JP2018174941A - 核酸の非特異的標的の捕捉方法 - Google Patents

核酸の非特異的標的の捕捉方法 Download PDF

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Abstract

【課題】サンプルから標的核酸を単離するための方法を提供すること。【解決手段】上記方法は、標的核酸を含むサンプルを、該標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から構成される非特異的捕捉プローブ、および、該標的核酸を支持体に連結するための手段と混合する工程などを含み、該オリゴヌクレオチド配列が：ポリＵ配列、ＧおよびＴヌクレオチド、またはＧおよびＵヌクレオチドを含むランダムポリ（ｋ）配列、１０個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、１０個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列などからなる群より選択される。【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年８月１７日に出願された仮出願第６０／８２１，０７８号（この内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
発明の分野
本開示の組成物および方法は、分子生物学に関し、より詳細には、サンプルなどの混合物から核酸を単離するための方法および組成物に関し、標的核酸を混合物の他の成分から分離するために、該方法および組成物は、標的核酸に対し非特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを使用する。
多くの分子生物学処理手順、例えば、核酸のインビトロ増幅およびインビトロハイブリダイゼーションは、後続手順において有効とするように、核酸について何らかの調製を行うことを含む。核酸精製法は、サンプル中に存在する全ての核酸を単離するか、物理的特徴にもとづいて種々のタイプの核酸をサンプルから単離するか、または、特異的核酸をサンプルから単離してもよい。多くの方法は、核酸単離を完了するために、複雑な手順を含むか、強烈な薬品または条件を用いるか、または長い時間を必要とする。いくつかの方法は、それぞれが所望の標的核酸に対して特異的な特別のオリゴヌクレオチドの使用を含むが、これは、特に、一つ以上の標的核酸の単離が望まれる場合、または、所望の標的核酸の配列が未知の場合、方法の設計、最適化、および性能をより複雑にする。したがって、他のサンプル成分から対象核酸を分離するための、単純、効率的で、高速な方法が常に求められている。
サンプルから標的核酸を単離するための方法であって：（ａ）標的核酸を含むサンプルを、該標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から構成される非特異的捕捉プローブと混合すること、および、該標的核酸を支持体に連結するための手段を含む方法が開示される。その場合、オリゴヌクレオチド配列は、ポリＵ配列、ＧおよびＴヌクレオチド、またはＧおよびＵヌクレオチドを含むランダムポリ（ｋ）配列、１０個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、１０個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、１０個以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、または、少なくとも二つのＧＵ単位から構成される、非ランダムポリＧＵ配列である。さらに、この方法工程は、支持体、標的核酸、および非特異的捕捉プローブを含む反応混合物を、捕捉プローブと標的核酸とが非特異的にハイブリダイズして、支持体に連結されるハイブリダイゼーション複合体を形成することを可能とするハイブリダイゼーション条件下で、インキュベートすること、および、反応混合物の溶液相から支持体を分離し、支持体に連結するハイブリダイゼーション複合体を、他のサンプル成分から分離し、それによって標的核酸を、他のサンプル成分から単離することを含む。一実施態様では、支持体に標的核酸を連結させるための手段は、支持体に対する捕捉プローブの直接的付着である。別の実施態様では、支持体に標的核酸を連結させるための手段は、捕捉プローブに付着する第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）、および、捕捉プローブが特異的に結合する、支持体に連結される第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）から構成される特異的結合対である。一実施態様では、ＳＢＰ’は、支持体に連結される固定プローブの一部である。この方法では、混合工程は、捕捉プローブに付着するＳＢＰを有するサンプルと、支持体に連結するＳＢＰ’とを混合することを含み、インキュベーション工程は、ＳＢＰおよびＳＢＰ’を結合して、支持体にハイブリダイゼーション複合体を連結することを含む。ある実施態様では、ＳＢＰおよびＳＢＰ’は、実質的に相補的な核酸配列であるが、一方、別のある実施態様では、ＳＢＰおよびＳＢＰ’は、非核酸成分である。この非核酸成分は、（ａ）受容体およびリガンドの対、（ｂ）酵素および基質の対、（ｃ）酵素および補因子の対、（ｄ）酵素および補酵素の対、（ｅ）抗体および抗原の対、（ｆ）抗体断片および抗原の対、（ｇ）糖およびレクチンの対、（ｈ）リガンドおよびキレート剤の対、（ｉ）ビオチンおよびアビジン、（ｊ）ビオチンおよびストレプトアビジン、および（ｋ）ニッケルおよびヒスチジンから成る群から選んでもよい。本法はさらに、分離工程の後に、支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体から、他のサンプル成分を除去するための洗浄工程を含んでもよい。その場合、洗浄工程は、支持体に連結するハイブリダイゼーション複合体を洗浄液と混合し、次いで、支持体に連結するハイブリダイゼーション複合体を洗浄液から分離する。インキュベーション工程は、約２５℃において約５分から約９０分行ってもよい。方法はさらに、分離工程の後で、他のサンプル成分から単離された標的核酸の存在を検出する工程、他のサンプル成分から単離された標的核酸に含まれる配列をインビトロで増幅する工程、または、他のサンプル成分から単離された標的核酸に含まれる配列を決定する工程を含んでもよい。
第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）であって、支持体に連結する第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合するパートナー、および、標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から構成される、非特異的捕捉プローブが開示される。その場合、オリゴヌクレオチド配列は、ポリＵ配列、ＧおよびＴヌクレオチド、またはＧおよびＵヌクレオチドを含むランダムポリ（ｋ）配列、１０個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、１０個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、１０個以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、または、少なくとも二つのＧＵ単位から構成される、非ランダムポリＧＵ配列である。この捕捉プローブオリゴヌクレオチド配列は、約５から１００ヌクレオチド長であってもよいし、ある実施態様では、約１２から約２５ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチド配列は：（ａ）標準的ＲＮＡ塩基および結合部、（ｂ）標準的ＤＮＡ塩基および結合部、（ｃ）２’修飾結合部を有するＲＮＡ塩基、（ｄ）配列の少なくとも一部は、ロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座であるＤＮＡ塩基、（ｅ）一つ以上のヌクレオチド塩基類縁体、（ｆ）一つ以上の脱塩基残基、（ｇ）一つ以上の、非核酸スペーサー化合物、または（ｈ）上記群（ａ）から（ｇ）から選ばれる要素の組み合わせ、を含んでもよい。ある実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対形成と比べた場合、別様の塩基対形成特性を示す塩基類縁体を含む。ある実施態様では、これらの塩基類縁体は、イノシンまたは５−ニトロインドールである。オリゴヌクレオチド配列は、ＬＮＡ立体配座形状、および標準的ＤＮＡ立体配座であるヌクレオチドの混合物を含んでもよい。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、２’修飾結合部を有するポリ（ｋ）ＲＮＡ塩基から構成される。ＳＢＰ’に特異的に結合する、捕捉プローブのＳＢＰは：（ａ）相補的核酸配列の対、（ｂ）受容体およびリガンドの対、（ｃ）酵素および基質の対、（ｄ）酵素および補因子の対、（ｅ）酵素および補酵素の対、（ｆ）抗体および抗原の対、（ｇ）抗体断片および抗原の対、（ｈ）糖およびレクチンの対、（ｉ）リガンドおよびキレート剤の対、（ｊ）ビオチンおよびアビジン、（ｋ）ビオチンおよびストレプトアビジン、および（ｌ）ニッケルおよびヒスチジン、であってもよい特異的結合対のメンバーである。オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチドの５’末端位置において、該オリゴヌクレオチドの３’末端において、または、リンカー化合物を介して、該オリゴヌクレオチドの内部位置において、ＳＢＰに連結されてもよい。ある実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、少なくとも一つのランダムポリ（ｋ）６配列を含むが、別のある実施態様は、ランダムポリ（ｋ）１２、ポリ（ｋ）１８、またはポリ（ｋ）２５配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。好ましい捕捉プローブ実施態様は、オリゴヌクレオチド配列が、（ｎ）６−Ｕ３−（ｎ）６配列、（ｎ）６−Ｎｉ５−（ｎ）６配列、ただし“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表す、（ｋ）６−Ｎｉ５−（ｋ）６配列、ただし“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表す、（ｋ）６−Ｃ９−Ｃ９−（ｋ）６配列、ただし“Ｃ９”は９炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６配列、ただし“Ｃ９”は９炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、（ｋ）１２配列、（ｋ）６−Ｕ３−（ｋ）６配列、（ｋ）６−Ｕ６−（ｋ）６配列、（ｋ）６−Ｔ３−（ｋ）６配列、（ｋ）１８配列、（ｋ）２４配列、ｄ（ＧまたはＴ）１８配列、Ｕ１８配列、（ＧＵ）９配列、または、“Ｌ”がロックド核酸立体配座を表す配列であって、Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６配列、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２配列、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４配列、Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３配列、Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６配列、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２配列、Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４配列、ｄ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６配列、および、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４配列を含む配列、である実施態様を含む。別の好ましい実施態様では、上に特定したオリゴヌクレオチド配列の内のいずれかが、捕捉プローブのＳＢＰである、ホモポリマー核酸配列に対して連結されてもよい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
サンプルから標的核酸を単離するための方法であって：
標的核酸を含むサンプルを、該標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から構成される非特異的捕捉プローブ、および、該標的核酸を支持体に連結するための手段と混合する工程であって、該オリゴヌクレオチド配列が：
ポリＵ配列、
ＧおよびＴヌクレオチド、またはＧおよびＵヌクレオチドを含むランダムポリ（ｋ）配列、
１０個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
１０個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
１０個以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、および、
少なくとも二つのＧＵ単位から構成される、非ランダムポリＧＵ配列、からなる群より選択される、工程、
該支持体、該標的核酸、および該非特異的捕捉プローブを含む反応混合物を、該捕捉プローブと該標的核酸とが非特異的にハイブリダイズして、該支持体に連結されるハイブリダイゼーション複合体を形成することを可能とするハイブリダイゼーション条件下で、インキュベートする工程、ならびに、
該反応混合物の溶液相から該支持体を分離し、該支持体に連結する該ハイブリダイゼーション複合体を、他のサンプル成分から分離し、それによって該標的核酸を、他のサンプル成分から単離する工程、
を含む、方法。
（項目２）
上記支持体に上記標的核酸を連結するための上記手段が、該支持体に対する上記捕捉プローブの直接的付着である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記支持体に上記標的核酸を連結するための上記手段が、該支持体に連結される第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する、上記捕捉プローブに付着する第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）から構成される特異的結合対である、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ＳＢＰ’が、上記支持体に連結される固定プローブの一部である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記混合工程が、上記サンプルを、上記捕捉プローブに付着する上記ＳＢＰ、および上記支持体に連結する上記ＳＢＰ’と混合することを含み、上記インキュベーション工程が、該ＳＢＰおよび該ＳＢＰ’を結合して、該支持体に上記ハイブリダイゼーション複合体を連結することを含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記ＳＢＰおよび上記ＳＢＰ’が、実質的に相補的な核酸配列である、項目３に記載の方法。
（項目７）
上記ＳＢＰおよび上記ＳＢＰ’が、非核酸成分である、項目３に記載の方法。
（項目８）
上記非核酸成分が：
（ａ）受容体およびリガンドの対、（ｂ）酵素および基質の対、（ｃ）酵素および補因子の対、（ｄ）酵素および補酵素の対、（ｅ）抗体および抗原の対、（ｆ）抗体断片および抗原の対、（ｇ）糖およびレクチンの対、（ｈ）リガンドおよびキレート剤の対、（ｉ）ビオチンおよびアビジン、（ｊ）ビオチンおよびストレプトアビジン、および（ｋ）ニッケルおよびヒスチジンからなる群より選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記分離工程の後に、上記支持体に連結した上記ハイブリダイゼーション複合体から、他のサンプル成分を除去するための洗浄工程をさらに含み、該洗浄工程は、該支持体に連結する該ハイブリダイゼーション複合体を洗浄液と混合し、次いで、該支持体に連結する該ハイブリダイゼーション複合体を該洗浄液から分離する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記インキュベーション工程が、約２５℃において約５分から約９０分行われる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記分離工程の後に、他のサンプル成分から単離された上記標的核酸の存在を検出する工程、他のサンプル成分から単離された上記標的核酸に含まれる配列をインビトロで増幅する工程、または、他のサンプル成分から単離された上記標的核酸に含まれる配列を決定する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
支持体に連結する第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）、および、標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む、非特異的捕捉プローブであって、該オリゴヌクレオチド配列が：
ポリＵ配列、
ＧおよびＴヌクレオチド、またはＧおよびＵヌクレオチドを含むランダムポリ（ｋ）配列、
１０個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
１０個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
１０個以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、および、
少なくとも二つのＧＵ単位から構成される、非ランダムポリＧＵ配列、
からなる群より選択される、非特異的捕捉プローブ。
（項目１３）
上記オリゴヌクレオチド配列が、約５から１００ヌクレオチド長である、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目１４）
上記オリゴヌクレオチド配列が、約１２から約２５ヌクレオチド長である、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目１５）
上記オリゴヌクレオチド配列が：（ａ）標準的ＲＮＡ塩基および結合部、（ｂ）標準的ＤＮＡ塩基および結合部、（ｃ）２’修飾結合部を有するＲＮＡ塩基、（ｄ）配列の少なくとも一部が、ロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座であるＤＮＡ塩基、（ｅ）一つ以上のヌクレオチド塩基類縁体、（ｆ）一つ以上の脱塩基残基、（ｇ）一つ以上の、非核酸スペーサー化合物、または（ｈ）上記群（ａ）から（ｇ）から選ばれる要素の組み合わせ、を含む、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目１６）
上記塩基類縁体が、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対形成と比べた場合、別様の塩基対形成特性を示す、項目１５に記載の捕捉プローブ。
（項目１７）
上記塩基類縁体が、イノシンまたは５−ニトロインドールである、項目１６に記載の捕捉プローブ。
（項目１８）
上記オリゴヌクレオチド配列が、ＬＮＡ立体配座であるヌクレオチド、および標準的ＤＮＡ立体配座であるヌクレオチドの混合物を含む、項目１５に記載の捕捉プローブ。
（項目１９）
ポリ（ｋ）塩基が、２’修飾結合部を有するＲＮＡ塩基である、項目１５に記載の捕捉プローブ。
（項目２０）
上記ＳＢＰ’に特異的に結合する上記ＳＢＰが：（ａ）相補的核酸配列の対、（ｂ）受容体およびリガンドの対、（ｃ）酵素および基質の対、（ｄ）酵素および補因子の対、（ｅ）酵素および補酵素の対、（ｆ）抗体および抗原の対、（ｇ）抗体断片および抗原の対、（ｈ）糖およびレクチンの対、（ｉ）リガンドおよびキレート剤の対、（ｊ）ビオチンおよびアビジン、（ｋ）ビオチンおよびストレプトアビジン、および（ｌ）ニッケルおよびヒスチジン、からなる群より選択される特異的結合対のメンバーである、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目２１）
上記オリゴヌクレオチド配列が、該オリゴヌクレオチドの５’末端位置、該オリゴヌクレオチドの３’末端位置、または、リンカー化合物を介して該オリゴヌクレオチドの内部位置において、上記ＳＢＰに連結される、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目２２）
上記オリゴヌクレオチド配列が、少なくとも一つのランダムポリ（ｋ）６配列を含む、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目２３）
上記オリゴヌクレオチド配列が、ランダムポリ（ｋ）１２、ポリ（ｋ）１８、またはポリ（ｋ）２５配列を含む、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目２４）
上記オリゴヌクレオチド配列が：
（ｎ）６−Ｕ３−（ｎ）６、
（ｎ）６−Ｎｉ５−（ｎ）６、ただし“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表す、
（ｋ）６−Ｎｉ５−（ｋ）６、ただし“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表す、
（ｋ）６−Ｃ９−Ｃ９−（ｋ）６、ただし“Ｃ９”は９炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、
（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６、ただし“Ｃ９”は９炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、
（ｋ）１２、
（ｋ）６−Ｕ３−（ｋ）６、
（ｋ）６−Ｕ６−（ｋ）６、
（ｋ）６−Ｔ３−（ｋ）６、
（ｋ）１８、
（ｋ）２４、
ｄ（ＧまたはＴ）１８、
Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２、
Ｕ１８、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４、
Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３、
（ＧＵ）９、
Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２、
Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４、
ｄ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６、および、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４、
からなる群より選択される、項目１２に記載の捕捉プローブ。
（項目２５）
上記オリゴヌクレオチド配列が、上記ＳＢＰである、ホモポリマー核酸配列に対して接合される、項目２４に記載の捕捉プローブ。
発明の詳細な説明
サンプルから、対象とする標的核酸を単離するための方法であって、標的核酸を含むサンプルを、溶液相においてサンプル中の標的核酸に非特異的にハイブリダイズする捕捉プローブと混合する工程を含む方法が開示される。その場合、捕捉プローブは、好ましくは、ポリＧ／Ｕ配列、またはポリ（ｋ）配列を含むポリマー配列を用いることによって、標的核酸に非特異的にハイブリダイズするポリマーオリゴヌクレオチド配列を含む。捕捉プローブはさらに、好ましくは、支持体に付着される固定プローブに特異的に結合する特異的結合パートナーを介して、それを支持体に付着させるための手段を含む。溶液相において標的核酸および捕捉プローブと、任意に固定プローブ含んでもよい支持体とを含む反応混合物が作製される。この反応混合物は、捕捉プローブが標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、固定プローブが存在する場合は、捕捉プローブと固定プローブの特異的結合パートナー同士の結合を介して固定プローブに特異的に結合する条件下で、インキュベートされる。標的核酸と、支持体に付着する捕捉プローブとを含むハイブリダイゼーション複合体は、反応混合物から分離され、標的核酸を、他のサンプル成分から単離する。
標的核酸の非特異的捕捉のためのプローブであって、該標的核酸に非特異的にハイブリダイズする、少なくとも一つの核酸配列、および、好ましくは、支持体に付着する固定プローブ上の、別の特異的結合パートナーに特異的に結合する、少なくとも一つの特異的結合パートナーを含むことによって、捕捉プローブを支持体に付着するための手段を含むプローブが開示される。すなわち、捕捉プローブの特異的結合パートナーと、固定プローブの特異的結合パートナーとは、特異的結合対のメンバーである。捕捉プローブの好ましい実施態様は、標的核酸に非特異的にハイブリダイズする核酸配列が、少なくとも一つのポリＧＵ配列、またはランダムポリ（ｋ）配列、または、標的核酸に対し、核酸の標準的塩基対形成と比べ、別様の塩基対形成特性を示す、少なくとも一つの核酸類縁体を含む配列を含む実施態様を含む。
開示の標的捕捉法は、標的核酸に対する、捕捉プローブの配列の、非特異的ハイブリダイゼーションによって、サンプルから標的核酸を単離する。その際、捕捉プローブは、標的核酸に対し、標準的塩基対形成（すなわち、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｔ／Ｕ結合）と比べ、別様の塩基対形成特性を示す、少なくとも一つの配列を含む。標的核酸は、ＲＮＡであっても、ＤＮＡであってもよく、これらは、単一鎖形状であっても、完全にまたは部分的に２本鎖形状であってもよい。別様塩基対形成特性を有する、好ましい捕捉プローブポリマー配列は、一つ以上の、非ランダムであるか、またはランダムなポリ（ｋ）セグメントまたは部分を含む配列で、“ｋ”は、オリゴヌクレオチド中のグアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）塩基である配列、一つ以上の塩基類縁体または誘導体を含む配列、および、標準的ＲＮＡまたはＤＮＡと比べ、別様立体配座を含む配列を含む。別様塩基対形成特性を示すプローブの配列は、本明細書に記載される好ましい実施態様のいくつかによって示されるように、単一オリゴマーの中に、上記の特徴の一つ以上、例えば、別様立体配座を持つ一つ以上の残基を有するポリ（ｋ）セグメントを含んでもよい。別様塩基対形成特性を示す捕捉プローブは、支持体に対し、直接または間接に接合されてもよい。好ましい捕捉プローブ実施態様は、該捕捉プローブを支持体に連結させるために、固定プローブ中の別の特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する特異的結合パートナー（ＳＢＰ）を含む。ＳＢＰおよびＳＢＰ’は、特異的結合対のメンバーであり、これらは、特異的に結合する種々の成分のいずれであってもよい。特異的結合パートナー（ＳＢＰ）に連結される、別様塩基対形成特性を持つ少なくとも一つの配列を含む捕捉プローブは、例えば、構造体、「非特異的ポリマー−ＳＢＰ」、または「ＳＢＰ−非特異的ポリマー」、または「ＳＢＰ−ポリ（ｋ）」、または「ポリ（ｋ）−ＳＢＰ」によって表されるように、捕捉プローブ化合物の任意の位置においてこの二つの成分を連結してもよい。捕捉プローブのＳＢＰは、ポリマー配列のいずれの末端位置に連結されてもよいし、または、捕捉プローブポリマーの内部位置に連結されてもよい。捕捉プローブのある実施態様は、短いヌクレオチド配列、例えば、ホモポリマー配列によって連結されるか、または、非ヌクレオチドスペーサー化合物、例えば、９炭素スペーサー化合物（Ｃ−９）によって連結される、複数のランダムポリマー配列を含む。捕捉プローブのある実施態様は、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部を含む。ただし、捕捉プローブには、種々の、非標準的結合部を含めることが可能である。ある好ましい実施態様は、捕捉プローブの中に、ロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座形状を持つ、一つ以上の塩基を含む。これは、この捕捉プローブに機能的偏倚を与え、好ましい標的核酸形、例えば、好んでＤＮＡに結合する傾向を与える可能性がある。ある実施態様では、捕捉プローブのＳＢＰは、固定プローブの相補配列（ＳＢＰ’）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列である、すなわち、特異的結合対は、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列同士から構成される。別の実施態様では、捕捉プローブのＳＢＰは、リガンド成分に特異的に結合する成分である、すなわち、二つの成分は、特異的結合対を構成する。特異的結合対の例はよく知られており、例えば、抗体または抗体断片、およびその抗原またはリガンドから構成される結合対、または、酵素およびその基質または補因子から構成される結合対、または、受容体、およびその結合パートナーまたはその類縁体から構成される結合対で、一般に、鍵と鍵穴式に機能する、任意の化合物対と称されるものであってもよい。
開示の方法では、捕捉プローブは、試験されるサンプルなどの混合物中に存在する、一つ以上の標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、次いで、標的核酸、および、支持体に直接または間接に付着する捕捉プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は、混合物中の他の成分から分離される。好ましい実施態様では、捕捉プローブのランダムポリマー配列は、標的核酸（単数または複数）中に存在する一つ以上の配列に非特異的にハイブリダイズし、捕捉プローブのＳＢＰは、支持体に付着する固定プローブのＳＢＰ’に特異的に結合する。これによって、捕捉プローブと標的核酸を含む複合体を付着させた支持体は、混合物中の他の成分から分離される。ある好ましい実施態様では、捕捉された標的核酸から他のサンプル成分をさらに除去するために、支持体に付着する複合体は洗浄される。さらに、標的核酸に対し、単離標的核酸を特定、定量、またはその他のやり方で使用するために、追加工程を実施してもよい。この追加工程は、検出工程、ハイブリダイゼーション工程、核酸増幅工程、配列決定工程などを含んでもよい。好ましい実施態様は、標的核酸、捕捉プローブ、および支持体を、任意に固定プローブと共に含む標的捕捉反応混合物を作製するために最小限の工程を使用する。反応混合物は、捕捉プローブの、標的核酸に対する非特異的ハイブリダイゼーションを可能とするよう、比較的穏やかな条件、例えば、室温で６０℃まで、という条件で２時間未満インキュベートされる。
本明細書に記載される方法は、一つ以上のサンプルから異なる標的核酸を選択的に捕捉するために、平行的に、または継時的に使用してよいことが理解されよう。例えば、一つのサンプルを、異なるいくつかの部分に分割し、各部分に、異なるタイプの標的核酸を優先的に捕捉する、異なる捕捉プローブ実施態様を使用することによって、標的捕捉工程を実行してもよい。例えば、一部分については、サンプルの他の成分からＤＮＡを優先的に分離する捕捉プローブを用いて標的捕捉を実行し、一方、別の部分については、サンプルの他の成分からＲＮＡを優先的に分離する捕捉プローブを用いて標的捕捉を実行し、それによって、同じサンプルのＲＮＡ成分からＤＮＡを優先的に分離するようにしてもよい。それとは別に、異なる標的核酸を優先的に分離する異なる捕捉プローブを用いることによって、サンプルを継時的に処理してもよい。例えば、サンプルの他の成分からＤＮＡを優先的に分離する捕捉プローブを用いることによって、サンプルに対し第１標的捕捉を実行し、そのため、ＤＮＡ標的が、先ず、溶液相から分離され（ペレット部分）、次いで、溶液相（上清部分）に対し、サンプルの他の成分からＲＮＡを優先的に分離する捕捉プローブを用いることによって、第２標的捕捉を実行し、これによって、同じサンプル中に含まれるＤＮＡおよびＲＮＡ標的が、一連の標的捕捉反応において分離される。
捕捉プローブの好ましい実施態様は、標的核酸に非特異的にハイブリダイズする、少なくとも一つのランダムポリマー配列、および特異的結合パートナー（ＳＢＰ）を含む。ある実施態様では、ランダムポリマー配列は、ポリ（ｋ）配列であり、“ｋ”は、オリゴヌクレオチドにおけるグアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）塩基のランダムな組み合わせである。このランダムポリマー配列は、通常、約５から１００ヌクレオチド長の範囲にあるが、好ましくは約６から約２５ヌクレオチドの範囲にある。ＳＢＰは、好ましくは、固定プローブにおいて、支持体に接合される別の特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する。特異的結合対のＳＢＰおよびＳＢＰ’は、特異的に結合する成分同士であればどのような成分であってもよく、例えば、相補的核酸配列同士、抗体−抗原対、受容体−リガンド対、酵素−基質または酵素−補酵素対、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンなどであってもよい。捕捉プローブのランダム配列は、ＳＢＰに対し、該化合物の任意の位置において、例えば、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端位置に、または、リンカー化合物を介して内部位置に連結されてもよい。このような成分を含む捕捉プローブは、ＳＢＰ−ランダムポリマー、またはランダムポリマー−ＳＢＰ、または、好ましい実施態様では、ＳＢＰ−ポリ（ｋ）またはポリ（ｋ）−ＳＢＰ構造と表されてもよい。捕捉プローブのある実施態様は、連鎖化合物において連結される複数のランダム配列、例えば、非ランダム配列または非ヌクレオチドスペーサー化合物によって連結されるランダム配列を含む。例えば、好ましい実施態様は、ランダム配列の複数のセグメントを分け隔てる、一つ以上のホモポリマー配列（例えば、ｄＴ３）、または非ヌクレオチドスペーサー（例えば、Ｃ−９化合物）を含んでもよい。ある捕捉プローブは、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部を含むが、一方、別のあるものは、捕捉ポリマーに機能的特性、例えば、特定タイプの標的核酸に対し優先的結合を実現する合成結合部を含んでもよい。例えば、捕捉プローブオリゴヌクレオチドのある実施態様は、ロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座形状、またはタンパク／ペプチド核酸（ＰＮＡ）立体配座形状を持つ、一つ以上の残基、または、一つ以上の２’−メトキシまたは２’−フルオロ置換ＲＮＡ残基、または、他の核酸類縁体立体配座形状を含む。好ましい実施態様は、ＤＮＡ標的に対し優先的に結合する捕捉プローブのために、ＬＮＡ立体配座形状を持つ一つ以上の残基を含むか、または、ＲＮＡ標的に対し優先的に結合する捕捉プローブのために、一つ以上の２’−メトキシ置換ＲＮＡ残基を含む。好ましい実施態様では、ＳＢＰおよびＳＢＰ’は、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列同士である、すなわち、捕捉プローブは、固定プローブのＳＢＰ’配列に対し特異的にハイブリダイズするＳＢＰ配列を含む。別の好ましい実施態様では、ＳＢＰは、固定プローブのＳＢＰ’リガンド成分に特異的に結合する、非核酸成分である。
ある実施態様では、捕捉プローブは、標的捕捉において、好ましくは、標的捕捉反応に使用される試薬混合物の一部として使用される組成物である。そのような試薬は、他の成分、例えば、固定プローブ、支持体に接合されるＳＢＰ’成分、および／または、溶液相において核酸ハイブリダイゼーションの条件を与える化学的化合物（例えば、塩、バッファー剤）を含んでもよい。捕捉プローブ試薬は、標的捕捉工程において使用される他の成分を含む、キットなどの組成物に、例えば、捕捉された標的核酸からサンプル成分を除去するための洗浄液の中に含まれてもよい。捕捉プローブ試薬は、捕捉された核酸を処理するための後続工程において使用される他の成分を含む、キットなどの組成物に、例えば、捕捉核酸に結合し、検出するための染料、捕捉核酸にハイブリダイズし、検出するための検出プローブ、または、標的核酸に結合し、標的配列のインビトロ増幅にプライマーとして作動する増幅オリゴヌクレオチドの中に含まれてもよい。好ましいキット実施態様は、捕捉プローブのＳＢＰに対してＳＢＰ’を提供する固定プローブと共に、本明細書に記載の捕捉プローブオリゴマーを含む溶液を含む。キットは、一つを超える捕捉プローブ実施態様を含んでもよいこと、例えば、第１ＳＢＰを含む第１捕捉プローブ、および第２ＳＢＰを含む第２捕捉プローブを含んでもよいことが理解されよう。このような組成物は、種々の固定プローブを用いることによって、例えば、第１ＳＢＰに対して特異的な第１ＳＢＰ’を持つ第１固定プローブ、および第２ＳＢＰに対して特異的な第２ＳＢＰ’を持つ第２固定プローブを用いることによって、一つ以上のサンプルから、異なる複数の標的核酸を優先的に捕捉するのに有用である可能性がある。
本明細書に記載の方法および組成物は、複雑な混合物、例えば、通例法によって処理されて細胞内核酸を溶液中に放出させた可能性のある、核酸または細胞から、核酸配列を精製するのに有用である。これらの組成物および方法は、多くの分子生物学過程、例えば、診断アッセイに使用されるインビトロ増幅および／または検出工程、生物学的試料の存在を検出するための法医学試験、または、環境、産業、または食品サンプルにおいて生物学的汚染を検出するためのアッセイにおいて使用するための核酸の調製に有用である。この標的捕捉法および組成物は、その中では微小成分にすぎないサンプルから標的核酸を濃縮し、検出感度を向上させる。この標的捕捉組成物および方法は、比較的穏やかな条件下で、比較的短時間で混合物から標的核酸を単離するので、種々の実験および野外条件における使用、または、手動または自動化システムによる多数サンプルのスクリーニングに好適であるという点で、特に有用である。さらに、この標的捕捉組成物および方法は、一つ以上の異なる標的核酸、例えば、様々の未知の核酸配列（例えば、様々のウィルスタイプまたはサブタイプ、様々のやり方でスプライスされた遺伝子のＲＮＡ転写物、または未知の遺伝子突然変異体）を含む可能性のあるサンプルから標的核酸を分離するのに有用である。本明細書に記載の非特異的捕捉プローブは、他のサンプル成分から、多くの異なる遺伝子サブタイプ、タイプ、突然変異体、または転写物を、各所望の標的核酸用の特異的捕捉プローブを設計、合成、または試験すること無しに、分離するのに使用し、その捕捉核酸に対し、後続工程において個別に検出、定量、またはその他のやり方で処理することが可能である。
「サンプル」または「標本」とは、標的核酸が、成分の混合物の一部として、例えば、水中または環境サンプル、食品、法医学分析のために収集された試料、または診断試験のためのバイオプシーサンプルの一部として存在してもよい。「生物学的サンプル」とは、標的核酸を含む可能性のある生存または死亡生物から得られる任意の組織または材料、例えば、細胞、組織、細胞または組織から作製される分解物、痰、末梢血、血漿、血清、子宮頸部スワブサンプル、バイオプシー組織（例えば、リンパ節）、呼吸組織または滲出物、消化組織、尿、大便、精液、またはその他の液状体または材料を含むものを指す。サンプルは、標準法による分析用サンプルの調製に使用される場合のように、組織および／または細胞構造を物理的に破壊するように処理して、細胞内成分を、酵素、バッファー、塩、界面活性剤、およびその他の化合物を含んでもよい溶液の中に放出させてもよい。
「核酸」とは、窒素性ヘテロ環塩基または塩基類縁体を有するヌクレオチドまたは類縁体を連結させてポリマーを形成する、マルチマー化合物、例えば、通例のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびその類縁体などを指す。核酸は、ヌクレオチドモノマーを連結する「バックボーン」を含むが、このバックボーンは、核酸鎖の中に、種々の結合部または立体配座、例えば、糖−ホスホジエステル結合、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート結合、ペプチド−核酸結合（ＰＮＡ；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９４，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５（１）：３−７；国際公開第９５／３２３０５号）、２環フラノース単位を有するヌクレオチドモノマーが、ＲＮＡ様糖立体配座の中に封じ込まれる、ロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座（Ｖｅｓｔｅｒら、２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（４２）：１３２３３−４１；Ｈａｋａｎｓｓｏｎ ＆ Ｗｅｎｇｅｌ，２００１，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１（７）：９３５−８）、または、そのような結合部の組み合わせを含む。核酸の糖成分は、リボース、デオキシリボース、または、類似化合物、例えば、２’メトキシ、または２’ハロゲン置換体を有する化合物であってもよい。窒素性塩基は、通例のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、塩基類縁体、例えば、イノシン、５−ニトロインダゾール、その他（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６，Ａｄａｍｓら、ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２；ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔｔら、１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３（２１）：４３６３−７０）、イミダゾール−４−カルボキサミド（Ｎａｉｒら、２００１，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，２０（４−７）：７３５−８）、ピリミジンまたはプリン誘導体、例えば、ピリミジン塩基修飾体６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（ＡまたはＧに結合する“Ｐ”塩基と表示されることがある）、およびプリン塩基修飾体Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミンプリン（ＣまたはＴに結合する“Ｋ”塩基と表示されることがある）、ヒポキサンチン（Ｈｉｌｌら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（８）：４２５８−６３，Ｌｉｎ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（１９）：５１４９−５２）、２−アミノ−７−デアザ−アデニン（ＣおよびＴと対形成する；Ｏｋａｍｏｔｏら、２００２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２（１）：９７−９）、Ｎ−４−メチルデオキシグアノシン、−４−エチル−２’−デオキシシチジン（Ｎｇｕｙｅｎら、１９９８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（１８）：４２４９−５８），４，６−ジフルオロベンジミダゾール、および２，４−ジフルオロベンゼンヌクレオシド類縁体（Ｋｌｏｐｆｆｅｒ ＆ Ｅｎｇｅｌｓ，２００５，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，２４（５−７）６５１−４）、ピレン官能基ＬＮＡヌクレオシド類縁体（Ｂａｂｕ ＆ Ｗｅｎｇｅｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）２０：２１１４−５；Ｈｒｄｌｉｃｋａら、２００５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（３８）；１３２９３−９）、デアザまたはアザ修飾プリンおよびピリミジン、５または６位置に置換基を有するピリミジン、および、２、６、または８位置に置換基を有するプリン、２−アミノアデニン（ｎＡ）、２−チオウラシル（ｓＵ）、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ−６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ−４−アルキル−ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２５号；国際公開第９３／１３１２１号；Ｇａｍｐｅｒら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３（３１）：１０２２４−３６）、および、水素結合無しに２本鎖ＤＮＡを形成する、疎水性核酸塩基（Ｂｅｒｇｅｒら、２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１５）：２９１１−４）であってもよい。多くの、誘導体および修飾体核酸塩基または類縁体が市販されている（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）。核酸は、一つ以上の「脱塩基」残基を含んでもよい、すなわち、バックボーンは、１箇所以上の位置において非窒素性塩基を含んでもよい（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、通例のＲＮＡまたはＤＮＡ糖、塩基、および結合部のみを含んでもよいし、または、通例の成分と、置換体（例えば、２’−Ｏ−メチル結合を有する、通例のＲＮＡ塩基、または、通例の塩基および類縁体の混合物）の両方を含んでもよい。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼす可能性のある実施態様としては、ＰＮＡ、２’−メトキシ、または２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、または、ハイブリダイゼーション複合体の全体電荷、電荷密度、または立体的会合に影響を及ぼす構造、例えば、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）、または中性基（例えば、メチルホスホネート）を含むオリゴマーが挙げられる。
「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」は、一般に、１０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満であって、約２から５ｎｔの下限、および、約５００から９００ｎｔの上限を持つサイズ範囲の核酸を指す。ある好ましいオリゴマー実施態様は、約５から１５ｎｔの下限、約５０から６００ｎｔの上限を持つサイズ範囲の中にあるが、一方、別の好ましい実施態様は、約１０から１５ｎｔの下限、約１８から１００ｎｔの上限を持つサイズ範囲の中にある。オリゴマーは、天然供給源から精製してもよいが、任意の、公知の、酵素法または化学法によって合成することが好ましい。オリゴマーは、「ランダムポリマー」配列を含んでもよい。このランダムポリマーとは、全体長および他の特徴は実質的に同じであるが、ある指定の長さにおいて異なる塩基をランダムに組み込むことによって、例えば、ＤＮＡオリゴマーの中に四つ全ての標準的塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）のランダムな組み合わせを、または、より大きなオリゴマーの、指定の一部に数塩基（ＵおよびＧ）のランダムな組み合わせを組み込むことによって合成される、オリゴマー集団を指す。得られるオリゴマーは、実際には、そのメンバーの有限数が、ランダム部分を構成する塩基の長さおよび数によって決定される、オリゴマーの集団（例えば、二つの異なる塩基を用いて合成される、６−ｎｔランダム配列を含むオリゴマー集団における２６個のオリゴマー）である。
「捕捉プローブ」、「捕捉オリゴヌクレオチド」、または「捕捉オリゴマー」とは、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡに対し、別様の塩基対形成特性を示す配列を用いることによって、標的核酸に非特異的に結合し、かつ、その捕捉された標的核酸を溶液相から分離するために、該捕捉標的核酸を支持体に接合する核酸オリゴマーを指す。捕捉プローブは、捕捉標的核酸を支持体に接合するために、支持体に直接的、または間接的に接合されてもよい。好ましい捕捉プローブ実施態様は、標的核酸、および、支持体に付着する固定プローブに該捕捉プローブを接合するための特異的結合パートナー（ＳＢＰ）に対し、一つ以上の、非ランダムまたはランダムポリマー部分の塩基対形成を使用する。ＳＢＰは、捕捉プローブのポリマー部分に直接的、連鎖的に接合されてもよく、あるいは、非ヌクレオチドリンカーを介して捕捉プローブ配列に接合されてもよい。「固定プローブ」は、支持体に付着されるが、捕捉プローブのＳＢＰに特異的に結合する、特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）を含む、すなわち、ＳＢＰおよびＳＢＰ’は、特異的結合パートナーのメンバーである。好ましい捕捉プローブ実施態様は、ｋが、ランダム配列のＧまたはＴ／Ｕである、一つ以上のポリ（ｋ）セグメントから構成されるランダムポリマー部分を含む。好ましい捕捉プローブ実施態様は、ＳＢＰとして作動し、固定プローブのオリゴヌクレオチドに対して部分的に、または完全に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい、すなわち、ＳＢＰおよびＳＢＰ’は、完全に、または部分的に相補的な配列同士である。
特異的結合パートナーは、相互に認識し、特異的に結合することが可能な、「特異的結合対」または「特異的結合パートナー組」のメンバーである。特異的結合対としては、例えば、受容体とリガンド、酵素と基質、酵素と補因子、酵素と補酵素、抗体と抗原、糖とレクチン、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、リガンドとキレート剤、ニッケルとヒスチジン、完全にか、または実質的に相補的な核酸配列同士、例えば、相補的ホモポリマー核酸配列同士などのメンバーが挙げられる。結合パートナー組の成分は、メンバーの、結合に参加する領域である。特異的結合対のメンバーは、短縮形ＳＢＰおよびＳＢＰ’によって表される場合がある。
「固定プローブ」、「固定オリゴマー」、または「固定核酸」とは、捕捉プローブのＳＢＰに特異的に結合し、支持体に付着する、特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）を指す。すなわち、ＳＢＰ’およびＳＢＰは、特異的に結合し、捕捉プローブと、支持体に連結する固定プローブとを接合する。固定プローブの、ある実施態様は、捕捉プローブ配列に対し完全にか、または部分的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。固定プローブおよび捕捉プローブを含む複合体は、捕捉プローブ、固定プローブ、および支持体に結合しない他のサンプル成分から、捕捉プローブに結合する標的核酸の分離をやり易くする。いずれの支持体を用いてもよく（例えば、溶液相における基質または粒子）、かつ、支持体は、種々の既知の材料（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および金属）のいずれから構成されてもよい。好ましい支持体は、それに対し固定プローブが安定に、かつ直接的に（共有結合、キレート配位、またはイオン相互作用を介して）、または間接的に（リンカーを介して）接合される、磁気的に吸引可能な粒子、例えば、単分散性常磁性ビーズ（均一サイズ、５％）である。
「分離する」、「精製する」、または「単離する」とは、サンプルの一つ以上の成分を、サンプルの、一つ以上の他の成分から選択的に取り出すこと、例えば、核酸を、その上さらに、タンパク、炭水化物、脂質、細胞破片、小器官、または無機質を含む可能性のある、全体として水性の溶液から取り出すことを指す。好ましい実施態様では、精製は、標的核酸の少なくとも約３０％、より好ましくは標的核酸の少なくとも約５０％、さらに好ましくは標的核酸の少なくとも約７５％を取り出す。それとは別に、精製は、他のサンプル成分の少なくとも約７５％、より好ましくは他のサンプル成分の少なくとも約８５％、さらに好ましくは他のサンプル成分の少なくとも約９０％を、標的核酸から取り除くことと見なしてもよい。
「ハイブリダイゼーション条件」とは、完全にか、または部分的に相補的な核酸配列同士が、ハイブリダイゼーション２本鎖または複合体を形成する、累積的物理および化学条件を指す。このような条件は、当該技術分野の当業者には周知であり、ハイブリダイゼーションに関与する核酸の配列組成に基づいて予測することが可能であるか、または、通例試験を用いて経験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）ａｔ §§１．９０−１．９１，７．３７−７．５７，９．４７−９．５１，１１．１２−１１．１３，ａｎｄ１１．４５−１１．５７）。
「十分に相補的」とは、ある連結核酸配列は、別の配列に対し、相補的塩基間の水素結合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ対形成）によってハイブリダイズすることが可能であることを意味する。相補配列は、その標的配列に対し、オリゴマー配列の各位置において、標準的塩基対を形成することによって相補的であってもよいし、あるいは、配列は、脱塩基残基を含む、相補的でない、一つ以上の位置を含んでもよいが、そのような配列も、その全体配列が、適切なハイブリダイゼーション条件においてはその標的配列にハイブリダイズすることが可能であるという点で、十分に相補的である。
「核酸増幅」とは、標的核酸配列、またはその相補鎖、またはその断片（すなわち、増幅配列の長さが、完全標的核酸未満である）の複数コピーを生産する、任意の、周知のインビトロ過程を指す。このような過程の例としては、転写関連法、例えば、転写介在増幅（ＴＭＡ）、ＮＡＳＢＡ法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など（米国特許第５，３９９，４９１、５，５５４，５１６、５，４３７，９９０，５，１３０，２３８、４，８６８，１０５、および５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ介在増幅（米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、および４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（欧州特許出願第０３２０３０８号）、および、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，４２２，２５２号）が挙げられる。
「検出プローブ」とは、ハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、該標的核酸を、直接（すなわち、プローブは、標的核酸に直接ハイブリダイズする）、または間接（すなわち、プローブは、中間構造を介して標的にハイブリダイズする）に検出することを可能にする、核酸オリゴマーを指す。検出プローブは、標的結合配列、および、その構造に寄与する他の成分を含んでもよい（米国特許第５，１１８，８０１、５，３１２，７２８、６，８３５，５４２、および６，８４９，４１２号）。
「ラベル」とは、検出されるか、または、検出可能な信号を誘導する成分または化合物であって、検出プローブ、または検出される核酸に対し直接または間接に接合されても良い成分または化合物を指す。直接的に接合されるラベルは、共有相互作用、または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性またはイオン相互作用、キレートまたは配位複合体形成）を用いてもよいし、間接的に接合されるラベルは、架橋結合成分またはリンカー（例えば、抗体またはオリゴマー）を用いてもよい。ラベルは、検出可能であればいずれの成分であってもよく、例えば、放射性核種、リガンド、酵素、酵素基質、反応基、発色団（例えば、染料、または色調を与える粒子）、発光性（生物発光、燐光、または化学発光）化合物、および蛍光化合物であってもよい。好ましいラベルは、均質アッセイにおいてすなわち、信号検出のために、結合ラベルから未結合ラベルを分離することを要することなく、検出することが可能な信号を提供する（米国特許第５，２８３，１７４、５，６５６，２０７、および５，６５８，７３７号）。好ましい均質条件下検出可能ラベルは、化学発光化合物、より好ましくはアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である（米国特許第５，６５６，２０７、５，６５８，７３７、および５，６３９，６０４号）。ラベルを合成する方法、ラベルを核酸に付着させる方法、およびラベルからの信号を検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．第１０章、および米国特許第５，６５８，７３７、５，６５６，２０７、５，５４７，８４２、５，２８３，１７４、および４，５８１，３３３号）。
別様に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語は、当業者によって普通に理解されるもの、または、技術文献、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、および同様の刊行物の中に見出される定義のものと同じ意味を持つ。別様に記載されない限り、本発明に用いられるか、または考慮の対象とされる技術は、標準的な、周知の方法である。
本明細書に開示される、非特異的標的捕捉法と違って、特異的標的捕捉法は、標的核酸の中の標的配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む捕捉プローブを用いる（例えば、米国特許第６，１１０，６７８、６，２８０，９５２、および６，５３４，２７３号を参照されたい）。簡単に言うと、特異的標的捕捉法は、標的核酸の中の標的配列に特異的にハイブリダイズする、標的特異的配列、および、固定プローブにハイブリダイズする尾部領域から構成される捕捉プローブを用いる。この特異的標的捕捉法は、２工程ハイブリダイゼーション過程であって、第１ハイブリダイゼーション条件は、標的配列に対する、捕捉プローブの標的特異的配列の溶液相ハイブリダイゼーションを優先的に促進し、次いで、捕捉プローブ：標的核酸の複合体を維持する第２ハイブリダイゼーション条件は、支持体上の固定プローブに対する、捕捉プローブの尾部領域のハイブリダイゼーションを可能とし、そのため、支持体上に、固定プローブ、捕捉プローブ、および標的核酸から構成される複合体が形成される、過程を使用する。支持体および付着複合体は、溶液相に残留する他のサンプル成分から分離される。
本明細書に記載される非特異的標的捕捉法は、捕捉プローブの一部の、別様塩基対形成特性（標準的ＤＮＡまたはＲＮＡ水素結合と比べ）を用いることによって、サンプル中の標的核酸に対し非特異的にハイブリダイズする捕捉プローブを利用する。この捕捉プローブは、支持体に、好ましくは、支持体上の固定プローブに特異的に結合することによって付着する。これによって、非特異的捕捉プローブと標的核酸とを含む複合体の、他のサンプル成分からの分離が可能となる。本法において使用される、好ましい捕捉プローブ実施態様は、特異的結合パートナー（ＳＢＰ）に付着する、非ランダムまたはランダムポリマー配列を含む。このポリマー配列は、標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、ＳＢＰは、固定プローブか、または支持体に付着する場合のある、特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に結合する。非特異的捕捉プローブのある実施態様として、四つの標準的ＤＮＡ塩基全て（グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、およびチミン（Ｔ））、または、四つの標準的ＲＮＡ塩基全て（Ｇ、Ｃ、Ａ、およびウラシル（Ｕ））から構成されるランダムポリマー配列が挙げられる。ある実施態様は、ランダムポリマー配列の中に、一つ以上の塩基類縁体（例えば、イノシン、５−ニトロインドール）、または脱塩基位置を含む。好ましい実施態様は、ポリ（ｋ）塩基から成る一つ以上の配列、すなわち、Ｇ、およびＵまたはＴ塩基のランダム混合物（例えば、ＷＩＰＯ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５（１９９８）表１を参照されたい）を含むランダムポリマー配列を含む。ＧおよびＵ／Ｔ塩基を含む配列は、その「ゆらぎ」特性、すなわち、Ｕ／ＴがＧまたはＡに結合し、一方、ＧがＣまたはＵ／Ｔに結合する特性に関して選ばれる。ランダムポリマー配列を持つように合成される非特異的捕捉プローブは、実際には、ランダム部分の合成中に含まれる塩基から構成される、種々のランダムポリマー配列を含む、オリゴヌクレオチドの有限集団であることが理解される。例えば、Ｇ、Ｃ、Ａ、およびＴから構成される、１５ｎｔランダムポリマー配列を含む、非特異的捕捉プローブの集団は、４１５個のメンバーから成る。
本明細書に記載される非特異的捕捉プローブは、たくさんの異なる実施態様として存在してよいが、一般に、構造ＲＰ−ＳＢＰ、またはＳＢＰ−ＲＰによって表されてもよい。この文字式において、“ＲＰ”は、「ランダムポリマー」配列部分を表し、“ＳＢＰ”は、「特異的結合パートナー」を表す。これらの図式的文字式において、ＳＢＰは、ＲＰに対して直線的に表されているが、当業者であれば、ＳＢＰは、捕捉プローブのＲＰの任意の点で接合されてもよいことが了解されるであろう。ＲＰが、Ｇ、およびＵまたはＴ塩基から構成される実施態様では、非特異的捕捉プローブは、図式構造（ｋ）ｘ−ＳＢＰ、またはＳＢＰ−（ｋ）ｘによって表されてもよい。この式において、“ｋ”は、ＲＰ部分のＧ、およびＵまたはＴ塩基を表し、“ｘ”は、ｋ配列の長さ（ｎｔで表した）を表し、“ＳＢＰ”は、「特異的結合パートナー」を表す。このＳＢＰおよび（ｋ）ｘ配列は直線的に示されているが、ＳＢＰは、捕捉プローブに対し、任意の点で接合されてもよいことが理解されるであろう。
非特異的捕捉プローブのＳＢＰ成分は、固定プローブの一部であってもよいＳＢＰ’に対して特異的に結合する特異的結合対のメンバーであれば、いずれのものであってもよい。ＳＢＰおよびＳＢＰ’メンバーとして好適な、特異的結合対の、ある実施態様は、受容体およびリガンドの対、酵素、および基質または補因子対、酵素および補酵素の対、抗体（または抗体断片）および抗原対、糖およびレクチンの対、ビオチン、およびアビジンまたはストレプトアビジン対、リガンドおよびキレート剤の対、ニッケルおよびヒスチジン、および、完全に、または実質的に相補的な核酸配列同士を含む。本標的捕捉法のある好ましい実施態様は、ＳＢＰおよびＳＢＰ’として、実質的に相補的な核酸配列、より好ましくは相補的ホモポリマー配列を用いる、例えば、捕捉プローブは、支持体に連結される、相補的、固定ＳＢＰ’配列に対してハイブリダイズする、３’側が実質的にホモポリマーのＳＢＰ配列を含む。別のある好ましい実施態様は、ＳＢＰおよびＳＢＰ’メンバーとして、非核酸結合対を、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンを使用する。
非特異的捕捉プローブの実施態様は、種々の核酸立体配座の内の任意のもの、例えば、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、または、糖成分が置換体（例えば、２’メトキシ、または２’ハロゲン化物）を有する、一つ以上の修飾結合部を含むオリゴヌクレオチド、または、別様立体配座、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはタンパク核酸（ＰＮＡ）立体配座を有する、一つ以上の位置を含むオリゴヌクレオチドを含有するように合成されてもよい。捕捉プローブ実施態様は、該捕捉プローブのランダムポリマーセグメントを接合するスペーサーとして、非ヌクレオチド化合物（例えば、Ｃ−９）を含んでもよい。非特異的捕捉プローブの好ましい実施態様は、ランダムポリマー部分が、２’メトキシ置換ＲＮＡ残基、または、ＬＮＡ立体配座を持つ一つ以上の残基を含むＲＮＡ残基を用いて合成されるものを含む。非特異的捕捉プローブのオリゴヌクレオチド部分に含まれる立体配座（単数または複数）の選択は、単離することを意図する標的核酸に応じて決めてよい。例えば、２’メトキシ置換ＲＮＡ残基を有するランダムポリマー領域として合成される非特異的捕捉プローブは、ＲＮＡ標的の捕捉には好ましいが、一方、あるＬＮＡ立体配座を伴ってランダムポリマー領域として合成されるプローブは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）標的を捕捉するのに好ましい。捕捉プローブのある好ましい実施態様は、複数の立体配座の組み合わせ（例えば、ＬＮＡおよびＤＮＡ）を含む。
非特異的標的捕捉法は、実行するのに比較的早く、単純で、標的捕捉反応は僅か５分のインキュベーションしか必要としないので、通常、完了するのに１時間もかからない。要すれば実行してもよい捕捉工程、例えば、核酸をさらに精製するための捕捉核酸の洗浄を含めてもよいが、余分の時間（例えば、約２０分）を要する。非特異的標的捕捉は、本明細書に記載するように、実質的に水性の溶液において、標的核酸を含むサンプルを、非標的捕捉プローブと、捕捉プローブが、その混合物において標的核酸に非特異的にハイブリダイズすることを可能とする条件下で、混合することを含む。このような条件は、短時間の高温（例えば、６０℃を約１５分）、次いで、室温でのインキュベーション（例えば、約２０−２５℃を約１０から９０分）を含んでもよい。ただし、全インキュベーションが室温で、実質的にさらに短くてもよい（例えば、５分）。混合物はさらに、ＳＢＰ−ＳＢＰ’特異的結合対を介して非特異的捕捉プローブに特異的に結合する固定プローブを含んでもよい。固定プローブは、捕捉プローブと同時に、または捕捉プローブがサンプルと混ぜ合わされる前か、または後に、混合物に導入されてもよい。ある好ましい実施態様では、固定プローブは、捕捉プローブがサンプルとインキュベートされた後に、サンプルおよび非特異的捕捉プローブの混合物の中に導入され、捕捉プローブが固定プローブに結合する前に、捕捉プローブと標的核酸が、溶液相において非特異的にハイブリダイズすることを可能とする。別の好ましい実施態様では、混合工程をできるだけ短縮するために、固定プローブは、捕捉プローブとほぼ同時に混合物の中に導入されるが、これは、自動化システムのために特に有用である。ＳＢＰとして尾部配列を有する捕捉プローブを使用する実施態様では、捕捉プローブは、固定プローブに含まれる相補配列（ＳＢＰ’）に対し、核酸ハイブリダイゼーション条件下に特異的に結合し、これによって、捕捉プローブに非特異的に結合し、かつ、固定プローブを介して支持体に連結された標的核酸の、他のサンプル成分からの分離が可能となる。インキュベーションされ、捕捉プローブが、標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、かつ、固定プローブに特異的に結合した後、固定プローブ、捕捉プローブ、および標的核酸から構成される複合体は、他のサンプル成分から分離される。これは、複合体を付着させた支持体を溶液相から分離することによって行われる。次に、必要に応じて洗浄工程（単数または複数）を実行して、複合体に付着している可能性のある、非核酸サンプル成分、複合体の成分、または支持体を除去してもよい。好ましい実施態様では、洗浄工程が実行され、その際、支持体に付着する複合体は、支持体上にハイブリダイゼーション複合体を維持する、実質的に水性の洗浄液によって洗浄され、次いで、支持体に付着する複合体が、他のサンプル成分を含む洗浄液から分離される。捕捉された標的核酸は、後続アッセイ工程が実行される前に、一つ以上の他の複合成分から分離されてもよいし、または、支持体に付着する複合体が直接後続工程（単数または複数）に使用されてもよい。後続工程としては、例えば、捕捉核酸の検出、および／または、捕捉核酸中に含まれる一つ以上の配列のインビトロ増幅が挙げられる。
種々の条件下で設計、試験した非特異的捕捉プローブに基づいて、これらの組成物を用いる非特異的標的捕捉に関して下記の一般的結論が得られた。ランダム化ＧおよびＵ塩基を含む、非特異的捕捉プローブの方が、そのランダムＧ／Ｕポリマー部分と同数の合計ヌクレオチド数を有する、非ランダム反復（ＧＵ）配列を含むプローブよりも、標的捕捉においてより有効である。２’−メトキシＲＮＡ塩基を用いて合成される、ランダム化ポリ（ｋ）配列を含む、非特異的捕捉プローブの方が、デオキシ結合を用いて合成される類似構造のプローブよりも標的捕捉においてより有効である。ランダム化ポリ（ｋ）配列を含む、非特異的捕捉プローブの方が、そのランダムポリマー部分にランダム化ＤＮＡセグメント（ランダム化Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣ塩基）を含むプローブよりも、標的捕捉においてより有効である。ランダム化ポリ（ｋ）配列を含む、非特異的捕捉プローブの方が、同じ長さのポリ−イノシン、ポリ−Ｕ、またはランダム化ＣおよびＡ塩基（すなわち、ポリ（ｍ）配列）を含むプローブよりも、標的捕捉においてより有効である。非特異的捕捉プローブに含まれる、一つ以上のランダムな連続配列の長さは変動してよいが、効率的標的捕捉のためには、約１２ｎｔ以上のポリ（ｋ）配列で十分である。非特異的捕捉プローブにおける、非ランダムオリゴヌクレオチドの存在、または、ランダムポリ（ｋ）配列間の、非ヌクレオチドスペーサーの存在は、標的捕捉効率に影響を及ぼす可能性がある。ｓｓＤＮＡ標的の捕捉において、ランダムポリ（ｋ）配列の少なくとも一部をＬＮＡ立体配座として含む非特異的捕捉プローブは、同じ長さの、ＤＮＡ立体配座の非特異的捕捉プローブよりも有効であり、かつ、ＬＮＡおよびＤＮＡ残基の混合物を含むプローブは、全てのポリ（ｋ）配列をＬＮＡ立体配座として含むプローブよりも有効である。ランダムポリ（ｋ）配列の少なくとも一部をＬＮＡ立体配座として含む非特異的捕捉プローブは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の標的捕捉よりも、ＲＮＡおよびｓｓＤＮＡの捕捉に対してより有効である。ランダムポリ（ｋ）配列の少なくとも一部をＬＮＡ立体配座として含む非特異的捕捉プローブの方が、同じ長さのランダムポリ（ｋ）配列が、２’−メトキシＲＮＡ塩基を用いて合成される捕捉プローブよりも、ＲＮＡ標的捕捉においてより有効である。これらの一般的パラメータは、意図する標的核酸、または意図するタイプの標的核酸を捕捉するための非特異的捕捉プローブ実施態様の設計、および最適化のために使用することが可能であり、所望の標的捕捉結果を与える、非特異的捕捉プローブおよび条件を選択するために、下記の実施例に記載される標準手順を用いて試験することが可能である。
固定プローブは、標的捕捉法で使用されるハイブリダイゼーション条件において安定なものであれば、いずれの結合によって支持体に接続されてもよい。好ましい実施態様は、公知の方法、例えば、遠心、ろ過、磁気吸引、または、他の物理的または電気化学的分離によって溶液から回収することが可能な、単分散粒子の支持体を使用する。捕捉された標的核酸は、支持体の上で単離、濃縮される、すなわち、標的核酸は、初期サンプルにおける、その濃度に比べ支持体上で濃縮され、これは、その捕捉核酸を用いて実行される、後続のアッセイ工程の感度を向上させる可能性がある。
本明細書に記載される標的捕捉法は、非特異的捕捉プローブはサンプル中の１種類以上の核酸に結合するので、同じサンプルから、二つ以上の標的核酸を同時に単離するために使用してもよい。ある実施態様では、非特異的捕捉プローブは、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の混合物を含むサンプルから、ある特定タイプの核酸（例えば、ＲＮＡ）を優先的に捕捉するのに使用するよう設計、選択してもよい。ある実施態様では、非特異的捕捉プローブは、該捕捉プローブが、異なる固定プローブに選択的に結合するように設計することによって、混合物から選択的に取り出し可能となるようにしてもよい。すなわち、固定プローブは、混合物に導入され、次いで、捕捉プローブおよび標的核酸を含む付着複合体によって分離される。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ混合物においてＲＮＡに優先的に結合する、第１非特異的捕捉プローブは、第１支持体上の第１固定ＳＢＰ’に、第１ＳＢＰを介して結合し、ＤＮＡおよびＲＮＡ混合物においてＤＮＡに優先的に結合する、第２非特異的捕捉プローブは、第２支持体上の第２固定ＳＢＰ’に、第２ＳＢＰを介して結合してもよい。次に、付着複合体によって、第１および第２次支持体を、アッセイシステムの異なる領域に選択的に移動させるか、または、あるアッセイ中の異なる時点で選択的に取り出すことによって、サンプルのＲＮＡ成分を、同じサンプルのＤＮＡ成分から選択的に分離することが可能である。それぞれの使用のための、非特異的捕捉プローブの最適構造および条件を決定するための方法は、下記の実施例に記載される。
非特異的標的捕捉の効率を試験するためにモデルシステムが用いられる。このシステムでは、ＲＮＡ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｒＲＮＡ）およびＤＮＡ（合成オリゴヌクレオチド）標的核酸の捕捉のために、異なる種々の捕捉プローブおよび条件が用いられる。典型的試験では、既知の濃度の、検出可能なマーカーで標識された標的核酸（例えば、標識プローブ）を、実質的に水性溶液（例えば、塩およびキレート剤を含むバッファー液）と混合して調製した。実質的に水性の溶液中に、既知量の、試験される、非特異的標的捕捉プローブ、および、支持体（例えば、磁気粒子）に付着した、既知量の固定プローブを含む試薬と、サンプルの一部を混合して、標的捕捉混合物を作製する。非特異的捕捉プローブ、標的核酸、および、支持体に付着する固定プローブから構成される捕捉複合体の形成を可能とするために、この標的捕捉混合物を、指定の温度（単数または複数）で指定の時間（単数または複数）インキュベートした。次に、支持体上の複合体を、溶液相から分離した。溶液相の残留部分を除去するために、必要に応じて支持体上の複合体を洗浄し、支持体上の複合体を、洗浄液から分離した。支持体と会合するラベルが検出され、標的捕捉効率の測定値を提供する、すなわち、他のサンプル成分から分離される、標的核酸量の定量値を提供する。支持体上の複合体から最初に分離される、溶液相と会合するラベルも検出され、標的捕捉工程後も依然として溶液中に滞在する、標識標的核酸の測定値を提供する。異なる複数の非特異的捕捉プローブおよび条件が互いに比較できるように、最少数の成分を含むよう、モデルシステムは設計されるけれども、標的捕捉混合物には、追加のオリゴヌクレオチド、例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチド（米国特許第５，０３０，５５７号、Ｈｏｇａｎら）、および／または増幅プライマーを、標的捕捉混合物に含めてもよいことが理解されよう。
ある場合、比較のために、標的核酸に特異的にハイブリダイズする特異的標的捕捉プローブを、既知の過程にしたがって用いることによって、サンプルに対し標的捕捉を実行する。その過程は、その標的核酸に対する、特異的捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能とする第１インキュベーション、および、その特異的捕捉プローブ中の相補配列に対する、固定オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを可能とする第２インキュベーションを含む（米国特許第６，１１０，６７８号、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）。通常、この特異的標的捕捉過程は、検出プローブによって標識される標的核酸を含むサンプルを、その標的核酸に特異的に結合する捕捉プローブ（例えば、１．７５ｐｍｏｌｅｓ）、および、常磁性粒子に、カルボジイミド化学（Ｌｕｎｄら、１９８８，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８６１−１０８８０）によって付着させた、約１００ ：ｇの固定プローブ（例えば、０．７−１．０５Ｆの磁気粒子（Ｓｅｒａｄｙｎｅ））に付着させたｄＴ１４プローブ）と混合し、この混合物を５５−６０℃において約１５−３０分、次いで、室温で５−１５分インキュベートし、捕捉プローブと標的核酸との、次いで、固定プローブと、捕捉プローブ：標的核酸複合体との継時的ハイブリダイゼーションを可能とする。磁場を印加することによって、複合体を付着させた粒子は、容器の一部において溶液相から分離され（米国特許第４，８９５，６５０号）、上清が除去される。粒子は、洗浄液（例えば、室温で１ｍｌ）に縣濁され、この磁気分離工程が繰り返される。
非特異的標的捕捉プローブは、当該技術分野で周知の、標準的インビトロ法によって合成される（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，ｐ．２８７（１９８７）；米国特許第５，２５２，７２３号、Ｂｈａｔｔ；国際公開第９２／０７８６４号、Ｋｌｅｍら）。合成オリゴヌクレオチドは、標準的ＲＮＡ塩基および結合部、ＤＮＡ塩基および結合部、２’メトキシ結合を有するＲＮＡ塩基、ＬＮＡ立体配座、または、そのような構造体の組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ塩基を用いて作製される。あるオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドスペーサー（例えば、Ｃ−９）、または核酸類縁体（例えば、イノシン、または５−ニトロインドール）を含むように合成される。捕捉プローブの非特異的部分は、通常、ランダムな“ｋ”残基の一つ、または一連の位置、すなわちＲＮＡ塩基であればＧまたはＵ、あるいは、ＤＮＡまたはＬＮＡ塩基であればＧまたはＴの、一つ、または一連の位置を含む。別様に指示しない限り、ランダムなｋ残基は、等量のＧおよびＵ塩基、またはＧおよびＴ塩基を含む混合物を用いて合成される。非特異的プローブの多くの実施態様は、標的核酸に非特異的にハイブリダイズする非特異的配列を含む５’部分、および、通常ｄＴ３ｄＡ３０、またはｄＡ３０配列で構成される３’ＤＮＡ「尾部」配列を含む。この尾部部分は、支持体に付着するポリｄＴオリゴマーに対して相補的であり、そのため、捕捉プローブは（標的核酸を結合させたものも、そうでないものも）、支持体と会合され、標的捕捉混合物の溶液相から分離される。非特異的捕捉プローブに付着するものであれば、いずれの「尾部」配列であっても、すなわち、非核酸性特異的結合パートナー（ＳＢＰ）であってもよいこと、支持体上の選ばれた特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）は、ＳＢＰに対する特異的結合対のメンバーであることが理解されよう。
本明細書に記載される非特異的捕捉プローブの実施態様は、５’から３’方向に向かうオリゴヌクレオチド成分の構造を簡略化するために下記の命名法を用いる。ランダムなＧまたはＵ／Ｔ塩基から成る一つ以上の残基を含むオリゴヌクレオチドは、用語“（ｋ）ｘ”を用いる。この用語において、“ｋ”は、ＧおよびＵ、またはＧおよびＴのランダムな組み合わせを表し、“ｘ”は、ＧおよびＵ、またはＧおよびＴ塩基のランダムな組み合わせにおける位置の数を示す。オリゴヌクレオチドが標準的ＲＮＡバックボーンを用いる場合、用語はさらに、ＧおよびＵ塩基のランダムな組み合わせにおけるＲＮＡを表示するために“ｒ”を、例えば、ｒ（ｋ）ｘを含めてもよい。一方、オリゴマーが、２’−メトキシ結合のバックボーンを有するＲＮＡ塩基を用いる場合、用語はさらに、ＧおよびＵ塩基のランダムな組み合わせの修飾型結合を表示するために“２’−Ｏｍｅｒ”を、例えば、２’−Ｏｍｅ−（ｋ）ｘを含んでもよい。オリゴヌクレオチドが、標準的ＤＮＡ結合を用いる場合、用語は、ＧおよびＴ塩基のランダムな組み合わせにおけるＤＮＡを表示するために“ｄ”を、例えば、ｄ（ｋ）ｘを含んでもよく、一方、オリゴマーが、ロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座を有するＤＮＡ塩基を用いる場合、用語は、ＧおよびＴ塩基のランダムな組み合わせにおけるＬＮＡ立体配座を表示するために“Ｌ”を、例えば、Ｌ（ｋ）ｘを含んでもよい。異なる種々の部分の組み合わせから構成されるオリゴヌクレオチドは、その全体構造を定義するために、これらの用語の一つ以上を含んでもよい。例えば、５’から３’方向において、標準的ＤＮＡ結合を有する６個のランダムなＧおよびＴ、標準的ＤＮＡ結合を有する３個のＴ塩基、および、標準的ＤＮＡ結合を有する５個のランダムなＧおよびＴ塩基（ｋ塩基）は、ｄ（ｋ）６−ｄＴ３−ｄ（ｋ）５のように簡略化されると考えられる。もう一例挙げると、５’から３’方向に、ＬＮＡ結合を有する、５個のランダムなＧおよびＴ塩基、ＤＮＡ結合を有する３個のＡ塩基、および、ＤＮＡ結合を有する、４個のランダムなＧおよびＴ塩基から構成されるオリゴヌクレオチドは、Ｌ（ｋ）５−ｄＡ３−ｄ（ｋ）４のように簡略化されると考えられる。もう一例挙げると、５’から３’方向に、２’−メトキシ結合を有する、１０個のランダムなＧおよびＵ塩基、および、標準的ＤＮＡ結合を有する１５個のＡ塩基の３’尾部から構成されるオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏｍｅ−（ｋ）１０−ｄＡ３０と簡略化されると考えられる。
少数の場合では、比較的複雑な構造の合成オリゴヌクレオチドは、意図される構造に基づくオリゴヌクレオチドの予想分子量（Ｍ．Ｗ．）と比較して、合成オリゴヌクレオチドの実際の分子量を定量することによって調べられる。例えば、１６３０８Ｄの予想Ｍ．Ｗ．を有する、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）の構造体を生産するために合成される、二つの異なるバッチのオリゴヌクレオチドは、１６２６３Ｄおよび１６２４８ＤのＭ．Ｗ．を有することが判明した。これよりもやや低いＭ．Ｗ．測定値は、集団の中の少数のオリゴヌクレオチドが、Ｔ／Ｇ混合物ではなく、主にＴを有することを意味する。
標的捕捉プローブおよび条件の相対的効率は、捕捉プローブ、標的核酸、および、支持体に付着する固定プローブを含む複合体が、混合物から分離された後、捕捉標的に結合する検出プローブから発せられる信号を測定することによって定量される。検出プローブは、標的核酸の任意の地点に付着させてよいが、試験されるモデルシステムにおいてサンプル中の標的核酸を標識する際の、簡便および一貫性のために、検出プローブは、サンプル作製過程において、標的核酸に特異的にハイブリダイズされる。当業者であれば、捕捉標的核酸は、他の標準的核酸検出法、例えば、捕捉の前または後に、標的核酸に染料を結合することによって、または、標的核酸に直接検出可能なラベル（例えば、放射性ラベル）を組み込むことによって検出してもよいことを了解するであろう。
モデルシステムにおいて種々の標的核酸とともに種々の捕捉プローブを用いることによって得られる結果に基づくと、非特異的捕捉プローブは、同じ条件下でも、種々の効率で作動する。これは、非特異的捕捉プローブの構造が、ある特定タイプの標的核酸に対する相対的アフィニティーに影響することを示す。これらの所見に基づいて、当業者であれば、あるタイプの標的核酸を選別する捕捉反応の効率を偏倚させるように、例えば、ＲＮＡ標的ではなく、ＤＮＡ標的を優先的に捕捉するように反応を偏倚させるように、標的捕捉プローブを設計し、最適化することが可能であろう。本明細書に記載される方法を用い、当業者であれば、種々の、異なるが、構造的には関連する捕捉プローブを設計し、ある特定タイプの標的核酸の効率的捕捉のために、捕捉反応を最適化するよう、それらの捕捉プローブを試験することが可能であろう。
実施例は、開示の非特異的標的捕捉法および組成物の実施態様を記載するために含まれる。下記に記載されるアッセイにおいて一般的に使用される試薬は下記の通りであるが、分子生物学分野の当業者であれば、記載される反応および試験の基本工程を実行するために、たくさんの、別の試薬が入手可能であることを了解されるであろう。
サンプル輸送試薬：１１０ｍＭ ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ６．７。
標的捕捉試薬（ＴＣＲ）：２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．８８Ｍ ＬｉＣｌ、３１０ｍＭ ＬｉＯＨ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．４、および２５０Ｆｇ／ｍｌの常磁性粒子（（ｄＴ）１４オリゴマーを共有的に結合させた、０．７−１．０５Ｆ粒子、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）ＭＧ−ＣＭ）。
洗浄液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、および０．１％（ｖ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。
ハイブリダイゼーション試薬：１００ｍＭ コハク酸、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ ＬｉＯＨ、１５ｍＭ アルドリチオール−２、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および３．０％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ４．７。
選択試薬：６００ｍＭ ホウ酸、１８２．５ｍＭ ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ｐＨ８．５またはｐＨ９．２、ハイブリダイズしない検出プローブオリゴマー上のＡＥラベルを加水分解するため。
検出試薬は、検出試薬Ｉ：１ｍＭ 硝酸および３２ｍＭ Ｈ２Ｏ２、および検出試薬ＩＩ：１．５Ｍ ＮａＯＨを含む。これは、ＡＥラベルから化学発光を誘起するためである（米国特許第５，２８３，１７４、５，６５６，７４４、および５，６５８，７３７号を参照されたい）。
捕捉された標的核酸は、分子生物学に精通する当業者に周知される、核酸を検出するものであれば、いずれのプロセスを用いて検出してもよい。例えば、捕捉核酸は、核酸全般に特異的に結合するか、または、特定形態の核酸に選択的に結合する染料を用いて検出してもよい。特異的核酸は、捕捉核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする検出プローブを結合させることによって検出してもよいし、あるいは、捕捉核酸中の標的配列は、インビトロ核酸増幅によって処理して該捕捉核酸の一部を増幅し、次いで、検出してもよい。実施例に記載されるモデルシステムでは、サンプル中の標的核酸は、一般に、標的捕捉前に、それを特異的検出プローブにハイブリダイズすることによって標識する。この特異的検出プローブは、別の文書（米国特許第５，６５８，７３７号の、コラム２５、２７−４６行、およびＮｅｌｓｏｎら、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８４２９−８４３８の８４３２を参照されたい）に詳述される周知の方法を用い、均一システムにおいて化学発光信号（相対的明度単位、または“ＲＬＵ”で表される）を誘起するアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物によって標識される。
（実施例１）
ＲＮＡの非特異的標的捕捉
本実施例は、ＲＮＡの捕捉において、種々の非特異的標的捕捉プローブの効率を明らかにする。試験は、既知量のＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｒＲＮＡ（１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの混合物）を用いて実行した。捕捉前に、該ｒＲＮＡ中の配列に対して相補的な標識検出プローブにハイブリダイズさせて、その標的ｒＲＮＡを標識した。典型的には、試験サンプルを調製するために、２００ｆｍｏｌｅのｒＲＮＡを、ハイブリダイゼーション試薬に溶解した１ｐｍｏｌｅのＡＥ標識にハイブリダイズさせ（０．０４ｍｌにおいて６０℃で６０分）、次いで、室温（ＲＴ）に冷却し、０．３ｍｌのハイブリダイゼーション試薬で希釈した。プローブ標識標的核酸混合物の分液（１０Ｆｌ）を、０．５ｍｌの実質的に水性の溶液（０．２ｍｌのサンプル輸送試薬、０．２ｍｌの水、および０．１ｍｌの、ポリｄＴ固定プローブを有する５０Ｆｇの磁気粒子を含むＴＣＲ）、および２０ｐｍｏｌｅの非特異的捕捉プローブと混合した。標的核酸に対し非特異的捕捉プローブを付着させ、相補的固定プローブに対し非特異的捕捉プローブの３’尾部をハイブリダイズさせるために、この混合物をインキュベートした。反応容器の外側に磁場を印加することによって溶液相から磁気粒子を分離し（ペレット部分）、上清を取り出し、保存した。ペレット部分において付着複合体を有する磁気粒子は、必要に応じて洗浄し（１ｍｌの洗浄液でＲＴにおいて）、前と同様に、洗浄液から分離してペレット状とした。ペレット部分において複合体を付着させた磁気粒子は、０．１ｍｌのバッファー水溶液に縣濁し、０．１ｍｌの保存上清部分を、別に５０Ｆｇの磁気粒子と混合して、信号検出のための比較上清分液とした。６０℃で１０分間インキュベートして、検出プローブ上の、標的核酸に結合していないＡＥラベルを加水分解させたペレットと上清サンプルの両方に選別試薬（０．２ｍｌ）を加えた。次に続いて、標的核酸に結合したプローブ上に残留するＡＥラベルから化学発光を誘起するために検出試薬を加え、相対的明度単位（ＲＬＵ）信号を、光度計（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）で、ほぼ以前に記載された通りに（米国特許第５，２８３，１７４および５，６５６，７４４号、Ａｒｎｏｌｄら、および、米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら、カラム２５、２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８４２９−８４３８、８４３２ページ）測定した。
第１組の試験では、非特異的捕捉プローブは、ＲＮＡ塩基と２’−メトキシ結合から構成される、５’非特異的標的捕捉配列、および、ｄＴ３ｄＡ３０の、３’−ＤＮＡ尾部配列を有し、それらは、下記の構造：
（ｎ）６−Ｕ３−（ｎ）６ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１）、
（ｎ）６−Ｎｉ３−（ｎ）６ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２）、前式において“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表し、
（ｎ）６−Ｎｉ５−（ｋ）６−（ｎ）６ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号３）、前式において“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表す、
によって示される。
標的捕捉試験は、前述のように、６０℃で１５分、次いでＲＴで９０分のインキュベーションを用いて実行した。陰性コントロールは同様に処理されたが、標的捕捉プローブを含んでおらず、陽性コントロールは、以前に記載された通り、標識ｒＲＮＡプローブ中の標的配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む、特異的標的捕捉プローブを用いた。表１は、これらの試験で得られた結果を示し、上清およびペレット部分で検出されたＲＬＵを、それぞれ、カラム２および３に示し、ペレットにおいて捕捉された標的核酸のパーセント計算値をカラム４に示す。これらの結果から、ランダム化６マー間に５−ニトロインドールスペーサーを含む、二つの非特異的捕捉プローブの間では、ランダム化ｋ・６マー（Ｇ／Ｕ）を含むプローブの方が、ランダム化ｎ・６マー（Ｇ、Ａ、Ｃ、およびＵ）を含む非特異的捕捉プローブよりも、より効率的にＲＮＡを捕捉すること、および、三つのＵ塩基によって連結される、ランダム化ｎ・６マーを含む捕捉プローブは、ランダム化ｋ・６マーを含むプローブと同程度に標的を捕捉することが示された。
Figure 2018174941
第２組の試験では、非特異的捕捉プローブは、ＲＮＡ塩基と２’−メトキシ結合から構成される、５’非特異的標的捕捉配列、および、３’ｄＴ３ｄＡ３０配列を有し、それらは、下記の構造：
（ｌ）１２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号４）、前式において“ｌ”はイノシンを表し、
（ｋ）６−Ｃ９−Ｃ９−（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号５）、前式において“Ｃ９”は、９炭素非ヌクレオチドスペーサーを表し、
（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号６）、前式において“Ｃ９”は、９炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、
によって示される。
標的捕捉試験は、前述のように行った。ただし、インキュベーションは、６０℃で１５分、次いでＲＴで６０分とした。表２は、前述のように表示された、これらの試験の結果を示す。これらの結果から、Ｃ９スペーサーを含む、二つの非特異的捕捉プローブの間では、二つのｋ・６マーを有するプローブ、および三つのｋ・６マーを含むプローブの両方とも、ｒＲＮＡを効率的に捕捉したが、ポリイノシンプローブは、ＲＮＡ標的捕捉において非効率的であることが示された。
Figure 2018174941
第３組の試験では、配列番号５および６の、Ｃ９含有非特異的捕捉プローブを同様に試験した。ただし、インキュベーションは、６０℃で１５分、次いでＲＴで１５分とした。これらの実験において、ＲＮＡ捕捉の効率は、陽性コントロールの７９％捕捉、および陰性コントロール（０％捕捉）と比べ、配列番号５の捕捉プローブでは３２％、配列番号６の捕捉プローブでは５０．７％であった。
（実施例２）
ＲＮＡの非特異的標的捕捉
本実施例は、標的捕捉インキュベーションを室温で１０から３０分とすることを除いて、実施例１の記載と実質的に同様に実行されるアッセイにおいて、種々の異なる捕捉プローブを用い、ｒＲＮＡに対する非特異的標的捕捉の効率を明らかにする。使用した非特異的捕捉プローブは全て、ＲＮＡ塩基および２’−メトキシ結合、および３’ＤＮＡ尾部配列を用いて合成した。
第１組の試験では、配列番号５および６の、Ｃ９−含有非特異的捕捉プローブを、ＲＴ３０分のインキュベーションを用いて試験したところ、ＲＮＡ捕捉の効率は、陽性コントロールの５３％捕捉、および陰性コントロールの１．３％捕捉と比べ、配列番号５の捕捉プローブで７１％であり、配列番号６の捕捉プローブで８９．５％であった。これらの結果は、ＲＮＡの効率的、非特異的標的捕捉には、６０℃のインキュベーションは必要ないことを示す。
第２組の標的捕捉においても、ＲＴ３０分でインキュベーションし、配列番号５の非特異的捕捉プローブを、他の、三つの非特異的捕捉プローブと比較した。それらは、下記：
（ｋ）１２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号７）、
（ｋ）６−Ｕ３−（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号８）、および、
（ｋ）６−Ｕ６−（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号９）
に示される構造を有する。
表３は、実施例１に記載されるように表示して、これらの試験の結果を示す。これらの結果は、全てＲＴで標的ＲＮＡを捕捉する、異なる非特異的捕捉プローブ設計の、相対的効率を示す。
Figure 2018174941
第３組の試験では、同じ非特異的捕捉プローブ（配列番号５、７、８、および９）を用いてｒＲＮＡの標的捕捉を実行した。ただし、インキュベーションはＲＴ１０分で行った。これらの試験の結果を表４に示す。表３のものと比べたこれらの結果から、ＲＴにおけるより長いインキュベーションでは、やや大きな標的捕捉が得られるが、著明な標的捕捉は、ＲＴ僅か１０分でも起こることが示された。二つのｋ・６マーを連結するＵ３を含むプローブと、二つのｋ・６マーを連結するＵ６を含むプローブの捕捉効率に関する、表４の結果の比較は、Ｕ３スペーサーを有するプローブの方がより効率的であることを示す。上記およびその他の結果に基づくと、一般に、より短いスペーサー（例えば、３ｎｔ、または一つのＣ−９スペーサー）を含む捕捉プローブの方が、同様の構造を持つ、より長いスペーサー（例えば、６ｎｔ、または二つの隣接Ｃ−９スペーサー）を含むプローブよりも効率的である。
Figure 2018174941
（実施例３）
ＨＩＶ−１標的ＲＮＡの標的捕捉
本実施例は、ＨＩＶ配列を捕捉するための、二つの異なる非特異的標的捕捉プローブの使用を示す。これらのプローブは、ＨＩＶ−１のプロテアーゼコード遺伝子およびＲＴ４遺伝子の部分に対応する合成ＲＮＡ配列であった。試験は、両標的核酸に対し個別に行った。すなわち、クローンされたプロテアーゼおよびＲＴ４配列から調製される、既知量のインビトロＲＮＡ転写体（６８１ｎｔプロテアーゼ転写体、および４７１ｎｔＲＴ４転写体）を用い、これらを、捕捉される前に、標的ｒＲＮＡ中の配列に対して相補的な標識検出プローブに、特異的、個別的にハイブリダイズさせた。試験サンプルを調製するために、２００ｆｍｏｌｅの標的ＲＮＡを、ハイブリダイゼーション試薬に溶解したＡＥ標識検出プローブと特異的にハイブリダイズさせ（０．０４ｍｌにおいて６０℃で６０分）、室温（ＲＴ）に冷却し、０．３ｍｌのハイブリダイゼーション試薬で希釈した。このプローブ−標識標的ＲＮＡ混合物の分液（１０Ｆｌ）を、０．５ｍｌの実質的に水性の溶液（０．２ｍｌのサンプル輸送試薬、０．２ｍｌの水、および０．１ｍｌの、ポリｄＴ固定プローブを有する５０Ｆｇの磁気粒子を含むＴＣＲ）、および２０ｐｍｏｌｅの非特異的捕捉プローブと混合した。標的核酸に対し非特異的捕捉プローブを付着させ、固定プローブに対し捕捉プローブの３’尾部をハイブリダイズさせるために、この混合物をＲＴで３０分インキュベートした。磁場を印加することによって溶液相から、複合体を付着させた磁気粒子（ペレット部分）を分離し、上清を保存した。ペレット部分を洗浄し（０．５ｍｌのサンプル輸送試薬でＲＴにおいて）、前と同様に分離してペレット部分を作製し、これを、ＲＬＵの検出のために、０．１ｍｌのバッファー水溶液と混合した。ＲＬＵ検出のために、保存上清の一部（０．１ｍｌ）を５０Ｆｇの磁気粒子と混合した。ＲＬＵ検出のための各混合物に、選択試薬（０．２ｍｌ）を加え、混合物を６０℃で１０分間インキュベートし、次いで、検出試薬と混合し、実施例１に記載の通りに化学発光（ＲＬＵ）の検出を行った。
これらの試験で用いた非特異的捕捉プローブは、（ｋ）１２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号７）、および、（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６−Ｃ９−（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号６）であった。陰性コントロールは、試験サンプルと同様に処理したが、その混合物は捕捉プローブを含んでいなかった。表５は、二つの非特異的捕捉プローブが共に、混合物からＨＩＶ−１標的ＲＮＡを捕捉することにおいて有効であることを示す、試験結果を示す。
Figure 2018174941
（実施例４）
非特異的捕捉プローブを用いる標的捕捉の反応速度
本実施例は、非特異的捕捉プローブを用いる標的捕捉が、ＲＴにおいて効率的で、顕著な捕捉が、僅か２−５分で起こることを示す。これらの試験は、種々の期間（１−６０分）インキュベーションしたことを除き、実質的に、実施例２に記載する通りに行った。インキュベーション後、ペレット部分を単離し、捕捉標的ＲＮＡからの信号（ＲＬＵ）を測定し、標的捕捉の相対的効率の継時変化を求めた。
第１組の試験では、下記の非特異的捕捉プローブ（反応当たり２０ｐｍｏｌｅ）を用いて、検出プローブ標識ｒＲＮＡ標的を捕捉した。捕捉プローブは全て、非特異的部分にはＲＮＡ塩基および２’−メトキシ結合、および３’ＤＮＡ尾部を伴って合成された：（ｋ）１２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号７）、（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）、および（ｋ）２４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１２）。標的捕捉混合物は、ＲＴで、１、２、５、１０、および２０分インキュベートし、次いで、ペレット部分を単離し、信号を測定した。関連試験では、同じ非特異的捕捉プローブ、および、５’非特異的部分に、２’−メトキシ結合ＲＮＡ塩基、および、ＤＮＡおよびＬＮＡ立体配座の混合体としてポリＡ残基を含む３’尾部を伴って合成された（ｋ）１８捕捉プローブ（配列番号１３、図式では、（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３ＬＡ１ｄＡ３ＬＡ１ｄＡ１ＬＡ１ｄＡ１ＬＡ１ｄＡ３ＬＡ１ｄＡ３ＬＡ１ｄＡ１ＬＡ１ｄＡ１ＬＡ２ｄＡ３ＬＡ１ｄＡ１となり、これは、表６では（ｋ）１８−ｄＴ３／Ｌ（Ａ３０）に短縮される）を同じ条件下に試験した。ただし、インキュベーションは１８分であった。これらの試験の全てにおいて、陰性コントロールは、標的捕捉混合物中に捕捉プローブが含まれなかったことを除いては、試験サンプルと同様に処理した。陰性コントロールは、標的の１．４から１．９％に相当するＲＬＵ信号をもたらした。これらの試験の結果を表６に示す。結果から、最大捕捉は、１８−２０分のインキュベーション後に観察されるが、顕著な捕捉が、室温において、僅か１−２分のインキュベーション後に観察されること、および、３’尾部におけるＬＮＡ立体配座の存在は、非特異的標的捕捉の効率を改善しないことが明らかにされた。
Figure 2018174941
第２組の試験では、第１組試験と同じ非特異的捕捉プローブ、および、（Ｇ／Ｔ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１４）で示されるように、ランダムなＧおよびＴ塩基から成る１８−ｎｔ部分を含み、２’−メトキシ結合および３’ＤＮＡ尾部を伴って合成された、もう一つの非特異的捕捉プローブを用いて、同じｒＲＮＡ標的を捕捉した。この標的捕捉混合物は、ＲＴで５および６０分インキュベートされ、次いで、そのペレット部分が単離され、信号が測定された。同様に処理されるが、捕捉プローブを含まない陰性コントロールは、ペレット部分において、５分のインキュベーション後１０７８ＲＬＵ、６０分のインキュベーション後２１６０ＲＬＵを与えた。非特異的捕捉プローブを用いて実行した反応の試験結果を表７に示す。この結果から、最大捕捉は、６０分のインキュベーション後に観察されるが、ＲＴ５分のインキュベーション後でも顕著な捕捉が観察されることが明らかにされた。
Figure 2018174941
第３組の試験では、ランダムＧ／Ｕ配列またはランダムＧ／Ｔ配列のいずれかとして、２’−メトキシ結合を伴って合成される、１８−ｎｔの５’部分、および３’ＤＮＡ尾部を有する非特異的捕捉プローブを用いて、同じｒＲＮＡ標的を捕捉した。この標的捕捉混合物は、ＲＴで０から５０分インキュベートされ、次いで、そのペレット部分が単離され、信号が測定された。これらの試験の結果を表８に示す。この結果から、最大捕捉は、５０分のインキュベーション後に観察されるが、ＲＴ１−２分のインキュベーション後でも顕著な捕捉が観察され、かつ、全ての時点において、ランダムＧ／Ｔ配列を含む捕捉プローブの方が、ランダムＧ／Ｕ配列を含む捕捉プローブよりも、やや効率的に捕捉することが明らかにされた。
Figure 2018174941
（実施例５）
種々の設計の非特異的捕捉プローブによる標的捕捉
本実施例は、非特異的捕捉プローブの、多くの異なる実施態様が、ｒＲＮＡ標的核酸の捕捉において有効であること、および、アッセイ性能を最適化するために、種々の捕捉プローブの試験の使用が可能であることを明らかにする。本実施例に記載される試験は、標的として検出プローブ標識ｒＲＮＡを、標的捕捉混合物のＲＴインキュベーションを用いる点で、実施例２に記載されるやり方とほぼ同様にして実行した。
第１組の試験では、非特異的捕捉プローブは全て、ｄＴ３ｄＡ３０の３’ＤＮＡ尾部を含み、５’非特異的部分には種々の異なる構造を持つように合成された。その構造は、下記：
（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）、５’部分は、ＲＮＡ塩基および２’−メトキシ塩基によって合成される；
ｄ（ｋ）６−ｄＴ３−ｄ（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１０）、５’部分は、ＤＮＡのみによって合成される；
Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１５）、５’部分は、ＬＮＡおよびＤＮＡとして合成される；および、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１６）、５’部分は、ＬＮＡおよびＤＮＡとして合成される、
に記載する通りである。配列番号１１の捕捉プローブは、種々の割合のＧおよびＵ塩基（５０：５０、７０：３０、および３０：７０）を用いて合成した。これは、効率的ＲＮＡ標的捕捉には、どの特定のランダム混合物が好ましいかを決定するためであった。標的捕捉混合物は、別々に、２０ｐｍｏｌｅの非特異的捕捉プローブを含み、ＲＴで２０分インキュベートし、次いで、標的捕捉後、ペレット部分に関連する信号を定量するために、実施例２に記載するように処理した。陰性コントロールは、混合物が捕捉プローブを含まないことを除いては同様に処理したが、上清部分では３８２６７ＲＬＵを、ペレット部分では１３７９ＲＬＵを与えた。これらの試験の結果を表９に示す。この結果から、非特異的捕捉プローブの、種々の立体配座の働きは、異なる相対的効率を示すことが明らかにされた。Ｇ：Ｕ＝５０：５０または３０：７０となるように合成された、ＧおよびＵ塩基のランダムな組み合わせは、Ｇ：Ｕ＝７０：３０となるように合成されたものよりも、より有効であった（表９の２列目から４列目を比較せよ）。類似の構造を持つが、ＬＮＡ残基によって作製された捕捉プローブの方が、ＤＮＡ残基による、対応捕捉プローブよりも有効であった（表９の５列目および６列目を比較せよ）。
Figure 2018174941
本実施例の第１組試験と同じ標的核酸および標的捕捉条件を用いて実行された、第２組の試験では、全て２’−メトキシ結合によって合成された１８−ｎｔ非特異的領域を含み、全て３’ＤＮＡ尾部を有する、種々の非特異的捕捉プローブが比較された。ｋ１８部分が、５０：５０、７０：３０、および３０：７０比率の混合物を用いて合成される、（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）の捕捉プローブを、Ｕ１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１７）の捕捉プローブと比較した。これらの試験の結果は、標的ｒＲＮＡ捕捉におけるこれらの捕捉プローブの相対的効率を示した。ポリＵ含有捕捉プローブは、もっとも効率が低く（３．５％捕捉）、Ｇ：Ｕ＝７０：３０を用いて作製した、ポリｋ含有捕捉プローブは効率的であり（４１％捕捉）、Ｇ：Ｕ＝５０：５０および３０：７０を用いて作製した、ポリｋ含有捕捉プローブはもっとも効率的であった（それぞれ、７３％および６５％捕捉）。したがって、比較試験は、非特異的標的捕捉のためのプローブ設計を最適化するために使用することが可能である。
（実施例６）
種々の量の非特異的捕捉プローブによる標的捕捉
本実施例は、反応に含まれる非特異的捕捉プローブの最適量を決定することによって、標的捕捉反応を最適化することが可能であることを示す。これらの試験は、ほぼ、実施例２に記載される反応混合物および条件を用いて行った。ただし、反応当たり、種々の量（例えば、１−６０ｐｍｏｌｅ）の非特異的捕捉プローブを用いた。標的捕捉反応は、ＲＴで１０−２５分インキュベートし、次いで、ペレット部分を分離し、捕捉効率を、ペレット部分のＲＬＵを検出することによって測定した。
第１組の実験では、種々の立体配座を有する、１８−ｎｔの非特異的領域を含む非特異的捕捉プローブを合成し、比較した。第１立体配座は、５’部分ではＲＮＡ塩基および２’−メトキシ結合によって、３’尾部ではＤＮＡとして合成した（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）であり、第２立体配座は、５’部分ではＬＮＡおよびＤＮＡ立体配座のＤＮＡ塩基によって、３’尾部ではＤＮＡとして合成したＬ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）であった。これら二つの捕捉プローブを、同じｒＲＮＡ標的を用い、ただし、別々に、反応当たり、１、２、５、１０、１５、２０、３０、および６０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブを用い、ＲＴで１０分インキュベートして試験した。表１０に示す、これらの試験結果は、反応当たり約１５−３０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブが使用された場合、捕捉はもっとも効率的であり、バックボーンに２’−メトキシ結合を有する捕捉プローブの方が、ＤＮＡおよびＬＮＡ残基を有する立体配座よりもやや効率的であることを示す。
Figure 2018174941
第２組の試験では、５’部分においてＲＮＡ塩基および２’−メトキシ結合によって合成された立体配座（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）を有する非特異的捕捉プローブを、５’部分においてＤＮＡおよびＬＮＡを、ただし、Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１９）として含む立体配座と比較した。いずれのプローブも３’ＤＮＡ尾部を含んでいた。捕捉プローブを、反応当たり、１、２、５、１０、１５、２０、４０、および６０ｐｍｏｌｅで使用し、ＲＴで１５分インキュベーションしたことを除いては、反応は、本実施例の第１組試験の記載とほぼ同様に行った。これらの試験の結果を表１１に示す。これらの結果から、いずれの立体配座も、ＲＮＡ標的を効率的に捕捉するが、試験した濃度範囲の最低部分では、ＬＮＡ含有捕捉プローブの方が、捕捉がやや効率的に行われることが示された。
Figure 2018174941
別の一組の試験が、二つの異なる濃度の、ＤＮＡおよびＬＮＡ残基を含むＫ１８捕捉プローブを用い同様にして行われた。一方の立体配座は、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）であり、他方は、Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１９）であり、反応当たり、０、１、２、５、１０、１５、２０、４０、および６０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブを用い、ＲＴで１０分インキュベートして前述のように試験した。この二つの立体配座による標的捕捉は、１−６０ｐｍｏｌｅ範囲において同様に実行されたが（配列番号１８プローブでは１５から５０％捕捉、配列番号１９プローブでは２１から６５％捕捉）、捕捉は、反応当たり、１５−４０ｐｍｏｌｅ範囲のプローブにおいて、もっとも効率的であった（第１プローブでは４５から５０％、第２プローブでは５８から６５％）。別の試験で、同じ標的ｒＲＮＡ、および同じ範囲の量の捕捉プローブを用いたが、ただしＲＴで２５分インキュベートした。これらの試験では、１−６０ｐｍｏｌｅ範囲では、配列番号１８プローブは、１６から８７％の標的を捕捉したが、配列番号１９プローブは、２７から１００％の標的を捕捉し、いずれのプローブにおいてももっとも効率的捕捉は、１０−６０ｐｍｏｌｅ範囲に見られた。
非特異的ｋ１８捕捉プローブ（配列番号１１）、共に、２’−メトキシ結合を有する非特異的５’領域、および３’ＤＮＡ尾部から成る、二つの異なる立体配座を用いて、同様の一組の試験を実行した。一つは、ＲＮＡ塩基（等モルのＧおよびＵ、配列番号２０）、および、一つは、ＤＮＡ塩基（等モルのＧおよびＴ、配列番号１４）によって合成した。反応当たり、０、１、２、５、１０、１５、２０、３０、および６０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブを用い、ＲＴで１０分インキュベートして前述のように試験した。この二つの捕捉プローブによる捕捉は、１−６０ｐｍｏｌｅ範囲では同様に実行されたが（Ｇ／Ｕプローブでは１５から８５％捕捉、Ｇ／Ｔプローブでは２１から９０％捕捉）、捕捉は、反応当たり、１５−３０ｐｍｏｌｅ範囲のプローブにおいて、もっとも効率的であった（Ｇ／Ｕプローブでは７８から８５％、Ｇ／Ｔプローブでは８６から９０％）。
（ＧＵ）９−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２１）および（Ｇ／Ｕ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２０）で、共に、ＲＮＡ塩基および２’−メトキシ結合を有する５’領域を伴って合成される非特異的プローブを比較するために、同様の試験を行った。この二つの捕捉プローブを、同じ標的ｒＲＮＡについて、別々に、反応当たり、０、１、２、５、１０、１５、２０、４０、および６０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブを用い、ＲＴで２５分インキュベートすることによって試験した。この二つの捕捉プローブによる標的捕捉は、１−６０ｐｍｏｌｅ範囲では同様に実行されたが（配列番号２０プローブでは１７から９６％捕捉、配列番号２１プローブでは７から９１％捕捉）、捕捉は、反応当たり、１０−４０ｐｍｏｌｅ範囲のプローブにおいて、もっとも効率的であった（配列番号２０プローブでは８７から９６％、配列番号２１プローブでは７５から９１％）。
（実施例７）
非特異的捕捉プローブによるＤＮＡ標的の標的捕捉
本実施例は、非特異的標的捕捉プローブが、サンプルから標的ＤＮＡを効率的に捕捉することを示す。標的ＤＮＡは、配列番号２２：ＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＧＴＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＣＡＡＴＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣＣＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＴＡＴＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＴＧＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＴから成る合成１本鎖によるｓｓＤＮＡ、または、配列番号２２のｓｓＤＮＡを、相補的検出プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能な、一部のｓｓＤＮＡ鎖を留める相補鎖（配列番号２３）とハイブリダイズさせることによって作製される、実質的にｄｓＤＮＡのいずれかである。このｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを、標識プローブにハイブリダイズさせることによって標識した（０．０４ｍｌ溶液において２００ｆｍｏｌの標的ＤＮＡを、１ｐｍｏｌｅのＡＥ標識プローブに６０℃で１時間ハイブリダイズさせ、次いで、０．４ｍｌのバッファー水溶液で希釈した）。標的捕捉反応液は、０．２ｍｌのサンプル輸送バッファー、０．２ｍｌの水、および０．１ｍｌの、磁気粒子に固定したポリｄＴを含むＴＣＲ、および、試験対象となる２０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブを含む０．５ｍｌと混合した、プローブ標識標的ＤＮＡの分液（０．０１ｍｌ）を含んでいた。実質的に、実施例１の記載の通りに、この標的捕捉反応液をＲＴで１時間インキュベートし、次いで処理して捕捉複合体をペレット状にし、捕捉複合体を一度洗浄（０．５ｍｌ洗浄液）し、ＲＬＵを検出した。
第１組の試験では、使用される非特異的捕捉プローブは、下記：
（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）、５’部分は、ＲＮＡ塩基および２’−メトキシ塩基によって合成される；
ｄ（ｋ）６−ｄＴ３−ｄ（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１０）、５’部分は、ＤＮＡのみによって合成される；
Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２４）、５’部分は、ＬＮＡおよびＤＮＡとして合成される；および、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２５）、５’部分は、ＬＮＡおよびＤＮＡとして合成される、
の内の全てまたは二つである。陰性コントロールは、同様に処理されるサンプルであるが、標的捕捉反応混合物が捕捉プローブをまったく含まない。これらの試験の結果を表１２に示す。これらの結果は、ｓｓＤＮＡは、非特異的標的プローブによって捕捉することが可能であること、および、プローブの構造は、捕捉効率に影響を及ぼすことを示す。
Figure 2018174941
もう一組の試験では、異なる立体配座の、種々の量（１−４０ｐｍｏｌｅ）のｋ１８捕捉プローブを用いて、ｓｓＤＮＡの標的捕捉を前述のように実行した。一つの立体配座は、２’−メトキシＲＮＡ基によって合成される５’非特異的部分、および３’ＤＮＡ尾部を有する、（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１１）であり、もう一つの立体配座は、ＬＮＡおよびＤＮＡ残基で構成される５’非特異的部分、および３’ＤＮＡ尾部を有するＬ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）であった。陰性コントロールは同様に処理されたが、捕捉プローブを含んでいなかった。標的捕捉反応液をＲＴで１０分インキュベートし、残余のアッセイ工程は、前述の通りであった。表１３に示す試験結果から、ＬＮＡ／ＤＮＡ捕捉プローブの方が、ｓｓＤＮＡの非特異的捕捉において、オリゴマーのバックボーンにおいてＲＮＡ残基と２’−メトキシ結合を有するｋ１８捕捉プローブよりも効率的であることが明らかになった。両捕捉プローブにおいて、捕捉は、反応当たり、１５−４０ｐｍｏｌｅ範囲の捕捉プローブで効率的であった。
Figure 2018174941
次の一組の試験では、異なるＬＮＡ／ＤＮＡ立体配座を持つ、二つのｋ１８捕捉プローブを、種々の量（１−６０ｐｍｏｌｅ）の捕捉プローブを用いて試験した。試験した、二つの立体配座は、Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）、およびＬ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１９）であった。標的はｓｓＤＮＡであり、ほぼ前述通りの方法を用い、ＲＴで２０分インキュベートした標的捕捉反応混合物において捕捉した。これらの試験の結果を表１４に示す。この結果は、捕捉効率は、捕捉プローブのＬＮＡ／ＤＮＡ構造に影響されることを示す。
Figure 2018174941
直前に記載した試験と同じ条件を用いて、種々のＬＮＡ／ＤＮＡ立体配座のｋ１８非特異的捕捉プローブを、反応当たり、１−６０ｐｍｏｌｅの捕捉プローブを用い、ｓｓＤＮＡ標的捕捉について試験した。Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）は、１−６０ｐｍｏｌｅ範囲において４から６６％のｓｓＤＮＡを捕捉したが、効率的捕捉（５４−６６％）は、１５−６０ｐｍｏｌｅ範囲において見られた。立体配座Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２６）の捕捉プローブは、１−６０ｐｍｏｌｅ範囲において２から６２％のｓｓＤＮＡを捕捉したが、効率的捕捉（４９−６２％）は、１５−６０ｐｍｏｌｅ範囲において見られた。両プローブとももっとも効率的な捕捉は、４０ｐｍｏｌｅが反応に含まれる場合に見られた。
もう一組の試験では、異なる立体配座の、（ｋ）１２、（ｋ）１８、または（ｋ）２５非特異的配列を有する非特異的捕捉プローブを用いてｓｓＤＮＡ標的を捕捉した。各プローブは、反応当たり２０ｐｍｏｌｅを用い、前述のように個別に試験したが、ただし、ＲＴで３０分インキュベートした。下記の（ｋ）１２捕捉プローブを試験した：
ｄ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２７）、
Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）６−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１５）、および、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）２−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２５）。
この三つの（ｋ）１２プローブを、下記の（ｋ）１８および（ｋ）２５捕捉プローブと比較した：
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１８）、および、
Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号２８、（ｋ）２５プローブ）。
これらの五つの捕捉プローブの内、（ｋ）１８および（ｋ）２５捕捉プローブが、ｓｓＤＮＡの捕捉においてもっとも有効であった（それぞれ、７４％および７７％）。試験した三つの（ｋ）１２プローブの内、ＬＮＡをまったく含まない最初のもの（配列番号２７）は、ＤＮＡ標的捕捉において、有効性が最低であったが（０．５％）、一方、ＬＮＡを含む二つのプローブは、ｓｓＤＮＡの捕捉において、より有効であった（配列番号１５プローブでは１５％、配列番号２５プローブでは４２％）。ｓｓＤＮＡ捕捉について同じ方法を用いて行った、上記およびその他の試験の結果に基づいて、種々のＬＮＡ／ＤＮＡ立体配座のｋ１８非特異的捕捉プローブの相対的効率を、下記のリストに示すように求めた。リストでは、もっとも有効な捕捉プローブを最初に掲げた：（１）Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）３−ｄ（ｋ）３−ｄＴ３ｄＡ３０、（２）Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄ（ｋ）３−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０、（３）Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−Ｌ（ｋ）２−ｄ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０、（４）Ｌ（ｋ）５−ｄ（ｋ）２−Ｌ（ｋ）５−ｄ（ｋ）２−Ｌ（ｋ）４−ｄＴ３ｄＡ３０、および（５）Ｌ（ｋ）１−ｄ（ｋ）５−Ｌ（ｋ）１−ｄ（ｋ）５−Ｌ（ｋ）１−ｄ（ｋ）５−ｄＴ３ｄＡ３０。一般に、ＬＮＡおよびＤＮＡ立体配座の混合体を含む、非特異的捕捉プローブの方が、同じ長さの、ＤＮＡ立体配座を持つ捕捉プローブ、または、非特異部分に２’−メトキシ結合を有するＲＮＡ塩基を用いて合成した捕捉プローブよりも、ｓｓＤＮＡ標的捕捉においてより効率的であった。
（実施例８）
非核酸特異的結合パートナーの使用による非特異的標的捕捉
本実施例は、核酸ではないが、支持体に付着する固定プローブである、第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）を含む非特異的捕捉プローブによる非特異的標的捕捉を実証する。この実証は、ＳＢＰが、標的核酸に対する非特異的結合領域を含むオリゴヌクレオチドに付着するビオチンであり、ＳＢＰ’が、磁気粒子に付着するストレプトアビジンであるモデルシステムを用いて実行した（ストレプトアビジン結合ＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。このモデルシステムは、実施例１および２に記載する通りに調製したｒＲＮＡ標的を使用する。非特異的捕捉プローブは、（ｋ）１８−ｄＴ６−ビオチン（配列番号２９）であり、５’部分はＲＮＡ塩基および２’−メトキシ結合を用い、３’末端にはビオチンを付着させて合成した。標的捕捉反応液は、０．２ｍｌのサンプル輸送バッファー、０．２ｍｌの水、および０．１ｍｌのＴＣＲと混合され、かつ、ビオチンおよびストレプトアビジンの特異的結合対を介して、ストレプトアビジン結合磁気ビーズに特異的に結合する、ビオチン誘導体捕捉プローブを含む、プローブ標識ｒＲＮＡ（実施例１に記載）の分液（０．０１ｍｌ）を含んでいた。この標識捕捉反応液をＲＴで２０分インキュベートし、次いで処理して、実施例１に記載するように捕捉複合体をペレット状にし、ペレット部分を、０．５ｍｌ洗浄液で一度洗浄し、ペレット部分を前述のように分離した。次に、標識ｒＲＮＡに付着するＡＥ標識プローブからの化学発光信号を、実施例１に記載する通りに検出した。上清部分の信号も検出した。これは２４６３１０ＲＬＵであった。この実験の結果を表１５に示す。この表から、特異的結合対を介して支持体に付着する非特異的捕捉プローブによって仲介される標的捕捉は、ＲＮＡ標的を捕捉し、もっとも効率的な捕捉は、約６０−１２０Ｆｇのストレプトアビジン結合粒子を用いた場合に見られることが示される。
Figure 2018174941
第２試験では、前述のものと同じ材料を用いて、標的捕捉混合物をＲＴで２から６０分インキュベートし、次いで、支持体上の複合体を溶液相から分離し、前述の、残余工程を実行することによって、捕捉の時間的変化を検出した。これらの反応は全て、ビオチン誘導体形成捕捉プローブに付着した、１００Ｆｇのストレプトアビジン結合磁気粒子を用いて行った。標的捕捉の時間的進行は、表１６に示す結果によって示される。この結果から、僅か６分でも効率的捕捉があり、最大捕捉は６０分に起こることが示された。
Figure 2018174941

Claims (24)

  1. サンプルから標的核酸を単離するための、非特異的捕捉プローブを含む組成物であって、該非特異的捕捉プローブは、（１）第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と、（２）標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列と、を含み、該オリゴヌクレオチド配列は、少なくとも６のＧＵ単位から構成される非ランダムポリＧＵ配列である、組成物。
  2. 前記ＳＢＰが、ｄＡ ３０ 配列、ｄＴ ３ ｄＡ ３０ 配列、またはｄＴ ３ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ １ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ ２ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ １ 配列であり、ｄは、該配列が標準的ＤＮＡ立体配座を有することを示し、Ｌは、該配列がロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座であることを示し、該ＳＢＰは、支持体に付着した第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記非ランダムポリＧＵ配列が、少なくとも１２核酸塩基の長さである、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記非ランダムポリＧＵ配列が、１以上の標準的ＲＮＡ塩基および結合部、標準的ＤＮＡ塩基および結合部、２’修飾結合部を有するＲＮＡ塩基、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記非ランダムポリＧＵ配列が、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ塩基を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記非ランダム反復（ＧＵ）配列が、少なくとも１８残基の長さである、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記捕捉プローブが、前記支持体に付着する、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記支持体に付着した第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する、前記捕捉プローブに付着した第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）、から構成される特異的結合対を用いて、該捕捉プローブが、該支持体に間接的に付着する、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ＳＢＰとＳＢＰ’が、（ｉ）非核酸成分、または、（ｉｉ）実質的に相補的な核酸配列である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記ＳＢＰ’に特異的に結合する前記ＳＢＰが、（ａ）相補的な核酸配列の対、（ｂ）受容体およびリガンドの対、（ｃ）酵素および基質の対、（ｄ）酵素および補因子の対、（ｅ）酵素および補酵素の対、（ｆ）抗体および抗原の対、（ｇ）抗体断片および抗原の対、（ｈ）糖およびレクチンの対、（ｉ）リガンドおよびキレート剤の対、（ｊ）ビオチンおよびアビジン、（ｋ）ビオチンおよびストレプトアビジン、および（ｌ）ニッケルおよびヒスチジン、から成る群より選択される特異的結合対のメンバーである、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記ＳＢＰが、（ｉ）前記非ランダム反復（ＧＵ）配列の３’側に配されるか、または、（ｉｉ）ｄＴ ３ ｄＡ ３０ もしくはｄＡ ３０ 配列であるか、または、（ｉｉｉ）（ｉ）かつ（ｉｉ）である、請求項２に記載の組成物。
  12. 前記ＳＢＰ’がｄＴ １４ である、請求項２に記載の組成物。
  13. サンプルから標的核酸を単離するための、非特異的捕捉プローブを含む組成物であって、該非特異的捕捉プローブは、（１）ｄＡ ３０ 配列、ｄＴ ３ ｄＡ ３０ 配列、またはｄＴ ３ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ １ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ １ ｄＡ １ ＬＡ ２ ｄＡ ３ ＬＡ １ ｄＡ １ 配列である第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）であって、ｄは、該配列が標準的ＤＮＡ立体配座を有することを示し、Ｌは、該配列がロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座であることを示し、支持体に付着した第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する、ＳＢＰと、（２）標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列と、を含み、該オリゴヌクレオチド配列は、以下：
    （ｉ）ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドを含む、少なくとも１２残基の長さのランダムポリ（ｋ）配列であって、ｋがＧ／Ｔ／Ｕである、ランダムポリ（ｋ）配列；
    （ｉｉ）式Ｎ １−１０ で表される非ランダム配列においてＮがＡ／Ｕ／Ｔ／Ｇ／Ｃである非ランダム配列によって隔てられた、ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドから成る二つのランダムオリゴヌクレオチド配列であって、該二つのランダムオリゴヌクレオチド配列の全長が少なくとも１２残基の長さである、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列；
    （ｉｉｉ）１０個以下のイノシンから成る非ランダム配列、もしくは、１０個以下の５−ニトロインドールから成る非ランダム配列によって隔てられた、ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドから成る二つのランダムオリゴヌクレオチド配列であって、該二つのランダムオリゴヌクレオチド配列の全長が少なくとも１２残基の長さである、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列；
    （ｉｖ）１または２のＣ９スペーサーから成る非ヌクレオチドスペーサーによって隔てられた、ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドから成る二つのランダムオリゴヌクレオチド配列であって、該二つのランダムオリゴヌクレオチド配列の全長が少なくとも１２残基の長さである、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列；
    （ｖ）各ランダムオリゴヌクレオチド配列が、式Ｎ １−１０ で表される非ランダム配列においてＮがＡ／Ｕ／Ｔ／Ｇ／Ｃである非ランダム配列によって、または、１０個以下のイノシンから成る非ランダム配列によって、または、１０個以下の５−ニトロインドールから成る非ランダム配列によって隔てられた、ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドから成る複数のランダムオリゴヌクレオチド配列であって、該複数のランダムオリゴヌクレオチド配列の全長が少なくとも１２残基の長さである、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列；
    （ｖｉ）各ランダムオリゴヌクレオチド配列が、１または２のＣ９スペーサーから成る非ヌクレオチドスペーサーによって隔てられた、ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドから成る複数のランダムオリゴヌクレオチド配列であって、該複数のランダムオリゴヌクレオチド配列の全長が少なくとも１２残基の長さである、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列；ならびに
    （ｖｉｉ）少なくとも６のＧＵ単位から構成される非ランダムポリＧＵ配列
    から成る群より選択される、組成物。
  14. 前記オリゴヌクレオチド配列が、１以上の標準的ＲＮＡ塩基および結合部、標準的ＤＮＡ塩基および結合部、２’修飾結合部を有するＲＮＡ塩基、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記オリゴヌクレオチド配列が、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ塩基を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記捕捉プローブが、前記支持体に付着する、請求項１３に記載の組成物。
  17. 前記支持体に付着した第２特異的結合パートナー（ＳＢＰ’）に特異的に結合する、前記捕捉プローブに付着した第１特異的結合パートナー（ＳＢＰ）、から構成される特異的結合対を用いて、該捕捉プローブが、該支持体に間接的に付着する、請求項１３に記載の組成物。
  18. 前記ＳＢＰとＳＢＰ’が、（ｉ）非核酸成分、または、（ｉｉ）実質的に相補的な核酸配列である、請求項１３または１７に記載の組成物。
  19. 前記非核酸成分が、（ａ）受容体およびリガンドの対、（ｂ）酵素および基質の対、（ｃ）酵素および補因子の対、（ｄ）酵素および補酵素の対、（ｅ）抗体および抗原の対、（ｆ）抗体断片および抗原の対、（ｇ）糖およびレクチンの対、（ｈ）リガンドおよびキレート剤の対、（ｉ）ビオチンおよびアビジン、（ｊ）ビオチンおよびストレプトアビジン、（ｋ）ニッケルおよびヒスチジン、から成る群より選択される、請求項１３または１８に記載の組成物。
  20. 前記ＳＢＰが、（ｉ）前記非ランダム反復（ＧＵ）配列の３’側に配されるか、または、（ｉｉ）ｄＴ ３ ｄＡ ３０ もしくはｄＡ ３０ 配列であるか、または、（ｉｉｉ）（ｉ）かつ（ｉｉ）である、請求項１３に記載の組成物。
  21. 前記オリゴヌクレオチド配列が、ＬＮＡ立体配座および標準的ＤＮＡ立体配座であるヌクレオチドの混合物を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記オリゴヌクレオチド配列が、以下：
    （ｎ） ６ −Ｎｉ ５ −（ｎ） ６ 、ここで“Ｎｉ”は５−ニトロインドールを表す、
    （ｋ） ６ −Ｃ９−Ｃ９−（ｋ） ６ 、ここで“Ｃ９”はＣ９スペーサーを表す、
    （ｋ） ６ −Ｃ９−（ｋ） ６ −Ｃ９−（ｋ） ６ 、ここで“Ｃ９”はＣ９スペーサーを表す、
    （ｋ） １２ 、
    （ｋ） １８ 、
    （ｋ） ２４ 、
    Ｌ（ｋ） ４ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ４ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ４ 、
    Ｌ（ｋ） ３ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ３ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ３ −ｄ（ｋ） ３ 、
    Ｌ（ｋ） ２ −ｄ（ｋ） ４ −Ｌ（ｋ） ２ −ｄ（ｋ） ４ −Ｌ（ｋ） ２ −ｄ（ｋ） ４ 、および
    Ｌ（ｋ） ４ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ４ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ４ −ｄ（ｋ） ３ −Ｌ（ｋ） ４
    から成る群より選択され、ｄは、該配列が標準的ＤＮＡ立体配座を有することを示し、Ｌは、該配列がロックド核酸（ＬＮＡ）立体配座であることを示す、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記オリゴヌクレオチド配列が、前記ランダムポリ（ｋ）配列であるか、あるいは、１〜２個のＣ９リンカーまたは１個の５−ニトロインドールによって隔てられた、ＧおよびＴ／Ｕヌクレオチドから成る二つ以上の６〜２４個のランダム化オリゴヌクレオチド配列から構成され、前記ＳＢＰが、ｄＴ ３ ｄＡ ３０ である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記ＳＢＰ’がｄＴ １４ である、請求項１３に記載の組成物。
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