JP2018027087A - アンチセンス核酸 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンの異なる2か所を標的とするオリゴマーを連結して得られるアンチセンスオリゴマーであって、標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー、前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、が連結した15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマー。
【選択図】なし
Description
本発明者らは、上記文献に記載の技術内容及びジストロフィン遺伝子の構造などを詳細に研究した結果、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44の異なる2か所を標的とするオリゴマーを連結して得られるアンチセンスオリゴマーが同エクソンのスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
[1]
(a)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(b)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
が連結した15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーであって、
前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない、
前記標的エクソンのスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[2]
前記第1及び/又は第2のユニットオリゴマーが、前記標的エクソンに隣接するイントロンの部分ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む、前記[1]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[3]
前記標的エクソンがヒトジストロフィン遺伝子のエクソンである、前記[1]又は[2]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[4]
前記第1のヌクレオチド配列が配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列である、前記[1]又は[2]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[5]
前記第2のヌクレオチド配列が配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列である、前記[1]〜[3]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[6]
以下の(c)〜(e)よりなる群より選ばれる2つのユニットオリゴマーが連結したものである、前記[1]又は[2]に記載のアンチセンスオリゴマー:
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;
(d)配列番号4に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;及び
(e)配列番号5に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[7]
配列番号6〜9よりなる群から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなる、前記[1]又は[2]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[8]
オリゴヌクレオチドである、前記[1]〜[7]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[9]
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、前記[8]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[10] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記[8]又は[9]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。)
[11] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記[8]〜[10]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[12] モルホリノオリゴマーである、前記[1]〜[7]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[13] ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記[12]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[14] 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、前記[12]又は[13]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[16] さらに医薬的に許容可能な担体を含む、前記[15]に記載の医薬組成物。
[17]
前記[1]〜[12]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物、あるいは前記[1]もしくは[16]に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
[18] 前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン44スキップの対象となる変異を有する患者である、前記[17]に記載の治療方法。
[19]
前記患者がヒトである、前記[17]又は[18]に記載の治療方法。
[20]
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における前記[1]〜[14]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物の使用。
[21]
筋ジストロフィー治療に使用するための前記[1]〜[14]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[22]
前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン44スキップの対象となる変異を有する患者である、前記[21]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[23]
前記患者がヒトである、前記[21]又は[22]に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
[24]
(a)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(b)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を連結することにより15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程を含み、
ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない、
前記[1]に記載のアンチセンスオリゴマーの製造方法。
[25]
前記工程で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程、
をさらに含む、前記[24]に記載の方法。
[26]
(a)(i)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(ii)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を選択する工程(ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない)、
(b)前記第1及び第2のユニットオリゴマーを連結することにより15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程、
(c)前記工程(b)で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
(d)基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程、
を含む、アンチセンスオリゴマーのスクリーニング方法。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2014年6 月17日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2014-124157号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
1.アンチセンスオリゴマー
本発明は、(a)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(b)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
が連結した15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーであって、
前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない、前記標的エクソンのスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物を提供する。
以下、「アンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物」を単に「アンチセンスオリゴマー」と総称する場合がある。
(a)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(b)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を連結することにより15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程を含み、
ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない、製造方法によって製造することができる。
上記製造方法は、前記工程で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する第2の工程、
をさらに含んでいてもよい。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
またはスキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照することもできる。
第2の工程において、基準値となるスキッピング効率は、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上である。
このように複数のユニットオリゴマーを連結することにより、ユニットオリゴマーのそれぞれのスキッピング活性が低い(あるいは同活性がない)場合であっても、スキッピング活性の向上したアンチセンスオリゴマーが得られることになる。
同様に、
(a)(i)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(ii)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を選択する工程(ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない)、
(b)前記第1及び第2のユニットオリゴマーを連結することにより15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程、
(c)前記工程(b)で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
(d)基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程、
を含む、アンチセンスオリゴマーのスクリーニング方法が提供される。
また、前記アンチセンスオリゴマーは、前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第3のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第3のユニットオリゴマーを含んでいてもよい。
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。)
前記第1及び/又は第2のユニットオリゴマーは、前記標的エクソンに隣接するイントロンの部分ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含むものであってもよい。例えば、第1のユニットオリゴマーが5’側に位置し、第2のユニットオリゴマーが3’側に位置して連結する実施態様においては、第1のユニットオリゴマーの5’側に、標的エクソンの5’側に隣接するイントロンの3’末端周辺部ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列が含まれ、及び/又は第2のユニットオリゴマーの3’側に、標的エクソンの3’側に隣接するイントロンの5’末端周辺部ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列が含まれていてもよい。
前記標的エクソンは特に限定されないが、ある実施態様ではヒトの遺伝子のエクソンであり、さらにはヒトジストロフィン遺伝子のエクソンである。
さらに具体的には、ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンである。
従って、本発明はある実施態様においてヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンをスキッピングしうるアンチセンスオリゴマー(以下、「本発明のオリゴマー」という)を提供する。以下において、本発明のアンチセンスオリゴマーの構造について詳細に説明する。
[ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソン]
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、3.0 Mbpのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している(Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993))。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である(GenBank Accession No. NM_004006)。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン44の塩基配列を配列番号10に示す。
ある実施態様において、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピングにより、DMD型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、BMD型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、本発明のオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン44には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44は、具体的には、以下の(I)又は(II)に記載のポリヌクレオチドである。
(I)配列番号10の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
(II)配列番号10の塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号10の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列とワトソン・クリック対を形成する塩基配列に限定されるものではなく、揺らぎ塩基対(Wobble base pair)を形成する塩基配列も含む。ここで、ワトソン・クリック対とは、アデニン-チミン、アデニン-ウラシル及びグアニン-シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味し、揺らぎ塩基対とは、グアニン-ウラシル、イノシン-ウラシル、イノシン-アデニン及びイノシン-シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列と100%の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、1〜3個、1〜2個又は1個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃又は5×SSC、1% SDS、50 mM Tris−HCl(pH7.5)、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃又は0.2×SSC、0.1% SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1%(w/v)SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出することができる。あるいは、配列番号10の塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬(例えば、PCRラベリングミックス(ロシュ・ダイアグノス社)等)を用いて該プローブをジゴキシゲニン(DIG)ラベルした場合には、DIG核酸検出キット(ロシュ・ダイアグノス社)を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
上記のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドとしては、相同性検索ソフトウェアであるBLASTにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号10のポリヌクレオチドからなる配列と90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、又は99.9%以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
本発明のオリゴマーは、具体的には以下の(a)及び(b)よりなる群より選ばれる2つのユニットオリゴマーが連結した、15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーである。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;及び
(b)配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー
例えば、前記第1のヌクレオチド配列が配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列であってもよく、及び/又は前記第2のヌクレオチド配列が配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列であってもよい。
好ましくは、本発明のオリゴマーは、以下の(c)〜(e)よりなる群より選ばれる2つのユニットオリゴマーが連結した、15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーである。
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー;
(d)配列番号4に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー;及び
(e)配列番号5に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー
また、(c)〜(e)よりなる群より2つのユニットオリゴマーを選ぶ際、2つのユニットオリゴマーは同じユニットオリゴマーの組合せであってもよく、あるいは異なったユニットオリゴマーの組合せであってもよいが、好ましくは異なる種類のユニットが1つずつ選ばれる。例えば、1つのユニットとして(c)を選んだ場合、他方のユニットは(d)又は(e)となることが好ましい。同様に一方にユニット(d)を選んだ場合、他方のユニットは(c)又は(e)となることが好ましく、また、一方にユニット(e)を選んだ場合、他方のユニットは(c)又は(d)となることが好ましい。
(a)及び(b)のユニットを選択した場合、選択された2つのユニットのいずれが5’末端側に配置されてもよいが、(a)と(b)を選択した場合であればユニット(a)が3’末端側に連結されることが好ましい。
(c)〜(e)より2つのユニットを選択した場合、選択された2つのユニットのいずれが5‘末端側に配置されてもよいが、(c)と(d)を選択した場合であればユニット(c)が3’末端側に連結され、(d)と(e)を選択した場合であればユニット(d)が3’末端側に連結され、(c)と(e)を選択した場合であればユニット(c)が3’末端側に連結されることが好ましい。
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。)
「ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物(例えば、pre-mRNA)のエクソン44に相当する部位に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン45に欠失を有するDMD患者の場合、エクソン43の3’末端に相当する塩基配列にエクソン46の5’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟mRNAが形成されることを意味する。
ここで、前記「結合」は、本発明のオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のpH、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、25〜40℃、好ましくは37℃、pH 5〜8、好ましくは、pH 7.4であって、塩化ナトリウム濃度が150 mMの条件が挙げられる。
ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞(例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞)に本発明のオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞のtotal RNAから、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAのエクソン44の周辺領域をRT-PCR増幅し、該PCR増幅産物に対してnested PCR又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。 スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、エクソン44がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン44がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
またはスキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照することもできる。
好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上の効率で標的エクソン(例えば、エクソン44を)スキッピングする。
本発明のアンチセンスオリゴマーとしては、例えば、15〜30塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid:PNA)オリゴマーを挙げることができる。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、16〜30塩基、17〜30塩基、18〜30塩基、19〜30塩基、20〜30塩基、20〜29塩基、20〜28塩基、20〜27塩基、20〜26塩基、21〜26塩基又は22〜26塩基の長さにあり、モルホリノオリゴマーであることが好ましい。
前記オリゴヌクレオチド(以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という)は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル,ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン(例えば、5-メチルシトシン)、5-アルキルウラシル(例えば、5-エチルウラシル)、5-ハロウラシル(5-ブロモウラシル)、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン(6-メチルウラシル)、2-チオウラシル、4-チオウラシル、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル) ウラシル、5'-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2,2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
糖部分の修飾としては、例えば、リボースの2’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの2’位の修飾としては、例えば、リボースの2’位の-OH基をOR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br、Iに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Rはアルキル又はアリールを表す。R’はアルキレンを表す。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のOをSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA(Locked Nucleic Acid)又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合(Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160 )に置換する修飾を挙げることができる(例えば、特許再公表公報第2006/129594号及び第2006/038608号を参照)。
シクロアルキルとしては、炭素数5〜12のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
アルコキシとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1〜6のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数1〜3のアルコキシが好ましい。
アリールとしては、炭素数6〜10のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α-ナフチル、β-ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが1〜3個置換されていてもよい。
アルキレンとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、2-(エチル)トリメチレン、1-(メチル)テトラメチレンを挙げることができる。 アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、2−メチルアセチル、2,2−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、2,2−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
(式中、Baseは、核酸塩基を表す。)
(式中、Baseは、前記と同義であり;
Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
(式中、Xは、-CH2R1、-O-CH2R1、-S-CH2R1、-NR2R3又はFを表し;
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。))
(式中、Base、R2、R3は、前記と同義である。)
PMOの1つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物(以下、PMO(I)という。)を挙げることができる。
[式中、各Base、R2、R3は、前記と同義であり;
nは、1〜99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、18〜28の範囲内にある任意の整数である。]
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
次の一般式(II)で表される化合物(以下、化合物(II)という。)に酸を作用させることによって、次の一般式(III)で表される化合物(以下、化合物(III)という。)を製造する工程。
[式中、n、R2、R3は、前記と同義であり;
各BPは,独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し;
Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し;
Lは、水素、アシル、又は次の一般式(IV)で表される基(以下、基(IV)という。)を表す。]
BPに係る「核酸塩基」としては、Baseと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、BPに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、4−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で1〜5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-(tert-ブチルカルボキシ)ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニルカルボキシ)ベンジルを挙げることができる(例えば、国際公開公報第2009/064471号公報参照)。
「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、(i)モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬(例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、N-メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸)にほとんど溶解せず、(ii)モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、(iii)化学修飾ができ、(iv)望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、(v)処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、(vi)一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン(例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂 1%ジベンジルベンゼン架橋(200〜400メッシュ)(2.4〜3.0mmol/g)(東京化成社製)、Aminomethylated Polystyrene Resin・HCl[ジベンジルベンゼン1%,100〜200メッシュ](ペプチド研究所社製))、非膨潤性ポリスチレン(例えば、Primer Support(GE Healthcare社製))、PEG鎖結合型ポリスチレン(例えば、NH2-PEG resin(渡辺化学社製)、TentaGel resin)、定孔ガラス(controlled pore glass;CPG)(例えば、CPG社製)、オキサリル化−定孔ガラス(例えば、Alulら,Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991)を参照)、TentaGel支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体(例えば、Wrightら,Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993)を参照)、Poros-ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、3-アミノプロピル、スクシニル、2,2’-ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ(LCAA)を挙げることができる。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量〜10モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、0.1モル当量〜2モル当量の範囲内である。
本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸2当量に対してトリエチルアミン1当量を混合したものを挙げることができる。
本工程に使用しうる酸は、0.1%〜30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当である。好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
[式中、BP、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。]
次の一般式(V)で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式(VI)で表される化合物(以下、化合物(VI)という。)を製造する工程。
[式中、BP、T、リンカーは、前記と同義であり;
R4は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。]
特に、次の一般式(VIa)で表される化合物は、化合物(V)と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
[式中、BP、Tは、前記と同義である。]
化合物(VI)に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物(IIa)を製造する工程。
[式中、BP、R4、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。]
本工程は、化合物(VI)と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
[式中、BP、R2、R3、T、リンカー、固相担体は、前記と同義であり;
n’は、1〜98を表す。]
[式中、BP、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、n’、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、Tは、前記と同義であり;
R5は、アシルを表す。]
[式中、BP、n’、R2、R3、R5、Tは、前記と同義である。]
化合物(III)に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式(VII)で表される化合物(以下、化合物(VII)という。)を製造する工程。
[式中、各BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、R2、R3、Tは前記と同義である。]
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、N-エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物(III)1モルに対して、1モル当量〜1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量〜100モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、0.1%〜30%の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン、DMF、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分〜48時間の範囲内が適当であり、好ましくは、30分〜24時間の範囲内である。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量〜10000モル当量の範囲内が好ましく、1モル当量〜1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤1モルに対して、0.1モル当量〜100モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜10モル当量の範囲内である。
本反応の反応温度は、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分から5時間の範囲内である。
工程Bにおいて製造される化合物(VII)において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式(IX)で表される化合物を製造する工程。
[式中、Base、BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
工程Cにおいて製造される化合物(IX)に酸を作用させることによって、PMO(I)を製造する工程。
[式中、Base、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば20mMのトリエチルアミン/酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1Mの食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
(式中、Baseは、前記と同義である。)
ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
1)P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt,Science, 254, 1497 (1991)
2)M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg,Jacs., 114, 1895 (1992)
3)K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt,J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4)L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm,O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
5)T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
以下、上記(1)、(2)及び(3)で示される基を、それぞれ「基(1)」、「基(2)」及び「基(3)」と呼ぶ。
本発明のオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピングを可能にする。従って、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物をジストロフィン遺伝子にエクソン44スキップの対象となる変異(エクソン44スキッピングでin-frame化する変異)を有するDMD患者に投与することにより、筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。また、短い鎖長からなる本発明のオリゴマーは製造工程が簡便であり、さらに製造コストが抑えられるというメリットがある。
そこで、別の実施態様として、本発明のオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物(以下、「本発明の組成物」という)を提供する。
本発明の組成物には、本発明のオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤(例えば、炭素数6〜22の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン)、安定化剤(例えば、コレステロール、ホスファチジン酸)、等張化剤(例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース)、pH調整剤(例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン)を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、90重量%以下が適当であり、70重量%以下が好ましく、50重量%以下がより好ましい。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
工程1:4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、N−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミド3.44gと4−ジメチルアミノピリジン(4−DMAP)1.1gをジクロロメタン50mLに懸濁し、無水コハク酸0.90gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール10mLを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、4.0gの目的物を得た。
4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸4.0gをピリジン(脱水)200mLに溶解し、4−DMAP0.73g、1−エチル−3‐(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩11.5gを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂 Primer support 200 amino(GE Healthcare Japan社製、17-5214-97)25.0g、トリエチルアミン8.5mLを加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン(脱水)200mL、無水酢酸15mL、2,6−ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、26.7gの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、129.2μmol/gであった。
機器:U-2910(日立製作所)
溶媒:メタンスルホン酸
波長:409 nm
ε値:45000
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(5-メチル−2,4−ジオキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−5−メチルピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオンを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、164.0μmol/gであった。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(6−ベンズアミドプリン−9−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、N-{9-[(2R,6S)-6-(ヒドロキシメチル)-4-トリチルモルフォリン-2-イル]プリン-6-イル}ベンズアミドを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、185.7μmol/gであった。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{{(2S,6R)−6−{6−(2−シアノエトキシ)−2−[(2−フェノキシアセチル)アミノ]プリン−9−イル}−4−トリチルモルホリン−2−イル}メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、N−{6−(2−シアノエトキシ)−9−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]プリン−2−イル}−2−フェノキシアセトアミドを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、164.8μmol/gであった。
5’末端塩基に対応する、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例1)、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(5-メチル−2,4−ジオキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例2)、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(6−ベンズアミドプリン−9−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例3)、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{{(2S,6R)−6−{6−(2−シアノエトキシ)−2−[(2−フェノキシアセチル)アミノ]プリン−9−イル}−4−トリチルモルホリン−2−イル}メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例4)0.2gをフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)を使用して、下記合成サイクルを開始した。表1に記載の各化合物の塩基配列になるよう、各カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した(下記表2を参照)。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記表4に示す通りである。
In vitroアッセイ
RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)3.5×105個に対して、表1のアンチセンスオリゴマー0.1〜30μMをAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。
導入後、細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)(インビトロジェン社製)を含むEagle's minimal essential medium(EMEM)培地(シグマ社製、以下同じ) 2mL中、37℃、5%CO2条件下で三晩培養した。
細胞をPBS(ニッスイ社製、以下同じ)で1回洗浄した後、1%の2-メルカプトエタノール(ナカライテスク社製)を含むBuffer RLT(キアゲン社製)を350 μL細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、QIAshredder ホモジナイザー(キアゲン社製)に回収した。15,000 rpmで2分間遠心し、ホモジネートを作製した。RNeasy Mini Kit (キアゲン社製)に添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000(エル・エム・エス社製)を用いて測定した。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
[94℃、30秒間;60℃、30秒間;72 ℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、10分間:最終伸長反応
フォワードプライマー:5’-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’ (配列番号125)
リバースプライマー:5’-GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3’ (配列番号126)
エクソン44 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン44がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値(単位:nmol/L)に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
In vitroアッセイ
試験例1と同様の方法で実験を行った。但し、RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)3.5×105個に対して、PMO No.34、100、45、73、49、47の本発明オリゴマーを単独で、あるいはそれぞれを構成している2本のユニットオリゴマーをそれぞれ単独又は混合させて、各1、3、又は10 μMの濃度でAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。導入した配列の組み合わせは以下の通りである。
結果を図27から31に示す。本実験により、エクソン44内を標的とするPMO No.110〜115、PMO No.117及びPMO No.118はそれぞれ単独ではエクソン44をスキッピングさせないことが判明した。また、エクソン44内の異なる部位を標的とする2本のアンチセンス核酸の混合物(PMO No.114とPMO No.115、PMO No.109と PMO No.114、PMO No.110と PMO No.111、PMO No.112と PMO No.113、PMO No.117とPMO No.118、及びPMO No.119と PMO No.120)と比較して、それぞれを連結したPMO No.34、 PMO No.100、 PMO No.45、 PMO No.73、 PMO No.49、 PMO No.47の本発明のオリゴマーは高い効率でエクソン44をスキッピングさせることが判明した。
GM05112細胞(エクソン45欠損DMD患者由来線維芽細胞、Coriell Institute for Medical Research)を使用し、本発明のオリゴマーのエクソン44スキッピング活性を検討した。増殖培地は10%FCS(ハイクローンラボラトリーズ)及び1%Penicillin/Streptomycin(P/S)(シグマ アルドリッチ社)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)(ライフテクノロジーズ社)を使用し、5% CO2存在下、37℃で培養した。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
[94℃、1分間;60℃、1分間;72℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、7分間:最終伸長反応
フォワードプライマー:5’- GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’ (配列番号125)
リバースプライマー:5’- GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3’ (配列番号126)
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図32に示す。本実験により、PMO No. 34、45、49及び73の本発明のオリゴマーは、エクソン45欠損DMD患者由来細胞において、高い効率でエクソン44をスキッピングさせることが判明した。
Claims (26)
- (a)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(b)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
が連結した15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーであって、
前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない、
前記標的エクソンのスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。 - 前記第1及び/又は第2のユニットオリゴマーが、前記標的エクソンに隣接するイントロンの部分ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む、請求項1に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記標的エクソンがヒトジストロフィン遺伝子のエクソンである、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記第1のヌクレオチド配列が配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列である、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記第2のヌクレオチド配列が配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 以下の(c)〜(e)よりなる群より選ばれる2つのユニットオリゴマーが連結したものである、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴマー:
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;
(d)配列番号4に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;及び
(e)配列番号5に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7〜15塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。 - 配列番号6〜9よりなる群から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなる、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- オリゴヌクレオチドである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項8に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項8又は9に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。)
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項8〜10のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- モルホリノオリゴマーである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項12に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、請求項12又は13に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
- さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物、あるいは請求項1もしくは16に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
- 前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン44スキップの対象となる変異を有する患者である、請求項17に記載の治療方法。
- 前記患者がヒトである、請求項17又は18に記載の治療方法。
- 筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における請求項1〜14のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物の使用。
- 筋ジストロフィー治療に使用するための請求項1〜14のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン44スキップの対象となる変異を有する患者である、請求項21に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- 前記患者がヒトである、請求項21又は22に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
- (a)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(b)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を連結することにより15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程を含み、
ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない、
請求項1に記載のアンチセンスオリゴマーの製造方法。 - 前記工程で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程、
をさらに含む、請求項24に記載の方法。 - (a)(i)標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー;及び
(ii)前記標的エクソン内の連続する7〜15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を選択する工程(ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するものではない)、
(b)前記第1及び第2のユニットオリゴマーを連結することにより15〜30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程、
(c)前記工程(b)で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
(d)基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程、
を含む、アンチセンスオリゴマーのスクリーニング方法。
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