JP2018102296A - 細胞シートの製造方法及び細胞培養支持体 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の増殖性が良好で、低温処理に依らずに細胞シートを剥離可能な細胞培養支持体及びそれを用いる細胞シートの製造方法を提供する。
【解決手段】基材と、基材上に配置される炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、を備える細胞培養支持体である。また当該細胞培養支持体上、第一温度で細胞を培養して細胞培養支持体上に細胞シートを形成することと、細胞培養支持体を第一温度よりも高い第二温度に保持して、細胞シートを回収することと、を含む細胞シートの製造方法である。
【選択図】図４

Description

本発明は、細胞シートの製造方法及び細胞培養支持体に関する。

損傷を受けた生体組織を再生する目的で、細胞シートを利用した移植法が開発されている。移植に利用される細胞シートの多くは、ヒト細胞を含む動物細胞の中でも特に付着依存性の細胞を用いて作製される。細胞シートを作製するには、動物細胞を基材表面上に付着させてシート状に培養し、その形態を保持したまま剥離させる必要性がある。例えば、特許文献１には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０℃から８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を剥離させる皮膚細胞培養法が記載されている。

特開平０５−１９２１３８号公報

特許文献１に記載の細胞培養支持体を用いて細胞シートを作製する場合、細胞種に依っては細胞シートが剥離しなかったり、低温障害を受ける場合があった。そこで本発明は、細胞の増殖性が良好で、低温処理に依らずに細胞シートを剥離可能な細胞培養支持体及びそれを用いる細胞シートの製造方法を提供することを目的とする。

第一態様は、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーを表面に有する細胞培養支持体上、第一温度で細胞を培養して細胞培養支持体上に細胞シートを形成することと、細胞培養支持体を第一温度よりも高い第二温度に保持して、細胞シートを回収することと、を含む細胞シートの製造方法である。
第二態様は、基材と、基材上に配置される炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、を備える細胞培養支持体である。
第三態様は、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、液媒体とを含む組成物である。
第四態様は、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、液媒体とを含む組成物を基材上に付与することを含む細胞培養支持体の製造方法である。

本発明によれば、細胞の増殖性が良好で、低温処理に依らずに細胞シートを剥離可能な細胞培養支持体及びそれを用いる細胞シートの製造方法を提供することができる。

ポリマーが付着した細胞培養皿の表面張力を示す図である。 培養４８時間後の細胞増殖の状態を示す図である。 培養７２時間後の細胞増殖の状態を示す図である。 細胞シートの剥離状態を示す図である。 ポリマーが付着したガラス製細胞培養皿の表面張力を示す図である。 培養４８時間後の細胞増殖の状態を示す図である。 培養７２時間後の細胞増殖の状態を示す図である。 細胞シートの剥離状態を示す図である。 ポリマーが付着した細胞培養皿の表面張力を示す図である。 細胞シートの剥離状態を示す図である。 細胞シートの細胞増殖能を評価する実験スケジュールである。 細胞シートの細胞増殖能の評価結果である。

本明細書において、組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。（メタ）アクリル酸は、アクリル酸及びメタクリル酸の少なくとも一方を意味し、（メタ）アクリレートは、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルの少なくとも一方を意味する。

＜細胞シートの製造方法＞
細胞シートの製造方法は、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーを表面に有する細胞培養支持体上、第一温度で細胞を培養して細胞培養支持体上に細胞シートを形成することと、細胞培養支持体を第一温度よりも高い第二温度に保持して、細胞シートを回収することと、を含む。

特定構成のポリマーを表面に有する細胞培養支持体上で細胞を培養することで、細胞が細胞培養支持体に付着して良好な増殖性を示して均一な細胞シートが得られる。表面に細胞シートが形成された細胞培養支持体を、培養温度よりも高い温度に保持することで、細胞培養支持体の表面状態が変化して細胞シートが剥離する。これにより低温障害を与えることなく細胞培養支持体から剥離した細胞シートが得られる。

（細胞培養支持体）
細胞シートの製造方法に用いられる細胞培養支持体は、基材と、基材の表面上に配置される炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーとを備える。ポリマーは特定の構成を有することで、基材への付着性を有し、基材表面に適度な親水性を付与することができる。更にポリマーは、培養温度である第一温度では培養細胞に対する被付着性を示し、培養温度より高い第二温度では培養細胞に対する被付着性を喪失する特有の感温特性を有する。

細胞培養支持体に用いられる基材の材質は、目的等に応じて通常用いられる基材の材質から適宜選択することができる。基材の材質としては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリビニル系樹脂、ガラス等を挙げることができる。また基材の形状、大きさ等は細胞培養が可能であれば特に制限されず、目的とする細胞シートの形状、大きさ等に応じて適宜選択すればよい。基材は市販の細胞培養用の基材から目的等に応じて適宜選択して用いることができる。

基材の表面上に配置されるポリマーは、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する第一構成単位と、（メタ）アクリル酸に由来する第二構成単位とを含む。第一構成単位に含まれるアルキル基の炭素数は、ポリマーの基材への付着性から１６から２２が好ましい。第一構成単位を形成するモノマーとして具体的には、テトラデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、エイコサニル（メタ）アクリレート、べへニル（メタ）アクリレート等の直鎖アルキル基を有する（メタ）アクリレートを挙げることができる。

ポリマーに含まれる第一構成単位と第二構成単位の含有モル比（第一構成単位：第二構成単位）は、例えば、２：８から５：５であり、２：８から４：６が好ましい。ポリマーはランダムコポリマーであってもよく、ブロックコポリマーであってもよいが、ブロックコポリマーであることが好ましい。

ポリマーは第一構成単位及び第二構成単位以外のその他の構成単位を、本発明の効果を損なわない程度で更に含んでいてもよい。その他の構成単位を構成するモノマーは、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレート及び（メタ）アクリル酸と共重合可能であれば特に制限されず、例えば、スチレン、ブチルアクリレート等の炭素数１２以下のアルキル基を有する（メタ）アクリレートが挙げられる。

ポリマーの分子量は、例えば、重量平均分子量（Ｍｗ）として３，５００から２００，０００であり、６，０００から７０，０００が好ましい。更に多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、例えば、１．０５から１５であり、１．２から２が好ましい。重量平均分子量および多分散度は、ＧＰＣを用いてポリスチレン換算で求めることができる。

ポリマーがブロックコポリマーである場合、第一構成単位部分の重量平均分子量は、例えば、５００以上、１，０００以上、２，０００以上、３，０００以上、４，０００以上又は５，０００以上であり、１００，０００以下、５０，０００以下、１０，０００以下８，０００以下又は７，０００以下である。また第二構成単位部分の重量平均分子量は、例えば、５００以上、１，０００以上又は２，０００以上であり、１００，０００以下、２０，０００以下又は１５，０００以下である。また、第一構成単位部分の重合度は、例えば、２以上、５以上又は１０以上であり、８００以下、５００以下、１００以下又は５０以下である。第二構成単位部分の重合度は、例えば、５以上、１０以上又は３０以上であり、８００以下、５００以下又は１００以下である。

ポリマーは通常用いられる製造方法で製造することができる。例えばポリマーがブロックコポリマーの場合、各種リビング重合法（ラジカル、アニオン、カチオン）で製造することができる。リビングラジカル重合法としては、ＮＰＭ法、ＡＴＲＰ法、ＲＡＦＴ法等を挙げられ、具体的には、例えば、国際公開第２０１２／０９８７５０号に記載の製造方法を参照することができる。
また、ポリマーの重合に用いられる開始剤としては、例えばＢｌｏｃＢｕｉｌｄｅｒ ＭＡ（アルケマ社製）等が挙げられる。

基材の表面上に配置されるポリマーの量は、例えば、３０μｇ／ｃｍ^２以上１６０μｇ／ｃｍ^２以下であり、５０μｇ／ｃｍ^２以上８０μｇ／ｃｍ^２以下が好ましい。またポリマーは１種単独で用いてもよく、２種以上の構成の異なるポリマーを組み合わせて用いてもよい。

（細胞培養）
細胞シートは所望の細胞を、細胞培養支持体上に播種し、第一温度（培養温度）で培養することで形成される。細胞培養支持体上で培養される細胞は、動物細胞であれば、種及び由来組織は特に制限されず、例えば、生体より採取した直後の細胞及び樹立細胞系等を挙げることができる。動物細胞の由来としてはヒトを含む哺乳動物が挙げられる。細胞は体細胞であっても幹細胞であってもよい。

細胞の培養には、通常使用される培地を使用することができる。培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地であればよく、例えば、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地等の血清を含まない各種の基礎培養液（標準培養液）を挙げることができる。この培地には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子、トランスフェリン等の既知血清成分等を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができ、例えば、５容量％から１０容量％とすることができる。また培地は、各種ビタミン類、ストレプトマイシン等の抗生物質、分化誘導物質等を添加したものであってもよい。

細胞培養支持体上に、播種する細胞の密度については、細胞シートが形成可能であればよく、細胞種等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養面積当たり３×１０⁴から６×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とすることができる。

細胞の培養は第一温度で行われ、細胞に応じて適宜選択することができる。例えば３５から３７℃とすることができる。細胞の培養は５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内で行ってもよい。各種細胞由来の細胞シートの形成は、通常の培養条件で３から５日程度、コンフルエントな状態になるまで培養を行えばよい。細胞シートの形成は顕微鏡観察で確認することができる。

（細胞シートの回収）
細胞培養支持体上に形成される細胞シートの回収は、細胞培養支持体を第一温度よりも高い第二温度（剥離温度）に保持して行われる。細胞シートが形成された細胞培養支持体を第二温度に保持することで、細胞シートが細胞培養支持体から剥離して細胞シートが回収できる。細胞シートの剥離では、必要に応じて細胞培養支持体を揺動してもよく、細胞シートの外縁の一部を物理的に剥離してから細胞培養支持体を揺動してもよい。

第二温度は、第一温度よりも高く、細胞に障害を与えない温度であればよい。また第二温度はポリマーの基材に対する付着性が維持される温度であることが好ましい。第二温度は、例えば、３８℃から４５℃とすることができ３８℃から４０℃が好ましい。細胞シートの回収において第二温度に保持する時間は、例えば、１０分から１８０分とすることができる。

細胞シートの製造方法では、極端に温度を低下させることなく、培養細胞をシート状態のままで回収することが可能であり、細胞に低温障害を与えることがない。また回収される細胞シートは均一性が高く、細胞シートの収縮による塊状化が抑制される。さらに細胞シートを構成する細胞において良好な細胞増殖性が維持される。

＜組成物＞
本実施形態に係る組成物は、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、液媒体とを含む。組成物は、細胞培養に用いられる基材の表面処理に適用され、培養温度では培養細胞に対する被接着性を示し、培養温度よりも高い温度では細胞に対する被付着性を喪失する特有の感温特性を有するポリマー層を基材の表面に形成することができる。すなわち、組成物は、細胞培養用基材のコーティング剤として用いられる。

組成物に含まれるポリマーの詳細については既述の通りである。組成物はポリマーを１種単独で含んでいてもよく、２種以上の構成の異なるポリマーを組み合わせて含んでいてもよい。

液媒体はポリマーの少なくとも一部を溶解可能であれば、通常用いられる液媒体から適宜選択して用いることができる。液媒体は、ポリマーを所望の濃度で溶解可能であることが好ましく、適用される基材に対して不活性であることが好ましい。液媒体は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール等の水溶性有機溶剤の少なくとも１種を含むことができる。中でも液媒体は、特別な手段を必要とせず容易に且つ短時間で細胞培養用基材の表面コーティングが可能であり、また特別な滅菌操作を必要としないことから、ＤＭＳＯを含むことが好ましい。また液媒体は水を含んでいてもよく、水溶性有機溶剤と水の混合物であってもよい。

組成物中のポリマーの含有量は、例えば、１（ｗ／ｖ）％以下とすることができ、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上０．０５（ｗ／ｖ）％以下が好ましい。

組成物は、例えば、ポリマーを所望の濃度となるように液媒体に溶解又は分散することで調製することができる。組成物は、適用される基材の表面にポリマー層を形成することで、基材表面に親水性を付与することができる。ポリマー層が形成された基材は、細胞培養支持体として細胞シートの製造方法に用いることができる。

＜細胞培養支持体の製造方法＞
細胞培養支持体は、前記組成物を細胞培養用の基材に付与して基材表面にポリマーを付着させることで製造することができる。組成物の付与方法は、滴下、塗布、スプレー、浸漬等の通常用いられる方法から適宜選択すればよい。組成物の付与量は、基材の面積及び組成物中のポリマー濃度を考慮し、基材面に付着するポリマー量が所望の範囲となるように適宜選択すればよい。

組成物を基材表面に付与した後に、組成物に含まれる液媒体の少なくとも一部を除去してもよい。これにより、例えば、ポリマーを基材の表面に付着させることができる。液媒体の除去は、例えば、減圧あるいは常圧で液媒体を揮発させて行うことができる。また液媒体が水溶性有機溶剤を含む場合には、生理食塩水等の水性媒体を付与後、上清を除去することで水溶性有機溶剤を除去してもよい。組成物を基材表面に付与してから、液媒体を除去するまでのコーティング時間は、例えば３０分以上であり、好ましくは６０分以上である。また例えば１８０分以下である。ポリマーを基材表面に付着させる温度は、例えば２０℃以上５０℃以下であり、好ましくは室温（２５℃）程度である。

細胞培養支持体の製造方法は、例えば細胞培養用の基材に、表面改質剤である組成物を付与する簡便な方法であるため、市販品等の任意の基材に容易に適用することができる。また、任意の基材表面に対して同等の表面特性を容易に付与することができため、得られる細胞培養支持体を用いことで、均一な品質の細胞シートを安定して製造することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（製造例１）
ステアリルアクリレート（ＳＴＡ；東京化成工業株式会社製）６．６ｇ（２０ｍｍｏｌ）を酢酸ブチル６．６ｇに溶解し、ＢｌｏｃＢｕｉｌｄｅｒ ＭＡ Ｎｏ．３３（アルケマ社製）０．３８６ｇを添加し、重合温度約１０５℃、撹拌速度７５ｒｐｍ、窒素雰囲気下で４．５時間重合させた。次いでアクリル酸（ＡＡ；東京化成工業株式会社製）３．４１５ｇ（４７ｍｍｏｌ）を酢酸ブチル３．４２ｇに溶解した溶液を添加し、１０５℃のままで２７時間重合させた。得られた重合液を再沈殿により精製してブロックコポリマーを得た。ブロックコポリマーの製造に用いた第一構成単位となるＳＴＡと第二構成単位となるＡＡの仕込み比は、ＳＴＡ：ＡＡ＝３：７であった。
得られたブロックコポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）を、ＧＰＣを用いてポリスチレン換算で求めたところ、第一構成単位部分の重量平均分子量が約４，５１９であり、第二構成単位部分の重量平均分子量が約３，３７１であった。なお、第一構成単位部分の重量平均分子量は、アクリル酸を添加する前に反応液をサンプリングして求めた。得られたポリマーにおける重量平均分子量の構成をＳＴＡ：ＡＡ＝５０００：３０００とした。

（実施例１）
上記製造例１で得られたポリマーを０．０５％（ｗ／ｖ）となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、細胞培養皿コーティング用の組成物を調製した。
得られた組成物を、ポリスチレン（ＰＳ）製の３５ｍｍ無処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ＃１０００−０３５）に１．５ｍＬ滴下して、培養面全体に行き渡らせた後、ＰＢＳを２ｍｌ加えてリンスして、表面にポリマーが付着した細胞培養支持体を作製した。

得られた細胞培養支持体の表面状態を評価するために、室温でＰＢＳを１００μＬ滴下して、液滴の状態を観察した。併せて、ＰＢＳのみで処理したディッシュ（ａ）、及びＤＭＳＯのみで処理し、ＰＢＳでリンスしたディッシュ（ｂ）についても同様にＰＢＳを滴下して表面状態を評価した。結果を図１に示す。

図１から、ポリマーが付着した細胞培養支持体（ｃ）は、ＰＢＳ処理ディッシュ（ａ）及びＤＭＳＯ処理ディッシュ（ｂ）に比べて、表面張力が低下し、親水性になっていることが分かる。なお、ポリマーが付着した細胞培養支持体にＰＢＳを加えて３７℃、７２時間静置後、４５℃で３０分間加熱してから、同様にして表面状態を評価したところ、表面張力は低下したままであった。このことから、４５℃で３０分間の熱処理ではポリマー層が剥離しないことが分かった。

（実施例２）
実施例１で作製した細胞培養支持体を用いて細胞シートの作製を行った。細胞培養支持体にＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ添加）を加え、ヒト舌がん由来扁平上皮がん細胞株（ＮＡ）を３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種した。３７℃、５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内で７２時間の細胞培養を行って細胞シートを形成した。
次いで４５℃で３０分から６０分振とうした。

（比較例１）
実施例１で作製した細胞培養支持体の代わりに、ポリスチレン（ＰＳ）製の３５ｍｍ無処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製、＃１０００−０３５）をＤＭＳＯのみで処理したディッシュを用いたこと以外は実施例２と同様にして細胞培養を行った。

（比較例２）
実施例１で作製した細胞培養支持体の代わりに、ポリスチレン（ＰＳ）製の３５ｍｍＴＣ処理済みディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製、＃３５３００１）をＤＭＳＯのみで処理したディッシュを用いたこと以外は実施例２と同様にして細胞培養を行った。
次いで４５℃で３０分から６０分振とうした。

実施例２、比較例１及び２における培養細胞の状態を、顕微鏡（×１０）を用いて観察した結果を図２及び３に示す。図２は４８時間後の、図３は７２時間後の細胞の増殖状態を示す。
また実施例２及び比較例２について４５℃で３０分振とうした後の状態を図４に示す。

図２から、実施例２及び比較例２を比較すると、実施例２の方がより均一に細胞が増殖していることが分かる。また図３から、実施例２及び比較例２では細胞がコンフルエントに増殖してシート状になっていることが分かる。
図４から、実施例２では培養細胞がシート状に剥離しているのに対して、比較例２では培養細胞の剥離が観察されなかったことが分かる。

（製造例２） ＦＩＴＣラベル化ポリマー製造
ステアリルアクリレート（ＳＴＡ；東京化成工業株式会社製）５ｇを酢酸ブチル５ｇに溶解し、ＢｌｏｃＢｕｉｌｄｅｒ ＭＡ Ｎｏ．３３（アルケマ社製）０．３８１ｇを添加し、重合温度約１１０℃、窒素雰囲気下で５時間重合させた。次いでフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）２００ｍｇとアクリル酸（ＡＡ；東京化成工業株式会社製）４ｇを酢酸ブチル４ｇに溶解した溶液を添加し、１１０℃のままで２９時間重合させた。得られた重合液を再沈殿により精製してＦＩＴＣラベル化ポリマーを得た。

（製造例３） アントラセンラベル化ポリマーの製造
製造例１で得られたブロックコポリマー１００ｍｇおよびテトラメチルアンモニウム塩酸塩・五水和物１０７ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍＬに加えた。そこに９−クロロメチルアントラセン１６０ｍｇを加えて７０℃で６時間撹拌した。得られた淡黄色溶液をエタノールに滴下してポリマーを沈殿させた。沈殿物をエタノールにて洗浄し、真空乾燥して白色のアントラセンラベル化ポリマーを得た。

（実施例３）
製造例１で得られたポリマーの代わりにラベル化ポリマーとして、製造例２で得られたＦＩＴＣラベル化ポリマー又は製造例３で得られたアントラセンラベル化ポリマーを用いたこと以外は、実施例１と同様にして細胞培養支持体を作製し、これらを用いて、実施例２と同様にして細胞培養を行って細胞シートを形成した。次いで４５℃で６０分振とうした。

剥離した細胞シートを、それぞれ別の細胞培養ディッシュのＰＢＳ中に移動し、移動した細胞シート及び細胞シートを剥離した後の細胞培養支持体について、ラベル体の蛍光を観察した。ＦＩＴＣラベル化ポリマーについては、励起波長４７０ｎｍ、検出波長５２５ｎｍを用い、アントラセンラベル化ポリマーについては、励起波長３６０ｎｍ、検出波長４４７ｎｍを用いた。

蛍光観察の結果、剥離した細胞シートには蛍光がほとんど検出されなかったが、細胞シートを剥離した後の細胞培養支持体についてはいずれのラベル化ポリマーを用いた場合でも明確な蛍光が検出された。
以上から、細胞シート形成後に４５℃で細胞シートを剥離しても、ポリマーは基材からは剥離しないことが分かる。

（実施例４）
上記製造例１で得られたポリマーを０．０５％（ｗ／ｖ）となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、細胞培養皿コーティング用の組成物を調製した。
得られた組成物を、ガラス製の３５ｍｍ無処理ディッシュ（松浪硝子工業株式会社製、＃D１１１３００）に１．５ｍＬ滴下して、培養面全体に行き渡らせた後、ＰＢＳを２ｍｌ加えてリンスして、ガラス表面にポリマーが付着した細胞培養支持体を作製した。

得られた細胞培養支持体の表面状態を評価するために、室温でＰＢＳを１００μＬ滴下して、液滴の状態を観察した。併せて、ＤＭＳＯのみで処理し、ＰＢＳでリンスしたディッシュ（ａ）についても同様にＰＢＳを滴下して表面状態を評価した。結果を図５に示す。
図５から、ポリマーが付着した細胞培養支持体（ｂ）は、ＤＭＳＯ処理ディッシュ（ａ）に比べて、表面張力が低下し、親水性になっていることが分かる。

（実施例５）
実施例１で作製した細胞培養支持体の代わりに、実施例４で作製した細胞培養支持体を用いたこと以外は、実施例２と同様にして細胞培養を行い、細胞シートの作製を行った。
次いで４５℃で１２０分振とうした。

実施例５における培養細胞の状態を、顕微鏡（×１０）を用いて観察した結果を図６及び７にそれぞれ示す。図６は４８時間の、図７は比較例３の７２時間後の細胞の増殖状態を示す。また実施例５について４５℃で１２０分振とうした後の状態を図８に示す。

図６及び７から、実施例５では細胞が均一に増殖し、７２時間後にはコンフルエントに増殖してシート状になっていることが分かる。図８から、実施例５では培養細胞がシート状に剥離していることが分かる。

（製造例４）
第一構成単位部分（ＳＴＡ）の重量平均分子量と、第二構成単位部分（ＡＡ）の重量平均分子量とが、ＳＴＡ：ＡＡ＝５０００：１０００となるように条件を変更したこと以外製造例１と同様にしてポリマーを製造した。

（製造例５）
第一構成単位部分（ＳＴＡ）の重量平均分子量と、第二構成単位部分（ＡＡ）の重量平均分子量とが、ＳＴＡ：ＡＡ＝５０００：１２０００となるように条件を変更したこと以外製造例１と同様にしてポリマーを製造した。

（製造例６）
第一構成単位部分（ＳＴＡ）の重量平均分子量と、第二構成単位部分（ＡＡ）の重量平均分子量とが、ＳＴＡ：ＡＡ＝１００００：１００００となるように条件を変更したこと以外製造例１と同様にしてポリマーを製造した。

（製造例７）
ステアリルアクリレートの代わりにヘキサデシルアクリレート（ＨＤＡ）を用い、第一構成単位部分（ＨＤＡ）の重量平均分子量と、第二構成単位部分（ＡＡ）の重量平均分子量とが、ＨＤＡ：ＡＡ＝８０００：８０００となるように条件を変更したこと以外製造例１と同様にしてポリマーを製造した。

（実施例６）
製造例１のポリマーの代わりに、製造例４および５のポリマーを用いたこと以外は実施例１と同様に、室温で２時間のコーティング条件で細胞培養支持体を作製した。得られた細胞培養支持体の表面状態を評価するために、室温でＰＢＳを１００μＬ滴下して、液滴の状態を観察した。併せて、ＤＭＳＯのみで処理し、ＰＢＳでリンスしたディッシュ（Ｎｏｎ ｃｏａｔ）についても同様にＰＢＳを滴下して表面状態を評価した。結果を図９に示す。

ポリマーが付着した細胞培養支持体は、Ｎｏｎ ｃｏａｔのディッシュに比べて表面張力が低下していることが分かる。

（実施例７）
実施例１及び実施例６で得られた細胞培養支持体を用いて、実施例２と同様にして細胞培養を行った。更に、第二温度を４３℃または４５℃とし、振とう時間を３０分、６０分または１２０分として、細胞培養支持体からの細胞シートの剥離性を評価した。結果を図１０及び表１に示す。なお、図１０は４３℃で６０分間振とうした後の状態を示す。また表１における評価は目視観察によって行い、評価基準は以下の通りであった。
評価基準
Ａ：完全に剥離した。
Ｂ：部分的に剥離したが、不完全であった。
Ｃ：剥離しなかった。

図１０及び表１から、第二構成単位部分の重量平均分子量が大きいほど良好な剥離性を示すことが分かる。

（実施例８）
製造例１、６及び７で得られたポリマーを用い、実施例１と同様に、室温で２時間のコーティング条件で細胞培養支持体を得た。得られた細胞培養支持体を用いて、培養時間を５日間としたこと以外は実施例２と同様にして細胞培養した後、４５℃で１２０分間浸透して細胞シートを細胞培養支持体から剥離した。剥離後の細胞シートをピペット操作により単一細胞になるように分散した。セルカウント後に９６穴培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、＃３５３０７２）に１×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、同様の条件で細胞培養を３日間行った。その際２４時間毎に、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８；同仁化学社製）を用い、その取り扱い説明書に準じた方法でＷＳＴ−８ａｓｓａｙを行って生細胞数を評価した。実験スケジュールを図１１Ａに、ＷＳＴ−８ａｓｓａｙ結果を図１１Ｂに示す。併せてポリマーをコートしていないＮｏｎ Ｃｏａｔの細胞培養皿を用いたこと以外は同様にして得た培養細胞の結果を示す。

図１１Ｂから、剥離した細胞シートを構成した細胞は、良好な細胞増殖能を有しており、再度生着が可能であった。

Claims (7)

1. 炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーを表面に有する細胞培養支持体上、第一温度で細胞を培養して細胞培養支持体上に細胞シートを形成することと、
   細胞培養支持体を第一温度よりも高い第二温度に保持して、細胞シートを回収することと、を含む細胞シートの製造方法。
2. 前記ポリマーは、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位の（メタ）アクリル酸に由来する構成単位に対する含有比率が２：８から５：５である請求項１に記載の製造方法。
3. 前記ポリマーは、炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートと（メタ）アクリル酸とのブロックコポリマーである請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
4. 基材と、基材上に配置される炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、を備える細胞培養支持体。
5. 炭素数１４から２２のアルキル基を有する（メタ）アクリレートに由来する構成単位及び（メタ）アクリル酸に由来する構成単位を含むポリマーと、液媒体とを含む組成物。
6. 液媒体は、ジメチルスルホキシドを含む請求項５に記載の組成物。
7. 請求項５又は６に記載の組成物を基材上に付与することを含む細胞培養支持体の製造方法。