JP2018117615A

JP2018117615A - 試験試料がＥｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法

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Publication number: JP2018117615A
Application number: JP2017232228A
Authority: JP
Inventors: 佳織山口; Yoshiori Yamaguchi; 幸嗣瓜生; Yukitsugu Uryu
Original assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Current assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2018-08-02
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: JP7012200B2; US10538801B2; US20180208961A1

Abstract

【課題】試験試料がExserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法を提供する。【解決手段】本発明は、試験試料がExserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する以下の工程を具備する方法である。（ａ）貫通孔を有さないセルロースフィルムの表側の面に試験試料を配置し、（ｂ）試験試料を所定時間、静置し、（ｃ）フィルムの裏面を観察し、（ｄ）フィルムの裏面に真菌が見いだされた場合には、試験試料はExserohilum属の植物病原性真菌を含有すると判定する。工程（ｂ）の前に試験試料に培地を供給するかまたは工程（ｂ）でフィルムの裏面を培地に接触させながら試験試料が静置される。培地は、カルベンダジウム、キャプタン、ストレプトマイシン硫酸塩、およびネオマイシン硫酸塩を含有しているラクトースカゼイン加水分解寒天培地である。【選択図】図８

Description

本発明は、試験試料がExserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法に関する。

特許文献１は、糸状菌計量方法を開示している。図１２は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。特許文献１に開示された糸状菌計量方法は、被験材料中の糸状菌数を計量するのに短時間の培養で糸状菌を計量し、また、正確な糸状菌を計量することができる糸状菌計量方法を提供することを目的としている。この糸状菌計量方法は、液体培養で培養した糸状菌１３、または微多孔膜支持体４の微多孔膜１上で培養した糸状菌１３の複数に伸びた偽菌糸を撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段１０で認識し解析させることにより、糸状菌１３を短時間の培養で計量できるという作用を有する。微多孔膜１は、押さえリング２およびベース３の間に挟まれている。

非特許文献１は、植物病原性卵菌の１種であるPhytophthora sojaeの偽菌糸が、３マイクロメートルの孔を有するＰＥＴ膜を貫通することを開示している。
非特許文献２は、Exserohilum属の真菌のみがよく成長する半選択培地を開示している。

特開２００５−２８７３３７号公報特開２０１６−２２０６６７号公報特開２０１６−２２０６６８号公報

Paul F. Morris. et. al. "Chemotropic and Contact Responses of Phytophthora sojae Hyphae to Soybean Isoflavonoids and Artificial Substrates", Plant Physiol. (1998) 117: 1171-1178 Roberto Luis De Rossi et. al. "Semi-selective culture medium for Exserohilum turcicum isolation from corn seeds", Summa Phytopathol., Botucatu, vol. 40, no. 2, p. 163 - 167, 2014

本発明の目的は、試験試料がExserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法を提供することである。

本発明は、試験試料が、Exserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）貫通孔を有さないセルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記試験試料を所定時間、静置する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に前記セルロースフィルムを貫通した真菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記Exserohilum属の植物病原性真菌を含有すると判定する工程、
ここで、
前記方法は、さらに
前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程を具備し、かつ
前記培地は、
カルベンダジウム、
キャプタン、
ストレプトマイシン硫酸塩、および
ネオマイシン硫酸塩を含有している
ラクトースカゼイン加水分解寒天培地である。

本発明はまた、試験試料が、Exserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）貫通孔を有さないセルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記試験試料を所定時間、静置する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に前記セルロースフィルムを貫通した真菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記Exserohilum属の植物病原性真菌を含有すると判定する工程、
ここで、
前記工程（ｂ）において、前記セルロースフィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置され、かつ
前記培地は、
カルベンダジウム、
キャプタン、
ストレプトマイシン硫酸塩、および
ネオマイシン硫酸塩を含有している
ラクトースカゼイン加水分解寒天培地である。

本発明は、試験試料がExserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法を提供する。

図１は、第１容器１００の断面図を示す。図２は、基板１７０の裏面に支持されたセルロースフィルム１０４の断面図を示す。図３は、試験試料が供給された第１容器１００の断面図を示す。図４は、植物病原性真菌が表面に配置されたセルロースフィルム１０４の断面図を示す。図５は、植物病原性真菌がセルロースフィルム１０４を貫通した様子を示す断面図である。図６は、真菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。図７は、図６に続き、真菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。図８は、セルロースフィルム１０４の裏面から真菌を観察する様子を示す断面図である。図９は、セルロースフィルム１０４の裏面から真菌を観察する様子を示す断面図である。図１０は、実施例１Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面の顕微鏡写真である。図１１は、比較例２Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面の顕微鏡写真である。図１２は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。

用語「植物病原性」とは、植物に対して病原性を有していることを意味する。用語「植物非病原性」とは、植物に対して病原性を有していないことを意味する。真菌が病原性を有しているとしても、植物に対して病原性を有していないのであれば、その真菌は「植物非病原性」である。言い換えれば、真菌が植物に対して悪影響を与えないのであれば、その真菌は「植物非病原性」である。用語「植物非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「植物」を修飾しない。接頭語「非」は「病原性」を修飾する。

以下、本発明の実施形態が図面を参照しながら詳細に説明される。

（工程（ａ））
工程（ａ）では、１４．５マイクロメートル以下の厚みを有するセルロースフィルムの表側の面に試験試料が配置される。一例として、セルロースフィルムは、０．０４マイクロメートル以上１４．５マイクロメートル以下の厚みを有する。０．０４マイクロメートル未満の厚みを有するセルロースフィルムを形成することは困難であろう。一方、１４．５マイクロメートルを超える厚みを有するセルロースフィルムをExserohilum属の植物病原性真菌が貫通するにはあまりにも長い時間を要する。従って、そのような厚みを有するセルロースフィルムは実用的ではない。

具体的には、図１に示されるように、容器１００が用意される。容器１００は、上端にフランジ１０２を具備していることが望ましい。容器１００の底面は、セルロースフィルム１０４から形成されている。セルロースフィルム１０４は、基板（図１では図示せず）に支持されていることが望ましい。このことについては、後述される。

図３に示されるように、この容器１００の内部に、試験試料２００が供給される。このようにして、セルロースフィルム１０４の表面１０４ａ上に試験試料２００が配置される。試験試料２００が植物病原性真菌２０２を含有している場合、図４に示されるように、セルロースフィルム１０４の表面１０４ａ上に植物病原性真菌２０２が配置される。

試験試料２００は、固体、液体、または気体である。試験試料２００は、固体または液体であることが望ましい。固体の試験試料２００の例は、土壌または破砕された植物である。他の例は、バーミキュライト、ロックウール、またはウレタンのような農業資材である。液体の試験試料２００の例は、農業用水、水耕栽培のために用いられた溶液、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、または作業者の衣類あるいは靴を洗浄するために使用した後の液体である。

（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）の後、試験試料２００が所定の培養時間、静置される。一例として、培養時間は、２４時間である。

図２に示されるように、セルロースフィルム１０４は、表側の面１０４ａおよび裏側の面１０４ｂの少なくともいずれか一方に、貫通孔１７２を具備する基板１７０を具備し得る。図２では、セルロースフィルム１０４は、表側の面に基板１７０を具備する。言い換えれば、図２では、基板１７０は、裏側の面１７０ｂにセルロースフィルム１０４を具備している。貫通孔１７２の直径は５マイクロメートルを超えることが望ましい。より望ましくは、貫通孔１７２の直径は８マイクロメートル以上であることが望ましい。貫通孔１７２の直径が５マイクロメートル以下の場合には、貫通孔１７２の内部に植物非病原性真菌がほとんど到達せず、その結果、植物非病原性真菌がセルロースフィルム１０４の表面に接することができない。このことについての詳細は、特許文献２および特許文献３を参照せよ。

言うまでもないが、セルロースフィルム１０４がピンと張られる限り、基板１７０は不要である。言い換えれば、セルロースフィルム１０４をピンと張ることが困難である場合に、セルロースフィルム１０４をサポートするための基板１７０が用いられる。

参照符号１７０ａは、基板１７０の表側の面を表している。図２に示されるように、基板１７０は複数の貫通孔１７２を有することが望ましい。基板１７０の厚みは限定されないが、一例として１マイクロメートル以上５００マイクロメートル以下である。セルロースフィルム１０４は非常に薄い。しかし、このような基板１７０上にセルロースフィルム１０４が配置されると、セルロースフィルム１０４の取り扱いが容易となる。なお、図２に示されるように、セルロースフィルム１０４は、貫通孔を有していないことに留意せよ。

本実施形態においては、試験試料２００に培地が供給される。非特許文献２に開示されるように、培地は、カルベンダジウム、キャプタン、ストレプトマイシン硫酸塩、およびネオマイシン硫酸塩を含有しているラクトースカゼイン加水分解寒天培地である。当該培地を用いることにより、Exserohilum属の植物病原性真菌のみがセルロースフィルム１０４を貫通して、工程（ｄ）において選択的にセルロースフィルム１０４の裏面に現れる。言い換えれば、Exserohilum属の植物病原性真菌以外の植物病原性真菌は、工程（ｄ）においてセルロースフィルム１０４の裏面に現れない。

具体的には、試験試料２００を含有する容器１００の内部に培地が供給される。培地は液体であることが望ましい。培地は、工程（ｂ）において供給される。これに代えて、培地は工程（ｂ）よりも前に供給される。言い換えれば、培地は工程（ａ）において供給される。培地は工程（ａ）の前に容器１００の内部に供給されても良い。

図６は、培地の供給の他の形態を示す。図６に示されるように、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂを液体の培地３０２に接触させることが望ましい。まず、液体の培地３０２を内部に有する第２容器３００が用意される。以下、第２容器３００から区別するため、容器１００は「第１容器１００」と呼ばれる。フランジ１０２の下面が第２容器３００の上端に接触するように、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる。言い換えれば、第１容器１００が第２容器３００の上端によって支持される。このようにして、液体の培地３０２がセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に挟まれる。

あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に液体の培地３０２が供給されても良い。

液体の培地３０２に代えて、粘性を有する固体の培地も用いられ得る。図６に示されるように、固体の培地３０４および液体の培地３０２の両者が用いられ得る。この場合、液体の培地３０２が固体の培地３０４およびセルロースフィルム１０４の間に挟まれる。図５に示されるように、裏面１０４ｂに現れた植物病原性真菌の培養が、液体培地３０２および固体培地３０４の少なくとも一方により加速される。

（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）の後、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂが観察される。光学顕微鏡を用いて裏面１０４ｂが観察されることが望ましい。

工程（ｂ）において説明されたように、Exserohilum属の植物病原性真菌２０２のみが、セルロースフィルム１０４を貫通して、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れる。一方、Exserohilum属の植物病原性真菌以外の植物病原性真菌は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このように、本発明では、Exserohilum属の植物病原性真菌２０２のみが、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに選択的に現れる。

工程（ｃ）では、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性真菌２０２が現れているかどうかが観察される。

具体的には、以下のようにして、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性真菌２０２が現れているかどうかが観察される。

図８に示されるように、セルロースフィルム１０４の表面１０４ａ上に配置された光源５００からの光をセルロースフィルム１０４に照射しながら、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された顕微鏡６００を用いて、植物病原性真菌２０２が光学的に観察される。

第２容器３００から液体の培地３０２および固体の培地３０４が除去される。次いで、第２容器３００の内部に、真菌蛍光液４０２が添加される。次いで、図７に示されるように、第１容器１００は、真菌蛍光液４０２を内部に有する第２容器３００に重ね合わされる。あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に真菌蛍光液４０２が供給されても良い。

セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた植物病原性真菌２０２の一部分は、真菌染色液４０２により染色される。第二容器３００と第一容器１００はセルロースフィルム１０４によって隔てられているので、真菌蛍光液４０２は第１容器１００の内部には広がらない。従って、第１容器１００に含有されている植物非病原性真菌は、真菌蛍光液４０２により染色されない。

図９に示されるように、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された落射蛍光顕微鏡６００を用いて、真菌蛍光剤４０２により染色されている植物病原性真菌２０２が観察される。言うまでもないが、植物病原性真菌２０２は真菌蛍光剤４０２を用いずに観察され得る。

（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、工程（ｃ）においてセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに真菌が見いだされた場合には、試験試料はExserohilum属の植物病原性真菌を含有すると判定される。言うまでもないが、工程（ｃ）においてセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに真菌が見いだされなかった場合には、試験試料はExserohilum属の植物病原性真菌を含有しないと判定される。

（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。

（実験例１）
（Exserohium turcicumの培養）
植物病原菌の一種であるExserohium turcicumが、Ｖ−８寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で１週間静置された。Exserohium turcicumは、テキサスＡ＆Ｍ大学の植物病理学微生物学部門に所属するシム教授より与えられた。

次いで、菌糸の先端を含む部分が、培地と共に１センチメートル×１センチメートルの大きさで切り出された。切り出された部分は、１２ウェルプレート上に配置された純水に浸された。各純水の容積は１ミリリットルであった。

１２ウェルプレート上に配置された水が光学顕微鏡で観察された。その結果、１２ウェルプレート上に配置された水にExserohium turcicumの胞子が放出されていることが確認された。このようにして、Exserohium turcicumを含有する水溶液が得られた。以下、この水溶液は、「植物病原性真菌水溶液」と呼ばれる。

（培地の用意）
本発明者らは、非特許文献２の開示内容に従って、以下の４つの試薬をラクトースカゼイン加水分解寒天培地に添加して、液体培地３０２を調製した。

カルベンダジウム６０ミリグラム／リットル
キャプタン３０ミリグラム／リットル
ストレプトマイシン硫酸塩６００ミリグラム／リットル
ネオマイシン硫酸塩３００ミリグラム／リットル

このようにして調製された液体培地３０２は、第２容器３００に供給された。

（実験例１）
実験例１は、実施例１Ａ〜実施例１Ｇからなる。

（実施例１Ａ）
図１に示される第１容器１００が以下のように用意された。

まず、セルロース（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手、商品名：ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１）がイオン液体に溶解され、７％の濃度を有するセルロース溶液が調製された。イオン液体は、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手）であった。

セルロース溶液は、摂氏６０度に加温された。次に、セルロース溶液が、底面にポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器（ミリポア社より入手、商品名：Millicell PIEP 12R 48）の裏面にスピンコート法により３０秒間、２０００ｒｐｍの回転速度で塗布された。ポリエチレンテレフタラートフィルムは、基板１７０として機能した。ポリエチレンテレフタラートフィルムは、複数の貫通孔１７２をランダムに有していた。このようにして、ポリエチレンテレフタラートフィルムの裏側の面に、１４．５マイクロメートルの厚みを有するセルロースフィルム１０４が形成された。

容器は、エタノール中で１２時間、室温で静置された。このようにして、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅは、エタノールに置換された。言い換えれば、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅがセルロースフィルム１０４から除去された。

最後に、容器は真空デシケーター内で乾燥された。このようにして、図１に示される第１容器１００が得られた。図１においては、基板１７０として機能するポリエチレンテレフタラートフィルムが図示されていないことに留意せよ。

次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂは、液体の培地３０２に接していた。続いて、第１容器１００の内部に、２００マイクロリットルの体積を有する水が添加された。さらに、１０００個のExserohium turcicumの胞子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。

第１容器１００は、摂氏３０度の温度で２４時間静置された。言い換えれば、実施例１Ａでは、培養時間は２４時間であった。

セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れたExserohium turcicumの菌糸の数が光学顕微鏡を用いて目視により数えられた。実施例１Ａは１５回繰り返された。その結果、裏面１０４ｂに現れたExserohium turcicumの菌糸の数の平均値は３５．５であった。図１０は、実施例１Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。

（実験例２）
実験例２では、Exserohium turcicumに代えてGibberella fujikuroiを用いたこと以外は、実験例１と同様の実験が行われた。実験例２は、比較例２Ａ〜比較例２Ｇからなる。Gibberella fujikuroiは、Exserohium turcicumと同様、植物病原性真菌の１種である。

（実験例３）
実験例３では、Exserohium turcicumに代えてFusarium avenaceumを用いたこと以外は、実験例１と同様の実験が行われた。実験例３は、比較例３Ａ〜比較例３Ｇからなる。Fusarium avenaceumは、Exserohium turcicumと同様、植物病原性真菌の１種である。

（実験例４）
実験例４では、Exserohium turcicumに代えてGlomerella tucumanensisを用いたこと以外は、実験例１と同様の実験が行われた。実験例４は、比較例４Ａ〜比較例４Ｇからなる。Glomerella tucumanensisは、Exserohium turcicumと同様、植物病原性真菌の１種である。

以下の表１〜表４は、実験例１〜実験例４においてセルロースフィルム１０４を貫通した菌糸の数を侵入点数として示す。

表１〜表４から明らかなように、Exserohium turcicumのみがセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた。一方、Exserohium turcicum以外の植物非病原性真菌は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れなかった。

本発明は、農業用水または土壌のような試験試料が、Exserohium属の植物病原性真菌を含有するかどうかを簡単に判定するために用いられ得る。

１００第１容器
１０２フランジ
１０４セルロースフィルム
１０４ａ表側の面
１０４ｂ裏側の面
１７０基板
１７０ａ表側の面
１７０ｂ裏側の面
２００試験試料
２０２植物病原性真菌
２０２ａ植物病原性真菌の一部分
３００第２容器
３０２液体の培地
３０４固体の培地
４０２真菌染色液
５００光源
６００顕微鏡

Claims

試験試料が、Exserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備し、
（ａ）貫通孔を有さないセルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記試験試料を所定時間、静置する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に前記セルロースフィルムを貫通した真菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記Exserohilum属の植物病原性真菌を含有すると判定する工程、
ここで、
前記方法は、さらに
前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程を具備し、かつ
前記培地は、
カルベンダジウム、
キャプタン、
ストレプトマイシン硫酸塩、および
ネオマイシン硫酸塩を含有している
ラクトースカゼイン加水分解寒天培地である、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）の間に、前記セルロースフィルムの裏面を真菌染色液に接触させる工程をさらに具備する、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記セルロースフィルムは、前記セルロースフィルムの表側の面および裏側の面の少なくともいずれか一方に設けられた基板によって支持されており、かつ
前記基板は、貫通孔を具備している、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である、
方法。
請求項６に記載の方法であって、
前記固体が、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である、
方法。
請求項８に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記Exserohilum属の植物病原性真菌が、Exserohilum turcicumである、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
前記セルロースフィルムは、０．０４マイクロメートル以上１４．５マイクロメートル以下の厚みを有している、
方法。
試験試料が、Exserohilum属の植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備し：
（ａ）貫通孔を有さないセルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記試験試料を所定時間、静置する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に前記セルロースフィルムを貫通した真菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記Exserohilum属の植物病原性真菌を含有すると判定する工程、
ここで、
前記工程（ｂ）において、前記セルロースフィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置され、かつ
前記培地は、
カルベンダジウム、
キャプタン、
ストレプトマイシン硫酸塩、および
ネオマイシン硫酸塩を含有している
ラクトースカゼイン加水分解寒天培地である、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）の間に、前記セルロースフィルムの裏面を真菌染色液に接触させる工程をさらに具備する、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記セルロースフィルムは、前記セルロースフィルムの表側の面および裏側の面の少なくともいずれか一方に設けられた基板によって支持されており、かつ
前記基板は、貫通孔を具備している、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である、
方法。
請求項１７に記載の方法であって、
前記固体が、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である、
方法。
請求項１９に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記植物病原性真菌が、Exserohilum turcicumである、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記セルロースフィルムは、０．０４マイクロメートル以上１４．５マイクロメートル以下の厚みを有している、
方法。