JP2017537611A - 持続的エピジェネティック遺伝子サイレンシング - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
1.2以上の異なるエフェクターモジュールの組合せ集合により機能する;
2.エピジェネティック抑制の頑強かつ持続的な状態を確立する;および
3.細胞において一過性に発現された場合に、この生物学的機能を発揮する。
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物(生成物)を提供し、ここで、それらのATRの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される。
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物を提供し、ここで、それらのATRの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される。
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを同時、連続的または別々に対象に投与することを含む遺伝子治療の方法を提供し、ここで、それらのATRの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される。本発明はまた、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを同時、連続的または別々に対象に投与することを含む遺伝子治療の方法を提供し、ここで、それらのATRの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される。
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供し、ここで、それらのATRの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される。本発明はまた、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供し、ここで、それらのATRの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される。
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含み、ここで、該DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される。該ATRは、例えば、群(a)のドメイン、群(b)のドメインおよび群(c)のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含みうる。本発明はまた、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)を提供し、ここで、該DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される。
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを個々に含み、ここで、それぞれの個々のDNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される。各ATRは、例えば、群(a)のドメイン、群(b)のドメインおよび群(c)のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含みうる。本発明はまた、2以上の異なる人工転写リプレッサー(ATR)またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む産物を提供し、ここで、それらの2以上の異なるATRは、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを個々に含み、ここで、それぞれの個々のDNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つは、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される。
本発明の好ましい特徴および実施形態を、ここに非限定的な例によって説明することとする。
(a) KRABドメインもしくはそのホモログに作動しうるように連結された(機能しうる形で連結された)DNA結合ドメインを含有する人工転写リプレッサー(ATR);
(b) DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそれらのホモログに作動しうるように連結されたDNA結合ドメインを含有するATR;および
(c) DNMT3Lドメインもしくはそのホモログに作動しうるように連結されたDNA結合ドメインを含有するATR
から選択される、2つ以上のATR、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含有する製品を提供するものであって、このATRの少なくとも2つは (a)、(b)もしくは(c)の同じでないグループ(異なる群)から選択される。
「エフェクタードメイン」という用語は、たとえば、DNAもしくはクロマチンに対する反応(たとえばDNAのメチル化)を触媒することによって、または細胞内から追加の活性物質をリクルートすることによって、標的遺伝子にサイレンシング効果をもたらす、ATRの一部分を指すと理解されるべきであって、結果として遺伝子の転写が抑制される。
ALSPQHSAVTQGSIIKNKEGMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSV
(配列番号1)
ITLEDVAVDFTWEEWQLLGAAQKDLYRDVMLENYSNLVAVGYQASKPDALFKLEQGEQLWTIEDGIHSGACS
(ZNF350タンパク質のKRABドメイン;配列番号2)
VMFEEVSVCFTSEEWACLGPIQRALYWDVMLENYGNVTSLEWETMTENEEVTSKPSSSQRADSHKGTSKRLQG
(ZNF197タンパク質のKRABドメイン;配列番号3)
VSFKDVAVDFTQEEWQQLDPDEKITYRDVMLENYSHLVSVGYDTTKPNVIIKLEQGEEPWIMGGEFPCQHSP
(RBAKタンパク質のKRABドメイン;配列番号4)
VKIEDMAVSLILEEWGCQNLARRNLSRDNRQENYGSAFPQGGENRNENEESTSKAETSEDSASRGETTGRSQKE
(ZKSCAN1タンパク質のKRABドメイン;配列番号5)
LTFKDVFVDFTLEEWQQLDSAQKNLYRDVMLENYSHLVSVGYLVAKPDVIFRLGPGEESWMADGGTPVRTCA
(KRBOX4タンパク質のKRABドメイン;配列番号6)
VTFEDVTLGFTPEEWGLLDLKQKSLYREVMLENYRNLVSVEHQLSKPDVVSQLEEAEDFWPVERGIPQDTIP
(ZNF274タンパク質のKRABドメイン;配列番号7)
TYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV
(配列番号8)
を含有することができる。
CHGVLRRRKDWNVRLQAFFTSDTGLEYEAPKLYPAIPAARRRPIRVLSLFDGIATGYLVLKELGIKVGKYVASEVCEESIAVGTVKHEGNIKYVNDVRNITKKNIEEWGPFDLVIGGSPCNDLSNVNPARKGLYEGTGRLFFEFYHLLNYSRPKEGDDRPFFWMFENVVAMKVGDKRDISRFLECNPVMIDAIKVSAAHRARYFWGNLPGMNRPVIASKNDKLELQDCLEYNRIAKLKKVQTITTKSNSIKQGKNQLFPVVMNGKEDVLWCTELERIFGFPVHYTDVSNMGRGARQKLLGRSWSVPVIRHLFAPLKDYFACE
(ヒトDNMT3Bの触媒ドメイン;配列番号9)
MVAELISEEDLEFMKGDTRHLNGEEDAGGREDSILVNGACSDQSSDSPPILEAIRTPEIRGRRSSSRLSKREVSSLLSYTQDLTGDGDGEDGDGSDTPVMPKLFRETRTRSESPAVRTRNNNSVSSRERHRPSPRSTRGRQGRNHVDESPVEFPATRSLRRRATASAGTPWPSPPSSYLTIDLTDDTEDTHGTPQSSSTPYARLAQDSQQGGMESPQVEADSGDGDSSEYQDGKEFGIGDLVWGKIKGFSWWPAMVVSWKATSKRQAMSGMRWVQWFGDGKFSEVSADKLVALGLFSQHFNLATFNKLVSYRKAMYHALEKARVRAGKTFPSSPGDSLEDQLKPMLEWAHGGFKPTGIEGLKPNNTQPENKTRRRTADDSATSDYCPAPKRLKTNCYNNGKDRGDEDQSREQMASDVANNKSSLEDGCLSCGRKNPVSFHPLFEGGLCQTCRDRFLELFYMYDDDGYQSYCTVCCEGRELLLCSNTSCCRCFCVECLEVLVGTGTAAEAKLQEPWSCYMCLPQRCHGVLRRRKDWNVRLQAFFTSDTGLEYEAPKLYPAIPAARRRPIRVLSLFDGIATGYLVLKELGIKVGKYVASEVCEESIAVGTVKHEGNIKYVNDVRNITKKNIEEWGPFDLVIGGSPCNDLSNVNPARKGLYEGTGRLFFEFYHLLNYSRPKEGDDRPFFWMFENVVAMKVGDKRDISRFLECNPVMIDAIKVSAAHRARYFWGNLPGMNRPVIASKNDKLELQDCLEYNRIAKLKKVQTITTKSNSIKQGKNQLFPVVMNGKEDVLWCTELERIFGFPVHYTDVSNMGRGARQKLLGRSWSVPVIRHLFAPLKDYFACE
(DNMT3B;配列番号36)
LRTLDVFSGCGGLSEGFHQAGISDTLWAIEMWDPAAQAFRLNNPGSTVFTEDCNILLKLVMAGETTNSRGQRLPQKGDVEMLCGGPPCQGFSGMNRFNSRTYSKFKNSLVVSFLSYCDYYRPRFFLLENVRNFVSFKRSMVLKLTLRCLVRMGYQCTFGVLQAGQYGVAQTRRRAIILAAAPGEKLPLFPEPLHVFAPRACQLSVVVDDKKFVSNITRLSSGPFRTITVRDTMSDLPEVRNGASALEISYNGEPQSWFQRQLRGAQYQPILRDHICKDMSALVAARMRHIPLAPGSDWRDLPNIEVRLSDGTMARKLRYTHHDRKNGRSSSGALRGVCSCVEAGKACDPAARQFNTLIPWCLPHTGNRHNHWAGLYGRLEWDGFFSTTVTNPEPMGKQGRVLHPEQHRVVSVRECARSQGFPDTYRLFGNILDKHRQVGNAVPPPLAKAIGLEIKLCMLAKARESASAKIKEEEAAKD
(ヒトDNMT1の触媒ドメイン;配列番号10)
MAAIPALDPEAEPSMDVILVGSSELSSSVSPGTGRDLIAYEVKANQRNIEDICICCGSLQVHTQHPLFEGGICAPCKDKFLDALFLYDDDGYQSYCSICCSGETLLICGNPDCTRCYCFECVDSLVGPGTSGKVHAMSNWVCYLCLPSSRSGLLQRRRKWRSQLKAFYDRESENPLEMFETVPVWRRQPVRVLSLFEDIKKELTSLGFLESGSDPGQLKHVVDVTDTVRKDVEEWGPFDLVYGATPPLGHTCDRPPSWYLFQFHRLLQYARPKPGSPRPFFWMFVDNLVLNKEDLDVASRFLEMEPVTIPDVHGGSLQNAVRVWSNIPAIRSRHWALVSEEELSLLAQNKQSSKLAAKWPTKLVKNCFLPLREYFKYFSTELTSSL
(配列番号11)
MSSLPGCIGLDAATATVESEEIAELQQAVVEELGISMEELRHFIDEELEKMDCVQQRKKQLAELETWVIQKESEVAHVDQLFDDASRAVTNCESLVKDFYSKLGLQYRDSSSEDESSRPTEIIEIPDEDDDVLSIDSGDAGSRTPKDQKLREAMAALRKSAQDVQKFMDAVNKKSSSQDLHKGTLSQMSGELSKDGDLIVSMRILGKKRTKTWHKGTLIAIQTVGPGKKYKVKFDNKGKSLLSGNHIAYDYHPPADKLYVGSRVVAKYKDGNQVWLYAGIVAETPNVKNKLRFLIFFDDGYASYVTQSELYPICRPLKKTWEDIEDISCRDFIEEYVTAYPNRPMVLLKSGQLIKTEWEGTWWKSRVEEVDGSLVRILFLDDKRCEWIYRGSTRLEPMFSMKTSSASALEKKQGQLRTRPNMGAVRSKGPVVQYTQDLTGTGTQFKPVEPPQPTAPPAPPFPPAPPLSPQAGDSDLESQLAQSRKQVAKKSTSFRPGSVGSGHSSPTSPALSENVSGGKPGINQTYRSPLGSTASAPAPSALPAPPAPPVFHGMLERAPAEPSYRAPMEKLFYLPHVCSYTCLSRVRPMRNEQYRGKNPLLVPLLYDFRRMTARRRVNRKMGFHVIYKTPCGLCLRTMQEIERYLFETGCDFLFLEMFCLDPYVLVDRKFQPYKPFYYILDITYGKEDVPLSCVNEIDTTPPPQVAYSKERIPGKGVFINTGPEFLVGCDCKDGCRDKSKCACHQLTIQATACTPGGQINPNSGYQYKRLEECLPTGVYECNKRCKCDPNMCTNRLVQHGLQVRLQLFKTQNKGWGIRCLDDIAKGSFVCIYAGKILTDDFADKEGLEMGDEYFANLDHIESVENFKEGYESDAPCSSDSSGVDLKDQEDGNSGTEDPEESNDDSSDDNFCKDEDFSTSSVWRSYATRRQTRGQKENGLSETTSKDSHPPDLGPPHIPVPPSIPVGGCNPPSSEETPKNKVASWLSCNSVSEGGFADSDSHSSFKTNEGGEGRAGGSRMEAEKASTSGLGIKDEGDIKQAKKEDTDDRNKMSVVTESSRNYGYNPSPVKPEGLRRPPSKTSMHQSRRLMASAQSNPDDVLTLSSSTESEGESGTSRKPTAGQTSATAVDSDDIQTISSGSEGDDFEDKKNMTGPMKRQVAVKSTRGFALKSTHGIAIKSTNMASVDKGESAPVRKNTRQFYDGEESCYIIDAKLEGNLGRYLNHSCSPNLFVQNVFVDTHDLRFPWVAFFASKRIRAGTELTWDYNYEVGSVEGKELLCCCGAIECRGRLL
(配列番号12)
VGCDCKDGCRDKSKCACHQLTIQATACTPGGQINPNSGYQYKRLEECLPTGVYECNKRCKCDPNMCTNRLVQHGLQVRLQLFKTQNKGWGIRCLDDIAKGSFVCIYAGKILTDDFADKEGLEMGDEYFANLDHIESVENFKEGYESDAPCSSDSSGVDLKDQEDGNSGTEDPEESNDDSSDDNFCKDEDFSTSSVWRSYATRRQTRGQKENGLSETTSKDSHPPDLGPPHIPVPPSIPVGGCNPPSSEETPKNKVASWLSCNSVSEGGFADSDSHSSFKTNEGGEGRAGGSRMEAEKASTSGLGIKDEGDIKQAKKEDTDDRNKMSVVTESSRNYGYNPSPVKPEGLRRPPSKTSMHQSRRLMASAQSNPDDVLTLSSSTESEGESGTSRKPTAGQTSATAVDSDDIQTISSGSEGDDFEDKKNMTGPMKRQVAVKSTRGFALKSTHGIAIKSTNMASVDKGESAPVRKNTRQFYDGEESCYIIDAKLEGNLGRYLNHSCSPNLFVQNVFVDTHDLRFPWVAFFASKRIRAGTELTWDYNYEVGSVEGKELLCCCGAIECRGRLL
(ヒトSETDB1の触媒ドメイン:配列番号13)
本発明のATRは、特定の核酸配列に結合してそのATRが、たとえば細胞のゲノムなどのポリヌクレオチド内の特定の部位を標的とすることを可能にする、DNA結合ドメインを含有する。DNA結合ドメインはたとえば、タンパク質、DNA、RNAに基づくか、または化学的なものとすることができる。
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVA(配列番号14)、その標的となる結合部位: 5′-TACCCAGATTGGCCCCACT-3′ (配列番号34)
および:
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVA(配列番号15)、その標的となる結合部位:5′-TACCTAGAGGAGAAAGGTT-3′ (配列番号35)。
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号16)、その標的となる結合部位:5′-TCTCTCCTACCCTCCCGCT-3′ (配列番号17)
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号18)、その標的となる結合部位:5′-TGGTCCTTCCTCTCCCGCT-3′ (配列番号19)
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号20)、その標的となる結合部位:5′-TCGCTCCGTGACTTCCCTT-3′ (配列番号21)。
TALE BCL11A #1
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号37)、その標的となる結合部位: 5′- TCCAAAAGCCAGTCTCACC -3′ (配列番号38)
TALE BCL11A #2
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号39)、その標的となる結合部位:5′- TCTCCCCGGGAATCGTTTT -3′ (配列番号40)
TALE BCL11A #3
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号41)、その標的となる結合部位: 5′- TCCTCCCGCTGCACACTTG -3′ (配列番号42)
TALE BCL11A #4
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号43)、その標的となる結合部位: 5′- TAGTCATCCCCACAATAGT -3′ (配列番号44)
TALE BCL11A #5
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号45)、その標的となる結合部位: 5′- TCCCGCTGCCTTTTGTGCC -3′ (配列番号46)
TALE BCL11A #6
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号47)、その標的となる結合部位: 5′- TCCTCGCGCTTGCCCTCCC -3′ (配列番号48)
TALE BCL11A #7
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG(配列番号49)、その標的となる結合部位: 5′- TCCCCCGGCCCTAGCTCCT -3′ (配列番号50)
TALE BCL11A #8
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号51)、その標的となる結合部位: 5′- TCCTGGTCCGCCCCCAGCA -3′ (配列番号52)
TALE BCL11A #9
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号53)、その標的となる結合部位: 5′- TGCCGAGACCTCTTCTCGA -3′ (配列番号54)
TALE BCL11A #10
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVKRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号55)、その標的となる結合部位: 5′- TCGGCTTTGCAAAGCATTT -3′ (配列番号56)
TALE BCL11A #11
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号57)、その標的となる結合部位: 5′- TGCAAAGCCGAGTTTCACC -3′ (配列番号58)
TALE BCL11A #12
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号59)、その標的となる結合部位:5′- TACAGTTGCCCTGCAAAAT -3′ (配列番号60)
TALE BCL11A #13
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TALE BCL11A #14
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TALE BCL11A #15
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号65)、その標的となる結合部位: 5′- TCTCCCGCTGACTGCGCCT -3′ (配列番号66)
TALE BCL11A #16
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号67)、その標的となる結合部位: 5′- TCCCTTGCTGCCAAACTTT -3′ (配列番号68)
TALE BCL11A #17
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (配列番号69)、その標的となる結合部位: 5′- TGGGCCCTCACGCCTTTCT -3′ (配列番号70)。
MGGRRVRWEVYISRALWLTREPTAYWLIEINTTHYRETQATGATMYPYDVPDYASPKKKRKVEASDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSPKKKRKVG
(触媒活性のないCas9:配列番号22)
gRNA #1: TATAAGTGGAGGCGTCGCGC (配列番号23)
gRNA #2: GCCCGAATGCTGTCAGCTTC (配列番号24)
gRNA #3: TGCGTCGCTGGCTTGGAGAC (配列番号25)
gRNA #4: CCAATCAGGACAAGGCCCGC (配列番号26)
gRNA #5: AGGGTAGGAGAGACTCACGC (配列番号27)
gRNA #6: GCGGGCCACCAAGGAGAACT (配列番号28)
gRNA #7: GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (配列番号29)
gRNA #8: CTCCCGCTCTGCACCCTCTG (配列番号30)
gRNA #9: TTTGGCCTACGGCGACGGGA (配列番号31)
gRNA #10: GGGGCAAGTAGCGCGCGTCC (配列番号32)
gRNA #11: TAGTCCAGGGCTGGATCTCG (配列番号33)
gRNA #1: UAUAAGUGGAGGCGUCGCGC
gRNA #2: GCCCGAAUGCUGUCAGCUUC
gRNA #3: UGCGUCGCUGGCUUGGAGAC
gRNA #4: CCAAUCAGGACAAGGCCCGC
gRNA #5: AGGGUAGGAGAGACUCACGC
gRNA #6: GCGGGCCACCAAGGAGAACU
gRNA #7: GCUACUCUCUCUUUCUGGCC
gRNA #8: CUCCCGCUCUGCACCCUCUG
gRNA #9: UUUGGCCUACGGCGACGGGA
gRNA #10: GGGGCAAGUAGCGCGCGUCC
gRNA #11: UAGUCCAGGGCUGGAUCUCG
GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
CpG 105に対するgRNA #1:
GCCUUUCUGCAGACGUUCCC (配列番号71)
CpG 105に対するgRNA #2:
UGGGUGUGCGCCUUGGCCGG (配列番号72)
CpG 105に対するgRNA #3:
CGGUGGUGAGAUGACCGCCU (配列番号73)
CpG 105に対するgRNA #4:
GGAAUGUGCUCACGGCGCCG (配列番号74)
CpG 105に対するgRNA #5:
GACUGCCCGCGCUUUGUCCU (配列番号75)
CpG 105に対するgRNA #6:
CCAGAGUCUGGCCCCCGGAG (配列番号76)
CpG 105に対するgRNA #7:
UCUGCGACCCUUAGGAGCCG (配列番号77)
CpG 105に対するgRNA #8:
GAGCGCCCCGCCAAGCGACU (配列番号78)
CpG 105に対するgRNA #9:
CAAGUCUCCAGGAGCCCGCG (配列番号79)
CpG 105に対するgRNA #10:
CGCGGAAUCCAGCCUAAGUU (配列番号80)
CpG 105に対するgRNA #11:
CCCGCUGCGGAGCUGUAACU (配列番号81)
CpG 31に対するgRNA #1:
CGCUCCUGAGUCCGCGGAGU (配列番号82)
CpG 31に対するgRNA #2:
CACGGCUCUCCCCGUCGCCG (配列番号83)
CpG 31に対するgRNA #3:
CCGCCUUUUGUUCCGGCCAG (配列番号84)
CpG 31に対するgRNA #4:
GCGCGAGGAGCCGGCACAAA (配列番号85)
CpG 31に対するgRNA #5:
GCCACUUUCUCACUAUUGUG (配列番号86)
CpG 31に対するgRNA #6:
GCUGCCUCUGAGGUUCGGUC (配列番号87)
CpG 31に対するgRNA #7:
AAGGGCAGGAGCUAGGGCCG (配列番号88)
CpG 31に対するgRNA #8:
GAGCCCGGACUGCUGCCUCC (配列番号89)
CpG 38に対するgRNA #1:
GUUUACAAGCACCGCGUGUG (配列番号90)
CpG 38に対するgRNA #2:
AACAGACAGAGGACCGAGCG (配列番号91)
CpG 38に対するgRNA #3:
GGCGCCGGGUGGGCGAUCCG (配列番号92)
CpG 38に対するgRNA #4:
GGUCGGGCAAGGCCCGGGCG (配列番号93)
CpG 38に対するgRNA #5:
AAGAGGUCUCGGCAUUGUGC (配列番号94)
CpG 38に対するgRNA #6:
GUUCCACAGCUUCGGGACCGCG (配列番号95)
CpG 38に対するgRNA #7:
GAAAUCGGCUGGGUGAAACU (配列番号96)
CpG 38に対するgRNA #8:
GCAGUGUCUCCGCGCCAGCC (配列番号97)
CpG 38に対するgRNA #9:
CCUCCCCUCCCCUCCGCCCUGGG (配列番号98)
CpG 115に対するgRNA #1:
UCCUCCUGUCCCGGGGUUAAAGG (配列番号99)
CpG 115に対するgRNA #2:
CAUCUUUUGGGACACUCUAGGCUGG (配列番号100)
CpG 115に対するgRNA #3:
AAGUCAGGCCCUUCUUCGGAAGG (配列番号101)
CpG 115に対するgRNA #4:
GCAGCCUGGACUGCGCGCCCCGG (配列番号102)
CpG 115に対するgRNA #5:
UGCCCGGCGAUUCUCGUCCG (配列番号103)
CpG 115に対するgRNA #6:
UGAGCCAUUCGGUCGCUAGG (配列番号104)
CpG 115に対するgRNA #7:
GGUGGUACUGAGGACCGGGA (配列番号105)
CpG 115に対するgRNA #8:
AUUUUCUGGGUGCUCAGAGG (配列番号107)
CpG 115に対するgRNA #9:
UGGUCUCAGCUCGCGCACGG (配列番号108)
CpG 115に対するgRNA #10:
ACAAAGACAUACGGGGUGAU (配列番号109)
gRNA #1:AGGAACGGCGCGUGCGCGGA
gRNA #2:AAGAGGCGGCGCGUGCGTAG
gRNA #3:GGGCGGUGUGACUUAGGACG
gRNA #4:CCAGAUGAUGGUCGUCCUCC
gRNA #5:GACCCUAGUGCUCGUCGCCG
gRNA #6:UGGGUGUUGUCCGCAGCCGC
gRNA #7:ACGGGGGCGGCGAUGCUGUU
gRNA #8:GACCGAAGGUUUCCCAGACU
gRNA #9:GUCGGGUUUAAUCUUUGGCG
gRNA #10:CGCUCCCGAGGACCCGUACA
gRNA #11:CGGGUCCCACCCCCGUGAAA
gRNA #12:UCAAACUCGACACAAAGCUC
gRNA #13:GCGGAGCCGCGGUACUUUCC
gRNA #1:GGCGCGCGCGCUAGGUGGGA
gRNA #2:AGAGAGGCUCACCGCCCACG
gRNA #3:GUACGUGCGGUGACUCCGGU
GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
「標的遺伝子のサイレンシング」によって、標的遺伝子の発現は、求める効果を得るのに十分な程度まで減少すると理解される。その発現減少は治療的に意味のある効果、たとえば疾病の予防もしくは治療を達成するのに十分なものである可能性がある。たとえば、疾病を引き起こす機能不全標的遺伝子は、標的遺伝子の発現がない程度まで、または残存する標的遺伝子発現レベルが病状を改善もしくは予防するほど十分に低い程度まで、抑制されることが好ましい。
別の態様において、本発明は、治療用に、本発明の製品、人工転写リプレッサー(ATR)、ポリヌクレオチド、および細胞を提供する。
標的遺伝子は、サイレンシングすると治療効果を生じることが好ましい。
B2Mのサイレンシングによって、移植用の同種HSPC、T細胞、または間葉細胞を生成することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAとすることができる。それらは一本鎖である場合も二本鎖である場合もある。当業者には当然のことながら、多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝暗号の縮重の結果として、同一のポリペプチドをコードすることがある。それに加えて、当然のことながら当業者は、常法によって、本発明のポリペプチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、本発明のヌクレオチドによりコードされたポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行うことができる。
本明細書に記載の「タンパク質」という用語は、一本鎖ポリペプチド分子、ならびに複数ポリペプチド複合体を含むが、この複合体において個々の構成ポリペプチドは共有結合または非共有結合によって連結されている。本明細書に記載の「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であって、それらが互いにペプチド結合またはジスルフィド結合によって連結されているポリマーを指す。
本明細書で言及される具体的なタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明は、それらのバリアント、誘導体、アナログ、ホモログ、および断片の使用も包含する。
本発明で使用されるポリヌクレオチドをコドン最適化することができる。コドン最適化はすでにWO 1999/41397およびWO 2001/79518に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度に違いがある。こうしたコドンの偏りは、その細胞型における特定のtRNAの相対存在量の偏りに対応する。対応するtRNAの相対存在量と釣り合うように調整するために、配列内のコドンを変更することによって、発現を増加させることができる。同様に、特定の細胞型において対応するtRNAがまれにしか存在しないことが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることができる。こうして、追加的な翻訳制御が利用可能となる。
ベクターは、ある実体をある環境から別の環境に移動させることを可能にする、または促進するツールである。本発明によれば、一例としてであるが、組換え核酸技術で使用されるベクターには、核酸セグメント(たとえば、異種cDNAセグメントなどの異種DNAセグメント)のような実体を標的細胞に移動させることを可能にするものがある。ベクターは、異種核酸(DNAまたはRNA)を細胞内に維持し、核酸セグメントを含有するベクターの複製を促進し、または核酸セグメントによってコードされるタンパク質の発現を促進するという目的を果たすことができる。ベクターは非ウイルスまたはウイルスとすることができる。組換え核酸技術で使用されるベクターの例としては、プラスミド、mRNA分子(たとえば、in vitroで転写されたmRNA)、染色体、人工染色体、およびウイルスがあるがそれらに限定されない。ベクターはたとえば、ネイキッド核酸(たとえばDNA)であってもよい。もっとも単純な形としては、ベクターは目的の核酸そのものであってもよい。
細胞にポリヌクレオチドを導入する代わりに、本発明の製品および人工転写リプレッサー(ATR)をタンパク質導入によって細胞に導入することができる。
本発明の製品、人工転写リプレッサー(ATR)、ポリヌクレオチド、および細胞を、被験体に投与するために、製薬上許容される基剤、賦形剤、または添加剤とともに製剤することができる。適当な基剤および賦形剤には等張食塩水、たとえばリン酸緩衝食塩水があるが、これはヒト血清アルブミンを含有することもある。
ある態様において、本発明は、グループ(a)、(b)または(c)から選択される2つ以上の人工転写リプレッサー(ATR)またはそれをコードするポリヌクレオチドを含んでなるキットを提供するが、このATRのうち少なくとも2つは異なるグループ(a)、(b)または(c)から選択される:(a) KRABドメインに作動しうるように連結されたDNA結合ドメインもしくはそのホモログを含有するATR;(b) DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインに作動しうるように連結されたDNA結合ドメインまたはそのホモログを含有するATR;ならびに(c) DNMT3Lドメインに作動しうるように連結されたDNA結合ドメインもしくはそのホモログを含有するATR。
当然のことながら、治療に関する本明細書の言及はすべて、根治的、対症的、および予防的治療を含む;ただし、本発明の文脈において予防への言及は、より広く予防的治療に関連付けられる。哺乳類、特にヒトの治療が好ましい。ヒトおよび動物の治療はいずれも本発明の範囲に含まれる。
(実施例)
DNAメチル化がtetR:D3によって引き起こされる抑制状態の維持に必要であるかを理解するために、図2Dのドキシサイクリン−条件から得られたeGFP- 細胞を、5-アザ-2′-デオキシシチジン(5-Aza)または溶媒(すなわちジメチルスルホキシド、DMSO)のいずれかで処理した後、フローサイトメトリーで分析してeGFP発現を測定した。5-Azaは、DNAに取り込まれた後、DNAメチルトランスフェラーゼによって基質として認識されるシトシンアナログであって、それはシトシンとは違って分解されない共有結合を確立するので、DNMT活性をブロックする(Issa, J.P. et al. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. Suppl. S6-7)。図2Eに示すように、5-Azaによる処理は結果として、eGFP発現の完全な再活性化をもたらした。予想通り、DMSO処理はeGFPサイレンシングを変化させず、培養物中のeGFP+ 細胞はセルソーティング手順から混入した細胞であった。
安全なエピジェネティック治療法に必要な要件の1つは、望ましい標的遺伝子の周囲の遺伝子にサイレンシングが広がってはならないということである。ここで留意すべきことは、AAVS1座位へのレポーターカセットの部位特異的組込みによって、レポーターカセット組込み部位の近傍に組み込まれた遺伝子の発現に及ぼす、本発明のサイレンシングプラットフォームの影響を容易に分析できるようになるということである。したがって、AAVS1組込み部位にある遺伝子およびその近傍の遺伝子の発現レベル(図3A)を、図2から得られたeGFP- 細胞と、未処理のAAVS1/TetO7細胞株との間で比較する。
次に、上記の2つのATRの一過性同時導入が、(tetR:Kのように)急速で、(tetR:D3Aのように)恒久的なエピジェネティックサイレンシングを十分に引き起こすことができるかどうかを検討した。この問題に答えるために、これらのATRを単独でコードするか、または組み合わせてコードする、いずれかのプラスミドを用いてAAVS1/TetO7細胞をトランスフェクトした後、経時的なフローサイトメトリー分析によって前記細胞におけるeGFP発現を追跡した。こうした実験の代表例を図4Aに示し、ここで、指定のATRをコードしたプラスミドでトランスフェクトされた細胞における、eGFP発現カセットのサイレンシングの動態(eGFP- 細胞の%;データは平均±SEMとして表す、n=3)を報告するが、対応するフローサイトメトリードットプロット分析は実験の終了時に実施される。これらの分析から、下記が判明した:i) tetR:KまたはtetR:D3Aのいずれか一方をコードしたプラスミドでトランスフェクトされた細胞はいずれもeGFP陰性とはならなかったが、ただしtetR:Kの一過性導入はトランスフェクション後10日までには対照レベルまで速やかに戻る、短い抑制の高まりと関連していた(この後者のデータはH3K9me3の一過性の蓄積を示し、その後tetR:Kをコードするプラスミドが細胞分裂によって希釈されることに伴って消失した);ならびにii) 驚くべきことに、tetR:KおよびtetR:D3Aをコードするプラスミドで同時形質導入された細胞の最大20%が、安定にサイレンシングされた状態となった。これらのデータにより、DNMT3Aに基づくリプレッサーとKRABに基づくリプレッサーの間に有意な相乗性が明らかになったが、それはATRの一過性同時導入による恒久的エピジェネティックサイレンシングの最初の証明を示している。
2つのATRが、たとえ一過性に細胞に導入された場合でも恒久的なサイレンシングを引き起こすことが判明したので、この効果が遺伝子座に依存しないかどうかを調べた。たしかに、エピジェネティック治療法の有効性は、標的遺伝子座が埋め込まれたクロマチン環境に依存する可能性があり、理論上は、ある遺伝子座が他の遺伝子座より、特定の抑制機構に対して不応性である可能性がある。たとえば、ある公開された根拠から、H3K4メチル化に富む座位はDNAメチル化から保護される可能性があることが示唆されている(Ooi, S.K. et al. (2007) Nature 448: 714-7)。これと一致して、標的座位またはその隣接領域に天然に存在する内在性エピジェネティック因子は、ATRの活性を妨げる可能性があるが、標的遺伝子の当初の生理的エピジェネティックプロファイルを回復させる可能性もある。
ATRの一過性発現による恒久的なエピジェネティックサイレンシングについての本発明者らの知見に対する最初の証明を上記データが提供するが、そうしたデータはまた、いくつかの細胞固有の要因がこれらのタンパク質のin vivo活性を調整できることも示している。たとえば、U937細胞株において低レベルのサイレンシングが観察されること、ならびにBリンパ芽球様細胞ではATRの組み合わせについて予想外のサイレンシング活性の欠如が認められることは、サイレンシングプロセスに関与するコファクターが存在しないこと、または細胞型に特有のリプレッサーが存在することによって、説明できる可能性がある。このため、本発明の混合物にさらに別のATRを含有することは、それらのATRが低濃度で存在する場合でも、コファクターがないことを回避することによって、または抑制複合体の適正な機能を可能にすることによって、KRAB/DNMT3A組み合わせのサイレンシング効率を高めるために有用であるかもしれない。したがって、恒久的なエピジェネティック抑制状態の確立に関与するクロマチンリモデリング酵素由来の他のエフェクタードメイン(またはそれらの組み合わせ)を、本発明のATRのサイレンシング効率を高めるために使用することができるかどうか検討した。この目的に向けて、DNMT3AもしくはKRAB-ZFPタンパク質の既知の相互作用(Chen, T. et al. (2014) Nat. Rev. Genet. 15: 93-106)、ならびに、より広範に、細胞運命特定および発生の転写調節に関与する分子(Schwartz, Y.B. et al. (2013) Nat. Rev. Genet. 14: 853-64)に関する文献を利用することによって、次の候補を特定した:
・ユークロマチンヒストンリジンN-メチルトランスフェラーゼ2(EHMT2、G9aとしても知られる):ヒストンH3リジン-9のジメチル化を触媒し、いくつかのヒストン脱アセチル化酵素をリクルートするヒストンメチルトランスフェラーゼ;
・SET domain bifurcated 1 (SETDB1):ヒストンH3リジン-9のジメチル化およびトリメチル化を蓄積するヒストンメチルトランスフェラーゼ(転写抑制に関係する2つのヒストンマーク);
・Chromobox protein homolog 5 (CBX5、HP1αとしても知られる):ヒストンH3K9meを認識して結合し、エピジェネティック抑制をもたらす、ヘテロクロマチンの構成成分;
・DNA (シトシン-5)-メチルトランスフェラーゼ3-like (DNMT3L):DNMT3Aの触媒ドメインに結合することによってそれを活性化する、触媒活性のないDNAメチルトランスフェラーゼ;
・Enhancer of Zeste homolog 2(EZH2):ポリコーム抑制複合体2の触媒サブユニット、これはヒストンH3のリジン-9およびリジン-27をメチル化して、従来型ポリコーム抑制複合体1のための結合部位を作製する;
・Suppressor of variegation 4-20 homolog 2 (SUV420H2):ヒストンH4のリジン-20を特異的にトリメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼ(セントロメア周辺のヘテロクロマチンにおいて転写抑制に関係する特異的ヒストンマーク):
・Transducin-like enhancer protein 1 (TLE1):多くの転写因子に結合してその活性を阻害するクロマチン結合性転写コリプレッサー。
そこで、tetR:K+tetR:D3A+tetR:D3Lの組み合わせの使用がBリンパ芽球様細胞で見られるブロックを乗り越えることができるかどうかを調べた(図5Dを参照されたい)。この問題に対処するために、TetO7.LVレポーターBリンパ芽球様細胞株を、3つのATRをコードするin vitro転写mRNAを用いて、単独で、または異なる組み合わせで、トランスフェクトした(図7G;tetR:D3AはtetR:Dと表示;tetR:D3LはtetR:Lと表示;データは平均±SEMとして表す、n=3)。過去の実験から予想されるように、tetR:K+tetR:D3A同時導入は、トランスフェクトされたmRNAが希薄化した後に完全に消える一過性のサイレンシングの高まりをもたらし、結果としてeGFP陰性細胞のない状態となった。しかしながら、tetR:D3A+tetR:D3LおよびtetR:D3L+tetR:Kはいずれも、高レベルのサイレンシングを引き起こすことができた(それぞれ50%および60%)。これらのレベルは、ATRが単独で導入された状態で観察されるレベルよりかなり高い(tetR:D3Aについては14%、tetR:KおよびtetR:D3Lトランスフェクト細胞については未処理サンプルと同等のレベル)。驚くべきことに、3つのATRをいっしょに導入すると、大半の細胞がeGFP陰性となったので(最大80%)、tetR:D3A/tetR:Kミックスに1つの要因を追加すると、かつて不応性であった細胞株においてサイレンシングの誘導および維持を十分に回復させられることが、明確に示された。これらの期待できる結果に基づいて、本発明のサイレンシングプラットフォームが、マウスなどの他の生物由来の実験上適切な細胞株において有効であるかどうかも調べた。この問題に答えるために、まず、TetO7.LVを用いてマウスNIH/3T3細胞に形質導入し、細胞を選別して、純粋なeGFP陽性集団を取得し(細胞当たり平均1コピーのベクターを含有する)、最後にその細胞を、tetRベースのATRをコードするmRNAでトランスフェクトしたが、それらは個別に、または組み合わせて、導入された。驚くべきことに、処理細胞のフローサイトメトリー分析は、この細胞モデルにおいても有効で長期的なサイレンシングを示した:tetR:D3A+tetR:D3Lまたは3つのATRの組み合わせの1回投与は、それぞれ45%または80%の遺伝子サイレンシング効率をもたらした(図7H)。その一方で、tetR:D3A+tetR:Kの組み合わせは、Bリンパ芽球様細胞で以前観察されたように、機能しなかった。
このプロジェクトの主な目標は、目的とする任意の遺伝子の発現をサイレンシングするために使用することができるエピジェネティック治療プラットフォームを開発することである。tetRと融合させると相乗的に協同作用してTetO7エレメント近傍のプロモーターをサイレンシングするエフェクタードメインをすでに特定したが、原核生物TetO7/tetR系の人工的な性質がこの技術の治療への応用を妨げる。その上、TetO7エレメントは、高い親和性で7つのtetR二量体を受け入れることができるので、このエレメント上で確率論的なATRのホモもしくはヘテロ二量体化をもたらす可能性がある。こうしたことが起こると、リプレッサー間相互の正の相互作用を助長する可能性がある。こうした理由から、TetO7/tetR系で得られた知見を、各ATRが単一でなおかつ独立した結合部位を標的遺伝子上に有するような状況に移し換えるために、いくつかの問題がまだ対処されずに残っている。なかでも、1つのエレメント(それぞれのリプレッサーの結合部位を含有する一定のゲノム配列として定義されるが、以下、「サイレンシングエレメント」と称する)が目的の遺伝子をサイレンシングするのに十分であるかは未解明である。さらに、2つのリプレッサーがサイレンシングエレメント上に配置される場合の相対的な順序および方向、ならびにそれらの結合部位間の距離は、抑制複合体の活性にとって重要な決定要因となるかもしれない。特に、これらの決定要因を、文献に基づいて、または内在性遺伝子上でそれを実験的に検討することによって明確にすることは、独自の結合部位および親和性を有するいくつかの異なるATRをデザインする必要があるため不可能である。
初代培養造血幹細胞(HSPC)は、大半のex vivo遺伝子治療応用のために臨床上適切なヒト細胞型であるが(Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158; Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151; Aiuti, A. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 360, 447-458; Cartier, N. et al. (2009) Science 326: 818-23; Hacein-Bey-Abina, S. et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 355-64; Cavazzana-Calvo, M. et al. (2010) Nature 467: 318-22)、それは、この細胞が生涯にわたって自己複製能および多分化能を有するためである。HSPC分化は、グローバルなクロマチンリモデリングを伴うが、その結果として、オープンなクロマチン形態からより圧縮された抑制的な形態に徐々に移行する。このように、この細胞型は、本発明のエピジェネティックプラットフォームの効率を検討し、安定性を証明するためにもっとも適切で厳密なモデルである。さまざまなATRの組み合わせの導入が、ヒトHSPCにおいて有意なレベルのサイレンシングを引き起こすのに十分であるかどうかを評価するために、図5Aに記載のTetO7/eGFPレポーターLVを用いて、健康な個体から得られたヒト臍帯血由来CD34+細胞に形質導入した。次に、tetR:D3A、tetR:K、またはtetR:D3Lを単独で、または組み合わせてコードするin vitro転写mRNAを用いて、その細胞をトランスフェクトした。その後、トランスフェクト細胞および未トランスフェクト細胞を液体培養で2週間、骨髄分化条件で増殖させ、コロニー形成単位-細胞(CFU-C)アッセイのために半固体培地に蒔いた(この実験のレイアウトについては、図11Aを参照されたい)。
さまざまな組み合わせのATRの導入が、ヒトTリンパ球において有意なレベルのサイレンシングを引き起こすのに十分であるかどうかを評価するために、図5Aに記載のTetO7/eGFPレポーターLVを用いて、健康な個体から得られたヒトT細胞に形質導入した。次に、tetR:D3A、tetR:K、またはtetR:D3Lを単独で、または組み合わせてコードするin vitro転写mRNAを用いて、その細胞をトランスフェクトした。その後、トランスフェクト細胞および未トランスフェクト細胞は、再活性化の前に、液体培養で3週間、IL-15およびIL-7を添加した培地中で維持された(これらの実験のレイアウトについては、図12Aを参照されたい)。
eGFPレポーターシステムで得られた結果が、天然のエピジェネティックな状況にはめ込まれた内在性遺伝子に移し換えられるかどうかを評価するために、β2-ミクログロブリン(B2M)遺伝子のプロモーター領域を標的とするカスタムメイドTALEを作製し(これらのTALEのアミノ酸配列および対応する結合部位のヌクレオチド配列は表3に記載する)、これらのTALEをKRAB、DNMT3A、およびDNMT3Lエフェクタードメインと融合させた(システムの概略図については図13Aを参照されたい)。第1TALEと第2TALEの間、または第2TALEと第3TALE間のスペーサーの長さは、それぞれ1または20 bpである。次に、上記の新規ATRをコードするプラスミドを用いてHEK-293T細胞を同時トランスフェクトし、フローサイトメトリーでB2M発現について細胞を分析した。
デザインして構築するさまざまなATRの数を減らすために、少なくとも1つのエフェクタードメインをDNA結合ドメインなしで細胞に導入することができるかどうか、ならびにそれでも効果的に、目的の望ましい遺伝子上に標的化された他の2つのATRと共に作用することができるかどうかを調べた。未標的化DNMT3L(以下D3Lと称する)の導入が、他の2つのエフェクタードメイン(具体的にはDNMT3AおよびKRAB)と協同作用するのに、その標的化された同等物ほど有効であるかどうかを評価するために、まずTetO7/tetR系を利用した。したがって、tetRベースのATRおよび未標的化D3Lをコードするin vitro転写mRNAを用いてTetO7.LVレポーターBリンパ芽球様細胞をトランスフェクトし、経時的フローサイトメトリー分析によってさまざまなトランスフェクション条件におけるeGFP陰性細胞のパーセンテージを測定した(図18A;データは平均±範囲として表す、n=2)。トランスフェクション後27日の時点で、個別のATRまたはtetR:K+tetR:D3Aの組み合わせで処理された細胞では、あったとしてもごくわずかなサイレンシングしか見いだされなかった。その代わり、3つのATRの組み合わせで処理された細胞の最大70%がeGFP陰性となった。標的化されたtetR:D3LもtetR:KまたはtetR:D3Aと相乗作用を示したが、ただしこれら2つの実験条件で測定されたサイレンシングレベルはトリプルATRの組み合わせで測定されたものより低く3.5分の1であった(約20%のeGFP陰性細胞)(図18A;プラスtetR:D3L条件と比較されたい)。これらのデータは、TetO7.LVレポーターBリンパ芽球様細胞株ですでに判明したことと合致するが、このtetR:D3A+tetR:K組み合わせのサイレンシング効率の予想外の低下は、混合物にtetR:D3Lを含めることによって完全に回復された(比較のために図7Gを参照されたい)。非標的化D3Lを単独で、またはtetR:Kと組み合わせて導入すると、eGFP陰性細胞はまったく見られなかった。一方、D3LはtetR:D3AおよびtetR:D3A+tetR:K組み合わせの両者と効果的に相乗作用することができた(図18A;プラスD3L条件を参照されたい)。重要なことに、これら2つの実験条件で測定されたサイレンシングレベルは、TetO7配列にDNMT3LおよびDNMT3A;またはDNMT3L、DNMT3AおよびKRABを同時に繋ぐことによって見いだされるレベルと同等であった。これらのデータは、非標的化D3LがKRAB + DNMT3Aの組み合わせと効果的に相乗作用することができることを示す。
de novo DNAメチル化の形成におけるDNMT3Bの役割を考慮して、内在性DNMT3Bが本発明のATRと協同作用しうるかどうかを検討した。この問題に答えるために、TetO7.LV K562レポーター細胞株においてCRISPR/Cas9によってDNMT3Bの遺伝子ノックアウトを行った。これを行うために、2つのレンチウイルスベクターを用いて細胞に形質導入したが、一方はドキシサイクリン誘導性Cas9ヌクレアーゼをコードし(Wang, T. et al. (2014) Science 343: 80-4)、もう一方はDNMT3B遺伝子のエクソン2に対するgRNAおよびΔLNGFRマーカーをコードする(図19Aにベクターの概略図;2重形質導入細胞に関する中央のFACSプロット)。ドキシサイクリン投与によりCas9を活性化し、その細胞に、さまざまな組み合わせのATRをコードするプラスミドを用いてエレクトロポレーションを行った後、フローサイトメトリーによってΔLNGFR陽性細胞および陰性細胞におけるサイレンシング効率を測定した。これらの数字を比較することによって、DNMT3B遺伝子の不活化がさまざまなATR組み合わせのサイレンシング効率を改善するか否かを評価することができる。ここで、DNMT3Bに対するgRNAを発現する部分集団(すなわちΔLNGFR陽性細胞)は、tetRK+tetR:D3Aの組み合わせによるサイレンシングに対して野生型細胞ほど許容的でないことが観察され(図19Bおよび図19C;右上のFACSプロット)、したがって、内在性DNMT3Bはこれら2つのATRの適切なパートナーであることが示された。驚くべきことに、DNMT3Bの遺伝子ノックアウトは、tetR:K+tetR:D3A+tetR:D3L組み合わせのサイレンシング効率を増加させたので、この場合DNMT3BはこれらのATRのデコイとして作用することが示唆された(図19Bおよび図19C;右下のFACSプロット)。他のすべてのATRの組み合わせおよび個別のATRについて、DNMT3Bの不活化は、野生型細胞と比べてサイレンシング効率に有意な相違をもたらさなかった。さらに、上記のBリンパ芽球様細胞株は、K562細胞とは対照的に、(RT-qPCR分析により測定されるように)DNMT3B発現がないことを考慮して、DNMT3Bの過剰発現が、DNMT3A+KRABの組み合わせに対して不応性のこの細胞株において、ATRサイレンシング効率を増加させることができるかを検討した。具体的には、2つのATRとともに、または2つのATRなしに、全長DNMT3Bを(それをtetR DNA結合ドメインに融合させることなく;DNMT3Bのアミノ酸配列は表1に記載する)コードするmRNAにより、TetO7.LV Bリンパ芽球様レポーター細胞株を一過性にトランスフェクトした。驚くべきことに、DNMT3Bの過剰発現は処理細胞の52%において、tetR:K+tetR:D3Aの組み合わせの活性を有意に回復させ、安定したeGFPサイレンシングを可能にしたが、それはtetR:K+tetR:D3A単独と比較して65倍の増加であった(図19C)。注目すべきは、DNMT3B過剰発現がtetR:D3A条件のサイレンシング効率の2.9倍の増加ももたらしたことである(図19D)。
BCL11Aは、それを抑制することがβサラセミアおよび鎌状赤血球貧血のための見込みのある治療的介入として提案された遺伝子であるが、そのBCL11AをサイレンシングするためにATRの組み合わせを利用した。BCL11A遺伝子上でのATRの活性を容易に評価するために、ヒトBリンパ芽球様細胞においてその遺伝子の第3エクソンの中にあるtdTomato導入遺伝子を、CRISPR/Cas技術による遺伝子ターゲティングによって標的化した(図20A)。このようなターゲティング戦略は、BCL11A遺伝子の制御配列からのtdTomato導入遺伝子の発現
を可能にするが、そのようにしてこの遺伝子の発現レベルは着実に報告される。次に、tdTomato陽性細胞をほぼ純粋となるまでセルソーティングによって濃縮し、DNMT3AまたはDNMT3Lを含有するCRISPR/dCas9ベースATRを用いて、この遺伝子のプロモーター/エンハンサー領域内の4つのCpGアイランドを標的とした。4つのCpGアイランドのそれぞれをgRNAの別々のプールを用いて個別に調べた(CRISPRとしても知られる;gRNAのヌクレオチド配列は表6に記載する)。tdTomato発現を処理対照と未処理対照とで比較することによって、各アイランドのBCL11A発現に対する相対的な寄与を評価することができた(図20B)。対照処理細胞と比較すると、各CpGアイランドのサイレンシングは、BCL11A発現の長期間安定した抑制と関係していた(ここではtdTomato陰性細胞の%として示す)が、ただしこの遺伝子のサイレンシングの程度はATRが標的としたCpGアイランドに応じてさまざまであった。次にトリプルATR組み合わせの活性を評価することを目的としてさらに研究するために、CpGアイランド31および38を選択した。これらの研究には、考えられるすべてのダブルATR組み合わせ、および単一のKRABベースATRも含めた。驚くべきことに、テストしたすべての条件が、CpG 38(先行実験でもっともよく反応したアイランド)のエピジェネティック編集によって、有意なレベルの遺伝子サイレンシングを引き起こすことができ、トリプルATR組み合わせは最大55%の遺伝子サイレンシングをもたらした(図20C)。最後に、CpGアイランド31および38を標的とする、17個の異なるTALEベースのATRをデザインし(それぞれ7個および10個のTALEタンパク質;これらのTALEのアミノ酸配列およびそれらの関連標的配列を表7に記載する;図20D上部の概略図)、トリプルATR組み合わせとして、またはKRABベースATRとして、それらのサイレンシング活性をテストした。すべてのトリプルATR組み合わせによる2つのCpGアイランドのサイレンシングはいずれも、BCL11Aの有効で長期的なサイレンシングをもたらしたが(最大55%のtdTomato陰性細胞に達した)、TALE:KRABによるサイレンシングは、さまざまな程度の遺伝子サイレンシングを伴い、トリプルATR組み合わせと同じく効率的なものもあれば、完全に不活性なものもあった。まとめると、これらのデータは、ヒトBCL11A遺伝子を恒久的にサイレンシングすることの実現可能性を示している。
最後に、本発明のエピジェネティックサイレンシング技術をさらに2つのヒト内在性遺伝子に対して調べたが、それはインターフェロン(α、β、およびω)受容体1(IFNAR1)遺伝子および血管内皮増殖因子A(VEGFA)遺伝子である。2つの遺伝子はいずれも、遺伝子プロモーター/エンハンサー領域にCpGアイランドを示す。したがって、IFNAR1 CpGアイランドに対して13個のgRNA(図20E、上)、VEGFA CpGアイランドに対して3個のgRNA(図20F、上)をデザインした(gRNAのヌクレオチド配列は表6に記載する)。興味深いことに、IFNAR1遺伝子に対する13個のgRNAプール、プラス トリプルdCas9ベースATRの組み合わせをコードするプラスミドによるK562細胞のエレクトロポレーションによって、未処理サンプルと比較して処理細胞においてIFNAR1転写レベルの長期的なダウンレギュレーション(0.22倍の変化)が達成された(図20E、下)。さらに、VEGFA遺伝子に対する3個のgRNAプール、プラス トリプルdCas9ベースATRの組み合わせをコードするプラスミドによるK562細胞のエレクトロポレーションによって、未処理サンプルと比較して処理細胞においてVEGFA転写レベルの長期的なダウンレギュレーション(0.57倍の変化)が達成された(図20F、下)。概括すると、これらのデータは、CRISPR/dCas9ベースATRによって、さまざまなヒト内在性遺伝子をサイレンシングすることの実現可能性を示している。
レンチウイルスベクターおよびATR構築
TetO7配列またはTALE結合部位を含有するATRレポーターレンチウイルスベクター(LV)、およびDNMT3B gRNA発現LVは、自己不活性化導入構築物pCCLsin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre (Follenzi, A. et al. (2000) Nat. Genet. 25: 217-22)から作製されたが、ATR発現Bid.LVは、導入構築物pCCLsin.cPPT.dLNGFR.mhCMV.hPGK.GFP.Wpre (Gentner, B. et al. (2010) Sci. Transl. Med. 2: 58ra84)から作製された。ドキシサイクリン誘導性Cas9発現ベクターは、Addgene (pCW-Cas9; #50661; Wang, T. et al. (2014) Science 343: 80-4)から購入した。LVストックは、前記のように調製された(Follenzi, A. et al. (2002) Methods Mol. Med. 69:259-74)。手短に述べると、それぞれ15 cmディッシュあたり35/12.5/9/6.25μgの導入構築物プラスミドである、pMD.Lg/pRREパッケージングプラスミド、pMD2.VSV-Gエンベロープをコードするプラスミド、および pRSV-Revを用いて、DNAリン酸カルシウム沈殿法によってHEK293T細胞を同時トランスフェクトした。ベクター粒子は、前記のように超遠心分離によって300倍に濃縮され、HEK293T細胞上で、段階希釈法によって力価を測定した(Cantore, A. et al. (2015) Sci. Transl. Med. 7: 277ra28)。他のすべてのtetRベースATRは、tetR:KRABにおけるKRABドメイン(それ自体はSzulc, J. et al. (2006) Nat. Methods 3: 109-16において論じられている)を他の適切なエフェクタードメインで置き換えることによって作製された。TALEベースATRは、Golden Gate TALEN Kit 2.0a (Addgene, Kit#1000000024; Cermak, T. et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39: e82)の修正版を使用して作製されたが、この修正版は以下の構築上の変化を含有する:Golden Gate TALE C-およびN-末端小領域はそれぞれ+163および+63欠失で置き換えられた。これらの構築物は、インフレームでエフェクタードメインを提供できるよう構成された。Cas9ベースATRは、プラスミドpAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression (Addgene #48240; Cheng, A.W. et al. (2013) Cell Res. 23: 1163-71)からVP160トランス活性化因子をエフェクタードメインで、またはTET1の触媒ドメインで置き換えることによって作製された。
ヒトエプスタイン・バーウイルスにより不死化されたBリンパ球(Bリンパ芽球様細胞)およびU-937細胞の維持は、RPMI-1640 (Sigma)中で行い;HEK293TおよびK-562はIMDM (Sigma)中で;NIH/3T3はDMEM (Sigma)中で行った。すべての培地は、10% FBS (ウシ胎仔血清;EuroClone)、L-グルタミン(EuroClone)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(100 U/mL終濃度;EuroClone)を添加した。細胞は5% CO2加湿インキュベーター内で37℃にて培養した。レポーター細胞株は、指定のATRレポーターLVによって、0.1の感染効率(MOI)で細胞に形質導入することによって作製され、その後MoFlo XDP Cell Sorter (Beckman Coulter)を用いてeGFP発現について濃縮された。標的化された組込みを有するレポーター細胞株は次のように作製された:i) AAVS1座位にeGFPカセットを挿入するために、ドナー構築物(カセットの下流または上流にTetO7配列を含有する;1.5μgドナープラスミド)および前記AAVS1-ZFNをmRNAとして(0.5μg 各ZFN;Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9)同時トランスフェクトした。単一細胞由来クローンが限界希釈プレーティングによって得られ、サザンブロットにより分析して、カセットの標的化された組込みを前記のように確認した(Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9);ii) BCL11Aの第3エクソン内にtdTomatoを挿入するために、2A自己触媒ペプチドと融合させたtdTomato導入遺伝子を含有するドナー構築物(2μg)を、Cas9をコードするプラスミド(1μg)およびエクソン3を標的とするgRNAを発現する別のプラスミド(125 ng;gRNAの配列:5′-GGAGCTCTAATCCCCACGCCTGG-3′)とともに同時トランスフェクトした;iii) BCL11Aに用いたのと同様のターゲティン戦略を用いて、スプライスアクセプター-IRES-tdTomatoカセットをB2Mのイントロン1に挿入した(gRNAの配列:5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′)。2つのtdTomato細胞株はいずれも陽性細胞のFACSソーティングによって作製した。
Bid.LV形質導入細胞、CD34+細胞およびその子孫細胞、ならびにTリンパ球の免疫表現型分析(FACSCanto II; BD Pharmingenにより実施された)のために、以下の抗体を使用した。
アミノアクチノマイシンD(7-AAD)陽性の生育不能細胞は分析から除外し、分析ごとに1-5×105の生細胞を点数化した。単一染色細胞およびFMO染色細胞を対照として使用した。
eGFP転写物を検出するために使用される遺伝子発現アッセイは、すでに記載された(Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9)。リアルタイムPCRは、ViiA 7 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて実施し、専用ソフトウェアを用いて生データを抽出した(Ctおよび未加工の蛍光)。Ct値≧37の遺伝子は解析から除外した。各遺伝子の相対発現レベルは、ΔΔCt法によって計算し、HPRTまたはB2M発現に対して補正して(ハウスキーピング遺伝子対照)、偽処理サンプル(検定用試料)に対する倍率変化として表した。
bisulfite sequencingのために、ゲノムDNAをDNeasy Blood & Tissue Kit またはQIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)で抽出した後、EpiTect Bisulfite kit(Qiagen)によりメーカーの使用説明書にしたがって処理した。bisulfite sequencingのために、ゲノムDNAをDNeasy Blood & Tissue KitまたはQIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した後、EpiTect Bisulfite kit (Qiagen)を用いてメーカーの説明書の通りに処理した。次に、変換産物を用いて、B2Mプロモーター領域を下記のプライマーによってPCR増幅した。PCR断片を精製し、pCRII-TOPO TA (Invitrogen)にクローニングして、各サンプルにつき5-10クローンを、M13ユニバーサルプライマーを用いたシーケンシングによって検証した。
TALE forward
5′-TACCCAGATTGGCCCCACT-3′
TALE reverse
5′-TACCTAGAGGAGAAAGGTT-3′
表2
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
TALE #1
5′-TCTCTCCTACCCTCCCGCT-3′
TALE #2
5′-TGGTCCTTCCTCTCCCGCT-3′
TALE #3
5′-TCGCTCCGTGACTTCCCTT-3′
表3
CpG 105に対するgRNA #1: GCCUUUCUGCAGACGUUCCC
CpG 105に対するgRNA #2: UGGGUGUGCGCCUUGGCCGG
CpG 105に対するgRNA #3: CGGUGGUGAGAUGACCGCCU
CpG 105に対するgRNA #4: GGAAUGUGCUCACGGCGCCG
CpG 105に対するgRNA #5: GACUGCCCGCGCUUUGUCCU
CpG 105に対するgRNA #6: CCAGAGUCUGGCCCCCGGAG
CpG 105に対するgRNA #7: UCUGCGACCCUUAGGAGCCG
CpG 105に対するgRNA #8: GAGCGCCCCGCCAAGCGACU
CpG 105に対するgRNA #9: CAAGUCUCCAGGAGCCCGCG
CpG 105に対するgRNA #10: CGCGGAAUCCAGCCUAAGUU
CpG 105に対するgRNA #11: CCCGCUGCGGAGCUGUAACU
CpG 31に対するgRNA #1: CGCUCCUGAGUCCGCGGAGU
CpG 31に対するgRNA #2: CACGGCUCUCCCCGUCGCCG
CpG 31に対するgRNA #3: CCGCCUUUUGUUCCGGCCAG
CpG 31に対するgRNA #4: GCGCGAGGAGCCGGCACAAA
CpG 31に対するgRNA #5: GCCACUUUCUCACUAUUGUG
CpG 31に対するgRNA #6: GCUGCCUCUGAGGUUCGGUC
CpG 31に対するgRNA #7: AAGGGCAGGAGCUAGGGCCG
CpG 31に対するgRNA #8: GAGCCCGGACUGCUGCCUCC
CpG 38に対するgRNA #1: GUUUACAAGCACCGCGUGUG
CpG 38に対するgRNA #2: AACAGACAGAGGACCGAGCG
CpG 38に対するgRNA #3: GGCGCCGGGUGGGCGAUCCG
CpG 38に対するgRNA #4: GGUCGGGCAAGGCCCGGGCG
CpG 38に対するgRNA #5: AAGAGGUCUCGGCAUUGUGC
CpG 38に対するgRNA #6: GUUCCACAGCUUCGGGACCG
CpG 38に対するgRNA #7: GAAAUCGGCUGGGUGAAACU
CpG 38に対するgRNA #8: GCAGUGUCUCCGCGCCAGCC
CpG 38に対するgRNA #9: CCUCCCCUCCCCUCCGCCCU
CpG 115に対するgRNA #1: UCCUCCUGUCCCGGGGUUAA
CpG 115に対するgRNA #2: CAUCUUUUGGGACACUCUAGG
CpG 115に対するgRNA #3: AAGUCAGGCCCUUCUUCGGAA
CpG 115に対するgRNA #4: GCAGCCUGGACUGCGCGCCC
CpG 115に対するgRNA #5: UGCCCGGCGAUUCUCGUCCG
CpG 115に対するgRNA #6: UGAGCCAUUCGGUCGCUAGG
CpG 115に対するgRNA #7: GGUGGUACUGAGGACCGGGA
CpG 115に対するgRNA #8: AUUUUCUGGGUGCUCAGAGG
CpG 115に対するgRNA #9: UGGUCUCAGCUCGCGCACGG
CpG 115に対するgRNA #10: ACAAAGACAUACGGGGUGAU
IFNAR1を標的とするgRNAのヌクレオチド配列
gRNA #1: AGGAACGGCGCGUGCGCGGA
gRNA #2: AAGAGGCGGCGCGUGCGUAG
gRNA #3: GGGCGGUGUGACUUAGGACG
gRNA #4: CCAGAUGAUGGUCGUCCUCC
gRNA #5: GACCCUAGUGCUCGUCGCCG
gRNA #6: UGGGUGUUGUCCGCAGCCGC
gRNA #7: ACGGGGGCGGCGAUGCUGUU
gRNA #8: GACCGAAGGUUUCCCAGACU
gRNA #9: GUCGGGUUUAAUCUUUGGCG
gRNA #10: CGCUCCCGAGGACCCGUACA
gRNA #11: CGGGUCCCACCCCCGUGAAA
gRNA #12: UCAAACUCGACACAAAGCUC
gRNA #13: GCGGAGCCGCGGUACUUUCC
VEGFAを標的とするgRNAのヌクレオチド配列
gRNA #1: GGCGCGCGCGCUAGGUGGGA
gRNA #2: AGAGAGGCUCACCGCCCACG
gRNA #3:GUACGUGCGGUGACUCCGGU
表6
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
対応するTALE結合部位のヌクレオチド配列
5′- TGGGCCCTCACGCCTTTCT -3′
表7
Claims (44)
- 群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物であって、それらのATRの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される、産物。 - 群(a)、(b)または(c):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物であって、それらのATRの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される、産物。 - KRABドメインまたはそのホモログが、配列番号1〜7のいずれか1つに対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載の産物。
- DNMT3Aドメインまたはそのホモログが、配列番号8に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;DNMT3Bドメインまたはそのホモログが、配列番号9または36に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;および/またはDNMT1ドメインまたはそのホモログが、配列番号10に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- DNMT3Lドメインまたはそのホモログが、配列番号11に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- SETDB1ドメインまたはそのホモログが、配列番号12または13に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- (a)、(b)、(c)または(d)のDNA結合ドメインが、TALE DNA結合ドメイン、ジンクフィンガードメイン、tetR DNA結合ドメイン、メガヌクレアーゼまたはCRISPR/Cas系から、独立して選択されるドメインを含む、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- 2以上のATRをコードするポリヌクレオチドが単一ベクターの形態であり、あるいは別々のベクター内に含まれる、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されていない別のエフェクタータンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを更に含む、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されていない別のエフェクタータンパク質が、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログ
から選択されるドメインを含む、請求項9記載の産物。 - 医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を更に含む医薬組成物の形態である、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- 治療における使用のための、前記請求項のいずれか1項記載の産物。
- 2以上のATRまたはそれらをコードするポリヌクレオチドが、同時、連続的または別々に対象に投与するための組合せ剤である、治療における使用のための、請求項1〜8のいずれか1項記載の産物。
- 細胞における2以上のATRの一過性発現が標的遺伝子をサイレンシングする、請求項12または13記載の、治療における使用のための産物。
- 細胞への2以上のATRの運搬が標的遺伝子を持続的にサイレンシングする、請求項12〜14のいずれか1項記載の、治療における使用のための産物。
- 細胞への2以上のATRの運搬が該細胞の後代における標的遺伝子を持続的にサイレンシングする、請求項12〜15のいずれか1項記載の、治療における使用のための産物。
- 異なるATRのDNA結合ドメインが、0〜30bp離れた結合部位に結合するように選択される、請求項12〜16のいずれか1項記載の、治療における使用のための産物。
- DNA結合ドメインがTALE DNA結合ドメインまたはCRISPR/Cas系である、請求項17記載の、治療における使用のための産物。
- 治療における使用のための、KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチドであって、該治療において、該ATRが、DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第2 ATR、および/またはDNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第3 ATR、および/またはSETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第4 ATR、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドと組合せて、同時、連続的または別々に対象に投与される、人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチド。
- 治療における使用のための、DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチドであって、該治療において、該ATRが、KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第2 ATR、および/またはDNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第3 ATR、および/またはSETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第4 ATR、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドと組合せて、同時、連続的または別々に対象に投与される、人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチド。
- 治療における使用のための、DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチドであって、該治療において、該ATRが、KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第2 ATR、および/またはDNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第3 ATR、および/またはSETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第4 ATR、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドと組合せて、同時、連続的または別々に対象に投与される、人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチド。
- 治療における使用のための、SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチドであって、該治療において、該ATRが、DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第2 ATR、および/またはDNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第3 ATR、および/またはKRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む第4 ATR、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドと組合せて、同時、連続的または別々に対象に投与される、人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の2以上のATRを含む細胞。
- 請求項23記載の細胞の後代である細胞。
- 治療における使用のための、請求項23または24記載の細胞。
- 請求項8記載の2以上のATRをコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることを含む遺伝子治療の方法。
- トランスフェクションをエクスビボで行う、請求項26記載の方法。
- 群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを同時、連続的または別々に対象に投与することを含む遺伝子治療の方法であって、それらのATRの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される、方法。 - 群(a)、(b)または(c):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを同時、連続的または別々に対象に投与することを含む遺伝子治療の方法であって、それらのATRの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される、方法。 - 群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される2以上の人工転写リプレッサー(ATR)あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含むキットであって、それらのATRの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される、キット。 - インビトロまたはエクスビボでの使用である、標的遺伝子をサイレンシングするための請求項1〜11のいずれか1項記載の産物の使用。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の産物を細胞に投与する工程を含む、標的遺伝子をサイレンシングする方法。
- DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)、およびSETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物。
- DNMT3LもしくはKRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATRあるいはそれをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項33記載の産物。
- 群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)であって、該DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される、人工転写リプレッサー(ATR)。 - 群(a)、(b)または(c):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR)であって、該DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される、人工転写リプレッサー(ATR)。 - 該DNA結合ドメインがTALE DNA結合ドメイン、ジンクフィンガードメイン、tetR DNA結合ドメイン、メガヌクレアーゼまたはCRISPR/Cas系を含む、請求項35または36記載のATR。
- 請求項35〜37のいずれか1項記載のATRをコードするポリヌクレオチド。
- 2以上の異なる人工転写リプレッサー(ATR)またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む産物であって、それらの2以上の異なるATRが、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを個々に含み、ここで、それぞれの個々のDNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)、(c)または(d)から選択される、産物。 - 2以上の異なる人工転写リプレッサー(ATR)またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む産物であって、それらの2以上の異なるATRが、群(a)、(b)または(c):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ
から選択される2以上のドメインに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを個々に含み、ここで、それぞれの個々のDNA結合ドメインに機能しうる形で連結されたドメインの少なくとも2つが、異なる群(a)、(b)または(c)から選択される、産物。 - それらの2以上の異なるATRのDNA結合ドメインが、TALE DNA結合ドメイン、ジンクフィンガードメイン、tetR DNA結合ドメイン、メガヌクレアーゼまたはCRISPR/Cas系からなる群から個々に選択される、請求項39または40記載の産物。
- 群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される、ただ1つの人工転写リプレッサー(ATR)、またはそれをコードするポリヌクレオチド、およびDNA結合ドメインに機能しうる形で連結されていない1以上の別のエフェクタータンパク質またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物。 - 群(a)、(b)または(c):
(a)KRABドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含む人工転写リプレッサー(ATR);
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR;および
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログに機能しうる形で連結されたDNA結合ドメインを含むATR
から選択される、ただ1つの人工転写リプレッサー(ATR)、またはそれをコードするポリヌクレオチド、およびDNA結合ドメインに機能しうる形で連結されていない1以上の別のエフェクタータンパク質またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む産物。 - DNA結合ドメインに機能しうる形で連結されていない1以上の別のエフェクタータンパク質が、群(a)、(b)、(c)または(d):
(a)KRABドメインまたはそのホモログ;
(b)DNMT3A、DNMT3BもしくはDNMT1ドメインまたはそのホモログ;
(c)DNMT3Lドメインまたはそのホモログ;および
(d)SETDB1ドメインまたはそのホモログ
から選択されるドメインを含み、ここで、該ドメインがATRのエフェクタードメインとは異なる、請求項42または43記載の産物。
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