JP2018126170A

JP2018126170A - ヒト化主要組織適合性遺伝子複合体を発現するマウス

Info

Publication number: JP2018126170A
Application number: JP2018101501A
Authority: JP
Inventors: マクドナルドリン; Macdonald Lynn; ジェイ．マーフィーアンドリュー; Anteneh Kebbede; ボロニナベラ; Voronina Vera; ギュラーケイガン; Gurer Cagan
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2018-08-16
Anticipated expiration: 2034-02-20
Also published as: EP3421490A1; EP2958937A1; JP2016507247A; KR20150122710A; CN110192541A; ES2949029T3; CY1121223T1; AU2018271326C1; AU2014218893C1; WO2014130667A1; ES2697248T3; CN105164154A; AU2018271326A1; SI2958937T1; CA2900824A1; RS57963B1; HK1214613A1; EP3699190B9; KR102211267B1; ES2798751T3

Abstract

【課題】キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドならびに／またはヒトもしくはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、ならびに当該ポリペプチドを含む胚、細胞、および組織を提供すること。
【解決手段】該遺伝子改変動物を作出するための構築物およびそれを作出する方法も提供される。ヒト免疫系の種々の態様を研究するための、遺伝子改変動物の使用方法が提供される。種々の実施形態では、本発明は、一般に、ゲノム内にヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【選択図】なし

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１３年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／７６７，８１１号に対する利益を、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）の下に主張し、この出願はその全体が参考として本明細書に援用される。

配列表
本明細書では、２０１４年２月２０日に「２０１０７９４−０４２４＿ＳＴ２５」という名称のａｓｃｉｉ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表に言及する。この．ｔｘｔファイルは、２０１４年２月２０日に作成されたものであり、サイズは８ｋｂである。

本発明は、ヒトまたはヒト化主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する遺伝子改変非ヒト動物、例えば、げっ歯類（例えばマウスまたはラット）に関する。本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩタンパク質（例えば、ＭＨＣＩα鎖）およびヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質（例えば、ＭＨＣＩＩαおよびＭＨＣＩＩβ鎖）を発現し、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをさらに発現する遺伝子改変非ヒト動物、例えばマウスまたはラット、ならびに当該タンパク質を発現している胚、組織、および細胞にも関する。本発明は、さらに、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質、ならびに／またはβ２ミクログロブリンをどちらも発現する遺伝子改変非ヒト動物を作出するための方法を提供する。ｉｎｖｉｔｒｏまたは遺伝子改変非ヒト動物においてヒト化細胞免疫系に関してペプチドを同定し、評価するための方法、および非ヒト動物、例えばマウスまたはラットのＭＨＣ遺伝子座を、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質を発現するように改変する方法も提供される。

適応免疫応答では、外来抗原がＢリンパ球上の受容体分子（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球上の受容体分子（例えばＴ細胞受容体またはＴＣＲ）によって認識される。これらの外来抗原は、一般的に主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と称される特殊化されたタンパク質によって、細胞の表面上にペプチド断片として提示される。ＭＨＣ分子は、約４Ｍｂにわたる遺伝子の連結したクラスターとして見いだされる多数の遺伝子座によりコードされる。マウスでは、ＭＨＣ遺伝子は第１７染色体上に見いだされ、歴史的な理由で組織適合性２（Ｈ−２）遺伝子と称される。ヒトでは、当該遺伝子は第６染色体上に見いだされ、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）遺伝子と称される。マウスおよびヒトにおける遺伝子座は多遺伝子性であり、ヒトゲノムおよびマウスゲノムにおいて同様の組織化を示す３つの高度に多型的なクラスのＭＨＣ遺伝子（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を含む（それぞれ図２および図３を参照されたい）。

ＭＨＣ遺伝子座はゲノム内で最も高度な多型を示し、いくつかの遺伝子は＞３００の対立遺伝子で表される（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲβおよびヒトＨＬＡ−Ｂ）。クラスＩＭＨＣ遺伝子およびクラスＩＩＭＨＣ遺伝子は全て、ペプチド断片を提示することができるが、各遺伝子は多型および対立遺伝子バリアントを反映する異なる結合特性を有するタンパク質を発現する。任意の所与の個体は、免疫応答の過程中に細胞表面上にＢ細胞およびＴ細胞に対して提示され得るペプチド断片の独特の範囲を有する。

ヒトおよびマウスはどちらもクラスＩＭＨＣ遺伝子を有する（図２および図３を参照されたい）。ヒトでは、古典的なクラスＩ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃと称され、マウスではこれらはＨ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌと称される。クラスＩ分子は、２つの鎖：多型のα鎖（時には重鎖と称される）と、一般に多型ではないβ２ミクログロブリンと称される（軽鎖としても公知である）より小さな鎖からなる（図１、左側）。これらの２つの鎖は細胞表面上に非共有結合性ヘテロ二量体を形成する。α鎖は、３つのドメイン（α１、α２およびα３）を含有する。α鎖遺伝子のエクソン１はリーダー配列をコードし、エクソン２およびエクソン３はα１ドメインおよびα２ドメインをコードし、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６およびエクソン７は細胞質尾部をコードする。α鎖は、α１ドメインおよびα２ドメインが関与するペプチド結合性溝（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｃｌｅｆｔ）（Ｉｇ様ドメインに似ている）を形成し、その後ろに、β２ミクログロブリンと類似したα３ドメインが続く。

β２ミクログロブリンは、グリコシル化されていない１２ｋＤａのタンパク質であり、その機能のうちの１つは、ＭＨＣクラスＩα鎖を安定化することである。α鎖とは異なり、β２ミクログロブリンは膜には及ばない。ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座は第１５染色体上にあるが、マウス遺伝子座は第２染色体にある。β２ミクログロブリン遺伝子は４つのエクソンおよび３つのイントロンからなる。循環形態のβ２ミクログロブリンが血清、尿、および他の体液中に存在し、生理的条件下で、非共有結合によりＭＨＣＩと会合したβ２ミクログロブリンが循環しているβ２ミクログロブリンで置き換えられ得る。

クラスＩＭＨＣ分子は、腫瘍細胞を含めた全ての有核細胞上に発現する。クラスＩＭＨＣ分子は、他の細胞の中でもＴリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞および好中球上で特異的に発現し、表面上にペプチド断片（一般には８〜１０アミノ酸の長さ）がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対してディスプレイされるように機能する。ＣＴＬは、それ自体の膜結合型ＴＣＲによって認識されるＭＨＣＩに結合したペプチドを担持する任意の細胞を死滅させることに特殊化されている。細胞により通常は存在しない細胞タンパク質（例えば、ウイルス、腫瘍、または他の非自己起源のもの）に由来するペプチドがディスプレイされると、そのようなペプチドは、ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬが活性化され、そのペプチドをディスプレイしている細胞を死滅させる。

ヒトおよびマウスはどちらもクラスＩＩＭＨＣ遺伝子を有する（図２および図３を参照されたい）。ヒトでは、古典的なＭＨＣＩＩ遺伝子はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲと称され、マウスでは、これらはＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅと称される（多くの場合、それぞれＩ−ＡおよびＩ−Ｅと省略される）。ＭＨＣＩＩ遺伝子座内の遺伝子、ヒトではＨＬＡ−ＤＭおよびＨＬＡ−ＤＯならびにマウスではＨ−２ＭおよびＨ−２Ｏによりコードされる追加的なタンパク質は、細胞表面上には見いだされないが、エンドサイトーシス区画（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内に存在し、ＭＨＣＩＩ分子へのペプチドの適切な負荷を確実にするものである。クラスＩＩ分子は２つのポリペプチド鎖：α鎖およびβ鎖からなる。α鎖の細胞外部分は２つの細胞外ドメイン、α１およびα２を含有し、β鎖の細胞外部分も同様に２つの細胞外ドメイン、β１およびβ２を含有する（図１、右側を参照されたい）α鎖およびβ鎖は互いと非共有結合により会合している。

ＭＨＣクラスＩＩ分子は、炎症などの経過中に抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞上に発現する。ＡＰＣの表面上に発現するＭＨＣＩＩ分子により、一般には、細胞内小胞で産生される抗原がＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。ＣＤ４＋Ｔ細胞との結びつきに関与するためには、目的の抗原を伴うＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と結びつくために十分に長く存在するために十分に安定でなければならない。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞にＡＰＣの表面上の外来ペプチド／ＭＨＣＩＩ複合体が結びつくと、Ｔ細胞が活性化されて、インベーダーに対する免疫応答を補助するサイトカインが放出される。

寛容機構に起因して、全ての抗原によりＴ細胞活性化が惹起されるとは限らない。しかし、いくつかの疾患（例えばがん、自己免疫疾患）では、自己タンパク質に由来するペプチドは免疫系の細胞性構成成分の標的になり、それにより、そのようなペプチドを提示している細胞の破壊がもたらされる。臨床的に重要な抗原（例えば、種々の型のがんに関連する抗原）の認識に関しては著しく前進している。しかし、ヒトＴ細胞における適切な応答を惹起するペプチドの同定および選択を改善するためには、特に臨床的に重要な抗原のペプチドに関して、依然として、ヒト免疫系の態様を模倣するｉｎｖｉｖｏ系およびｉｎｖｉｔｒｏ系が必要である。したがって、ヒト免疫系の構成成分を示すことができる生物系（例えば、遺伝子改変非ヒト動物および細胞）が必要とされている。

ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質およびそのキメラと会合し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合するペプチド、ならびにヒトＭＨＣクラスＩＩタンパク質およびそのキメラと会合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するペプチドを作製または同定するための生物系が提供される。細胞性免疫応答において機能するヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物が提供される。ヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質をコードするヒト化げっ歯類遺伝子座も提供される。ヒト化ＭＨＣ分子を発現するヒト化げっ歯類細胞も提供される。１種または複数種のヒト化免疫系分子を発現するヒト化げっ歯類細胞を含むｉｎｖｉｖｏ系およびｉｎｖｉｔｒｏ系が提供される。

種々の実施形態では、内在性ＭＨＣ遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む第１のヌクレオチド配列；キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のヌクレオチド配列；およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む第３のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座から機能的なキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、動物は、内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座から機能的な内在性ＭＨＣＩ、ＩＩα、および／またはＩＩβポリペプチドを発現しない。

一態様では、第１のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座に位置し、第２のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩＩα遺伝子座に位置し、第３のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩＩβ遺伝子座に位置する。一態様では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および／または第３のヌクレオチド配列は内在性非ヒト調節エレメントに作動可能に連結している。一態様では、第１のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、第２のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩＩαプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、第３のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩＩβプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している。

一実施形態では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含む。一態様では、キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群から選択することができる。一実施形態では、ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨＬＡ−Ａ２である。別の態様では、ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｃｗ６、またはヒト集団において発現する任意の他のＭＨＣＩ分子である。追加的な実施形態では、本発明の非ヒト動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する。

一実施形態では、ヒトＭＨＣＩＩα細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩＩα１およびα２ドメインを含む。別の実施形態では、ヒトＭＨＣＩＩβ細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩＩβ１およびβ２ドメインを含む。一態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。一態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。一実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する。特定の一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する。あるいは、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、またはヒト集団において発現する任意の他のＭＨＣＩＩ分子から選択されるヒトＭＨＣＩＩタンパク質由来のものであってよい。

一部の態様では、提供される動物は、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列を含有するＭＨＣ遺伝子座の２つのコピーを含み、他の態様では、提供される動物は、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列を含有するＭＨＣ遺伝子座の１つのコピーを含む。したがって、動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、およびＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＭＨＣ遺伝子座についてホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、およびＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変ＭＨＣ遺伝子座は非ヒト動物の生殖細胞系列内にある。

本発明では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む第１のヌクレオチド配列；キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のヌクレオチド配列；およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む第３のヌクレオチド配列を含むＭＨＣ遺伝子座も提供される。一部の態様では、キメラＭＨＣＩ、ＩＩα、およびＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、それぞれ非ヒトＭＨＣＩ、ＩＩα、およびＩＩβの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

一実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物はげっ歯類である。一実施形態では、げっ歯類はラットまたはマウスである。一実施形態では、げっ歯類はマウスである。したがって、一態様では、第１のヌクレオチド配列は、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードし、キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分は、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、またはＨ−２Ｌに由来する。特定の一実施形態では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分は、Ｈ−２Ｋに由来する。一態様では、第２のヌクレオチド配列はキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードし、第３のヌクレオチド配列はキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードし、キメラＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドのマウス部分はＨ−２ＥまたはＨ−２Ａに由来する。特定の実施形態では、キメラＭＨＣＩＩポリペプチドのマウス部分はＨ−２Ｅに由来する。

したがって、本明細書では、内在性ＭＨＣ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む第１のヌクレオチド配列；キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のヌクレオチド配列；およびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む第３のヌクレオチド配列を含む遺伝子操作されたマウスであって、内在性マウスＭＨＣ遺伝子座から機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質を発現するマウスも提供される。特定の一実施形態では、第１のヌクレオチド配列はキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列はキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅポリペプチドのα鎖をコードし、第３のヌクレオチド配列はキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅポリペプチドのβ鎖をコードし、マウスは機能的なＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質およびＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する。追加的な実施形態では、マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態では、マウスは、その内在性ＭＨＣ遺伝子座から機能的な内在性ＭＨＣポリペプチドを発現しない。

本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）を作製するための方法も提供される。したがって、一態様では、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、第１の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップ；および第２の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法を提供する。一態様では、ヌクレオチド配列を置き換えるステップは、非ヒトＥＳ細胞における相同組換えを含み、第２の非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を担持するＥＳ細胞における相同組換えによって作製される。キメラＭＨＣＩＩ複合体はキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドを含む。

代替の実施形態では、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、第１の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップ；および第２の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法を提供する。一態様では、ヌクレオチド配列を置き換えるステップは、非ヒトＥＳ細胞における相同組換えを含み、第２の非ヒト動物はキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を担持するＥＳ細胞における相同組換えによって作製される。

本明細書では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばマウスまたはラット）に由来する細胞、例えば、単離された抗原提示細胞も提供される。本明細書に記載の非ヒト動物に由来する組織および胚も提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
内在性ＭＨＣ遺伝子座に、
キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む第１のヌクレオチド配列、
キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のヌクレオチド配列、および
キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列であって、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む第３のヌクレオチド配列
を含む非ヒト動物であって、
内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座からキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩタンパク質およびＭＨＣＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物。
（項目２）
前記内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座から機能的な内在性ＭＨＣＩ、ＩＩα、および／またはＩＩβポリペプチドを発現しない、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記第１のヌクレオチド配列が内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座に位置し、前記第２のヌクレオチド配列が内在性非ヒトＭＨＣＩＩα遺伝子座に位置し、前記第３のヌクレオチド配列が内在性非ヒトＭＨＣＩＩβ遺伝子座に位置する、項目１に記載の動物。
（項目４）
前記第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および／または第３のヌクレオチド配列が内在性非ヒト調節エレメントに作動可能に連結している、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記キメラＭＨＣＩポリペプチドの前記ヒト部分が、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分が、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目７）
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群から選択される、項目１に記載の動物。
（項目８）
内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座にヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、項目１に記載の動物。
（項目９）
前記ヒトＭＨＣＩＩα細胞外ドメインが、ヒトＭＨＣＩＩα１およびα２ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目１０）
前記ヒトＭＨＣＩＩβ細胞外ドメインが、ヒトＭＨＣＩＩβ１およびβ２ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目１１）
前記第１のヌクレオチド配列が内在性非ヒトＭＨＣＩプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列が内在性非ヒトＭＨＣＩＩαプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第３のヌクレオチド配列が内在性非ヒトＭＨＣＩＩβプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、項目１に記載の動物。
（項目１２）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの非ヒト部分が、内在性非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目１３）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒト部分が、内在性非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目１４）
前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドの前記ヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、項目１に記載の動物。
（項目１５）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲタンパク質に由来する、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
げっ歯類である、項目１に記載の動物。
（項目１７）
マウスまたはラットである、項目１６に記載のげっ歯類。
（項目１８）
マウスである、項目１７に記載のげっ歯類。
（項目１９）
前記第１のヌクレオチド配列がキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードし、該キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分がＨ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、またはＨ−２Ｌに由来する、項目１８に記載のマウス。
（項目２０）
前記キメラＭＨＣＩポリペプチドの前記マウス部分がＨ−２Ｋに由来する、項目１９に記載のマウス。
（項目２１）
前記第２のヌクレオチド配列がキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードし、前記第３のヌクレオチド配列がキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードし、該キメラＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドのマウス部分がＨ−２Ｅまたは
Ｈ−２Ａに由来する、項目１８に記載のマウス。
（項目２２）
前記キメラＭＨＣＩＩポリペプチドの前記マウス部分がＨ−２Ｅに由来する、項目２１に記載のマウス。
（項目２３）
内在性ＭＨＣ遺伝子座に、
キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む第１のヌクレオチド配列、
キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のヌクレオチド配列、および
キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列であって、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む第３のヌクレオチド配列
を含むマウスであって、
内在性マウスＭＨＣ遺伝子座からキメラヒト／マウスＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質を発現するマウス。
（項目２４）
前記第１のヌクレオチド配列がキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードし、前記第２のヌクレオチド配列がキメラＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅポリペプチドのα鎖をコードし、前記第３のヌクレオチド配列がキメラＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅポリペプチドのβ鎖をコードし、前記マウスがＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する、項目２４に記載のマウス。
（項目２５）
内在性β２ミクログロブリン遺伝子座に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目２４に記載のマウス。
（項目２６）
内在性ＭＨＣ遺伝子座から機能的な内在性ＭＨＣポリペプチドを発現しない、項目２４に記載のマウス。
（項目２７）
遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、
第１の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップ、および
第２の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップ
を含む方法。
（項目２８）
ヌクレオチド配列を置き換える前記ステップが、非ヒトＥＳ細胞における相同組換えを含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を担持するＥＳ細胞における相同組換えによって第２の非ヒト動物が作製される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ヌクレオチド配列を置き換える前記ステップが、非ヒトＥＳ細胞における相同組換えを含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を担持するＥＳ細胞における相同組換えによって第１の非ヒト動物が作製される、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記動物がマウスである、項目２７に記載の方法。

別段の指定があるまたは文脈から明らかである場合を除き、本明細書に記載されている実施形態および態様はいずれも、互いと併せて使用することができる。以下の詳細な説明についての総説から他の実施形態が当業者に明らかになるであろう。以下の詳細な説明は、本発明の種々の実施形態の例示的な表示を含み、これは特許請求された本発明を限定するものではない。添付図は本明細書の一部を構成し、その説明と共に、単に実施形態を例示するものとして機能し、本発明を限定するものではない。

図１は、細胞の表面上に発現するＭＨＣＩクラス分子（左側のパネル）およびＭＨＣＩＩクラス分子（右側のパネル）の概略図である。灰色の丸はペプチド結合性溝に結合したペプチドを表す。

図２は、ヒトＨＬＡの相対的なゲノム構造の略図（縮尺不定）である。クラスＩ遺伝子、クラスＩＩ遺伝子およびクラスＩＩＩ遺伝子が示されている。

図３は、マウスＭＨＣの相対的なゲノム構造の略図（縮尺不定）である。クラスＩ遺伝子、クラスＩＩ遺伝子およびクラスＩＩＩ遺伝子が示されている。

図４は、ヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ遺伝子を含むヒト化ＭＨＣ遺伝子座を作製するための戦略を示す図である。示されている特定の実施形態では、作製されたマウスのＭＨＣ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−ＤＲ４配列を含む（Ｈ２−Ｋ^{＋／１６６６} ＭＨＣ−ＩＩ^{＋／１６８１}）。ヒト化の各段階においてＥＳ細胞に導入した大きなターゲティングベクターが矢印の右側に示されている。

図５（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−ＥβおよびＩ−Ｅα（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲティングベクターを作製するための戦略の概略図（縮尺不定）である。図５Ｃでは、図５Ｂの最終的なヒト化ＭＨＣＩＩ配列を図５Ａの最終的な構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間でライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を作製する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝電気穿孔。三角形はエクソンを表し、黒い三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として、斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。図５（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−ＥβおよびＩ−Ｅα（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲティングベクターを作製するための戦略の概略図（縮尺不定）である。図５Ｃでは、図５Ｂの最終的なヒト化ＭＨＣＩＩ配列を図５Ａの最終的な構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間でライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を作製する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝電気穿孔。三角形はエクソンを表し、黒い三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として、斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。図５（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−ＥβおよびＩ−Ｅα（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲティングベクターを作製するための戦略の概略図（縮尺不定）である。図５Ｃでは、図５Ｂの最終的なヒト化ＭＨＣＩＩ配列を図５Ａの最終的な構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間でライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を作製する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝電気穿孔。三角形はエクソンを表し、黒い三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として、斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。図５（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−ＥβおよびＩ−Ｅα（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲティングベクターを作製するための戦略の概略図（縮尺不定）である。図５Ｃでは、図５Ｂの最終的なヒト化ＭＨＣＩＩ配列を図５Ａの最終的な構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間でライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を作製する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝電気穿孔。三角形はエクソンを表し、黒い三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として、斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。

図６は、ＭＨＣクラスＩＩＩ−Ｅ遺伝子およびＩ−Ａ遺伝子の縮尺不定の概略図である、ハイグロマイシンカセットを使用したマウス遺伝子座のノックアウト、その後のヒト化Ｉ−ＥβおよびＩ−Ｅα（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むベクターの導入が示されている。白抜きの三角形はヒトエクソンを表し、黒い三角形はマウスエクソンを表す。遺伝子型決定に使用したプローブが囲まれている。

図７は、図６のネオマイシンカセットのＣｒｅ媒介性除去に関する縮尺不定の概略図である。白抜きの三角形はヒトエクソンを表し、黒い三角形はマウスエクソンを表す。上の２つの鎖はネオマイシン選択カセットを有するヒト化ＭＨＣＩＩヘテロ接合性マウスのＭＨＣＩＩ遺伝子座を表し、下の２つの鎖はネオマイシンカセットが除去されたヒト化ＭＨＣＩＩヘテロ接合性マウスのＭＨＣＩＩ遺伝子座を表す。

図８は、ヒトＨＬＡ−Ａ２タンパク質の細胞外領域を発現するキメラＨ−２Ｋ遺伝子座を作出するために使用したターゲティング戦略の概略図（縮尺不定）である。マウス配列が黒色で表されており、ヒト配列が白色で表されている。Ｌ＝リーダー、ＵＴＲ＝非翻訳領域、ＴＭ＝膜貫通ドメイン、ＣＹＴ＝細胞質ドメイン、ＨＹＧ＝ハイグロマイシン。

図９は、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ遺伝子座を有するヘテロ接合性マウスにおけるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−ＤＲ４のｉｎｖｉｖｏにおける発現のドットプロットである。定常状態のＨＬＡ−ＤＲ４の発現は低いものであったが、存在した。この低発現は予測されたものであり、活性化されると発現は上方制御される。

定義
本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩタンパク質とヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質の両方を発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えばマウス、ラット、ウサギなど）；当該タンパク質を含む胚、細胞、および組織；それらを作出する方法；ならびにそれらの使用方法を提供する。別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての用語および句は、それに反することが明示されているまたはその用語もしくは句が使用される文脈から明らかである場合を除き、その用語および句が当技術分野において得ている意味を包含する。

「保存的」という用語は、保存的アミノ酸置換について記載するために使用される場合、アミノ酸残基の、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似した側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基での置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチドの変化が導入されるようにヌクレオチド配列を改変することによって実現することができる。一般に、保存的アミノ酸置換により、タンパク質の目的の機能的性質、例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩの目的のペプチドを提示する能力は実質的に変化しない。化学的性質が類似した側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなど；脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えばセリンおよびトレオニンなど；アミドを含有する側鎖、例えばアスパラギンおよびグルタミンなど；芳香族側鎖、例えばフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなど；塩基性側鎖、例えばリシン、アルギニン、およびヒスチジンなど；酸性側鎖、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸など、ならびに、硫黄を含有する側鎖、例えばシステインおよびメチオニンなどが挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘発で使用されるように、タンパク質内の任意のネイティブな残基のアラニンでの置換であってよい。一部の実施形態では、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（（１９９２年）ＥｘｈａｕｓｔｉｖｅＭａｔｃｈｉｎｇｏｆｔｈｅＥｎｔｉｒｅＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１４４３〜４５頁）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように成される。一部の実施形態では、置換は、置換がＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有する、中程度に保存的な置換である。

したがって、本明細書に記載のアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含むヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物も本発明に包含される。

本明細書に記載のヒトまたはヒト化ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩポリペプチドをコードする核酸残基に加えて、遺伝暗号の縮重に起因して、他の核酸が本発明のポリペプチドをコードし得ることが当業者には理解されよう。したがって、保存的アミノ酸置換を伴うＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物に加えて、遺伝暗号の縮重に起因して本明細書に記載のものとは異なるヌクレオチド配列をゲノム内に含む非ヒト動物も提供される。

「同一性」という用語は、配列に関連して使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で公知のいくつかの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を包含する。本明細書に記載の一部の実施形態では、オープンギャップペナルティ（ｏｐｅｎｇａｐｐｅｎａｌｔｙ）１０．０、伸長ギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｄｇａｐｐｅｎａｌｔｙ）０．１を使用したＣｌｕｓｔａｌＷｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用し、Ｇｏｎｎｅｔ類似度マトリックス（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＩｎｃ．、２００８年）を使用して同一性を決定する。配列の同一性に関して比較される配列の長さは特定の配列に左右される。種々の実施形態では、同一性は、成熟タンパク質のＮ末端からＣ末端までの配列を比較することによって決定する。種々の実施形態では、キメラヒト／非ヒト配列とヒト配列を比較する場合、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分の間の同一性のレベルを確認するために、キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分を比較に使用する（非ヒト部分は使用しない）（例えばキメラヒト／マウスタンパク質のヒト外部ドメインとヒトタンパク質のヒト外部ドメインを比較する）。

「相同性」または「相同な」という用語は、配列、例えばヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関しては、最適にアラインメントおよび比較すると、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約７５％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約９０〜９５％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の９７％超が同一である２つの配列を意味する。最適な遺伝子ターゲティングのためには、ターゲティング構築物は内在性ＤＮＡ配列と相同なアーム（すなわち、「相同性アーム」）を含有すべきであり、したがって、ターゲティング構築物と標的とされる内在性配列の間で相同組換えが起こり得ることが当業者には理解されよう。

「作動可能に連結した」という用語は、そのように記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある、近位を指す。そのように、適切な転写調節が保持されるように、タンパク質をコードする核酸配列を調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。さらに、細胞内のタンパク質の適切なフォールディング、プロセシング、ターゲティング、発現、および他の機能的性質を保持するために、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々の部分を作動可能に連結することができる。別段の指定のない限り、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結している。

「ＭＨＣＩ複合体」などの用語は、本明細書で使用される場合、ＭＨＣＩα鎖ポリペプチドとβ２ミクログロブリンポリペプチドの複合体を含む。「ＭＨＣＩポリペプチド」などの用語は、本明細書で使用される場合、単独のＭＨＣＩα鎖ポリペプチドを含む。「ＭＨＣＩＩ複合体」、「ＭＨＣＩＩタンパク質」などの用語は、本明細書で使用される場合、ＭＨＣＩＩαポリペプチドとＭＨＣＩＩβポリペプチドの複合体を含む。「ＭＨＣＩＩαポリペプチド」または「ＭＨＣＩＩβポリペプチド」（など）の用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ単独のＭＨＣＩＩαポリペプチドまたは単独のＭＨＣＩＩβポリペプチドを含む。同様に、「ＨＬＡ−ＤＲ４複合体」、「ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質」、「Ｈ−２Ｅ複合体」、「Ｈ−２Ｅタンパク質」などの用語は、αポリペプチドとβポリペプチドの複合体を指す。一般には、「ヒトＭＨＣ」および「ＨＬＡ」という用語は互換的に使用される。

「置き換え」という用語は、遺伝子の置き換えに関しては、内在性遺伝子座に外因性遺伝物質を配置し、それにより内在性遺伝子の全部または一部をオルソロガスなまたは相同な核酸配列で置き換えることを指す。下記の実施例において実証されている通り、内在性ＭＨＣ遺伝子座の核酸配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの一部をコードする配列、特に、ＭＨＣＩポリペプチドの細胞外部分をコードする配列、ならびにヒトＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドの一部、特に、ＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドの細胞外部分をコードするヌクレオチド配列で置き換えた。

「機能的」とは、本明細書で使用される場合、例えば、機能的なポリペプチドに関しては、ネイティブなタンパク質に通常付随する少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドを指す。例えば、本発明の一部の実施形態では、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座における置き換え）により、機能的な内在性ポリペプチド、例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩポリペプチドを発現することができない遺伝子座がもたらされる。同様に、「機能的」という用語は、タンパク質の機能的な細胞外ドメインに関して本明細書で使用される場合、その機能性、例えばＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩの場合では、抗原に結合する能力、Ｔ細胞補助受容体に結合する能力などを保持する細胞外ドメインを指す。本発明の一部の実施形態では、内在性ＭＨＣ遺伝子座における置き換えにより、内在性ＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現することができないが、ヒトＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現する遺伝子座がもたらされる。

遺伝子改変ＭＨＣ動物
種々の実施形態では、本発明は、一般に、ゲノム内にヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。

ＭＨＣ遺伝子は３つのクラス：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩにカテゴリー化され、その全てがヒト第６染色体またはマウス第１７染色体のいずれかにコードされる。ヒトＭＨＣクラスおよびマウスＭＨＣクラスの相対的な組織化の概略図がそれぞれ図２および図３に示されている。ＭＨＣ遺伝子は、マウスおよびヒトゲノムの最も多型的な遺伝子の１つである。ＭＨＣ多型は、進化的利点をもたらすことにおいて重要であると推定され、配列の変化によりペプチド結合性の差異がもたらされ、それにより、細胞傷害性Ｔ細胞への病原体のよりよい提示が可能になる。

ＭＨＣクラスＩタンパク質は、細胞外ドメイン（３つのドメイン：α_１、α_２、およびα_３を含む）、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含む。α_１ドメインおよびα_２ドメインはペプチド結合性溝を形成し、α_３はβ２ミクログロブリンと相互作用する。

β２ミクログロブリンとの相互作用に加えて、α_３ドメインは、ＴＣＲ補助受容体ＣＤ８と相互作用し、それにより、抗原特異的な活性化が容易になる。ＭＨＣクラスＩのＣＤ８への結合性はＴＣＲのＭＨＣクラスＩへの結合性の約１００分の１であるが、ＣＤ８の結合によりＴＣＲの結合の親和性が増強される。Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅら（２０１０年）ＭＨＣＣｌａｓｓＩＭｏｌｅｃｕｌｅｓｗｉｔｈＳｕｐｅｒｅｎｈａｎｃｅｄＣＤ８ＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓＢｙｐａｓｓｔｈｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒＣｏｇｎａｔｅＴＣＲＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄＮｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖａｔｅＣＴＬｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４巻：３３５７〜３３６６頁。興味深いことに、ＭＨＣクラスＩのＣＤ８への結合が増大することにより、ＣＴＬ活性化の抗原特異性が抑止される。同文献。

ＭＨＣクラスＩ分子へのＣＤ８の結合は種特異的であり、ＣＤ８のマウスホモログ、Ｌｙｔ−２は、α３ドメインにおいてＨ−２Ｄ^ｄ分子に結合するが、ＨＬＡ−Ａ分子には結合しないことが示された。Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８８年）ＴｈｅＬｙｔ−２ＭｏｌｅｃｕｌｅＲｅｃｏｇｎｉｚｅｓＲｅｓｉｄｕｅｓｉｎｔｈｅＣｌａｓｓＩ α３ＤｏｍａｉｎｉｎＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＣｅｌｌＲｅｓｐｏｎｓｅｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８巻：３２５〜３４１頁。示差的な結合は、おそらくヒトとマウスの間で保存的ではないＣＤ８上のＣＤＲ様決定因子（ＣＤＲ１様およびＣＤＲ２様）に起因するものであった。Ｓａｎｄｅｒｓら（１９９１年）ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＣＤ８ｔｈａｔＡｆｆｅｃｔＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＨＬＡＣｌａｓｓＩａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉ−ＣＤ８Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４巻：３７１〜３７９頁；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９１年）ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄＩｎｆｌｕｅｎｚａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＲｅｓｐｏｎｓｅｉｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＭｉｃｅＣａｒｒｙｉｎｇａＣｈｉｍｅｒｉｃＨｕｍａｎ−ＭｏｕｓｅＣｌａｓｓＩＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３巻：１００７〜１０１５頁、および、Ｇａｏら（１９９７年）ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｂｅｔｗｅｅｎｈｕｍａｎＣＤ８αα ａｎｄＨＬＡ−Ａ２、Ｎａｔｕｒｅ３８７巻：６３０〜６３４頁。ＣＤ８は、α３ドメインの保存的領域（２２３〜２２９位）においてＨＬＡ−Ａ２に結合することが報告されている。ＨＬＡ−Ａにおける単一の置換（Ｖ２４５Ａ）により、ＣＤ８とＨＬＡ−Ａの結合性が低下し、同時にＴ細胞媒介性溶解が大きく低下する。Ｓａｌｔｅｒら（１９８９年）、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎｔｈｅ α３ｄｏｍａｉｎｏｆＨＬＡ−ＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｆｆｅｃｔｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏＣＤ８、Ｎａｔｕｒｅ３３８巻：３４５〜３４８頁。一般に、ＨＬＡ−Ａ分子のα３ドメインにおける多型も、ＣＤ８との結合に影響を及ぼす。同文献。マウスでは、Ｈ−２Ｄ^ｄの残基２２７におけるアミノ酸置換により、マウスＬｙｔ−２とＨ−２Ｄ^ｄの結合が影響を受け、変異Ｈ−２Ｄ^ｄをトランスフェクトした細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞によって溶解されなかった。Ｐｏｔｔｅｒら（１９８９年）Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｔｒｅｓｉｄｕｅ２２７ｏｆＨ−２ｃｌａｓｓＩｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｂｒｏｇａｔｅｓｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙＣＤ８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｂｕｔｎｏｔＣＤ８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ３３７巻：７３〜７５頁。

したがって、ＭＨＣクラスＩα３ドメインとＣＤ８の間の相互作用の種特異性に起因して、Ｈ−２Ｋ α３ドメインのヒトＨＬＡ−Ａ２ α３ドメインでの置き換えを含むＭＨＣＩ複合体はマウス（すなわち、ｉｎｖｉｖｏ）においてヒトＣＤ８の不在下では非機能的であった。ＨＬＡ−Ａ２についてのトランスジェニック動物では、ヒトα３ドメインでマウスα３ドメインを置換することにより、Ｔ細胞応答が回復する。Ｉｒｗｉｎら（１９８９年）Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＣＤ８ａｎｄｔｈｅ α３ｄｏｍａｉｎｏｆｃｌａｓｓＩｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｍａｇｎｉｔｕｄｅｏｆｔｈｅｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０巻：１０９１〜１１０１頁；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９１年）、上記。

マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部も重要な機能を有する。ＭＨＣＩ膜貫通ドメインの１つの機能は、おそらく表面ＭＨＣ分子の架橋（またはライゲーション）の結果としてホモタイプ細胞接着のＨＬＡ−Ａ２による調節（接着を増強または阻害する）を容易にすることである。Ｗａｇｎｅｒら（１９９４年）ＬｉｇａｔｉｏｎｏｆＭＨＣＣｌａｓｓＩａｎｄＣｌａｓｓＩＩＭｏｌｅｃｕｌｅｓＣａｎＬｅａｄｔｏＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＤｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＰａｔｈｗａｙｓＴｈａｔ
ＲｅｇｕｌａｔｅＨｏｍｏｔｙｐｉｃＡｄｈｅｓｉｏｎｉｎＨｕｍａｎＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２巻：５２７５〜５２８７頁。細胞接着は、ＨＬＡ−Ａ２分子の多様なエピトープに結合するｍＡｂの影響を受ける可能性があり、これにより、ホモタイプ細胞接着の調節に関係づけられる部位がＨＬＡ−Ａ２上に多数存在することが示唆される。結合したエピトープに応じて、影響はＨＬＡ−Ａ２依存性接着の増強または阻害であり得る。同文献。

ＭＨＣＩ遺伝子のエクソン６およびエクソン７によりコードされる細胞質尾部は、報告によれば、細胞表面上での適切な発現およびＮＫ細胞の細胞傷害性のＬＩＲ１媒介性阻害に必要である。Ｇｒｕｄａら（２００７年）ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣｙｓｔｅｉｎｅＲｅｓｉｄｕｅｓｉｎｔｈｅＴａｉｌｏｆＭＨＣＣｌａｓｓＩＰｒｏｔｅｉｎｓＡｒｅＣｒｕｃｉａｌｆｏｒＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙＬｅｕｋｏｃｙｔｅＩｇ−ＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９巻：３６５５〜３６６１頁。細胞質尾部は、少なくともいくつかのＭＨＣＩ分子の、そのシステイン残基におけるジスルフィド結合の形成による多量体化に必要であり、したがって、クラスター形成およびＮＫ細胞による認識において役割を果たし得る。Ｌｙｎｃｈら（２００９年）ＮｏｖｅｌＭＨＣＣｌａｓｓＩＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｎＥｘｏｓｏｍｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３巻：１８８４〜１８９１頁。

ＨＬＡ−Ａ２の細胞質ドメインは、構成的にリン酸化されたセリン残基およびリン酸化可能なチロシンを含有するが、ジャーカット細胞では、細胞質ドメインを欠く変異ＨＬＡ−Ａ２分子は発現、細胞骨格会合、凝集、およびエンドサイトーシスによる内部移行に関しては正常だと思われる。Ｇｕｒら（１９９７年）ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｌａｓｓＩＭＨＣＭｏｌｅｃｕｌｅｓ：ＴｈｅＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＤｏｍａｉｎＩｓＮｏｔＲｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，ａｎｄＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４巻（２号）：１２５〜１３２頁。細胞質ドメインを欠く切断型ＨＬＡ−Ａ２分子は、見たところでは正常に発現し、β２ミクログロブリンと会合する。同文献。

しかし、いくつかの試験により、細胞質尾部は細胞内輸送、樹状細胞（ＤＣ）媒介性抗原提示、およびＣＴＬ刺激において重要であることが実証された。エクソン６によりコードされるチロシン残基は、エンドソーム区画を通るＭＨＣＩ輸送、外因性抗原の提示、およびＣＴＬ刺激のために必要であることが示され、一方、エクソン７の欠失により、抗ウイルスＣＴＬ応答の増強がもたらされた。Ｌｉｚｅｅら（２００３年）ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｒｏｓｓ−ＰｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｂｙｔｈｅＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘＣｌａｓｓＩＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＤｏｍａｉｎ、ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌ．４巻：１０６５〜７３頁；Ｂａｓｈａら（２００８年）ＭＨＣＣｌａｓｓＩＥｎｄｏｓｏｍａｌａｎｄＬｙｓｏｓｏｍａｌＴｒａｆｆｉｃｋｉｎｇＣｏｉｎｃｉｄｅｓｗｉｔｈＥｘｏｇｅｎｏｕｓＡｎｔｉｇｅｎＬｏａｄｉｎｇｉｎＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓ、ＰＬｏＳＯＮＥ３：ｅ３２４７；およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｒｕｚら（２０１１年）ＮａｔｕｒａｌＳｐｌｉｃｅＶａｒｉａｎｔｏｆＭＨＣＣｌａｓｓＩＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＴａｉｌＥｎｈａｎｃｅｓＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌ−ＩｎｄｕｃｅｄＣＤ８＋Ｔ−ＣｅｌｌＲｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄＢｏｏｓｔｓＡｎｔｉ−ＴｕｍｏｒＩｍｍｕｎｉｔｙ、ＰＬｏＳＯＮＥ６：ｅ２２９３９。

ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、非共有結合により会合した２つのドメイン：本明細書では、αポリペプチドおよびβポリペプチドとも称されるα鎖およびβ鎖を含む（図１、右側）。このタンパク質は原形質膜にわたり、したがって、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含有する。α鎖の細胞外部分はα１ドメインおよびα２ドメインを含み、β鎖の細胞外部分はβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。α１ドメインおよびβ１ドメインは、細胞表面上にペプチド結合性溝を形成する。ＭＨＣＩＩ複合体のペプチド結合性溝の３次元コンフォメーションに起因して、理論的には、結合する抗原の長さに上限はないが、一般には、ＭＨＣＩＩにより提示されるペプチドは１３アミノ酸からおよび１７アミノ酸の間の長さである。

ＭＨＣＩＩ分子のペプチド結合性溝は、抗原性ペプチドとの相互作用に加え、ＭＨＣＩＩ複合体の形成およびペプチド獲得のプロセス中に不変鎖（Ｉｉ）と相互作用する。α／β ＭＨＣＩＩ二量体は小胞体内に集合し、Ｉｉ鎖と会合し、これは、ペプチド結合の制御およびＭＨＣＩＩのエンドサイトーシス経路内へのターゲティングに関与する。エンドソームにおいて、Ｉｉはタンパク質分解を受け、Ｉｉの小さな断片であるクラスＩＩと会合した不変鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）はペプチド結合性溝に残る。エンドソームにおいて、ＨＬＡ−ＤＭの制御下で（ヒトでは）、抗原性ペプチドがＣＬＩＰで置き換えられる。

ＭＨＣＩＩは、α２ドメインとβ２ドメインの間の接合部にある疎水性間隙においてＴ細胞補助受容体ＣＤ４と相互作用する。ＷａｎｇおよびＲｅｉｎｈｅｒｚ（２００２年）ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢａｓｉｓｏｆＴＣｅｌｌＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓＢｏｕｎｄｔｏＭＨＣＭｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３８巻：１０３９〜４９頁。ＣＤ４とＴ細胞受容体が、ペプチドと複合体を形成した同じＭＨＣＩＩ分子に結合すると、Ｔ細胞の抗原に対する感受性が増大し、活性化に必要な抗原が１００分の１になる。参照により本明細書に組み込まれるＪａｎｅｗａｙ’ｓＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７版、Ｍｕｒｐｈｙら編、ＧａｒｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ、２００８年を参照されたい。

ＭＨＣＩＩの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに関しては多数の機能が提唱されてきた。細胞質ドメインの場合では、細胞内シグナル伝達、原形質膜の輸送、および最終的に抗原の提示に重要であることが示されている。例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマは、細胞質ドメインにＭＨＣＩＩ β鎖切断型をトランスフェクトした抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する応答が不十分であり、Ｂ細胞分化の誘導が妨害されることが示された。例えば、Ｓｍｉｌｅｙら（１９９６年）ＴｒｕｎｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌａｓｓＩＩβ−ｃｈａｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｏｍａｉｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｃｌａｓｓＩＩ／ｉｎｖａｒｉａｎｔｃｈａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｐｅｐｔｉｄｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻：２４１〜４４頁を参照されたい。クラスＩＩ分子の切断により、ｃＡＭＰ産生が損なわれるように思われる。ＭＨＣＩＩの細胞質尾部の欠失により、細胞内輸送が影響を受け、したがって、複合体がエンドサイトーシス経路において関連性のある抗原と遭遇することが妨げられることが仮定されている。Ｓｍｉｌｅｙら（上記）により、細胞質ドメインにおけるクラスＩＩ分子の切断によりＣＬＩＰ／クラスＩＩ複合体の数が減少し、それによりＣＬＩＰ／クラスＩＩ複合体の数が減少することによって、抗原提示を効果的に調節するＣＬＩＰの能力が影響を受けると仮定されることが実証された。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）誘発のためにはＭＨＣＩＩのクラスター形成が重要であるので、細胞質ドメインにおいて切断されたＭＨＣＩＩ分子は細胞骨格への結合、したがって凝集が妨げられると、Ｔ細胞への抗原の提示が影響を受けることになるという仮説が立てられている。Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９１年）ＡｂｒｏｇａｔｉｏｎｏｆＴｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙｂｙＭＨＣＣｌａｓｓＩＩＡｎｔｉｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＲｅｑｕｉｒｅｓｔｈｅＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＤｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＣｌａｓｓＩＩＭｏｌｅｃｕｌｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻：２４１９〜２２頁。実際、細胞質ドメインにおいて切断されたＨＬＡ−ＤＲは、オリゴマー化後に細胞骨格と会合することができないことが最近示された。ＥｌＦａｋｈｙら（２００４年）ＤｅｌｉｎｅａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨＬＡ−ＤＲＲｅｇｉｏｎａｎｄｔｈｅＲｅｓｉｄｕｅｓＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻：１８４７２〜８０頁。重要なことに、アクチン細胞骨格は、局在するシグナルトランスダクション活性の部位であり、これにより、抗原の提示が影響を受ける。最近の試験により、細胞骨格との会合に加えて、全てのＨＬＡ−ＤＲ分子の２０％に至るまでが、コレステロールおよびスフィンゴ糖脂質が豊富なマイクロドメインであるＡＰＣの脂質ラフト内に構成的に存在すること、およびそのような局在化が、抗原の提示、免疫シナプス形成、およびＭＨＣＩＩ媒介性シグナル伝達に重要であることも示された。例えば、Ｄｏｌａｎら（２００４年）ＩｎｖａｒｉａｎｔＣｈａｉｎおよびｔｈｅＭＨＣＩＩＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＤｏｍａｉｎｓＲｅｇｕｌａｔｅＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＭＨＣＣｌａｓｓＩＩＭｏｌｅｃｕｌｅｓｔｏＬｉｐｉｄＲａｆｔｓｉｎＴｕｍｏｒＣｅｌｌ−ＢａｓｅｄＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２巻：９０７〜１４頁を参照されたい。Ｄｏｌａｎらにより、ＭＨＣＩＩの細胞質ドメインの切断により、ＭＨＣＩＩの脂質ラフトへの構成的な局在化が減少することが示唆された。

さらに、ＭＨＣＩＩ、特にβ鎖の細胞質ドメインは、ユビキチンリガーゼである膜結合型ＲＩＮＧ−ＣＨＩ（ＭＡＲＣＨＩ）によるユビキチン化を受けるロイシン残基を含有し、これにより、ＭＨＣＩＩのエンドサイトーシス輸送、内部移行、および分解が制御される。また、ＭＡＲＣＨ媒介性ユビキチン化は樹状細胞が成熟化すると停止し、それにより、原形質膜におけるＭＨＣＩＩのレベルが上昇することが示されている。Ｓｈｉｎら（２００６年）ＳｕｒｆａｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＨＣｃｌａｓｓＩＩｉｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ４４４巻：１１５〜１８頁；ＤｅＧａｓｓａｒｔら（２００８年）ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｔｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｈｕｍａｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｍａｔｕｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＭＡＲＣＨＩｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５巻：３４９１〜９６頁。

ＭＨＣＩＩのα鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインは互いと相互作用し、この相互作用は、クラスＩＩＭＨＣ複合体の適切な集合のために重要である。ＣｏｓｓｏｎおよびＢｏｎｉｆａｃｉｎｏ（１９９２年）ＲｏｌｅｏｆＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅＤｏｍａｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＡｓｓｅｍｂｌｙｏｆＣｌａｓｓＩＩＭＨＣＭｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ２５８巻：６５９〜６２頁。実際、α鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインがＩＬ−２受容体のα鎖で置き換えられたＭＨＣＩＩ分子はＥＲ内に保持され、細胞表面ではほぼ検出不可能であった。同文献。変異誘発試験を通じて、α膜貫通ドメインおよびβ膜貫通ドメインにおける保存的Ｇｌｙ残基が細胞表面におけるＭＨＣＩＩの集合に関与することが見いだされた。同文献。したがって、膜貫通ドメインと細胞質ドメインはどちらも、ＭＨＣＩＩ複合体の適切な機能のために極めて重要である。

種々の実施形態では、ゲノム内に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物、例えば、げっ歯類（例えばマウスまたはラット）が本明細書において提供される。ＭＨＣＩヌクレオチド配列は、部分的にヒトのものであり、部分的に非ヒトのものであるＭＨＣＩポリペプチド、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードし得、ＭＨＣＩＩヌクレオチド配列は、部分的にヒトのものであり、部分的に非ヒトのものであるＭＨＣＩＩタンパク質、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩタンパク質をコードし得る（例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドを含む）。一部の態様では、動物は、内在性ＭＨＣＩおよびＩＩポリペプチド、例えば、機能的な内在性ＭＨＣＩおよびＩＩポリペプチドを発現しない。

ゲノム内、例えば内在性遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物は、それらの出願全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６６１，１５９号および同第１３／７９３，８１２号に開示されている。ゲノム内、例えば内在性遺伝子座にヒト化、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物は、それらの出願全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６６１，１１６号および同第１３／７９３，９３５号に開示されている。本明細書では、内在性ＭＨＣ遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩポリペプチドを含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。そのような動物は、マウス第１７染色体およびヒト第６染色体上のＭＨＣＩ遺伝子およびＭＨＣＩＩ遺伝子の近いつながりに起因して、ヒト化ＭＨＣＩ動物とヒト化ＭＨＣＩＩ動物を単純に掛け合わせることによって作製することは難しいと思われる。したがって、本出願は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドをコードする配列を含む遺伝子改変非ヒト動物、例えば、内在性ＭＨＣＩおよびＩＩポリペプチドをコードする配列がキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびＩＩポリペプチドをコードする配列で置き換えられた動物を作製するための新規の方法も提供する。

したがって、種々の実施形態では、ゲノム内、例えば内在性ＭＨＣ遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む第１のヌクレオチド配列；キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のヌクレオチド配列；およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列であって、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む第３のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座から機能的なキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および／または第３のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座に位置する。非ヒト動物がマウスである一実施形態では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および／または第３のヌクレオチド配列は、マウス第１７染色体上の内在性マウスＭＨＣ遺伝子座に位置する。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座に位置する。一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩＩα遺伝子座に位置する。一実施形態では、第３のヌクレオチド配列は内在性非ヒトＭＨＣＩＩβ遺伝子座に位置する。

一実施形態では、非ヒト動物は、内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座からキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣ βＩＩポリペプチドのみを発現し、内在性非ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、機能的な内在性ＭＨＣＩ、ＩＩαおよび／またはＩＩβポリペプチド）は発現しない。一実施形態では、本明細書に記載の動物は、その細胞、例えば抗原提示細胞などの表面上に機能的なキメラＭＨＣＩおよび機能的なキメラＭＨＣＩＩを発現する。

一実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、そのヒト部分にヒトＭＨＣＩポリペプチドのペプチド結合性ドメインを含む。一態様では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメインを含む。この実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのα鎖の細胞外ドメインを含む。一実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのα１ドメインおよびα２ドメインを含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含む。

一態様では、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分および／またはキメラＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドおよび／またはヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのペプチド結合性ドメインを含む。一態様では、キメラＭＨＣＩＩαおよび／またはβポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣＩＩαおよび／またはβポリペプチドの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのα１ドメインを含み、別の実施形態では、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのα１ドメインおよびαドメインを含む。追加的な実施形態では、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのβ１ドメインを含み、別の実施形態では、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。

ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、またはＨＬＡ−Ｇ遺伝子座のいずれかによりコードされる機能的なヒトＨＬＡ分子由来のものであってよい。ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座によりコードされる機能的なヒトＨＬＡ分子由来のものであってよい。一般に使用されるＨＬＡ抗原および対立遺伝子の一覧は、参照により本明細書に組み込まれるＳｈａｎｋａｒｋｕｍａｒら（（２００４年）ＴｈｅＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４巻（２号）：９１〜１０３頁）に記載されている。Ｓｈａｎｋａｒｋｕｍａｒらにより、当技術分野において使用されるＨＬＡ命名法に関する簡単な説明も示されている。ＨＬＡ命名法および種々のＨＬＡ対立遺伝子に関する追加情報は、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈら（２００９年）ＴｈｅＨＬＡｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ２００８：ａｓｕｍｍａｒｙｏｆＨＬＡ−Ａ， −Ｂ， −Ｃ， −ＤＲＢ１／３／４／５，ａｎｄＤＱＢ１ａｌｌｅｌｅｓａｎｄｔｈｅｉｒａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄＨＬＡ−Ａ， −Ｂ， −Ｃ， −ＤＲ，ａｎｄ −ＤＱａｎｔｉｇｅｎｓ、ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ７３巻：９５〜１７０頁、およびＭａｒｓｈら（２０１０年）ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｆｏｒｆａｃｔｏｒｓｏｆｔｈｅＨＬＡｓｙｓｔｅｍ、２０１０年、ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ７５巻：２９１〜４５５頁による最近の更新に見いだすことができる。したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよび／またはＩＩポリペプチドは、それらに記載されている任意の機能的なヒトＨＬＡ分子由来のものであってよい。

いくつかのヒト疾患、例えば、ヒト自己免疫疾患に関連することが公知のヒトＨＬＡ分子、特定の多型ＨＬＡ対立遺伝子が特に興味深い。実際、関節リウマチ、１型糖尿病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、小児脂肪便症、クローン病、潰瘍性大腸炎、および他の自己免疫障害の発生と相関するＨＬＡ遺伝子座の特定の多型が同定されている。例えば、ＷｏｎｇおよびＷｅｎ（２００４年）ＷｈａｔｃａｎｔｈｅＨＬＡｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅｔｅｌｌｕｓａｂｏｕｔａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉａｂｅｔｅｓ？、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４７巻：１４７６〜８７頁；ＴａｎｅｊａおよびＤａｖｉｄ（１９９８年）ＨＬＡＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＭｉｃｅａｓＨｕｍａｎｉｚｅｄＭｏｕｓｅＭｏｄｅｌｓｏｆＤｉｓｅａｓｅａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１巻：９２１〜２６頁；Ｂａｋｋｅｒら（２００６年）、Ａｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＨＬＡａｎｄＳＮＰｈａｐｌｏｔｙｐｅｍａｐｆｏｒｄｉｓｅａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｉｎｔｈｅｅｘｔｅｎｄｅｄｈｕｍａｎＭＨＣ、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ３８巻：１１６６〜７２頁および補足情報；ならびにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭＨＣａｎｄＡｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙＧｅｎｅｔｉｃｓＮｅｔｗｏｒｋ（２００９年）ＭａｐｐｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｖａｒｉａｎｔｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅＭＨＣｒｅｇｉｏｎｆｏｒ７ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６巻：１８６８０〜８５頁を参照されたい。したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよび／またはＩＩポリペプチドは、特定の疾患、例えば自己免疫疾患に関連することが公知のヒトＨＬＡ分子由来のものであってよい。

特定の一態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドはヒトＨＬＡ−Ａに由来する。特定の実施形態では、ＨＬＡ−ＡポリペプチドはＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド（例えば、およびＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチド）である。一実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子によりコードされるポリペプチドである。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１対立遺伝子は、北アメリカ人の集団において共通して使用される。本実施例ではこの特定のＨＬＡ配列に関して記載しているが、任意の適切なＨＬＡ−Ａ配列、例えば、ヒト集団において示されるＨＬＡ−Ａ２の多型バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸改変を伴う配列、遺伝暗号の縮重に起因して本明細書に記載の配列とは異なる核酸配列などが本発明に包含される。

別の特定の態様では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃから選択されるヒトＭＨＣＩに由来する。一態様では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−Ｂ、例えばＨＬＡ−Ｂ２７に由来する。別の態様では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ６などに由来する。

特定の一態様では、本明細書に記載のヒト化ＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４に由来する。一般には、ＨＬＡ−ＤＲ α鎖は単型であり、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ複合体のα鎖はＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１遺伝子）によりコードされる。他方では、ＨＬＡ−ＤＲ β鎖は多型である。したがって、ＨＬＡ−ＤＲ４は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子によりコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４遺伝子）によりコードされるβ鎖を含む。下記の通り、ＨＬＡ−ＤＲ４は、いくつかの自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、１型糖尿病、多発性硬化症などの発生率に関連することが公知である。本発明の一実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１：０１：０１：０１である。別の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４、例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４：０１：０１である。本実施例ではこれらの特定のＨＬＡ配列について記載しているが、任意の適切なＨＬＡ−ＤＲ配列、例えば、ヒト集団において示される多型バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸改変を伴う配列、遺伝暗号の縮重に起因して本明細書に記載の配列とは異なる核酸配列などが本明細書に包含される。

キメラＭＨＣＩＩαおよび／またはβポリペプチドのヒト部分は、一般的なヒト疾患に関連することが公知のＨＬＡ対立遺伝子ヌクレオチド配列によりコードされ得る。そのようなＨＬＡ対立遺伝子としては、これだけに限定されないが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１^＊０５０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１^＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１^＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１^＊０１０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１^＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１^＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１^＊０５０１、およびこれらの組合せが挙げられる。ＨＬＡ対立遺伝子／疾患の関連の要約に関しては、参照により本明細書に組み込まれるＢａｋｋｅｒら（２００６年）、上記を参照されたい。

一態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチド（複数可）の非ヒト部分は、それぞれ内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばマウス、ラットなど）ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチド（複数可）の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含む。したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。非キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。一態様では、非ヒト動物はマウスであり、キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分はマウスＨ−２Ｋタンパク質に由来する。一態様では、動物はマウスであり、キメラＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドの非ヒト部分はマウスＨ−２Ｅタンパク質に由来する。したがって、キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｋに由来する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得、キメラＭＨＣＩＩαおよびβポリペプチドの非ヒト部分はマウスＨ−２Ｅタンパク質に由来する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。実施例では特定のＨ−２ＫおよびＨ−２Ｅ配列が意図されているが、任意の適切な配列、例えば、多型バリアント、保存的／非保存的アミノ酸置換などが本明細書に包含される。

キメラヒト／非ヒトポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトリーダー（シグナル）配列を含むようにすることができる。一実施形態では、キメラＭＨＣＩポリペプチドは内在性ＭＨＣＩポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。一実施形態では、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドは内在性ＭＨＣＩＩαポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。一実施形態では、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドは内在性ＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。代替の実施形態では、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチド（複数可）は、それぞれ、別の非ヒト動物、例えば、別のげっ歯類または別のマウス系統に由来するＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチド（複数可）の非ヒトリーダー配列を含む。したがって、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてよい。さらに別の実施形態では、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチド（複数可）は、それぞれヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩαおよび／またはヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒトリーダー配列（例えば、それぞれヒトＨＬＡ−Ａ２、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよび／またはヒトＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４のリーダー配列）を含む。

キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチドは、そのヒト部分に、それぞれ完全なまたは実質的に完全なヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩαおよび／またはヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。したがって、ヒト部分は、ヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩαおよび／またはヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよび／またはヒトＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４）をコードするアミノ酸の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、９５％以上を含み得る。１つの例では、実質的に完全なヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩαおよび／またはヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインはヒトリーダー配列を欠く。別の例では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩαおよび／またはキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドはヒトリーダー配列を含む。

さらに、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβポリペプチドは、それぞれ内在性非ヒトプロモーターおよび調節エレメント、例えばマウスＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよび／またはＭＨＣＩＩβ調節エレメントに作動可能に連結していてよい（例えば、その調節的制御の下で発現する）。そのような配置により、例えば非ヒト動物における免疫応答の間の非ヒト動物におけるキメラＭＨＣＩおよび／またはＭＨＣＩＩポリペプチドの適切な発現が容易になる。

遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、スイギュウ）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。適切な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手可能でない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作出するために他の方法が使用される。そのような方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変することおよび核移植を使用して、改変されたゲノムを適切な細胞、例えば卵母細胞に移植すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を非ヒト動物において適切な条件下で熟させて胚を形成することが挙げられる。

一態様では、非ヒト動物は哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、例えばＤｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小さな哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変動物はげっ歯類である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、げっ歯類は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ（例えばマウス様ハムスター（ｍｏｕｓｅ−ｌｉｋｅｈａｍｓｔｅｒ））、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス（ＮｅｗＷｏｒｌｄｒａｔｓａｎｄｍｉｃｅ）、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ（真性マウスおよび真性ラット（ｔｒｕｅｍｉｃｅａｎｄｒａｔｓ）、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ（キノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇｍｉｃｅ）、イワマウス（ｒｏｃｋｍｉｃｅ）、オジロハムスターモドキ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄｒａｔ）、マダガスカルラットおよびマダガスカルマウス（Ｍａｌａｇａｓｙｒａｔｓａｎｄｍｉｃｅ））、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ（例えば、メクラネズミ（ｍｏｌｅｒａｔｅｓ）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科の動物である。特定の実施形態では、遺伝子改変げっ歯類は、真性マウスまたは真性ラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、スナネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスはＭｕｒｉｄａｅ科のメンバーである。一実施形態では、動物はげっ歯類である。特定の実施形態では、げっ歯類はマウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物はマウスである。

特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９年）Ｒｅｖｉｓｅｄｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｆｏｒｓｔｒａｉｎ１２９ｍｉｃｅ、ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ１０巻：８３６頁を参照されたい。Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００年）ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＣｈｉｍｅｒａＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ１２９／ＳｖＥｖ− ａｎｄＣ５７ＢＬ／６−ＤｅｒｉｖｅｄＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＬｉｎｅｓも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上述の１２９系統と上述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合である。別の特定の実施形態では、マウスは、上述の１２９系統の混合、または上述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上述の系統の混合である。

一実施形態では、非ヒト動物はラットである。一実施形態では、ラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系統、スプラーグドーリー系統、フィッシャー系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、スプラーグドーリー、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉからなる群から選択される２種以上の系統の混合である。

したがって、一実施形態では、本発明は、そのゲノム内に、キメラヒト／マウスＭＨＣＩをコードする第１のヌクレオチド配列、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαをコードする第２のヌクレオチド配列、およびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変マウスに関する。キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、およびＭＨＣＩＩβのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、およびＭＨＣＩＩβの細胞外ドメインを含み得る。一実施形態では、マウスは、その内在性マウスＭＨＣ遺伝子座から機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、およびＭＨＣＩＩβポリペプチドを発現する。一実施形態では、マウスは、その内在性マウスＭＨＣ遺伝子座から機能的なマウスＭＨＣポリペプチド、例えば、機能的なマウスＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、およびＭＨＣＩＩβポリペプチドを発現しない。

一実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのペプチド結合性ドメインまたは細胞外ドメイン（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１）を含む。一部の実施形態では、マウスは、その内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座から内在性マウスＭＨＣＩポリペプチドのペプチド結合性ドメインまたは細胞外ドメインを発現しない。ヒトＭＨＣＩのペプチド結合性ドメインはα１ドメインおよびα２ドメインを含み得る。あるいは、ヒトＭＨＣＩのペプチド結合性ドメインはα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含み得る。一態様では、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメインはヒトＭＨＣＩα鎖の細胞外ドメインを含む。一実施形態では、内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座はＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）遺伝子座であり、キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分はマウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。したがって、一実施形態では、本発明のマウスは、その内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣＩをコードするヌクレオチド配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分はヒトＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分はマウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、マウスはキメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質を発現する。他の実施形態では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分は、他のマウスＭＨＣＩ由来のもの、例えば、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌなどであってよく、キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は他のヒトＭＨＣＩ由来のもの、例えば、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃなどであってよい。一態様では、マウスは、その内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座から機能的な内在性Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現しない。

一実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩαペプチド結合性ドメインまたは細胞外ドメインを含み、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩβペプチド結合性ドメインまたは細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、マウスは、内在性マウス遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ａおよび／またはＨ−２Ｅ遺伝子座）から内在性マウスαおよび／またはβポリペプチドのペプチド結合性ドメインまたは細胞外ドメインを発現しない。一部の実施形態では、マウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、Ｈ−２Ｅａ、およびこれらの組合せを含む機能的なＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする遺伝子を欠くゲノムを含む。ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのペプチド結合性ドメインはα１ドメインを含み得、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのペプチド結合性ドメインはβ１ドメインを含み得、したがって、キメラＭＨＣＩＩ複合体のペプチド結合性ドメインはヒトα１ドメインおよびβ１ドメインを含み得る。ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインはα１ドメインおよびα２ドメインを含み得、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインはβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み得、したがって、キメラＭＨＣＩＩ複合体の細胞外ドメインはヒトα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメインを含み得る。一実施形態では、キメラＭＨＣＩＩ複合体のマウス部分は、マウスＭＨＣＩＩ、例えばマウスＨ−２Ｅの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（例えば、マウスＨ−２Ｅα鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン）を含む。したがって、一実施形態では、本発明のマウスは、その内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαをコードするヌクレオチド配列を含み、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩのα鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４のα鎖）に由来する細胞外ドメインを含み、マウス部分はマウスＭＨＣＩＩ（例えば、Ｈ−２Ｅ）のα鎖に由来する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、かつ、マウスは、その内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβをコードするヌクレオチド配列を含み、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分はヒトＭＨＣＩＩのβ鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４のβ鎖）に由来する細胞外ドメインを含み、マウス部分はマウスＭＨＣＩＩ（例えば、Ｈ−２Ｅ）のβ鎖に由来する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、マウスは、キメラヒト／マウスＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する。他の実施形態では、キメラＭＨＣＩＩタンパク質のマウス部分は、他のマウスＭＨＣＩＩ、例えば、Ｈ−２Ａなど由来のものであってよく、キメラＭＨＣＩＩタンパク質のヒト部分は、他のヒトＭＨＣＩＩ、例えば、ＨＬＡ−ＤＱなどに由来するものであってよい。一態様では、マウスは、それらの内在性マウス遺伝子座から機能的な内在性Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅポリペプチドを発現しない（例えばマウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａポリペプチドを発現しない）。

さらなる実施形態では、本発明の非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えばマウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む。β２ミクログロブリンまたはＭＨＣクラスＩ複合体の軽鎖（「β２Ｍ」とも省略される）は、ＭＨＣＩα鎖を安定化するように主に機能する小さな（１２ｋＤａ）グリコシル化されていないタンパク質である。ヒトまたはヒト化ミクログロブリン動物の作製は、米国特許出願第１３／６６１，１５９号に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。本開示に記載のヒト化ＭＨＣ遺伝子座、および米国特許出願第１３／６６１，１５９号に記載のヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子座を含むマウスは、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、掛け合わせによって作製することができる。

遺伝子改変非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えば、ラットまたはマウスの種々の他の実施形態は本開示および参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６６１，１５９号および同第１３／６６１，１１６号開示から当業者には明らかであろう。

本発明の種々の態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩポリペプチドをコードする配列（複数可）は、内在性非ヒトＭＨＣ遺伝子座（例えばマウスＨ−２Ｋおよび／またはＨ−２Ｅ遺伝子座）に位置する。一実施形態では、これにより、内在性ＭＨＣ遺伝子（複数可）またはその一部の、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（複数可）の置き換えがもたらされる。ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよびＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、染色体上で互いの近傍に位置するので、１つの動物においてＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩの両方のヒト化の最大の成功を実現するためには、ＭＨＣＩ遺伝子座とＭＨＣＩＩ遺伝子座を逐次的に標的とするべきである。したがって、本明細書では、本明細書に記載のキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩαおよびＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法も提供される。

一部の実施形態では、当該方法では、実施例に記載の通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術、ＥＳ細胞への構築物の導入、およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用したマウス胚への標的ＥＳ細胞クローンの導入を使用して作出されたターゲティング構築物を利用する。

本明細書に記載の非ヒト動物を作製するために使用するヌクレオチド構築物も提供される。一態様では、ヌクレオチド構築物は、５’および３’非ヒト相同性アーム、ヒトＭＨＣ遺伝子配列（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはヒトＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子配列）を含むヒトＤＮＡ断片、および組換え部位と隣接する選択カセットを含む。一実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、ヒトＭＨＣ遺伝子（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子）のイントロンとエクソンの両方を含むゲノム断片である。一実施形態では、非ヒト相同性アームは、非ヒトＭＨＣ遺伝子座（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ遺伝子座）と相同である。特定の構築物が下記の実施例（例えば、ＭＨＣＩＩ構築物、ＭＡＩＤ１６８０については図６；ＭＨＣＩ構築物、ＭＡＩＤ１６６５については図８）、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６６１，１５９号および同第１３／６６１，１１６号に記載されている。

選択カセットは、目的の構築物に組み込まれた細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするためにターゲティング構築物に挿入されるヌクレオチド配列である。いくつかの適切な選択カセットが当技術分野で公知である。一般に、選択カセットにより、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下での正の選択が可能になる。さらに、選択カセットを組換え部位と隣接させ、それによりリコンビナーゼ酵素で処理した際に選択カセットの欠失を可能にすることができる。一般に使用される組換え部位は、それぞれＣｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によって認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものが当技術分野で公知である。一実施形態では、選択カセットはヒトＤＮＡ断片の５’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットはヒトＤＮＡ断片の３’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットはヒトＤＮＡ断片内に位置する。別の実施形態では、選択カセットはヒトＤＮＡ断片のイントロン内に位置する。

一実施形態では、５’および３’非ヒト相同性アームは、それぞれ、内在性非ヒト（例えばマウス）ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子遺伝子座の５’位および３’位のゲノム配列（例えば、第１のリーダー配列の５’およびマウスＭＨＣＩ遺伝子のα３エクソンの３’、またはマウスＨ−２Ａｂ１遺伝子の上流およびマウスＨ−２Ｅａ遺伝子の下流）を含む。一実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌから選択される。特定の実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座はマウスＨ−２Ｋである。一実施形態では、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座はマウスＨ−２ＥおよびＨ−２Ａから選択される。一実施形態では、工学的に操作されたＭＨＣＩＩ構築物により、マウスＨ−２Ｅ遺伝子とマウスＨ−２Ａ遺伝子の両方を置き換えることが可能になる。

したがって、一実施形態では、ヒト化ＭＨＣＩおよびＩＩタンパク質を発現することができる遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法であって、第１の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップ；および第２の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列を置き換えるステップは、ＥＳ細胞における相同組換えを含む。一実施形態では、第２の非ヒト動物はキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を担持するＥＳ細胞における相同組換えによって作製される。あるいは、ヒト化ＭＨＣＩおよびＩＩタンパク質を発現することができる遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法であって、第１の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップ；および第２の非ヒト動物を作製するために、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座において、非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換えるステップを含む方法も本明細書において提供される。そのような実施形態では、第２の非ヒト動物はキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を担持するＥＳ細胞における相同組換えによって作製される。

遺伝子ターゲティングが完了したら、ＥＳ細胞または遺伝子改変非ヒト動物をスクリーニングして、目的の外因性のヌクレオチド配列が上首尾に組み入れられたことまたは外因性のポリペプチドが発現することを確認する。多数の技法が当業者に公知であり、それらとして（これだけに限定されないが）サザンブロット法、ロングＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用したリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、フローサイトメトリー、ウエスタン分析、免疫細胞化学的検査、免疫組織化学的検査などが挙げられる。１つの例では、目的の遺伝子改変を担持する非ヒト動物（例えばマウス）は、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｇｅｎｏｍｅｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載の対立遺伝子アッセイの改変を使用して、マウス対立遺伝子喪失および／またはヒト対立遺伝子獲得についてスクリーニングすることによって同定することができる。遺伝子改変動物における特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定する他のアッセイは、当業者に公知である。

一態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質およびＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質）を発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載のキメラＭＨＣクラスＩ配列およびキメラＭＨＣクラスＩＩ配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現するＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、および網膜細胞から選択される。

本明細書に記載のＨＬＡ−ＤＲ４の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣＩＩ複合体は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって検出することができる。したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩポリペプチドをディスプレイする細胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して検出し、かつ／または選択することができる。本明細書に記載のＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣＩ複合体は、抗ＨＬＡ−Ａ抗体、例えば抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を使用して検出することができる。したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをディスプレイする細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ抗体を使用して検出し、かつ／または選択することができる。他のＨＬＡ対立遺伝子を認識する抗体は商業的に入手することもでき、作製することもでき、検出／選択のために使用することができる。

以下に続く実施例ではゲノムにマウスＨ−２Ｋ、およびＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、それぞれキメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質およびＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列での置き換えを含む遺伝子操作された動物について記載されているが、同様の戦略を使用して、他のヒトＭＨＣＩおよびＩＩ遺伝子（他のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ；および他のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ遺伝子）を含むキメラを導入することできることが当業者には理解されよう。内在性ＭＨＣ遺伝子座に多数のキメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣＩ遺伝子およびＭＨＣＩＩ遺伝子を含むそのような動物も提供される。

種々の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、細胞表面上にヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびＩＩを有し、結果として、複合体の構成成分の実質的に全てがヒトまたはヒト化であるので、ペプチドをエピトープとしてＴ細胞にヒト様の様式で提示する細胞、例えばＡＰＣを生成する。本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化動物におけるヒト免疫系の機能を試験するため；例えば、ワクチン開発において使用するための、免疫応答を引き出す抗原および抗原エピトープ（例えばＴ細胞エピトープ、例えば、独特のヒトがんエピトープ）を同定するため；ワクチン候補および他のワクチン戦略を評価するため；ヒト自己免疫を研究するため；ヒト感染症を研究するため；および他の点で、ヒトＭＨＣ発現に基づくよりよい治療戦略を考案するために使用することができる。

本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに例示する。これらの実施例は本発明の理解を補助するために記載されており、いかなる形でもその範囲を限定するものではなく、そのように解釈されるべきである。実施例には、当業者には周知であろう従来の方法（分子クローニング技法など）の詳細な説明は含まれない。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示されており、圧力は大気または大気付近の圧力である。
（実施例１）
キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座の工学的操作およびキメラＭＨＣＩＩマウスの作製
（実施例１．１）
内在性ＭＨＣクラスＩＩＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅ遺伝子座の欠失

内在性ＭＨＣクラスＩＩＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を導入するためのターゲティングベクターを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記を参照されたい）を使用して作出した。細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＤＮＡを、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａが欠失するように改変した。

簡単に述べると、上流および下流の相同性アームを、マウスＢＡＣＤＮＡのＰＣＲにより、それぞれＨ−２Ａｂ１遺伝子の５’位およびＨ−２Ｅａ遺伝子の３’位から引き出した。図５に示されている通り、これらの相同性アームを使用して、細菌相同組換え（ＢＨＲ）により、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａを含むＲＰ２３−４５８ｉ２２の約７９ｋｂが欠失したカセットを作出した。この領域をｌｏｘ６６部位およびｌｏｘ７１部位と隣接するハイグロマイシンカセットで置き換えた。５’から３’までの最終的なターゲティングベクターは、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ａｂ１遺伝子に対して５’側のマウスゲノム配列、５’ｌｏｘ６６部位、ハイグロマイシンカセット、３’ｌｏｘ７１部位を含む３４ｋｂの相同性アーム、および内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ｅａ遺伝子に対して３’側のマウスゲノム配列を含む６３ｋｂの相同性アームを含むものであった（ＭＡＩＤ５１１１、図６を参照されたい）。

ＢＡＣＤＮＡターゲティングベクター（上記）をマウスＥＳ細胞に電気穿孔により導入するために使用して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含む改変ＥＳ細胞を創製した。ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイによって内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含有する陽性ＥＳ細胞を同定した（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ（１９９８年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９巻：４３〜４８頁）。欠失した遺伝子座の上流領域を、プライマー５１１１ＵＦ（ＣＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣ；配列番号１）および５１１１ＵＲ（ＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＣ；配列番号２）およびプローブ５１１１ＵＰ（ＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＴＡＣＡ；配列番号３）を使用したＰＣＲによって確認し、欠失した遺伝子座の下流領域を、プライマー５１１１ＤＦ（ＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣ；配列番号４）および５１１１ＤＲ（ＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＣ；配列番号５）およびプローブ５１１１ＤＰ（ＡＧＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴ；配列番号６）を使用して確認した。ターゲティングベクター由来のハイグロマイシンカセットの存在を、プライマーＨＹＧＦ（ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣ；配列番号７）およびＨＹＧＲ（ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧ；配列番号８）およびプローブＨＹＧＰ（ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣ；配列番号９）を使用して確認した。欠失点の上流にわたるヌクレオチド配列（配列番号１０）は以下を含み、これには欠失点に存在するカセット配列に連続的に連結した欠失点の上流の内在性マウス配列（以下の括弧内に含まれる）が示されている：（ＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴ）ＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧ。欠失点の下流にわたるヌクレオチド配列（配列番号１１）は以下を含み、これには欠失点の下流の内在性マウス配列（以下の括弧内に含まれる）に連続したカセット配列が示されている：ＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣ（ＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＧＧＡＡＧＡ）。次いで、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（下記）を使用して、陽性ＥＳ細胞クローンを雌マウスに埋め込むために使用して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含有する同腹仔を生じさせた。

上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｉｃｅｔｈａｔａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｆｕｌｌｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｏｎｏｒｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄＥＳｃｅｌｌｓａｌｌｏｗｉｎｇｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｅｓ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座においてＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を担持するマウスを、対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それによりハイグロマイシンカセットの存在が検出され、内在性ＭＨＣクラスＩＩ配列の不在が確認された。

例えばＥＳ細胞段階または胚において除去されていない、ターゲティングベクターにより導入されたいかなるｆｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットも除去するために、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座においてＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を担持するマウスをＣｒｅｄｅｌｅｔｏｒマウス系統（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）と掛け合わせることができる。任意選択で、ハイグロマイシンカセットはマウス内に保持される。
（実施例１．２）
ヒト化Ｈ−２Ｅｂ１およびＨ−２Ｅａ遺伝子を含む大きなターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）の作製

ヒト化ＭＨＣＩＩ配列を導入するためのターゲティングベクターを図５に示されている通り設計した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用して、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２ＤＮＡを以下の種々のステップで改変した：（１）ＢＡＬＢ／ｃＨ−２Ｅａ遺伝子由来の機能的なＩ−Ｅαエクソン１を含むベクターを創製する（図５Ａ）；（２）マウスＩ−Ｅβ遺伝子のエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲβ１^＊０４のエクソン２およびエクソン３での置き換え、ならびにマウスＩ−Ｅαのエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲα１^＊０１のエクソン２およびエクソン３での置き換えを含むベクターを創製する（図５Ｂ）；（３）残りがマウスＩ−Ｅβエクソンである中でヒトＤＲβ１^＊０４のエクソン２およびエクソン３、ならびに残りがＢＡＬＢ／ｃマウス由来の機能的なＩ−Ｅαエクソン１（ステップ（１））を含めたマウスＩ−Ｅαエクソンである中でヒトＤＲα１^＊０１のエクソン２およびエクソン３を有するベクターを創製する（図５Ｃ）；ならびに（４）（３）で作製されたベクターを潜在的なスプライス部位を除去する（図５Ｄ）。

特に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでは、Ｉ−Ｅα遺伝子は非機能性のエクソン１が存在することに起因して偽遺伝子であるので、まず、ＢＡＬＢ／ｃＨ−２Ｅａ遺伝子由来の機能的なＩ−Ｅαエクソン１を含むベクターを創製した（図５Ａ）。ＲＰ２３−４５８ｉ２２ＢＡＣを、細菌相同組換え（１．ＢＨＲ）により、クロラムフェニコール耐性遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子で置き換えられるように改変した。得られたベクターを、ＢＨＲにより、Ｉ−Ａコード領域およびＩ−Ｅコード領域全体が、組換え部位と隣接するネオマイシンカセットで置き換えられるようにさらに改変した（２．ＢＨＲ）。ＢＡＬＢ／ｃＩ−Ｅαリーダーをコードするエクソン（エクソン１）ならびにＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＩ−ＣｅｕＩ制限部位と隣接するクロラムフェニコール遺伝子を含む構築物を用いた別のラウンドのＢＨＲ（３．ＢＨＲ）により、機能的なＢＡＬＢ／ｃＨ−２Ｅａエクソン１を含むベクターがもたらされた。

独立に、マウスＩ−Ｅβ遺伝子のエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲβ１^＊０４のエクソン２およびエクソン３での置き換え、ならびにマウスＩ−Ｅαのエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲα１^＊０１のエクソン２およびエクソン３での置き換えを含むベクターを作製するために、ＲＰ２３−４５８ｉ２２ＢＡＣをいくつかの相同組換えステップ、４．ＢＨＲ〜８．ＢＨＲによって改変した（図５Ｂ）。得られた核酸配列は、上記のＢＡＬＢ／ｃＩ−Ｅαエクソン１を有する構築物にライゲーションを可能にするためのＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ制限部位と隣接するものであった（図５Ｃ）。

図５Ｃに示されている最終的な構築物の配列は、ＢＡＬＢ／ｃイントロンの３’末端の潜在的なスプライス部位を含むものであった。いくつかのＢＨＲステップ（１１．ＢＨＲ〜１２．ＢＨＲ）、その後の欠失ステップを実施して、ＥＳ細胞に電気穿孔により導入するために使用する最終的なターゲティングベクター（ＭＡＩＤ１６８０）を得た（図５Ｄ）。

詳細には、最終的なターゲティングベクター（ＭＡＩＤ１６８０）は、５’から３’までに、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ａｂ１遺伝子のすぐ上流で終わる約２６ｋｂのマウスゲノム配列からなる５’マウス相同性アーム；ヒト化ＭＨＣＩＩβ鎖遺伝子（ヒト化Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子）およびヒト化ＭＨＣＩＩα鎖遺伝子（ヒト化Ｈ−２Ｅａ遺伝子）ならびにｆｌｏｘｅｄネオマイシンカセットを含有する約５９ｋｂの挿入断片；ならびに内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ｅａ遺伝子のすぐ下流から始まる約５７ｋｂのマウスゲノム配列からなる３’マウス相同性アームで構成されるものであった。５’アームと挿入断片の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１２）は以下を含むものであった：
、イタリック体で示されている配列は独特のＰＩ−ＳｃｅＩ部位であり、５’相同性アーム内のマウスゲノム配列が括弧内に示されている。挿入断片と３’アームの接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１３）は以下を含むものであった：ＣＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧＣＴＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＧ（ＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣ）、３’相同性アーム内のマウスゲノム配列が括弧内に示されている。

約５９ｋｂの挿入断片内で、Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子を以下の通り改変した：イントロン１の最後の１５３ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の１２２ｂｐを含むＨ−２Ｅｂ１の５１３６ｂｐの領域を、イントロン１の最後の１４８ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の１３２ｂｐを含む３１１１ｂｐのヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４の相同な領域で置き換えた。ヒトイントロン３配列とマウスイントロン３配列の接合部に、５’ｌｏｘ２３７２部位、ＵｂＣプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、および３’ｌｏｘ２３７２部位からなるカセットを挿入した。生じた遺伝子は、マウスＨ−２Ｅｂ１リーダー、ＤＲＢ１^＊０４由来のヒトβ１ドメインおよびβ２ドメイン、ならびにマウス膜貫通ドメインおよび細胞質尾部で構成されるキメラＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４／Ｈ−２Ｅｂ１タンパク質をコードするものであった。イントロン１内のマウス／ヒト接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１４）は以下を含むものであった：
、イタリック体で示されている配列はクローニングステップの間に導入された多重クローニング部位であり、マウスイントロン１配列が括弧内に示されている。ヒトイントロン３とネオマイシンカセットの接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１５）は以下を含むものであった：
、５’ｌｏｘ２３７２部位がイタリック体で示されており、ヒトイントロン３配列が括弧内に示されている。ネオマイシンカセットとマウスイントロン３の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１６）は以下を含むものであった：
、３’ｌｏｘ２３７２部位がイタリック体で示されており、マウスイントロン３配列が括弧内に示されている。

同様に、約５９ｋｂ挿入断片内で、Ｈ−２Ｅａ遺伝子を以下の通り改変した：イントロン１の最後の１０１ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の６６ｂｐを含むＨ−２Ｅａの１１８５ｂｐの領域を、イントロン１の最後の１０４ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の６６ｂｐを含む１１８９ｂｐのヒトＨＬＡ−ＤＲＡ１^＊０１の相同な領域で置き換えた。上記の通り、Ｈ−２ＥａのＣ５７ＢＬ／６対立遺伝子のエクソン１は遺伝子を非機能性にする欠失を含有するので、Ｈ−２Ｅａエクソン１およびイントロン１の残部を、機能的である、等価のＨ−２ＥａのＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子由来の２６１６ｂｐ領域で置き換えた。生じた遺伝子は、ＢＡＬＢ／ｃ由来のマウスＨ−２Ｅａリーダー、ＤＲＡ１^＊０１由来のヒトα１ドメインおよびα２ドメイン、ならびにマウス膜貫通ドメインおよび細胞質尾部で構成されるキメラＨ−２Ｅａ／ＨＬＡ−ＤＲＡ１^＊０１タンパク質をコードするものであった。イントロン１内のマウス／ヒト接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１７）は以下を含むものであった：
、イタリック体で示されている配列はクローニングステップの間に導入された制限酵素部位であり、ＢＡＬＢ／ｃイントロン１配列が括弧内に示されている。イントロン３内のヒト／マウス接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１８）は以下を含むものであった：
、イタリック体で示されている配列はクローニングステップの間に導入された制限酵素部位であり、マウスイントロン３配列が括弧内に示されている。エクソン１の５’側のＣ５７Ｂｌ／６−ＢＡＬＢ／ｃ接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１９）は以下を含むものであった：（ＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴ）ＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣ、Ｃ５７ＢＬ／６に特異的な配列が括弧内に示されている。エクソン１の３’側のＢＡＬＢ／ｃ−Ｃ５７ＢＬ／６接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号２０）は以下を含むものであった：
、ＳａｃＩＩ制限部位がイタリック体で示されており、Ｃ５７ＢＬ／６配列が括弧内に示されている。
（実施例１．３）
ヒト化ＭＨＣＩＩマウスの作製

実施例１．２のベクターを使用してヒト化ＭＨＣＩＩマウスを作製するための戦略の簡易図が図６に示されている。

特に、ＭＡＩＤ１６８０ＢＡＣＤＮＡ（上記）をＭＡＩＤ５１１１ＥＳ細胞に電気穿孔により導入するために使用して、内在性マウスＩ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を含むゲノム断片での置き換えを含む改変ＥＳ細胞を創製した。キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を含むゲノム断片で置き換えられた内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の欠失を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ（ＬｉｅａｎｄＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、上記）を使用した定量的ＰＣＲアッセイによって同定した。ヒトＤＲα配列の挿入を、プライマーｈＤＲＡ１Ｆ（ＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧ；配列番号２１）、ｈＤＲＡ１Ｒ（ＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣ；配列番号２２）、およびプローブｈＤＲＡ１Ｐ（ＣＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧ；配列番号２３）を使用したＰＣＲによって確認した。ヒトＤＲβ配列の挿入を、プライマーｈＤＲＢ１Ｆ（ＡＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＧ；配列番号２４）、ｈＤＲＢ１Ｒ（ＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣ；配列番号２５）、およびプローブｈＤＲＢ１Ｐ（ＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＡ；配列番号２６）を使用したＰＣＲによって確認した。ターゲティングベクターからのハイグロマイシンカセットの喪失を、プライマーＨＹＧＦ（ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣ；配列番号７）およびＨＹＧＲ（ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧ；配列番号８）およびプローブＨＹＧＰ（ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣ；配列番号９）を用いて確認した。

次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（上記）を使用して雌マウスに埋め込むために使用して、内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座のキメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座での置き換えを含有する同腹仔を生じさせた。上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した。キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を担持するマウスを対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それにより、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座の存在が検出された。

例えばＥＳ細胞段階または胚において除去されていない、ターゲティングベクターにより導入されたいかなるｆｌｏｘｅｄネオマイシンカセットも除去するために、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を担持するマウスをＣｒｅｄｅｌｅｔｏｒマウス系統（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）と掛け合わせることができる（図７を参照されたい）。
（実施例２）
キメラヒト／マウスＭＨＣＩ遺伝子座の工学的操作およびキメラＭＨＣＩマウスの作製

マウスＨ−２Ｋ遺伝子を、ヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して独特のターゲティングベクターを構築することによって単一のステップでヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｇｅｎｏｍｅｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１７３ｋ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＤＮＡを、相同組換えにより、マウスＨ−２Ｋ遺伝子のα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードするゲノムＤＮＡが、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子のα１サブユニット、α２サブユニットおよびα３サブユニットをコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換えられるように改変した（図８）。

簡単に述べると、Ｈ−２Ｋ遺伝子のマウスα１サブユニット、α２サブユニットおよびα３サブユニットをコードするゲノム配列を、ヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子のα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡで、５’非翻訳領域（ＵＴＲ；５’相同性アームは配列番号２７に記載されている）を含むマウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’側の配列を含有する５’マウス相同性アームおよびマウスＨ−２Ｋα３コード配列の３’側のゲノム配列を含有する３’マウス相同性アーム（３’相同性アームは配列番号２８に記載されている）を伴うｌｏｘＰ部位と隣接するハイグロマイシンカセットを含むターゲティングベクターを使用した単一のターゲティング事象で置き換える。

内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座にターゲティングするための最終的な構築物は、５’から３’までに、（１）５’ＵＴＲを含む内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子の５’側の約２００ｂｐのマウスゲノム配列を含有する５’相同性アーム、（２）ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１リーダー配列、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１リーダー／α１イントロン、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ α１〜α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１α２エクソン、α２〜α３イントロンの約３１６ｂｐの５’末端を含む約１３３９ｂｐのヒトゲノム配列、（３）５’ｌｏｘＰ部位、（４）ハイグロマイシンカセット、（５）３’ｌｏｘＰ部位、（６）α２〜α３イントロンの約３０４ｂｐの３’末端、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１α３エクソンを含む約５８０ｂｐのヒトゲノム配列、および（７）マウスＨ−２Ｋ α３と膜貫通コード配列の間のイントロンを含む約２００ｂｐのマウスゲノム配列を含有する３’相同性アーム（Ｈ−２Ｋターゲティングベクターの略図については図８を参照されたい）。ターゲティングベクターの５’に存在するマウス／ヒト配列の接合部の１４９ヌクレオチドの配列は配列番号２９に記載されており、ターゲティングベクターの３’に存在するヒト／マウスの配列の接合部の１５９ヌクレオチドの配列は配列番号３０に記載されている。このターゲティングベクターを用いた相同組換えにより、翻訳されるとキメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の形成を導く、内在性マウスＨ−２Ｋ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインコード配列に作動可能に連結したＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子のα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する改変マウスＨ−２Ｋ遺伝子座を創製した。

有核細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、好中球）の表面上にキメラＭＨＣクラスＩタンパク質を発現するマウスを作製するために、ターゲティングＢＡＣＤＮＡをマウスＦ１Ｈ４ＥＳ細胞に電気穿孔により導入するために使用して、改変ＥＳ細胞を創製した。ヒトＨＬＡ配列の挿入断片を含有するＥＳ細胞を定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイによって同定した。ヒトＨＬＡ配列および付随する選択カセットの挿入断片（対立遺伝子獲得、ＧＯＡ）および内在性マウス配列の喪失（対立遺伝子喪失、ＬＯＡ）を検出するために、特異的なプライマーセットおよびプローブを設計した。表２には、定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用したプローブのそれぞれについての名称および検出位置が識別されている。

選択カセットは当業者に公知の方法によって除去することができる。例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子配列を含有するターゲティング構築物を挿入することによって導入された「ｆｌｏｘｅｄ」ハイグロマイシンカセットを除去するために、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩ遺伝子座を担持するＥＳ細胞にＣｒｅを発現する構築物をトランスフェクトすることができる（図８を参照されたい）。ハイグロマイシンカセットは、任意選択で、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによって除去することができる。任意選択で、ハイグロマイシンカセットはマウス内に保持される。

上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｉｃｅｔｈａｔａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｆｕｌｌｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｏｎｏｒｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄＥＳｃｅｌｌｓａｌｌｏｗｉｎｇｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｅｓＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。キメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を独立に担持するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それにより、独特のヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子配列の存在が検出された。
（実施例３）
キメラＭＨＣＩ遺伝子およびＭＨＣＩＩ遺伝子を含むマウスの作製および特徴付け
（実施例３．１）
キメラＭＨＣＩおよびＩＩ遺伝子を含むマウスの作製

キメラＭＨＣＩ遺伝子およびＭＨＣＩＩ遺伝子を含むマウスを作製するための戦略は、図４に示されている。具体的には、ＭＡＩＤ１６６５ＢＡＣＤＮＡ（上の実施例２に記載されているＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫＢＡＣ）をＭＡＩＤ１６８０ＥＳ細胞（実施例１に記載のヒト化ＭＨＣＩＩ遺伝子を担持するＥＳ細胞）に電気穿孔により導入するために使用して、キメラヒト／マウスＭＨＣＩ遺伝子およびＭＨＣＩＩ遺伝子を含む改変ＥＳ細胞を創製した。キメラＭＨＣＩ遺伝子とキメラＭＨＣＩＩ遺伝子の両方を含有する陽性ＥＳ細胞を、上の実施例１および２に記載のプライマーおよびプローブを使用したＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、上記）を使用した定量的ＰＣＲアッセイによって同定した。

ＨＹＧ選択カセットおよびＮＥＯ選択カセットは当業者に公知の方法によって除去することができる。例えば、ターゲティング構築物を挿入することによって導入された「ｆｌｏｘｅｄ」ハイグロマイシンおよびネオマイシンカセットを除去するために、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子座を担持するＥＳ細胞に、Ｃｒｅを発現する構築物をトランスフェクトすることができる（図４、図７、および図８を参照された）。選択カセットは、任意選択で、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによって除去することができる。任意選択で、選択カセットはマウス内に保持される。

上記のヒト化ＭＨＣＩとヒト化ＭＨＣＩＩの両方を含む標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｉｃｅｔｈａｔａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｆｕｌｌｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｏｎｏｒｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄＥＳｃｅｌｌｓａｌｌｏｗｉｎｇｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｅｓＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。キメラＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子を担持するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定した。
（実施例３．２）
キメラＭＨＣＩおよびＩＩ遺伝子を含むマウスの特徴付け

ＷＴまたは２重ヘテロ接合性ヒト化ＨＬＡ−Ａ２／ＨＬＡ−ＤＲ４マウス（「１６６６ＨＥＴ／１６８１ＨＥＴ」または「Ｈ−２Ｋ^{＋／１６６６}ＭＨＣ−ＩＩ^{＋／１６８１}」）由来の脾臓を、コラゲナーゼＤ（ＲｏｃｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて灌流し、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解させた。ヒトＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−ＤＲ４の細胞表面での発現を、蛍光色素でコンジュゲートした抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＨＬＡ−Ａ２（ＢＢ７．２）および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）を使用したＦＡＣＳによって分析した。ＢＤ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用してフローサイトメトリーを実施した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞の表面上でヒトＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−ＤＲ４の両方の発現が明白に検出可能であった（図９）。
均等物

当業者は、常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を理解する、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

全ての非特許文献、本出願全体を通して引用されている特許出願および特許の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

本明細書に記載の発明。