JP2018137091A

JP2018137091A - バイオ燃料電池

Info

Publication number: JP2018137091A
Application number: JP2017029991A
Authority: JP
Inventors: 康司重森; Yasushi Shigemori
Original assignee: Aisin Seiki Co Ltd
Current assignee: Aisin Corp
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2018-08-30
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: JP6926516B2

Abstract

【課題】バイオ燃料電池のアノードの電極触媒である酵素に安定的かつ連続的に燃料を供給し、効率的に燃料から電気エネルギーを取り出すことができるバイオ燃料電池を提供すること。更に、発電効率及び発電持続時間を向上できるバイオ燃料電池を提供すること。
【解決手段】酵素を電極触媒とするアノードと、前記アノードとイオン伝導性を有する隔膜を挟んで対向するカソードを備えるバイオ燃料電池であって、前記アノードが、前記酵素が固定化され、燃料溶液が含浸する多孔質体を備えると共に、水平方向に対して20〜60度傾斜して配置されている、バイオ燃料電池。
【選択図】図１

Description

本発明は、バイオ燃料電池に関する。

近年、酵素や微生物が持つエネルギー変換システムを利用したバイオ燃料電池の開発が進められている。バイオ燃料電池は、生体内のエネルギー変換系を応用した燃料電池であり、電極触媒として生体触媒を使用して、生体触媒による酸化還元反応と電極反応を共役させ電気エネルギーを取り出す発電装置である。バイオプロセスを利用するバイオ燃料電池は、緩和な条件かつ高い選択性を有し、燃料として糖やアルコール等の環境中に存在する多様な物質を利用できるという利点を有する。そのため、安全で環境負荷が小さいことから、携帯型機器や体内埋込型機器等の小型電子機器等の次世代電源としての更なる発展が期待されている。

電極触媒として酵素を利用したバイオ燃料電池の場合、アノード側では燃料の酸化反応により電子とプロトンを生成し、取り出された電子を電極材に伝達する。電子は、外部回路を介して、また、プロトンは電解質層等のプロトン伝導体として構成される隔膜を介してカソード側に輸送され、カソード側では酸素の還元反応が進められる。バイオ燃料電池の燃料としては、グルコース等の糖類や脂質、タンパク質等を利用することができる。これらは、動植物の活動のエネルギーとなる物質であることから、飲料等をバイオ燃料電池の燃料として利用することができる。

例えば、特許文献１には、飲料を飲用と発電用の両方に使用することが可能なバイオ燃料電池が開示されている。特許文献１に記載のバイオ燃料電池は、プロトン伝導体（「隔膜」に相当）を介して対向配置されたアノード及びカソードを含む電池部（「電池セル」に相当）と電池セル内に燃料溶液を供給する燃料供給と、電池セル内の燃料供給部とは反対側に配置され当該電池セル内の燃料溶液を吸収する吸収体部を含んで構成されている。このように構成することにより、電池セル内の燃料溶液は吸収体部に吸収され保持され、発電に使用した後の燃料溶液は燃料供給部から逆流することがない。燃料溶液の逆流が生じないことから、燃料溶液の汚染が生じず、市販の飲料等を飲用と発電用の双方に利用することができるという利点を有する。

また、バイオ燃料電池が長期間にわたって安定して連続的に発電するためには、燃料溶液をアノードに安定的かつ連続的に供給することが要求される。特許文献１のバイオ燃料電池は、アノード等を含む電池セルと反対側に吸収体部を配置し、吸収体部の吸収力を利用することにより燃料溶液の電池セルへの安定的かつ連続的な流れを形成することを試みている。しかしながら、吸収体が配置されるアノードの燃料供給部の反対側は隔膜とカソードが配置されているため、燃料溶液はこれらを容易に透過することはできない。そのため、吸収体は燃料溶液を吸収することは困難であると考えられる。特許文献１に開示のバイオ燃料電池は、燃料溶液を予め吸収させたアノードを電池セルに組み込んで発電を行うことを想定しているものと考えられる。発電中の電池セルへの燃料溶液の供給には適用できないものと考えられ、アノードへの燃料溶液の安定的かつ連続的な供給の面では依然として課題がある。

特許文献２には、燃料溶液が透過可能な負極（「アノード」に相当）集電体と酸化剤が透過可能な正極（「カソード」に相当）集電体との間に形成された空間の内部に、カソードとプロトン伝導体（「隔膜」に相当）、アノードが収納されたコイン型又はボタン型のバイオ燃料電池が開示されている。アノード集電体は、アノード上面に配置することができ、燃料タンク等の燃料保持部を有するものとして構成することができる。このように構成することで、燃料溶液は自然拡散によりアノードに供給することができる。しかしながら、特許文献２のバイオ燃料電池は燃料溶液を自然拡散で供給するものであるが、アノードの燃料消費に伴う燃料溶液の自然対流は小さい。そのため、アノード上の酵素触媒の近傍に存在する燃料が消費されるに留まり、燃料の電気エネルギーへの変換効率が悪いという問題がある。

特許文献３には、プロトン伝導体（「隔膜」に相当）を介して対向配置された一対の負極（「アノード」に相当）及び正極（「カソード」に相当）を含む発電体（「電池セル」に相当）が複数積層された積層体（「電池セルスタック」に相当）を含むバイオ燃料電池が開示され、電池セルスタックとの各電池セルのカソード側には気体のみが通流可能なガス拡散層がカソードに接触配置されている。これにより、バイオ燃料電池のカソード側燃料である大気（酸素）は自然拡散によりカソードに供給される。このように、特許文献３のバイオ燃料電池は、カソード側燃料の安定的かつ連続的供給に関するものである。しかしながら、燃料供給手段は、燃料の態様等に起因しカソード側とアノード側ではその要求される機能が相違するため、特許文献３の技術をアノード側の燃料の供給機構に適用することができない。

特開２０１１−２３８５４１号公報特開２００８−２８２５８６号公報国際公開第２０１３／１３２７０７号公報

そこで、本発明は、バイオ燃料電池のアノードの電極触媒である酵素に安定的かつ連続的に燃料を供給し、効率的に燃料から電気エネルギーを取り出すことができるバイオ燃料電池を提供することを課題とする。更に、発電効率及び発電持続時間を向上できるバイオ燃料電池を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、バイオ燃料電池のアノードを、多孔質体を備えると共に、水平方向に対して所定角度傾斜させることによって、アノードに燃料溶液を自然拡散又は自然対流により安定的かつ長期間にわたって供給できることを見出した。更に、燃料溶液の拡散性の向上により、アノードの電極触媒である酵素は供給された燃料溶液が持つ化学エネルギーを高効率に電気エネルギーに変換することができることを見出すと共に、これにより、発電効率及び発電持続時間を向上できることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成した。

すなわち、上記課題を解決するため、以下の〔１〕〜〔３〕に示す発明を提供する。

〔１〕酵素を電極触媒とするアノードと、前記アノードとイオン伝導性を有する隔膜を挟んで対向するカソードを備えるバイオ燃料電池であって、
前記アノードが、前記酵素が固定化され、燃料溶液が含浸する多孔質体を備えると共に、水平方向に対して20〜60度傾斜して配置されている、バイオ燃料電池。

上記〔１〕の構成よれば、アノードに燃料溶液を供給すると、アノード内部に燃料溶液が含浸し保留され、保留された燃料溶液量はアノード内部で勾配を持って変化している。つまり、重力の働きにより燃料溶液がアノードの傾斜の下端方向に流れるのに対して、毛細管現象により燃料溶液が上端方向に吸い上げられ自然対流が生じることで、アノード内に保留される燃料溶液量が傾斜の上下方向に沿って勾配を形成する。アノードの傾斜の上端部では燃料溶液量が最も少なくなっていることから燃料溶液の自然蒸発が最も活発に生じる。かかる燃料溶液の自然蒸発に従って、毛細管現象により燃料溶液が傾斜の上端方向に吸い上げられる動きが生じる。これにより、アノード内部で燃料溶液の流れが生じ燃料溶液が自然拡散され、結果的に、燃料溶液がアノード内部全体に自然拡散されていく。したがって、本実施形態のバイオ燃料電池は、安定的かつ連続的な運転を実現することができ、発電効率、電圧保持時間及び電池容量を向上することができ、ひいては耐久性を向上することができる。

〔２〕酵素を電極触媒とするアノードと、前記アノードとイオン伝導性を有する隔膜を挟んで対向するカソードを備えるバイオ燃料電池であって、
前記アノード、前記イオン伝導性を有する隔膜、及び、カソードを収納する筐体を備え
前記アノードが、前記酵素が固定化され、燃料溶液が含浸する多孔質体を備えると共に、前記筐体の底面に対して20〜60度傾斜して配置されている、バイオ燃料電池。

上記〔２〕の構成によれば、アノードが筐体に対して位置決めされて配置されることから、アノードの水平方向に対する所定角度の傾斜を好適に維持することができる。これにより、本実施形態のバイオ燃料電池の更なる安定的かつ連続的な運転を実現することができ、発電効率、電圧保持時間及び電池容量を向上することができ、ひいては耐久性を向上することができる。

〔３〕前記燃料溶液が、緩衝液成分としてリン酸塩を含む上記バイオ燃料電池。

上記〔３〕の構成によれば、更に燃料溶液の拡散性を向上させることができる。また、リン酸緩衝液は生物の体液成分であることから、アノード上で電極触媒である酵素の触媒反応を持続的に進めることができる。これにより、本実施形態のバイオ燃料電池の更なる安定的かつ連続的な運転を実現することができ、発電効率、電圧保持時間及び電池容量を向上することができ、ひいては耐久性を向上することができる。

本発明の実施形態のバイオ燃料電池の一例を示す模式図。本発明の実施形態のバイオ燃料電池の一例を示す模式図であり、筐体を含んで構成した例を示す。従来型のバイオ燃料電池の構築と性能評価の検討を行った予備実験例１の結果を示すグラフ。アノードの配置による燃料溶液の消費効率への影響の検討を行った実施例１の結果を示すグラフ。アノードの配置による燃料溶液の消費効率への影響の検討を行った実施例２の結果を示すグラフ。緩衝液成分による燃料溶液の消費効率への影響の検討を行った実施例３の結果を示すグラフ。アノード内部での燃料溶液量の勾配形成による燃料溶液の消費効率への影響の検討を行った実施例４の結果を示すグラフ。アノード内部での燃料溶液量の勾配形成による燃料溶液の消費効率への影響の検討を行った実施例５の結果を示すグラフ。

以下、本発明の実施形態に詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定するものではない。

本発明の実施形態のバイオ燃料電池について、図面を参照して詳細に説明する。図１は、本発明の実施形態のバイオ燃料電池の一例を模式的に示すものである。本発明の実施形態のバイオ燃料電池は、アノード１とカソード２が、隔膜３を挟んで対向するように配置され、アノード１とカソード２は外部回路によって接続されている。アノード１には燃料溶液が供給され、カソード２は大気中の酸素を取り入れられるように構成される。

バイオ燃料電池の最小単位は、アノード１、カソード２、及び隔膜３を少なくとも一組含んだ電池セルであり、図１は、一の電池セルでの例であるが、かかる電池セルを複数個直列に電気的に接続して集積させることにより電池セルスタックを作製することができる。電池セルスタックの形状は、平面状に電池セルを配列した平面形状であってもよいし、電池セルを積み重ねる積層形状であってもよい。

アノード１は、水平方向（X-Y）に対して所定角度（θ）傾斜して配置されている。図１では、アノード１の隔膜３を挟んでカソード２と対向する面が、水平方向に対して所定角度傾斜して配置されているが、かかる配置に限定するものではない。例えば、アノード１の隔膜３を挟んでカソード２と対向する面の中心線が水平方向に所定角度傾斜していればよい。長さの異なる中心線が複数ある場合には長手方向の中心線が水平方向に所定角度傾斜していることが好ましい。したがって、アノード１の何れの面が水平方向に対して傾斜して配置されていてもよく、アノード１が水平面に対してなす角度θがどの地点でも一定であってもよいし、また変化していてもよい。例えば、アノード１が水平方向に対して成す角度θは、20度より大きいことが好ましく、更に好ましくは20〜60度又は20〜90度、特に好ましくは45度とすることができる。

図１では、アノード１は、隔膜３を挟んで対向するカソード２よりも、鉛直上方（Z方向）に位置している。しかしながら、アノード１をカソード２と鉛直方向において同位置、若しくは下方の位置とすることを妨げるものではない。

図１では、カソード２及び隔膜３は、アノード１と略平行に、アノード１と同じ角度で水平方向に対して所定角度傾斜して配置されている。しかしながら、アノード１からのプロトン及び電子の授受を妨げない限りは、カソード２及び隔膜３は、それぞれ水平方向に対して傾斜を有せずに配置されてもよいし、それぞれアノード１とは異なる角度で水平方向に傾斜して配置されていてもよい。

図２は、隔膜３を挟んで対向するアノード１及びカソード２を筐体４内に収納した本実施形態のバイオ燃料電池の一例を模式的に示すものである。アノード１は、筐体４の底面４１に対して所定角度傾斜して配置されている。図２におけるアノード１と筐体４の底面４１に対して成す角度が、図１におけるアノード１が水平方向に対してなす角度θに相当する。

図２では、筐体４を長方体としたが、これに限定するものではない。したがって、筐体４は、立方体や直方体、三角柱、円柱の他、五角形等の多角形を底面４１とする多角柱等の角柱、また、三角錐や四角錐等の錐体、及び球等とすることができる。筐体４の大きさ及び素材についても、特に制限はなく、使用目的等に応じて適宜変更することができる。例えば、素材としては、アクリル、炭素、金属、紙、ビニール、木材等を利用することができる。

以下、各部材について詳細に説明する。

アノード１は、酵素１２を電極触媒として備え、かかる酵素１２の触媒作用により、燃料（基質）から生物エネルギーを取り出し電気エネルギーに変換する反応を行う酵素電極である。図１では、アノード１は、多数の空隙を有する多孔質体の電極材１１の空隙に酵素１２及び電子メディエータ１３が固定された酵素電極として構成されている。酵素１２から取り出された電子は集電体１４に移行する。

アノード１用の酵素１２は、燃料の酸化反応を触媒できる酵素１２であれば特に制限はなく、燃料の種類に応じて適宜選択することができる。酵素１２は単独で、若しくは複数組み合わせて利用することができる。したがって、例えば、任意の酵素１２と、その酵素１２に共役する他の任意の酵素１２とを組み合わせて用いることによって、共役系を構築することもできる。

アノード１用の酵素１２の種類は、例えば、脱水素酵素等の酸化還元酵素の使用が好ましい。酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビル酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、グルコース脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、マンノース脱水素酵素、グリセルアルデヒド脱水素酵素、アラビノース脱水素酵素、キシロース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ピルビル酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ヒドロキシ酪酸脱水素酵素等を例示することができるが、これらに限定するものではない。

また、アノード１用の酵素１２は、補酵素及び補因子要求性の有無についても特に制限はない。したがって、ピロロキノリンキノン（以下、「PQQ」と称する場合がある）依存性酵素や、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「NAD」、又は「NAD^＋」と称する場合がある）、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（「NADP」、又は「NADP^＋」と称する場合がある）依存性酵素等を利用することができるが、これらに限定するものではない。ここで、PQQ依存性酵素は、触媒活性の発揮に補酵素PQQを要求するものである。NAD依存性酵素及びNADP依存性酵素は、触媒活性の発揮に補酵素NAD若しくはNADPを要求するものであり、燃料（基質）を酸化しNAD又はNADPを還元する反応を触媒する。

アノード１用の酵素１２は、燃料の酸化反応を触媒できる限り、その由来も特に制限されない。したがって、天然に存在する生物体から適当なタンパク質の単離精製技術により精製された天然由来のものであってよく、また遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたものあるいは化学的に合成されたものあってもよい。更には、市販品を利用することもできる。

遺伝子工学的手法により製造する場合には公知の方法を利用することができる。具体的には、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作成したDNAをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、生物体由来のゲノムDNA、全RNAから逆転写反応によって合成したcDNA等から所望の酵素をコードする核酸分子を作製することができる。ここで用いられるプローブは、所望の酵素と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて作製することができる。例えば、化学合成法の他、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。

また、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作成したプライマーとして用いるPCRによっても同様に、生物体由来のゲノムDNA、cDNAを鋳型として所望の酵素をコードする核酸分子を作製することができる。PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、所望の酵素をコードする核酸分子の塩基配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、上記プローブと同様にして常法に基づいて作製することができる。化学合成法に基づきプローブ又はプライマーを作製する場合には、合成に先立って標的核酸分子の配列情報に基づいてプローブ又はプライマーの設計を行う。

ここで、相補的とは、プローブ又はプライマーと標的核酸分子とが塩基対合則にしたがって特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プローブ又はプライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。プローブ又はプライマーの長さはGC含量等の標的核酸分子の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件等の多くの因子に依存して決定される。

更に、常法のホスホルアミダイト法等のDNA合成法を利用して、所望の酵素１２をコードする核酸分子を化学的に合成することができる。

そして、得られた核酸分子を用いて、当業者に公知の遺伝子組換え技術により所望の酵素１２を製造することができる。

具体的には、所望の酵素１２をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを宿主に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、利用可能なベクターとしては、外来DNAを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。そして、ベクターは、外来遺伝子がその機能を発現できるように組み込まれ、機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。更に、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。

ベクターへの外来遺伝子の挿入は、例えば、適当な制限酵素で所望の酵素１２をコードする核酸分子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法等を用いることができるが、これに限定されない。

形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、外来遺伝子を効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。

続いて、得られた形質転換体を、導入された核酸分子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養し、所望の酵素１２を製造する。培養は、常法に準じて行うことができ、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。

所望の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。

形質転換体の培養物から、所望の酵素１２を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。精製は、上記形質転換体の培養物から、所望の酵素１２の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、所望の酵素１２が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、単離精製することができる。

また、所望の酵素１２が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。

また、アミノ酸配列が公知である酵素１２については、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、所望の酵素１２のアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより作製することもできる。

更に、アノード１用の酵素１２としては、上記した精製品に限らず、燃料（基質）が持つ化学エネルギーを取り出し電気エネルギーに変換可能な触媒活性を有する限り、微生物、細胞小器官及び細胞等の生物体の形態であってもよい。また、これらの生物体からの粗精製物あってもよい。

アノード１用の酵素１２は、好ましくはグルコース脱水素酵素であり、特に好ましくは、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）NBRC12552株由来のPQQ依存性グルコース脱水素酵素が例示される。当該酵素の配列情報を、配列表の配列番号１（塩基配列）、及び、配列番号２（アミノ酸配列）として示す。

アノード１用の電極材１１は、その内部に燃料溶液を含浸し保留することが可能な微細な空隙を有する多孔質体を備え、外部回路に接続可能で電子を伝達できる導電性の基材である限りは特に制限はない。ここで、電極材１１は、その全部及び一部が多孔質体として構成される。好ましくは、多孔質体の水分保持量は、好ましくは50μL〜100μL / cm³（電極面積）である。例えば、アノード１用の電極材１１は、導電性繊維の集合体として構成することができ、導電性繊維の織布及び不織布等が挙げられる。導電性繊維の材質としては、炭素、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO₂、In₂O₃、WO₃、TiO₂等の導電性酸化物等、当該技術分野で公知の材質の導電性の物質を利用することができる。これらの物質は１種類で利用してもよく、また２種類以上を混合して利用してもよい。好ましくは、カーボンクロス等の炭素繊維の織布やカーボンフェルト等の炭素繊維の不織布等やグラッシーカーボン等の炭素材を利用することができる。導電性基材は単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。その大きさ及び形状、及び厚み等は特に限定されるものではなく、利用目的に応じて適宜調整することができる。

アノード１用の電極材１１は、好ましくは、市販のケッチェンブラック等のカーボンブラックや活性炭の粉末や粒子等の導電性の炭素微粒子を含んで構成してもよい。炭素微粒子は、炭素前駆体と酸化マグネシウム（MgO）前駆体との混合物を焼成し、得られた炭素及びMgO粒子を含む焼成物からMgO粒子を除去することによって得られるMgOを鋳型とした炭素微粒子（メソ孔とこのメソ孔の外郭を構成する炭素質壁を備えた多孔質炭素及びその製造方法が開示される特開2012-188309号公報等を参照のこと）等の多数の微細の空隙を有する多孔質体の炭素微粒子を好ましく利用することができる。空隙はメソ又はマクロスケール程度の空隙として構成され、例えば、平均径が30〜100 nmであることが好ましく、特に好ましくは35〜50 nmとして構成される。このような電極材１１は、例えば、炭素微粒子を適当な溶媒に分散させた分散液を、適当な導電性基材、特には、上記した導電性繊維の集合体に塗布や含浸することにより、調製することができる。分散液は、炭素微粒子を超音波処理等により懸濁させてスラリーとして調製してもよい。また、必要に応じて、結着剤を用いてもよい。塗布の方法としては、スクリーンプリント法、ロールコート法、ドクターブレード法、スピンコート法、スプレーによる噴霧法等を利用することができる。また、電着法を利用することもでき、例えば、炭素微粒子を適当な溶媒に分散させた分散液中に導電性基材と対向電極とを浸漬し、当該導電性基材と対向電極との間に電流を流して導電性基材に炭素微粒子を固定することもでき、必要に応じて結着剤や増粘剤等を用いてもよい。

結着剤は、炭素微粒子を導電性基材に結着させ得る物質であれば、当該技術分野で公知の物質を利用することができる。例えば、ポリテトラフルオロエチレン（以下、「PTFE」と略する）、ポリフッ化ビニリデン（以下、「PVDF」と略する）やポリヘキサフルオロプロピレン等のフッ素系高分子、ポリシロキサン系高分子等を利用することができる。結着剤は１種類を単独で用いてもよいし、又は２種類以上併用してもよい。

アノード１用の電極材１１の大きさ（電極面積及び厚み等）及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。

アノード１用の電極材１１には、好ましくは、酵素１２が固定化されるが、固定化の方法は、当該技術分野で公知の方法の何れを用いて行うことができる。例えば、物理的吸着、共有結合、イオン結合、抗体等の生物化学的特異的結合による担体結合法、２以上の官能基をもつ試薬による架橋法、ゲル内に封入する包括法等によって固定することができる。また、これらを組み合わせてもよく、各々の酵素１２に最適化な酵素固定法を適宜選択することが好ましい。

特に好ましくは、物理的吸着であり、酵素１２を適当な溶媒に溶解又は分散した酵素溶液を電極材表面に接触させることにより行うことができる。例えば、酵素１２は、1〜100mg/mlの濃度で固定化することができ、50μg〜10 mg / cm³（電極面積）で固定化することが好ましい。接触は噴霧、滴下、含浸等の公知の方法で行うことができる。また、スピンコート、スプレー法、スクリーン法、ディップコート、ブレード法等の塗布方法を利用することができる。酵素溶液の作製は、酵素１２を適当な溶媒に溶解又は分散させることによって作製することができる。溶媒は、水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝液成分としては、例えば、リン酸塩、イミダゾール、炭酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）−ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパンスルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせて使用することができる。特に好ましくは、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸塩を緩衝液成分とするリン酸緩衝液を使用することができる。

アノード１用の電極材１１には、酵素１２と共に、酵素１２がその触媒活性を発揮するのに必要な物質を固定化してもよい。例えば、酵素１２の触媒活性の発揮に補酵素等を要求する酵素１２の場合には、活性化に必要な物質を電極材１１上に酵素１２と共に固定化することができる。一方、電極材１１上に酵素１２のみを固定化した場合には、活性化に必要な物質を電極材１１上に固定化された酵素１２に供給する手段を設けてもよい。また、補因子を要求する酵素１２については、固定化される酵素１２は、アポ形態及びホロ形態の別を問わないが、電極反応に際しては活性を発揮できるように構成する必要がある。したがって、アポ形態として電極材１１上に保持した場合には、電極材１１上に固定化された酵素１２に補因子を供給する手段を設ける等、アポ形態の酵素１２を活性型のホロ形態に変換するための手段を設けることが必要となる。更に、前記電極材１１には、触媒反応と電極との間の電子授受を媒介する電子メディエータ１３を酵素１２と共に固定化してもよい。電極材１１に、補酵素や電子メディエータ１３を酵素１２と共に固定化する場合には、これらを酵素溶液に混合して固定化してもよいし、また、別個の溶液として作製し、酵素１２の固定化前、又は、固定化後に電極材１１に固定化してもよい。

例えば、酵素１２がPQQ依存性酵素の場合には、酵素１２の触媒活性の発揮に要求される補酵素であるPQQ、及び電極材１１に電子を伝達する電子メディエータ１３を固定化してもよい。酵素１２がNAD依存性酵素及びNADP依存性酵素の場合には、酵素１２の触媒活性の発揮に要求される補酵素であるNAD又はNADPを、酵素１２と共に電極材１１上に固定化してよい。ここで、NAD又はNADPは、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の燃料の酸化に伴い還元され還元型であるNADH又はNADPHを生成する。したがって、このNADH又はNADPHを酸化して酸化型であるNAD又はNADPに戻すと共に、電子メディエータ１３との電子の授受を媒介するジアホラーゼ等のNADH酸化酵素又はNADPH酸化酵素、及び電極材１１に電子を伝達する電子メディエータ１３を固定化してもよい。

アノード１用の電子メディエータ１３は、酵素１２−電極材１１間での電子移動を媒介できる限り、特に制限はない。例えば、キノン類、フェロセン、フェリシアン化物、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェレドキシン類及びその誘導体等が例示されるが、電極触媒の種類に応じて最適な物質を選択すればよい。例えば、1,4-ナフトキノンや1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルスルフェート（以下、「mPMS」と略する）を用いることができる。

カソード２は、酸素の還元反応を行えるものである限り特に制限はない。したがって、オキシダーゼ等の酸素の還元反応を行う酵素の触媒反応を利用する酵素電極の他、金属の触媒反応を利用する白金等の金属電極等として構成しても良い。

カソード２を酵素電極として構成する場合、カソード２用の酵素は、好ましくは、適当電極材に固定化されている。固定化の方法は、アノード１と同様にして行うことができる。
酵素の種類は、酸素の還元反応を触媒できる限り特に制限はない。酵素は、アノード１と同様に、単独で、若しくは複数組み合わせて利用することができる。

カソード２用の酵素としては、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化還元酵素の利用が好ましいが、これらに限定するものではない。ここで、ビリルビンオキシダーゼは、銅イオンを活性中心に持つマルチ銅オキシダーゼであり、ビリルビンからビルベルジンへの酸化反応を触媒する酵素である。基質から取り出した電子を用いて分子状酸素を電子還元し水分子を生成する反応を触媒するという性質を有することから、バイオ燃料電池のカソード２用の電極触媒としての利用価値が高い酵素である。

また、カソード２用の酵素は、補酵素及び補因子要求性の有無についても特に制限はない。また、その由来も特に制限されない。したがって、天然に存在する生物体から適当なタンパク質の単離精製技術により精製された天然由来のものであってよく、また遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたものあるいは化学的に合成されたものあってもよい。更には、市販品を利用することもできる。

カソード２用の電極材は、外部回路に接続可能で電子を伝達できる導電性基材であれば特に制限はない。導電性基材としては、グラファイト、グラッシーカーボン、カーボンペーパー等のカーボン材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO₂、In₂O₃、WO₃、TiO₂等の導電性酸化物等が例示できるが、これらに限定するものではない。従来公知の材質の導電性基材を使用することができる。また、アノード１用の電極材１１と同様、多孔質体の導電性基材を使用することもできる。

カソード２用の電極材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。

カソード２用の電極材には、アノード１用の電極材１１と同様に、酵素と共に、酵素がその触媒活性を発揮するのに必要な物質を固定化してもよいし、活性化に必要な物質を電極材上に固定化された酵素に供給する手段を設けてもよい。更に、前記電極材には、酵素の触媒反応と電極との間の電子授受を媒介する電子メディエータを酵素と共に固定化してもよい。

カソード２用の電子メディエータは、アノード１用の電子メディエータ１３と同様、酵素−電極材間での電子移動を媒介できる限り、特に制限はない。例えば、2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)（以下、「ABTS」と略する場合がある）等を使用することができる。

隔膜３は、プロトン等を透過できるイオン伝導性を有すると共に、プロトン等のイオン以外の負極側の構成成分及び正極側の構成成分を透過させないという性質を有する限り、その素材及び形状等に制限はない。例えば、セルロース膜等を利用することができ、また、固体電解質膜を利用することができる。固体電解質膜としては、スルホン基、リン酸基、ホスホン基、及びホスフィン基等の強酸基、カルボキシル基等の弱酸基、及び極性基を有する有機高分子等のイオン交換機能を有する固体膜等が例示されるが、これらに限定するものではない。具体的にはセルロース膜、及びテトラフルオロエチレンとパーフルオロ〔２−（フルオロスルフォニルエトキシ）プロピルビニルエーテル〕：tetrafluoroethyleneとperfluoro[2-(fluorosulfonylethoxy)propylvinyl ether]の共重合体であるナフィオン（登録商標）等のパーフルオロカーボンスルホン酸（PFS）系の樹脂膜を利用することができる。

本実施形態のバイオ燃料電池の燃料は、前記アノード１に固定された酵素１２によって進められる酸化還元反応により電子を放出可能な物質であれば特に制限はない。したがって、燃料は、アノード１に固定された酵素１２の種類に応じて適宜選択することができる。燃料は、好ましくは、バイオマス燃料である。バイオマスとは生物由来の資源を意味し、これら自体でもよいが、これらを加工したものが好ましい。

例えば、燃料としては、単糖類、二糖類、多糖類の別を問わず、糖類を使用することができる。単糖類としては、炭素数4のエリトロース、トレオース、エリトルロース、炭素数５のアラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、炭素数６のグルコース、ガラクトース、タロース、マンノース、ソルボース、フルクトース、タガソース、ソルボース等が挙げられる。二糖類としては、マルトース、ラクトース、スクロース等を、また、多糖類としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース等を例示できる。更に、メタノールや、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等のアルデヒド類、アラニンやバリン、ロイシン、グリシン等のアミノ酸、ペプチド、タンパク質類のポリアミノ酸類等が例示されるが、これらに制限するものではない。

燃料は、必要に応じて適当な溶媒に溶解又は混和させた燃料溶液として供給される。溶媒は、好ましくは水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝液成分としては、例えば、リン酸塩、イミダゾール、炭酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）−ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパンスルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせて使用することができる。特に好ましくは、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸塩を緩衝液成分とするリン酸緩衝液を使用することができる。

燃料溶液には、補酵素や補因子等の酵素がその触媒活性を発揮するのに必要な物質、及び電子メディエータ１３等の酵素１２の触媒反応と電極反応と共役させるために必要な物質を含めてもよい。例えば、アノード１の電極触媒としてPQQ依存性酵素を利用する場合には、PQQ、及び適当な電子メディエータ１３等を含んで構成することができる。また、アノード１の電極触媒としてNAD又はNADP依存性酵素を利用する場合には、NAD又はNADP、ジアホラーゼ等のNADH又はNADPH酸化酵素、及び適当な電子メディエータ１３を含んで構成することができる。

燃料溶液は、アノード１に供給される。燃料溶液の供給は、燃料溶液をアノード１に供給できる限り、その形態に制限はない。例えば、本実施形態のバイオ燃料電池は、燃料溶液を貯留する共に、その内部に貯留する燃料溶液をアノード１に供給する燃料溶液貯留空間を設けて構成してもよい。そして、外部から燃料溶液貯留空間に燃料溶液を供給するように構成してもよい。更に、燃料溶液貯留空間に燃料溶液を供給するための供給流路や供給孔、及び負極との接触後の使用済みの燃料溶液を回収し燃料溶液貯留空間から排出する排出流路や排出孔を設けてもよい。バイオ燃料電池の組み立て時に燃料溶液貯留空間に燃料溶液を供給するように構成してもよい。また、燃料溶液貯留空間等を設けず、直接的にアノード１に燃料溶液を供給するように構成してもよい。

更に、本実施形態のバイオ燃料電池は、カソード２に大気中の酸素を採り入れるための空気取り込み口等を設けて形成してもよい。

本実施形態のバイオ燃料電池は、アノード１に燃料溶液が供給されると、アノード１の電極触媒である酵素１２が燃料を酸化し、電子及びプロトンを生成する。そして、電子メディエータ１３等を介して電極材１１にこの電子が伝達される。

続いて、電子は、アノード１から外部回路を通ってカソード２に伝達されることにより、酵素１２によって燃料の持つ化学エネルギーが電気エネルギーに変換される。酵素１２による燃料の酸化反応伴い電子と共に生じたプロトンは隔膜３を通ってカソード２に移行することにより発電を行う。カソード２上では、プロトンが大気から取り込んだ酸素と外部回路を通して移動してきた電子との反応により水を生成する。

本実施形態のバイオ燃料電池は、アノード１が多数の微細な空隙を持つ多孔質体を備えて構成されていると共に、水平方向に対して所定角度傾斜して配置されている。これにより、アノード１に燃料溶液を供給すると、アノード１内部に燃料溶液が含浸し保留され、保留された燃料溶液量はアノード１内部で勾配を持って変化している。詳細には、アノード１内部の燃料溶液量の勾配は、傾斜の上方に向かって減少し、アノード１の傾斜の下端側で燃料溶液の保留量が最も多くなり、上端側で最も少なくなっている。アノード１は、多孔質体を備えることアノード１内部に密な微細な空隙を有することから、毛細管現象により燃料溶液がアノード１の傾斜の上端方向に吸い上げられる。したがって、重力の働きにより燃料溶液がアノード１の傾斜の下端方向に流れるのに対して、毛細管現象により燃料溶液が上端方向に吸い上げられ自然対流が生じることで、アノード１内に保留される燃料溶液量が傾斜の上下方向に沿って勾配を形成する。アノード１の傾斜の上端部では燃料溶液量が最も少なくなっていることから燃料溶液の自然蒸発が最も活発に生じる。かかる燃料溶液の自然蒸発に従って、毛細管現象により燃料溶液が傾斜の上端方向に吸い上げられる動きが生じる。これにより、アノード１内部で燃料溶液の流れが生じ燃料溶液が自然拡散され、結果的に、燃料溶液がアノード１内部全体に自然拡散されていく。このように燃料溶液の拡散性が向上し、かかる拡散性の向上が持続することからアノード１に接触する燃料溶液は順次入れ替わり、アノード１の電極触媒である酵素１２は供給された燃料溶液が持つ化学エネルギーを高効率に電気エネルギーに変換することができる。これにより、本実施形態のバイオ燃料電池が、安定的かつ連続的な運転を実現することができ、発電効率、電圧保持時間及び電池容量を向上することができ、ひいてはバイオ燃料電池の耐久性を向上することができる。

上記した燃料溶液の拡散性は、リン酸緩衝液を燃料溶液の緩衝成分として含ませることにより、促進させることができる。また、リン酸緩衝液は生物の体液成分であることから、アノード１上で酵素１２の触媒反応を持続的に進めることにも役立つ。

本実施形態のバイオ燃料電池では、燃料溶液の供給及び拡散のための動力を要せず、簡便な構成で効率的に燃料溶液の供給及び拡散を行うことができる。これにより、バイオ燃料電池の小型化及びコスト低減を更に図ることができると共に、発電した電力を本来の使用目的に有効活用することができる。

上記したように、本実施形態のバイオ燃料電池は、アノード１内部に多量の燃料溶液が保留する燃料だまりが形成されることから、燃料溶液を効率的に抜き取り、新しい燃料溶液と交換することが可能であるとの利点をも有する。更に、アノード１内部での燃料溶液の拡散性が向上していることから、交換された新しい燃料溶液は、アノード１内部全体に自然拡散され、アノード１上の酵素１２により効率的に電気エネルギーに変換される。また、アノード１から燃料溶液を効率的に抜き取ることができることから、必要に応じて速やかに発電を停止できるとの利点も有する。

更に、本実施形態のバイオ燃料電池は、好ましくは、アノード１は、隔膜３を挟んで対向するカソード２よりも、鉛直上方に位置させるように構成される。このように構成することで、アノード１の隔膜３と接触している面の燃料溶液量が多くなることから、隔膜３を介したカソード２へのプロトンの効率的な移行を行うことができ、発電効率、電圧保持時間及び電池容量を向上することができ、ひいてはバイオ燃料電池の耐久性を向上することができる。

更に、本実施形態のバイオ燃料電池は、アノード１が筐体の底面４１に対して位置決めされて配置することにより、アノード１の水平方向に対する所定角度の傾斜を好適に維持することができる。これにより、本実施形態のバイオ燃料電池の更なる安定的かつ連続的な運転を実現することができ、発電効率、電圧保持時間及び電池容量を向上することができ、ひいては耐久性を向上することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

（予備実験例１）従来型のバイオ燃料電池の構築と性能評価の検討
本予備実験例では、従来型のバイオ燃料電池を構築し、その電池の性能評価を燃料溶液の消費効率（電界率）の観点から検討を行った。

（方法）
一般的に、バイオ燃料電池は、電極材１１、電子メディエータ１３、及び酵素１２等を含んで構成されるアノード１に、緩衝液を含む燃料溶液（例えば、グルコース溶液）を供給して、カソード２反応と組み合わせることで、発電を開始するものである。バイオ燃料電池の電池セルの各構成部材、電池セルの組み立て、及び発電について以下に詳細に説明する。

１．構成部材
（a）電極材
（ａ）−１．アノード１側
多孔質体の炭素微粒子（0.4 g）、20％PVDF溶液（0.8 g、KFポリマー、クレハ・バッテリー・マテリアルズ・ジャパン）、N-メチル-2-ピロリドン（8 ml）を混合し、超音波処理して炭素インクを作製した。ここで、炭素微粒子は、BET比表面積640 m² / g、全細孔容量0.59 mL / g、メソ孔径31 mL / g、ミクロ孔容量0.25 mL / g、かさ密度0.2 g / mLのものを使用した。導電性基材（カーボン繊維：日本カーボンBF-20、4 cm×4 cm）を上記で作製した炭素インクに浸して引き揚げ、60℃で乾熱乾燥させたものを、アノード１側の電極材１１として使用した。

（ａ）−２．カソード２側
上記（ａ）−１．で使用した多孔質体の炭素微粒子（0.4 g）、PTFE（0.4 g、PTFE 6J、三井・デュポンフロロケミカル）、イソプロパノール（8 ml）を混合し、超音波処理して炭素インクを作製した。導電性基材（カーボン繊維：日本カーボンBF-20、4 cm×4 cm）を炭素インクに浸して引き揚げ、60℃で乾熱乾燥させたものを、カソード２側の電極材として使用した。

（ｂ）電子メディエータ
（ｂ）−１．アノード１側
アノード１側の電子メディエータ１３としては1,4-ナフトキノンを使用し、1,4-ナフトキノン溶液（32 mgをアセトニトリル2.0 mlに溶解）を上記（ａ）−１．で作製したアノード１側の電極材１１に滴下して、減圧下で乾燥固定化した。

（ｂ）−２．カソード２側
カソード２側の電子メディエータとしては、2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)（以下、「ABTS」と略する）を使用し、ABTS溶液（20 mgをMilli-Q水2.0 mlに溶解）を上記（ａ）−２．で作製したカソード２側の電極材に滴下して、乾燥固定化した。

（ｃ）酵素
（ｃ）−１．アノード１側
アノード１側の酵素１２として、グルコース脱水素酵素を使用した。配列番号１に示すグルコース脱水素酵素をコードする核酸分子を、大腸菌タンパク質合成系で使う発現プラスミドベクター（pET22b）にクローニングして、大腸菌BL21(DE3)pLysS株に形質転換した。得られた形質転換体をLB培地（200 mL）にて、吸光度OD₆₀₀=0.1になるまで37℃で前培養した。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（isopropyl thio-β-galactoside （以下「IPTG」と略する））を0.05 mM（終濃度）とピロロキノリンキノン（以下、「PQQ」と略する）（1/4カプセル／1L-LB培地 PQQ Caps with Bio PQQ、Life Extension）を添加して、発現誘導を行い、27℃で12時間の本培養を行った。続いて、培養液中の酵素発現菌体を緩衝液（20 mM Tris-HCl（pH 7.4））に懸濁し、界面活性剤（0.4％ Brij-58）を加えて氷中で30分間放置した後、酵素発現菌体を超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（42,000×g）して上澄み液を分取し、上澄み液をアフィニティーカラムにて精製した。具体的には、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製用金属アフィニティー担体TALON（クロンテック）をオープンカラムに適当量充填し、上記で調製した菌体破砕液に終濃度0.3 M NaClを加えてカラムにアプライした。50 mM リン酸カリウム（H7.4）、5 mMイミダゾール、0.3 M NaCl溶液で洗浄後、50 mM リン酸ナトリウム、150 mMイミダゾール、0.3 M NaCl溶液でタンパク質を溶出した。溶出液に含まれる塩類（イミダゾールやNaCl）を除くため、緩衝液（50 mM PIPES（pH 7.4）、1mM CaCl₂）に対して透析し、最終の酵素溶液とした。

（ｃ）−２．カソード２側
カソード２側の酵素として、ビリルビンオキシダーゼ（bilirubin oxidase）（天野エンザイム、診断薬用酵素BO“Amano”3 [BO-3]）を使用した。

２．電池セルの組み立て
上記１．の（ｂ）−１．で電子メディエータ１３を固定化したアノード１側の電極材１１に、上記１．の（ｃ）−１．で作製したグルコース脱水素酵素の最終の酵素溶液（100μl：0.1 mg/cm²、1M リン酸カリウム（pH 7.0））と任意量のグルコースを含浸させた。また、上記１．の（ｂ）−２．で電子メディエータを固定化したカソード２側の電極材に、上記１．の（ｃ）−２．のビリルビンオキシダーゼの溶液（50μl：1.0 mg/cm²、1 Mリン酸カリウム（pH 7.0））を含浸させた。続いて、アノード１とカソード２の間に、隔膜３としてセルロース膜を挟み込んで、アノード１を上部にして電池セルの筐体４の電極部に入れることにより、電池セルを組み立てた。

３．発電
上記２．で組み立てた電池セル（以下、「電池セルＡ」と称する）を、アノード１を上向きに水平に置き、アノード１に燃料溶液（1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を含む、1.6 mLの1.5 Mグルコース溶液）を染み込ませて、電子負荷装置を使用して、一定電流負荷（負荷電流0.62 mA/cm²）時のセル電圧の変化を測定した。

また、アノード１側の電極材１１として、導電性基材に炭素インクに浸さなかった以外は、電池セルＡと同様にして作製したものを使用して組み立てた電池セル（以下、「電池セルＢ」と称する）について、電池セルＡと同様にして一定電流負荷時のセル電圧の変化を測定した。

更に、電子メディエータ１３として1,4−ナフトキノンに代えて同モル数のフェナジン系化合物（1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルスルフェート（以下、「mPMS」と略する）、同仁科学）をMilli-Q水を溶媒とし溶解したものを使用すると共に、アノード１側の電極材１１として、電池セルＢと同様に、導電性基材に炭素インクに浸さなかった以外は電池セルＡと同様にして作製したものを使用して組み立てた電池セル（以下、「電池セルＣ」と称する）について、電池セルＡと同様にして一定電流負荷時のセル電圧の変化を測定した。

（結果）
結果を図３に示し、縦軸はセル電圧（V）を、横軸は発電時間（秒）である。カーボン繊維（カーボンクロス）上に、多孔質体の炭素微粒子の炭素インクを塗布した電極材１１を使用したアノード１の電池セルＡの方が、炭素インクを塗布しなかった電極材１１を使用した電池セルＢよりもセル電圧が高かった。この結果から、多孔質炭素の空隙に酵素１２分子が内包されることで、酵素１２反応による電子伝達（燃料→酵素１２→電子メディエータ１３→電極材１１）の効率が向上したと考えられる。電子メディエータ１３として1,4−ナフトキノンを使用した電池セルＡの方が、電子メディエータ１３としてmPMSを使用した電池セルＣよりもセル電圧は高かった。この結果から、1,4−ナフトキノンはアノード１の電極材１１に固定化されているが、mPMSは水溶性であることから疎水性のカーボン繊維には吸着（固定化）せず、もし、吸着したとしてもその電子メディエータ１３としての機能を失うことからmPMSは固定化されていない状態にあるため、電子メディエータ１３から電極材１１への電子伝達効率が低下したと考えられる。これらの結果より、以下の実施例においては、電池セルＡを用いて検討を行った。

なお、電池セルＡの発電での、燃料溶液の消費効率（電界率）を算定したところ62％となった。算定は以下の通り行った。

作動時間：5.3時間（19,221秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm²× 19,221（秒） = 12.0 C/cm²
グルコースの電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M = 29 C/cm²
βグルコースの含有率は67％より：29 × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：12 / 19.4 × 100 = 62％

更に、本予備実験例では、発電中におけるカソード２の性能低下の有無をも確認した。具体的には、電池セルの電圧変化と同時に、アノード１側にAg|AgCl₂参照電極を入れ、3電極のポテンショスタットでカソード２側の電圧を測定した。カソード２ではなくアノード１へ参照極を入れたのは、隔膜抵抗による測定誤差が無視できないためである。その結果、本測定の間では、カソード２の電圧変化はなく、性能低下が生じないことを確認した。

（実施例１）アノード１の配置による燃料溶液の消費効率への影響の検討−１
本実施例では、アノード１の配置が燃料溶液の消費効率に与える影響について検討を行った。ここでは、アノード１の上向き配置と下向き配置の比較検討を行った。

（方法）
アノード１側の電極材１１は、多孔質体の炭素微粒子を、結着剤を使って炭素繊維（カーボンクロス）に練り込んだものを使用しているため、厚みが0.3 mm程度あり、燃料溶液を0.1 mL/cm²程度保留することが可能である。かかる電極材１１の特性に起因して、アノード１の配置が燃料溶液の消費効率に影響を与えるか否か検討を行った。

具体的には、予備実験例１の電池セルＡの構成で、予備実験例１と同様に、アノード１を上に隔膜３を挟んでカソード２を下にして水平に配置した配置ａと、反対にカソード２を上に隔膜３を挟んでアノード１を下にして水平に配置した配置ｂとを比較した。このように配置した電池セルを、予備実験例１と同様にして、電子負荷装置により一定電流負荷時のセル電圧の変化を測定した。

（結果）
結果を図４に示し、縦軸はセル電圧（V）を、横軸は発電時間（秒）である。カソード２を上にアノード１を下に配置した配置ｂでは、アノード１を上に配置した配置ａに比べて、燃料溶液の消費効率が大幅に低下することが認められた。その要因としては、アノード１を下に配置した配置ｂのアノード１内での燃料溶液の勾配は、燃料の拡散性を低下させていることが推定される。また、アノード１の電極触媒である酵素１２による燃料の酸化反応により生成されたプロトンは、隔膜３を介してカソード２に移行する。このとき、プロトンは燃料溶液中の緩衝液と共に移動するが、配置ｂにおいては隔膜３と接触しているアノード１の上端部の燃料溶液量が局所的に少なくなり、隔膜３を介したカソード２へのプロトンの移行効率が低下していることが推定される。配置aのようにアノード１を上に配置することにより、アノード１の下端部の燃料溶液量が多くなり隔膜３を介したカソード２へのプロトンの移行が円滑に進んでいるものと考えられる。

なお、本実施例における配置ａ及び配置ｂの発電での燃料溶液の消費効率（電界率）を算定したところ、それぞれ68％及び26％となった。算定は以下の通り行った。

配置ａ
作動時間：5.9時間（21,367秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 21,367（秒） = 13.2 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：13.2 / 19.4 × 100 = 68％

配置ｂ
作動時間：2.3時間（8,148秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 8,148（秒） = 5.0 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M× 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：5.0 / 19.4 × 100 = 26％

（実施例２）アノード１の配置による燃料溶液の消費効率への影響の検討−２
本実施例では、実施例１に続き、アノード１の配置が燃料溶液の消費効率に与える影響について検討を行った。ここでは、アノード１の縦向き配置と横向き配置の比較検討を行った。

（方法）
本実施例では、予備実験例１の電池セルＡの構成で、予備実験例１と同様に、アノード１を上に隔膜３を挟んでカソード２を下にして横向きに配置した配置ａ（実施例１の配置ａと同一の配置）と、アノード１、隔膜３を挟んで対向するカソード２を縦向きに配置した配置ｃとを比較した。このように配置した電池セルを、予備実験例１と同様にして、電子負荷装置により一定電流負荷時のセル電圧の変化を測定した。

（結果）
結果を図５に示し、縦軸はセル電圧（V）を、横軸は発電時間（秒）である。アノード１を横向きに配置した配置ａに比べて、縦向きに配置した配置ｃの方が燃料溶液の消費効率が向上することが認められた。縦向きに配置した配置ｃのアノード１内部に保持される燃料溶液量は勾配を持って変化し、上端に向かって減少する。つまり、アノード１の下端側では燃料溶液量が最も多くなり、上端側で最も少なくなっている。アノード１の電極材１１に多孔質の炭素微粒子を利用したことで、電極材１１は密な微細な空隙を多数有していることから、毛細管現象で燃料溶液がアノード１の上端方向に吸い上げられる。したがって、重力の働きにより燃料溶液が下端方向に流れるのに対して、毛細管現象により燃料溶液が上端方向に吸い上げられ自然対流が生じることで、アノード１内に保留される燃料溶液量が上下方向に勾配を形成する。更に、アノード１の上端側では、燃料溶液量が最も少なくなっていることから燃料溶液の自然蒸発が活発に生じ、かかる燃料溶液の自然蒸発に伴い毛細管現象で燃料溶液が上端方向に吸い上げられる動きが生じる。結果的に、燃料溶液がアノード１内部全体に自然に拡散していくことが推定できる。

なお、本実施例における配置ａ及び配置ｃの発電での燃料溶液の消費効率（電界率）を算定したところ、それぞれ69％及び81％となった。算定は以下の通り行った。

配置ａ
作動時間：5.9時間（21,372秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 21,372（秒） = 13.3 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：13.3 / 19.4 × 100 = 69％

配置ｃ
作動時間：7.0時間（25,317秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 25,317（秒）= 15.7 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：15.7 / 19.4 × 100 = 81％

（実施例３）緩衝液成分による燃料溶液の消費効率への影響の検討
本実施例では、緩衝液成分が燃料溶液の消費効率に与える影響について検討を行った。ここでは、上記した実施例２で好適な結果が得られた縦向きにアノード１を配置し、イミダゾールとリン酸カリウムの２種類の緩衝液成分について比較検討した。

（方法）
本実施例では、予備実験例１の電池セルＡの構成で、実施例２と同様に、アノード１、隔膜３を挟んで対向するカソード２を縦向きに配置した（実施例２の配置ｃに相当）。燃料溶液に上記予備実験例１と同様にリン酸カルシウム緩衝液を含ませた条件１と、リン酸カルシム緩衝液に代えてイミダゾール緩衝液（終濃度1 M、pH 7.0）を含ませた条件２について、予備実験例１と同様にして、電子負荷装置により一定電流負荷時のセル電圧の変化を測定した。

（結果）
結果を図６に示し、縦軸はセル電圧（V）を、横軸は発電時間（秒）である。セル電圧が0.1 Vに低下する時間は、イミダゾール緩衝液を含ませた条件２では5.5時間であり、リン酸カルシウム緩衝液を含ませた条件１では7.2時間であった。この結果から、燃料供給のための緩衝液としては、リン酸カルシウム等を緩衝液成分とするリン酸緩衝液の使用が好ましいことが判明した。

また、この結果から、バイオ燃料電池の研究開発において先行他社が標準的に使用しているイミダゾール緩衝液よりも、生物の体液成分でもあるリン酸緩衝液（例えば、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等）を使用することで、酵素１２の触媒反応を持続的に進めることができ、持続して酵素触媒電流を得ることができることが理解できる。更に、実施例２で確認されたアノード１内での保留される燃料溶液量の上下方向の勾配形成、及び、燃料溶液の自然拡散にもリン酸緩衝液は貢献していることが推定できる。

実施例４：アノード１内部での燃料溶液量の勾配形成による燃料溶液の消費効率への影響−１
上記実施例２にて、アノード１の縦向き配置が横向き配置に比べて燃料溶液の消費効率が高いことが判明したことから、本実施例では、アノード１を水平方向に対して45度傾斜させた配置での燃料溶液の消費効率を検討した。

（方法）
上記実施例２でアノード１を縦向き配置とした場合について検討を行い、燃料溶液の消費効率の点で良好な結果が得られた。かかるアノード１の縦向き配置において、アノード１の上端側で燃料溶液量が極端に少なくなり、毛細管現象での燃料溶液の拡散が不十分となることをも想定し、本実施例ではアノード１を水平方向に対して45度傾斜させた配置での燃料溶液の消費効率を検討した。

具体的には、本実施例では、予備実験例１の電池セルＡの構成で、予備実験例１と同様に、アノード１を上に隔膜３を挟んでカソード２を下にして横向きに配置した配置ａ（実施例１及び実施例２の配置ａに相当）と、アノード１と、隔膜３を挟んで対向するカソード２を縦向きに配置した配置ｃ（実施例２の配置ｃに相当）と、アノード１を上に隔膜３を挟んでカソード２を下にすると共に、水平方向に対して45度傾斜させた配置（配置ｄ）を比較した。このように配置した電池セルを、予備実験例１と同様にして、電子負荷装置により一定電流負荷時のセル電圧の変化を測定した。

（結果）
結果を図７に示し、縦軸はセル電圧（V）を、横軸は発電時間（秒）である。それぞれの配置における燃料溶液の消費効率を算定したところ、アノード１を横向きに配置した配置aで69％、縦向きに配置した配置ｃで82％、45度傾斜させた配置ｄでは97％となった。算定は以下の通り行った。

配置ａ
作動時間：5.9時間（21,371秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 21,371（秒） = 13.3 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：13.3 / 19.4 × 100 = 69％

配置ｃ
作動時間：7.1時間（25,775秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 25,775 （秒） = 16.0 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：16.0 / 19.4 × 100 = 82％

配置ｄ
作動時間：8.4時間（30,247秒）
得られた電気量：0.62 mA/cm² × 30,247（秒） = 18.8 C/cm²
ブドウ糖の電気量：0.00015 L/cm² × 2e- × 96,500 C/moL × 1.5 M × 0.67 = 19.4 C/cm²
燃料溶液の消費効率：18.8 / 19.4 × 100 = 97％

これらの結果より、アノード１を水平方向に対して45度傾斜させて配置することで、燃料溶液の消費効率が最大になり、かつ、ほほ完全に消費できることが判明した。また、アノード１を水平方向に45度傾斜させて配置することにより、実施例２で確認されたアノード１の縦置き配置による燃料溶液の拡散性を更に向上させることができ、燃料溶液をアノード１内部全体に円滑かつ効率的に自然拡散できることが理解できる。

また、これらの結果から、バイオ燃料電池のアノード１への燃料溶液の供給では、多孔質体のように毛細管現象により燃料溶液を吸い上げることが可能な構造を有する電極材１１を使用すると共に、アノード１内部で燃料溶液量が変化する勾配を持たせることができるように電池セルや電池セルスタックにおける燃料溶液の供給機構を設計することで、燃料溶液の自然拡散供給が可能となることが理解できる。

実施例５：アノード１内部での燃料溶液量の勾配形成による燃料溶液の消費効率への影響−２
上記実験例４にて、アノード１を水平方向に対して45度傾斜させた配置での燃料溶液の消費効率が非常に高く、燃料溶液をほぼ完全に消費できることが判明したことから、アノード１の水平方向に対する傾斜角度を変化させて、燃料溶液の消費効率への影響を検討した。

（方法）
本実施例では、予備実験例１の電池セルＡの構成で、電極材１１を電極面積9 cm²（3 cm×3 cm）のものを使用し実験を行った。アノード１を上に隔膜３を挟んでカソード２を下にして、水平方向に対して20度（配置ｅ）、30度（配置ｆ）、60度（配置ｇ）、及び90度（配置ｈ：実施例２の縦置き配置した配置ｃに相当）傾斜させた配置を比較した。発電は、このように配置した電池セルを組み立て、アノード１に燃料溶液（1Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）と1.0Mグルコースを含有）を63 μL/cm²で染み込ませて、電子負荷装置を使用して、一定電流負荷（負荷電流0.88 mA/cm²）時のセル電圧の変化を測定した。

（結果）
結果を図８に示し、縦軸はセル電圧（V）を、横軸は発電時間（秒）である。その結果、セル電圧が0.1 Vに低下する時間は、20度傾斜させた配置ｅで7,800秒、30度傾斜させた配置ｆで6,800秒、60度傾斜させた配置ｇで6,200秒、及び90度傾斜させた配置ｈで5,500秒であった。これらの結果より、20度傾斜、30度傾斜、60度傾斜、90度傾斜（縦置き配置）の順で燃料溶液の消費効率が高いことが判明した。このことは、アノード１内部で燃料溶液量が変化する勾配を持たせることができるように電池セルや電池セルスタックにおける燃料溶液の供給機構を設計することで、燃料溶液の自然拡散供給が可能となるとの実施例４の結果を追認するものであった。

本発明は、バイオ燃料電池に関し、バイオ燃料電池が要求されるあらゆる分野、特に、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。特に卓上電卓等の携帯型機器や心臓ペースメーカー等の体内埋め込み式機器等の小型電子機器の電源等への応用が可能である。

アノード１
電極材１１
酵素１２
電子メディエータ１３
集電体１４
カソード２
隔膜３
筐体４
底面４１

Claims

酵素を電極触媒とするアノードと、前記アノードとイオン伝導性を有する隔膜を挟んで対向するカソードを備えるバイオ燃料電池であって、
前記アノードが、前記酵素が固定化され、燃料溶液が含浸する多孔質体を備えると共に、水平方向に対して20〜60度傾斜して配置されている、バイオ燃料電池。
酵素を電極触媒とするアノードと、前記アノードとイオン伝導性を有する隔膜を挟んで対向するカソードを備えるバイオ燃料電池であって、
前記アノード、前記イオン伝導性を有する隔膜、及び、カソードを収納する筐体を備え
前記アノードが、前記酵素が固定化され、燃料溶液が含浸される多孔質体を備えると共に、前記筐体の底面に対して20〜60度傾斜して配置されている、バイオ燃料電池。
前記燃料溶液が、緩衝液成分としてリン酸塩を含む請求項１又は２に記載のバイオ燃料電池。