JP2018043997A - 活性化血小板上のｔｌｔ−１に対する凝固因子の標的化 - Google Patents

活性化血小板上のｔｌｔ−１に対する凝固因子の標的化 Download PDF

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ベルント・ペシュケ
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イェンス・ブラインホルト
Breinholt Jens
ミケール・コフォーズ−ハンセン
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Abstract

【課題】本発明が解決しようとする課題は、血友病A、BまたはCを有するヒトなど凝固障害を有する対象において凝固促進薬として使用するのに適した化合物を提供することである。【解決手段】前記課題は、(iii)TLT-1に特異的に結合することができる(ii)モノクローナル抗体またはその断片と共有結合している、(i)少なくとも1つの凝固因子、および/またはその断片もしくは変異体を含む、凝固促進性タンパク質によって解決することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、凝固促進性タンパク質;凝固促進性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、凝固促進性融合タンパク質を発現する細胞、凝固促進性タンパク質を調製する方法、および前記凝固促進性タンパク質の使用に関する。
正常な休止血小板は、内皮がインタクトである際には血液循環全体にわたって自由に流動する。単層の内皮障壁が損傷した際に、休止血小板は糖タンパク質(GP)受容体を用いて内皮下構造に付着する。例えば、GPIaIIaおよびGPVIはコラーゲンと結合し、GPIcIIaはフィブロネクチンと結合し、GPIcIIaはラミニンと結合し、GPIb-V-IXはフォンウィルブランド因子(vWF)ポリマーと結合する。損傷部位において局所的に産生される因子(例えば、セリンプロテアーゼトロンビン)の影響と共に、血管損傷後に曝露される血管外組織構成成分への付着が、血小板の活性化につながる。活性化の複雑なプロセスにおいて、血小板は形状を変化させ、その表面上に特定のリン脂質を露出する。また、休止状態の血小板表面上に既に存在する受容体が、血小板活性化の際に活性化される。さらに、血小板活性化は、休止状態ではアルファ顆粒および濃染顆粒中に細胞内貯蔵され、したがって、休止状態の血小板の表面上には存在しない分子の、放出および表面露出につながる。GPIIbIIIaは、休止血小板および活性化血小板の両方の表面上に存在する血小板受容体の一例である。GPIIbIIIaは、閉じた不活性な高次構造で休止血小板上に存在し、血小板活性化の間に、フィブリノーゲンおよびフィブリンを含むそのリガンドに結合することができる開いた活性な高次構造を取る。休止血小板においてアルファ顆粒中に細胞内貯蔵されるが、活性化血小板の表面上に放出および露出される受容体の一例は、本出願が関連するTREM様転写物1(TLT-1)である(Washingtonら、Blood、104巻、1042〜1047頁(2004年)、Gattisら、Journal of Biological Chemistry、281巻、13396〜13403頁(2006年))。
内皮下層中の組織因子(TF)保有細胞が、血中を循環する構成成分に曝露されたときに、血液凝固カスケードが開始される。循環する凝固第VIla因子(FVIIa)へのTFの曝露が、少量のトロンビンの形成を誘発し、これが、損傷部位に付着した血小板のさらなる動員および活性化につながる凝固促進シグナルとして機能する。凝固は、活性化血小板の表面上でさらに伝播および増幅され、最終的に爆発的なトロンビン生成につながり、これが次に、フィブリノーゲンのフィブリン線維への活性化および重合をもたらし、止血クロットを架橋および安定化する。凝固カスケードのいくつかの構成成分に帰せられる特徴は、活性化血小板のリン脂質膜と特異的に会合する能力である。この目的のために、FVIIaならびに例えば凝固第IX因子および凝固第X因子(それぞれ、FIXおよびFX)ならびにそれらの対応する活性化形態(それぞれ、FVIIa、FIXaおよびFXa)は、それらを活性化血小板の表面に指向させ、そこに結合することを可能にするγ-カルボキシグルタミン酸リッチ領域(Glaドメイン)を保有する。凝固第VIII因子(FVIII)は、その軽鎖を介して結合することによって、活性化血小板と会合する。凝固第XI因子(FXI)が血小板に結合する機構は、さらに議論の余地があるが、血小板がFXIおよびFXIaに影響を与えること、および血小板へのFXIの結合がFXI A3ドメイン中の残基を必要とすることを示唆する証拠が挙がってきている(Emsleyら、2010年、Blood、115巻、2569頁)。
膜結合は、FVIIaなどの凝固因子の活性を強く亢進する。しかし、血小板膜とのその相互作用は、変動する親和性のものである。例えば、FVIIaの血小板表面への結合定数(KD)は、低いマイクロモル濃度の範囲である。改善された血小板結合および活性化血小板表面への凝固因子の局在化は、それらの活性を亢進できる。したがって、これを行う手段が望まれる。
血友病A、BまたはCを有するヒトなど凝固障害を有する対象では、例えば機能性凝固因子が不在でありまたはその存在量が不十分であるために、凝固カスケードの様々なステップが機能障害となる。凝固の一部のそのような機能障害の結果、例えば関節に突発性出血をもたらす不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血が生じる。
WO06/096828 EP 404,097 WO 93/11161 米国特許第5,047,335号 米国特許第5,510,261号 米国特許第5,278,299号 WO 01/83725 WO 02/22776 WO 02/077218 WO 03/027147 WO 03/037932 WO 04/029090 WO 05/024006 WO 07/031559 EP 05108713.8 US 7173000 B2 JP4451514 B2 US 2011/0217284 A1 米国特許第5,629,384号 WO2003/031464 WO2006134148 WO 90/13540 米国特許第5,932,462号 米国特許第5,643,575号 WO2004/099231 特許02/077218 WO2009108806
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本発明の一目的は、そのような対象において凝固促進薬として使用するのに適した化合物を提供することである。本発明の第2の目的は、それらが由来する凝固因子と比較して活性が増加した凝固促進性分子を提供することである。本発明の第3の目的は、生理学的に適切な微小環境において血液凝固を上方制御する分子を提供することである。本発明の第4の目的は、それらが由来する凝固因子よりも長い半減期を有する凝固促進性分子を提供することである。本発明の第5の目的は、血小板計数の低下を生じない凝固促進性分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、凝固因子を活性化血小板の表面に導くことである。本発明の1つの特定の目的は、活性化血小板の表面上でのFIXaおよび/またはFXaの生成を亢進させることである。したがって、その目的は、血管内または血管外に位置する活性化血小板の表面上で血液凝固の開始を可能にすることである。
WO06/096828は、可溶性組織因子(sTF)およびアネキシンVなどのホスファチジルセリン(PS)結合ドメインを含むキメラタンパク質を開示している。PSは、単球、内皮細胞およびアポトーシスを起こしている細胞などの活性化細胞の表面上、ならびに活性化および休止血小板上に露出している。キメラタンパク質は凝固促進性でもあり抗凝固性でもある;後者は、高い用量で構築物が活性化血小板上でのPSとの結合において凝固因子と競合することに起因する。したがって、WO06/096828のキメラタンパク質は、本明細書に記載の凝固促進性タンパク質とは異なるセットの特性を有する。
本発明の凝固促進性タンパク質は、損傷部位に存在する活性化血小板に特異的に標的化される。本発明のタンパク質は、血小板がもはや休止していないが活性化されている場合または活性化過程にある場合に血小板膜上に現れる特定の受容体および構成成分エピトープの同定に基づいている。したがって、本発明は、活性化血小板の表面上の凝固を亢進する方法に関する。
本発明の凝固促進性タンパク質は、活性化血小板の表面上に露出され、休止血小板の表面上ではより低い程度に露出される(およびある種のアッセイでは、検出可能には露出されない)(iii)受容体に結合することができる(ii)抗体またはその断片と共有結合している、(i)少なくとも1つの凝固因子、および/またはその断片もしくは変異体を含む。TLT-1はそのような受容体の一例であり、凝固促進性タンパク質は、例えば、TLT-1(16〜162)、TLT-1(20〜125)またはTLT-1(126〜162)に結合できる。凝固因子は、酵素前駆体形態のセリンプロテアーゼ、例えば、FVII、FIXもしくはFX、または対応する活性化形態のFVIIa、FIXaおよびFXa、あるいはセリンプロテアーゼの誘導体;FVもしくはその誘導体、FVIIIもしくはその誘導体またはFXIもしくはその誘導体でよい。凝固因子および抗体または抗体断片は、リンカーによって必要に応じて連結される。本発明の凝固促進性タンパク質は、融合タンパク質または化学的コンジュゲートでよい。したがって、本発明は、それらの製造にも関する。少なくとも1つの本発明の凝固促進性タンパク質を含む組成物を調製する1つの方法は、(i)TLT-1抗体またはその断片を、リンカーの1つの反応性基(RS1)と化学的にコンジュゲート化するステップ、および(ii)凝固因子を、前記リンカーの別の反応性基(RS2)と反応させるステップを含む。
この場合、前記リンカーは、ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマーでよい。
本発明は、以下もまた提供する:本発明による凝固促進性タンパク質のいずれか1つをコードする単離ヌクレオチド配列;次に本発明による凝固促進性タンパク質のいずれか1つをコードする単離ヌクレオチド配列を含むベクター;本発明の凝固促進性タンパク質のいずれか1つをコードするヌクレオチド配列を含む単離細胞。前記ヌクレオチド配列は、次に、細胞内ベクターによって発現させることができる。前記単離細胞は、BHK細胞またはCHO細胞またはHEK細胞などの哺乳動物細胞などの真核細胞でよい。
同様に、本発明は、医薬として使用し、凝固障害を治療するための凝固促進性タンパク質に関する。一実施形態では、治療有効量の前記タンパク質を、それを必要とする個体に静脈内または皮下投与など非経口投与する。必要とするそのような個体は、先天性、後天性および/または医原性凝固障害を有し得る。
ヒトTLT-1ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。図1では、hTLT-1を表すヌクレオチドおよびアミノ酸配列が示されている。ここで、1〜45位のヌクレオチド配列は予測されるシグナルペプチドをコードし、46〜486位のヌクレオチド配列はhTLT-1の細胞外ドメインをコードし、487〜555位のヌクレオチド配列は膜貫通領域をコードし、556〜933位のヌクレオチド配列はhTLT-1の細胞内ドメインをコードする。 C末端His-6タグを含有するヒトTLT-1の細胞外ドメインを表すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。図2では、C末端Hisタグを有するhTLT-1の細胞外ドメインを表すヌクレオチドおよびアミノ酸配列が示されている。ここで、下線の配列(7〜15)はコザック配列の位置を示し、16〜60位のヌクレオチド配列は予測されるシグナルペプチドをコードし、61〜501位のヌクレオチド配列はhTLT-1の細胞外ドメインをコードし、502〜519位のヌクレオチド配列は6×Hisタグをコードする(太字)。制限酵素部位HindIII(1〜6位のヌクレオチド配列)およびEcoRI(523〜528位のヌクレオチド配列)も示され、終止コドンは星印が付けられている(520〜522)。 Kabatの番号付けを含む0012LCおよび0012HCの可変ドメイン:A)0012LCの可変ドメインを示す図である。 図3Aでは、1〜57位のヌクレオチド配列はLCシグナルペプチド配列をコードし、58〜396位のヌクレオチド配列は0012LCの可変ドメインをコードする。 Kabatの番号付けを含む0012LCおよび0012HCの可変ドメイン:B)0012LCの可変ドメイン-Kabatの番号付けを示す図である。 図3Bでは、太字および灰色の配列はKabatの番号付けによる0012LC CDRの位置を表す。 Kabatの番号付けを含む0012LCおよび0012HCの可変ドメイン:C)0012HCの可変ドメインを示す図である。 図3Cでは、1〜54位のヌクレオチド配列は0012HCシグナルペプチドをコードし、55〜396位のヌクレオチド配列は0012HCの可変ドメインをコードする。 Kabatの番号付けを含む0012LCおよび0012HCの可変ドメイン:D)0012HCの可変ドメイン-Kabatの番号付けを示す図である。 図3Dでは、太字および灰色の配列はKabatの番号付けによる0012HC CDRの位置を表す。 (pTT-0012LC.HPC4によってコードされる)ヒトLC、カッパの定常領域およびHPC4タグと一緒になった0012LCの可変ドメインを示す図である。図4では、1〜57位のヌクレオチド配列はLCシグナルペプチドをコードし、58〜396のヌクレオチド配列は0012LCの可変ドメインをコードし、397〜714のヌクレオチド配列はヒト0012LC、カッパの定常領域をコードし、715〜750のヌクレオチド配列はHPC4タグをコードする。 ヒトIgG4の定常領域と一緒になった0012HCの可変ドメイン(pTT-0012HC)を示す図である。図5では、1〜54のヌクレオチド配列はHCシグナルペプチドをコードし、55〜396のヌクレオチド配列は0012HCの可変ドメインをコードし、397〜1377のヌクレオチド配列はヒトIgG4の定常領域をコードする(太字)。 mAb0023の存在下および不在下におけるTLT-1のHX分析ペプチドの配列カバー範囲を示す図である。hTLT-1の一次配列が(水平の棒として示される)HX分析ペプチドの上に表示されている。0023の存在下でも不在下でも同様の交換パターンを示しているペプチドは白色で表示され、一方0023結合後に重水素の取り込みの低減を示しているペプチドは黒色となっている。 mAb0051の存在下および不在下におけるTLT-1のHX分析ペプチドの配列カバー範囲を示す図である。hTLT-1の一次配列が(水平の棒として示される)HX分析ペプチドの上に表示されている。0051の存在下でも不在下でも同様の交換パターンを示しているペプチドは白色で表示され、一方0051結合後に重水素の取り込みの低減を示しているペプチドは黒色となっている。 mAb0062の存在下および不在下におけるTLT-1のHX分析ペプチドの配列カバー範囲を示す図である。hTLT-1の一次配列が(水平の棒として示される)HX分析ペプチドの上に表示されている。0062の存在下でも不在下でも同様の交換パターンを示しているペプチドは白色で表示され、一方0062結合後に重水素の取り込みの低減を示しているペプチドは黒色となっている。 mAb0061(mAb0012)の存在下および不在下におけるTLT-1のHX分析ペプチドの配列カバー範囲を示す図である。hTLT-1の一次配列が(水平の棒として示される)HX分析ペプチドの上に表示されている。0061の存在下でも不在下でも同様の交換パターンを示しているペプチドは白色で表示され、一方0061結合後に重水素の取り込みの低減を示しているペプチドは黒色となっている。 TLT-1領域126〜162のHX分析ペプチドの配列カバー範囲を示す図である。hTLT-1の一次配列が(水平の棒として示される)HX分析ペプチドの上に表示されている。全てのペプチドがmAb0061(mAb0012)結合後に重水素の取り込みの低減を示した。 トロンボエラストグラフィー(TEG)によって測定した正常ドナー由来のヒト全血(HWB)におけるTF誘導性フィブリンクロット形成に対するFVIIa-Fab1029の影響を示す図である。再石灰化HWBにおけるクロット形成(曲線HWB)は、0.03pMのTF(Innovin(登録商標))によって誘導される。曲線「血友病」は、HWBに10μg/mlの抗FVIII抗体を補充した場合の、遅延した不適切なクロット形成を示す。他の曲線は、FVIII抗体によって誘導された血友病様状態が、種々の濃度(0;0.25;0.5;1.0nM)の示されたFVIIa-Fab1029またはrFVIIaによって回復される場合に得られた曲線を示す。FVIIa-Fab1029のFVIIIバイパス活性は、rFVIIaのバイパス活性よりも強力であることが示されている。 トロンボエラストグラフィー(TEG)によって測定した正常ドナー由来のヒト全血(HWB)におけるTF誘導性フィブリンクロット形成に対するFVIIa-Fab1029の影響を示す図である。R時間は、図11A中に示される実験のTEG痕跡から決定される。クエン酸安定化ヒト全血(HWB)は、正常ドナーから採取する。血友病様状態は、10μg/mlの抗FVIII抗体(Sheep anti-Human Factor VIII;Hematologic Technologies Inc)と共に室温で30分間HWBをインキュベートすることによって得られる。クロット形成は、トロンボエラストグラフィー(5000シリーズTEG分析器、Haemoscope Corporation、Niles、IL、USA)によって測定される。種々の濃度(0;0.25;0.5;1.0nM)のFVIIa-Fab1029またはrFVIIaを、血友病様クエン酸HWBに添加する。340μlの正常HMBまたは血友病様HWBを、0.03pMの脂質付加TF(Innovin(登録商標)、Dade Behring GmbH(Marburg、Germany))を含む0.2M CaCl2を20μl含有するトロンボエラストグラフカップに移したときに、凝固が開始される。TEG痕跡を最大で120分間連続的に追跡する。以下のTEG変数を記録する:R時間(凝固時間、すなわち凝固の開始から2mmの振幅が得られたところまでの時間)、α角度(R値とTEG痕跡の変曲点との間の角度として測定されるクロットの発生)、K(特定のレベルのクロット強度に達するまでのクロット動態の速度、振幅=20mm)、およびMA(クロットの最大の機械的強度を反映するTEG痕跡の最大振幅)。 トロンボエラストグラフィー(TEG)によって測定した正常ドナー由来のヒト全血(HWB)におけるTF誘導性フィブリンクロット形成に対するFIX-Fab0135の影響を示す図である。再石灰化HWBにおけるクロット形成(曲線HWB)は、0.03pMのTF(Innovin(登録商標))によって誘導される。曲線「血友病」は、HWBに10μg/mlの抗FVIII抗体を補充した場合の、遅延した不適切なクロット形成を示す。他の曲線は、FVIII抗体によって誘導された血友病A様状態が、種々の濃度(0.1;0.2;1.0;5.0;10nM)のFIX-Fab0135によって回復された場合に得られたTEG痕跡を示す。FIX融合タンパク質を1nMのrFVIIaまたは10nMのrFIXで置き換えたときに得られたTEG曲線を比較のために示す。 TLT-1濃縮リン脂質小胞に標的化されたFIX-Fab0135が、FVIIIの不在下でFVIIaによって誘導されるFX活性化を顕著に促進することを示す図である。種々の濃度(0.05〜100nM)のrFVIIaを、Hepes緩衝液(○)、または10nMのFIX(□);10nMのFIXa(■)もしくは10nMのFIX-Fab0135(▲)を含むHepes緩衝液中で、15分間インキュベートする。次いで、これを混合し、示されたように、5nMのFVIII不在下または存在下で、100nMのFXおよび1:4,000希釈のTLT-1濃縮リン脂質小胞と共に3分間インキュベートする。反応をEDTAで停止させ、FXa生成を発色アッセイで測定する。 ヒト血小板上でのTLT-1発現を示す図である。数字は、フローサイトメトリー分析において前方散乱および側方散乱でゲーティングした全血中の血小板上のTLT-1数を示す。抗体を検出するための明確な数の結合部位を有するビーズから得られた標準曲線を使用して、血小板ゲート内の平均蛍光を使用して、TLT-1数を計算した。血小板を、プロテアーゼ活性化受容体-1活性化ペプチドSFLLRN(0.3〜30μM)で活性化した。最大TLT-1発現を確実にするために、SFLLRN(30μM)およびコンブルキシン(Cvlxn)(100ng/ml)の組合せを対照として使用した。TLT-1発現を、2つの異なる抗TLT-1抗体mAb0136;左側の棒グラフおよびmAb0123;右側の棒グラフによって測定した。データは、異なる群中の2人から4人の範囲の血液ドナー数と共に平均±標準誤差として示す。 FVIIa-Fab9015が、ビヒクルを受容する血友病マウスと比較して、抗体誘導性の血友病を有するTLT-1 KOKIマウスにおいて、出血時間(左)および血液損失(右)を用量依存的に減少させたことを示す図である。20nmol/kgの用量のFVIIa-Fab9015は、20nmol/kgのrFVIIaと比較して、顕著により有効であった。 FVIIa-Fab9015(20または4nmol/kg)、rFVIIa(20nmol/kg)またはビヒクルを投薬した一過性血友病TLT-1 KOKIマウスにおける血小板計数を示す図である。マウスに-5分の時点で投薬し、出血を0分から30分まで観察し、血小板計数を出血の誘導後120分間観察した。 25nMのrFVIIa(塗りつぶしなしの棒)またはFVIIa-Fab9015(塗りつぶした棒)のいずれかによって生成されたピーク量のトロンビンを示す棒グラフである。トロンビン生成を、150000plts/μlの固定された血小板濃度で、誘導された血友病A状態(ヒツジ抗ヒトFVIIIポリクローナル抗体)下で測定した。反応は、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(30μM)およびGPIVアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の添加による血小板活性化で開始した。 5nMのrFVIIa(塗りつぶしなしの棒)またはFVIIa-Fab9015(塗りつぶした)のいずれかによって生成されたピーク量のトロンビンを示す棒グラフである。トロンビン生成を、150000plts/μlの固定された血小板濃度で、血友病A状態下で測定した。反応は、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(30μM)およびGPIVアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の添加による血小板活性化で開始した。 FVIIa-Fab9015の効果が血小板活性化に依存することを示す図である。25nMのFVIIa-Fab9015を、ヒツジ抗ヒトFVIII抗体の添加によって血友病A様にされたヒト多血小板血漿(150000plts/μl)に添加した。活性化されていない血小板を含む試料は、低いトロンビン生成を示し(点線)、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(10μM)は、トロンビン生成の幾分かの増加を生じ(破線)、SFLLRN(30μM)およびGPVIアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の両方で活性化した血小板は、最大のトロンビン生成を生じた(実線)。 rFVIIaと比較したFVIIa-Fab9015によるトロンビン生成の増加が、TLT-1依存的であることを示す図である。元の痕跡は、ヒツジ抗ヒトFVIIIポリクローナル抗体の添加によって血友病A様にされたヒト多血小板血漿(150000plts/μl)におけるトロンビン生成を示す。トロンビン生成は、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(30μM)およびGPVIアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の添加によって開始した。痕跡によって示されるように、FVIIa-Fab9015(5nM)(実線)は、rFVIIa(5nM)(点線)よりも有意に大きいトロンビンピークを生じる。試料を可溶性TLT-1(100nM)と共に予めインキュベートすることによって、FVIIa-Fab9015のトロンビン生成能は顕著に低下した(破線)。これにより、9015効果が、活性化血小板上のTLT-1結合に依存することが確認される。 rFIXと比較したFIX-Fab0155によるトロンビン生成の増加が、TLT-1依存的であることを示す図である。元の痕跡は、ヒト血小板(150000plts/μl)を含むFIX欠乏症血漿におけるトロンビン生成を示す。トロンビン生成は、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(30μM)およびGPVIアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の添加によって開始した。痕跡によって示されるように、1nMのFIX-Fab0155(実線)は、rFIX(灰色の線)よりも有意に大きいトロンビンピークを生じる。可溶性TLT-1(100nM)の予めのインキュベーションは、FIX-Fab0155(破線)のトロンビン生成能を顕著に低下させ、TLT-1依存性が確認された。 可溶性組織因子(sTF)の存在下でのFVII-Fab5001融合タンパク質の自己活性化を示す図である。タンパク質分解活性を、リン脂質(PC:PS)およびsTFの存在下で測定した。結果は、2つの独立した測定値の平均であり、wtFVIIaと比較した相対的kcat/Km値で与えられる。 TLT-1抗体(mAb0023、mAb0051、mAb0061、mAb0062)のいずれも、血小板凝集に影響を与えないことを示す図である。この図は、血小板をSFLLRN(1μM)で活性化した多血小板血漿における光透過率測定値からの元の痕跡を示す。試料を、抗TLT-1抗体または無関係の対照抗体(10nM)と共に、血小板活性化の前に3分間予めインキュベートした。 TLT-1抗体(mAb0023、mAb0051、mAb0061、mAb0062)のいずれも、血小板凝集に影響を与えないことを示す図である。この図は、血小板をSFLLRN(10μM)で活性化した多血小板血漿における光透過率測定値からの元の痕跡を示す。試料を、抗TLT-1抗体または無関係の対照抗体(10nM)と共に、血小板活性化の前に3分間予めインキュベートした。 トロンボエラストグラフィー(TEG)によって測定した正常ドナー由来のヒト全血(HWB)におけるTF誘導性フィブリンクロット形成に対するFIX-mAb0145の影響を示す図である。種々の濃度のFIX-mAb0145またはrFIXを補充した正常HWBおよび「血友病」血を用いたTEG痕跡から得られたR時間が示される。 25nMのFVIIa-Fab9015、FVIIa-Fab1029およびFVIIa-Fab1001によって生成されたピーク量のトロンビンを示す棒グラフである。3つ全ての構築物が、rFVIIa(25nM)と比較して、増加した能力を示した。トロンビン生成を、150000plts/μlの固定された血小板濃度で、誘導された血友病A状態(ヒツジ抗ヒトFVIIIポリクローナル抗体)下で測定した。反応は、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(30μM)およびGPIVアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の添加による血小板活性化で開始した。棒は、ピークトロンビン生成の平均±SDを示す(n=2〜5)。 野生型rFVIIaと比較して増加したFVIIa-Fab5001の能力を示す図である。元の痕跡は、洗浄されたヒト血小板(150000plts/μl)を含む第VIII因子欠乏症血漿におけるトロンビン生成を示す。活性化試料において、トロンビン生成を、PAR-1活性化ペプチドSFLLRN(30μM)およびGPVIアゴニストコンブルキシン(100ng/ml)の添加によって開始した。痕跡によって示されるように、FVIIa-Fab5001(25nM)(実線)は、野生型rFVIIa(25nM)(点線)よりもおよそ4倍大きいトロンビンピークを生じた。活性化されていない血小板(破線)では、能力の亢進はなかった。
本発明の凝固促進性タンパク質は、少なくとも1つの凝固因子またはその機能性変異体と、活性化または活性化血小板に関連する形態学的変化および機能的変化を受けている血小板上にのみ存在する(単語の普遍的な意味において)受容体に結合することができる抗体またはその断片とを含む。そのような受容体は、休止血小板のアルファまたは濃染顆粒に由来することがあり、そのような受容体の1つの特定の例は、TREM様転写物1(TLT-1)である。
凝固促進性分子は融合タンパク質でよい。「融合タンパク質」という用語は、本明細書中で、元々別々のタンパク質もしくはペプチドをコードする2つ以上のDNA配列またはその断片をインフレームで連結することによって作製されるタンパク質を指す。融合タンパク質DNA配列の翻訳は、単一のタンパク質配列を生じ、これは、元のタンパク質またはペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有してもよい。融合タンパク質をコードするDNA配列は、重複PCRまたはDNAライゲーションなどの標準的な分子生物学的方法によって人工的に作製でき、3'末端DNA配列中の終止コドンを保持しつつ最初の5'末端DNA配列中の終止コドンを排除するアセンブリが実施される。得られた融合タンパク質DNA配列は、標準的な宿主生物(例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞または哺乳動物細胞)における異種融合タンパク質発現を支持する適切な発現ベクター中に挿入できる。
融合タンパク質は、融合タンパク質を規定するタンパク質またはペプチド部分を分離するリンカーまたはスペーサーペプチド配列を含んでよい。リンカーまたはスペーサーペプチド配列は、個々のタンパク質またはペプチド部分の正確な折り畳みを促進し得、それらの個々の機能的特性を保持するために個々のタンパク質またはペプチド部分にとってよりふさわしいものになり得る。リンカーまたはスペーサーペプチド配列は、完全な融合タンパク質DNA配列を形成する個々のDNA断片のインフレームアセンブリの間、すなわち、重複PCRまたはDNAライゲーションの間に、融合タンパク質DNA配列中に挿入できる。
あるいは、本発明の凝固促進性タンパク質は、凝固因子および抗体が互いに独立して製造され、その後合成により連結されるように、構成要素の凝固因子と抗体対応物とのコンジュゲートであり得る。
上述のように、本発明の凝固促進性分子は、TREM様転写物1(TLT-1)に特異的に結合できる。骨髄細胞上で発現する誘発性受容体(triggering receptors expressed on myeloid cells)(TREM)は、様々な骨髄系列の生物学において十分確立された役割を有し、自然免疫および適応免疫の制御に重要な役割を担う。TLT-1は同じタンパク質ファミリーに属するが、TLT-1遺伝子は単一の系列、すなわち巨核球および栓球(血小板)中でのみ発現し、巨核球および血小板のアルファ顆粒中で専ら認められる。TLT-1は、アルファ顆粒放出後の活性化血小板の表面上に露出している膜貫通タンパク質である。今まで、TLT-1は休止血小板の表面または任意の他の細胞型の表面上では認められていない。
TLT-1の細胞外部分は、ストークと呼ばれるリンカー領域により血小板の細胞膜に連結した単一の免疫グロブリン様(Ig様)ドメインからなることが知られている(Gattisら、Jour Biol Chem、2006年、281巻、19号、13396〜13403頁)。ヒトTLT-1(hTLT-1)のIg様ドメインは105残基からなり、37アミノ酸のストークにより膜に付着している。したがって、TLT-1のIg様ドメインはかなり自由に運動することが予想される。
hTLT-1の推定上の膜貫通セグメントは、長さが20アミノ酸である。TLT-1は、細胞内シグナル伝達ドメインとして機能し得る細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(Immune-receptor Tyrosine-based Inhibitory-Motif)(ITIM)も有する。
血小板生物学におけるTLT-1の役割は、未だ完全には解明されていない;TLT-1はフィブリノーゲンに結合することが示されており、TLT-1は、損傷部位において凝固および炎症の制御において役割を果たすと考えられている。Ig様ドメインを含有する可溶型のTLT-1が報告されている(Gattisら、Jour Biol Chem、2006年、281巻、19号、13396〜13403頁)。血小板結合TLT-1に対する可溶性TLT-1の特定の機能はまだ明らかとなっていない。
Giomerarelliら(ThrombosisおよびHaemostasis(2007年)97巻、955〜963頁)は、ファージディスプレイ技術を使用した抗TLT-1 scFv分子の生成を報告している。いくつかの抗TLT-1 scFv分子は、トロンビン媒介性のヒト血小板凝集を阻害することが見出された。したがって、そのような特徴を有する抗TLT-1 scFc分子は、Schwartzら(FASEB Journal、(2004年)、18巻、1704〜1706頁)に記載された抗GPIIb/IIIa scFv分子と同様の抗血栓特性を有してよい。
本発明は、抗TLT-1抗体またはその抗原結合断片(scFvが含まれる)に結合した凝固因子を含む融合タンパク質またはコンジュゲートに関する。抗TLT-1抗体またはその断片は、活性化血小板表面に凝固促進活性を送達する目的で、TLT-1に結合することによって、連結された凝固因子を活性化血小板の表面に標的化するように働く。これに関して、血小板凝集の阻害は、抗TLT-1抗体の所望の特性ではない。したがって、本発明の抗TLT-1抗体は、TLT-1の機能を好ましくは妨害せず、特に、血小板凝集を阻害しない。
TLT-1などの受容体は、本発明の凝固促進性タンパク質にとって有用な標的であるエピトープを含む。凝固促進性タンパク質は、Ig様ドメインの表面到達可能な残基、またはストークの部分など、in vivoでの結合に利用可能であるTLT-1の任意の部分と結合することができる。したがって、融合タンパク質は、TLT-1(20〜125)、TLT-1(16〜162)、TLT-1(126〜162)および/またはTLT-1(129〜142)内の1つまたは複数の残基と結合することができる(括弧内の数字は、配列番号2中のアミノ酸残基を指す)。
好ましい実施形態では、凝固促進性タンパク質は、TLT-1(126〜162)またはTLT-1(129〜142)の1つまたは複数の残基など、TLT-1のストークと結合する。TLT-1のストークと結合する凝固促進性タンパク質は、Ig様ドメインの機能に干渉する可能性が低い。別の好ましい実施形態では、凝固因子を抗体またはその断片のC末端と融合させると、FVIIおよびFVIIaと比べて、凝固因子が活性化血小板の細胞表面上のさらに好ましい位置となる。
別の好ましい実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質は、血小板凝集を妨害せずにTLT-1に結合する。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質は、TLT-1へのフィブリノーゲン結合と競合せずにTLT-1に結合する。
本発明に関して、TLT-1は、齧歯目(マウス、ラットまたはモルモットなど)、ウサギ目(ウサギなど)、偶蹄目(ブタ、ウシ、ヒツジまたはラクダなど)または霊長目(サルまたはヒトなど)などの任意の哺乳動物など、任意の脊椎動物由来のものでよい。TLT-1は、好ましくはヒトTLT-1である。TLT-1は、機能的なTLT-1タンパク質を生じさせる任意の天然に存在する遺伝子型または対立遺伝子から翻訳することができる。1つのヒトTLT-1の非限定的な例は、配列番号2のポリペプチド配列である。配列番号2は、配列番号2のシグナルペプチド(残基1〜15(MGLTLLLLLLLGLEG))を含み、成熟TLT-1ポリペプチドは、配列番号2の残基16〜311に対応する。
本発明の凝固促進性タンパク質は、TLT-1に対して産生された抗体またはその断片を含む。抗体またはその断片は、TLT-1の高次構造の変化を生じても生じなくてもよい。さらに、抗体またはその断片によって、TLT-1との結合の結果細胞内シグナル伝達が生じることもあり、または生じないこともある。1つの実施形態では、抗体またはその断片は、TLT-1のストークと結合することができる。したがって、抗体またはその断片は、本発明に独特であり、それによって提供される効果を実現するために、天然に存在する受容体、またはその部分を利用する。
「抗体」という用語は、本明細書中で、TLT-1またはその一部である抗原に特異的に結合することができる、生殖系列免疫グロブリン配列由来のタンパク質を指す。この用語は、任意のアイソタイプ(すなわち、IgA、IgE、IgG、IgMおよび/またはIgY)の全長抗体およびその任意の断片もしくは単鎖を含む。
全長抗体は通常、少なくとも4つのポリペプチド鎖を含む:すなわち、ジスルフィド結合によって相互接続される2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖。特定の医薬対象の1つの免疫グロブリンサブクラスはIgGファミリーであり、これは、アイソタイプIgGl、IgG2、IgG3およびIgG4に細分できる。IgG分子は、2つ以上のジスルフィド結合によって相互連結された2つの重鎖、および1つのジスルフィド結合によってそれぞれが重鎖に結合した2つの軽鎖から構成される。重鎖は1つの重鎖可変領域(VH)および最大3つの重鎖定常(CH)領域:CH1、CH2およびCH3を含んでよい。軽鎖は、1つの軽鎖可変領域(VL)および1つの軽鎖定常領域(CL)を含んでよい。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域に組み入れられた、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分できる。VH領域およびVL領域は、典型的には3つのCDRおよび4つのFRから構成され、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと整列される:FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の超可変領域は、抗原(TLT-1)と相互作用できるドメインを形成するが、抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(エフェクター細胞)、Fc受容体および古典的補体系の第1の構成成分(Clq)が含まれるがそれらに限定されない宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介できる。
凝固促進性タンパク質の抗体構成成分は、モノクローナル抗体でよい。そのような抗体は、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはそれらいずれかの抗原結合部分でよい。抗体産生のために、実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスなどの適切な哺乳動物である。
構造的には、モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を有する単一の分子種で表される。本発明の凝固促進性タンパク質のモノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばKohlerおよびMilstein(1975年)Nature 256巻:495頁の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、またはBリンパ球のウイルス性もしくは発癌性形質転換を含めた様々な周知の技術によって産生することができる。ハイブリドーマの調製に好ましい動物の系はマウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された手順である。免疫感作プロトコール、および融合のために免疫感作した脾臓細胞を単離する技術は当技術分野で知られている。融合の相手(例えば、マウスミエローマ細胞)および融合の手順も知られている。
適切なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るために、免疫感作したマウスから脾臓細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、それをマウスミエローマ細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合させることができる。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートに播き、再度スクリーニングし、適切なIgGについて依然として陽性である場合、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングすることができる。次いで安定したサブクローンをin vitroで培養して、組織培養培地中で特徴付けのための少量の抗体を得ることができる。
本発明の抗体は、(a)対象とする免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックもしくは染色体導入動物(例えば、マウス)またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、(b)対象とする抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、(c)組換えのコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および(d)他のDNA配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製され、発現し、作製されまたは単離された抗体など、組換え手段によって調製し、発現させ、作製しまたは単離することができる。
Table 1(表1)に示されているいくつかの適切なモノクローナル抗体は、本明細書において接頭語「mAb」を4桁の番号と一緒に用いて特定される。したがって、モノクローナル抗体は、mAb0012またはその変異体でもよい。モノクローナル抗体は、mAb0023またはその変異体でもよい。モノクローナル抗体は、mAb0051またはその変異体でもよい。モノクローナル抗体は、mAb0061またはその変異体でもよい。モノクローナル抗体は、mAb0062またはその変異体でもよい。モノクローナル抗体は、mAb0082またはその変異体でもよい。
抗体の「抗原結合部分」という用語は、TLT-1または本明細書に記載の別の標的受容体などの抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって発揮できることが示されている。したがって、凝固促進性タンパク質の抗体構成成分は、抗体の断片、例えば、モノクローナル抗体の断片でよい。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、ScFv断片、dAb断片および単離相補性決定領域(CDR)が含まれる。scFvなどの単鎖抗体およびVHHやラクダ抗体などの重鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得ることができ、インタクトな抗体と同じように、有用性について断片をスクリーニングすることができる。
「Fab」断片は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインならびに重鎖の可変ドメインおよび第1の定常ドメイン(CH1)を含む。Fab'断片は、重鎖または軽鎖への1つまたは複数のカルボキシ末端ジスルフィド結合を含む。F(ab')2抗体断片は、ヒンジシステインによってカルボキシ末端の近傍で一般に共有結合している1対のFab断片を含む。抗体断片の他の化学カップリングも、当技術分野で知られている。
「Fv」断片は、完全な抗原認識部位および結合部位を含む抗体断片であり、例えば単鎖可変ドメイン断片(scFv)中に、天然には共有結合であり得る緊密な会合での1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインのダイマーを一般に含む。この立体配置では、各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用して、VH-VLダイマーの表面上に抗原結合部位を規定する。集合的に、6つの超可変領域またはそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、抗原に特異的な3つの超可変領域だけを含む単一の可変ドメインでさえ、抗原を認識および結合する能力を有するが、通常は、結合部位全体よりも低い親和性である(CaiおよびGaren、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93巻:6280〜6285頁、1996年)。例えば、1つの重鎖可変ドメイン(VHH)のみを有する天然に存在するラクダ抗体が抗原に結合できる(Desmyterら、J.Biol.Chem.、277巻:23645〜23650頁、2002年;Bondら、J.Mol.Biol.2003年;332巻:643〜655頁)。
「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの総説については、Pluckthun、1994年、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag、New York、269〜315頁を参照のこと。
「ダイアボディ(diabody)」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖(VHおよびVL)中に、軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含んでいる。同じ鎖上の2つの可変ドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、可変ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成することを余儀なくされ、2つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097;WO 93/11161;およびHollingerら、1993年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90巻:6444〜6448頁中により完全に記載されている。
「直鎖抗体」という表現は、Zapataら、1995年、Protein Eng.、8巻(10号):1057〜1062頁に記載されるような抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって1対の抗原結合領域を形成する、1対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖抗体は、二重特異性または単一特異性のものであり得る。
「モノボディ(monobody)」という用語は、本明細書中で使用する場合、1つの重鎖可変ドメインを有し軽鎖可変ドメインを有さない抗原結合分子を指す。モノボディは、軽鎖の不在下で抗原に結合でき、典型的には、3つの超可変領域、例えば、CDRH1、CDRH2およびCDRH3と称するCDRを有する。重鎖IgGモノボディは、ジスルフィド結合によって接続された2つの重鎖抗原結合分子を有する。この重鎖可変ドメインは、1つまたは複数の超可変領域、好ましくはCDRH3領域またはHVL-H3領域を含む。
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用する場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」(軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)ならびに重鎖可変ドメイン中の残基31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)として配列によって規定される;Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年))由来のアミノ酸残基、ならびに/あるいは「超可変ループ」(構造によって規定され、各抗体について異なっている;例えば、ChothiaおよびLesk、1987年、J.Mol.Biol.196巻:901〜917頁を参照のこと)由来のアミノ酸残基を含む。一例において、HVL残基は、軽鎖可変ドメイン中の26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3)を含むことができる。
本発明の一実施形態では、凝固促進性タンパク質のTLT-1結合部分はFab断片である。Table 2(表2)に示されているいくつかの適切なFab断片は、本明細書において接頭語「Fab」を4桁の番号と一緒に用いて特定される。Fab断片は、Fab0003またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0004またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0012またはその変異体でもよい。Fab断片は、0023またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0051またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0052またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0061またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0062またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0074またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0082またはその変異体でもよい。Fab断片は、Fab0084またはその変異体でもよい。
上記で述べたように、本発明の抗体は、ヒト抗体でもよく、またはヒト化抗体でもよい。本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域もCDR領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroでのランダムもしくは部位特異的な突然変異生成によって、またはin vivoでの体細胞突然変異によって導入される突然変異)を含んでもよい。しかし、本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。
そのようなヒト抗体はヒトモノクローナル抗体でよい。不死化細胞と融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたB細胞を含むハイブリドーマによって、そのようなヒトモノクローナル抗体を産生することができる。
ヒトリンパ球のin vitro免疫感作、その後のエプスタインバーウイルスを用いたリンパ球の形質転換によって、ヒト抗体を調製することができる。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、任意の改変型のヒト抗体、例えばその抗体と別の作用物質または抗体のコンジュゲートを指す。
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書では、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を指す。ヒトフレームワーク配列内でさらなるフレームワーク領域の改変を行うことができる。
例えば、標準的なELISAまたはウェスタンブロット法により、標的タンパク質との結合について本発明の抗体を試験することができる。ELISAアッセイを使用して、標的タンパク質と正の反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。例えばフローサイトメトリーにより標的タンパク質を発現している細胞と抗体の結合をモニタリングすることによって、抗体の結合特異性を決定することもできる。
抗体が他のタンパク質と結合するか否かを判定することによって、標的タンパク質に対する本発明の抗体の特異性をさらに試験することができる。例えば、TLT-1またはTLT-1の特定の部分、例えばエピトープと特異的に結合する抗体を産生することが所望される場合、抗体が他の分子または対象とする部分を欠く改変型のTLT-1とも結合するか否かを判定することによって、抗体の特異性を評価することができる。
本発明によるポリペプチドまたは抗体「断片」は、対応するモノクローナル抗体の切断によって、例えばポリペプチドのNおよび/またはC末端からの1つまたは複数のアミノ酸の除去によって作製することができる。このようにしてNおよび/またはC末端から最大で10個、最大で20個、最大で30個、最大で40個またはそれ以上のアミノ酸を除去することができる。1つまたは複数の内部欠失によって断片を得ることもできる。
本発明に関して、「エピトープ」とは、凝固促進性タンパク質の抗体(Ab)部分が特異的に結合することができる活性化血小板の表面上の分子構造である抗原(Ag)上の区域または領域、すなわちAbと物理的に接触する区域または領域を指す。抗原のエピトープは、Abとの結合に直接関与するAg中のアミノ酸残基(エピトープの免疫優性構成成分)およびAbによって有効に遮断されるAgのアミノ酸残基(言い換えると、アミノ酸残基が「溶媒排除表面」および/またはAbの「フットプリント」内にある)など結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでよい。本明細書でエピトープという用語は、別段述べられていない限り、抗TLT-1抗体、またはその断片と特異的に結合するTLT-1などの受容体の任意の特定の領域における両方の型の結合部位を含む(例えば、いくつかの場面では、本発明は特定のアミノ酸残基と直接結合する抗体に関する)。TLT-1などの受容体はいくつかの異なるエピトープを含んでよく、そのエピトープには、それだけに限らないが、(1)直鎖ペプチドエピトープ、(2)成熟した受容体の高次構造において互いに近くに位置する1つまたは複数の不連続アミノ酸を含む高次構造エピトープ、および(3)炭水化物基など、全体または一部においてTLT-1と共有結合している分子構造を含む翻訳後エピトープが含まれ得る。
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)の対のエピトープは、種々の実験的および計算的エピトープマッピング法を使用して、詳細の様々なレベルで定義し特徴付けることができる。実験的方法には、突然変異生成、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分析、水素重水素交換質量分析(HX-MS)および様々な競合的結合法が含まれる。各方法が独特の原理を利用するので、エピトープの記載は、それが決定された方法と密接につながっている。したがって、所与のAb/Agの対のエピトープは、使用されるエピトープマッピング法に応じて異なる形で定義される。
その最も詳細なレベルでは、AgとAbとの相互作用のエピトープは、Ag-Ab相互作用中に存在する原子の接触を定義する空間座標、ならびに結合熱力学に対するその相対的な寄与についての情報によって定義することができる。より詳細でないレベルでは、エピトープは、AgとAbとの原子の接触を定義する空間座標によって特徴付けることができる。さらにより詳細でないレベルでは、エピトープは、特定の基準、例えばAbおよびAg中の原子間の距離によって定義される、それが含むアミノ酸残基によって特徴付けることができる。さらにより詳細でないレベルでは、エピトープは、機能を通じて、例えば他のAbとの競合的結合によって特徴付けることができる。エピトープは、別のアミノ酸による置換がAbとAgとの相互作用の特徴を変化させるアミノ酸残基を含むものとしてより一般的に定義することもできる。
Ab、例えばFab断片とそのAgとの複合体の空間座標によって定義される、X線に由来する結晶構造の場面では、エピトープという用語は、本明細書で、別段指定されておらずまたは場面によって否定されない限り、Ab中の重原子(すなわち非水素原子)から4Åの距離内に重原子を有することによって特徴付けられる血小板受容体残基として具体的に定義される。
エピトープの記載および定義が、使用されるエピトープマッピング法次第で、詳細の様々なレベルで得られることから、同じAg上の異なるAbに対するエピトープの比較も同様に詳細の様々なレベルで行うことができることになる。
アミノ酸レベルで記載された、例えばX線構造から決定されたエピトープは、それらが同じアミノ酸残基のセットを含有する場合に同一であるといえる。エピトープは、少なくとも1つのアミノ酸がエピトープによって共有されている場合に重複しているといえる。エピトープは、アミノ酸残基がエピトープによって共有されていない場合に別々(独特)であるといえる。
競合的結合によって特徴付けられるエピトープは、対応するAbの結合が相互排他的である場合、すなわち一方のAbの結合が他方のAbの同時結合を排除する場合に重複しているといえる。エピトープは、Agが対応するどちらのAbの結合も同時に受け入れることができる場合に別々(独特)であるといえる。さらに、1つまたは複数の抗体が、重複するエピトープを有さないが、同時に結合できない場合がある。抗原の三次構造および四次構造に起因して、1つの抗体は、別の抗体の事前の結合に起因してそのエピトープに接近できない場合がある。
本発明の凝固促進性タンパク質は、mAb0012と同じエピトープに結合できる場合がある。凝固促進性タンパク質は、mAb0023と同じエピトープに結合できる場合がある。凝固促進性タンパク質は、mAb0051と同じエピトープに結合できる場合がある。凝固促進性タンパク質は、mAb0061と同じエピトープに結合できる場合がある。凝固促進性タンパク質は、mAb0062と同じエピトープに結合できる場合がある。凝固促進性タンパク質は、mAb0082と同じエピトープに結合できる場合がある。
エピトープは、配列番号4のK133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145およびA146(配列番号2のK133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145およびA146に対応する)からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
エピトープは、配列番号5のV17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、I95およびL96(配列番号2のV36、Q37、C38、H39、Y40、R41、L42、Q43、D44、V45、K46、A47、L82、G83、G84、G85、L86、L87、G108、A109、R110、G111、P112、Q113、I114およびL115に対応する)からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
エピトープは、配列番号5のL36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100およびL101(配列番号2のL55、P56、E57、G58、C59、Q60、P61、L62、V63、S64、S65、A66、V92、T93、L94、Q95、E96、E97、D98、A99、G100、E101、Y102、G103、C104、M105、R110、G111、P112、Q113、I114、L115、H116、R117、V118、S119およびL120に対応する)からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
エピトープは、配列番号5のV17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100およびL101(配列番号2のV36、Q37、C38、H39、Y40、R41、L42、Q43、D44、V45、K46、A47、R110、G111、P112、Q113、I114、L115、H116、R117、V118、S119およびL120に対応する)からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
エピトープは、配列番号7のE5、T6、H7、K8、I9、G10、S11、L12、A13、E14、N15、A16、F17、S18、D19およびP20(配列番号2のE130、T131、H132、K133、I134、G135、S136、L137、A138、E139、N140、A141、F142、S143、D144およびP145に対応する)からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
エピトープは、配列番号7のK8、I9、G10、S11、L12、A13、N15、A16、F17、S18、D19、P20およびA21(配列番号2のK133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145およびA146に対応する)からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
「パラトープ」という用語の定義は、見方を逆にすることにより「エピトープ」の上記の定義から導き出される。したがって、「パラトープ」という用語は、Agが特異的に結合する、すなわちAgと物理的に接触するAb上の区域または領域を指す。
パラトープは、抗TLT-1軽(L)鎖(配列番号33)のH50、N52、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118およびY120、ならびに抗TLT-1重(H)鎖(配列番号32)の残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118およびT120からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含んでよい。
Ab、例えばFab断片とそのAgとの複合体の空間座標によって定義される、X線に由来する結晶構造の場面では、パラトープという用語は、本明細書で、別段指定されておらずまたは場面によって否定されない限り、血小板受容体中の重原子(すなわち非水素原子)から4Åの距離内に重原子を有することによって特徴付けられるAg残基として具体的に定義される。
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)の対のエピトープおよびパラトープは、日常的な方法によって同定することができる。例えば、エピトープの一般的な位置は、抗体がTLT-1の様々な断片または変異体と結合する能力を評価することによって決定することができる。実施例に記載のものなどの日常的な方法を使用して、抗体と接触するTLT-1内の特定のアミノ酸(エピトープ)およびTLT-1と接触する抗体中の特定のアミノ酸(パラトープ)を決定することもできる。例えば、抗体および標的分子を組み合わせ、Ab/Ag複合体を結晶化することができる。複合体の結晶構造を決定し、それを使用して抗体とその標的との相互作用の特定部位を同定することができる。
抗体またはその断片を含む融合タンパク質は、その相補性決定領域(CDR)の点から定義することもできる。「相補性決定領域」または「超可変領域」という用語は、本明細書では、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。相補性決定領域または「CDR」は一般的に、軽鎖可変ドメイン中のアミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)と重鎖可変ドメイン中の31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3);(Kabatら(1991年) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91-3242)ならびに/または「超可変ループ」由来の残基(軽鎖可変ドメイン中の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)と重鎖可変ドメイン中の26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3);ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol 1987年;196巻:901〜917頁)からなる。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら、上記に記載の方法によって行われる。本明細書で「Kabat位置」、「Kabat残基」や「Kabatによれば」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてのこの番号付けの体系を指す。Kabatの番号付けの体系を使用すると、ペプチドの現実の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはCDRの短縮またはそれへの挿入に対応して含有するアミノ酸が少ないこともあり、またはさらなるアミノ酸を含有することもある。例えば、重鎖可変ドメインは、CDR H2の残基52の後にアミノ酸の挿入(Kabatによれば残基52a、52bおよび52c)を、重鎖FRの残基82の後に挿入された残基(Kabatによれば例えば残基82a、82b、および82cなど)を含み得る。Kabatの残基番号付けは、「標準の」Kabat番号付け配列との、抗体の配列の相同性のある領域でのアラインメントにより、所与の抗体について決定することができる。
「フレームワーク領域」または「FR」残基という用語は、本明細書で定義されるCDR内にないVHまたはVLのアミノ酸残基を指す。
一実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の重鎖は、
・配列番号34のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号34のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号34のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質について、抗体の軽鎖またはその断片は、以下
・配列番号35のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号35のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号35のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の重鎖は、
・配列番号36のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号36のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号36のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の軽鎖は、
・配列番号37のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号37のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号37のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の重鎖は、
・配列番号42のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の軽鎖は、
・配列番号39のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の重鎖は、
・配列番号40のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の軽鎖は、
・配列番号41のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の重鎖は、
・配列番号32のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号32のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号32のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
別の実施形態では、本発明の凝固促進性タンパク質のための抗体またはその断片の軽鎖は、
・配列番号33のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号33のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号33のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
本発明の凝固促進性タンパク質について、モノクローナル抗体またはその断片は、グリコシル化変異体でもよい。抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体中に見出される1つまたは複数の炭水化物部分を欠失させること、1つまたは複数の炭水化物部分を抗体に付加すること、グリコシル化の組成(グリコシル化パターン)、グリコシル化の程度を変化させることを意味する。
抗体は、その定常領域中の保存された位置においてグリコシル化される(JefferisおよびLund、Chem.Immunol.1997年;65巻:111〜128頁;WrightおよびMorrison、Trends Biotechnol.1997年;15巻:26〜32頁)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能に影響を与えることができ(Boydら、Mol.Immunol.1996年;32巻:1311〜1318頁)、糖タンパク質の部分間の分子内相互作用は、糖タンパク質の高次構造および提示される3次元表面に影響を与ることができる。オリゴ糖はまた、特異的認識構造に基づいて、所与の糖タンパク質を特定の分子に標的化するようにも働くことができる。例えば、非ガラクトシル化(agalactosylated)IgGにおいて、オリゴ糖部分はCH2間空間から「飛び出し」、末端N-アセチルグルコサミン残基が、マンノース結合タンパク質に結合するために利用可能となることが報告されている(Malhotraら、Nature Med.1995年;1巻:237〜243頁)。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において産生されたCAMPATH-1H(ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgGl抗体)からの、グリコペプチダーゼによるオリゴ糖の除去は、補体媒介溶解(CMCL)における完全な低下を生じたが(Boydら、Mol.Immunol.1996年;32巻:1311〜1318頁)、ノイラミニダーゼを使用したシアル酸残基の選択的除去は、DMCLの喪失を生じなかった。抗体のグリコシル化が抗体依存性細胞傷害(ADCC)に影響を与えることもまた報告されている。特に、β(l,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)、2つに分岐するGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼの テトラサイクリン制御された発現を有するCHO細胞は、改善されたADCC活性を有することが報告されている(Umanaら、Nature Biotech.1999年;17巻:176〜180頁)。
抗体のグリコシル化は、典型的に、N-結合型またはO-結合型のいずれかである。N-結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列であり、ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。O-結合型グリコシル化とは、糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち1つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンもまた使用できる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、1つまたは複数の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される(N-結合型グリコシル化部位に関して)。この変更は、元の抗体の配列に対する1つまたは複数のセリン残基またはスレオニン残基の付加またはそれらによる置換によって行ってもよい(O-結合型グリコシル化部位に関して)。同様に、グリコシル化部位の除去は、抗体のネイティブのグリコシル化部位内のアミノ酸変更によって達成できる。
アミノ酸配列は通常、基礎となる核酸配列を変更することによって変更される。TLT-1抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で知られている種々の方法によって調製される。これらの方法には、天然の供給源(天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合)からの単離、またはTLT-1抗体の初期に調製された変異体または非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介性(または部位特異的)突然変異生成、PCR突然変異生成およびカセット突然変異生成による調製が含まれるが、これらに限定されない。
抗体のグリコシル化(グリコシル化パターンを含む)は、アミノ酸配列または基礎となるヌクレオチド配列を変更することなしに変更することもできる。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現のために使用される細胞型がネイティブ細胞であることはめったにないので、抗体のグリコシル化パターンにおける顕著なバリエーションが予測できる(例えば、Hseら、J.Biol.Chem.1997年;272巻:9062〜9070頁を参照のこと)。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間にグリコシル化に影響を与える因子には、増殖様式、培地処方、培養密度、酸素添加、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖産生に関与する特定の酵素を導入または過剰発現することを含む種々の方法が、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するために提唱されてきた(米国特許第5,047,335号; 米国特許第5,510,261号および米国特許第5,278,299号)。グリコシル化または特定の型のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼH(Endo H)を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去できる。さらに、組換え宿主細胞は遺伝子操作でき、例えば、特定の型の多糖のプロセシングにおいて欠損させることができる。これらおよび類似の技術は、当技術分野で周知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィー、NMR、質量分析、HPLC、GPC、単糖組成分析、連続的酵素消化、および電荷に基づいてオリゴ糖を分離するために高pHアニオン交換クロマトグラフィーを使用するHPAEC-PADを含めた炭水化物分析の従来の技術によって、容易に分析できる。分析目的のためにオリゴ糖を放出する方法も知られ、これには、酵素処理、主にO-結合型構造を放出するために厳しいアルカリ環境を使用する脱離、ならびにN-結合型オリゴ糖およびO-結合型オリゴ糖の両方を放出するために無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれるが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体またはその断片を含むTLT-1結合部分に加えて、本発明の凝固促進性タンパク質は、凝固因子構成成分もまた含み、この構成成分の機能は、活性化血小板の近傍で血液凝固を上方制御することである。
本発明の凝固促進性融合タンパク質またはコンジュゲートの凝固因子は、不活性形態であっても活性化形態であってもよい。凝固因子はセリンプロテアーゼでよく、この場合、凝固因子の不活性形態は酵素前駆体形態に対応し、活性化形態は触媒的に活性な形態に対応する。この凝固因子は、FVIIポリペプチド(FVIIまたはFVIIa)、FVIIIポリペプチド(すなわち、FVIIIまたはFVIIIa)、FIXポリペプチド(FIXまたはFIXa)、FXポリペプチド(FXまたはFXa)またはFXIポリペプチド(FXIまたはFXIa)でよい。本発明のFVII、FVIII、FIX、FXおよびFXIポリペプチドには、前記凝固因子の切断型変異体などの変異体および誘導体もまた含まれる。FVII、FIX、FXおよびFXIの変異体には、切断型des-GIa変異体、すなわち、前記凝固因子のリン脂質膜との相互作用を担うGlaドメインを欠く前記凝固因子の変異体が含まれる。
凝固因子がFVIIポリペプチドである場合、FVII構成成分は、組織因子に結合できるものでよく、好ましくは、FIXまたはFXを切断できる。凝固因子がFVIIIポリペプチドである場合、FVIII構成成分は、好ましくは、FIXaに結合でき、FXの切断を支持できる。凝固因子がFIXaポリペプチドである場合、これは好ましくは、FXを切断できる。凝固因子がFXaである場合、これは好ましくは、プロトロンビン(FII)を切断できる。凝固因子がFXIaポリペプチドである場合、これは好ましくは、FIXを切断できる。
1つの特定の実施形態では、凝固因子はFVポリペプチドである。第V因子は肝臓によって合成され、分泌された第V因子は、不活性な凝固促進物質である330kDaの単鎖ポリペプチドとして血漿中を循環する(Huangら(2008年)Haemophilia 14巻:1164〜9頁)。FVは2196アミノ酸から構成され、28アミノ酸のシグナルペプチドを含む。これは、6つのドメインA1(Aa30〜329)、A2(Aa348〜684)、B(Aa692〜1573)、A3(Aa1578〜1907)、C1(Aa1907〜2061)およびC2(Aa2066〜2221)から構成される。2つのタンパク質のAドメインおよびCドメインは、FVIIIの等価なドメインとおよそ40%相同であるが、Bドメインは保存されていない。FVIIIの場合と同様、FV活性は、部位特異的タンパク質分解を介して厳しく制御される。トロンビンおよびより低い程度で第Xa因子(FXa)は、位置Arg709-Ser710、Arg1018-Thr1019およびArg1545-Ser1546におけるタンパク質分解性切断を介したFV活性化を主に担っている。これらの切断は、Bドメインを放出し、A1ドメインおよびA2ドメインを含む105kDaの重鎖ならびにA3ドメイン、C1ドメインおよびC2ドメインを含む71〜74kDaの軽鎖から構成されるダイマー分子を作製する。これら2つの鎖は、残基Asp139およびAsp140におけるカルシウム、ならびに疎水性相互作用によって結び付けられる。重鎖は、FXaおよびプロトロンビンの両方に対する接触を提供するが、軽鎖中の2つのCドメインは、FVaとリン脂質表面との相互作用に必要である。したがって、第V因子は、トロンビナーゼ(thrombinase)複合体のFXaに対する補助因子として活性であり、活性化FXa酵素は、細胞表面膜上でプロトロンビンをトロンビンに変換するために、カルシウムおよびFVaを必要とする。軽鎖中のA3ドメインは、FXaおよびリン脂質相互作用の両方に関与している。合わせて考えると、2つのFVa鎖は、損傷部位において血小板プラグ(platelet plug)によって形成されたリン脂質表面にFXaを連結し、またFXaがプロトロンビンを結合して切断し、トロンビンを生成することを可能にする。第V因子は、活性化血小板に結合できる。FVは血漿中で可溶性構成成分として主に見出されるが、FVの一部は、血小板特異的第V因子欠乏症によって証明されるように、正常な止血に重要な血小板のアルファ顆粒中にも存在する(Janewayら(1996年)Blood 87巻:3571〜8頁)。
1つの野生型ヒト第V因子配列が、配列番号155中に提供される。「第V因子ポリペプチド」という用語は、本明細書中で、野生型第V因子分子、ならびにFV変異体、FV誘導体およびFVコンジュゲートを指す。そのような変異体、誘導体およびコンジュゲートは、野生型ヒト第V因子と比較して、実質的に同じまたは改善された生物学的活性を示し得る。
本発明の目的のために、第V因子は、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、γ-カルボキシル化ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。
第V因子ポリペプチドは、市販の凝固アッセイ、例えば、in vitro Hemoclot Factor V Reagentアッセイ(Aniara、Ohio、USA:カタログ番号ACK071K)を使用して試験できる。
1つの特定の実施形態では、凝固因子はFVIIaポリペプチドである。第VII因子(FVII)は、肝臓で主に産生される糖タンパク質である。その成熟タンパク質は、406アミノ酸残基から構成され、相同性によって規定される4つのドメインから構成される。N末端Glaドメイン、その後の2つの上皮成長因子(EGF)様ドメインおよびC末端セリンプロテアーゼドメインが存在する。FVIIは単鎖分子として血漿中を循環する。活性化FVII(FVIIa)への活性化の際に、この分子は、残基Arg152と残基Ile153との間で切断され、ジスルフィド結合で結び付けられた2本鎖のタンパク質を生じる。その軽鎖は、GlaドメインおよびEGF様ドメインを含むが、重鎖はプロテアーゼドメインである。FVIIaは、完全に生物学的に活性になるために、細胞表面補助因子組織因子への結合を必要とする。
「第VII(a)因子」という用語は、本明細書中で、未切断の酵素前駆体、第VII因子、ならびに切断されしたがって活性化されたプロテアーゼ第VIIa因子を包含する。「第VII(a)因子」は、1つの個体から別の個体で存在し得るおよび生じ得るFVII(a)の天然の対立遺伝子変異体を含む。1つの野生型ヒト第VIIa因子配列が、配列番号157ならびにProc Natl Acad Sci USA 1986年;83巻:2412〜2416頁中に提供されている。
「第VII(a)因子ポリペプチド」という用語は、本明細書中で、野生型第VIIa因子分子ならびにFVII(a)変異体、FVII(a)誘導体およびFVII(a)コンジュゲートを指す。そのような変異体、誘導体およびコンジュゲートは、野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは改善された生物学的活性を示し得る。
「FVII(a)変異体」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列番号157の配列を有する因子FVIIを指定する意図であり、この変異体では、親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている、および/あるいは親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。そのような付加は、親タンパク質のN末端またはC末端のいずれかあるいはそれら両方で生じ得る。この定義内の1つまたは複数の「類似体」は、その活性化形態でFVII活性をなおも有する。一実施形態では、変異体は、配列番号157の配列と少なくとも90%同一である。別の実施形態では、変異体は、配列番号157の配列と少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%同一である。本明細書中で使用する場合、特定の位置に対する任意の言及は、配列番号157中の対応する位置を指す。
組換え野生型ヒト第VII(a)因子と比較して実質的に同じまたは増加したタンパク質分解活性を有するFVII(a)変異体の非限定的な例には、WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/027147、WO 03/037932、WO 04/029090、WO 05/024006、WO 07/031559およびEP 05108713.8、US 7173000 B2;ならびにJP4451514 B2に開示されたものが含まれる。
「改善された生物学的活性」という用語は、i)組織因子の存在下および/または不在下で、組換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じまたは増加したタンパク質分解活性を示すFVII(a)ポリペプチド、あるいはii)組換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じまたは増加したTF親和性を有するFVII(a)ポリペプチド、あるいはiii)組換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じまたは増加した血漿中半減期を有するFVII(a)ポリペプチド、あるいはiv)活性化血小板に対する実質的に同じまたは増加した親和性を有するFVII(a)ポリペプチドを指す。FVIIaポリペプチドの生物学的活性は、当業者に知られている種々のアッセイ、例えば、実施例26および27に記載されるin vitro加水分解アッセイおよびin vitroタンパク質分解アッセイを使用して測定できる。
本発明の目的のために、第VII(a)因子は、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、γ-カルボキシル化ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。
以下のFVII配列中のγ-カルボキシル化残基は、「γ」によって示される。
配列番号157:野生型ヒト凝固第VII因子
ANAFLγγLRPGSLγRγCKγγQCSFγγARγIFKDAγRTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCKIPILEKNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCAVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP
別の特定の実施形態では、凝固因子はFVIIIポリペプチドである。第VIII因子(FVIII)は、肝細胞によって主に産生される大きい複雑な糖タンパク質である。FVIIIは、シグナルペプチドを含む2351アミノ酸から構成され、相同性によって規定されるいくつかの別個のドメインを含む。3つのAドメイン、1つの独自のBドメインおよび2つのCドメインが存在する。ドメインの順序は、NH2-A1-A2-B-A3-C1〜C2-COOHとして記載できる。FVIIIは、B-A3境界において分離した2つの鎖として血漿中を循環する。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって接続される。A1-A2-B鎖は重鎖(HC)と称され、A3-C1〜C2は軽鎖(LC)と称される。小さい酸性領域A1(a1領域)およびA2(a2領域)のC末端ならびにA3ドメイン(a3領域)のN末端は、トロンビンおよびフォンウィルブランド因子(vWFまたはVWF)、FVIIIの担体タンパク質を含めた他の凝固タンパク質とのin vivo相互作用において重要な役割を果たす。
内因性FVIII分子は、種々のサイズのBドメインを有する分子のプールとしてin vivoで循環し、最も短いものは位置740、すなわち、A2-a2のC末端にC末端を有する。異なる長さのBドメインを有するこれらのFVIII分子は全て、完全な凝固促進活性を有する。トロンビンによる活性化の際に、FVIIIは、位置372におけるA1-a1のC末端、位置740におけるA2-a2のC末端、および位置1689におけるa3とA3との間で切断され、後者の切断は、vWFに対する親和性の喪失と同時に、a3領域を放出する。活性化FVIII分子は、FVIIIaと称される。活性化は、活性化血小板および活性化第IX因子(FIXa)と同様、リン脂質表面とのFVIIIaの相互作用を可能にする:テナーゼ複合体が形成され、第X因子(FX)の効果的な活性化を可能にする。
「第VIII(a)因子」および「FVIII(a)」という用語には、FVIIIおよびFVIIIaの両方が含まれる。「第VIII因子」または「FVIII」は、本明細書中で、固有の凝固経路のメンバーであり、血液凝固に重要なヒト血漿糖タンパク質を指す。「ネイティブFVIII」は、配列番号159(アミノ酸1〜2332)に示される全長配列由来のヒトFVIII分子である。「FVIII(a)」は、1つの個体から別の個体で存在し得るおよび生じ得るFVIII(a)の天然の対立遺伝子変異体を含む。
FVIII分子/変異体は、Bドメイン切断型FVIII分子であり得、このとき、残りのドメインは、配列番号159のアミノ酸番号1〜740および1649〜2332に示される配列に密接に対応する。そのような変異体、ならびに全長配列由来のFVIIIにおいて、例えばvWF結合能を低下させるために、突然変異を導入してよい。アミノ酸改変、例えば、置換および欠失を、種々の他の構成成分、例えばLRP、種々の受容体、他の凝固因子、細胞表面とのFVIIIの結合能、グリコシル化部位の導入および/または破壊を改変するために、分子中に導入できる。FVIII活性を破壊しない他の突然変異もまた、本発明の目的のために使用され得るFVIII分子/変異体中に取り入れることができる。
FVIIIのBドメインは、配列番号159のアミノ酸741〜1648にわたる。Bドメインは、いくつかの異なる部位において切断されて、循環血漿FVIII分子における大きな不均一性を生じる。重度にグリコシル化されたBドメインの正確な機能は未知である。知られているのは、Bドメインが、凝固カスケードにおけるFVIII活性に不可欠であることである。したがって、組換えFVIIIは、Bドメイン欠失型/切断型変異体の形態で産生されることが多い。
内因性全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌前に、この前駆体は、重鎖および軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失型FVIIIは、2つの異なる戦略によって産生できる。Bドメインなしの重鎖、および軽鎖のいずれもが、2つの異なるポリペプチド鎖として個々に合成される(2本鎖戦略)か、またはBドメイン欠失型FVIIIが、全長FVIII前駆体と同じ方法で重鎖および軽鎖へと切断される単一の前駆体ポリペプチド鎖として合成される(単鎖戦略)。
単鎖戦略によって産生されたBドメイン欠失型FVIII前駆体ポリペプチドにおいて、重鎖部分および軽鎖部分は、リンカーによって分離されていることが多い。Bドメイン欠失型FVIII中に免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するために、リンカーの配列は、好ましくはFVIIIのBドメインに由来する。最低限、リンカーは、Bドメイン欠失型FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖および軽鎖へと切断するプロテアーゼの認識部位を含まなくてはならない。全長FVIIIのBドメインにおいて、アミノ酸1644〜1648がこの認識部位を構成する。Bドメイン欠失型FVIIIの活性化に際してリンカーの除去を導くトロンビン切断部位は、重鎖中に位置する。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列は、トロンビン活性化による残りのFVIII分子からのリンカー除去に影響を与える可能性が低い。Bドメインの欠失/切断は、FVIIIの産生に有利である。それにもかかわらず、Bドメインの一部を、生産性を低下させることなくリンカー中に含めることができる。生産性に対するBドメインの負の影響は、Bドメインの任意の特定のサイズおよび配列には起因しない。
本発明のためのFVIII分子は、FVIIIと機能的に類似または等価な様式で、凝固カスケード中で機能でき、活性化血小板上のFIXaとの相互作用を介してFXaの形成を誘導でき、血餅の形成を支持できる。FVIII活性は、当技術分野で周知の技術を使用してin vitroで評価できる。クロット分析、FX活性化アッセイ(しばしば発色アッセイと称される)、トロンビン生成アッセイおよび全血トロンボエラストグラフィーは、そのようなin vitro技術の例であり、そのうち2つが、実施例28および29中に記載されている。本発明によるFVIII分子は、少なくともネイティブヒトFVIIIのFVIII活性を有する。
「FVIII変異体」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列番号159の配列を有する因子FVIIIを指定する意図であり、この変異体では、親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている、および/あるいは親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。そのような付加は、親タンパク質のN末端またはC末端のいずれかあるいはそれら両方で生じ得る。この定義内の1つまたは複数の「類似体」は、その活性化形態でFVIII活性をなおも有する。一実施形態では、変異体は、配列番号159の配列と少なくとも90%同一である。別の実施形態では、変異体は、配列番号159の配列と少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%同一である。本明細書中で使用する場合、特定の位置に対する任意の言及は、配列番号159中の対応する位置を指す。
本発明の目的のために、FVIIIは、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、γ-カルボキシル化ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。
別の特定の実施形態では、凝固因子は第IX因子ポリペプチドである。その活性化形態FIXaにおいて、第IX因子(FIX)は、テナーゼ複合体の一部として、凝固の間の適切なトロンビン形成を支持するのに必要な第Xa因子のほとんどを生成することによって止血において重要な役割を果たす、トリプシン様セリンプロテアーゼである(総説は(HoffmanおよびMonroe、III 2001年)中)。
第IX因子(FIX)は、第VII因子、プロトロンビン、第X因子およびプロテインCと類似の構造を有する、ビタミンK依存的凝固因子である。循環する酵素前駆体形態は、1つのN末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメイン、2つのEGFドメインおよび1つのC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む4つの別個のドメインに分割される415のアミノ酸から構成される。FIXの活性化は、Arg145-Ala146およびArg180-Val181における限定的なタンパク質分解によって生じ、35aaの断片、いわゆる活性化ペプチドを放出する(SchmidtおよびBajaj 2003年)。活性化ペプチドは、重度にグリコシル化されており、2つのN-結合型グリカンおよび最大4つのO-結合型グリカンを含む。
「第IX因子」または「FIX」は、本明細書中で使用する場合、固有の凝固経路のメンバーであり、血液凝固に重要なヒト血漿第IX因子糖タンパク質を指す。「第IX(a)因子」は、1つの個体から別の個体で存在し得るおよび生じ得るFIX(a)の天然の対立遺伝子変異体を含む。第IX(a)因子は、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、γ-カルボキシル化ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。特に特定も示しもしない限り、第IX因子は、凝固におけるその通常の役割での、その任意の断片、類似体および誘導体を含む任意の機能的ヒト第IX因子タンパク質分子を意味する。
「野生型FIX」の一例は、配列番号161に示される全長ヒトFIX分子である。
「FIX類似体」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列番号161の配列を有する因子FIXを指定する意図であり、この類似体では、親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている、および/あるいは親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。そのような付加は、親タンパク質のN末端またはC末端のいずれかあるいはそれら両方で生じ得る。この定義内の1つまたは複数の「類似体」は、その活性化形態でFIX活性をなおも有する。一実施形態では、変異体は、配列番号161の配列と少なくとも90%同一である。さらなる実施形態では、変異体は、配列番号161の配列と少なくとも95%同一である。本明細書中で使用する場合、特定の位置に対する任意の言及は、配列番号161中の対応する位置を指す。組換え野生型ヒト第IX(a)因子と比較して、実質的に同じ活性、FVIIIバイパス活性または増加したタンパク質分解活性を有するFIX(a)変異体の非限定的な例には、Milanov P、Ivanciu L、Abriss D、Quade-Lyssy P、Miesbach W、Alesci S、Tonn T、Grez M、Seifried E、Schuttrumpf(2012年)J.Blood 119巻:602〜11頁およびUS 2011/0217284 A1に開示されたものが含まれる。特に特定しない限り、第IX因子のドメインは、以下のアミノ酸残基を含む:残基Tyr1から残基Lys43までの領域であるGlaドメイン;残基Gln44から残基Leu84までの領域であるEGF1;残基Asp85から残基Arg145までの領域であるEGF2;残基Ala146から残基Arg180までの領域である活性化ペプチド;および残基Val181からThr414までの領域であるプロテアーゼドメイン。軽鎖とは、Glaドメイン、EGF1およびEGF2を包含する領域を指し、重鎖とは、プロテアーゼドメインを指す。
第IX因子は、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、γ-カルボキシル化ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。
「Hyphen BioMed Chromogenic Factor IXキット(Aniara)」として知られる市販のアッセイキットを、FIXポリペプチドの活性レベルを評価するために使用できる。このアッセイにおいて、第XIa因子は、第IX因子を活性化して第IXa因子にし、これが活性化第VIII因子:C、リン脂質およびCa2+と一緒になって、第X因子を第Xa因子へと活性化する。生成された第Xa因子の量を、第Xa因子特異的発色基質SXa-11から放出されたpNAの量によって、405nmで測定した。
以下のFVII配列中のγ-カルボキシル化残基は、「γ」によって示される。
配列番号161:野生型ヒト凝固第IX因子
YNSGKLγγFVQGNLγRγCMγγKCSFγγARγVFγNTγRTTγFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
別の特定の実施形態では、凝固因子はFXポリペプチドである。凝固第X因子(FX)は、第VII因子、プロトロンビン、第IX因子(FIX)およびプロテインCと類似の構造を有する、ビタミンK依存的凝固因子である。これは、分泌のためにタンパク質を標的化する疎水性シグナル配列(Aa1〜31)を含む、40残基のプレプロ配列を伴って合成される。プロペプチドは、第X因子の軽鎖にγ-カルボキシル化を指向させるために重要である。循環するヒトFX酵素前駆体は、1つのN末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメイン、2つのEGFドメインおよび1つのC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む4つの別個のドメインに分割される445アミノ酸から構成される。FXの成熟2本鎖形態は、ジスルフィド結合(Cys172-Cys342)によって結び付けられた軽鎖(Aa41〜179)および重鎖(Aa183〜488)から構成される。その軽鎖は、負に荷電したリン脂質膜へのFXのCa2+依存的結合に重要な11個のGla残基を含む。野生型ヒト凝固因子Xは、その活性化ペプチド中に、2つのN-グリコシル化部位(Asn221およびAsn231)および2つのO-グリコシル化部位(Thr199およびThr211)を有する。β-ヒドロキシル化が、第1のEGFドメイン中のAsp103で生じ、β-ヒドロキシアスパラギン酸(Hya)を生じる。FXの活性化は、Arg234-Ile235における限定的タンパク質分解によって生じ、52アミノ酸の活性化ペプチド(Aa183〜234)を放出する。外因性の経路において、これは、内皮下細胞の膜上の組織因子(TF)の血漿への露出およびFVIIaの引き続く活性化の際に生じる。内因性の経路を介した活性化は、第IXa因子、第VIIIa因子、カルシウムおよび酸性リン脂質表面の相互作用と共に生じる。プロトロンビンは、第Xa因子の最も重要な基質であるが、その活性化は、FXaの補助因子第Va因子、カルシウムおよび酸性リン脂質表面を必要とする。FX欠乏症は、一般的な集団において1:1,000,000の発生率の稀な常染色体劣性出血障害である(Dewerchinら(2000年)Thromb Haemost 83巻:185〜190頁)。これは、多様な出血傾向を生じるが、重度のFX欠乏症を有する患者は、稀な凝固異常を有する患者のうちで最も深刻に影響を受ける傾向がある。ヘテロ接合性FX欠乏症の有病率は約1:500であるが、通常は臨床的に無症候性である。
「野生型FX」の一例は、配列番号163に示される全長ヒトFX分子である。
「第X因子ポリペプチド」は、本明細書中で、配列番号163の断片、類似体および誘導体を含む、トロンビンを活性化できる任意の機能的第X因子タンパク質分子を指す。
「FX類似体」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列番号163の配列を有する因子FXを指定する意図であり、この類似体では、親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている、および/あるいは親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。そのような付加は、親タンパク質のN末端またはC末端のいずれかあるいはそれら両方で生じ得る。この定義内の1つまたは複数の「類似体」は、その活性化形態でFX活性をなおも有する。一実施形態では、変異体は、配列番号163の配列と少なくとも90%同一である。さらなる実施形態では、変異体は、配列番号163の配列と少なくとも95%同一である。本明細書中で使用する場合、特定の位置に対する任意の言及は、配列番号163中の対応する位置を指す。
FXは、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、γ-カルボキシル化ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。
別の特定の実施形態では、凝固因子は第XI因子ポリペプチドである。第XI因子(FXI)は、第IX因子の活性化を介して止血に寄与する血液凝固プロテアーゼ、第XIa因子(FXIa)の酵素前駆体である。この因子は、肝臓によって産生される(Emsleyら(2010年)Blood 115巻:2569〜77頁)。このタンパク質は、同一の607アミノ酸のサブユニットの160kDaのジスルフィド結合ダイマーであり、各サブユニットは、アップル(apple)ドメインと呼ばれる4つの90アミノ酸または91アミノ酸のリピート(N末端から:A1:Aa20〜103、A2:Aa110〜193、A3:Aa200〜283、A4:Aa291〜374)およびC末端トリプシン様触媒ドメインを含む。このタンパク質は、シグナルペプチドAa1〜18を伴って発現される。この構造は、充分特徴付けられたビタミンK依存的凝固プロテアーゼの構造とは異なる。FXIは、高分子量キニノーゲン(HK)との複合体として血液中を循環する。プレカリクレイン(PK)、プロテアーゼ-カリクレインの酵素前駆体は、同様にHKとの複合体で循環する同じドメイン構造を有するFXIのモノマー相同体である。酵素前駆体因子は、第XIIa因子(FXIIa)、トロンビンによって第XIa因子へと活性化されるし、自己触媒的でもある。切断活性化は、Arg369-Ile370切断部位を含む活性化ループで生じる。FXI欠乏症は、比較的穏やかな出血を引き起こすので、FXIは、初期フィブリン生成において役割を有すると推測される。FXIaは、凝固を強固にするためにFIX活性化を介してトロンビン生成を維持するフィードバックループの一部であると推測される。中咽頭および尿路を含む、強い線維素溶解活性を有する特定の組織は、FXI欠乏症患者における一般的な出血部位であるので、これらの組織は、FXIa活性に重要であると考えられる。先天性FXI欠乏症は、軽度から中程度の出血障害と関連する。100より多い単一アミノ酸(ミスセンス)置換を含む、FXI欠乏症に関連する180より多い他のFXI遺伝子突然変異が報告されている(http://www.factorxi.org、http://www.isth.org)。重度の欠乏症は、ユダヤ系人の人々において高い有病率である(Seligsohnら(2007年)Thromb Haemost.98巻:84〜89頁)。保因者率は、アシュケナージ系ユダヤ人においておよそ5%であり、重度の(ホモ接合性)欠乏症は、450人に1人で見出される。例として、Glu117Stopにおける重度の突然変異は、切断型タンパク質を生じ、ホモ接合体は、血漿FXI抗原を完全に欠いている。
第XIa因子は、Arg145-Ala146およびArg180-Val181を選択的に切断することによって第IX因子を活性化する。
「FXI類似体」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列番号165の配列を有する第XI因子を指定する意図であり、この類似体では、親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている、および/あるいは親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および/あるいは1つまたは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。そのような付加は、親タンパク質のN末端またはC末端のいずれかあるいはそれら両方で生じ得る。この定義内の1つまたは複数の「類似体」は、その活性化形態でFXI活性をなおも有する。一実施形態では、変異体は、配列番号165の配列と少なくとも90%同一である。さらなる実施形態では、変異体は、配列番号165の配列と少なくとも95%同一である。本明細書中で使用する場合、特定の位置に対する任意の言及は、配列番号165中の対応する位置を指す。
FXIは、周知の産生法および精製法を使用して、血漿から誘導されるまたは組換え産生できる。グリコシル化の程度および位置、ならびに他の翻訳後修飾は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変動し得る。
「同一性」という用語は、当技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定される、2つ以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、「同一性」は、2つ以上のアミノ酸残基のストリング間の整合の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)によって位置指定されるギャップアラインメント(もしあれば)を有する、2つ以上の配列のうち小さいものの間にある同一の整合のパーセントを測定するものである。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算できる。そのような方法には、Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、Oxford University Press、New York、1988年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993年;Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、Academic Press、1987年;Sequence Analysis Primer、Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M.Stockton Press、New York、1991年;ならびにCarilloら、SIAM J.Applied Math.48巻、1073頁(1988年)に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大の整合が得られるように設計される。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムの方法には、GAP(Devereuxら、Nucl.Acid.Res.12巻、387頁(1984年);Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison、Wis.)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Altschulら、J.Mol.Biol.215巻、403〜410頁(1990年))を含むGCGプログラムパッケージが含まれる。BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information (NCBI)および他の供給源(BLAST Manual、Altschulら、NCB/NLM/NIH Bethesda、Md.20894;Altschulら、上記)から公的に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用できる。
例えば、コンピュータアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison、Wis.)を使用して、パーセント配列同一性が決定される2つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸の最適な整合のためにアラインされる(アルゴリズムによって決定される「整合スパン」)。ギャップ開始ペナルティー(平均項の3倍として算出される;「平均項」は、使用されている比較行列の項の平均である;「項」は、特定の比較行列により完璧な各アミノ酸整合に割り当てられるスコアまたは数である)およびギャップ伸長ペナルティー(通常はギャップ開始ペナルティーの{分数(1/10)}倍である)、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62などの比較行列が、このアルゴリズムと併せて使用される。標準的な比較行列(PAM 250比較行列についてはDayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure、5巻、補遺3(1978年);BLOSUM 62比較行列についてはHenikoffら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 89巻、10915〜10919頁(1992年)を参照のこと)も、このアルゴリズムによって使用される。
ペプチド配列比較に好ましいパラメーターには、以下が含まれる:アルゴリズム:Needlemanら、J.Mol.Biol.48巻、443〜453頁(1970年);比較行列:Henikoffら、PNAS USA 89巻、10915〜10919頁(1992年)のBLOSUM 62;ギャップペナルティー:12、ギャップ長ペナルティー:4、類似度の閾値:0。
上記のパラメーターを用いたGAPプログラムが有用である。上述のパラメーターは、GAPアルゴリズムを使用した(末端のギャップにペナルティーが付かない)ペプチド比較のデフォルトパラメーターである。
したがって、本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つの凝固因子構成成分と、(ii)受容体および/またはその断片に結合することができる抗体またはその断片とを含み、この受容体は、活性化血小板の表面上にのみ(単語の普遍的でない意味で)存在する。1つの好ましい実施形態では、前記受容体はTLT-1である。本発明の凝固促進性タンパク質は、好ましくは、その構成部分が互いに独立して機能できるように工学的に作製される。例えば、本発明の前記凝固因子構成成分は、血液凝固を上方制御できる。同様に、本発明の前記「抗体」構成成分は、前記凝固因子構成成分の存在によって妨げられずに、TLT-1などの受容体に結合できることが好ましい。凝固因子構成成分のカルボキシ末端は、構築物の抗体構成成分のアミノ末端に共有結合でき、その逆もまた同様である。構築物のこの前記抗体構成成分は、任意の他の骨髄細胞上で発現する誘発性受容体(triggering receptors expressed on myeloid cells)(TREM)に対して、結合しないまたはほとんど親和性を示さないことが好ましい。本発明の構築物は、前記凝固因子構成要素と前記抗体構成要素との間にリンカーを含んでも含まなくてもよい。前記任意選択のリンカーは、Table 3(表3)中に記載されるリンカーのいずれか1つであってもよく、または構築物の凝固因子構成要素部分および抗体構成要素部分の両方が機能的であるようにそれら両方に結合する任意の他のリンカーであってもよい。一実施形態では、凝固因子構成成分および抗TLT-1構成成分は、融合タンパク質として発現される。一実施形態では、凝固因子構成成分と抗TLT-1構成成分とは、化学的にコンジュゲート化される。
部分(ii)がmAbである凝固促進性タンパク質は、2つの凝固因子ポリペプチド(部分(i))を含んでよい。凝固因子は、mAbのHCに融合させることができる。凝固因子は、mAbのLCに融合させることができる。凝固因子は、抗体またはその断片に融合させることができ、これは次に、mAbのHCまたはmAbのLCに融合される。
したがって、本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つのFVポリペプチドと、(ii)TLT-1に結合できる抗体またはその断片とを含んでよい。
本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つのFVIIポリペプチドと、(ii)TLT-1に結合できる抗体またはその断片とを含んでよい。
本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つのFVIIIポリペプチドと、(ii)TLT-1に結合できる抗体またはその断片とを含んでよい。
本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つのFIXポリペプチドと、(ii)TLT-1に結合できる抗体またはその断片とを含んでよい。
本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つのFXポリペプチドと、(ii)TLT-1に結合できる抗体またはその断片とを含んでよい。
本発明の凝固促進性タンパク質は、(i)少なくとも1つのFXIポリペプチドと、(ii)TLT-1に結合できる抗体またはその断片とを含んでよい。
凝固促進性タンパク質は、リンカーをさらに含んでよい。凝固促進性タンパク質が融合タンパク質として製造される場合に利用できるリンカーのアミノ酸配列の非限定的な例は、Table 3(表3)中に示される。したがって、前記リンカーはL1でもよい。リンカーはL2でもよい。リンカーはL3でもよい。リンカーはL4でもよい。リンカーはL5でもよい。リンカーはL6でもよい。リンカーはL7でもよい。リンカーはL8でもよい。リンカーはL9でもよい。リンカーはL10でもよい。
上記で述べたように、TLT-1の細胞外部分は、免疫グロブリン様ドメインおよびストークからなる。本発明の凝固促進性タンパク質は、これらのどちらかと結合することができる。凝固促進性タンパク質の部分(ii)が免疫グロブリン様ドメインと結合できる際には、長いリンカーが、前記融合タンパク質の部分(i)を活性化血小板の表面上の機能的に適切な位置および方向に適合させることができ、それによってその機能が促進される。
TLT-1のストークと結合することができる凝固促進性タンパク質は、血小板の膜に隣接する。ストークと結合することができる凝固促進性タンパク質は、リンカーを含んでよいが、リンカーを含むことは、融合タンパク質の凝固因子の機能に必ずしも影響を及ぼさない。
上記のように、本発明の凝固促進性タンパク質は、活性化を受けているまたは完全に活性化された血小板上に存在するTLT-1などの受容体に結合できる。「結合親和性」という用語は、その標的に結合するまたは結合しない、凝固促進性タンパク質または凝固促進性タンパク質の抗体構成成分の特性を指す意図である。結合親和性は、抗体構成成分およびその標的に関する結合定数(KD)を決定することによって定量できる。同様に、抗体構成成分のその標的への結合の特異性は、抗体および別の非標的分子についての結合定数と比較した、抗体のその標的に対する比較結合定数(KD)の点から定義できる。
典型的には、標的についての抗体のKDは、関連のない物質または環境中の付随物質などの他の非標的分子についてのKDの2分の1、好ましくは5分の1、より好ましくは10分の1未満となる。より好ましくは、KDは50分の1未満、さらにより好ましくは100分の1未満、なおより好ましくは200分の1未満となる。
この結合定数の値は、周知の方法によって直接決定することができ、例えば、Caceciら(Byte 9巻:340〜362頁、1984年)に記載のものなどの方法によって複雑な混合物についても計算することができる。例えば、WongおよびLohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90巻、5428〜5432頁、1993年)に開示されているような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用してKDを確定することができる。標的に対する抗体の結合能を評価する他の標準的なアッセイは、例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIAおよびフローサイトメトリー分析を含めて当技術分野で知られている。抗体の結合動態(会合速度定数および解離速度定数)および結合親和性は、表面プラスモン共鳴(SPR)分析などの、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって評価することもできる。
抗体の標的への結合を、その標的の別の公知のリガンドまたは別の抗体による標的の結合と比較する競合的結合アッセイを行うことができる。
本発明の抗体またはその断片についてのKD値は、少なくとも1×10-15M、例えば少なくとも1×10-14M、例えば少なくとも1×10-13M、例えば少なくとも1×10-12M、例えば少なくとも1×10-11M、例えば少なくとも1×10-10M、例えばおよそ3×10-9M、例えば少なくとも1×10-9M、または少なくとも1×10-8Mでもよい。本発明の抗体は、その標的に対して1×10-7M以下、1×10-8M以下または1×10-9M以下のKd(またはKi)を有し得る。
抗体またはその断片に対する好ましいKD値は、1×10-15M〜1×10-14M、例えば1×10-14M〜1×10-13M、1×10-13M〜1×10-12M、例えば1×10-12M〜1×10-11M、例えば1×10-11M〜1×10-10M、例えば1×10-10M〜1×10-9M、例えばおよそ3×10-9M、例えば1×10-9M〜2×10-8Mでもよい。
その標的と特異的に結合する抗体またはその断片は、上記で論じたKDなどの高い親和性でその標的と結合でき、低い親和性で他の非標的分子と結合することがある。例えば、この抗体は1×10-6M以上、より好ましくは1×10-5M以上、より好ましくは1×10-4M以上、より好ましくは1×10-3M以上、さらにより好ましくは1×10-2M以上のKDで非標的分子と結合することがある。本発明の凝固促進性タンパク質は、好ましくは、TLT-1以外のTREMなどの別の非標的分子との結合についてのその親和性の少なくとも2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍もしくは10,000倍またはそれ以上の親和性でその標的と結合することができる。
本発明の凝固促進性タンパク質の機能的効果は、様々なin vitroおよびin vivoの実験を用いて評価することができる。融合タンパク質全体として、ならびにその構成成分(i)凝固因子部分および(ii)抗体部分の機能を評価するin vitro実験を設計することができる。in vivoでは、融合タンパク質は、ヒト血小板を輸血した血友病マウスにおける尾出血モデルで試験することができる。さらにin vivoでは、融合タンパク質は、ヒトTLT-1遺伝子を挿入した(TLT-1について「ヒト化した」)血友病マウスにおける尾出血モデルで試験することができる。
上記のように、凝固促進性タンパク質は、融合タンパク質または化学的コンジュゲートの形態で提供できる。前者の場合、本発明は、本発明の凝固促進性タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される任意の凝固促進性タンパク質をコードできる。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、単離または精製された形態で提供することができる。
選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な制御配列の調節下に置かれた際にin vivoで(DNAの場合)転写され、(mRNAの場合)翻訳されてポリペプチドとなる核酸分子である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端にある開始コドンおよび3'(カルボキシ)末端にある翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的では、そのような核酸配列には、ウイルス、原核生物または真核生物mRNA由来のcDNA、ウイルスまたは原核生物DNAまたはRNA由来のゲノム配列、および合成DNA配列も含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の3'に位置し得る。
例としてSambrookら(1989年、Molecular Cloning-a laboratory manual;Cold Spring Harbor Press)に記載されている、当技術分野で周知の方法に従って、本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
本発明の核酸分子は、挿入配列と作動的に連結した調節配列を含み、それによってin vivoで本発明の抗体の発現を可能にする発現カセットの形態で提供することができる。次に、これらの発現カセットは、典型的には、ベクター(例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター)内に提供される。そのような発現カセットは、宿主対象に直接投与できる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主対象に投与できる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製および/または投与される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を運搬することができ、本発明のポリペプチドの発現を可能にする任意のベクターであり得る。
したがって、本発明は、そのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。そのような発現ベクターは、分子生物学の分野で日常的に構築され、例えばプラスミドDNA、ならびに本発明のペプチドの発現を可能にするために必要となることがあり、正しい方向に位置付けられる適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルなどの使用を伴い得る。他の適切なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関連するさらなる例としてはSambrookらを参照されたい。
本発明は、本発明による融合タンパク質を発現するように改変されている単離細胞もまた含む。そのような細胞には、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの一過性もしくは好ましくは安定した高等真核細胞系統;酵母などの下等真核細胞;または細菌細胞などの原核細胞が含まれる。本発明の構築物をコードするベクターまたは発現カセットの挿入によって改変することができる細胞の特定の例には、哺乳動物HEK293T、CHO、HeLaおよびCOS細胞が含まれる。好ましくは、選択された細胞系統は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現も可能にするものである。
日常的な方法を使用して本発明のそのような細胞系統を培養して、本発明による融合タンパク質または構築物を産生することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターをex vivoで対象由来の細胞に投与し、次いでその細胞を対象の身体に戻すことができる。
あるいは、凝固促進性タンパク質は、抗体(例えばmAb)またはその断片と凝固因子との化学的コンジュゲート化によって得ることができる。この場合、2つのタンパク質間のリンカーは、DNAによってコードされるアミノ酸中には存在しない1つまたは複数の化学的部分を含んでよい。
一実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、構造
を有するバイラジカル(biradical)を含み、この構造中、*は、このバイラジカルの接続位置を示す。
「バイラジカル」という用語は、互いに独立して作用する2つのフリーラジカル中心を有する偶数電子の化合物を指す。
別の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、ポリマー:共有化学結合によって典型的には接続される反復構造単位から構成される高分子を含む。そのようなポリマーは、親水性であり得る。
親水性または「水溶性」という用語は、水中での検出可能なある程度の溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出および/または定量する方法は、当技術分野で周知である。
本発明による例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖、(ポリ)エーテル、(ポリ)アミン、(ポリ)カルボン酸などが含まれる。ペプチドは、混合配列を有することができ、(ポリ)リジンのように、単一アミノ酸から構成できる。例示的な多糖は(ポリ)シアル酸である。例示的な(ポリ)エーテルは(ポリ)エチレングリコールである。(ポリ)エチレンイミンは例示的なポリアミンであり、(ポリ)アクリル酸は、代表的な(ポリ)カルボン酸である。
本発明による親水性ポリマーは、好ましくは天然には存在しないものである。一例において、天然に存在しない修飾基は、ポリマー性の修飾基であり、この基では、少なくとも1つのポリマー部分が天然には存在しないものである。別の例において、天然に存在しない修飾基は、修飾された炭水化物である。修飾基による官能基化の位置は、「修飾糖」がポリペプチドに酵素的に付加されるのを妨げないように選択される。「修飾糖」とはまた、修飾基によって官能基化され、グリコシルトランスフェラーゼなどの天然または修飾酵素の基質である、任意のグリコシル模倣部分を指す。
他の多数のポリマーも、本発明に適切である。非ペプチド性で水溶性のポリマー骨格は、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例には、以下が含まれるがそれらに限定されない:他のポリ(アルキレングリコール)、例えば、ポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、エチレングリコールとプロピレングリコールなどとのコポリマー、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィンアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ([α]-ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、例えば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第5,629,384号に記載されるものなど、ならびにそれらのコポリマー、ターポリマーおよび混合物。
ポリマー性リンカーは、凝固促進性タンパク質の特性、例えば、身体中でのバイオアベイラビリティ、生物学的活性または半減期を変更できる。
ポリマー性リンカーは、好ましくは直鎖である。
各個々のポリマー鎖の分子量は変動し得るが、典型的には、約1,000Da(1kDa)〜約40,000Da(40kDa)の範囲内、例えば、約1,000Da〜約12,000Da、例えば約2,000Da〜約11,000Da、例えば約2,000Da〜約3,000Da;約3,000Da〜約4,000Da;約4,000〜約5,000Da;約5,000〜約6,000Da;約6,000〜約7,000Da;約7,000〜約8,000Da;約8,000〜約9,000Da;約9,000〜約10,000Da;または約10,000〜約11,000Daである。これらのサイズは、正確な測定ではなく概算を示すことを理解すべきである。好ましい実施形態によれば、本発明による分子は、親水性ポリマーの不均一な集団とコンジュゲート化される。
特定の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。
「PEG」という用語は、本明細書中で、構造
を含むバイラジカルを指し、この構造中、n'は1より大きい整数である。
PEGは、エチレンオキシドの重合によって調製され、広い分子量範囲にわたって市販されている。本発明によって使用されるPEGは、好ましくは直鎖である。
さらに「PEG」は、カップリング剤、カップリング部分もしくは活性化部分ありまたはなしの(例えば、カルボン酸/活性エステル、ケト、アルコキシアミン、チオール、トリフレート、トレシレート(tresylate)、アジリジン、オキシラン、アルキン、アジドまたはマレイミド部分ありの)、ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を指す場合がある。
1つの特定の実施形態では、本発明によって使用するPEGは単分散である。別の特定の実施形態では、本発明によって使用するPEGは多分散である。
多分散PEGは、種々の分子量を有するPEG分子から構成される。サイズ分布は、その重量平均分子量(Mw)およびその数平均分子量(Mn)によって統計的に特徴付けることができ、それらの比は、多分散度(Mw/Mn)と呼ばれる(例えば、「Polymer Synthesis and Characterization」、J.A.Nairn、University of Utah、2003年を参照のこと)。MwおよびMnは、質量分析によって測定できる。
多分散度は1以上の数であり得、Gel Permeation Chromatographicデータから概算できる。多分散度が1の場合、その生成物は単分散であり、したがって、単一の分子量を有する化合物から構成される。多分散度が1より大きい場合、そのポリマーは多分散であり、多分散度は、異なる分子量を有するポリマーの分散がどのくらい広いかを述べている。多分散度は典型的に、PEGの分子量と共に増加する。特定の実施形態では、本発明によって使用されるPEGの多分散度は、i)1.06未満、ii)1.05未満、iii)1.04未満、iv)1.03未満またはv)1.02と1.03との間である。
重合プロセスに使用されるイニシエーターに依存して、異なる形態のPEGが利用可能である。
PEG置換基のコンジュゲート化のための多数の方法は、Advanced Drug Delivery Reviews、2002年、54巻、459〜476頁、Nature Reviews Drug Discovery、2003年、2巻、214〜221頁 DOI:10.1038/nrd l033、Adv Polym Sci、2006年、192巻、95〜134頁、DOI 10.1007/12_022、Springer-Verlag、Berlin Heidelberg、2005年中およびそこで引用された参考文献中に記載されている。あるいは、親水性ポリマー置換基のコンジュゲート化は、酵素的方法の使用によって生じ得る。そのような方法は、例えば、WO2003/031464に記載されるグリコシルトランスフェラーゼの使用またはWO2006134148に記載されるトランスグルタミナーゼの使用である。
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合をもたらすために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性化形態で、すなわち反応性官能基を伴って提供される。適切な活性化ポリマー分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation、St.Louis、MO、USA、Rapp Polymere GmbH、Tubingen、GermanyまたはPolyMASC Pharmaceuticals plc、UKから市販されている。あるいは、ポリマー分子は、例えばWO 90/13540に開示されている、当技術分野で知られている従来の方法によって活性化できる。活性化PEGポリマーの具体的な例は、米国特許第5,932,462号および米国特許第5,643,575号に開示されている。さらに、以下の公開公報が、有用なポリマー分子および/またはPEG化化学を開示している:WO2003/031464、WO2004/099231。
活性化ポリマー分子とモノクローナル抗体、その断片または凝固因子とのコンジュゲート化は、例えば以下の参考文献(これらは、ポリマー分子の活性化に適した方法を記載している)に記載されるような、任意の従来の方法の使用によって実施できる:R.F.Taylor、(1991年)、「Protein immobilisation.Fundamental and applications」、Marcel Dekker、N.Y.;S.S.Wong、(1992年)、「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」、CRC Press、Boca Raton;G.T.Hermansonら(1993年)、「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press、N.Y.、'Bioconjugate Techniques、第2版、Greg T.Hermanson、2008年、Amsterdam、Elsevier)。当業者は、使用される活性化方法および/またはコンジュゲート化化学が、ポリペプチドの結合基(attachment group)(その例は、上にさらに与えられる)ならびにポリマーの官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテートである)に依存することを知るであろう。PEG化は、ポリペプチド上の全ての利用可能な結合基(すなわち、ポリペプチドの表面上に露出されるそのような結合基)へのコンジュゲート化に向けられ得るか、または1つまたは複数の特定の結合基(例えば、N末端アミン基)に向けられ得る。さらに、コンジュゲート化は、1ステップまたはステップワイズな方法で達成できる。
別の実施形態では、リンカーとして使用される化学的部分は、ヒドロキシエチルデンプンである。「ヒドロキシエチルデンプン」(HES/HAES)という用語は、本明細書中で使用する場合、非イオン性デンプン誘導体を指す。異なる型のヒドロキシエチルデンプンは、典型的にはそれらの平均分子量によって記載され、典型的には約130kDa〜200kDaである。
別の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、ポリシアル酸を含む。
別の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、少なくとも1つのタンパク質からグリカン:タンパク質に結合している多糖またはオリゴ糖に結合している。
別の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、少なくとも1つのタンパク質からO-結合型グリカンに結合している。
別の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、少なくとも1つのタンパク質からN-結合型グリカンに結合している。
N-グリカンおよびO-グリカンは共に、これらのタンパク質を産生する細胞によって、mAbおよび凝固因子などのタンパク質に結合している。新生タンパク質がリボソームから小胞体に移動される際に、細胞性のN-グリコシル化機構は、アミノ酸鎖中のN-グリコシル化シグナル(N-X-S/Tモチーフ)を認識してグリコシル化する(Kielyら、1976年;Glabeら、1980年)。同様に、O-グリカンは、アミノ酸鎖中の特定のO-グリコシル化部位に結合しているが、O-グリコシル化を誘発するモチーフは、N-グリコシル化シグナルよりもかなり不均一であり、アミノ酸配列中のO-グリコシル化部位を予測する我々の能力はなお不十分である(Juleniusら、2004年)。ポリペプチドを種々のポリマー性側基へコンジュゲート化する方法は、WO0331464中に記載されている。
別の実施形態では、リンカー中で使用される化学的部分は、そのリンカーを少なくとも1つのタンパク質に結合させるために使用される、バイラジカルの選択された構造:
を有する化学的部分を含む。
一実施形態では、このリンカーは、
のバイラジカル構造を含み、この構造中、*は、このバイラジカルの接続位置を示す。
別の実施形態では、このリンカーは、構造
を含み、この構造中、*は、このバイラジカルの接続位置を示す。
一般式
の化合物は、例えば2ステップの手順で調製でき、「抗TLT-1 mAb(断片)」は、TLT-1に対する全長サイズのmAbまたは断片もしくは知識によりそこから誘導される類似体であり得、例えば、点突然変異がない、1つまたは複数の点突然変異を有するFAB断片またはsc-FABであるがこれらに限定されず、リンカーは、例えば、PEG、ポリシアル酸またはヒドロキシエチルデンプンなどであるが、これらに限定されない水溶性ポリマーであり得、タンパク質は、抗TLT-1 mAb(断片)に結合したときに1つまたは複数の改善された特性を有すると考えられる任意のタンパク質である。
第1のステップの間、2つの異なる反応性基RS1およびRS2を有するリンカーは、抗TLT-1 mAb(断片)に結合することができる。この反応は、RS1だけが抗TLT-1 mAb(断片)の1つまたは数個の位置で反応するように、低い部位選択性でまたは選択的な方法で実施できる。非排他的な例として、RS1はアルデヒドであり得、当業者に知られている還元的アミノ化によって、抗TLT-1 mAb(断片)のN末端とだけ還元的アミノ化によって反応する。別の非排他的な例では、RS1は、抗TLT-1 mAb(断片)上の遊離チオールと反応できるマレイミド基であり得る。
第2のステップの間、反応性基RS2は、低い部位選択性でまたは部位選択性で、FVIIa分子と反応させてよい。非排他的な例として、RS2が、例えばST3Gal-IIIであるがこれに限定されない適切な酵素の存在下で、シアル酸で排他的に終わることのないN-結合型グリカンと反応できるシアル酸誘導体である場合に、FVIIaにおける部位選択的反応を得ることができる。
リンカーから2つのタンパク質、すなわち抗TLT-1 mAb(断片)およびタンパク質への結合の順番は切り替えることができ、それにより、RS1-リンカー-RS2分子を最初にタンパク質分子に結合させ、次いで抗TLT-1 mAb(断片)に結合させる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターや細胞などの本発明の分子を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤される、本発明の1つまたは複数の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
したがって、本発明の一目的は、0.25mg/ml〜250mg/mlの濃度で存在するそのような抗体を含む医薬製剤を提供することであり、前記製剤は2.0〜10.0のpHを有する。製剤は、緩衝系、保存剤、等張化剤、キレート化剤、安定化剤および表面活性物質をさらに含んでよい。医薬組成物中での保存剤、等張剤、キレート化剤、安定化剤および表面活性物質の使用は当業者に周知である。Remington : The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照することができる。
一実施形態では、医薬製剤は水性製剤である。そのような製剤は、典型的には溶液または懸濁液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも50重量%の水を含む製剤と定義される。同様に、「水性溶液」という用語は、少なくとも50重量%の水を含む溶液と定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50重量%の水を含む懸濁液と定義される。
別の実施形態では、医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、医者または患者が使用前にそれに溶媒および/または希釈液を添加する。
さらなる態様では、医薬製剤は、そのような抗体の水性溶液、および緩衝液を含み、抗体は1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤は約2.0〜約10.0のpHを有する。
本明細書において、「治療」という用語は、それを必要とする任意のヒトまたは他の動物対象の医学的療法を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が前記ヒトまたは他の動物対象の健康に有益であることを示す暫定または確定診断を行った医師により診察を受けていることが予想される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状に従って、個体により様々となり得る。本発明の抗体の予防的(preventativeまたはprophylactic)投与もまた企図され、予防は、疾患または障害の1つまたは複数の症状の徴候悪化を遅延させるまたは妨げることであると定義される。したがって、前記治療は、予防的、待機的、対症的および/または治癒的であり得る。
本発明に関して、予防的、待機的、対症的および/または治癒的治療は、本発明の別々の態様を表し得る。
出血傾向が増大する凝固障害は、正常な凝固カスケードの任意の凝固促進性構成成分の任意の質的もしくは量的欠乏、またはフィブリン溶解の任意の上方制御によって引き起こされる可能性がある。そのような凝固障害は、先天性および/または後天性および/または医原性である可能性があり、当業者によって特定される。
先天性凝固低下障害の非限定的な例は、血友病A、血友病B、第VII因子欠乏、第X因子欠乏、第XI因子欠乏、フォンウィルブランド病、およびグランツマン血小板無力症やベルナールスーリエ症候群などの血小板減少症である。
後天性凝固障害の非限定的な例は、ビタミンK欠乏によって引き起こされるセリンプロテアーゼ欠乏である;そのようなビタミンK欠乏は、ワルファリンなどのビタミンKアンタゴニストの投与によって引き起こされることがある。後天性凝固障害は、広範な外傷の後に起こることもある。他に「観血性悪循環(bloody vicious cycle)」として知られているこの場合、それは、血液希釈(希釈性血小板減少および凝固因子の希釈)、低体温、凝固因子の消費および代謝の乱れ(アシドーシス)によって特徴付けられる。輸液療法およびフィブリン溶解の増大がこの状況を悪化させることがある。前記出血は、身体のどの部分からでもよい。
「インヒビター」(すなわち第VIII因子に対する同種抗体)保有血友病Aおよび「インヒビター」(すなわち第IX因子に対する同種抗体)保有血友病Bは、部分的に先天性であり、部分的に後天性である凝固障害の非限定的な例である。
医原性凝固障害の非限定的な例は、血栓塞栓性疾患を治療するために処方されることがあるヘパリン、アスピリン、ワルファリンおよび他の血小板凝集インヒビターなどの抗凝固物質の過量の投薬である。医原性凝固障害の第2の非限定的な例は、輸血によって誘導され得るものなど、過剰かつ/または不適当な輸液療法によって誘導されるものである。
本発明の一実施形態では、出血は血友病AまたはBと関連する。別の実施形態では、出血は後天性インヒビター保有血友病AまたはBと関連する。別の実施形態では、出血はフォンウィルブランド病と関連する。別の実施形態では、出血は重度の組織損傷と関連する。別の実施形態では、出血は重度の外傷と関連する。別の実施形態では、出血は手術と関連する。別の実施形態では、出血は出血性胃炎および/または腸炎と関連する。別の実施形態では、出血は胎盤剥離などにおける大量の子宮出血と関連する。別の実施形態では、出血は、頭蓋内、耳内または眼内など、機械的止血の可能性が限定される臓器中で起こる。別の実施形態では、出血は抗凝固療法と関連する。
さらなる実施形態では、出血は血小板減少と関連し得る。血小板減少を有する個体では、本発明の構築物を血小板と同時に投与することができる。
以下は、本発明の実施形態の非限定的なリストである。
実施形態1: (iii)TLT-1に結合することができる(ii)抗体またはその断片と共有結合している、(i)少なくとも1つの凝固因子、および/またはその断片もしくは変異体を含む、凝固促進性タンパク質。
実施形態2:(iii)がTLT-1またはその断片もしくは変異体である、実施形態1に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態3:(iii)がTLT-1(16-162)である、実施形態2に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態4:(iii)がTLT-1(20-125)である、実施形態2に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態5:(iii)がTLT-1(126-162)である、実施形態2に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態6:(i)がセリンプロテアーゼまたはその誘導体である、実施形態1から2のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態7:(i)が第VII因子ポリペプチドである、実施形態3に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態8:(i)が第IX因子ポリペプチドである、実施形態3に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態9:(i)が第X因子ポリペプチドである、実施形態3に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態10:(i)が第V因子ポリペプチドである、実施形態1から2のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態11:(i)が第VIII因子ポリペプチドである、実施形態1から2のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態12:(i)が第XI因子ポリペプチドである、実施形態1から2のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態13:(ii)がモノクローナル抗体またはその断片である、実施形態1から6のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態14:(ii)がFab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、ScFv断片、dAb断片または単離相補性決定領域(CDR)である、実施形態10に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態15:(ii)がFab断片である、実施形態11に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態16:(ii)のエピトープが、配列番号5のV17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、I95およびL96からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態17:(ii)が、mAb0023と同じエピトープと結合することができる抗体またはその断片である、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態18:(ii)の重鎖が、
・配列番号34のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号34のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号34のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態16および17のいずれかに記載の融合タンパク質。
実施形態19:(ii)の軽鎖が、
・配列番号35のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号35のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号35のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態16から18のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態20:(ii)の重鎖が、
・配列番号34のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号34のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号34のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号35のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号35のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号35のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態16から17のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態21:(ii)の重鎖が、
・配列番号34のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列;
・配列番号34のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列;および
・配列番号34のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号35のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列;および
・配列番号35のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列;および
・配列番号35のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列
を含む、実施形態20に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態22:(ii)のエピトープが、配列番号5のL36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S110およびL111からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態23:(ii)が、mAb0051と同じエピトープと結合することができる抗体またはその断片である、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態24:(ii)の重鎖が、
・配列番号36のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号36のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号36のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態22から23のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態25:(ii)の軽鎖が、
・配列番号37のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号37のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号37のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態22から24のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態26:(ii)の重鎖が、
・配列番号36のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号36のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号36のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号37のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号37のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号37のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態22から23のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態27:(ii)の重鎖が、
・配列番号36のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列;および
・配列番号36のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列;および
・配列番号36のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号37のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列;および
・配列番号37のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列;および
・配列番号37のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態26に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態28:(ii)のエピトープが、配列番号5のV17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100およびL101からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態29:(ii)が、mAb 0062と同じエピトープと結合することができる抗体またはその断片である、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態30:(ii)の重鎖が、
・配列番号42のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態28から29のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態31:(ii)の軽鎖が、
・配列番号39のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態28から30のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態32:(ii)の重鎖が、
・配列番号42のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号39のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態28から31のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態33:(ii)の重鎖が、
・配列番号42のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列;および
・配列番号42のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列;および
・配列番号42のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号39のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列;および
・配列番号39のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列;および
・配列番号39のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態32に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態34:(ii)のエピトープが、配列番号7のE5、T6、H7、K8、I9、G10、S11、L12、A13、E14、N15、A16、F17、S18、D19、P20およびA21からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態35:前記残基がK8、I9、G10、S11、L12、A13、N15、A16、F17、S18、D19、P20およびA21である、実施形態34に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態36:(ii)のエピトープが、配列番号6のK118、I119、G120、S121、L122、A123、E124、N125、A126、F127からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態37:(ii)が、mAb0061またはmAb0082と同じエピトープと結合することができる抗体またはその断片である、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態38:(ii)の重鎖が、
・配列番号40のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態34から37のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態39:(ii)の軽鎖が、
・配列番号41のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態34から38のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態40:(ii)の重鎖が、
・配列番号40のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号41のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態34から39のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態41:(ii)の重鎖が、
・配列番号40のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列;および
・配列番号40のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列;および
・配列番号40のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号41のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列;および
・配列番号41のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列;および
・配列番号41のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態40に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態42:(ii)の重鎖が、
・配列番号50のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号50のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYAPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号50のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号41のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態34から37のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態43:(ii)の重鎖が、
・配列番号50のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列;および
・配列番号50のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYAPSLKD)のCDR2配列;および
・配列番号50のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号41のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列;および
・配列番号41のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列;および
・配列番号41のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態42に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態44:(ii)のパラトープが、抗TLT-1軽(L)鎖(配列番号33)のH50、N52、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118およびY120、ならびに抗TLT-1重(H)鎖(配列番号32)の残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118およびT120からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態45:(ii)のエピトープが、配列番号4のK133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145およびA146からなる群から選択される1つまたは複数の残基を含む、実施形態13から15および44のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態46:(ii)が、mAb0012と同じエピトープと結合することができる抗体またはその断片である、実施形態13から15のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態47:(ii)の重鎖が、
・配列番号32のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号32のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号32のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態44から46のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態48:(ii)の軽鎖が、
・配列番号33のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号33のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号33のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態44から47のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態49:(ii)の重鎖が、
・配列番号32のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号32のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号32のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号33のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号33のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号33のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態44から48のいずれかに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態50:(ii)の重鎖が、
・配列番号32のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列;および
・配列番号32のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列;および
・配列番号32のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号33のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列;および
・配列番号33のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列;および
・配列番号33のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態49に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態51:(ii)がヒトモノクローナル抗体またはその断片である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態52:(ii)がキメラ抗体またはその断片である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態53:(ii)がヒト化抗体またはその断片である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態54:(ii)のアイソタイプがIgGである、実施形態51から53のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態55:アイソタイプがIgG1、IgG2またはIgG4である、実施形態54に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態56:アイソタイプがIgG4である、実施形態55に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態57:(i)と(ii)の間にリンカーをさらに含む、実施形態1から56のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態58:融合タンパク質である、実施形態1から57のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態59:(i)と(ii)とのコンジュゲートである、実施形態1から57のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態60:(i)と(ii)とが、ポリエチレングリコール(PEG)を含むリンカーによって共有結合している、実施形態59に記載のコンジュゲート。
実施形態61:(i)と(ii)とが、少なくとも1つの前記タンパク質のグリカンを介して共有結合でコンジュゲート化されている、実施形態59から60のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
実施形態62:実施形態59から61のいずれか1つに記載のコンジュゲートを少なくとも1つ含む組成物を調製する方法であって、(i)抗TLT-1抗体またはその断片を、リンカーの1つの反応性基(RS1)と化学的にコンジュゲート化するステップ、および(ii)凝固因子を、前記リンカーの別の反応性基(RS2)と反応させるステップを含む、方法。
実施形態63:(i)がモノクローナル抗体である、実施形態62に記載の方法。
実施形態64:(i)がモノクローナル抗体の断片である、実施形態62に記載の方法。
実施形態65:(i)がFab断片である、実施形態64に記載の方法。
実施形態66:前記Fab断片が定常領域中に1つのCys突然変異を含む、実施形態65に記載の方法。
実施形態67:(i)がsc-Fab断片である、実施形態62に記載の方法。
実施形態68:(ii)がFVポリペプチドである、実施形態62から67のいずれか1つに記載の方法。
実施形態69:(ii)がFVIIaポリペプチドである、実施形態62から67のいずれか1つに記載の方法。
実施形態70:(ii)がFVIIIポリペプチドである、実施形態62から67のいずれか1つに記載の方法。
実施形態71:(ii)がFIXポリペプチドである、実施形態62から67のいずれか1つに記載の方法。
実施形態72:(ii)がFXポリペプチドである、実施形態62から67のいずれか1つに記載の方法。
実施形態73:(ii)がFXIポリペプチドである、実施形態62から67のいずれか1つに記載の方法。
実施形態74:前記リンカーが水溶性である、実施形態62から73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態75:前記リンカーがポリマーである、実施形態62から74のいずれか1つに記載の方法。
実施形態76:(ii)がポリエチレングリコール(PEG)である、実施形態74から75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態77:(ii)がポリシアル酸である、実施形態74から75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態78:(ii)がヒドロキシエチルデンプンである、実施形態74から75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態79:RS1がアルデヒドである、実施形態62から78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態80:RS1がマレイミド基である、実施形態62から78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態81:RS1が、酵素触媒反応において反応できる活性化炭水化物誘導体である、実施形態62から78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態82:RS1が、酵素触媒反応において反応できる活性化シアル酸誘導体である、実施形態81に記載の方法。
実施形態83:RS1がO2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸である、実施形態82に記載の方法。
実施形態84:RS2がアルデヒドである、実施形態62から83のいずれか1つに記載の方法。
実施形態85:RS2がマレイミド基である、実施形態62から83のいずれか1つに記載の方法。
実施形態86:RS2が、酵素触媒反応において反応できる活性化炭水化物誘導体である、実施形態62から83のいずれか1つに記載の方法。
実施形態87:RS2が、シアル酸誘導体である、実施形態62から83のいずれか1つに記載の方法。
実施形態88:(ii)が10nM未満など100nM未満のKDを有する、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態89:活性化血小板の表面に凝固因子またはその機能性断片を標的化する方法であって、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質と活性化血小板を接触させるステップを含む方法。
実施形態90:医薬として使用するための、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態91:凝固促進物質として使用するための、実施形態87に記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態92:実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質を含む医薬製剤。
実施形態93:凝固障害の治療で使用するための、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質または実施形態92に記載の医薬製剤。
実施形態94:凝固障害の治療用医薬の製造のための、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質の使用。
実施形態95:前記凝固障害が、インヒビター保有または非保有血友病A、およびインヒビター保有または非保有血友病Bである、実施形態93または94のいずれかに記載の使用。
実施形態96:実施形態1から61のいずれか1つに記載の有効量の凝固促進性タンパク質または実施形態93の製剤を、それを必要する個体に投与するステップを含む、凝固障害を治療する方法。
実施形態97:前記凝固障害が、インヒビター保有または非保有血友病A、およびインヒビター保有または非保有血友病Bである、実施形態95に記載の方法。
実施形態98:実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態99:実施形態1から61のいずれか1つに記載の融合タンパク質および/または実施形態97に記載のポリヌクレオチドを含む単離細胞。
実施形態100:(ii)が、TLT-1へのフィブリノーゲン結合と競合せずにTLT-1に結合する、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
実施形態101:(ii)が血小板凝集を阻害しない、実施形態1から61のいずれか1つに記載の凝固促進性タンパク質。
さらに限定するものと解釈すべきでない下記の実施例によって本発明をさらに説明する。本出願を通じて引用した全図面および全参照文献の内容は、参照により本明細書にはっきりと組み込まれる。
実施例において、抗TLT-1抗体およびその断片、例えばFab断片を使用して、凝固因子を活性化血小板に標的化した。実施例中に示されるデータの解釈を容易にするために、Table 3a(表4)が、以下にさらに記載される抗TLT-1抗体およびその断片のいくつかに関する情報をまとめている。Table 3A(表4)において、親抗体、その変異体、断片、融合物およびコンジュゲートが、親mAb、およびタンパク質の型を参照して列挙されている。名称は、タンパク質の名称を指し、親は、抗TLT-1 mAb、Fabまたは融合物/コンジュゲートが誘導される抗体を指し、型は、タンパク質がmAb、Fab、凝固因子とのDNA融合物(融合物)、または凝固因子との化学的コンジュゲート(コンジュゲート)であるかを規定する。
(実施例1)
hTLT-1 ECD-His抗原のクローニングおよび発現。
C末端His-6タグと一緒になった、ヒトTLT-1(hTLT-1)(図1)の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、コザック配列と一緒にHindIII認識部位を含有する順向プライマーならびに終止コドンおよびEcoRI認識部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した(図2)。HindIIIおよびEcoRIで消化したPCR断片を、pTTを基礎とする発現ベクターのHindIIIおよびEcoRI部位に挿入した。pTTベクターは、本質的に、Durocher, Y.ら、(2002年) Nucleic Acid Res、30巻:E9頁に記載されている。得られた発現プラスミドをpTT-hTLT-1 ECD-Hisと称した。hTLT-1 ECD-Hisのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号3および4に示される。hTLT-1 ECD-Hisを一過性に発現させるために、pTT-hTLT-1 ECD-HisをHEK293-6E浮遊細胞にトランスフェクトした。1% P/S(GIBCOカタログ番号15140-122)、0.1%プルロニック(GIBCO、カタログ番号24040-032)および25ug/mL Geneticin(GIBCO、カタログ番号10131-019)を補充したFreestyle HEK293培地(GIBCO、カタログ番号12338-018)中でHEK293-6E細胞を増殖させ、293fectin(Invitrogen、カタログ番号12347-019)を使用して1mill/mLの細胞密度で細胞をトランスフェクトした。1mgのpTT-hTLT-1 ECD-His DNAを30mLのOptimem中に希釈し(希釈液A)、1mlの293fectinを30mLのOptimem中に希釈する(GIBCO、カタログ番号51985-026、希釈液B)ことによって、各リットルのHEK293-6E細胞についてトランスフェクションを行った。希釈液AおよびBを混合し、室温で30分間インキュベートした。この後、そのトランスフェクションミックスをHEK293-6E細胞に添加し、軌道回転(125rpm)する加湿インキュベーター中で細胞を37℃でインキュベートした。トランスフェクション後5〜7日目に、遠心分離によって細胞を除去し、得られたhTLT-1 ECD-Hisを含有する上清を精製前に滅菌濾過した。
(実施例2)
hTLT1 ECD-Hisタンパク質の精製および特徴付け。
1)コバルトを添加した樹脂TALON(Clontech、カタログ番号635506)を使用するHis-アフィニティークロマトグラフィー、および2)微粒子樹脂Source 15Q(GE Healthcare、カタログ番号17-0947)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスとしてhTLT1 ECD-Hisタンパク質の精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。第1の精製ステップに使用した緩衝系は、20mM Hepes、pH7.0、150 mM NaClから構成される平衡化緩衝液、20mM Hepes、pH 7.0、0.5 M NaClから構成される洗浄緩衝液、および20mM Hepes、pH 7.0、150mMイミダゾールから構成される溶出緩衝液であった。細胞上清を、何も調製せずに、予め平衡化したTALONカラムに直接かけた。20カラム容の平衡化緩衝液で、20カラム容の洗浄緩衝液で、最後に20カラム容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。およそ5カラム容の溶出緩衝液中にタンパク質を均一濃度で溶出させた。SDS-PAGE/Coomassie NuPage 4〜12 % Bis-Trisゲル(Invitrogen、カタログ番号NP0321BOX)およびMicro-flexシステム(Bruker Daltonics)のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)の設定を使用して、溶出したタンパク質の分子量を分析した。ここで、ほとんど等しい量のおよそ16.7および33.4kDaの2つの異なるタンパク質の質量が観察された。観察された質量は、hTLT1 ECD-Hisのモノマーおよびダイマー形態に対応していた。タンパク質を還元すると、SDS-PAGE/Coomassie分析から判断されるように33.4kDaのタンパク質が完全に消失し、一方16.7kDaのタンパク質が増強された。したがって、hTLT-1 ECD-Hisタンパク質は、連結したC-Cダイマーを含有していた。ダイマーからモノマーを分離するために、第2の精製ステップを使用した。この精製ステップに使用した緩衝系は、50mM Hepes、pH 8.0から構成される平衡化緩衝液および50mM Hepes、pH 8.0、1M NaClから構成される溶出緩衝液であった。1M NaOHを使用して試料をpH8.0に調整し、次いでおよそ10mS/cmの伝導率に希釈した。タンパク質を、予め平衡化したSource 15Qカラムにかけ、5カラム容の平衡化緩衝液で洗浄し、20カラム容を超える0〜100%溶出緩衝液を使用して溶出した。UV280のモニタリングに基づいて、2つのピークがほとんどベースラインの分離で明らかとなった。SDS-PAGE/Coomassie、MALDI-TOF MSおよびDynapro機器(Wyatt Technology)を使用した動的光散乱(DLS)分析を使用してその2つのピークにわたる分画を分析すると、最初に溶出するピーク中にモノマーhTLT-1 ECD-Hisタンパク質の存在が、2番目に溶出するピーク中にCys-Cysダイマーの存在が示された。モノマーhTLT-1 ECD-Hisタンパク質のみを含有するプールを調製した。Agilent LC 1100/1200システムのサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)法の設定に基づき、BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mmカラム(Phenomenex、カタログ番号00H-2146-K0)ならびに200mMリン酸Na pH 6.9、300mM NaClおよび10%イソプロパノールから構成されるランニング緩衝液を使用して、最終的なタンパク質の完全性を分析した。保持時間およそ9.9分、流速1ml/分で、単一の対称的なピークとしてタンパク質が溶出した。
モノクローナル抗TLT1抗体の産生についての免疫感作試験用に一団のhTLT-1 ECD-Hisを調製した。したがって、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette 10kDa MWCO(Pierce、カタログ番号66453)を使用して、等張PBS緩衝液にタンパク質を透析した。最終的なタンパク質濃度を測定するために、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を、吸光係数0.55と一緒に使用した。
(実施例3)
モノクローナルTLT-1抗体の調製。
50μgのhTLT-1 ECD-Hisを注射することによって、RBFマウスを免疫感作した。経皮でのFCAに続いてFIA中のhTLT-1 ECD-His20μgを2回注射した。25μgのhTLT-1 ECD-Hisを用いて高応答マウスを静脈内で追加免疫し、3日後に脾臓を採取した。脾臓細胞をミエローマFox細胞系統と融合させた。特異的ELISA ならびにhTLT-1をトランスフェクトしたまたは偽トランスフェクトしたCHO細胞をそれぞれ陽性および陰性標的細胞として利用するFACSアッセイにおいて、hTLT-1特異的抗体産生について上清をスクリーニングした。ヒト、カニクイザル、イヌ、ウサギまたはマウス由来の休止対二重アゴニスト活性化血小板に対して二次スクリーニングを行った。
(実施例4)
ハイブリドーマからの抗TLT-1 mAb LCおよびHC cDNAのクローニングおよび配列決定。
0012Hyb、0023Hyb、0051Hybおよび0052Hybと称する4つの異なる抗TLT-1 mAbを発現しているハイブリドーマから全RNAを抽出した。RNeasy miniキット(Qiagen、カタログ番号74106)を使用してハイブリドーマ細胞からRNAを抽出し、得られたRNAのアリコートを、5'RACEについて製造業者の使用説明書に従ってSMART RACE cDNA増幅キット(Clontech、カタログ番号634914)を使用し、5'RACE CDSプライマーAをSMART II A RNAオリゴヌクレオチドと一緒に使用する第1鎖cDNA合成の鋳型として使用した。この後、4つの抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれの軽鎖(LC)および重鎖(HC)コード領域cDNAを、UPM順向プライマーミックスをマウスLC、カッパ特異的逆向プライマー(逆向プライマー番号339、348、または610)と一緒にまたはマウスIgG1、IgG2a、IgG2bもしくはIgG3配列を認識する逆向プライマー(逆向プライマー番号341、347、613、614、615、または616、プライマー配列はTable 4(表5)および配列番号60〜145に示されている)と一緒に使用して、PCRで増幅した。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号:F-531L)を使用してPCR反応を行った。配列決定用Zero blunt Topo PCRクローニングキット(Invitrogen、カタログ番号K287540)を使用して、得られたPCR断片をクローニングし、配列を決定した。0012LCおよびHCの可変ドメインの配列は図3に示されている。
(実施例5)
pTT-0012HC、pTT-0023HC、pTT-0051HCおよびpTT-0052HC発現構築物の開発。
4つの異なる抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれから単離されたHC可変ドメイン(VH)をコードするDNA配列を、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマーおよびNheI制限酵素部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した。以下のプライマー番号の対:490(順向)+491(逆向)、546(順向)+547(逆向)、627(順向)+628(逆向)、および617(順向)+618(逆向、プライマー配列はTable 4(表5)および配列番号60〜145に示されている)それぞれを用いて、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用して0012VH、0023VH、0051VHおよび0052VH DNA配列をPCRで増幅し、ヒトIgG4 HCの定常領域をコードする配列(すなわちCH1-ヒンジ-CH2-CH3)を含有する、pTT-hIgG4と称するpTTを基礎とするベクターのHinDIIIおよびNheI制限酵素部位にそれを挿入した。pTTベクターは、本質的に、Durocher, Y.ら、(2002年) Nucleic Acid Res、30巻:E9頁に記載されている(図22)。得られたベクターを、pTT-0012HC(図5)、pTT-0023HC、pTT-0051HC、およびpTT-0052HCと称した。発現ベクターによってコードされる抗TLT-1 HCアミノ酸配列が示されている(配列番号:0012HC:32、0023HC:34、0051HC:36、0052HC:38)。
(実施例6)
pTT-0012LC、pTT-0023LC、pTT-0051LCおよびpTT-0052LC発現構築物の開発。
4つの異なる抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれから単離されたLC可変ドメイン(VL)をコードするDNA配列を、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマーおよびBsiWI制限酵素部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した。以下のプライマー番号の対:493(順向)+495(逆向)、548(順向)+549(逆向)、492(順向)+494(逆向)、および619(順向)+620(逆向プライマー配列はTable 4(表5)および配列番号60〜145に示されている)それぞれを用いて、0012VL、0023VL、0051VLおよび0052VL DNA配列をPCRで増幅し、ヒトLC、カッパの定常領域をコードする配列を含有する、pTT-hLC、カッパと称するpTTを基礎とするベクターのHinDIIIおよびBsiWI制限酵素部位にそれを挿入した。得られたベクターを、pTT-0012LC、pTT-0023LC、pTT-0051LC、およびpTT-0052LCと称した。発現ベクターによってコードされる抗TLT-1 LC アミノ酸配列が(配列番号:0012LC:33、0023LC:35、0051LC:37、0052LC:39)に示されている。
(実施例7)
pTT-0012HC.T60N、pTT-0012HC.T60A、pTT-0012LC.C36AおよびpTT-0052HC.C91Yの開発。
0012VHアミノ酸配列は、潜在的なN結合グリコシル化部位(T60、kabatの番号付け)を含有し、0012VLおよび0052VHアミノ酸配列は不対のCys(それぞれC36およびC91、kabatの番号付け)をそれぞれ含有する。製造業者の使用説明書に従って部位特異的突然変異生成(Quickchange II、Stratagene、カタログ番号20523-5)を使用して、0012HC.T60Nまたは0012HC.T60Aまたは0012LC.C36Aまたは0052HC.C91Yをコードする発現ベクターを開発した。a)pTT-0012HC.T60Nについては鋳型であるpTT-0012HC DNAおよびプライマー番号682(順向)+683(逆向)、b)pTT-0012HC.T60Aについては鋳型であるpTT-0012HC DNAおよびプライマー番号688(順向)+689(逆向)、c)pTT-0012LC.C36Aについては鋳型であるpTT-0012LC DNAおよびプライマー番号598(順向)+599(逆向)、d)pTT-0052HC.C91Yについては鋳型であるpTT-0052HC DNAおよび以下のプライマー番号684(順向)+685(逆向、プライマー配列はTable 4(表5)および配列番号60〜145に示されている)を使用して、部位特異的突然変異生成反応を行った。DNA配列を検証するために、得られた発現ベクターの配列を決定した。pTT-0012HC.T60N、pTT-0012HC.T60AおよびpTT-0012LC.C36A発現ベクターによってコードされる抗TLT-1 HCおよびLCアミノ酸配列は、(配列番号:0012HC.T60N(0061HCとも呼ばれる):40、0012HC.T60A(0082HCとも呼ばれる):43、0012LC.C36A(0061LCとも呼ばれる):41)に示されている。0012LC.C36Aのアミノ酸配列はまた、配列番号153中にN末端シグナルペプチド配列なしで示される。
(実施例8)
pTT-0012LC-HPC4、pTT-0012LC.C36A-HPC4、pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4およびpTT-0052LC-HPC4発現構築物の開発。
4つの異なる抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれから単離されたVLをコードするDNA配列を、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマーおよびBsiWI制限酵素部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した。以下のプライマー番号:493(順向)+495(逆向)、493(順向)+495(逆向)、548(順向)+549(逆向)、492(順向)+494(逆向)、および619(順向)+620(逆向、プライマー配列はTable 4(表5)および配列番号60〜145に示されている)それぞれを用いて、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用して0012VL、0012VL.C36A、0023VL、0051VLおよび0052VL DNA配列をPCRで増幅した。順向プライマー番号486および逆向プライマー番号485を用いて、ヒトCL、カッパをコードする配列をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー番号486はBsiWI 制限酵素部位を含有し、逆向プライマー485はHPC4タグ、その後に終止コドンをコードし、3'に隣接するEcoRI部位を含有する。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用してPCR反応を行った。HindIII+BsiWIで消化した0012VL PCR断片を、BsiWI+EcoRIで消化したヒトCL、カッパ-HPC4 PCR断片と混合し、pTTを基礎とする発現ベクターのHinDIII+EcoRI部位にそれを挿入してpTT-0012LC-HPC4が得られた(図4)。残っている3つの抗TLT-1 LC配列のLC-HPC4バージョンをコードする、対応する発現ベクターを開発するために、pTT-0012LC-HPC4中の0012VL配列をHinDIII+BsiWIで切り出し、HinDIII+BsiWIで消化した0023VL、0051VL、0052VLおよび0012VL.C36A PCR断片と置き換えた。得られた4つの発現ベクターを、pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4、pTT-0052LC-HPC4およびpTT-0012LC.C36A.HPC4と称した (図4B)。pTT-0012LC.C36A-HPC4、pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4およびpTT-0052LC-HPC4がコードするアミノ酸配列は、配列番号:0012LC.C36A-HPC4(0061LC-HPC4とも呼ぶ):167、0023LC-HPC4:179、0051LC-HPC4:177、0052LC-HPC4(0062LC-HPC4とも呼ぶ):174に示される。
(実施例9)
pTT-0012VH.T60N-CH1-YGPPC、pTT-0023VH-CH1-YGPPC、pTT-0051VH-CH1-YGPPCおよびpTT-0052VH.C91Y-CH1-YGPPC発現構築物の開発。
0012VH.T60N-CH1-YGPPC、0023VH-CH1-YGPPC、0051VH-CH1-YGPPCおよび0052VH.C91Y-CH1-YGPPCの配列(YGPPCは、部分的ヒトIgG4ヒンジアミノ酸配列である)を、それぞれ順向および逆向のプライマー対:572(順向)+698(逆向)、576(順向)+698(逆向)、627(順向)+698(逆向)および617(順向)+698(逆向)を使用して、それぞれpTT-0012HC.T60N、pTT-0023HC、pTT-0051HCおよびpTT-0052HC.C91YからPCRで増幅した。順向プライマーはHinDIII制限酵素部位を含み、逆向プライマー698は、終止コドンおよびクローニング目的のためのEcoRI部位を含む。得られたPCR断片をHinDIII+EcoRIで消化し、pTTを基礎とするベクターのHinDIII+EcoRI部位に挿入した。得られた発現ベクターを、pTT-0012VH.T60N-CH1-YGPPC(図4A)、pTT-0023VH-CH1-YGPPC、pTT-0051VH-CH1-YGPPCおよびpTT-0052VH.C91Y-CH1-YGPPCと称した。pTT-0012VH.T60N-CH1-YGPPC(図4A)、pTT-0023VH-CH1-YGPPC、pTT-0051VH-CH1-YGPPCおよびpTT-0052VH.C91Y-CH1-YGPPCがコードするアミノ酸配列は、配列番号:0012VH.T60N-CH1-YGPPC(0061VH-CH1-YGPPCとも呼ぶ):171、0023VH-CH1-YGPPC:178、0051VH-CH1-YGPPC:176、0052VH.C91Y-CH1-YGPPC(0062VH-CH1-YGPPCとも呼ぶ):175に示される。
(実施例10)
pTT-0012VH-CH1、pTT-0012VH-CH1-HPC4、pTT-0023VH-CH1、pTT-0023VH-CH1-HPC4、pTT-0051VH-CH1、pTT-0051VH-CH1-HPC4、pTT-0052VH-CH1およびpTT-0052VH-CH1-HPC4発現構築物の開発。
0012Hyb、0023Hyb、0051Hyb、0052Hybから単離された0012VH、0023VH、0051VH、および0052VH配列を、プライマー番号:490(順向)+491(逆向)、546(順向)+547(逆向)、627(順向)+628(逆向)、617(順向)+618(逆向、プライマー配列はTable 4(表5)および配列番号60〜145に示されている)それぞれを用いて、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用してPCRで増幅した。クローニングする目的で全ての順向プライマー(490、546、627、および617)がHinDIII部位を含有し、全ての逆向プライマー(491、547、628、および618)がNheI部位を含有していた。プライマー番号489(順向)+488(逆向)、またはプライマー番号489(順向)+487(逆向)を用いて、ヒトIgG4 CH1領域をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー番号489はNheI部位を含有し、488逆向プライマー番号は終止コドンおよびEcoRI部位を含有し、487逆向プライマー番号はHPC4タグをコードする配列、終止コドン、その後にEcoRI部位を含有していた。HinDIII+NheIで消化した0012VH PCR断片を、NheI+EcoRIで消化したヒトIgG4 CH1 PCR断片またはNheI+EcoRIで消化したヒトIgG4 CH1-HPC4 PCR断片と組み合わせ、pTTを基礎とするベクターのHindIII+EcoRI部位にクローニングした。得られたベクターを、それぞれpTT-0012VH-CH1およびpTT-0012VH-CH1-HPC4と称した。pTT-0012VH-CHl-HPC4ベクターは図5Bに示される。0012VH-CH1-HPC4のアミノ酸配列およびDNA配列は、配列番号168〜169に示される。HindIII+NheI消化によってpTT-0012VH-CH1およびpTT-0012VH-CH1-HPC4のVHドメインを切り出し、HinDIII+NheIで消化した0197-0000-0023VH、0197-0000-0051VHおよび0197-0000-0052VH PCR断片を挿入した。得られた発現ベクターを、pTT-0023VH-CH1、pTT-0023VH-CH1-HPC4、pTT-0051VH-CH1、pTT-0051VH-CH1-HPC4、pTT-0052VH-CH1、およびpTT-0052VH-CH1-HPC4と称した。
(実施例11)
pTT-0012VH.T60N-CH1、pTT-0012VH.T60N-CH1-HPC4、pTT-0052VH.C91Y-CH1およびpTT-0052VH.C91Y-CH1-HPC4発現構築物の開発。
phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、それぞれpTT-0012HC.T60NおよびpTT-0052HC.C91Yから0012VH.T60N-CH1および0052VH.C91Y-CH1配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。0012VH.T60N-CH1 PCR断片について、HinDIII制限酵素部位を含む順向プライマー番号572およびクローニング目的のためのEcoRI部位を含む逆向プライマー番号488またはクローニング目的のためのEcoRI部位と共にHPC4タグコード配列を含む逆向プライマー487を使用した。0052VH.C91Y-CH1 PCR断片について、逆向プライマー番号488または487のいずれかと共に、順向プライマー番号617を使用した(プライマー配列は、Table 4(表5)および配列番号60〜145に示す)。得られたPCR断片をHinDIII+EcoRIで消化し、pTTを基礎とするベクターのHinDIII+EcoRI部位に挿入した。得られた発現ベクターを、pTT-0012VH.T60N-CH1、pTT-0012VH.T60N-CH1-HPC4、pTT-0052VH.C91Y-CH1およびpTT-0052VH.C91Y-CH1-HPC4と称した。pTT-0012VH.T60N-CH1がコードするアミノ酸配列は、配列番号:0012VH.T60N-CH1(0061VH-CH1とも呼ぶ):146に示され、N末端シグナルペプチド配列なしの対応するアミノ酸配列は配列番号152に示される。
(実施例12)
pTT-FIX-L4b-0012LCおよびpTT-FIX-L4b-0012LC.C36A発現構築物の開発。
FIXのDNA配列(シグナルペプチドコード配列を含む)を、順向プライマー753および逆向プライマー754を使用して、ヒトFIXのDNA配列からPCRで増幅した。順向プライマー753は、5'末端HinDIII制限酵素部位を挿入し、逆向プライマー754は、クローニング目的のための3'末端BamHI制限酵素部位を含む17アミノ酸長のグリシン-セリンリンカー(L4b:GGGGSGGGGSGGGGSGS)を挿入する。FIX-L4b PCR断片を、pTT-hTF.1-219-L4b-0012LCのHinDIII+BamHI部位に挿入した、すなわち、hTF.1-219のDNA配列を置き換え、pTT-FIX-L4b-0012LCと称されるFIX-L4b-0012LC発現構築物を得た(図5A)。FIX-L4b-0012LCのアミノ酸配列およびDNA配列は、配列番号172〜173に示される。
pTT-FIX-L4b-0012LC.C36Aをコードする発現プラスミドを開発するために、シグナルペプチド配列を排除した0012LC.C36Aコード領域を、pTT-0012LC.C36Aを鋳型として使用し、5'末端BamHI部位を含む順向プライマー1055ならびに終止コドンおよびクローニング目的のためのEcoRI部位を含む逆向プライマー1056を使用して、PCRで増幅した(Table 4(表5))。得られたPCR断片を、pTT-FIX-L4b-0012LCのBamHI部位およびEcoRI部位に挿入した、すなわち、0012LCのDNA配列を0012LC.C36AのDNA配列で置き換えた。得られた発現ベクターをpTT-FIX-L4b-0012LC.C36Aと呼んだ。これは、配列番号:FIX-L4b-0012LC.C36A(FIX-L4b-0061LCとも呼ぶ):182に示されるアミノ酸配列をコードする。
(実施例13)
pTT-FVII-L4b-0052VH.C91Y-CH1-HPC4発現構築物の開発。
ヒトFVIIのDNA配列(シグナルペプチドコード配列を含む)を、順向プライマー751および逆向プライマー752を使用して、ヒトFVIIのDNA配列からPCRで増幅した。順向プライマー751は5'末端HinDIII制限酵素部位を挿入し、逆向プライマー752は、クローニング目的のための3'末端BamHI制限酵素部位を含む17アミノ酸長のグリシン-セリンリンカー(L4b:GGGGSGGGGSGGGGSGS)を挿入する。FVII-L4b PCR断片を、pTT-hTF.1-219-L4b-0012LCのHinDIII+BamHI部位に挿入した、すなわち、hTF.1-219のDNA配列を置き換え、pTT-FVII-L4b-0012LCと称されるFVII-L4b-0012LC発現構築物を得た。0052VHC91Y-CH1-HPC4コードDNA配列を、pTT-0052VH.C91Y-CH1-HPC4ベクターを鋳型として使用し、5'末端BamHI制限酵素部位を含む順向プライマー1236を使用し、終止コドンおよびクローニング目的のためのEcoRI部位を含む逆向プライマー1095を使用して、PCRで増幅した。得られたPCR断片を、pTT-FVII-L4b-0012LCのBamHI+EcoRI部位に挿入した、すなわち、0012LC配列を置き換え、pTT-FVII-L4b-0052VH.C91Y-CH1-HPC4と称される発現ベクターを得た。FVII-L4b-0052VH.C91Y-CH1-HPC4のアミノ酸は、配列番号:FVII-L4b-0052VH.C91Y-CH1-HPC4(FVII-L4b-0062VH-CH1-HPC4とも呼ぶ):180に示される。
(実施例14)
HEK293-6E細胞の一過性トランスフェクション。
発現プラスミドを細胞に一過性にトランスフェクトすることによって、全てのmAb、Fab、および融合タンパク質をHEK293-6E浮遊細胞中で発現させた。得られた特定のタンパク質化合物の根底にある個々のプラスミドの組合せはTable 5(表6)に示されている。1% P/S(GIBCOカタログ番号15140-122)、0.1%プルロニック(GIBCO、カタログ番号24040-032)および25ug/mL Geneticin(GIBCO、カタログ番号10131-019)を補充したFreestyle HEK293培地(GIBCO、カタログ番号12338-018)中でHEK293-6E細胞を増殖させ、製造業者の使用説明書に従って293fectin(Invitrogen、カタログ番号12347-019)を使用しておよそ1mill/mLの細胞密度で細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、合計1mgのDNAを30mLのOptimem中に希釈し(希釈液A)、1mlの293fectinを30mLのOptimem中に希釈する(GIBCO、カタログ番号51985-026、希釈液B)ことによって、各リットルのHEK293-6E細胞についてトランスフェクションを行った。希釈液AおよびBを混合し、室温で30分間インキュベートした。この後、そのトランスフェクションミックスをHEK293-6E細胞に添加し、軌道回転(125rpm)する加湿インキュベーター中で細胞を37℃でインキュベートした。トランスフェクション後5〜7日目に、遠心分離によって細胞を除去し、得られた細胞培養上清を精製前に滅菌濾過した。2つの発現プラスミドの同時トランスフェクションを使用する全ての一過性トランスフェクション実験で、トランスフェクトする各リットルのHEK293-6E細胞について総DNA量1mgを使用して1:1(ug:ug)のプラスミド比でプラスミドを同時にトランスフェクトした。
(実施例15)
組換え発現された抗TLT-1 Fab(Fab0084、Fab0074、Fab0003およびFab0004)の精製および特徴付け。
抗TLT-1 Fab(0084、0074、0003および0004)の精製を、樹脂kappaSelect(GE Healthcare、カタログ番号17-5458-01)に基づくアフィニティークロマトグラフィーを使用して実施した。4つのFabは、それぞれ配列中に含まれる単一の遊離システイン残基を含んでいる。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を実施した。精製ステップに使用した緩衝系は、10mMリン酸Na、pH7.5、150mM NaClから構成される平衡化/洗浄緩衝液および20mMギ酸、pH3.0から構成される溶出緩衝液であった。kappaSelect樹脂で充填された、予め平衡化したカラムにかける前には、清澄にした細胞上清の調整は行わなかった。カラムを、5カラム容の平衡化/洗浄緩衝液で洗浄した。およそ4カラム容の溶出緩衝液中にタンパク質を均一濃度で溶出した。溶出物を、0.5Mリン酸Na、pH9.0を用いてpH7に調整した。溶出したタンパク質の分子量を、SDS-PAGE/クマシー NuPage 4〜12% Bis-Trisゲル(Invitrogen、カタログ番号NP0321BOX)ならびにAgilent 6210機器での液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法の設定および脱塩カラムMassPREP(Waters、カタログ番号USRM 10008656)を使用して分析した。予測された分子量を有する純粋で均質なタンパク質が観察された。Agilent LC 1100/1200システムでのサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)分析の設定もまた、BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mmカラム(Phenomenex、カタログ番号00H-2146-K0)ならびに200mMリン酸Na、pH6.9、300mM NaClおよび10%イソプロパノールから構成されるランニング緩衝液を使用して実施した。このとき、保持時間およそ9.1分、流速1ml/分で、単一の対称なピークとしてタンパク質が溶出した。タンパク質終濃度を測定するために、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を、1.29の吸光係数と共に使用した。
(実施例16)
組換え発現したFIX-抗TLT-1 Fab融合タンパク質(FIX-Fab0135)の精製および特徴付け。
抗HPC4樹脂(Roche、カタログ番号11815024001)に基づくアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、FIX-Fab0135の精製を実施した。精製は、AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して実施した。精製ステップに使用した緩衝系は、20mM Hepes、pH7.5、1.0mM CaCl2、100mM NaClおよび0.005%(v/v)Tween-80から構成される平衡化緩衝液、20mM Hepes、pH7.5、1.0mM CaCl2、1.0M NaClおよび0.005%(v/v)Tween-80から構成される洗浄緩衝液、ならびに20mM Hepes、pH7.5、5.0mM EDTAおよび100mM NaClから構成される溶出緩衝液であった。細胞上清を、1mM CaCl2終濃度およびpH7.5で調整し、予め平衡化した抗HPC4カラムにかけた。カラムを、5カラム容の平衡化緩衝液、5カラム容の洗浄緩衝液および最後に5カラム容の平衡化緩衝液で洗浄した。およそ4カラム容の溶出緩衝液中にタンパク質を均一濃度で溶出した。SDS-PAGE/クマシーおよびMicro-flexシステム(Bruker Daltonics)でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)設定を使用してタンパク質を分析したところ、106kDaの分子量を有する純粋で均質なタンパク質が得られたことが示された。FIX-Fab0135構築物のアミノ酸配列の理論的質量は95.9kDaであったことから、発現されたタンパク質は、翻訳後修飾を含んでいた。タンパク質終濃度を測定するために、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を、1.29の吸光係数と共に使用した。
(実施例17)
pcDNA3.1(+)-hTLT-1 ECD-HPC4 ala突然変異プラスミド。Table 6(表7)に従って40種のhTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異発現構築物を設計した。外部請負業者GENEART AG(Im Gewerbepark B35、93059 Regensburg、Germany)によって発現構築物が開発され、40種の発現構築物は全て、pcDNA3.1(+)と称する発現ベクターを基礎として作製された。各hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異タンパク質(Table 6(表7))を一過性に発現させるために、40種のhTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+)発現構築物それぞれのDNAのアリコートをHEK293-6E浮遊細胞にトランスフェクトした。HEK293-6E細胞の一過性トランスフェクションおよび培養は、実施例14に記載のように行った。
(実施例18)
モノクローナル抗TLT-1抗体(mAb0012、mAb0023、mAb0051、mAb0061、mAb0062)の精製および特徴付け。
Protein A MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-5438-01)を使用するアフィニティーークロマトグラフィー、および26/60 Superdex 200 PrepGradeカラム(GE Healthcare、カタログ番号17-1071-01)を使用するゲル濾過クロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスによって、Table 5(表6)に記載の組換えにより発現させたモノクローナル抗TLT-1抗体の精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。アフィニティー精製ステップに使用した緩衝系は、20mMリン酸Na pH7.2、150mM NaClから構成される平衡化緩衝液、10mMギ酸、pH3.5から構成される溶出緩衝液、および0.5Mリン酸Na pH9.0から構成されるpH調整緩衝液であった。細胞上清を、何も調製せずに、予め平衡化したMabSelect SuReカラムに直接かけた。15カラム容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、およそ2〜5カラム容の溶出緩衝液中にモノクローナル抗体を均一濃度で溶出させた。溶出後直ちに、記載したpH調整緩衝液を使用して、プールした分画を中性pHに調整した。前記ゲル濾過カラムを使用してタンパク質をさらに精製し緩衝液を交換した。サイズ排除クロマトグラフィーに使用したランニング緩衝液は、25mM His pH6.5、135mM NaClであった。使用した流速は2.5ml/分であり、モノクローナル抗TLT1抗体がおよそ0.4カラム容で単一のピークとして溶出した。前述のSEC-HPLC法(実施例2に記載されている)を使用したピーク全体にわたる分画の分析に基づいて、およそ8.5分で対称的なピークとして溶出する純粋な抗体タンパク質を含有し、初期に溶出する高分子量タンパク質の含量が最小限であるプールを調製した。
精製した抗体は前述のSDS-PAGE/Coomassie(実施例2に記載されている)およびSEC-HPLC法を使用して特徴付け、産生した全ての抗体タンパク質調製物が高度に均質であったことが示された。全ての抗体が、SDS-PAGE/Coomassie分析を実行する前に還元条件を使用した際に、予想されたおよそ50kDaの重鎖構成成分およびおよそ25kDaの軽鎖構成成分を示した。Agilent 6210機器の液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法の設定および脱塩カラムMassPREP(Waters、カタログ番号USRM10008656)を使用して、インタクトな分子量の決定を行った。使用した緩衝系は、LC-MSグレードH2O中0.1%ギ酸から構成される平衡化緩衝液、およびLC-MSグレードACN中0.1%ギ酸から構成される溶出緩衝液であった。全ての抗体が147.2〜148.6kDaのインタクトな分子量を示したが、これは、各抗体のアミノ酸配列の理論的な質量をおよそ2.7〜3.1 kDa上回る。したがって、組換えにより発現させた全ての抗TLT-1抗体は、予想されたHCのN-グリコシル化に対応する翻訳後修飾を示した。6つの抗体について最終的な純度95〜99%が得られた。クローニングし精製した抗TLT-1抗体のN末端配列を検証するために、自動化配列決定システム(Applied Biosystems 494 Protein Sequencer)を使用してEDMAN分解を行った。各抗体について10〜20の分解サイクルを行った。ここで、6つのクローニングした抗TLT-1抗体について予想された軽鎖および重鎖配列が確認された。最終的なタンパク質濃度を測定するために、Nano-Drop分光光度計(Thermo Scientific)を、6つの各抗体に特異的な吸光係数1.34〜1.51と一緒に使用した。
(実施例19)
mAb結合およびTLT-1との結合についての様々なmABの競合。
材料:
方法: 対象とするmAbは、CM5チップに直接固定化したか、またはCM5チップに固定化されたヒトFc捕捉mAbを介した捕捉により固定化し、一方TLT-1-Hisは、Fab分析のために抗His mAb CM5チップを介した捕捉により固定化した。使用した試薬はTable 7(表8)に示されている。
mAb直接捕捉:供給業者によって推奨される標準的な手順を使用して、TLT-1 mAbをおよそ500〜1000RUのレベルまでCM5チップ上に固定化した(酢酸Na、pH 4.0で希釈した50μg/ml)。mABとの結合について200nM〜0.2nMのTLT-1の2倍希釈物を試験した。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM HEPES、150mM、0.005% p20、pH 7.4。10mMグリシン、pH 1.7によって再生を行った。
ヒトFc mAbを介したmAb捕捉:およそ10.000RUまでヒトFc mAbを固定化した。対象とするmAbを添加した(およそ100 nM)。200nM〜0.2nMのTLT1の2倍希釈物を試験した。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM HEPES、150mM、0.005% p20、pH 7.4。3M MgCl2によって再生を行った。
抗His mAb(R&D # MAB050)を介したTLT-1-His捕捉:抗His mAbを、およそ9.000RUまで固定化した。TLT-1-Hisを、供給業者によって推奨される標準的な手順を使用して、およそ30〜40RUのレベルまで添加した(10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween-20中に希釈した10μg/ml)。3μg/mlから0.047μg/mlまでのFabの8倍希釈物を、TLT-1-Hisへの結合について試験した。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween-20。3M MgCl2によって再生を行った。
Biacore T100評価ソフトウェアを使用して、TLT-1およびフィブリノーゲンの1:1の相互作用を想定して動態および結合定数(kon、koff、KD)の決定を行った。
競合:固定化されたmAb0012(または代替のmAb)と結合した際の様々なTLT-1 mAbとTLT-1の結合を分析する、Biacore T-100における表面プラスモン共鳴によって競合的結合相互作用分析を行った。5000〜10000RUのレベルまでのmAbのCM5チップへの直接固定化が、10mM酢酸ナトリウム、pH4.5〜5.0中で実現された。この後に50nM TLT-1の結合が続き、解離の2分後に競合について試験する他の3つのmAbの結合が続いた。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM HEPES、150mM、0.005% p20、pH 7.4。10mMグリシン、pH 1.7によって再生を行った。
結果:
結論:
mAb0061、mAb0023、mAb0051、mAb0062およびFab0074、Fab0084、Fab0003およびFab0004の結合定数をBiacore分析によって概算した(Table 8(表9)を参照)。mAb0061およびmAB0051は、結合について他のmAbのいずれとも競合しない(Table 9(表10)を参照)。mAb0023およびmAb0062は互いに競合する(Table 9(表10)を参照)。
(実施例20)
20:80のPS:PC小胞の調製ならびにTLT-1のクローニング、発現、リフォールディングおよび再脂質付加。
TFの代わりにTLT-1を使用した以外はSmithおよびMorrissey(2005年)、J. Thromb. Haemost.、2巻、1155〜1162頁に記載のように、界面活性剤としてTriton X-100を使用して20:80のPS:PC小胞中の再脂質付加TLT-1を調製した。
材料
LB培地カナマイシン(50mg/ml)。カナマイシンSigma K-0254
1000mM IPTG(IPTG Sigma 1-6758)
溶解緩衝液:50mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM EDTA、pH8.0中のBugbuster(Novagen)。0.5mg/mlリゾチーム+DNAseIを添加。1×完全インヒビターカクテル(Roche)を添加
IB洗浄緩衝液1:IB緩衝液中の1:10 bugbuster。50μg/mlリゾチーム+0.5×完全インヒビターカクテル(Roche)を添加
IB洗浄緩衝液2:IB緩衝液中の1:10 Bugbuster
IB緩衝液:50mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM EDTA、pH8.0
GndHCl緩衝液:6MグアニジウムHCl、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.1%Triton X-100 red.、pH8.0
リフォールディング緩衝液:50mM Tris-HCl、800mMアルギニン、0.1%Triton X-100 red.、5mM還元型グルタチオン、0.5mM酸化型グルタチオン、pH8.5
透析緩衝液:20mM Tris-HCl、0.1%Triton X-100、pH8.0
DTT:還元型グルタチオン(Sigma G4251)、酸化型グルタチオンSigma G4376
PC:クロロホルム中の10mg/ml L-α-ホスファチジルコリン(卵、ニワトリ)(Avanti Polar Lipids Inc.)カタログ番号840051C。Mw 760.09
PS:クロロホルム中の10mg/ml L-α-ホスファチジルセリンナトリウム塩(脳、ブタ)(Avanti Polar Lipids Inc.)カタログ番号840032C。Mw 812.05
Triton X-100:10%Triton X-100、水素化、タンパク質グレード界面活性剤、滅菌濾過。Calbiochemカタログ番号648464、濃度159mM(Mw 628)
HBS緩衝液:50mM HEPES、100mM NaCl、pH7.4
Bio-Beads:Bio-Beads SM2 Adsorbent、20〜50メッシュ、BioRad Laboratoriesカタログ番号152-3920。
方法
発現:プライマー1004(配列番号150)および1005(配列番号151)ならびに鋳型であるpTT-hTLT-1を使用して、細胞外ドメイン、リンカーおよび膜貫通ドメインを含むTLT-1(TLT-1 18-188;配列番号149)をpET24aにクローニングした。DNA調製の標準的な技術を使用した。BL21(DE3)への形質転換を行った。終夜培養:250mlフラスコ(プラスチック)中の1×50ml LB培地および50μlの50mg/mlカナマイシン+BL21プレートの1つのコロニー(形質転換)を混合した。37℃、220rpmで、培養物をONでインキュベートした。開始培養:300μlの50mg/mlカナマイシンを入れた2Lフラスコ(プラスチック)中に2×500 ml LB培地を添加した。BL21(DE3)中TLT-1 lip/pET24aの10ml ON培養物を添加しOD600を追跡した。37℃、220rpmでインキュベートした。誘導:LB中のTLT-1 lip/pET24a〜BL21(DE3)が2×500 mlある。25℃〜で、OD600が0.6〜0.8に達した際に、細胞培養物に0.2mM IPTGを添加した(1Mを100μl)。25℃、220rpmでこれを3時間インキュベートした。3時間後に培養物を採取し、4600rpmで30分間遠心分離した。上清を捨てた。ペレットを-20℃で貯蔵した。封入体の溶解:ペレット1g当たり5mlの溶解緩衝液でE.coliペレットを再懸濁した。MgSO4を5mMになるまで添加してDNAseI活性を支援した。振盪プラットホーム上で細胞懸濁液を室温で20分間インキュベートした。4℃で20分間20000g(8500rpm)で遠心分離することにより溶解液を清澄にした。100mlのIB洗浄緩衝液でペレットを再懸濁した。穏やかにボルテックスをかけることにより懸濁液を混合し、RTで5分間インキュベートした。懸濁液を4℃で20分間20000gで遠心分離して、封入体を収集した。100mlのIB洗浄緩衝液2で封入体を再懸濁した。試料を4℃で20分間20000gで遠心分離して、封入体を収集した。100mlの水でペレットを再懸濁し、4℃で20分間20000gで遠心分離して、封入体を収集した。リフォールディング:xmlのGdnHCl緩衝液(20ml)でペレットを再可溶化した。TLT-1の終濃度(A280を測定した)は1〜2mg/mlであった。DTT(400μl)を終濃度20mMになるまで添加した。RTで約1〜2.5時間(1.5時間)磁気撹拌することによって完全な可溶化を確実なものとした。20000gで20分間遠心分離することにより不溶性物質を除去した。蠕動ポンプをゆっくりと(終夜)使用して、GdnHCl/タンパク質溶液(20ml)を4℃の>20×リフォールディング緩衝液(400ml)に移した。リフォールディング緩衝液を速く撹拌して迅速な希釈を確実なものとした。流速1×、速度2.5、4℃でポンプ運転を行い、4℃で終夜放置した。50ml管中で30分間20000g(8500rpm)で遠心分離することにより、沈殿したタンパク質を除去した。4.5バールでAmico-フィルター直径76mm、10.000 MWCO中にTLT-1 lipを400mlから120mlに濃縮した。試料中のGdnHClのため、EtOH沈殿によりSDS-Pageでタンパク質を確認した。10.000 MWCOを用いて0.5ml管中に2×500μlおよび2×25μlを濃縮した。50μlの試料+9容の氷冷99%EtOH(450μl)を混合し、-20℃で10分間置いた。試料を全速力の13.000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨てた。450μlの氷冷96%EtOH+50μlのMQでペレットを洗浄した。再度遠心分離した。乾燥させた(SDS-PAGEの前にEtOHが除去されなければならない)。100μlは再懸濁1×試料緩衝液であった。
PS:PCの調製および再脂質付加:TLT-1の再脂質付加について、Smith SAおよびMorrissey JH(2004年)「Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes」、J. Thromb. Haemost. 2巻:1155〜1162頁に記載の正確なプロトコールに従った。
(実施例21)
TLT1とフィブリノーゲンの結合およびTLT1 mAbとフィブリノーゲンの間の結合の競合の分析。
TLT-1はフィブリノーゲンと結合し、これはSPR分析によって試験される。さらに、Biacore T100機器でのSPR分析によって、フィブリノーゲンならびに4つのmAb:mAb0012、mAb0023、mAb0051およびmAb0062のそれぞれの同時結合を試験した。
使用した材料がTable 10(表11)に示されている。
方法:
供給業者によって推奨される標準的な手順を使用して、ヒトTLT-1をおよそ1000RUのレベルまでCM5チップ上に固定化した(酢酸Na、pH 4.0で希釈した50μg/ml)。固定化されたTLT1との結合について200nM〜0.2nMのヒトフィブリノーゲンの4倍希釈物を試験した。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM HEPES、150mM、0.005% p20、pH 7.4。10mMグリシン、pH 1.7によって再生を行った。Biacore T100評価ソフトウェアを使用して、TLT-1およびフィブリノーゲンの1:1の相互作用を想定して動態および結合定数(kon、koff、KD)の決定を行った(Table 11(表12))。
CM5チップでのおよそ10000〜15000RUまでの各mAbの固定化、その後、解離の2〜3分後に続く、競合について試験する様々な濃度のmAbによる50nM TLT-1の結合によって、TLT1およびフィブリノーゲンとの結合についての様々なmAbの競合を同時に試験した。10mMグリシン、pH 1.7によってチップの再生を行った(Table 12(表13))。
結果:
結論:
TLT-1(HCI-0150R)はフィブリノーゲンと結合する。mAb0023およびmAb0062はこの結合部位と競合する。mAb0012およびmAb0051は競合しない。
(実施例22)
水素交換質量分析(HX-MS)によるエピトープマッピング。
HX-MS技術を使用して、4つのモノクローナル抗体mAb0023、mAb0051、mAb0062およびmAb0061によってカバーされるTLT-1結合エピトープを同定した。
マッピング実験では、配列番号5、6および7にそれぞれ対応するhTLT-1.20-125、hTLT-1.16-162およびhTLT-1.126-162を使用した。実験前に全てのタンパク質についてPBS pH7.4に緩衝液を交換した。
方法:HX-MS実験。
機器類およびデータ記録。HX実験は、重水素交換反応の開始、反応時間の調節、失活反応、UPLCシステムへの注射、および消化時間の調節を行う、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)によって作動するLeapロボット(H/D-x PAL;Leap Technologies Inc.)によって自動化された。Leapロボットは、2つの温度調節スタックを備え、これらはそれぞれ緩衝液貯蔵およびHX反応用に20℃に維持され、タンパク質および失活溶液の貯蔵用に2℃に維持されていた。Leapロボットは、1℃でペプシン、プレおよび分析カラム、ならびにLCチューブおよび切替弁を保持する冷却Trio VSユニット(Leap Technologies Inc.)をさらに含有していた。切替弁は、HPLCからMicrobore UHPLC切替弁(Cheminert, VICI AG)にアップグレードした。インラインのペプシン消化では、200pmolのTLT-1を含有する100μLの失活試料を添加し、均一濃度の流速200μL/分(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を使用してPoroszyme(登録商標)固定化ペプシンカートリッジ(2.1×30mm(Applied Biosystems))を通過させた。得られたペプチドを捕らえ、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))で脱塩した。その後、弁を切り替えて、分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm (2.1×100mm(Waters Inc.))とインラインのプレカラムを配置し、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から150μL/分で送達される15〜40%Bの9分の勾配を使用してペプチドを分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸およびB:CH3CN中の0.1%ギ酸からなっていた。ESI MSデータ、および個別データ依存的MS/MS取得(CID)および高エネルギー(MSE)実験を、Q-Tof Premier MS(Waters Inc.)を使用して陽イオンモードで取得した。ロイシン-エンケファリンをロック質量として使用し(m/z 556.2771で[M+H]+イオン)、データを連続モードで収集した。
データ分析。標準的なCID MS/MSまたはMSE法(Waters Inc.)を使用して別々の実験で消化ペプチドを同定した。BiopharmaLynx 1.2(017版)を使用してMSEデータを処理した。Mass-Lynxソフトウェアおよび社内MASCOTデータベースを使用してCIDデータ依存的MS/MS取得を分析した。
HX-MS生データファイルを連続的なロック質量補正にかけた。HX-Express((ベータ版);Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17巻、1700頁(2006年))を使用して、データ分析、すなわち重水素化ペプチドの重心決定および交換曲線のプロットを行った。
mAb0023のエピトープマッピング:対応する重水素化緩衝液(すなわちD2Oで調製したPBS、最終96%D2O、pH7.4(非補正値))中へのmAb 0023の存在下または不在下でhTLT-1.20-125の30倍希釈物によってアミド水素/重水素交換(HX)を開始した。HX反応は全て20℃で実施され、2.4μM mAb 0023の不在下または存在下で4μM hTLT-1.20-125を含有し、それによってmAb結合部位が1.2倍モル過剰となった。10秒〜8時間の適当な時間間隔で、最終pHが2.6(非補正値)となる等体積の氷冷失活緩衝液(1.35M TCEP)によってHX反応のアリコートを失活させた。
mAb 0051および0062のエピトープマッピング:hTLT-1.20-125を使用して別々の実験でmAb0051およびmAb0062のエピトープマッピングを行い、上記に記載のmAb0023のマッピングと同様に実施した。
mAb 0061のエピトープマッピング:hTLT-1.16-162タンパク質またはhTLT-1.126-162ペプチドを使用して、2つの別々の実験でmAb0061のエピトープマッピングを行った。
mAb0023について上記に記載のものと同様に実験を行った。しかし、hTLT-1.126-162を使用した実験ではペプシンカラムを室温で配置した。この結果、ペプシン消化効力が増大し、さらなる交換損失が最小限となった。
結果
mAb0023のエピトープマッピング
TLT-1の一次配列を100%カバーする20個のペプチドのHX時間経過を10秒〜8時間にかけてmAb0023の存在下または不在下でモニタリングした。
mAb 0023の存在下または不在下で観察される交換パターンは、2つの異なる群:mAb0023の結合によって影響を受けない交換パターンを示すTLT-1ペプチドの1つの群、およびmAb0023結合後に交換からの防御を示すTLT-1ペプチドのもう1つの群に分割することができる。mAb0023結合後に防御を示す領域は、TLT-1残基36〜51、79〜91および105〜120をカバーするペプチドを包含する。各ペプチド内での交換防御の相対量を比較することによって、mAb0023のエピトープを残基36〜47、VQCHYRLQDVKA(50%)、82〜87、LGGGLL(30%)、108〜115、GARGPQIL(20%)に絞ることができ、各セグメントの相対的交換防御を括弧内に示す。0023エピトープのペプチドマップの外観は、図6に示されている。
mAb0051のエピトープマッピング
TLT-1の一次配列を100%カバーする22個のペプチドのHX時間経過を10秒〜1000秒にかけてmAb 0051の存在下または不在下でモニタリングした。
mAb0051の存在下または不在下で観察される交換パターンは、2つの異なる群:mAb0051の結合によって影響を受けない交換パターンを示すTLT-1ペプチドの1つの群、および影響を受ける群に分割することができる。mAb0051結合後に防御を示す領域は、残基52〜66、92〜120をカバーするペプチドを包含する。各ペプチド内での交換防御の相対量を比較することによって、mAb0051のエピトープを残基55〜66、LPEGCQPLVSSA(75%)および110〜120、RGPQILHRVSL(25%)ならびに92〜105のストレッチ中の弱い相互作用に絞ることができる。0051エピトープのペプチドマップの外観は、図7に示されている。
mAb0062のエピトープマッピング
TLT-1の一次配列を100%カバーする22個のペプチドのHX時間経過を10秒〜1000秒にかけてmAb0062の存在下または不在下でモニタリングした。
mAb0062の存在下または不在下で観察される交換パターンは、2つの異なる群:mAb0062の結合によって影響を受けない交換パターンを示すTLT-1ペプチドの1つの群、および防御を示すTLT-1ペプチドのもう1つの群に分割することができる。mAb0062結合後に防御を示す領域は、残基36〜51および105〜120をカバーするペプチドを包含する。各ペプチド内での交換防御の相対量を比較することによって、mAb0062のエピトープを36〜47、VQCHYRLQDVKA(60%)および110〜120、RGPQILHRVSL(40%)に絞ることができる。0062エピトープのペプチドマップの外観は、図8に示されている。
mAb0061のエピトープマッピング
hTLT-1.16-162タンパク質またはhTLT-1.126-162を使用して、2つの別々の実験でmAb0061のエピトープをマッピングした。
hTLT-1.16-162では、TLT-1の一次配列を85%カバーする19個のペプチドのHX時間経過を10秒〜8時間にかけてmAb0061の存在下または不在下でモニタリングした。残基S148でのO-グリコシル化のため、残基141を越えての情報を記録することができなかった。
mAb 0061の存在下または不在下で観察された交換パターンは、2つの異なる群:mAb0061の結合によって影響を受けない交換パターンを示すTLT-1ペプチドの1つの群、およびmAb0061結合後に交換からの防御を示すTLT-1ペプチドのもう1つの群に分割することができる。mAb0061結合後に防御を示す領域は、残基121〜141をカバーするペプチドを包含する。しかし、この実験では残基142およびそれを越えての情報が得られないことに留意することが重要である。各ペプチド内での交換防御の相対量を比較することによって、mAb0061のエピトープを残基130での開始に絞ることができる。
mAb0061エピトープについて完全な情報を得るために、ペプチドhTLT-1.126-162を使用してマッピング実験を反復した。このペプチドは高い親和性でmAb0061と結合し、グリコシル化によって修飾されていない。したがって、領域全体のHX-MS情報を得ることができるはずである。
126〜162のTLT-1領域全体をカバーする12個のペプチドのHX時間経過を10秒〜3000秒にかけてmAb0061の存在下または不在下でモニタリングした。
この126〜162の領域中の全てのペプチドが、mAb0061結合後に交換からの防御を示す。各ペプチド内での交換防御の相対量を比較することによって、mAb0061のエピトープを残基130〜145、ETHKIGSLAENAFSDPに絞ることができる。0061エピトープのペプチドマップの外観は、図9および10に示されている。
(実施例23)
hTLT1 ECD-HPC4 Ala突然変異体の産生、特徴付けおよび結合分析。
Table 6(表7)に従ってhTLT-1 ECD-HPC4アラニン突然変異構築物を設計した。外部請負業者GENEART AG(Im Gewerbepark B35、93059 Regensburg、Germany)によって発現構築物が開発され、発現構築物は全て、pcDNA3.1(+)と称する発現ベクターを基礎として作製された。各hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異タンパク質(Table 6(表7))を一過性に発現させるために、40種のhTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+)発現構築物それぞれのDNAのアリコートをHEK293-6E浮遊細胞にトランスフェクトした。HEK293-6e細胞の一過性トランスフェクションおよび培養は、実施例Aに記載のように行った。
トランスフェクション後7日目に、遠心分離によって細胞を除去し、得られたhTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異タンパク質を含有する上清を分析前に滅菌濾過した。RP-HPLCおよびSDS-PAGE/Coomassie分析の組合せを使用して、清澄にした細胞上清中の発現したhTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異タンパク質の濃度を決定した。これらは4〜40μg/mLであり、程度の変動するダイマー形成を含有していた。免疫感作実験に使用したhTLTタンパク質の産生について前述したように、全てのhTLT ECD-HPC4 Ala突然変異構築物について、発現したタンパク質のモノマー/ダイマー形態が観察された。モノマー/ダイマーhTLTl ECD-HPC4タンパク質の相対的濃度をSDS-PAGE/Coomassieによって概算し、各突然変異調製物の平均Mwを算出した。
全ての結合試験を25℃で実行し、表面プラスモン共鳴を通じてリアルタイムで分子の相互作用を測定するProteOn分析器(BioRad)の試料区画中に試料を15℃で貯蔵した。ProteOnによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、個々のセンサーチップの表面スポット上の質量に直接相関する。
0.4M EDAC[1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩]および0.1Mスルホ-NHS[N-ヒドロキシスルホスクシンイミド]の1:1混合物を使用して、GLMセンサーチップの別々のフローセル上に抗hFcポリクローナル抗体を固定化した。各抗体を10mM酢酸ナトリウムpH5.0で50μg/mlの濃度に希釈し、30μl/分で240秒間、個々のフローセルに固定化した。抗体はフローセルA1〜A6(水平方向)に固定化した。固定化後、1Mエタノールアミンを用いてフローセル上の活性部位を遮断した。捕捉抗体の最終固定化レベルは、典型的には1回の実験でおよそ9,000〜10,000RUであった。HBS-EP緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性物質P20、pH 7.4)中に0.5μg/mlに希釈し、垂直方向に30μl/分で60秒間注射することによって抗TLT1抗体mAb0023、mAb0051、mAb0061およびmAb0062の捕捉を行い、抗ヒトFc抗体だけを有するスポット間参照点を作製した。試験抗体の最終捕捉レベルは、典型的には1回の実験でおよそ200〜300RUであった。並行するフローセルにわたって水平方向に注射することによりwtまたはAla突然変異hTLT-1 ECD-HPC4タンパク質の結合を行って、スポット間参照物との結合に対する、異なる捕捉抗TLT-1抗体との結合の比較分析を可能にした。算出された平均Mwに基づいて、HBS-EP緩衝液中に各hTLT-1 ECD-HPC4タンパク質を100nMに希釈し、30μl/分で240秒間注射した。分析物の各注射サイクル後に、100μl/分で1回の1Mギ酸の18秒の注射、その後50mM NaOHの18秒の注射によりGLMチップを再生した。この再生ステップで、固定化捕捉抗体表面から抗TLT-1抗体および結合したTLT-1が除去され、次の試験試料の対のその後の結合が可能となった。その再生手順では、直接固定化された抗ヒトFc捕捉抗体はチップ表面から除去されなかった。
ProteOn Manager(商標)ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。スポット間対照表面との著しい非特異的結合は観察されなかった。二重参照(捕捉抗TLT-1抗体に対するスポット間対照表面シグナルならびにブランク緩衝液注射の減算)によって結合曲線を処理した。これは、試料注射中の機器ノイズ、バルクシフトおよびドリフトの補正を可能にした。分析物注射の停止後10秒での結合シグナルを捕捉抗TLT-1抗体のレベルに対して標準化し、wt hTLT-1 ECD-HPC4タンパク質と相対的な結合として示した。
以下のAla突然変異は、wt hTLT-1 ECD-HPC4タンパク質と比較したそれぞれの抗TLT-1との結合の著しい低下を示した。mAb0051:F54A<0.4wt;M91A<0.2wt;R117A<0.2wt;S119A<0.6wt。mAb0062:R41A<0.2wt;L42A<0.6wt;Q43A<0.4wt;F54A<0.6wt;M91A<0.4wt;R110A<0.2wt;H116A<0.6wt。mAb0023:L42A<0.2wt;Q43A<0.2wt;K46A<0.2wt;M91A<0.4wt;R110A<0.2wt。4つ全ての抗TLT-1抗体でhTLT-1 ECD-HPC4突然変異体M91Aについて結合の低下を観察することができたため、おそらくその残基は現実のエピトープの一部ではなくタンパク質の安定性に対して重要な影響を有する。mAb0061は、試験した突然変異TLT-1変異体のいずれとも結合の低下を示さなかったが、これは、結合試験で導入された突然変異体によってエピトープがカバーされていないことを示している。
(実施例24)
抗TLT-1 FabとTLT-1ストークペプチドとの結晶構造複合体。
結晶化用抗TLT-1 Fab、Fab0100(Fab0061と同一)の発現:一般化された手順に従って、配列番号152に対応する重鎖および配列番号153に対応する軽鎖を含む抗TLT-1 Fab断片Fab0100をHEK293細胞中で一過性に発現させた。
結晶化用抗TLT-1 Fab、Fab0100の精製:kappaSelect樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-5458-01)を使用するアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスによって、前記Fabの精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。精製ステップに使用した緩衝系は、10mMリン酸Na、pH7.5および150mM NaClから構成される平衡化緩衝液、ならびに20mMギ酸、pH3.0から構成される溶出緩衝液であった。1M NaOHで上清をpH7.5に調整し、予め平衡化したkappaSelectカラムにかけた。5カラム容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、およそ5カラム容の溶出緩衝液を使用してFabタンパク質を均一濃度で溶出させた。SDS-PAGE/CoomassieおよびLC-MS分析を使用してFabタンパク質を分析し、予想される分子量が46.9kDaである純粋かつ均質なタンパク質が得られたことが示された。タンパク質濃度を測定するために、Nano-Drop分光光度計(Thermo Scientific)を、吸光係数1.31と一緒に使用した。サイズ排除カラム(Superdex200)を使用してFabタンパク質の最終仕上げを行った。
結晶化用ペプチドの調製:固相ペプチド合成によってTLT-1ストークペプチドhTLT-1.126-162(配列番号7)を調製した。同様に、配列番号8に対応するストークペプチドの短いバージョンhTLT-1.129-142を調製した。
Fab0100:TLT-1複合体の調製、結晶化および構造決定。Fab0100:hTLT-1.126-162の調製:2倍モル過剰のhTLT-1.126-162をFab0100の溶液に添加し、その後調製用サイズ排除クロマトグラフィーを使用して過剰なhTLT-1.126-162を分離することにより複合体を単離することによって、Fab0100とhTLT-1.126-162との複合体を調製した。したがって、どちらもPBS緩衝液(pH7.4)中のFab(1100μl、98μM)およびhTLT-1.126-162(155μl、1391μM)を混合することによってFab0100:hTLT-1.126-162複合体を調製した。Superdex 200 HighLoad 26/60(GE Healthcare)カラムを使用して複合体をゲル濾過にかけ、流速1ml/分でPBS緩衝液(pH7.4)を用いて溶出させた。体積3mlに対応する分画を収集した。所望のFab0100:hTLT-1.126-162複合体を含有する分画をプールし、次いで遠心分離フィルターデバイス(Amicon、10kDaカットオフ)を使用してタンパク質濃度8.6mg/mlに濃縮した。この調製物をFab0100:hTLT-1.126-162複合体の結晶化に使用した。
Fab0100:hTLT-1.129-142の調製:hTLT-1.129-142とFabのモル比が1.5:1であり、長いストークペプチド(hTLT-1.126-162)と比較してhTLT-1.129-142の結合が弱いためにゲル濾過の停止を省略したことを除いて、Fab0100と短いストークペプチド(hTLT-1.129-142)との複合体を同様に調製した。
Fab0100:hTLT-1.129-142およびFab0100:hTLT-1.126-162複合体の結晶化およびデータ収集:シッティングドロップ(sitting drop)法によってFab0100:hTLT-1.129-142およびFab0100:hTLT-1.126-162複合体を室温で結晶化した。タンパク質溶液に1:2の体積比(沈殿剤:タンパク質)で0.04Mリン酸二水素カリウム、16重量/体積%PEG 8,000および20%グリセロールを含有する沈殿溶液を添加することによってFab0100:hTLT-1.129-142を結晶化し、一方タンパク質溶液に1:1の体積比(沈殿剤:タンパク質)で20重量/体積%PEG 10,000および0.10M Hepes pH7.5を含有する沈殿溶液を添加することによってFab0100:hTLT-1.126-162複合体を結晶化した。Fab0100:hTLT-1.129-142複合体の結晶を液体N2中で急速冷凍し、極低温N2ガス流によりデータ収集の間100Kで維持した。その後、Rigaku MicroMax-007 HF回転陽極およびmarCCD 165 X線検出器を使用して2.14Å分解能までの結晶学的データを収集した。XDSソフトウェアパッケージ(Kabsch,W.(1993年) J. Appl. Crystallogr. 26巻、795〜800頁)によって空間群の決定、データの積分およびスケーリングを行った。結晶の格子パラメーターは、a、b、c、α、βおよびγについてそれぞれ82.10、64.99、107.73Å、90°、95.12°および90°と決定され、空間群はC2と決定された。データセットの強度のRsymは6.5%と算出された。PDBに寄託されている(Berman,H.M.ら(2000年)Nucleic Acids Res. 28巻、235〜242頁)1NGZ構造(Yin,J.ら、PNAS us 100巻、856〜861頁)のFabモデルの座標を抗TLT-1 Fab分子の構造決定に使用した。1NGZ Fabモデルを可変および定常ドメインの2つのドメインに分割し、次いでそれをCCP4スイート(Bailey,S.(1994年)Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystal-logr. 50巻、760〜763頁)のPHASERソフトウェアプログラム(Mccoy,AJ.ら、Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 61巻、458〜464頁;Mccoy,AJら、J. Appl. Crystallogr. 40巻、658〜674頁)による分子置換の実行において独立した検索モデルとして使用した。その後、ARP-wARPソフトウェアパッケージ(Evrard,G.X.ら、Acta Crystallographica Section D 63巻、108〜117頁)を自動化モデル構築および位相調整に使用した。REFMAC5ソフトウェアプログラム(Murshudov,G.N.ら、Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53巻、240〜255頁)を使用したさらなる結晶学的精密化、その後にCOOTソフトウェアプログラム(Emsley,P.ら、Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 60巻、2126〜2132頁)を使用した電子密度マップのコンピュータグラフィックス検査、モデル補正および構築を適用した。モデルにさらなる著しい改善を施すことができなくなるまでこの手順を繰り返した。3サイクルの手作業での介入後の最終の算出R-およびR-フリーはそれぞれ0.185および0.245であり、このモデルは0.022Åの理想的な結合の長さからの二乗平均平方根偏差(RMSD)を示した。
Fab0100:hTLT-1.126-162複合体の結晶を、75%の沈殿剤溶液および25%のグリセロールを含有する凍結溶液に移した。結晶を約15秒間浸し、次いで液体N2中で急速冷凍し、極低温N2ガス流によりデータ収集の間100Kで維持した。その後、MAX-lab、Lund、SwedenのビームラインBL911-3(Ursby,T.ら(2004年) AIP Conference Proceedings 705巻、1241〜1246頁)で1.85Å分解能までの結晶学的データを収集した。XDSソフトウェアパッケージにおいて空間群の決定、データの積分およびスケーリングを行った。そのシンクロトロンデータについての格子パラメーターは、a、b、c、α、βおよびγについてそれぞれ82.54、65.32、108.05Å、90°、95.15°および90°と決定され、空間群はC2と決定された。データセットの強度のRsymは6.7%と算出された。その結晶はFab0100:hTLT-1.129-142結晶と同形であり、したがってFab0100:hTLT-1.126-162の元の位相調整、その後のARP-wARPソフトウェアパッケージを使用した自動化モデル構築および位相調整にFab0100:hTLT-1.129-142複合体の剛体精密化を使用した。REFMAC5ソフトウェアプログラムを使用したさらなる結晶学的精密化、その後にCOOTソフトウェアプログラムを使用した電子密度マップのコンピュータグラフィックス検査、モデル補正および構築を適用した。モデルにさらなる著しい改善を施すことができなくなるまでこの手順を繰り返した。13サイクルの手作業での介入後および精密化後の最終の算出R-およびR-フリーはそれぞれ0.171および0.223であり、このモデルは0.027Åの理想的な結合の長さからのRMSDを示した(Table 11(表12))。
結果
Table 14および15(表15および16)に示されるように、抗TLT-1はTLT-1のストークと有効に結合する。CCP4プログラムスイートのソフトウェアプログラムAREAIMOLを使用して、Fab0100およびTLT-1とのペアワイズ相互作用において排除された平均面積が764Å2と算出された。Fab0100:hTLT-1.126-162複合体のペアワイズ相互作用において排除された平均面積は、抗TLT-1およびTLT-1についてそれぞれ656および871Å2を示した。
Fab0100:hTLT-1.126-162複合体においてFab0100と直接接触しているTLT-1ペプチド(hTLT-1.126-162)中の残基がエピトープと定義され、Fab0100:hTLT-1.126-162複合体においてhTLT-1.126-162と直接接触している抗TLT-1 Fab中の残基がパラトープと定義される。抗TLT-1 FabとTLT-1分子とのカットオフ距離4.0Åを使用してCCP4プログラムスイートのCONTACTSソフトウェアを実行することによってエピトープおよびパラトープ残基を同定した。Fab0100:hTLT-1.126-162複合体についての結晶構造の接触算出の結果はTable 14および15(表15および16)に示されている。抗TLT-1について得られたTLT-1エピトープは、配列番号7の以下の残基:Lys8(133)、Ile9(134)、Gly10(135)、Ser11(136)、Leu12(137)、Ala13(138)、Asn15(140)、Ala16(141)、Phe17(142)、Ser18(143)、Asp19(144)、Pro20(145)、Ala21(142)を含むことが分かり、ここで括弧内の数字は配列番号2において対応する残基を指す(Table 12および13(表13および14))。
得られたパラトープは、配列番号163に対応するFab0100軽鎖の残基His31、Asn33、Tyr37、His39、Tyr54、Phe60、Ser96、Thr97、Val99およびTyr101(Table 12(表13))、ならびに配列番号152に対応するFab0100重鎖の残基Val2、Phe27、Arg31、Tyr32、Trp33、Glu50、Thr57、Asn59、Ser98、Gly99、Val100およびThr102(Table 13(表14))を含んでいた。水素結合に関与するTLT-1エピトープ残基もTable 12および13(表13および14)で示される。
(実施例25)
ペプチドウォークによるエピトープマッピング。
ペプチドウォーキングELISAでペプチドの最小限の結合領域が定義された。これは、ストレプトアビジンプレート中で、TLT-1のストーク領域中に1残基のフレームシフトを有するビオチン化ペプチドを被覆し、その後対象とする抗体(mAb0061)を結合させることによって確立された。検出用二次抗体を添加し、450nmで結合を測定した。陽性対照:ビオチン化TLT-1との結合。
材料
10×PBS:10×GPBS 14200 Gibco
Tween20:Aldrichカタログ番号27,434-8、ロット番号S30950-315
プレート:96ウェルストレプトアビジン被覆プレート、Nunc番号466014
BSA:A7030-100g、ロット番号057K0737
ブロッキング/希釈緩衝液:1×PBS pH=7.4、2%BSA、0.5%Tween20
洗浄緩衝液:1×PBS+0.5%Tween20
標準物質:ビオチン化TLT-1 04/09-08 1mg/ml
mAb:0197-0000-0061-4A-0.55mg/ml
検出Ab:ヤギ抗ヒトIgG HRP標識 1mg/ml、製品番号NEF802001EA
TMB基質:使用準備済、カタログ番号4390L、ロット番号70904
停止溶液:2M H3PO4
ビオチン化TLT-1の希釈:
1mg/ml->6.3ng/ml(158500×希釈)
ウェル中の濃度:0.63ng
ビオチン化ペプチドの希釈:
概算濃度2〜5mg/ml(2.5mg/ml)
2.5mg/ml->10000×希釈(25ng/ウェル):各ウェル中に各ペプチドを100μl。
mAb 0061の希釈
0.55mg/ml->100ng/ml(5500×希釈)
ウェル中の濃度:10ng
mAbヤギ抗ヒトIgG HRPの希釈:
1mg/ml->0.2μg/ml(5000×希釈)
96ウェルフォーマットでのビオチン化ペプチドの合成。
標準的な固相ペプチド合成を使用してビオチン化ペプチドを合成した。N-メチルピロリジノン(NMP)中0.3Mの1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)中0.3MのFmoc保護アミノ酸の溶液を、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して1〜4時間結合させた。96マイクロタイターフィルタープレート(Nunc)中で固体支持体としてRinkアミドLL樹脂(Merck)を使用し、1ウェル当たり約20mgの樹脂を使用した。Intavis、Germanyの Multipep RSペプチド合成機を使用して合成を行い、製造業者のプロトコールを使用した。NMP中25%のピペリジンを使用してFmocの除去を行った。全てのペプチドをN末端でビオチンと結合させ、ビオチンとペプチドの間のスペーサーとして8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸を使用した。合成プロトコール(IRIS biotech、Germany)に従って、Fmoc保護構成単位としてもこのスペーサーを結合させた。
最終的な脱保護およびワークアップ
90%トリフルオロ酢酸(TFA)、5%トリイソプロピルシランおよび5%H2Oを使用して最終的な脱保護を3時間行った。1ウェル当たりに合計1mlのTFAを使用した。TFAを96深型ウェル(Nunc)に濾過し、蒸発によってTFAの体積を1ウェル当たり約100〜200ulに減らし、ペプチドを沈殿させるためにジエチルエーテルを全てのウェルに添加した。ジエチルエーテル中のペプチドの懸濁液をsolvinert 96ウェルフィルタープレート(0.47um、Millipore)に移し、ペプチドをジエチルエーテルで2回洗浄し乾燥させた。ペプチドを80%DMSOおよび20%水中で再溶解して、約1〜3mg/mlのストック溶液が得られた。
TLT-1のストーク領域(SEQ ID NO 6)のビオチン化20merペプチド
75%DMSO/H2O中2〜5mg/ml(N末端でビオチン化):
ペプチドの番号は左に示されている:
hTLT-1のストーク領域(SEQ ID NO 6)のビオチン化16merペプチド
75%DMSO/H2O中2〜5mg/ml:
方法
エピトープマッピングは、TLT-1のストーク領域の2つの系列のビオチン化ペプチドとmAb0061の結合を伴った。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジンプレートと結合させた。
ストークペプチド:
LNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIPL
1)1残基のフレームシフトを有する20merペプチドのマッピング(20,1)(材料を参照)
2)1残基のフレームシフトを有する16merペプチドのマッピング(16,1)(材料を参照)
1. プレートを250μlの洗浄緩衝液で3回予め洗浄した
2. 100μlのビオチン化ペプチド溶液を添加した(マスタープレートから、10000×希釈、1ウェル当たり1つのペプチド)
3. RTで1時間または+5℃で終夜インキュベートした
4. 洗浄緩衝液で3回洗浄した
5. 100μlの一次抗体を添加した(希釈は上記を参照)
6. RTで1時間インキュベートした
7. 洗浄緩衝液で3回洗浄した
8. 100μlの二次抗体を添加した(希釈は上記を参照)
9. RTで1時間インキュベートした
10. 洗浄緩衝液で3回洗浄した
11. 100μlの基質/発色緩衝液を添加した(反応時間3分)
12. 100μlの2M H3PO4を添加した
13. 450nmで終点を読み取った
ウェル中のビオチン化ペプチドとの結合は、450nmでの吸収が3を上回った際に「結合」と記録した。シグナルが1を下回った際に「結合なし」と記録した。中間のシグナルを「弱い結合」と記録した。
結果
ビオチン化ペプチドを以下のようにウェルに入れた:
行A:ペプチド2〜12 (20mer)
行B:ペプチド13〜24 (20mer)
行C:ペプチド25〜27 (20mer)
行C:ペプチド29〜36 (16mer)
行D:ペプチド37〜48 (16mer)
行E:ペプチド49〜58 (16mer)
まとめると、20merペプチド(5〜16)は、アミノ酸:IGSLAENAFに対応する強い陽性シグナル(<3)を引き起こす。16merペプチド36〜42は、KIGSLAENAFに対応する強い陽性シグナル(<3)を引き起こす。
結論
ペプチドウォーキングELISAで、アミノ酸残基の以下のストレッチ:KIGSLAENAFとして、mAb 0061との結合についてのエピトープの最小限の結合区域が定義された。このストレッチは、実際に、結晶構造により上記で定義されたエピトープ:KIGSLANAFSDPAの一部である。
(実施例26)
第VIIa因子ポリペプチドのin vitro加水分解アッセイ。
ネイティブ(野生型)の第VIIa因子および第VIIa因子変異体(両方とも以下で「第VIIa因子」と呼ぶ)を、その比活性を直接比較するために並行してアッセイする。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)中で実施する。発色基質D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288、Chromogenix、Sweden)、終濃度1mMを、0.1M NaCl、5mM CaCl2および1mg/mlウシ血清アルブミンを含む50mM Hepes、pH7.4中で第VIIa因子(終濃度100nM)に添加した。405nmでの吸光度を、SpectraMax(商標)340プレートリーダー(Molecular Devices、USA)で連続的に測定する。酵素を含まないブランクウェルでの吸光度を差し引いた後の、20分間のインキュベーションの間に得られた吸光度を、変異体と野生型第VIIa因子との間の活性の比を計算するために使用する:
比=(A405nm第VIIa因子変異体)/(A405nm第VIIa因子野生型)。
(実施例27)
第VIIa因子ポリペプチドのin vitroタンパク質分解アッセイ。
ネイティブ(野生型)第VIIa因子および第VIIa因子変異体(両方とも以下で「第VIIa因子」と呼ぶ)を、その比活性を直接比較するために並行してアッセイする。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)中で実施する。0.1M NaCl、5mM CaCl2および1mg/mlウシ血清アルブミンを含む100μLの50mM Hepes、pH7.4中で、第VIIa因子(10nM)および第X因子(0.8μM)を15分間インキュベートする。次いで、第X因子切断を、0.1M NaCl、20mM EDTAおよび1mg/mlウシ血清アルブミンを含む50μLの50mM Hepes、pH7.4の添加によって停止させる。生成された第Xa因子の量を、発色基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765、Chromogenix、Sweden)、終濃度0.5mMの添加によって測定する。405nmでの吸光度を、SpectraMax(商標)340プレートリーダー(Molecular Devices、USA)で連続的に測定する。FVIIaを含まないブランクウェルでの吸光度を差し引いた後の、10分間の間に得られた吸光度を、変異体と野生型第VIIa因子との間のタンパク質分解活性の比を計算するために使用する:
比=(A405nm第VIIa因子変異体)/(A405nm第VIIa因子野生型)。
(実施例28)
第VIIIa因子の活性アッセイ:発色アッセイ。
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を、Coatest SP試薬(Chromogenix)を使用して、発色FVIIIアッセイにおいて以下のように評価する:rFVIII試料およびFVIII標準物質(例えば、NIBSCの第7国際FVIII標準物質に対して較正した精製野生型rFVIII)を、Coatestアッセイ緩衝液(50mM Tris、150mM NaCl、1% BSA、pH7.3、保存剤を含む)中に希釈する。50μlの試料、標準物質および緩衝液陰性対照を、96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc)に二連で添加する。Coatest SPキットの第IXa因子/第X因子試薬、リン脂質試薬およびCaCl2を、5:1:3(容量:容量:容量)で混合し、このうち75μlをウェルに添加する。室温で15分間のインキュベーション後、50μlの第Xa因子基質S-2765/トロンビンインヒビターI-2581ミックスを添加し、試薬を室温で10分間インキュベートし、その後25μlの1Mクエン酸、pH3を添加する。415nmでの吸光度を、Spectramaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で測定し、620nmでの吸光度を、参照波長として使用する。陰性対照の値を全ての試料から差し引き、FVIII濃度に対してプロットした吸光度値の線形回帰によって較正曲線を得る。比活性を、HPLCで決定したタンパク質濃度で試料の活性を除算することによって計算する。試料の濃度を、軽鎖に対応するクロマトグラム中のピーク下面積を積分することによって決定し、野生型の未改変rFVIIIの並行分析における同ピークの面積と比較し、この濃度はアミノ酸分析によって決定する。
(実施例29)
第VIIIa因子の活性アッセイ:1段階クロットアッセイ。
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を、1段階FVIIIクロットアッセイにおいて以下のようにさらに評価する:rFVIII試料およびFVIII標準物質(例えば、NIBSCの第7国際FVIII標準物質に対して較正した精製野生型rFVIII)を、HBS/BSA緩衝液(20mM hepes、150mM NaCl、pH7.4、1% BSAを含む)中に希釈しておよそ10U/mlにし、その後VWF(Dade Behring)を含むFVIII欠乏症血漿中に10倍希釈する。試料を、引き続いてHBS/BSA緩衝液中に希釈する。APTT凝固時間を、ACL300RまたはACL5000機器(Instrumentation Laboratory)を使用し、シングルファクター(single factor)プログラムを使用して測定する。VWF(Dade Behring)を含むFVIII欠乏症血漿をアッセイ血漿として使用し、SynthASil(HemosIL(商標)、Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として使用する。クロット機器において、希釈した試料または標準物質を、FVIII欠乏症血漿およびaPTT試薬と37℃で混合する。塩化カルシウムを添加し、クロット形成までの時間を、濁度を測定することによって決定する。試料中のFVIII:Cを、FVIII標準物質の希釈物のクロット形成時間の検量線に基づいて計算する。
(実施例30)
第Xa因子ポリペプチドのin vitroタンパク質分解アッセイ。
予め活性化したネイティブ(野生型)第Xa因子および予め活性化した第Xa因子変異体(両方とも以下で「第Xa因子」と呼ぶ)を、その比活性を直接比較するために並行してアッセイする。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)中で実施する。0.1M NaCl、5mM CaCl2および1mg/mlウシ血清アルブミンを含む100μLの50mM Hepes、pH7.4中で、第Xa因子(10nM)およびプロトロンビン(0.8μM)を、15分間インキュベートする。次いで、プロトロンビン切断を、0.1M NaCl、20mM EDTAおよび1mg/mlウシ血清アルブミンを含む50μLの50mM Hepes、pH7.4の添加によって停止させる。生成されたトロンビンの量を、発色基質H-D-フェニルアラニル-L-ピペコリル-L-Arg-p-ニトロアニリド(S-2738、Chromogenix、Sweden)、終濃度0.5mMの添加によって測定する。405nmでの吸光度を、SpectraMax(商標)340プレートリーダー(Molecular Devices、USA)で連続的に測定する。FXaを含まないブランクウェルでの吸光度を差し引いた後の、10分間の間に得られた吸光度を、変異体と野生型第FXa因子との間のタンパク質分解活性の比を計算するために使用する:
比=(A405nm第Xa因子変異体)/(A405nm第Xa因子野生型)。
(実施例31)
抗TLT-1抗体(断片)と凝固因子との化学的コンジュゲート化。
一般式
の化合物は、例えば2ステップの手順で調製でき、「抗TLT-1 mAb(断片)」は、TLT-1に対する全長サイズのmAbまたは断片もしくは知識によりそこから誘導される類似体であり得、例えば、点突然変異がない、1つまたは複数の点突然変異を有するFAB断片またはsc-FABであるがこれらに限定されず、リンカーは、例えば、PEG、ポリシアル酸またはヒドロキシエチルデンプンなどであるが、これらに限定されない水溶性ポリマーであり得、FVIIaは、任意の保持されたFVIIaの活性を有する、ネイティブFVIIaに対し>50%の配列類似性を有する任意の分子である。
第1のステップの間、2つの異なる反応性基RS1およびRS2を有するリンカーは、抗TLT-1 mAb(断片)に結合することができる。この反応は、RS1だけが抗TLT-1 mAb(断片)の1つまたは数個の位置と反応するように、低い部位選択性でまたは選択的な方法で実施できる。非排他的な例として、RS1はアルデヒドであり得、当業者に知られている還元的アミノ化によって、抗TLT-1 mAb(断片)のN末端とだけ還元的アミノ化によって反応する。別の非排他的な例では、RS1は、抗TLT-1 mAb(断片)上の遊離チオールと反応し得るマレイミド基であり得る。
第2のステップの間、反応性基RS2は、低い部位選択性でまたは部位選択性で、FVIIa分子と反応させてよい。非排他的な例として、RS2が、例えばST3Gal-IIIであるがこれに限定されない適切な酵素の存在下で、シアル酸で排他的に終わることのないN-結合型グリカンと反応できるシアル酸誘導体である場合に、FVIIaにおける部位選択的反応を得ることができる。
リンカーから2つのタンパク質、すなわち抗TLT-1 mAb(断片)およびFVIIa分子への結合の順番は切り替えることができ、それにより、RS1-リンカー-RS2分子を最初にFVIIa分子に結合させ、次いで抗TLT-1 mAb(断片)に結合させる。
(実施例32)
FVIIa-Fab1029の産生のための、FVIIaへの抗TLT-1-FAB断片(Fab0084)のコンジュゲート化。
ステップ1:3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル。
3-マレイミドプロピオン酸(1.0g、5.9mmol)を、テトラヒドロフラン(20ml)中に溶解した。2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート(TSTU、2.14g、7.1mmol)およびエチルジイソプロピルアミン(1.24ml、7.1mmol)を引き続いて添加した。N,N-ジメチルホルムアミド(5ml)を添加した。反応混合物を、緩慢にひっくり返しながら室温で撹拌した。この混合物を2分間撹拌した。N,N-ジメチルホルムアミド(5ml)を添加した。この混合物を室温で2.5時間撹拌した。これをジクロロメタン(150ml)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの10%水性溶液(150ml)、炭酸水素ナトリウムの飽和水性溶液(150ml)および水(150ml)で続けて洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶化して、1.20gの3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルを得た。
MS:m/z=289、[M+Na]+に要する:289
1H-NMR(CDCl3)δ 2.82(m,4H);3.02(t,2H);3.94(t,2H),6.73(s,2H)。
ステップ2:N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(NNC 0129-0000-3259)。
N-((3-(ω-アミノ10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(100mg、0.009mmol)を、テトラヒドロフラン(2ml)およびジクロロメタン(10ml)の混合物中に溶解した。ジクロロメタン中の3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(50mg、0.18mmol)溶液(3ml)を添加した。エチルジイソプロピルアミン(0.005ml、0.028mmol)を添加した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。ジクロロメタン(2ml)およびエチルジイソプロピルアミン(0.5ml)を添加した。アミノメチル化ポリスチレン樹脂(例えばNovabiochemで市販される、0.85mmol/g、438mg、0.372mmolをロードする)を添加した。この混合物を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。樹脂を濾過によって除去した。25℃の浴温度で溶媒を真空中で除去した。残渣をジクロロメタン(4ml)中に溶解した。エーテル(200ml)を添加した。形成された沈殿物を熟成させるために、この混合物を室温で2時間放置した。この沈殿物を濾過によって単離し、真空中で乾燥させて、38mgの表題化合物を得た。DMSO-d6中での1H-NMRスペクトルは、マレイミド基の存在を示した。
ステップ3:N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の、抗TLT-1 FABへの結合。
対形成していないCysが取り込まれたヒンジ領域の一部を有する抗TLT-1 FAB断片のLC-MS分析により、対形成していないCysがシステインでキャップされていることが示された。したがって、N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸との反応の前に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩との反応による、対形成していないCysのキャップ除去を実施しなければならなかった。
pH7.5に調節した、20mM HEPES、5.0mM EDTA、100mM NaClの緩衝液中の、対形成していないCysが取り込まれたヒンジ領域の一部を有する抗TLT-1 FAB断片(1mg)の溶液を、10kDaのカットオフのamicon超遠心デバイス中に置いた。緩衝液を、4000rpmでの反復超遠心によって、pH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールから構成される緩衝液に交換した。緩衝液を交換した後、pH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールから構成される緩衝液中のタンパク質溶液(4ml)を得た。1mg/mlのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液(0.40ml)を添加した。反応混合物を20℃で1時間、300rpmで震盪した。反応混合物を、10kDaのカットオフの超遠心デバイス中に置き、4000rpmで7分間の超遠心によって濃縮し、0.700mlの溶液を残した。これを、pH7.00に調節した25mM HEPESの緩衝液で平衡化したPD-10カラム(Amersham Bioscience)にかけた。pH7.00に調節した25mM HEPESの緩衝液(3.2ml)を使用して、タンパク質をカラムから溶出した。この溶液を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中で、4000rpmで7分間の超遠心によって濃縮し、0.750mlの溶液を得た。この溶液をバイアル中に置き、pH7.00に調節した25mM HEPESの緩衝液(0.360ml)を添加した。N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)-プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の1mg/ml溶液(0.89ml)を添加した。反応混合物を、20℃で3.5時間、300rpmで穏やかに震盪した。これを、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中に置き、4000rpmで10分間の超遠心によって、0.120mlの容量に濃縮した。pH8.00に調節した、25mM TRIS、150mM NaClから構成される緩衝液を溶出剤として使用して、この溶液を、0.50ml/分の流速でSuperose 75 10/300 GLカラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。画分を、クロマトグラムの280nmでのUV痕跡に基づいてプールした。SDS-PAGEで判断される所望の化合物を含み、PEG特異的染色法(Kurfurst、M.M.Analyt.Biochem.1992年、200巻、244〜248頁に記載されている)を使用するSDS-PAGEで判断されるように遊離のPEG試薬を含まないこのプール(0.148mg、1.4ml)を、以下のステップにおいて使用した。
ステップ4:固定化シアリダーゼ。(アガロース上に固定化したC.パーフリンジェンス(C.Perfringens)型VI-A、Sigma:N-5254、0.6〜1.8U/mlゲル、0.180ml)を、水(2×0.50ml)で洗浄し、pH6.1に調節した、25mM MES、20mM CaCl2、100mM NaClの緩衝液(3×0.50ml)で引き続き洗浄した。pH6.0に調節した、25mM Gly-Gly、10mM CaCl2から構成される緩衝液中のFVIIa(0.50mg)溶液を、固定化したシアリダーゼに添加した。反応混合物を、20分毎に注意深く混合しながら、室温に放置した。3時間後、固定化した樹脂を、2000rpmで2分間の遠心分離によって、Pierceスピンカラムを介した濾過によって除去した。
上述のステップにおいて記載される、抗TLT-1 FABへのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合の生成物混合物を、10kDaのカットオフのAmikon超遠心デバイス中に置いた。緩衝液を、反復超遠心によって、pH6.1に調節した、25mM MES、20mM CaCl2、100mM NaClから構成される緩衝液に交換した。
この溶液に、FVIIa誘導体溶液の一部(0.092ml)を添加した。緩衝液を、pH6.1に調節した、25mM MES、20mM CaCl2、100mM NaClから構成される緩衝液に交換し、0.20mlの総容量にした。ST3-Gal-III溶液(0.015ml)を添加した。反応混合物を、32℃で25分間穏やかに震盪し、その後32℃に16時間放置した。pH6.1に調節した、25mM MES、20mM CaCl2、100mM NaClの緩衝液中のCMP-N-アセチルノイラミン酸(CMP NeuNAc、0.70mg、0.070ml)の10mg/ml溶液を添加した。この反応混合物を32℃で15分間穏やかに震盪し、その後32℃で1時間放置した。pH6.1に調節した、10mMヒスチジン、20mM CaCl2、150mM NaClの緩衝液を溶出剤として使用して、この反応混合物を、Superdex 200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)での0.5ml/分の流速のサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。TRIS-アセテートゲルでのSDS-PAGEで判断される所望の生成物を含む画分をプールした。Nandrop(登録商標)装置で280nmで11.22のモル吸光度を使用して、0.022mgの収率が見出された。SDS-PAGE分析の結果は、所望の生成物についての予測と一致した。この生成物をFVIIa-Fab1029と命名した。
(実施例33)
FVIIIへの抗TLT-1-FAB断片(Fab0084)のコンジュゲート化、FVIII-Fab3002。
ステップ1:抗TLT-1 FAB断片へのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合
対形成していないCysが取り込まれたヒンジ領域の一部を有する抗TLT-1 FAB断片のLC-MS分析により、対形成していないCysがシステインでキャップされ得ることが示された。したがって、N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸との反応の前に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)との反応による、対形成していないCysのキャップ除去を実施しなければならなかった。
pH7.5に調節した、20mM HEPES、5mM EDTA、100mM NaClから構成される緩衝液中0.27mg/mlの前記TLT-1-FAB-断片(1.35mg、27.4nmol)の溶液を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中に置いた。これを、20℃で10分間の4000rpmでの超遠心にかけた。pH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールから構成される緩衝液(4ml)を添加した。この混合物を、20℃で8分間の4000rpmでの超遠心にかけた。pH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールから構成される緩衝液(4ml)を添加した。この混合物を、20℃で8分間の4000rpmでの超遠心にかけた。pH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールから構成される緩衝液(3ml)を添加した。この混合物を、20℃で10分間の4000rpmでの超遠心にかけた。この混合物を反応バイアル中に置いた。pH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールから構成される緩衝液(4ml)を添加し、その結果、反応混合物の総容量は、この時点で4.7mlであった。pH7.35に調節した、イミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールの緩衝液中のTCEPの1M溶液(0.54ml)を添加した。この反応混合物を300rpmで1時間震盪した。この混合物を2つの部分に分割し、それぞれを、25mM HEPES、pH7.0の緩衝液で平衡化したPD-10カラム(GE Healthtech)にかけた。溶出物を合わせ(合計7ml)、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中で、20℃で6〜8分間4000rpmでの超遠心によって1mlに濃縮した。
この溶液を反応バイアル中に置いた。pH7.0に調節した25mM HEPESの緩衝液(0.50ml)を添加して、1.5mlの総容量を得た。新たに調製した、pH7.0に調節した25mM HEPESの緩衝液中のN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(1.2ml、1.2mg、109nmol)の1mg/ml溶液を添加した。反応混合物を、20℃で3.2時間、300rpmで穏やかに震盪した。これを、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中での、19℃で11分間の4000rpmでの超遠心によって、0.30mlの容量に濃縮した。これを、pH8.0に調節した、25mM TRIS、150mM NaClの緩衝液を溶出剤として使用して、Superdex 75 10/300 GLカラム(GE Healthtech)での0.50ml/分の流速のサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。N-メチルマレイミド(NEM)の存在下でのSDS-PAGE分析によって判断される許容可能な純度で所望の生成物を含み、PEG感受性染色((Kurfurst、M.M.Analyt.Biochem.1992年、200巻、244〜248頁中に記載されている))と組み合わせたSDS-PAGEで判断されるように未反応のN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸を含まない画分を、以下のステップで使用した。還元条件下でのSDS-PAGE分析は、所望の生成物について予測された結果に従っていた。非元条件下でのSDS-PAGE分析により、抗TLT-1-FAB断片の一方の鎖が失われた物質がいくらか示された。しかし、この知見が分析における問題に起因するか否か、あるいは記載された反応の間またはさらに以前に鎖が本当に失われたか否かは、未解決のままである。Nandrop(登録商標)装置で280nmで10.44のモル吸光度を使用して、0.1mg/mlの濃度が0.287mgの収率を与えることが見出された。
ステップ2:上記実施例に記載された抗TLT-1 FAB断片へのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合の生成物の溶液、およびpH7.35に調節した、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02% Tween80および1Mグリセロールから構成される緩衝液中の重鎖のC末端におけるSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失型FVIII(0.780mg、5.64mmol)の溶液(0.018ml)を混合し、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中に置いた。この溶液を、反復超遠心および緩衝液の添加による、pH6.05に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、20%グリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClへの緩衝液交換にかけた。0.40mlの総容量が得られた。A.ウリファシエンス(A.Urifaciens)由来のシアリダーゼの0.4mg/ml(242U/mg、98U/ml、0.0055ml)溶液およびST3Gal-IIIの2.5mg/ml溶液(0.033ml)を、引き続いて添加した。この反応混合物を、32℃で300rpmで15分間穏やかに震盪し、32℃で2時間放置し、その間これを時折注意深く震盪し、最後に32℃で18時間放置した。この反応混合物を水(0.030ml)で希釈した。これを、Superose 6 10/300 GLカラム(GE Healthcare)を使用し、0.50ml/分の流速で、pH7に調節した、10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01% Tween80、0.3M NaCl、8.8mMスクロースの緩衝液を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。SDS-PAGE分析によって判断される所望の生成物を含む画分をプールした。このプールを、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイスを使用する、pH6.07に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClから構成される緩衝液への緩衝液交換にかけた。0.250mlの総容量が得られた。Nandrop装置で280nmで14.6のモル吸光度を使用して、0.59mg/mlの濃度が見出され、これは0.148mgの収率に対応した。pH6.05に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、20%グリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClの緩衝液中CMP-N-アセチルノイラミン酸(CMP NeuNAc、0.26mg、0.026ml)の10mg/ml溶液、およびST3Gal-III溶液(0.015ml)を添加した。この反応混合物を、32℃で15分間、300rpmで穏やかに震盪し、次いで、32℃で45分間放置した。反応混合物を水(0.10ml)で希釈した。これを、Superose 6 10/300 GLカラム(GE Healthcare)を使用し、0.50ml/分の流速で、pH7に調節した、10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01% Tween80、0.3M NaCl、8.8mMスクロースの緩衝液を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。SDS-PAGE分析によって判断される所望の生成物を含む画分をプールし、Amicon超遠心デバイスでの超遠心によっておよそ0.275mlの総容量に濃縮した。Nandrop(登録商標)装置で、280nmで14.6のモル吸光度を使用して、0.180ml/mlの濃度が見出され、これは0.0495mgの収率に対応した。還元条件下での生成物のSDS-PAGE分析は、所望の生成物についての予測と一致していた。非元条件下でのSDS-PAGE分析により、FAB-断片の一方の鎖が失われた生成物に対応するバンドの量の変化が示される。aに対応するバンドの出現は、生成物中のそのような化合物の存在に起因する可能性があり、またはSDS-PAGE分析前の変性の間の分解に起因する可能性がある。
(実施例34)
TLT-1への結合。
方法:
供給業者が推奨する標準的な手順およびTable 16(表20)中に提供された試薬を使用して、およそ2000RUのレベルまで、TLT-1をCM5チップに直接固定化した(50ug/ml、酢酸Na、pH4.0中に希釈)。20nM〜0.3nMのFVIIa-Fab1029およびFIX-Fab0135の2倍希釈物を、TLT-1への結合について試験した。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM HEPES、150mM、0.005% p20、pH7.4。10mMグリシン、pH1.7によって再生を行った。Biacore T100評価ソフトウェアを使用して、TLT-1とFVIIa-Fab1029またはFIX-Fab0135との1:1相互作用を仮定して、動態学および結合定数(kon、koff、KD)の決定を行った。
結果:
結論:
TLT-1へのFVIIa-Fab1029結合およびFIX-Fab0135結合についての結合定数を、biacore分析によって概算し、TLT-1への結合を確認した(Table 17(表21))。
(実施例35)
FVIIa-Fab1029は、血友病様全血においてフィブリンクロット形成を促進する。
正常HWB(NWB)、「血友病」血、および(0;0.25;0.5;1.0;nM)のFVIIa-Fab1029またはrFVIIaを補充した「血友病」血で得たTEG痕跡を、図11Aに示す。描かれたTEG痕跡について得られたR時間値が図11B中に示される。図11Bでは、FVIIa-Fab1029またはrFVIIaタンパク質についてのR時間値に加えて、rFVIIaの等価な濃度についてのR時間値も含まれる。全てのデータを、1人の代表的なドナーから得る。FVIIa-Fab1029は、血友病様HWBの凝固を効果的に正常化することが観察される。さらに、rFVIIaの既知の凝固促進効果が、TLT-1に対する抗体のFAb断片へのrFVIIaのコンジュゲート化によってさらに強化されることが、結果により示される。したがって、FVIIa-Fab1029タンパク質を用いた実施例は、血小板上のTLT-1へのrFVIIaの標的化が、rFVIIaのFVIIIバイパス活性をさらに強化することを実証している。
(実施例36)
FIX-Fab0135は、FVIIIバイパス活性を有し、血友病A様全血においてフィブリンクロット形成を促進する。
クエン酸安定化ヒト全血(HWB)を、正常ドナーから採取する。クロット形成を、トロンボエラストグラフィー(5000シリーズTEG分析器、Haemoscope Corporation、Niles、IL、USA)によって測定する。血友病A様状態を、10μg/mlの抗FVIII抗体(Sheep anti-Human Factor VIII;Hematologic Technologies Inc)と共に正常なクエン酸安定化ヒト全血(HWB)を室温で30分間インキュベートすることによって得る。種々の濃度(0.1;0.2;1.0;5.0;10nM)のFIX-Fab0135を、血友病A様クエン酸HWBに添加する。340μlの正常HWBまたは予め混合したHWBを、0.03pM脂質付加TF(Innovin(登録商標)、Dade Behring GmbH(Marburg、Germany))を含む20μlの0.2M CaCl2を含有するトロンボエラストグラフカップに移したときに、凝固が開始される。TEG痕跡を最大で120分間連続的に追跡する。正常HWB(HWB)、「血友病」血、および(0.1;0.2;1.0;5.0;10nM)のFIX-Fab0135を補充した「血友病」血で得たTEG痕跡を、図12に示す。FIX-Fab0135を1nM rFVIIaまたは10nM rFIXで置き換えたときに得られたTEG痕跡も、比較のために示される。全てのデータを、1人の代表的なドナーから得る。
驚くべきことに、TLT-1に対する抗体のFAb断片へのFIXの融合が、FVIIIバイパス活性を有するタンパク質を生じることが、結果により示される。FIX-Fab0135は、血友病A様HWBの凝固を効果的に正常化することが観察される。FIX依存的な凝固の伝播は、活性化血小板の表面上でのFIXa/FVIIIa複合体のアセンブリを必要とし、得られたFX活性化(テナーゼ)活性は、阻害FVIII抗体によって防止される。FIX-Fab0135を用いた本実施例は、FVIIIが阻害抗体によって遮断された場合でさえ、血小板表面上のTLT-1へのFIXの標的化が、凝固促進活性を有するFIX含有複合体を生成することを実証している。
(実施例37)
TLT-1濃縮されたリン脂質小胞に標的化されたFIX-Fab0135融合タンパク質は、FVIIIの不在下でFVIIaによって誘導されるFX活性化を顕著に促進する。
方法:実施例20に記載したように調製したTLT-1濃縮リン脂質小胞が、図13中に示される実験において、活性化血小板の表面上のTLT-1を模倣するために適用される。種々の濃度(0.05〜100nM)のrFVIIaを、i)Hepes緩衝液(50mM Hepes、0.1M NaCl、5mM CaCl2、1mg/ml BSA pH7.4)中で、またはii)10nM FIX、iii)10nM FIXaもしくはiv)10nM FIX-Fab0135を含むHepes緩衝液中で、室温で15分間インキュベートする。次いで、これを、5nM FVIIIの不在下または存在下で、100nMのFX(Enzyme Research Laboratories、UK)および1:4,000希釈のTLT-1濃縮リン脂質小胞と混合し、3分間インキュベートする。反応を、等容量の停止緩衝液(50mM Hepes、0.1M NaCl、20mM EDTA、1mg/ml BSA pH7.5)の添加によって停止させる。次いで、試料中の生成されたFXaの量を、50μlの混合物をマイクロタイタープレートウェルに移し、ウェルに25μlのChromozyme X(最終0.42mg/ml)を添加することによって、発色アッセイで決定する。405nmでの吸光度を、マイクロプレートSpectramax光度計(Molecular Devices、Sunnyvale CA、USA)中で連続的に測定する。
FVIIaは、FIXを活性化でき(OsterudおよびRappaport、1977年)、次いで、得られたFIXaは、FVIIIaと合わせ、いわゆるテナーゼ複合体のタンパク質分解性構成成分を形成すると指定した。この複合体の形成は、活性化血小板の表面上で生じる。テナーゼ複合体は、凝固プロセスの伝播期において重要な役割を果たす大量のFX活性化を担っている。活性なテナーゼ複合体を形成できないことは、血友病A患者および血友病B患者の両方において、中心的な素因である。
本実施例では、TLT-1濃縮リン脂質小胞は、活性化血小板の表面を模倣するために適用する。この系を、FIX-Fab0135によるそのような小胞上のTLT-1へのFIXの標的化が、活性化血小板上のテナーゼ複合体と同様にFX活性化を促進できるか否かを試験するために使用する。さらにこれは、FVIIIの存在がこの活性に必須であるか否かを試験するのに興味がもたれる。
図13は以下であることを示す:1)FIX誘導体を添加していない実験条件下で5nMのFVIIIの不在下および存在下で試験した全てのFVIIa濃度では、FXaはほとんど生成されない(○);2)これは、10nMのFIXが反応混合物中に存在する場合にもあてはまる(□);3)著名なFX活性化は、10nMのFIXを10nMのFIXaで置き換えた場合に観察されるが、FVIIIの存在下に限られる(■);4)FIX-Fab0135によるTLT-1濃縮リン脂質小胞へのFIXの標的化は、濃度依存的様式でFVIIaによって活性化される複合体を提供する;5)得られた活性化テナーゼ様複合体は、FVIIIの存在下および不在下の両方で、FX活性化を顕著に促進する。
これらの結果ならびに実施例36の結果は、TLT-1に標的化されたFIXのFVIIa活性化およびかなりのFVIII非依存性テナーゼ様活性を有する複合体の形成を含む機構によるFVIIa媒介性のFXa活性化を顕著に促進するFVIIIバイパス剤を、FIX-Fab0135FIX融合タンパク質が提供することを示唆している。
(実施例38)
ヒト血小板上でのTLT-1発現。
TLT-1は、活性化血小板上にのみ発現することが報告されている(Washingtonら(2004年)Blood.2004年8月15日;104巻(4号):1042〜7頁)。これを検証し、血小板表面上のTLT-1の具体的なコピー数を概算するために、本発明者らは、血小板が特異的モノクローナル抗体による洗浄なしの間接的免疫蛍光によって染色され、定量的フローサイトメトリーによって分析される、Biocytex(Marseille、France)の「血小板キャリブレーターキット」を使用した。試験した抗原の発現レベルを、検出抗体に対する明確な数の結合部位を有する較正ビーズを使用して決定する。製造業者の指示に従って、クエン酸ヒト全血中の血小板を、異なる濃度(0.3〜30μM)のアミノ酸配列SFLLRNを有するプロテアーゼ活性化受容体(PAR)-1活性化ペプチドによって活性化した。これらの試料を、TLT-1結合抗体で標識する前にキット中に提供された生理食塩水緩衝液中に1:4希釈した。使用したTLT-1結合抗体は、mAb0123(mAb0023抗体のIgG1サブタイプ)またはmAb0136(mAb0012抗体のIgG1サブタイプ)のいずれかであった。いずれかのTLT-1抗体(10μg/ml)との15分間のインキュベーションと、その後のFITC標識した検出抗体(製造業者により提供された)との15分間のインキュベーションの後に、試料を、フローサイトメトリー分析の直前に1:50希釈した。血小板表面上のTLT-1の絶対数を、ビーズ由来の検量線を使用して得た。
活性化されていない血小板は、使用した2つの抗体のいずれでも、TLT-1の発現を示さない。しかし、血小板をSFLLRNで活性化した場合、それぞれmAb0123およびmAb0136によって検出された9685±1696および12981±2083の最大発現の表面分子で、TLT-1発現の増加が観察された(図14)。最大血小板TLT-1発現を、SFLLRN(30μM)およびコンブルキシン(100ng/ml)による二重刺激によって達成した。
(実施例39)
3kDaのPEGリンカーを介した、FVIIaへの抗TLT-1-FAB断片(Fab0084)のコンジュゲート化、FVIIa-Fab1001。
ステップ1:N-((3-(ω-(フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸
3-(ω-(フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオン酸 ピロリジン-2,5-ジオン-1-イルエステル(Rapp Polymere GmbHで購入、1g、0.292mmol)を、テトラヒドロフラン(80ml)中に溶解した。pH8.9に調節した50mM TRISから構成される緩衝液(20ml)中のシチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸二ナトリウム塩(0.276g、0.438mmol)溶液を添加した。この反応混合物を室温で16時間撹拌した。25℃の浴温度でTHFを真空中で除去した。残りの混合物を、水で希釈して60mlにし、0.45μmフィルターを介して濾過した。この溶液を3つの部分に分割し、これらをそれぞれ、20ml/分の流速および50mM炭酸水素アンモニウムの水性緩衝液中0〜60%のアセトニトリル勾配を使用して、50mM炭酸水素アンモニウムの水性緩衝液で10分間洗浄した後で50分間にわたって、C4カラムでのHPLCクロマトグラフィーにかけた。シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸を有さず、最大吸収の15〜20%よりも大きい214nmでの吸収を有する画分を合わせた。合わせた画分をフリーズドライして、532mgのN-((3-(ω-(フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸を得た。1H-NMRスペクトルは予測と一致した。
ステップ2:N-((3-(ω-アミノ3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸
N-((3-(ω-(フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(532mg、0.135mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(9ml)中に溶解した。ピペリジン(2.25ml)を添加した。この反応混合物を室温で20分間撹拌した。エーテル(150ml)を添加した。この混合物を室温で1時間放置した。形成した沈殿物を、デカンテーションおよび遠心分離によって単離した。これをジクロロメタン(10ml)中に溶解した。エチルジイソプロピルアミン(2.4ml)を添加した。この混合物を2分間撹拌した。エーテル(150ml)を添加した。沈殿物を熟成させるために、この混合物を1.5時間放置した。沈殿物をデカンテーションおよび濾過によって単離した。これを、25℃の浴温度で、真空中で乾燥させて、343mgのN-((3-(ω-アミノ3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸を得た。1H-NMRは予測と一致した。
ステップ3:N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(NNC 0129-0000-3259)
N-((3-(ω-アミノ3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(343mg、0.009mmol)を、ジクロロメタンの混合物(15ml)中に溶解した。エチルジイソプロピルアミン(0.05ml、0.028mmol)を添加した。3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(492mg、1.85mmol)を固体として添加した。反応混合物を、室温で16時間撹拌した。ジクロロメタン(140ml)を添加した。アミノメチル化ポリスチレン樹脂(例えばNovabiochemで市販される、0.85mmol/g、4.3g、3.69mmolをロードする)を添加した。この混合物を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。樹脂を濾過によって除去した。25℃の浴温度で溶媒を真空中で除去した。Amberlyst 15樹脂(2g)を添加した。この反応混合物を、20分間ゆっくりと撹拌した。樹脂を濾過によって除去した。25℃の浴温度で溶媒を真空中で除去した。残渣をジクロロメタン(10ml)中に溶解した。エーテル(200ml)を添加した。形成された沈殿物を熟成させるために、この混合物を室温で6時間放置した。沈殿物をデカンテーションおよび遠心分離によって単離した。これを真空中で乾燥させて、180mgの表題化合物を得た。DMSO-d6中での1H-NMRスペクトルは、マレイミド基の存在を示した。
ステップ4: 抗TLT-1 FABへのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合
対形成していないCysが取り込まれたヒンジ領域の一部を有する抗TLT-1 FAB断片(10mg)のリン酸緩衝液中溶液を、10kDaのカットオフのamicon超遠心デバイス中に置いた。緩衝液を、4000rpmでの反復超遠心によって、pH7.3に調節した100mM HEPESから構成される緩衝液に交換した。緩衝液を交換した後、pH7.3に調節した100mM HEPESから構成される緩衝液中のタンパク質溶液(36ml)が得られた。トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩の1mg/ml溶液(4ml)を添加した。この反応混合物を、300rrpmで、20℃で15分間震盪し、20℃で45分間放置した。この反応混合物を、10kDaのカットオフの超遠心デバイス中に置いた。緩衝液を、4000rpmでの反復超遠心によって、pH7.0に調節した25mM HEPESから構成される緩衝液に交換し、13.2mlの溶液を得た。N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の1mg/ml溶液(6.4ml)を添加した。この反応混合物を300rpmで、20℃で15分間穏やかに震盪し、20℃で16時間放置した。これを、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中に置き、4000rpmで10分間の超遠心によって、<5mlの容量に濃縮した。pH8.00に調節した、25mM TRIS、150mM NaClから構成される緩衝液を溶出剤として使用して、この溶液を、1ml/分の流速でSuperose 75 16/60 GLカラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。画分を、クロマトグラムの280nmでのUV痕跡に基づいてプールした。SDS-PAGEで判断される所望の化合物を含み、PEG特異的染色法(Kurfurst、M.M.Analyt.Biochem.1992年、200巻、244〜248頁に記載されている)を使用するSDS-PAGEで判断される遊離のPEG試薬を含まないこのプール(9.9mg、13.7ml)を、以下のステップにおいて使用した。
ステップ5:固定化シアリダーゼ(アガロース上に固定化したC.パーフリンジェンス型VI-A、Sigma:N-5254、0.6〜1.8U/mlゲル、1.52ml)を、水(3×9ml)で洗浄し、引き続き、pH7.5に調節した、20mM HEPES、10mM CaCl2、0.005% Tween80、100mM NaClの緩衝液(3×9ml)で洗浄した。pH6.0に調節した、25mM Gly-Gly、10mM CaCl2から構成される緩衝液(6.59ml)中のFVIIa(8.9mg)溶液を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中に置いた。緩衝液を、4000rpmでの反復遠心分離によって、pH7.5に調節した、20mM HEPES、10mM CaCl2、0.005% Tween80、100mM NaClの緩衝液に交換して、6.5mlの最終容量を得た。この溶液を固定化シアリダーゼに添加した。この反応混合物を室温で3.5時間回転させた。
pH8.00に調節した、25mM TRIS、150mM NaClからなる緩衝液(13.5ml)中の、上述のステップにおいて記載したように得た、抗TLT-1 FABへのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)3kDa PEGイル)プロピオニルアミノ)アセチル)-02-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合の生成物(10mg)を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心デバイス中に置いた。pH6.0に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、20%グリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClから構成される緩衝液を添加した。4000rpmで2分間の超遠心にかけた。pH6.0に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、20%グリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClから構成される緩衝液の別の部分を添加した。4000rpmで10分間の超遠心にかけた。固定化シアリダーゼとの反応の反応性生物を添加し、濾過によって固定化シアリダーゼを除去した。pH6.0に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、20%グリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClから構成される緩衝液の別の部分を添加した。4000rpmで10分間の超遠心にかけて、9mlの総容量を得た。ST3Gal-III溶液(500μl)を添加した。この反応混合物を、32℃で15分間穏やかに震盪し、その後、32℃で16時間放置した。pH6.0に調節した、20mMヒスチジン、10mM CaCl2、20%グリセロール、0.02% Tween 80、500mM NaClの緩衝液中のCMP-N-アセチルノイラミン酸(CMP NeuNAc、0.70mg、0.89ml)の10mg/ml溶液を添加した。この反応混合物を、32℃で15分間穏やかに震盪し、その後、32℃で1時間放置した。pH6に調節した、10mMヒスチジン、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、200mM NaClの緩衝液を溶出剤として使用して、この反応混合物を、2ml/分の流速でSuperdex 200 26/60 GLカラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。TRIS-アセテートゲルでのSDS-PAGEによって判断される所望の生成物を含む画分をプールした。Nandrop(登録商標)装置で280nmで12.86のモル吸光度を使用して、3.2mgの収率が見出された。SDS-PAGE分析の結果は、所望の生成物についての予測と一致した。
(実施例40)
3kDaのPEGリンカーを介したFVIIa 407Cへの抗TLT-1-FAB断片(Fab0084)のコンジュゲート化、FVIIa-Fab9015。
20mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中のFVIIa 407C(5mg、0.55mg/ml、9ml)を、グルタチオン(還元型、40mM、125マイクロリットル、HEPES緩衝液中)、グルタチオン(酸化型、1.6mM、125マイクロリットル、HEPES緩衝液中)、パラ-アミノベンズアミジン(0.5M、500マイクロリットル、HEPES緩衝液中)およびグルタレドキシン(Grx2、EC 1.20.4.1、96マイクロモル濃度、200マイクロリットル)の溶液と混合した。容量を10.0mlに調節し、pHは7.0であった。
得られた混合物を、摂氏32℃で5時間インキュベートした。
水中のEDTA(800マイクロリットル、0.25M、pH7.0)を添加した。伝導率が8.3mS/cm(20ml)に低下するまで、この溶液を脱塩水で希釈した。
この溶液を、予め条件調整したHiTrap Q FFカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:50mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA、0.01% Tween-80、pH7.0。
緩衝液B:50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween-80、pH7.0。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。タンパク質を、緩衝液B(10CV)を用いて2ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
7つの画分をプールした。合わせたプール中のタンパク質濃度を、0.49mg/ml(吸光度280nm)、容量7.5ml、3.8mgのFVIIa(77.6nmol)と推定した。
20mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中のビス-マレイミドポリエチレングリコールリンカー(3kDa、Rapp Polymere Gmbh、Tubingen、Germany、製品番号11300-45、ロット番号1210.764、70mg、23マイクロモル)溶液(3.5ml)を添加した。得られた混合物を、室温で1時間インキュベートした。
水中のEDTA溶液(250mM、900マイクロリットル)をこの混合物に添加した。pHを7.0に調節した。伝導率が8.3mS/cmになり、17mlの容量に達するまで、得られた混合物を水で希釈した。
この溶液を、予め条件調整したHiTrap Q FFカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:50mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA、0.01% Tween-80、pH7.0。
緩衝液B:50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween-80、pH7.0。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。このタンパク質を、緩衝液B(10CV)を用いて2ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
対象とする画分をプールして、12mlの総容量を得た。タンパク質濃度を測定したところ(280nmでの吸光度)、0.30mg/mlであり、合計3.6mgのタンパク質であった。
HEPES緩衝液(20mM HEPES、1.0mM CaCl2、100mM NaCl、0.005%(v/v)Tween-80、pH7.5)中の抗体断片、Fabタンパク質ID 0084(6.7mg、3.21mg/ml)の溶液を、トリス(3-スルホナトフェニル)ホスフィン水和ナトリウム塩(工業グレード85%純粋、10mg/ml、5ml、同じ緩衝液)の溶液と混合した。得られた混合物を、室温で2時間インキュベートした。この混合物を、Amicon Ultracentrifugalフィルターデバイス(Millipore corp.、MWCO 10kDa)中に置き、緩衝液を、緩衝液(20mM HEPES、1.0mM CaCl2、100mM NaCl、0.005%(v/v)Tween-80、pH7.5)の反復添加によって交換し、その後遠心分離した。
緩衝液交換した抗体断片の試料を、リンカーコンジュゲート化FVIIa試料と混合し、得られた溶液を、緩衝液(50mM HEPES、100mM NaCl、35mM CaCl2、50mMベンズアミジン、0.01% Tween-80、pH7.5)へと緩衝液交換し、引き続いて7mlに濃縮した。この混合物を、室温で一晩インキュベートした。得られた混合物を、SDS-PAGEゲル電気泳動を使用して分析した。
pHが7.2になり、測定された伝導率が11.0mS/cmになり、総容量:21mlになるまで、水(8.5ml)、EDTA溶液(5.5ml、0.25M)および水酸化ナトリウム(1M)をこの混合物に添加した。
この溶液を、予め条件調整したHiTrap Q FFカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:50mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA、0.01% Tween-80、pH 7.0。
緩衝液B:50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween-80、pH7.0。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。タンパク質を、緩衝液B(10CV)を用いて2ml/分で溶出した。選択した画分を、Amicon Ultracentrifugalフィルターデバイス(Millipore corp.、MWCO 10kDa)で濃縮し、緩衝液を、緩衝液(20mM HEPES、1.0mM CaCl2、100mM NaCl、0.005%(v/v)Tween-80、pH7.5)の反復添加によって交換し、その後遠心分離した。濃縮した試料(5ml)を、予め条件調整したSuperdex Hiload 16/60カラム(GE Healthcare、適用した緩衝液で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液:10mM L-ヒスチジン、10mM CaCl2、100mM NaCl、0.01% Tween80、pH6.0。
タンパク質を、0.8ml/分の流速で2CVでの溶出によって精製した。
画分を、SDS PAGEゲル電気泳動(4〜12% Bis-Trisアセテート、MESランニング緩衝液)による分析に基づいて選択した。
選択した画分のプールを、Amicon Ultracentrifugalフィルターデバイス(Millipore corp.、MWCO 10kDa)を使用して総容量:2.25mlに濃縮した。タンパク質の量を測定したところ(吸光度280nm)、1.2mg(タンパク質コンジュゲート)であった。
SDS PAGEゲル電気泳動(4〜12% Bis-Trisアセテート)および以下に対する(HPC4)ウエスタンブロッティングによる分析:
1.一次-ProteinC-tag抗体(HPC4)pAb、ウサギ、カタログ番号:A00637(40ug)を、80ulのmilliQ水で溶解して、0.5mg/mlの濃度にした。ブロットの間1:1000希釈。
2.二次-ヤギ抗ウサギIgG抗体(H&L)(HRP)、pAb、カタログ番号A00098、ロット番号11B000259。ブロットの間1:1000希釈。
(実施例41)
2-[2-[4-[2-(3-ヒドロキシ-6-オキソ-キサンテン-9-イル)ベンゾイル]ピペラジン-1-イル]-2-オキソ-エトキシ]酢酸の合成。
6-ヒドロキシ-9-[2-(ピペラジン-4-イウム-1-カルボニル)フェニル]キサンテン-3-オン(Changら、J.Am.Chem.Soc.、2007年、129巻、8400頁に記載されるように調製したもの)を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50ml)およびテトラヒドロフラン(50ml)の混合物中に懸濁した。この混合物を10分間撹拌した。ジグリコール酸無水物を添加した。3時間後、さらなるジグリコール酸無水物(500mg)を添加した。この混合物を20時間撹拌した。この混合物を、発煙塩酸を用いてpH1に酸性化した。ジクロロメタン(100ml)および塩酸(1M、100ml)を添加した。ブライン(100ml)および固体塩化ナトリウムを添加した。多量の固体が観察された。この固体を濾過によって単離し、水で洗浄し、数日間真空中で乾燥させた。LC-MS:517.1641[M+H]+。
(実施例42)
蛍光シチジル一リン酸ノイラミン酸誘導体、(2R,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソ-ピリミジン-1-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-ヒドロキシ-ホスホリル]オキシ-4-ヒドロキシ-5-[[2-[[5-[2-[2-[[2-[2-[4-[2-(3-ヒドロキシ-6-オキソ-キサンテン-9-イル)ベンゾイル]ピペラジン-1-イル]-2-オキソ-エトキシ]アセチル]アミノ]エチルジスルファニル]エチルアミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]アセチル]アミノ]-6-[(2R)-1,2,3-トリヒドロキシプロピル]テトラヒドロピラン-2-カルボン酸の合成。
システアミン二塩酸塩を、1M NaOH(水溶液)50ml中に溶解した。この溶液を、DCM(5×30ml)で抽出した。合わせた有機相を乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、真空中で濃縮した。
このジアミンを、アセトニトリル(30ml)中に溶解した。アセトニトリル中の無水物溶液(30ml)を、この溶液に滴下した。得られた混合物を15分間撹拌した。形成した固体を、1時間静置させた。溶媒をデカントして除いた。
2-[2-[4-[2-(3-ヒドロキシ-6-オキソ-キサンテン-9-イル)ベンゾイル]ピペラジン-1-イル]-2-オキソ-エトキシ]酢酸、OxymaおよびDICを、DMF(25ml)中に混合した。この混合物を1時間撹拌した。
形成したアミノ酸を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(25ml)中に溶解した。得られた混合物を一晩撹拌した。DCM(50ml)および水酸化ナトリウム水溶液(50ml)を添加した。相分離した。有機相を水酸化ナトリウム水溶液(3×50ml)で抽出した。合わせた水性抽出物を、塩酸(発煙)の添加によって酸性化し、大規模な沈殿を引き起こした。この混合物を濾過した。単離したスラリーをDMF中に再溶解し、真空中で濃縮した。
粗い単離化合物およびOxymaを、DMF(20ml)中に溶解した。DIC(1.5ml)を添加した。この混合物を2時間撹拌した。炭酸水素ナトリウム飽和水溶液中のGSC溶液(10ml)を添加した。この混合物を一晩撹拌した。DCM(50ml)を添加した。相分離した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2×5ml)で抽出した。合わせた水性相を、逆相HPLC(水中0〜50%のMeCN、50mM NH4HCO3、5cmカラム)を使用して精製した。LC-MS:688.6752[M+H]2+。分析HPLCおよびLC-MSにより、この化合物が純粋でないことが示された。しかし、これをそのまま使用した。
(実施例43)
FVIIIへの抗TLT-1-FAB断片(Fab0084)のコンジュゲート化、FVIII-Fab0247。
(0084)
イミダゾール緩衝液(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0、02% Tween 80、150mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)中のBドメイン欠失型第VIII因子(turoctocoq alpha、Novo Nordisk A/S、1.92ml、4.2mg/ml)およびシアリダーゼ(組換え、アルスロバクター・ウレファシエンス(Arthrobactor Ureafaciens)シアリダーゼ、3.2U)を混合し、周囲温度で1時間放置した。この試料を、緩衝液で25mlに希釈した。
この溶液を、予め条件調整したmonoQカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
緩衝液B:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。このタンパク質を、緩衝液Bの勾配(2CV当量+未結合の試料を5回洗浄+2CVの0〜20% B+10CVの20% B+10CVの100% B)を用いて、1ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
単離されたN,O-アシアロBDD-FVIII(0.98mg/ml、5mg)を、蛍光シチジル一リン酸ノイラミン酸誘導体および組換えシアリルトランスフェラーゼ(His-ST3Gal1)と混合した。得られた混合物を、室温で暗中一晩インキュベートした。
この試料を、緩衝液A:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3で40mlに希釈した。
この溶液を、予め条件調整したmonoQカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
緩衝液B:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。このタンパク質を、緩衝液Bの勾配(2CV当量+未結合の試料を5回洗浄+2CVの0〜20% B+10CVの20% B+10CVの100% B)を用いて、1ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
選択した画分をプールし、シチジル一リン酸N-アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラーゼ(ST3GalIII)と共に30分間インキュベートした。この混合物を緩衝液Aで35mlに希釈した。
この溶液を、予め条件調整したmonoQカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
緩衝液B:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。このタンパク質を、緩衝液Bの勾配(2CV当量+未結合の試料を5回洗浄+2CVの0〜20% B+10CVの20% B+10CVの100% B)を用いて、1ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
選択した画分をプールし、SDS PAGEゲル電気泳動(4〜12% Bis-Trisアセテート、還元および非還元)によって溶出した。
単離した画分を、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン、TCEP(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3、0.7mM TCEP)を含む緩衝液(15ml)と混合した。得られた混合物を20分間インキュベートした。この溶液を、予め条件調整したmonoQカラム(5/50GL、TCEPを含む緩衝液Aで予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A1:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3、0.7mM TCEP。
緩衝液A2:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
緩衝液B1:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
A1で10CV当量、A1で未結合の試料を5回洗浄、100% A1で30CV、100% A2で10CV、15CVの100% B1。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A1(45CV)で洗浄し、その後緩衝液A2(10CV)で洗浄した。このタンパク質を緩衝液B(15CVの100% B)を用いて1ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
選択した画分をプールし、SDS-PAGE(Tris-アセテート)で分析した。
単離した第VIII因子化合物を、緩衝液Aで希釈し、予め条件調整したmonoQカラム(5/50GL、緩衝液Aで予め条件調整した)上に注入した。
4.8mMのBM(PEG)2(1,8-ビスマレイミドジエチレングリコール、Pierce/Thermo scientific)を含む緩衝液Aの流れを、100分間維持した。タンパク質を洗浄し、以下のプロトコルを使用して溶出した:10CVのA1、0.25ml/分(100分)で緩衝液A2で25CV(ビスマレイミド)、10CVの緩衝液A1、10CVの100% B1。
抗TLT-1抗体断片0084を、Amicon UltracentrifugalフィルターデバイスMWCO 30kDaを使用して、HEPES緩衝液(20mM HEPES+1mM CaCl2、100mM NaCl+0.005% Tween80、pH:7.50)に緩衝液交換した。測定した濃度:3.44mg/ml、2mg:トリス(3-スルホナトフェニル)ホスフィン水和ナトリウム塩(Alfa Aesar、工業グレード85%)を添加し、得られた濃度は12.5mMであった。得られた混合物を室温で2時間インキュベートした。抗体断片を、Amicon UltracentrifugalフィルターデバイスMWCO 30kDaを使用してイミダゾール緩衝液(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)へと緩衝液交換した。
第VIII因子および抗体断片の溶液を混合し、2mlに濃縮した。得られた溶液を、室温で一晩インキュベートした。
この溶液を、予め条件調整したmonoQカラム(緩衝液A、5mlカラム容で予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
緩衝液B:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3。
固定化タンパク質を、Akta清浄器100クロマトグラフィーステーションを使用して、緩衝液A(5CV)で洗浄した。このタンパク質を、緩衝液Bの勾配(2CV当量+未結合の試料を5回洗浄+2CVの0〜20% B+10CVの20% B+10CVの100% B)を用いて、1ml/分で溶出した。対象とするタンパク質の溶出を、280nmで吸光度をモニタリングすることによって行った。
選択した画分をプールし、濃縮した。このタンパク質を、予め条件調整したSuperdex 200 16/60 PGカラム(緩衝液Aで予め条件調整した)上に注入した。
緩衝液A:ヒスチジン(1.5g、1.5mg/ml)、CaCl2*H2O(376mg、0.37mg/ml)、NaCl(18g、18mg/ml)、スクロース(3g、3mg/ml)、Tween 80(100mg、0.1mg/ml)、MQで1000mlに希釈、pH7.0に調節。
画分を、SDS-PAGEおよび抗HPC4ウエスタンブロッティングによる分析に基づいて選択した。
(実施例44)
抗TLT-1-FAB断片(Fab0084)のFIXへのコンジュゲート化。
第IX因子(50マイクロリットル)、シアリルトランスフェラーゼ3(10マイクロリットル)、蛍光シチジル一リン酸ノイラミン酸誘導体;スパチュラの先端)を混合する。この混合物を、摂氏32℃で24時間インキュベートする。
最終濃度は以下である:第IX因子:0.33mg/ml、ST3Ga13:0.08mg/ml
SDS-PAGEによる分析(蛍光応答およびクマシーブルー染色)。
第IX因子および抗体断片を、本明細書中に記載される方法、すなわち、ホスフィンまたはグルタチオンによって媒介される還元、リンカー実体へのカップリング、ならびにコンジュゲート化とその後の精製および分析を使用して、コンジュゲート化する。
(実施例45)
FVIIa-Fab9015は、一過性血友病マウスにおける尾出血を低下させることにおいて、rFVIIaより優れている。
ヒト化TLT-1ノックアウト/ノックイン(KOKI)マウスを、モノクローナルFVIII抗体の投与によって一過性血友病性にした。尾出血の誘導の5分前に、マウスを、20、5もしくは0.8nmol/kgのFVIIa-Fab9015(3.625ml/kg)、20nmol/kgのrFVIIaまたはビヒクルで予め処置した。尾出血を、尾の先端から4mmでの切断によって誘導し、生じた出血を30分間観察した。血小板計数を最初に取得し、尾出血の誘導の30、60および120分後に取得した。
FVIIa-Fab9015の優位性を示すことができるように、本発明者らは、出血に対して顕著な影響を有すると予測されていないrFVIIaの用量(20nmol/kg〜1mg/kg)を使用した。
TLT-1-FAb-FVIIaは、用量依存的に血液喪失および出血時間を低下させ、20および5nmol/kgで統計的有意に達した。さらに、20nmol/kgのFVIIa-Fab9015は、20nmol/kgのrFVIIaと比較して、有意により有効であった(図15)。
血小板計数における有意な変化は、任意の処置群において、処置の2時間以内には観察されなかった(図16)。
結論として、FVIIa-Fab9015は、TLT-1 KOKIマウスにおける血友病性尾出血を低下させることにおいて、rFVIIaよりも優れていた。血小板計数の減少などの有害な影響の徴候は観察されなかった。
(実施例46)
血友病A様状態下で表面発現したTLT-1への結合を介した、活性化血小板の表面へのrFVIIaの局在化による、トロンビン生成の亢進。
FVIIa-Fab9015を、トロンビン生成アッセイで試験した。簡潔に述べると、ヒト多血小板血漿(PRP)を、220gで20分間のクエン酸ヒト全血の遠心分離によって得た。血小板を含む上相を収集し、残りの試料を2500gで10分間遠心分離して少血小板血漿(PPP)を得、これを使用して血小板濃度を150000plts/μlの終濃度で使用するように調整した。PRPを、ヒツジ抗ヒトFVIIIポリクローナル抗体(0.1mg/ml)(HTI #Z0429)との30分間のインキュベーションによって血友病性にした。血小板を、プロテアーゼ活性化受容体-1活性化ペプチド(SFLLRN;Bachem #H-2936)、またはこのペプチドおよびGPVI活性化ヘビ毒コンブルキシン(Pentapharm #119-02)の組合せのいずれかを用いて、活性化した。生成したトロンビンを、Thrombinoscope(登録商標)の蛍光発生法を使用して測定した。PRP、FluCa試薬および化合物を混合し、96ウェルのNunc Microwell丸底ウェルプレートに添加した。反応を、血小板アクチベータの添加によって開始させ、基質からの蛍光シグナルを、ThermoFisher Fluoroskanプレートリーダー(Fisher Scientific)で検出した。トロンビン濃度を、Thrombinoscopeによって提供されるトロンビンキャリブレーターを指示に従って使用して計算した。
この結果により、rFVIIaと比較したFVIIa-Fab9015の能力の増加が示された(図17A)。さらに、この結果により、能力のこの増加が、血小板の活性化段階に依存することが明らかになった。図18は、血小板をSFLLRN(10μM)で活性化した場合にトロンビン生成能の増加を示し、血小板をSFLLRN(30μM)およびコンブルキシン(100ng/ml)の組合せで活性化したときに完全な潜在力に到達したことを示している。アクチベータのこの組合せによって血小板を活性化した場合、FVIIa-Fab9015は、試験した2つの濃度(5および25nM)のrFVIIaと比較して、ピークトロンビン生成として測定されるおよそ4倍の能力増加を示した(それぞれ図17Aおよび17B)。可溶性TLT-1との予めのインキュベーションは、亢進を完全に逆転させたので、トロンビン生成能のこの増加は、活性化血小板の表面上のTLT-1へのFVIIa-Fab9015結合に完全に依存していた(図19)。
(実施例47)
血友病B様状態下で表面発現したTLT-1への結合を介した、活性化血小板の表面へのrFIXの局在化による、トロンビン生成の亢進。
FIX-Fab0155を、トロンビン生成アッセイで試験し、rFIX(Benefix(登録商標))と比較した。ヒト血小板を、新鮮なクエン酸安定化全血から単離した。1部のACD溶液(2.5%クエン酸三ナトリウム、1.5%クエン酸および2% D-グルコース)を、5部の血液に添加し、その後、220gで20分間遠心分離して、多血小板血漿を得た。上相を収集し、新しい円錐形チューブに移し、500gで15分間遠心した。血漿を除去し、ペレットを、プロスタグランジンEl(5pg/ml)を補充したHepes-緩衝液(10mM Hepes、137mM NaCl、2.7mM KCL、1.7mM MgCl2、5mM D-グルコース、0.4mM NaH2PO4;pH6.5)中に溶解した。500gで15分間の2回目の遠心分離後、上清を廃棄し、洗浄した血小板を、第IX因子欠乏症血漿(Geroge King Bio-medical,Inc.)中に溶解し、血小板濃度を300000plts/μlに調整した。トロンビン生成アッセイにおいて、アゴニスト、第IX因子変異体およびFluCa試薬(Thrombinoscope(登録商標))を、血小板を含む第IX因子欠乏症血漿と一緒に96ウェルのNunc Microwell丸底ウェルプレートに添加した場合に、血小板終濃度を150000plts/μlに調整した。プロテアーゼ活性化受容体-1活性化ペプチド(SFLLRN;Bachem #H-2936)およびGPVI活性化ヘビ毒コンブルキシン(Pentapharm #119-02)の組合せによって、血小板を活性化した。トロンビン切断された基質からの蛍光シグナルをThermoFisher Fluoroskanプレートリーダー(Fisher Scientific)で検出する、Thrombinoscope(登録商標)の蛍光発生法によって、生成されたトロンビンを測定した。トロンビン濃度を、Thrombinoscope(登録商標)により提供されるトロンビンキャリブレーターを指示に従って使用して計算した。
この結果により、血小板をSFLLRN(30μM)およびコンブルキシン(100ng/ml)の組合せで活性化した場合に、rFIXと比較して、1nMのFIX-Fab0155で能力の増加が示された(図20)。さらに、可溶性TLT-1(100nM)が亢進した効果を拮抗したので、この結果により、能力のこの増加が、血小板上のTLT-1の発現に依存することが明らかになった。
(実施例48)
野生型FVIIa(配列番号156)、FVIIa 407C(配列番号181)およびFVIIa-Fab5001(配列番号180)の精製および特徴付け。
FVIIaタンパク質の精製を、抗FVIIa F1A2-Sepharose 4B樹脂に基づく捕捉アフィニティークロマトグラフィー法を使用して実施し、この樹脂は、Novo Nordiskで開発された、FVIIaのGlaドメインに特異的に結合する抗体がカップリングされた樹脂(GE Healthcareのベースアフィニティーゲル)である(詳細については、参照文献Jurlander B、Thim L、Klausen NK、Persson E、Kjalke M、Rexen P、Jorgensen TB、Ostergaard PB、Erhardtsen E、Bjorn SE(2001年)Recombinant activated factor VII(rFVIIa):characterization、manufacturing、and clinical development.Semin Thromb Hemost.27巻:373〜84頁を参照のこと)。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を実施した。精製ステップに使用した緩衝系は、10mMヒスチジン、pH6.0、5mM CaCl2、25mM NaClおよび0.01%(v/v)Tween-80から構成される平衡化緩衝液、10mMヒスチジン、pH6.0、5mM CaCl2、1.0M NaClおよび0.01%(v/v)Tween-80から構成される洗浄緩衝液、ならびに50mMヒスチジン、pH6.0、15mM EDTAから構成される溶出緩衝液であった。細胞上清を、5mMのCaCl2終濃度に調節し、予め平衡化した抗HPC4カラムにかけた。カラムを、5〜10カラム容の平衡化緩衝液、5〜10カラム容の洗浄緩衝液および最後に5〜10カラム容の平衡化緩衝液で洗浄した。FVIIaタンパク質を、約5カラム容の溶出緩衝液を用いて均一濃度で溶出した。
低い純度のFVIIa変異体(Agilent 1100/2100システムでのSEC-HPLC法の設定に基づき、TSK G3000SWXLカラム(Tosho)およびPBSランニング緩衝液を使用して、<90%)を含む捕捉溶出物のさらなる精製を、以下を使用して実施した:1)Poros HQ50樹脂(Applied Biosystems)に基づくアニオン交換クロマトグラフィー(AIEC)、および2)予め充填されたSuperdex200カラム(GE Healthcare)を使用する分取ゲル濾過。
AIEC精製ステップに使用した緩衝系は、10mM Hepes、pH5.9および150mM NaClから構成される平衡化緩衝液、10mM Hepes、pH5.9および50mM NaClから構成される洗浄緩衝液、ならびに10mM Hepes、pH5.9、50 NaClおよび30mM CaCl2から構成される溶出緩衝液であった。捕捉溶出物を1:6(v:v)希釈し、その後、予め平衡化したPoros HQ50カラムにかけた。カラムを、5〜10カラム容の平衡化緩衝液および5〜10カラム容の洗浄緩衝液で洗浄し、その後、およそ2〜5カラム容の溶出緩衝液中に均一濃度でFVIIaタンパク質を溶出した。
ゲル濾過ステップに使用した緩衝系は、10mMヒスチジン、pH6.0、10mM CaCl2、100mM NaClおよび0.01% Tween 80から構成されるランニング緩衝液であった。FVIIaタンパク質を、およそ0.02〜0.08カラム容中に、対称ピークとして収集した。
精製したFVIIa調製物の活性化を、活性化したCNBr-Sepharose 4 FFビーズ(GE Healthcare)にカップリングされた血漿由来FXa(Enzyme Research Lab.)から構成される樹脂を使用して実施した。
FVIIaタンパク質を、SDS-PAGE/クマシーならびにAgilent 6210機器での液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法の設定および脱塩カラムMassPREP(Waters)を、LC-MSグレードのH20中0.1%のギ酸から構成される平衡化緩衝液およびLC-MSグレードのACN中0.1%のギ酸から構成される溶出緩衝液と共に使用して実施したインタクト分子質量決定を使用して分析した。精製した全てのFVIIa変異体および野生型は、約50kDaのインタクト分子質量を示した。還元条件を用いたインタクト質量SDS-PAGE/クマシーおよびLC-MS分析に基づいて、FVIIa-Fab5001融合物の鎖同定を実施した。
SEC-HPLC分析に基づいて、全てのFVIIa調製物は、>90〜99%の純度を示し、高度に均質であるように見えた。
(実施例49)
可溶性組織因子の存在下でのタンパク質分解アッセイを使用する、FVII-Fab5001の自己活性化。
自己活性化を、可溶性組織因子(sTF)の存在下でFXを活性化する能力として決定した。タンパク質を、50mM HEPES(pH7.4)、100mM NaCl、10mM CaCl2、1mg/mL BSA、および0.1%(w/v)PEG8000中に希釈した。FX活性化についての動態パラメーターを、5pMのFVII-Fab5001(n=2)を100nMのsTFおよび25μMのPC:PSリン脂質(Haematologic technologies)と共に10分間予めインキュベートすることによって決定した。次いで、30nMのFXを、96ウェルプレート中100μLの総反応容量に添加し、反応物を室温で20分間インキュベートした。インキュベーション後、反応を、50μLの停止緩衝液(50mM HEPES(pH7.4)、100mM NaCl、80mM EDTA)を添加し、その後50μLの2mM S-2765を添加することによって失活させた。最後に、吸光度の増加を、Spectramax 190マイクロプレートリーダーで405nMで連続的に測定した。kcat/Km値を、線形回帰を使用して修正型Michaelis Menten方程式([S]<Km)にデータをフィッティングすることによって決定した。生成されたFXaの量を、FXa検量線から概算した。
酵素前駆体融合タンパク質FVII-Fab5001は、sTFの存在下でのタンパク質の自己活性化の結果、wtFVIIaの活性と比較して38%のタンパク質分解活性を示した(図21を参照のこと)。
(実施例50)
抗TLT-1抗体、mAbOO23、mAb0051、mAb0061およびmAbOO62の抗凝集効果の欠如。
抗TLT-1抗体の抗凝集効果を、ヒト多血小板血漿(PRP)で試験した。PRPを、ヘパリン安定化ヒト全血を200gで15分間遠心分離することによって得た。血小板を含む上相を収集し、残りの試料を1500gで10分間遠心分離して、凝集測定において参照試料として使用する少血小板血漿(PPP)を得た。PRPを、Platelet Aggregation Profiler(PAP-8)機器(Bio/Data Corporation、Horsham、PA)中で37℃で3分間インキュベートした。安定なベースラインを記録し、その後抗TLT-1抗体(10nM)または無関係の対照抗体(10nM)をPRPに添加した。血小板を、抗体の添加の3分後に、プロテアーゼ活性化受容体-1(PAR-1)活性化ペプチドSFLLRN(1または10μM)(Bachem)で活性化した。
この結果により、無関係な対照抗体と比較して、抗体(10nM)(mAb0023、mAb0051、mAb0061およびmAb0062)の阻害効果がないことが示された。血小板凝集を、高濃度(10μM)または中程度の濃度(1μM)のいずれかのSFLLRNで開始させた。データは、抗体がいずれのSFLLRN濃度でも凝集を阻害しないことを示している。結論として、これらのデータは、これらの抗体が、凝集として測定される血小板機能を誘導も阻害もしないことを示している。
(実施例51)
トロンボエラストグラフィー(TEG)によって測定された、正常ドナー由来のヒト全血(HWB)におけるTF誘導性フィブリンクロット形成に対するFIX-mAb0145の影響。
クエン酸安定化ヒト全血(HWB)を、正常ドナーから採取する。血友病様状態を、10μg/mlの抗FVIII抗体(Sheep anti-Human Factor VIII;Hematologic Technologies Inc)と共にHWBを室温で30分間インキュベートすることによって得る。クロット形成を、トロンボエラストグラフィー(5000シリーズTEG分析器、Haemoscope Corporation、Niles、IL、USA)によって測定する。種々の濃度(0;0.2;1.0;5.0および10nM)のFIX-mAb0145または(0;0.2;5.0および10nM)のrFIX(Novo Nordisk A/S)を、「血友病様」クエン酸HWBに添加する。340μlの正常HWBまたは「血友病様」HWBを、0.03pM脂質付加TF(Innovin(登録商標)、Dade Behring GmbH(Marburg、Germany))を含む20μlの0.2M CaCl2を含有するトロンボエラストグラフカップに移したときに、凝固が開始される。TEG痕跡を最大で120分間連続的に追跡する。以下のTEG変数を記録する:R時間(凝固時間、すなわち凝固の開始から2mmの振幅が得られたところまでの時間)、α角度(R値とTEG痕跡の変曲点との間の角度として測定されるクロットの発生)、K(特定のレベルのクロット強度に達するまでのクロット動態の速度、振幅=20mm)、およびMA(クロットの最大の機械的強度を反映するTEG痕跡の最大振幅)。図23は、個々のTEG痕跡から決定されたR時間値を示す。
種々の濃度のFIX-mAb0145またはrFIXを補充した正常HWBおよび「血友病」血を用いたTEG痕跡から得られたR時間を図23中に示す。正常ドナー由来のHWBは、980秒のR時間を示し、これは、FVIII中和抗体の添加によって血液を「血友病様」にした場合に、5475秒まで延長された。FIX-mAb0145は、等価な濃度で対照として添加した場合に有意な影響のないrFIXとは対照的に、濃度依存的様式でR時間凝固を短縮した。全てのデータは、1人の代表的なドナーから得る。
FIX-mAb0145は、濃度依存的様式で「血友病様HWB」の凝固を正常化することが観察される。したがって、驚くべきことに、この結果は、活性化血小板の表面にrFIXを標的化するTLT-1に対する抗体にrFIXをコンジュゲート化することが、改善された凝固促進活性を生じるFVIII非依存的バイパス活性を提供することを示している。
(実施例52)
血友病A様状態下で表面発現したTLT-1への結合を介した、活性化血小板の表面へのrFVIIaの局在化による、トロンビン生成の亢進。
25nMのFVIIa-Fab9015、FVIIa-Fab1029およびFVIIa-Fab1001を、トロンビン生成アッセイで試験した。簡潔に述べると、ヒト多血小板血漿(PRP)を、220gで20分間のクエン酸ヒト全血の遠心分離によって得た。血小板を含む上相を収集し、残りの試料を2500gで10分間遠心分離して少血小板血漿(PPP)を得、これを使用して血小板濃度を150000plts/μlの終濃度に調整した。PRPを、ヒツジ抗ヒトFVIIIポリクローナル抗体(0.1mg/ml)(HTI #Z0429)との30分間のインキュベーションによって血友病性にした。血小板を、プロテアーゼ活性化受容体-1(PAR-1)活性化ペプチド(30μM)(SFLLRN;Bachem #H-2936)およびGPVI活性化ヘビ毒コンブルキシン(100ng/ml)(Pentapharm #119-02)の組合せによって活性化した。生成したトロンビンを、Thrombinoscope(登録商標)からの蛍光発生法を使用して測定し、この方法では、PRP、FluCa試薬および試験化合物を混合し、96ウェルのNunc Microwell丸底ウェルプレート(Nunc #268152)に添加した。反応を、血小板アクチベータの添加によって開始させ、基質からの蛍光シグナルを、ThermoFisher Fluoroskanプレートリーダー(Fisher Scientific)で検出した。トロンビン濃度を、Thrombinoscope(登録商標)によって提供されるトロンビンキャリブレーターを指示に従って使用して計算した。
この結果により、3つ全てのタンパク質FVIIa-Fab9015、FVIIa-Fab1029およびFVIIa-Fab1001が、rFVIIaと比較して能力が増加したことが示された。FVIIa-Fab9015およびFVIIa-Fab1001(25nM)は、およそ4倍増加した能力を示したが、FVIIa-Fab1029(25nM)は、rFVIIa(25nM)と比較して、ピークトロンビン生成として測定されるおよそ2倍増加した能力を有した(図24)。
(実施例53)
組換え発現されたFIX(配列番号161)、FIX-抗TLT-1 FabおよびMab融合タンパク質(FIX-Fab0155およびFIX-Mab0145)の精製および特徴付け。
前記FIXタンパク質の精製を、抗FIX A3B6-Sepharose 4 FF樹脂に基づく捕捉アフィニティクロマトグラフィー法を使用して実施し、この樹脂は、Novo Nordiskで開発された、FIXのGlaドメインに特異的に結合する抗体がカップリングされた樹脂(GE Healthcareのベースアフィニティーゲル)である(参考文献:Ostergaardら(2011年)、Blood 118巻:2333〜41頁を参照のこと)。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を実施した。精製ステップに使用した緩衝系は、20mM Tris、1mM CaCl2、100mM NaCl、0.01%(v/v)Tween 80 pH7.5から構成される平衡化緩衝液、20mM Tris、1mM CaCl2、2.0M NaCl、0.01%(v/v)Tween 80 pH7.5から構成される洗浄緩衝液、および20mM Tris、20 mM EDTA、50mM NaCl、0.01%(v/v)Tween 80 pH7.5から構成される溶出緩衝液であった。細胞上清を、5mMのCaCl2終濃度に調整し、予め平衡化したA3B6-Seph 4 FFカラムにかけた。カラムを、5〜10カラム容の平衡化緩衝液、5〜10カラム容の洗浄緩衝液および最後に5〜10カラム容の平衡化緩衝液で洗浄した。FIX融合タンパク質を、およそ5カラム容の溶出緩衝液を用いて均一濃度で溶出した。
FIXタンパク質を、SDS-PAGE/クマシーならびにAgilent 6210機器での液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法の設定および脱塩カラムMassPREP(Waters)を、LC-MSグレードのH20中0.1%のギ酸から構成される平衡化緩衝液およびLC-MSグレードのACN中0.1%のギ酸から構成される溶出緩衝液と共に使用して実施したインタクト分子質量決定を使用して分析した。還元条件を用いたインタクト質量SDS-PAGE/クマシーおよびLC-MS分析に基づいて、FIXタンパク質の鎖同定を実施した。SEC-HPLC分析に基づいて、全てのFIX融合タンパク質調製物は、>85〜99%の純度を示し、高度に均質であるように見えた。
(実施例54)
FVIIa野生型(配列番号157)およびFVIIa-407C(配列番号:181)の組換え発現の生成。
前記変異体および野生型FVIIaを、特許02/077218およびJurlanderら(2001年)、Semin Thromb Hemost.27巻:373〜84頁に記載されるように生成した。より具体的には、FVIIa分子を、接着性BHK細胞系統中で発現させた。使用した増殖培地は、5mg/LのビタミンK1および10%のウシ胎児血清(生成の間2%)を含むDMEM/F12培地異形であった。簡潔に述べると、細胞を、ベントしたT-175フラスコ中で増殖させ、2層または10層の細胞工場を、37℃、5%CO2でインキュベートした。コンフルエントになった時点で、TrypLE(商標)Express(GIBCOカタログ番号12604-013)を使用して細胞を解離させ、その後次のステップに進んだ。生成期を、マイクロキャリア(5g/L、Cytodex 3、GE Life Sciences)を含む15Lのバイオリアクタ中で、反復バッチ培養として実施した。pHを、CO2を添加することによって7.2の上限で調節し、Na2CO3を添加することによって6.8の下限で調節した。溶解酸素濃度を、酸素をスパージすることによって、空気中50%飽和より上に維持した。温度は36.5℃に維持した。撹拌は50〜70rpmであった。回収/培地交換を実施して、1mMを上回るグルタミン濃度を維持した。培地交換の1時間前に、撹拌を停止させて、マイクロキャリア(細胞が接着したもの)をリアクタの底に沈殿させた。その後、およそ80%の容量を回収し、その後新たな培地で満たして、100%の作業容量にした。細胞回収物を取り出し、2種の使い捨てカプセルフィルター(3μm Clarigard、Opticap XL10、Millipore、カタログ番号K030A1OHH1;0.22μm Durapore、Opticap XL10、Millipore、カタログ番号KVGLS1OHH1)からなるフィルタートレインによって清澄化して、その後精製した。
(実施例55)
血友病A様状態下で表面発現したTLT-1への結合を介した、活性化血小板の表面へのrFVIIaの局在化による、トロンビン生成の亢進。
FVIIa-Fab5001を、トロンビン生成アッセイにおいて試験し、洗浄したヒト血小板を含む第VIII因子欠乏症血漿中のrFVIIaと比較した。ヒト血小板を単離するために、1部のACD溶液(2.5%クエン酸三ナトリウム、1.5%クエン酸および2% D-グルコース)を5部の血液に添加し、その後220gで20分間遠心分離して、多血小板血漿を得た。上相を収集し、新しい円錐形チューブに移し、500gで15分間遠心した。血漿を除去し、ペレットを、プロスタグランジンEl(5μg/ml)を補充したHepes緩衝液(10mM Hepes、137mM NaCl、2.7mM KCL、1.7mM MgCl2、5mM D-グルコース、0.4mM NaH2PO4;pH6.5)に溶解した。500gで15分間の2回目の遠心分離後、上清を廃棄し、洗浄した血小板を、第VIII因子欠乏症血漿(Geroge King Biomedical、Inc.)中に溶解し、血小板濃度を300000plts/μlに調整した。トロンビン生成アッセイにおいて、アゴニスト、第IX因子変異体およびFluCa試薬(Thrombinoscope(登録商標))を、血小板を含む第IX因子欠乏症血漿と一緒に96ウェルのNunc Microwell丸底ウェルプレートに添加したときに、血小板終濃度を150000plts/μlに調整した。プロテアーゼ活性化受容体-1活性化ペプチド(SFLLRN;Bachem #H-2936)およびGPVI活性化ヘビ毒コンブルキシン(Pentapharm #119-02)の組合せによって、血小板を活性化した。トロンビン切断された基質からの蛍光シグナルをThermoFisher Fluoroskanプレートリーダー(Fisher Scientific)で検出するThrombinoscope(登録商標)の蛍光発生法によって、生成したトロンビンを測定した。トロンビン濃度を、Thrombinoscope(登録商標)により提供されるトロンビンキャリブレーターを指示に従って使用して計算した。この結果により、野生型rFVIIaと比較してFVIIa-Fab5001の能力の増加が示された(図25)。さらに、この結果により、能力のこの増加が、血小板活性化に依存することが明らかになった。SFLLRN(30μM)およびコンブルキシン(100ng/ml)の組合せを用いて血小板を活性化すると、FVIIa-Fab5001(25nM)は、野生型rFVIIa(25nM)と比較して、ピークトロンビン生成として測定されるおよそ4倍の能力増加を示した。
(実施例56)
TLT1に対するFVIIa-Fab1001結合およびFVIIa-Fab5001結合のSPR分析。
TLT1に対するFVIIa-Fab1001結合のSPR分析。Biacore T200機器におけるSPR分析によって試験されるとおり、FVIIa-Fab1001はTLT1に結合する。
使用した材料をTable 18(表24)中に示す。
方法:抗6×his抗体を、供給業者が推奨する標準的な手順を使用して、CM5チップにおよそ9000RUのレベルまで固定化した(0.5mg/ml、酢酸Na、pH5.0中に希釈)。100ng/mlの濃度のヒトhisタグ化TLT-1をリガンドとして使用した。29.29nM〜0.45nMの2倍希釈物中のFVIIa-Fab1001を、分析物として使用した。ランニングおよび希釈緩衝液は、以下から構成された:10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% p20、pH7.4。3M MgCl2によって再生を行った。実験は摂氏25℃で実施した。Biacore T200評価ソフトウェアを使用して、TLT-1およびFVIIa-Fab1001の1:1相互作用を仮定して、動態学および結合定数(kon、koff、KD)の決定を行った(Table 19(表25))。
結論:
TLT-1に対するFVIIa-Fab1001結合についての結合定数をSPR分析によって概算し、TLT-1に対する結合を確認した。
TLT-1に対するFVIIa-Fab5001結合のSPR分析。Biacore T200機器におけるSPR分析によって試験されるように、FVIIa-Fab5001はTLT-1に結合する。
使用した材料をTable 20(表26)中に示す。
方法:抗6×his抗体を、供給業者が推奨する標準的な手順を使用して、CM5チップにおよそ9000RUのレベルまで固定化した(0.5mg/ml、酢酸Na、pH5.0中に希釈)。100ng/mlの濃度のヒトhisタグ化TLT-1をリガンドとして使用した。15.77nM〜0.49nMの2倍希釈物中のFVIIa-Fab5001を、分析物として使用した。ランニングおよび希釈緩衝液は、以下から構成された:10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% p20、pH7.4。3M MgCl2によって再生を行った。実験は摂氏25℃で実施した。Biacore T200評価ソフトウェアを使用して、TLT1とFVIIa-Fabとの1:1相互作用を仮定して、動態学および結合定数(kon、koff、KD)の決定を行った(Table 21(表27))。
結論:
TLT-1に対するFVIIa-Fab5001結合についての結合定数をSPR分析によって概算し、TLT-1に対する結合を確認した。
(実施例57)
ヒトFVIIIの組換え産生。
本明細書中で使用するヒト 第VIII因子変異体の産生は、特許番号WO2009108806の実施例1中に記載されている。
配列は以下の通りである:
配列番号1は、ヒト(h)TLT-1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号2は、hTLT-1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号3は、hTLT-1-His6の細胞外ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号4は、hTLT-1-His6の細胞外ドメインのアミノ酸配列を提供する。
配列番号5〜8は、hTLT-1断片:hTLT-1.20-125、hTLT-1.16-162、hTLT-1.126-162およびhTLT-1.129-142のアミノ酸配列を提供する。
配列番号9は、mAb 0012、LCの可変ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号10は、mAb 0012、LCの可変ドメインのアミノ酸配列を提供する。
配列番号11は、0012HCの可変ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号12は、0012HCの可変ドメインのアミノ酸配列を提供する。
配列番号13は、mAb0012の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号14は、mAb0012およびFab0012の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号15は、mAb0023の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号16は、mAb0023およびFab0023の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号17は、mAb0051の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号18は、mAb0051およびFab0051の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号19は、mAb0052の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号20は、mAb0062の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号21は、mAb0052、Fab0052およびmAb0062の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号22は、mAb0061の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号23は、mAb0082の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号24は、mAb0061、Fab0061、mAb0082およびFab0082の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号25は、Fab0012 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号26は、Fab0023 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号27は、Fab0051 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号28は、Fab0052 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号29は、Fab0061 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号30は、Fab0082 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号31は、hIgG4ヒンジ-CH2-CH3のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号32は、mAb0012、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号33は、mAb0012、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびFab0012、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号34は、mAb0023、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号35は、mAb0023、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびFab0023、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号36は、mAb0051、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号37は、mAb0051、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびFab0051、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号38は、mAb0052、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号39は、mAb0052、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);Fab0052、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);mAb0062、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号40は、mAb0061、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号41は、mAb0061、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);Fab0061、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびmAb0082、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);Fab0082、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号42は、mAb0062、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号43は、mAb0082、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号44は、Fab0012、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号45は、Fab0023、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号46は、Fab0051、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号47は、Fab0052、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号48は、Fab0082、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号49〜58は、任意選択リンカーL2〜L10のアミノ酸配列を提供する。任意選択リンカーは、Table 3(表3)で番号付けられ列挙されている。
配列番号59は、精製タグHPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号60〜145は、実施例4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、24、25に記載の発現構築物の開発の間に使用されたプライマーの核酸配列を提供する。
配列番号146は、Fab0061 VH-CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号147は、hIgG4-ヒンジ-CH2-CH3のアミノ酸配列を提供する。
配列番号148は、His6タグのアミノ酸配列を提供する。
配列番号149は、hTLT-1.18-188のアミノ酸配列を提供する。
配列番号150は、プライマーno.1004の核酸配列を提供する。
配列番号151は、プライマーno.1005の核酸配列を提供する。
配列番号152は、Fab0100 HCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号153は、Fab0100 LCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号154は、野生型ヒト因子FVの核酸配列を提供する。
配列番号155は、野生型ヒト因子FVのアミノ酸配列を提供する。
配列番号156は、野生型ヒト因子FVIIの核酸配列を提供する。
配列番号157は、野生型ヒト因子FVIIのアミノ酸配列を提供する。
配列番号158は、野生型ヒト因子FVIIIの核酸配列を提供する。
配列番号159は、野生型ヒト因子FVIIIのアミノ酸配列を提供する。
配列番号160は、野生型ヒト因子FIXの核酸配列を提供する。
配列番号161は、野生型ヒト因子FIXのアミノ酸配列を提供する。
配列番号162は、野生型ヒト因子FXの核酸配列を提供する。
配列番号163は、野生型ヒト因子FXのアミノ酸配列を提供する。
配列番号164は、野生型ヒト因子FXIの核酸配列を提供する。
配列番号165は、野生型ヒト因子FXIのアミノ酸配列を提供する。
配列番号166は、0012LC.C36A-HPC4のDNA配列を提供する。
配列番号167は、0012LC.C36A-HPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号168は、0012VH-CH1-HPC4のDNA配列を提供する。
配列番号169は、0012VH-CH1-HPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号170は、0012VH.T60N-CH1-YGPPCのDNA配列を提供する。
配列番号171は、0012VH.T60N-CH1-YGPPCを提供する。
配列番号172は、FIX-L4b-0012LCのDNA配列を提供する。
配列番号173は、FIX-L4b-0012LCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号174は、0003Fab-LC:0062Fab-LC-HPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号175は、0003Fab-HC:0062Fab-VH-CH1-YGPPCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号176は、0197-0000-0074Fab-HC:0197-0000-0051Fab-VH-CH1-YGPPCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号177は、0074Fab-LC:0051Fab-LC-HPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号178は、0004Fab-HC:0023Fab-VH-CH1-YGPPCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号179は、0004Fab-LC:0023Fab-LC-HPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号180は、ヒトFVII-L4b-0062VH-CH1-HPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号181は、ヒトFVII 407Cのアミノ酸配列を提供する。
配列番号182は、ヒトFIX-L4b-0061LCのアミノ酸配列を提供する。

Claims (1)

  1. (iii)TLT-1に特異的に結合することができる(ii)モノクローナル抗体またはその断片と共有結合している、(i)少なくとも1つの凝固因子、および/またはその断片もしくは変異体
    を含む、凝固促進性タンパク質。
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