JP2018502090A - 5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2h)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートの共結晶ならびにその調製方法およびその使用方法 - Google Patents
5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2h)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートの共結晶ならびにその調製方法およびその使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
式I化合物の共結晶およびその医薬組成物は疾患(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染、B型肝炎ウイルス(HBV)感染、C型肝炎ウイルス(HCV)感染、およびがん)の治療のための新規な治療薬である。式I化合物の対応するトシレート塩体と比較して、該共結晶は酸化および水性分解に対してより安定であり、より良い薬物動態プロファイルを有し、および優れた生物学的活性を持つ。
Description
本願発明は、5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートと有機酸の共結晶、該共結晶の合成、および病理的疾患、特にB型肝炎(HBV)感染の治療のためのその使用に関する。
ヌクレオシドアナログは、DNA合成において天然ヌクレオシドのようにまたはこれによく似た作動をする分子である。当該カテゴリー「ヌクレオシドアナログ」に含まれる化合物はがん、ウイルス感染、および免疫抑制疾患の重要な治療薬である。ヌクレオシドアナログはDNA合成を阻害することによって、その治療効果を発揮する。細胞に入ると、ヌクレオシドアナログはその対応する一リン酸、二リン酸、または三リン酸にリン酸化される。三リン酸のヌクレオシドアナログはDNA転写を打ち切ることによって、細胞分裂を阻害する。
ヌクレオシドアナログはまた、いくつかのヌクレオシドアナログが米国食品医薬品局(FDA)から、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染、B型肝炎ウイルス(HBV)感染、C型肝炎ウイルス(HCV)感染、およびがんのような疾患の治療について現在承認を受けているといった、確立された承認歴がある。
該B型肝炎ウイルス(HBV)はタバコに次ぐヒトがんの原因である。HBVががんを誘導するメカニズムは分かっていない。HBV感染が直接腫瘍成長を引き起こす、あるいは、該感染に関連する慢性炎症、肝硬変、および細胞の再生を介して間接的に腫瘍成長を引き起こしていることが想定されている。HBV感染者は急性肝炎や肝障害を患い、腹痛、黄疸および特定の肝臓酵素の血中レベルの上昇という結果を引き起こす。患者は通常急性HBV感染からは回復するが、該ウイルスは無期限に複製し続けることができ、肝細胞がん、原発性肝がんの主原因の一つである慢性持続性肝炎を引き起こす。
3TC(ラミブジン)、インターフェロンアルファ−2b、ペグインターフェロンアルファ−2a、ヘプセラ(アデホビルピボキシル)、バラクルード(エンテカビル)、およびTyzeka(テルビブジン)はHBV感染の治療薬として現在FDAで承認されている。しかしながら、これらの薬剤の多くは重い副作用があり、また、これらの薬剤で治療を受けた患者ではウイルス抵抗性が急速に進む。市販のヌクレオシドアナログの他のデメリットには、これらに限定される訳ではないが、保存中の安定性に関する課題および宿主細胞を損傷することなしにウイルス複製を阻害する能力に関する課題に加え、時間も費用もかかる精製工程が必要な複数工程の合成プロトコルが用いられており、製造関連の困難性も挙げられる。
本願発明は疾患および障害(例えば、がん、ウイルス感染、および不適切な免疫機能に関連する障害)の治療薬としての共結晶を提供する。
該共結晶形成体は有機酸である。共結晶形成体として使用できる有機酸の例は、フマル酸、マロン酸、グルタル酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸およびアントラニル酸である。一つの実施形態に従って該共結晶形成体はグルタル酸であり、他の実施形態において該共結晶形成体はマロン酸、アジピン酸、またはフマル酸から選択される有機酸でありうる。
本願発明の共結晶は式I化合物およびマロン酸、式I化合物およびフマル酸、式I化合物およびグルタル酸、式I化合物およびアジピン酸、式I化合物およびアントラニル酸、または式I化合物およびα−ケトグルタル酸を含むことができる。本発明の共結晶における式I化合物の共結晶形成体に対する比は1:1、1:2、または2:1でありうる。
本発明の共結晶は結晶性であり、テーブル2に示される回折角2θに特徴的な粉末X線回折ピークを有する。本発明の共結晶はIR吸光分光法によりさらに特徴づけられた。
一つの実施形態において、本願発明は医薬的に許容される担体または希釈剤および共結晶(少なくとも2つの成分:(A)式Iの化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体および(B)共結晶形成体;を含む)を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態に従って、本発明にかかる医薬組成物の共結晶は、式I化合物および共結晶形成体としてグルタル酸を含む。
別の実施形態に従って、本願発明はその必要がある対象に治療的有効量の請求項1の該共結晶を投与することにより疾患または状態を治療する方法を提供する。本発明にかかる共結晶を用いて治療される疾患または状態の例として、がん、炎症、またはB型肝炎感染から選択されるものが挙げられる。
本方法の実施形態に従って、該共結晶は、抗生物質、制吐剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ペグ化α−インターフェロン、ペグ化β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、ポリメラーゼ阻害剤、およびトール受容体様モジュレーターからなる群から選択される第2の治療薬の治療的有効量と組み合わせて投与される。
本願発明の共結晶は、共結晶形成体の溶液または懸濁液を式I化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体の溶液または懸濁液と混合(combining)し、共結晶化溶液を得て、該共結晶化溶液を過飽和させて共結晶の形成を開始することによって合成される。
共結晶形成体、式I化合物を可溶化するのに使用される溶媒として、有機溶媒、水、または水および有機溶媒の混合物が挙げられる。共結晶形成体を可溶化するのに適する該クラス有機溶媒の例として、これらに限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、酢酸エチル、またはそれらの組合せが挙げられる。
本願発明は式I化合物および共結晶形成体としての有機酸を含む共結晶を提供する。本発明の共結晶およびその医薬組成物は、ウイルス感染、がん、および不適切な免疫機能に関連する疾患または状態の治療または予防に有用である。
用語「含む(comprising)」(およびその文法的バリエーション)は「有する(having)」または「含む(including)」の包含的な意味で使用されるのであって、「のみからなる(consisting only of)」の排他的な意味では使用されるものではない。本明細書で使用される用語「a」、「an」、および「the」は複数と単数を包含するものと理解される。
該用語「医薬有効成分」または「API」は物質、例えば医薬組成物中の生物学的活性を生じさせる化合物または生物製剤を意味する。
本願発明において、用語「共結晶」は2またはそれ以上の化合物からなる結晶性分子複合体を意味する。医薬共結晶は、同一結晶内に存在する医薬物質および1またはそれ以上の付加的な分子を含有する。共結晶の当該2またはそれ以上の化合物は室温で固体であることができる。各化合物は、独自の特徴的な物理的特性、例えば構造、融点および融解熱を持っている。用語「共結晶」はまた、各々は室温で液状であるかもしれないが、共結晶化を促進する条件下で混合されたときは結晶性物質を形成する、2またはそれ以上の化合物からなる結晶性物質を意味する。本願発明の共結晶はさらに、室温で固体である化合物を室温で液体である化合物と共結晶化を促進するのに適した条件下で混合することによって得られる結晶性物質を包含する。本願発明いくつかの態様において、本発明の共結晶は共結晶化を促進するのに適した条件下で、式I化合物の溶媒和物を共結晶形成体と混合することによって、または式I化合物を共結晶形成体の溶媒和物と混合することによって得られる。
用語「共結晶形成体」は、共結晶の同一結晶性分子複合体内で、薬物と一緒に存在する付加的な化合物またはゲスト化合物を意味する。該薬物とのドナーアクセプター相互作用に関与することができる分子はいずれも、共結晶形成体として使用されうる。当該クラス「共結晶形成体」の化合物の例には、これらに限定されないが、有機酸、有機塩基類、アルコール類、フェノール類 エステル類、およびシクロデキストリン類が挙げられる。例えば、共結晶形成体はサッカリン、ニコチンアミド 4−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸、グルタル酸、フマル酸、マロン酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸、アントラニル酸、またはメチルパラベンでありうる。
本発明のコンテキストの範囲において、用語「免疫調節剤」は、刺激または抑制を介して正常または異常な免疫システムを修正することができる天然または合成産物を意味する。
用語「予防する(preventing)」とは、その疾患を有すると診断された患者、または、そのような疾患が進行するリスクのある患者において、本願発明の化合物または組成物が、本明細書において認定された疾患を予防する能力を意味する。当該用語はまた、そのような疾患を既に患っている、または、そのような疾患の症状がある患者において当該疾患の更なる進行を防ぐことも包含する。
用語「患者」または「対象」は動物(例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等)または哺乳動物(好ましくはヒト)を意味し、キメラおよびトランスジェニックの動物および哺乳動物を含む。
用語「治療的有効量」は、疾患の治療または予防における有用性を提供するのに十分な、疾患に関連する症状を遅らせるまたは抑えるのにするのに十分な、または疾患または感染またはそれらの原因を治療または改善するのに十分な本願発明の化合物の量を意味する。特に、治療的有効量はインビボで治療的有用性を提供するのに十分な量を意味する。本発明の化合物の量に関連して使用されるとき、当該用語は、好ましくは全体的に治療を改善し、疾患の症状または原因を軽減または回避し、または別の治療薬と共に治療効果を増強もしくは相乗効果を発揮する、毒性のない量を包含する。
用語「治療する(treat)」、「治療している(treating)」および「治療(treatment)」は、疾患に関連する疾患または症状の改善または根絶を意味する。ある実施形態において、上記用語はある疾患を有する患者に1またはそれ以上の予防または治療薬を投与することにより生じた、疾患の拡散または悪化を抑制することを意味する。
本明細書において記載されるいくつかの化合物は不斉中心を有し得、それ故、光学異性体エナンチオマーおよびジアステレオマーとして存在しうる。本願発明の化合物は、単一のエナンチオマー(光学異性体)、ジアステレオマー、またはエナンチオマーの混合物(ラセミ混合物を含む)の形態であり得る。本願発明の化合物の光学異性体は、既知の方法(例えば不斉合成、キラルクロマトグラフィー、または光学活性分割剤を利用する立体異性体の化学的分離)によって得ることができる。
別段の指示がない限り、「立体異性体」は、化合物の1つの立体異性体であって、その化合物の他の立体異性体は実質的に含まれないものを意味する。従って、一つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な(stereomerically pure)化合物は、該化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まない。2つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は他の該化合物ジアステレオマーを実質的に含まない。代表的な立体異性体的に純粋な化合物は、該化合物の1つの立体異性体を約80重量%より多く含みかつ該化合物の他の立体異性体を約20重量%より少なく含み、例えば、該化合物の1つの立体異性体を約90重量%より多く含みかつおよび該化合物の他の立体異性体を約10重量%より少なく含み、または該化合物の1つの立体異性体を約95重量%より多く含みかつ該化合物の他の立体異性体を約5重量%より少なく含み、または該化合物の1つの立体異性体を約97重量%より多く含みかつ該化合物の他の立体異性体を約3重量%より少なく含む。
描かれた構造とその構造につけられたの名前に相違がある場合、構造を優先する。さらに、構造または構造の一部の立体化学が、例えば太い線または破線で表示されていない場合、該構造または該構造の一部は、その全ての立体異性体を包含するものと理解される。有機合成分野の当業者は、製造するのに用いられた方法から該化合物が単一のエナンチオマーとして製造されたかどうか理解するであろう。
共結晶
共結晶
下記式Iで示される5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートは、遊離塩基体の非晶質粉末として存在する3’−デオキシアデノシンアナログである。
I
I
該遊離塩基は化学安定性が乏しく、コンスタントに医薬グレードの原料を合成する適切な製造方法がないため、該遊離塩基は医薬としては適さない。これらの欠点に対処するため、該遊離塩基のp−トルエンスルホン酸(トシレート)塩が合成されたことが米国特許番号7,928,085号に記載される。この特許の開示のとおり、該トシレート塩の結晶は該遊離塩基と比べてメリットがあり、例えば、該トシレート塩は該遊離塩基と比較して安定性および水溶解性が高い。そのため、該トシレート塩は該遊離塩基よりも残留溶媒量の低い医薬組成物を製造するのに適切な剤であると考えられた。
当該5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートのトシレート塩体は該遊離塩基より有利な特性を有するものの、該トシレート塩の合成には困難が伴う。例えば、合成には発がん性物質として知られるp−トルエンスルホン酸(TsOH)が必要である。該トシレート塩の商業規模での合成は、副産物として遺伝毒性物質−エチル−4−メチルベンゼン スルホネート(エチルトシレート)およびイソプロピル−4−メチルベンゼン スルホネート(イソプロピルトシレート)が形成されるという見解があり、さらに複雑である。
エチルトシレートおよびイソプロピルトシレートの生物学的毒性のために、該トシレート塩の商業規模での製造においては、時間がかかりコストもかかる精製方法が使用されなければならない。すなわち、該遺伝毒性の副産物の濃度を、医薬品処方での使用の際に要求される百万分率(ppm)レベルの一桁にまで除去または減少させることができる精製プロトコルが、治療薬としての使用に適するトシレート塩を得るには必要である。合成の困難性に加えて、該5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートのトシレート塩を含有する医薬組成物の製造も困難である。
下記のプロトコルを用いて合成される本発明の共結晶は、HBVおよびHCV感染の治療剤として該トシレート塩を合成するおよび医薬開発をするのに付随するいくつかの欠点および困難性に対処する。以下にさらに記載するとおり、本発明の共結晶は5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート(式I化合物)と少なくとも1つの共結晶形成体とを接触させることによって合成される。
式I化合物の溶媒和物および塩もまた、共結晶形成体と混合されると共結晶を形成することができる。このような目的に向かって、いくつかの有機酸が共結晶形成体として評価された。共結晶形成体の例として、これらに限定されないが、シュウ酸、L−アスパラギン酸、マレイン酸、サッカリン、2−アミノ安息香酸、L−グルタミン酸、L−スレオニン、4−アミノ安息香酸、α−ケトグルタル酸、1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、マロン酸、ゲンチシン酸、サリチル酸、L−(+)−酒石酸、フマル酸、ガラクタル酸、クエン酸、D−グルクロン酸、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、4−アミノサリチル酸、ニコチンアミド、L(−)−リンゴ酸、馬尿酸、グリコール酸、L(−)ピログルタミン酸、γ−シクロデキストリン、安息香酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、4−ヒドロキシ安息香酸、(+)カンファー酸、ソルビン酸、ニコチン酸、オロチン酸、尿素、メチルパラベン、プロピルパラベン、L(−)−ラクトアミド 、L−アスコルビン酸、桂皮酸、D、L−マンデル酸、バニリン酸、およびメチル−4−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
上記の有機酸に加え、本願発明はまた、該共結晶形成体が第2の薬物または第2の医薬有効成分(API)である共結晶を提供する。該カテゴリー「第2の薬物」または「第2のAPI」の例として、抗生物質、制吐剤、抗鬱剤、抗真菌薬、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、またはトール受容体様モジュレーターを含む治療薬が挙げられる。
テーブル1は式I化合物および有機酸共結晶形成体を含む本願発明の例示共結晶の物理的特性を示す。テーブル1および下記に説明するとおり、例示共結晶の多くは優れた水溶解性を有するのでBiopharmaceutics Regulatory Systems(BCS)分類体系に基づいたクラスI薬物として表示できる。
テーブル1
テーブル1
本発明の共結晶は粉末X線回折(XRPD)分光法、核磁気共鳴(NMR)分光法、光学顕微鏡および赤外線(IR)分光法を用いてさらに特徴づけられた。この結果、グルタル酸共結晶のパラフィンオイル中懸濁液の偏光光学顕微鏡は結晶性固体を示した。当該現行技術に従って、固体NMR分析は式Iグルタル酸共結晶を確認し、液相NMR分析は、共結晶に関し、2:1、式I化合物のグルタル酸(共結晶形成体)に対する化学量論を確認する。例示グルタル酸共結晶のエタノール溶液(0.27mg/mL)のUV−分光光度法試験は222nm、248nmおよび316nmに3つの吸収ピークを示した。加えて、本発明の共結晶を特徴づけるために粉末X線回折試験が行れた。本願発明のいくつかの共結晶の粉末X線回折分析の2θ値がテーブル2に示される。
テーブル2
テーブル2
本願発明者らが驚いたことに、本願発明の共結晶は式I化合物の該トシレート塩と比較していくつかのメリットを有する。例えば、下記の合成プロトコルを用いる共結晶の合成はあまり時間を必要としない。本発明にかかる合成方法は容易にスケールアップに対応でき、商業的合成および共結晶の単離を可能とする。本発明の共結晶の精製はコスト効率がよく、かつ速い。医薬としての使用に適する共結晶を得るのに単純なろ過および洗浄で十分である。本発明の共結晶の合成は、さらに、該トシレート塩の製造には付随していた遺伝毒性の副産物の産生がない。
上記のメリットに加え、本発明の共結晶は化学安定性が増し、5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートの非晶質遊離塩基またはトシレート塩よりも加水分解による分解に対して感受性が低い。そのため、本発明の共結晶は室温で長期間保存できるが、当該対応するp−トルエンスルホン酸塩は吸湿性であり、かつ分解を防ぐために低温での保存が必要である。
別のメリットは、本願発明の共結晶は残留溶媒の量が非常に少ない。このことは、残留溶媒は(あったとしても)非常に少ない、本発明の共結晶の医薬組成物の製造を可能にする。加えて、水に対する高い溶解性は医薬組成物の製造には望ましいところ、溶解性試験により本発明の共結晶は水に対し高い溶解性を有することが示唆された。この高い水溶解性により、該共結晶はBiopharmaceutics Regulatory Systems(BCS)ガイドラインに基づいてクラスI薬物に分類される。
該塩ファクター(S)(これは塩またはエステルの形状にある薬物の投与量の割合(fraction)を意味する)は、薬物動態および生体内分布に影響する。例えば、塩ファクター(S)は他のファクターの中で、薬物の血漿中濃度、定常状態での該APIの血漿中濃度を達成するのに必要な投与量、該APIのバイオアベイラビリティ、および薬物の生体内分布に影響する。本願発明者らが驚いたことに、式I化合物の共結晶は、当該対応する式I化合物のトシレート塩と比較して、より低い値の「S」(医薬的塩ファクター)を持つ。例えば、例示グルタル酸共結晶の塩ファクター(S)は1.2である。式I化合物(5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート)のトシレート塩の(S)塩ファクターはより大きくて、約1.53である。従って、該グルタル酸の共結晶の各グラムには、該対応するトシレート塩のグラムと比較して、より多い5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート遊離塩基が含まれる。
つまり、グルタル酸共結晶を含む医薬組成物は、各単位用量により多い5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート遊離塩基を含む。その結果として、毎日の患者に投与されるべき該共結晶の医薬組成物の投与量は少なくなり、このことは治療における患者の服薬順守を高めるのに有利である。
単なる例示として、5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート遊離塩基の一日用量は約1600mg/日とされる。経口製剤(錠剤)が製造されるとき、各錠剤の最大重量は1000mgを超えず、および各錠中に存在しうる5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート遊離塩基の最大量は錠剤の70重量%を超えず、標的の一日用量1600mg遊離塩基を達成するのに必要とされる患者に投与されるべき錠剤の総数は、(A)錠剤の製造に使用される式I化合物の特定の構造、および
(B)式I化合物の特定の構造に関連する塩ファクター(S)に異存する。
(B)式I化合物の特定の構造に関連する塩ファクター(S)に異存する。
テーブル3に示されるとおり、式I化合物の特定の構造の塩ファクター(S)は標的の一日用量1600mg遊離塩基を達成するのに必要とされる錠剤の数に影響する。経口製剤が式I化合物の該遊離塩基または該グルタレート共結晶を含むとき、標的の一日用量を達成するのに必要とされる錠剤は少ない。式I化合物の遊離塩基を含む錠剤の総重量が770mgであるとき(該遊離塩基の塩ファクター(S)は1.0)、各錠剤は539mgの該遊離塩基(0.7x770mg)を含有する。該遊離塩基を商業的スケールで合成および精製するのは難しく、上述のとおり該遊離塩基を含む錠剤は安定性が悪く、保存可能期間が短いため、該遊離塩基の錠剤は商業化には適さない。
比較すると、標的の一日用量である式I化合物の該遊離塩基1600mgを達成するのに必要とされる該トシレート塩の錠剤は4錠である。例えば、単位用量あたりの重さ(mg)、すなわち、式I化合物の該トシレート塩を含有する錠剤の重さが875mgであって、かつ該塩ファクター(S)が1.53であるとき、各875mg錠剤は612.5mg(該錠剤の総重量の70%)の該トシレート塩を含有し、これは錠剤あたり該対応する遊離塩基400mg(612.5/1.53)に相当する。従って、該トシレート塩の錠剤4錠が標的の一日用量1600mg遊離塩基を達成するために患者投与される必要がある。従って、該トシレート塩が薬物として使用される場合、患者はより多くの錠剤を摂取する必要があるだけでなく、はるかに大きい錠剤を飲み込む必要があり、これは子供やおよび老人の患者には困難であり得る。
該トシレート塩と比較して本発明の共結晶の塩ファクターの値は低いため1日に必要とされる該共結晶を含有する錠剤数は減る。例えば、該グルタル酸共結晶を含有する錠剤の重さが930mgであるとき、そのような錠剤は重さ612.5mg(930mgの70%)の該グルタル酸共結晶を含む。従って、各錠剤中の該遊離塩基の量は533.7mg(612.5/1.22)である。上記の議論からグルタル酸共結晶を含有する錠剤は、該対応するトシレート塩を含有する錠剤と比較して、より多量の該遊離塩基(すなわち、遊離塩基重さmg/単位用量)を含有することが明かである。従って、テーブル3に示されるとおり、該標的の一日用量1600mgを達成するのに必要とされる該共結晶の錠剤は少なくなる。
テーブル3
医薬組成物および投与量
テーブル3
本願発明はまた、本発明の共結晶の医薬製剤および疾患状態(例えばがん、ウイルス感染、または不適切な免疫機能に関連する疾患)の治療のための当該医薬製剤の使用に関する。従って、一つの態様において、本願発明は式I化合物または医薬的に許容される立体異性体、互変異性体、または溶媒和物および少なくとも1つの共結晶形成体を含む共結晶ならびに医薬的に許容される賦形剤を含む医薬製剤に関する。
本発明にかかる組成物は、一般に受け入れられている医薬配合のプラクティスに従って、さらに1またはそれ以上の付加的な治療薬、医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、安定剤、乳化剤、保存料、着色料、緩衝剤、または香味料(flavor imparting agents)を含有しうる。適当な賦形剤は薬学分野の当業者によく知られており、適当な賦形剤の例がこれらに限定されるものではないが、ここに挙げられる。ある特定の賦形剤が医薬組成物または製剤に組み入れるのに適するかどうかは、当該技術分野でよく知られたさまざまなファクターに、これに限定されるものではないが、例えば当該製剤の患者への投与方法に異存する。例えば、経口製剤(例えば錠剤)は非経口製剤への使用には適さない賦形剤を含み得る。ある特定の賦形剤が適合するかどうかはまた、該製剤中の特定の有効成分に依存しうる。
本発明の共結晶および医薬的に許容される担体を含む単一単位投与剤に適する医薬組成物はまた本開示の範囲内に包含される。本願発明の医薬製剤および単一単位投与剤は、経口投与、粘膜投与(舌下、口腔、直腸、鼻、または膣が挙げられる)、非経口投与(皮下投与、筋肉内投与、ボーラス投与、動脈内投与、または静脈投与が挙げられる)、経皮投与、または局所投与に適しうる。本発明にかかる共結晶の無菌製剤もまた考慮される。
医薬製剤および単一単位投与剤は、さまざまな量の該共結晶、その医薬的に許容される塩、または互変異性体を含み得る。例えば、該医薬製剤および単一単位投与剤中の該共結晶の量は約0.1mg〜約1000mgの範囲であり得る。ある製剤および単一の製剤に関し、該共結晶の量は約50mg〜約750mg、約50mg〜約500mg、約100mg〜約250mg、約10mg〜約100mg、または約1mg〜約10mgである。
本願発明の共結晶を含む無水の医薬組成物もまた本開示の範囲内に含まれる。水分および/または湿度は医薬製剤の製造、保存、取り扱い、パッケージング、輸送および使用の際に常に直面するので、該製剤分野の当業者に知られた無水または低水分含有成分および低水分または低湿度条件を用いる、本開示の無水の医薬組成物および製剤を製造する方法は本開示の範囲内である。
該共結晶の医薬組成物の無水の特性を維持するために、本発明にかかる医薬製剤はその無水の特性を維持する条件下でパッケージングおよび保存されるべきである。従って、無水の組成物は好ましくは水への曝露を防ぐことが知られている材料を用いてパッケージングされる。適当なパッケージングの例には、これらに限定されないが、密閉シールの金属箔、プラスティック、単位用量の容器(例えばバイアル)、ブリスター・パック、およびストリップ包装が挙げられる。
本願発明の共結晶は不適切な細胞分裂、不適切な免疫機能に関連する疾患または障害、またはウイルス感染の治療剤である。治療が必要な患者または対象に本発明の共結晶の1またはそれ以上の治療有効用量を投与することよって達成されうる。
経口製剤
経口製剤
経口使用に適する当該発明の組成物は医薬組成物の製造の分野において知られるいずれかの方法によって調整されうる。一般に、Remington’s Pharmaceutical Sciences、18th ed.、Mack Publishing、Easton PA(1990)を参照。当該経口製剤は少なくとも1つの賦形剤と緊密に混合された所定量の有効成分を含有する。本発明の共結晶の医薬的に洗練されていて口当たりの良い調剤物を得るために、液体製剤は甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤をさらに含有することができる。
本願発明の適当な経口組成物には、これらに限定されないが、錠剤、トローチ、ローゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末剤または顆粒剤、乳濁液、硬または軟カプセル、シロップまたはエリキシル剤が挙げられる。投与、保存、およびパッケージングがしやすいでの、錠剤、およびカプセルは最も有利な経口単位投与剤であり、それらには固体賦形剤が使用される。必要に応じて、錠剤は標準的な水性または非水性技術によってコートされることができる。一般に、医薬組成物および製剤は、有効成分、すなわち該共結晶を液体担体、微粉化された固体担体、または両方と均一および緊密に混合し、その後必要であれば望みの見栄えに成形することによって調製される。
錠剤組成物の関し、該有効成分は毒性のない医薬的に許容される賦形剤と混合されて錠剤の製造に使用される。当該賦形剤の例には、これらに限定されないが、不活性希釈剤(例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム);造粒剤および崩壊剤(例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸);結合剤(例えばスターチ、ゼラチン、ゴム(例えばアラビアゴム));および滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク)が挙げられる。本願発明の医薬組成物に使用される結合剤または増量剤は通常、医薬組成物または製剤の約50〜約99重量%で含まれる。
錠剤は圧縮または成形(molding)によって製造されることができ、および無コートであってよく、または消化管での崩壊および吸収を遅らせ、それにより望ましい時間にわたって持続的な治療効果を得るためにコートされていてもよい。時間遅延物質の例には、これらに限定されないが、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
経口用製剤は、該有効成分が不活性固体希釈剤(例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン)と混合される硬ゼラチンカプセルであることができ、または該有効成分が水またはオイル媒体(例えばピーナッツオイル、液体パラフィンまたはオリーブ油)と混合される軟ゼラチンカプセルであることができる。
錠剤およびカプセルに加えて、本願発明の共結晶は経口投与に適するシロップ、懸濁液、分散性粉末剤および顆粒剤として製剤化されうる。経口懸濁液として製剤化されるとき、該医薬組成物は分散剤または湿潤剤、例えば天然のホスファチド(例えばレシチン)、またはアルキレンオキサイドと脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、もしくは脂肪酸の部分エステルとの縮合生成物を含むことができる。そのような生成物の例として、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール(heptadecaethyleneoxycetanol)、ヘキシトール(例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。経口懸濁液はまた1またはそれ以上の保存料、例えばエチルまたはn−プロピルp−ヒドロキシベンゾエート、1またはそれ以上の着色剤、1またはそれ以上の香味剤、および1またはそれ以上の甘味剤(例えばスクロースまたはサッカリン)を含み得る。シロップおよびエリキシル剤はまた甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースでもって製剤化されうる。これらの製剤は鎮痛薬、保存料、香味料および着色剤を含んでいてもよい。
遅延放出性製剤
遅延放出性製剤
本発明の共結晶は当該技術分野の当業者によく知られる制御放出法または送達手段によって投与されることができる。これらに限定されないが、例として、米国特許:3,845,770;3,916,899;3,536,809;3,598,123;および4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、および5,733,566(これらは各々引用することによって本願明書に組み込まれる)に記載のものが挙げられる。このような製剤は1またはそれ以上の有効成分の持続放出または制御放出を提供するために使用されることができ、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性の膜、浸透圧性のシステム、多層皮膜、微小粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはそれらの組合せを用いて様々な割合の放出特性が提供される。適当な制御放出製剤は当該製剤分野の当業者に知られている。従って、当該開示は、経口投与に適する単一単位投与剤、例えば、これらに限定されないが、制御放出に適している錠剤、カプセル、ジェルカプセル、およびカプレットを包含する。
全ての制御放出医薬製品は、非制御放出のもの以上であるように薬物治療を改良するという共通の目的を持っている。理想的には、制御放出製剤の医学的治療における使用は、予め決められた時間間隔(例えば2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、4週間、または2−12箇月、3−12箇月、4−12箇月、5−12箇月、6−12箇月、7−12箇月、8−12箇月、9−12箇月、10−12箇月、11−12箇月、または1年)で既知量の該活性成分が投与されることを特徴とする。制御放出製剤の利点として、該薬物の活性の延長、投与頻度の減少、および患者の服薬順守の向上が挙げられる。加えて、制御放出製剤は作用の開始時間または他の特性、例えば該薬物の血中濃度に影響を及ぼすために使用されることができ、その結果副作用(例えば、有害影響)の発生に影響することができる。
大抵の制御放出製剤は所望の治療効果を迅速に生み出す薬物(有効成分)量を最初に放出し、および徐々におよび持続的に同一または別量の薬物を放出して、長期間にわたって同一レベルの治療または予防効果を維持するように設計されている。体内でこの一定濃度の薬物を維持するために、該薬物は、代謝されかつ体から排出される薬物の量を置き換える速度で、製剤から放出されなければならない。有効成分の制御放出は、これらに限定されないが例えば、pH、温度、酵素、水、または他の生理学的条件もしくは化合物といった様々な条件によってによって刺激され得る。
非経口製剤
非経口製剤
非経口製剤は様々な方法、これらに限定されないが例えば、皮下投与、静脈投与(ボーラス投与を含む)、筋肉内投与、および動脈注射、によって患者に投与されることができる。それらの投与は通常患者の汚染に対する自然防御能を回避してしまうので、非経口製剤は無菌であるかまたは患者に投与される前に滅菌できることが好ましい。非経口製剤の例には、これらに限定されないが、例えば、注射用の溶液、注射用に医薬的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁されて使用される乾燥および/または凍結乾燥された生産物(再構成可能な粉末)、注射用の懸濁液、およびエマルションが挙げられる。
本開示の非経口製剤を提供するために使用されることができる適当なビヒクルは当業者に周知である。これらに限定されないが、例として:注射USP用水;水性ビヒクル(これらに限定されないが例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、ブドウ糖注射、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射、および乳酸リンゲル注射);水混和性ビヒクル(これらに限定されないが例えば、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール;および非水性ビヒクル(これらに限定されないが例えば、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジル)が挙げられる。非経口製剤は1またはそれ以上の該医薬有効成分または本発明にかかる共結晶の溶解性を向上する化合物を含むことができる。
キット
キット
本開示は本発明の共結晶を含む1またはそれ以上の容器を含み、任意に医薬的に許容される担体を含む1またはそれ以上の容器を含み得る医薬パックまたはキットを提供する。他の実施形態において、本開示は本発明の共結晶を含む1またはそれ以上の容器、付加的な治療薬を含む1またはそれ以上の容器、および医薬的に許容される担体を含む1またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
本願発明のキットまたはパックは、本発明にかかる共結晶を投与に適する医薬組成物にするのに必要な1またはそれ以上の医薬成分を含む1またはそれ以上の容器または小包、およびデバイス(例えばf本発明にかかる共結晶の医薬組成物を投与するための1またはそれ以上の注射器)を含み得る。
キットまたはパックは送達および生体内分布を改良するように親水性−親油性バランス(HLB)を変えるために医薬担体および化合物の浸透圧を調整する緩衝剤、化合物を含み得る。任意にキットまたはパックに含まれる容器に付随して、通知は薬事または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定された書式であることができ、その通知はヒト投与に関する製造、使用または販売の当該機関による承認を反映する。
併用療法
併用療法
一つの態様において、治療的に有効な用量の本願発明の共結晶は治療的に有効な用量の組合せ薬物(付加的な治療薬)と併せて治療が必要な患者または対象に投与され得る。当業者は該共結晶の1回量は別々に、例えば該組合せ薬物の投与前または投与後の数秒内、数分内、数時間内に投与されても、当該2つが一緒に投与されてもよいことを認識するであろう。該付加的な治療薬として、これらに限定されないが、抗生物質、制吐剤、抗鬱剤、および抗真菌薬、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロンs、β−インターフェロンs、ペグ化α−インターフェロン、ペグ化β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、またはトール受容体様モジュレーターが挙げられる。
上記の治療薬に加えて、本願発明は、共結晶と治療的有効量のポリメラーゼ阻害剤、例えば、ラミブジン、アデホビル、エンテカビルおよびテルビブジンとの併用を含む、併用療法レジメンを包含する。3つの薬物の組合せを含む治療レジメンもまた本発明の範囲に包含される。例えば、そのようなレジメンは治療的に有効な用量の該共結晶、ポリメラーゼ阻害剤およびインターフェロンまたはペグ化インターフェロンの投与を包含することができる。
組成物に含まれる各化合物またはその医薬的に許容される塩または互変異性体のパーセンテージもまた変動することができる。例えば、いくつかの実施形態において、該組成物は該共結晶または医薬的に許容される塩または互変異性体を約1%〜約98%(重量/重量)の範囲を含むことができる。該組成物は本発明にかかる共結晶またはその医薬的に許容される塩または互変異性体を約5%〜約80%、約10%〜約70%、約15%〜約60%、約20%〜約50%および約30%〜約40%(重量/重量)の範囲で含むことができる。
該第2の治療薬として抗生物質が使用される場合、例示的な化合物としてこれらに限定されないが、
マクロライド系薬(例えば、トブラマイシン(Tobi(登録商標)))、
セファロスポリン(例えば、セファレキシン(Keflex(登録商標))、セフラジン(Velosef(登録商標))、セフロキシム(Ceftin(登録商標))、セフプロジル(Cefzil(登録商標))、セファクロル(Ceclor(登録商標))、セフィキシム(Suprax(登録商標))またはセファドロキシル(Duricef(登録商標)))、
クラリスロマイシン(例えば、クラリスロマイシン(Biaxin(登録商標)))、
エリスロマイシン(例えば、エリスロマイシン(EMycin(登録商標)))、
ペニシリン(例えば、ペニシリンV(V-Cillin K(登録商標)またはPen Vee K(登録商標)))または
キノロン(例えば、オフロキサシン(Floxin(登録商標))、シプロフロキサシン(Cipro(登録商標))またはノルフロキサシン(Noroxin(登録商標)))、
アミノグリコシド抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート(undecylenate)、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン)、アンフェニコール抗生物質(例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えば、リファミドおよびリファンピン)、カルバセフェム(例えば、ロラカルベフ)、カルバペネム(例えば、ビアペネムおよびイミペネム)、セファロスポリンs(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム)、セファマイシン(例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム(tigemonam))、
オキサセフェム系薬(例えば、フロモキセフ、およびモキサラクタム)、ペニシリン系薬(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸(benzylpenicillinic acid)、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェベニシリン(fenbenicillin)、フロキサシリン、ペナムクシリン(penamccillin)、ペネタメートヨウ化水素酸塩(penethamate hydriodide)、ペニシリンo−ベネタミン(penicillin o-benethamine)、ペニシリン0、ペニシリンV、ペニシリンV ベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピサイクリン、およびフェネチシリンカリウム(phencihicillin potassium))、リンコサミド系薬(例えば、クリンダマイシン、およびリンコマイシン)、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンドゥラシジン(enduracidin)、エンビオマイシン、テトラサイクリン系薬(例えば、アピサイクリン(apicycline)、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン)、2,4−ジアミノピリミジン系薬(例えば、ブロジモプリム)、ニトロフラン系薬(例えば、フラルタドン(furaltadone)、および塩化フラゾリウム(furazolium chloride))、キノロンおよびそのアナログ(例えば、シノキサシン、、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパフロキサシン(grepagloxacin))、スルホンアミド系薬(例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド(benzylsulfamide)、ノプリルスルファミド(noprylsulfamide)、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン(sulfachrysoidine)、およびスルファシチン(sulfacytine))、
スルホン系薬(例えば、ジアチモスルホン(diathymosulfone)、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン(solasulfone))、
サイクロセリン、ムピロシン、およびツベリンが挙げられる。
マクロライド系薬(例えば、トブラマイシン(Tobi(登録商標)))、
セファロスポリン(例えば、セファレキシン(Keflex(登録商標))、セフラジン(Velosef(登録商標))、セフロキシム(Ceftin(登録商標))、セフプロジル(Cefzil(登録商標))、セファクロル(Ceclor(登録商標))、セフィキシム(Suprax(登録商標))またはセファドロキシル(Duricef(登録商標)))、
クラリスロマイシン(例えば、クラリスロマイシン(Biaxin(登録商標)))、
エリスロマイシン(例えば、エリスロマイシン(EMycin(登録商標)))、
ペニシリン(例えば、ペニシリンV(V-Cillin K(登録商標)またはPen Vee K(登録商標)))または
キノロン(例えば、オフロキサシン(Floxin(登録商標))、シプロフロキサシン(Cipro(登録商標))またはノルフロキサシン(Noroxin(登録商標)))、
アミノグリコシド抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート(undecylenate)、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン)、アンフェニコール抗生物質(例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えば、リファミドおよびリファンピン)、カルバセフェム(例えば、ロラカルベフ)、カルバペネム(例えば、ビアペネムおよびイミペネム)、セファロスポリンs(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム)、セファマイシン(例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム(tigemonam))、
オキサセフェム系薬(例えば、フロモキセフ、およびモキサラクタム)、ペニシリン系薬(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸(benzylpenicillinic acid)、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェベニシリン(fenbenicillin)、フロキサシリン、ペナムクシリン(penamccillin)、ペネタメートヨウ化水素酸塩(penethamate hydriodide)、ペニシリンo−ベネタミン(penicillin o-benethamine)、ペニシリン0、ペニシリンV、ペニシリンV ベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピサイクリン、およびフェネチシリンカリウム(phencihicillin potassium))、リンコサミド系薬(例えば、クリンダマイシン、およびリンコマイシン)、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンドゥラシジン(enduracidin)、エンビオマイシン、テトラサイクリン系薬(例えば、アピサイクリン(apicycline)、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン)、2,4−ジアミノピリミジン系薬(例えば、ブロジモプリム)、ニトロフラン系薬(例えば、フラルタドン(furaltadone)、および塩化フラゾリウム(furazolium chloride))、キノロンおよびそのアナログ(例えば、シノキサシン、、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパフロキサシン(grepagloxacin))、スルホンアミド系薬(例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド(benzylsulfamide)、ノプリルスルファミド(noprylsulfamide)、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン(sulfachrysoidine)、およびスルファシチン(sulfacytine))、
スルホン系薬(例えば、ジアチモスルホン(diathymosulfone)、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン(solasulfone))、
サイクロセリン、ムピロシン、およびツベリンが挙げられる。
本発明にかかる共結晶は他の抗ウイルス剤も組み合わせて投与または製剤化されることができる。有用な抗ウイルス剤として、これらに限定されないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシドアナログが挙げられる。該抗ウイルス剤として、これらに限定されないが、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、コンビビル、アバカビル、アデホビル、ジピボキシル、シドホビル、リバビリンおよびそのアナログ、、レボビリン(levovirin)、ビラミジン、イサトリビン(isatoribine)、ピルフェニドン、またはそのアナログ、アシクロビル、(gangcyclovir)、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、該α−インターフェロン類;β−インターフェロン類;クレブジン(clevadine)、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
付加的な治療薬として、腫瘍壊死因子アンタゴニスト、例えばエタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブ)、チモシン−.アルファ.(Zadaxin.TM.)、インターフェロン受容体アゴニスト、α−グルコシダーゼ阻害剤、TNF−αアンタゴニスト、NS3ヘリカーゼ阻害剤、NS5Bポリメラーゼの阻害剤(例えばGS−9190、MK−3281、VCH−759(VX−759)、VCH−916、ABT−333、BMS−791325、PF−00868554、IDX−184、R1626、PSI−7851、VCH−222(VX−222)、ABT−072、およびBI207127)およびNS5Aタンパク質の阻害剤(例えばBMS−790052、A−831、およびAZD2836)を挙げることができる。
本発明にかかる共結晶は、ウイルス性NS3プロテアーゼを阻害する剤、例えば、VX−950およびSCH503034、Toll様受容体(TLR)修飾薬(例えばIMO−2125、およびPF−04878691);
チトクロムP450モノオキシゲナーゼ阻害剤;リボザイム(例えばHeptazyme(商標)およびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、これらはHBVタンパク質配列を補完し、ウイルスのコアタンパク質の発現を阻害する)と組み合わせて投与または製剤化されることができる。
チトクロムP450モノオキシゲナーゼ阻害剤;リボザイム(例えばHeptazyme(商標)およびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、これらはHBVタンパク質配列を補完し、ウイルスのコアタンパク質の発現を阻害する)と組み合わせて投与または製剤化されることができる。
別法として、本願発明の共結晶は免疫調節剤と組み合わせて投与または製剤化されることができる。免疫調節剤として、これらに限定されないが、メトトレキサート(methothrexate)、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン(シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスパガリン、ブレキナル、マロノニトリロアミンデ(malononitriloaminde)(例えば、レフルノミド(leflunamide))、T細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーター、ペプチド模倣薬、および抗体(例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Fvs、ScFvs、FabまたはF(ab)2フラグメントまたはエピトープ結合フラグメント)、核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子および3重らせん体)、低分子、有機化合物、および無機化合物が挙げられる。T細胞受容体モジュレーターの例には、これらに限定去されないが、抗T細胞受容体抗体(例えば、抗CD4抗体(例えば、cM−T412(Boehringer)、IDEC−CE9.1(登録商標)(IDECおよびSKB)、mAB 4162W94、オルソクローンおよびOKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗体(例えば、ヌヴィオン(Product Design Labs)、OKT3(Johnson & Johnson)、またはリツキサン(IDEC))、抗CD5抗体(例えば、抗CD5 リシン結合イムノコンジュゲート)、抗CD7抗体(例えば、CHH−380(Novartis))、抗CD8抗体、抗CD40リガンドモノクローナル抗体(例えば、IDEC−131(IDEC))、抗CD52抗体(例えば、CAMPATH 1H(Ilex))、抗CD2抗体、抗CD11a抗体(例えば、ザネリン(Genentech))、抗B7抗体(例えば、IDEC−114(IDEC))、CTLA4−免疫グロブリン、およびtoll受容体様(TLR)修飾薬が挙げられる。サイトカイン受容体モジュレーターの例には、これらに限定されないが、可溶性サイトカイン受容体(例えば、TNF−α受容体の細胞外領域またはそのフラグメント、IL−1β受容体の細胞外領域またはそのフラグメント、およびIL−6受容体の細胞外領域またはそのフラグメント)、サイトカインまたはそのフラグメント(例えば、インターロイキン(IL)−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−15、TNF−α、インターフェロン(IFN)−α、IFN−β、IFN−γ、およびGM−CSF)、抗サイトカイン受容体抗体(例えば、抗IFN受容体抗体、抗IL−2受容体抗体(例えば、Zenapax(Protein Design Labs))、抗IL−4受容体抗体、抗IL−6受容体抗体、抗IL−10受容体抗体、および抗IL−12受容体抗体)、抗サイトカイン抗体(例えば、抗IFN抗体、抗TNF−α 抗体、抗IL−1β抗体、抗IL−6抗体、抗IL−8抗体(例えば、ABX−IL−8(Abgenix))、および抗IL−12抗体)が挙げられる。
付加的な治療薬と組み合わせて投与されるとき、該共結晶および該他の治療薬は相加的に、または、より好ましくは相乗的に作用することができる。一つの実施形態において、本開示の共結晶を含む組成物は別の治療薬の投与と一斉に投与され、当該別の治療薬は同一組成物の一部であっても、または本開示の化合物を含む組成物とは違う組成物にあってもよい。別の実施形態において、該共結晶は別の治療薬の前にまたはそれに引き続いて投与されうる。また別の実施形態において、本開示の共結晶は別の治療薬(特に抗ウイルス剤)でこれまでに治療を受けたことがない、または現在は受けていない患者に投与される。
I.適合性試験
本発明の共結晶の医薬的に許容される賦形剤との適合性を典型的な適合性アッセイ(COMPASS)により試験をした。この方法に従って、本発明にかかるグルタル酸共結晶を単一の医薬賦形剤と物理的に混合して二成分混合物を得るか、または本発明にかかるグルタル酸共結晶を2またはそれ以上の賦形剤を含む混合物と物理的に混合することによって(三成分混合物)、賦形剤適合性が調査された。三成分混合物中の式I化合物の重量%は50%であったのに対して、各二成分混合物は式I化合物を5重量%含有した。テスト混合物を、50℃で4週間保存するか、または温度40℃および相対湿度75%で4週間保存した。
本発明の共結晶の医薬的に許容される賦形剤との適合性を典型的な適合性アッセイ(COMPASS)により試験をした。この方法に従って、本発明にかかるグルタル酸共結晶を単一の医薬賦形剤と物理的に混合して二成分混合物を得るか、または本発明にかかるグルタル酸共結晶を2またはそれ以上の賦形剤を含む混合物と物理的に混合することによって(三成分混合物)、賦形剤適合性が調査された。三成分混合物中の式I化合物の重量%は50%であったのに対して、各二成分混合物は式I化合物を5重量%含有した。テスト混合物を、50℃で4週間保存するか、または温度40℃および相対湿度75%で4週間保存した。
本発明の共結晶は医薬組成物の製造に通常使用される増量剤および/または賦形剤に適合する。テーブル4は本発明にかかる式I化合物のグルタル酸共結晶の三成分混合物の適合性試験の結果を示す。テーブル5は式I化合物の該トシレート塩の三成分混合物を使った同様の試験の結果を示す。
適合性試験の結果、テーブル4および5は、本発明にかかるグルタル酸共結晶は医薬的に許容される製剤の製造の間に通常使用される医薬賦形剤および増量剤とよりよい適合性があることを明確に示した。しかし、対応するトシレート塩は通常使用される賦形剤および/または増量剤に対し不安定であることが認められた。
例えば、グルタル酸共結晶および医薬増量剤または賦形剤を含む三成分混合物を50℃で4週間、または40℃/75%相対湿度で4週間保存したとき、式I化合物はほんの少ししか分解しなかった。典型的な分解の割合の範囲は50℃で約0.02%〜0.098%であった。湿度の存在は本発明にかかる共結晶の三成分混合物の適合性および/または安定性に不利な影響を与えず、40℃および75%相対湿度の存在下、式I化合物の分解の割合に増加はなかった。
対照的に式I化合物の該トシレート塩および2またはそれ以上の医薬増量剤または賦形剤を含む三成分混合物の式I化合物の分解の割合は、より大きかった。水分の存在が該トシレート塩を含有する三成分混合物の適合性を損なうことは明白である。テーブル5に示されるとおり、湿度の存在は該三成分混合物の分解を増加する。該トシレート塩に関し、湿度の存在下で、三成分混合物2は、同様の本発明のグルタル酸共結晶の三成分混合物の分解が0.02%であったのに対して、約10%分解を示した。
これらのデータは明白に本発明にかかるグルタル酸共結晶は、該トシレート塩と比較して、医薬製剤の製造に通常使用される賦形剤および増量剤に対してより適合性があることを示す。
II. 安定性試験
II. 安定性試験
該共結晶のテストサンプルを様々な温度および様々な相対湿度で1〜3箇月間保存することによって、固体状態の安定性試験を行った。安定性は該テスト共結晶のウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー(UPLC)分析によって判断した。該共結晶のテストサンプル中のAPIの分解の割合は下記の様に計算した:
%分解=(標準試料のAPIの%AUC−テストサンプルのAPIの%AUC)/(標準試料のAPIの%AUC)×100
%分解=(標準試料のAPIの%AUC−テストサンプルのAPIの%AUC)/(標準試料のAPIの%AUC)×100
本願発明の共結晶は本試験に使用された温度範囲にわたってかなり安定である。湿度の存在下(75%相対湿度(R.H.))での保存は本発明の共結晶の分解の割合を増加しなかった。特定の理論に帰するものではないが、結晶化度は本願発明の共結晶の安定性に寄与しているかもしれない。テーブル7は広範囲の温度にわたっての、また75%相対湿度・40℃下での本願発明の式Iグルタル酸共結晶の安定性データを示す。
テーブル7
テーブル7
テーブル7に示されるとおり、式I化合物の該グルタル酸共結晶は広範囲の保存温度でおよび湿度の存在下で優れた安定性を示す。
テーブル8に示されるとおり、結晶化度は式I化合物の遊離塩基の非晶質形を式I化合物の結晶形と比較することによって示された安定性の向上に寄与するという仮説をさらに支持する。
上記の結果より、該結晶形は、対応する非晶質形と比較して、特に水分の存在下で、分解に対してより安定であるので、結晶化度は安定性に重要な影響を持つことが示唆される。従って、結晶化度はまた本発明の共結晶のもつ改善された安定性に寄与しているかもしれない。
テーブル8に示されるとおり、結晶化度は式I化合物の遊離塩基の非晶質形を式I化合物の結晶形と比較することによって示された安定性の向上に寄与するという仮説をさらに支持する。
上記の結果より、該結晶形は、対応する非晶質形と比較して、特に水分の存在下で、分解に対してより安定であるので、結晶化度は安定性に重要な影響を持つことが示唆される。従って、結晶化度はまた本発明の共結晶のもつ改善された安定性に寄与しているかもしれない。
本発明の共結晶の持つ改善された安定性はメリットを有する。より良い安定性は、特に該共結晶の商業的スケールの製造および該共結晶の医薬製剤の商業的スケールの製造の間の該共結晶のより良いハンドリング、および使用のし易さを可能にし得る。向上した安定性はまた、固体医薬組成物(例えば該共結晶を含有する錠剤)の保存可能期間の増加に寄与しうる。
該結晶形は溶液中、すなわち共結晶が溶媒に溶解したときには保持されないので、溶液安定性への影響に関与するのは式I化合物と該溶媒との相互作用のみである。従って、該共結晶、該トシレート塩、または該遊離塩基の該結晶形の溶液は、同一実験条件下では同等な溶液安定性を示すことが予想される。
III.薬物動態についての製剤の開発&該共結晶の毒性学的試験
III.薬物動態についての製剤の開発&該共結晶の毒性学的試験
試験により、該共結晶は水および緩衝化溶媒に溶解することが示された。これらの試験により、該溶媒のpHは該共結晶の溶解性に影響することが明らかになった。溶解性は、低pH、例えばpH1.0またはpH2.0の緩衝液では最も大きく、および緩衝液のpHが高まるにつれ、該溶解性は低下した。グルタル酸共結晶のpH1.0の緩衝液のUPLC分析は、60mgより多くの式I化合物の遊離塩基体が緩衝液ミリリットルあたりに存在することを示す。しかしながら、UPLC分析によれば、pH7.0緩衝液のミリリットルあたりにははるかに少ない量の式I化合物の遊離塩基体約22mgが存在する。興味深いことに、恐らく式I化合物の両性イオン体の形成に起因して、pH4.0の緩衝液で溶解性が最も低く、約8mgの遊離塩基体が該緩衝液ミリリットルあたりに存在する。
室温で24時間放置した後の分析では該緩衝化共結晶溶液に分解はなかった。該トシレート塩とは違い、本発明の共結晶の溶液中、遺伝毒性の副産物は形成されなかった。多形スクリーニング(Polymorph screening)により更に、固体状態フォームAと特徴づけられた例示グルタル酸共結晶に関し単一の多形が示された。
A. 薬物動態
A. 薬物動態
試験はグルタル酸共結晶の薬物動態(PK)を式I化合物のトシレート塩のPKと比較するために行われた。3%Blanose 7LF PM(保存料なし)溶液を使用して、グルタル酸共結晶およびトシレート塩を調製した。カニクイザルにおける薬物動態学的試験の結果は、各化合物の経口投与後、グルタル酸共結晶の血漿中濃度は対応するトシレート塩よりも高いことを示す。
この試験において、各化合物を10mg/kgの用量でカニクイザル経口投与した。投与後、0分、60分、120分および180分に各試験対象から血液を採取した。全血から血漿を分離し、各血漿サンプルの一部を70%エタノールを加えることによって変性した。変性したタンパク質を遠心分離によってペレットにし、上清を集めて、乾燥窒素ガスを流して乾燥した。得られた該ペレットを0.1%ギ酸を含有する水で再構成し、該再構成された混合物をHSS−T3(高強度シリカ)カラムまたはYMC TriartC−18カラムを用いるUPLCで分析した。0.1% HCOOH含有水(移動相A)および0.1% HCOOH含有アセトニトリル(移動相B)の混合を用いるグラディエント溶離を薬物動態(PK)試料の分析に使用した。
図1に示されるとおり、グルタル酸共結晶の経口投与は、循環血漿において高濃度の共結晶を提供した。実際のところ、グルタル酸共結晶の経口投与後測定された式I化合物の脱アセチル化型の血漿中濃度は、トシレート塩の経口投与後に測定された式I化合物の脱アセチル化型の血漿中濃度と比較して、約2倍の高さであった。
該共結晶の経口投与後の高濃度な式I化合物の該脱アセチル化型は、高濃度な活性医薬種、すなわち、式I化合物の脱アセチル化、酸化型ももたらす。スキーム1を参照。式Iの化合物は二重のプロドラッグであり、下記のスキーム1に示されるように、酵素的に生物学的に活性な医薬5−アミノ−3−((2R,3R,5S)−3−ヒドロキシ−5−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン−2−イル)−3a,7a−ジヒドロチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7(3H,6H)−ジオンに変換される。
スキーム1
スキーム1
対照的に、対応するトシレート塩10mg/kgを経口投与されたサルでは式I化合物の脱アセチル化型および生物学的に活性な種の血漿濃度は低い。いくつかのファクターがプロドラッグおよび活性種の血漿濃度の違いの原因となり得る。特定の理論に縛られることなく、対応するトシレート塩と比較して、共結晶の安定性は高く、生体媒質における共結晶の溶解性は高く、および肝臓および腎臓による共結晶のクリアランス速度が低いことがグルタル酸共結晶製剤の経口投与に脱アセチル化および活性種の血漿濃度が高いことに起因しているかもしれないというのが一つの仮説である。
該PK結果に基づいて、本発明の共結晶はがん、HBV感染を含むウイルスの感染を標的にした治療の開発のためのより良い候補治療剤であると考えられる。
B. 経口GLP毒性学的試験
B. 経口GLP毒性学的試験
3つのビヒクル、Blanose 7LF PM(カルボキシルメチルセルロースナトリウム)(保存料なし)、Pluronic F60、およびポリビニルアルコールを本発明の共結晶のための医薬担体として試験した。該共結晶は良好な水溶解性を示したため、界面活性剤は共結晶含有医薬製剤には加えなかった。
本発明の共結晶を様々な量(濃度)で含有する製剤を用いて毒性学的試験を行った。簡潔に言えば、該遊離塩基(式I化合物)100mg/mL、10mg/mL、および1mg/mLを含有する製剤が得られるように、既知量のグルタル酸共結晶を各担体に溶解した。各試験製剤を3等分に分け、室温、2−8℃および−20℃で保存した。7日間保存した後、含有量および純度についてはウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー(UPLC)によって、および粒子径については光学顕微鏡によって、各製剤を分析した。各製剤のpHも測定した。
該製剤のpHは担体によって影響されず、7日間の試験期間にわたって同一であった。使用する担体に依存して、pHの測定値は試験製剤について全ての保存温度で4.0〜5.6の範囲であった。全ての試験製剤である程度の分解が認められたが、分解の割合は医薬的に許容される範囲内であった。しかしながら、他の2つの担体を用いて作成した製剤と比較して、Blanose 7LF PMを含有する製剤は分解の割合が最も高かった。
脱アセチル化はBlanose 7LF PM製剤で多く認められ、およびPluronic F60製剤では少なかった。これらの結果は、担体の性質が、該活性医薬の分解速度と分解の程度、認められる沈降の程度、および保存後の固体ケーキ様物質の形成に影響しうることを示す。
堆積および固体ケーキ様産物の形成がPVA製剤およびPluronic F60製剤で多く認められた。PVA製剤で形成された堆積物とは違って、Pluronic F60製剤で形成された堆積物は震とうすることで容易に分散できた。堆積物形成はBlanose製剤では相対的に低かった。しかしながら、Blanose製剤で固体ケーキが一旦形成されると、該固体は撹拌しても震とうしても容易に懸濁できなかった。
堆積および固体ケーキ様産物の形成がPVA製剤およびPluronic F60製剤で多く認められた。PVA製剤で形成された堆積物とは違って、Pluronic F60製剤で形成された堆積物は震とうすることで容易に分散できた。堆積物形成はBlanose製剤では相対的に低かった。しかしながら、Blanose製剤で固体ケーキが一旦形成されると、該固体は撹拌しても震とうしても容易に懸濁できなかった。
室温で1箇月の保存した後、ハンドリングが容易であり、長期保存の後でさえ安定性は増加していたので、10%Pluronic F60製剤をインビトロおよび/またはインビボ効力試験の担体として選択した。
IV. 製造方法
IV. 製造方法
式I化合物および少なくとも1つの共結晶形成体を含む共結晶は該共結晶形成体の溶液を式I化合物の溶液と混ぜ合わせることによって合成されることができる。具体的には、当該2つの溶液を、共結晶化を促進する共結晶形成体の式I化合物に対するモル比で混ぜ合わせる。
一つの本発明にかかる方法の実施形態に従って、共結晶形成体および式I化合物をモル比1:2で混ぜ合わせる。そのように得られた共結晶化溶液を過飽和にし、共結晶の形成を開始させる。共結晶化溶液を過飽和し、および共結晶形成を開始するために、冷却、溶媒の蒸発、または抗溶媒(anti-solvent)の添加が使用されうる。式I化合物および少なくとも1つの共結晶形成体を含む共結晶は、ろ過または化学分野で知られる他の適当な方法によって共結晶化溶液から単離されうる。
共結晶の形成は式I化合物と共結晶形成体間の接触を必要とするので、一つの実施形態において、式I化合物および共結晶形成体は一緒にすりつぶされ、得られた固体混合物を融解(melting)して、冷却して共結晶を形成させる。別法として、結晶形成体は式Iとの接触の前に融解されることができ、得られた混合物は共結晶化することができる。本発明の共結晶は、共結晶化を促進するのに適当な条件下で、式I化合物の溶媒和物を共結晶形成体と混ぜ合わせることによって、または式I化合物を共結晶形成体の溶媒和物と混ぜ合わせることによって得ることができる。
共結晶の存在についての該固体混合物の試験は当該技術分野で知られる従来の方法によって行われ得る。例えば、結晶化混合物中の共結晶の存在を調べるために粉末X線回折法を使用することは便利であり、一般的である。類似の方法で使用される他の方法には、示差走査熱量測定法(DSC)、熱重量分析法(TGA)およびラマン分光法が挙げられる。単一の結晶X線回折法および固体NMR法が共結晶構造を特定するのに特に有用である。
図2は例示共結晶形成体として式I化合物およびグルタル酸を含む共結晶の合成を示す。比較するために、図2はまた、5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテートのp−トルエンスルホン酸塩の製造方法を示す。示されるとおり、該合成方法は共結晶の商業的生産として操作上シンプルで、ロバストで、効率的で、およびスケーラブルである。さらに、該方法は費用効率が高く、良好な収率で共結晶の製造が可能である。
簡潔に言えば、デオキシアデノシン(2)は酸性条件下で脱プリン化される。一つの実施形態において、脱プリン反応は化合物2を無水酢酸、酢酸カリウムおよび氷酢酸と接触させ(3R、5S)−5−(メチルアセトキシテトラヒドロフラン)−2、3−ジイル ジアセテート(3)を形成することにより達成される。
ついで化合物3を5−アミノ−3H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2−オン(4) [Wolfe et al. J. Org. Chem. 1997, 62, 1754-1759の方法に従って調製]とテトラメチルシリル トリフルオロメタンスルホネート(TMSOTf)の存在下で結合させ化合物5を得る。化合物3と化合物4の結合ための酸触媒の例としてTMSOTfが挙げられるが、他の酸触媒、例えばAlCl3、SnCl4およびTiCl4をシリル化試薬(silating reagent:例えばN,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(「BSA」)またはトリメチルシリルクロリド)と共に、を使用することもできる。通常、化合物3および4の化学量論量が当該カップリング反応に使用される。しかしながら、わずかに超過量の5−アミノ−3H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2−オン(4)を化合物5の当該合成に使用することができる。ある態様に従って、5−アミノ−3H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2−オン(4)の化合物3に対するモル比の範囲は、約1.2:1〜約10:1、約1.2:1〜約9:1、約1.2:1〜約8:1、約1.2:1〜約7:1、約1.2:1〜約6:1、約1.2:1〜約5:1、約1.2:1〜約4:1、約1.2:1〜約3:1、または約1.2:1〜約2:1である。
該5−メチルアセトキシ基の選択的脱アセチル化は化合物5をリポザイム435とインキュベートすることによって達成される。
酵素触媒による脱アセチル化は該酵素の緩衝液を化合物5の有機溶液に加えることによって行われる。別法として、該酵素は固体支持体と共有結合していてもよく、選択的脱アセチル化は該固体支持酵素を化合物5の有機溶液と接触させることによって達成される。固体支持酵素の使用は、該酵素の効率的な再利用を可能とし、反応時間を短縮するというメリットがある。
化合物5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート(6)は取扱いが難しい。反応混合物からの反応溶媒の蒸発または化合物6の沈降は難しく、さらに、共結晶形成には不適な順最適な産物を生み出す。本開示の方法は、反応混合物が純度の高い状態の化合物6を共結晶を引き起こすのに適する溶媒混合物中に含有するため、化合物6の単離の必要性を排除する。従って、本発明の共結晶は、化合物6を含有する反応混合物を共結晶形成体(固体)または共結晶形成体の溶液と接触させることによって容易に製造することができる。
一つの実施形態に従って、化合物6と共結晶形成体を含む反応混合物を環境温度でエイジングすることによって共結晶の形成は引き起こされる。例えば、反応混合物は温度約−10℃〜約35℃、約10℃〜約25℃、または温度約10℃〜約20℃でエイジングされ得る。
共結晶形成を引き起こすために冷却が必要な場合、共結晶化混合物の温度は毎分約1℃、毎分約0.5℃、または毎分約0.25℃のペースで冷却されうる。いくつかの実施形態について、該冷反応混合物の温度は約−20℃〜約20℃、例えば約−20℃〜約−10℃、約−10℃〜約0℃、約0℃〜約5℃、または約0℃〜約10℃の範囲である。
本願発明の共結晶の他の製造方法として、これらに限定されないが、機械的共結晶合成、ソルボサーマル共結晶合成、共結晶合成のための溶媒蒸発の使用、共結晶合成のための固体状態粉砕法(solid state grinding method)、および共結晶合成のための溶媒滴下粉砕法(solvent drop grinding method)が挙げられる。
該溶媒蒸発法による共結晶の合成には、式I化合物の溶液と適当な共結晶形成体の溶液を別々に調製し、式I化合物の溶液の化学量論量を共結晶形成体の溶液の化学量論量と混合し、および共結晶形成を引き起こすのに適する温度で該反応混合物を保存することによって式I化合物および共結晶形成体を含む生じた反応混合物を過飽和させることが含まれる。
一つの実施形態に従って、本発明の共結晶は溶媒滴下粉砕法によって得られた。簡潔に言えば、触媒として機能すると考えられる適当な共結晶化溶媒が少量存在するもとで、式I化合物(化合物6)および該共結晶形成体を一緒に粉砕した。
共結晶形成に適する溶媒には、例えば、エタノール、メタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、イソブタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸イソプロピル、THFおよびそれらの混合物が挙げられる。一つの実施形態において、グルタル酸のエタノール溶液が化合物6のトルエン−エタノール溶液に添加された。次いで、得られた過飽和反応混合物を冷却して5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−5−ヒドロキシメチル テトラヒドロフラン−3−イル アセテート グルタル酸共結晶を形成した。
通常、等モル量のまたはより大きなモル量の共結晶形成体が共結晶を合成するために使用される。反応化学量論に依存して、共結晶形成体の式I化合物に対するモル比は約1:1、1:2、または約2:1であることができる。化合物6の溶液および共結晶形成体の溶液の濃度は約50ミリモーラー〜約2.0モーラーとさまざまであることができ、例えば 約250ミリモーラー、約500ミリモーラー、約600ミリモーラー、約700ミリモーラー、約800ミリモーラー、約900ミリモーラー、約1モーラー、約1.2モーラー、約1.4モーラー、約1.6モーラー、約1.8モーラーまたは約2.0モーラーが挙げられる。
共結晶の形成は共結晶形成体の溶液の濃度、式I化合物の溶液の濃度、共結晶形成を引き起こすのに適する温度での反応物(共結晶形成体および式I化合物)および反応混合物の生成物(共結晶)の溶解性に依存する。典型的な共結晶化時間は約10分間〜約48時間、約10分間〜約24時間、約10分間〜約12時間、約10分間〜約10時間、約10分間〜約8時間、約10分間〜約6時間、約10分間〜約4時間、約10分間〜約2時間、または約10分間〜約1時間とさまざまであることができる。
このように形成された共結晶は重力ろ過、真空ろ過し、単離された共結晶を洗浄し乾燥させることによって単離されることができる。共結晶はまた該反応混合物から溶媒を蒸発させることによって単離されうる。通常、単離された共結晶は温度約30℃〜約70℃または約40℃〜約60℃で乾燥される。乾燥は大気圧または減圧(真空)下、例えば、減圧範囲約0.1〜約10水銀柱ミリメートルでおこわなれ得る。
上記の方法は少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、または99.9%の純度を有する本願発明の共結晶を提供した。下記の例示共結晶は本発明の方法を用いて合成された。
実施例
実施例
下記の合成プロトコル例は説明のみを目的とするものであり、本願請求の範囲を限定することを意図するものではない。
以下に記載される合成スキームにおいて、別段の指示がない限り、全ての温度はセルシウス度で記載され、全ての部分およびパーセンテージは重量による。試薬は商業的サプライヤーから購入し、別段の指示がない限り、追加の精製なしに使用した。全ての溶媒は商業的サプライヤーから購入し、受け取ったままで使用した。
以下に記載する反応は、概して窒素またはアルゴンの陽圧下、環境温度(別段の記載がない限り)、無水の溶媒中で行われ、反応フラスコは基質および試薬のシリンジでの導入用にゴム隔膜を装着された。ガラス器具はオーブンで乾燥および/または加熱乾燥した。反応はTLCで試験され、および/またはLC−MSで分析され、および出発物質の消費で判断されて終わらされた。ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー(UPLC)による分析はHigh Strength Silica(HSS)カラムまたはYMCカラム(Waters(登録商標))を用いて行った。典型的な流量は0.7mL〜1.0mL/分であり、注入量は約2〜5μLである。
分析薄層クロマトグラフィー(TLC)をシリカゲルで予めコートされたガラスプレート60F2540.25mmプレート(EMD Chemicals)上で行い、シリカゲル上UV光(254nm)および/またはヨウ素、および/またはTLC染色(例えばエタノール性リンモリブデン酸、ニンヒドリン溶液、過マンガン酸カリウム溶液、または硫酸セリウム(ceric sulfate)溶液)と共に加熱して可視化してもよい。
1H−NMRスペクトルおよび13C−NMRをBruker Avance II(登録商標)分光計を600MHzで操作して記録した。NMRスペクトルはクロロホルムを参照標準(プロトンについては7.27ppm、炭素については77.00ppm)として用いるCDCl3溶液(ppmで示す)として、プロトンの参照標準として3.4ppmおよび4.8ppmおよび炭素の参照標準として49.3ppmを用いるCD3OD溶液として、DMSO−d6(プロトンについて2.49ppm)、または適切な場合には内部標準のテトラメチルシラン(0.00ppm)を用いて得られた。必要に応じて他のNMR溶媒も使用した。ピーク多重度を報告するのに、下記の略語:s(一重線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)、m(多重線)、br(ブロード)、bs(ブロードな一重線)、dd(二重線の二重線)、dt(三重線の二重線)を使用した。カップリング定数は測定時、ヘルツ(Hz)で表した。
5−アミノ−3−(2’−O−アセチル−3’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3H−チアゾロ[4、5]ピリミジン−2−オン)のグルタル酸共結晶の合成
A.カップリング反応−(2S、4R、5R)−4−アセトキシ−5−(5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−テトラヒドロフラン−2−イル−メチル アセテート(5)の合成
5−アミノ−3−(2’−O−アセチル−3’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3H−チアゾロ[4、5]ピリミジン−2−オン)のグルタル酸共結晶の合成
A.カップリング反応−(2S、4R、5R)−4−アセトキシ−5−(5−アミノ−2−オキソチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−3(2H)−イル−テトラヒドロフラン−2−イル−メチル アセテート(5)の合成
化合物5をPCT公開番号:WO2008140549に記載のプロトコルに従って合成した。簡潔に言えば、温度プローブ、冷却器および窒素注入口を装着した三つ口フラスコに5−アミノ−3H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2−オン(化合物4)およびアセトニトリルを入れる。N,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA)を化合物4の該溶液に漏斗を使って加え、40℃、窒素雰囲気下で90分間撹拌した。5℃に冷却した後、1、2、5−トリ−O−アセチル−β−D−リボフラノース(化合物3)のアセトニトリル溶液を加え、次いでTMSOTfを加える。
次いで反応混合物を75℃に加熱し、この温度で10時間保持した。加熱後、該反応混合物が入ったフラスコをゆっくり15℃に冷却した。次いで、該反応混合物の温度を15℃に維持しながら、水を1mLずつ該冷反応混合物に加え、反応をクエンチした。該クエンチされた反応混合物をセライトと混合し、水酸化ナトリウムを用いて中和した。セライトを除去して得られたろ液を重炭酸ナトリウム水溶液および固体塩化ナトリウムと混合し、分液ロートに移して、アセトニトリルで抽出した。有機層を濃縮して所望の生成物、化合物5を得た。化合物5の同定およびその純度を認証済み(authentic)物質を標準品として使用してHPLCで測定した。
B.選択的脱アセチル化−化合物6の合成
B.選択的脱アセチル化−化合物6の合成
化合物5のアセトニトリル溶液を固体担体に固定化されているCandida antarctica、タイプB(Biocatalyticsカタログ番号IMB−111)リパーゼの重炭酸塩水溶液に加える。該反応混合物(懸濁液)を36時間撹拌し、続いて当該担体結合の酵素をろ過した。ろ液を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を合わせ、無水の硫酸マグネシウムで乾燥し、Norit 211で90分間撹拌し、ついでセライトフィルターエイドでろ過して、所望のアルコール(6)を得た。化合物6の同定およびその純度を認証済み(authentic)な物質を標準品として使用してHPLCで測定した。
C.共結晶形成
C.共結晶形成
17.2gの化合物(6)[52.7ミリモル]を含有する酢酸エチル溶液(47.4mL)を、180ミリバールの減圧下60℃でロータリーエバポレーションにかけて溶媒を除去した。このように得られた残渣をエタノール(110mL)に溶解し、減圧(60℃、180ミリバール)下で濃縮した。ついで新たにエタノール(83mL)を丸底フラスコに入った反応混合物に加え、この混合物を化合物(6)の澄明黄色エタノール溶液が得られるまで室温で撹拌した。
グルタル酸を15mLのエタノールに溶解してグルタル酸(3.62g、27.4ミリモル)溶液を調製した。ついでこの透明無色溶液を、グルタル酸の添加の間に加熱されて温度50℃に維持されたエタノール溶液化合物(6)(撹拌されながら)に、15分間かけて滴加した。ついで該共結晶化混合物を0.25℃/分の速度で30℃に冷却し、共結晶形成が開始した。該冷却共結晶化混合物を撹拌した後に形成される結晶はなかった。
該共結晶化混合物を撹拌しながら50℃に再加熱した。10mgの式I化合物のグルタル酸共結晶を共結晶形成を引き起こすための種として該共結晶化混合物に添加し、該混合物を0.25℃/分の速度で冷却した。温度が下がると、撹拌できない粘度の高い懸濁液が形成された。該共結晶化混合物を55℃に再び加熱し、この温度で容易に撹拌できる懸濁液が得られるまで維持した。
ついで該熱懸濁液を撹拌しながら0.25℃/分のペースで約0℃まで徐々に冷却した。該共結晶化混合物の温度を0℃〜5℃に維持しながら、該冷共結晶化混合物を終夜撹拌した。該共結晶の懸濁液を吸引ろ過して集め、冷エタノール(43mL)で洗浄し、および真空オーブン(5mbar)中、温度40℃で乾燥した。収量−18.24g(88.1%)のグルタル酸共結晶を白色固体として得た。該共結晶の純度をHPLCで測定したところ、純度99.75%であった。
上記に説明するとおり、本発明の共結晶の塩ファクター(S)は、式I化合物のトシレート塩の塩ファクター(STosは1.53である)よりも低い。それらの低いS値により、該共結晶を含む組成物はより少ない経口投与量で式I化合物のより高い定常状態での血漿中濃度を達成する。結果として、式I化合物の治療的に適当な血漿中濃度を達成するために、治療を受けている患者は、式I化合物の該トシレート塩の組成物を投与されている患者と比べて、より少ない経口投与量の該共結晶の組成物しか必要としないであろう。
V.HBVウイルスのレプリコン複製活性の阻害
V.HBVウイルスのレプリコン複製活性の阻害
HBV感染は急性および慢性肝疾患の主要な原因の一つである。現在のHBV治療は血清HBV DNA濃度を低下するのに効果的であるものの、低いウイルス排除率ではこれらの治療薬の効果は限定的であって、しばしば長期の使用を必要とし、重い毒性の副作用を引き起こす。本願発明はToll様受容体7(TLR−7)(これは未成熟樹状細胞に発現する)のアゴニストとして式I化合物の共結晶を提供する。
TLRは宿主中のサイトカインおよびケモカインの放出を刺激することによって免疫応答を活性化する病原体認識受容体のファミリーである。宿主の免疫システムが活性化して放出されたサイトカインおよびケモカインは効果的な抗ウイルス剤であり、これは主にそれらのウイルス感染細胞を認識し殺傷する能力によるものである。従って、式I化合物の共結晶(二重のプロドラッグ)、単一のプロドラッグ(脱アセチル化式I化合物または酸化型の式I化合物)および非アセチル化・酸化型の式I化合物(生物活性種)をHBV複製を阻害する能力についてインビトロで評価した。スキーム1(上記)は該二重のプロドラッグの構造、該単一のプロドラッグの構造および該生物活性種を示す。
TLRは宿主中のサイトカインおよびケモカインの放出を刺激することによって免疫応答を活性化する病原体認識受容体のファミリーである。宿主の免疫システムが活性化して放出されたサイトカインおよびケモカインは効果的な抗ウイルス剤であり、これは主にそれらのウイルス感染細胞を認識し殺傷する能力によるものである。従って、式I化合物の共結晶(二重のプロドラッグ)、単一のプロドラッグ(脱アセチル化式I化合物または酸化型の式I化合物)および非アセチル化・酸化型の式I化合物(生物活性種)をHBV複製を阻害する能力についてインビトロで評価した。スキーム1(上記)は該二重のプロドラッグの構造、該単一のプロドラッグの構造および該生物活性種を示す。
ウイルスの複製の直接的な阻害を、HBV感染HepaRG細胞を含有する培養物中の分泌されたHBV DNA濃度およびHBV表面抗原(HBsAg)濃度をモニタリングすることによって評価した。また、培養物におけるウイルスの複製の阻害をHBV感染HepaRG細胞を該非アセチル化・酸化型の式I化合物(生物活性種)(これは選択的TLR−7アゴニストである)で刺激された末梢血単核細胞(PBMC)の馴化培地に曝露することによって間接的に評価した。
HEPARG細胞株の生成
HEPARG細胞株の生成
HepaRG細胞(Cat# HPR101)、HepaRG成長培地サプリメント(Cat# ADD710)、およびHepaRG分化培地培地サプリメント(Cat# ADD720)をBiopredics International(レンヌ、フランス)から購入した。該成長培地サプリメント中にはDMSOは含まれず、該分化培地サプリメントは2%DMSOを含む。細胞を、37℃、5%CO2湿度環境で、成長培地サプリメント含有ウィリアムズE培地(WEM)(GIBCO)中で培養した。分化を引き起こすために、成長培地を分化培地(分化培地サプリメント含有WEM)と1:1の比で混合し、コンフルエントなHepaRG細胞に加えた。
3日間の培養後、混合培地を分化培地で置き換え、細胞を分化培地中でさらに2〜4週間維持した。培養期間をとおして、分化培地を2〜3日間毎に取り替えた。分化されたHepaRG細胞(HepaRGd)は胆汁性様(biliary-like)細胞の単層で取り囲まれた肝細胞様細胞島(island)を示す。HBV感染および化合物処置の前に、HepaRGd細胞をコラーゲンIでコーティングされた96ウェルプレート(Gibco、Cat# A11428−03)に50,000〜60,000細胞/ウェルで播種した。HBV感染に先だって、96ウェルプレート中播種後少なくとも1週間で細胞は分化した表現型を回復した。
HBV感染
HBV感染
Sells M.A., et al., PNAS, 84(4): 1005-1009に開示されるように、HBV接種源をHepG2.2.15培養細胞(HBV(遺伝子型D、ayw株)複製およびビリオン分泌物をサポートする細胞株)から採取した。HepG2.2.15細胞を、コラーゲンI(BD Biosciences)で予めコートされたハイパーフラスコ(コーニング)を用いて、1xPen/Strep(インビトロジェン)、10%FBS、および0.25mg/mLG−418(インビトロジェン)を含有するDMEM+GlutaMAX−I(インビトロジェン)中で維持した。コンフルエンシーに達したら、HepG2.2.15培養培地を1xPen−Strep、2.5%FBS、および1%DMSOを含有するDMEM+GlutaMAX−Iで3日間置き換え、その後1xPen−Strepおよび1%DMSOを含有するDMEM+GlutaMAX−Iで置き換えた。該1%DMSO含有培地を3〜4日間毎に2週間かけて集め、Ti45ベックマンローター中、20%スクロースクッションを介して、45,000rpm、4℃で、3時間超遠心分離して、HBV感染性ビリオンおよびウイルス成分粒子をでペレット状にした。該ペレットを、プラスミドDNAを含有する遺伝子型D HBVを内部標準として用いて下記に記載のようにリアルタイムPCRで測定した108−109ゲノム当量(GE)/mLの濃度でWEM中に再懸濁した。該接種源の感染力を評価するために、96ウェルプレート中HepaRGd細胞を50〜200GE/細胞および4%PEG8000(ポリエチレングリコール8000、シグマ、Cat# P5413−500G)を含有する分化培地で37℃で16時間感染させた。感染の最後に、HBV接種源を取り除き、細胞を分化培地で3回洗浄した。分化培地を2〜3日間毎に補充し、およびHBV複製を分泌されたHBV DNA、B型肝炎表面(HBsAg)抗原および/またはe(HBeAg)抗原を測定することによってモニタリングした。
分泌されたHBV抗原およびHBV DNAの測定
分泌されたHBV抗原およびHBV DNAの測定
HBsAgを、HBsAg化学発光イムノアッセイ(CLIA)キットを製造者(Autobio Diagnostics Co.、鄭州、中国)が勧める方法に従って用いて、50μLのHBV感染HepaRGの上清から測定した。HBV DNAを、MagNA Pure 96 DNAおよびViral NA Small Volume Kit(Roche、Cat# 05 467 497 001)を用いて、50μLのHBV感染HepaRGdの上清から抽出した。EagleTaq Master Mix Kit(Roche、Cat# 05529026 190)を用いて、フォワードプライマーCTG TGC CTT GGG TGG CTT T、リバースプライマーAAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA、およびプローブ56−FAM−AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G−3IABkFQ(IDT DNA)で、加熱/冷却サイクル条件:50℃で2分間、95℃で10分間、および95℃で15秒間および60℃で1分間を40サイクルで、コア領域をカバーする99ヌクレオチドフラグメントを増幅した。全てのPCR反応はViiA7 リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を用いて行った。
HBVウイルスの複製の阻害
HBVウイルスの複製の阻害
本願発明の式I化合物の共結晶は二重のプロドラッグであり、上記のスキーム1に記載されるとおりインビボで酵素的に生物学的に活性な種5−アミノ−3−((2R,3R,5S)−3−ヒドロキシ−5−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン−2−イル)−3a,7a−ジヒドロチアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7(3H,6H)−ジオンに変換される。これらの化合物はToll様受容体、特にTLR−7、を刺激してサイトカインおよびケモカインを放出させることにより抗ウイルス活性を発揮するとみられている。ウイルスの複製阻害活性を測定するために、グルタル酸共結晶(二重のプロドラッグ)、式I化合物の脱アセチル化型(単一のプロドラッグ)および生物学的に活性な種(RO6871765)を合成した。
HBV複製の直接的なおよび間接的な阻害活性の両方を測定した。当該試験の薬物なしのコントロールとしてロフェロン−A、IL−6、TNF−α、IP−10またはDMSOを使用した。直接的試験のために、グルタル酸共結晶、式I化合物の脱アセチル化型、および生物学的に活性な種(RO6871765)の原液、ならびにコントロール薬剤をWEM成長培地中、最終容量120μLおよびDMSO濃度2%(v/v)で調製した。これらの試薬のアリコートを感染後4日にHBV感染HepaRGd細胞を含有する96ウェル培養プレートの各ウェルに加えた。各ウェルのDMSO最終濃度は2%であった。阻害試験で使用されたHepaRGd細胞を2%DMSO含有分化培地で維持した。HBV複製の間接的阻害活性を評価するために、HBV感染HepaRGd細胞を、DMSO(コントロール)またはRO6871765(100μM)刺激PBMCから採取され、分化培地で段階希釈された馴化培地と共にインキュベートした。
テスト化合物を含有する分化培地の既知のアリコートまたは馴化培地のアリコートを培養物中のHBV感染細胞に加えることによって、HBVウイルスの複製阻害活性を行った。テスト化合物を含有する分化培地の既知のアリコートまたは馴化培地を2〜3日間毎に培養物中のHBV感染細胞に計7日間加えた。処置の7日目(感染後11日)に、上清50μLを使用して、分泌されたHBV抗原またはHBV DNAの濃度をそれぞれ上記と様にCLIAまたはリアルタイムPCRを用いて測定した。細胞の生存はCellTiter−Glo(Promega、Cat#G7571)を用いて測定した。Graphpad(La Jolla、CA)を用いて用量応答曲線を得た。用量応答曲線からEC50(50%阻害を引き起こす有効濃度)およびCC50(未処理細胞対照)値を薬物なしコントロールと比較してHBVウイルスの複製活性の50%減少が認められるテスト化合物の濃度または馴化培地の濃度(log希釈として)を算出した。EC50およびCC50値は2〜4個の独立したHBV感染試験(各々2重に行われた)に由来した。
HBV複製に対するRO6871765の直接的影響
HBV複製に対するRO6871765の直接的影響
これまでのウイルスの阻害試験は該グルタル酸共結晶(二重のプロドラッグ)、および式I化合物の該脱アセチル化型(単一のプロドラッグ)は培養されたHepaRG細胞でウイルスの複製を阻害しないことを示した。RO6871765(生物学的に活性な種)がHepaRG細胞中でHBVウイルスの複製を阻害するかどうかを評価するために、感染細胞を感染後4日目に既知濃度のRO6871765と共にインキュベートした。RO6871765の200μM原液を段階希釈して、試験溶液を調製した。ウイルスの阻害試験で試験したRO6871765の濃度は200μM、66.67μM、22.22μM、7.41μM、2.47μMおよび0.82μMであった。細胞培地に既知濃度のRO6871765または2%DMSO(コントロール細胞)を含有する新しい培地を3日間毎に補充した。ペグ化インターフェロン−アルファ2a(Pegasys(登録商標))の3つの異なる濃度(56pM、167pM、および500pM)で処理したHBV感染HepaRGd細胞ををポジティブコントロールとして使用した。
処置の7日目(細胞感染11日後)に分泌されたHBsAgおよびHBV DNAの濃度を測定した。図3Aに示されるとおり、RO6871765は直接的な抗HBV効果は示さなかった。最高濃度の(200μM)RO6871765でインキュベートした細胞に関し、HBV DNAまたはHBsAgの濃度の変化は検出されなかった。従って、RO6871765のEC50は200μMより高い(図3A、テーブル11)。HBV感染HepaRGd細胞がRO6871765で試験されたとき、著しい細胞傷害性は認められなかった(CC50>200μM、生存における最大減少はRO6871765の最高濃度で約17%である)。
テーブル11
テーブル11
対照的に、ペグ化インターフェロン−アルファ2aで処理されたHBV感染HepaRGd細胞はHBV複製の著しい減少を示した。試験された最高濃度で分泌されたHBV DNAおよびHBsAgの濃度はそれぞれ76.9%±14.8%および46.0%±6.3%まで減少した(500pM;図3B、テーブル12を参照)。
テーブル12
テーブル12
これらの結果はRO6871765が抗ウイルス活性が低いことを示す。しかしながら発明者らが驚いたことに、RO6871765刺激PBMCから得られた馴化培地はHBV感染培養HepaRG細胞からのHBV DNAおよびHBsAg分泌の両方を著しく減少させ、これはRO6871765によるHBVウイルス複製の間接的阻害のサポートを提供する。
RO6871765のHBV複製に対する間接的影響
RO6871765のHBV複製に対する間接的影響
TLR−7アゴニストはヒトPBMCからの産生サイトカインおよびケモカインを刺激する。培養されたPBMCをDMSO(コントロール)または100μMのRO6871765(薬物)を接触させることによって得られた馴化培地をHBV感染HepaRGd細胞と接触させた。
HBV感染HepaRGd細胞を健康なドナー−ドナー70615(グラフA−D)およびドナー77726(グラフE、F)から単離されたPBMCから採取された様々に希釈した馴化培地と共にインキュベートした。各ドナーのPBMCをDMSO(グラフA、C、E)または100μMのRO6871765(グラフB、D、F)のいずれかで刺激した。図4A、4Cおよび4EはDMSO刺激PBMCを用いたHBVウイルス複製阻害に対応し、図4B、4Dおよび4FはRO6871765刺激PBMCを用いたHBVウイルス複製阻害に対応する。3つの実験を行った。第1の実験において(図4A、4B)、PBMC(ドナー70615)からの馴化培地を分化培地を用いてまず10倍に希釈し、次いで該希釈馴化培地をHBV感染HepaRGd細胞に添加する前に3倍ずつ段階希釈した。第2の実験において(図4C、4D)、PBMC(ドナー70615)からの馴化培地をまず分化培地を用いて5倍に希釈し、次いでHBV感染HepaRGd細胞に添加する前に5倍ずつ段階希釈した。第3の実験において(図4E、4F)、PBMC(ドナー77726)からの馴化培地を分化培地を用いてまず5倍に希釈し、次いでHBV感染HepaRGd細胞に添加する前に5倍ずつ段階希釈した。コントロールおよびRO6871765処理細胞について、培養培地中で分泌されたHBV DNAおよびHBsAgの濃度をモニタリングすることでHBV複製阻害活性を測定した。
HBV感染HepaRGd細胞を健康なドナー−ドナー70615(グラフA−D)およびドナー77726(グラフE、F)から単離されたPBMCから採取された様々に希釈した馴化培地と共にインキュベートした。各ドナーのPBMCをDMSO(グラフA、C、E)または100μMのRO6871765(グラフB、D、F)のいずれかで刺激した。図4A、4Cおよび4EはDMSO刺激PBMCを用いたHBVウイルス複製阻害に対応し、図4B、4Dおよび4FはRO6871765刺激PBMCを用いたHBVウイルス複製阻害に対応する。3つの実験を行った。第1の実験において(図4A、4B)、PBMC(ドナー70615)からの馴化培地を分化培地を用いてまず10倍に希釈し、次いで該希釈馴化培地をHBV感染HepaRGd細胞に添加する前に3倍ずつ段階希釈した。第2の実験において(図4C、4D)、PBMC(ドナー70615)からの馴化培地をまず分化培地を用いて5倍に希釈し、次いでHBV感染HepaRGd細胞に添加する前に5倍ずつ段階希釈した。第3の実験において(図4E、4F)、PBMC(ドナー77726)からの馴化培地を分化培地を用いてまず5倍に希釈し、次いでHBV感染HepaRGd細胞に添加する前に5倍ずつ段階希釈した。コントロールおよびRO6871765処理細胞について、培養培地中で分泌されたHBV DNAおよびHBsAgの濃度をモニタリングすることでHBV複製阻害活性を測定した。
図4に示すように、DMSOで処理されたPBMCからの馴化培地は有意な抗ウイルス効果を誘導しなかった(図4A、4Cおよび4Eおよびテーブル13を参照)。対照的に、RO6871765で処理されたPBMCからの馴化培地の存在下では分泌されたHBV DNAおよびHBsAg濃度の両方の用量依存的減少が認められた(図4B、4Dおよび4F、テーブル13を参照)。HBV DNAに対するRO6871765の平均EC50値は−2.5±0.4log10であり、これはRO6871765刺激馴化培地の1:318希釈に相当する(テーブル13)。該RO6871765刺激馴化培地のHBV表面抗原(HBsAg)分泌に対する平均EC50値は−1.2log10であり、これは1:16希釈に相当する(テーブル13)。細胞生存アッセイはDMSO処理PBMCからの馴化培地は有意な細胞傷害性効果を示さなかったが、RO6871765刺激PBMCからの希釈馴化培地(10倍および5倍希釈)で処理されたHBV感染HepaRGd細胞はそれぞれ14%および19%の細胞生存の若干の減少を示した(図4、テーブル13)ことを示した。
テーブル13
テーブル13
RO6871765で処理された培養PBMCから得られた馴化培地の抗ウイルス効果は大抵PBMCからのサイトカインおよびケモカインの放出によるものである。馴化培地からのサイトカインプロファイリング試験はRO6871765はインターフェロン−α(IFN−α)、インターロイキン6(IL−6)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)、およびIFNγ誘導タンパク質10(IP−10)の放出を誘導し、PBMCがDMSOで処理されたときはこれらのサイトカインの放出は認められなかったことを示した。
IFN−アルファ2a(ロフェロン−A)、IL−6、TNF−α、およびIP−10のHBV複製に対する影響を調べるために、HBV感染HepaRG細胞アッセイを用いて、これらのサイトカインの各々の用量依存的滴定を行った。試験された最高濃度は、ロフェロン−Aについては − 1000IU/ml、およびIL−6、TNF−αおよびIP−10については1000ng/mlであり、これらはその後、比較のためにモル濃度に変換された。
図5に示すように、ロフェロン−AおよびIL−6の両者は、分泌されたHBsAgおよびHBV DNAの用量依存的阻害を示した。HBV DNA分泌に対するロフェロン−AおよびIL−6のEC50値はそれぞれ1.0±0.3pMおよび0.027±0.0073nMである。ロフェロン−AおよびIL−6はまたHBsAgの分泌をそれぞれ0.033±0.022nMおよび0.26±0.020nMのEC50値で阻害する。TNF−αはHBV複製を阻害するように見えるが、このサイトカインは約1nMの濃度でさえ細胞傷害性である。TNF−αのHBV DNAおよびHBsAg分泌に対するEC50値はそれぞれ0.085±0.046nMおよび0.32であった。ケモカインIP−10に関し試験した最高濃度でさえ細胞毒性もHBV複製阻害作用も認められなかった(EC/CC50>115nM、図5を参照)。これらのデータは合わせて、RO6871765刺激PBMC馴化培地が、ヒトPBMCからのIFN類およびサイトカインの放出を媒介する間接メカニズムを介してHBV複製を阻害したこと強く示唆する。
Claims (21)
- 該共結晶形成体がフマル酸、マロン酸、グルタル酸、アジピン酸、およびグリコール酸からなる群から選択される、請求項1に記載の共結晶。
- 該共結晶形成体がグルタル酸である、請求項2に記載の共結晶。
- 該共結晶が式Iの化合物およびマロン酸を含む、請求項1に記載の共結晶。
- 該共結晶が式Iの化合物およびフマル酸を含む、請求項1に記載の共結晶。
- 該共結晶が式Iの化合物およびグルタル酸を含む、請求項1に記載の共結晶。
- 該共結晶が式Iの化合物およびアジピン酸を含む、請求項1に記載の共結晶。
- 該共結晶が式Iの化合物および2−アミノ安息香酸を含む、請求項1に記載の共結晶。
- 該共結晶が式Iの化合物およびα−ケトグルタル酸を含む、請求項1に記載の共結晶。
- 式Iの化合物および共結晶形成体が該共結晶内において、1:1、1:2、または2:1の比で存在する、請求項1に記載の共結晶。
- 該グルタル酸共結晶が回折角2θ 5.9、8.1、11.3、11.9、12.4、15.7、17.8、18.3、18.9、20.6、20.8、21.6、22.4、24.2、24.6、25.4、25.6、26.5、および28.6に粉末X線回折ピークを有する、請求項6に記載の共結晶。
- 該共結晶形成体がグルタル酸である、請求項12に記載の医薬組成物。
- 該疾患または状態ががん、炎症、またはB型肝炎感染から選択される、請求項14に記載の方法。
- 該疾患または状態がB型肝炎感染である、請求項15に記載の方法。
- 請求項1の共結晶が抗生物質、制吐剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ペグ化α−インターフェロン、ペグ化β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、ポリメラーゼ阻害剤、およびトール受容体様モジュレーターからなる群から選択される第2の治療薬の治療的有効量と組み合わせて投与される、請求項14に記載の方法。
- 請求項1の共結晶が治療的有効量のα−インターフェロン、β−インターフェロン、ペグ化α−インターフェロン、またはペグ化β−インターフェロンと組み合わせて投与される、請求項18に記載の方法。
- 該共結晶形成体の溶液および該式Iの化合物の溶液が有機溶媒、水、または水および有機溶媒の混合物を用いて得られる、請求項19に記載の方法。
- 有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、THF、酢酸エチル、またはそれらの組合せから選択される、請求項20に記載の方法。
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