대 화합물, 펩티드 및 폴리뉴클레오티드 및 상술한 것으로부터 아미노, 히드록실 및/또는 카르복실기의 아실화, 알킬화, 인산화, 붕산화, 탄산화, 에스테르화, 아미드화 또는 우레탄화(urethanization) 에 의해 유도된 그 동등물을 예로 들 수 있다. 그러나 이들 예는 예시적일 뿐이며 포괄적인 것은 아니다. 당업자라면 화합물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 상기 그 동등물로부터 공지 방법으로 각종 다른 공지의 전구약물을 제조할 수 있다. 화합물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 상기 그 동등물로부터 제조된 전구약물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서, "Aβ-기초 질환" 이란 용어는 알츠하이머병 (AD) (예컨대, 문헌 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 참조); 알츠하이머 유형의 노인성 치매 (SDAT), 노인성 치매 (예컨대, 문헌 9 참조); 전측두엽 치매 (예컨대, 문헌 10 참조); 픽병(Pick's disease) (예, 문헌 11 참조); 다운 증후군 (예, 문헌 12 및 13 참조); 뇌혈관 병증 (예, 문헌 14, 15, 16 및 17 참조); 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈 (네덜란드형) (예, 문헌 18, 19, 20 및 21 참조); 인지장애 (예, 문헌 22 참조); 기억장애, 학습 장애 (예, 문헌 23, 24 및 25 참조); 아밀로이드증, 뇌허혈증 (예, 문헌 22, 26 및 27 참조); 뇌혈관성 치매 (예, 문헌 28 참조); 안근마비 (예, 문헌 29 참조); 다발성 경화증 (예, 문헌 30 및 31 참조); 두부외상 (예, 문헌 32 참조); 행위상실증 (예, 문헌 33 참조); 프리온병, 가족성 아밀로이드 신경병증, 삼염기반복 질환(triplet repeat disease) (예, 문헌 34, 35 및 36 참조); 파킨슨병 (예, 문헌 37 참조), 루이소체를 동반한 치매 (예, 문헌 38, 39, 40 및 37 참조); 파킨슨증-치매 복합증 (예, 문헌 41 및 42 참조); 염색체 17 에 관계된 전측두엽 치매-파킨슨증 (예, 문헌 43 참조); 호은성 결정(argyrophilic grain)을 동반한 치매 (예, 문헌 44 참조); 니만픽(Niemann-Pick)병 (예, 문헌 45 참조); 근위축성 측삭 경화증 (예, 문헌 46, 47, 48 및 49 참조); 뇌수종 (예, 문헌 50, 51, 52, 53 및 54 참조); 대부전 마비 (예, 문헌 29, 33, 55 및 56 참조); 진행성 핵상마비 (예, 문헌 40 및 37 참조); 뇌출혈 (예, 문헌 57 및 58 참조); 경련 (예, 문헌 59 참조); 경도인지장애 (예, 문헌 60 및 61 참조); 및 동맥경화증 (예, 문헌 62 참조) 을 포함하는 매우 다양한 질병을 포괄한다.
본원에서, "Aβ-기초 질환" 이란 표현은 바람직하게는 알츠하이머병, 알츠하이머형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 또는 아밀로이드증이다.
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본원에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료" 란 용어는 일반적으로 목적하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미한다. 그 효과는 질병 및/또는 그 증상을 완전 또는 부분적으로 방지하는 면에서 예방적이고, 질병 및/또는 그 증상에 기인하는 불리한 작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료" 란 용어는 포유류, 특히 인간의 질병에 대한 임의의 치료를 포괄하며, 하기 (a) 내지 (c) 를 포함한다:
(a) 질병 또는 증상의 소인이 있는 것으로 의심은 되나 아직 이를 갖는 것으로 진단받지 않은 환자에게서 그 질병 또는 증상이 발병하는 것을 방지함;
(b) 질병/증상을 억제함, 즉 그 진행을 저지하거나 또는 늦춤; 및
(c) 질병/증상을 경감시킴, 즉 질병 또는 증상을 후퇴시키거나 증상의 진행을 되돌림.
본 발명의 약학 조성물, 바람직하게는 본 발명의 Aβ-기초 질환 치료제를 경구 또는 비경구 경로 (예, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 투여, 직장내 투여, 경피 투여) 에 의해 인간 또는 비-인간 포유류에 다양한 형태로 투여할 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 함유한 약학 조성물을, 투여 경로에 따라 통상 이용되는 방법으로 약학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 적당한 투여 형태로 제형화하거나 혹은 단독으로 사용할 수 있다.
바람직한 투여 형태의 예로는, 경구 제형물의 경우 정제, 분말, 미세 과립, 과립, 코팅 정제, 캡슐, 시럽 및 및 트로키제, 및 비경구 제형물의 경우 흡입제, 좌제, 주사제 (점적약 포함), 연고, 안약, 안연고, 점비제, 점이제, 습포제, 로션 및 리포솜이 포함된다.
이들 제형물의 제형화에 사용되는 담체로서, 예컨대 통상의 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 착색제 및 조정제(corrective)를, 필요에 따라 안정화제, 유화제, 흡수제, 세정제, pH 조절제, 방부제, 항산화제, 증량제, 습윤제, 계면 활성제, 분산제, 완충제, 보존제, 용매 보조제, 진정제(soothing agent) 등과 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로 약학 제형물의 원료 물질로 사용되는 성분들을 첨가함으로써 이들 제형물을 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 사용가능한 상기 비독성 성분의 예로는 동물성 및 식물성 오일 (예, 대두유, 우지, 합성 글리세라이드); 탄화수소 (예, 액체 파라핀, 스쿠알란, 경질 파라핀); 에스테르 오일 (예, 옥틸도데실 미리스테이트, 이소프로필 미리스테이트); 고급 알코올 (예, 세토스테아릴 알코올, 베헤닐 알코올); 규소 수지; 실리콘 오일; 세정제 (예, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블로킹 공중합체); 수용성 중합체 (예, 히드록시에틸셀룰로스, 폴리아크릴산, 카복시비닐 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로스); 저급 알코올 (예, 에탄올, 이소프로판올); 다가 알코올 (폴리올) (예, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜); 당류 (예, 글루코스, 수크로스); 무기 분말 (예, 규산 무수물, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 알루미늄 실리케이트); 무기 염 (예, 소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트); 및 정제수가 포함된다.
부형제의 예로는, 락토스, 프럭토스, 옥수수 전분, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 소르빗, 결정질 셀룰로스, 및 이산화규소가 포함된다. 결합제의 예로는, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 아라비아검, 트라가칸쓰(tragacanth), 젤라틴, 셀락, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌 글리콜-폴리옥시에틸렌 블로킹 중합체, 및 메글루민이 포함된다. 붕해제의 예로는, 전분, 한천, 분말 젤라틴, 결정질 셀룰로스, 칼슘 카보네이트, 소듐 하이드로겐 카보네이트, 칼슘 시트레이트, 덱스트린, 펙틴, 및 카복시메틸 셀룰로스 칼슘이 포함된다. 윤활제의 예로는, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 실리카, 및 수소화 식물성 오일류가 포함된다. 착색제의 예로는 약학 제제에의 사용이 허용된 것이 포함된다. 조정제의 예로는, 코코아분말, 멘톨, 방향 분말, 페퍼민트오일, 보르네올, 및 계피 분말이 포함된다. 상술한 성분들은 이의 염 또는 용매화물 형태일 수 있다.
경구 제형물의 경우, 예를 들어 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물에 부형체 및, 필요에 따라 결합제, 붕해제, 윤활제, 착색제 및/또는 조정제 등의 추가 성분을 보충한 다음 통상적 방법에 의해 분말, 미세 과립, 과립, 정제, 코팅 정제, 캡슐 등으로 제형화할 수 있다. 물론 정제 및 과립을 필요에 따라 당 코팅 등으로 적절하게 추가로 코팅할 수 있다. 예컨대 시럽 및 주사용 제형물의 경우, pH 조절제, 가용화제, 등장화제 등을 필요에 따라 용매 보조제, 안정화제 등과 조합하여 첨가한 후 통상의 방법으로 제형화할 수 있다. 외용제의 경우, 그 제법은 어떠한 방식으로든 한정되지 않고 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 외용제에 사용되는 기제 성분으로는 약학 제제, 의약외품, 화장품 등에 흔히 사용되는 각종 물질을 사용할 수 있으며, 동물성 및 식물성 오일, 미네랄 오일, 에스테르 오일, 왁스, 고급 알코올, 지방산, 실리콘 오일, 세정제, 인지질, 알코올, 다가 알코올, 수용성 중합체, 점토광물, 정제수 등을 예로 들 수 있다. 필요에 따라, pH 조절제, 항산화제, 킬레이트제, 방부제 및 항진균제, 착색제, 풍미제 등을 포함할 수도 있다. 필요에 따라, 혈류 자극제, 살균제, 소염제, 세포-활성화제, 비타민, 아미노산, 보습제 및 각질용해제 등의 다른 성분들도 포함할 수 있다. 이 경우, 담체에 대한 활성 성분의 비율은 1% 내지 90 중량% 로 가변적이다. 상기 치료에 사용할 경우, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 90% 이상 순도, 바람직하게는 95% 이상 순도, 더욱 바람직하게는 98% 이상 순도, 보다 더 바람직하게는 99% 이상 순도로 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물은, Aβ-기초 질환 증상이 있는 환자에게 통상의 방식으로 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물의 유효량을 투여하고 상기 펩티드가 생체내에서 발현되도록 함으로써 상기 환자의 유전자 치료를 가능케한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 세포에 도입하여 세포내에서 상기 펩티드가 발현되게 한 다음, 상기 세포를 환자에 이식하여 Aβ-기초 질환을 치료할 수 있다. 다르게는, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 치료에 사용할 경우, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 단독으로 사용하거나 또는 시그널 서열 또는 폴리펩티드-안정화 서열 등의 추가적 서열에 연결하거나 또는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터 등의 적절한 벡터에 삽입하여 통상의 방법으로 인간 또는 비인간 포유류에 투여할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 그와 같이 혹은 약학적으로 허용가능한 담체와의 제형물로 카테터 또는 유전자 총을 통해 통상의 방법으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 삽입할 상기 벡터 또한 상술한 바와 같은 방법으로 제형화하여 예컨대 비경구 목적으로 사용할 수 있다. 투여량 수준의 변동은 당업계에 공지된 표준 실험적 최적화 절차를 이용하여 조정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 함유한 본 발명의 약학 조성물의 유효 투여량은 예컨대 증상의 경중도, 연령, 성별, 체중, 원하는 투여 형태, 염의 유형, 실제 질병 유형 등에 따라 가변적이다. 일반적으로, 성인 (체중: 60 kg) 의 1일 용량은 경구 투여의 경우 약 30 ㎍ 내지 10 g, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 5 g, 더 바람직하게는 100 ㎍ 내지 100 mg 로 이를 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 제공할 수 있으며, 주사 투여의 경우 약 30 ㎍ 내지 1 g, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 500 mg, 더 바람직하게는 100 ㎍ 내지 30 mg 로 이를 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 함유한 본 발명의 약학 조성물의 투여 형태 및 필요 투여량 범위는, 펩티드 또는 그 동등물 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제형물 특성, 환자 상태, 및 의사의 판단에 따라 다르다. 그러나 적당한 투여를 위해 바람직한 투여량 범위는, 예컨대 환자 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 500 ㎍, 바람직하게는 약 0.1 내지 100 ㎍, 더 바람직하게는 1 내지 50 ㎍ 이다. 효능은 투여 경로에 따라 다름을 고려할 때, 필요 투여량은 광범위하게 가변적일 것으로 예상된다. 예를 들어, 경구 투여의 경우 정맥내 주사에 의한 투여에 비해 고용량을 필요로 할 것으로 예상된다. 유아에 투여하는 경우, 성인에 투여하는 용량에 비해 투여량이 낮을 것이다. 그러한 투여량 수준의 변동은 당업계에 공지된 표준 실험적 최적화 절차를 이용하여 조정가능하다.
상술한 투여량을 본 발명의 Aβ 응집 방지 방법 또는 신경세포 사멸 방지 방법에 적용할 수 있다.
9. 병용 치료
본 발명은 병용 요법에 의한 Aβ-기초 질환의 치료 방법 (이하 "본 발명의 병용 치료" 라고도 함) 및 본 발명에서 사용되는 약학 조성물을 포함한다.
(1) 구현예
본원에서 "병용" 이란 용어는 개별 화합물의 병용 투여 및 혼합물(배합 제형물)로서의 투여 두 방식을 포함하는 화합물의 병용 사용을 의미한다.
본원에서 "병용" 이란 용어는, 서로 조합되는 성분 중 하나가 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물 및 본 발명의 약학 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물이고, 다른 성분은 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 함유한 약학 조성물, 또는 NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 함유한 약학 조성물인 것을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물, 즉 Aβ-기초 질환 치료제와 관련하여, "8. 약학 조성물" 을 참조한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 병용물은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 및 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질, 또는 NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 함유하는 약학 조성물 (배합 제형물) 로서 제공된다.
본 발명의 다른 구현예에서, "병용" 이란 용어는 서로 조합되는 성분들이 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 및 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물인 경우, 또는 서로 조합되는 성분들이 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 및 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물인 경우를 포함한다. 상기 병용물은 본 발명에서 사용되는 화합물 및 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 함유한 약학 조성물 (배합 제형물) 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 및 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 함유한 약학 조성물 (배합 제형물) 로서 제공된다.
(2) 약학 조성물 (배합 제형물)
(i) 본 발명은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 함유하는 약학 조성물 (배합 제형물) 을 제공한다.
(ii) 본 발명은 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물, 즉 Aβ37 또는 Aβ38, 이의 변이체, 이의 절편, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합, 또는 Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이의 동족체, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합, 및 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
(iii) 본 발명은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 및 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물을 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
(iv) 본 발명은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 및 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에서 "본 발명의 병용 치료에 사용되는 약학 조성물" 이란 표현은 상기 (i) 내지 (iv) 에 나타낸 약학 조성물을 의미한다.
(3) ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제
ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제는 각각 Aβ-기초 질환의 치료제로서 사용 또는 개발되었다.
(i) ChE-억제 물질
본원에서 ChE-억제 물질은 ChE-억제 효과를 갖는 화합물 또는 이의 염 또는 이의 용매화물을 가리키며, 이는 ChE 활성을 가역적 또는 비가역적으로 억제하는 (즉, ChE-억제 효과) 물질을 의미한다. 본 발명에서, ChE 는 아세틸콜린에스터라제 (AChE) (EC3.1.1.7) 및 부티릴콜린에스터라제를 포함한다. 본 발명에 따른 ChE-억제 물질은 바람직하게는 하기를 특징으로 한다: 부티릴콜린에스터라제보다 AChE 에 대한 선택성이 더 높음; 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 능력을 가짐; 및 치료에 필요한 용량에서 어떠한 심각한 부작용도 유발하지 않음 등.
본 발명의 병용 치료에서 사용되는 약학 조성물에 있어서, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물 및 본 발명의 약학 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물과 조합 또는 배합되는 바람직한 화합물로는 ChE-억제 물질 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질, 특히 AChE-억제 물질 및 이의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질이 포함된다.
본 발명에서, ChE-억제 물질의 예로는, 도네페질 (ARICEPT®), 갈란타민 (Reminyl®), 타크린 (Cognex®), 리바스티그민 (Exelon®), 지프로실론 (미국 특허 No. 5693668), 파이소스티그민 (Synapton), 이피다크린 (미국 특허 No. 4550113), 퀼로스티그민, 메트리포네이트 (Promem) (미국 특허 No. 4950658), 엡타스티그민, 벨나크린, 톨세린, 심세린 (미국 특허 No. 6410747), 메스티논, 이코페질 (미국 특허 No. 5750542), TAK-147 (J. Med. Chem., 37(15), 2292-2299, 1994, 일본 특허 No. 2650537, 미국 특허 No. 5273974), 후페르진 A (Drugs Fut., 24, 647-663, 1999), 스타코필린 (미국 특허 No. 4599338), 티아톨세린, 네오스티그민, 에세롤린 또는 티아심세린, 8-[3-[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-4-피페리디닐]-1-옥소프로필]-1,2,5,6-테트라히드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온 (일본 특허 No. 3512786), 펜세린 및 ZT-1, 또는 상기 화합물의 유도체, 또는 이의 염 또는 이의 용매화물, 또는 상기 화합물 또는 유도체의 전구약물, 또는 이의 염 또는 이의 용매화물, 또는 이의 조합이 포함된다.
전형적 예로서, 도네페질 또는 이의 염 (예, 염화수소산 염) 을, 예컨대 JP 01-79151 A, 일본 특허 No. 2578475, 일본 특허 No. 2733203, 일본 특허 No. 3078244 또는 미국 특허 No. 4895841 에 개시된 바와 같이 용이하게 제조할 수 있다. 갈란타민 및 그 유도체는, 예컨대 미국 특허 No. 4663318, 국제 공개 공보 No. WO88/08708, 국제 공개 공보 No. WO97/03987, 미국 특허 No. 6316439, 미국 특허 No. 6323195 및 미국 특허 No. 6323196 에서 찾을 수 있다. 타크린 및 그 유도체는, 예컨대 미국 특허 No. 4631286, 미국 특허 No. 4695573, 미국 특허 No. 4754050, 국제 공개 공보 No. WO88/02256, 미국 특허 No. 4835275, 미국 특허 No. 4839364, 미국 특허 No. 4999430 및 국제 공개 공보 No. WO97/21681 에서 찾을 수 있다. 리바스티그민 및 그 유도체는, 예컨대 유럽 특허 No. 193926, 국제 공개 공보 No. WO98/26775 및 국제 공개 공보 No. WO98/27055 에서 찾을 수 있다.
본 발명에서, ChE-억제 물질의 추가적 예로는 국제 공개 공보 No. WO00/18391 에 기재된 ChE-억제 효과를 갖는 화합물이 포함된다.
상기 목적상, 다양한 종류의 전구약물, 예컨대 상술한 것으로부터 아미노, 히드록실 및/또는 카르복실기의 아실화, 알킬화, 인산화, 붕산화, 탄산화, 에스테르화, 아미드화 또는 우레탄화에 의해 유도된 화합물 등을 예로 들 수 있다. 그러나 이러한 예는 예시적인 것일 뿐이며 포괄적인 것은 아니다. 당업자라면 상술한 화합물로부터 공지의 방법에 의해 다른 각종 공지의 전구약물을 제조할 수 있다. 상술한 화합물로부터 제조된 전구약물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
(ii) NMDA 수용체 길항제
본원에서 NMDA 수용체 길항제는 NMDA 수용체에 결합하여 그 기능을 억제하는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 의미한다. 본 발명에 따른 NMDA 수용체 길항제에는, 메만틴 (3,5-디메틸-아다만탄-1-일아민; CAS#19982-08-2), 그 유도체 또는 이의 전구약물, 또는 이의 염 (바람직하게는 염화수소산 염) 또는 이의 용매화물 또는 이의 조합이 포함된다. 메만틴 및 그 유도체 및 이의 제법은 일본 특허 No. 2821233 에서 찾을 수 있다.
(iii) AMPA 수용체 길항제
본원에서 AMPA 수용체 길항제는 AMPA 수용체에 결합하여 그 기능을 억제하는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 의미한다. 본 발명에 따른 AMPA 수용체 길항제에는, 탈람파넬 (LY300164; (R)-(-)-1-(4-아미노페닐)-3-아세틸-4-메틸-7,8-메틸렌디옥시-3,4-디히드로-5H-2,3-벤조디아제핀; CAS#161832-65-1), 그 유도체 또는 이의 전구약물, 또는 이의 염 또는 이의 용매화물 또는 이의 조합이 포함된다. 탈람파넬의 제법은 [J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1995, p. 1423] 에서 찾을 수 있다.
(4) 투여 형태
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물 및 본 발명의 약학 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질 또는 NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질과 조합하여 사용할 경우, 그러한 조합은 Aβ-기초 질환의 치료에 유용하다. 마찬가지로, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 및 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물의 조합, 또는 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물 및 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물의 조합 또한 Aβ-기초 질환의 치료에 유용하다. 즉, 본 발명의 병용 치료에 사용되는 약학 조성물은 Aβ-기초 질환의 치료에 유용하다.
본원에서 "Aβ-기초 질환" 이란 표현은 바람직하게는 알츠하이머병, 알츠하이머형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 또는 아밀로이드증이다.
본 발명의 병용 치료에서, 조합할 각 성분을 동시에 또는 일정한 간격으로 그러한 질병의 치료를 요하는 포유류 (예, 인간) 에 유효량을 투여할 수 있다. 다르게는, 통상의 방법으로 제형화된 별도의 약학 조성물 형태에 있어서 조합할 각 성분을 유효량으로 동시에 또는 일정 간격으로 투여할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 병용 치료에 있어서 조합할 각 성분을 직접 배합하여 제형물로 만들거나 또는 부분적으로 예비-제형화한 후 배합하여 제형물로 만들 수 있다. 이 경우, 수득한 제형물의 유효량을 투여할 수 있다. 당업자라면 통상 이용되는 기술에 기초하여 이들 성분들을 제형화할 수 있다 (상기 "8. 약학 조성물" 참조). 본원에서 "동시에" 란 표현은 이들 성분을 단일 투여 계획으로 동일 시각에 투여하는 것을 의미한다. 이 경우 반드시 완전히 동일한 시간 및 분에 투여할 필요는 없다.
본 발명의 병용 치료에 사용되는 약학 조성물의 투여 형태는 특별히 한정되지 않고; 약학 조성물을 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다 (상기 "8. 약학 조성물" 참조). 조합 또는 배합시에 조합 또는 배합할 각 성분은 상이한 투여 형태 또는 상이한 용량일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물의 투여량은 예컨대 증상의 경중도, 연령, 성별, 체중, 원하는 투여 형태, 염의 종류, 실제 질병 유형 등에 따라 가변적이다. 일반적으로 성인 (체중: 60 kg) 의 1일 투여량은 경구 투여의 경우 약 30 ㎍ 내지 10 g, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 5 g, 더 바람직하게는 100 ㎍ 내지 100 mg 이고 주사 투여의 경우 약 30 ㎍ 내지 1 g, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 500 mg, 더 바람직하게는 100 ㎍ 내지 30 mg 이며, 이를 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물의 투여 형태 및 필요 투여량 범위는 펩티드 또는 그 동등물 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제형물 특성, 환자 상태, 및 의사의 판단에 따라 다르다. 그러나 적절한 투여를 위한 바람직한 투여량 범위는 체중 60 kg 인 환자에 있어서 예컨대 약 0.006 내지 30 mg, 바람직하게는 약 0.006 내지 6 mg, 더 바람직하게는 0.06 내지 3 mg 이다. 효능이 투여 경로에 따라 다름을 고려할 때, 필요 투여량은 광범위하게 가변적일 것으로 예상된다. 예를 들어, 경구 투여의 경우 정맥내 주사에 의한 투여에 비해 고용량을 필요로 할 것으로 예상된다. 유아에 투여하는 경우, 성인에 투여하는 용량에 비해 투여량이 낮을 것이다. 그러한 투여량 수준의 변동은 당업계에 공지된 표준 실험적 최적화 절차를 이용하여 조정가능하다.
ChE-억제 물질의 경구 투여 형태와 관련하여, 도네페질 히드로클로라이드의 미세 과립은 상품명 ARICEPT 미세 과립 (Eisai Co., Ltd.) 으로 입수가능하고, 도네페질 히드로클로라이드의 정제는 상품명 ARICEPT 정제 (Eisai Co., Ltd.) 로 입수가능하다. 팻치 형태로 경피 흡수를 통해 투여하는 경우, 염을 형성하지 않는, 즉 이른바 유리 형태인 ChE-억제 물질을 선별하는 것이 바람직하다.
경구 투여를 위한 상기 ChE-억제 물질의 투여량은 성인 체중 60 kg 당 0.001 내지 1000 mg/일, 바람직하게는 0.01 내지 500 mg/일, 더 바람직하게는 0.1 내지 300 mg/일이다. 도네페질 히드로클로라이드를 예로 들면, 경구 투여를 위한 투여량은 바람직하게는 0.1 내지 300 mg/일, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/일, 보다 더 바람직하게는 1.0 내지 50 mg/일 이다. 마찬가지로, 타크린은 0.1 내지 300 mg/일, 바람직하게는 40 내지 120 mg/일의 용량으로 투여하는 것이 바람직하고, 리바스티그민은 0.1 내지 300 mg/일, 바람직하게는 3 내지 12 mg/일의 용량으로 투여하는 것이 바람직하며, 갈란타민은 0.1 내지 300 mg/일, 바람직하게는 16 내지 32 mg/일의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
비경구 투여를 위한 상기 ChE-억제 물질의 바람직한 투여량은 팻치 형태로 투여시 5 내지 50 mg/일, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 mg/일이다. 한편, ChE-억제 물질을 생리 식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용가능한 담체에 용해 또는 현탁하여 담체 1 ml 당 0.1 ㎍ 내지 10 mg 의 농도로써 주사제를 제조할 수 있다. 이렇게 제조한 주사제를 치료를 요하는 환자에게 0.01 내지 5.0 mg/일, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/일의 용량으로 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다.
NMDA 수용체 길항제 (예, 메만틴) 또는 AMPA 수용체 길항제 (예, 탈람파넬) 의 투여 형태 및 투여량은 투여 대상, 투여 경로, 제형물 특성, 환자 상태 및 의사 판단에 따라 다르다. 예를 들어, 메만틴의 경구 투여에 바람직한 치료 투여량은 성인 (체중: 60 kg) 당 약 5 내지 35 mg/일 이지만, 메만틴은 100 내지 500 mg/일의 용량으로 치료에 사용하도록 충분히 허용되고 있다. 유사하게, 탈람파넬을 성인 (체중: 60 kg) 당 약 20 내지 70 mg, 바람직하게는 약 20 내지 50 mg 의 투여량으로 1일 2 내지 4회, 바람직하게는 1일 3회 사용할 수 있다.
상기 NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제의 투여량은 상술한 것에 한정되지 않고, 투여 화합물의 유형 또는 이의 염 또는 이의 용매화물, 투여 경로간의 효능 차이 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여에 비해 고용량을 요할 것으로 예상된다. 유아에 투여하는 경우, 투여량은 성인 투여량에 비해 낮을 수 있다. 투여량 수준의 이러한 변동은 당업계에 공지된 표준 실험적 최적화 절차를 이용하여 조정가능하다.
조합 또는 배합시 용량은 상술한 것 중에서 적절히 선택할 수 있다.
10. 키트
본 발명은 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물, 즉 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40/42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 상술한 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 이들 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제는 각각 도네페질 또는 이의 염 (예, 염화수소산 염), 메만틴 및 탈람파넬일 수 있다.
본 발명의 병용 치료에 사용되는 약학 조성물의 효능을 탐지 또는 예측하는 데 본 발명의 키트를 이용할 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물에 함유된 것과 동일한 활성 성분을 포함하는 본 발명의 키트를 이용하여, 본 발명의 방법에 의한 Aβ 응집 또는 신경세포 사멸에 대한 억제 활성을 분석함으로써 약학 조성물의 치료적 효능을 탐지 또는 예측할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로 완충제, 효소, 기질, 실험 기구, 사용 안내 등을 포함하여 치료적 효능의 탐지 또는 예측에 필요한 추가 요소들을 포함할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 키트를 병용 치료에 사용하기 위한 약학 조성물로 적합한 화합물의 스크리닝 또는 동정 방법에 이용할 수 있다. 본 발명의 키트는 공지 화합물, 예컨대 상술한 도네페질 또는 이의 염, 메만틴 및 탈람파넬을 포함할 수 있으며, 이는 스크리닝 또는 동정을 위한 표준으로 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로 개별 시약, 사용 안내서 등을 포함하여 스크리닝 또는 동정에 필요한 추가적 요소들을 포함할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 키트를 본 발명의 병용 치료, 즉 병용 치료에 의한 Aβ-기초 질환의 치료에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물 및 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 키트를 Aβ-기초 질환의 병용 치료에 이용할 수 있다. 유사하게, 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 함유한 약학 조성물 및 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 키트 또한 Aβ-기초 질환의 병용 치료에 이용할 수 있다. Aβ-기초 질환의 치료에 이용시 본 발명의 키트에 필요한 투여량, 투여 형태 등에 관하여, 상기 "9. 병용 치료" 를 참조할 수 있다. 상기 키트는 추가로 주사기, 주사바늘, 용매, 카테터, 사용 안내서 등을 포함하여 투여에 필요한 추가 요소들을 포함할 수 있다.
본원에서, "Aβ-기초 질환" 이란 표현은 바람직하게는 알츠하이머병, 알츠하이머형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 또는 아밀로이드증이다.
또한 본 발명의 키트의 다른 구현예에서, 상기 구현예의 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 동등물을 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물로 대체할 수 있다. 즉, Aβ37 또는 Aβ38, 이의 변이체, 이의 절편, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합, 또는 Aβ37 또는 Aβ38 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이의 동족체, 이의 염, 이의 용매화물 또는 이의 조합을 사용하는 키트가 제공된다.
마찬가지로 본 발명의 키트의 다른 구현예에서, 상기 구현예의 ChE-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질 대신에 본 발명에서 사용되는 펩티드 또는 그 동등물 또는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 동등물을 사용하는 키트가 제공된다.
하기 실시예 및 제제예에서 본 발명을 더 상세히 설명하나, 이는 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니며 당업자에게 완전한 공개를 제공하고자 함이다. 또한 이 실시예는 공개된 실험들이 실제로 수행된 모든 혹은 유일한 실험임을 의미하거나 암시하는 것은 아니다. 본원에 사용된 숫자 (예, 양, 온도, 농도 등) 와 관련하여 정확성을 기하려 노력했으나 일부 실험상의 오차 및 편차를 감안해야하며 이들 숫자는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 변화가능하다.
실시예 1 Aβ 의 원편광 이색성 ( CD ) 분석
(1) 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP) 을 이용한 Aβ 의 처리
인간형 Aβ1-42 (Peptide Institute, Inc., Prod. # 4349-v), 인간형 Aβ1-40 (Peptide Institute, Inc., Prod. # 4307-v), 인간형 Aβ1-38 (SIGMA, A0189) 또는 인간형 Aβ1-37 (Peptide Institute, Inc., 주문 합성) 을 HFIP (SIGMA, H8508) 에 1 mg/mL 로 용해하고 생성된 용액을 4℃ 에서 2 시간 진탕시켰다. 이어서 용액을 10 내지 30 μL 분취액으로 나눠 500 μL 폴리프로필렌 마이크로튜브에 넣고 사용시까지 -80℃ 로 보관하였다.
(2) 석영셀의 세척
광경로 길이가 1 mm (최대부피: 500 μL) 및 2 mm (최대부피: 1 mL) (JASCO Corporation) 인 석영셀에 2% 소듐 도데실 설페이트 용액을 채우고 초음파 세척기로 20 분간 세척하였다. 이어서 석영셀 내 용액을 따라버리고 셀에 다시 2% 소듐 도데실 설페이트 용액을 채운 후, 초음파 세척기에서 20 분간 세척하였다. 셀 내 용액을 이어서 따라버리고 셀 내부를 증류수로 세척하였다. 그 후, 셀을 수산화나트륨 포화 용액으로 채우고 초음파 세척기로 20 분간 세척하였다. 이어서 셀 내 용액을 따라버리고 셀 내부를 증류수 및 메탄올로 차례로 세척하였다. 마지막으로, 셀 내부를 아세톤으로 세척하고 실온에서 자연건조시켰다.
(3) Aβ 의 재용해 및 인큐베이션
HFIP 중의 Aβ 용액을 원심분리 증발장치 (Tomy Seiko Co., Ltd., CC-180 and ST-10) 를 이용하여 증발시켜 HFIP 를 제거한 후 0.9% NaCl 함유 10 mM HEPES 용액에 용해하였다. 생성된 각 Aβ 용액을 37℃ 에서 인큐베이션하고 상이한 시점에 그 CD 를 측정하였다. 또한 Aβ1-42 의 응집 능력에 대한 Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 의 효과를 조사하기 위해, Aβ1-42 및 각 Aβ 를 1:3 (5 μM:15 μM) 의 비율로 혼합하고, 생성된 혼합물에 대해 상술한 것과 동일한 방법으로 그 CD 를 측정하였다.
(4) 표준 용액에 대한 측정
광경로 길이 10 mm 인 실린더형 석영셀 (JASCO Corporation) 에 암모늄-d-10-캄포르술포네이트 0.06% 수용액 (Katayama Chemical Industries Co., Ltd, Prod. #05-1251) 을 채우고 하기 조건 하에 측정하였다. 이용된 CD 측정 장치는 JASCO J720WI (JASCO Corporation) 였다.
측정 범위: 350 내지 220 nm
데이타 간격: 1 nm
스캐닝 속도: 50 nm/초
축적 횟수: 1
반응: 2 초
밴드 너비: 1.0 nm
민감도: 200 meg
표준 용액이 약 290 nm 에서 최대인 정규분포와 유사한 모양의 측정 곡선을 나타냄을 확인하면, 장치가 바르게 작동하는 것으로 판단하였다.
(5) CD 측정
Aβ-함유 용액을 광경로 길이 1 또는 2 mm 인 세척된 석영셀에 주입하고 그 CD 를 측정하였다. 측정시까지, 석영셀을 37℃, 100% 습도에서 정치시켰다. 하기 조건 하에 CD 측정을 실시하였다.
측정 범위: 260 내지 190 nm
데이타 간격: 1 nm
스캐닝 속도: 50 nm/초
축적 횟수: 2
반응: 2 초
밴드 너비: 1.0 nm
민감도: 100 meg
(6) 결과
(6A) 각 Aβ 의 2차 구조
37℃ 에서 인큐베이션된 각 Aβ 용액에 대해 상이한 시점에 CD 를 측정하였 다. 측정 개시로부터 용해 후 1일째까지의 기간 동안, 모든 Aβ 절편은 랜덤한 구조를 나타내는 CD 스펙트럼을 보였다 (도 1A ~ 1E). 그러나 용해 후 2일째로부터, Aβ1-42 만이 β-시트 구조의 형성을 나타내는 CD 스펙트럼을 보이는 것으로 검출되었다 (도 1F). 용해 후 5일째까지 CD 측정을 추가로 계속하였을 때, Aβ1-42 는 Aβ1-42 가 β-시트 구조로 남아있음을 나타내는 CD 스펙트럼을 보였다 (도 1G ~ 1I). 반대로, 다른 Aβ 절편은 용해 후 5일째에도 랜덤한 구조를 나타내는 CD 스펙트럼을 보였다 (도 1A ~ 1I). 이는 Aβ1-37 이 Aβ1-42 에 비해 β-시트 구조를 덜 형성함을 암시한다. 이러한 특성은 Aβ1-37 의 경우와 같이 Aβ1-38 및 Aβ1-40 에서도 발견되었다.
(6B) Aβ1-42 의 β-시트 구조 형성에 대한 다른 Aβ 의 효과
Aβ1-42 의 응집 능력에 대한 Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 의 효과를 Aβ1-42 및 각 Aβ 의 1:3 혼합물에 대한 CD 측정에 의해 조사하였다.
측정 개시 후 8시간까지의 기간 동안, 모든 Aβ 절편은 랜덤한 구조를 나타내는 CD 스펙트럼을 보였다 (도 2A ~ 2E). 인큐베이션 개시 후 1일째부터, Aβ1-42+완충제만이 β-시트 구조의 형성을 나타내는 CD 스펙트럼을 보이는 것으로 검출되었다 (도 2F). 용해 후 3일째까지 CD 측정을 추가로 계속하였을 때, Aβ1-42+완충제는 Aβ1-42 가 β-시트 구조로 남아있음을 나타내는 CD 스펙트럼을 보였다 (도 2G 및 2H). 마찬가지로, Aβ1-40 과 혼합된 시료는 용해 후 2일째에 β-시트 구조의 형성을 나타내는 CD 스펙트럼을 보이는 것으로 검출되었다 (도 2G). 반대로, Aβ1-37 과 혼합된 시료는 용해 후 3일째에 β-시트 구조의 형성을 나 타내는 CD 스펙트럼을 보이는 것으로 검출되었는데 (도 2H), 이는 Aβ1-37 이 Aβ1-42 의 β-시트 구조 형성 속도를 늦추는 효과가 있음을 암시한다. 이 효과는 Aβ1-38 에서도 발견되었다 (도 2H). 이러한 결과는 Aβ1-42 의 β-시트 구조 형성에 대한 Aβ1-40 의 억제 효과가 Aβ1-37 또는 Aβ1-38 에 비해 약함을 암시한다.
실시예 2 Aβ 의 응집 능력에 대한 티오플라빈 T ( ThT ) 분석
(1) Aβ 의 응집 능력 분석
상기 실시예 1 에 나타낸 것과 동일한 방법으로 준비한 각 인간형 Aβ (Aβ1-37, Aβ1-38, Aβ1-40 또는 Aβ1-42) 를 각각 0.9% NaCl 함유 10 mM HEPES 용액에 최종 농도 10 mM 로 다시 용해하고 37℃ 의 CO2 인큐베이터에서 상이한 시간 동안 인큐베이션하였다. ThT (SIGMA) 를 최종 농도 10 μM 로 첨가한 후, 각 시료를 96-웰 블랙 플레이트 (Corning) 로 옮기고 10 초간 교반한 후, 각 시료에 대한 형광 강도를 측정하였다. 형광분광광도계 (LJL Biosystems) 를 이용하여, 파장 490 nm 에서의 형광 강도를 450 nm 파장의 여기광으로 측정하였다. 다음으로, Aβ1-42 의 응집 능력에 대한 Aβ1-37, Aβ1-38 또는 Aβ1-40 의 효과를 조사하기 위해, Aβ1-42 및 각 Aβ 를 1:3 비율로 혼합하고 생성된 혼합물에 대해 ThT 의 형광 강도를 상이한 시점에서 상술한 것과 동일한 방법으로 측정하였다.
(2) 결과
(2A) 각 Aβ의 β시트 구조 형성
Aβ1-42 에서, ThT 의 형광 강도가 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 증가한 반면 (도 3A, 검은색 사각형, ■), Aβ1-37 (검은색 원, ●), Aβ1-38 (검은색 삼각형, ▲) 또는 Aβ1-40 (흰색 사각형, □) 은 형광 강도가 증가하지 않았다.
(2B) Aβ1-42 의 β-시트 구조 형성에 대한 다른 Aβ 의 효과
Aβ1-42 를 Aβ1-37 (검은색 원, ●), Aβ1-38 (검은색 삼각형, ▲) 또는 Aβ1-40 (흰색 사각형, □) 과 1:3 비율로 혼합할 경우, Aβ1-42 단독 (검은색 사각형, ■) 에 비해 형광 강도의 증가가 억제되었다 (도 3B). 그 억제율은 Aβ1-40 이 존재할 때에 비해 Aβ1-37 또는 Aβ1-38 의 존재시에 더 컸다 (도 3C). 이러한 결과는 β-시트 구조에 대한 CD 분석 결과와 밀접하게 연관되었다.
실시예 3 래트 배아 해마-유래 배양 신경세포 내 Aβ (25 μM) 의 세포 독성
(1) 초대 배양된 신경세포의 제조
태령 18 일 의 Wistar 래트 (Charles River Japan) 로부터 해마를 분리하여 배양에 제공하였다. 더 구체적으로, 임신한 래트로부터 에테르 마취하에 태아를 무균 추출하였다. 상기 태아로부터 뇌를 추출하여 빙냉 L-15 배지 (Invitrogen 또는 SIGMA) 에 침지시켰다. 실체현미경 하에서 추출한 뇌로부터 해마를 수합하였다. 이렇게 수합한 해마 조각을 0.25% 트립신 (Invitrogen) 및 0.01% DNase (SIGMA) 를 함유한 효소 용액으로 37℃ 에서 30 분간 효소적 처리하여 세포를 흩뜨렸다. 이 경우, 불활성화된 말 혈청을 첨가함으로써 효소 반응을 중단시켰다. 이렇게 효소 처리된 용액을 1500 rpm 으로 5 분간 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 5 내지 10 ml 배지를 수득한 세포 펠렛에 첨가하였다. 이용한 배지는 2% B-27 보충물 (Invitrogen Corp. Cat #17504-044, Carlsbad, CA USA), 25 μM 2-머캅토에탄올 (2-ME, WAKO. Cat #139-06861, Osaka, Japan), 0.5 mM L-글루타민 (Invitrogen Corp. Cat #25030-081, Carlsbad, CA USA) 및 항생제-항진균제 (Invitrogen Corp. Cat #15240-062, Carlsbad, CA USA) (Neurobasal/B27/2ME) 가 보충된 Neurobasal 배지 (Invitrogen Corp. Cat #21103-049, Carlsbad, CA USA) 였다. 배지 첨가 후, 세포 펠렛을 천천히 피펫팅하여 세포를 다시 흩뜨렸다. 생성된 세포 분산물을 40 ㎛ 나일론 메쉬 (cell strainer, Becton Dickinson Labware) 로 여과하여 세포 응집물을 제거함으로써 신경세포 현탁물을 수득하였다. 이 신경세포 현탁물을 배지로 희석하고 96-웰 플레이트 (BIOCOAT® 폴리-D-라이신 코팅, Becton Dickinson Labware) 에 초기 세포 밀도 1.6×105 세포/100 ㎕/웰로 접종하였다. 접종된 세포를 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양한 후, 배지를 새로운 Neurobasal/B27/2ME 로 완전히 대체하였다.
(2) Aβ 첨가 및 MTT 측정
각 Aβ (Aβ1-37, Aβ1-40 또는 Aβ1-42) 를 10 mM NaOH 용액에 100 ㎍/ml 로 용해하고, 5분 후 인산염 완충 식염수 (PBS) 에 500 μM 로 희석하였다. 각 시료를 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 의 인큐베이터에서 3 일간 인큐베이션하였다. 배양 개시 후 5 일째에, 배지를 교체하고 각 Aβ 를 세포에 가하였다. 추가로 48 시간 배양 후, MTT 측정에 의해 시료의 독성을 측정하였다. 배지를 제거한 후, 새로운 가온된 배지를 100 ㎕/웰 부피로 첨가하고, D-PBS (Dulbecco's PBS, SIGMA) 중의 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드 (MTT; SIGMA) 8 mg/ml 용액을 5 ㎕/웰 부피로 추가 첨가하였다. 시료를 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 의 인큐베이터에서 20 분간 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후, 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 를 100 ㎕/웰 부피로 가하여 침전된 MTT 포르마잔 결정을 충분히 용해한 다음 550 nm 흡광도를 측정하였다. 대조군 (Aβ-미처리 군, CTRL) 에 대한 비율 (CTRL 의 %) 을 각 시료에 대해 계산하고 세포 생존 활성의 비교 및 평가에 이용하였다.
CTRL 의 % = (A550_시료)/(A550_CTRL) x 100
(식에서, A550_시료는 550 nm 에서의 시료 웰의 흡광도를 나타내고 A550_CTRL 은 550 nm 에서 대조군 웰의 흡광도를 나타낸다).
(3) 결과
래트 해마-유래 신경세포의 MTT 활성을 각 Aβ (Aβ1-37, Aβ1-40 또는 Aβ1-42) 첨가 48 시간 후에 측정하였는 바, Aβ1-37 및 대조군 간에 차이가 없는 것으로 나타났다. Aβ1-40 은 활성을 약 10% 감소시킨 것으로 나타났지만, Aβ1-42 처리는 MTT 활성을 약 25% 감소시켰다 (도 4). 더 긴 C-말단을 갖는 각 Aβ 는 더 강한 세포 독성을 보였다. Aβ 의 세포 독성은 그 응집 상태 (β-시트 구조 함량) 와 관련있는 것으로 여겨지며; 이는 이 실시예의 결과로도 확인할 수 있었다. 즉, Aβ1-37 은 β-시트 구조를 덜 형성하고 따라서 Aβ1-42 에 비 하여 세포 독성이 낮은 것으로 나타났다.
실시예 4 화합물 A
(E)-N-비페닐-3- 일메틸 -3-[3- 메톡시 -4-(4- 메틸이미다졸 -1-일) 페닐 ] 아크릴아미드 (하기 화학식으로 나타냄) 의 합성
Figure 112007080232949-PCT00018
3- 메톡시 -4-(4- 메틸이미다졸 -1-일) 벤즈알데하이드 및 3- 메톡시 -4-(5- 메틸이미다졸 -1-일) 벤즈알데하이드의 합성
N,N'-디메틸포름아미드 (50 mL) 중의 4-플루오로-3-메톡시벤즈알데하이드 (3.00 g) 및 4-메틸이미다졸 (3.307 g) 용액에 탄산칼륨 (4.05 g) 을 가하고, 반응 혼합물을 밤새 100℃ 에서 교반하였다. 생성된 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 잔류물을 물 및 에틸 아세테이트에 가하고 이들 사이에 분획하여 유기층을 분리하였다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 헥산-에틸 아세테이트 시스템) 로 정제하여 3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)벤즈알데하이드 (856mg) 및 3-메톡시-4-(5-메틸이미다졸-1-일)벤즈알데하이드 (44 mg) 를 수득하였다.
3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)벤즈알데하이드의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00019
3-메톡시-4-(5-메틸이미다졸-1-일)벤즈알데하이드의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00020
(E)-3-[3- 메톡시 -4-(4- 메틸이미다졸 -1-일) 페닐 ]아크릴산의 합성
이렇게 수득한 테트라히드로퓨란 (40 mL) 중의 3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)벤즈알데하이드 (4.00 g) 용액에 디에틸포스포노아세트산 에틸 에스테르 (4.00 mL) 및 리튬 하이드록시드 1수화물 (932 mg) 을 차례로 가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 출발 물질이 사라진 것을 확인한 후, 2N 수성 수산화나트륨 (30 mL) 및 에탄올 (5 mL) 을 반응 혼합물에 가하고, 이어서 이를 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃ 로 냉각한 후, 2N 염산 (30 mL) 을 첨가하였다. 생성된 침전물을 Kiriyama 깔때기로 수합하고 물 및 에틸 아세테이트로 세정하여 (E)-3-[3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)페닐]아크릴산 (4.61 g) 을 수득하였다. 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00021
Figure 112007080232949-PCT00022
(E)-N-비페닐-3- 일메틸 -3-[3- 메톡시 -4-(4- 메틸이미다졸 -1-일) 페닐 ] 아크릴아미드의 합성
N,N'-디메틸포름아미드 (30 mL) 중의 (E)-3-[3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)페닐]아크릴산 (2.20 g) 용액에, 3-페닐벤질아민 히드로클로라이드 (2.30 g) 및 디이소프로필에틸아민 (4.57 mL) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드 (1.96 g) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (1.38 g) 을 차례로 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 출발 물질이 사라진 것을 확인한 후, 반응 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트에 첨가하고 이들 사이에 분획하여 유기층을 분리하였다. 생성된 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 다음 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (용출 용매: 에틸 아세테이트→에틸 아세테이트:에탄올 = 10:1), (E)-N-비페닐-3-일메틸-3-[3-메톡시-4-(4-메틸이미다졸-1-일)페닐]아크릴아미드를 수득하였다 (3.30 g). 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00023
실시예 5 화합물 B ( CAS #501907-79-5)
N-{[(4- 클로로페닐 )아미노] 이미노메틸 }- N' -(4- 시아노페닐 ) 유레아 (하기 화학식으로 나타냄) 의 합성
Figure 112007080232949-PCT00024
N-(4- 클로로페닐 )구아니딘 p- 톨루엔술폰산 염의 합성
톨루엔 (60 mL) 중의 4-클로로아닐린 (5.0 g) 및 시안아미드 (1.91 g) 및 p-톨루엔술폰산 1수화물 (7.45 g) 용액을 환류 하에 12 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각되게 하고 빙랭수 (300 mL) 를 반응 혼합물에 첨가한 다음 30분간 교반하였다. 반응 혼합물에 침전된 고형물을 흡입 여과로 수합하고 밤새 자연건조하여 N-(4-클로로페닐)구아니딘 p-톨루엔술폰산 염을 수득하였다 (11.1 g). 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00025
N-{[(4- 클로로페닐 )아미노] 이미노메틸 }- N' -(4- 시아노페닐 ) 유레아의 합성
아세톤 (30 mL) 중의 N-(4-클로로페닐)구아니딘 p-톨루엔술폰산 염 (1.0 g) 및 4-시아노페닐 이소시아네이트 (422 mg) 용액에 5N 수성 수산화나트륨 (0.56 mL) 를 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하고 상기 반응 혼합물로부터 침전된 고형물을 여과 수합하였다. 수득 한 고형물을 물 (50 mL) 및 에틸 에테르 (50 mL) 로 세정한 다음 밤새 자연건조하여 N-{[(4-클로로페닐)아미노]이미노메틸}-N'-(4-시아노페닐)유레아 (850 mg) 를 수득하였다. 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 보고된 값과 일치하였다 (CAS #501907-79-54).
실시예 6 화합물 C ( CAS #670250-40-5)
5-{2-{3-[(1R)-1- 히드록시메틸 -2-옥소-2-피페리딘-1- 일에틸 ] 유레이도 }피리딘-4-일옥시}-1H-인돌-1- 카르복실산 메틸아미드 (하기 화학식으로 나타냄) 의 합성
Figure 112007080232949-PCT00026
N1 - 메틸 -5-(2-아미노-4- 피리딜 ) 옥시 -1H- 인돌카르복사미드의 합성
소듐 하이드라이드 (40% 미네랄 오일 함유, 430 mg) 의 DMF 현탁액에, 국제 공개 공보 No. WO02/32872 에 기재된 4-(1H-5-인돌릴옥시)-2-피리딘아민 (2.253 g, CAS #417722-11-3) 을 실온에서 질소 대기 하에 서서히 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10 분간 교반한 후 빙랭 수조에서 냉각한 다음 페닐 N-메틸카바메이트 (1.587 g) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물에 가하고 이들 사이에 분획하여 유기층을 분리하였다. 생성된 유기층을 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 차례로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 용매를 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로부터 결정화하고, 침전된 결정을 여과 수합하고 환기 하에 건조하여 N1-메틸-5-(2-아미노-4-피리딜)옥시-1H-인돌카르복사미드 (2.163 g) 를 담갈색 결정으로 수득하였다. 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00027
페닐 N-{4-[1-(메틸아민)카르보닐-1H-5- 인돌릴옥시 ]-2- 피리딜 }-N-( 페녹시카르보닐 ) 카바메이트의 합성
THF (140 mL) 및 DMF (1.4 mL) 중의 N1-메틸-5-(2-아미노-4-피리딜)옥시-1H-인돌카르복사미드 (2.0 g) 현탁액에 트리에틸아민 (2.2 mL) 을 가하였다. 빙랭 하에, 페닐 클로로포르메이트 (1.8 mL) 를 상기 반응 혼합물에 가한 후 이를 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 페닐 클로로포르메이트 (0.5 mL) 를 추가로 첨가한 후, 이 반응 혼합물을 실온에서 추가로 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 포화 수성 염화나트륨에 가하고 이들 사이에 분획하여 유기층을 분리하였다. 생성된 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 증발시켜서 용매를 제거하였다. 디에틸 에테르를 잔류물에 가하고, 침전된 결정을 여과 수합하고 디에틸 에테르로 세정한 후 환기 하에 건조하여, 페닐 N-{4-[1-(메틸아민)카르보닐-1H-5-인돌릴옥시]-2-피리딜}-N- (페녹시카르보닐)카바메이트 (3.3 g) 를 담갈색 결정으로 수득하였다. 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00028
5-{2-{3-[(1R)-1- 히드록시메틸 -2-옥소-2-피페리딘-1- 일에틸 ] 유레이도 }피리딘-4-일옥시}-1H-인돌-1- 카르복실산 메틸아미드의 합성
(2R)-벤질옥시카르보닐아미노-3-히드록시프로피온산 (1.91 g) 및 N-메틸모르폴린 (809 mg) 의 THF 용액에 이소부틸 클로로포르메이트 (1.09 g) 를 -15℃ 이하에서 적가하고, 반응 혼합물을 30 분간 교반하였다. 피롤리딘 (1.13 g) 을 -15℃ 이하에서 첨가한 후, 반응 혼합물을 0℃ 에서 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물에 가하고 이들 사이에 분획하여 유기층을 분리하였다. 생성된 유기층을 1N 염산, 1N 수성 수산화나트륨, 포화 수성 중탄산나트륨 및 포화 수성 염화나트륨으로 차례로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 다음 용매를 증발 제거하였다. 생성된 잔류물을 메탄올 (15 mL) 및 THF (15 mL) 에 용해한 후, 10% 팔라듐-탄소 (물-함유 생성물, 300 mg) 을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 수소 스트림 하에 90분간 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 여과액을 감압 하에 농축하여, (2R)-아미노-3-히드록시-1-(피페리딘-1-일)프로판-1-온 (684 mg) 을 무색 오일로 수득하였다. DMF (3 mL) 중의 페닐 N-{4-[1-(메틸아민)카르보닐-1H-5-인돌릴옥시]-2-피리딜}-N-(페녹시카르보닐)카바메이트 (157 mg) 및 트리에틸아민 (1.5 mL) 용액에 (2R)-아미노-3-히드록시-1-(피페리딘-1-일)프로판-1-온 (228 mg) 을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 교반한 다음 에틸 아세테이트 및 포화 수성 염화암모늄에 가하고 이들 사이에 분획하여 유기층을 분리하였다. 생성된 유기층을 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 차례로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 용매를 증발 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 에틸 아세테이트:메탄올 = 50: 1) 로 정제하고 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합 용매로부터 결정화하였다. 생성된 결정을 여과 수합하고 환기 하에 건조하여, 5-{2-{3-[(1R)-1-히드록시메틸-2-옥소-2-피페리딘-1-일에틸]유레이도}피리딘-4-일옥시}-1H-인돌-1-카르복실산 메틸아미드 (107 mg) 를 흰색 결정으로 수득하였다. 생성된 화합물의 물리적 특성 데이타는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112007080232949-PCT00029
실시예 7 래트 초대 배양된 신경세포 배양물의 상청액 중 Aβ 종에 대한 MALDI-TOF/MS 분석
(1) 래트 신경세포의 초대 배양
상기 실시예 3 과 동일한 방법으로, 태령 18 일의 Wistar 래트로부터 뇌 피질-유래 신경세포를 준비하였다. 뇌 피질-유래 신경세포 현탁액을 배지로 희석하고, 폴리-D-라이신으로 예비-코팅된 10 cm 폴리스티렌 배양 접시 상에 15 ml/접시 부피로 접종하여 (BIOCOAT® cell environments poly-D-lysine cell culture dish, Becton Dickinson Labware) 초기 세포 밀도 3.5×105 세포/cm2 를 얻었다. 접종된 세포를 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 의 인큐베이터에서 하루 동안 배양하고, 배지를 새로운 Neurobasal/B27/2ME 로 완전히 교체한 다음, 추가로 3 일간 배양하였다.
(2) 화합물 첨가
배양 개시 후 4일째, 앞선 실시예에서 합성한 시험 화합물, 즉 화합물 A, 화합물 B (CAS#501907-79-5) 또는 화합물 C (CAS#670250-40-5) 를 다음과 같이 첨가하였다. 배지를 완전히 제거하고 2-ME 없는 Neurobasal/B27/2ME (즉, Neurobasal/B27) 로써 11 ml/접시 부피로 대체하였다. DMSO 중의 시험 화합물 (화합물 A, B 및 C) 을 Neurobasal/B27 로써 최종 농도의 100 배로 희석하고 110 ㎕/접시 부피로 첨가한 다음 충분히 혼합하였다. 최종 DMSO 농도를 1% 이하로 유지하였다. 대조군에는 DMSO 만 첨가하였다.
(3) 샘플링
시험 화합물의 첨가 후, 세포를 3 일간 배양하고 배지 전체 부피를 각 접시로부터 수합하였다. 수득한 배지를 MALDI-TOF/MS 시료로 제공하였다.
(4) 세포 생존율 평가
세포 생존율을 MTT 측정법에 의해 하기 방법으로 평가하였다. 배지 수합 후의 접시에 가온된 배지를 10 ml/접시 부피로 가하고 D-PBS 중의 8 mg/ml MTT 용액을 500 ㎕/접시 부피로 가하였다. 접시를 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 의 인큐베이터에서 20 분간 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후, DMSO 를 접시에 10 ml/접시 부피로 가하여 침전된 MTT 포르마잔 결정을 충분히 용해한 다음, 각 접시의 550 nm 흡광도를 측정하였다. 각 접시의 대조군 (미처리 군, CTRL) 에 대한 비율 (CTRL 의 %) 을 계산하고 세포 생존 활성의 비교 및 평가에 이용하였다.
(5) 면역침전법
각 샘플링된 배양 상청액을 15 mL 원심분리관에 수합하고 400 μL 의 단백질분해효소 억제제 칵테일 25-배 농축 용액 Complete (Roche Diagnostics GmbH) 을 보충한 후, 4℃ 에서 3,000 rpm 으로 5 분간 원심분리하여 세포 절편을 침전시켰다. 생성된 상청액을 다른 15 mL 원심분리관으로 옮기고, 내부 기준으로서 합성 Aβ12-28 (Bachem) 을 최종 농도 2 nM 로 보충한 다음, 5 ㎍ 항-Aβ 단일클론 항체 (클론명: 4G8, Signet Laboratories, Inc) 를 첨가하였다. 이 후, 4℃ 에 서 2% BSA 로 블로킹하고 TBS 완충제로 세정한 5 μL 의 단백질 G + 단백질 A 아가로스 (Oncogene Research Products) 를 가하였다. 또한 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS; SIGMA) 를 각 튜브에 최종 농도 1% 로 가하고, 4℃ 에서 4 내지 8 시간 동안 혼합하였다.
(6) MALDI-TOF/MS [Matrix-Associated Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry]
면역침전된 Aβ 절편이 흡착된 단백질 G + 단백질 A 아가로스를, 각 튜브를 4℃ 에서 3,000 rpm 으로 5 분간 원심분리하여 수합하고 1.5 mL 마이크로튜브로 옮겼다. 단백질 G + 단백질 A 아가로스를 500 μL 의 140 mM NaCl, 0.1% N-옥틸 글루코시드 (NOG; Loche Diagnostics GmbH), 10 mM Tris-HCl, pH 8 로 2회 세정하고, 500 μL 의 Tris-HCl, 10 mM, pH 8 로 1회 세정한 다음, 500 μL 의 이온교환수로 1회 세정하였다. 이온교환수로 세정한 다음, 각 튜브로부터 액체를 가능한 한 많이 제거하고 Aβ 를 5 μL 의 0.2% NOG, 2.4% 트리플루오로아세트산 (TFA; PIERCE) 및 48.7% 아세토니트릴 (HPLC 등급, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 로 용출하였다. 이와 별도로, α-시아노-4-히드록시-신남산 (CHCA; BRUKER DALTONICS) 을 0.2% NOG, 0.1% TFA 및 33% 아세토니트릴에 포화 농도로 용해하고 인간 인슐린 (Peptide Institute, Inc.) 및 안지오텐신 III (Peptide Institute, Inc.) 을 질량 표준으로서 각각 최종 농도 167 nM 및 56 nM 로 보충하여 매트릭스 용액으로 이용하였다. 각 Aβ 용출액 (0.5 μL) 및 매트릭스 용액 (0.5 μL) 을 질량 분석용 시료 플레이트 상에 동일 위치에 스포팅한 후, 질량 분 석기 Voyager DE (Applied Biosystems) 로 분석하였다. 모든 검출된 질량 데이타는 인간 인슐린 및 안지오텐신 III 의 질량에 대해 교정되었다 (각각 5807.6 및 931.1). 시료 간의 검출된 Aβ 강도의 정규화를, 내부 기준 Aβ12-28 의 검출 강도가 모든 시료에서 동일하다는 가정하에 실시하였다.
래트형 Aβ (SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 22) 는 인간형 Aβ (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 18) 와 아미노산 서열 중 아미노산 위치 5 (R→G), 10 (Y→F) 및 13 (H→R) 에서 상이하고, 주생성물로서 Aβ1-Y 뿐만 아니라 Aβ11-Y 또한 생성하는 것으로 알려져 있다 (여기서, Y 는 32 - 42 의 정수) (J. Neurochem. 71, 1920-1925, 1998).
반면 인간형 APP 의 생성물 중에서, Aβ1-40 이 가장 주요한 피크로 관찰되었고, Aβ1-37, Aβ1-38 및 Aβ1-42 는 부수적 피크로 관찰되었다 (J. Biol. Chem. 271(50), 31894-31902, 1996). 이 패턴은 본 실시예에서 관측된 래트 초대 배양된 신경세포의 것과 매우 유사하고 (Aβ1-Y 및 Aβ11-Y 를 동일 절편으로 볼 경우 가정), 또한 아미노산 14 의 다운스트림 서열이 래트형과 인간형 간에 동일하다. 즉, γ-위치 절단과 관련하여 래트형 Aβ 로부터 발견된 사실을 인간형 Aβ 에 적용할 수 있다; 이는 당업자에게 자명하다. 따라서 본 실시예의 데이타 분석을 Aβ1-Y 및 Aβ11-Y 에 대해 실시하였다 (여기서, Y 는 32 - 42 의 정수).
(7) 결과
시험 화합물 부재 하의 신경세포 배양 상청액 중 각 Aβ 절편에 대한 MALDI-TOF/MS 분석 결과를 도 5A 에 나타내었고, 도 5B 는 도 5A 중 분자량 범위 2421 ~ 4565 의 확대도이다. 이들 결과를 위하여, 각 피크의 강도를 그 높이 및 면적을 토대로 점수화하였다. 시험 화합물 존재 하의 신경세포 배양 상청액의 MALDI-TOF/MS 분석 결과 또한 동일한 형식으로 얻었으므로, 피크 면적 데이타를 피크 강도 값으로 이용하여 비교 전에 내부 기준 Aβ12-28 의 강도에 대해 정규화하였다. 도 6A 내지 6C 는 다양한 농도의 각 시험 화합물에서 관측된 개별 Aβ 절편의 강도 변화를 보여준다.
화합물 A (도 6A)
Aβ1-42 또는 Aβ11-42 에 대해 탐지가능한 변화가 관측되지 않았지만, 본 도면은 Aβ1-40 또는 Aβ11-40 생성이 화합물 A 농도에 의존하는 방식으로 억제됨을 나타낸다. 반대로 Aβ1-37 또는 Aβ11-37 생성 및 Aβ1-38 또는 Aβ11-38 생성은 화합물 A 농도에 의존하는 방식으로 증강되는 것으로 나타났다.
화합물 B ( CAS #501907-79-5) (도 6B)
Aβ1-42 또는 Aβ11-42 에 대해 탐지가능한 변화가 관측되지 않았지만, 본 도면은 Aβ1-40 또는 Aβ11-40 생성이 화합물 B 농도에 의존하는 방식으로 억제됨을 나타낸다. 반대로 Aβ1-37 또는 Aβ11-37 생성 및 Aβ1-38 또는 Aβ11-38 생성은 화합물 B 농도에 의존하는 방식으로 증강되는 것으로 나타났다.
화합물 C ( CAS #670250-40-5) (도 6C)
Aβ1-42 또는 Aβ11-42 에 대해 탐지가능한 변화가 관측되지 않았지만, 본 도면은 Aβ1-40 또는 Aβ11-40 생성이 억제되는 경향이 있음을 나타낸다. 반대로 Aβ1-37 또는 Aβ11-37 생성 및 Aβ1-39 또는 Aβ11-39 생성은 화합물 C 농도에 의존하는 방식으로 증강되는 것으로 나타났다.
실시예 8 래트 초대 배양된 신경세포 배양물 상청액 중 Aβ 종에 대한 정량적 ELISA 분석
(1) ELISA 측정용 시료
상술한 실시예 7(3) 에서 수합된 각 배지 일부를 ELISA 시료로 사용하였다. Aβ42 측정을 위해 각 시료를 희석하지 않은 반면, Aβ40 측정을 위해 ELISA 수행 전에 ELISA 키트에 첨부된 희석제로 5-배 희석하였다.
(2) Aβ ELISA
각 Aβ 의 보정 곡선이 베타-아밀로이드 펩티드 1-42 (래트) 또는 베타-아밀로이드 펩티드 1-40 (래트) (Calbiochem. #171596[Aβ42] 또는 #171593[Aβ40]) 을 이용하여 준비되었음을 전제로 하여, 인간 아밀로이드 베타 (1-42) 분석용 키트 (#17711, IBL Co., Ltd.) 및 인간 아밀로이드 베타 (1-40) 분석용 키트 (#17713, IBL Co., Ltd.) 를 이용하여 키트의 권장 프로토콜 (첨부된 서류에 기재된 절차) 에 따라 Aβ ELISA 를 수행하였다. 그 결과를 대조군 (미처리 군) 의 배지 내 Aβ 농도에 대한 백분율 (대조군의 %) 로 표현하였다.
(3) 결과
그 결과는, 모든 화합물 A, B 및 C 가 Aβ40 (흰색 사각형, □) 및 Aβ42 (검은색 사각형, ■) 생성을 농도-의존적 방식으로 억제함을 나타내었다 (도 7A 내 지 7C).
본원에서의 기술 용어는 특정한 구현예를 예시하고자 사용될 뿐, 한정하고자 사용되는 것이 아니다.
달리 정의하지 않는 한, 본원의 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질은 상기한 바와 같다.
본원의 모든 공개문헌은, 예컨대 본원과 관련하여 이용된 공개문헌에 보고된 세포주, 구축물 및 방법론을 설명 및 개시하고자 그 전체가 참조 병합되거나, 본 발명의 화합물의 동정 및 스크리닝 방법 및 이들 기술에 이용되는 방법 및 조성물의 개시를 위해 참조 병합되며; 이들을 본 발명을 실시하는 데 이용할 수 있다.
<110> Eisai R&D Management Co., Ltd. <120> A THERAPEUTIC AGENT FOR Abeta RELATED DISORDERS <130> PCT06-0038 <150> US 11/111,504 <151> 2005-04-20 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2088 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2085) <400> 1 atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg gct cgg 48 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc 96 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag 144 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat 192 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg 240 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 cag atc acc aat gtg 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Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr 515 520 525 gtg gag ctc ctt ccc gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag 1632 Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln 530 535 540 ccg tgg cat tct ttt ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac 1680 Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn 545 550 555 560 gaa gtt gag cct gtt gat gcc cgc cct gct gcc gac cga gga ctg acc 1728 Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr 565 570 575 act cga cca ggt tct ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tct 1776 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser 580 585 590 gaa gtg aag atg gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt 1824 Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 595 600 605 cat cat caa aaa ttg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa 1872 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 610 615 620 ggt gca atc att gga ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg 1920 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 625 630 635 640 atc gtc atc acc ttg gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att 1968 Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 645 650 655 cat cat ggt gtg gtg gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc 2016 His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 660 665 670 cac ctg tcc aag atg cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag 2064 His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 675 680 685 ttc ttt gag cag atg cag aac tag 2088 Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 690 695 <210> 2 <211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 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gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg 2160 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg 2208 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc cac ctg tcc aag atg 2256 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg 2304 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 cag aac tag 2313 Gln Asn 770 <210> 6 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 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Thr Ile Gln Asn 85 90 95 tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acg cac acc cac atc gtg 336 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Thr His Ile Val 100 105 110 att cct tac cgg tgc cta gtt ggt gag ttt gta agc gat gcc ctt ctc 384 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 gtg ccc gac aag tgc aag ttt cta cac cag gag cgg atg gac gtt tgt 432 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 gag acc cat ctt cac tgg cat act gtt gcc aaa gag aca tgc agt gag 480 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 aag agc act aac ttg cac gac tat ggc atg ctg ctg ccc tgt ggc atc 528 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 gac aag ttc cga ggg gtc gag ttc gtg tgc tgc ccg ttg gcg gag gag 576 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 agc gac agc atc gat tct gcg gac gca gag gag gac gac tcc gat gtc 624 Ser Asp Ser Ile Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 tgg tgg ggt gga gcg gac aca gac tat gct gat ggc ggt gaa gac aaa 672 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Gly Glu Asp Lys 210 215 220 gtc gta gaa gta gcc gaa gag gag gaa gtg gcc gat gtt gag gaa gaa 720 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Asp Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 gaa gct gag gat gac gag gat gtg gag gat ggg gat gag gtg gag gag 768 Glu Ala Glu Asp Asp Glu Asp Val Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 gag gcc gag gag ccc tac gaa gag gcc aca gag aga aca acc agc att 816 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 gcc acc act acc aca act acc act gag tct gtg gag gag gta gtc cga 864 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 gag gtg tgc tct gaa caa gct gag acc ggg cca tgc cgt gca atg atc 912 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 tcc cgc tgg tac ttt gat gtc act gaa gga aag tgc gcc cca ttc ttt 960 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 tac ggc gga tgt ggc ggc aac agg aac aac ttt gac act gaa gag tac 1008 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 tgc atg gcg gtg tgt ggc agc gtg tca tcc caa agt tta ctc aag act 1056 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Val Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 acc agt gaa cct ctt ccc caa gat ccg gtt aaa ctt ccc acg acg gca 1104 Thr Ser Glu Pro Leu Pro Gln Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 gcc agc acc cct gac gca gtc gac aag tac ctg gag acc ccc gga gat 1152 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 gag aac gag cac gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ttg gaa gcc 1200 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 aag cac cga gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gag gag gca 1248 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 gaa cgt caa gcc aag aat ttg ccc aaa gct gac aag aag gcc gtt atc 1296 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ctg gaa cag gaa gca gcc aac 1344 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 gag agg cag cag ctt gta gag aca cac atg gcc aga gtt gaa gcc atg 1392 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 ctc aat gat cgc cgt cgc ctg gcc ctc gag aat tac atc acc gca ctg 1440 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 cag gcg gtg cct cca agg cct cat cat gtg ttc aac atg ctg aag aag 1488 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro His His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 tac gtc cgt gca gag cag aag gac aga cag cac acc cta aag cat ttt 1536 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 gaa cat gtg cgc atg gtg gac ccc aag aaa gct gct cag atc cgg tcc 1584 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg atc tac gag cgc atg aac cag tct 1632 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 ctg tcc ctg ctc tac aac gtc cct gcc gtg gct gag gag att caa gat 1680 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 gaa gtt gac gag ctg ctt cag aag gag cag aac tac tcc gac gac gtc 1728 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 tta gcc aac atg atc agt gaa ccc aga atc agt tac ggc aac gat gct 1776 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 ctc atg cct tct ttg act gaa acg aag acc act gtg gag ctc ctt ccc 1824 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 gtg aat ggc gaa ttc agc ctg gat gat ctc caa ccg tgg cat cct ttt 1872 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Pro Phe 610 615 620 ggg gtg gac tct gtg cca gcc aat aca gaa aat gaa gtt gag cct gtc 1920 Gly Val Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 gac gcc cgc ccc gct gct gac cga gga ctg acc act cga cca ggg tct 1968 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 ggg ttg aca aac atc aag aca gaa gag atc tca gaa gtg aag atg gat 2016 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 gcg gag ttc gga cat gat tca ggc ttc gaa gtc cgc cat caa aaa ctg 2064 Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys Leu 675 680 685 gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gcc atc att gga 2112 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 ctc atg gtg ggt ggc gtt gtc ata gca aca gtg att gtc atc acc ttg 2160 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc atc cat cat ggc gtg gtg 2208 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 gag gtt gac gct gct gtg acc ccg gag gag cgc cac ctc tcc aag atg 2256 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 cag cag aat gga tat gag aat cca aca tac aag ttc ttt gag cag atg 2304 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 cag aac taa 2313 Gln Asn 770 <210> 10 <211> 770 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Met Leu Pro Ser Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Val Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Lys Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Glu Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Gly 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Thr His Ile Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Ser Ile Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Gly Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Asp Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Glu Asp Asp Glu Asp Val Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Val Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Ser Glu Pro Leu Pro Gln Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro His His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Pro Phe 610 615 620 Gly Val Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 11 <211> 111 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(111) <400> 11 gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 ttg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gca atc att 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 gga ctc atg gtg ggc 111 Gly Leu Met Val Gly 35 <210> 12 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly 35 <210> 13 <211> 111 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(111) <400> 13 gat gca gaa ttc gga cat gat tca gga ttt gaa gtc cgc cat caa aaa 48 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 ctg gtg ttc ttt gct gaa gat gtg ggt tcg aac aaa ggc gcc atc atc 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 gga ctc atg gtg ggc 111 Gly Leu Met Val Gly 35 <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly 35 <210> 15 <211> 111 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(111) <400> 15 gat gcg gag ttc gga cat gat tca ggc ttc gaa gtc cgc cat caa aaa 48 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 ctg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gcc atc att 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 gga ctc atg gtg ggt 111 Gly Leu Met Val Gly 35 <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 16 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly 35 <210> 17 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(114) <400> 17 gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 ttg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gca atc att 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 gga ctc atg gtg ggc ggt 114 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 18 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 19 <211> 114 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(114) <400> 19 gat gca gaa ttc gga cat gat tca gga ttt gaa gtc cgc cat caa aaa 48 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 ctg gtg ttc ttt gct gaa gat gtg ggt tcg aac aaa ggc gcc atc atc 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 gga ctc atg gtg ggc ggc 114 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 20 <211> 38 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 21 <211> 114 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(114) <400> 21 gat gcg gag ttc gga cat gat tca ggc ttc gaa gtc cgc cat caa aaa 48 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 ctg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gcc atc att 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 gga ctc atg gtg ggt ggc 114 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 22 <211> 38 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 22 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly 35

Claims (60)

  1. 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 이용하여 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성의 억제 방법.
  2. 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성의 억제 및 Aβ37 생성의 증강 방법.
  3. Aβ37 및/또는 Aβ38 이 생체 또는 이의 일부에서 Aβ42 에 작용하도록 하는 것을 포함하는 Aβ 응집의 억제 방법.
  4. 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하여 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 포함하는 Aβ 응집의 억제 방법.
  5. 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증 강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 Aβ 응집의 억제 방법.
  6. Aβ37 및/또는 Aβ38 이 생체 또는 이의 일부에서 Aβ42 에 작용하도록 하는 것을 포함하는 신경세포 사멸 방지 방법.
  7. 생체 또는 이의 일부에서 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하여 Aβ37 생성을 증강시키는 것을 포함하는 신경세포 사멸 방지 방법.
  8. 생체 또는 이의 일부에서 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 신경세포 사멸 방지 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체의 일부가 뇌인 방법.
  10. Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 Aβ 응집 억제제.
  11. Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 신경세포 사멸 억제제.
  12. Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료에 사용되는 약학 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
  15. 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 Aβ 응집 억제제:
    (a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
  16. 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 신경세포 사멸 억제제:
    (a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
  17. 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 약학 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
  18. 제 17 항에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료에 사용되는 약학 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
  20. 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Aβ 응집 억제제:
    (a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
  21. 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 (b) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 Aβ 응집 억제제:
    (a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 (stringent conditions) 하에 혼성화하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 신경세포 사멸 억제제:
    (a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
  23. 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 (b) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 신경세포 사멸 억제제:
    (a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에 혼성화하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 하기 펩티드 (a) 및 (b), 및 이의 절편으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22 중 임의의 하나에 표시된 아미노산 서열로부터, 하나 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가, 또는 이의 조합에 의해 유도된 아미노 산 서열을 포함하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드.
  25. 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 (b) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하는 약학 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 21 중 임의의 하나에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에 혼성화하고 Aβ 응집에 대해 억제 활성을 갖는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료에 사용되는 약학 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
  28. Aβ-기초 질환의 치료를 요하는 포유류에, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 Aβ-기초 질환의 치료 방법.
  29. Aβ-기초 질환의 치료를 요하는 포유류에, 제 12 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항, 제 19 항, 제 24 항, 제 25 항, 제 26 항 및 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 Aβ-기초 질환의 치료 방법.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 방법.
  31. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
  32. 하기를 포함하는 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 방법:
    (a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
    (b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 측정함;
    (c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양과 비교하여 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키는 후보 화합물을 선별함; 및
    (d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
  33. 하기를 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 동정 방법:
    (a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
    (b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양을 측정함;
    (c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양과 비교하여, 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키고 또한 Aβ40 및 Aβ42 의 양을 감소시키는 후보 화합물을 선별함; 및
    (d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
  34. 하기를 포함하는 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
    (b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 측정함;
    (c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양과 비교하여 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키는 후보 화합물을 선별함; 및
    (d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
  35. 하기를 포함하는 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 후보 화합물을 생물학적 조성물과 접촉시킴;
    (b) 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양 및 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양을 측정함;
    (c) 후보 화합물과 접촉하지 않은 생물학적 조성물 중의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ37 의 양과 비교하여, 후보 화합물과 접촉한 생물학적 조성물 중의 Aβ37 의 양을 증가시키고 또한 Aβ40 및 Aβ42 의 양을 감소시키는 후보 화합물을 선별함; 및
    (d) 상기 (c) 에서 수득한 후보 화합물을 Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물로서 동정함.
  36. 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 조성물이 β-아밀로이드 전구체 단백질-발현 세포를 포함하는 방법.
  37. 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 조성물이 포유류 세포를 포함하는 방법.
  38. 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 조성물이 신경세포를 포함하는 방법.
  39. Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 콜린에스터라제-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 약학 조성물.
  40. 제 39 항에 있어서, 콜린에스터라제-억제 물질이 도네페질 또는 이의 염인 약학 조성물.
  41. 제 39 항에 있어서, NMDA 수용체 길항제가 메만틴인 약학 조성물.
  42. 제 39 항에 있어서, AMPA 수용체 길항제가 탈람파넬인 약학 조성물.
  43. 제 39 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ-기초 질환의 치료제인 약학 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 약학 조성물.
  45. Aβ-기초 질환의 치료를 요하는 포유류에, Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량, 및 콜린에스터라제-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 Aβ-기초 질환의 치료 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 콜린에스터라제-억제 물질이 도네페질 또는 이의 염인 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, NMDA 수용체 길항제가 메만틴인 방법.
  48. 제 45 항에 있어서, AMPA 수용체 길항제가 탈람파넬인 방법.
  49. 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ-기초 질환이 알츠하이머병, 알츠하이머 유형의 노인성 치매, 경도인지장애, 노인성 치매, 다운 증후군 및 아밀로이드증으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 질환인 방법.
  50. 제 45 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
  51. Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, Aβ40 및 Aβ42 생성을 억제하고 Aβ37 생성을 증강시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물의 염 및 이의 용매화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 콜린에스터라제-억제 물질, NMDA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 키트.
  52. 제 51 항에 있어서, 콜린에스터라제-억제 물질이 도네페질 또는 이의 염인 키트.
  53. 제 51 항에 있어서, NMDA 수용체 길항제가 메만틴인 키트.
  54. 제 51 항에 있어서, AMPA 수용체 길항제가 탈람파넬인 키트.
  55. 제 15 항에 있어서, 펩티드 (a) 및 (b) 및 이의 절편이 이의 염 또는 용매화물의 형태인 억제제.
  56. 제 16 항에 있어서, 펩티드 (a) 및 (b) 및 이의 절편이 이의 염 또는 용매화물 형태인 억제제.
  57. 제 17 항에 있어서, 펩티드 (a) 및 (b) 및 이의 절편이 이의 염 또는 용매화물 형태인 약학 조성물.
  58. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드(들)이 이의 염 또는 용매화물 형태인 억제제.
  59. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드(들)이 이의 염 또는 용매화물 형태인 억제제.
  60. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드(들)이 이의 염 또는 용매화물 형태인 약학 조성물.
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