CN104193686A - N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及涉及一种N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物及其制备方法，以及这类化合物在制备抗菌和促进软骨细胞生长方面的药物方面的应用。该N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物及其水溶性盐。在体外对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、变形杆菌、肺科杆菌等具有一定的抑菌作用；并具能够促进骨细胞的增殖，对软骨细胞内总蛋白、糖胺聚糖的合成有明显的促进作用，还可上调蛋白聚糖、II 型胶原及SOX9基因的基因水平，抑制I 型胶原的基因水平，促进软骨细胞外基质的分泌与合成，可用于制备治疗骨性关节炎的药物。
Description
技术领域
本发明涉及药物及制备方法和用途，具体涉及一类N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺化合物及制备方法和用途。
背景技术
没食子酸（Gallic acid）又称五倍子酸或棓酸（化学式C7H6O5，分子量170.12），是自然界存在的一种多酚类化合物，广泛存在于五倍子、葡萄、漆树、茶叶等植物中。大量的文献证实没食子酸及含没食子酸的提取物具有促进细胞凋亡、抗炎、抗突变、抗氧化的生物学活性，此外，还有文献报道了其在关节病治疗中促进软骨细胞形成的重要作用。然而，由于没食子酸的强亲水性，药物的跨膜通透性较低，因此在人体内表现出的药理活性弱于其酯类的衍生物。磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的药物的总称，其在人体内膜渗透性较好，吸收后分布于人体组织中，且与血浆蛋白结合率高，在上世纪里被广泛用于预防和治疗细菌感染性疾病。近年来，有文献报道了一些磺胺类药物在治疗骨关节炎症中的作用，一种具有苯磺酰胺结构的异羟肟酸化合物被人工合成并证实为聚蛋白多糖酶ADAMTS-5的抑制剂。聚蛋白多糖酶ADAMTS-5在关节炎疾病的软骨和滑液中可促使聚蛋白多糖分解代谢，造成骨细胞的降解，因此此异羟肟酸的磺酰胺衍生物通过下调体内聚蛋白多糖酶ADAMTS-5达到抑制软骨细胞降解的作用，并且构效关系表明苯磺酰胺的结构的是产生拮抗作用的重要基团。综合以上没食子酸及磺胺类药物的药学特性，将没食子酸与磺胺类药物进行化学键合，形成一种跨膜通透性强的没食子酸化合物，提高其在体内的药理活性具有一定的可行性。
发明内容
本发明的目的是：采用化学合成方法，制备一种具有下列结构通式（I）的N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物，或者其药学上可以接受的盐，能够制备体外抗菌作用的药物和制备对软骨细胞生长有促进作用的药物。
本发明所述N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物见下（I）式所示：
I
R1为以下的嘧啶基团；
；；；
；；
R2为-OH或-OCOCH3 。
除通式（I）所表示的化合物以外，本发明还包括以下其中一种：
所述的具有通式I的化合物，其特征在于：
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺嘧啶
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺间甲氧嘧啶
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺对甲氧嘧啶
3,4,5-三乙酰没食子酰周效磺胺
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺间甲氧嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺对甲氧嘧啶。
所述的具有上述通式I的化合物为水溶性盐，优选钠盐和钾盐。
本发明所述通式I化合物通过以下步骤合成：
反应条件：第一步，以没食子酸为原料，在50～120℃下与1～5倍体积的醋酐回流生成3,4,5-三乙酰基没食子酸；第二步，3,4,5-三乙酰基没食子酸在50～100℃下与1～5倍体积二氯亚砜回流生成3,4,5-三乙酰基没食子酰氯；第三步，将3,4,5-三乙酰基没食子酰氯溶于四氢呋喃中，与磺胺类药物在0～30℃下，以吡啶或三乙胺为催化剂混合搅拌2 ～24小时，生成通式I-a的化合物。I-a的化合物溶于四氢呋喃中在室温～60℃下与浓盐酸反应1～5小时水解生成I-b的化合物。
本发明所述通式I化合物药学上可接受的盐可通过以下反应合成：
上述所述的抗菌作用的试验是采用滤纸片扩散法检测没食子酸衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、变形杆菌、肺科杆菌等的体外抗菌作用，结果表明，衍生物对上述菌株的一种或几种具有一定的抗菌作用；
上述反应得到的化合物是没食子酸衍生物及其钠盐、钾盐还具有促进软骨细胞生长的作用。
促进软骨细胞生长的作用的试验是采用MTT法测试没食子酸衍生物对体外软骨细胞增殖。通过检测没食子酸衍生物对兔软骨细胞在细胞增殖、形态、活性，及其促进细胞中GAG的合成、调节软骨特异性基因表达方面的影响，结果表明，衍生物可促进软骨细胞生长。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，下述实施例仅是用于说明，而并非限制本发明。本领域技术人员根据本发明的教导所做出的各种变化均应在本申请权利要求所要求的保护范围之内。
一、N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺化合物的制备方法
实施例1
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺嘧啶
在油浴80℃下，将没食子酸与3倍（m:V）乙酸酐混合搅拌12小时，加入15倍体积蒸馏水静置48小时，滤取不溶物，真空干燥，得到3,4,5-三乙酰基没食子酸；在油浴70℃下将3,4,5-三乙酰基没食子酸与二氯亚砜回流6小时，减压回收二氯亚砜，得到3,4,5-三乙酰基没食子酰氯；将3,4,5-三乙酰基没食子酰氯与磺胺嘧啶钠在四氢呋喃中混合，加入少量吡啶为催化剂，在冰浴中搅拌2小时及常温搅拌12小时后加入蒸馏水，80℃减压蒸去部分四氢呋喃后，放置48小时，滤取不溶物，真空干燥，在甲醇-四氢呋喃体系中重结晶，得3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺嘧啶。
实施例2-4
同实施例1的操作，分别用磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、周效磺胺代替实施例1中的磺胺嘧啶钠，其余操作同实施例1，得到3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺间甲氧嘧啶、3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺对甲氧嘧啶、3,4,5-三乙酰没食子酰周效磺胺。
实施例5
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶
同实施例1的操作，用磺胺二甲嘧啶代替实施例1中的磺胺嘧啶，在得到3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺二甲嘧啶后，用四氢呋喃溶解，在60℃下加入盐酸水解6小时，加入蒸馏水，80℃减压蒸去部分四氢呋喃后，放置，滤取不溶物，真空干燥，在甲醇-四氢呋喃体系中重结晶，得3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶。
实施例6-8
同实施例3的操作，分别用磺胺嘧啶钠、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺对甲氧嘧啶钠代替实施例3中的磺胺二甲嘧啶，其余操作同实施例8，得到3,4,5-三羟基没食子酰磺胺嘧啶、3,4,5-三羟基没食子酰磺胺间甲氧嘧啶、3,4,5-三羟基没食子酰磺胺对甲氧嘧啶。
实施例9-16
取适量的3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺嘧啶、3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺间甲氧嘧啶、3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺对甲氧嘧啶、3,4,5-三乙酰没食子酰周效磺胺、3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶、3,4,5-三羟基没食子酰磺胺嘧啶、3,4,5-三羟基没食子酰磺胺间甲氧嘧啶及3,4,5-三羟基没食子酰磺胺对甲氧嘧啶分别溶于0.1M/L的氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液中，制成一定浓度的上述N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物的钠盐或钾盐。
上述实施例中，为了此N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物的结构进行确证，本发明人对衍生物的氢谱、碳谱、质谱进行解析，确证了其结构化合物表征数据见下表1：
二、N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺化合物的抗菌效果实施例
本发明为了明确此N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物的生物活性作用。采用滤纸片扩散法检测没食子酸衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、变形杆菌、肺科杆菌等的体外抗菌作用，结果表明，衍生物对上述菌株的一种或几种具有一定的抗菌作用；通过检测此N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物对兔软骨细胞在细胞增殖、形态、活性，及其促进细胞中GAG的合成、调节软骨特异性基因表达方面的影响，结果表明，衍生物可促进软骨细胞生长。
实施例17 3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶的体外抗菌活性研究
用打孔器将滤纸制成直径6mm的圆片，160℃灭菌30min备用。取3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶溶解于二甲亚砜溶液中制成1mg/mL的供试品溶液，用10uL进样针吸取适量供试品溶液于6mm直径的滤纸片上，制成含药量为1、10、50、100μg的滤纸片，置5-8℃冰箱密封保存。
菌悬液制备：接种金葡球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、变形杆菌、阴沟杆菌、肺克杆菌临床株的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35-37℃培养18-24小时，取培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释成系列菌悬液，置8冰箱保存。取各菌悬液0.1ml注入平皿，倒入灭菌营养琼脂培养基13-15ml，35-37℃培养18-24小时后作菌落计数。取与平皿内菌落数约为5-10个菌落相对应的菌悬液，在72小时内使用，本菌悬液细菌密度约为50-100cfu/ml。
取灭菌营养琼脂培养基平皿、新鲜菌悬液（细菌密度50-100cfu/ml），用灭菌棉拭子蘸取菌悬液，均匀涂布整个培养基表面，反复几次，保证涂布表面均匀染菌。取一含药纸片贴于培养基表面，轻压纸片，使之与培养基表面紧密接触。每一平皿贴含药纸片4片，再贴1片阳性药纸片于平皿中心，每个直径9厘米平皿共贴5片，纸片间距离大于25mm。所有平皿于贴含药纸片后25分钟内，置35-37℃恒温培养箱培养18-24小时，之后，观察菌落生长状况，菌生长受抑制（或无菌生长）区域围纸片形成园形透亮区为抑菌圈，测量记录抑菌圈直径，以抑菌圈直径大于10mm为该含药纸片对该菌株有抑制（或杀灭）作用。结果见表2。
实验结果表明，3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶在体外对金葡球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、变形杆菌、阴沟杆具有一定抗菌活性。
实施例18 3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺对甲氧嘧啶的体外抗菌活性研究
实验部分同实施例17，抗菌实验结果见表3。
实验结果表明，3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺对甲氧嘧啶在体外对金葡球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌、变形杆菌、阴沟杆具有一定抗菌活性。
实施例19 3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶对兔软骨细胞增殖的体外活性研究
1.细胞毒性试验
采用MTT法测试没食子酸衍生物对体外软骨细胞增殖作用。将3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶溶解于0.1M/L的NaOH溶液中，制成0、3.125、3.90625、4.6875、6.25、7.8125、9.375、12.5、15.625、18.75、25、31.25、37.5、50、62.5 μg/ml系列浓度，采用新西兰兔的关节软骨细胞实验。细胞贴壁后加入0、3.125、3.90625、4.6875、6.25、7.8125、9.375、12.5、15.625、18.75、25、31.25、37.5、50、62.5 μg/ml系列浓度的3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶，孵育72小时后，每孔加入20 μL 0.5%(g/L) 的MTT溶液，继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。实验结果：药物浓度在3.125～25 μg/ml范围内OD值高于空白，表明其在该范围内对软骨细胞生长有促进作用。
具体见说明书附图，图1。
三、没食子酸衍生物对细胞毒性以及软骨细胞增殖效果的实施例
2.体外软骨细胞增殖作用试验
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.90625, 7.8125, 和15.625 μg/ml）浓度的3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，经胰蛋白酶消化后， Hoechst 33258染色，使用荧光分光计测量其在460nm下的OD值，计算DNA含量。采用1,9-二甲基亚甲基蓝（DMMB）染色，以硫酸软骨素为对照，使用荧光分光计测量其在在525nm下的OD值， 测定GAG/DNA的相对含量。实验结果：给药组的软骨细胞DNA含量、GAG（糖胺聚糖）相对含量在2,4,6天内均比空白值高，表明给药后的细胞生长速度高于空白组，药物对软骨细胞增殖有促进作用。
具体见说明书附图，图2、3。
3.细胞形态观测
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.90625, 7.8125, 和15.625 μg/ml）浓度的3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，用95%乙醇固定30分钟，PBS溶液洗涤，并采用hematoxylin and eosin (HE)染色，在倒置相差显微镜下观测细胞形态。结果：给药组培养基中细胞繁殖的趋势与细胞形态优于空白组。
4.番红精染色试验
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.90625, 7.8125, 和15.625 μg/ml）浓度的3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，用95%乙醇固定30分钟，PBS溶液洗涤，并采用番红精(Safranin O)染色，放置10分钟后，用蒸馏水洗涤并密封，在倒置相差显微镜下观测细胞形态，用以评测没食子酸衍生物对软骨细胞分泌GAGs的影响。结果：给药组培养基中细胞分泌GAG的量多于空白组。
5.细胞活性试验
细胞活性试验采用细胞活性检测试剂盒(Invitrogen, USA)，分别在2、4、6天进行检测，并在激光扫描共焦显微镜下观测细胞活性。结果：给药组培养基中细胞繁殖的速度快于空白组。
6.免疫组织化学染色试验
采用I型胶原、II型胶原的单克隆抗体进行试验，，在倒置相差显微镜下观测细胞形态。结果：给药2、4、6天后，给药组细胞培养基中II型胶原的量均比空白组多，而I型胶原的量比空白组少。
7.实时荧光定量PCR试验
采用实时荧光定量PCR测定软骨细胞给药3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶后细胞中I型、II型、X型胶原，蛋白聚糖及Sox9基因的含量。采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.90625, 7.8125, 和15.625 μg/ml）浓度的3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，Trizol试剂盒提取给药后细胞的总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA。采用SYBR-Green mix试剂盒PCR法扩增cDNAs，特异性引物序列见表4（其余实施例中的特异性引物序列同表4）。采用定量PCR检测系统测定，通过2-ΔΔCt法比较给药组细胞与空白组的I型、II型胶原，蛋白聚糖及Sox9的基因表达倍数与磷酸甘油醛脱氢酶归一化后的值。
表4 引物序列表
给药2、4、6天后，给药组细胞培养基中II型胶原、Sox9、蛋白聚糖的基因表达均高于空白组，I型胶原的基因表达低于空白组，表明3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶有上调II型胶原、Sox9、蛋白聚糖的基因表达及抑制I型胶原的基因表达的作用。给药6天后的基因表达结果见说明书附图4。
实施例20 3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶对兔软骨细胞增殖的体外活性研究
1.细胞毒性试验
采用MTT法测试没食子酸衍生物对体外软骨细胞增殖作用。将3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶溶解于0.1M/L的NaOH溶液中，制成0、1.9653125、2.34375、3.125、3.90625、4.6875、6.25、7.8125、9.375、12.5、15.625、18.75、25、31.25、37.5 μg/ml系列浓度，采用新西兰兔的关节软骨细胞实验。细胞贴壁后加入上述系列浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶，孵育72小时后，每孔加入20 μL 0.5%(g/L) 的MTT溶液，继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。实验结果：药物浓度在1.9653125～15.625 μg/ml范围内OD值高于空白，表明其在该范围内对软骨细胞生长有促进作用。结果见图5。
2.体外软骨细胞增殖作用试验
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.125, 6.25, 和12.5 μg/ml）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，经胰蛋白酶消化后， Hoechst 33258染色，使用荧光分光计测量其在460nm下的OD值，计算DNA含量。采用1,9-二甲基亚甲基蓝（DMMB）染色，以硫酸软骨素为对照，并与原料药没食子酸及磺胺嘧啶钠比对，使用荧光分光计测量其在525nm下的OD值， 测定GAG/DNA的相对含量。实验结果：给药组的软骨细胞DNA含量、GAG（糖胺聚糖）相对含量在2,4,6天内均比空白值和原料药高，表明给药后的细胞生长速度高于空白组和原料药组，合成的药物对软骨细胞增殖有促进作用。结果见图6、7。
3.细胞形态观测
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.125, 6.25, 12.5 μg/ml）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，用95%乙醇固定30分钟，PBS溶液洗涤，并采用hematoxylin and eosin (HE)染色，在倒置相差显微镜下观测细胞形态。结果：给药组培养基中细胞繁殖的趋势与细胞形态优于空白组。
4.番红精染色试验
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.125, 6.25, 12.5 μg/ml）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，用95%乙醇固定30分钟，PBS溶液洗涤，并采用番红精(Safranin O)染色，放置10分钟后，用蒸馏水洗涤并密封，在倒置相差显微镜下观测细胞形态，用以评测没食子酸衍生物对软骨细胞分泌GAGs的影响。结果：给药组培养基中细胞分泌GAG的量多于空白组。
5.细胞活性试验
细胞活性试验采用细胞活性检测试剂盒(Invitrogen, USA)，分别在2、4、6天进行检测，并在激光扫描共焦显微镜下观测细胞活性。结果：给药组培养基中细胞繁殖的速度快于空白组。
6.免疫组织化学染色试验
采用I型胶原、II型胶原的单克隆抗体进行试验，，在倒置相差显微镜下观测细胞形态。结果：给药2、4、6天后，给药组细胞培养基中II型胶原的量均比空白组多，而I型胶原的量比空白组少。
7.实时荧光定量PCR试验
采用实时荧光定量PCR测定软骨细胞给药3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶后细胞中I型、II型、X型胶原，蛋白聚糖及Sox9基因的含量。采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（3.125, 6.25, 12.5 μg/ml）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶溶液，继续培养2、4、6天，Trizol试剂盒提取给药后细胞的总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA。采用SYBR-Green mix试剂盒PCR法扩增cDNAs，特异性引物序列见表4。采用定量PCR检测系统测定，通过2-ΔΔCt法比较给药组细胞与空白组、原料药组的I型、II型胶原，蛋白聚糖及Sox9的基因表达倍数与磷酸甘油醛脱氢酶归一化后的值。结果：给药2、4、6天后，给药组细胞培养基中II型胶原、Sox9、蛋白聚糖的基因表达均高于空白组，I型胶原的基因表达低于空白组，表明3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶有上调II型胶原、Sox9、蛋白聚糖的基因表达及抑制I型胶原的基因表达的作用。其中以给药6天后测定的结果最为明显，给药2、4、6天后的基因表达结果见说明书附图8、9、10、11。
实施例21 3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺对兔软骨细胞增殖的体外活性研究
1.细胞毒性试验
采用MTT法测试没食子酸衍生物对体外软骨细胞增殖作用。将3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺溶解于0.1M/L的NaOH溶液中，制成0、1.06×10-7、1.06×10-6、1.06×10-5、1.06×10-4、1.06×10-3、1.06×10-2、1.06×10-1、0.133、0.213、0.266、0.425、0.53、0.85、1.06、1.70、2.12、3.40、4.25、42.5 mM/mL系列浓度，采用新西兰兔的关节软骨细胞实验。细胞贴壁后加入上述系列浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺，孵育72小时后，每孔加入20 μL 0.5%(g/L) 的MTT溶液，继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。实验结果：药物浓度在1.06×10-4至1.06×10-2mM/mL范围内OD值高于空白，表明其在该范围内对软骨细胞生长有促进作用，见图12。
2.体外软骨细胞增殖作用试验
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（1.06×10-4、1.06×10-3、1.06×10-2 mM/mL）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺溶液，继续培养2、4、6天，经胰蛋白酶消化后， Hoechst 33258染色，使用荧光分光计测量其在460nm下的OD值，计算DNA含量。采用1,9-二甲基亚甲基蓝（DMMB）染色，以硫酸软骨素为对照，使用荧光分光计测量其在525nm下的OD值， 测定GAG/DNA的相对含量。实验结果：给药组的软骨细胞DNA含量、GAG（糖胺聚糖）相对含量在2,4,6天内均比空白值高，表明给药后的细胞生长速度高于空白组，合成的药物对软骨细胞增殖有促进作用。见表13、14。
3.细胞形态观测
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（1.06×10-4、1.06×10-3、1.06×10-2 mM/mL）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺溶液，继续培养2、4、6天，用95%乙醇固定30分钟，PBS溶液洗涤，并采用hematoxylin and eosin (HE)染色，在倒置相差显微镜下观测细胞形态。结果：给药组培养基中细胞繁殖的趋势与细胞形态优于空白组。
4.番红精染色试验
采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（1.06×10-4、1.06×10-3、1.06×10-2 mM/mL）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺溶液，继续培养2、4、6天，用95%乙醇固定30分钟，PBS溶液洗涤，并采用番红精(Safranin O)染色，放置10分钟后，用蒸馏水洗涤并密封，在倒置相差显微镜下观测细胞形态，用以评测没食子酸衍生物对软骨细胞分泌GAGs的影响。结果：给药组培养基中细胞分泌GAG的量多于空白组。
5.细胞活性试验
细胞活性试验采用细胞活性检测试剂盒(Invitrogen, USA)，分别在2、4、6天进行检测，并在激光扫描共焦显微镜下观测细胞活性。结果：给药组培养基中细胞繁殖的速度快于空白组。
6.免疫组织化学染色试验
采用I型胶原、II型胶原的单克隆抗体进行试验，，在倒置相差显微镜下观测细胞形态。结果：给药2、4、6天后，给药组细胞培养基中II型胶原的量均比空白组多，而I型胶原的量比空白组少。
7.实时荧光定量PCR试验
采用实时荧光定量PCR测定软骨细胞给药3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺后细胞中I型、II型、X型胶原，蛋白聚糖及Sox9基因的含量。采用新西兰兔的关节软骨细胞进行实验，细胞贴壁后分别加入高中低（1.06×10-4、1.06×10-3、1.06×10-2 mM/mL）浓度的3,4,5-三乙酰基没食子酰周效磺胺溶液，继续培养2、4、6天，Trizol试剂盒提取给药后细胞的总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA。采用SYBR-Green mix试剂盒PCR法扩增cDNAs，特异性引物序列见表4。采用定量PCR检测系统测定，通过2-ΔΔCt法比较给药组细胞与空白组、原料药组的I型、II型胶原，蛋白聚糖及Sox9的基因表达倍数与磷酸甘油醛脱氢酶归一化后的值。结果：给药2、4、6天后，给药组细胞培养基中II型胶原、Sox9、蛋白聚糖的基因表达均高于空白组，I型胶原的基因表达低于空白组，表明3,4,5-三乙酰基没食子酰磺胺嘧啶有上调II型胶原、Sox9、蛋白聚糖的基因表达及抑制I型胶原的基因表达的作用。图见15、16、17。
附图说明：
图1－图17是上述实施例的试验结果。
图18是本发明的3,4,5-三羟基没食子酰胺苯磺酰胺类化合物结构图。
Claims (5)
1.一种N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物，其特征在于：具有如下（I）的结构通式：
I
其中：
R1为以下的嘧啶基团；
；；；
；；
R2为-OH或-OCOCH3 。
2.权利要求1所述的N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物，是以下其中一种：
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺嘧啶
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺间甲氧嘧啶
3,4,5-三乙酰没食子酰磺胺对甲氧嘧啶
3,4,5-三乙酰没食子酰周效磺胺
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺间甲氧嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺对甲氧嘧啶
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺氯哒嗪
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺氯吡嗪
3,4,5-三羟基没食子酰磺胺二甲氧嘧啶
根据权利要求1或2所述的具有通式I的化合物，其特征在于：该化合物的药用物为水溶性盐。
3.权利要求1所述的N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物，其特征在于：通过如下反应制得：
当R2=OH时，可由I-a通过水解反应得到I-b：
；
所述的反应条件包括：
第一步，以没食子酸为原料，在50～120℃下与1～5倍体积的醋酐回流生成3,4,5-三乙酰基没食子酸；第二步，3,4,5-三乙酰基没食子酸在50～100℃下与1～5倍体积二氯亚砜回流生成3,4,5-三乙酰基没食子酰氯；第三步，将3,4,5-三乙酰基没食子酰氯溶于四氢呋喃中，与磺胺类药物在0～30℃下，以吡啶或三乙胺为催化剂混合搅拌2 ～24小时，生成通式I-a的化合物；I-a的化合物溶于四氢呋喃中在室温～60℃下与浓盐酸反应1～5小时水解生成I-b的化合物。
4.权利要求1所述的N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类化合物，其特征在于：该化合物体外抗菌作用的药物方面的应用。
5.权利要求1所述的N-没食子酰胺-嘧啶苯磺酰胺类化合物，其特征在于：该化合物对软骨细胞生长有促进作用的药物方面的应用。
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