JP2018166723A - 生体組織の接着方法およびこれに用いる生体組織接着剤調製用キット、並びに生体組織接着用デバイス - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質を含有する生体組織接着剤を用いて生体組織を接着する際の酵素漏出防止効果の低下や接着強度（耐圧性）の低下を抑制しうる手段を提供する。
【解決手段】タンパク質を含有する生体組織接着剤を生体組織に適用することにより前記生体組織を接着する方法において、前記生体組織接着剤を前記生体組織に適用するのと同時またはその後に前記タンパク質に対して加熱処理を施す。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体組織の接着方法およびこれに用いる生体組織接着剤調製用キット、並びに生体組織接着用デバイスに関する。

消化管皮膚瘻は、消化管に穴が開き、その穴が、体外にまで達する病気であって、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、術後縫合不全等（例えば、腸管皮膚瘻、胆汁瘻、膵液瘻）、放射線治療後の合併症（例えば、直腸膣瘻、直腸膀胱瘻）等の多岐の疾病にわたる難治性の疾患である。

なかでも、膵液瘻は、膵臓に瘻孔が生じ、膵液が持続的または断続的に漏出する状態であり、膵臓手術後に高頻度で発生する術後合併症の一つである。また、膵炎（急性または慢性）や外傷によって膵液瘻が発生することもある。

ここで、膵液瘻のような術後縫合不全を原因とする消化管皮膚瘻を予防または治療する方法として、縫合時に密着縫合を行う、膵管ステントを留置するなどの方法のほか、消化管皮膚瘻の瘻管を閉塞するための生体組織接着剤を患部に適用することが行われている。このような生体組織接着剤としては、いわゆる「フィブリン糊」のほか、タンパク質を主成分として含むものが汎用されている。このうち「フィブリン糊」は、主にフィブリノーゲンからなるＡ液と、主にトロンビンからなるＢ液との２液を混合することによって得られる。混合によって、モノマーであるフィブリノーゲンが、トロンビンの触媒作用によって重合し、ポリマーであるフィブリンを形成し、それが糊となって生体組織に接着するのである。フィブリン糊は生体適合性が良好であり、生体内に留置できるという利点を有していることから、手術の際によく使用されている。なお、患部に適用されたフィブリン糊は、生体内で徐々に分解されて縮小し、最終的に体内に吸収される（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。

特開平０２−０７１７４７号公報 特開昭６０−２０４７２５号公報

ここで、膵液は、タンパク質を構成するポリペプチドを切断する消化酵素（エンドペプチダーゼ）であるトリプシンおよびキモトリプシンを含んでいる。このため、膵液瘻の瘻管から漏出したこれらの消化酵素が生体組織接着剤の主成分であるタンパク質（フィブリンなど）と接触すると、当該タンパク質に対しても消化作用を示す結果、生体組織接着剤による酵素漏出防止効果が十分に得られなかったり、フィブリン糊の接着強度（耐圧性）が低下したりするという問題がある。この問題に対する対処として、フィブリン糊等の生体組織接着剤にはアプロチニン等のトリプシン阻害剤が添加する方法などが検討されている。しかしながら、この対処による効果は限定的であり、さらに他の解決手段が求められているのが現状である。

そこで本発明は、タンパク質を含有する生体組織接着剤を用いて生体組織を接着する際の酵素漏出防止効果の低下や接着強度（耐圧性）の低下を抑制しうる手段を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、生体組織接着剤を生体組織に適用した状態で当該接着剤の主成分であるタンパク質を加熱することで、当該接着剤の酵素漏出防止効果の低下や接着強度（耐圧性）の低下が抑制されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の一形態によれば、タンパク質を含有する生体組織接着剤を生体組織に適用することにより生体組織を接着する方法（生体組織の接着方法）が提供される。そして、当該方法は、生体組織接着剤を生体組織に適用するのと同時またはその後に、生体組織接着剤に含有されるタンパク質に対して加熱処理を施すことを含む点に特徴がある。

本発明によれば、タンパク質を含有する生体組織接着剤を用いて生体組織を接着する際の酵素漏出防止の効果の低下や接着強度（耐圧性）の低下を抑制することが可能となる。

後述する実施例１の実験結果を示す写真である。 後述する実施例２の実験結果を示す写真である。 後述する実施例３の実験結果を示す写真である。

以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。

≪生体組織の接着方法≫
上述したように、本発明の一形態は、タンパク質を含有する生体組織接着剤を生体組織に適用することにより前記生体組織を接着する方法であって、前記生体組織接着剤を前記生体組織に適用するのと同時またはその後に前記タンパク質に対して加熱処理を施すことを含む、生体組織の接着方法に関する。以下では、本形態についてより詳細に説明する。

［生体組織接着剤］
生体組織接着剤は、生体組織を接着するのに用いられる剤である。本形態に係る生体組織接着剤は、タンパク質を含有するものであり、好ましくはタンパク質を主成分として（固形分濃度として５０質量％以上）含有するものである。生体組織接着剤の固形分（主として、フィブリノーゲンおよびトロンビン）濃度に対するタンパク質の含有割合は、より好ましくは３０質量％以上であり、さらに好ましくは４０質量％以上である。

タンパク質を含有する生体組織接着剤としては、前記タンパク質がフィブリンである、いわゆる「フィブリン糊」が好ましく用いられる。フィブリン糊は、フィブリンが水等の媒体に分散してなる糊状の分散液である。なお、本明細書において「フィブリン」との語は、フィブリンが血液凝固第ＶＩＩＩ因子等の作用によって架橋された「フィブリン塊」をも包含する概念である。

ここで、市販のフィブリン糊としては、「ボルヒール（ＢＯＬＨＥＡＬ）（登録商標） 組織接着用」や「ベリプラスト（Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ）（登録商標）Ｐ コンビセット 組織接着用」などが知られている。これら市販のフィブリン糊では、フィブリノーゲンを含む組成物とトロンビンを含む組成物とが別々のバイアル中の凍結乾燥物として提供されており、これらをさらに別のバイアルにより提供される溶解液に用時溶解することにより得られるそれぞれの溶解液を患部に適用することによって使用される。本形態に係る生体組織の接着方法は、上述した市販のフィブリン糊を生体組織接着剤として用いることも好ましい実施形態の一つである。すなわち、本形態に係る生体組織の接着方法は、
フィブリノーゲンを含有する組成物Ａと、
トロンビンを含有する組成物Ｂと、
を接触させることにより前記フィブリンを生成させることをさらに含むことが好ましい。

なお、本明細書において「フィブリノーゲン」とは、通常「フィブリノーゲン」とされるものであり、本形態が目的とする生体組織接着剤を得ることができれば、特に制限されず、上述した市販のフィブリン糊により提供されるフィブリノーゲンが好適に用いられうる。また、フィブリノーゲンは、市販の原液をそのまま使用することができるが、適切な水性媒体を用いて溶解および／または分散させて、水性液を作成して使用することもできる。また、本明細書において「トロンビン」とは、通常「トロンビン」とされるものであり、本形態が目的とする生体組織接着剤を得ることができれば、特に制限されず、上述した市販のフィブリン糊により提供されるトロンビンが好適に用いられうる。トロンビンは、市販の原液をそのまま使用することができるが、適切な水性媒体を用いて溶解および／または分散させて、水性液を作成して使用することもできる。

本明細書において、「水性媒体」とは、生体組織接着剤を製造するのに通常使用され、主として水から形成される媒体であって、本形態が目的とする生体組織接着剤を得ることができるものであれば、特に制限されない。そのような水性媒体として、例えば、フィブリノーゲン溶解液およびトロンビン溶解液（化学及血清療法研究所製）等が例示される。また、本形態において、「水性液」とは、本形態に係る種々の成分が、水性媒体に溶解および／または分散した状態であることを意味する。なお、「水」とは、医薬・バイオテクノロジー分野において、一般的に純水または超純水と呼ばれる水であって、通常、イオン交換法、蒸留法、逆浸透膜法、及び（逆浸透＋連続イオン交換法）から選択される少なくとも１種を用いて精製された水をいい、超純水が好ましく、ミリポア社製の超純水装置ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）（商品名）により精製された超純水（いわゆる、ミリＱ水）がより好ましいが、本形態が目的とする生体組織接着剤が得られる限り特に制限されない。一般的に「純水」とは、比抵抗が１ＭΩ・ｃｍ（２５℃）以上、好ましくは３ＭΩ・ｃｍ（２５℃）以上を示す水をいい、「超純水」とは、比抵抗が１５ＭΩ・ｃｍ（２５℃）以上、好ましくは１８ＭΩ・ｃｍ（２５℃）以上を示し、有機物量（ＴＯＣ）が５０ｐｐｂ以下、好ましくは２０ｐｐｂ以下であるものをいう。

フィブリノーゲンの濃さは、生体用接着剤の濃さと関連し、濃い方が接着剤としてより大きな接着力を発揮すると考えられる。また、トロンビンはフィブリノーゲンの重合に関する触媒作用を有することから、濃い場合はフィブリン糊形成が速く、薄い場合はフィブリン糊形成が遅くなる。したがって、本形態に係る生体組織接着剤に求められる性質（例えば、接着強度、固化に要する時間等）に応じて、フィブリノーゲンおよびトロンビンの濃さは、適宜選択されるものである。

組成物Ａおよび組成物Ｂのそれぞれにおけるフィブリノーゲンおよびトロンビンの濃度は特に制限されないが、組成物Ａにおけるフィブリノーゲンの濃度は４０〜８０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。また、組成物Ｂにおけるトロンビンの濃度は２５０〜３００単位／ｍＬであることが好ましい。これらの組成物を生体組織へ適用する際の適用量についても特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうるが、上記の濃度の組成物Ａおよび組成物Ｂを用いる場合には、生体組織１０ｃｍ^２あたり各０．５〜２ｍＬ程度（好ましくは、それぞれ約１ｍＬ）の量を適用すればよい。

フィブリノーゲンとトロンビンとを混合することで得られるフィブリン糊をゲル化させることにより糊として機能させるためには、フィブリン糊のｐＨは５．５より大きく７．０以下の範囲内の値であることが好ましい。フィブリン糊のｐＨをこの範囲に調整する手法について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。

なお、上述したフィブリン糊やその前駆体は、薬学的に許容しうる添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤は、フィブリン糊にそのまま含まれる場合のほか、前駆体に含まれる場合には、上述した組成物Ａおよび／または組成物Ｂに含まれる場合や、組成物Ａおよび組成物Ｂと混合されて用いられる他の組成物に含まれることができる。このような添加剤の例としては、例えば、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、トリプシン阻害剤（アプロチニンなど）、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、界面活性剤、ｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、糖アルコール（グリセロール、マンニトール等）、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。なかでも、血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含むことで強固なフィブリン網を形成可能であるという利点があり、また、アプロチニン等のトリプシン阻害剤を含むことで生成したフィブリンがトリプシン等の消化酵素により消化（分解）されるのを抑制することができる。

以上、タンパク質を含有する生体組織接着剤がいわゆる「フィブリン糊」である場合を例に挙げてその詳細を説明したが、本形態に係る生体組織の接着方法において、生体組織接着剤はフィブリン糊のみに限定されるわけではなく、グルタルアルデヒドを用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を架橋するタイプの生体組織接着剤や、新たに開発される生体組織接着剤が用いられてもよい。なお、グルタルアルデヒドを用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を架橋するタイプの生体組織接着剤の市販品としては、例えば、バイオグルー外科用接着剤が知られている。

［生体組織］
本形態に係る生体組織の接着方法において、生体組織接着剤が適用される生体組織の具体的な部位についても特に制限はなく、生体組織接着剤が従来使用されている部位が好適に採用されうる。そのような適用部位の一例として、例えば、外科手術後の縫合部位、出血部位、骨折片の固定部位、末梢神経や微小血管の吻合部位、腱接着や腱縫合の患部、臓器創傷部の接着部位などが挙げられる。なかでも、本発明の課題がより発生しやすい部位として、消化酵素等のタンパク質分解酵素と接触しうる部位が好ましい。特に、膵臓（タンパク質分解酵素であるトリプシンやキモトリプシンを分泌している）に対する外科手術後の縫合部位が特に好ましく、膵臓癌に対する外科手術後の縫合部位が最も好ましい。言い換えれば、本形態に係る生体組織の接着方法の好ましい実施形態は、膵液瘻を予防および／または治療する方法である。

［加熱処理］
本形態に係る生体組織の接着方法においては、生体組織接着剤に含有されるタンパク質に対して加熱処理を施す点に特徴がある。

加熱処理の具体的な形態について特に制限はなく、生体組織接着剤に含有されるタンパク質の温度を当該タンパク質の変性温度以上とすることができる処理であれば好適に採用されうる。好ましい実施形態において、加熱処理を施された生体組織接着剤に含有されるタンパク質の温度は６０〜１００℃であり、より好ましくは７０〜１００℃であり、さらに好ましくは８０〜９０℃である。本形態に係る生体組織の接着方法によれば、このような加熱処理を施すことにより、生体組織接着剤による接着強度の低下を抑制することが可能となる。加熱処理によって接着強度の低下が抑制されるメカニズムは完全には明らかとはなっていないが、本発明者は、加熱処理によって生体組織接着剤に含まれるタンパク質が変性し、その結果として当該タンパク質のタンパク質消化酵素（トリプシン、キモトリプシンなど）に対する耐性（消化されにくさ）が向上しているのではないかと推定している。なお、このメカニズムは推測に基づくものであり、当該メカニズムの正誤が本発明の技術的範囲に影響することはない。なお、加熱処理を施すことによってフィブリン糊等の生体組織接着剤の消化酵素耐性が向上することは後述する実施例の結果からも明らかである。ここで、当該実施例の結果を確認する前の時点においては、生体組織に適用された生体組織接着剤に対して加熱処理を施すことは、当該接着剤を構成するタンパク質の変性に留まらずこれが劣化したり炭化したりするなどにより酵素漏出防止効果が低下したり、その接着強度（耐圧性）は著しく低下するものと予想されていた。にもかかわらず、実際には加熱処理によってそのような接着強度の低下は確認されず、むしろ消化酵素耐性の向上によって接着強度の低下を抑制する作用が発揮されるという驚くべき現象が観察されたことで本発明は完成されたのである。

加熱処理を施すための手段（加熱手段）についても特に制限はなく、生体組織接着剤に含有されるタンパク質を、例えば上述した好適な温度に加熱することができる手段であれば任意の公知の手段が好適に採用されうる。このような加熱手段としては、例えば、大気圧プラズマ処理装置のほか、火花放電を生じない電気メスが挙げられる。なかでも、フィブリン糊に対してより優れた消化酵素耐性を付与しうるという観点からは、加熱手段として大気圧プラズマ処理装置を採用することが好ましい。

本明細書において、「大気圧プラズマ」とは、真空プラズマや低圧プラズマに対して高い圧力という意味を含めて「大気圧」を象徴的に使用していることから、大気圧を含む前後の圧力範囲を含み、実用的には０．１〜１０気圧程度の範囲のプラズマを意味するものとする。大気圧プラズマを用いて生体組織を処理する際の条件について特に制限はなく、やはり生体組織接着剤に含有されるタンパク質を、例えば上述した好適な温度に加熱することができる条件であればよい。

なお、大気圧（低温）プラズマ処理（照射）を施すための装置に関する技術としては、例えば特開２０１５−７６１４３号公報、特表２０１４−５１９８７５号公報、国際公開第２０１２／００５１３２号パンフレットなどを参照可能である。特に、特開２０１５−７６１４３号公報に記載されているような細い筒状の電極の先端においてプラズマが発生しうる装置を用いることで、例えばφ１ｍｍといった極めて限局された部位のみを加熱することができたり、生体組織の構造が複雑に入り組んだ患部に対してもプラズマ照射による加熱処理を確実に施すことができたりするという利点がある。

また、本明細書において「火花放電を生じない電気メス」とは、いわゆる「ソフト凝固」とも称される処置手法であり、一例としてはＥＲＢＥ社製の電気メス（ＶＩＯシステム シリーズ）に搭載されている「ＳｏｆｔＣｏａｇモード」が例示される。このモードは特殊なモードであり、従来の電気メスとは異なった制御がなされているという特徴がある。すなわち、ＶＩＯシリーズの「ＳｏｆｔＣｏａｇモード」では、設定した出力（Ｗ）に対してピーク電圧が２００Ｖｐ以下となるように制御されていることから、スパーク（火花放電）を発生させることなく生体組織に対して凝固効果をもたらすことができ、この際、電気エネルギーが金属部で熱に変換される結果、装置の表面温度が約６０〜１００℃に制御される。本形態に係る生体組織の接着方法では、このような凝固効果をもたらす際のエネルギーを利用することにより、生体組織接着剤に含有されるタンパク質の温度が例えば上記所定の範囲内の値となるように、当該タンパク質を加熱することができるのである。したがって、「火花放電を生じない電気メス」を用いて加熱処理を行う場合の各種条件についても、生体組織接着剤に含有されるタンパク質の温度が所望の値となるように適宜設定することが可能である（特表２０１３−５４４１２２号公報も参照）。なお、加熱手段としていかなる手段を採用するにしても、装置の熱源の表面温度を確認することが好ましい。このようなモニタリングのための手段としては従来公知の温度センサーを好適に用いることができる。

≪生体組織接着剤調製用キット≫
本発明の他の形態によれば、上述した本発明の一形態に係る生体組織の接着方法に用いられる生体組織接着剤調製用キットとして、上述した「フィブリノーゲンを含有する組成物Ａ」と、「トロンビンを含有する組成物Ｂ」とを必須成分として含むキットもまた、提供される。生体組織接着剤調製用キットは、組成物Ａおよび組成物Ｂに加えて、これらを溶解するための溶解液やその他の添加剤、取扱説明書、包装容器などをさらに含んでもよい。組成物Ａおよび組成物Ｂの詳細や、溶解液および添加剤の詳細については上述した通りであるため、ここでは詳細な説明を省略する。

≪生体組織接着用デバイス≫
本発明のさらに他の形態によれば、生体組織接着用デバイスもまた、提供される。

当該デバイスは、まず、生体組織に適用されて前記生体組織を接着するのに用いられるタンパク質を含有する生体組織接着剤の前駆体を含有する生体組織接着剤調製用キットを含んでいる。ここで、生体組織接着剤調製用キットの構成としては、上述した形態に係る生体組織接着剤調製用キットの構成が同様に採用されうる。

また、当該デバイスは、前記生体組織接着剤を前記生体組織に適用するのと同時またはその後に前記タンパク質に対して加熱処理を施すのに用いられる加熱手段をさらに含んでいる。ここで、加熱手段としては、生体組織接着剤に含有されるタンパク質を、例えば上述した好適な温度に加熱することができる手段であれば任意の公知の手段が好適に採用されうる。このような加熱手段の例としては、上述した形態に係る生体組織の接着方法の欄において説明した大気圧プラズマ処理装置や火花放電を生じない電気メスが挙げられる。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。

［実施例１：いわゆるソフト凝固によるフィブリン糊の加熱処理］
まず、生体組織接着剤であるフィブリン糊を調製するための調製用キットとして、「ボルヒール（ＢＯＬＨＥＡＬ）（登録商標） 組織接着用」を準備した。次いで、添付の取扱説明書に従ってＡ液およびＢ液をそれぞれ調製した。

次いで、ポリプロピレン製シャーレを準備し、上記で調製したボルヒールのＡ液２００μＬを当該シャーレ内に滴下した後に、その滴下されたＡ液の上にＢ液２００μＬを滴下し、フィブリン塊を形成した。

そして、本実施例においては、いわゆる「ソフト凝固」を模した加熱手段を用いて、上記で形成されたフィブリン塊に対して加熱処理を行った。具体的に、当該加熱手段としては、温度コントローラーによって温度を制御可能な棒状（φ５ｍｍ）のヒーター（Ｃ３６０４（快削黄銅二種）製、テフロン（登録商標）コート）を用いた。なお、当該加熱手段におけるヒーターの設定温度を６０〜１４０℃の範囲で変化させたところ、ヒーターの表面温度は４０〜７０℃の範囲で線形的に変化した。ヒーターの表面温度は加熱処理を施された生体組織の温度と同視できることから、本実施例においては、ヒーターの表面温度が６０〜７０℃の範囲となるように、加熱処理の際のヒーターの設定温度を１１０〜１３０℃の範囲とした。なお、この加熱処理は、フィブリン塊の半分の領域において表裏の両面に施した。

一方、炭酸水素ナトリウム１．５ｇおよびパンクレアチン（ブタ由来）１．０ｇをＲＯ水１００ｍＬに添加して溶解させた溶液を１０ｍＬ分取し、これにパンクレアチン０．３ｇをさらに添加して溶解させることにより疑似膵液を調製した。当該疑似膵液におけるパンクレアチン濃度は４ｗ／ｖ％であり、炭酸水素ナトリウム濃度は１．５ｗ／ｖ％であった。このようにして調製した疑似膵液５〜６ｍＬを、上記加熱処理の直後に、当該加熱処理を施したフィブリン塊の入ったシャーレに入れた。これにより、加熱処理を施した半分の領域と、加熱処理を施していない残り半分の領域との間で、疑似膵液に対する消化酵素耐性を評価した（図１の上段を参照）。なお、本実験において環境温度はオーブン環境温度４０℃に維持した。

その結果、図１の下段の左の写真（加熱処理後０分）、中央の写真（加熱処理後３０分）、右の写真（加熱処理後４５分）の推移からわかるように、加熱処理を施した領域は加熱処理の４５分後であっても疑似膵液による消化を受けることなくフィブリン塊が残存した（写真で白く観察される領域；３０分および４５分の写真ではフィブリン塊が１８０°回転している）。一方、加熱処理を施していない領域は疑似膵液による消化を受けたことから、もはやフィブリン塊としては残存していないことがわかる。これによって、加熱処理を施すことでフィブリン塊の消化酵素に対する耐性を向上させうることが実証された。

［実施例２：大気圧プラズマ照射によるフィブリン糊の加熱処理］
本実施例では、実施例１とは異なり、ソフト凝固に代えて特開２０１５−７６１４３号公報に記載されているプラズマ発生装置（大気圧プラズマ照射装置である）を用いて、以下の照射条件によりフィブリン塊に対する加熱処理を行った。

（大気圧プラズマ照射条件）
・入力電源：ＡＣ１００Ｖ±５Ｖ ５０／６０Ｈｚ
・高圧電源電圧：８〜１０ｋＶｏ−ｐ
・高圧電源電流：２５〜３１ｍＡ（最大）
・使用ガス：ヘリウム（Ｈｅ）ガス
・ガス流量：２〜３Ｌ／分。

この方法では、まず、サーミスタの金属素子にプラズマを照射させ、プラズマの温度を測定した。測定結果から、同一箇所に１０〜３０秒間照射させた場合、６０〜１００℃の範囲に温度が推移するものであった。そして、次に、フィブリン塊の温度上昇を考慮して、同一箇所に照射が集中しないように、フィブリン塊に対して均一になるように動かしながら、同じ条件のプラズマを照射した（プラズマフレアの直径：１ｍｍ）。このとき、フィブリン塊が白く変性することにより、フィブリン塊にプラズマが均一に照射されていることを判断した。

ここで、本実施例においてもフィブリン塊の半分の領域において表裏の両面に加熱処理を施したが、その際のプラズマ照射時間は、表裏のそれぞれに対して１２０秒間ずつとした（図２の上段を参照）。

その結果、図２の下段の左の写真（加熱処理後０分）、中央の写真（加熱処理後３０分）、右の写真（加熱処理後４５分）の推移からわかるように、加熱処理を施した領域は加熱処理の４５分後であっても疑似膵液による消化を受けることなくフィブリン塊が残存した（写真で白く観察される領域）。一方、加熱処理を施していない領域は疑似膵液による消化を受けたことから、もはやフィブリン塊としては残存していないことがわかる。これによって、本実施例においても、加熱処理を施すことでフィブリン塊の消化酵素に対する耐性を向上させうることが実証された。

［実施例３：加熱手段の違いが消化酵素耐性に及ぼす影響］
本実施例では、上述した実施例１および実施例２においてそれぞれ採用した加熱手段どうしを比較することで、加熱手段の違いがフィブリン塊の消化酵素耐性に及ぼす影響を評価した。具体的には、シャーレ中の疑似膵液に浸漬させたフィブリン塊の半分の領域において表裏の両面にソフト凝固（実施例１）による加熱処理を施した。一方、残り半分の領域においては表裏の両面に大気圧プラズマ照射（実施例２）による加熱処理を施した（図３の上段を参照）。

その結果、図３の下段の４つの写真（左から加熱処理後０分、３０分、６０分、９０分）の推移を比較すると、加熱処理後３０分まではほとんど違いは確認されなかった一方で、加熱処理後６０分ではソフト凝固を採用した領域がわずかながら疑似膵液の消化を受け、加熱処理後９０分では大気圧プラズマ照射に対してソフト凝固により加熱処理を施した領域の消化が比較的顕著に観察された。ただし、上述した実施例１および実施例２によって加熱処理を施していない場合に対する加熱処理の優位性は明白であり、また、疑似膵液中の消化酵素の濃度は実際の生体組織が曝される環境における濃度よりもかなり高く設定されている。したがって、本実施例の結果によってもソフト凝固による加熱処理の利点が否定されるわけではない。

Claims (10)

1. タンパク質を含有する生体組織接着剤を生体組織に適用することにより前記生体組織を接着する方法であって、
   前記生体組織接着剤を前記生体組織に適用するのと同時またはその後に前記タンパク質に対して加熱処理を施すことを含む、生体組織の接着方法。
2. 前記加熱処理を施された前記タンパク質の温度が６０〜１００℃である、請求項１に記載の方法。
3. 前記加熱処理を、大気圧プラズマ処理装置または火花放電を生じない電気メスを用いて行う、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記タンパク質がフィブリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. フィブリノーゲンを含有する組成物Ａと、
   トロンビンを含有する組成物Ｂと、
   を接触させることにより前記フィブリンを生成させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記組成物Ａにおけるフィブリノーゲンの濃度が４０〜８０ｍｇ／ｍＬであり、
   前記組成物Ｂにおけるトロンビンの濃度が２５０〜３００単位／ｍＬである、
   請求項５に記載の方法。
7. 前記生体組織が、膵臓癌に対する外科手術後の縫合部位である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に用いられる生体組織接着剤調製用キットであって、
   フィブリノーゲンを含有する組成物Ａと、
   トロンビンを含有する組成物Ｂと、
   を含む、生体組織接着剤調製用キット。
9. 生体組織に適用されて前記生体組織を接着するのに用いられるタンパク質を含有する生体組織接着剤の前駆体を含有する生体組織接着剤調製用キットと、
   前記生体組織接着剤を前記生体組織に適用するのと同時またはその後に前記タンパク質に対して加熱処理を施すのに用いられる加熱手段と、
   を含む、生体組織接着用デバイス。
10. 前記生体組織接着剤調製用キットを含み、
    前記生体組織接着剤調製用キットが、
    フィブリノーゲンを含有する組成物Ａと、
    トロンビンを含有する組成物Ｂと、
    を含む、請求項９に記載の生体組織接着用デバイス。