JP2018030809A - イミダゾールジペプチドを含有する、グリア細胞における神経栄養因子等の遺伝子の発現誘導剤 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
イミダゾールジペプチドを含有し、BDNF、NGF、NTF3、NTF4、CSF3およびCYR61からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の、グリア細胞における発現を誘導するための剤。
[2]
前記イミダゾールジペプチドとして鶏肉由来のものを含有する、項1に記載の剤。
[3]
前記イミダゾールジペプチドとしてカルノシンを含有する、項1または2に記載の剤。
イミダゾールジペプチドは、イミダゾール基を有するアミノ酸と他のアミノ酸とからなるジペプチドであって、下記の式Iまたは式IIで表すことができる。
式Iにおいては、R1、R2は、いずれか一方がC1-6アルキルであり、他方がHであることが好ましい。式IIにおいては、R2、R3は、いずれか一方がC1-6アルキルであり、他方がHであることが好ましい。C1-6アルキルの好ましい例の一つは、メチルである。
-COR4であるXの具体例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、アクリロイルが挙げられる。
神経栄養因子には、神経栄養因子ファミリーに属するサイトカイン、グリア細胞株由来神経栄養因子ファミリーに属するサイトカイン、およびそれら以外のものが含まれる。本発明ではこのうち、神経栄養因子ファミリーに属するNGF、BDNF、NTF3およびNTF4を、グリア細胞における遺伝子の発現の誘導の対象とすることができる。また、本発明ではさらに、神経栄養因子に類する機能を有するCSF3およびCYR61も、グリア細胞における遺伝子の発現の誘導の対象とすることができる。これらの遺伝子を、本明細書においては「神経栄養因子等」と呼ぶことがある。
グリア細胞(神経膠細胞とも呼ばれる。)は、神経系を構成する神経細胞ではない細胞の総称である。このようなグリア細胞には、ミクログリア(小膠細胞)、アストロサイト(星状膠細胞)、オリゴデンドロサイト(希突起膠細胞・乏突起膠細胞・稀突起膠細胞)、上衣細胞、シュワン細胞(鞘細胞)、衛星細胞などが包含される。本発明の発現誘導剤は、これらのグリア細胞の中でも、脳などの中枢神経系において神経細胞の近傍にある、ミクログリア、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを対象とすることが好ましい。例えばアストロサイトは、本発明の発現誘導剤による神経栄養因子等の遺伝子の発現誘導作用について優れた効果が認められる、特に好ましい対象である。
本発明の発現誘導剤の用途は、特定の神経栄養因子等の遺伝子のグリア細胞における発現を誘導する作用を利用する限り特に限定されるものではない。
食品組成物は、イミダゾールジペプチドまたはこれを含有する抽出物等と、食品として許容される種々の添加剤等やその他の成分とを、所定の配合比で混合するなど、公知の技術を用いて製造することができる。なお、イミダゾールジペプチドを含有するが、組成物として製造されていない天然の素材またはその調理・加工品、例えば鶏肉自体は、食品組成物には該当しない。
医薬組成物は、イミダゾールジペプチド(通常は精製物)と、医薬品として許容される種々の添加剤等やその他の成分とを、所定の配合比で混合するなど、公知の技術を用いて製造することができる。
本発明におけるカルノシンは全てL-カルノシン(和光純薬工業(株) Cat. 032-11031)であり、DPBS(Dulbecco's phophate buffered saline)(サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat. 14190-144)に1Mとなるように溶液を調製した後、それぞれの終濃度に合わせて希釈して使用した。
グリア細胞株(U87-MG)について、以下の手順で、カルノシンによる処理および遺伝子発現の解析を行った。具体的には、培養中のグリア細胞にカルノシン溶液を添加し、6時間後の細胞からRNAを精製し、cDNAの合成を行い、定量RT-PCRにより遺伝子発現の変化を解析した。
カルノシン処理及びRNAの回収、精製
12well plateに3×10^5 cells/wellの濃度で細胞を播種し、24時間後にカルノシンを添加する。6時間後、培養上清を除去し、Tri reagent(Molecular Research Center, Inc. Cat. TR118)(500μl/well)を添加し、細胞をホモジェナイズする。室温で5分静置させた後、クロロホルム溶液(100μl/500μl Tri reagent)を添加し10秒間Vortexにより撹拌する。その後再度5分間、室温に静置した後、15000rpmで10分間遠心しRNA(上層)、タンパク質(中間層)、有機物(下層)に分離させる。上層を回収し、100% エタノール溶液を回収した溶液の0.55倍量添加する。その後エコノスピン(ジーンデザイン(株) Cat. EP-21201)に回収し、10000 rpmで1分間遠心する。RNA wash solution(RWA)(プロメガ Cat. Z3091)(500μl/カラム)をカラムに添加し再度10000rpmで1分間遠心する。再びRNA wash solution(RWA)(500μl/カラム)を添加し15000rpmで1分間遠心する。遠心後カラムの蓋を開け、5分間風乾させる。風乾後、Ultra Pure Water(Dnase and Rnase-free)(Biological Industries Cat. 01-866-1A)(40 μl/カラム)を添加し、5分間静置する。その後15000rpmで1分間遠心し、RNAを回収する。
cDNAの合成には、ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT kit(TOYOBO Cat. FSQ-101)を用いた。RNAサンプル(500ng)にNuclease-free waterをtotal 7μlになるように添加し、65℃で5分間インキュベートした。その後氷上で急冷させ、5分後、5×RT Buffer 2μl, Primer Mix 0.5 μl, RT Enzyme Mix 0.5 μlをそれぞれ加え、37℃で15分、98℃で5分間反応させ、cDNAを合成させる。
定量RT-PCRには、THUNDERBIRD(登録商標) SYBR(登録商標) qPCR MIX(TOYOBO Cat. QPS-201)を使用した。合成したcDNAの鋳型とprimer, 滅菌水, THUNDERBIRD(登録商標) SYBR(登録商標) qPCR MIXの混合溶液を調製し、95℃ 3分の後、95℃ 10秒、55℃ 30秒の2ステップを39サイクルという行程でPCR反応を行う。
得られた結果をエクセルでグラフ化し、T検定により有意差を判定した。
結果を図1および図2に示す。有意差レベルp<0.05に基づき、グリア細胞へのカルノシン10mM処理により有意にBDNF及びNGF、NTF4の遺伝子発現が増強されていることが明らかになった。
方法
12well plateへグリア細胞を播種し、24時間後、カルノシン10mMを添加した。これを3日間続けた後培養上清を回収し、2000gで20分間遠心しタンパク質の定量を行った。BDNFのタンパク質の定量はBDNF Emax ImmunoAssay System(プロメガ Cat. G7610)を使用した。方法はKit付属のプロトコルに従った。
結果を図3に示す。有意差レベルp<0.05に基づき、1日1回のカルノシン処理を3日行った後では、無処理と比較して有意にBDNF量が培養上清中に増加していることが明らかとなった。このことからカルノシンがグリア細胞を活性化させることで周りの神経細胞に影響を与えていることが明らかとなった。
方法
グリア細胞株(U87-MG)の代わりに神経細胞株(SH-SY5Y)を用いて、それ以外は前記[2]と同様の手順で、カルノシンによる処理および遺伝子発現の解析を行った。
結果を図4および図5に示す。神経細胞へのカルノシン10mM処理ではグリア細胞のような神経栄養因子の発現誘導効果は認められなかった。
方法
神経細胞(SH-SY5Y)の分化誘導
神経細胞をコラーゲンコーティング済み6cmディッシュ(IWAKI Cat. 4010-010-MYP)へ播種(2.8×10^5 cells/dish)し、24時間後、レチノイン酸(Wako Cat. 182-01116)を終濃度10μMで添加し5日間培養した。
12well plateへグリア細胞を播種し、24時間後、培地交換を行った(DMEM / 1%FBS 1ml)。この時、カルノシン処理を行うサンプルについては終濃度5mMとなるようにカルノシンを添加した。処理24時間後、培養上清を回収し、2000gで20分間遠心した。その後分化誘導済み神経細胞へ添加し、神経突起の観察及び定量化を行った。また、余った培地は培地交換用に-80℃に保存した。
神経突起の観察は、分化誘導済み神経細胞に神経突起の伸長誘導処理を7日間行った後、ミリポア社のMilli-Mark(商標) FluoroPan Neuronal Marker(Cat. MAB2300X)で免疫染色することで行った。免疫染色の方法は付属のプロトコルに従って実験を行った。以下に神経突起伸長誘導処理の方法を記載する。
レチノイン酸による分化誘導後の神経細胞をコラーゲンコート済みの12 well plate(住友ベークライト株式会社 Cat. MS-0012K)へ播種する。24時間後、グリア培養上清1 mlを添加し、ポジティブコントロールとしてBDNF 100ng/mlで処理するサンプルも用意する(培地血清濃度1%とする。)。24時間後、グリア培養上清に浸っているサンプルについては半量(500μl)を前もってストックしておいたグリア培養上清に交換する。これを1週間続ける。培養終了後、免疫染色を行い、顕微鏡観察を行う。
神経突起の定量化にはNeurite Outgrowth Assay kit( Merck Millipore CorporationCat. NS225)を使用した。まず、24well plateのインサートをコラーゲン溶液でコーティング(ウシ真皮由来コラーゲンタイプI ペプシン可溶化, ニッピ Cat. PSC-1-100-20)する。PBS+(Ca2+, Mg2+)で300倍希釈したコラーゲン(10μg/mL)400μlにインサートを浸らせ37℃で2時間コーティングする。コーティング済みインサートをグリア培養上清入り(600μl)のwellへ移し、細胞を播種する(100μl)(SH-SY5Y : 5×10^4 cells/well)。15分間室温で静置後37℃のインキュベータへ移す。この時ポジティブコントロールとしてBDNF 100ng/mlで処理するサンプルも用意する(培地血清濃度1%とする。)。24時間後、グリア培養上清に浸っているサンプルについては半量(300μl)を新しい培養上清に交換する。これを1週間続ける。培養終了後、インサートから培地を除去し800μl のPBS(−)入りのwellへ移す。その後400μlの−20℃のメタノールに室温で20分間浸し、再び800μlのPBSで洗浄する。400μlのNeurite Stain Solutionで15-30分間 室温で染色し、800μlのPBSで洗浄する。その後PBSで濡らした付属の綿棒を使ってインサート上の細胞質を除去し神経突起のみを残す。パラフィルムに200μlのNeurite Stain Extraction Bufferを滴下し、その上にインサートの底を付け室温で5分間培養し神経突起を抽出する。パラフィルム上やインサートの底や内側に付着している溶液を回収し、96well plateへ移し、分光光度計で測定する(562nm)。得られたOD値をもとに結果を考察した。
結果を図6に示す。カルノシン処理を行ったグリア細胞の培養上清にさらされた神経細胞では、統計学上有意に(p<0.05)、神経突起の伸長が増強される傾向にあった。
グリア細胞株(U87-MG)について、以下の手順で、カルノシン処理による網羅的な遺伝子発現の解析を行った。具体的には、培養中のグリア細胞にカルノシン溶液を添加し、6時間後の細胞からRNAを精製し、マイクロアレイにより遺伝子発現の変化を解析した。
マイクロアレイはAgilent社(CA, USA)のSurePrint G3 Human GEマイクロアレイキット 8x60K v3を用いて行った。
まず、RNAを[2]の方法で精製し、Agient Low-Input QuickAmp Labeling kit, one-colorを用いてラベリングした。予め準備した One-Color Spike Mix stock solution にラベル済みRNA を加え、次に、T7 Promoter Primerを加え、ヒートブロックで65℃ 10分間インキュベートした。その後5分間氷上で急冷し、さらに、予め調製したcDNA Master Mixを加え、2時間40℃のヒートブロックでインキュベートした。その後、70℃のヒートブロックに移し、さらに15分間インキュベートした。インキュベート後、氷上で5分間急冷し、予め調整したTranscription Master Mix 6 μLを加え、40℃のヒートブロックで遮光しながら2時間インキュベートした。その後、Nuclease-free water、Buffer RLT、エタノールを加え、RNeasyカラムに全量を添加し、13000 rpmで4℃ 30秒間遠心し、Buffer RPEによって2回洗浄した。その後、RNase-free waterによって溶出しハイブリダイゼーションに使用した。
Agilent社推奨のプロトコルで、ハイブリダイゼーションを行った。まず、先程溶出したRNAをFragmentation mix と混ぜ断片化し、60℃のヒートブロックで30分間インキュベートしてすぐに1分間氷冷した。次に、そのcRNA from Fragmentation Mix に2x GEx Hybridization Buffer HI-RPMを混合しHybridization mixを作製した。Hybridization mixをmicroarray slideにアプライした後、ハイブリダイゼーションチャンバーに設置し、ハイブリダイゼーションオーブンに設置し、65℃ 10 rpmにて17時間かけてハイブリダイズした。
予め準備したGene Expression Wash Bufferを用いてmicroarray slideの洗浄を行った。まず、ハイブリダイゼーションが終わる前に、3つの洗浄用ガラス容器のうち2つにGene Expression Wash Buffer 1を、残りの1つに37℃のGene Expression Wash Buffer 2をそれぞれ満たした。ハイブリダイゼーションが終わったハイブリダイゼーションチャンバーを1つ目の洗浄用ガラス容器中で分解しmicroarray slideを取り出し、2つ目の洗浄用ガラス容器中で洗浄した。3つ目の洗浄用ガラス容器でさらにmicroarray slideを洗浄後、microarray slideを水面からゆっくり引き上げることで乾燥させ、最後に専用のスキャナーに設置しmicroarray slideのスキャンを行った。
Agilent社Feature Extractionソフトウェアによってデータの数値化を行った。正規化は統計解析ソフトRを用い、quantile法にて行った。また、正規化後のシグナル値からZ-scoreとRatioを算出し、±2以上の変動があるもののみを抽出することで得られたデータを、アノテーションデータベース DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)を用いて解析した。まず、データベースに変動が確認された遺伝子のGenBank Accession Numberを入力した後、Functional Annotation Clusteringを行い遺伝子変動が起きている機能ごとにクラスタリングを行った。また、同様にDAVIDを用いて、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)のパスウェイ解析を行った。
有意差レベルp<0.05に基づく判定により、神経栄養因子であるBDNFのみならず、新たにCSF3、CYR61といった神経栄養因子に似た機能を有する因子の遺伝子の発現が確認された。図7には定量RT-PCRによる遺伝子発現レベルの確認を行った結果を示す。
Claims (3)
- イミダゾールジペプチドを含有し、BDNF、NGF、NTF3、NTF4、CSF3およびCYR61からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の、グリア細胞における発現を誘導するための剤。
- 前記イミダゾールジペプチドとして鶏肉由来のものを含有する、請求項1に記載の剤。
- 前記イミダゾールジペプチドとしてカルノシンを含有する、請求項1または2に記載の剤。
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