JP2018022620A - 試料収容セル及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】利便性を高めた試料を収容するセルを提供する。【解決手段】試料収容セル１００は、第１開口部１１１を有する第１層１１０と、前記第１層１１０に対向して配置され、第１開口部１１１に対向する位置に電子線透過部を有する第２層１５０と、第１層１１０と第２層１５０との間に配置され、第１層１１０に接する第１薄膜１２０と、第１薄膜１２０に接して配置される中間層１３０と、第１層１１０又は第２層１５０に配置された液体注入口１４１、１４３とを備え、第１薄膜１１０は、第１開口部１１１を塞ぎ、電子線に対して透過性を有し、中間層１３０は、液体注入口１４１、１４３の端部から所定の距離にわたって拡がり、第１薄膜１２０と電子線透過部の間の観察空間ＭＳと液体注入口１４１、１４３とを接続する流路空間ＦＰを備える。【選択図】図３

Description

本開示の実施形態は観察対象の試料を収容するセル及びその製造方法に関する。

電子顕微鏡を用いた試料の観察は、一般的には、観察対象の試料が真空等の特殊な空間に曝される。一方、近年では、メカノバイオロジー（Ｍｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）と呼ばれる技術分野において、生体細胞、生体組織等をそのまま観察したいという要求がある。しかしながら、電子顕微鏡での観察の際に試料を真空中に曝すと、細胞等は、液体成分が揮発していくことで変質し、また測定環境の汚染につながってしまう。これを防ぐために、様々な方法が開発されている。

例えば、試料を急速凍結して薄い氷の中に閉じ込め、冷凍状態で観察する技術がある。しかしながら、冷凍状態で観察する技術は、容易に観察用の試料を作製することができず、また、試料作成用の装置が非常に特殊であり高価なものであった。

さらに、液体中に試料を保持したまま観察することで、さらに試料を直接的に観察するための技術が、特許文献１に開示されている。この技術では、観察用のセルを構成する薄膜間に試料を含む液体を配置しつつ、試料が配置される空間をセルの外部空間と遮断する。電子線は、薄膜を透過して薄膜間の試料に到達するようになっている。

特開２００７−１６５２７１号公報

特許文献１に開示されたセルのうち、注入口から試料を含む液体を注入する方式のセルにおいては、観察孔の大きさが小さい。そのため、観察孔に観察対象となる試料が到達しているか、電子顕微鏡による測定前に確認することが困難であった。また、試料を座体に配置した後に蓋体を被せ、座体と蓋体とを接着剤で接合する方式のセルについても特許文献１に開示されている。このようなセルでは、接合に高度な技術がユーザに求められ、座体と蓋体との接合がうまくいかずに内部の液体が漏れ出したり、座体と蓋体とのギャップ制御が困難であったりする場合があった。これらの複数の問題の少なくとも１つが生じる結果、試料を収容したセルが電子顕微鏡による観察に用いることができない状態であることも多くなり、ユーザの利便性を損ねていた。

本開示の実施形態の目的の一つは、試料を収容するセルの利便性を高めることにある。

本開示の一実施形態によると、第１開口部を有する第１層と、前記第１層に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に電子線透過部を有する第２層と、前記第１層と前記第２層との間に配置され、前記第１層に接する第１薄膜と、前記第１薄膜に接して配置される中間層と、前記第１層又は前記第２層に配置された液体注入口と、を備え、前記第１薄膜は、前記第１開口部を塞ぎ、電子線に対して透過性を有し、前記中間層は、前記液体注入口の端部から所定の距離にわたって拡がり、前記第１薄膜と前記電子線透過部の間の観察空間と当該液体注入口とを接続する流路空間を備える試料収容セルを提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

前記中間層に接して配置される第２薄膜をさらに備え、前記第２層は、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有し、前記第２薄膜は、前記第２開口部を塞ぎ、前記液体注入口に対応する位置で開口し、電子線に対して透過性を有し、前記電子線透過部は、前記第２開口部と前記第２薄膜とにより構成されてもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記液体注入口が前記第１層に配置されもよい。これによれば、電子線の入射角のマージンが確保できる。また、空気より軽いガス中のウイルスなどを検出する際に注入しやすい。観察しながら試料を入れ替えることも可能である。

前記第１層は、シリコンであり、前記第２層は、シリコン薄膜であり、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、窒化ケイ素であり、前記中間層は、酸化ケイ素であってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層は、シリコンであり、前記第２層は、シリコン薄膜であり、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、酸化ケイ素であり、前記中間層は、窒化ケイ素であってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層は、シリコンであり、前記第２層は、シリコン薄膜であり、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、アモルファスシリコンであり、前記中間層は、窒化ケイ素又は酸化ケイ素であってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層は、シリコンであり、前記第２層は、シリコン薄膜であり、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、窒化ケイ素、酸化ケイ素又はアモルファスシリコンであり、前記中間層は、金属であってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１開口部及び前記第２開口部がテーパ状の構造を有してもよい。これによれば、電子線の入射角のマージンが確保できる。

前記液体注入口の側面がスキャロップ形状を有してもよい。これによれば、封止材による封止性能を向上させることができる。

前記第１開口部及び前記第２開口部が曲線テーパ状の構造を有してもよい。これによれば、電子線の入射角のマージンが確保できる。

前記第１開口部及び前記第２開口部が段付きテーパ状の構造を有してもよい。これによれば、電子線の入射角のマージンが確保できる。また、第１開口部が段付きテーパ状の構造を有することにより、測定装置に取付けるガイドとすることができる。

前記第１層および前記第２層は、表面が（１００）面、（１１０）面又は（１１１）面であってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

本開示の一実施形態によると、第１層上に、第１薄膜、中間層及び第２層を順次積層し、前記第２層の第１領域及び第２領域をエッチングし、前記第２領域の前記第２層を貫通させ、前記第２領域に対応する前記中間層の領域を露出させて、前記中間層に接続する液体注入口を形成し、前記第１領域に対応する領域の前記第１層をエッチングし、前記第１薄膜を露出させて、前記第１層に第１開口部を形成し、前記液体注入口を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第２層の前記第１領域に電子線透過部を形成し、前記第１薄膜と前記電子線透過部との間の観察空間、及び当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成する試料収容セルの製造方法を提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

前記中間層上に第２薄膜をさらに積層し、前記第２層の前記第１領域及び前記第２領域をエッチングして貫通させて、前記第１領域に前記第２薄膜を露出する第２開口部を形成し、前記第２領域に対応する前記第２薄膜をエッチングして前記中間層の領域を露出させて、前記中間層に接続する液体注入口を形成し、前記液体注入口を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングして、前記第２層の前記第１領域に電子線透過部を形成してもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

本開示の一実施形態によると、第１層上に、第１薄膜、中間層、第２薄膜及び第２層を順次積層し、前記第２層の第１領域をエッチングして、前記第２薄膜を露出させ、前記第１領域に対応する前記第１層の領域及び前記第１層の第２領域をエッチングして、前記第１薄膜を露出させ、前記第１領域に第１開口部を形成し、前記第２領域に対応する前記第２薄膜をエッチングして前記中間層の領域を露出させて、前記中間層に接続する液体注入口を形成し、前記液体注入口を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第２層の前記第１領域に電子線透過部を形成し、前記第１薄膜と前記電子線透過部との間の観察空間、及び当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成する試料収容セルの製造方法を提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

前記第１層および前記第２層をエッチングして前記第１薄膜および前記第２薄膜を露出させ、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成してもよい。これによれば、工程負荷をほとんど増加させずに、試料収容セルの個片化を容易にすることができる。

前記第１層および前記第２層は、第２エッチング液又は第１エッチングガスを用いてエッチングし、前記第１層および前記第２層は、前記第２エッチング液又は第１エッチングガスよりも前記１エッチング液に対して耐性を有し、前記中間層は、前記第１エッチング液よりも前記第２エッチング液又は第１エッチングガスに対して耐性を有してもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層及び前記第２層は、第２エッチング液又は第１エッチングガスを用いてエッチングし、前記第１薄膜及び前記第２薄膜は、第２エッチングガスを用いてエッチングし、前記第１層および前記第２層は、前記第２エッチング液及び第１エッチングガスよりも前記第１エッチング液及び前記第２エッチングガスに対して耐性を有し、前記第１薄膜及び前記第２薄膜は、前記第２エッチングガスよりも前記第１エッチング液、前記第２エッチング液及び第１エッチングガスに対して耐性を有し、前記中間層は、前記第１エッチング液よりも前記第２エッチング液、前記第１エッチングガス及び前記第２エッチングガスに対して耐性を有してもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

本開示によると、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

本開示の第１実施形態における試料収容セル１００の外観を示す図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セル１００を第１層側から見た平面図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セル１００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セル１００へ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セル１００を封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料注入装置の試料注入処理を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料注入装置のセル封止処理を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。 図８に続く試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。 図９に続く試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。 図１０に続く試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。 本開示の第２実施形態における試料収容セル２００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第２実施形態における試料収容セル２００の変形例の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第３実施形態における試料収容セル３００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第４実施形態における試料収容セル４００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第４実施形態における試料収容セル４００の製造工程を説明する図である。 図１６に続く試料収容セル４００の製造工程を説明する図である。 図１７に続く試料収容セル４００の製造工程を説明する図である。 本開示の第５実施形態における試料収容セル５００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第５実施形態における試料収容セル５００の製造工程を説明する図である。 図２０に続く試料収容セル５００の製造工程を説明する図である。 本開示の第６実施形態における試料収容セル６００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第６実施形態における試料収容セル６００の製造工程を説明する図である。 図２３に続く試料収容セル６００の製造工程を説明する図である。 本開示の第１実施形態における複数の試料収容セルを分離する方法を説明する図である。 本開示の第７実施形態における試料収容セルを封止する方法を説明する図である。 本開示の第８実施形態における試料収容セル７００の流路空間ＦＰの形状を説明する図である。

＜第１実施形態＞
以下、本開示の一実施形態に係る試料収容セルについて、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は本開示の実施形態の一例であって、本開示はこれらの実施形態に限定して解釈されるものではない。なお、本実施形態で参照する図面において、同一部分または同様な機能を有する部分には同一の符号または類似の符号（数字の後にＡ、Ｂ等を付しただけの符号）を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、図面の寸法比率（各構成間の比率、縦横高さ方向の比率等）は説明の都合上実際の比率とは異なったり、構成の一部が図面から省略されたりする場合がある。

［試料収容セルの構成］
図１は、本開示の第１実施形態における試料収容セル１００の外観を示す図である。試料収容セル１００は、第１層１１０、第１薄膜１２０、中間層１３０、第２薄膜１４０および第２層１５０により形成されている。第２層１５０は第１層１１０に対向して配置され、第１薄膜１２０は第１層１１０と第２層１５０との間に、第１層１１０に接して配置され、中間層１３０は第１薄膜１２０に接して配置され、第２薄膜１４０は中間層１３０に接して配置される。また、第１層１１０の第１薄膜１２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜１６０が配置されてもよい。

第１層１１０はシリコン（支持層、支持基板）で構成され、数百μｍ（この例では３００μｍ）の膜厚を有する。また、第１層１１０にはシリコンに替えて、単結晶サファイア（Al₂O₃）；炭化ケイ素（SiC）；窒化ガリウム（GaN）；タングステン、モリブデン、銅、ステンレス等の金属；石英ガラス、硬質ガラス；アルミナ（Al₂O₃）、ジルコニア（ZrO₂）、AIN、SiC、BN等のセラミクス；SrTiO₃、LaAlO₃、MgO、TiO₂、Al₂O₃、SiO₂、LiNbO₃(SLN)、LiTaO₃(SLT)等の酸化物単結晶、及び、MgF₂、CaF₂、BaF₂、LiF等のフッ化物単結晶等の各種単結晶類から選択される材料を用いることもできる。

第２層１５０は、例えば、アモルファスシリコンやポリシリコン等のシリコン薄膜で構成され、１μｍ以上１００μｍ以下（この例では５μｍ）の膜厚を有する。また、第２層１５０にはシリコン薄膜に替えて、単結晶サファイア（Al₂O₃）；炭化ケイ素（SiC）；窒化ガリウム（GaN）；タングステン、モリブデン、銅、ステンレス等の金属；石英ガラス、硬質ガラス；アルミナ（Al₂O₃）、ジルコニア（ZrO₂）、AIN、SiC、BN等のセラミクス；SrTiO₃、LaAlO₃、MgO、TiO₂、Al₂O₃、SiO₂、LiNbO₃(SLN)、LiTaO₃(SLT)等の酸化物単結晶、及び、MgF₂、CaF₂、BaF₂、LiF等のフッ化物単結晶等の各種単結晶類から選択される材料を用いることもできる。

中間層１３０は酸化ケイ素、窒化ケイ素または金属材料で構成され、数百ｎｍ（この例では２００ｎｍ）の膜厚を有する。中間層１３０には、銅、銀、金、錫、アルミニウム、アルミニウムとネオジウムの合金、アルミニウムとケイ素の合金、アルミニウムとケイ素と銅の合金、ニッケル＋金、ニッケル＋パラジウム金、ベリリウム銅、ニッケル、タングステン、ベリリウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、白金、パラジウム、クロム、タンタル、タリウム、チタン、モリブデン等から選択される金属材料を用いることができる。中間層１３０は、これらの金属材料をめっき又はスパッタ法により堆積して形成することができる。中間層１３０を部分的に除去することで、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との間に空間（流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳ）を形成する。

試料収容セル１００は、電子顕微鏡の観察対象となる試料を液体に含ませた状態で、この内部空間に収容するセルである。以下、試料を含む液体を、試料含有液体と表現する場合がある。試料収容セル１００の大きさは、１辺が０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度の正方形または長方形であり、この例では一辺が概ね１．０ｍｍである。

第１層１１０および第２層１５０には、それぞれ開口部が形成されている。この例では、第１層１１０に比べて薄い第２層１５０に、開口部１５１、液体注入口１４１、１４３が配置されている。第１層１１０には、開口部１１１（図２，３参照）が配置されている。続いて、試料収容セル１００の内部構造を含めた詳細な構造について、図２、図３を用いて説明する。

図２は、本開示の第１実施形態における試料収容セル１００を第２層１５０側から見た平面図である。図３は、本開示の第１実施形態における試料収容セル１００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。なお、図３は、各断面線に対応する端面図を示している。以下の断面構成を示す模式図についても、それぞれ端面図として示している。

開口部１５１の中間層１３０側の開口は、第２層１５０に接して中間層１３０側に配置された第２薄膜１４０により塞がれている。これにより、開口部１５１と第２薄膜１４０とは電子線透過部を構成する。一方、液体注入口１４１または１４３に対応する位置では、第２薄膜１４０は開口している。また、開口部１１１の中間層１３０側の開口は、第１層１１０に接して中間層１３０側に配置された第１薄膜１２０により塞がれている。

開口部１５１を塞いでいる部分の第２薄膜１４０と、開口部１１１を塞いでいる部分の第１薄膜１２０とは対向している。第１薄膜１２０および第２薄膜１４０は、電子線に対して透過性を有する膜である。開口部１５１を塞いでいる部分の第１薄膜１２０と、開口部１１１を塞いでいる部分の第１薄膜１２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

第１薄膜１２０および第２薄膜１４０は中間層１３０の材料に応じて、例えば、シリコン（アモルファスシリコン、ポリシリコン、シリコン）、酸化ケイ素または窒化ケイ素で形成される。すなわち、中間層１３０として窒化ケイ素を選択する場合、第１薄膜１２０および第２薄膜１４０はシリコン（アモルファスシリコン、ポリシリコン、シリコン）または酸化ケイ素を選択することができる。また、中間層１３０として酸化ケイ素を選択する場合、第１薄膜１２０および第２薄膜１４０は窒化ケイ素を選択することができる。さらに、中間層１３０として金属材料を選択する場合、第１薄膜１２０および第２薄膜１４０はシリコン（アモルファスシリコン、ポリシリコン、シリコン）、酸化ケイ素または窒化ケイ素を選択することができる。

第１薄膜１２０および第２薄膜１４０の膜厚は、１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、望ましくは、１５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、この例では、２０ｎｍである。第１薄膜１２０と第２薄膜１４０とは同じ膜厚であってもよいし、異なる膜厚であってもよい。第１薄膜１２０および第２薄膜１４０は、１０ｎｍより薄くなると強度がなくなり破損するおそれがある。一方、２００ｎｍよりも厚くなると、電子線が透過しなくなる。したがって、第１薄膜１２０および第２薄膜１４０は、破損しない程度の膜の強度を得ながらも、できるだけ薄くすることが望ましい。

第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との距離は、中間層１３０の膜厚に対応する。そのため、この例では、上述した通り、２００ｎｍとなる。この距離は、試料すなわち観察対象物（例えば細胞）の大きさに依存して設定されることが望ましく、観察対象物よりも大きくする必要がある。一方、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との距離が観察対象物に対して大きすぎると、観察対象物が重なって個々の観察対象物の観察結果が得られにくくなったり、電子線が透過しにくくなったりする。すなわち、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との距離を、電子線が通過できない程度の距離以上にする必要はない。

開口部１５１と開口部１１１とは対向して配置され、第２層１５０側から見た場合に、中間層１３０側において、ほぼ同じ大きさで開口するように設計されている。開口部１５１および開口部１１１の開口（中間層１３０側）の形状は、この例では、５０μｍ×５０μｍの正方形である。なお、この開口の形状は、５μｍ×５０μｍ等の長方形であってもよい。

液体注入口１４１、１４３の開口の形状は、開口部１５１と比べて大きく、この例では、中間層１３０側の開口の大きさは、１００μｍ×１００μｍの正方形である。この開口の形状についても正方形でなく長方形であってもよい。説明に用いた各図では、構造をわかりやすくする表現するために、各構成間の比率等を調整して示している。

なお、これらの開口部１５１、液体注入口１４１、１４３の開口の形状は、四角形以外の多角形であってもよいし、円形、楕円形等、曲線で囲まれた形状であってもよいし、直線と曲線とで囲まれた形状であってもよい。ただし、第１層１１０および第２層１５０のエッチングを結晶異方性エッチングで行う場合には、開口の形状は四角形であることが望ましい。また、液体注入口１４１の形状と液体注入口１４３の形状とが異なっていてもよい。例えば、試料含有液体が注入される側の開口部が大きくてもよい。

開口部１５１、１１１は、その内壁が、第１薄膜１２０および第２薄膜１４０が拡がる平面（基板表面）に対して傾き（テーパ形状）を持って形成されている。液体注入口１４１、１４３についても、その内壁がその基板表面に対して傾きを持って形成されている。後述するように、（１００）面が表面になっている単結晶シリコンである第１層１１０を用い、ＴＭＡＨ（Tetramethylammonium hydroxide）水溶液等のエッチング液で結晶異方性エッチングを施すようにすれば、（１１１）面が開口部の側面に現れるため、テーパ形状の制御が容易になる。また、第２層１５０が同様の結晶方位を有する単結晶シリコンの場合には、同様にテーパ形状の制御が可能である。なお、第１層１１０及び第２層１５０の表面が（１１０）面又は（１１１）面であってもよい。また、第１層１１０及び第２層１５０に面方位がなくてもよい。

なお、開口部内において傾きの程度が一定でなく変化していてもよい。すなわち、開口部１５１、液体注入口１４１、１４３は中間層１３０側の開口面積が外部空間１９０側の開口面積よりも小さい。また、開口部１１１は中間層１３０側の開口面積が外部空間１９０側の開口面積よりも小さい。開口部１５１、１１１の内壁がテーパ形状であると、電子線の入射角のマージンを確保することができる。

第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との間には、中間層１３０によって囲まれた空間が形成されている。この空間は、上記の観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰを含み、液体注入口１４１の開口端部から拡がった第１範囲、および液体注入口１４３の開口端部から拡がった第２範囲を含んでいる。それぞれの開口端部から空間端部までは、ほぼ等距離（この例では、約１５０μｍ）に拡がっている。第１範囲と第２範囲とは一部において重複している。この例では、重複した部分に観察空間ＭＳが配置されている。

流路空間ＦＰは、観察空間ＭＳと外部空間１９０とを接続するための空間である。この例では、流路空間ＦＰは、少なくとも２つの開口部を介して外部空間１９０と接続し、この例では液体注入口１４１、１４３を介して外部空間１９０に接続する。一方の開口部が試料含有液体を注入するための開口であり、他方が流路空間ＦＰの空気を外部空間１９０に押し出すための排気口として機能する。

以上が、試料収容セル１００の構成についての説明である。試料収容セル１００は、開口部１５１と開口部１１１とがテーパ状の構造を有するため、電子線の入射角のマージンを確保することができる。続いて、試料収容セル１００に試料含有液体を配置して、電子顕微鏡にて観察できる状態にするための処理（観察セル作製処理）について説明する。

［観察セル作製処理］
図４は、本開示の第１実施形態における試料収容セル１００へ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。試料含有液体９１０は、流路空間ＦＰに液体注入口１４１から注入されると、流路空間ＦＰを移動して観察空間ＭＳに至り、さらには、液体注入口１４３まで到達する。なお、液体注入口１４１ではなく液体注入口１４３に試料含有液体９１０が注入されてもよいが、以下の説明では、液体注入口１４１に試料含有液体９１０が注入される液体注入口であるものとして説明する。この場合には、液体注入口１４３は、試料含有液体９１０が注入されるときに、流路空間ＦＰの気体を排出する排出口として機能する。

図５は、本開示の第１実施形態における試料収容セル１００を封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。試料含有液体９１０が流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳに充填された後、液体注入口１４１、１４３を封止材９３１、９３３で塞ぐことで、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳは、外部空間１９０と分離される。封止材９３１、９３３は、例えば、エポキシ樹脂等の樹脂であり、ＵＶ硬化型の樹脂であってもよいし、２液混合型硬化樹脂（例えば、２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプ）であってもよい。ＵＶ硬化型の場合には、液体注入口１４１、１４３を塞ぐように硬化前の樹脂を形成し、ＵＶ照射によって硬化させて封止材９３１、９３３が形成される。なお、封止材９３１、９３３によって外部空間１９０と分離された内部空間には気泡が含まれないようにしてもよいし、硬化前の樹脂と試料含有液体９１０とが混合しないように、少なくとも樹脂が硬化するまでは互いに離れた状態（試料含有液体と封止材との間に気泡が存在する状態）にしてもよい。

観察空間ＭＳに配置された試料含有液体９１０は、外部空間１９０と離隔されているため、電子顕微鏡による観察が行われる際に、試料収容セル１００が真空環境に曝されても、試料含有液体９１０が揮発してしまうことを防ぎ、液体の状態を保持することができる。また、観察空間ＭＳは、電子線に対して透過性を有する数十ｎｍ程度の第１薄膜１２０および第２薄膜１４０に囲まれている。観察空間ＭＳの高さ（第１薄膜１２０および第２薄膜１４０との距離）、すなわち試料含有液体９１０の厚さは、電子線に対して透過性を有する程度の大きさである。

したがって、電子顕微鏡で用いられる電子線（図５における電子線ＥＢ）は、開口部１５１を通って、第２薄膜１４０、試料含有液体９１０および第１薄膜１２０を通過し、さらに開口部１１を通過することができる。電子線ＥＢの方向は図５に示す方向とは逆であってもよい。

図４における試料注入処理、および図５におけるセル封止処理については、手動処理であっても、自動処理であってもよい。手動処理の場合には、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスキャピラリの先端と液体注入口１４１、１４３との位置関係を、実体顕微鏡を用いて確認し、ガラスキャピラリに接続されたインジェクタを用いて試料含有液体９１０を注入したり、封止材９３１、９３３を注入したりすればよい。

また、自動処理の場合には、試料注入処理およびセル封止処理を自動的に実行して観察セルを作成する装置を用いればよい。

［観察セル作製装置］
図６は、本開示の第１実施形態における観察セル作製装置の試料注入処理を説明する図である。観察セル作製装置８００は、試料注入器８１０、ＵＶ照射器８６０およびステージ８８８を備える。ステージ８８８には、チップ台８２５、カップ台８３５、８４５、試料台８５０が取り付けられている。チップ台８２５は、チップ８２０を収容する。チップ８２０は、試料含有液体９１０を吸い取るためのノズルを有するピペットチップである。カップ台８３５は、試料含有液体９１０を保持する試料カップ８３０を収容する。カップ台８４５は、封止材となる硬化前樹脂９３０を保持する試料カップ８４０を収容する。試料台８５０は、試料収容セル１００を設置する。また、ステージ８８８には、チップ８２０を廃棄するための廃棄口８７０が配置されている。

試料注入器８１０に対して、ステージ８８８は水平方向（図６における左右方向、以下、Ｘ方向という）に移動可能である。また、試料注入器８１０は、水平方向であってステージ８８８の移動方向とは垂直な方向（図６における奥行き方向、以下、Ｙ方向という）と、鉛直方向（図６における上下方向、以下、Ｚ方向という）とに移動可能である。したがって、試料注入器８１０とステージ８８８とでＸ、Ｙ、Ｚ方向で相対的に移動可能になっている。なお、ステージ８８８上の試料台８５０については、別途Ｙ方向にも移動可能であってもよい。

試料注入器８１０は、チップ取付部８１１、支持部８１３、制御部８１５およびチップ取り外し部８１７を備える。チップ取付部８１１は、先端にチップ８２０が差し込まれて取り付けられる部分である。支持部８１３は、装置天井に対してＹ方向、Ｚ方向に移動させるように試料注入器８１０を支持する。制御部８１５は、チップ取付部８１１に取り付けられたチップ８２０に試料カップ内の液体を吸い込んで保持したり、チップ８２０に保持された液体を排出したりするための制御を行う。チップ取り外し部８１７は、下方に移動することによって、チップ８２０を下方に押し出してチップ取付部８１１から取り外す。

ＵＶ照射器８６０は、硬化前樹脂９３０を硬化させるためのＵＶ光を照射する装置である。ＵＶ光の照射範囲は、試料台８５０に設置された試料収容セル１００全体を含んでいてもよいし、液体注入口１４１、１４３に対応する部分にスポットで照射するようにしてもよい。液体注入口１４１、１４３に対応する部分にスポットで照射するようにすれば、試料へのＵＶ光の影響を抑えることができる。

図６（ａ）は、試料収容セル１がセル保管庫等から運ばれて、観察セル作製装置８００の試料台８５０に設置された状態を示している。続いて、ステージ８８８と試料注入器８１０とを移動させ、以下に示す順に処理を実行する。まず、チップ取付部８１１にチップ８２０を取り付ける（図６（ｂ））。その後、試料注入器８１０は、試料カップ８３０内の試料含有液体９１０を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図６（ｃ））。試料含有液体９１０を保持するチップ８２０を試料収容セル１００の液体注入口１４１上に移動させて、チップ８２０内の試料含有液体９１０を排出して液体注入口１４１から試料収容セル１００内部に注入する（図６（ｄ））。

なお、チップ８２０を試料収容セル１００の液体注入口１４１上に移動させる際には、例えば、試料注入器８１０は、カメラ等の撮像部を用いて試料収容セル１００の形状を画像認識し、さらには液体注入口１４１の位置を認識し、液体注入口１４１の位置にチップ８２０を移動させる。続いて、観察セル作製装置８００の封止処理について説明する。

図７は、本開示の第１実施形態における観察セル作製装置のセル封止処理を説明する図である。試料注入器８１０は、試料カップ８４０内の硬化前樹脂９３０を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図７（ａ））。硬化前樹脂９３０を保持するチップ８２０を試料収容セル１００の液体注入口１４１上に移動させて、チップ８２０内の硬化前樹脂９３０を排出して液体注入口１４１に滴下し（図７（ｄ））、続いて、液体注入口１４３に滴下する（図７（ｅ））。なお、液体注入口１４３への滴下前に、再度チップ８２０内に硬化前樹脂９３０を吸い上げておいてもよい。硬化前樹脂９３０が、ＵＶ硬化型ではなく、上述した２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプであっても同様であり、この場合には、後述するＵＶ光の照射は不要である。

続いて、試料台８５０をＵＶ照射器８６０の下方に移動させ、試料収容セル１にＵＶ照射器８６０からのＵＶ光を照射する。この照射によって、試料収容セル１００の液体注入口１４１、１４３に滴下された硬化前樹脂９３０を硬化させる。このとき、試料含有液体９１０に細胞や生体由来の試料が含まれる場合は、ＵＶ光を試料収容セル１の液体注入口１４１、１４３に滴下された硬化前樹脂９３０のみに照射することが好ましい。これによって、試料収容セル１００の内部空間に試料含有液体９１０が外部空間１９０と離隔された状態で収容される。また、試料注入器８１０は、チップ取り外し部８１７によって、チップ８２０をチップ取付部８１１から取り外して廃棄口８７０に廃棄する。ＵＶ光の照射中にチップ８２０の廃棄が実施されてもよい。

その後、試料含有液体９１０を収容した試料収容セル１００が回収され、新たな試料収容セル１００が試料台８５０に設置される（図６（ａ））。なお、チップ８２０は、試料収容セル１００毎に交換するプロセスを説明したが、液体注入口１４１に滴下する硬化前樹脂９３０を吸い上げる前にチップ８２０を交換してもよい。

以上が、観察セル作製装置８００による試料注入処理およびセル封止処理についての説明である。続いて、試料収容セル１００の製造方法について図８〜図１０を用いて説明する。

［試料収容セルの製造方法］
試料収容セル１００は、上述したように、シリコン基板１１０上に各層を積層した基材を用いて製造される。そして、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との間に形成された中間層１３０の一部をエッチングすることによって、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０の間に、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを形成する。以下、具体的に、試料収容セル１００の製造方法を説明する。

図８は、本開示の第１実施形態における試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。図９は、図８に続く試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。図１０は、図９に続く試料収容セル１００の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。まず、図８（ａ）に示すように、第１層１１０を準備する。

第１層１１０上に、第１薄膜１２０を形成する（図８（ｂ））。第１薄膜１２０は中間層１３０の材料に応じて、例えば、アモルファスシリコン、酸化ケイ素または窒化ケイ素で形成される。第１薄膜１２０は、例えば、真空蒸着法や、化学気相成長（ＣＶＤ）法等のＭＥＭＳの分野で用いられる公知の方法で形成することができる。また、酸化ケイ素はシリコンの熱酸化により形成することもできる。

第１薄膜１２０上に、中間層１３０を形成する（図８（ｃ））。中間層１３０は酸化ケイ素、窒化ケイ素または金属材料で形成することができる。中間層１３０には、銅、銀、金、錫、アルミニウム、アルミニウムとネオジウムの合金、アルミニウムとケイ素の合金、アルミニウムとケイ素と銅の合金、ニッケルニッケル＋金、ニッケル＋パラジウム金、ベリリウム銅、ニッケル、タングステン、ベリリウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、白金、パラジウム、クロム、タンタル、タリウム、チタン、モリブデン等から選択される金属材料を用いることができる。中間層１３０は、例えば、真空蒸着法や、化学気相成長（ＣＶＤ）法、スパッタリング法等のＭＥＭＳの分野で用いられる公知の方法で形成することができる。

中間層１３０上に、第２薄膜１４０を形成する（図８（ｄ））。第２薄膜１４０は、第１薄膜１２０と同様の材料を用いて、同様の形成方法により形成することができるため、詳細な説明は省略する。

第２薄膜１４０上に、第２層１５０を形成する（図８（ｅ））。第２層１５０は、例えば、アモルファスシリコンやポリシリコン等のシリコン薄膜で形成することができる。また、第２層１５０にはシリコン薄膜に替えて、単結晶サファイア（Al₂O₃）；炭化ケイ素（SiC）；窒化ガリウム（GaN）；タングステン、モリブデン、銅、ステンレス等の金属；石英ガラス、硬質ガラス；アルミナ（Al₂O₃）、ジルコニア（ZrO₂）、AIN、SiC、BN等のセラミクス；SrTiO₃、LaAlO₃、MgO、TiO₂、Al₂O₃、SiO₂、LiNbO₃(SLN)、LiTaO₃(SLT)等の酸化物単結晶、及び、MgF₂、CaF₂、BaF₂、LiF等のフッ化物単結晶等の各種単結晶類から選択される材料を用いることもできる。第２層１５０、例えば、真空蒸着法や、化学気相成長（ＣＶＤ）法、スパッタリング法等のＭＥＭＳの分野で用いられる公知の方法で形成することができる。

一実施形態においては、第１層１１０および第２層１５０は、第２エッチング液又は第１エッチングガスを用いてエッチングする。第１層１１０および第２層１５０は、第２エッチング液又は第１エッチングガスよりも第１エッチング液に対して耐性を有する。中間層１３０は、第１エッチング液よりも第２エッチング液又は第１エッチングガスに対して耐性を有する。

また、一実施形態においては、第１層１１０及び第２層１５０は、第２エッチング液又は第１エッチングガスを用いてエッチングする。第１薄膜１２０及び第２薄膜１４０は、第２エッチングガスを用いてエッチングする。第１層１１０および第２層１５０は、第２エッチング液及び第１エッチングガスよりも第１エッチング液及び第２エッチングガスに対して耐性を有することが好ましい。第１薄膜１２０及び第２薄膜１４０は、前記第２エッチングガスよりも第１エッチング液、第２エッチング液及び第１エッチングガスに対して耐性を有しことが好ましい。また、中間層１３０は、第１エッチング液よりも前記第２エッチング液、第１エッチングガス及び第２エッチングガスに対して耐性を有することが好ましい。

図９（ａ）に示すように、第２層１５０の上面に、マスク層１５５を形成する。マスク層１５５は、後述するシリコンに対するエッチング液（この例では水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）水溶液又は水酸化カリウム（ＫＯＨ）水溶液）に対して耐性（エッチングレートが低い）を有する膜が望ましく、例えば、シリコン窒化膜である。マスク層１５５の膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上２μｍ以下である。

これらの膜は、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理等によって形成されればよい。また、マスク層１５５がシリコン窒化膜でなく酸化ケイ素膜であれば、第２層１５０を熱酸化することで表面に形成された熱酸化膜を用いてもよい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層１５５の一部をエッチングする。エッチングされる領域は、開口部１５１、液体注入口１４１、１４３に対応する領域である。マスク層１５５のエッチングには、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）が用いられる。このとき、第２層１５０についても一部エッチング（オーバーエッチング）してもよい。なお、膜のエッチングのためには、ドライエッチングおよびウエットエッチングのいずれも適用可能であり、特に明示しない限り以下の説明においても同様である。

次に、マスク層１５５をエッチングマスクとして、第２層１５０をエッチングして第２薄膜１４０を露出させる（図９（ｂ））。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液が用いられる。第２薄膜１４０がエッチングストッパとなって、第２層１５０がエッチングされる。この例では、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いることにより、第２層１５０がテーパ状にエッチングされる。これにより、開口部１５１、１５２及び１５３が形成される。その後、第２層１５０からマスク層１５５を剥離する。

次に、フォトリソグラフィ技術を用いて、開口部１５１及び第２層１５０を覆うようにレジスト層１５７を形成する（図９（ｃ））。なお、レジスト層１５７は、ＲＩＥで用いるＳＦ₆等のエッチングガスに対して耐性を有することが望ましい。しかし、完全な耐性を有することは困難であるため、後述するＳＦ₆等を用いたエッチングにおいて減少する膜厚分を考慮して、予め厚膜化しておいてもよい。

次に、ＲＩＥを用いて、第２薄膜１４０の一部をエッチングする（図９（ｄ））。第２薄膜１４０は、少なくとも、開口部１５１に形成された部分を残し、かつ、開口部１５２、１５３から中間層１３０の少なくとも一部が露出するようにエッチングされる。この工程により、第２層１５０側のパターンの形成が終了する。その後、第２層１５０からレジスト層１５７を剥離する。

次に、第１層１１０の第２薄膜１４０が形成されている面とは反対側の面に酸化膜１６０を形成する（図１０（ａ））。酸化膜１６０は、例えば、プラズマＣＶＤにより形成することができ、その膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上１０μｍであるが、これに限定されない。酸化膜１６０上にマスク層１６５を形成し、ＲＩＥを用いて、酸化膜１６０をエッチングする（図１０（ｂ））。エッチングされる領域は、開口部１１１に対応する領域である。その後、酸化膜１６０からマスク層１６５を剥離する。

そして、酸化膜１６０をエッチングマスクとして、第１層１１０をエッチングする（図１０（ｃ））。このエッチングは、第２層１５０のエッチングと同様に、結晶異方性エッチングであり、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液が用いられる。この例では、第１層１１０（シリコン）の表面が（１００）面であり、開口部１１１の側面が、エッチングレートの遅い（１１１）面に沿って形成される。また、第１薄膜１２０がエッチングストッパとなる。なお、第２層１５０に比べて、第１層１１０は、エッチングされる層厚が大きい。したがって、図１０（ｂ）においてマスク層１６５がエッチングされる領域は、図９（ａ）において開口部１５１の位置に対応してマスク層１５５がエッチングされた領域よりも大きくなる。

次に、液体注入口１４１、１４３を介して中間層１３０にエッチング液を供給することによって、中間層１３０をエッチングする（図１１）。本実施形態において、等方性のエッチングにより中間層１３０がエッチングされる。エッチング液は、この例では、ＢＨＦである。このエッチングは、等方性エッチングであるため、エッチング時間の経過とともに、液体注入口１４１、１４３の開口端部から拡がるように中間層１３０がエッチングされていく。一方、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０とは、ＢＨＦに対して耐性を有しているため、ほとんどエッチングされない。そのため、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との間に空間が形成されていく。

そして、液体注入口１４１、１４３の双方から拡がった空間が接続され、かつ、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０とが対向する領域（観察空間ＭＳ）が形成された後に、エッチングを終了する。これによって、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０との間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳが形成される。なお、中間層１３０のエッチングの際には、エッチング液中に気泡が発生する場合がある。このような場合には、脱気処理をしつつ、エッチング処理を実行すればよい。観察空間ＭＳが形成されることにより、開口部１５１と第２薄膜１４０とは電子線透過部を形成する。

上述した試料収容セル１００は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル１００が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル１００を個片化するための処理が行われる。この処理は、ダイシング等により切断するものであってもよいが、この例では、別の方法により個片化を実現する。

（実施例１）
上述した第１実施形態の試料収容セル１００について、具体的な実施例を示して、さらに説明する。実施例１の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０として窒化ケイ素、中間層１３０として酸化ケイ素、第２薄膜１４０として窒化ケイ素および第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。

実施例１においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例１においては、フッ酸を用いた等方性エッチングにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例１の試料収容セルを製造することができる。

（実施例２）
実施例２の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０として酸化ケイ素、中間層１３０として窒化ケイ素、第２薄膜１４０として酸化ケイ素および第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。

実施例２においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例２においては、熱リン酸を用いた等方性エッチングにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例２の試料収容セルを製造することができる。

（実施例３）
実施例３の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０としてアモルファスシリコン又はポリシリコン、中間層１３０として窒化ケイ素、第２薄膜１４０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンおよび第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。

実施例３においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例３においては、熱リン酸を用いた等方性エッチングにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例３の試料収容セルを製造することができる。

（実施例４）
実施例４の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０としてアモルファスシリコン又はポリシリコン、中間層１３０として酸化ケイ素、第２薄膜１４０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンおよび第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。

実施例４においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例４においては、フッ酸を用いた等方性エッチングにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例４の試料収容セルを製造することができる。

（実施例５）
実施例５の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０として窒化ケイ素、中間層１３０として金属材料、第２薄膜１４０として窒化ケイ素および第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。なお、中間層１３０に用いる金属材料は、上述した材料から選択することができるため、詳細な説明は省略する。

実施例５においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例５においては、中間層１３０として用いた金属材料に応じた公知のエッチング液を選択することにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例５の試料収容セルを製造することができる。

（実施例６）
実施例６の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０として酸化ケイ素、中間層１３０として金属材料、第２薄膜１４０として酸化ケイ素および第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。なお、中間層１３０に用いる金属材料は、上述した材料から選択することができるため、詳細な説明は省略する。

実施例６においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例６においては、中間層１３０として用いた金属材料に応じた公知のエッチング液を選択することにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例６の試料収容セルを製造することができる。

（実施例７）
実施例７の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０としてシリコン基板、第１薄膜１２０としてアモルファスシリコン又はポリシリコン、中間層１３０として金属材料、第２薄膜１４０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンおよび第２層１５０としてアモルファスシリコン又はポリシリコンを選択することができる。なお、中間層１３０に用いる金属材料は、上述した材料から選択することができるため、詳細な説明は省略する。

実施例７においては、第１層１１０及び第２層１５０は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングによりエッチングしてもよく、また、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）やＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によりエッチングしてもよい。第１層１１０は、ＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる異方性エッチングやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。また、第２層１５０は、ＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例７においては、中間層１３０として用いた金属材料に応じた公知のエッチング液を選択することにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例７の試料収容セルを製造することができる。

（実施例８）
実施例８の試料収容セルとして、例えば、第１層１１０と第２層１５０は、シリコンに替えて、単結晶サファイア（Al₂O₃）；炭化ケイ素（SiC）；窒化ガリウム（GaN）；タングステン、モリブデン、銅、ステンレス等の金属；石英ガラス、硬質ガラス；アルミナ（Al₂O₃）、ジルコニア（ZrO₂）、AIN、SiC、BN等のセラミクス；SrTiO₃、LaAlO₃、MgO、TiO₂、Al₂O₃、SiO₂、LiNbO₃(SLN)、LiTaO₃(SLT)等の酸化物単結晶、及び、MgF₂、CaF₂、BaF₂、LiF等のフッ化物単結晶等の各種単結晶類から選択される材料を用いて形成することができる。

また、実施例８の試料収容セルとして、第１薄膜１２０と第２薄膜１４０には、中間層１３０のエッチング液に耐性があり、中間層１３０との選択比が大きい材料を選択することができる。中間層１３０には、中間層１３０のエッチング液に耐性がなく、第１薄膜１２０及び第２薄膜１４０との選択比が大きい材料を選択することができる。

実施例８においては、第１層１１０及び第２層１５０は、選択した材料に応じたエッチング液を用いた異方性エッチングやＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることができる。

実施例８においては、中間層のエッチング速度が速く、第１薄膜及び第２薄膜にはエッチング速度が遅い液およびガスにより、中間層１３０をエッチングすることができる。このように、実施例８の試料収容セルを製造することができる。

＜第２実施形態＞
図１２は、本開示の第２実施形態における試料収容セル２００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。試料収容セル２００は、第１層２１０、第１薄膜２２０、中間層２３０、第２薄膜２４０および第２層２５０により形成されている。第２層２５０は第１層２１０に対向して配置され、第１薄膜２２０は第１層２１０と第２層２５０との間に、第１層２１０に接して配置され、中間層２３０は第１薄膜２２０に接して配置され、第２薄膜２４０は中間層２３０に接して配置される。また、第１層２１０の第１薄膜２２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜２６０が配置されてもよい。

開口部２５１の中間層２３０側の開口は、第２層２５０に接して中間層２３０側に配置された第２薄膜２４０により塞がれている。これにより、開口部２５１と第２薄膜２４０とは電子線透過部を構成する。一方、液体注入口２４１または２４３に対応する位置では、第２薄膜２４０は開口している。また、開口部２１１の中間層２３０側の開口は、第１層２１０に接して中間層２３０側に配置された第１薄膜２２０により塞がれている。

開口部２５１を塞いでいる部分の第２薄膜２４０と、開口部２１１を塞いでいる部分の第１薄膜２２０とは対向している。第１薄膜２２０および第２薄膜２４０は、電子線に対して透過性を有する膜である。開口部２５１を塞いでいる部分の第１薄膜２２０と、開口部２１１を塞いでいる部分の第１薄膜２２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

試料収容セル２００においては、開口部２５１、液体注入口２４１、２４３及び開口部２１１は、テーパ状の構造を有していない点で、第１実施形態の試料収容セル１００とは異なる。なお、開口部２５１、液体注入口２４１、２４３及び開口部２１１は、各層及び膜をＲＩＥやＤＲＩＥによりエッチングすることにより形成することができる。第１層２１０、第１薄膜２２０、中間層２３０、第２薄膜２４０および第２層２５０に用いる材料は、上述した第１実施形態の試料収容セル１００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

試料収容セル２００は、開口部２５１及び開口部２１１においてテーパ状の構造をなくすことにより、必用な電子線のみを使用することができる。

また、図１３は、本開示の第２実施形態における試料収容セル２００Ａの変形例の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。試料収容セル２００Ａは、第１層２１０ａ、第１薄膜２２０、中間層２３０、第２薄膜２４０および第２層２５０ａにより形成されている。第２層２５０ａは第１層２１０ａに対向して配置され、第１薄膜２２０は第１層２１０ａと第２層２５０ａとの間に、第１層２１０ａに接して配置され、中間層２３０は第１薄膜２２０に接して配置され、第２薄膜２４０は中間層２３０に接して配置される。また、第１層２１０ａの第１薄膜２２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜２６０が配置されてもよい。

試料収容セル２００Ａは、開口部２５１ａ、液体注入口２４１ａ及び２４３ａが配置された第２層２５０ａの側面と、開口部２１１ａが配置された第１層２１０ａの側面とがスキャロップ形状を有する点で、試料収容セル２００とは異なる。他の構成は、試料収容セル２００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

図１３に示したように、試料収容セル２００Ａにおいては、液体注入口２４１ａ及び２４３ａが配置された第１層２１０ａの側面がスキャロップ形状を有するため、封止材９３１で液体注入口２４１ａ及び２４３ａを封止した際にアンカー効果により封止材９３１が外れにくくなり、封止性能を向上させることができる。

なお、開口部２５１ａ、液体注入口２４１ａ、２４３ａ及び開口部２１１ａは、各層及び膜をＤＲＩＥによりエッチングすることにより形成することができる。第１層２１０ａ、第１薄膜２２０、中間層２３０、第２薄膜２４０および第２層２５０ａに用いる材料は、上述した第１実施形態の試料収容セル１００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

＜第３実施形態＞
図１４は、本開示の第３実施形態における試料収容セル３００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。試料収容セル３００は、第１層３１０、第１薄膜３２０、中間層３３０、第２薄膜３４０および第２層３５０により形成されている。第２層３５０は第１層３１０に対向して配置され、第１薄膜３２０は第１層３１０と第２層３５０との間に、第１層３１０に接して配置され、中間層３３０は第１薄膜３２０に接して配置され、第２薄膜３４０は中間層３３０に接して配置される。また、第１層３１０の第１薄膜３２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜３６０が配置されてもよい。

開口部３５１の中間層３３０側の開口は、第２層３５０に接して中間層３３０側に配置された第２薄膜３４０により塞がれている。これにより、開口部３５１と第２薄膜３４０とは電子線透過部を構成する。一方、液体注入口３４１または３４３に対応する位置では、第２薄膜３４０は開口している。また、開口部３１１の中間層３３０側の開口は、第１層３１０に接して中間層３３０側に配置された第１薄膜３２０により塞がれている。

開口部３５１を塞いでいる部分の第２薄膜３４０と、開口部３１１を塞いでいる部分の第１薄膜３２０とは対向している。第１薄膜３２０および第２薄膜３４０は、電子線に対して透過性を有する膜である。開口部３５１を塞いでいる部分の第１薄膜３２０と、開口部３１１を塞いでいる部分の第１薄膜３２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

試料収容セル３００においては、開口部３５１、液体注入口３４１、３４３及び開口部３１１は、曲線テーパ状の構造を有している点で、他の実施形態の試料収容セルとは異なる。本開示において、曲線テーパ状の構造とは、図１４の試料収容セル３００の積層方向の断面（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）において、中間層３３０側から第１層３１０の中間層３３０とは反対側の面、中間層３３０側から第２層３５０の中間層３３０とは反対側の面に向かって、開口面積が広がるテーパ状の構造であって、開口部のテーパ状の壁面が開口に向かって凹状の曲面を有する構造である。

なお、開口部３５１、液体注入口３４１、３４３及び開口部３１１は、各層及び膜をフッ酸、酢酸、硝酸混合液を用いたウエットエッチング、SF₆を用いたドライエッチングによりエッチングすることにより形成することができる。第１層３１０、第１薄膜３２０、中間層３３０、第２薄膜３４０および第２層３５０に用いる材料は、上述した第１実施形態の試料収容セル１００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

試料収容セル３００は、開口部３５１及び開口部３１１において曲線テーパ状の構造を有することにより、電子線の入射角のマージンを確保することができる。

＜第４実施形態＞
図１５は、本開示の第４実施形態における試料収容セル４００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。試料収容セル４００は、第１層４１０、第１薄膜４２０、中間層４３０、第２薄膜４４０および第２層４５０により形成されている。第２層４５０は第１層４１０に対向して配置され、第１薄膜４２０は第１層４１０と第２層４５０との間に、第１層４１０に接して配置され、中間層４３０は第１薄膜４２０に接して配置され、第２薄膜４４０は中間層４３０に接して配置される。また、第１層４１０の第１薄膜４２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜４６０が配置されてもよい。

開口部４５１の中間層４３０側の開口は、第２層４５０に接して中間層４３０側に配置された第２薄膜４４０により塞がれている。これにより、開口部４５１と第２薄膜４４０とは電子線透過部を構成する。一方、液体注入口４４１または４４３に対応する位置では、第２薄膜４４０は開口している。また、開口部４１１の中間層４３０側の開口は、第１層４１０に接して中間層４３０側に配置された第１薄膜４２０により塞がれている。

開口部４５１を塞いでいる部分の第２薄膜４４０と、開口部４１１を塞いでいる部分の第１薄膜４２０とは対向している。第１薄膜４２０および第２薄膜４４０は、電子線に対して透過性を有する膜である。開口部４５１を塞いでいる部分の第１薄膜４２０と、開口部４１１を塞いでいる部分の第１薄膜４２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

試料収容セル４００においては、開口部４５１、液体注入口４４１、４４３及び開口部４１１は、段付きテーパ状の構造を有している点で、他の実施形態の試料収容セルとは異なる。本開示において、段付きテーパ状の構造とは、図１５の試料収容セル４００の積層方向の断面（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）において、中間層４３０側から第１層４１０の中間層４３０とは反対側の面、中間層４３０側から第２層４５０の中間層４３０とは反対側の面に向かって、開口面積が広がるテーパ状の構造であって、開口部のテーパ状の壁面が開口に向かって階段状の形状を有する構造である。

なお、開口部４５１、液体注入口４４１、４４３及び開口部４１１は、ＤＲＩＥによりエッチングすることにより形成することができる。第１層４１０、第１薄膜４２０、中間層４３０、第２薄膜４４０および第２層４５０に用いる材料は、上述した第１実施形態の試料収容セル１００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

試料収容セル４００は、開口部４５１及び開口部４１１において段付きテーパ状の構造を有することにより、電子線の入射角のマージンを確保することができる。また、開口部４１１を測定装置に取付ける時にガイドとして用いることができる。

［試料収容セル４００の製造方法］
試料収容セル４００は、上述した第１の実施形態と同様に、第１層４１０上に、第１薄膜４２０、中間層４３０、第２薄膜４４０および第２層４５０を積層した基材を用いて製造される。第１層４１０上に、第１薄膜４２０、中間層４３０、第２薄膜４４０および第２層４５０を積層する方法は、第１の実施形態の試料収容セル１００の製造方法において説明したため、詳細な説明は省略する。

図１６は、本開示の第４実施形態における試料収容セル４００の製造工程を説明する図である。図１７は、図１６に続く試料収容セル４００の製造工程を説明する図である。図１８は、図１７に続く試料収容セル４００の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。

まず、図１６（ａ）に示すように、第２層４５０の上面に、マスク層４５５を形成する。マスク層４５５は、後述するシリコンに対するＤＲＩＥに用いるエッチングガスに対して耐性（エッチングレートが低い）を有する膜が望ましい。マスク層４５５の膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上２μｍ以下である。

これらの膜は、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理等によって形成されればよい。また、マスク層４５５が酸化ケイ素膜であれば、第２層４５０を熱酸化することで表面に形成された熱酸化膜を用いてもよい。マスク層４５５は無機膜に限定されず、フォトレジストにより形成してもよい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層４５５の一部をエッチングする。エッチングされる領域は、開口部４５１、液体注入口４４１、４４３に対応する領域である。マスク層４５５のエッチングには、ＲＩＥが用いられる。このとき、第２層４５０についても一部エッチング（オーバーエッチング）してもよい。また、フォトレジストを用いて、公知のフォトリソグラフィによりマスク層４５５を形成してもよい。

次に、マスク層４５５をエッチングマスクとして、第２層４５０をＤＲＩＥにより所定の領域をエッチングして、段付きテーパ状の構造の１段目を形成する。その後、マスク層４５５を剥離して、エッチングした第２層４５０を露出させる（図１６（ｂ））。

次に、開口部４５２、４５３に対応する領域を開口したマスク層４５７を第２層４５０上に形成する。マスク層４５７をエッチングマスクとして、第２層４５０をＲＩＥにより所定の領域をエッチングして、段付きテーパ状の構造の２段目を形成するとともに、第２薄膜４４０を露出させる（図１６（ｂ））。第２薄膜４４０がエッチングストッパとなって、第２層４５０がエッチングされる。これにより、開口部４５２、４５３が形成される。その後、第２層４５０からマスク層４５７を剥離する。

次に、フォトリソグラフィ技術を用いて、開口部４５１及び第２層４５０を覆うようにマスク層４５９を形成する（図１６（ｄ））。なお、マスク層４５９は、ＤＲＩＥに用いるエッチングガスに対して耐性を有することが望ましい。しかし、完全な耐性を有することは困難であるため、後述するＲＩＥに用いるエッチングガスにおいて減少する膜厚分を考慮して、予め厚膜化しておいてもよい。

次に、ＲＩＥを用いて、第２薄膜４４０の一部をエッチングする。第２薄膜４４０は、少なくとも、開口部４５１に形成された部分を残し、かつ、開口部４５２、４５３から中間層４３０の少なくとも一部が露出するようにエッチングされる。この工程により、第２層４５０側のパターンの形成が終了する。その後、第２層４５０からマスク層４５９を剥離する（図１７（ａ））。

次に、第１層４１０の第１薄膜４２０が形成されている面とは反対側の面にマスク層４６５を形成する（図１７（ｂ））。ＲＩＥを用いて、第１層４１０をエッチングする（図１７（ｃ））。このエッチングは、第２層４５０のエッチングと同様に、ＤＲＩＥが用いられる。これにより、段付きテーパ状の構造の１段目を形成する。

次に、第１層４１０の開口部４１１を配置する領域を開口したマスク層４６７を第１層４１０上に形成する（図１８（ａ））。マスク層４６７をエッチングマスクとして、第１層４１０をＤＲＩＥにより所定の領域をエッチングして、段付きテーパ状の構造の２段目を形成するとともに、第１薄膜４２０を露出させる（図１８（ｂ））。第１薄膜４２０がエッチングストッパとなって、第１層４１０がエッチングされる。これにより、開口部４１１が形成される。その後、第１層４１０からマスク層４６７を剥離する。

液体注入口４４１、４４３を介して中間層４３０をエッチングする工程は、第１実施形態と同様に、等方性のエッチングにより形成することができるため、詳細な説明は省略する。

上述した試料収容セル４００は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル４００が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル４００を個片化するための処理が行われる。

＜第５実施形態＞
図１９は、本開示の第５実施形態における試料収容セル５００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。試料収容セル５００は、第１層５１０、第１薄膜５２０、中間層５３０、第２薄膜５４０および第２層５５０により形成されている。第２層５５０は第１層５１０に対向して配置され、第１薄膜５２０は第１層５１０と第２層５５０との間に、第１層５１０に接して配置され、中間層５３０は第１薄膜５２０に接して配置され、第２薄膜５４０は中間層５３０に接して配置される。また、第１層５１０の第１薄膜５２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜５６０が配置されてもよい。

開口部５５１の中間層５３０側の開口は、第２層５５０に接して中間層５３０側に配置された第２薄膜５４０により塞がれている。これにより、開口部５５１と第２薄膜５４０とは電子線透過部を構成する。また、開口部５１１の中間層５３０側の開口は、第１層５１０に接して中間層５３０側に配置された第１薄膜５２０により塞がれている。一方、液体注入口５２１または５２３に対応する位置では、第１層５１０は開口している。

開口部５５１を塞いでいる部分の第２薄膜５４０と、開口部５１１を塞いでいる部分の第１薄膜５２０とは対向している。第１薄膜５２０および第２薄膜５４０は、電子線に対して透過性を有する膜である。開口部５５１を塞いでいる部分の第２薄膜５４０と、開口部５１１を塞いでいる部分の第１薄膜５２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

試料収容セル５００においては、液体注入口５２１、５２３が開口部５１１側に配置される構造を有している点で、他の実施形態の試料収容セルとは異なる。なお、開口部５５１、開口部５１１及び液体注入口５２１、５２３は、第１実施形態と同様に、異方性エッチングにより形成することができる。また、試料収容セル５００は、第２実施形態と同様に、ＤＲＩＥによりエッチングすることにより形成することもできる。第１層５１０、第１薄膜５２０、中間層５３０、第２薄膜５４０および第２層５５０に用いる材料は、上述した第１実施形態の試料収容セル１００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

試料収容セル５００は、液体注入口５２１、５２３を開口部５１１側に配置することにより、電子線の入射角のマージンを確保することができる。また、空気より軽いガス中のウイルスなどを検出する際に注入しやすい利点もある。さらに、測定装置に配置して、観察しながら液体注入口５２１、５２３から試料を入れ替えることも可能である。

［試料収容セル５００の製造方法］
試料収容セル５００は、上述した第１の実施形態と同様に、第１層５１０上に、第１薄膜５２０、中間層５３０、第２薄膜５４０および第２層５５０を積層した基材を用いて製造される。第１層５１０上に、第１薄膜５２０、中間層５３０、第２薄膜５４０および第２層５５０を積層する方法は、第１の実施形態の試料収容セル１００の製造方法において説明したため、詳細な説明は省略する。

図２０は、本開示の第５実施形態における試料収容セル５００の製造工程を説明する図である。図２１は、図２０に続く試料収容セル５００の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。図２０及び図２１においては、第１実施形態と同様に、異方性エッチングにより形成する方法について説明する。なお、試料収容セル５００は、第２実施形態と同様に、ＤＲＩＥによりエッチングすることにより形成することもできる。

まず、図２０（ａ）に示すように、第２層５５０の上面に、マスク層５５５を形成する。マスク層５５５は、後述するシリコンに対するエッチング液（この例では水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）水溶液又は水酸化カリウム（ＫＯＨ）水溶液）に対して耐性（エッチングレートが低い）を有する膜が望ましく、例えば、シリコン窒化膜である。マスク層５５５の膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上２μｍ以下である。

これらの膜は、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理等によって形成されればよい。また、マスク層５５５が酸化ケイ素膜であれば、第２層５５０を熱酸化することで表面に形成された熱酸化膜を用いてもよい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層５５５の一部をエッチングする。エッチングされる領域は、開口部５５１に対応する領域である。マスク層５５５のエッチングには、ＲＩＥが用いられる。このとき、第２層５５０についても一部エッチング（オーバーエッチング）してもよい。なお、膜のエッチングのためには、ドライエッチングおよびウエットエッチングのいずれも適用可能であり、特に明示しない限り以下の説明においても同様である。

次に、マスク層５５５をエッチングマスクとして、第２層５５０をエッチングして、第２薄膜５４０を露出させる。第２薄膜５４０がエッチングストッパとなって、第２層５５０がエッチングされる。この例では、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いることにより、第２層５５０がテーパ状にエッチングされる。これにより、開口部５５１が形成される。その後、第２層５５０からマスク層５５５を剥離する。

次に、第１層５１０の第１薄膜５２０が形成されている面とは反対側の面に酸化膜５６０を形成する（図２０（ｂ））。酸化膜５６０は、例えば、プラズマＣＶＤにより形成することができ、その膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上１０μｍであるが、これに限定されない。酸化膜５６０上にマスク層５６５を形成する。酸化膜５６０をエッチングマスクとして、ＲＩＥを用いて、酸化膜５６０をエッチングする（図２０（ｄ））。エッチングされる領域は、開口部５１１、５１２、５１３に対応する領域である。その後、酸化膜５６０からマスク層５６５を剥離する。

そして、酸化膜５６０をエッチングマスクとして、第１層５１０をエッチングする（図２１（ａ））。このエッチングは、第２層５５０のエッチングと同様に、このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液が用いられる。これにより、第１薄膜５２０を露出する開口部５１１、５１２、５１３が形成される。

次に、フォトリソグラフィ技術を用いて、開口部５１１及び酸化膜５６０を覆うようにマスク層５６７を形成する（図２１（ｂ））。なお、マスク層５６７は、ＲＩＥに用いるエッチングガスに対して耐性を有することが望ましい。しかし、完全な耐性を有することは困難であるため、後述するＲＩＥに用いるエッチングガスにおいて減少する膜厚分を考慮して、予め厚膜化しておいてもよい。

次に、ＲＩＥを用いて、第１薄膜５２０の一部をエッチングする。第１薄膜５２０は、少なくとも、開口部５１１に形成された部分を残し、かつ、開口部５１２、５１３から中間層５３０の少なくとも一部が露出するようにエッチングされる（図２１（ｃ））。この工程により、第１薄膜５２０側のパターンの形成が終了する。その後、第１薄膜５２０及び酸化膜５６０からマスク層５６７を剥離する。

液体注入口５２１、５２３を介して中間層５３０をエッチングする工程は、第１実施形態と同様に、等方性のエッチングにより形成することができるため、詳細な説明は省略する。

上述した試料収容セル５００は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル５００が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル５００を個片化するための処理が行われる。

＜第６実施形態＞
図２２は、本開示の第６実施形態における試料収容セル６００の断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。試料収容セル６００は、第１層６１０、第１薄膜６２０、中間層６３０および第２層６５０により形成されている。第２層６５０は第１層６１０に対向して配置され、第１薄膜６２０は第１層６１０と第２層６５０との間に、第１層６１０に接して配置され、中間層６３０は第１薄膜６２０に接して配置される。また、第１層６１０の第１薄膜６２０が配置される面とは反対側の面に酸化膜６６０が配置されてもよい。

試料収容セル６００においては、電子線透過部６５１が第２層６５０のみで構成されている点で、他の実施形態の試料収容セルとは異なる。試料収容セル６００においては、第２薄膜は配置されず、電子線透過部６５１は第２層６５０の中間層６３０側の薄肉部で構成される。一方、液体注入口６５２または６５３に対応する位置では、第２層６５０は開口している。また、開口部６１１の中間層６３０側の開口は、第１層６１０に接して中間層６３０側に配置された第１薄膜６２０により塞がれている。

電子線透過部６５１と、開口部６１１を塞いでいる部分の第１薄膜６２０とは対向している。第１薄膜６２０は、電子線に対して透過性を有する膜である。また、電子線透過部６５１では、第２層６５０が薄肉化されているため、電子線に対して透過性を有する。電子線透過部６５１と、開口部６１１を塞いでいる部分の第１薄膜６２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

本開示において、テーパ状の構造とは、図２２の試料収容セル６００の積層方向の断面（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）において、中間層６３０側から第１層６１０の中間層６３０とは反対側の面、中間層６３０側から第２層６５０の中間層６３０とは反対側の面に向かって、開口面積が広がる形状を有する構造である。

なお、電子線透過部６５１、液体注入口６５２、６５３及び開口部６１１は、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる結晶異方性エッチングにより形成することができる。第１層６１０、第１薄膜６２０、中間層６３０および第２層６５０に用いる材料は、上述した第１実施形態の試料収容セル１００と同様であるため、詳細な説明は省略する。

試料収容セル６００は、電子線透過部６５１を第２層６５０で一体形成することにより、製造プロセスを簡素化することができる。

［試料収容セル６００の製造方法］
試料収容セル６００は、第１層６１０上に、第１薄膜６２０、中間層６３０および第２層６５０を積層した基材を用いて製造される。なお、第１層６１０上に、第１薄膜６２０、中間層６３０および第２層６５０を積層する方法は、第１の実施形態の試料収容セル１００の製造方法と同様に行うことができるため、詳細な説明は省略する。

図２３は、本開示の第６実施形態における試料収容セル６００の製造工程を説明する図である。図２４は、図２３に続く試料収容セル６００の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。

まず、図２３（ａ）に示すように、第２層６５０の上面に、マスク層６５５を形成する。マスク層６５５は、後述するシリコンに対するエッチング液（この例では水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）水溶液又は水酸化カリウム（ＫＯＨ）水溶液）に対して耐性（エッチングレートが低い）を有する膜が望ましく、例えば、シリコン窒化膜である。マスク層５５５の膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上２μｍ以下である。

これらの膜は、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理等によって形成されればよい。また、マスク層６５５が酸化ケイ素膜であれば、第２層６５０を熱酸化することで表面に形成された熱酸化膜を用いてもよい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層６５５の一部をエッチングする。エッチングされる領域は、電子線透過部６５１、液体注入口６５２、６５３に対応する領域である。マスク層６５５のエッチングには、ＲＩＥが用いられる。このとき、第２層５５０についても一部エッチング（オーバーエッチング）してもよい。

次に、マスク層６５５をエッチングマスクとして、第２層６５０をエッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる結晶異方性エッチングにより所定の領域をエッチングして、第２層６５０に薄肉部を形成する。その後、マスク層６５５を剥離して、エッチングした第２層６５０を露出させる（図２３（ｂ））。

次に、液体注入口６５２、６５３に対応する領域を開口したマスク層６５７を第２層６５０上に形成する（図２３（ｃ））。マスク層６５７をエッチングマスクとして、第２層６５０をＲＩＥやＤＲＩＥにより所定の領域をエッチングして、中間層６３０を露出させる（図２３（ｄ））。中間層６３０がエッチングストッパとなって、第２層６５０がエッチングされる。これにより、液体注入口６５２、６５３が形成される。その後、第２層６５０からマスク層６５７を剥離する。

次に、第１層６１０の第１薄膜６２０が形成されている面とは反対側の面に酸化膜６６０を形成する（図２４（ａ））。酸化膜６６０は、例えば、プラズマＣＶＤにより形成することができ、その膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上１０μｍであるが、これに限定されない。酸化膜６６０上にマスク層６６５を形成し、ＲＩＥを用いて、酸化膜６６０をエッチングする（図２３（ｂ））。エッチングされる領域は、開口部６１１に対応する領域である。その後、酸化膜６６０からマスク層６６５を剥離する。

そして、酸化膜６６０をエッチングマスクとして、第１層６１０をエッチングする（図２４（ｃ））。このエッチングは、第２層６５０のエッチングと同様に、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液やＫＯＨ水溶液を用いる結晶異方性エッチングが用いられる。第１薄膜６２０がエッチングストッパとなって、第１層６１０がエッチングされる。これにより、開口部６１１が形成される。

液体注入口６５２、６５３を介して中間層６３０をエッチングする工程は、第１実施形態と同様に、等方性のエッチングにより形成することができるため、詳細な説明は省略する。

上述した試料収容セル６００は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル６００が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル６００を個片化するための処理が行われる。

図２５は、本開示の第１実施形態における複数の試料収容セルを分離する方法を説明する図である。図２５（ａ）は、試料収容セル１が個片化される前の基板の一部を第１層１１０側から見た平面図である。図２５（ｂ）は、分断溝部分の断面構成（図２５（ａ）における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。なお、図２５（ａ）においては、試料収容セル１が３×３で配置された例を示しているが、これは基板全体の一部を抽出して例示したものである。

各試料収容セル１の間には、分断溝ＳＬ１が形成されている。この例では、分断溝ＳＬ１は、第１層１１０側に設けられている。第２層１５０側にも分断溝ＳＬ２が分断溝ＳＬ１に対向した位置に設けられている。分断溝ＳＬ１、ＳＬ２はいずれも、中間層１３０に到達してもよい。

この分断溝ＳＬ１は、図９（ｂ）に示す開口部１５１、１５２、１５３を形成する際に、一緒に形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、マスク層１５５が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ１が中間層１３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ１の深さを３μｍ程度とする場合には、マスク層１５５のスリットを４μｍ程度の幅にしておけばよい。

同様に、分断溝ＳＬ２は、図１０（ｃ）に示す開口部１１１を形成する際に、一緒に形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、酸化膜１６０が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ２が中間層１３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ２の深さを２００μｍ程度とする場合には、酸化膜１６０のスリットを３００μｍ程度の幅にしておけばよい。

分断溝ＳＬ１、ＳＬ２が中間層１３０に到達していないため、図１１に示す中間層１３０のエッチングの際に、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２から中間層１３０がエッチングされないようにすることができる。そして、試料収容セル１００に軽い衝撃を与えることにより、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２において容易に、隣接する試料収容セル１００と分離することができる。

なお、上述した製造方法における各構成の材料、エッチング方法等の各種条件については一例であって、様々な条件に設定可能である。また、本実施形態の複数の試料収容セルを分離する方法は、上述した第２実施形態〜第６実施形態にも適用することができる。

上述した各実施形態に係る試料収容セルは、シリコン基板に各層を積層した機材を用いており、２つの基板を接合する必要がなく、内部に形成された空間に注入された試料含有液体が漏れることはほとんどない。また、第１薄膜と第２薄膜との距離は中間層の厚さによって決まるため、精度のよいギャップ制御が可能である。また、このように、本開示の各実施形態に係る試料収容セルによれば、利便性を高めることができる。

＜第７実施形態＞
第１実施形態においては、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを外部空間１９０と分離するために、液体注入口である開口部１４１、１４３を封止材９３１、９３２によって塞いでいた。第７実施形態では、これを蓋板で塞ぐ例を説明する。

図２６は、本開示の第７実施形態における試料収容セルを封止する方法を説明する図である。この例では、蓋板９６０によって開口部１４１、１４３を塞ぐようになっている。蓋板９６０は、例えば、ガラスである。蓋板９６０と第１層１１０との間には、図２６に示すように接着剤９５０が形成されていてもよい。蓋板９６０は、開口部１４１、１４３を塞ぐ程度の大きさ（例えば、開口部より２００μｍ程度大きい正方形）であればよいが、封止する工程の容易性を考慮して、より大きくした形状であってもよいし、正方形以外の形状であってもよい。

なお、本実施形態の試料収容セルを封止する方法は、上述した第２実施形態〜第６実施形態にも適用することができる。

＜第８実施形態＞
第８実施形態では、外部空間１９０と流路空間ＦＰとを接続する開口部が３つ以上である場合について説明する。

図２７は、本開示の第８実施形態における試料収容セル７００の流路空間ＦＰの形状を説明する図である。この例では、第１実施形態で説明した開口部７４１、７４３の他に、これらと同様な形状の開口部７４７が形成されている。このように、外部空間１９０と流路空間ＦＰとを接続する開口部の数は２つに限らず、さらに多くてもよい。このようにすると、例えば、開口部７５１と開口部７４７とを離すことができ、試料含有液体９１０の注入が容易になる。ただし、この場合には、電子顕微鏡による観察前に、開口部７５１以外の開口部を封止しておく必要がある。

この場合、開口部７４１、７４３は、開口部７４７よりも開口部が小さくてもよい。すなわち、試料含有液体９１０を注入するための開口部を大きくしておき、流路空間ＦＰを形成する際のエッチング液導入のための開口部は小さくしてもよい。

なお、本実施形態の開口部が３つ以上である形態は、上述した第２実施形態〜第６実施形態にも適用することができる。

＜その他の実施形態＞
［表面処理］
試料収容セル１００の外面（特に、第１層１１０の外面）については、親油（疎水）処理を施してもよい。このようにすると、試料含有液体９１０が水分系のものであれば、注入の際に外側にこぼれた試料含有液体９１０をセル表面から取り除くことが容易になる。また、封止材がアルコール系（油系）であれば、開口部内に浸入しにくくなり、試料含有液体との接触を避けて混合しないようにすることもできる。試料含有液体９１０がアルコール系（油系）であれば、試料収容セル１００の外面に、逆の処理、すなわち親水処理を施してもよい。

例えば、親水処理であれば、酸化膜で覆う処理であればよく、フッ素および酸素によるプラズマ処理で形成してもよいし、酸素含有雰囲気下での熱処理で形成してもよい。また、シリコン基板表面に形成された自然酸化膜を親水表面としてもよい。一方、親油（疎水）処理であれば、フッ素および窒素によるプラズマ処理によりシリコン基板表面にフッ化物を形成してもよいし、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシロキサン）処理によってシリコン基板表面にメチル基を形成してもよい。

なお、本実施形態の表面処理は、上述した第２実施形態〜第６実施形態にも適用することができる。

［チャージアップ防止］
電子顕微鏡による観察時において、試料収容セルのチャージアップを防止するために、数ｎｍのカーボン等の導電膜をセル外面（第１層１１０、第２層１５０、第１薄膜１２０および第２薄膜１４０の表面の少なくとも一部）に配置しておいてもよい。

なお、本実施形態のチャージアップ防止は、上述した第２実施形態〜第６実施形態にも適用することができる。

１００…試料収容セル、１１０…第１層、１２０…第１薄膜、１３０…中間層、１４０…第２薄膜、１５０…第２層、１１１，１５１…開口部、１４１，１４３…液体注入口、１５５，１５７，１６５…マスク層、１９０…外部空間、２００…試料収容セル、２１０…第１層、２２０…第１薄膜、２３０…中間層、２４０…第２薄膜、２５０…第２層、２１１，２５１…開口部、２４１，２４３…液体注入口、３００…試料収容セル、３１０…第１層、３２０…第１薄膜、３３０…中間層、３４０…第２薄膜、３５０…第２層、３１１，３５１…開口部、３４１，３４３…液体注入口、４００…試料収容セル、４１０…第１層、４２０…第１薄膜、４３０…中間層、４４０…第２薄膜、４５０…第２層、４１１，４５１，４５２，４５３…開口部、４４１，４４３…液体注入口、４５５，４５７，４５９，４６５，４６７…マスク層、５００…試料収容セル、５１０…第１層、５２０…第１薄膜、５２１，５２３…液体注入口、５３０…中間層、５４０…第２薄膜、５５０…第２層、５１１，５１２，５１３，５２１，５２３…開口部、５５５，５６０，４６５，４６７…マスク層、６００…試料収容セル、６１０…第１層、６２０…第１薄膜、６３０…中間層、６５０…第２層、６１１，６５１，６５２，６５３…開口部、６５５，６５７，６６０，６６５…マスク層、７００…試料収容セル、７５０…第２層、７５１…開口部、７４１，７４３，７４７…液体注入口８００…観察セル作製装置、８１０…試料注入器、８１１…チップ取付部、８１３…支持部、８１５…制御部、８１７…チップ取り外し部、８２０…チップ、８２５…チップ台、８３０，８４０…試料カップ、８３５，８４５…カップ台、８５０…試料台、８６０…ＵＶ照射器、８７０…廃棄口、８８８…ステージ、９１０…試料含有液体、９３０…硬化前樹脂、９３１，９３３…封止材、９５０…接着剤、９６０…蓋板、

Claims (18)

1. 第１開口部を有する第１層と、
   前記第１層に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に電子線透過部を有する第２層と、
   前記第１層と前記第２層との間に配置され、前記第１層に接する第１薄膜と、
   前記第１薄膜に接して配置される中間層と、
   前記第１層又は前記第２層に配置された液体注入口と、を備え、
   前記第１薄膜は、前記第１開口部を塞ぎ、電子線に対して透過性を有し、
   前記中間層は、前記液体注入口の端部から所定の距離にわたって拡がり、前記第１薄膜と前記電子線透過部の間の観察空間と当該液体注入口とを接続する流路空間を備える試料収容セル。
2. 前記中間層に接して配置される第２薄膜をさらに備え、
   前記第２層は、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有し、
   前記第２薄膜は、前記第２開口部を塞ぎ、前記液体注入口に対応する位置で開口し、電子線に対して透過性を有し、
   前記電子線透過部は、前記第２開口部と前記第２薄膜とにより構成される請求項１に記載の試料収容セル。
3. 前記液体注入口が前記第１層に配置される請求項２に記載の試料収容セル。
4. 前記第１層は、シリコンであり、
   前記第２層は、シリコン薄膜であり、
   前記第１薄膜および前記第２薄膜は、窒化ケイ素であり、
   前記中間層は、酸化ケイ素である請求項２に記載の試料収容セル。
5. 前記第１層は、シリコンであり、
   前記第２層は、シリコン薄膜であり、
   前記第１薄膜および前記第２薄膜は、酸化ケイ素であり、
   前記中間層は、窒化ケイ素である請求項２に記載の試料収容セル。
6. 前記第１層は、シリコンであり、
   前記第２層は、シリコン薄膜であり、
   前記第１薄膜および前記第２薄膜は、アモルファスシリコンであり、
   前記中間層は、窒化ケイ素又は酸化ケイ素である請求項２に記載の試料収容セル。
7. 前記第１層は、シリコンであり、
   前記第２層は、シリコン薄膜であり、
   前記第１薄膜および前記第２薄膜は、窒化ケイ素、酸化ケイ素又はアモルファスシリコンであり、
   前記中間層は、金属である請求項２に記載の試料収容セル。
8. 前記第１開口部及び前記第２開口部がテーパ状の構造を有する請求項２に記載の試料収容セル。
9. 前記液体注入口の側面がスキャロップ形状を有する請求項２に記載の試料収容セル。
10. 前記第１開口部及び前記第２開口部が曲線テーパ状の構造を有する請求項２に記載の試料収容セル。
11. 前記第１開口部及び前記第２開口部が段付きテーパ状の構造を有する請求項２に記載の試料収容セル。
12. 前記第１層および前記第２層は、表面が（１００）面、（１１０）面又は（１１１）面である請求項２乃至１１の何れか一に記載の試料収容セル。
13. 第１層上に、第１薄膜、中間層及び第２層を順次積層し、
    前記第２層の第１領域及び第２領域をエッチングし、前記第２領域の前記第２層を貫通させ、
    前記第２領域に対応する前記中間層の領域を露出させて、前記中間層に接続する液体注入口を形成し、
    前記第１領域に対応する領域の前記第１層をエッチングし、前記第１薄膜を露出させて、前記第１層に第１開口部を形成し、
    前記液体注入口を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第２層の前記第１領域に電子線透過部を形成し、前記第１薄膜と前記電子線透過部との間の観察空間、及び当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成する試料収容セルの製造方法。
14. 前記中間層上に第２薄膜をさらに積層し、
    前記第２層の前記第１領域及び前記第２領域をエッチングして貫通させて、前記第１領域に前記第２薄膜を露出する第２開口部を形成し、
    前記第２領域に対応する前記第２薄膜をエッチングして前記中間層の領域を露出させて、前記中間層に接続する液体注入口を形成し、
    前記液体注入口を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングして、前記第２層の前記第１領域に電子線透過部を形成する請求項１３に記載の試料収容セルの製造方法。
15. 第１層上に、第１薄膜、中間層、第２薄膜及び第２層を順次積層し、
    前記第２層の第１領域をエッチングして、前記第２薄膜を露出させ、
    前記第１領域に対応する前記第１層の領域及び前記第１層の第２領域をエッチングして、前記第１薄膜を露出させ、
    前記第１領域に第１開口部を形成し、前記第２領域に対応する前記第２薄膜をエッチングして前記中間層の領域を露出させて、前記中間層に接続する液体注入口を形成し、
    前記液体注入口を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第２層の前記第１領域に電子線透過部を形成し、前記第１薄膜と前記電子線透過部との間の観察空間、及び当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成する試料収容セルの製造方法。
16. 前記第１層および前記第２層をエッチングして前記第１薄膜および前記第２薄膜を露出させ、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分断溝を形成する請求項１４又は１５に記載の試料収容セルの製造方法。
17. 前記第１層および前記第２層は、第２エッチング液又は第１エッチングガスを用いてエッチングし、
    前記第１層および前記第２層は、前記第２エッチング液又は第１エッチングガスよりも前記第１エッチング液に対して耐性を有し、
    前記中間層は、前記第１エッチング液よりも前記第２エッチング液又は第１エッチングガスに対して耐性を有する請求項１４乃至１６の何れか一に記載の試料収容セルの製造方法。
18. 前記第１層及び前記第２層は、第２エッチング液又は第１エッチングガスを用いてエッチングし、
    前記第１薄膜及び前記第２薄膜は、第２エッチングガスを用いてエッチングし、
    前記第１層および前記第２層は、前記第２エッチング液及び第１エッチングガスよりも前記１エッチング液及び前記第２エッチングガスに対して耐性を有し、
    前記第１薄膜及び前記第２薄膜は、前記第２エッチングガスよりも前記第１エッチング液、前記第２エッチング液及び第１エッチングガスに対して耐性を有し、
    前記中間層は、前記第１エッチング液よりも前記第２エッチング液、前記第１エッチングガス及び前記第２エッチングガスに対して耐性を有する請求項１５又は１６に記載の試料収容セルの製造方法。

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