JP2017224507A - 試料収容セルの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】利便性の高い試料収容セルを歩留まり良く製造すること。【解決手段】本開示の実施形態における試料収容セルの製造方法は、第１基板の第１領域に不純物を注入し、第２基板の第２領域に不純物を注入し、第１基板上又は第２基板上の少なくとも一方に中間層を形成し、第１基板および第２基板を接合し、第１基板の一部領域を、第１エッチング液を用いてエッチングし、第１領域内に有底の第１開口部、および中間層を露出する第２開口部および第３開口部を含む少なくとも２つの開口部を形成し、第２基板の一部領域を、第１エッチング液を用いてエッチングし、第２領域内に有底の第４開口部を形成し、第２開口部および第３開口部を介して第２エッチング液を中間層に供給して中間層をエッチングし、観察空間、および流路空間を形成することを含む。【選択図】図３

Description

本開示は観察対象の試料（Ｏｂｊｅｃｔ）を収容するセルの製造方法に関する。

電子顕微鏡を用いた試料の観察は、一般的には、観察対象の試料が真空等の特殊な空間に曝される。一方、近年では、メカノバイオロジー（Ｍｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）と呼ばれる技術分野において、生体細胞、生体組織等をそのまま観察したいという要求がある。しかしながら、電子顕微鏡での観察の際に試料を真空中に曝すと、細胞等は、液体成分が揮発していくことで変質し、また測定環境の汚染につながってしまう。これを防ぐために、様々な方法が開発されている。

例えば、試料を急速凍結して薄い氷の中に閉じ込め、冷凍状態で観察する技術がある。しかしながら、冷凍状態で観察する技術は、容易に観察用の試料を作製することができず、また、試料作成用の装置が非常に特殊であり高価なものである。

さらに、液体中に試料を保持したまま観察することで、さらに試料を直接的に観察するための技術が、特許文献１に開示されている。この技術では、観察用のセルを構成する薄膜間に試料を含む液体を配置しつつ、試料が配置される空間をセルの外部空間と遮断する。電子線は、薄膜を透過して薄膜間の試料に到達するようになっている。

特開２００７−１６５２７１号公報

また、特許文献１に開示されたセルのうち、注入口から試料を含む液体を注入する方式のセルにおいては、観察孔の大きさが小さい。そのため、観察孔に観察対象となる試料が到達しているか、電子顕微鏡による測定前に確認することが困難であった。また、試料を座体に配置した後に蓋体を被せ、座体と蓋体とを接着剤で接合する方式のセルについても特許文献１に開示されている。このようなセルでは、接合に高度な技術がユーザに求められ、座体と蓋体との接合がうまくいかずに内部の液体が漏れ出したり、座体と蓋体とのギャップ制御が困難であったりする場合があった。これらの複数の問題の少なくとも１つが生じる結果、試料を収容したセルが電子顕微鏡による観察に用いることができない状態であることも多くなり、ユーザの利便性を損ねていた。

また、観察用のセルの製造において、観察用のセルを構成する薄膜が破損し易いという課題がある。例えば、薄膜が破損されて穴が開いてしまうと、電子顕微鏡観察に必要な高真空条件下において、観察空間が密封されずに液体試料が蒸発してしまう危険性がある。その場合、試料収容セルとして機能しないばかりか、電子顕微鏡の故障にも繋がる場合がある。

本開示の目的の一つは、利便性の高い試料収容セルを歩留まり良く製造することにある。

本開示の一実施形態によると、第１面および前記第１面とは反対の第２面を有する第１基板の第１領域に、前記第１面から不純物を注入し、第３面および前記第３面とは反対の第４面を有する第２基板の第２領域に、前記第３面から前記不純物を注入し、前記第１基板の前記第１面上又は前記第２基板の前記第３面上の少なくとも一方に中間層を形成し、前記第１基板の前記第１面側および前記第２基板の前記第３面側が対向し、前記第１領域および前記第２領域の少なくとも一部が重畳するように前記第１基板および前記第２基板を接合し、前記第１基板の一部領域を、第１エッチング液を用いて前記第２面側からエッチングし、前記第１領域内に有底の第１開口部、および前記中間層を露出する第２開口部および第３開口部を含む少なくとも２つの開口部を形成し、前記第２基板の一部領域を、前記第１エッチング液を用いて前記第４面側からエッチングし、前記第２領域内に有底の第４開口部を形成し、前記第２開口部および前記第３開口部を介して第２エッチング液を前記中間層に供給して前記中間層をエッチングし、前記第１開口部と前記第４開口部との間に位置する観察空間、および前記観察空間と前記第２開口部および前記第３開口部とを接続する流路空間を形成することを含み、前記第１基板および前記第２基板に前記不純物が注入された領域は、それぞれ前記第１基板および前記第２基板よりも、前記第１エッチング液に対する耐性が高いことを特徴とする試料収容セルの製造方法を提供する。

これによれば、有底の第１開口部および第４開口部を形成すると共に第１薄膜および第２薄膜を形成した後は、第１薄膜および第２薄膜が外部空間に露出される表面側において何らかの加工を行う必要が無い。よって、第１薄膜および第２薄膜が形成された後に、それらが破損される危険性を低減させることができる。

前記第１基板および前記第２基板は、単結晶シリコン基板であってもよい。これによれば、不純物の濃度によって、第１エッチング液に対する単結晶シリコンのエッチングレートを制御することができるため、第１薄膜および第２薄膜を容易に形成することができる。

前記不純物は、ホウ素を含んでもよい。これによれば、ホウ素の濃度によって、第１エッチング液に対する単結晶シリコンのエッチングレートを制御することができるため、第１薄膜および第２薄膜を容易に形成することができる。

前記第１エッチング液は、エチレンジアミンおよびピロカテコールを含んでもよい。これによれば、ホウ素の濃度によって、エチレンジアミンおよびピロカテコールを含む第１エッチング液に対する単結晶シリコンのエッチングレートを制御することができるため、第１薄膜および第２薄膜を容易に形成することができる。

前記接合した後に、前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方を薄化してもよい。これによれば、第１乃至第４開口部を容易に形成することができる。

前記中間層は、酸化シリコン層であってもよい。これによれば、容易に観察空間を形成することができる。

本開示によると、利便性の高い試料収容セルを歩留まり良く製造することができる。

本開示の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料注入装置の試料注入処理を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料注入装置のセル封止処理を説明する図である。 本開示の第１実施形態における試料収容セルの製造工程を説明する図である。 図８に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。 図９に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。 本開示の第１実施形態における複数の試料収容セルを分離する方法を説明する図である。 本開示の第２実施形態における試料収容セルを封止する方法を説明する図である。 本開示の第３実施形態における試料収容セルの流路空間ＦＰの形状を説明する図である。 単結晶シリコン中のホウ素濃度と、各種エッチング液に対するエッチングレートの関係を示す図である。

＜第１実施形態＞
以下、本開示の一実施形態に係る試料収容セルについて、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は本開示の実施形態の一例であって、本開示はこれらの実施形態に限定して解釈されるものではない。なお、本実施形態で参照する図面において、同一部分または同様な機能を有する部分には同一の符号または類似の符号（数字の後にＡ、Ｂ等を付しただけの符号）を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、図面の寸法比率（各構成間の比率、縦横高さ方向の比率等）は説明の都合上実際の比率とは異なったり、構成の一部が図面から省略されたりする場合がある。

［試料収容セルの構成］
図１は、本開示の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。試料収容セル１は、第１基板１０、第２基板２０およびこれらに挟まれた中間層３０により形成されている。第１基板１０はシリコンであり、この例では１５０μｍの膜厚を有する。第２基板２０はシリコンであり、この例では１５０μｍの膜厚を有する。中間層３０は酸化シリコンであり、この例では１００ｎｍの膜厚を有する。中間層３０を部分的に除去することで、第１基板１０と第２基板２０との間に空間（流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳ）を形成する。

試料収容セル１は、電子顕微鏡の観察対象となる試料を液体に含ませた状態で、この内部空間に収容するセルである。以下、試料を含む液体を、試料含有液体と表現する場合がある。試料収容セル１の大きさは、１辺が０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度の正方形または長方形であり、この例では一辺が概ね１．０ｍｍである。

第１基板１０および第２基板２０には、それぞれ開口部が形成されている。この例では、第１基板１０に、第１開口部１１０、第２開口部１２０および第３開口部１３０が配置されている。第２基板２０には、第４開口部１４０（図３参照）が配置されている。続いて、試料収容セル１の内部構造を含めた詳細な構造について、図２および図３を用いて説明する。

図２は、本開示の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。図３は、本開示の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。なお、図３は、各断面線に対応する端面図を示している。以下の断面構成を示す模式図についても、それぞれ端面図として示している。

第１開口部１１０の中間層３０（第２基板２０）側の開口は、第１薄膜１５０により塞がれている。この例では、第１薄膜１５０は、第１基板１０の中間層３０側において、第１開口部１１０の少なくとも周縁部と接触した状態で、開口を塞いでいる。

第４開口部１４０の中間層３０（第１基板１０）側の開口は、第２薄膜２５０により塞がれている。この例では、第２薄膜２５０は、第２基板２０の中間層３０側において、第４開口部１４０の少なくとも周縁部と接触した状態で、開口を塞いでいる。

第１開口部１１０を塞いでいる部分の第１薄膜１５０と、第４開口部１４０を塞いでいる部分の第２薄膜２５０とは対向している。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、電子線に対して透過性を有する膜である。第１開口部１１０を塞いでいる部分の第１薄膜１５０と、開口部２１０を塞いでいる部分の第２薄膜２５０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、シリコンに不純物が注入された薄膜である。不純物としては、例えばホウ素（Ｂ）であり、濃度としては、１０²⁰ｃｍ^-3程度かそれ以上である。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０の膜厚は、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下、あるいは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下、あるいは５ｎｍ以上２５ｎｍ以下、あるいは１０ｎｍ以上２５ｎｍ以下、あるいは５ｎｍ以上１０ｎｍ以下、あるいは２５ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、この例では、２０ｎｍである。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とは同じ膜厚であってもよいし、異なる膜厚であってもよい。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、５ｎｍより薄くなると強度がなくなり破損するおそれがある。一方、１００ｎｍよりも厚くなると、電子線が透過しなくなる。したがって、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、破損しない程度の膜の強度を得ながらも、できるだけ薄くすることが望ましい。

第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離は、中間層３０の膜厚に対応する。そのため、この例では、上述した通り、１００ｎｍとなる。この距離は、試料すなわち観察対象物（例えば細胞）の大きさに依存して設定されることが望ましく、観察対象物よりも大きくする必要がある。一方、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が観察対象物に対して大きすぎると、観察対象物が重なって個々の観察対象物の観察結果が得られにくくなったり、電子線が透過しにくくなったりする。すなわち、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離を、電子線が通過できない程度の距離以上にすべきではない。

第１開口部１１０と第４開口部１４０とは対向して配置され、第１基板１０側から見た場合に、中間層３０側において、ほぼ同じ大きさで開口するように設計されている。第１開口部１１０および第４開口部１４０の開口（中間層３０側）の形状は、この例では、５０μｍ×５０μｍの正方形である。なお、この開口の形状は、５μｍ×５０μｍ等の長方形であってもよい。

第２開口部１２０および第３開口部１３０の開口の形状は、第１開口部１１０と比べて大きく、この例では、中間層３０側の開口の大きさは、１００μｍ×１００μｍの正方形である。この開口の形状についても正方形でなく長方形であってもよい。説明に用いた各図では、構造をわかりやすくする表現するために、各構成間の比率等を調整して示している。

なお、これらの第１開口部１１０、第２開口部１２０および第３開口部１３０の開口の形状は、四角形以外の多角形であってもよいし、円形、楕円形等、曲線で囲まれた形状であってもよいし、直線と曲線とで囲まれた形状であってもよい。ただし、第１基板１０および第２基板２０のエッチングを結晶異方性エッチングで行う場合には、開口の形状は四角形であることが望ましい。また、第２開口部１２０の形状と第３開口部１３０の形状とが異なっていてもよい。例えば、試料含有液体が注入される側の開口部が大きくてもよい。

第１開口部１１０および第４開口部１４０は、その内壁が、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が拡がる平面（基板表面）に対して傾き（テーパ形状）を持って形成されている。第２開口部１２０および第３開口部１３０についても、その内壁がその基板表面に対して傾きを持って形成されている。後述するように、｛１００｝面が表面になっている単結晶シリコンである第１基板１０および第２基板２０を用い、エチレンジアミンおよびピロカテコール（ＥＤＰ）水溶液等のエッチング液で結晶異方性エッチングを施すようにすれば、｛１１１｝面が開口部の側面に現れるため、テーパ形状の制御が容易になる。

なお、開口部内において傾きの程度が一定でなく変化していてもよい。すなわち、第１開口部１１０、第２開口部１２０および第３開口部１３０は中間層３０（第２基板２０）側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。また、第４開口部１４０は中間層３０（第１基板１０）側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。第１開口部１１０および第４開口部１４０の内壁がテーパ形状であると、電子線の入射角のマージンを確保することができる。

第１基板１０と第２基板２０との間には、中間層３０によって囲まれた空間が形成されている。この空間は、上記の観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰを含み、第２開口部１２０の開口端部から拡がった第１範囲、および第３開口部１３０の開口端部から拡がった第２範囲を含んでいる。それぞれの開口端部から空間端部までは、ほぼ等距離（この例では、約１５０μｍ）に拡がっている。第１範囲と第２範囲とは一部において重複している。この例では、重複した部分に観察空間ＭＳが配置されている。

流路空間ＦＰは、観察空間ＭＳと外部空間１０００とを接続するための空間である。この例では、流路空間ＦＰは、少なくとも２つの開口部を介して外部空間１０００と接続し、この例では第２開口部１２０および第３開口部１３０を介して外部空間１０００に接続する。一方の開口部が試料含有液体を注入するための開口であり、他方が流路空間ＦＰの空気を外部空間１０００に押し出すための排気口として機能する。

以上が、試料収容セル１の構成についての説明である。続いて、試料収容セル１に試料含有液体を配置して、電子顕微鏡にて観察できる状態にするための処理（観察セル作製処理）について説明する。

［観察セル作製処理］
図４は、本開示の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。試料含有液体７００は、流路空間ＦＰに第２開口部１２０から注入されると、流路空間ＦＰを移動して観察空間ＭＳに至り、さらには、第３開口部１３０まで到達する。なお、第２開口部１２０ではなく第３開口部１３０に試料含有液体７００が注入されてもよいが、以下の説明では、第２開口部１２０に試料含有液体７００が注入される液体注入口であるものとして説明する。この場合には、第３開口部１３０は、試料含有液体７００が注入されるときに、流路空間ＦＰの気体を排出する排出口として機能する。

図５は、本開示の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。試料含有液体７００が流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳに充填された後、第２開口部１２０および第３開口部１３０を、封止材３２０、３３０で塞ぐことで、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳは、外部空間１０００と分離される。封止材３２０、３３０は、例えば、エポキシ樹脂等の樹脂であり、ＵＶ硬化型の樹脂であってもよいし、２液混合型硬化樹脂（例えば、２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプ）であってもよい。ＵＶ硬化型の場合には、第２開口部１２０および第３開口部１３０を塞ぐように硬化前の樹脂を形成し、ＵＶ照射によって硬化させて封止材３２０、３３０が形成される。なお、封止材３２０、３３０によって外部空間１０００と分離された内部空間には気泡が含まれないようにしてもよいし、硬化前の樹脂と試料含有液体７００とが混合しないように、少なくとも樹脂が硬化するまでは互いに離れた状態（試料含有液体と封止材との間に気泡が存在する状態）にしてもよい。

観察空間ＭＳに配置された試料含有液体７００は、外部空間１０００と離隔されているため、電子顕微鏡による観察が行われる際に、試料収容セル１が真空環境に曝されても、試料含有液体７００が揮発してしまうことを防ぎ、液体の状態を保持することができる。また、観察空間ＭＳは、電子線に対して透過性を有する数十ｎｍ程度の第１薄膜１５０および第２薄膜２５０に囲まれている。観察空間ＭＳの高さ（第１薄膜１５０および第２薄膜２５０との距離）、すなわち試料含有液体７００の厚さは、電子線に対して透過性を有する程度の大きさである。

したがって、電子顕微鏡で用いられる電子線（図５における電子線ＥＢ）は、第１開口部１１０を通って、第１薄膜１５０、試料含有液体７００および第２薄膜２５０を通過し、さらに第４開口部１４０を通過することができる。電子線ＥＢの方向は図５に示す方向とは逆であってもよい。

図４における試料注入処理、および図５におけるセル封止処理については、手動処理であっても、自動処理であってもよい。手動処理の場合には、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスキャピラリの先端と第２開口部１２０および第３開口部１３０との位置関係を、実体顕微鏡を用いて確認し、ガラスキャピラリに接続されたインジェクタを用いて試料含有液体７００を注入したり、封止材３２０、３３０を注入したりすればよい。

また、自動処理の場合には、試料注入処理およびセル封止処理を自動的に実行して観察セルを作成する装置を用いればよい。

［観察セル作製装置］
図６は、本開示の第１実施形態における観察セル作製装置の試料注入処理を説明する図である。観察セル作製装置８００は、試料注入器８１０、ＵＶ照射器８６０およびステージ８８８を備える。ステージ８８８には、チップ台８２５、カップ台８３５、８４５、試料台８５０が取り付けられている。チップ台８２５は、チップ８２０を収容する。チップ８２０は、試料含有液体７００を吸い取るためのノズルを有するピペットチップである。カップ台８３５は、試料含有液体７００を保持する試料カップ８３０を収容する。カップ台８４５は、封止材となる硬化前樹脂３００を保持する試料カップ８４０を収容する。試料台８５０は、試料収容セル１を設置する。また、ステージ８８８には、チップ８２０を廃棄するための廃棄口８７０が配置されている。

試料注入器８１０に対して、ステージ８８８は水平方向（図６における左右方向、以下、Ｘ方向という）に移動可能である。また、試料注入器８１０は、水平方向であってステージ８８８の移動方向とは垂直な方向（図６における奥行き方向、以下、Ｙ方向という）と、鉛直方向（図６における上下方向、以下、Ｚ方向という）とに移動可能である。したがって、試料注入器８１０とステージ８８８とでＸ、Ｙ、Ｚ方向で相対的に移動可能になっている。なお、ステージ８８８上の試料台８５０については、別途Ｙ方向にも移動可能であってもよい。

試料注入器８１０は、チップ取付部８１１、支持部８１３、制御部８１５およびチップ取り外し部８１７を備える。チップ取付部８１１は、先端にチップ８２０が差し込まれて取り付けられる部分である。支持部８１３は、装置天井に対してＹ方向、Ｚ方向に移動させるように試料注入器８１０を支持する。制御部８１５は、チップ取付部８１１に取り付けられたチップ８２０に試料カップ内の液体を吸い込んで保持したり、チップ８２０に保持された液体を排出したりするための制御を行う。チップ取り外し部８１７は、下方に移動することによって、チップ８２０を下方に押し出してチップ取付部８１１から取り外す。

ＵＶ照射器８６０は、硬化前樹脂３００を硬化させるためのＵＶ光を照射する装置である。ＵＶ光の照射範囲は、試料台８５０に設置された試料収容セル１全体を含んでいてもよいし、第２開口部１２０および第３開口部１３０に対応する部分にスポットで照射するようにしてもよい。第２開口部１２０および第３開口部１３０に対応する部分にスポットで照射するようにすれば、試料へのＵＶ光の影響を抑えることができる。

図６（ａ）は、試料収容セル１がセル保管庫等から運ばれて、観察セル作製装置８００の試料台８５０に設置された状態を示している。続いて、ステージ８８８と試料注入器８１０とを移動させ、以下に示す順に処理を実行する。まず、チップ取付部８１１にチップ８２０を取り付ける（図６（ｂ））。その後、試料注入器８１０は、試料カップ８３０内の試料含有液体７００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図６（ｃ））。試料含有液体７００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の第２開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の試料含有液体７００を排出して第２開口部１２０から試料収容セル１内部に注入する（図６（ｄ））。

なお、チップ８２０を試料収容セル１の第２開口部１２０上に移動させる際には、例えば、試料注入器８１０は、カメラ等の撮像部を用いて試料収容セル１の形状を画像認識し、さらには第２開口部１２０の位置を認識し、第２開口部１２０の位置にチップ８２０を移動させる。続いて、観察セル作製装置８００の封止処理について説明する。

図７は、本開示の第１実施形態における観察セル作製装置のセル封止処理を説明する図である。試料注入器８１０は、試料カップ８４０内の硬化前樹脂３００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図７（ａ））。硬化前樹脂３００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の第２開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の硬化前樹脂３００を排出して第２開口部１２０に滴下し（図７（ｄ））、続いて、第３開口部１３０に滴下する（図７（ｅ））。なお、第３開口部１３０への滴下前に、再度チップ８２０内に硬化前樹脂３００を吸い上げておいてもよい。硬化前樹脂３００が、ＵＶ硬化型ではなく、上述した２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプであっても同様であり、この場合には、後述するＵＶ光の照射は不要である。

続いて、試料台８５０をＵＶ照射器８６０の下方に移動させ、試料収容セル１にＵＶ照射器８６０からのＵＶ光を照射する。この照射によって、試料収容セル１の第２開口部１２０および第３開口部１３０に滴下された硬化前樹脂３００を硬化させる。これによって、試料収容セル１の内部空間に試料含有液体７００が外部空間１０００と離隔された状態で収容される。また、試料注入器８１０は、チップ取り外し部８１７によって、チップ８２０をチップ取付部８１１から取り外して廃棄口８７０に廃棄する。ＵＶ光の照射中にチップ８２０の廃棄が実施されてもよい。

その後、試料含有液体７００を収容した試料収容セル１が回収され、新たな試料収容セル１が試料台８５０に設置される（図６（ａ））。なお、チップ８２０は、試料収容セル１毎に交換するプロセスを説明したが、第２開口部１２０に滴下する硬化前樹脂３００を吸い上げる前にチップ８２０を交換してもよい。

以上が、観察セル作製装置８００による試料注入処理およびセル封止処理についての説明である。続いて、試料収容セル１の製造方法について図８〜図１０を用いて説明する。

［試料収容セルの製造方法］
図８は、本開示の第１実施形態における試料収容セルの製造工程を説明する図である。図９は、図８に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。図１０は、９に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。

まず、図８（ａ）に示すように、第１基板１０を用意する。第１基板は、第１面１０ａおよび第１面とは反対の第２面１０ｂを有する。この例では、第１基板１０は、単結晶シリコン基板である。第１基板１０の厚さとしては、例えば６００μｍ〜７５０μｍ程度の標準的な厚さであってよいが、この例では７２５μｍである。また、第１基板１０としての単結晶シリコン基板の極性は、ｎ型であってもｐ型であってもよい。ただし、第１基板１０がｐ型であり、ホウ素（Ｂ）を含む場合は、その濃度が１０¹⁹ｃｍ^-3以下であることが好ましい。

さらに、図示はしないが、第２基板２０を用意する。第２基板２０は、第１基板１０と同じ基板であってもよく、この例では、両者は同じ基板である。第２基板２０は、第３面２０ａおよび第３面とは反対の第４面２０ｂを有する。

次に、図８（ｂ）に示すように、第１基板１０の第１領域に、イオン注入法によって第１面１０ａから不純物を注入する。不純物としては、ホウ素（Ｂ）を含む。第１領域は、前述の第１薄膜１５０が形成される領域であり、イオン注入の際にはフォトレジストをマスクとして第１領域に不純物を注入する。さらに、図示はしないが、第２基板２０にも同様の処理を行う。つまり、第２基板２０の第２領域に、イオン注入法によって第３面２０ａから不純物を注入する。第２領域は、前述の第２薄膜２５０が形成される領域である。この例では、第１基板１０の第１面１０ａ内の第１領域と、第２基板２０の第３面２０ａ内の第２領域とのレイアウトは等しい。

第１基板１０に不純物が注入された領域は、前述の第１薄膜１５０となる。この例では、前述のとおり、第１薄膜１５０の膜厚は２０ｎｍであり、第１薄膜１５０内の不純物としてのホウ素濃度は、１０²⁰ｃｍ^-3以上である。このため、ホウ素（Ｂ）は、第１基板１０の第１面１０ａから２０ｎｍの深さまで、１０²⁰ｃｍ^-3以上の濃度で注入されることが好ましい。このような条件を用いる根拠の詳細は後述する。

次に、中間層３０となる層を形成する。中間層３０を形成するには、第１基板１０の第１面１０ａ上又は第２基板２０の第３面上２０ａの少なくとも一方に中間層３０を形成する。つまり、第１基板１０の第１面１０ａ上又は第２基板２０の第３面２０ａ上のいずれかのみに中間層３０を形成してもよい。第１基板１０の第１面１０ａ上に形成された中間層３１と、第２基板２０の第３面２０ａ上に形成された中間層３２との膜厚の和が、中間層３０の所望の膜厚であればよい。この例では、所望の中間層３０の膜厚は１００ｎｍであり、第１基板１０の第１面１０ａおよび第２基板２０の第３面２０ａの各々に５０ｎｍの中間層を形成する。図８（ｃ）は、第１基板１０の第１面１０ａに５０ｎｍの中間層３１を形成した状態を示している。

次に、図９（ａ）に示すように、第１基板１０および第２基板２０を接合する。このとき、第１基板１０の第１面１０ａ側および第２基板２０の第３面２０ａ側が対向するように第１基板１０および第２基板２０を接合する。さらに、第１領域および第２領域の少なくとも一部が重畳するように第１基板１０および第２基板２０を接合する。この例では、第１領域および第２領域が一致して重畳するように第１基板および第２基板が接合されている。第１基板１０および第２基板２０は、例えば表面活性化接合法により接合することができる。

第１基板１０および第２基板２０を接合した後に、第１基板１０および第２基板２０の少なくとも一方の厚さを調整してもよい。この例では、第１基板１０および第２基板２０を共に１５０μｍに薄化する（図９（ｂ））。薄化する方法としては、切削加工および研磨加工を用いることができる。

次に、図９（ｃ）に示すように、第１基板１０の第２面１０ｂおよび第２基板２０の第４面２０ｂに、それぞれマスク層１５５、２５５を形成する。マスク層１５５、２５５は、後述するシリコンに対する第１エッチング液に対して耐性（エッチングレートが低い）を有する膜が望ましく、例えば、窒化シリコン膜である。マスク層１５５、２５５の膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上２μｍ以下である。

これらの膜は、ＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ＰＶＤ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）などの蒸着処理等によって形成されればよい。また、マスク層１５５、２５５が窒化シリコン膜でなく酸化シリコン膜であれば、第１基板１０および第２基板２０を熱酸化することで表面に形成された熱酸化膜を用いてもよい。但し、熱酸化膜を用いる場合は、第１薄膜１５０及び第２薄膜２５０にイオン注入された不純物が拡散してしまう恐れがあるため、ＣＶＤ、ＰＶＤなどの蒸着処理が望ましい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層１５５の一部をエッチングする（図１０（ａ））。エッチングされる領域は、第１開口部１１０、第２開口部１２０および第３開口部１３０に対応する領域である。マスク層１５５のエッチングには、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）が用いられる。このとき、第１基板１０についても一部エッチング（オーバーエッチング）してもよい。なお、膜のエッチングのためには、ドライエッチングおよびウエットエッチングのいずれも適用可能であり、特に明示しない限り以下の説明においても同様である。

次に、第１基板１０に、第１開口部１１０、第２開口部１２０および第３開口部１３０を形成する。第１開口部１１０は、第１領域内に配置され、有底である。第２開口部１２０および第３開口部１３０は、この工程において、中間層３０を露出する。中間層３０を露出する開口部は、第２開口部１２０および第３開口部１３０のみならず、これらを含む少なくとも２つの開口部を形成すればよい。マスク層を介して、第１基板の一部領域を、第１エッチング液を用いて第２面側からエッチングする。

同様に、第２基板２０に、第４開口部１４０を形成する。第４開口部は、第２領域内に配置され、有底である。マスク層を介して、第２基板の一部領域を、第１エッチング液を用いて第４面側からエッチングする。この例では、図１０（ｂ）に示すように、第１開口部１１０、第２開口部１２０、第３開口部１３０および第４開口部１４０を同時に形成する。

この第１開口部１１０、第２開口部１２０、第３開口部１３０および第４開口部１４０を形成する工程条件としては、第１基板１０および第２基板２０に不純物が注入された領域は、それぞれ第１基板１０および第２基板２０よりも、第１エッチング液に対する耐性が高い。換言すると、第１基板１０に不純物が注入された領域の第１エッチング液に対するエッチングレートは、第１基板１０に対するエッチングレートよりも小さい。

このような条件によれば、第１基板１０のエッチングにおいて、有底の第１開口部１１０および中間層３０を露出する第２開口部１２０および第３開口部１３０を同時に形成することができる。また、第２基板２０のエッチングにおいて、有底の第４開口部１４０を形成することができる。

前述のように、この例では、不純物としてホウ素（Ｂ）を用いる。これに対して用いることができる第１エッング液としては、図１４（Ｓｃｏｔｔ Ｄ. Ｃｏｌｌｉｎｓ, "Ｅｔｃｈ Ｓｔｏｐ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ", Ｊ. Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., ｖｏｌ.１４４, Ｎｏ.６, ｐｐ.２２４２−２２６２, １９９７から引用）に示すように、例えば、エチレンジアミンおよびピロカテコールの混合水溶液（ＥＤＰ）、および水酸化カリウム（ＫＯＨ）が知られている。

この例では、第１エッチング液は、ＥＤＰである。ＥＤＰの場合は、単結晶シリコン基板中のホウ素濃度が１０¹⁹ｃｍ^-3から１０²⁰ｃｍ^-3に増えると、エッチングレートが３桁以上小さくなる。よって、前述のような第１開口部１１０、第２開口部１２０、第３開口部１３０および第４開口部１４０を形成する際に、エッチング時間に関して十分なマージンを確保することができる。

また、これらのエッチングは、結晶異方性エッチングである。この例では、第１基板１０および第２基板（シリコン）の表面が｛１００｝面であり、第１開口部、第２開口部、第３開口部および第４開口部の側面が、エッチングレートの遅い｛１１１｝面に沿って形成される。また、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０と中間層３０とがエッチングストッパとなる。

次に、観察空間ＭＳ、および流路空間ＦＰを形成する。観察空間は、第１開口部１１０と第４開口部１４０との間に位置する。流路空間は、観察空間ＭＳと第２開口部１２０および第３開口部１３０とを接続する。

観察空間ＭＳ、および流路空間ＦＰを形成する方法としては、第２開口部１２０および第３開口部１３０を介して第２エッチング液を中間層３０に供給する。これによって中間層３０をエッチングする。エッチング液は、この例では、緩衝フッ酸水溶液（ＢＨＦ）である。このエッチングは、等方性エッチングであるため、エッチング時間の経過とともに、第２開口部１２０および第３開口部１３０の開口端部から拡がるように中間層３０がエッチングされていく。一方、第１基板１０と第２基板２０とは、ＢＨＦに対して耐性を有しているため、ほとんどエッチングされない。そのため、第１基板１０と第２基板２０との間に空間が形成されていく。

そして、第２開口部１２０および第３開口部１３０の双方から拡がった空間が接続され、かつ、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが対向する領域（観察空間ＭＳ）が形成された後に、エッチングを終了する。これによって、第１基板１０と第２基板２０との間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳが形成される。なお、中間層３０のエッチングの際には、エッチング液中に気泡が発生する場合がある。このような場合には、脱気処理をしつつ、エッチング処理を実行すればよい。

上述した試料収容セル１は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル１が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル１を個片化するための処理が行われる。この処理は、ダイシング等により切断するものであってもよいが、この例では、別の方法により個片化を実現する。

図１１は、本開示の第１実施形態における複数の試料収容セルを分離する方法を説明する図である。図１１（ａ）は、試料収容セル１が個片化される前の基板の一部を第１基板１０側から見た平面図である。図１１（ｂ）は、分断溝部分の断面構成（図１１における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。なお、図１１においては、試料収容セル１が３×３で配置された例を示しているが、これは基板全体の一部を抽出して例示したものである。

各試料収容セル１の間には、分断溝ＳＬ１とＳＬ２が形成されている。この例では、分断溝ＳＬ１は、第１基板１０側に設けられている。第２基板２０側にも分断溝ＳＬ２が分断溝ＳＬ１に対向した位置に設けられている。分断溝ＳＬ１、ＳＬ２はいずれも、中間層３０には到達していない。尚、分断溝は第１基板１０または第２基板２０だけに設けてもよい。

これらの分断溝ＳＬ１、ＳＬ２は、図１０（ｂ）に示す第１開口部１１０、第２開口部１２０、第３開口部１３０および第４開口部１４０を形成する際に、一緒に形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、マスク層１５５、２５５が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２が中間層３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２の深さを３μｍ程度とする場合には、マスク層１５５、２５５のスリットを４μｍ程度の幅にしておけばよい。

分断溝ＳＬ１、ＳＬ２が中間層３０に到達していないため、図１０（ｃ）に示す中間層３０のエッチングの際に、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２から中間層３０がエッチングされないようにすることができる。そして、試料収容セル１に軽い衝撃や曲げの力を与えることにより、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２において容易に、隣接する試料収容セル１と分離することができる。

なお、上述した製造方法における各構成の材料、エッチング方法等の各種条件については一例であって、様々な条件に設定可能である。以上が試料収容セル１の製造方法についての説明である。

上述した一実施形態に係る試料収容セル１は、第１基板１０と第２基板２０との距離は中間層３０の厚さによって決まるため、精度のよいギャップ制御が可能である。また、このように、試料収容セル１によれば、利便性を高めることができる。

また、上述した一実施形態に係る試料収容セルの製造方法によれば、有底の第１開口部１１０および第４開口部１４０を形成すると共に第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を形成した後は、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が外部空間に露出される表面側において何らかの加工を行う必要が無い。つまり、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が外部空間に露出される表面に、例えば、何らかの膜を成膜したり、それをエッチングしたりする工程を必要としない。よって、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が形成された後、それらが破損される危険性が低減する。例えば、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が破損されて穴が開いてしまうと、電子顕微鏡観察に必要な高真空条件下において、液体試料が観察空間に密閉されずに蒸発してしまう危険性がある。その場合、試料収容セルとして機能しないばかりか、電子顕微鏡の故障にも繋がる場合がある。

＜第２実施形態＞
第１実施形態においては、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを外部空間１０００と分離するために、第２開口部１２０および第３開口部１３０を封止材３２０、３３０によって塞いでいた。第２実施形態では、これを蓋板で塞ぐ例を説明する。

図１２は、本開示の第２実施形態における試料収容セル２を封止する方法を説明する図である。この例では、蓋板３７０によって第２開口部１２０および第３開口部１３０を塞ぐようになっている。蓋板３７０は、例えば、ガラスである。蓋板３７０と第１基板１０との間には、図１２に示すように接着剤３６０が形成されていてもよい。蓋板３７０は、開口部１２０、１３０を塞ぐ程度の大きさ（例えば、開口部より２００μｍ程度大きい正方形）であればよいが、封止する工程の容易性を考慮して、より大きくした形状であってもよいし、正方形以外の形状であってもよい。

＜第３実施形態＞
第３実施形態では、外部空間１０００と流路空間ＦＰとを接続する開口部が３つ以上である場合について説明する。

図１３は、本開示の第３実施形態における試料収容セル３の流路空間ＦＰの形状を説明する図である。この例では、第１実施形態で説明した第２開口部１２０および第３開口部１３０の他に、これらと同様な形状の第５開口部１５１が形成されている。このように、外部空間１０００と流路空間ＦＰとを接続する開口部の数は２つに限らず、さらに多くてもよい。このようにすると、例えば、第５開口部１５１と第１開口部１１０とを離すことができ、試料含有液体７００の注入が容易になる。ただし、この場合には、電子顕微鏡による観察前に、第１開口部１１０以外の開口部を封止しておく必要がある。

この場合、第２開口部１２０および第３開口部１３０は、第５開口部１５１よりも開口部が小さくてもよい。すなわち、試料含有液体７００を注入するための開口部を大きくしておき、流路空間ＦＰを形成する際のエッチング液導入のための開口部は小さくしてもよい。

＜その他の実施形態＞
［表面処理］
試料収容セルの外面（特に、第１基板１０の外面）については、親油（疎水）処理を施してもよい。このようにすると、試料含有液体７００が水分系のものであれば、注入の際に外側にこぼれた試料含有液体７００をセル表面から取り除くことが容易になる。また、封止材がアルコール系（油系）であれば、開口部内に浸入しにくくなり、試料含有液体との接触を避けて混合しないようにすることもできる。試料含有液体７００がアルコール系（油系）であれば、試料収容セル１の外面に、逆の処理、すなわち親水処理を施してもよい。

例えば、親水処理であれば、酸化膜で覆う処理であればよく、フッ素および酸素によるプラズマ処理で形成してもよいし、酸素含有雰囲気下での熱処理で形成してもよい。また、シリコン基板表面に形成された自然酸化膜を親水表面としてもよい。一方、親油（疎水）処理であれば、フッ素および窒素によるプラズマ処理によりシリコン基板表面にフッ化物を形成してもよいし、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシロキサン）処理によってシリコン基板表面にメチル基を形成してもよい。

１…試料収容セル、１０…第１基板、２０…第２基板、３０，３１，３２…中間層、１１０，１２０，１３０，１４０，１５１…開口部、１５０…第１薄膜、１５５，２５５…マスク層、２５０…第２薄膜、３００…硬化前樹脂、３２０，３３０…封止材、３６０…接着剤、３７０…蓋板、７００…試料含有液体、８００…観察セル作製装置、８１０…試料注入器、８１１…チップ取付部、８１３…支持部、８１５…制御部、８１７…チップ取り外し部、８２０…チップ、８２５…チップ台、８３０，８４０…試料カップ、８３５，８４５…カップ台、８５０…試料台、８６０…ＵＶ照射器、８７０…廃棄口、８８８…ステージ、１０００…外部空間

Claims (6)

1. 第１面および前記第１面とは反対の第２面を有する第１基板の第１領域に、前記第１面から不純物を注入し、
   第３面および前記第３面とは反対の第４面を有する第２基板の第２領域に、前記第３面から前記不純物を注入し、
   前記第１基板の前記第１面上又は前記第２基板の前記第３面上の少なくとも一方に中間層を形成し、
   前記第１基板の前記第１面側および前記第２基板の前記第３面側が対向し、前記第１領域および前記第２領域の少なくとも一部が重畳するように前記第１基板および前記第２基板を接合し、
   前記第１基板の一部領域を、第１エッチング液を用いて前記第２面側からエッチングし、前記第１領域内に有底の第１開口部、および前記中間層を露出する第２開口部および第３開口部を含む少なくとも２つの開口部を形成し、
   前記第２基板の一部領域を、前記第１エッチング液を用いて前記第４面側からエッチングし、前記第２領域内に有底の第４開口部を形成し、
   前記第２開口部および前記第３開口部を介して第２エッチング液を前記中間層に供給して前記中間層をエッチングし、前記第１開口部と前記第４開口部との間に位置する観察空間、および前記観察空間と前記第２開口部および前記第３開口部とを接続する流路空間を形成することを含み、
   前記第１基板および前記第２基板に前記不純物が注入された領域は、それぞれ前記第１基板および前記第２基板よりも、前記第１エッチング液に対する耐性が高いことを特徴とする試料収容セルの製造方法。
2. 前記第１基板および前記第２基板は、単結晶シリコン基板であることを特徴とする請求項１に記載の試料収容セルの製造方法。
3. 前記不純物は、ホウ素を含むことを特徴とする請求項２に記載の試料収容セルの製造方法。
4. 前記第１エッチング液は、エチレンジアミンおよびピロカテコールを含むことを特徴とする請求項３に記載の試料収容セルの製造方法。
5. 前記接合した後に、前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方を薄化することを更に含む請求項１に記載の試料収容セルの製造方法。
6. 前記中間層は、酸化シリコン層である請求項１に記載の試料収容セルの製造方法。

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