JP2018052850A

JP2018052850A - 生理活性を有する組成物

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Publication number: JP2018052850A
Application number: JP2016190049A
Authority: JP
Inventors: 正之谷口; Masayuki Taniguchi; 秋人落合; Akihito Ochiai; 伸彦橘; Nobuhiko Tachibana
Original assignee: Niigata University NUC; Fuji Oil Holdings Inc
Current assignee: Niigata University NUC; Fuji Oil Holdings Inc
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2018-04-05

Abstract

【課題】本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる組成物及びその用途を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することを目的とする。【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物が、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有することを見出した。（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。【選択図】なし

Description

本発明は、生理活性を有する組成物に関する。

人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌などの口腔機能が低下する。なかでも唾液分泌が低下すると、歯周病や口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭といった口腔疾患が増大する。また、皮膚の疾患や傷害によって皮膚のバリア機能や保湿機能が低下する。更に、乳幼児や高齢者の免疫機能は低いため、病原菌に感染しやすい。これらの機能の低下は、国民の健康の維持と増進にとって重大な課題である。

これまで、口腔ケア用品等に添加される抗菌成分又は殺菌成分としては、エタノール等の有機溶剤や抗生物質などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、前記有機溶剤を用いた口腔ケア用品は、体質的に受け入れられないという問題、乳幼児には使用できないという問題があり、前記抗生物質を用いた口腔ケア用品では、長期間使用により耐性菌が出現するという問題がある。

一方、動物、植物、昆虫、微生物等の様々な生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っており、多糖分解酵素や溶菌酵素などのタンパク質やアミノ酸が約１０個〜約５０個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生している。これらの抗菌成分は、前記抗生物質と比較して広範囲な抗菌活性を有し、耐性菌を生じさせにくいという特性を有することから、口腔用抗菌剤としての利用が期待されている。

生物由来の抗菌剤として、例えば、イネ由来の抗菌タンパク質であるオリザシスタチンが知られている。しかしながら、オリザシスタチンは、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）のジンジパインを阻害することが知られているものの、その菌体に対して直接抗菌活性を示すものではない。
イネゲノム中にはディフェンシンなど既知の抗菌タンパク質のホモログが存在するが、イネの生体防御に対する寄与は不明である。

本発明者らは、イネ種子に由来し、歯周病の治療や予防に有効な、歯周病菌のプロテアーゼに対する阻害活性を有するペプチドを報告している（例えば、特許文献２参照）。

しかしながら、未だ、生物由来であって、菌体に対して強い抗菌作用を有し、且つ、エンドトキシン中和活性、創傷治癒活性のような生理活性を有する組成物の開発が望まれているのが現状である。

特開２００７−８４４７１号公報特許第４９８２９０８号公報

本発明は、従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる組成物及びその用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物が、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有することを見出し本発明を完成させた。
（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。

すなわち本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物、
（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）生理活性が、抗菌活性、エンドトキシン中和活性または創傷治癒活性である、（１）記載の生理活性を有する組成物、
（３）以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分とする生理活性剤、
（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（４）生理活性剤が、抗菌剤、エンドトキシン中和剤または創傷治癒剤である、（３）記載の生理活性剤、
である。

本発明によれば、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた抗菌活性、エンドトキン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる生理活性を有する組成物、及びその用途を提供することができる。
また、本発明によれば、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた抗菌活性、エンドトキン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することができる。

配列番号４〜６のペプチドのグラム陰性菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＡＴＣＣ３３２７７）に対する抗菌活性を測定した結果を示すグラフである。配列番号４〜６のペプチドのグラム陽性菌（Ｐ．ａｃｎｅｓＪＣＭ６４７３）に対する抗菌活性を測定した結果を示す図である。配列番号４〜６のペプチドのグラム陽性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓＪＣＭ５７０５）に対する抗菌活性を測定した結果を示すグラフである。配列番号４〜６のペプチドの真菌（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＮＢＲＣ１３８５）に対する抗菌活性を測定した結果を示すグラフである。配列番号４〜６のペプチドのエンドトキシン中和活性を測定した結果を示すグラフである。ＬＬ−３７のＨＵＶＥＣに対する血管新生（管腔形成）促進作用を測定した結果を示すグラフである。各ペプチドのＨＵＶＥＣに対する血管新生（管腔形成）促進作用を測定した結果を示すグラフである。

（生理活性を有する組成物）
本発明の生理活性を有する組成物は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することからなる。
（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド

本発明でいう生理活性とは、抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性をいう。
本発明の抗菌活性としては、例えば、歯周病の原因となるグラム陰性細菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＡＴＣＣ３３２７７）に対する抗菌活性、う蝕（虫歯）の原因となるグラム陽性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓＪＣＭ５７０５）に対する抗菌活性、にきび（アクネ）の原因となるグラム陽性菌（Ｐ．ａｃｎｅｓＪＣＭ６４７３）に対する抗菌活性、日和見感染症の原因となる真菌（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＮＢＲＣ１３８５）に対する抗菌活性が挙げられる。
本発明のエンドトキシン中和活性は、カブトガニ血球抽出物を用いたリムルステストにおいて、エンドトキシンが引き起こす反応を阻害する活性が挙げられる。
本発明の創傷治癒活性としては、例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の管腔形成促進作用に基づくものが挙げられる。

（ペプチド）
前記ペプチドは、配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性の生理活性を有する限り、配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

（配列番号４）
RKSREWRSKKTQPRRPR

（配列番号５）
KNQYGRIRVLQRFNQR

（配列番号６）
RIRLLQRFNKR

配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、大豆タンパク質より得ることができるし、また、化学合成により得ることもできる。
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、大豆タンパク質のグリシニン成分の配列番号１から見出され（配列番号１の下線部分: 348〜364番目の17残基）、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、大豆タンパク質のβ-コングリシニン成分のαサブユニットの配列番号２から見出され（配列番号２の下線部分：208〜223番目の16残基）、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、大豆タンパク質のβ-コングリシニン成分のβサブユニットの配列番号３から見出される(配列番号３の下線部分：52〜62番目の11残基)。
配列番号１〜３の配列を以下に示す。

（配列番号１）
MGKPFTLSLS SLCLLLLSSA CFAISSSKLN ECQLNNLNAL EPDHRVEFEG
GLIQTWNSQH PELKCAGVTV SKLTLNRNGL HLPSYSPYPR MIIIAQGKGA
LQCKPGCPET FEEPQEQSNR RGSRSQKQQL QDSHQKIRHF NEGDVLVIPP
GVPYWTYNTG DEPVVAISLL DTSNFNNQLD QTPRVFYLAG NPDIEYPETM
QQQQQQKSHG GRKQGQHQQE EEEEGGSVLS GFSKHFLAQS FNTNEDIAEK
LQSPDDERKQ IVTVEGGLSV ISPKWQEQQD EDEDEDEDDE DEQIPSHPPR
RPSHGKREQD EDEDEDEDKP RPSRPSQGKR EQDQDQDEDE DEDEDQPRKS
REWRSKKTQP RRPRQEEPRE RGCETRNGVE ENICTLKLHE NIARPSRADF
YNPKAGRIST LNSLTLPALR QFQLSAQYVV LYKNGIYSPH WNLNANSVIY
VTRGQGKVRV VNCQGNAVFD GELRRGQLLV VPQNFVVAEQ AGEQGFEYIV
FKTHHNAVTS YLKDVFRAIP SEVLAHSYNL RQSQVSELKY EGNWGPLVNP
ESQQGSPRVK VA

（配列番号２）
MMRARFPLLL LGLVFLASVS VSFGIAYWEK ENPKHNKCLQ SCNSERDSYR
NQACHARCNL LKVEKEECEE GEIPRPRPRP QHPEREPQQP GEKEEDEDEQ
PRPIPFPRPQ PRQEEEHEQR EEQEWPRKEE KRGEKGSEEE DEDEDEEQDE
RQFPFPRPPH QKEERKQEED EDEEQQRESE ESEDSELRRH KNKNPFLFGS
NRFETLFKNQ YGRIRVLQRF NQRSPQLQNL RDYRILEFNS KPNTLLLPNH
ADADYLIVIL NGTAILSLVN NDDRDSYRLQ SGDALRVPSG TTYYVVNPDN
NENLRLITLA IPVNKPGRFE SFFLSSTEAQ QSYLQGFSRN ILEASYDTKF
EEINKVLFSR EEGQQQGEQR LQESVIVEIS KEQIRALSKR AKSSSRKTIS
SEDKPFNLRS RDPIYSNKLG KFFEITPEKN PQLRDLDIFL SIVDMNEGAL
LLPHFNSKAI VILVINEGDA NIELVGLKEQ QQEQQQEEQP LEVRKYRAEL
SEQDIFVIPA GYPVVVNATS NLNFFAIGIN AENNQRNFLA GSQDNVISQI
PSQVQELAFP GSAQAVEKLL KNQRESYFVD AQPKKKEEGN KGRKGPLSSI
LRAFY

（配列番号３）
MMRVRFPLLV LLGTVFLASV CVSLKVREDE NNPFYFRSSN SFQTLFENQN
GRIRLLQRFN KRSPQLENLR DYRIVQFQSK PNTILLPHHA DADFLLFVLS
GRAILTLVNN DDRDSYNLHP GDAQRIPAGT TYYLVNPHDH QNLKIIKLAI
PVNKPSRYDD FFLSSTQAQQ SYLQGFSHNI LETSFHSEFE EINRVLFGEE
EEQRQQEGVI VELSKEQIRQ LSRRAKSSSR KTISSEDEPF NLRSRNPIYS
NNFGKFFEIT PEKNPQPRDL DIFLSSVDIN EGALLLPHFN SKAIVILVIN
EGDANIELVG IKEQQQKQKQ EEEPLEVQRY RAELSEDDVF VIPAAYPFVV
NATSNLNFLA FGINAENNQR NFLAGEKDNV VRQIERQVQE LAFPGSAQDV
ERLLKKQRES YFVDAQPQQK EEGSKGRKGP FPSILGALY

「１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された」とは、部位特異的変異法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換又は付加できる程度の数（好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質から単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、本技術分野において周知である。更に、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。好ましい変異体は、保存性又は非保存性アミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有する。より好ましくは、保存性置換、欠失、又は付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。

（その他の成分）
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記生理活性を有する組成物中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。

前記生理活性を有する組成物の用途としては、例えば、抗菌剤、エンドトキシン中和剤、創傷治癒剤などが好適に挙げられる。

（飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料）
本発明の飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料は、前記生理活性を有する組成物を含有してなる。

前記飲食品としては、特に制限はなく、例えば、各種の清涼飲料水、果汁飲料、和洋菓子、乳製品その他の畜産加工品、果実加工品、野菜加工品、穀物の加工品、水産加工品、調味料、ビタミンなどを主成分としたいわゆる各種の健康食品など数多くの飲食品が挙げられる。
前記医薬品、医薬部外品としては、特に制限はないが、歯周病治療剤、口内炎治療剤、薬用トローチ、薬用のど飴、洗口液、練歯磨き、などが好適に挙げられる。
前記化粧品又は飼料としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

以下に実施例を記載することで本発明を説明するが、本発明の技術思想がこれらの例示によって限定されるものではない。尚、例中の部及び％は特に断らない限り重量基準を意味するものとする。

（実施例１）大豆タンパク質由来ペプチドの抗菌活性
配列番号１に示す大豆タンパク質（グリシニン）から見出した配列番号４のペプチド、配列番号２に示す大豆タンパク質（β-コングリシニンαサブユニット）から見出した配列番号５のペプチド、及び配列番号３に示す大豆タンパク質（β-コングリシニンβサブユニット）から見出した配列番号６のペプチドの特徴を表１に示す。
各ペプチドは、株式会社医学生物学研究所に委託して、合成した。配列番号４、５、および６の各ペプチドの表２に示す被験菌に対する抗菌活性を測定した。

（表１）大豆タンパク質由来生理活性ペプチドの特徴

（表２）被験菌として使用した疾病に関連する微生物

（抗菌試験）
グラム陰性細菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＡＴＣＣ３３２７７）は、変法ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン５．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン５．０ｇ、消化血清末１０．０ｇ、酵母エキス末２．５ｇ、肉エキス末２．２ｇ、肝臓エキス末１．２ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、Ｌ−アルギニン１．０ｇ、ビタミンＫ１０．００５ｇ、ヘミン０．０１ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、ｐＨ７．３）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で４８時間静置培養した。
グラム陽性細菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓＪＣＭ５７０５）は、ＢＨＩ培地（１Ｌ中、豚脳エキス末４．０ｇ、豚ハートエキス末４．０ｇ、ペプトン１７．５ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ、ｐＨ７．２）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で６時間静置培養した。
グラム陽性細菌（Ｐ．ａｃｎｅｓＪＣＭ６４７３）は、ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で２４時間静置培養した。
真菌（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＮＢＲＣ１３８５）は、ＹＭ培地（１Ｌ中、グルコース１０．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、麦芽エキス１．０ｇ、ｐＨ６．２）を用いて、通性嫌気条件下、２５℃で２４時間静置培養した。

被験菌に対する抗菌活性試験は、以下の手順で行った。被験菌の培養に用いたものと同じ培地に、８０μＬの各被験菌の培養液を播種した後、所定の温度に設定したインキュベーターに入れて所定の時間培養した。その後、新たな培地に植え継いで、さらに所定の時間培養した。得られた前培養液を段階希釈することでＯＤ６５０＝５．０×１０−５の種菌液を調製した。
次に、リザーバーを用意して、各レーンに３００μＬの１．３３倍濃度の培地、１００μＬの各ペプチド溶液（等電点電気泳動によって分画した各フラクションの濃度は1.5ｍｇ／ｍＬに調節した。また化学合成したペプチドの濃度は、100μＭ、200μＭまたは300μＭに調節した。）、１００μＬの前記種菌液を添加してよく混合した。
コントロールとブランクには、ペプチド溶液の代わりに同量の滅菌水を添加し、更にブランクには種菌液の代わりに１倍濃度の各培地を同量添加した。ペプチド溶液を添加したもの、コントロール及びブランクのそれぞれを９６ウェル培養プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェルに１００μＬずつ分注し、前記各被験菌の培養条件と同じ条件で培養を行った。

（抗菌活性の評価方法）
各ペプチドの抗菌活性は、生菌に由来するＡＴＰを定量することによって評価した。
生菌に由来するＡＴＰの定量は、ＢａｃＴｉｔｅｒ・Ｇｌｏ（登録商標）ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光法により行った。以下のように微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ量に応じた発光強度から微生物量を測定した。
具体的には、まず、培養プレートの各ウェルに分注した１００μＬ被験菌培養液に対して１０μＬのルシフェールＡＴＰ消去試薬（キッコーマン株式会社製）を添加し、１０分間撹拌することによって生菌体外に存在するＡＴＰを分解消去させてサンプルとした。
次に、あらかじめ９６穴プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）の各ウェルに分注した５０μＬのＡＴＰ発光試薬に対して、前記サンプルを５０μＬ添加した。各ウェルの生菌に由来するＡＴＰ発光強度（発光波長５６０ｎｍ）を、マイクロプレートリーダー１４２０（ＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＣｏｕｎｔｅｒＡｒｖｏ（登録商標）ＭＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用い、ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（ＲＬＵ）として測定した。１サンプルについて３回測定を行い、測定は、各菌の対数増殖初期において行った。抗菌活性は、抗菌成分を含まないコントロールのＲＬＵを１００％とし、それぞれの濃度のおけるＲＬＵから増殖率を求め、各ペプチドの増殖阻害率を算出した。

これらの抗菌活性を測定した結果を図１〜４に示した。
図１から図４の結果から明らかなように、前記の３種類のペプチド（配列番号４、５、及び６）は、いずれもＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＡＴＣＣ３３２７７、グラム陽性菌のＰ．ａｃｎｅｓＪＣＭ６４７３及びＳ．ｍｕｔａｎｓＪＣＭ５７０５及び真菌のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＮＢＲＣ１３８５に対して抗菌活性を示した。

（実施例２）ペプチドのエンドトキシン中和活性
実施例１で用いた３種のペプチドのエンドトキシン中和活性は、「エンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット」（生化学工業株式会社製）及び「エンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット」（生化学工業株式会社製）を用いて評価した。
９６ウェルプレート（＃３５９５マルチプルウェルプレート（平底）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルにエンドトキシン標準品（０．１０ＥＵ／ｍＬ）２５μＬ及びペプチド溶液（最終濃度0.1 μＭ, 0.5μＭ、及び１μＭ）を加えて、３７℃にて３０分間又は３５分間振盪しながらインキュベーションした。次に、５０μＬの前記セットに含まれていたＬＡＬ試薬を各ウェルに添加し、３７℃で１０分間振盪しながらインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー（２０３０ＡｒｖｏＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド溶液の代わりに蒸留水（エンドトキシンフリー）を添加したものをコントロールとし、コントロール（０μＭ）の吸光度を１００％とした時の相対値をエンドトキシン中和活性とした。

３種類のペプチドのエンドトキシン中和活性を測定した結果を図５に示した。図５から明らかなように、配列番号４，５，及び６のペプチドは、すべて濃度依存的にエンドトキシンを中和することが示された。特に、配列番号４と５の中和活性は、0.4μＭにおいてエンドトキシンの反応を１００％抑制したことから、医療用の抗菌薬であり、0.1μＭにおいて約50％の中和活性を示すポリミキシンＢ（Ｐ１００４−１、Ｓｉｇｍａ社製）に匹敵する活性を有していた。

（実施例３）ペプチドの創傷治癒活性
実施例１で用いたペプチドの創傷治癒作用を、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−４１０９）の管腔形成促進作用に基づいて評価した。
９６穴プレート（＃３５９５，Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、ＨＵＶＥＣを３日間〜４日間コンフルエントな状態になるまで培養した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３３２０）を用いて洗浄し、不純物を取り除いた。次に、トリプシン／ＥＤＴＡ（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３１２０）で３分間処理し、剥がれてきたＨＵＶＥＣを回収し、トリプシン中和液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３２２０）に添加した。この細胞懸濁液を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液を除去し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−２１５０Ｓ）を加えて細胞濃度を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液と各ペプチドとを１：１の割合で混合した。
本実験では、ヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドとして知られているＬＬ−３７（LLGDF FRKSK EKIGK EFKRI VQRIK DFLRN LVPRTDS：（配列番号７）／株式会社ペプチド研究所製、４４４５−ｓ）をポジティブコントロールとして用いて、化学合成したペプチドの管腔形成促進作用と比較した。
なお、ＬＬ−３７がヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドであることは、例えば、１）Ｍ．Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｍ．Ｊ．Ｅｓｃａｍｅｚ，Ｍ．Ｇａｒｃ?ａ，Ｂ．Ｄｕａｒｔｅ，Ａ．Ｈｏｌｇｕｉｎ，Ｌ．Ｒｅｔａｍｏｓａ，Ｊ．Ｌ．Ｊｏｒｃａｎｏ，Ｍ．ｄｅｌＲｉｏ，ａｎｄＦ．Ｌａｒｃｈｅｒ：ＩｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｐｒｏｍｏｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎＬＬ−３７．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，（２００８）Ｖｏｌ．１２８，ｐｐ．２３３−２３６．、２）Ｒ．Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ｐ．Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｃ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，ＲＣｏｓｔａ，Ｌ．Ｇｕａｒｄａｏ，Ｆ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｒ．Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．Ｖｉｌａｎｏｖａ，Ｌ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，ａｎｄＭ．Ｇａｍａ：ＷｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｈｕｍａｎａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅＬＬ３７．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，（２０１１）Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．１４６９−１４７６．などに記載されている。

マトリゲル（ＢｅｃｔｏｎＤｅｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、３５４２３４）は常温では固まり、４℃で液体状態になるため、はじめに４０μＬのマトリゲルを氷上で９６穴プレート（＃３５９５，Ｃｏｒｉｎｉｇ社製）に添加した。添加したマトリゲルを３７℃で３０分間インキュベートした後、予め準備しておいた細胞懸濁液と各ペプチド、又はＬＬ−３７との混合液（１００μＬ）を添加し、１５時間培養した。
マトリゲル内でＨＵＶＥＣが形成した管腔構造を、顕微鏡を用いて４０倍の倍率で観察し、写真撮影を行った。また、得られた画像から３００×４００ｐｉｘｅｌの範囲を抽出し、形成された管腔構造をした細胞の長さの合計値を測定し、各ペプチドの創傷治癒作用を評価した。

ＬＬ−３７及び各ペプチドのＨＵＶＥＣに対する血管新生（管腔形成）促進作用を図６-１と図６-２に示した。
図６-１に示すように、ポジティブコントロールとして用いたＬＬ−３７は、0.1μＭ、1.0μＭ、10μＭと濃度が高くなるにつれて、顕微鏡観察した細胞の写真からもわかるように、管腔構造をした細胞の長さを徐々に促進した。
また、図６-２に示すように、配列番号４，５，及び６の３種類のペプチドは、すべて管腔構造をした細胞の長さを徐々に促進した。また、１０ μＭのペプチドを添加した実験において、顕微鏡観察した細胞の写真を、それぞれ示す。顕微鏡観察の結果から、１０ μＭのペプチドを添加したときに、無添加の場合に比べて細胞の増殖が促進され、１０ μＭのＬＬ−３７を添加したときと同じように、管腔構造をした細胞の長さが増加していることがわかった。細胞の長さを定量した結果、特に配列番号５は、ＬＬ−３７に比べて、ＨＵＶＥＣの管腔形成促進作用が強いことがわかった。
したがって、３種類のペプチド（配列番号４、５及び６）は、血管新生（管腔形成）促進作用を示し、創傷治癒活性を有することがわかった。

（実施例４）化学合成したペプチドの溶血活性
緬羊脱繊維無菌血液（０１０２−１、株式会社日本バイオテスト研究所製、以下「赤血球」とも称する）を用いて、前記ペプチドの溶血活性を試験した。
マイクロチューブ中にて、４０μｌの赤血球を９６０μｌの生理的食塩を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ７．２）に４体積％になるように懸濁して懸濁液とした。前記懸濁液を５，０００ｒｐｍにて、５分間遠心分離した後、上澄液を除き、新たに９６０μＬのＰＢＳを加えて赤血球を再懸濁した。この操作を３回繰り返した後、得られた赤血球をサンプルとして用いた。任意の濃度に希釈された前記ペプチド溶液、又は０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（５９５−１３１３５、和光純薬工業株式会社製）を９６穴プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに５０μｌずつ分注した。次に、４体積％の赤血球懸濁液を各ウェルに５０μＬずつ分注した後、３７℃にて１時間インキュベーションした。その後、４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。遠心分離によって得られた５０μＬの上澄液を、あらかじめ５０μＬのＰＢＳ又は水を分注しておいたウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（２０３０ＡｒｖｏＴＭＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光を測定した。前記ペプチドを添加しないときの吸光度を０％、及び前記ペプチドの代わりに０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度を１００％として、次の式を用いて溶血活性を評価した。
溶血活性（％）＝（Ａ_{ｐｅｐｔｉｄｅ}−Ａ_０）×１００／（Ａ_{ＴｒｉｔｏｎＸ−１００}−Ａ_０）
ここで、Ａ_０は無添加のときの吸光度、Ａ_{ｐｅｐｔｉｄｅ}は各ペプチドを添加したときの吸光度、及びＡ_{ＴｒｉｔｏｎＸ−１００}は０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度をそれぞれ示す。

強い抗菌活性を有するが、同時に強い溶血活性を持つハチ毒中の抗菌ペプチドであるＭｅｌｉｔｔｉｎ（５１１−９７５３１、ＳｅｒｖａＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社製）は、１０μＭにおいて９４％の溶血活性を示した。一方、配列番号４、５及び６の３種類のペプチドの溶血活性は、２００μＭの濃度においてそれぞれ0.4％、31.3％、及び0.7％であり、配列番号５のペプチドを除いて、溶血率が1％以下であり、ほとんど溶血活性を示さなかった。

Claims

以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物。
（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド
生理活性が、抗菌活性、エンドトキシン中和活性または創傷治癒活性である、請求項１記載の生理活性を有する組成物。
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分とする生理活性剤。
（Ａ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号（４）〜（６）で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド
生理活性剤が、抗菌剤、エンドトキシン中和剤または創傷治癒剤である、請求項３記載の生理活性剤。