JP6640290B2 - 核酸の非特異的標的の捕捉方法 - Google Patents
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Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2006年8月17日に出願された仮出願第60/821,078号(この内容は、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
本開示の組成物および方法は、分子生物学に関し、より詳細には、サンプルなどの混合物から核酸を単離するための方法および組成物に関し、標的核酸を混合物の他の成分から分離するために、該方法および組成物は、標的核酸に対し非特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを使用する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
サンプルから標的核酸を単離するための方法であって:
標的核酸を含むサンプルを、該標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から構成される非特異的捕捉プローブ、および、該標的核酸を支持体に連結するための手段と混合する工程であって、該オリゴヌクレオチド配列が:
ポリU配列、
GおよびTヌクレオチド、またはGおよびUヌクレオチドを含むランダムポリ(k)配列、
10個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
10個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
10個以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、および、
少なくとも二つのGU単位から構成される、非ランダムポリGU配列、からなる群より選択される、工程、
該支持体、該標的核酸、および該非特異的捕捉プローブを含む反応混合物を、該捕捉プローブと該標的核酸とが非特異的にハイブリダイズして、該支持体に連結されるハイブリダイゼーション複合体を形成することを可能とするハイブリダイゼーション条件下で、インキュベートする工程、ならびに、
該反応混合物の溶液相から該支持体を分離し、該支持体に連結する該ハイブリダイゼーション複合体を、他のサンプル成分から分離し、それによって該標的核酸を、他のサンプル成分から単離する工程、
を含む、方法。
(項目2)
上記支持体に上記標的核酸を連結するための上記手段が、該支持体に対する上記捕捉プローブの直接的付着である、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記支持体に上記標的核酸を連結するための上記手段が、該支持体に連結される第2特異的結合パートナー(SBP’)に特異的に結合する、上記捕捉プローブに付着する第1特異的結合パートナー(SBP)から構成される特異的結合対である、項目1に記載の方法。
(項目4)
上記SBP’が、上記支持体に連結される固定プローブの一部である、項目3に記載の方法。
(項目5)
上記混合工程が、上記サンプルを、上記捕捉プローブに付着する上記SBP、および上記支持体に連結する上記SBP’と混合することを含み、上記インキュベーション工程が、該SBPおよび該SBP’を結合して、該支持体に上記ハイブリダイゼーション複合体を連結することを含む、項目3に記載の方法。
(項目6)
上記SBPおよび上記SBP’が、実質的に相補的な核酸配列である、項目3に記載の方法。
(項目7)
上記SBPおよび上記SBP’が、非核酸成分である、項目3に記載の方法。
(項目8)
上記非核酸成分が:
(a)受容体およびリガンドの対、(b)酵素および基質の対、(c)酵素および補因子の対、(d)酵素および補酵素の対、(e)抗体および抗原の対、(f)抗体断片および抗原の対、(g)糖およびレクチンの対、(h)リガンドおよびキレート剤の対、(i)ビオチンおよびアビジン、(j)ビオチンおよびストレプトアビジン、および(k)ニッケルおよびヒスチジンからなる群より選択される、項目7に記載の方法。
(項目9)
上記分離工程の後に、上記支持体に連結した上記ハイブリダイゼーション複合体から、他のサンプル成分を除去するための洗浄工程をさらに含み、該洗浄工程は、該支持体に連結する該ハイブリダイゼーション複合体を洗浄液と混合し、次いで、該支持体に連結する該ハイブリダイゼーション複合体を該洗浄液から分離する、項目1に記載の方法。
(項目10)
上記インキュベーション工程が、約25℃において約5分から約90分行われる、項目1に記載の方法。
(項目11)
上記分離工程の後に、他のサンプル成分から単離された上記標的核酸の存在を検出する工程、他のサンプル成分から単離された上記標的核酸に含まれる配列をインビトロで増幅する工程、または、他のサンプル成分から単離された上記標的核酸に含まれる配列を決定する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目12)
支持体に連結する第2特異的結合パートナー(SBP’)に特異的に結合する第1特異的結合パートナー(SBP)、および、標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む、非特異的捕捉プローブであって、該オリゴヌクレオチド配列が:
ポリU配列、
GおよびTヌクレオチド、またはGおよびUヌクレオチドを含むランダムポリ(k)配列、
10個以下のヌクレオチドから成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
10個以下のヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
10個以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基類縁体から成る非ランダム配列によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、二つのランダムオリゴヌクレオチド配列、
非ヌクレオチドスペーサー化合物によって隔てられる、複数のランダムオリゴヌクレオチド配列、および、
少なくとも二つのGU単位から構成される、非ランダムポリGU配列、
からなる群より選択される、非特異的捕捉プローブ。
(項目13)
上記オリゴヌクレオチド配列が、約5から100ヌクレオチド長である、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目14)
上記オリゴヌクレオチド配列が、約12から約25ヌクレオチド長である、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目15)
上記オリゴヌクレオチド配列が:(a)標準的RNA塩基および結合部、(b)標準的DNA塩基および結合部、(c)2’修飾結合部を有するRNA塩基、(d)配列の少なくとも一部が、ロックド核酸(LNA)立体配座であるDNA塩基、(e)一つ以上のヌクレオチド塩基類縁体、(f)一つ以上の脱塩基残基、(g)一つ以上の、非核酸スペーサー化合物、または(h)上記群(a)から(g)から選ばれる要素の組み合わせ、を含む、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目16)
上記塩基類縁体が、標準的DNAまたはRNA塩基対形成と比べた場合、別様の塩基対形成特性を示す、項目15に記載の捕捉プローブ。
(項目17)
上記塩基類縁体が、イノシンまたは5−ニトロインドールである、項目16に記載の捕捉プローブ。
(項目18)
上記オリゴヌクレオチド配列が、LNA立体配座であるヌクレオチド、および標準的DNA立体配座であるヌクレオチドの混合物を含む、項目15に記載の捕捉プローブ。
(項目19)
ポリ(k)塩基が、2’修飾結合部を有するRNA塩基である、項目15に記載の捕捉プローブ。
(項目20)
上記SBP’に特異的に結合する上記SBPが:(a)相補的核酸配列の対、(b)受容体およびリガンドの対、(c)酵素および基質の対、(d)酵素および補因子の対、(e)酵素および補酵素の対、(f)抗体および抗原の対、(g)抗体断片および抗原の対、(h)糖およびレクチンの対、(i)リガンドおよびキレート剤の対、(j)ビオチンおよびアビジン、(k)ビオチンおよびストレプトアビジン、および(l)ニッケルおよびヒスチジン、からなる群より選択される特異的結合対のメンバーである、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目21)
上記オリゴヌクレオチド配列が、該オリゴヌクレオチドの5’末端位置、該オリゴヌクレオチドの3’末端位置、または、リンカー化合物を介して該オリゴヌクレオチドの内部位置において、上記SBPに連結される、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目22)
上記オリゴヌクレオチド配列が、少なくとも一つのランダムポリ(k)6配列を含む、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目23)
上記オリゴヌクレオチド配列が、ランダムポリ(k)12、ポリ(k)18、またはポリ(k)25配列を含む、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目24)
上記オリゴヌクレオチド配列が:
(n)6−U3−(n)6、
(n)6−Ni5−(n)6、ただし“Ni”は5−ニトロインドールを表す、
(k)6−Ni5−(k)6、ただし“Ni”は5−ニトロインドールを表す、
(k)6−C9−C9−(k)6、ただし“C9”は9炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、
(k)6−C9−(k)6−C9−(k)6、ただし“C9”は9炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、
(k)12、
(k)6−U3−(k)6、
(k)6−U6−(k)6、
(k)6−T3−(k)6、
(k)18、
(k)24、
d(GまたはT)18、
L(k)6−dT3−L(k)6、
L(k)4−d(k)2−dT3−L(k)4−d(k)2、
U18、
L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4、
L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3、
(GU)9、
L(k)6−dT3−L(k)6、
L(k)4−d(k)2−dT3−L(k)4−d(k)2、
L(k)2−d(k)4−L(k)2−d(k)4−L(k)2−d(k)4、
d(k)6−dT3−L(k)6、および、
L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4、
からなる群より選択される、項目12に記載の捕捉プローブ。
(項目25)
上記オリゴヌクレオチド配列が、上記SBPである、ホモポリマー核酸配列に対して接合される、項目24に記載の捕捉プローブ。
サンプルから、対象とする標的核酸を単離するための方法であって、標的核酸を含むサンプルを、溶液相においてサンプル中の標的核酸に非特異的にハイブリダイズする捕捉プローブと混合する工程を含む方法が開示される。その場合、捕捉プローブは、好ましくは、ポリG/U配列、またはポリ(k)配列を含むポリマー配列を用いることによって、標的核酸に非特異的にハイブリダイズするポリマーオリゴヌクレオチド配列を含む。捕捉プローブはさらに、好ましくは、支持体に付着される固定プローブに特異的に結合する特異的結合パートナーを介して、それを支持体に付着させるための手段を含む。溶液相において標的核酸および捕捉プローブと、任意に固定プローブ含んでもよい支持体とを含む反応混合物が作製される。この反応混合物は、捕捉プローブが標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、固定プローブが存在する場合は、捕捉プローブと固定プローブの特異的結合パートナー同士の結合を介して固定プローブに特異的に結合する条件下で、インキュベートされる。標的核酸と、支持体に付着する捕捉プローブとを含むハイブリダイゼーション複合体は、反応混合物から分離され、標的核酸を、他のサンプル成分から単離する。
サンプル輸送試薬:110mM ラウリル硫酸リチウム(LLS)、15mM NaH2PO4、15mM Na2HPO4、1mM EDTA、1mM EGTA、pH6.7。
標的捕捉試薬(TCR):250mM HEPES、1.88M LiCl、310mM LiOH、100mM EDTA、pH6.4、および250Fg/mlの常磁性粒子((dT)14オリゴマーを共有的に結合させた、0.7−1.05F粒子、Sera−Mag(商標)MG−CM)。
洗浄液:10mM HEPES、150mM NaCl、1mM EDTA、0.3%(v/v)エタノール、0.02%(w/v)メチルパラベン、0.01%(w/v)プロピルパラベン、および0.1%(v/v)ラウリル硫酸ナトリウム、pH7.5。
ハイブリダイゼーション試薬:100mM コハク酸、2%(w/v)LLS、100mM LiOH、15mM アルドリチオール−2、1.2M LiCl、20mM EDTA、および3.0%(v/v)エタノール、pH4.7。
選択試薬:600mM ホウ酸、182.5mM NaOH、1%(v/v)オクトキシノール(TRITON(登録商標)X−100)、pH8.5またはpH9.2、ハイブリダイズしない検出プローブオリゴマー上のAEラベルを加水分解するため。
検出試薬は、検出試薬I:1mM 硝酸および32mM H2O2、および検出試薬II:1.5M NaOHを含む。これは、AEラベルから化学発光を誘起するためである(米国特許第5,283,174、5,656,744、および5,658,737号を参照されたい)。
RNAの非特異的標的捕捉
本実施例は、RNAの捕捉において、種々の非特異的標的捕捉プローブの効率を明らかにする。試験は、既知量のChlamydia trachomatis rRNA(16Sおよび23S rRNAの混合物)を用いて実行した。捕捉前に、該rRNA中の配列に対して相補的な標識検出プローブにハイブリダイズさせて、その標的rRNAを標識した。典型的には、試験サンプルを調製するために、200fmoleのrRNAを、ハイブリダイゼーション試薬に溶解した1pmoleのAE標識にハイブリダイズさせ(0.04mlにおいて60℃で60分)、次いで、室温(RT)に冷却し、0.3mlのハイブリダイゼーション試薬で希釈した。プローブ標識標的核酸混合物の分液(10Fl)を、0.5mlの実質的に水性の溶液(0.2mlのサンプル輸送試薬、0.2mlの水、および0.1mlの、ポリdT固定プローブを有する50Fgの磁気粒子を含むTCR)、および20pmoleの非特異的捕捉プローブと混合した。標的核酸に対し非特異的捕捉プローブを付着させ、相補的固定プローブに対し非特異的捕捉プローブの3’尾部をハイブリダイズさせるために、この混合物をインキュベートした。反応容器の外側に磁場を印加することによって溶液相から磁気粒子を分離し(ペレット部分)、上清を取り出し、保存した。ペレット部分において付着複合体を有する磁気粒子は、必要に応じて洗浄し(1mlの洗浄液でRTにおいて)、前と同様に、洗浄液から分離してペレット状とした。ペレット部分において複合体を付着させた磁気粒子は、0.1mlのバッファー水溶液に縣濁し、0.1mlの保存上清部分を、別に50Fgの磁気粒子と混合して、信号検出のための比較上清分液とした。60℃で10分間インキュベートして、検出プローブ上の、標的核酸に結合していないAEラベルを加水分解させたペレットと上清サンプルの両方に選別試薬(0.2ml)を加えた。次に続いて、標的核酸に結合したプローブ上に残留するAEラベルから化学発光を誘起するために検出試薬を加え、相対的明度単位(RLU)信号を、光度計(LEADER(登録商標)、Gen−Probe Incorporated)で、ほぼ以前に記載された通りに(米国特許第5,283,174および5,656,744号、Arnoldら、および、米国特許第5,658,737号、Nelsonら、カラム25、27−46行;Nelsonら、1996,Biochem.35:8429−8438、8432ページ)測定した。
(n)6−U3−(n)6dT3dA30(配列番号1)、
(n)6−Ni3−(n)6dT3dA30(配列番号2)、前式において“Ni”は5−ニトロインドールを表し、
(n)6−Ni5−(k)6−(n)6dT3dA30(配列番号3)、前式において“Ni”は5−ニトロインドールを表す、
によって示される。
第2組の試験では、非特異的捕捉プローブは、RNA塩基と2’−メトキシ結合から構成される、5’非特異的標的捕捉配列、および、3’dT3dA30配列を有し、それらは、下記の構造:
(l)12−dT3dA30(配列番号4)、前式において“l”はイノシンを表し、
(k)6−C9−C9−(k)6−dT3dA30(配列番号5)、前式において“C9”は、9炭素非ヌクレオチドスペーサーを表し、
(k)6−C9−(k)6−C9−(k)6−dT3dA30(配列番号6)、前式において“C9”は、9炭素非ヌクレオチドスペーサーを表す、
によって示される。
第3組の試験では、配列番号5および6の、C9含有非特異的捕捉プローブを同様に試験した。ただし、インキュベーションは、60℃で15分、次いでRTで15分とした。これらの実験において、RNA捕捉の効率は、陽性コントロールの79%捕捉、および陰性コントロール(0%捕捉)と比べ、配列番号5の捕捉プローブでは32%、配列番号6の捕捉プローブでは50.7%であった。
RNAの非特異的標的捕捉
本実施例は、標的捕捉インキュベーションを室温で10から30分とすることを除いて、実施例1の記載と実質的に同様に実行されるアッセイにおいて、種々の異なる捕捉プローブを用い、rRNAに対する非特異的標的捕捉の効率を明らかにする。使用した非特異的捕捉プローブは全て、RNA塩基および2’−メトキシ結合、および3’DNA尾部配列を用いて合成した。
(k)12−dT3dA30(配列番号7)、
(k)6−U3−(k)6−dT3dA30(配列番号8)、および、
(k)6−U6−(k)6−dT3dA30(配列番号9)
に示される構造を有する。
第3組の試験では、同じ非特異的捕捉プローブ(配列番号5、7、8、および9)を用いてrRNAの標的捕捉を実行した。ただし、インキュベーションはRT10分で行った。これらの試験の結果を表4に示す。表3のものと比べたこれらの結果から、RTにおけるより長いインキュベーションでは、やや大きな標的捕捉が得られるが、著明な標的捕捉は、RT僅か10分でも起こることが示された。二つのk・6マーを連結するU3を含むプローブと、二つのk・6マーを連結するU6を含むプローブの捕捉効率に関する、表4の結果の比較は、U3スペーサーを有するプローブの方がより効率的であることを示す。上記およびその他の結果に基づくと、一般に、より短いスペーサー(例えば、3nt、または一つのC−9スペーサー)を含む捕捉プローブの方が、同様の構造を持つ、より長いスペーサー(例えば、6nt、または二つの隣接C−9スペーサー)を含むプローブよりも効率的である。
(実施例3)
HIV−1標的RNAの標的捕捉
本実施例は、HIV配列を捕捉するための、二つの異なる非特異的標的捕捉プローブの使用を示す。これらのプローブは、HIV−1のプロテアーゼコード遺伝子およびRT4遺伝子の部分に対応する合成RNA配列であった。試験は、両標的核酸に対し個別に行った。すなわち、クローンされたプロテアーゼおよびRT4配列から調製される、既知量のインビトロRNA転写体(681ntプロテアーゼ転写体、および471ntRT4転写体)を用い、これらを、捕捉される前に、標的rRNA中の配列に対して相補的な標識検出プローブに、特異的、個別的にハイブリダイズさせた。試験サンプルを調製するために、200fmoleの標的RNAを、ハイブリダイゼーション試薬に溶解したAE標識検出プローブと特異的にハイブリダイズさせ(0.04mlにおいて60℃で60分)、室温(RT)に冷却し、0.3mlのハイブリダイゼーション試薬で希釈した。このプローブ−標識標的RNA混合物の分液(10Fl)を、0.5mlの実質的に水性の溶液(0.2mlのサンプル輸送試薬、0.2mlの水、および0.1mlの、ポリdT固定プローブを有する50Fgの磁気粒子を含むTCR)、および20pmoleの非特異的捕捉プローブと混合した。標的核酸に対し非特異的捕捉プローブを付着させ、固定プローブに対し捕捉プローブの3’尾部をハイブリダイズさせるために、この混合物をRTで30分インキュベートした。磁場を印加することによって溶液相から、複合体を付着させた磁気粒子(ペレット部分)を分離し、上清を保存した。ペレット部分を洗浄し(0.5mlのサンプル輸送試薬でRTにおいて)、前と同様に分離してペレット部分を作製し、これを、RLUの検出のために、0.1mlのバッファー水溶液と混合した。RLU検出のために、保存上清の一部(0.1ml)を50Fgの磁気粒子と混合した。RLU検出のための各混合物に、選択試薬(0.2ml)を加え、混合物を60℃で10分間インキュベートし、次いで、検出試薬と混合し、実施例1に記載の通りに化学発光(RLU)の検出を行った。
(実施例4)
非特異的捕捉プローブを用いる標的捕捉の反応速度
本実施例は、非特異的捕捉プローブを用いる標的捕捉が、RTにおいて効率的で、顕著な捕捉が、僅か2−5分で起こることを示す。これらの試験は、種々の期間(1−60分)インキュベーションしたことを除き、実質的に、実施例2に記載する通りに行った。インキュベーション後、ペレット部分を単離し、捕捉標的RNAからの信号(RLU)を測定し、標的捕捉の相対的効率の継時変化を求めた。
第2組の試験では、第1組試験と同じ非特異的捕捉プローブ、および、(G/T)18−dT3dA30(配列番号14)で示されるように、ランダムなGおよびT塩基から成る18−nt部分を含み、2’−メトキシ結合および3’DNA尾部を伴って合成された、もう一つの非特異的捕捉プローブを用いて、同じrRNA標的を捕捉した。この標的捕捉混合物は、RTで5および60分インキュベートされ、次いで、そのペレット部分が単離され、信号が測定された。同様に処理されるが、捕捉プローブを含まない陰性コントロールは、ペレット部分において、5分のインキュベーション後1078RLU、60分のインキュベーション後2160RLUを与えた。非特異的捕捉プローブを用いて実行した反応の試験結果を表7に示す。この結果から、最大捕捉は、60分のインキュベーション後に観察されるが、RT5分のインキュベーション後でも顕著な捕捉が観察されることが明らかにされた。
第3組の試験では、ランダムG/U配列またはランダムG/T配列のいずれかとして、2’−メトキシ結合を伴って合成される、18−ntの5’部分、および3’DNA尾部を有する非特異的捕捉プローブを用いて、同じrRNA標的を捕捉した。この標的捕捉混合物は、RTで0から50分インキュベートされ、次いで、そのペレット部分が単離され、信号が測定された。これらの試験の結果を表8に示す。この結果から、最大捕捉は、50分のインキュベーション後に観察されるが、RT1−2分のインキュベーション後でも顕著な捕捉が観察され、かつ、全ての時点において、ランダムG/T配列を含む捕捉プローブの方が、ランダムG/U配列を含む捕捉プローブよりも、やや効率的に捕捉することが明らかにされた。
(実施例5)
種々の設計の非特異的捕捉プローブによる標的捕捉
本実施例は、非特異的捕捉プローブの、多くの異なる実施態様が、rRNA標的核酸の捕捉において有効であること、および、アッセイ性能を最適化するために、種々の捕捉プローブの試験の使用が可能であることを明らかにする。本実施例に記載される試験は、標的として検出プローブ標識rRNAを、標的捕捉混合物のRTインキュベーションを用いる点で、実施例2に記載されるやり方とほぼ同様にして実行した。
(k)18−dT3dA30(配列番号11)、5’部分は、RNA塩基および2’−メトキシ塩基によって合成される;
d(k)6−dT3−d(k)6−dT3dA30(配列番号10)、5’部分は、DNAのみによって合成される;
L(k)6−dT3−L(k)6−dT3dA30(配列番号15)、5’部分は、LNAおよびDNAとして合成される;および、
L(k)4−d(k)2−dT3−L(k)4−d(k)2−dT3dA30(配列番号16)、5’部分は、LNAおよびDNAとして合成される、
に記載する通りである。配列番号11の捕捉プローブは、種々の割合のGおよびU塩基(50:50、70:30、および30:70)を用いて合成した。これは、効率的RNA標的捕捉には、どの特定のランダム混合物が好ましいかを決定するためであった。標的捕捉混合物は、別々に、20pmoleの非特異的捕捉プローブを含み、RTで20分インキュベートし、次いで、標的捕捉後、ペレット部分に関連する信号を定量するために、実施例2に記載するように処理した。陰性コントロールは、混合物が捕捉プローブを含まないことを除いては同様に処理したが、上清部分では38267RLUを、ペレット部分では1379RLUを与えた。これらの試験の結果を表9に示す。この結果から、非特異的捕捉プローブの、種々の立体配座の働きは、異なる相対的効率を示すことが明らかにされた。G:U=50:50または30:70となるように合成された、GおよびU塩基のランダムな組み合わせは、G:U=70:30となるように合成されたものよりも、より有効であった(表9の2列目から4列目を比較せよ)。類似の構造を持つが、LNA残基によって作製された捕捉プローブの方が、DNA残基による、対応捕捉プローブよりも有効であった(表9の5列目および6列目を比較せよ)。
本実施例の第1組試験と同じ標的核酸および標的捕捉条件を用いて実行された、第2組の試験では、全て2’−メトキシ結合によって合成された18−nt非特異的領域を含み、全て3’DNA尾部を有する、種々の非特異的捕捉プローブが比較された。k18部分が、50:50、70:30、および30:70比率の混合物を用いて合成される、(k)18−dT3dA30(配列番号11)の捕捉プローブを、U18−dT3dA30(配列番号17)の捕捉プローブと比較した。これらの試験の結果は、標的rRNA捕捉におけるこれらの捕捉プローブの相対的効率を示した。ポリU含有捕捉プローブは、もっとも効率が低く(3.5%捕捉)、G:U=70:30を用いて作製した、ポリk含有捕捉プローブは効率的であり(41%捕捉)、G:U=50:50および30:70を用いて作製した、ポリk含有捕捉プローブはもっとも効率的であった(それぞれ、73%および65%捕捉)。したがって、比較試験は、非特異的標的捕捉のためのプローブ設計を最適化するために使用することが可能である。
種々の量の非特異的捕捉プローブによる標的捕捉
本実施例は、反応に含まれる非特異的捕捉プローブの最適量を決定することによって、標的捕捉反応を最適化することが可能であることを示す。これらの試験は、ほぼ、実施例2に記載される反応混合物および条件を用いて行った。ただし、反応当たり、種々の量(例えば、1−60pmole)の非特異的捕捉プローブを用いた。標的捕捉反応は、RTで10−25分インキュベートし、次いで、ペレット部分を分離し、捕捉効率を、ペレット部分のRLUを検出することによって測定した。
第2組の試験では、5’部分においてRNA塩基および2’−メトキシ結合によって合成された立体配座(k)18−dT3dA30(配列番号11)を有する非特異的捕捉プローブを、5’部分においてDNAおよびLNAを、ただし、L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−dT3dA30(配列番号19)として含む立体配座と比較した。いずれのプローブも3’DNA尾部を含んでいた。捕捉プローブを、反応当たり、1、2、5、10、15、20、40、および60pmoleで使用し、RTで15分インキュベーションしたことを除いては、反応は、本実施例の第1組試験の記載とほぼ同様に行った。これらの試験の結果を表11に示す。これらの結果から、いずれの立体配座も、RNA標的を効率的に捕捉するが、試験した濃度範囲の最低部分では、LNA含有捕捉プローブの方が、捕捉がやや効率的に行われることが示された。
別の一組の試験が、二つの異なる濃度の、DNAおよびLNA残基を含むK18捕捉プローブを用い同様にして行われた。一方の立体配座は、L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−dT3dA30(配列番号18)であり、他方は、L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−dT3dA30(配列番号19)であり、反応当たり、0、1、2、5、10、15、20、40、および60pmoleの捕捉プローブを用い、RTで10分インキュベートして前述のように試験した。この二つの立体配座による標的捕捉は、1−60pmole範囲において同様に実行されたが(配列番号18プローブでは15から50%捕捉、配列番号19プローブでは21から65%捕捉)、捕捉は、反応当たり、15−40pmole範囲のプローブにおいて、もっとも効率的であった(第1プローブでは45から50%、第2プローブでは58から65%)。別の試験で、同じ標的rRNA、および同じ範囲の量の捕捉プローブを用いたが、ただしRTで25分インキュベートした。これらの試験では、1−60pmole範囲では、配列番号18プローブは、16から87%の標的を捕捉したが、配列番号19プローブは、27から100%の標的を捕捉し、いずれのプローブにおいてももっとも効率的捕捉は、10−60pmole範囲に見られた。
非特異的捕捉プローブによるDNA標的の標的捕捉
本実施例は、非特異的標的捕捉プローブが、サンプルから標的DNAを効率的に捕捉することを示す。標的DNAは、配列番号22:CCTCCATTCCGTTACCAACAGAACTGGAGGCGGTACAATGGGTCTTGTCATCCGGTAAAGGCCAAATATACGAGCATCAACATATGTACTTATGTATGTATCTACTATATACATACATATGTACATATATGAATACCATCAGTCTGTGCAGTから成る合成1本鎖によるssDNA、または、配列番号22のssDNAを、相補的検出プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能な、一部のssDNA鎖を留める相補鎖(配列番号23)とハイブリダイズさせることによって作製される、実質的にdsDNAのいずれかである。このssDNAまたはdsDNAを、標識プローブにハイブリダイズさせることによって標識した(0.04ml溶液において200fmolの標的DNAを、1pmoleのAE標識プローブに60℃で1時間ハイブリダイズさせ、次いで、0.4mlのバッファー水溶液で希釈した)。標的捕捉反応液は、0.2mlのサンプル輸送バッファー、0.2mlの水、および0.1mlの、磁気粒子に固定したポリdTを含むTCR、および、試験対象となる20pmoleの捕捉プローブを含む0.5mlと混合した、プローブ標識標的DNAの分液(0.01ml)を含んでいた。実質的に、実施例1の記載の通りに、この標的捕捉反応液をRTで1時間インキュベートし、次いで処理して捕捉複合体をペレット状にし、捕捉複合体を一度洗浄(0.5ml洗浄液)し、RLUを検出した。
(k)18−dT3dA30(配列番号11)、5’部分は、RNA塩基および2’−メトキシ塩基によって合成される;
d(k)6−dT3−d(k)6−dT3dA30(配列番号10)、5’部分は、DNAのみによって合成される;
L(k)6−dT3−L(k)6−dT3dA30(配列番号24)、5’部分は、LNAおよびDNAとして合成される;および、
L(k)4−d(k)2−dT3−L(k)4−d(k)2−dT3dA30(配列番号25)、5’部分は、LNAおよびDNAとして合成される、
の内の全てまたは二つである。陰性コントロールは、同様に処理されるサンプルであるが、標的捕捉反応混合物が捕捉プローブをまったく含まない。これらの試験の結果を表12に示す。これらの結果は、ssDNAは、非特異的標的プローブによって捕捉することが可能であること、および、プローブの構造は、捕捉効率に影響を及ぼすことを示す。
もう一組の試験では、異なる立体配座の、種々の量(1−40pmole)のk18捕捉プローブを用いて、ssDNAの標的捕捉を前述のように実行した。一つの立体配座は、2’−メトキシRNA基によって合成される5’非特異的部分、および3’DNA尾部を有する、(k)18−dT3dA30(配列番号11)であり、もう一つの立体配座は、LNAおよびDNA残基で構成される5’非特異的部分、および3’DNA尾部を有するL(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−dT3dA30(配列番号18)であった。陰性コントロールは同様に処理されたが、捕捉プローブを含んでいなかった。標的捕捉反応液をRTで10分インキュベートし、残余のアッセイ工程は、前述の通りであった。表13に示す試験結果から、LNA/DNA捕捉プローブの方が、ssDNAの非特異的捕捉において、オリゴマーのバックボーンにおいてRNA残基と2’−メトキシ結合を有するk18捕捉プローブよりも効率的であることが明らかになった。両捕捉プローブにおいて、捕捉は、反応当たり、15−40pmole範囲の捕捉プローブで効率的であった。
次の一組の試験では、異なるLNA/DNA立体配座を持つ、二つのk18捕捉プローブを、種々の量(1−60pmole)の捕捉プローブを用いて試験した。試験した、二つの立体配座は、L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−dT3dA30(配列番号18)、およびL(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−dT3dA30(配列番号19)であった。標的はssDNAであり、ほぼ前述通りの方法を用い、RTで20分インキュベートした標的捕捉反応混合物において捕捉した。これらの試験の結果を表14に示す。この結果は、捕捉効率は、捕捉プローブのLNA/DNA構造に影響されることを示す。
直前に記載した試験と同じ条件を用いて、種々のLNA/DNA立体配座のk18非特異的捕捉プローブを、反応当たり、1−60pmoleの捕捉プローブを用い、ssDNA標的捕捉について試験した。L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−dT3dA30(配列番号18)は、1−60pmole範囲において4から66%のssDNAを捕捉したが、効率的捕捉(54−66%)は、15−60pmole範囲において見られた。立体配座L(k)2−d(k)4−L(k)2−d(k)4−L(k)2−d(k)4−dT3dA30(配列番号26)の捕捉プローブは、1−60pmole範囲において2から62%のssDNAを捕捉したが、効率的捕捉(49−62%)は、15−60pmole範囲において見られた。両プローブとももっとも効率的な捕捉は、40pmoleが反応に含まれる場合に見られた。
d(k)6−dT3−L(k)6−dT3dA30(配列番号27)、
L(k)6−dT3−L(k)6−dT3dA30(配列番号15)、および、
L(k)4−d(k)2−dT3−L(k)4−d(k)2−dT3dA30(配列番号25)。
L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−dT3dA30(配列番号18)、および、
L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−dT3dA30(配列番号28、(k)25プローブ)。
非核酸特異的結合パートナーの使用による非特異的標的捕捉
本実施例は、核酸ではないが、支持体に付着する固定プローブである、第2特異的結合パートナー(SBP’)に特異的に結合する第1特異的結合パートナー(SBP)を含む非特異的捕捉プローブによる非特異的標的捕捉を実証する。この実証は、SBPが、標的核酸に対する非特異的結合領域を含むオリゴヌクレオチドに付着するビオチンであり、SBP’が、磁気粒子に付着するストレプトアビジンであるモデルシステムを用いて実行した(ストレプトアビジン結合DYNABEAD(登録商標)、Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。このモデルシステムは、実施例1および2に記載する通りに調製したrRNA標的を使用する。非特異的捕捉プローブは、(k)18−dT6−ビオチン(配列番号29)であり、5’部分はRNA塩基および2’−メトキシ結合を用い、3’末端にはビオチンを付着させて合成した。標的捕捉反応液は、0.2mlのサンプル輸送バッファー、0.2mlの水、および0.1mlのTCRと混合され、かつ、ビオチンおよびストレプトアビジンの特異的結合対を介して、ストレプトアビジン結合磁気ビーズに特異的に結合する、ビオチン誘導体捕捉プローブを含む、プローブ標識rRNA(実施例1に記載)の分液(0.01ml)を含んでいた。この標識捕捉反応液をRTで20分インキュベートし、次いで処理して、実施例1に記載するように捕捉複合体をペレット状にし、ペレット部分を、0.5ml洗浄液で一度洗浄し、ペレット部分を前述のように分離した。次に、標識rRNAに付着するAE標識プローブからの化学発光信号を、実施例1に記載する通りに検出した。上清部分の信号も検出した。これは246310RLUであった。この実験の結果を表15に示す。この表から、特異的結合対を介して支持体に付着する非特異的捕捉プローブによって仲介される標的捕捉は、RNA標的を捕捉し、もっとも効率的な捕捉は、約60−120Fgのストレプトアビジン結合粒子を用いた場合に見られることが示される。
第2試験では、前述のものと同じ材料を用いて、標的捕捉混合物をRTで2から60分インキュベートし、次いで、支持体上の複合体を溶液相から分離し、前述の、残余工程を実行することによって、捕捉の時間的変化を検出した。これらの反応は全て、ビオチン誘導体形成捕捉プローブに付着した、100Fgのストレプトアビジン結合磁気粒子を用いて行った。標的捕捉の時間的進行は、表16に示す結果によって示される。この結果から、僅か6分でも効率的捕捉があり、最大捕捉は60分に起こることが示された。
Claims (9)
- サンプルから標的核酸を単離するための反応混合物であって、該反応混合物は、以下:
a)該標的核酸を含む細胞内成分を溶液相中に放出するように処理された、細胞由来のサンプルと;
b)非特異的捕捉プローブであって、以下:
(i)標的核酸に非特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列であって、GおよびTヌクレオチド、または、GおよびUヌクレオチドからなる、6〜25ヌクレオチドの長さのランダム化ポリ(k)配列であり、ここで、kはG/T/Uである、オリゴヌクレオチド配列、ならびに
(ii)dT3dA3LA1dA3LA1dA1LA1dA1LA1dA3LA1dA3LA1dA1LA1dA1LA2dA3LA1dA1配列である第1特異的結合パートナー(SBP)であって、dは、該配列が標準的DNA立体配座を有することを示し、Lは、該配列がロックド核酸(LNA)立体配座であることを示し、該第1SBPは、第2特異的結合パートナー(SBP’)に特異的に結合する、第1特異的結合パートナー(SBP)
を含む、非特異的捕捉プローブと;
を含み、c)該SBP’が支持体に固定される、反応混合物。 - 前記溶液相が、界面活性剤、または、ラウリル硫酸リチウムおよび水酸化リチウムを含む、請求項1に記載の反応混合物。
- 前記サンプルが末梢血を含む、請求項1に記載の反応混合物。
- 前記オリゴヌクレオチド配列が、1以上の標準的RNA塩基および結合部、標準的DNA塩基および結合部、2’修飾結合部を有するRNA塩基、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の反応混合物。
- 前記オリゴヌクレオチド配列が、LNA立体配座および標準的DNA立体配座であるヌクレオチドの混合物を含む、請求項1に記載の反応混合物。
- 前記オリゴヌクレオチド配列が、12〜25ヌクレオチドの長さである、請求項1に記載の反応混合物。
- 前記SBP’に特異的に結合する前記SBPが、実質的に相補的な核酸配列の対である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記オリゴヌクレオチド配列が、以下:
(k)6、
(k)12、
(k)18、
(k)24、
(k)25、
L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4、
L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3−L(k)3−d(k)3、
L(k)2−d(k)4−L(k)2−d(k)4−L(k)2−d(k)4、および
L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4−d(k)3−L(k)4
から成る群より選択され、dは、該配列が標準的DNA立体配座を有することを示し、Lは、該配列がロックド核酸(LNA)立体配座であることを示す、請求項1に記載の反応混合物。 - 前記SBP’がdT14である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の反応混合物。
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