JP2018503387A5 - - Google Patents
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Description
本明細書で用いられる「一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型」または「ssODT」という語句は、HDRの鋳型として細胞が利用できるDNAオリゴヌクレオチドを指す。概して、ssODTは、標的部位に対して少なくとも1つの相同領域を有する。いくつかの場合において、ssODTは、標的切断部位に挿入されるべき変異または異種配列を含有する領域に隣接する2つの相同領域を有する。
[本発明1001]
a)Cas9リボヌクレオタンパク質複合体と細胞とを含む反応混合物を提供する工程であって、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、Cas9ヌクレアーゼドメインと、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAとを含む、工程；および
b)細胞内部にCas9リボヌクレオタンパク質複合体を導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞である、方法。
[本発明1002]
少なくとも約20％のゲノム編集の効率をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1003]
細胞が、Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない、本発明1001の方法。
[本発明1004]
a)の提供する工程の前に、細胞が不死化も形質転換もされない、本発明1001の方法。
[本発明1005]
b)の導入する工程の後に、細胞が不死化も形質転換もされない、本発明1004の方法。
[本発明1006]
a)の提供する工程の前に、細胞が継代されていない、本発明1001の方法。
[本発明1007]
a)の提供する工程の前に、細胞が宿主生物または組織から直接単離されており、かつ培養されている、本発明1006の方法。
[本発明1008]
a)の提供する工程の前に、細胞が宿主生物または組織から直接単離されており、かつ培養されていない、本発明1006の方法。
[本発明1009]
導入する工程がエレクトロポレーションを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
導入する工程が、
ナノワイヤまたはナノチューブをCas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートする工程；
細胞を、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブと接触させる工程；および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブで細胞の細胞膜を突き通す工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
導入する工程が、
反応混合物を、細胞の直径より小さい細胞変形コンストリクション(cell deforming constriction)に強制的に通過させる工程であって、細胞の細胞膜に一過性の細孔を導入する、工程；および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を、一過性の細孔を通って細胞に進入させる工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、細胞上の細胞外受容体に対するリガンドを含み、かつ導入する工程が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の受容体媒介性内部移行を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が細胞透過性ペプチドを含み、かつ導入する工程が細胞透過性ペプチドを細胞に接触させる工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
エレクトロポレーションが、カソード電極とアノード電極との間のチャンバー内に反応混合物を配置する工程、およびカソード電極とアノード電極との間に約20 kV/mから約100 kV/mの電位を印加する工程を含む、本発明1009の方法。
[本発明1015]
電位が、約5 msから約100 msの長さを有するパルスとして印加される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
電位パルスの印加を2から10回繰り返す工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
チャンバーが、長手方向の長さおよび水平断面積を有する中空の部材であり；
チャンバーが、長手方向の長さによって隔てられた第1の遠位端および第2の遠位端を含み；かつ
チャンバーが、第1の遠位端に第1の電極と、チャンバーの第2の遠位端と流体連通している電解液を含有するリザーバーとを有し、該リザーバーが第2の電極を有する、
本発明1014の方法。
[本発明1018]
チャンバーが、50から10,000の範囲で水平断面積に対する長手方向の長さの比率を有する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.25μMから約5μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.9μMから約1.8μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
反応混合物が、約1×10 5 から約4×10 5 個の初代造血細胞または初代造血幹細胞を含有する、本発明1001の方法。
[本発明1022]
反応混合物が、約2×10 5 から約2.5×10 5 個の初代造血細胞または初代造血幹細胞を含有する、本発明1001の方法。
[本発明1023]
細胞が初代造血細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
初代造血細胞が免疫細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
免疫細胞がT細胞である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
T細胞が制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞がCD4 + T細胞である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
T細胞がCD4 + CD25 hi CD127 lo 制御性T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1029]
T細胞がFOXP3 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1030]
T細胞がCD4 + CD25 lo CD127 hi エフェクターT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1031]
T細胞がCD4 + CD25 lo CD127 hi CD45RA hi CD45RO - ナイーブT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1032]
T細胞がCD8 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1033]
T細胞がCD4 + CD8 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1034]
a)の提供する工程の前に、T細胞が予め活性化される、本発明1025の方法。
[本発明1035]
a)の提供する工程の前に、T細胞が刺激されない、本発明1025の方法。
[本発明1036]
T細胞が組換え抗原受容体を含む、本発明1025の方法。
[本発明1037]
反応混合物が、一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型をさらに含み、かつ方法が、細胞内部に一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を導入する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1038]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約9μMから約180μMの濃度である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約45μMの濃度である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
少なくとも約30％の初代造血細胞または初代造血幹細胞のゲノム編集の効率をもたらす、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
少なくとも約10％または少なくとも約14％の初代造血細胞または初代造血幹細胞の鋳型指向性ゲノム編集の効率をもたらす、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が、組換え抗原受容体、その一部分、またはその構成成分をコードする、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1043]
細胞がT細胞であり、かつ方法が、
c)b)の導入する工程の後に、CD3アゴニストおよびCD28アゴニストを含有する培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1044]
CD3アゴニストおよびCD28アゴニストが固体表面上に固定化されている、本発明1043の方法。
[本発明1045]
CD3アゴニストが抗CD3抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
CD28アゴニストが抗CD28抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1047]
c)c)の培養する工程の後に、CD3アゴニストもCD28アゴニストも含有しない培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、本発明1043の方法。
[本発明1048]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ヌクレアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1049]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ニッカーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1050]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼに融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1051]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、転写モジュレーターまたはクロマチン修飾因子に融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1052]
反応混合物が、少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1053]
少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、構造的に異なるsgRNAを含有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、構造的に異なるCas9ドメインを含有する、本発明1052の方法。
[本発明1055]
a)Cas9ヌクレアーゼドメインと細胞とを含む反応混合物を提供する工程；および
b)細胞内部にCas9ヌクレアーゼドメインを導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞であり、Cas9ヌクレアーゼドメインが細胞内部のガイドRNAと複合体を形成する、方法。
[本発明1056]
細胞内部のガイドRNAが細胞内部のガイドRNA遺伝子によってコードされ、ガイドRNA遺伝子がDNAを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
細胞が、Cas9ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を含有しない、本発明1055または1056の方法。
[本発明1058]
Cas9送達の効率が少なくとも約20％または30％である、本発明1055の方法。
[本発明1059]
Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞であって、該複数の細胞の少なくとも20％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞。
[本発明1060]
その少なくとも30％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1061]
その少なくとも20％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体および一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1062]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の存在について濃縮されていない、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1063]
その少なくとも20％または30％が、二本鎖切断、またはNHEJもしくはHDR修復二本鎖切断を標的ゲノム領域に含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1001]
a)Cas9リボヌクレオタンパク質複合体と細胞とを含む反応混合物を提供する工程であって、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、Cas9ヌクレアーゼドメインと、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAとを含む、工程；および
b)細胞内部にCas9リボヌクレオタンパク質複合体を導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞である、方法。
[本発明1002]
少なくとも約20％のゲノム編集の効率をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1003]
細胞が、Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない、本発明1001の方法。
[本発明1004]
a)の提供する工程の前に、細胞が不死化も形質転換もされない、本発明1001の方法。
[本発明1005]
b)の導入する工程の後に、細胞が不死化も形質転換もされない、本発明1004の方法。
[本発明1006]
a)の提供する工程の前に、細胞が継代されていない、本発明1001の方法。
[本発明1007]
a)の提供する工程の前に、細胞が宿主生物または組織から直接単離されており、かつ培養されている、本発明1006の方法。
[本発明1008]
a)の提供する工程の前に、細胞が宿主生物または組織から直接単離されており、かつ培養されていない、本発明1006の方法。
[本発明1009]
導入する工程がエレクトロポレーションを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
導入する工程が、
ナノワイヤまたはナノチューブをCas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートする工程；
細胞を、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブと接触させる工程；および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブで細胞の細胞膜を突き通す工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
導入する工程が、
反応混合物を、細胞の直径より小さい細胞変形コンストリクション(cell deforming constriction)に強制的に通過させる工程であって、細胞の細胞膜に一過性の細孔を導入する、工程；および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を、一過性の細孔を通って細胞に進入させる工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、細胞上の細胞外受容体に対するリガンドを含み、かつ導入する工程が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の受容体媒介性内部移行を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が細胞透過性ペプチドを含み、かつ導入する工程が細胞透過性ペプチドを細胞に接触させる工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
エレクトロポレーションが、カソード電極とアノード電極との間のチャンバー内に反応混合物を配置する工程、およびカソード電極とアノード電極との間に約20 kV/mから約100 kV/mの電位を印加する工程を含む、本発明1009の方法。
[本発明1015]
電位が、約5 msから約100 msの長さを有するパルスとして印加される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
電位パルスの印加を2から10回繰り返す工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
チャンバーが、長手方向の長さおよび水平断面積を有する中空の部材であり；
チャンバーが、長手方向の長さによって隔てられた第1の遠位端および第2の遠位端を含み；かつ
チャンバーが、第1の遠位端に第1の電極と、チャンバーの第2の遠位端と流体連通している電解液を含有するリザーバーとを有し、該リザーバーが第2の電極を有する、
本発明1014の方法。
[本発明1018]
チャンバーが、50から10,000の範囲で水平断面積に対する長手方向の長さの比率を有する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.25μMから約5μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.9μMから約1.8μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
反応混合物が、約1×10 5 から約4×10 5 個の初代造血細胞または初代造血幹細胞を含有する、本発明1001の方法。
[本発明1022]
反応混合物が、約2×10 5 から約2.5×10 5 個の初代造血細胞または初代造血幹細胞を含有する、本発明1001の方法。
[本発明1023]
細胞が初代造血細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
初代造血細胞が免疫細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
免疫細胞がT細胞である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
T細胞が制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞がCD4 + T細胞である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
T細胞がCD4 + CD25 hi CD127 lo 制御性T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1029]
T細胞がFOXP3 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1030]
T細胞がCD4 + CD25 lo CD127 hi エフェクターT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1031]
T細胞がCD4 + CD25 lo CD127 hi CD45RA hi CD45RO - ナイーブT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1032]
T細胞がCD8 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1033]
T細胞がCD4 + CD8 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1034]
a)の提供する工程の前に、T細胞が予め活性化される、本発明1025の方法。
[本発明1035]
a)の提供する工程の前に、T細胞が刺激されない、本発明1025の方法。
[本発明1036]
T細胞が組換え抗原受容体を含む、本発明1025の方法。
[本発明1037]
反応混合物が、一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型をさらに含み、かつ方法が、細胞内部に一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を導入する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1038]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約9μMから約180μMの濃度である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約45μMの濃度である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
少なくとも約30％の初代造血細胞または初代造血幹細胞のゲノム編集の効率をもたらす、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
少なくとも約10％または少なくとも約14％の初代造血細胞または初代造血幹細胞の鋳型指向性ゲノム編集の効率をもたらす、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が、組換え抗原受容体、その一部分、またはその構成成分をコードする、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1043]
細胞がT細胞であり、かつ方法が、
c)b)の導入する工程の後に、CD3アゴニストおよびCD28アゴニストを含有する培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1044]
CD3アゴニストおよびCD28アゴニストが固体表面上に固定化されている、本発明1043の方法。
[本発明1045]
CD3アゴニストが抗CD3抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
CD28アゴニストが抗CD28抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1047]
c)c)の培養する工程の後に、CD3アゴニストもCD28アゴニストも含有しない培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、本発明1043の方法。
[本発明1048]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ヌクレアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1049]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ニッカーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1050]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼに融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1051]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、転写モジュレーターまたはクロマチン修飾因子に融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1052]
反応混合物が、少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1053]
少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、構造的に異なるsgRNAを含有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、構造的に異なるCas9ドメインを含有する、本発明1052の方法。
[本発明1055]
a)Cas9ヌクレアーゼドメインと細胞とを含む反応混合物を提供する工程；および
b)細胞内部にCas9ヌクレアーゼドメインを導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞であり、Cas9ヌクレアーゼドメインが細胞内部のガイドRNAと複合体を形成する、方法。
[本発明1056]
細胞内部のガイドRNAが細胞内部のガイドRNA遺伝子によってコードされ、ガイドRNA遺伝子がDNAを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
細胞が、Cas9ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を含有しない、本発明1055または1056の方法。
[本発明1058]
Cas9送達の効率が少なくとも約20％または30％である、本発明1055の方法。
[本発明1059]
Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞であって、該複数の細胞の少なくとも20％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞。
[本発明1060]
その少なくとも30％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1061]
その少なくとも20％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体および一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1062]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の存在について濃縮されていない、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1063]
その少なくとも20％または30％が、二本鎖切断、またはNHEJもしくはHDR修復二本鎖切断を標的ゲノム領域に含有する、本発明1059の複数の細胞。
Cas9 RNPおよびssODTで処理した細胞において顕著な効率のHDRを観察した(図2D)。発明者らは、T7E1アッセイにより測定される、ssODTなしで24％の総編集(Cas9切断部位にインデルを生じるNHEJ事象およびHDR事象全ての合計として定義される)を観察した。50 pmol ssODTの存在下では、最大で33％の総編集が観察された。この濃度では、標的遺伝子座のHindIII消化によって14％HDRが観察され、＞40％の編集がHDRからもたらされたことが示された(観察された編集の残りの約60％はNHEJから生じた可能性がある)。HDRのパーセンテージは100 pmol ssODTではわずかに低い(12％)が、総編集に対してより高い比率のHDRが計算された(100 pmで0.48に対して、50 pmolで0.42)。この条件でのCXCR4染色のほぼ完全な消失は、HDRによって導入された変異(84DLLFV88→84ESLDP88；SEQ ID NO：1および2)が、CXCR4の細胞表面発現または抗体によるその認識に強力な影響を与えることを実証する(図2BおよびC)。この実験では、編集効率は200 pmol ssODTで低下した。
sgRNAのインビトロT7転写
T7プロモーター、20 nt標的配列およびキメラsgRNA足場をコードするDNA鋳型を、オーバーラッピングPCRにより合成オリゴヌクレオチドから構築した。簡単に言うと、CXCR4 sgRNA鋳型に関して、PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがい、
の20 nMプレミックス、
の1μMプレミックス、200μM dNTP、ならびにPhusion Polymerase(NEB)を含有する。サーモサイクラーの設定は、95℃10秒、57℃10秒および72℃10秒を30サイクルで構成された。PCR産物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで1回抽出し、次いで、クロロホルムで1回抽出し、その後-20℃で一晩イソプロパノール沈降した。DNAペレットを70％エタノールで3回洗浄し、真空によって乾燥させ、DEPC処理水で溶解した。FOXP3 sgRNA鋳型を、同じ手法によって、T25、SLKS1、SLKS2およびSLKS4
から構築した。
T7プロモーター、20 nt標的配列およびキメラsgRNA足場をコードするDNA鋳型を、オーバーラッピングPCRにより合成オリゴヌクレオチドから構築した。簡単に言うと、CXCR4 sgRNA鋳型に関して、PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがい、
T細胞をNeonトランスフェクションキットおよびデバイス(Invitrogen)によりエレクトロポレーションした。2〜2.5×105個のT細胞を、9μlのバッファーT(Neonキット, Invitrogen)で再懸濁する前に、PBSで3回洗浄した。Cas9 RNP(1〜2μlの10μM Cas9のみ(対照)またはCas9:sgRNA RNP；最終濃度0.9〜1.8μM)ならびにHDR鋳型(0 〜200 pmol)を細胞懸濁物に加え、混合し、Neonエレクトロポレーションデバイス(Invitrogen; 1600V、10ミリ秒、3パルス)を用いて細胞内にトランスフェクトした。HDR鋳型は、標的配列に相補的な(−鎖)一本鎖オリゴヌクレオチドであり、90-ntホモロジーアーム
と隣接しているHindIII制限配列を含有する。
CXCR4標的、FOXP3標的1またはFOXP3標的2の標的部位を含有するゲノム領域を、以下のプライマーセットを用いてPCR増幅した。CXCR4用：
。FOXP3標的1用：
。FOXP3標的2用：
。CXCR4プライマーを、ホモロジーアームの外側へのアニーリングによるHDR鋳型の増幅を避けるように設計した。PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがって、高GCバッファー中に200 ngのゲノムDNAおよびKapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を含有した。サーモサイクラーの設定は、95℃5分間を1サイクル、98℃20秒間、62℃(CXCR4およびFOXP3標的2)または60℃(FOXP3標的1)を15秒間および72℃1分間を35サイクル、ならびに72℃1分間を1サイクルで構成された。PCR産物を、SYBR Safe(Life Technologies)を含有する2％アガロースゲル上で精製した。PCR産物を、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてアガロースゲルから溶出した。PCR DNAの濃度をNanoDropデバイス(Thermo scientific)により定量した。200 ngのPCR DNAをT7エンドヌクレアーゼI分析およびHindIII分析のために用いた。
HindIII制限消化によるHDRの分析
CXCR4 HDR鋳型は遺伝子座内にHindIII制限部位を導入する。938 bp領域をPCRとしてプライマー
を用いて増幅した。反応は、CutSmartバッファー(NEB)中に200 ngのPCR DNAおよび10ユニットのHindIII高フィデリティで構成された。37℃でのインキュベーションの2時間後、反応を70℃で10分間の1倍量のゲルローディング色素により停止させた。産物を、SYBRゴールド(Life technologies)を含有する2％アガロースゲル上で分離させた。バンド強度をImage Labを用いて定量した。HDRのパーセンテージを以下の方程式(b+c/a+b+c)×100を用いて計算した、式中、「a」はDNA基質のバンド強度であり、かつ「b」および「c」は切断産物である。
CXCR4 HDR鋳型は遺伝子座内にHindIII制限部位を導入する。938 bp領域をPCRとしてプライマー
実施例2：
PD-1のエクソン1(sgRNA1により標的とされるPD-1標的1（SEQ ID NO：75）、およびsgRNA2により標的とされるPD-1標的2（SEQ ID NO：74）)およびエクソン2(sgRNA3により標的とされるPD-1標的3（SEQ ID NO：72）、およびsgRNA4により標的とされるPD-1標的4（SEQ ID NO：73）)に対するsgRNAを設計した(図5A)。sgRNA標的部位で誘導される二本鎖切断の鋳型指向性修復をもたらすHDRオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO：71）も作製した(図5A)。sgRNA1〜4を含有するCas9 RNPを作製し、初代ヒトエフェクターT細胞(CD4+CD25loCD127hi)に送達し、細胞を回収した。FACSによる回収後の細胞の分析は、複数のCas9 RNPおよびそれらの組み合わせを用いるPD-1の高い効率の除去を明らかにする。2種類の異なるHDR鋳型を有するPD-1コード配列を標的とするCas9 RNPの様々な組み合わせの機能的作用を、PD-1細胞表面発現のFACS分析によって評価した。除去は、2種類のHDR鋳型 (コード配列の一部を除去し、未成熟終始コドンおよび新たなHindIII制限酵素消化部位を導入するように設計された) それぞれとCas9 RNPの複数の組み合わせで観察された。
PD-1のエクソン1(sgRNA1により標的とされるPD-1標的1（SEQ ID NO：75）、およびsgRNA2により標的とされるPD-1標的2（SEQ ID NO：74）)およびエクソン2(sgRNA3により標的とされるPD-1標的3（SEQ ID NO：72）、およびsgRNA4により標的とされるPD-1標的4（SEQ ID NO：73）)に対するsgRNAを設計した(図5A)。sgRNA標的部位で誘導される二本鎖切断の鋳型指向性修復をもたらすHDRオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO：71）も作製した(図5A)。sgRNA1〜4を含有するCas9 RNPを作製し、初代ヒトエフェクターT細胞(CD4+CD25loCD127hi)に送達し、細胞を回収した。FACSによる回収後の細胞の分析は、複数のCas9 RNPおよびそれらの組み合わせを用いるPD-1の高い効率の除去を明らかにする。2種類の異なるHDR鋳型を有するPD-1コード配列を標的とするCas9 RNPの様々な組み合わせの機能的作用を、PD-1細胞表面発現のFACS分析によって評価した。除去は、2種類のHDR鋳型 (コード配列の一部を除去し、未成熟終始コドンおよび新たなHindIII制限酵素消化部位を導入するように設計された) それぞれとCas9 RNPの複数の組み合わせで観察された。
PAGE精製によるsgRNAのインビトロT7転写。T7プロモーター、20 ヌクレオチド(nt)標的配列およびキメラsgRNA足場をコードするDNA鋳型を、オーバーラッピングPCRにより合成オリゴヌクレオチドから構築した。簡単に言うと、CXCR4 sgRNA鋳型に関して、PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがい、
の20 nMプレミックス、
の1μMプレミックス、200μM dNTP、ならびにPhusion Polymerase(NEB)を含有する。サーモサイクラーの設定は、95℃10秒間、57℃10秒間および72℃10秒間を30サイクルで構成された。PCR産物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで1回抽出し、次いで、クロロホルムで1回抽出し、その後-20℃で一晩イソプロパノール沈降した。DNAペレットを70％(v/v)エタノールで3回洗浄し、真空によって乾燥し、ジエチルピロカルボネート (DEPC)処理水で溶解した。PD-1 sgRNA鋳型を、同じ手法によって、T25、SLKS1、SLKS2およびSLKS11
から構築した。
フェノール/クロロホルム抽出によるsgRNAのインビトロT7転写。インビトロT7転写のためのDNA鋳型を、相補的な一本鎖ウルトラマー(ultramer)
をアニールすることによって作製した。ウルトラマーをヌクレアーゼフリーduplexバッファー(IDT)において1:1の比率で混合し、95℃まで2分間加熱し、続いて、RTで30分のインキュベーションを行った。
T細胞をNeonトランスフェクションキットおよびデバイス(Invitrogen)によりエレクトロポレーションした。2.5×105個のT細胞を、8μlのバッファーT(Neonキット, Invitrogen)で再懸濁する前に、PBSで3回洗浄した。Cas9 RNP(2μlの10μM Cas9対照 sgRNAなし、または1〜2μl Cas9:sgRNA RNP；最終濃度0.9〜1.8μM)ならびにHDR鋳型(示した通り0 〜200 pmol)を11μlの最終量まで細胞懸濁物に加え(Cas9保存バッファーで調整)、混合した。10μlの懸濁物をNeonエレクトロポレーションデバイス(Invitrogen; 1600V、10ミリ秒、3パルス)を用いてエレクトロポレーションした。CXCR4およびPD-1用のHDR鋳型は、標的配列に相補的な(アンチセンス鎖)一本鎖オリゴヌクレオチドであり、90-ntホモロジーアームと共にHindIII制限配列を含有する。HDRが成功すると、各PAM部位は欠失され、Cas9 RNPによる編集部位の再切断が妨げられるはずである。PD-1 HDR鋳型は加えて、12 ntを11 ntと置換することによって早ければアミノ酸25位にフレームシフトおよびナンセンス変異を引き起こす
。CXCR4 HDR対照ドナーは、HindIII制限部位を含有する元のCXCR4 HDR鋳型に対する配列スクランブル化バージョンである
。
CXCR4標的部位またはPD-1標的部位を含有するゲノム領域を、以下のプライマーセットを用いてPCR増幅した。CXCR4用：
。PD-1用：
。両方のプライマーセットを、ホモロジーアームの外側へのアニーリングによるHDR鋳型の増幅を避けるように設計した。PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがって、高GCバッファー中に200 ngのゲノムDNAおよびKapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を含有した。サーモサイクラーの設定は、95℃5分間を1サイクル、98℃20秒間、CXCR4では62℃またはPD-1では68℃を15秒間および72℃1分間を35サイクル、ならびに72℃1分間を1サイクルで構成された。PCR産物を、SYBR Safe(Life Technologies)を含有する2％(w/v)アガロースゲル上で精製した。PCR産物を、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてアガロースゲルから溶出した。PCR DNAの濃度をNanoDropデバイス(Thermo scientific)により定量した。200 ngのPCR DNAをT7エンドヌクレアーゼI分析およびHindIII分析のために用いた。図7Eに関して、PCR産物をTOPO Zero Blunt PCR Cloning Kit(Invitrogen)でクローン化し、Sangerシーケンシングに供した。
HindIII制限消化によるHDRの分析。HDR鋳型を標的遺伝子座内のHindIII制限部位に導入するように設計した。CXCR4遺伝子座内へのHindIII部位の導入の成功を試験するために、938 bp領域をプライマー
を用いてPCR増幅した。PD-1遺伝子座に関して、905 bp領域をプライマー
を用いて増幅した。反応は、CutSmartバッファー(NEB)中に200 ngのPCR DNAおよび10ユニットのHindIII高フィデリティで構成された。37℃にて2時間のインキュベーション後、反応を70℃で10分間の1倍量のゲルローディング色素により停止させた。産物を、SYBRゴールド(Life technologies)を含有する2％(w/v)アガロースゲル上で分離させた。バンド強度をImage Labを用いて定量した。HDRのパーセンテージを以下の方程式(b+c/a+b+c)×100を用いて計算した、式中、「a」はDNA基質のバンド強度であり、かつ「b」および「c」は切断産物である。
オンターゲット部位およびオフターゲット部位のディープシーケンシング分析。CXCR4オンターゲット遺伝子および2つのオフターゲット遺伝子についてCas9標的部位に隣接するゲノム領域を、下記に挙げるプライマーを用いて2段階PCR法によって増幅した。CXCR4 オンターゲット
、オフターゲット#1(POUドメイン、クラス2、転写因子1アイソフォーム1 [POU2F1] 遺伝子座；
)ならびにオフターゲット#2(グルタミン酸受容体1アイソフォーム1前駆体[GRIA1]遺伝子座；
)。最初に、製造者のプロトコールにしたがって、編集された試料および対照試料由来の100〜150 ngのゲノムDNAを、Kapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を用いてPCR増幅した。サーモサイクラーの設定は、95℃5分間を1サイクル、ならびに98℃20秒間、63℃15秒間および72℃15秒間を15〜20サイクル、ならびに72℃1分間を1サイクルで構成された。結果として生じるアンプリコンを2％(w/v)上で分離させ、SYBR Goldで染色し、Qiagenゲル抽出キットを用いてゲル抽出した。
Illumina TruSeq Universalアダプター
および改変Illumina RNA PCRバーコードプライマー
をKapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を用いる第2のPCR段階でアンプリコンに付着させた。サーモサイクラーの設定は、98℃30秒間を1サイクル、98℃20秒間、65℃15秒間および72℃15秒間を8〜10サイクル、ならびに72℃5分間を1サイクルで構成された。結果として生じるアンプリコンを2％(w/v)上で分離させ、SYBR Goldで染色し、Qiagenゲル抽出キットを用いてゲル抽出した。バーコードを付けかつ精製したDNA試料をQubit 2.0 Fluorometer(Life Technologies)によって定量し、BioAnalyzer(Agilent)によってサイズ分析し、qPCRによって定量し、そして等モル比でプールした。シーケンシングライブラリーをIllumina HiSEq 2500で配列決定した。
Claims (23)
- a)Cas9リボヌクレオタンパク質複合体と細胞とを含む反応混合物を提供する工程であって、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、Cas9ヌクレアーゼドメインと、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAとを含む、工程；および
b)細胞内部にCas9リボヌクレオタンパク質複合体を導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集するためのインビトロまたはエクスビボにおける方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞である、方法。 - 細胞が、Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない、請求項1に記載の方法。
- 導入する工程がエレクトロポレーションを含む、請求項1に記載の方法。
- 導入する工程が、
ナノワイヤまたはナノチューブをCas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートする工程；
細胞を、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブと接触させる工程；および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブで細胞の細胞膜を突き通す工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 導入する工程が、
反応混合物を、細胞の直径より小さい細胞変形コンストリクション(cell deforming constriction)に強制的に通過させる工程であって、細胞の細胞膜に一過性の細孔を導入する、工程；および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を、一過性の細孔を通って細胞に進入させる工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、細胞上の細胞外受容体に対するリガンドを含み、かつ導入する工程が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の受容体媒介性内部移行を含む、請求項1に記載の方法。
- エレクトロポレーションが、カソード電極とアノード電極との間のチャンバー内に反応混合物を配置する工程、およびカソード電極とアノード電極との間に約20 kV/mから約100 kV/mの電位を印加する工程を含む、請求項3に記載の方法。
- 反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.25μMから約5μMの濃度である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が初代造血細胞である、請求項1に記載の方法。
- 初代造血細胞が免疫細胞である、請求項9に記載の方法。
- 免疫細胞がT細胞である、請求項10に記載の方法。
- T細胞が組換え抗原受容体を含む、請求項11に記載の方法。
- 反応混合物が、一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型をさらに含み、かつ方法が、細胞内部に一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約9μMから約180μMの濃度である、請求項13に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が、組換え抗原受容体、その一部分、またはその構成成分をコードする、請求項13または14に記載の方法。
- 細胞がT細胞であり、かつ方法が、
c)b)の導入する工程の後に、CD3アゴニストおよびCD28アゴニストを含有する培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - d)c)の培養する工程の後に、CD3アゴニストもCD28アゴニストも含有しない培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、請求項16に記載の方法。 - Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ヌクレアーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、転写モジュレーターまたはクロマチン修飾因子に融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- a)Cas9ヌクレアーゼドメインと細胞とを含む反応混合物を提供する工程；および
b)細胞内部にCas9ヌクレアーゼドメインを導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集するためのインビトロまたはエクスビボにおける方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞であり、Cas9ヌクレアーゼドメインが細胞内部のガイドRNAと複合体を形成する、方法。 - 細胞内部のガイドRNAが細胞内部のガイドRNA遺伝子によってコードされ、ガイドRNA遺伝子がDNAを含む、請求項20に記載の方法。
- 細胞が、Cas9ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を含有しない、請求項20または21に記載の方法。
- Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞であって、該複数の細胞の少なくとも20％が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞。
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