JP5095421B2 - 真菌増殖抑制剤 - Google Patents
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Description
HA:ヒアルロン酸
HAS:ヒアルロン酸合成酵素
以下、本発明に関連する技術について説明する。
本発明抑制剤の有効成分であるHA又はその塩の重量平均分子量は、6万〜250万であるものが好ましく、10万〜250万であるものがより好ましく、20万〜250万であるものがさらに好ましく、25万〜250万であるものがさらに好ましく、50万〜250万であるものがさらに好ましく、75万〜250万であるものがさらに好ましく、80万〜250万であるものがさらに好ましく、100万〜250万であるものがさらに好ましく、150万〜250万であるものがさらに好ましく、180万〜220万であるものが特に好ましい。
また、本発明抑制剤による増殖抑制の対象とする真菌は、カンジダ属に属するもの、アスペルギルス属に属するもの、クリプトコッカス属に属するもの、ヒストプラズマ属に属するもの、トリコフィトン属に属するもの、ミクロスポラム属に属するもの、マラセチア属に属するもの、コクシディオイデス属に属するもの、ブラストミセス属に属するもの及びムコール属に属するものからなる群から選ばれる1又は2以上の真菌であることが好ましい。
本発明増強剤は、細胞に導入して用いられることが好ましい。また「HAS」としては、HAS1、HAS2及びHAS3からなる群から選ばれる1又は2以上のHASであることが好ましい。また「細胞」は、上皮細胞又は線維芽細胞であることが好ましい。
また本発明は、HASをコードするDNAを細胞に導入するステップを少なくとも含む、細胞の真菌増殖抑制作用の増強方法(以下「本発明増強方法」という。)を提供する。
また本発明は、HASをコードするDNAが導入された細胞と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法(以下「本発明抑制方法2」という。)を提供する。
本発明抑制剤は、HA又はその塩を有効成分とする、真菌増殖抑制剤である。
本発明抑制剤の有効成分として用いることができるHA又はその塩の由来は特に限定されず、鶏冠、臍帯、HAを産生する微生物等から分離されたものを用いることができる。
本発明抑制剤の剤形等は、HA又はその塩を有効成分として含有しており、かつこれによる真菌増殖の抑制効果が発揮される限りにおいて特に限定されない。
本発明抑制剤は、生体を含むあらゆる物における真菌増殖の抑制に用いることができる。したがって、本発明抑制剤が適用される物は、増殖が抑制されるべき真菌が既に存在している物若しくは今後存在することとなる物又はこれらの可能性がある物である限りにおいて特に限定されず、例えば、非生物体(例えば、工業生産物、培養液等)や生物体(動物、植物等)等が例示される。なかでも、培養液又は生物体であることが好ましい。
本発明抑制方法1は、HA又はその塩と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法である。
本発明増強剤は、HASをコードするDNAを有効成分とする、細胞が有する真菌増殖抑制作用の増強剤である。
本発明増強剤の有効成分として用いることができる「HASをコードするDNA」は、HASの活性を持つポリペプチドをコードしており、かつ、かかるポリペプチドの発現能を有するDNAである限りにおいて特に限定されない。このDNAは、cDNAであることが好ましい。
本発明増強剤の剤形等は、HASをコードするDNAを有効成分として含有している限りにおいて特に限定されない。
本発明増強剤は、細胞が保持している真菌増殖抑制作用を増強する目的で用いることができる。
本発明増強方法は、HASをコードするDNAを細胞に導入するステップを少なくとも含む、細胞の真菌増殖抑制作用の増強方法である。
本発明抑制方法2は、HASをコードするDNAが導入された細胞と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法である。
(1)材料及び方法
まず、本実施例において用いた材料及び方法について説明する。
ヒト口腔上皮細胞株であるKB(ATCC(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)カタログ番号:CCL−17)及びCOS−7細胞(アフリカミドリザル由来の腎細胞をシミアンウイルス40(以下「SV40」という)で形質転換した細胞)を、10%ウシ胎仔血清(以下「FCS」という)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(ともにギブコ(Gibco)社)を含有し、非必須アミノ酸及びEarle’s balanced salt solutionを含む90% イーグル最少必須培地(以下「DMEM」という)(シグマ(Sigma)社)中で、5%CO2条件下、37℃で保持し、3〜4日毎に継代した。歯肉上皮(GE)1細胞株(GE1細胞株)は、温度感受性SV40ラージT抗原遺伝子を導入したC57BL/6マウスのGE組織より樹立した(J. Oral Pathol. Med.,30(5), p.296−304(2001))細胞を、プラスチックシャーレを用いて、1%FCS及び10ng/ml EGFを含有するSFM101(日水製薬株式会社)中、33℃で培養した。SFM101培地のカルシウム濃度は1.13mMであった。細胞は指数関数的に増殖し、培養後約10日目でコンフルエントな状態となり、層状の上皮からなる三次元構造を形成した。
HA(14糖、重量平均分子量60kDa、同250kDa、同800kDa及び同2000kDa)は、生化学工業株式会社中央研究所から恵与されたものを用いた。
真菌として、種々のカンジダ種(カンジダ・アルビカンス(C. albicans)ATCC18804、カンジダ・グラブラータ(C. glabrata)ATCC2001、カンジダ・クルセイ(C. krusei)ATCC6258及びカンジダ・トロピカリス(C. tropicalis)ATCC4563)を用いた。これらのカンジダは、カンジダGE寒天培地(Candida GE agar;日水製薬株式会社)上で、25℃の条件下で増殖させ、1つのコロニーを10mlのグルコースペプトンブロス(Glucose Peptone broth;日本製薬株式会社。以下「GPブロス」という)に播種した。この培養物を25℃で18時間震盪し、定常期に至るまで増殖させた。
(1−4−1)細胞マトリックスからのHAの除去
細胞を、ヒアルロニダーゼ(シグマ(Sigma)社)(50 ユニット/106 細胞)を用いて、37℃で2時間処理した(J. Oral Sci., 45, p.85−91 (2003))。処理後の細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.2、以下「PBS」という)で2回洗浄し、DMEMに再懸濁させた。
細胞を、24ウェルのプレートを用いて、90%の集密度(confluence)に至るまで増殖させた。DNA(50μlの溶液中に0.8μg)及びLipofectamineTM(50μlの溶液中に2.0μg)(インビトロジェン(Invitrogen)社)を、別々に無血清DMEMに希釈した後、混合し、室温で20分間インキュベートした。これにより得られたDNA−LipofectamineTM複合体100μlを、細胞と培地の混合物に添加した。この細胞を、37℃で36時間インキュベートした。細胞表面のHAを過剰に産生させるために、マウス由来のHASの各アイソフォームをコードするcDNAが組み込まれたプラスミド(pEXneo−HAS1、pEXneo−HAS2及びpEXneo−HAS3)(J. Biol. Chem.,274(38), p.25085−25092(1999))を発現ベクターとして用いた。マウス由来のHAS1、HAS2及びHAS3をコードするcDNAの塩基配列を、それぞれ配列番号1、配列番号3及び配列番号5に示す。またこれらのcDNAによってコードされているHAS1、HAS2及びHAS3のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号2、配列番号4及び配列番号6に示す。
リポフェクション工程によって、COS−7細胞をpEXneo−HAS1、pEXneo−HAS2若しくはpEXneo−HAS3又はベクターコントロール(pEXneo)でトランスフェクションした。その24時間後に、1:10希釈となるように細胞を新鮮な培地に移し、10%FCS、2mM L−グルタミン及び0.5mg/ml G418を含有するDMEM中、37℃で選択を行った。この選択期間中において生存していた細胞をクローニングし、実験に用いた。
(1−5−1)HAのカンジダ増殖阻害活性の分析
HAとカンジダとの共培養は、96ウェルプレート(イワキ(Iwaki)社)を用いて、100μlの培地中で行った。カンジダ・アルビカンスは、GPブロス中で、好気的条件下、37℃で一晩増殖させることにより調製した。このカンジダ・アルビカンスの培養物を、異なる終濃度(0.1mg/ml、1.0mg/ml)の種々のサイズのHA(14糖、重量平均分子量60kDa、同250kDa、同800kDa又は同2000kDa)の存在下で、10%CO2条件下、37℃で9時間インキュベートした。
インキュベーション終了後、それぞれのカンジダの増殖の程度を評価するために、培養液を十分に混合し、波長660nmにおける吸光度を測定した。以下、HA存在下でインキュベートしたサンプルの吸光度を「ODtest」と表記する。コントロールとして、HAの非存在下でそれぞれのカンジダを同様にインキュベートしたサンプルを用い、波長660nmにおける吸光度を測定した。以下、このコントロールの吸光度を「ODcontrol」と表記する。
増殖阻害率(%)=(1−ODtest/ODcontrol)x100
(1−5−2)定量プレートカウント
カンジダ・アルビカンスの増殖阻害をモニターするために、定量プレートカウント法も用いた(J. Infect. Dis., 182, p.1479−1485(2000)、Infect. Immun., 69, p.7091−7099(2001)、Med. Mycol., 37, p.251−259(1999))。簡単に説明すると、同様のエフェクターとターゲットとの共培養物を、5%CO2条件下、37℃で9時間インキュベートした。その後、カンジダを除去するためにウェルに0.3% Triton X−100を100μl添加し、このサンプルを連続的に希釈(1:103)して、サブローデキストロース寒天培地(Sabouraud−dextrose agar)にプレーティングした。これを30℃で48時間インキュベートし、コロニー形成単位(以下「CFU」という)をカウントした。以下、HA存在下でインキュベートしたサンプルにおけるCFUのカウント値を「試験CFU」と表記する。
増殖阻害率(%)=(1−試験CFU/コントロールCFU)x100
(1−6)カンジダの生体染色
上皮細胞とカンジダとの共培養(エフェクター:ターゲット比(以下「E:T」と略記する)が20:1、40:1又は80:1)は、96ウェルプレート(コスター(Costar)社)を用いて、100μlの培地中で行った。9時間インキュベートした後、この共培養物を回収して2回洗浄した。フルオレセインジアセテート(生細胞を染色する。以下「FDA」という)(50μg/ml)及びヨウ化プロピジウム(死細胞を染色する。以下「PI」という)(1μg/ml)(いずれもシグマ(Sigma)社)(Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 62, p.33−73(1998)、Anal. Chem., 37, p.1219−1221(1965))を、細胞のペレットに同時に添加し、暗所において、室温で20分間インキュベートした。なお、予備試験によってそれぞれの色素の最適濃度を決定した。
生細胞のアッセイは、既報と同様に行った(Infect. Immun., 69, p.5925−5930(2001))。
簡単に説明すると、まず、COS−7及びKB細胞を、5x105細胞/mlの濃度で96ウェルプレートにプレーティングした。これに、10、20又は100ユニット/mlの各濃度のヒアルロニダーゼ(シグマ(Sigma)社)を添加し、カンジダ・アルビカンスを20時間培養した。培養の終期にMTT溶液(20μg/ml)をウェルに添加し、プレートの内容物を4時間インキュベートした。これに酸性イソプロパノール(イソプロパノール中に0.04MのHClを含有するもの)100μlを添加して赤色のホルマザンを溶離させ、十分に混合した。各ウェルにおける溶液中のホルマザン濃度は、試験波長として570nm、リファレンスの波長として620nmをそれぞれ用い、プレートリーダー(ダイネックス(Dynex)社)により測定した。
指数関数的に増殖している細胞の培養物及びコンフルエントとなっている細胞の培養物を新鮮な培地を用いて24時間培養し、その順化培地を回収した。この順化培地中のHA濃度を、既報の競合的ELISA−likeアッセイ(J. Biol. Chem., 274, p.25085−25092(1999))により測定した。
簡単に説明すると、回収した順化培地とビオチン標識HA結合タンパク質(生化学工業株式会社)とを混合し、4℃で20時間インキュベートした。この混合物を、HAが結合した96ウェルのプレートに添加し、室温で6時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンを2次プローブとして、パラニトロフェニルホスフェート(p−nitrophenyl phosphate)を基質としてそれぞれ用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定した。HA濃度は検量線を用いて算出した。
全てのデータは、平均値±標準偏差(以下「SD」と略記する)で示した。有意差検定は、unpaired Student’s t検定により行った。p<0.05の場合に統計学的に有意であるとした。全ての統計処理は、SPSS11.0J(SPSSジャパン社)を用いて行った。
(2−1)上皮細胞によるカンジダの増殖阻害
上皮細胞(KB細胞及びGE1細胞)がカンジダ増殖阻害活性を有するか否かを調べるために、カンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を、定量プレートカウントにより測定・算出し、3回の試験の平均値±SDを算出した。結果を図1に示す。
図1より、両細胞がカンジダ増殖阻害活性を有することが示された。
細胞外のHAの役割を検討するために、種々の濃度のヒアルロニダーゼで処理して細胞表面のHAを除去した上皮細胞(KB細胞)及び線維芽細胞(COS−7細胞)を用いて、前記(2−1)と同様にカンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、3回の試験の平均値±SDを算出した。なお、E:T=80:1とした。結果を図2に示す。
図2より、ヒアルロニダーゼで細胞を処理することにより、KB細胞及びCOS−7細胞のカンジダ増殖阻害活性が低下することが示された。なお、MTTアッセイにより、ヒアルロニダーゼ処理は細胞の生死に影響を与えないことが示された(データは示していない)。
HAがカンジダ増殖阻害活性を有するか否かを調べるために、カンジダ・アルビカンス(5×105(細胞/ml))を種々の濃度及び重量平均分子量のHAと共に9時間インキュベートしてカンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、3回の試験の平均値±SDを算出した。結果を図3に示す。
図3より、HAがカンジダ・アルビカンスの増殖阻害作用を有することが示された。さらにこの作用は、高分子のHAにおいて顕著であること及び高濃度のHAにおいて顕著であることが示された。
COS−7細胞を3種類のpEXneo−HAS、又はpEXneo(コントロール)でトランスフェクトし、カンジダ・アルビカンスとともに9時間インキュベートした。一定濃度の細胞(1×106個細胞/ml)から産生されたHA量を以下に示す。
pEX−HAS1:453.9 ng/ml
pEX−HAS2:494.0 ng/ml
pEX−HAS3:347.0 ng/ml
pEXneo : 75.4 ng/ml
この結果から、3種類のHASトランスフェクタントは、いずれもpEXneoに比して細胞外のHAを高レベルに産生することが示された。
KB細胞によるカンジダ増殖阻害が、カンジダ・アルビカンスを殺菌することによるものか、増殖を遅延させることによるものかを調べるために、PI及びFDAを、上皮細胞とカンジダ・アルビカンスの共培養物(E:T=10:1)由来の細胞に加えた。KB細胞の非存在下で培養したカンジダ・アルビカンスをコントロールとした。
HAが、カンジダ・アルビカンス以外のカンジダ種に対しても増殖阻害活性を発揮するか否か調べるために、他のカンジダ種(5×105(細胞/ml))を、2,000kDaのHAとともに、室温で9時間インキュベートし、カンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、3回の試験の平均値±SDを算出した。結果を図5に示す。
本出願は、2006年2月10日出願の日本特許出願(特願2006−033418)に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
Claims (5)
- ヒアルロン酸合成酵素をコードするDNAを有効成分とする、細胞が有する真菌増殖抑制作用の増強剤。
- 真菌がカンジダ属に属するものである、請求項1に記載の増強剤。
- 細胞に導入して用いられることを特徴とする、請求項1または2に記載の剤。
- ヒアルロン酸合成酵素が、ヒアルロン酸合成酵素1、ヒアルロン酸合成酵素2及びヒアルロン酸合成酵素3からなる群から選ばれる1又は2以上のヒアルロン酸合成酵素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の剤。
- 細胞が、上皮細胞又は線維芽細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007557890A JP5095421B2 (ja) | 2006-02-10 | 2007-02-08 | 真菌増殖抑制剤 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006033418 | 2006-02-10 | ||
JP2006033418 | 2006-02-10 | ||
PCT/JP2007/052249 WO2007091644A1 (ja) | 2006-02-10 | 2007-02-08 | 真菌増殖抑制剤 |
JP2007557890A JP5095421B2 (ja) | 2006-02-10 | 2007-02-08 | 真菌増殖抑制剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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