JP2016213150A - 試料収容セル - Google Patents

Abstract

【課題】２種の試料の接触、混合そして反応といった過程を動的に観察することができる試料収容セルを提供すること。【解決手段】本発明の実施形態における試料収容セルは、第１開口部を有する第１基板と、第１基板に対向して配置され、第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、第１開口部の第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、第２開口部の第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、少なくとも第１開口部と第２開口部との間において第１薄膜と第２薄膜とに挟まれて配置されたギャップ膜と、を備え、第１基板と第２基板との間には、第１薄膜と第２薄膜とギャップ膜とに囲まれた観察空間と、第１流路空間と、観察空間及び第１流路空間を接続する第１接続空間と、第２流路空間と、観察空間及び第２接続空間を接続する第２接続空間とが配置され、第１薄膜および第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする。【選択図】図２

Description

本発明は観察対象の試料（Ｏｂｊｅｃｔ）を収容するセルに関する。

電子顕微鏡を用いた試料の観察は、一般的には、観察対象の試料が真空等の特殊な空間に曝される。一方、近年では、メカノバイオロジー（Ｍｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）と呼ばれる技術分野において、生体細胞、生体組織等をそのまま観察したいという要求がある。しかしながら、電子顕微鏡での観察の際に試料を真空中に曝すと、細胞等は、液体成分が揮発していくことで変質し、また測定環境の汚染につながってしまう。これを防ぐために、様々な方法が開発されている。

例えば、試料を急速凍結して薄い氷の中に閉じ込め、冷凍状態で観察する技術がある。しかしながら、冷凍状態で観察する技術は、容易に観察用の試料を作製することができず、また、試料作成用の装置が非常に特殊であり高価なものであった。

さらに、生体細胞、生体組織等と、それらに影響を及ぼす試薬等との反応を動的に観察したいという要求がある。特許文献１には、２種の流体が充填される２つのチャネルと、それらを接続するギャップとをマイクロリアクター内に設け、２種の流体の混合が行われる当該ギャップ内を観察することで、混合した流体を観察する技術が開示されている。

特開２０１１−８９９９０号公報

特許文献１に開示されたマイクロリアクターの構造では、２つのチャネルが互いに接近した領域を一部に有し、当該接近した領域を互いに接続するギャップが設けられている。つまり、当該ギャップの長さは短く設けられているため、当該ギャップの両端から流入した２種の流体は瞬時に混合してしまう。したがって、２種の流体の接触、混合及び反応過程を動的に観察することは困難である。

本発明の目的の一つは、２種の試料の接触、混合そして反応といった過程を動的に観察することができる試料収容セルを提供することにある。

本発明の一実施形態によると、第１開口部を有する第１基板と、前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、少なくとも前記第１開口部と前記第２開口部との間において前記第１薄膜と前記第２薄膜とに挟まれて配置されたギャップ膜と、を備え、前記第１基板と前記第２基板との間には、前記第１薄膜と前記第２薄膜と前記ギャップ膜とに囲まれた観察空間と、少なくとも２箇所で外部空間と接続される第１流路空間と、当該観察空間及び当該第１流路空間を接続する第１接続空間と、少なくとも２箇所で外部空間とを接続される第２流路空間と、当該観察空間及び当該第２接続空間を接続する第２接続空間とが配置され、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セルを提供する。これによれば、２種の試料含有液体の接触、混合、反応といった動的過程を観察することができる。

前記第１接続空間の流路幅及び前記第２接続空間の流路幅は、前記第１流路空間の流路幅及び前記第２流路空間の流路幅よりも小さい。これによれば、試料収容セルへの２種の試料含有液体の注入から、両者が合流するまでの時間を遅延させることができ、動的過程の観察が容易になる。

前記第１接続空間の流路幅及び前記第２接続空間の流路幅は、前記第１流路空間の流路幅及び前記第２流路空間の流路幅の１０％以下である。これによれば、試料収容セルへの２種の試料含有液体の注入から、両者が合流するまでの時間を遅延させることができ、動的過程の観察が容易になる。

前記観察空間から引き出され、外部空間と接続された第３流路空間を更に備えてもよい。これによれば、前記観察空間内で２種の試料含有液体の移動および合流がスムーズになる。

観察空間から引き出され、吸着剤が配置された第３流路空間を更に備えてもよい。これによれば、吸着剤を加熱して活性化することにより前記観察空間内で２種の試料含有液体の移動および合流がさらにスムーズになる。

本発明の一実施形態によると、前述の試料収容セルを備えた電子顕微鏡を提供することができる。これによれば、２種の試料含有液体の接触、混合、反応といった動的過程を電子顕微鏡を通して観察することができる。

前記試料収容セルを加熱するためのヒーターを更に備えた電子顕微鏡であってもよい。これによれば、観察中において２種の試料含有液体の反応を促進することができる。

レーザ光源を更に備えた電子顕微鏡であってもよい。これによれば、第３流路空間に配置された吸着剤にレーザを照射することによって活性化させ、前記観察空間内で２種の試料含有液体の移動および合流がさらにスムーズになる。

本発明の一実施形態によると、電子線を透過させる薄膜に囲まれた観察空間に、前記観察空間に接続された第１流路空間に第１試料含有液体を注入し、前記観察空間に接続された第２流路空間に第２試料含有液体を注入し、前記観察空間に電子線を照射し、前記観察空間に侵入した前記第１試料含有液体及び前記第２試料含有液体を透過した前記電子線を観察することを含む試料観察方法を提供する。これによれば、２種の試料含有液体の接触、混合、反応といった動的過程を観察することができる。

前記第１試料含有液体及び前記第２試料含有液体を加熱しながら観察してもよい。これによれば、観察中において２種の試料含有液体の反応を促進することができる。

本発明によると、２種の試料の接触、混合そして反応といった過程を動的に観察することができる試料収容セルを提供することができる。

本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料注入装置の試料注入処理を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料注入装置のセル封止処理を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。 本発明の第１実施形態における第１基板と第２基板との接合および開口の形成に関する製造工程を説明する図である。 本発明の第２実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。 本発明の第２実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。 本発明の第３実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。 本発明の第３実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。 本発明の第３実施形態における電子顕微鏡の模式図である。 本発明の第５実施形態における電子顕微鏡の模式図である。 流路形成部の配置例を示す模式図である。 流路形成部の配置例を示す模式図である。 流路形成部の配置例を示す模式図である。

＜第１実施形態＞
以下、本発明の一実施形態に係る試料収容セルについて、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は本発明の実施形態の一例であって、本発明はこれらの実施形態に限定して解釈されるものではない。なお、本実施形態で参照する図面において、同一部分または同様な機能を有する部分には同一の符号または類似の符号（数字の後にＡ、Ｂ等を付しただけの符号）を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、図面の寸法比率（各構成間の比率、縦横高さ方向の比率等）は説明の都合上実際の比率とは異なったり、構成の一部が図面から省略されたりする場合がある。

［試料収容セルの構成］
図１は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。試料収容セル１は、第１基板１０と第２基板２０とがギャップ膜５０を介して接合して製造されている。第１基板１０は、例えば、シリコン基板である。第２基板２０は、可視光線に対して透過性を有する基板であって、例えば、ガラス基板である。なお、第１基板１０も第２基板２０と同様に、可視光線に対して透過性を有する基板（例えば、ガラス基板）であってもよい。また、第１基板１０も第２基板２０もシリコン基板であってもよい。

ギャップ膜５０は、第１基板１０と第２基板２０とを接合し、第１基板１０と第２基板２０との間に空間（流路空間ＦＰ、接続空間ＣＳおよび観察空間ＭＳ）を形成する膜である。ギャップ膜５０は、後述する周辺部５１０および流路形成部５３０を含む。これらをまとめてギャップ膜５０と表現する場合がある。

試料収容セル１は、電子顕微鏡の観察対象となる試料を液体に含ませた状態で、この内部空間に収容するセルである。以下、試料を含む液体を、試料含有液体と表現する場合がある。試料収容セル１の大きさは、１辺が２．５ｍｍ〜３ｍｍ程度の正方形であり、この例では２．６ｍｍである。試料収容セル１の厚さは、第１基板１０と第２基板２０とをあわせて０．３〜１．２ｍｍ程度である。

第１基板１０および第２基板２０には、それぞれ開口部が形成されている。この例では、第１基板１０には開口部１１０、１２０、１２５、１３０、１３５が配置されている。第２基板には、開口部２１０（図４参照）が配置されている。続いて、試料収容セル１の内部構造を含めた詳細な構造について、図２、図３、図４を用いて説明する。

図２は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。図３は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。図４は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。

開口部１１０の第２基板２０側は、第１薄膜１５０により塞がれている。開口部２１０の第１基板１０側は、第２薄膜２５０により塞がれている。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とは対向して配置されている。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、電子線に対して透過性を有する膜である。

第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、例えば、窒化シリコンで形成される。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０の膜厚は、１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、望ましくは、１５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、この例では、２０ｎｍである。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とは同じ膜厚であってもよいし、異なる膜厚であってもよい。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、１０ｎｍより薄くなると強度がなくなり破損するおそれがある。一方、２００ｎｍよりも厚くなると、電子線が透過しなくなる。したがって、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、破損しない程度の膜の強度を得ながらも、できるだけ薄くすることが望ましい。

以下に示す通り、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との間には、双方に接続されたギャップ膜５０が部分的に存在する。このギャップ膜５０は、開口部１１０と開口部２１０との外側部分（第１基板１０と第２基板２０との間の開口部が存在しない部分）から延在している。そのため、ギャップ膜５０（流路形成部５３０）は、梁のような機能を有することとなり、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とを支持することができる。

第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とがギャップ膜５０によって支持されない場合、これらの薄膜は開口部１１０、２１０の外側で支持される必要がある。すなわち、電子線が通過する領域のうち薄膜を支持する部分から離れた領域（例えば開口部の中心付近）が増加するため、薄膜の強度を高める必要がある。一方、この例のようにギャップ膜５０で第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とを支持することにより、電子線が通過する領域を確保しつつ、支持する部分から離れた領域を少なくすることができる。したがって、ギャップ膜５０によって薄膜が支持されている場合は、ギャップ膜５０によって薄膜が支持されない場合に比べて、薄膜の強度を低くしても破損しにくい状態に保つことができる。逆に言えば、同じ膜厚でも薄膜の強度が増加した解釈することもできる。その結果、薄膜をさらに薄くすることもできる。

第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との間には、ギャップ膜５０が配置されている。図２、図３、図４に示すように、ギャップ膜５０は、周辺部５１０および流路形成部５３０を含む。周辺部５１０は、試料収容セル１の端部に面して配置される部分である。流路形成部５３０は、開口部１１０と開口部２１０との間において観察空間ＭＳの位置を決めるように配置された部分である。周辺部５１０と流路形成部５３０とは、それぞれの領域が明確に区分されるものではないが、便宜上、分けて定義している。

ギャップ膜５０は、この例では金（Ａｕ）で形成されている。ギャップ膜５０は、その膜の中央付近でＡｕ−Ａｕ接合により接合されている。すなわち、この接合の前においては、ギャップ膜５０は、第１薄膜１５０側の層および第２薄膜２５０側の層に分かれている。そして、接合によってギャップ膜５０が形成される。以下の製造方法の説明において、ギャップ膜５０の形成過程の詳細を示す。なお、接合表面において金が形成され、それ以外の部分が酸化シリコン膜、窒化シリコン膜等で形成された積層膜であってもよい。この例では、金が接合時の接着層として機能する。一方、金が形成されていなくてもよい。ギャップ膜５０の膜厚は、１０ｎｍ以上４００ｎｍ以下、望ましくは、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、この例では、２００ｎｍである。この厚さが、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離に相当する。

なお、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、それぞれ２０ｎｍであるため、この部分における第１基板１０と第２基板２０との距離は、２４０ｎｍとなる。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離（ギャップ膜５０の膜厚）は、試料すなわち観察対象物（例えば細胞）の大きさに依存して設定されるため、少なくとも観察対象物よりも大きくなる必要がある。一方、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が観察対象物に対して大きすぎると、観察対象物が重なって個々の観察対象物の観察結果が得られにくくなる。

ギャップ膜５０は電子線が透過するようになっていてもよいし、透過しなくてもよい。ギャップ膜５０が配置されていない領域において、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とを電子線が通過すればよい。なお、観察対象物が大きすぎる場合、観察対象物自体を電子線が通過できないため、透過型電子顕微鏡による観察はできない。すなわち、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離（ギャップ膜５０の膜厚）を、電子線が通過できない程度の距離以上にすることは、必要ない。

開口部１１０と開口部２１０とは対向して配置され、第１基板１０側から見た場合に、ほぼ同じ大きさで開口するように設計されている。開口部１１０および開口部２１０の開口の形状は、この例では、６０μｍ×６０μｍの正方形である。なお、この開口の形状は、５μｍ×２０μｍ等の長方形であってもよい。上述したように、ギャップ膜５０（流路形成部５３０）の配置パターン、すなわち流路空間ＦＰの配置パターンを調整することによって、薄膜の強度を向上させなくても、開口部１１０および開口部２１０の開口の形状をより大きくして設定することもできる。

開口部１２０、１２５、１３０、１３５の開口の形状は、開口部１１０と比べて、大きく、この例では、１．０ｍｍ×１．５ｍｍの長方形である。なお、この開口の形状は、１．０ｍｍ×１．０ｍｍ等の正方形であってもよい。このように、開口部１２０、１２５、１３０、１３５に比べて、開口部１１０は非常に小さいが、説明に用いた各図では、構造をわかりやすくする表現するために、これらの大きさを調整して示している。

なお、これらの開口部１１０、１２０、１２５、１３０、１３５の開口の形状は、四角形以外の多角形であってもよいし、円形、楕円形等、曲線で囲まれた形状であってもよいし、直線と曲線とで囲まれた形状であってもよい。また、開口部１２０、１２５、１３０、１３５の形状がそれぞれ異なっていてもよい。

開口部１１０、２１０は、その内壁が、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が拡がる平面（基板表面）に対して傾き（テーパ形状）を持って形成されている。開口部１２０、１２５、１３０、１３５についても、その内壁がその基板表面に対して傾きを持って形成されている。開口部内において傾きの程度が一定でなく変化していてもよい。すなわち、開口部１１０、１２０、１２５、１３０、１３５は第１薄膜１５０側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。また、開口部２１０は第２薄膜２５０側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。開口部１１０、２１０の内壁がテーパ形状であると、電子線の入射角のマージンを確保することができる。

第１基板１０と第２基板２０とは、ギャップ膜５０（周辺部５１０および流路形成部５３０）を挟み、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を介して接合している。第１基板１０と第２基板２０との間には、第１薄膜１５０、第２薄膜２５０および流路形成部５３０に囲まれた空間が形成されている。この空間は、観察空間ＭＳ、接続空間ＣＳおよび流路空間ＦＰを含む。さらに、流路空間ＦＰは、第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２を含み、接続空間ＣＳは、第１接続空間ＣＳ１および第２接続空間ＣＳ２を含む。観察空間ＭＳは、開口部１１０およ開口部２１０との間の領域に形成され、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０と流路形成部５３０とで囲まれた空間であり、電子顕微鏡に用いられる電子線が通過する空間である。

第１流路空間ＦＰ１は、少なくとも２箇所において外部空間１０００と接続される。第２流路空間ＦＰ２は、少なくとも２箇所において外部空間１０００と接続される。この例では、第１流路空間ＦＰ１は、２つの開口部を介して外部空間１０００と接続し、この例では開口部１２０、１３０を介して外部空間１０００に接続する。また、第２流路空間ＦＰ２は、２つの開口部を介して外部空間１０００と接続し、この例では開口部１２５、１３５を介して外部空間１０００に接続する。

第１接続空間ＣＳ１は、観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰ１を接続する。第２接続空間ＣＳ２は、観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰ２を接続する。

第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２の流路幅は、それぞれ０．２μｍ以上５００μｍ以下であり、望ましくは、１００μｍ以上４００μｍ以下である。一方、接続空間ＣＳの流路幅は、０．２μｍ以上５００μｍ以下であり、望ましくは、２μｍ以上３００μｍ以下である。

観察空間ＭＳにおいて流路幅が広くなるほど薄膜の強度を高める必要がある。また、流路幅が広くなるほど、流路内の流体の進行速度が速くなるため、観察空間ＭＳの両端から侵入した２種の流体が接触し、混合し、反応する動的な過程を観察することが困難になる。

一方、流路空間ＦＰ、接続空間ＣＳおよび観察空間ＭＳのいずれも、流路幅を狭くし、例えば、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離（ギャップ膜５０の厚さ）よりも狭くすると、試料が通過できなくなってしまう場合もある。例えば、ギャップ膜５０の厚さが試料のサイズに合わせてできるだけ薄く形成されている場合には、これよりも流路幅を狭くすると試料が通過できない。したがって、試料が通過できる程度に流路幅を狭くしておくことで、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０をより薄くすることもできる。

接続空間ＣＳの流路幅と、流路空間ＦＰの流路幅との関係として、好ましくは接続空間ＣＳの流路幅は、流路空間ＦＰの流路幅よりも小さく、より好ましくは接続空間ＣＳの流路幅は流路空間流ＦＰの流路幅の１０％以下である。これによって、後述するように、観察される２流体である試料含有液体７００および７５０の注入から反応までの時間を、観察可能な程度に長期化させることができる。

第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２のそれぞれの一方の開口部が試料含有液体を注入するための開口であり、それぞれの他方が第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２の空気を外部空間１０００に押し出すための排気口として機能する。なお、それぞれの一方の開口部（例えば、開口部１３０、１３５）が、第１基板１０の別の部分に形成されていてもよいし、第２基板２０に形成されていてもよい。また、第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２が試料収容セルの側面まで到達するようにして、第１基板１０と第２基板２０との間に開口部が形成されていてもよい。

以上が、試料収容セル１の構成についての説明である。続いて、試料収容セル１に試料含有液体を配置して、電子顕微鏡にて観察できる状態にするための処理（観察セル作製処理）について説明する。

［観察セル作製処理］
図５は、本発明の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。図５（ａ）は、図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面を示し、図５（ｂ）は、図１、２における断面線Ｂ−Ｂ’の断面を示している。試料含有液体７００および７５０は、それぞれ第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２にそれぞれ開口部１２０および１２５から注入されると、それらの空間内を移動してそれぞれ接続空間ＣＳ１およびＣＳ２に至り、観察空間ＭＳ内で合流する。なお、開口部１２０および１２５ではなく開口部１３０および１３５に試料含有液体７００および７５０がそれぞれ注入されてもよいし、開口部１２０および１３５に試料含有液体７００および７５０がそれぞれ注入されてもよいが、以下の説明では、開口部１２０および１３０に試料含有液体７００が注入される注入口であるものとして説明する。

観察空間ＭＳに対応する開口部１１０、２１０は、試料収容セル１の全体の大きさに比べると非常に小さい。そのため、開口部１１０、２１０を視認するだけでは、観察空間ＭＳに試料含有液体７００および７５０が到達しているかわかりにくい。試料収容セル１では、第２基板２０が可視光線を透過する材料で形成されているため、第２基板２０側から試料含有液体７００および７５０の位置を確認することができる。

したがって、試料含有液体７００および７５０、または液体中の試料自体の位置を第２基板２０側から確認しつつ、開口部１２０および１２５からの注入量、注入圧力等を制御することにより、目的とする範囲（例えば、第１流路空間ＦＰ１、第２流路空間ＦＰ２、第１接続空間ＣＳ１、第２接続空間ＣＳ２、観察空間ＭＳ、開口部１３０および開口部１３５）に試料含有液体７００および７５０を拡げることができる。このとき、試料含有液体７００および７５０は、それぞれ第１流路空間ＦＰ１および第２流路空間ＦＰ２の全体を充填するように、注入されることが望ましい。後述のように封止材で封止された後に、流路空間ＦＰを含む封止された空間において試料含有液体７００および７５０によって充填されない部分が気泡として存在すると、電子顕微鏡による観察がされるまでにその気泡が観察空間ＭＳに移動してしまう可能性があるためである。

図６は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。試料含有液体７００および７５０がそれぞれ第１流路空間ＦＰ１、第２流路空間ＦＰ２に注入された後、開口部１２０、１２５、１３０、１３５をそれぞれ封止材３２０、３２５、３３０、３３５で塞ぐことで、流路空間ＦＰ、接続空間ＣＳおよび観察空間ＭＳは、外部空間１０００と分離される。封止材３２０、３２５、３３０、３３５は、例えば、エポキシ樹脂等の樹脂であり、ＵＶ硬化型の樹脂であってもよいし、２液混合型硬化樹脂（例えば、２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプ）であってもよい。ＵＶ硬化型の場合には、開口部１２０、１２５、１３０、１３５を塞ぐように硬化前の樹脂を形成し、ＵＶ照射によって硬化させて封止材３２０、３２５、３３０、３３５が形成される。なお、封止材３２０、３２５、３３０、３３５によって外部空間１０００と分離された内部空間には気泡が含まれないようにしてもよいし、硬化前の樹脂と試料含有液体７００および７５０とが混合しないように、少なくとも樹脂が硬化するまでは互いに離れた状態（試料含有液体と封止材との間に気泡が存在する状態）にしてもよい。

観察空間ＭＳに到達した試料含有液体７００および７５０は、外部空間１０００と離隔されているため、電子顕微鏡による観察が行われる際に、試料収容セル１が真空環境に曝されても、試料含有液体７００および７５０が揮発してしまうことを防ぎ、液体の状態を保持することができる。また、観察空間ＭＳは、電子線に対して透過性を有する数十ｎｍ程度の第１薄膜１５０および第２薄膜２５０に囲まれている。

また、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との間にギャップ膜５０が配置されているために薄膜そのものの強度を低くすることもできる。その結果、ギャップ膜５０が配置されていない場合に比べて、観察空間ＭＳの領域を大きくしたり、薄膜を薄くしたりすることもできる。さらに、電子顕微鏡による観察時には、外部空間１０００が観察空間ＭＳより減圧状態にあるため、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が外部空間１０００側に拡がるように力がかかって観察空間ＭＳが膨らむ可能性があるが、ギャップ膜５０によって第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが接続されていれば、少なくともギャップ膜５０と接触している部分では、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が固定されるため、観察空間ＭＳが膨らむことを抑制することができる。

そのため、観察空間ＭＳの高さ（第１薄膜１５０および第２薄膜２５０との距離）、すなわち試料含有液体７００および７５０の厚さは、電子線に対して透過性を有する程度の大きさを保つことができる。したがって、電子顕微鏡で用いられる電子線は、開口部１１０を通って、第１薄膜１５０、試料含有液体７００および第２薄膜２５０を通過し、さらに開口部２１０を通って、試料収容セル１全体を通過することができる。電子線ＥＢの方向は上記とは逆に、開口部２１０側から開口部１１０側に通過する方向あってもよい。

図５における試料注入処理、および図６におけるセル封止処理については、手動処理であっても、自動処理であってもよい。手動処理の場合には、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスキャピラリの先端と開口部１２０、１２５、１３０、１３５との位置関係を、実体顕微鏡を用いて確認し、ガラスキャピラリに接続されたインジェクタを用いて試料含有液体７００および７５０を注入したり、封止材３２０、３２５、３３０、３３５を注入したりすればよい。

また、自動処理の場合には、試料注入処理およびセル封止処理を自動的に実行して観察セルを作成する装置を用いればよい。

［観察セル作製装置］
図７は、本発明の第１実施形態における観察セル作製装置の試料注入処理を説明する図である。観察セル作製装置８００は、試料注入器８１０、ＵＶ照射器８６０およびステージ８８８を備える。ステージ８８８には、チップ台８２５、カップ台８３５、８４５、試料台８５０が取り付けられている。チップ台８２５は、チップ８２０を収容する。チップ８２０は、試料含有液体７００を吸い取るためのノズルを有するピペットチップである。カップ台８３５は、試料含有液体７００を保持する試料カップ８３０を収容する。カップ台８４５は、封止材となる硬化前樹脂３００を保持する試料カップ８４０を収容する。試料台８５０は、試料収容セル１を設置する。また、ステージ８８８には、チップ８２０を廃棄するための廃棄口８７０が配置されている。

試料注入器８１０に対して、ステージ８８８は水平方向（図７における左右方向、以下、Ｘ方向という）に移動可能である。また、試料注入器８１０は、水平方向であってステージ８８８の移動方向とは垂直な方向（図７における奥行き方向、以下、Ｙ方向という）と、鉛直方向（図７における上下方向、以下、Ｚ方向という）とに移動可能である。したがって、試料注入器８１０とステージ８８８とでＸ、Ｙ、Ｚ方向で相対的に移動可能になっている。なお、ステージ８８８上の試料台８５０については、別途Ｙ方向にも移動可能であってもよい。

試料注入器８１０は、チップ取付部８１１、支持部８１３、制御部８１５およびチップ取り外し部８１７を備える。チップ取付部８１１は、先端にチップ８２０が差し込まれて取り付けられる部分である。支持部８１３は、装置天井に対してＹ方向、Ｚ方向に移動させるように試料注入器８１０を支持する。制御部８１５は、チップ取付部８１１に取り付けられたチップ８２０に試料カップ内の液体を吸い込んで保持したり、チップ８２０に保持された液体を排出したりするための制御を行う。チップ取り外し部８１７は、下方に移動することによって、チップ８２０を下方に押し出してチップ取付部８１１から取り外す。

ＵＶ照射器８６０は、硬化前樹脂３００を硬化させるためのＵＶ光を照射する装置である。ＵＶ光の照射範囲は、試料台８５０に設置された試料収容セル１全体を含んでいてもよいし、開口部１２０、１２５、１３０、１３５に対応する部分にスポットで照射するようにしてもよい。開口部１２０、１２５、１３０、１３５に対応する部分にスポットで照射するようにすれば、試料へのＵＶ光の影響を抑えることができる。

図７（ａ）は、試料収容セル１がセル保管庫等から運ばれて、観察セル作製装置８００の試料台８５０に設置された状態を示している。続いて、ステージ８８８と試料注入器８１０とを移動させ、以下に示す順に処理を実行する。まず、チップ取付部８１１にチップ８２０を取り付ける（図７（ｂ））。その後、試料注入器８１０は、試料カップ８３０内の試料含有液体７００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図７（ｃ））。試料含有液体７００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の試料含有液体７００を排出して開口部１２０から試料収容セル１内部に注入する（図７（ｄ））。

なお、チップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させる際には、例えば、試料注入器８１０は、カメラ等の撮像部を用いて試料収容セル１の形状を画像認識し、さらには開口部１２０の位置を認識し、開口部１２０の位置にチップ８２０を移動させる。また、試料台８５０に試料収容セル１の内部の状態を第２基板２０側から撮像する撮像部を用いることで、試料含有液体７００の注入の程度を検出し、その程度に応じて注入量、注入圧力が調整されるようにしてもよい。

次いで、上記と同様の処理によって、開口部１２５から試料含有液体７５０を試料収容セル１に収容する。

続いて、観察セル作製装置８００の封止処理について説明する。図８は、本発明の第１実施形態における観察セル作製装置のセル封止処理を説明する図である。試料注入器８１０は、試料カップ８４０内の硬化前樹脂３００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図８（ａ））。硬化前樹脂３００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の硬化前樹脂３００を排出して開口部１２０に滴下し（図８（ｂ））、続いて、開口部１３０に滴下する（図８（ｃ））。なお、開口部１３０への滴下前に、再度チップ８２０内に硬化前樹脂３００を吸い上げておいてもよい。同様にして硬化前樹脂３００を、開口部１２５および１３５に滴下する（図示せず）。なお、硬化前樹脂３００が、ＵＶ硬化型ではなく、上述した２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプであっても同様であり、この場合には、後述するＵＶ光の照射は不要である。

続いて、試料台８５０をＵＶ照射器８６０の下方に移動させ、試料収容セル１にＵＶ照射器８６０からのＵＶ光を照射する（図８（ｄ））。この照射によって、試料収容セル１の開口部１２０、１３０に滴下された硬化前樹脂３００を硬化させる。これによって、試料収容セル１の内部空間に試料含有液体７００が外部空間１０００と離隔された状態で収容される。また、試料注入器８１０は、チップ取り外し部８１７によって、チップ８２０をチップ取付部８１１から取り外して廃棄口８７０に廃棄する。ＵＶ光の照射中にチップ８２０の廃棄が実施されてもよい。

その後、試料含有液体７００および７５０を収容した試料収容セル１が回収され、新たな試料収容セル１が試料台８５０に設置される（図７（ａ））。なお、チップ８２０は、試料収容セル１毎に交換するプロセスを説明したが、開口部１２０に滴下する硬化前樹脂３００を吸い上げる前にチップ８２０を交換してもよい。

尚、上記では、試料含有液体７００を注入し、次いで試料含有液体７５０を注入した後に、開口部１２０、１２５、１３０、１３５を封止する実施形態を例示したが、これに限られない。他の例として、試料含有液体７００を、開口部１２０を介して注入した後に、開口部１２０、１３０を封止し、その後、試料含有液体７５０を、開口部１２５を介して注入した後に、開口部１２５、１３５を封止してもよい。

また、他の例として、試料含有液体７００および７５０を同時に注入し、開口部１２０、１２５、１３０、１３５を封止してもよい。

尚、試料含有液体７００および７５０の接触、混合そして反応の動的過程を観察するためには、観察空間ＭＳ内の開口部１１０および開口部２１０に対応する領域において両者が合流する必要がある。しかしながら、本実施形態のような場合、試料含有液体７００および７５０の試料収容セルへの収容は同時ではなく、時間差が生じてしまうため、観察空間ＭＳ内の開口部１１０および開口部２１０に対応する領域の外において両者が合流してしまうことが懸念される。

このような場合の対策として、例えば観察空間ＭＳの配置を工夫することが考えられる。つまり、最初に収容される試料含有液体７００の注入から、観察空間ＭＳ内の開口部１１０および開口部２１０に対応する領域への到達を遅延させるような観察空間ＭＳの配置とすればよく、種々の設計が可能である。

例えば、後の実施形態において説明されるように、第１流路空間ＦＰ１側の端部付近において流路幅を狭くすることで、最初に試料収容セル１に収容される試料含有液体７００の流速を低下させることができる。

他の例として、後の実施形態において説明されるように、観察空間ＭＳ内の開口部１１０および開口部２１０に対応する領域への経路について、第２流路空間ＦＰ２を経由する経路よりも、第１流路空間ＦＰ２を経由する経路を長く設定すればよい。

以上が、観察セル作製装置８００による試料注入処理およびセル封止処理についての説明である。続いて、試料収容セル１の製造方法について図９〜図１０を用いて説明する。

［試料収容セル１の製造方法］
試料収容セル１は、第１基板１０と第２基板２０とがギャップ膜５０を介して接合されて形成される。第１基板１０および第２基板２０のそれぞれは、以下に説明する所定の製造工程を経てから接合される。

図９は、本発明の第１実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。図１０は、図９に続く第１基板の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図４に対応する断面構造を示している。まず、図９（ａ）に示す第１基板１０を準備する。第１基板１０は、上述したように、シリコン基板であり、この例では、７５０μｍの厚さを有する。なお、３００μｍ程度のシリコン基板を用いることで、後述する図１９（ｄ）の薄化処理が不要となるため、薄化処理のための支持基板を用いなくてもよい。

第１基板１０に第１薄膜１５０、およびギャップ膜５０の一部の層となる膜５００１を形成する（図９（ｂ））。第１膜１５０は窒化シリコン膜であり２０ｎｍの膜厚を有する。膜５００１は金（Ａｕ）であり、１００ｎｍの膜厚を有する。これらの膜は、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理、めっき処理等によって形成されればよい。また、第１膜１５０が窒化シリコン膜でなく酸化シリコン膜である場合、シリコン基板の第１基板１０を熱酸化することで形成された熱酸化膜であってもよい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、膜５００１の一部を除去する（図９（ｃ））。除去される領域は流路空間ＦＰ、観察空間ＭＳに対応する領域であり、この結果、周辺部５１１および図示されない流路形成部５３１が形成される。なお、膜の除去のためには、ドライエッチングおよびウエットエッチングのいずれも適用可能であり、特に明示しない限り以下の説明においても同様である。また、数十ｎｍ程度の粒径を有する金粒子に有機溶剤を混ぜたペースト状の材料を用いて、スクリーン印刷によって周辺部５１１および図示されない流路形成部５３１が形成されてもよい。

ここで、第１膜１５０の一部を除去してもよい。除去される場合には、除去される領域は、開口部１２０、１２５、１３０、１３５が形成される位置に対応した領域である。この例では、この工程は存在しない。第１膜１５０の一部を除去する場合については、別の実施形態で説明する。

その後、第１基板１０の第１薄膜１５０が形成された側に、粘着層を含む支持基板を貼り付ける。支持基板の粘着層は、貼り合わせ面に設けられており、熱、光等の刺激の印加により粘着力が低下するようになっている。この例では、ＵＶ光の照射によって粘着力が低下する粘着層を用いている。

支持基板によって支持された第１基板１０を薄化する（図９（ｄ））。第１基板１０の薄化は、例えば、ＣＭＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、ウエットエッチングを用いる。ウエットエッチングを用いる場合には、例えば、第１基板１０をエッチングすることのできる液体として、フッ酸およびフッ化アンモニウムの混合液が用いられる。第１基板１０は７５０μｍの厚さを有しているが、この薄化処理によって、２５０μｍ程度まで薄くなる。第１基板１０が支持基板によって支持されているため、第１基板１０が薄化しても第１基板１０の反りが抑制され、また、製造工程中の強度を保つこともできる。以上の通り、ギャップ膜となる層と第１薄膜１５０とが配置された第１基板１０が製造される。この例では、第２基板２０についても同様にして形成される。この例では、第２基板２０は、上述したように、可視光線に対する透過性を有する基板であって、この例ではガラス基板であり、７００μｍの厚さを有する。なお、３００μｍ程度のガラス基板を用いることで、薄化処理を行わなくてもよい。

図１０は、本発明の第１実施形態における第１基板と第２基板との接合および開口の形成に関する製造工程を説明する図である。上述のように薄膜等が形成された第１基板１０と第２基板２０とは、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが対向するようにして（図１０（ａ））、第１薄膜１５０上に配置されたギャップ膜（周辺部５１１および図示されない流路形成部５３１）と第２薄膜２５０上に配置されたギャップ膜（周辺部５１１および図示されない流路形成部５３１）とをそれぞれ接触させて接合させる（図１０（ｂ））。それぞれ表面が金（Ａｕ）であり、Ａｕ−Ａｕ接合が実現される。すなわち、金が接着層として機能する。接着層として機能する材料であれば、金に限られない。

この接合によって、第１基板１０と第２基板２０との間にギャップ膜５０（周辺部５１０および図示されない流路形成部５３０）が形成され、このギャップ膜５０を介して第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが強固に接合され、これらの間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを含む空間が形成される。また、Ａｕ−Ａｕ接合によれば、２００℃程度の低温、１００ＭＰａ程度の低圧でも強固な接合ができるため、第１薄膜１５０、第２薄膜２５０への負荷を低減することができる。

続いて、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１基板１０に開口部１１０および図示されない、１２０、１２５、１３０、１３５を形成し、第２基板２０に開口部２１０を形成する（図１０（ｃ））。このエッチング工程では、Ｄ−ＲＩＥ（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）を用いてもよいし、ウエットエッチングを用いてもよい。エッチングの際、開口部１１０、１２０、１２５、１３０、１３５の内壁が第１基板１０の表面に対して傾きを有するように処理していてもよい。同様に、開口部２１０の内壁が第２基板２０の表面に対して傾きを有するように処理していてもよい。

なお、開口部２１０を形成する前に、開口部２１０に対応する部分にレーザを照射しておき、第２基板２０のエッチングレートを増加させてもよい。この場合には、レジストマスク等を用いずに、ウエットエッチング処理でレーザ照射部分を開口することによって開口部２１０を形成するようにしてもよい。

このようにして、試料収容セル１が製造される。なお、この試料収容セル１は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル１が同時に形成されている。したがって、それぞれの試料収容セル１を個片化するためにダイシングを行う。なお、上述した製造方法における各構成の材料、エッチング方法等の各種条件については一例であって、様々な条件に設定可能である。

この状態では、試料収容セル１は、第１薄膜１５０が開口部１１０を塞いでいるだけでなく、開口部１２０、１２５、１３０、１３５をも塞いでいる。これは、第１基板１０と第２基板２０とをギャップ膜５０を介して接合する前に、開口部１２０、１２５、１３０、１３５に対応する部分の膜を除去していないためである。このように構成された試料収容セル１は、流路空間ＦＰと外部空間１０００とが第１薄膜１５０によって隔てられている。したがって、このままでは、観察空間ＭＳに試料含有液体を注入することができない。

そこで、この例では、開口部１２０、１２５、１３０、１３５を塞ぐ第１薄膜１５０を物理的な力によって破る。これによって生じた孔を通して、流路空間ＦＰが外部空間１０００と接続される。物理的な力とは、開口部１２０、１２５、１３０、１３５の底部ＢＡに位置する第１膜１５０に対して針状の物体を押し当てて孔を形成する方法が例として挙げられる。なお、物理的な力とは、第１薄膜１５０に接触して力を伝達する方法に限らず、空気を強く吹き付けることなどによって、第１薄膜１５０に対して間接的に力を伝達する方法であってもよい。例えば、観察セル作製装置８００において、底部ＢＡの第１薄膜１５０に孔を形成することで、試料含有液体を注入する直前まで、観察空間ＭＳを外部空間１０００に露出させないようにして、内部を清浄に保つこともできる。以上が試料収容セル１の製造方法についての説明である。

上述した一実施形態に係る試料収容セル１は、予め第１基板１０と第２基板２０とがギャップ膜５０を介して強固な接合をしているため、内部に注入された試料含有液体７００および７５０が漏れることはほとんどない。また、第２基板２０が可視光線に対する透過性を有しているため、注入状態を確認しながら、第１基板１０と第２基板２０との間の内部空間への試料含有液体７００および７５０を注入することもできる。また、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とに挟まれて接続されたギャップ膜５０（この例では、流路形成部５３０）が配置されているため、薄膜そのものの強度を低くすることもできる。その結果、流路形成部５３０が存在しない場合に比べて、観察空間ＭＳの領域を大きくしたり、薄膜を薄くしたりすることもできる。

また、電子顕微鏡による観察時には、外部空間１０００が観察空間ＭＳより減圧状態にあるため、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が外部空間１０００側に拡がるように力がかかって観察空間ＭＳが膨らむ可能性がある。この例のように、ギャップ膜５０によって第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが接続されていれば、少なくともギャップ膜５０と接触している部分では、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が固定されるため、観察空間ＭＳが膨らむことを抑制することができる。なお、同様の理由により、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが近づいて貼り付いてしまう現象（スティッキング現象）を抑制することもできる。このように、試料収容セル１によれば、利便性を高めることができる。

＜第２実施形態＞
以下、本発明の他の一実施形態に係る試料収容セルについて、図面を参照しながら詳細に説明する。

［試料収容セルの構成］

図１１は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。第１実施形態における試料収容セルと比較すると、第１基板１０には、開口部１４０がさらに配置されている点で相違している。

続いて、試料収容セル１の内部構造を含めた詳細な構造について、図１２を用いて説明する。図１２は、本発明の第２実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。

第１実施形態における試料収容セル１と比較すると、流路空間ＦＰは、第３流路空間ＦＰ３をさらに含む点で相違している。第３流路空間ＦＰ３は、観察空間ＭＳから引き出されている。第３流路空間ＦＰ３は、本実施形態においては観察空間ＭＳと外部空間１０００とを開口部１４０を介して接続する。

第３流路空間ＦＰ３は、開口部１１０および開口部２１０に対応する領域を含んで形成されることから、前述の観察空間ＭＳと同様の理由により、流路幅は、好ましくは０．２μｍ以上５００μｍ以下であり、さらに好ましくは２μｍ以上３００μｍ以下である。

第１実施形態における試料収容セルは、観察空間ＭＳ内に空気の排出口を有しないため、観察空間ＭＳの両端から侵入した試料含有液体７００および７５０が内部へ侵入して行かないことが懸念される。そこで、観察空間ＭＳと外部空間１０００とを接続し、空気の排出口として機能する第３流路空間ＦＰ３を設けることによって、試料含有液体７００および７５０を観察空間ＭＳ内でスムーズに進行させることができる。

＜第３実施形態〜第５実施形態＞
試料含有液体７００および７５０を観察空間ＭＳ内でスムーズに進行させ、反応を促進させるためには、本実施形態による試料収容セルの構成に限らず、他にも種々の構成が考えられる。

第３実施形態として、例えば、第２実施形態における試料収容セルに対して、開口部１４０を設けず、その代わりに第３流路空間ＦＰ３内に吸着剤１４５を設けておいてもよい。図１３は、本発明の第３実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。図１４は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。当該吸着剤（ゲッター材）としては、例えばレーザ照射等による加熱によって活性化される材料を用いることができる。例えば、ゲッター材は、薄膜、ペレット、錠剤、粉末、粒状体又は他の形状の形であってよい。材質としては、ジルコニウム（Ｚｒ）−バナジウム（Ｖ）−鉄（Ｆｅ）合金やジルコニウム（Ｚｒ）−アルミニウム（Ａｌ）合金や、ジルコニウム＋鉄系、ジルコニウム＋ニッケル系の合金材料を用いることができるを用いることができる。観察時に当該吸着剤に対してレーザを照射して活性化させることによって、試料含有液体７００および７５０の観察空間ＭＳ内への侵入を促進することができる。レーザ光源９３０は電子顕微鏡に設けられてもよい。図１５は、本実施形態に係る電子顕微鏡９００を説明する模式図である。電子銃９１０から放出され、試料収容セル１を透過した電子線を検出することによって試料含有液体を観察する。観察開始と共に、レーザ光源９２０より吸着剤にレーザを照射して活性化させればよい。

このとき、第３流路空間ＦＰ３内の吸着剤にレーザ照射を行うためには、第１基板１０または第２基板２０の少なくともいずれか一方は、例えばガラス基板等の透光性を有する基板を用いる必要がある。

また、第４実施形態として、試料含有液体７００および７５０を注入後、開口部１４０を介して観察空間ＭＳ内の空気を吸引してもよい。これによって、試料含有液体７００および７５０を観察空間ＭＳ内への侵入を促進し、さらに混合を促進することができる。

また、第５実施形態として、電子顕微鏡に試料収容セルを加熱するためのヒーター９２０を設けてもよい。図１６は、本実施形態に係る電子顕微鏡９００を説明する模式図である。当該ヒーター９２０を用いて試料収容セル１を加熱することによって、観察時に試料含有液体７００および７５０の混合を促進することができる。

＜接続空間ＣＳの配置例＞
上記実施形態では、接続空間ＣＳは、ギャップ膜５０によって、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを接続する直線状の流路として形成されていた。ここでは、他の形状となる接続空間ＣＳの例を説明する。

図１７〜図１９は、観察空間の様々な配置例を示す模式図である。図１７は、第１接続空間ＣＳ１の流路幅が第２接続空間ＣＳ２の流路幅に比べて狭く設けている配置例である。このような配置とすることによって、第１流路空間ＦＰ１側から試料含有液体７００を注入し、その後に第２流路空間ＦＰ１側から試料含有液体７５０を注入する場合において、これらの注入の時間差が無視できない場合にも、第１流路空間ＦＰ１側から注入された試料含有液体７００が観察空間ＭＳへ到達するまでの時間を遅延させることができるため、観察空間ＭＳにおいて試料含有液体７００および７５０が接触、混合そして反応する動的な過程を観察することができる。

図１８は、第１流路空間ＦＰ１から観察空間ＭＳまでの経路を引き回すことによって、第２流路空間ＦＰ２から観察空間ＭＳまでの経路に比べて長く設けた接続空間ＣＳの配置例である。このような配置とすることによって、第１流路空間ＦＰ１側から試料含有液体７００を注入し、その後に第２流路空間ＦＰ１側から試料含有液体７５０を注入する場合において、これらの注入の時間差が無視できない場合にも、第１流路空間ＦＰ１側から注入された試料含有液体７００が観察空間ＭＳへ到達するまでの時間を遅延させることができるため、観察空間ＭＳにおいて試料含有液体７００および７５０が接触、混合そして反応する動的な過程を観察することができる。

図１９は、観察空間ＭＳ内を観察しやすくするために比較的広い面積を確保した配置例である。接続空間ＣＳによって、観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰに接続されている。接続空間の流路幅を調節することによって、試料含有液体の注入から観察空間ＭＳに侵入するまでの時間を調節できるため、観察空間ＭＳの配置は、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を指示できる範囲までは面積を拡大しても構わない。

＜その他の実施形態＞
第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、窒化シリコン膜に限らず、窒化酸化シリコン、酸化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜であってもよく、さらには、金属膜、金属窒化膜、金属酸化膜、金属窒化酸化膜であってもよい。これら薄膜としては、上述したように、電子線に対して透過性を有する必要がある。そして、電子顕微鏡による観察時に真空中に曝されるため、これらの薄膜は、大気や水分に対してバリア性を有することが望ましい。

また、膜が弛まないようにすることも望ましい。さらには、製造工程中においてフッ酸に代表される酸に対して腐食されにくい（エッチングされたとしても表面が荒れにくく、変色しにくい）ことが望ましい。これらの要素を考慮に入れて、第１薄膜、第２薄膜の材料を選択することが製造上は望ましい。

また、第１薄膜および第２薄膜は、単層に限らず、複数種類の膜を積層した膜であってもよい。第１薄膜１５０を酸化シリコン膜とする場合には、第１基板１０の熱酸化膜を用いてもよい。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を窒化シリコン膜で形成すると、薄く加工しやすく、また、膜の強度が確保しやすくなる。さらに、膜質の制御による応力調整が容易であり、膜が弛まないように形成することもできる。また、ギャップ膜３０（流路形成部３５０）を配置することにより、さらに膜全体の強度、応力調整等が容易になる。

電子顕微鏡による観察時において、試料収容セルのチャージアップを防止するために、数ｎｍのカーボン等の導電膜をセル外面（第１基板、第２基板、第１薄膜および第２薄膜の表面の少なくとも一部）に配置しておいてもよい。

１…試料収容セル、１０…第１基板、２０…第２基板、５０…ギャップ膜、１１０，１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，２１０…開口部、１４５…吸着剤、１５０…第１薄膜、２５０…第２薄膜、３００…硬化前樹脂、３２０，３３０…封止材、５１０，５１１…周辺部、５３０，５３１…流路形成部、７００，７５０…試料含有液体、８００…観察セル作製装置、８１０…試料注入器、８１１…チップ取付部、８１３…支持部、８１５…制御部、８１７…チップ取り外し部、８２０…チップ、８２５…チップ台、８３０，８４０…試料カップ、８３５，８４５…カップ台、８５０…試料台、８６０…ＵＶ照射器、８７０…廃棄口、８８８…ステージ、９００…電子顕微鏡、９１０…電子銃、９２０…レーザ光源、９３０…ヒーター、１０００…外部空間、１５０１，５００１…膜、５０１０…ガラス基板、５０２０…ガラス層

Claims (10)

1. 第１開口部を有する第１基板と、
   前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
   前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
   前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
   少なくとも前記第１開口部と前記第２開口部との間において前記第１薄膜と前記第２薄膜とに挟まれて配置されたギャップ膜と、
   を備え、
   前記第１基板と前記第２基板との間には、前記第１薄膜と前記第２薄膜と前記ギャップ膜とに囲まれた観察空間と、少なくとも２箇所で外部空間と接続される第１流路空間と、当該観察空間及び当該第１流路空間を接続する第１接続空間と、少なくとも２箇所で外部空間とを接続される第２流路空間と、当該観察空間及び当該第２接続空間を接続する第２接続空間とが配置され、
   前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セル。
2. 前記第１接続空間の流路幅及び前記第２接続空間の流路幅は、前記第１流路空間の流路幅及び前記第２流路空間の流路幅よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の試料収容セル。
3. 前記第１接続空間の流路幅及び前記第２接続空間の流路幅は、前記第１流路空間の流路幅及び前記第２流路空間の流路幅の１０％以下であることを特徴とする請求項１に記載の試料収容セル。
4. 前記観察空間から引き出され、外部空間と接続された第３流路空間
   を更に備えた請求項１に記載の試料収容セル。
5. 前記観察空間から引き出され、吸着剤が配置された第３流路空間
   を更に備えた請求項１に記載の試料収容セル。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか一に記載の試料収容セルを備えた電子顕微鏡。
7. 前記試料収容セルを加熱するためのヒーターを更に備えた請求項６に記載の電子顕微鏡。
8. レーザ光源を更に有する
   請求項７に記載の電子顕微鏡。
9. 電子線を透過させる薄膜に囲まれた観察空間に、前記観察空間に接続された第１流路空間に第１試料含有液体を注入し、
   前記観察空間に接続された第２流路空間に第２試料含有液体を注入し、
   前記観察空間に電子線を照射し、前記観察空間に侵入した前記第１試料含有液体及び前記第２試料含有液体を透過した前記電子線を観察すること
   を含む試料観察方法。
10. 前記観察することは、
    前記第１試料含有液体及び前記第２試料含有液体を加熱しながら観察することである請求項９に記載の試料観察方法。

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