JP2018054682A - 共焦点ラマン顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の課題は、良好なラマン散乱光を検出し、分析精度の良い共焦点ラマン顕微鏡を提供することである。
【解決手段】 励起光を放射する光源１１と、前記励起光を試料１８に照射する励起光照射手段１と、試料１８によって散乱された光から、共焦点アパーチャー２０を用いてラマン散乱光を集光する集光手段３と、集光したラマン散乱光を検出する検出手段２６と、を備えた共焦点ラマン顕微鏡１０であって、
前記励起光照射手段１は、励起光の断面形状を略環状に形成する励起光形成手段１３を備え、
前記集光手段３は、前記共焦点アパーチャー２０を通過した光のうち断面略中央部の光を集光し、断面略中央部外側の光を遮蔽する遮蔽手段２２を備えたことを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡１０。
【選択図】 図１

Description

本発明は共焦点ラマン顕微鏡、特に良好なラマン散乱光を検出し、分析精度を上げる技術の改良に関する。

物質に特定の波長の光を照射すると、その照射光は散乱され、その一部は照射光の波長とは異なるラマン散乱光となる。
このラマン散乱光は、試料を構成する分子の振動や回転に基づいてある決まった波数になり、その波数は分子によって特有であるため、物質の同定が可能である。
また、ラマン強度は、照射光の強度、分子数（濃度）に比例するため試料中の特定成分の定量も可能である。
このため、従来より各種のラマン顕微鏡が開発されており、特に対物レンズの焦点位置と共役な位置（結像点）にピンホール等を配置することで、焦点のあった位置の光を効率良く検出可能な共焦点ラマン顕微鏡は、しばしば各種測定、分析に用いられている。

一方で、ラマン散乱光は非常に微弱なスペクトル（入射光と同じ波長の光が散乱されるレイリー散乱光に比べて１０^−６倍ほど微弱）であるため、多種多様な要因により、正確な分析が妨げられる。例えば分析時に試料へ励起光を照射する際に、測定部位の深さ方向に蛍光物質がある場合、深さ方向に対して励起光が到達してしまうため、蛍光物質自体に蛍光が生じてしまう。したがって、蛍光とラマン散乱光とが重なり、精度の高い分析が行えないことが頻繁に起こる。前述のとおりラマン散乱光は非常に弱いスペクトルであるため、こうした蛍光によって、分析結果に大きな影響が出てしまう。これに対し、特許文献１には試料からの蛍光を防止する作用のある誘導放出光を導入することにより、蛍光物質の蛍光の発生率を低く抑える技術が開示されている。

特開２０１３−１５５１５号公報

しかしながら、上記方法のように誘導放出光を導入することで、試料からの蛍光の発生は抑えられるものの、分析装置（ラマン顕微鏡）の構成機器が多くなり、分析装置（ラマン顕微鏡）の大型化、あるいは複雑化を招いてしまう。また、誘導放出光の導入のみでは蛍光の発生率は抑えられるとはいえ、精度の良い分析を行ううえでは、まだまだ改良の余地がある。

本発明は、前記従来技術の課題に鑑みて行われたものであって、その目的は良好なラマン散乱光を検出し、精度の良い分析が可能な共焦点ラマン顕微鏡を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明にかかる共焦点ラマン顕微鏡は、
励起光を放射する光源と、前記励起光を試料に照射する励起光照射手段と、試料によって散乱された光から、共焦点アパーチャーを用いてラマン散乱光を集光する集光手段と、集光したラマン散乱光を検出する検出手段と、を備えた共焦点ラマン顕微鏡であって、
前記励起光照射手段は、励起光の断面形状を略環状に形成する励起光形成手段を備え、
前記集光手段は、前記共焦点アパーチャーを通過した光のうち断面略中央部の光を集光し、断面略中央部外側の光を遮蔽する遮蔽手段を備えたことを特徴とする。

また、前記励起光形成手段は、前記励起光の断面略中央部を遮蔽するマスクであることが好ましい。

また、前記遮蔽手段は、前記マスクと逆パターンの断面形状を有するしぼりであることが好ましい。

また、本発明にかかる共焦点ラマン顕微鏡は、
励起光を放射する光源と、前記励起光を試料に照射する励起光照射手段と、試料によって散乱された光から、共焦点アパーチャーを用いてラマン散乱光を集光する集光手段と、集光したラマン散乱光を検出する検出手段と、を備えた共焦点ラマン顕微鏡であって、
前記励起光照射手段は、励起光の断面形状を略環状または縮小断面に形成する励起光形成手段を備え、
さらに前記励起光形成手段は、ラマン散乱光を集光する際、集光した光のうち断面略中央部の光または断面略中央部外側の光のどちらか一方を遮蔽することを特徴とする。

また、前記励起光形成手段は、断面略中央部に穴の開いた略環状の開口ミラーであり、
試料へ励起光を照射する際は、前記励起光のうち断面略中央部外側の光を試料へ反射し、
試料によって散乱された光からラマン散乱光を集光する際、集光した光のうち前記開口ミラーの断面略中央部への光を集光し、開口ミラーの断面略中央部外側へのラマン散乱光を遮蔽することが好ましい。

また、前記励起光形成手段は、前記励起光断面を略環状に形成することが好ましい。

また、前記励起光形成手段は、断面略中央部にミラーを有する中央閉口ミラーであり、
試料へ励起光を照射する際は、前記励起光のうち断面略中央部の光を試料へ反射し、
試料によって散乱された光からラマン散乱光を集光する際、集光した光のうち前記中央閉口ミラーの断面略中央部外側への光を集光し、中央閉口ミラーの断面略中央部への光を遮蔽することが好ましい。

また、前記励起光形成手段は、前記励起光断面を縮小することが好ましい。

また、前記集光手段は、前記遮蔽手段よりも検出手段側に設けられたカセグレンミラーを含むことが好ましい。

本発明の共焦点ラマン顕微鏡によれば、励起光の断面形状を工夫して励起光を照射する際に、励起光断面を略環状に形成することで、垂直方向の空間分解能を高めると共に試料の垂直方向からの蛍光を減らし、さらに集光過程で励起光照射時とは逆パターン形状のしぼりを設けて共焦点アパーチャーを通過した光のうち断面略中央部の外側の光を遮蔽することで、集光した光のうち分析に不要な光が多く混在する部分の光を除去し、精度の良い分析が可能となる。
また、励起光断面を縮小し、試料に垂直成分の強い励起光を照射してラマン散乱光の強度を強めるとともに、集光過程で試料からの垂直方向の蛍光等を遮蔽することによっても、精度の良い分析が可能となる。
加えて励起光に暗視野照明を利用する場合は、顕微測定時の水平空間分解能の向上効果も得られた。

本発明に係る共焦点ラマン顕微鏡の第１実施形態の概略構成図を示す。 励起光の垂直成分カットの概要説明図を示す。 励起光のマスクの有無による焦点面での観察画像を示す。 開口部が１０μｍのアパーチャーを使用した場合のＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が１７μｍのアパーチャーを使用した場合のＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が３４μｍのアパーチャーを使用した場合のＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が１００μｍのアパーチャーを使用した場合のＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が１０μｍのアパーチャーを使用した場合のルビーのＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が１７μｍのアパーチャーを使用した場合のルビーのＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が３４μｍのアパーチャーを使用した場合のルビーのＺ分解能の測定結果を示す。 開口部が１００μｍのアパーチャーを使用した場合のルビーのＺ分解能の測定結果を示す。 マスクの有無によるレイリー光の光学観察を示す。 レンズ焦点における光強度分布の概略図を示す。 試料面におけるビームスポットの光学観察画像を示す。 試料面でのピンホールが取り込む範囲を示す。 クロムとガラスのロンキー板を使用した水平分解能評価の概略図を示す。 開口部が３４μｍのアパーチャーを使用した場合の水平分解能の測定結果を示す。 開口部が１０μｍのアパーチャーを使用した場合の水平分解能の測定結果を示す。 本発明に係る共焦点ラマン顕微鏡の第２実施形態の概略構成図を示す。 本発明に係る共焦点ラマン顕微鏡の第３実施形態の概略構成図を示す。 本発明に係る共焦点ラマン顕微鏡の第４実施形態の概略構成図を示す。

以下、本発明の共焦点ラマン顕微鏡について図面を用いて説明するが、本発明の趣旨を超えない限り何ら以下の例に限定されるものではない。
＜第１実施形態＞

図１に本発明の第１実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡の概念図を示す。同図に示す共焦点ラマン顕微鏡１０は、励起光を放射する光源１１と、前記励起光を対物レンズ系２に導光する励起光学系１と、励起光を試料１８の所定位置に照射し、ラマン散乱光を集光する対物レンズ系２と、該対物レンズ系２で集光されたラマン散乱光を分光器２６へ導光する集光光学系３と、を備える。

本実施例において特徴的なことは、略環状（略リング状）の励起光断面を形成する励起光形成手段を備えていることであり、このために本実施例は、励起光学系１のビームエキスパンダ１２の後方にはマスク１３を備えている。また集光光学系３には、マスク１３とは断面形状が逆パターンのしぼり２２を備えている。

はじめに励起光学系１および励起光の照射過程について説明する。
励起光学系１はビームエキスパンダ１２とマスク１３を備える。光源１１から放射された励起光は励起光学系１のビームエキスパンダ１２により励起光断面を適正な幅に調整（拡大）され、断面を拡大された励起光はマスク１３へ到達する。マスク１３は励起光を透過可能なガラス部材１４と励起光を遮蔽するための遮蔽部材１５から構成されている。ガラス部材１４は略四角形状あるいは略丸形状であり、励起光を透過可能であればどのような形状でも構わない。遮蔽部材１５は略円形状である。また、遮蔽部材１５の材質は、例えばアルミ箔等であり、励起光を遮蔽出来ればどのような材質でも構わない。遮蔽部材１５はマスク１３の略中央部に位置し、励起光の断面略中央部のみを遮光可能となっている。断面を拡大された励起光がマスク１３を通過することにより、励起光の断面略中央部のみが遮光され、該励起光は略環状（略リング状）の断面形状となる。この略環状断面を形成された励起光は、対物レンズ系２のビームスプリッタ−１６によって試料１８の方向（下方向）へ反射され、対物レンズ１７を経由してビームスポットとしてサンプル１８へ照射される。

ここでマスク１３によって断面略中央部が遮光された励起光は、ビームスプリッター１６で試料１８の方向へ反射されるまでは中央に穴のあいた略環状（略リング状）の形状となっているが、対物レンズ１７によって試料１８へ照射する際には、略円形断面のビームスポットとして照射される。これにより、後述するが、励起光の略環状断面の中央部分から試料１８へ照射される光は、垂直方向への光強度を減少していることとなり、結果的には、一般的な暗視野照明のように試料１８の垂直方向へは直接励起光が当たらないようになるのである。

このように、略環状の励起光（暗視野照明）による励起光照射方法を利用することで、試料１８の垂直方向の空間分解能を高め、また、試料１８の分析部位の深さ方向（垂直方向）に蛍光性物質があっても、蛍光が生じず、良好なラマン散乱光を得ることが可能となる。

次に、対物レンズ系２について詳しく説明する。
対物レンズ系２は試料１８の位置する方向へ励起光を反射するビームスプリッター１６と、試料１８の所定位置へ励起光を照射する対物レンズ１７と、集光した光を結像するための結像レンズ１９を備える。
上述のとおり励起光学系で略環状（略リング状）の断面形状となった励起光は、ビームスプリッタ−１６によって試料１８の方向（下方向）へ反射され、対物レンズ１７を経由してビームスポットとして試料１８へ照射される。試料１８に照射された励起光により、該励起光の波長とは異なる光（ラマン散乱光）が散乱する。そして対物レンズ１７によってラマン散乱光が取り込まれ、その後、ビームスプリッター１６を通過し、結像レンズ１９を経由して、ラマン散乱光は集光される方向（分光器２６が設置されている上方向）へと進む。

次に集光光学系３および集光過程について詳しく説明する。
集光光学系３は、ラマン散乱光の結像点に設けられた共焦点アパーチャー２０と、該共焦点アパーチャー２０を通過した光を平行光にするための平行レンズ２１と、集光した光のうち、分析に不要な光が多く混在する部分の光の進入を防ぐためのしぼり２２と、特定の光を除去するフィルター２３と、平行光を分光器２６に集光するための集光レンズ２４と、分光器２６へ進入する光の量を調整する入射スリット２５を備える。対物レンズ系２で方向の定まったラマン散乱光は、ラマン散乱光が結像する位置（結像点）に設けられた共焦点アパーチャー２０によって、焦点のあった光のみが効率良く集光される。

したがって、共焦点アパーチャー２０を備えることにより、焦点位置以外の位置で発生した蛍光やレイリー散乱光を完全に除去できる。加えて、焦点位置からもレイリー散乱光等が発生する可能性はあるが、レイリー散乱光の特性上、焦点位置からの垂直方向への光強度は格段に小さくなることから、結果として焦点位置からは良好なラマン散乱光が得られる。

ここで、共焦点アパーチャー２０によって、焦点のあった光が効率よく集光されているが、前述したとおり実際には、集光された光（焦点のあった光）はラマン散乱光と分析に不要な光の両方が混在した状態となっている。ラマン散乱光は非常に微弱な散乱光であるため、精度の高い分析を行うためには集光された光のうち、分析に不要な光をなるべく少なくすることが重要となる。しかしながら共焦点アパーチャー２０で集光した光の中からラマン散乱光と分析に不要な光を分けることは極めて困難である。

また、共焦点アパーチャーを通過した光のうち、特に断面略中央部の外側の光には分析に不要な光が多く混在していることが多い。そこで共焦点アパーチャー２０を通過した光のうち、断面略中央部の光のみをしぼり２２を通過させ、分析に不要な光が多く混在する断面略中央部の外側の光をカットすることで、ラマン散乱光の割合が大きい断面略中央部の光のみを集光することが出来る。

具体的には、しぼり２２はマスク１３と逆パターンの断面形状を有しており、本実施形態（図１）のようなマスク１３の場合は中央部分に穴のあいたピンホールのような断面形状となる。後述するが、マスク１３と逆パターンの断面形状を有するしぼり２２を利用することにより、レイリー散乱光等の分析に不要な光が多く混在する部分の光（断面略中央部外側の光）を的確にカットすることができる。また、しぼり２２は進入させたい光（または排除したいレイリー光等の分析に不要な光）に合わせて穴の大きさが調整可能にしておくことが好適である。

しぼり２２の上方向（分光器２６の方向）にはフィルター２３を設けて、一定の周波数領域における分析に不要な光をカットしても良い。但し、フィルター２３は分析に不要な光をカットするにあたり、補助的な役割を果たしている。また図１では、フィルター２３はしぼり２２の上方向（分光器２６側）に配置されているが、該フィルター２３は、しぼり２２の下方向（試料側）に設けても良い。加えて、しぼり２２を設けることにより、フィルター２３のカット率を低くすることも可能となり、結果的に分析装置のコストダウンに繋がる。

このように、共焦点アパーチャー２０で結像点における光を効率良く集光し、また、しぼり２２で集光した光のうち分析に不要な光が多く混在する部分の光（断面略中央部外側の光）をカットし、フィルター２３を経由する一連の集光過程によって、良好なラマン散乱光が得られる。この良好なラマン散乱光は、集光レンズ２４によって入射スリット２５を通過可能な光となり、該入射スリット２５を経由して分光器２６へ進入し、良好なラマン散乱光による精度の良い分析が行われる。

（疑似暗視野照明による蛍光発生の抑制）
前述したとおり、ラマン散乱光による分析では、分析試料や基板から生じる蛍光が大きな問題となる。例えば、図２中の左側に示すように、蛍光性のある基板の上に分析対象の試料がある場合、基板または試料から生じる蛍光によって、ラマン散乱光が埋もれてしまうことがある。このような蛍光は、ラマン散乱光に比べると非常に強い。そのため、従来のラマン散乱光の分析では、焦点面から離れた拡散した励起光により励起された蛍光も無視することは出来なかった。また、共焦点顕微鏡は、一般的には、焦点面の光だけを効率よく検出可能であるが、試料に対して垂直方向に進む光の成分は、除去することが困難である。そこで、照射する励起光の断面中央部分にマスクをかけて遮光し、該励起光を略環状（略リング状）の形状にすることで、垂直成分の光を除去することを見出した（図２中の右側を参照）。

ここで、マスク１３を平行光束の中心に位置するように調整をして、実験を行った。マスク１３の有無による焦点面での観察画像を図３に示す。同図（ａ）に示すように、マスク１３が無い場合には、焦点をぼかした状態でも円形断面を保っているのが分かる。これに対して、同図（ｂ）では試料表面にフォーカスを合わせると、励起光は１点に集光するが、高さをずらすと（焦点をぼかすと）、中央部分の光は無くなる。そのため、垂直方向へ励起光がもぐり込まなくなる。

（Ｚ分解能評価）
次に、Ｚ分解能評価としてＳｉ基板に対して、高さを変えながらラマン測定を行い、Ｓｉピークの半値全幅からＺ分解能を求めた。ピンホールサイズの異なる各アパーチャー２０でのＺ分解能を表１に示す。ピンホールサイズが大きい時ほど、マスク１３を入れた時に、分解能の改善がみられる。

表１．マスクの有無によるＳｉのＺ分解能の違い
ピンホール Ｚ分解能 半値全幅
サイズ マスク無し マスク有り 対応図面
φ１０μｍ ０．９５μｍ ０．９５μｍ 図４
φ１７μｍ １．２５μｍ １．１５μｍ 図５
φ３４μｍ ２．１０μｍ １．７０μｍ 図６
φ１００μｍ ３．８０μｍ ２．８０μｍ 図７

各アパーチャー２０でのＳｉのＺ分解能の測定結果を図４〜７に示す。ピンホールサイズが小さい時、５０％幅での分解能は、同程度であるが、１０％レベルでは大きな差がある。これは、マスク１３をかけることで、試料１８の深さ方向に励起光が届いていないことを意味している。

次に、Ｚ分解能評価として透明で蛍光性の特徴をもつルビーに対して、高さを変えながらラマン測定を行い、１０％〜９０％幅からＺ分解能を求めた。ピンホールサイズの異なる各アパーチャー２０でのＺ分解能を表２に示す。Ｓｉと同様に、ルビーにおいてもピンホールサイズが大きい時ほどマスク１３を入れた時に、分解能の改善がみられる。

表２．マスクの有無によるルビーのＺ分解能の違い
ピンホール Ｚ分解能 １０％〜９０％幅
サイズ マスク無し マスク有り 対応図面
φ１０μｍ ４．６μｍ ４．１μｍ 図８
φ１７μｍ ４．９μｍ ４．１μｍ 図９
φ３４μｍ ５．１μｍ ４．２μｍ 図１０
φ１００μｍ １２．０μｍ ７．０μｍ 図１１

各アパーチャー２０でのルビーのＺ分解能の測定結果を図８〜１１に示す。Ｓｉと同様に、ピンホールサイズが大きい時ほど分解能の改善がみられる。また、Ｓｉのような不透明な材料と比べると、レーザーが潜り込む透明な材料の方が、よりＺ分解能の改善効果が大きいのが分かる。

（ラマン散乱光に混在するレイリー光等のカット）
励起光入射側（励起光照射過程）の平行光束には、断面中央部分にマスク１３をかけ、検出側光路（集光過程）には、入射側に設置したマスク１３とは逆パターンのしぼり２２をかける。この方法を用いれば、レイリー光をカットすることができ、暗視野照明のような光学系が可能となる。試料１８からのラマン散乱光はマスクした領域の分だけ小さくなるが、レイリー光等を効率良く除去できるため、検出感度が改善できる。

試料１８をミラーに変更し、検出光路（集光過程）に紙を置き、返ってくる平行光束の状態を確認した（図１２）。入射側にマスク１３を入れると、検出側の励起光の中央部分が抜けているのが確認できた（図１２の下段を参照）。つまり、集光過程にマスク１３とは逆パターンの中央部分だけを通すしぼり２２を取り付ければ、レイリー光等をカットすることが可能となる。

（水平空間分解能の向上）
ここで、励起光の水平空間分解能の向上について説明する。前述したように、励起光の断面中央部分にマスク１３をかけることにより、試料面でのビームスポットの形状を変える事ができる。したがって、励起光照射手段の条件を整えれば、水平空間分解能を上げることが可能となる。

まず、レンズ集光点での光強度について説明する。図１３に示すように、レンズ集光点では、さまざまな角度で焦点に光が集まる。焦点の中心位置では、それぞれの光の位相が一致するため、非常に強い光強度が得られる。これを、焦点に入射する光の角度別に見てみる。レンズの外側を通った２つの光を考え、焦点で光が交わると、光の干渉縞が作られる。干渉縞の間隔は、光の波長と角度で決定される。レンズの外側を通った光で作られる干渉縞は、間隔が狭く、内側であるほど、間隔が広いことを意味する。

本発明のように、内側の光をマスク１３により遮光して取り除くことは、間隔が広い干渉縞を取り除いていることを意味している（図１３を参照）。したがって、中央部分での光強度は落ちるが、間隔の狭い干渉縞だけを重ねるので、中央部のビームサイズを小さくすることができる。

最も細かな干渉縞の間隔は、波長の半分であるので、例えば５３２ｎｍのレーザー波長の場合では、２６６ｎｍが限界である。

試料面でのビームスポットの光学観察画像を図１４に示す。マスク無しの場合、中央部分の光強度は強い。マスク有りの場合では、中央部分の光強度は弱くなり、ビームスポットは小さく構成されていることが分かる。
このように中央部分の小さなスポットだけを取り込めるように光学系を工夫することにより、水平空間分解能が改善出来る。

図１５にサンプル面でのアパーチャー２０が取り込む範囲を示す。サンプル面では、二重のビームができている。φ１７μｍのアパーチャー２０を用いた場合、外側のリング状のビームまで取り込むことになる。φ１０μｍのアパーチャー２０を用いると、中心部を多く取り込む。

サンプル１８をロンキー板にして、レイリー光から水平空間分解能を評価した。図１６に示すように、クロムとガラスで構成されるロンキー板を使用し、レイリー光の位置を水平方向に移動させながら光強度の測定を行った。また、本評価ではレイリー光の位置を水平方向に移動させているが、クロムとガラスで構成されるロンキー板を水平方向に移動させても同様の評価が得られる。

図１７に開口部が３４μｍのアパーチャーを使用した場合のＸ分解能の測定結果を示す。また、図１８には開口部が１０μｍのアパーチャーを使用した場合のＸ分解能の測定結果を示す。アパーチャーが３４μｍの場合、２つの分解能が得られている。これは、外側のリング状のビームと中心部のビーム形状が反映されるためである。アパーチャーの開口部が１０μｍの場合、中心部のビームを取り込み、外側のリング状のビームを除去するため、高い空間分解能が得られている。

＜第２実施形態＞
次に、本発明の第２実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡について図面を用いて説明する。図１に示した共焦点ラマン顕微鏡１０と共通する構成については、符号１００を足して示している。

図１９に本発明の第２実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡の概念図を示す。同図に示す共焦点ラマン顕微鏡１１０は、励起光を放射する光源１１１と、前記励起光を対物レンズ系１０２に導光する励起光学系１０１と、励起光を試料１１８の所定位置に照射し、ラマン散乱光を集光する対物レンズ系１０２と、対物レンズ系１０２で集光されたラマン散乱光を分光器１２６へ導光する集光光学系１０３と、を備える。

本実施例において特徴的なことは、第１実施形態と同様に略環状（略リング状）の励起光断面を形成する励起光形成手段を備えていることであり、このために本実施例は、励起光学系１０１のビームエキスパンダ１１２の後方には開口ミラー１３０を備えている。また開口ミラー１３０は第１実施形態におけるビームスプリッター１６及びしぼり２２の役割も同時に果たしている。

はじめに励起光学系１０１および励起光の照射過程について説明する。
光源１１１から照射された励起光はビームエキスパンダ１１２により励起光断面を適正な幅に調整（拡大）され、断面を拡大された励起光は開口ミラー１３０に到達する。開口ミラー１３０は略環状で、中央部が開口した形状である。そのため、励起光のうち断面略中央部は開口ミラー１３０によっては試料１１８の方向へは反射されずにそのまま直進し、断面略中央部の外側の励起光は開口ミラー１３０の反射によって、試料１１８の方向（下方向）へと導光される。つまり、励起光のうち断面略中央部外側の励起光のみが、試料方向へ導かれるため、励起光の断面形状は第１実施形態と同様に、断面の中央部に穴のあいた略環状の形状となる。略環状に断面を形成された励起光は、対物レンズ系１０２の対物レンズ１１７を経由してビームスポットとして試料１１８へ照射される。

次に、対物レンズ系１０２について詳しく説明する。
対物レンズ系１０２は試料１１８の位置する方向へ励起光を反射する開口ミラー１３０と、試料１１８の所定位置へ励起光を照射し、ラマン散乱光を集光する対物レンズ１１７と、集光した光を結像するための結像レンズ１１９を備える。
上述のとおり開口ミラー１３０によって形成された略環状（略リング状）の断面形状の励起光が試料１１８の方向（下方向）へ反射され、対物レンズ１１７を経由してビームスポットとして試料１１８へ照射される。試料１１８に照射された励起光により、該励起光の波長とは異なる光（ラマン散乱光）が散乱する。対物レンズ１１７によってラマン散乱光が取り込まれる。

ここで、開口ミラー１３０は第１実施形態におけるしぼり２２の役割も果たしており、該開口ミラー１３０によって対物レンズ１１７を通過した光のうち、分析に不要な光が多く混在する部分の光（断面略中央部外側の光）をカットし、ラマン散乱光が多く混在する光のみを開口ミラーの中央部から集光する。開口ミラー１３０の中央部を通過した光は、結像レンズ１１９を経由して、集光される方向（分光器１２６が設置されている上方向）へと進む。

このように第２実施形態では、第１実施形態におけるマスク１３と、励起光を試料方向へ導くためのビームスプリッター１６としぼり２２の機能を開口ミラー１３０に持たせることが出来るので、共焦点ラマン顕微鏡の小型化、簡略化が可能となる。

次に集光光学系１０３および集光過程について詳しく説明する。
集光光学系１０３は、ラマン散乱光の結像点に設けられた共焦点アパーチャー１２０と、該共焦点アパーチャー１２０を通過した光を平行光にするための平行レンズ１２１と、特定の光を除去するフィルター１２３と、平行光を分光器１２６に集光するための集光レンズ１２４と、分光器１２６へ進入する光の量を調整する入射スリット１２５を備える。対物レンズ系１０２で方向の定まったラマン散乱光は、ラマン散乱光が結像する位置（結像点）に設けられた共焦点アパーチャー１２０によって、焦点のあった光のみが効率良く集光される。つまり、共焦点アパーチャー１２０を備えることにより、焦点位置以外からの蛍光やレイリー散乱光を完全に除去できる。加えて、焦点位置からも例えばレイリー散乱光等は発生する可能性はあるが、レイリー散乱光の特性上、焦点位置からの垂直方向への光強度は格段に小さくなることから、結果として良好なラマン散乱光が得られる。

さらに集光光学系１０３にはフィルター１２３を設けて、一定の周波数領域の分析に不要な光をカットしても良い。但し、フィルター１２３は分析に不要な光を除去するにあたり、補助的な役割を果たしている。前述のとおり開口ミラー１３０を設けることにより、フィルター１２３のカット率を低くすることも可能となり、結果的に分析装置のコストダウンに繋がる。

開口ミラー１３０で分析に不要な光が多く混在する部分の光をカットし、共焦点アパーチャ−１２０で結像点の光を効率良く集光し、さらにフィルター１２３を経由する一連の集光過程によって、良好なラマン散乱光が得られる。この良好なラマン散乱光は、集光レンズ１２４によって入射スリット１２５を通過可能な光となり、該入射スリット１２５を経由して分光器１２６へ進入し、良好なラマン散乱光による精度の良い分析が行われる。

＜第３実施形態＞
次に、本発明の第３実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡について図面を用いて説明する。図１に示した共焦点ラマン顕微鏡１０と共通する構成については、符号２００を足して示している。

図２０は本発明の第３実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡の概念図を示す。同図に示す共焦点ラマン顕微鏡２１０は、励起光を放射する光源２１１と、前記励起光を対物レンズ系２０２に導光する励起光学系２０１と、励起光をサンプル２１８の所定位置に照射し、ラマン散乱光を集光する対物レンズ系２０２と、対物レンズ系で集光されたラマン散乱光を分光器２２６へ導光する集光光学系２０３と、を備える。

ここで本実施例において特徴的なことは、励起光断面を縮小するための励起光形成手段を備えていることであり、このために本実施例は、励起光学系２０１のビームエキスパンダ２１２の後方には中央閉口ミラー２４０を備えている。また、中央閉口ミラー２４０は第１実施形態におけるマスク１３の役割も果たしている。加えて中央閉口ミラー２４０は第１実施形態における励起光を試料１８へ導くためのビームスプリッター１６役割も果たしている。

はじめに励起光学系２０１および励起光の照射過程について説明する。
光源２１１から照射された励起光はビームエキスパンダ２１２により励起光断面を適正な幅に調整（拡大）され、断面を拡大された励起光は中央閉口ミラー２４０へ到達する。中央閉口ミラー２４０はガラス部材２１４と該ガラス部材２１４の断面略中央部に位置する反射ミラー２４１から構成されている。ガラス部材２１４は四角形状あるいは丸形状であり、励起光を透過可能であればどのような形状でも構わない。反射ミラー２４１は略円形状である。

励起光は中央閉口ミラー２４０の反射によって試料２１８の方向へ導かれる。ここで励起光のうち、断面略中央部の励起光のみが反射ミラー２４１によって試料２１８の方向（下方向）へ反射され、断面略中央部の外側の励起光は試料２１８の方向へは反射されず、ガラス部材２１４を透過し、そのまま直進する。中央閉口ミラー２４０によって試料２１８の方向へ反射された励起光は、対物レンズ２１７を経由してビームスポットとして試料２１８へ照射される。

次に、対物レンズ系２０２について詳しく説明する。
本実施形態では試料２１８の垂直方向に励起光を照射しているので、ラマン散乱光とともに試料２１８からの蛍光が多く発生する可能性がある。前述したとおりラマン散乱光は非常に微弱な光であるため、試料２１８からの蛍光の影響により、精度の良い分析が妨げられることとなる。そこで本実施形態の集光過程では図２０に示すように、集光の最初の段階で、中央閉口ミラー２４０を構成する反射ミラー２４１を用いて、垂直方向における蛍光を全て遮光しているのである。これにより、中央閉口ミラー２４０の中央部外側の断面（反射ミラー２４１の外側の断面）を経由して良好なラマン散乱光を集光可能となる。

試料２１８に照射された励起光により、該励起光の波長とは異なるラマン散乱光が散乱する。対物レンズ２１７によってラマン散乱光が取り込まれ、さらに、中央閉口ミラー２４０で垂直方向における蛍光を遮光され、閉口ミラーを構成するガラス部材２１４を経由してラマン散乱光は集光される方向（上方向）へと進み、結像レンズ２１９を経由して、ラマン散乱光は集光される方向へと進む。

次に集光光学系２０３および集光過程について詳しく説明する。
集光光学系２０３は、ラマン散乱光の結像点に設けられた共焦点アパーチャー２２０と、該共焦点アパーチャー２２０を通過した光を平行光にするための平行レンズ２２１と、特定の光を除去するフィルター２２３と、平行光を分光器２２６に集光するための集光レンズ２２４と、分光器２２６へ進入する光の量を調整する入射スリット２２５を備える。
方向の定まったラマン散乱光は、ラマン散乱光の結像する位置（結像点）に設けられた共焦点アパーチャー２２０によって、焦点のあった光のみが効率よく集光される。共焦点アパーチャー２２０で集光した光を、平行レンズ２２１で平行光にしてから、フィルター２２３によって、一定の周波数領域における分析に不要な光をカットしても良い。但し、フィルター２２３は分析に不要な光を除去するにあたり、補助的な役割を果たしている。

中央閉口ミラー２４０を構成する反射ミラー２４１によって垂直方向における試料２１８からの蛍光を遮光し、共焦点アパーチャー２２０で結像点における光を効率良く集光し、さらに、フィルター２２３を経由する一連の集光過程によって、良好なラマン散乱光が得られる。この良好なラマン散乱光は、集光レンズ２２４によって入射スリット２２５を通過可能な光となり、該入射スリット２２５を経由して分光器２２６へ進入し、良好なラマン散乱光による精度の良い分析が行われる。

このように、第３実施形態では、試料２１８から蛍光が発生することを前提として、垂直方向へ強い励起光を照射している。その結果、垂直成分から強い蛍光が発生するが、該蛍光を中央閉口ミラー２４０を利用して完全に遮光することで、良好なラマン散乱光を検出し、精度の良い分析が可能となる。

＜第４実施形態＞
次に、本発明の第４実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡について図面を用いて説明する。図１に示した共焦点ラマン顕微鏡１０と共通する構成については、符号３００を足して示している。

図２１は本発明の第４実施形態に係る共焦点ラマン顕微鏡の概念図を示す。同図に示す共焦点ラマン顕微鏡３１０は、励起光を放射する光源３１１と、前記励起光を試料３１８に導光する励起光学系３０１と、ラマン散乱光を集光し分光器３２６へ導光する集光光学系３０３と、を備える。

本実施例において特徴的なことは、励起光を試料３１８へ導光するための反射ミラー３４１を備えており、該反射ミラー３４１は同時に第１実施形態におけるマスク１３の役割も果たしていることである。ここで、本実施形態には対物レンズ系を備えていない。試料３１８から散乱されたラマン散乱光はカセグレンミラー３５０を有する集光光学系３０３によって直接集光され、分光器３２６へと導かれる。

はじめに励起光学系３０１および励起光の照射過程について説明する。
励起光学系３０１はビームエキスパンダ３１２と反射ミラー３４１を備える。光源３１１から照射された励起光はビームエキスパンダ３１２によって励起光断面を適正な幅に調整され、断面を調整された励起光は反射ミラー３４１へ到達する。反射ミラー３４１は凹状の曲面を有するミラーであり、励起光の進行方向に対して垂直方向（図１３の場合、試料３１８の方向）へ反射させることが出来る。断面を調整された励起光は凹状の曲面を有する反射ミラー３４１によって下方向へ導光され、ビームスポットとして試料３１８へ照射される。

次に集光光学系３０３および集光過程について詳しく説明する。
集光光学系３０３は、励起光を試料３１８の方向へ導光する反射ミラー３４１と、ラマン散乱光を集光するためのカセグレンミラー３５０と、ラマン散乱光の結像点に設けられた共焦点アパーチャー３２０と、特定の光を除去するフィルター３２３と、分光器３２６へ進入する光の量を調整する入射スリット３２５を備える。
本実施形態では第３実施形態と同様に、試料３１８の垂直方向に励起光を照射することから、ラマン散乱光とともに試料３１８からの蛍光が多く発生する可能性がある。そこで本実施形態の集光過程では図２１に示すように、集光過程の最初の段階で、反射ミラー３４１を用いて、垂直方向における蛍光を全て遮光しているのである。このような遮光によって、良好なラマン散乱光が集光可能となる。また、集光にはカセグレンミラー３５０を利用する。該カセグレンミラー３５０を利用することにより、対物レンズが必要なく、また、焦点距離が長い場合でも結像点までの距離を短くできるので、顕微鏡の小型化が可能となる。

試料３１８に照射された励起光により、該励起光と波長の異なるラマン散乱光は、反射ミラー３４１によって垂直方向への蛍光は遮光され、カセグレンミラー３５０を利用して、ラマン散乱光は集光される方向（分光器が設定してある上方向）へ反射される。方向の定まったラマン散乱光は、ラマン散乱光の結像する位置（結像点）に設けられた共焦点アパーチャー３２０によって、焦点のあった光のみが効率よく集光される。その後、フィルター３２３を経由し、ラマン散乱光に混在する分析に不要な光を多く含む部分の光が取り除かれた良好なラマン散乱光は、入射スリット３２５を経由して分光器３２６へ進入し、良好なラマン散乱光による精度の良い分析が行われる。

以上のように、本発明に係る共焦点ラマン顕微鏡によれば、励起光断面を略環状にすることで垂直方向の空間分解能を高めると共に試料の垂直方向からの蛍光を減らし、さらに集光過程で励起光照射時とは逆パターン形状のしぼりを設けて共焦点アパーチャーを通過した光のうち断面略中央部の外側の光を遮光することで、ラマン散乱光が多く混在する光のみを集光し、精度の良い分析が可能となる。
また、励起光断面を縮小し、試料の垂直方向に強い励起光を照射してラマン散乱光の強度を強めるとともに、集光過程において試料からの垂直方向の蛍光等を遮光することによっても、精度の良い分析が可能となる。
加えて励起光に疑似暗視野を利用する場合は、顕微測定時の水平空間分解能の向上効果も得られた。

１ １０１ ２０１ ３０１ 励起光学系
２ １０２ ２０２ 対物レンズ系
３ １０３ ２０３ ３０３ 集光光学系
１０、１１０、２１０、３１０ 共焦点ラマン顕微鏡
１１、１１１、２１１、３１１ 光源
１２、１１２、２１２、３１２ ビームエキスパンダ
１３ マスク
１４ ２１４ ガラス部材
１５ 遮蔽部材
１６ ビームスプリッター
１７、１１７、２１７、 対物レンズ
１８、１１８、２１８、３１８ 試料
１９、１１９、２１９ 結像レンズ
２０、１２０、２２０、３２０ 共焦点アパーチャ−
２１ １２１、２２１ 平行レンズ
２２、１２２ しぼり
２３、１２３、２２３、３２３ フィルター
２４、１２４、２２４ 集光レンズ
２５、１２５、２２５、３２５ 入射スリット
２６、１２６、２２６、３２６ 分光器
１３０ 開口ミラー
２４０ 中央閉口ミラー
２４１、３４１ 反射ミラー
３５０ カセグレンミラー

Claims (9)

1. 励起光を放射する光源と、前記励起光を試料に照射する励起光照射手段と、試料によって散乱された光から、共焦点アパーチャーを用いてラマン散乱光を集光する集光手段と、集光したラマン散乱光を検出する検出手段と、を備えた共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光照射手段は、励起光の断面形状を略環状に形成する励起光形成手段を備え、
   前記集光手段は、前記共焦点アパーチャーを通過した光のうち断面略中央部の光を集光し、断面略中央部外側の光を遮蔽する遮蔽手段を備えたことを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
2. 請求項１に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光形成手段は、前記励起光の断面略中央部を遮蔽するマスクであることを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
3. 請求項１および請求項２に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記遮蔽手段は、前記マスクと逆パターンの断面形状を有するしぼりであることを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
4. 励起光を放射する光源と、前記励起光を試料に照射する励起光照射手段と、試料によって散乱された光から、共焦点アパーチャーを用いてラマン散乱光を集光する集光手段と、集光したラマン散乱光を検出する検出手段と、を備えた共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光照射手段は、励起光の断面形状を略環状または縮小断面に形成する励起光形成手段を備え、
   さらに前記励起光形成手段は、ラマン散乱光を集光する際、集光した光のうち断面略中央部の光または断面略中央部外側の光のどちらか一方を遮蔽することを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
5. 請求項４に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光形成手段は、断面略中央部に穴の開いた略環状の開口ミラーであり、
   試料へ励起光を照射する際は、前記励起光のうち断面略中央部外側の光を試料へ反射し、
   試料によって散乱された光からラマン散乱光を集光する際、集光した光のうち前記開口ミラーの断面略中央部への光を集光し、開口ミラーの断面略中央部外側へのラマン散乱光を遮蔽することを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
6. 請求項５に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光形成手段は、前記励起光断面を略環状に形成することを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
7. 請求項４に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光形成手段は、断面略中央部にミラーを有する中央閉口ミラーであり、
   試料へ励起光を照射する際は、前記励起光のうち断面略中央部の光を試料へ反射し、
   試料によって散乱された光からラマン散乱光を集光する際、集光した光のうち前記中央閉口ミラーの断面略中央部外側への光を集光し、中央閉口ミラーの断面略中央部への光を遮蔽することを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
8. 請求項７に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記励起光形成手段は、前記励起光断面を縮小することを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。
9. 請求項４に記載の共焦点ラマン顕微鏡であって、
   前記集光手段は、前記励起光形成手段よりも検出手段側に設けられたカセグレンミラーを含むことを特徴とする共焦点ラマン顕微鏡。