ES2906263T3 - Silenciamiento génico epigénico permanente - Google Patents

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Abstract

Una composición para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde la composición comprende una combinación de represores de transcripción artificial (ATR) seleccionados del grupo que consiste en: (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); (b) y (d); y (c) y (d); o polinucleótidos que los codifican, donde: (a) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB; (b) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1; (c) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L; y (d) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR: (i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y (ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.

Description

DESCRIPCIÓN
Silenciamiento génico epigénico permanente
Campo de la invención
La presente invención se refiere al silenciamiento génico y/o edición epigenética. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos mejorados para silenciar un gen de interés o para editar el estado epigenético de un elemento genético de interés, incluso durante aplicaciones de terapia génica.
Antecedentes de la invención
La terapia génica implica la incorporación de material genético en una célula para tratar o prevenir enfermedades. El material genético puede complementar genes defectuosos con copias funcionales de esos genes, inactivar genes que funcionan incorrectamente o introducir nuevos genes terapéuticos en una célula.
Un ejemplo clásico de terapia génica es el reemplazo de genes, donde una secuencia de ADN que codifica un gen terapéutico funcional se usa para reemplazar un gen disfuncional (Naldini, L. (2011) Nat. Rev. Genet. 12: 301-15; Kay, M.A. (2011) Nat. Rev. Genet. 12: 316-28; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158; Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151; Aiuti, A. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 360: 447-58). Sin embargo, existen varias enfermedades hereditarias en las que el objetivo de la terapia génica es silenciar en lugar de reemplazar la función del gen. Los ejemplos paradigmáticos incluyen la enfermedad de Huntington, la mayoría de los tipos de ataxias espinocerebelosas y algunas colagenopatías. Además, el silenciamiento de genes está emergiendo como una estrategia prometedora para tratar ciertas enfermedades infecciosas (Younan, P. et al. (2014) Mol. Ther. 22: 257-64), mediante la inactivación de ya sea productos génicos asociados a patógenos o genes del huésped que son necesarios para el ciclo de vida del patógeno.
Por ejemplo, el silenciamiento del gen del receptor de quimioquinas (motivo C-C) tipo 5 (CCR5), uno de los dos correceptores celulares requeridos para la entrada del VIH en las células T, ha recibido una atención significativa. Esto se debe a que una deleción natural en CCR5 confiere resistencia a la infección por cepas de VIH con tropismo por CCR5 sin causar efectos patológicos evidentes (Liu, R. et al. (1996) Cell 86: 367-77; Hutter, G. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 360: 692-8).
Además, recientemente se ha propuesto que las hemoglobinopatías (Weatherall, D.J. (2013) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 14: 1-24), los trastornos recesivos hereditarios más comunes del sistema hematopoyético y objetivos principales para el reemplazo de genes terapéuticos también pueden ser susceptibles de silenciamiento de genes terapéuticos. Este intrigante concepto surge de nuestra creciente comprensión de los mecanismos que orquestan el cambio de hemoglobina fetal a adulta durante el desarrollo (Stamatoyannopoulos, G. (2005) Exp. Hematol. 33: 259-71; Bauer, D.E. et al. (2011) Curr. Opin. Pediatr. 23: 1 -8) y por una amplia evidencia clínica que muestra que la expresión persistente de la hemoglobina fetal (HbF) mejora significativamente la morbilidad y la mortalidad de la enfermedad de células falciformes (SCD; Platt, O.S. et al. (1994) N. Engl. J. Med. 330: 1639-44) y p-talasemia (p-Thal; Andreani, M. et al. (2011) Haematologica 96: 128­ 33) en pacientes. En particular, los estudios de asociación de todo el genoma realizados en pacientes afectados por la persistencia hereditaria de HbF revelaron que el factor de transcripción linfoma/leucemia de células B 11A (BCL11A) es un regulador importante del cambio de hemoglobina (Sankaran, V.G. et al. (2008) Science 322: 1839-42; Uda, M. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 105: 1620-5; Galarneau, G. et al. (2010) Nat. Genet. 42: 1049-51) y que la inactivación de mutaciones en este gen da como resultado un aumento de la expresión de HbF (Wilber, A. et al. (2011) Blood 117: 2817-26; Xu, J. et al. (2011) Science 334: 993-6). Además, recientemente se ha identificado un potenciador específico de eritroides dentro del segundo intrón de BCL11A (Bauer, D.E. et al. (2013) Science 342: 253-7). La inactivación genética de este elemento regulador afecta la expresión de BCL11A específicamente en precursores eritroides, lo que resulta en la reactivación de HbF, mientras que conserva la actividad de esta proteína necesaria para la ontogenia adecuada de las células B (Canver, M.C. et al. (2015) Nature Sep 16 doi: 10.1038/nature15521 [Epub ahead of print]; Vierstra, J. et al. (2015) Nat. Methods 12: 927-30).
Hasta la fecha, se han utilizado dos tecnologías principales de direccionamiento para silenciar la expresión génica: ARN de interferencia (ARNi; Davidson, B. L. et al. (2011) Nat. Rev. Genet. 12: 329-40) con un único a Rn de horquilla corta (ARNsh); y selección de genes con nucleasas artificiales (AN; Carroll, D. (2014) Annu. Rev. Biochem. 83: 409-39). ARNi explota la ruta endógena de microARN (miARN) para regular a la baja la expresión de la transcripción diana que es complementaria al ARNsh (Davidson, B. L. et al. (2011) Nat. Rev. Genet. 12: 329-40). El enfoque de AN explota la naturaleza propensa a errores del proceso de reparación del ADN que se une a los extremos no homólogos para interrumpir permanentemente el marco de codificación del gen diana de AN (Ciccia, A. et al. (2010) Mol. Cell 40: 179­ 204).
Aunque se han obtenido datos preclínicos y clínicos prometedores usando estas tecnologías (DiGiusto, D. L. et al. (2013) Viruses 5: 2898-919; DiGiusto, D.L. et al. (2010) Sci. Transl. Med. 2: 36ra43; Ramachandran, P.S. et al. (2013) Neurotherapeutics 10: 473-85; McBride, J.L. et al. (2011) Mol. Ther. 19: 2152-62), el agotamiento parcial de la expresión génica con ARNsh y la baja eficiencia por la que se produce la alteración homocigota en células diploides de mamíferos pueden poner en peligro la eficacia de estos tratamientos. Estas desventajas son particularmente relevantes en aquellas aplicaciones donde los niveles residuales de actividad génica son suficientes para la función biológica.
Además, la explotación segura de estas tecnologías requiere resolver problemas con: a) silenciamiento de genes fuera de la diana; b) alterar el perfil transcripcional de la célula al interferir con la ruta de miARN endógeno; y c) alterar la progresión del ciclo celular o desencadenar la apoptosis al sobreactivar la respuesta al daño del ADN (Ciccia, A. et al. (2010) Mol. Cell 40: 179-204). Además, ARNi y AN no son adecuados para la inactivación de elementos reguladores amplios no transcritos, como promotores o potenciadores.
Además, se han explotado mecanismos epigenéticos para silenciar la expresión génica. La epigenética se refiere a los mecanismos que transmiten cambios hereditarios en la función del genoma sin alterar la secuencia primaria de ADN. Estos cambios pueden mediar en instrucciones a corto plazo que pueden revertirse rápidamente en respuesta a estímulos exógenos (p. ej., modificaciones postranscripcionales de histonas, HPTM por sus siglas en inglés). Alternativamente, pueden constituir instrucciones a largo plazo que contribuyen de manera estable a la identidad y memoria celular (p. ej., metilación del ADN; Smith, Z. D. et al. (2013) Nat. Rev. Genet. 14: 204-20). Los estudios actuales están desentrañando la composición y función de los complejos moleculares reclutados por la cromatina para inducir estados represivos epigenéticos, y los mecanismos por los cuales estos estados se propagan indefinidamente a lo largo de la división celular (Cedar, H. et al. (2009) Nat. Rev. Genet. 10: 295-304; Chen, T. et al. (2014) Nat. Rev. Genet. 15: 93-106; Probst, A.V. et al. (2009) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10: 192-206).
Varios estudios han establecido el silenciamiento génico utilizando represores de transcripción artificial (ATR por sus siglas en inglés) expresados de forma estable creados a partir de dominios de unión a ADN fusionados con los dominios efectores de las enzimas remodeladoras de la cromatina (de Groote, M. L. et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40: 10596-613; Mendenhall, E.M. et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 1133-6; Zhang, F. et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29: 149-53; Konermann, S. et al. (2013) Nature 500: 472-6; Sera, T. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61: 513-26; Qi, L.S. et al. (2013) Cell 152: 1173­ 83). Sin embargo, estos estudios no lograron demostrar un silenciamiento epigenético permanente en ausencia de una expresión continua de los ATR, probablemente debido a la incapacidad intrínseca de los dominios efectores elegidos para recrear estados represivos de cromatina autopropagantes en los loci diana de ATR.
Además, se ha demostrado que el silenciamiento inducido por represores basados en la caja asociada a Krüppel artificial (KRAB) se borra en las células somáticas una vez que las proteínas represoras no se expresan o ya no se unen a su locus diana (Szulc, J. et al. Alabama. (2006) Nat. Methods 3: 109-16).
En consecuencia, sigue existiendo una necesidad importante para el desarrollo de tecnologías de silenciamiento de genes más potentes y seguras.
Breve descripción de la invención
Hemos desarrollado un enfoque novedoso para el silenciamiento de genes que aprovecha los mecanismos epigenéticos endógenos. Inesperadamente, nuestro enfoque transmite estados robustos y hereditarios de represión transcripcional del gen diana deseado. Es importante destacar que esto permite la inactivación permanente de genes de interés terapéutico (por ejemplo, causante de enfermedades) o biotecnológico.
Debido a las dificultades anteriores para mantener un silenciamiento génico robusto, y debido a que la expresión duradera de represores de transcripción artificial (ATR) de vectores integrados puede representar una amenaza importante para la seguridad de las células, seleccionamos usar solo ATRs que satisfagan todos los siguientes criterios:
1. trabajar por ensamblaje combinatorio de dos o más módulos efectores diferentes;
2. establecer estados robustos y permanentes de represión epigenética; y
3. ejercer esta función biológica cuando se expresan transitoriamente en la célula.
Este enfoque nos ha permitido mejorar tanto la eficiencia como la seguridad del silenciamiento génico, ya que la actividad de cada ATR individual en los sitios fuera de la diana será transitoria, si no ausente.
La presente memoria proporciona un producto que comprende dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo;
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo; y
(d) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d).
La presente memoria también proporciona un producto que comprende dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c).
En un aspecto, la invención proporciona una composición para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde la composición comprende una combinación de represores de transcripción artificial (ATR) seleccionados del grupo que consiste en:
(a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); (b) y (d); y (c) y (d); o polinucleótidos que los codifican, donde:
(a) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB;
(b) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L; y
(d) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el kit comprende una combinación de represores de transcripción artificial (ATR) seleccionados del grupo que consiste en: (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); (b) y (d); y (c) y (d), o polinucleótidos que los codifican, donde:
(a) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB;
(b) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L; y
(d) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En una realización, la composición o kit de la invención comprende los ATR (a) y (b), o los polinucleótidos que los codifican. En otra realización, la composición o kit de la invención comprende los ATR (a) y (c), o los polinucleótidos que los codifican. En otra realización, la composición o kit de la invención comprende los ATR (b) y (c), o los polinucleótidos que los codifican. En una realización preferida, la composición o kit de la invención comprende los ATR (a), (b) y (c), o los polinucleótidos que los codifican. En otra realización, la composición o kit de la invención comprende los ATR (a), (b) y (d), o los polinucleótidos que los codifican. En otra realización, la composición o kit de la invención comprende los ATR (b) y (d), o los polinucleótidos que los codifican. En otra realización, la composición o kit de la invención comprende los ATR (c) y (d), o los polinucleótidos que los codifican. En otra realización preferida, la composición o kit de la invención comprende los ATR (b), (c) y (d), o los polinucleótidos que los codifican.
El dominio KRAB o su homólogo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7.
El dominio DNMT3A o su homólogo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 8 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 8.
El dominio DNMT3B o su homólogo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 9 o 36 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 9 o 36.
El dominio DNMT1 o su homólogo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 10 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 10.
El dominio DNMT3L o su homólogo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 11 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 11.
El dominio SETDB1 o su homólogo puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 12 o 13 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 12 o 13.
En una realización, el dominio de unión a ADN de (a), (b), (c) o (d) comprende un dominio seleccionado independientemente de un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas. En una realización preferida, el dominio de unión a ADN de (a), (b), (c) o (d) comprende un dominio de unión a ADN TALE o un sistema CRISPR/Cas.
Los dominios de unión a ADN, por ejemplo, los dominios de unión a ADN TALE o el sistema CRISPR/Cas, de (a), (b), (c) o (d) pueden seleccionarse o diseñarse para unirse a diferentes sitios de unión.
Los dominios de unión a ADN pueden unirse a sitios de unión dentro de un gen diana o dentro de secuencias reguladoras para el gen diana, por ejemplo, secuencias promotoras o potenciadoras.
Los dominios de unión a ADN pueden unirse a sitios de unión dentro de sitios de corte y empalme. Las variantes de corte y empalme de un gen dado pueden estar reguladas por la metilación/desmetilación del ADN en los sitios de corte y empalme. A su vez, estas modificaciones pueden provocar la exclusión/inclusión de exones en el transcrito maduro. Esta exclusión/inclusión puede tener relevancia terapéutica, como en el caso de la distrofia muscular de Duchenne, en la cual se ha propuesto para la terapia la exclusión (por ablación genética u omisión de exón) del ARNm maduro de un exón que porta la mutación causante de la enfermedad más frecuente. (Ousterout, D. G. et al. (2015) Mol. Ther. 23: 523-32; Ousterout, D.G. et al. (2015) Nat. Commun. 6: 6244; Kole, R. et al. (2015) Adv. Drug Deliv. Rev. 87: 104-7; Touznik, A. et al. (2014) Expert Opin. Biol. Ther. 14: 809-19).
Los ATR de la presente invención también pueden dirigirse a elementos genéticos que pueden transcribirse activamente o no (p. ej., secuencias que controlan la disposición topológica, la estabilidad y la replicación del genoma, como aislantes, dominios asociados a laminina, regiones teloméricas y centroméricas), elementos repetitivos o móviles. En consecuencia, la presente invención puede relacionarse con la edición epigenética, como el silenciamiento/edición de un elemento genético. Por lo tanto, la invención puede abarcar el uso de los productos y ATR de la invención para la edición epigenética de elementos de ADN reguladores, como los descritos en el presente documento. La edición epigenética de un gen diana o de un elemento genético también puede estar asociada con su activación o actividad de transcripción, respectivamente. La invención también puede abarcar el uso de los productos y ATR de la invención para el silenciamiento epigenético simultáneo de múltiples genes diana o elementos de ADN reguladores, como los descritos en el presente documento.
En una realización, los polinucleótidos que codifican los ATR están en forma de un solo vector o están comprendidos dentro de vectores separados.
En una realización en la que se usan dos ATR, los polinucleótidos que codifican (a) y (b) pueden estar comprendidos dentro de un único vector; los polinucleótidos que codifican (a) y (c) pueden estar comprendidos dentro de un único vector; o los polinucleótidos que codifican y (c) pueden estar comprendidos dentro de un único vector.
En otra realización en la que se usan dos ATR, los polinucleótidos que codifican (b) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un único vector; o los polinucleótidos que codifican (c) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector.
En otra realización en la que se usan dos ATR, los polinucleótidos que codifican (a) y (b) pueden estar comprendidos en vectores separados; los polinucleótidos que codifican (a) y (c) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados; o los polinucleótidos que codifican (b) y (c) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados.
En otra realización donde se usan dos ATR, los polinucleótidos que codifican (b) y (d) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados; o los polinucleótidos que codifican (c) y (d) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados.
En una realización en la que se usan tres ATR, los polinucleótidos que codifican (a), (b) y (c) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector; los polinucleótidos que codifican (a), (b) y (c) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados; los polinucleótidos que codifican (a) y (b) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (c) puede estar comprendido dentro de un vector separado; los polinucleótidos que codifican (a) y (c) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (b) puede estar comprendido dentro de un vector separado; o los polinucleótidos que codifican (b) y (c) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (a) puede estar comprendido dentro de un vector separado.
En otra realización donde se usan tres ATR, los polinucleótidos que codifican (a), (b) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector; los polinucleótidos que codifican (a), (b) y (d) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados; los polinucleótidos que codifican (a) y (b) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (d) puede estar comprendido dentro de un vector separado; los polinucleótidos que codifican (a) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (b) puede estar comprendido dentro de un vector separado; o los polinucleótidos que codifican (b) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (a) puede estar comprendido dentro de un vector separado.
En otra realización en la que se usan tres ATR, los polinucleótidos que codifican (b), (c) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un único vector; los polinucleótidos que codifican (b), (c) y (d) pueden estar comprendidos dentro de vectores separados; los polinucleótidos que codifican (b) y (c) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (d) puede estar comprendido dentro de un vector separado; los polinucleótidos que codifican (b) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (c) puede estar comprendido dentro de un vector separado; o los polinucleótidos que codifican (c) y (d) pueden estar comprendidos dentro de un solo vector y el polinucleótido que codifica (b) puede estar comprendido dentro de un vector separado.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmidos, vectores de ARNm (por ejemplo, vectores de ARNm transcritos in vitro) o vectores virales. Preferiblemente, los vectores permiten la expresión transitoria de los ATR dentro de una célula.
Como alternativa al suministro de polinucleótidos que codifican ATR a las células, los ATR de la presente invención pueden administrarse a las células mediante transducción de proteínas. La transducción de proteínas puede ser, por ejemplo, a través del suministro de vectores o mediante el suministro directo de proteínas.
En una realización, los ATR, o los polinucleótidos que los codifican, están en forma de una composición farmacéutica que comprende además un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición o el kit de la invención comprende además un dominio KRAB, o un polinucleótido que lo codifica, donde el dominio KRAB no está unido operativamente a un dominio de unión al ADN.
En una realización, la composición o kit de la invención comprende además un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, o un polinucleótido que lo codifica, donde el dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 no está unido operativamente a un dominio de unión a ADN.
En una realización, la composición o kit de la invención comprende además un dominio DNMT3L, o un polinucleótido que lo codifica, donde el dominio DNMT3L no está unido operativamente a un dominio de unión a ADN.
En una realización, la composición o kit de la invención comprende además un dominio SETDB1, o un polinucleótido que lo codifica, donde el dominio SETDB1 no está unido operativamente a un dominio de unión a ADN.
La memoria también proporciona el producto divulgado aquí para uso en terapia.
La memoria también proporciona el producto divulgado aquí para uso en terapia, donde los dos o más represores de transcripción artificial (ATR), o los polinucleótidos que los codifican, son una preparación combinada para la administración a un sujeto de forma simultánea, secuencial o separada.
En otro aspecto, la invención proporciona la composición o kit de la invención para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, preferiblemente donde los ATR, o los polinucleótidos que los codifican, son una preparación combinada para la administración a un sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado, preferiblemente donde:
(i) la expresión transitoria de los ATR en una célula silencia la diana;
(ii) la administración de los ATR a una célula silencia permanentemente la diana;
(iii) la administración de los ATR a una célula silencia permanentemente la diana en la progenie de la célula; y/o (iv) se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
En el presente documento, la administración a un sujeto puede incluir la administración a una célula, por ejemplo, durante terapia ex vivo.
La divulgación también proporciona el uso del producto divulgado aquí para silenciar un gen diana.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de la composición o kit de la invención para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el uso es in vitro o ex vivo, opcionalmente donde se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme. Por ejemplo, se puede silenciar un gen diana en una población de células (p. ej., una línea celular o células primarias) para potenciar la producción de un agente (p. ej., un agente bioterapéutico) por medio de las células, o para impartir una ventaja de crecimiento a las células. Alternativamente, por ejemplo, se puede silenciar un gen diana para generar un modelo animal inactivado para el gen diana. El enfoque epigenético de la presente invención proporciona una alternativa a los métodos existentes para inactivar un gen, como los que utilizan la recombinación homóloga. Alternativamente, por ejemplo, se puede silenciar un gen diana en una célula vegetal.
Según los usos anteriores, incluidos los usos en terapia, la administración de los ATR de la invención a una célula puede silenciar un gen diana. La administración puede ser entrega transitoria. La administración puede ser a través de la expresión de los ATR en una célula, por ejemplo, la expresión de polinucleótidos que codifican los ATR. La administración de los ATR de la invención a una célula también puede provocar la exclusión/inclusión de exones en un transcrito maduro, por ejemplo, a través de un efecto en un sitio de corte y empalme. La administración de los ATR de la invención a una célula también puede permitir el silenciamiento y/o la edición de un elemento genético como se describe en el presente documento.
En una realización, la expresión de los ATR de la invención en una célula silencia un gen diana. La expresión puede ser una expresión transitoria.
En una realización, la administración de los ATR de la invención a una célula (p. ej., mediante expresión en la célula) silencia permanentemente un gen diana. En otra realización, la administración de los ATR de la invención a una célula (p. ej., mediante expresión en la célula) silencia permanentemente un gen diana en la progenie de la célula. Por ejemplo, la célula puede ser una célula madre y el gen diana puede silenciarse en la progenie de la célula madre (por ejemplo, el gen diana puede silenciarse en células resultantes de la diferenciación de las células madre).
A modo de ejemplo, las células pueden derivar de animales (tales como mamíferos, por ejemplo, seres humanos), hongos (tales como levaduras) o plantas. Por ejemplo, las células pueden ser células madre y progenitoras hematopoyéticas, linfocitos T, células madre mesenquimatosas, fibroblastos, monocitos, células madre epidérmicas o neurales.
La separación de los sitios de unión a los que se seleccionan los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR para unirse no está particularmente limitada en tamaño. Por ejemplo, los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR pueden seleccionarse para unirse a sitios de unión que están separados por aproximadamente 1-100 pb, 1-50 pb, 1-30 pb, 5-30 pb, 10-30 pb o 15-30 pb. En una realización, los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR se seleccionan para unirse a sitios de unión que están separados por 1-30 pb. Preferiblemente, los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR se seleccionan para unirse a sitios de unión que están separados por aproximadamente 15-25 pb. Por ejemplo, los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR pueden seleccionarse para unirse a sitios de unión que están separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pb.
Los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR también pueden seleccionarse para unirse al mismo sitio de unión, por ejemplo, los dominios de unión a ADN de los diferentes a Tr pueden seleccionarse para unirse a sitios de unión que están separados por 0 pb. Así, por ejemplo, los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR pueden seleccionarse para unirse a sitios de unión que están separados por aproximadamente 0-100 pb, 0-50 pb, 0-30 pb, 5-30 pb, 10-30 pb o 15-30 pb. Los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR pueden seleccionarse para unirse a sitios de unión que están separados por aproximadamente 0-15 o 15-25 pb.
El orden direccional en el que se unen los diferentes ATR en relación con el gen diana no es particularmente importante. En una realización, los ATR comprenden un ATR que comprende un dominio KRAB y un ATR que comprende un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y los dominios de unión a ADN (p. ej., dominios de unión a ADN TALE) de cada ATR se seleccionan de manera que el ATR que comprende un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 se une al ADN cadena arriba del ATR que comprende un dominio KRAB.
En una realización, los dominios de unión a ADN son dominios de unión a ADN TALE o sistemas CRISPR/Cas.
La selección de los dominios de unión a ADN puede comprender dominios de unión a ADN diseñados para unirse a secuencias de ADN deseadas, específicas.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usar en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o su homólogo, o polinucleótidos que los codifican.
La memoria también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia donde el ATR se administra a un sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o su homólogo, o polinucleótidos que los codifican.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo, o polinucleótidos que los codifican.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usar en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o su homólogo, y/o un cuarto a Tr que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
La memoria también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia donde el ATR se administra a un sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o su homólogo, y/o un cuarto ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B DNMT3B o DNMT1 o su homólogo, y/o un cuarto ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usar en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o su homólogo, y/o un cuarto a Tr que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
En otro aspecto, la invención proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB, o polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, dodne el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótidos que lo codifican, y donde los dominios de unión al ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En otro aspecto, la invención proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio KRAB, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, y/o un cuarto ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótidos que lo codifican, y donde los dominios de unión a ADN de las diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En otro aspecto, la invención proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio KRAB, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y/o un cuarto ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótidos que lo codifican, y donde los dominios de unión a ADN de las diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En otro aspecto, la invención proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, dodne el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótido que lo codifican, y donde los dominios de unión al ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende los represores de transcripción artificiales (ATR) de la invención. La célula puede transfectarse por medio de los polinucleótidos que codifican los ATR de la invención. Los polinucleótidos pueden estar en forma de un solo vector o pueden estar comprendidos dentro de vectores separados.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula donde dicha célula es descendiente de una célula que comprende los represores de transcripción artificial (ATR) de la invención, y donde el gen diana, el elemento genético o la variante de corte y empalme permanece silenciado. En una realización, la célula descendiente ya no comprende los ATR de la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona la célula de la invención para su uso en terapia.
La memoria también proporciona un método de terapia génica que comprende transfectar una célula con los polinucleótidos que codifican los dos o más represores de transcripción artificial (ATR) de la invención, donde los polinucleótidos están en forma de un solo vector o están comprendidos dentro de vectores separados.
En una realización, la transfección se lleva a cabo ex vivo.
La divulgación también proporciona un método de terapia génica que comprende administrar dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo a un sujeto de forma simultánea, secuencial o separada, donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c).
La divulgación también proporciona un método de terapia génica que comprende administrar dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo;
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo; y
(d) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo
a un sujeto de forma simultánea, secuencia! o por separado, donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d).
La memoria también proporciona un Kit que comprende dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo
donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c). La memoria también proporciona un Kit que comprende dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo;
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo; y
(d) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d).
La memoria también proporciona un método para silenciar un gen diana que comprende el paso de administrar los dos o más ATR, o los polinucleótidos que los codifican, de la invención a una célula. El método puede ser un método in vitro.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición o kit que comprende un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, preferiblemente un dominio DNMT3A, y un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótidos que lo codifican. La presente invención también proporciona usos de esta composición o kit, usos de esta composición o kit en terapia y células que comprenden estos ATR y sus descendientes, como se describe en el presente documento. Esta composición o kit también puede comprender además un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o KRAB, o un polinucleótido que lo codifica.
En una realización, la composición o kit comprende un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio Dn Mt 3A, DNMT3B o DNMT1, preferiblemente un dominio DNMT3A o su homólogo, un ATR que comprende un dominio de de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, y un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótidos que lo codifican.
En una realización, la composición o kit comprende un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio Dn Mt 3A, DNMT3B o DNMT1, preferiblemente un dominio DNMT3A, un ATR que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a un dominio SETDB1, y un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB, o polinucleótidos que lo codifican.
El dominio SETDB1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 12 o 13 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 12 o 13.
La memoria también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR), o un polinucleótido que lo codifica, donde el ATR comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de los grupos (a), (b) o (c):
(a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y
(c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente al dominio de unión al ADN se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c). El ATR puede, por ejemplo, comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio del grupo (a), un dominio del grupo (b) y un dominio de
grupo (c). La memoria también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de los grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo;
(c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo; y
(d) un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente al dominio de unión al ADN se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d).
En otro aspecto, la invención proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde el ATR comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1,
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente al dominio de unión a ADN se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d), preferiblemente donde el dominio de unión a ADN comprende un dominio de unión a ADN TALE , un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas, y donde el dominio de unión a ADN se une a un sitio de unión seleccionado del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen diana o elemento genético; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana.
En una realización, el dominio de unión a ADN comprende un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas.
La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican este ATR, usos de este ATR, usos de este ATR en terapia, células que comprenden este ATR y sus descendientes, como se describe en el presente documento.
La memoria también proporciona un producto que comprende dos o más represores de transcripción artificial (ATR) diferentes, o polinucleótidos que los codifican, donde los dos o más ATR diferentes comprenden individualmente un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b) o (c):
(a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y
(c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente a cada dominio de unión al ADN individual se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c). Cada ATR puede, por ejemplo, comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio del grupo (a), un dominio del grupo (b) y un dominio de grupo (c). La memoria también proporciona un producto que comprende dos o más represores de transcripción artificial (ATR) diferentes, o polinucleótidos que los codifican, donde los dos o más ATR diferentes comprenden individualmente un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo;
(c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo; y
(d) un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente a cada dominio de unión al ADN individual se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d).
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde la composición comprende dos o más represores de transcripción artificial (ATR) diferentes, o polinucleótidos que los codifican, donde los dos o más ATR diferentes comprenden individualmente un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1,
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente a cada dominio de unión al ADN individual se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d), preferiblemente donde los dominios de unión al ADN de los dos o más ATR diferentes se seleccionan individualmente del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde el kit comprende dos o más represores de transcripción artificial (ATR) diferentes, o polinucleótidos que los codifican, donde los dos o más ATR diferentes comprenden individualmente un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1,
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente a cada dominio de unión al ADN individual se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d), preferiblemente donde los dominios de unión al ADN de los dos o más ATR diferentes se seleccionan individualmente del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas, donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
Los dominios de unión a ADN, por ejemplo, los dominios de unión a ADN TALE o el sistema CRISPR/Cas, de los dos o más ATR diferentes pueden seleccionarse o diseñarse para unirse a diferentes sitios de unión.
Los dominios de unión a ADN pueden unirse a sitios de unión dentro de un gen diana o dentro de secuencias reguladoras para el gen diana, por ejemplo, secuencias promotoras o potenciadoras. Los dominios de unión a ADN pueden unirse a sitios de unión dentro de sitios de corte y empalme.
La presente invención también proporciona usos de esta composición o kit, usos de esta composición o kit en terapia, células que comprenden estos ATR y sus descendientes, como se describe en el presente documento.
La memoria también proporciona un producto que comprende solo un ATR y una proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN, o polinucleótidos que lo codifican. El ATR puede comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio efector seleccionado entre: (a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo; (b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; o (c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo (es decir, el ATR puede ser como se describe en este documento). La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN puede comprender un dominio KRAB, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1 o DNMT3L o un homólogo del mismo. La proteína efectora separada puede ser un dominio/proteína efectora como se describe en el presente documento. La proteína efectora separada puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento funcional de la misma. Preferiblemente, la proteína efectora separada es diferente del dominio efector del ATR. Preferiblemente, la proteína efectora separada es de una clase diferente al dominio efector del ATR. Preferiblemente, la proteína efectora separada se selecciona de modo que no comprenda un dominio que pertenezca al mismo grupo (a), (b) o (c) que el dominio efector que constituye el ATR.
La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN también puede comprender un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo.
La memoria también proporciona un producto que comprende solo un ATR y una proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN, o polinucleótidos que lo codifican. El ATR puede comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio efector SETDB1 o un homólogo del mismo (es decir, el ATR puede ser como se describe en este documento). La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN puede comprender un dominio KRAB, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1 o DNMT3L o un homólogo del mismo. La proteína efectora separada puede ser un dominio/proteína efectora como se describe en el presente documento. La proteína efectora separada puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento funcional de la misma.
En una realización, el dominio de unión a ADN del ATR se selecciona del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas.
También se describen usos de este producto, usos de este producto en terapia, células que comprenden este producto y sus descendientes, métodos que emplean este producto y kits que comprenden este producto, como se describe en el presente documento.
Cuando el producto de la memoria comprende solo un ATR y una proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión al ADN, los polinucleótidos que codifican el ATR y la proteína efectora separada pueden estar en forma de un solo vector o estar comprendidos dentro de vectores separados.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmidos, vectores de ARNm (por ejemplo, vectores de ARNm transcritos in vitro) o vectores virales. Preferiblemente, los vectores permiten la expresión transitoria del ATR y/o la proteína efectora separada dentro de una célula.
El ATR y/o la proteína efectora separada de la memoria también pueden administrarse a las células mediante transducción de proteínas, como se describe en el presente documento.
Los ATR y/o las proteínas efectoras separadas de la invención, o los polinucleótidos que los codifican, pueden estar en forma de una composición farmacéutica que comprende además un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La memoria también proporciona el ATR de la invención, o el ATR y la proteína efectora separada de la memoria, o los polinucleótidos que la codifican, para uso en terapia.
La memoria también proporciona el ATR y la proteína efectora separada de la memoria, o los polinucleótidos que la codifican, para su uso en terapia, donde el ATR y la proteína efectora separada, o los polinucleótidos que la codifican, son una preparación combinada para la administración a un sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado.
La memoria también proporciona el ATR de la invención, o el ATR y la proteína efectora separada de la invención, o los polinucleótidos que la codifican, para silenciar un gen diana. El uso puede ser, por ejemplo, uso in vitro o ex vivo.
En otro aspecto, la invención proporciona el ATR, polinucleótido, composición o kit de la invención para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, opcionalmente donde se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso del ATR, polinucleótido, composición o kit de la invención para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el uso es in vitro o ex vivo, opcionalmente donde se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
Según los usos anteriores, incluidos los usos en terapia, la administración del ATR de la invención a una célula puede silenciar un gen diana. La administración puede ser entrega transitoria. La administración puede ser a través de la expresión del ATR de la invención en una célula, por ejemplo, la expresión de polinucleótidos que codifican el ATR de la invención.
En una realización, la expresión del ATR de la invención en una célula silencia un gen diana. La expresión puede ser una expresión transitoria.
En una realización, la administración del ATR de la invención a una célula (p. ej., mediante expresión en la célula) silencia permanentemente un gen diana. En otra realización, la administración del ATR de la invención a una célula (p. ej., mediante expresión en la célula) silencia permanentemente un gen diana en la progenie de la célula. Por ejemplo, la célula puede ser una célula madre y el gen diana puede silenciarse en la progenie de la célula madre (por ejemplo, el gen diana puede silenciarse en células resultantes de la diferenciación de las células madre).
A modo de ejemplo, las células pueden derivar de animales (tales como mamíferos, por ejemplo, seres humanos), hongos (tales como levaduras) o plantas. Por ejemplo, las células pueden ser células madre y progenitoras hematopoyéticas, linfocitos T, células madre mesenquimatosas, fibroblastos, monocitos, células madre epidérmicas o neurales.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usar en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con una primera proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión al ADN que comprende un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o un homólogo del mismo y/o una segunda proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
La memoria también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia donde el ATR se administra a un sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado en combinación con una primera proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión al ADN que comprende un dominio KRAB o un homólogo del mismo y/o una segunda proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en una terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con una primera proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio KRAB o un homólogo del mismo y/o una segunda proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 u homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
En estas combinaciones también se puede usar una tercera proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo.
La divulgación también proporciona un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia donde el ATR se administra a un sujeto de manera simultánea, secuencial o por separado en combinación con una primera proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio KRAB o un homólogo del mismo y/o una segunda proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT 1 u homólogo del mismo y/o una tercera proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN que comprende un dominio DNMT3L u homólogo del mismo, o polinucleótidos que lo codifican.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende el ATR de la invención. La célula puede transfectarse por medio de los polinucleótidos que codifican el ATR de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula donde dicha célula es descendiente de una célula que comprende el ATR de la invención, y donde el gen diana, el elemento genético o la variante de corte y empalme permanece silenciado. En una realización, la célula descendiente ya no comprende los ATR de la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona la célula de la invención para su uso en terapia.
La memoria también proporciona un método de terapia génica que comprende transfectar una célula con los polinucleótidos que codifican el ATR de la invención, o el ATR y la proteína efectora separada de la invención. Los polinucleótidos que codifican el ATR y la proteína efectora separada de la invención pueden estar en forma de un solo vector o estar comprendidos dentro de vectores separados.
En una realización, la transfección se lleva a cabo ex vivo.
La memoria también proporciona un método de terapia génica que comprende administrar solo un ATR y una proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN, o polinucleótidos que lo codifican, a un sujeto de forma simultánea, secuencial o separada. El ATR puede comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio efector seleccionado entre: (a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo; (b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; o (c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo (es decir, el ATR puede ser como se describe en este documento). La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN puede comprender un dominio KRAB, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1 o DNMT3L o un homólogo del mismo. La proteína efectora separada puede ser un dominio/proteína efectora como se describe en el presente documento. La proteína efectora separada puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento funcional de la misma. Preferiblemente, la proteína efectora separada es diferente del dominio efector del ATR. Preferiblemente, la proteína efectora separada es de una clase diferente al dominio efector del ATR. Preferiblemente, la proteína efectora separada se selecciona de modo que no comprenda un dominio que pertenezca al mismo grupo (a), (b) o (c) que el dominio efector que constituye el a Tr .
El ATR también puede comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio efector SETDB1 o un homólogo del mismo. La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN también puede comprender un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo.
La memoria también proporciona un Kit que comprende solo un ATR y una proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN, o polinucleótidos que lo codifican. El ATR puede comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio efector seleccionado entre: (a) un dominio KRAB o un homólogo del mismo; (b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; o (c) un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo (es decir, el ATR puede ser como se describe en este documento). La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN puede comprender un dominio KRAB, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1 o DNMT3L o un homólogo del mismo. La proteína efectora separada puede ser un dominio/proteína efectora como se describe en el presente documento. La proteína efectora separada puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento funcional de la misma. Preferiblemente, la proteína efectora separada es diferente del dominio efector del ATR. Preferiblemente, la proteína efectora separada es de una clase diferente al dominio efector del ATR. Preferiblemente, la proteína efectora separada se selecciona de modo que no comprenda un dominio que pertenezca al mismo grupo (a), (b) o (c) que el dominio efector que constituye el ATR.
El ATR también puede comprender un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio efector SETDB1 o un homólogo del mismo. La proteína efectora separada que no está operativamente unida a un dominio de unión a ADN también puede comprender un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo.
La memoria también proporciona un método para silenciar un gen diana que comprende el paso de administrar el ATR de la invención, o el ATR y la proteína efectora separada de la memoria, o los polinucleótidos que la codifican, a una célula. El método puede ser un método in vitro.
Además, se prevé que el ATR o la proteína efectora separada de la invención puedan comprender un dominio SETDB1 o un homólogo del mismo, cuando otro componente del producto de la invención (es decir, el ATR o la proteína efectora separada) comprende un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 u homólogo del mismo.
Los usos de la presente invención, por ejemplo, usos en terapia o silenciamiento de un gen diana, también pueden incluir un paso de inactivación de un gen endógeno que puede contrarrestar la actividad de los ATR o proteínas efectoras separadas de la invención. Por ejemplo, el gen DNMT3B puede estar inactivado. La inactivación de este paso puede ser, por ejemplo, transitoria o permanente. La inactivación puede, por ejemplo, lograrse mediante eliminación genética, por ejemplo, mediante el uso de enfoques basados en CRISPR/Cas9, o mediante la regulación a la baja postranscripcional, por ejemplo, mediante el uso de ARNsh/si, o mediante la regulación a la baja transcripcional, por ejemplo, mediante el uso de un ATR basado en KRAB individual dirigido a las secuencias reguladoras del gen de interés. La inactivación de DNMT3B puede ser especialmente preferida cuando se utilizan tres ATR que comprenden individualmente los dominios KRAB, DNMT3A y DNMT3L.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1
Esquema que detalla el modelo de célula experimental.
Un casete de expresión de eGFP (basado en el promotor hPGK) seguido de la secuencia TetO7 se integra dentro del primer intrón del gen PPP1R12C (también conocido como el AAVS1 locus) de la línea celular K562. Los clones derivados de células individuales que contienen la inserción homocigótica del casete se transducen luego con un vector que expresa ATR (con dominios represivos rep. candidatos) y, después de la deposición de marcas epigenéticas represivas (puntos rojos), las células se tratan o no con doxiciclina. A continuación, se evalúa el mantenimiento del silenciamiento o la reactivación de la expresión de eGFP midiendo la expresión de eGFP.
Figura 2
Comparación del silenciamiento epigenético inducido por tetR:K y tetR:D3A.
A. Esquemas de los vectores lentivirales bidireccionales (Bid.LVs) que expresan tetR:K y el gen marcador mOrange (a la izquierda) o tetR:DNMT3A y el gen marcador ALNGFR (a la derecha). B. Los clones indicadores de TetO7.eGFP se transdujeron con Bid.LV-tetR:K o con Bid.LV-tetR:D3A en presencia o ausencia de doxiciclina (gráficos derecho e izquierdo, respectivamente) y se analizaron mediante citometría de flujo sobre tiempo para medir el porcentaje de células negativas para eGFP. C. Análisis de diagrama de puntos representativo en los puntos de tiempo indicados de la línea celular indicadora TetO7.eGFP transducida con Bid.LV-tetR:K o Bid.LV-tetR:D3A en presencia o ausencia de doxiciclina. La intensidad de fluorescencia media (MFI por sus siglas en inglés) de las células silenciadas con eGFP se compara con la MFI de las células de tipo salvaje no tratadas. D. Las células silenciadas de las condiciones mínimas de doxiciclina en (B) se clasificaron hasta la pureza y se mantuvieron en cultivo con o sin doxiciclina para evaluar la reactivación de eGFP. En la parte inferior se muestran diagramas de puntos representativos de las células en presencia o ausencia del fármaco. E. Las células clasificadas silenciadas de las condiciones en (B) se trataron durante 7 días con AZA (1 mM) o vehículo (DMSO) y se analizaron para determinar la expresión de eGFP (histograma a la izquierda). Se muestran diagramas de puntos representativos de células tratadas con vehículo y AZA.
Figura 3
La represión transcripcional inducida por TetR:D3A se limita al locus objetivo.
A. Esquema del locus AAVS1. Se indican los genes que rodean el casete indicador (flecha roja). B. Histogramas que muestran los cambios de plegamiento en los niveles de expresión de los genes indicados entre células negativas para eGFP silenciadas con ya sea Bid.LV-tetR:K o Bid.LV-tetR:D3A y células no tratadas. El nivel de expresión relativo de cada gen se normalizó a la expresión de B2M, y se representó como cambio de plegamiento relativo a las células no tratadas (calibrador) (n=3).
Figura 4
Actividad sinérgica de tetR:K y tetR:D3A tras su coadministración transitoria.
A. La línea celular indicadora TetO7.eGFP se transfectó transitoriamente con plásmidos que codifican tetR:K y tetD3A, solos o en combinación. Las células se analizaron mediante citometría de flujo a lo largo del tiempo y la eficacia del silenciamiento se midió como porcentaje de células negativas para eGFP después de la transfección. El diagrama de puntos representativo para cada condición de transfección se muestra en la parte inferior del histograma (n = 3). B. El histograma que muestra los cambios de plegamiento en los niveles de expresión de los genes indicados entre células silenciadas con eGFP clasificadas de las condiciones mixtas que se muestran en (A) y células no tratadas. El nivel de expresión relativo de cada gen se normalizó a B2M, y se representó como cambio de plegamiento relativo a las células no tratadas (calibrador) (n=3). C. Las células negativas para eGFP de la condición de tratamiento mixto en (A) se clasificaron y luego se trataron con AZA o DMSO (histograma que muestra el porcentaje de células positivas para eGFP después de 7 días de los tratamientos indicados; n=3). D. Experimento similar al de (A) pero realizado con ARNm transcrito in vitro que codifica para tetR:K y tetD3A, administrado solo o en combinación. E. El histograma que muestra los cambios de plegamiento en niveles de expresión de los genes indicados entre células silenciadas con eGFP clasificadas de las condiciones mixtas que se muestran en (D) y células no tratadas (= 3).
Figura 5
El silenciamiento génico con la combinación tetR:K y tetR:D3A es independiente del locus y del tipo de célula.
A. Esquema del indicador LV de TetO7 usado en el estudio. La secuencia de TetO7 se clonó cadena arriba del promotor hPGK impulsando la expresión del transgén indicador eGFP. B. Gráfico que muestra la cinética del silenciamiento de eGFP (% de células negativas para eGFP por citometría de flujo) en la línea celular indicadora K562 LV/TETO7 transfectada con ARNm transcrito in vitro que codifica para tetR:K y tetR:D3A, administrado ya sea solo o en combinación (n=3; los datos se representan como media±SEM). C-D. Gráficos que muestran la cinética del silenciamiento de eGFP (% de células negativas para eGFP por citometría de flujo) en la línea celular U937LV/TETO7 (C) o en la línea celular indicadora B-linfoblastoide LV/TETO7 (D). Las células se transfectaron como se indica en (B) (n=1 para U937 y n=3 para células B-linfoblastoides).
Figura 6
Cribado de dominios efectores epigenéticos adicionales para ATR.
A. Gráfico que muestra la cinética del silenciamiento de eGFP (% de células negativas para eGFP por citometría de flujo) en la línea celular indicadora K562 LV/TETO7 tras la transducción con vectores lentivirales que expresan los ATR basados en tetR indicados (n=3).
B. Gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para los LV indicados a lo largo del tiempo en cultivo (n=3). C. Gráfico que muestra la cinética del silenciamiento de eGFP (% de células negativas para eGFP por citometría de flujo) en la línea celular indicadora K562 LV/TETO7 transducida con vectores lentivirales que expresan de manera estable los ATR basados en tetR indicados, antes y después de la administración de doxiciclina (n= 3).
Figura 7
Cribado de combinaciones adicionales de represores de transcripción artificiales (ATR) en diferentes células de mamíferos.
A-D. Gráficos que muestran la cinética del silenciamiento de eGFP (% de células negativas para eGFP por citometría de flujo) en la línea celular indicadora K562 LV/TETO7 tras la electroporación con plásmidos individuales que codifican para a Tr basados en tetR indicados (A; n=3; los datos se representan como media±SEM), o tras la electroporación con el plásmido que codifica para tetR:D3A más el plásmido que codifica para uno de los otros ATR basados en tetR (B; n=3; los datos se representan como media±SEM), o tras la electroporación con el plásmido que codifica para tetR:K más el plásmido que codifica para uno de los otros ATR basados en tetR (C; n=3; los datos se representan como media±SEM), o tras la electroporación con los plásmidos que codifican para tetR:D3A tetR:K junto con el plásmido que codifica para uno de los otros ATR basados en tetR (D; n=3; los datos se representan como media±SEM). E. Histograma que muestra la eficacia del silenciamiento de eGFP 21 días después de la electroporación de la línea celular indicadora K562 LV/TETO7 con plásmidos que codifican para los ATR basados en tetR indicados (puntos temporales posteriores de A-D; n=3; los datos se representan como media±SEM). F. Histograma que muestra la eficiencia del silenciamiento de eGFP 30 días después de la electroporación de la línea celular reportera K562 LV/TETO7 con plásmidos que codifican para los ATR basados en tetR indicados, incluido el basado en SETDB1 (n=3; los datos se representan como media±SEM). G. Gráfico que muestra la cinética del silenciamiento de eGFP de la línea celular indicadora B-linfoblastoide LV/TETO7 electroporada con ARNm que codifica para los ATR basados en tetR indicados (n=3; los datos se representan como media±S.E.M). H. Gráfico que muestra la cinética del silenciamiento de eGFP de la línea celular indicadora NIH/3T3 LV/TETO7 murina electroporada con ARNm que codifica para los ATR basados en tetR indicados (n=2; los datos se representan como media±rango).
Figura 8
Silenciamiento de genes mediante la coadministración transitoria de represores de transcripción artificiales (ATR) que comprenden dominios de unión a ADN hechos a medida (orientación de cabeza a cola).
A. Representación esquemática de los diversos casetes de Sitios de Unión de Cola Artificiales.(cabeza a cola).hPGK.eGFP integrados semialeatoriamente en el genoma de las células K562 a través de la transducción de LV, que difieren en la longitud del espaciador entre los dos sitios de unión de ATR. Se han fusionado por separado dos dominios TALE diferentes con cada efector epigenético, lo que da lugar a dos estrategias alternativas de coadministración que difieren en el orden relativo de unión de D3A-K en la diana. B. Gráficos que muestran la eficiencia de silenciamiento (% de células negativas para eGFP a los 34 días posteriores a la electroporación) con respecto a la longitud del espaciador, en el orden de unión de los ATR relativos K ^D 3A (izquierda) y D 3A ^K (derecha) en la diana. C. Gráficas que muestran la cinética de silenciamiento de eGFP en la línea celular con el espaciador de 25 pb (el espaciador de mejor rendimiento probado en los experimentos que se muestran en B) en el orden de unión de los ATR relativos K ^ d 3a ( izquierda) y D 3A ^K (derecha) en la diana (n = 3; los datos se representan como media±SEM).
Figura 9
Silenciamiento de genes mediante la coadministración transitoria de represores de transcripción artificiales (ATR) que comprenden dominios de unión a ADN hechos a medida (orientación de cabeza a cabeza).
A. Representación esquemática de los diversos casetes de Sitios de Unión de Cola Artificiales.(cabeza a cabeza).hPGK.eGFP integrados semialeatoriamente en el genoma a través de la transducción de LV, que difieren en la longitud del espaciador entre los dos sitios de unión de ATR. Se han fusionado por separado dos dominios TALE diferentes con cada efector epigenético, lo que da lugar a dos estrategias alternativas de coadministración que difieren en el orden relativo de unión de D3A-K en la diana. B. Gráficos que muestran la eficiencia de silenciamiento (es decir, % de células negativas para eGFP a los 34 días posteriores a la electroporación) con respecto a la longitud del espaciador, en el orden de unión de los ATR relativos D 3A ^K (izquierda) y K^D 3A (derecha) en la diana. C. Gráficas que muestran la cinética de silenciamiento de eGFP en la línea celular con el espaciador de 15 pb (el espaciador de mejor rendimiento probado en los experimentos que se muestran en B) en el orden de unión de los ATR relativos D 3A ^K (izquierda) y K ^D 3A (derecha) en la diana (n = 3; los datos se representan como media±SEM).
Figura 10
Silenciamiento de genes con represores de transcripción artificial (ATR) que comprenden más de un dominio efector.
A. Representación esquemática de los casetes de Sitios de Unión de Cola Artificiales.(cabeza a cabeza).hPGK.eGFP integrados semialeatoriamente en el genoma de las células K562 a través de la transducción LV unida por medio de ATR quimérico K:tetR:D3A (Bi-Partite; BiP), donde los dominios KRAB y DNMT3A se fusionaron con el extremo N y C (respectivamente) del mismo dominio de unión al ADN. B. Gráficos que muestran la cinética del silenciamiento de eGFP en la línea celular con el espaciador de 25 pb (la misma línea utilizada en la Figura 8B), transfectada con plásmidos que codifican para la proteína de fusión Bi-Partite (BiP), cuando se transfectan solos o en combinación (n=3; los datos se representan como media±SEM).
Figura 11
Silenciamiento epigenético permanente en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas (HSPC por sus siglas en inglés) mediante el uso de diferentes combinaciones de represores de transcripción artificiales (ATR).
A. Línea de tiempo esquemática del protocolo usado para evaluar la eficiencia del silenciamiento en HSPC. Brevemente, el día 0, las células CD34+ humanas se descongelaron en medios estimulantes con citoquinas de acción temprana y se transdujeron el día 1 con el reportero LV TetO7 (esquema del vector en la Figura 5A). Luego se lavaron las células y se electroporaron con ARNm transcrito in vitro el día 3 desde la descongelación. El día siguiente, se sembraron 800 células para ensayos de CFC-U, mientras que las células restantes se cultivaron en cultivo líquido y se analizaron mediante citometría de flujo en los puntos de tiempo indicados. El análisis de CFC-U se realizó 14 días después de la descongelación. B. Gráfico que muestra la cinética de silenciamiento de eGFP en CD34+ humano en cultivo líquido transfectado con ARNm transcrito in vitro que codifica para los ATR indicados, administrado ya sea solo o en combinaciones dobles o triples (los datos se normalizaron al control no electroporado, pero transducido por LV; n = 3; los datos se representan como media±SEM).
C. Histograma que muestra el porcentaje de silenciamiento de eGFP en colonias eritroides y mieloides derivadas del CD34+ humano transfectado con ARNm transcritos in vitro como se indica en (B) (n=3; los datos se representan como media±SEM).
Figura 12
Silenciamiento epigenético permanente en linfocitos T humanos mediante el uso de diferentes combinaciones de represores de transcripción artificiales (ATR).
A. Línea de tiempo esquemática del protocolo usado en este estudio para evaluar la eficacia del silenciamiento en células T primarias humanas. Brevemente, el día 0, las células T se aislaron con perlas recubiertas de anti-CD3/CD28 y se dejaron en cultivo 3 días antes de la transducción con el indicador TetO.LV. El día 6, las células se transfectaron con ARNm transcrito in vitro que codifica para los ATR indicados, y la expresión de eGFP se midió mediante citometría de flujo en los puntos de tiempo indicados. 3 semanas después de la transfección, las células se volvieron a estimular y la estabilidad del silenciamiento de eGFP se midió mediante citometría de flujo. B. Gráfico que muestra la cinética del silenciamiento de eGFP en células T primarias humanas transfectadas con ARNm transcrito in vitro que codifica para los ATR indicados, que se administraron solos o en combinaciones dobles o triples normalizados sobre células no tratadas (los datos se normalizaron al control no electroporado, pero transducido por LV; n = 2; los datos se representan como media±rango).
Figura 13
Silenciamiento epigenético permanente del gen de la p2-microglobulina (B2M) humana usando combinaciones de represores de transcripción artificial (ATR).
A. Representación esquemática del locus B2M que indica los sitios de unión de los ATR basados en TALE. B. Gráfico que muestra las cinéticas del silenciamiento de B2M en células HEK-293T electroporadas con plásmidos que codifican para los ATR basados en TALE indicados, los cuales se administraron ya sea solos o en combinación (n = 3; los datos se representan como media±SEM). C. Diagramas de puntos de citometría de flujo representativos de células HEK-293T transfectadas con plásmidos que codifican para la combinación triple TALE:ATR (gráfico en la parte superior) y la estrategia de clasificación de células utilizada para enriquecer el doble negativo (gráfico inferior a la izquierda) y las células doblemente positivas (gráfico inferior a la derecha). D. Histograma que muestra el cambio de plegamiento en los niveles de expresión del gen B2M en las células clasificadas de (C) y en células HEK293T no tratadas (n = 3; los datos se representan como media±SEM). E. Esquemas de los ATR basados en dCas9 y de los ARNg seleccionados para dirigirse a la isla CpG ubicada en la región promotora de B2M. F. Histograma que muestra la eficiencia de silenciamiento en el día 33 posterior a la electroporación del plásmido ATR basado en CRISPR/dCas9 (n=3; los datos se representan como media±SEM). G. Las células silenciadas con B2M de la Figura 2C (llamadas TALE B2Min en este panel), las células silenciadas con B2M clasificadas de la combinación ATR basada en CRISPR/dCas9 triple en la Figura 2f (llamadas TALE B2Min en este panel) y las células HeK- 293T salvajes (denominadas WT B2M+ en este panel) se expusieron o no a IFN-y y luego se analizaron para medir los niveles de expresión de B2M y OAS1. Histograma que muestra el cambio de plegamiento en los niveles de expresión de los genes B2M y OAS1 entre IFN-y y células no tratadas. La expresión del gen hipoxantina fosforribosiltansferasa 1 (HPRT1) se usó como normalizador (n = 3; los datos se representan como media±SEM). H. Diagramas de puntos de citometría de flujo representativos de las poblaciones de HEK-293T indicadas ya sea sin tratar (diagramas a la izquierda) o 4 días después del tratamiento con IFN-y (diagramas a la derecha). Los números indican la MFI B2M.
Figura 14
El silenciamiento de p2-microglobulina (B2M) está asociado con una importante edición epigenética del gen.
A. Diagramas de puntos de citometría de flujo representativos de células HEK-293T transfectadas con plásmidos que codifican para la combinación TALE:ATR triple, y la estrategia de clasificación celular utilizada para enriquecer las células doblemente positivas y doblemente negativas.
B. Análisis de ChIP realizado en células no tratadas (histograma superior) y silenciadas de (A) (histograma inferior) para detectar la presencia de ARN Polll. El histograma muestra el enriquecimiento de plegamientos en ARN Polll sobre la entrada en relación con la distancia de los ensayos de qPCR desde el sitio de inicio de la transcripción (TSS; establecido en 1) del gen (n = 3; los datos se representan como media±SEM). El locus AAVS1 transcrito ubicuamente se usó como control positivo (PC por sus siglas en inglés) para el enriquecimiento de ARN Polll, mientras que el gen CCR5 silenciado se usó como Control Negativo (NC por sus siglas en inglés). C. Análisis de bisulfito de Isla CpG de B2M en células no tratadas (UT por sus siglas en inglés) y silenciadas. Se indican el TSS del gen y la posición relativa del sitio de unión de los tres TALE:ATR (D;L;K). D. Histograma que muestra el porcentaje de células positivas B2M el día 7 tras el tratamiento con AZA (n=3; los datos se representan como media±SEM). E. Arriba: representación esquemática del locus B2M. Las islas CpG dentro de este locus se representan en verde. Abajo: histograma que muestra el cambio de plegamiento en los niveles de expresión génica de los genes indicados entre células silenciadas y no tratadas. Los genes con un valor de Ct >37 se excluyeron del análisis. El nivel de expresión relativo de cada gen se normalizó a HPRT y se representó como cambio de plegamiento en relación con las células no tratadas (calibrador).
Figura 15
El silenciamiento de p2-microglobulina (B2M) es eficaz en otra línea celular humana.
A. Esquemas (a la izquierda) de la estrategia de selección de genes basada en CRISPR/Cas9 utilizada para insertar el transgén tdTomato bajo el control del promotor B2M. Diagramas de puntos representativos de citometría de flujo de células K-562 antes y después de la selección del gen (parte superior e inferior derecha, respectivamente). B. Histograma que muestra la eficiencia de silenciamiento de B2M (es decir, células negativas para dtTomato) en el día 30 después de la electroporación con plásmidos que codifican para los ATR basados en TALE indicados que llevan ya sea los dominios efectores de tipo salvaje (WT por sus siglas en inglés) o de codones optimizados (n = 1). C. Gráfica que muestra las cinéticas del silenciamiento de B2M (medido como % de células negativas para dtTomato) de células K-562 electroporadas con plásmidos que codifican para los ATR basados en CRISPR/dCas9 indicados (n=1). D. Análisis representativos de citometría de flujo de: (i) células negativas para tdTomato clasificadas después de la transfección con ARNm transcritos in vitro que codifican para la combinación TALE:ATR triple (esquema izquierdo y diagrama de puntos); (ii) las células de (i) tras la transfección con un plásmido que codifica para dCas9:Tet1 junto con plásmidos para los ARNg de B2M (esquema izquierdo y diagrama de puntos) (n = 1).
Figura 16
El silenciamiento de la p2-microglobulina (B2M) es eficaz en los linfocitos T primarios.
A. Esquemas del flujo de trabajo experimental. B. Gráfico que muestra las cinéticas del silenciamiento de B2M en linfocitos T humanos electroporados con ARNm que codifican para los ATR basados en TALE triple (n = 1). C. Diagrama de puntos de citometría de flujo representativo de las poblaciones de linfocitos T indicadas 14 días después del tratamiento. Se muestran el porcentaje de células dentro de las puertas indicadas y el MFI de B2M.
Figura 17
El sitio de unión de ATR único es suficiente para el silenciamiento efectivo del gen endógeno tanto con Cas9 como con ATR basados en TALE.
A. Arriba: esquema del gen B2M que indica la ubicación relativa de los ARNg (leer flechas) seleccionados para dirigirse a la isla CpG de este gen. Abajo: histograma que muestra la eficiencia del silenciamiento de B2M (calculado como % de células negativas para tdTomato) 18 días después de la electroporación del plásmido ATR basado en CRISPR/dCas9 en la línea celular reportera K562 B2M_tdTomato (n = 1). B. Izquierda: esquema de unión de ATR basados en TALE en el ADN. En los recuadros grises se indican las condiciones en las que cada uno de los tres dominios de unión al ADN diferentes (formas #1 a #3; denominadas en la figura como Diresiduo variable repetido RDV por sus siglas en inglés) están equipados con los tres dominios efectores diferentes. En la parte inferior de este esquema se representa la condición en la que los tres RDV diferentes están equipados cada uno con un dominio efector diferente, como ya se muestra en la Figura 13A. Derecha: histograma que muestra el porcentaje de células negativas para tdTomato tras la transfección con plásmidos que codifican para las combinaciones ATR basadas en TALE indicadas (n = 3; los datos se representan como media±SEM).
Figura 18
La expresión transitoria de un DNMT3L no dirigido mejora y rescata la eficiencia de silenciamiento de los ATR basados en d Nm T3A KRAB en tipos de células refractarias.
A. Histograma que muestra el porcentaje de silenciamiento de eGFP de la línea celular reportera B-linfoblastoide LV-TetO7 a los 27 días después de la transfección con ARNm transcritos in vitro que codifican para los ATR basados en tetR indicados, los cuales se administraron junto con o sin tetR:D3L o con el ARNm codificante de DNMT3L de longitud completa no dirigido (n = 2; los datos se representan como media±rango). B. Esquemas del locus B2M que representa los sitios de unión y la disposición relativa de los ATR basados en TALE indicados. Tenga en cuenta que cada módulo puede estar unido por un par de ATR basados en TALE. Además, para cada Módulo, se puede intercambiar el orden relativo del dominio efector. Por ejemplo, para el Módulo 1, el sitio A puede estar unido por el ATR basado en KRAB, mientras que el sitio B por ATR basado en DNMT3A, o viceversa. C. Diagramas de puntos de citometría de flujo representativos del silenciamiento de B2M en células HEK-293T 21 días después de la transfección con plásmidos que codifican para los pares indicados de ATR basados en TALE (Módulo 1 o Módulo 2, que se muestran para los dos posibles órdenes relativos de unión de los ATR), los cuales se administraron solos (fila de puntos superior) o en combinación con el DNMT3L no dirigido (fila de puntos inferior). D. Histograma que muestra el porcentaje del silenciamiento de B2M de células HEK-293T a los 45 días posteriores a la transfección con plásmidos que codifican para los ATR basados en dCas9 indicados y los ARNg afines (como los que se muestran en la Figura 13E), los cuales se administraron ya sea solos o junto con el dCas9:D3L o con plásmido codificante de DNMT3L de longitud completa no dirigido (n = 3; los datos se representan como media±SEM).
Figura 19
La inactivación genética de DNMT3B aumenta la eficiencia de silenciamiento de la combinación de ATR triple en líneas celulares permisivas, mientras que la expresión transitoria de un DNMT3B no dirigido rescata la eficiencia de silenciamiento de la combinación DNMT3A KRAB en tipos de células refractarias.
A. Esquemas de los vectores lentivirales usados para expresar condicionalmente Cas9 tras la administración de doxiciclina (izquierda) o para expresar el ARNg de interés (derecha). B. Análisis de citometría de flujo representativo de: i) células K-562 positivas para eGFP tras la transducción con el vector lentiviral descrito en la Figura 5A y luego clasificadas cercanas a la pureza para la expresión de eGFP (diagrama izquierdo); ii) la línea celular de (i) después de haber sido transducida con la codificación LV para el Cas9 inducible y con la codificación LV para el DNMT3B-ARNg (ALNGFR se usó como marcador de transducción para el último LV; diagrama central). Tenga en cuenta que esta segunda línea celular luego se expuso a doxiciclina durante 7 días con el fin de activar la expresión de Cas9 e interrumpir la secuencia codificante del gen DNMT3B endógeno; iii) las células de (ii) tras la electroporación con plásmidos que codifican ya sea las combinaciones de ATR tetR:K tetR:D3A doble (gráfico superior derecho) o tetR:K tetR:D3A tetR:D3L triple (gráfico inferior derecho). C. Histograma que muestra el porcentaje de células silenciadas con eGFP el día 19 posterior a la interrupción genética del gen DNMT3B por el sistema CRISPR/inducibleCas9 (n=1). Estos números se obtuvieron calculando las eficiencias de silenciamiento en células positivas para ALNGFR (las células con alteración de DNMT3B; barras rojas) y negativas (células K-562 de tipo salvaje; barras azules). D. Histograma que muestra la eficiencia de silenciamiento (% de células negativas para eGFP) en la línea celular reportera TetO7 de B-linfoblastoide en el día 27 posterior a la transfección con ARNm que codifican para los ATR basados en tetR indicados, que se administraron junto con o sin el ARNm que codifica para la secuencia de DNMT3B de tipo salvaje no dirigida (los datos se muestran como la media de los dos experimentos).
Figura 20
Silenciamiento epigenético permanente de genes endógenos humanos adicionales (usando combinaciones de represores de transcripción artificial (ATR)).
A. Esquema (a la izquierda) del gen de linfoma de células B / leucemia 11A (BCL11A) que muestra las dos variantes de transcripción de este gen. Los recuadros discontinuos resaltan los elementos reguladores de genes. En particular, la región promotora/potenciadora del gen a nivel del sitio de inicio de la transcripción (recuadro amarillo) con un grupo de 4 islas CpG diferentes que varían en tamaño y número de residuos CpG, y el potenciador específico eritroide (recuadro rojo) responsable de la expresión restringida de linaje del gen dentro del segundo intrón del gen. Con el fin de estudiar las funciones tanto del promotor del gen como del potenciador específico de eritroides, el transgén tdTomato unido a la transcripción BCL11A a través de un péptido autocatalítico 2A fue dirigida dentro del tercer exón del gen. A la derecha, se muestra un diagrama de puntos representativo de células de B-linfoblastoides después de clasificar las células positivas para tdTomato. B. Histograma que muestra el porcentaje de células negativas para tdTomato en el día 32 después de la transfección con los ATR basados en dCas9 indicados y los grupos correspondientes de ARNg (es decir, 11 ARNg para CpG105; 8 ARNg para CpG31; 9 ARNg para CpG38; 10 ARNg para CpG115) dirigido a las islas CpG indicadas de Bc L11A (n=3; los datos se representan como media±SEM). Se usaron como controles células no tratadas o células transfectadas con los grupos de ARNg solos o con los ATR basados en dCas9 solos. C. La línea celular reportera de tdTomato se cotransfectó con plásmidos que codifican para ATR basados en dCas9, ya sea solos o en combinación doble o triple, y con plásmidos para un grupo de 9 ARNg dirigidas a CpG 38, o con plásmidos para un grupo de 8 ARNg para CpG 31. La eficiencia de silenciamiento se midió 2 semanas después de la transfección y se informa en el histograma (n=3; los datos se representan como media±SEM). D superior: Esquemas de los sitios de unión de ATR basados en TALE dirigidos a CpG 31 (arriba a la izquierda) o CpG 31 (arriba a la derecha) de la región promotora de BCL11A y su orientación relativa de unión en el ADN (+ indica la hebra de Watson, mientras que indica la hebra de Crick). Abajo: la línea celular reportera de dTomato se transfectó con plásmidos que codifican TALE:KRAB solo, o con las combinaciones indicadas de ATR basados en TALE triples, como se indica en el eje x de los histogramas. La eficiencia de silenciamiento se informa como porcentaje de células negativas para dTomato. El análisis se realizó el día 18 después de la transfección del plásmido (n=3; los datos se representan como media±SEM). E. superior: Esquema del gen Receptor de Interferón 1 (alfa, beta y omega) (IFNAR1). El recuadro verde resalta una isla CpG (se indica el número de residuos de CpG) al nivel de la región promotora/potenciadora del gen. Abajo: Histograma que muestra el cambio de plegamiento en el nivel de expresión del gen IFNAR1 entre células electroporadas con plásmidos que codifican un grupo de 13 ARNg contra la isla CpG IFNAR1 más los ATR dCas9:K dCas9:D3A dCas9:D3L (18 días después del tratamiento) y células no tratadas. El nivel de expresión relativo del gen IFNAR1 se normalizó a la expresión de DNMT1, y se representó como cambio de plegamientos en relación con las células no tratadas (calibrador) (n = 1). F superior: Esquema del gen del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular A (VEGFA por sus siglas en ingñés). El recuadro verde resalta una isla CpG (se indica el número de residuos de CpG) al nivel de la región promotora/potenciadora del gen. Abajo: Histograma que muestra el cambio de plegamiento en el nivel de expresión del gen VEGFa entre células electroporadas con plásmidos que codifican un grupo de 3 ARNg contra la isla CpG VEGFA más los ATR dCas9:K dCas9:D3A dCas9:D3L (14 días después del tratamiento) y células no tratadas. El nivel de expresión relativo del gen VEGFA se normalizó a la expresión de DNMT1, y se representó como cambio de plegamientos en relación con las células no tratadas (calibrador) (n = 1).
Descripción detallada de la invención
A continuación, se describirán varias características y realizaciones preferidas de la presente invención a modo de ejemplos no limitativos.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, bioquímica, biología molecular, microbiología e inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto en la materia. Tales técnicas se explican en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J., and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M., and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principies and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M., and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press.
La memoria proporciona un producto que comprende dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c):
(a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo;
(b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y
(c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c).
El producto de la memoria puede ser, por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende dos o más ATR, o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c): (a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo; (b) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y (c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, en mezcla, donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c). Alternativamente, el producto puede ser, por ejemplo, un kit que comprende una preparación de dos o más ATR, o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c): (a) un At R que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo; (b) un a Tr que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y (c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c) y, opcionalmente, instrucciones para la administración simultánea, secuencial o separada de los preparados a un sujeto que lo necesite.
Los represores de transcripción artificial (ATR) son agentes que actúan para reducir la transcripción de un gen diana. Los ATR pueden ser proteínas quiméricas que comprenden un dominio de unión a ADN operativamente unido a un dominio efector (por ejemplo, un dominio KRAB, un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o un dominio DNMT3L, u homólogos de los mismos). El dominio de unión a ADN permite la unión del ATR a una secuencia de ácido nucleico específica y puede diseñarse para unirse a una secuencia de ácido nucleico de elección. El dominio efector puede albergar una actividad catalítica que permite la represión de la transcripción del gen diana. Como alternativa, o adicionalmente, el dominio efector puede reclutar agentes adicionales dentro de la célula para el gen diana, lo que da como resultado la represión de la transcripción del gen diana.
Por "unido operativamente", debe entenderse que los componentes individuales están unidos entre sí de una manera que les permite llevar a cabo su función (por ejemplo, unirse al ADN, catalizar una reacción o reclutar agentes adicionales desde dentro de una célula) sustancialmente sin obstáculos. Por ejemplo, un dominio de unión a ADN puede conjugarse con un dominio efector, por ejemplo, para formar una proteína de fusión. Los métodos para conjugar polipéptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la provisión de una secuencia de aminoácidos conectora que conecta los polipéptidos. Los métodos alternativos de conjugación de polipéptidos conocidos en la técnica incluyen métodos de conjugación inducidos por luz y químicos (p. ej., usando agentes de reticulación químicos). Preferiblemente, el dominio de unión al ADN y el dominio efector (p. ej., el dominio KRAB, el dominio DNMT3A, Dn Mt 3B o DNMT1 o el dominio DNMT3L, o su homólogo) del ATR forman una proteína de fusión.
Dominios efectores
El término "dominio efector" debe entenderse que se refiere a la parte del ATR que proporciona el efecto silenciador en un gen diana, por ejemplo, al catalizar una reacción en el ADN o la cromatina (por ejemplo, la metilación del ADN), o reclutando un agente adicional dentro de una célula, lo que da como resultado la represión de la transcripción de un gen.
"Dominio" debe entenderse en este contexto en referencia a una parte del ATR que alberga una determinada función. El dominio puede ser un dominio individual (por ejemplo, un dominio catalítico) aislado de una proteína natural o puede ser una proteína natural entera de longitud completa. Dicho de otro modo, como dominio efector se puede utilizar ya sea la proteína de longitud completa o un fragmento funcional de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, "dominio KRAB" se refiere a la parte del ATR que comprende una secuencia de aminoácidos con la función de un dominio KRAB.
Las enzimas remodeladoras de cromatina que se sabe que están implicadas en el silenciamiento epigenético permanente de retrovirus endógenos (ERVs; Feschotte, C. et al. (2012) Nat. Rev. Genet. 13: 283-96; Leung, D.C. et al. (2012) Trends Biochem. Sci. 37: 127-33) puede proporcionar dominios efectores adecuados para su explotación en la presente invención.
La familia de la caja asociada a Krüppel que contiene proteínas con dedos de zinc (KRAB-ZFP; Huntley, S. et al. (2006) Genome Res. 16: 669-77) juega un papel importante en el silenciamiento de retrovirus endógenos. Estos factores de transcripción se unen a secuencias ERV específicas a través de su dominio de unión a ADN ZFP, mientras que reclutan la Proteína 1 asociada a KRAB (KAP1) con su dominio KRAB conservado. KAP1 a su vez se une a una gran cantidad de efectores que promueven la formación local de cromatina represiva (lyengar, S. et al. (2011) J. Biol. Chem. 286: 26267­ 76).
En el desarrollo embrionario temprano, se sabe que KAP1 recluta el dominio SET bifurcado 1 (SETDB1), una histona metiltransferasa que deposita una di y trimetilación de histona H3 lisina-9 (H3K9me2 y H3K9me3, respectivamente), dos marcas de histona asociadas con la represión transcripcional. Al mismo tiempo, KAP1 se une a la Proteína de heterocromatina 1 alfa (HP1a), que lee H3K9me2 y H3K9me3 y estabiliza el complejo que contiene KAP1. KAP1 también puede interactuar con otros silenciadores epigenéticos bien conocidos, como la histona desmetilasa 1 específica de lisina (LSD1) que inhibe la transcripción al eliminar la metilación de la histona H3 lisina-4, y el complejo de desacetilasa y remodelación de nucleosomas (NURD), que elimina los grupos acetilo de las histonas. Finalmente, el complejo que contiene KAP1 contribuye al reclutamiento de la ADN metiltransferasa 3A (DNMT3A) de novo, que metila las citosinas en los sitios CpG (Jones, P.A. (2012) Nat. Rev. Genet. 13: 484-92). Juntos, estos datos sugieren un modelo en el que, previo a la implantación del embrión, el complejo KAP1 asegura el silenciamiento de ERV a través de la acción concertada de las enzimas modificadoras de histonas y la metilación del ADN. Luego, después de la implantación, la metilación del ADN previamente dirigida por KRAB-ZFP a los ERV se estabiliza (Reik, W. (2007) Nature 447: 425-32), siendo heredado a través de la mitosis y la diferenciación de células somáticas sin la necesidad de la expresión continua de KRAB-ZFP específicos de ERV. A diferencia de las células madre embrionarias, el complejo KAP1 no puede inducir de manera eficiente la metilación del ADN en las células somáticas, y solo puede depositar la metilación H3K9. Sin embargo, esta marca de histona no se mantiene sin ser depositada continuamente en el sitio diana por las KRAB-ZFP (Hathaway, N.A. et al. (2012) Cell 149: 1447-60).
Por lo tanto, en vista de un enfoque de terapia epigenética basada en la expresión transitoria de ATR en células somáticas, se espera que la maquinaria KRAB-ZFPs/KAP1 no sea funcional si se emplea sola. Por otro lado, consideramos una estrategia preferible para coadministrar dos ATR distintos: uno basado en, por ejemplo, el dominio KRAB, el iniciador de la cascada epigenética que ocurre en los ERV en células madre embrionarias, y el otro basado en, por ejemplo, DNMT3A, el bloqueo final de este proceso. Este enfoque puede permitir recapitular en un gen diana preseleccionado los estados de cromatina represivos establecidos en los ERV en el embrión previo a la implantación y luego heredados permanentemente a lo largo del desarrollo de los mamíferos y la vida adulta.
Un ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender un dominio KRAB. Se conocen varios dominios KRAB en la familia de proteínas KRAB-ZFP. Por ejemplo, un ATR de la presente invención puede comprender el dominio KRAB de la proteína 10 con dedos de zinc humanos (ZNF10; Szulc, J. et al. (2006) Nat. Methods 3: 109-16):
ALSPQHSAVTQGSIIKNKEGMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQI VYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIK SSV
(SEQ ID NO: 1)
Otros ejemplos de dominios KRAB adecuados para usarse en la presente invención incluyen:
ITLEDVAVDFTWEEWQLLGAAQKDLYRDVMLENYSNLVAVGYQASKPDALFKLEQ GEQLWTIEDGIHSGACS
(el dominio KRAB de la proteína ZNF350; SEQ ID NO: 2)
VMFEEVSVCFTSEEWACLGPIQRALYWDVMLENYGNVTSLEWETMTENEEVTSKP SSSQRADSHKGTSKRLQG
(el dominio KRAB de la proteína ZNF197; SEQ ID NO: 3)
VSFKDVAVDFTQEEWQQLDPDEKITYRDVMLENYSHLVSVGYDTTKPNVIIKLEQGE EPWIMGGEFPCQHSP
(el dominio KRAB de la proteína RBAK; SEQ ID NO: 4)
VKIEDMAVSLILEEWGCQNLARRNLSRDNRQENYGSAFPQGGENRNENEESTSKA ETSEDSASRGETTGRSQKE
(el dominio KRAB de la proteína ZKSCAN1; SEQ ID NO: 5)
LTFKDVFVDFTLEEWQQLDSAQKNLYRDVMLENYSHLVSVGYLVAKPDVIFRLGPG EESWMADGGTPVRTCA
(el dominio KRAB de la proteína KRBOX4; SEQ ID NO: 6)
VTFEDVTLGFTPEEWGLLDLKQKSLYREVMLENYRNLVSVEHQLSKPDVVSQLEEA EDFWPVERGIPQDTIP
(el dominio KRAB de la proteína ZNF274; SEQ ID NO: 7)
Un ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender un dominio de ADN humano metiltransferasa 3A (DNMT3A; Law, J.A. et al. (2010) Nat. Rev. Genet. 11: 204-20), preferiblemente el dominio catalítico. Por ejemplo, un ATR de la presente invención puede comprender la secuencia:
TYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATG LLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDL VIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVV AMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLEL QECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPV HYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV
(SEQ ID NO: 8)
Las ADN metiltransferasas 3B y 1 (DNMT3B y DNMT1), de manera similar a DNMT3A, también son responsables del depósito y mantenimiento de la metilación del ADN, y también pueden usarse en un ATR de la presente invención. Por ejemplo, un ATR de la presente invención puede comprender cualquiera de las secuencias:
CHGVLRRRKDWNVRLQAFFTSDTGLEYEAPKLYPAIPAARRRPIRVLSLFDGIATGY ILVLKELGIKVGKYVASEVCEESIAVGTVKHEGNIKYVNDVRNITKKNIEEWGPFDLVI GGSPCNDLSNVNPARKGLYEGTGRLFFEFYHLLNYSRPKEGDDRPFFWMFENVVA MKVGDKRDISRFLECNPVMIDAIKVSAAHRARYFWGNLPGMNRPVIASKNDKLELQ DCLEYNRIAKLKKVQTITTKSNSIKQGKNQLFPVVMNGKEDVLWCTELERIFGFPVH YTDVSNMGRGARQKLLGRSWSVPVIRHLFAPLKDYFACE
(el dominio catalítico de DNMT3B humano; SEQ ID NO: 9)
MVAELISEEDLEFMKGDTRHLNGEEDAGGREDSILVNGACSDQSSDSPPILEAIRTP EIRGRRSSSRLSKREVSSLLSYTQDLTGDGDGEDGDGSDTPVMPKLFRETRTRSE SPAVRTRNNNSVSSRERHRPSPRSTRGRQGRNHVDESPVEFPATRSLRRRATASA GTPWPSPPSSYLTIDLTDDTEDTHGTPQSSSTPYARLAQDSQQGGMESPQVEADS GDGDSSEYQDGKEFGIGDLVWGKIKGFSWWPAMVVSWKATSKRQAMSGMRWVQ WFGDGKFSEVSADKLVALGLFSQHFNLATFNKLVSYRKAMYHALEKARVRAGKTFP SSPGDSLEDQLKPMLEWAHGGFKPTGIEGLKPNNTQPENKTRRRTADDSATSDYC PAPKRLKTNCYNNGKDRGDEDQSREQMASDVANNKSSLEDGCLSCGRKNPVSFH PLFEGGLCQTCRDRFLELFYMYDDDGYQSYCTVCCEGRELLLCSNTSCCRCFCVE CLEVLVGTGTAAEAKLQEPWSCYMCLPQRCHGVLRRRKDWNVRLQAFFTSDTGL EYEAPKLYPAIPAARRRPIRVLSLFDGIATGYLVLKELGIKVGKYVASEVCEESIAVGT VKHEGNIKYVNDVRNITKKNIEEWGPFDLVIGGSPCNDLSNVNPARKGLYEGTGRLF FEFYHLLNYSRPKEGDDRPFFWMFENVVAMKVGDKRDISRFLECNPVMIDAIKVSA AHRARYFWGNLPGMNRPVIASKNDKLELQDCLEYNRIAKLKKVQTITTKSNSIKQGK NQLFPVVMNGKEDVLWCTELERIFGFPVHYTDVSNMGRGARQKLLGRSWSVPVIR HLFAPLKDYFACE
(DNMT3B: SEQ ID NO: 36)
LRTLDVFSGCGGLSEGFHQAGISDTLWAIEMWDPAAQAFRLNNPGSTVFTEDCNIL LKLVMAGETTNSRGQRLPQKGDVEMLCGGPPCQGFSGMNRFNSRTYSKFKNSLV IVSFLSYCDYYRPRFFLLENVRNFVSFKRSMVLKLTLRCLVRMGYQCTFGVLQAGQY GVAQTRRRAIILAAAPGEKLPLFPEPLHVFAPRACQLSVVVDDKKFVSNITRLSSGPF
RTITVRDTMSDLPEVRNGASALEISYNGEPQSWFQRQLRGAQYQPILRDHICKDMS
ALVAARMRHIPLAPGSDWRDLPNIEVRLSDGTMARKLRYTHHDRKNGRSSSGALR GVCSCVEAGKACDPAARQFNTLIPWCLPHTGNRHNHWAGLYGRLEWDGFFSTTV TNPEPMGKQGRVLHPEQHRVVSVRECARSQGFPDTYRLFGNILDKHRQVGNAVPP PLAKAIGLEIKLCMLAKARESASAKIKEEEAAKD
(el dominio catalítico de DNMT1 humano; SEQ ID NO: 10)
Un ATR de la presente invención puede comprender, por ejemplo, ADN similar a (citosina-5)-metiltransferasa 3 (DNMT3L), una ADN metiltransferasa catalíticamente inactiva que activa DNMT3A uniéndose a su dominio catalítico. Por ejemplo, un ATR de la presente invención puede comprender la secuencia:
MAAIPALDPEAEPSMDVILVGSSELSSSVSPGTGRDLIAYEVKANQRNIEDICICCGS LQVHTQHPLFEGGICAPCKDKFLDALFLYDDDGYQSYCSICCSGETLLICGNPDCTR CYCFECVDSLVGPGTSGKVHAMSNWVCYLCLPSSRSGLLQRRRKWRSQLKAFYD RESENPLEMFETVPVWRRQPVRVLSLFEDIKKELTSLGFLESGSDPGQLKHVVDVT DTVRKDVEEWGPFDLVYGATPPLGHTCDRPPSWYLFQFHRLLQYARPKPGSPRPF FWMFVDNLVLNKEDLDVASRFLEMEPVTIPDVHGGSLQNAVRVWSNIPAIRSRHWA LVSEEELSLLAQNKQSSKLAAKWPTKLVKNCFLPLREYFKYFSTELTSSL
(SEQ ID NO: 11)
Un ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender un dominio SETDB1. Por ejemplo, un ATR de la presente invención puede comprender cualquiera de las secuencias:
MSSLPGCIGLDAATATVESEEIAELQQAVVEELGISMEELRHFIDEELEKMDCVQQR KKQLAELETWVIQKESEVAHVDQLFDDASRAVTNCESLVKDFYSKLGLQYRDSSSE DESSRPTEIIEIPDEDDDVLSIDSGDAGSRTPKDQKLREAMAALRKSAQDVQKFMDA VNKKSSSQDLHKGTLSQMSGELSKDGDLIVSMRILGKKRTKTWHKGTLIAIQTVGPG KKYKVKFDNKGKSLLSGNHIAYDYHPPADKLYVGSRVVAKYKDGNQVWLYAGIVAE TPNVKNKLRFLIFFDDGYASYVTQSELYPICRPLKKTWEDIEDISCRDFIEEYVTAYPN RPMVLLKSGQLIKTEWEGTWWKSRVEEVDGSLVRILFLDDKRCEWIYRGSTRLEPM FSMKTSSASALEKKQGQLRTRPNMGAVRSKGPVVQYTQDLTGTGTQFKPVEPPQP TAPPAPPFPPAPPLSPQAGDSDLESQLAQSRKQVAKKSTSFRPGSVGSGHSSPTS PALSENVSGGKPGINQTYRSPLGSTASAPAPSALPAPPAPPVFHGMLERAPAEPSY RAPMEKLFYLPHVCSYTCLSRVRPMRNEQYRGKNPLLVPLLYDFRRMTARRRVNR KMGFHVIYKTPCGLCLRTMQEIERYLFETGCDFLFLEMFCLDPYVLVDRKFQPYKPF YYILDITYGKEDVPLSCVNEIDTTPPPQVAYSKERIPGKGVFINTGPEFLVGCDCKDG CRDKSKCACHQLTIQATACTPGGQINPNSGYQYKRLEECLPTGVYECNKRCKCDP NMCTNRLVQHGLQVRLQLFKTQNKGWGIRCLDDIAKGSFVCIYAGKILTDDFADKE GLEMGDEYFANLDHIESVENFKEGYESDAPCSSDSSGVDLKDQEDGNSGTEDPEE SNDDSSDDNFCKDEDFSTSSVWRSYATRRQTRGQKENGLSETTSKDSHPPDLGP PHIPVPPSIPVGGCNPPSSEETPKNKVASWLSCNSVSEGGFADSDSHSSFKTNEGG EGRAGGSRMEAEKASTSGLGIKDEGDIKQAKKEDTDDRNKMSVVTESSRNYGYNP
SPVKPEGLRRPPSKTSMHQSRRLMASAQSNPDDVLTLSSSTESEGESGTSRKPTA GQTSATAVDSDDIQTISSGSEGDDFEDKKNMTGPMKRQVAVKSTRGFALKSTHGIA IKSTNMASVDKGESAPVRKNTRQFYDGEESCYIIDAKLEGNLGRYLNHSCSPNLFV QNVFVDTHDLRFPWVAFFASKRIRAGTELTWDYNYEVGSVEGKELLCCCGAIECRG RLL
(SEQ ID NO: 12)
VGCDCKDGCRDKSKCACHQLTIQATACTPGGQINPNSGYQYKRLEECLPTGVYEC NKRCKCDPNMCTNRLVQHGLQVRLQLFKTQNKGWGIRCLDDIAKGSFVCIYAGKIL TDDFADKEGLEMGDEYFANLDHIESVENFKEGYESDAPCSSDSSGVDLKDQEDGN SGTEDPEESNDDSSDDNFCKDEDFSTSSVWRSYATRRQTRGQKENGLSETTSKD SHPPDLGPPHIPVPPSIPVGGCNPPSSEETPKNKVASWLSCNSVSEGGFADSDSHS SFKTNEGGEGRAGGSRMEAEKASTSGLGIKDEGDIKQAKKEDTDDRNKMSVVTES SRNYGYNPSPVKPEGLRRPPSKTSMHQSRRLMASAQSNPDDVLTLSSSTESEGES GTSRKPTAGQTSATAVDSDDIQTISSGSEGDDFEDKKNMTGPMKRQVAVKSTRGF ALKSTHGIAIKSTNMASVDKGESAPVRKNTRQFYDGEESCYIIDAKLEGNLGRYLNH SCSPNLFVQNVFVDTHDLRFPWVAFFASKRIRAGTELTWDYNYEVGSVEGKELLCC CGAIECRGRLL
(el dominio catalítico de SETDB1 humano; SEQ ID NO: 13)
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13.
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, estar codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, o una proteína que tenga 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99 % o 100 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13.
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13.
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, estar codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, o una proteína que tenga al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99 % o 100 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID No : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13.
Dominios de unión al ADN
Los ATR de la invención comprenden un dominio de unión a ADN que se une a una secuencia de ácido nucleico específica y permite que el ATR se dirija a un sitio específico en un polinucleótido, por ejemplo, el genoma de una célula. El dominio de unión a ADN puede, por ejemplo, estar basado en proteínas, ADN, ARN o productos químicos.
Se conocen en la técnica una serie de dominios de unión a ADN adecuados, por ejemplo, dominios efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) y proteínas con dedos de zinc (ZFP) (Gaj, T. et al. (2013) Trends Biotechnol. 31: 397­ 405).
El dominio de unión a ADN del represor controlado por tetraciclina (tetR), por ejemplo, el dominio de unión a ADN E. coli tetR (Gossen, M. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 5547-51), también puede emplearse como un dominio de unión a ADN adecuado en los ATR de la presente invención. El sistema tetR es particularmente ventajoso para su uso en sistemas modelo, porque permite el control temporal de la unión de tetR a su secuencia de nucleótidos diana, el operón de tetraciclina (TetO), mediante la administración de doxiciclina (doxy). Esto permite investigar si los estados de cromatina inducidos por los ATR se pueden mantener después de la liberación de los ATR de su locus diana.
Además, se conocen en la técnica métodos para el diseño de dominios de unión a ADN para unirse a secuencias de ácido nucleico deseadas.
Las secuencias de ejemplo de dominios TALE adecuados incluyen:
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP EQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDG GKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTP EQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGG GKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQR LLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGL TPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQR LLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACL GGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVA (SEQ ID NO: 14), la cual se dirige
al sitio de unión: 5'-TACCCAGATTGGCCCCACT-3' (SEQ ID NO: 34):
y:
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG
ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP EQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGG GKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTP EQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNG GKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTP EQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGG KQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTP EQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRL LPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLG GRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVA (SEQ ID NO: 15), la cual se
dirige al sitio de unión: 5'-TACCTAGAGGAGAAAGGTT-3' (SEQ ID NO: 35)
Las secuencias de ejemplo de dominios TALE que se han diseñado para dirigirse a la región promotora del gen de p2 -microglobulina incluyen:
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNG GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
16) , la cual se dirige al sitio de unión: 5-TCTCTCCTACCCTCCCGCT-3' (SEQ ID NO:
17)
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS HDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
18) , la cual se dirige al sitio de unión: 5-TGGTCCTTCCTCTCCCGCT-3' (SEQ ID NO: 19)
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNG GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQAL
ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
20) , la cual se dirige al sitio de unión: 5-TCGCTCCGTGACTTCCCTT-3' (SEQ ID NO:
21)
Secuencias de ejemplo de dominios TALE que se han diseñado para dirigirse al gen BCL11A incluyen:
TALE BCL11A #1
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
37) , la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCAAAAGCCAGTCTCACC -3' (SEQ ID NO: 38)
TALE BCL11A #2
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQ
RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS HDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHL VALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
37), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCTCCCCGGGAATCGTTTT -3' (SEQ ID NO:
40)
TALE BCL11A #3
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
37), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCTCCCGCTGCACACTTG -3' (SEQ ID NO: 42)
TALE BCL11A #4
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIG GKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLT PDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQR LLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASN NGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIA SNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
37), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TAGTCATCCCCACAATAGT -3' (SEQ ID NO: 44)
TALE BCL11A #5
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG
ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLL PVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNG GKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLT PDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQR LLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVAL ACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 45), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCCGCTGCCTTTTGTGCC -3' (SEQ ID NO: 46)
TALE BCL11A #6
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 47), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCTCGCGCTTGCCCTCCC -3' (SEQ ID NO: 48)
TALE BCL11A #7
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNG GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 49), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCCCCGGCCCTAGCTCCT -3' (SEQ ID NO: 50)
TALE BCL11A #8
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 51), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCTGGTCCGCCCCCAGCA -3' (SEQ ID NO: 52)
TALE BCL11A #9
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNG GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIA SNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVV AIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 53), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TGCCGAGACCTCTTCTCGA -3' (SEQ ID NO: 54)
TALE BCL11A #10
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASNNGGKQALETVKRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQ
ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 55) , la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCGGCTTTGCAAAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 56)
TALE BCL11A #11
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIA SNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 57) , la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TGCAAAGCCGAGTTTCACC -3' (SEQ ID NO: 58)
TALE BCL11A #12
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIG GKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLT PDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQR LLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIA SNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 59), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TACAGTTGCCCTGCAAAAT -3' (SEQ ID NO: 60)
TALE BCL11A #13
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS
NGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALET VQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAI ASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQ DHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQAL ETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLV ALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 61), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCGCCCTGGGTACTTTCT -3' (SEQ ID NO: 62)
TALE BCL11A #14
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLL PVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDG GKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLT PDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQR LLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDH GLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETV QRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALA CLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 63), la cual se dirige al sitio de unión: 5-TCTCTTGTCCACAGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 64)
TALE BCL11A #15
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS HDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 65), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCTCCCGCTGACTGCGCCT -3' (SEQ ID NO: 66)
TALE BCL11A #16
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAH IVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL
LPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS NGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO: 67), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TCCCTTGCTGCCAAACTTT -3' (SEQ ID NO: 68)
TALE BCL11A #17
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQ HH EALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSG ARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTP DQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRL LPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHD GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGL TPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIAS HDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQD HGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALE TVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVA IASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLC QDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQ ALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDH LVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVAGSGGG (SEQ ID NO:
69), la cual se dirige al sitio de unión: 5'- TGGGCCCTCACGCCTTTCT -3' (SEQ ID
NO: 70)
Las meganucleasas (Silve, G. et al. (2011) Cur. Gene Ther. 11: 11-27) y sistemas CRISPR/Cas (Sander, J.D. et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 347-55) también pueden emplearse como dominios de unión a ADN adecuados en los ATR de la presente invención.
El sistema CRISPR/Cas es un sistema de unión de ADN guiado por ARN (van der Oost et al. (2014) Nat. Rev. Microbiol.
12: 479-92), donde el ARN guía (ARNg) puede seleccionarse para permitir que un ATR que comprende un dominio Cas9 se dirija a una secuencia específica. Por lo tanto, para emplear el sistema CRISPR/Cas como un dominio de unión a ADN en la presente invención, debe entenderse que un dominio efector ATR puede unirse operativamente a una endonucleasa Cas9. Preferiblemente, el dominio efector ATR está ligado operativamente a una endonucleasa Cas9 que ha sido inactivada de manera que sustancialmente no posee actividad de nucleasa. El ATR que comprende la endonucleasa Cas9 puede administrarse a una célula diana en combinación con uno o más ARN guía (ARNg). Los ARN guía están diseñados para dirigir el ATR a un gen diana de interés o un elemento regulador (p. ej., promotor, potenciador o sitios de corte y empalme) del gen diana. Los métodos para el diseño de ARNg son conocidos en la técnica. Además, se han desarrollado recientemente proteínas Cas9 totalmente ortogonales, así como complejos de ribonucleoproteínas Cas9/ARNg y modificaciones de la estructura/composición del ARNg para unirse a diferentes proteínas, para dirigirse simultánea y direccionalmente a diferentes dominios efectores a los sitios genómicos deseados de las células (Esvelt et al. (2013) Nat. Methods 10: 1116-21; Zetsche, B. et al. (2015) Cell pii: S0092-8674(15)01200-3; Dahlman, J.E. et al. (2015) Nat. Biotechnol. 2015 Oct 5. doi: 10.1038/nbt.3390. [Epub ahead of print]; Zalatan, J.G. et al. (2015) Cell 160: 339-50; Paix, A. et al. (2015) Genetics 201: 47-54), y son adecuados para su uso en la presente invención.
Por ejemplo, un ATR de la presente invención puede comprender la secuencia:
MGGRRVRWEVYISRALWLTREPTAYWLIEINTTHYRETQATGATMYPYDVPDYASP KKKRKVEASDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLV EEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRG HFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLEN LIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQI GDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQ QLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLL RKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARG NSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLL YEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKK IECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREM IEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGF ANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVD ELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVE NTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTR SDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKA GFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQF YKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEI GKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVL SMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSV LVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSL FELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFV EQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLG
APAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSPKKKRKVG
(Cas9 catalíticamente inactivo; SEQ ID NO: 22)
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 22 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 22.
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, estar codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de Se Q ID NO: 22, o una proteína que tiene 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 22 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 22.
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 22 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 22.
El ATR de la presente invención puede, por ejemplo, estar codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO: 22, o una proteína que tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 22 donde la secuencia de aminoácidos retiene sustancialmente la función natural de la proteína representada por SEQ ID NO: 22.
Secuencias de ejemplo de sitios diana genómicos reconocidos por ARN guía (ARNg) para su uso en la selección del gen p2-microglobulina incluyen:
ARNg #1: TATAAGTGGAGGCGTCGCGC (SEQ ID NO: 23)
ARNg #2: GCCCGAATGCTGTCAGCTTC (SEQ ID NO: 24)
ARNg #3: TGCGTCGCTGGCTTGGAGAC (SEQ ID NO: 25)
ARNg #4: CCAATCAGGACAAGGCCCGC (SEQ ID NO: 26)
ARNg #5: AGGGTAGGAGAGACTCACGC (SEQ ID NO: 27)
ARNg #6: GCGGGCCACCAAGGAGAACT (SEQ ID NO: 28)
ARNg #7: GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (SEQ ID NO: 29)
ARNg #8: CTCCCGCTCTGCACCCTCTG (SEQ ID NO: 30)
ARNg #9: TTTGGCCTACGGCGACGGGA (SEQ ID NO: 31)
ARNg #10: GGGGCAAGTAGCGCGCGTCC (SEQ ID NO: 32)
ARNg #11: TAGTCCAGGGCTGGATCTCG (SEQ ID NO: 33)
Los ejemplos de ARN guía (ARNg) para usar en el gen de p2-microglobulina incluyen:
ARNg #1: UAUAAGUGGAGGCGUCGCGC
ARNg #2: GCCCGAAUGCUGUCAGCUUC
ARNg #3: UGCGUCGCUGGCUUGGAGAC
ARNg #4: CCAAUCAGGACAAGGCCCGC
ARNg #5: AGGGUAGGAGAGACU CAC GC
ARNg #6: GCGGGCCACCAAGGAGAACU
ARNg #7: GCUACUCUCUCUUUCUGGCC
ARNg #8: CUCCCGCUCUGCACCCUCUG
ARNg #9: UUUGGCCUACGGCGACGGGA
ARNg #10: GGGGCAAGUAGCGCGCGUCC
ARNg #11: UAGUCCAGGGCUGGAUCUCG
Todos los ARNg anteriores pueden fusionarse con el armazón de ARNg con la siguiente secuencia:
GUU UAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUU UAAAUAAGGCIIAGUCCGUUAU U CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU.
Secuencias de ejemplo de ARNg que se dirigen al gen BCL11A incluyen:
ARNg #1 contra CpG 105: GCCUUUCUGCAGACGUUCCC (SEQ ID NO: 71)
ARNg #2 contra CpG 105: UGGGUGUGCGCCUUGGCCGG (SEQ ID NO: 72)
ARNg #3 contra CpG 105: CGGUGGUGAGAUGACCGCCU (SEQ ID NO: 73)
ARNg #4 contra CpG 105: GGAAUGUGCUCACGGCGCCG (SEQ ID NO: 74)
ARNg #5 contra CpG 105: GACUGCCCGCGCUUUGUCCU (SEQ ID NO: 75)
ARNg #6 contra CpG 105: CCAGAGUCUGGCCCCCGGAG (SEQ ID NO: 76)
ARNg #7 contra CpG 105: UCUGCGACCCUUAGGAGCCG (SEQ ID NO: 77)
ARNg #8 contra CpG 105: GAGCGCCCCGCCAAGCGACU (SEQ ID NO: 78)
ARNg #9 contra CpG 105: CAAGUCUCCAGGAGCCCGCG (SEQ ID NO: 79)
ARNg #10 contra CpG 105: CGCGGAAUCCAGCCUAAGUU (SEQ ID NO: 80)
ARNg #11 contra CpG 105: CCCGCUGCGGAGCUGUAACU (SEQ ID NO: 81)
ARNg #1 contra CpG 31: CGCUCCUGAGUCCGCGGAGU (SEQ ID NO: 82)
ARNg #2 contra CpG 31: CACGGCUCUCCCCGUCGCCG (SEQ ID NO: 83)
ARNg #3 contra CpG 31: CCGCCUUUUGUUCCGGCCAG (SEQ ID NO: 84)
ARNg #4 contra CpG 31: GCGCGAGGAGCCGGCACAAA (SEQ ID NO: 85)
ARNg #5 contra CpG 31: GCCACUUUCUCACUAUUGUG (SEQ ID NO: 86)
ARNg #6 contra CpG 31: GCUGCCUCUGAGGUUCGGUC (SEQ ID NO: 87)
ARNg #7 contra CpG 31: AAGGGCAGGAGCUAGGGCCG (SEQ ID NO: 88)
ARNg #8 contra CpG 31: GAGCCCGGACUGCUGCCUCC (SEQ ID NO: 89)
ARNg #1 contra CpG 38: GUUUACAAGCACCGCGUGUG (SEQ ID NO: 90)
ARNg #2 contra CpG 38: AACAGACAGAGGACCGAGCG (SEQ ID NO: 91)
ARNg #3 contra CpG 38: GGCGCCGGGUGGGCGAUCCG (SEQ ID NO: 92)
ARNg #4 contra CpG 38: GGUCGGGCAAGGCCCGGGCG (SEQ ID NO: 93)
ARNg #5 contra CpG 38: AAGAGGUCUCGGCAUUGUGC (SEQ ID NO: 94)
ARNg #6 contra CpG 38: GUUCCACAGCUUCGGGACCGCG (SEQ ID NO: 95)
ARNg #7 contra CpG 38: GAAAUCGGCUGGGUGAAACU (SEQ ID NO: 96)
ARNg #8 contra CpG 38: GCAGUGUCUCCGCGCCAGCC (SEQ ID NO: 97)
ARNg #9 contra CpG 38: CCUCCCCUCCCCUCCGCCCUGGG (SEQ ID NO: 98)
ARNg #1 contra CpG 115: UCCUCCUGUCCCGGGGUUAAAGG (SEQ ID NO: 99)
ARNg #2 contra CpG 115: CAUCUUUUGGGACACUCUAGGCUGG (SEQ ID NO: 100)
ARNg #3 contra CpG 115: AAGUCAGGCCCUUCUUCGGAAGG (SEQ ID NO: 101)
ARNg #4 contra CpG 115: GCAGCCUGGACUGCGCGCCCCGG (SEQ ID NO: 102)
ARNg #5 contra CpG 115: UGCCCGGCGAUUCUCGUCCG (SEQ ID NO: 103)
ARNg #6 contra CpG 115: UGAGCCAUUCGGUCGCUAGG (SEQ ID NO: 104)
ARNg #7 contra CpG 115: GGUGGUACUGAGGACCGGGA (SEQ ID NO: 105)
ARNg #8 contra CpG 115: AUUUUCUGGGUGCUCAGAGG (SEQ ID NO: 107)
ARNg #9 contra CpG 115: UGGUCUCAGCUCGCGCACGG (SEQ ID NO: 108)
ARNg #10 contra CpG 115: ACAAAGACAUACGGGGUGAU (SEQ ID NO: 109)
Secuencias de ejemplo de ARNg que se dirigen al gen IFNAR1 incluyen:
ARNg #1: AGGAACGGCGCGUGCGCGGA
ARNg #2: AAGAGGCGGCGCGUGCGTAG
ARNg #3: GGGCGGUG UGAC UUAGGAC G
ARNg #4: CCAGAUGAUGGUCGUCCUCC
ARNg #5: GACCCUAGUGCUCGUCGCCG
ARNg #6: UGGGUGUUGUCCGCAGCCGC
ARNg #7: ACGGGGGCGGCGAUGCUGUU
ARNg #8: GACCGAAGGUUUCCCAGACU
ARNg #9: GUCGGGUUUAAUCUUUGGCG
ARNg #10: CGCUCCCGAGGACCCGUACA
ARNg #11: CGGGUCCCACCCCCGUGAAA
ARNg #12: UCAAAC UCGACACAAAGCU C
ARNg #13: GCGGAGCCGCGGUACUUUCC
Secuencias de ejemplo de ARNg que se dirigen al gen VEGFA incluyen:
ARNg #1: GGCGCGCGCGCUAGGUGGGA
ARNg #2: AGAGAGGCUCACCGCCCACG
ARNg #3: GUACGUGCGGUGACUCCGGU
Todos los ARNg anteriores pueden fusionarse con el armazón de ARNg con la siguiente secuencia:
GUU UAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUU UAAAUAAGGCIIAGUCCGUUAU U CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU.
Represión de genes diana
Por "silenciar un gen diana", debe entenderse que la expresión del gen diana se reduce en una medida suficiente para lograr un efecto deseado. La expresión reducida puede ser suficiente para lograr un efecto terapéuticamente relevante, como la prevención o el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, un gen diana disfuncional que da lugar a una enfermedad se reprime preferiblemente hasta el punto de que no hay expresión del gen diana o el nivel residual de expresión del gen diana es lo suficientemente bajo como para mejorar o prevenir el estado de la enfermedad.
La expresión reducida puede ser suficiente para permitir que se realicen investigaciones sobre la función del gen mediante el estudio de células reducidas o que carecen de esa función.
Después de la administración de los ATR de la invención, el nivel de transcripción o expresión del gen diana puede reducirse, por ejemplo, en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99% o 100% en comparación con el nivel de transcripción o expresión en ausencia de ATR.
Preferiblemente, los ATR de la presente invención tienen un efecto sinérgico en el silenciamiento de un gen diana. Por lo tanto, los ATR de la presente invención pueden demostrar sinergia, por ejemplo, sinergia terapéutica, cuando se usan como se describe en el presente documento.
Por ejemplo, los ATR de la presente invención pueden dar como resultado un aumento sinérgico en la fracción de una población de células que comprende los ATR que presenta un gen diana silenciado, en comparación con una población de células que carece de los ATR (por ejemplo, comprende solo un ATR o comprende una combinación diferente de ATR). Alternativamente, o adicionalmente, los ATR de la presente invención pueden dar como resultado un aumento sinérgico en la duración del silenciamiento del gen diana en una población de células que comprende los ATR, en comparación con una población de células que carece de los ATR.
Preferiblemente, el silenciamiento del gen diana se produce después de la administración o expresión transitoria de los ATR de la presente invención a una célula o en ella.
Por "expresión transitoria", debe entenderse que la expresión del ATR no es estable durante un período de tiempo prolongado. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica el ATR no se integra en el genoma del huésped. Más específicamente, la expresión transitoria puede ser una expresión que se pierde sustancialmente dentro de las 20 semanas siguientes a la introducción del polinucleótido que codifica el ATR en la célula. Preferiblemente, la expresión se pierde sustancialmente dentro de las 12, 6, 4 o 2 semanas siguientes a la introducción del polinucleótido que codifica el ATR en la célula.
De manera similar, por "administración transitoria", debe entenderse que el ATR sustancialmente no permanece en la célula (es decir, la célula lo pierde sustancialmente) durante un período de tiempo prolongado. Más específicamente, la administración transitoria puede dar como resultado que la célula pierda sustancialmente el ATR dentro de las 20 semanas siguientes a la introducción del ATR en la célula. Preferiblemente, el ATR se pierde sustancialmente dentro de las 12, 6, 4 o 2 semanas siguientes a la introducción del ATR en la célula.
Los métodos para determinar la transcripción de un gen, por ejemplo, la diana de un ATR, son conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen PCR de transcripción inversa y enfoques basados en transferencia Northern. Además de los métodos para determinar la transcripción de un gen, en la técnica se conocen métodos para determinar la expresión de un gen. Métodos adicionales adecuados incluyen enfoques basados en Western blot o citometría de flujo.
El efecto de un ATR o combinación de ATR puede estudiarse comparando la transcripción o expresión del gen diana, por ejemplo, un gen endógeno a una célula, en presencia y ausencia de ATR o combinación de ATR.
El efecto de un ATR o una combinación de ATR también puede estudiarse utilizando un sistema modelo donde se controla la expresión de un gen reportero, por ejemplo, un gen que codifica una proteína fluorescente. Los métodos adecuados para controlar la expresión de dichos genes indicadores incluyen citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS por sus siglas en inglés) y microscopía de fluorescencia.
Por ejemplo, una población de células puede transfectarse con un vector que alberga un gen reportero. El vector puede construirse de manera que el gen reportero se exprese cuando el vector transfecta una célula. Los genes reporteroes adecuados incluyen genes que codifican proteínas fluorescentes, por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes, amarillas, cereza, cian o naranja. Además, la población de células puede transfectarse con vectores que codifican los ATR de interés. Posteriormente, el número de células que expresan y no expresan el gen reportero, así como el nivel de expresión del gen reportero, pueden cuantificarse usando una técnica adecuada, tal como FACS. A continuación, se puede comparar el nivel de expresión del gen reportero en presencia y ausencia de los ATR.
Preferiblemente, el gen diana se silencia permanentemente. Por "silenciamiento permanente" de un gen diana, se debe entender que la transcripción o expresión del gen diana se reduce (por ejemplo, se reduce en un 100 %) en comparación con el nivel de transcripción o expresión en ausencia de los ATR durante al menos 2 meses, 6 meses, 1 año, 2 años o toda la vida de la célula/organismo. Preferiblemente, un gen diana silenciado permanentemente permanece silenciado durante el resto de la vida de la célula.
Preferiblemente, el gen diana permanece silenciado en la progenie de la célula a la que se han administrado los ATR de la invención (es decir, la progenie de la célula hereda el silenciamiento del gen diana). Por ejemplo, los ATR de la invención pueden administrarse a una célula madre (p. ej., una célula madre hematopoyética) para silenciar un gen diana en una célula madre y también en la progenie de la célula madre, que puede incluir células que se han diferenciado de la célula madre.
Un gen diana puede silenciarse usando ATR que se unen al propio gen diana o a secuencias reguladoras para el gen diana (por ejemplo, secuencias promotoras o potenciadoras). Además, el corte y empalme alternativo de un gen diana puede alterarse usando ATR que se unen a los sitios de corte y empalme del propio gen diana. La capacidad de silenciar un gen diana o de modular sus variantes de corte y empalme mediante el uso de ATR que se unen a secuencias reguladoras no es posible con ciertas tecnologías de silenciamiento de genes y es una ventaja particular de la presente invención.
Uso en terapia
En otro aspecto, la presente invención proporciona las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR), polinucleótidos y células de la presente invención para uso en terapia.
El uso en terapia puede ser, por ejemplo, un uso para el tratamiento de p-talasemia o anemia de células falciformes. El uso en terapia puede ser, por ejemplo, un uso para la preparación de células trasplantables alogénicas "universalmente" (por ejemplo, mediante el silenciamiento de p2-microglobulina, B2M). Este uso puede aplicarse, por ejemplo, a la preparación de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas (HSPC por sus siglas en inglés), trasplante de órganos completos e inmunoterapia contra el cáncer.
Los ATR, o los polinucleótidos que los codifican, pueden administrarse simultáneamente, en combinación, secuencialmente o por separado (como parte de un régimen de dosificación).
Por "simultáneamente", debe entenderse que los dos agentes se administran simultáneamente, mientras que el término "en combinación" se usa para indicar que se administran, si no simultáneamente, entonces "secuencialmente" dentro de un marco de tiempo que ambos están disponibles para actuar terapéuticamente dentro del mismo marco de tiempo. Por lo tanto, la administración "secuencialmente" puede permitir que un agente se administre dentro de los 5 minutos, 10 minutos o unas horas después del otro, siempre que la vida media circulatoria del primer agente administrado sea tal que ambos estén presentes al mismo tiempo en cantidades terapéuticamente efectivas. El tiempo de demora entre la administración de los componentes variará dependiendo de la naturaleza exacta de los componentes, la interacción entre ellos y sus respectivas vidas medias.
A diferencia de "en combinación" o "secuencialmente", "por separado" debe entenderse que el espacio entre la administración de un agente y el otro agente es significativa, es decir, el primer agente administrado puede no estar presente en el torrente sanguíneo en una cantidad terapéuticamente eficaz cuando se administra el segundo agente. Gen diana
Preferiblemente, el gen diana da lugar a un efecto terapéutico cuando se silencia.
A modo de ejemplo, las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR) y polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para silenciar p2-microglobulina (B2M), BCL11A, KLF1, genes de globina, CCR5, CXCR4, genes TCR, miR126, PDL1, Ct La 4, COL1A1, secuencias virales y oncogenes.
El silenciamiento de los genes TCR, PDL1 y CTLA4 puede usarse para mejorar la eficacia de los enfoques de inmunoterapia contra el cáncer.
El silenciamiento de B2M se puede usar para generar HSPC alogénicas, células T o células mesenquimales para usar para trasplante.
El silenciamiento de miR126 puede usarse para expandir el conjunto de células madre hematopoyéticas más primitivas antes o después de su infusión.
A modo de ejemplo, las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR), polinucleótidos y células de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de, por ejemplo, la enfermedad de Huntington, ataxias espinocerebelosas, colagenopatías, hemoglobinopatías y enfermedades causadas por por expansiones de trinucleótidos. Además, las composiciones o kits de la presente invención se pueden usar en el tratamiento o prevención de ciertas enfermedades infecciosas (p. ej., infecciones por VIH con tropismo por CCR5) al inactivar ya sea los productos génicos asociados a patógenos de los genes o los genes del huésped que son necesarios para el ciclo de vida del patógeno. Además, o como alternativa, las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR), polinucleótidos y células de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO 1998/005635. Para facilitar la referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: cáncer, inflamación o enfermedad inflamatoria, trastornos dermatológicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuesta de fase aguda, caquexia, anorexia, infección aguda, infección por VIH, estados de shock, reacciones injerto contra el huésped, enfermedad autoinmune, lesión por reperfusión, meningitis, migraña y antitrombosis dependiente de aspirina; crecimiento tumoral, invasión y diseminación, angiogénesis, metástasis malignas, ascitis y derrame pleural maligno; isquemia cerebral, cardiopatía isquémica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis múltiple, neurodegeneración, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, apoplejía, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; psoriasis, dermatitis atópica, úlceras crónicas, epidermólisis ampollosa; ulceración corneal, retinopatía y cicatrización de heridas quirúrgicas; rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, anafilaxia; restenosis, insuficiencia cardiaca congestiva, endometriosis, aterosclerosis o endosclerosis.
Además, o como alternativa, las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR), polinucleótidos y células de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO 1998/007859. Para facilitar la referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: actividad de proliferación/diferenciación de citoquinas y células; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (p. ej., para tratar la inmunodeficiencia, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana; regulación del crecimiento de linfocitos; tratamiento del cáncer y muchas enfermedades autoinmunes, y para prevenir el rechazo de trasplantes o inducir inmunidad tumoral); regulación de la hematopoyesis, por ejemplo, tratamiento de enfermedades mieloides o linfoides; promover el crecimiento de hueso, cartílago, tendón, ligamento y tejido nervioso, por ejemplo, para curar heridas, tratamiento de quemaduras, úlceras y enfermedad periodontal y neurodegeneración; inhibición o activación de la hormona estimulante del folículo (modulación de la fertilidad); actividad quimiotáctica/quimiocinética (por ejemplo, para movilizar tipos de células específicas a sitios de lesión o infección); actividad hemostática y trombolítica (p. ej., para tratar la hemofilia y el accidente cerebrovascular); actividad antiinflamatoria (para tratar, por ejemplo, choque séptico o enfermedad de Crohn); como antimicrobianos; moduladores de, por ejemplo, el metabolismo o el comportamiento; como analgésicos; tratar trastornos de deficiencia específicos; en el tratamiento de, por ejemplo, psoriasis, en medicina humana o veterinaria.
Además, o como alternativa, las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR), polinucleótidos y células de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO 1998/009985. Para facilitar la referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: actividad inhibidora de macrófagos y/o inhibidora de células T y, por lo tanto, actividad antiinflamatoria; actividad antiinmune, es decir, efectos inhibidores contra una respuesta inmune celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada con inflamación; inhibir la capacidad de los macrófagos y las células T para adherirse a los componentes de la matriz extracelular y la fibronectina, así como la expresión del receptor fas regulado al alza en las células T; inhibir la reacción inmune no deseada y la inflamación, incluida la artritis, incluida la artritis reumatoide, la inflamación asociada con la hipersensibilidad, las reacciones alérgicas, el asma, el lupus eritematoso sistémico, las enfermedades del colágeno y otras enfermedades autoinmunes, la inflamación asociada con la aterosclerosis, la arteriosclerosis, la enfermedad cardíaca aterosclerótica, la lesión por reperfusión, el paro cardíaco , infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome de dificultad respiratoria u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada con úlcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tracto gastrointestinal, fibrosis hepática, cirrosis hepática u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epidídimo-orquitis, infertilidad, trauma orquidario u otras enfermedades testiculares inmunorelacionadas, disfunción placentaria, insuficiencia placentaria, aborto habitual, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecológicas relacionadas con el sistema inmunológico y/o inflamatorio, uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveoretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo, retinitis o edema macular cistoide, oftalmía simpática, escleritis, retinosis pigmentaria, componentes inmunitarios e inflamatorios de la enfermedad degenerativa del fondo de ojo, componentes inflamatorios de trauma ocular, inflamación ocular causada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo, después de operación de filtración de glaucoma, reacción inmunológica y/o inflamatoria frente a implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas relacionadas con la inmunidad e inflamación, inflamación asociada a enfermedades autoinmunes o condiciones o trastornos donde, tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en cualquier otro órgano, supresión inmune y/o de la inflamación sería beneficiosa, enfermedad de Parkinson, complicación y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, encefalopatía relacionada con el VIH del complejo de demencia relacionada con el SIDA, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades, afecciones o trastornos degenerativos del SNC , componentes inflamatorios de los accidentes cerebrovasculares, síndrome pospolio, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, cora de Sydenham, miastenia grave, pseudotumor cerebri, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de compresión del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorios de atrofias y distrofias musculares, y enfermedades, afecciones o trastornos relacionados con el sistema inmunitario e inflamatorio de los sistemas nervioso central y periférico, inflamación postraumática, shock séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de la cirugía, trasplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios del trasplante, complicaciones inflamatorias y/o inmunitarias y efectos secundarios de la terapia génica, por ejemplo, debido a una infección con un portador viral , o inflamación asociada con el SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmune humoral y/o celular, para tratar o mejorar enfermedades proliferativas de monocitos o leucocitos, por ejemplo, leucemia, reduciendo la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o tratamiento de rechazo de injertos en casos de trasplante de células, tejidos y órganos naturales o artificiales tales como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos, tejido de piel natural o artificial.
Polinucleótidos
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que el experto en la materia puede, usando técnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que los polipéptidos de la invención deben expresarse.
Los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de mejorar la actividad in vivo o vida útil de los polinucleótidos de la invención.
Los polinucleótidos tales como los polinucleótidos de ADN se pueden producir de forma recombinante, sintética o por cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También se pueden clonar mediante técnicas estándar.
Los polinucleótidos más largos generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esto implicará hacer un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean la secuencia diana que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizando una reacción en cadena de la polimerasa. en condiciones que provoquen la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción con un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados para que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector adecuado.
Proteínas
Como se usa en el presente documento, el término "proteína" incluye moléculas polipeptídicas de cadena sencilla, así como complejos polipeptídicos múltiples en los que los polipéptidos constituyentes individuales están unidos por medios covalentes o no covalentes. Como se usa en el presente documento, los términos "polipéptido" y "péptido" se refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y se unen mediante enlaces peptídicos o disulfuro.
Variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos
Además de las proteínas y nucleótidos específicos mencionados en el presente documento, la presente invención también abarca el uso de variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos de los mismos.
En el contexto de la presente invención, una variante de cualquier secuencia dada es una secuencia en la que la secuencia específica de residuos (ya sean residuos de aminoácidos o de ácidos nucleicos) se ha modificado de tal manera que el polipéptido o polinucleótido en cuestión conserva sustancialmente al menos una de sus funciones endógenas. Se puede obtener una secuencia variante por adición, deleción, sustitución, modificación, reemplazo y/o variación de al menos un resto presente en la proteína natural.
El término "derivado" como se usa en el presente documento, en relación con proteínas o polipéptidos de la presente invención incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, eliminación y/o adición de uno (o más) residuos de aminoácidos desde o hacia la secuencia siempre que la proteína o polipéptido resultante retenga sustancialmente al menos una de sus funciones endógenas.
El término "análogo" como se usa en el presente documento, en relación con polipéptidos o polinucleótidos incluye cualquier mimético, es decir, un compuesto químico que posee al menos una de las funciones endógenas de los polipéptidos o polinucleótidos que imita.
Típicamente, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, de 1, 2 o 3 a 10 o 20 sustituciones siempre que la secuencia modificada retenga sustancialmente la actividad o capacidad requerida. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos no naturales.
Las proteínas utilizadas en la presente invención también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Se pueden realizar sustituciones deliberadas de aminoácidos sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la función endógena. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilia similares incluyen asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina.
Se pueden realizar sustituciones conservadoras, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:
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El término "homólogo", como se usa en el presente documento, significa una entidad que tiene una cierta homología con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje. El término "homología" se puede equiparar con "identidad".
Una secuencia homóloga puede incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 50 %, 55 %, 65 %, 75 %, 85 % o 90 % idéntica, preferiblemente al menos 95 % o 97 % o 99 % idéntica a la secuencia objecto. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos en cuestión. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Una secuencia homóloga puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 50 %, 55 %, 65 %, 75 %, 85 % o 90 % idéntica, preferiblemente al menos 95 % o 97 % o 99 % idéntica a la secuencia objecto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud, en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Preferiblemente, la referencia a una secuencia que tiene un porcentaje de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO detalladas en el presente documento se refiere a una secuencia que tiene el porcentaje de identidad indicado en toda la longitud de la SEQ ID NO a la que se hace referencia.
Las comparaciones de homología se pueden realizar a simple vista o, más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología o identidad entre dos o más secuencias.
El porcentaje de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina alineación "sin espacios". Por lo general, dichas alineaciones sin espacios se realizan solo en un número relativamente corto de residuos.
Aunque este es un método muy simple y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, de lo contrario, en un par de secuencias idénticas, una inserción o eliminación en la secuencia de nucleótidos puede hacer que los siguientes codones se eliminen de la alineación, lo que potencialmente resulta en una gran reducción en el porcentaje de homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que tengan en cuenta las posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología global. Esto se logra insertando "espacios" en la alineación de secuencias para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por espacios" a cada espacio que se produce en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con la menor cantidad de espacios posible, lo que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas, obtendrán una puntuación más alta que una con muchos espacios. Normalmente se utilizan "costos de espacio afines" que cobran un costo relativamente alto por la existencia de un espacio y una penalización menor por cada residuo subsiguiente en el espacio. Este es el sistema de puntuación de espacios más utilizado. Por supuesto, las altas penalizaciones por espacios producirán alineaciones optimizadas con menos espacios. La mayoría de los programas de alineación permiten que se modifiquen las penalizaciones por espacio. Sin embargo, se prefiere usar los valores predeterminados cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por espacio predeterminada para las secuencias de aminoácidos es -12 para un espacio y -4 para cada extensión.
Por lo tanto, el cálculo del porcentaje máximo de homología requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por brecha. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE. UU.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Los ejemplos de otro programa informático que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limita a, el paquete BLAST (ver Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18), FAs Ta (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol.
403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas en línea y sin conexión (consulte Ausubel et al. (1999) ibid, páginas 7-58 to 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Otra herramienta, llamada BLAST 2 Sequences, también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (ver FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247­ 50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).
Aunque el porcentaje final de homología puede medirse en términos de identidad, el propio proceso de alineación normalmente no se basa en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, generalmente se usa una matriz de puntaje de similitud escalada que asigna puntajes a cada comparación por pares en función de la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas de GCG Wisconsin generalmente usan los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se proporciona (consulte el manual del usuario para obtener más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores predeterminados públicos para el paquete GCG o, en el caso de otro programa informático, la matriz predeterminada, como BLOSUM62.
Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el porcentaje de homología, preferiblemente el porcentaje de identidad de secuencia. El software normalmente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Los "fragmentos" también son variantes y el término normalmente se refiere a una región seleccionada del polipéptido o polinucleótido que es de interés funcionalmente o, por ejemplo, en un ensayo. Por lo tanto, "fragmento" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos que es una porción de un polipéptido o polinucleótido de longitud completa.
Dichas variantes se pueden preparar usando técnicas estándar de ADN recombinante tales como mutagénesis dirigida al sitio. Cuando se van a realizar inserciones, se puede realizar el ADN sintético que codifica la inserción junto con las regiones flanqueantes 5' y 3' correspondientes a la secuencia natural a cada lado del sitio de inserción. Las regiones flanqueantes contendrán sitios de restricción convenientes correspondientes a sitios en la secuencia natural de manera que la secuencia pueda cortarse con la enzima(s) apropiada y el ADN sintético ligado en el corte. A continuación, el ADN se expresa de acuerdo con la invención para producir la proteína codificada. Estos métodos son solo ilustrativos de las numerosas técnicas estándar conocidas en la técnica para la manipulación de secuencias de ADN y también se pueden usar otras técnicas conocidas.
Optimización de codones
Los polinucleótidos usados en la presente invención pueden tener codones optimizados. La optimización de codones se ha descrito previamente en los documentos WO 1999/41397 y WO 2001/79518. Diferentes células difieren en el uso de codones particulares. Este sesgo de codón corresponde a un sesgo en la abundancia relativa de ARNt particulares en el tipo de célula. Al alterar los codones en la secuencia para que se ajusten a la medida a la abundancia relativa de los ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresión. Del mismo modo, es posible disminuir la expresión eligiendo deliberadamente codones para los que se sabe que los ARNt correspondientes son raros en el tipo de célula particular. Por lo tanto, se encuentra disponible un grado adicional de control de traducción.
Vectores
Un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. De acuerdo con la presente invención, y a modo de ejemplo, algunos vectores utilizados en técnicas de ácidos nucleicos recombinantes permiten que entidades, como un segmento de ácido nucleico (por ejemplo, un segmento de ADN heterólogo, como un segmento de ADNc heterólogo), se transfieran a una célula diana. El vector puede servir para mantener el ácido nucleico heterólogo (ADN o ARN) dentro de la célula, facilitando la replicación del vector que comprende un segmento de ácido nucleico o facilitando la expresión de la proteína codificada por un segmento de ácido nucleico. Los vectores pueden ser virales o no virales. Los ejemplos de vectores utilizados en técnicas de ácidos nucleicos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, moléculas de ARNm (por ejemplo, ARNm transcritos in vitro), cromosomas, cromosomas artificiales y virus. El vector también puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico desnudo (por ejemplo, ADN). En su forma más simple, el vector mismo puede ser un nucleótido de interés.
Los vectores utilizados en la invención pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmidos, ARNm o virus y pueden incluir un promotor para la expresión de un polinucleótido y, opcionalmente, un regulador del promotor.
Los vectores que comprenden polinucleótidos usados en la invención se pueden introducir en las células usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como transfección, transformación y transducción. Varias de tales técnicas son conocidas en la técnica, por ejemplo, infección con vectores virales recombinantes, tales como vectores retrovirales, lentivirales (por ejemplo, lentivirales de integración defectuosa), adenovirales, virales adenoasociados, baculovirales y herpes simplex virales; inyección directa de ácidos nucleicos y transformación biolística.
Los sistemas de administración no virales incluyen, pero no se limitan a, métodos de transfección de ADN. Aquí, la transfección incluye un proceso que usa un vector no viral para administrar un gen a una célula diana. Los métodos de transfección típicos incluyen electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactada, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, transfección mediada por agentes catiónicos, anfífilos faciales catiónicos (CFA por sus siglas en inglés) (Nat. Biotechnol. (1996) 14: 556) y combinaciones de los mismos.
El término "transfección" debe entenderse que abarca la administración de polinucleótidos a las células tanto mediante suministro viral como no viral.
Transducción de proteínas
Como alternativa a la administración de polinucleótidos a las células, los represores de transcripción artificiales (ATR) de la presente invención pueden administrarse a las células mediante transducción de proteínas. La transducción de proteínas puede realizarse mediante la administración de vectores (Cai, Y. et al. (2014) Elife 3: e01911; Maetzig, T. et al. (2012) Curr. Gene Ther. 12: 389-409). La administración de vectores implica el diseño de partículas virales (p. ej., partículas lentivirales) para comprender las proteínas que se administrarán a una célula. En consecuencia, cuando las partículas víricas diseñadas entran en una célula como parte de su ciclo de vida natural, las proteínas comprendidas en las partículas se transportan al interior de la célula.
La transducción de proteínas puede ser a través de la administración de proteínas (Gaj, T. et al. (2012) Nat. Methods 9: 805-7). La administración de proteínas puede lograrse, por ejemplo, utilizando un vehículo (por ejemplo, liposomas) o incluso administrando la propia proteína directamente a una célula.
Composición farmacéutica
Las composiciones, kits, represores de transcripción artificial (ATR), polinucleótidos y células de la presente invención pueden formularse para su administración a sujetos con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, y contienen potencialmente albúmina de suero humano.
El manejo de los productos de terapia celular se realiza preferiblemente de acuerdo con los Estándares Internacionales FACT-JACIE para terapia celular.
Kit
La memoria también proporciona un Kit que comprende dos o más represores de transcripción artificiales (ATR), o polinucleótidos que los codifican, seleccionados de los grupos (a), (b) o (c): (a) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB o un homólogo del mismo; (b) un a Tr que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1 o su homólogo; y (c) un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L o un homólogo del mismo, donde al menos dos de los ATR se seleccionan de diferentes grupos (a), (b) o (c).
Los dos o más ATR, o los polinucleótidos que los codifican, pueden proporcionarse en recipientes adecuados.
El kit también puede incluir instrucciones de uso, por ejemplo, instrucciones para la administración simultánea, secuencial o separada de los dos o más ATR, o los polinucleótidos que los codifican, a un sujeto que los necesite.
Método de tratamiento
Debe apreciarse que todas las referencias aquí al tratamiento incluyen tratamiento curativo, paliativo y profiláctico; aunque en el contexto de la presente invención las referencias a la prevención se asocian más comúnmente con el tratamiento profiláctico. Se prefiere el tratamiento de mamíferos, particularmente humanos. Tanto los tratamientos humanos como los veterinarios están dentro del alcance de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1:
Con el objetivo de recapitular los mecanismos epigenéticos endógenos que silencian de forma permanente los retrovirus endógenos (ERV) durante el desarrollo, empleamos el dominio de la caja asociada a Krüppel (KRAB) de la proteína 10 con dedos de zinc humanos (ZNF10; Szulc, J. et al. (2006) Nat. Methods 3: 109-16) y el dominio catalítico de la metiltransferasa 3A de ADN humana (DNMT3A; Law, J.A. et al. (2010) Nat. Rev. Genet. 11: 204-20). Las secuencias de aminoácidos de estos dominios se muestran en la Tabla 1.
Para probar la actividad y la estabilidad del silenciamiento génico inducido por estos dos dominios efectores, usamos el sistema sensible a la tetraciclina (tet). Fusionamos por separado los dos dominios efectores con el dominio de unión a ADN del represor controlado por tetraciclina (tetR) de E. coli (Gossen, M. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 5547-51), generando los represores de transcripción artificial tetR:KRAB y tetR:DNMT3A (ATR, en lo sucesivo denominados tetR:K y tetR:D3A, respectivamente). La ventaja del sistema tetR es que permite el control temporal de la unión de tetR a su secuencia de nucleótidos diana, el operón de tetraciclina (TetO), mediante la administración de doxiciclina (doxy). Esto nos permite investigar si los estados de cromatina inducidos por los ATR se pueden mantener después de la liberación de los ATR de su locus diana.
Para evaluar rápidamente la actividad de los ATR, ideamos un modelo celular experimental en el que la actividad de los ATR puede seguirse fácilmente a lo largo del tiempo mediante análisis de citometría de flujo (Figura 1). Específicamente, generamos clones derivados de células individuales de células K562 diseñadas para contener dentro del primer intrón del gen PPP1R12C (Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9; también conocido como locus AAVS1) la inserción homocigótica de un casete de expresión de eGFP seguido de siete repeticiones en tándem de TetO (TetO7; Figura 1, esquema superior). La expresión del marcador eGFP en esta construcción reportera está impulsada por el promotor del gen de la fosfoglicerato quinasa humana (hPGK) expresado de forma ubicua. En lo sucesivo, esta línea celular reportera se denominará Línea celular AAVS1/TetO7.
Tras la expresión de los ATR, estas proteínas quiméricas se unen al elemento TetO7 a través de su dominio de unión al ADN tetR, lo que eventualmente conduce a la deposición de marcas epigenéticas represivas sobre la cromatina cercana (que se muestra como puntos rojos en el promotor hPGK;
Figura 1, esquema medio). Esto induce el silenciamiento transcripcional del casete. Tras la liberación condicional del ATR del elemento TetO7 mediante la administración de doxy, las marcas represivas pueden ya sea borrarse o propagarse a la progenie celular mediante la maquinaria celular endógena, lo que conduce a la reactivación transcripcional o al silenciamiento permanente de la expresión de eGFP, respectivamente (Figura 1, esquemas inferiores). Las principales ventajas en el uso de un modelo experimental de este tipo son: i) la actividad de los ATR se puede controlar rápida y fácilmente observando la expresión de eGFP mediante análisis de citometría de flujo; y ii) debido a que estos clones se diseñaron para contener la inserción homocigota del casete, podemos estudiar el impacto epigenético y transcripcional del silenciamiento en los genes en el sitio de integración y cerca del mismo sin el efecto de confusión del locus de tipo salvaje no modificado.
Para evaluar si los nuevos ATR eran biológicamente activos, administramos tetR:K y tetR:D3A en la línea celular AAVS1/TetO7 usando vectores lentivirales bidireccionales de integración estándar (Amendola, M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23: 108-16; Bid.LV; Figure 2A). La ventaja de estos vectores es que coexpresan constitutivamente los ATR y un gen marcador (ya sea el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad truncado -ALNGFR o el monomérico orange-mOrange-) del mismo promotor, lo que nos permite restringir nuestro análisis de silenciar exclusivamente a las células que expresan los ATRs.
En resumen, en virtud del entorno experimental descrito, podemos probar si la unión constitutiva de ATR candidatos al casete TetO7 puede depositar marcas epigenéticas represivas sobre la cromatina cercana e inducir el silenciamiento transcripcional del casete reportero. En este caso, la posterior liberación condicional de la unión a ATR por la administración de doxy nos permite discernir si las marcas represivas inducidas artificialmente se borran (lo que conduce a la reactivación transcripcional) o se propagan a la progenie celular por la maquinaria endógena (lo que indica que un se ha establecido un estado de silenciamiento epigenético heredado permanentemente).
Tras la caracterización molecular, la línea celular AAVS1/TetO7 se transdujo con ya sea Bid.LV-tetR:K o Bid.LVtetR:D3A en presencia o ausencia de doxy y luego se mantuvo en estas condiciones de cultivo hasta 200 días. Durante este tiempo, las células se analizaron periódicamente mediante citometría de flujo para medir el porcentaje de células negativas para eGFP (eGFP-) dentro de las poblaciones de células transducidas con Bid.LV. Como se muestra en la Figura 2B, la unión constitutiva de los ATR a la secuencia de TetO7 (condiciones doxi) eventualmente condujo al silenciamiento de eGFP en el 100% de las células transducidas, aunque con diferentes cinéticas entre los dos ATR. Específicamente, las células transducidas con tetR:K se convirtieron rápidamente en eGFP (Figura 2B, histograma izquierdo) y este efecto fue independiente del nivel de transducción (Figura 2C, transferencias de puntos de citometría de flujo a la izquierda). Por otro lado, el silenciamiento inducido por tetR:D3A fue significativamente más lento (Figura 2B, histograma derecho). En este caso, las células con el mayor nivel de expresión del gen marcador (probablemente aquellas con mayor número de copias del vector, VCN) fueron las primeras en ser silenciadas (Figura 2C, transferencias de puntos de citometría de flujo a la derecha), lo que indica el requisito de un cierto nivel de expresión del tetR:D3A para asegurar una represión más rápida. Es importante destacar que, en puntos de tiempo posteriores (~ 200 días), los análisis de citometría de flujo mostraron que la intensidad de fluorescencia media (MFI) de eGFP era superponible entre las células K562 silenciadas y de tipo salvaje (WT) (compare las MFI en la Figura 2C), lo que indica un silenciamiento completo de expresión de eGFP. Cuando doxy estuvo presente en los cultivos (condiciones doxy+), ninguna de las células transducidas silenció eGFP, lo que indica que la unión de ATR a la secuencia diana es necesaria para inducir el silenciamiento. En general, estos datos muestran que ambos ATR son funcionales, aunque inducen silenciamiento con diferentes cinéticas.
Luego evaluamos si la liberación de los ATR del locus daría como resultado la reactivación de eGFP. Con este objetivo, clasificamos las células eGFP en el día 21 después de la transducción de Bid.LVs y luego cultivamos estas células en presencia o ausencia de doxy durante 170 días adicionales. Curiosamente, la administración de doxy dio como resultado dos resultados opuestos según el ATR utilizado: el silenciamiento inducido por tetR:K fue rápida (dentro de los 15 días posteriores a la administración de doxy) y completamente borrado en toda la población celular (Figura 2D, histograma izquierdo y análisis representativos de citometría de flujo en la parte inferior); mientras que el silenciamiento inducido por tetR:D3A se mantuvo inalterado durante la duración del experimento (Figura 2D, histograma derecho y análisis de citometría de flujo representativos en la parte inferior). Esto indica claramente que, a diferencia de tetR:K, que tiene que estar continuamente activo en el locus para reprimirlo, tetR:D3A es capaz de establecer modificaciones epigenéticas represivas que pueden ser propagadas permanentemente por la maquinaria celular endógena incluso en ausencia del estímulo inicial. Esta diferencia puede explicarse por el hecho de que, en las células somáticas, la maquinaria basada en KRAB no es capaz de inducir de manera eficiente la metilación del ADN (que puede propagarse de manera estable) y deposita solo marcas epigenéticas reversibles, como la metilación H3K9 (Hathaway, N.A. et al. (2012) Cell 149: 1447­ 60).
En general, estos experimentos muestran claramente que incluso en ausencia de unión de tetR:D3A al elemento TetO7, el silenciamiento del casete reportero puede mantenerse inalterado a lo largo de varias generaciones de células. Por otro lado, la liberación condicional de tetR:K del elemento TetO7 conduce a una reactivación rápida y completa de la expresión de eGFP en células transducidas con tetR:K.
La metilación del ADN está implicada en el mantenimiento del silenciamiento permanente inducido por tetR:D3A
Para comprender si la metilación del ADN era necesaria para mantener el estado represivo inducido por tetR:D3A, las células eGFP de las condiciones de doxi en la Figura 2D se trataron con 5-Aza-2'-desoxicitidina (5-Aza) o vehículo (es decir, dimetilsulfóxido, DMSO) y luego se analiza mediante citometría de flujo para medir la expresión de eGFP. 5-Aza es un análogo de la citosina que tras incorporarse al ADN es reconocido por la metiltransferasa del ADN como sustrato, estableciendo un enlace covalente que, al contrario que la citosina, no se resuelve, bloqueando así la actividad de la DNMT (Issa, J.P. et al. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. Suppl. S6-7). Como se muestra en la Figura 2E, el tratamiento con 5-Aza resultó en la reactivación completa de la expresión de eGFP. Como era de esperar, el tratamiento con DMSO no alteró el silenciamiento de eGFP, con células eGFP+ en el cultivo representando células contaminantes del procedimiento de clasificación celular.
Al contrario de tetR:K, la represión inducida por tetR:D3A se limita al locus diana
Uno de los requisitos necesarios para un enfoque de terapia epigenética segura es que el silenciamiento no debe extenderse a los genes que rodean al gen diana deseado. Tenga en cuenta que la integración específica del sitio del casete reportero en el locus AAVS1 nos permite analizar fácilmente el impacto de nuestra plataforma de silenciamiento en la expresión de genes incrustados cerca del sitio de integración del casete reportero. Por lo tanto, comparamos los niveles de expresión de los genes en y cerca del sitio de integración AAVS1 (Figura 3A) entre las células eGFP de la Figura 2 y la línea celular no tratada AAVS1/TetO7.
Las células eGFP transducidas con tetR:K regularon significativamente a la baja todos los genes analizados (Figura 3B, histograma izquierdo; los datos se representan como media±SEM, n=3), lo que indica que este ATR deposita marcas represivas capaces de propagarse durante al menos 340 kb (~170 kb en ambos lados del sitio de unión ATR). Este hallazgo es consistente con estudios previos realizados en otras líneas de células somáticas y muestra que tetR:K puede silenciar promotores ubicados a varias decenas de kilobases de distancia de los sitios de unión de ATR a través de la propagación de largo alcance de H3K9me3 (Groner, A.C. et al. (2010) PLoS Genet. 6: e1000869). Es importante destacar que, al analizar las células eGFP transducidas con tetR:D3A y cultivadas con doxy, solo eGFP y, en menor medida, el gen PPP1R12C (que aloja el casete reportero en su primer intrón) mostró una regulación significativa a la baja (Figura 3B, histograma derecho; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0,0001 y **p<0,001, anova unidireccional y prueba posterior de Bonferroni), indicando una represión epigenética muy localizada.
En general, estos experimentos muestran que tetR:K induce una represión transcripcional rápida y robusta, capaz de propagación de largo alcance, que sin embargo es reversible tras la liberación de ATR del locus. Por otro lado, tetR:D3A induce el silenciamiento con una cinética más lenta, pero esta represión transcripcional está fuertemente confinada al locus diana y se mantiene permanentemente incluso en ausencia del estímulo inicial.
Actividad sinérgica de los ATR en su administración conjunta transitoria
Luego nos preguntamos si la administración conjunta transitoria de estos dos ATR era suficiente para inducir un silenciamiento epigenético rápido (como tetR:K) y permanente (como tetR:D3A). Para responder a esta pregunta transfectamos la línea celular AAVS1/TetO7 con plásmidos que codifican los ATR, ya sea solos o en combinación, y luego siguió la expresión de eGFP en estas células mediante análisis de citometría de flujo en el curso del tiempo. Los ejemplos representativos de estos experimentos se muestran en la Figura 4A, en la que informamos la cinética de silenciamiento del casete de expresión de eGFP (% de células eGFP; los datos se representan como media±SEM, n = 3) en células transfectadas con los plásmidos que codifican para los ATR indicados y los análisis de diagrama de puntos de citometría de flujo correspondientes realizados al final de los experimentos. A partir de estos análisis encontramos que: i) ninguna de las células transfectadas con el plásmido que codifica para tetR:K o tetR:D3A se volvió negativa para eGFP, aunque la administración transitoria de tetR:K se asoció con una onda corta de represión que rápidamente volvió a los niveles de control el día 10 después de la transfección (este último dato indica el depósito transitorio de H3K9me3 seguido de su desaparición concomitantemente con la dilución mitótica del plásmido que codifica tetR:K); y ii) notablemente, hasta el 20 % de las células cotransfectadas con los plásmidos que codifican tetR:K y tetR:D3A se silenciaron de forma estable. Estos datos revelaron un grado significativo de sinergia entre DNMT3A y los represores basados en KRAB, y representan la primera demostración de silenciamiento epigenético permanente sobre la administración conjunta transitoria de ATR.
Luego nos preguntamos si el silenciamiento inducido por la combinación tetR:K/tetR:D3A se limitaba al casete reportero o, en cambio, se extendía a lo largo del locus AAVS1, afectando así también a los genes cercanos al sitio de inserción del casete indicador. Para responder a esta pregunta, comparamos el perfil de expresión de los genes en y cerca del sitio de integración de AAVS1 (se muestra un esquema del locus en la Figura 3A) entre las poblaciones eGFP-negativas y eGFP-positivas clasificadas de las condiciones tratadas con tetR:K/tetR:D3A. En estos análisis, encontramos que el tratamiento resultó en un silenciamiento significativo solo del transgén reportero (Figura 4B; los datos se representan como media±SEM, n=3; **p<0,001, anova unidireccional y prueba posterior de Bonferroni). Estos datos importantes indican que la combinación tetR:K/tetR:D3A depositó un silenciamiento epigenético puntuado solo en el gen diana previsto, lo que destaca la seguridad de nuestro enfoque. Finalmente, el tratamiento de las células clasificadas negativas para eGFP de las condiciones tetR:K/tetR:D3A con 5-Aza reactivó por completo la expresión de eGFP en estas células (Figura 4C; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0,0001, prueba t no pareada de dos colas), lo que indica que la metilación del ADN juega un papel importante en el mantenimiento de estos estados epigenéticos de represión. También se encontraron resultados similares al transfectar las líneas celulares reporteras AAVSl/TetO7 con ARNm transcritos in vitro que codifican los ATR (Figura 4D). Sorprendentemente, el grado de silenciamiento medido en estos experimentos fue ~ 2 veces mayor que el medido en la transfección de plásmidos, lo que probablemente refleja la mejor tolerabilidad y los niveles de expresión más altos logrados por la transfección de ARNm. Los análisis de expresión génica mostraron que solo eGFP y el gen que aloja el casete reportero de eGFP (es decir, PPP1R12C) fueron regulados a la baja por el tratamiento (Figura 4E; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0,0001 y *p<0,01, anova unidireccional y prueba posterior de Bonferroni).
El silenciamiento con combinaciones ATR es independiente del locus y del tipo de célula
Habiendo demostrado que los dos ATR son capaces de inducir un silenciamiento permanente incluso cuando se administran transitoriamente a las células, luego nos preguntamos si este efecto era independiente del locus. De hecho, la eficacia de un enfoque de terapia epigenética podría depender del entorno de cromatina en el que está incrustado el locus diana, y teóricamente algunos loci son más refractarios a un mecanismo represivo específico que otros. Por ejemplo, alguna evidencia publicada sugiere que los loci enriquecidos en la metilación de H3K4 pueden protegerse de la metilación del ADN (Ooi, S.K. et al. (2007) Nature 448: 714-7). De acuerdo con esto, los factores epigenéticos endógenos naturalmente presentes en el locus diana o en sus regiones vecinas pueden contrarrestar la actividad de los ATR o restaurar el perfil epigenético fisiológico original del gen diana.
Para abordar esta pregunta, insertamos la secuencia de TetO7 cadena arriba del promotor hPGK de un casete de expresión de eGFP, y luego administramos esta construcción de forma semialeatoria en el genoma de las células K562 mediante transducción de vector lentiviral estándar (un esquema del provirus utilizado se muestra en la Figura 5A). Luego clasificamos para purificar las células que expresan eGFP (en lo sucesivo, la línea celular reportera TetO7.LV) y las transfectamos con ARNm transcritos in vitro que codifican para tetR:K o tetR:D3A, solos o en combinación. Los análisis de citometría de flujo de evolución temporal de estas células (Figura 5B; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0,0001, anova bidireccional y prueba posterior de Bonferroni) mostraron que: i) hasta el 32 % de las células transfectados con el ARNm que codifica para tetR:D3A se volvieron progresivamente negativos para eGFP, alcanzando una meseta de represión dos semanas después de la transfección; ii) hasta el 80 % de las células transfectadas con el plásmido que codifica tetR:K rápidamente se volvieron negativas para eGFP, pero poco después la mayoría de estas células reactivaron la expresión de eGFP (al contrario del experimento realizado con la línea celular AAVS1/TetO7, hasta el 19% de las células permanecieron negativas para eGFP); y iii) notablemente, hasta el 80 % de las células cotransfectadas con ARNm que codifican para tetR:K/tetR:D3A se silenciaron permanentemente. Curiosamente, incluso si medimos eficiencias comparables de silenciamiento entre las condiciones tetR:K y tetR:K/tetR:D3A a corto plazo después de la transfección, solo la combinación de los dos factores resultó en altos niveles de silenciamiento epigenético permanente. También se encontraron resultados similares en células U937 con inserción aleatoria del casete TetO7/eGFP (Figura 5C). Aquí, sin embargo, las eficiencias de silenciamiento para todas las condiciones de tratamiento fueron inferiores a las obtenidas en las células K562, aunque las eficiencias generales de transfección entre estos dos tipos de células fueron comparables. Inesperadamente, cuando realizamos un experimento similar en células B-linfoblastoides que contenían inserción aleatoria del casete TetO7/eGFP, se observó un silenciamiento estable a largo plazo solo en las condiciones tratadas con tetR:D3A (Figura 5D; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0,0001, anova de dos vías y prueba posterior de Bonferroni). Al contrario de los resultados de todos los experimentos anteriores, el silenciamiento inducido por la combinación de los ATR fue transitorio, mostrando una cinética superponible a la medida en las condiciones tratadas con tetR:K.
En general, estos resultados demuestran claramente que los dos ATR cooperan en el establecimiento de estados estables de represión epigenética también cuando sus sitios diana se distribuyen aleatoriamente a lo largo del genoma accesible del vector lentiviral de diferentes tipos de células, lo que indica que el mecanismo de silenciamiento podría ser independiente del locus. Sin embargo, estos estudios sugieren que varios factores intrínsecos a las células pueden modular la actividad in vivo de estas proteínas.
Identificación de nuevos ATR capaces de aumentar la eficiencia de silenciamiento de nuestra plataforma
Si bien los datos anteriores proporcionan la primera demostración de nuestro conocimiento del silenciamiento epigenético permanente sobre la expresión transitoria de ATR, también indican que varios factores intrínsecos de la célula pueden modular la actividad in vivo de estas proteínas. Por ejemplo, el menor nivel de silenciamiento observado en la línea celular U937 y la inesperada falta de actividad silenciadora de la combinación ATR que se encuentra en las células B-linfoblastoides podrían explicarse por la ausencia de uno o más cofactores involucrados en el proceso de silenciamiento o por la presencia de uno o más represores específicos de tipo celular. Por esta razón, la inclusión de otro ATR en nuestro cóctel podría ser útil para aumentar la eficiencia del silenciamiento de la combinación KRAB/DNMT3A, ya sea obviando la ausencia de un cofactor, o permitiendo el correcto funcionamiento del complejo represivo incluso cuando los ATR están presentes en bajas concentraciones. Por lo tanto, investigamos si cualquier dominio efector alternativo (o combinación de los mismos) de las enzimas remodeladoras de cromatina involucradas en el establecimiento de estados permanentes de represión epigenética podría usarse para aumentar la eficiencia de silenciamiento de nuestros ATR. Con este fin, al buscar en la literatura interactuadores conocidos de las proteínas DNMT3A o KRAB-ZFPs (Chen, T. et al. (2014) Nat. Rev. Genet.
15: 93-106) y, más ampliamente, para moléculas involucradas en el control transcripcional de la especificación y el desarrollo del destino celular (Schwartz, Y.B. et al. (2013) Nat. Rev. Genet. 14: 853-64), identificamos los siguientes candidatos:
• Histona-lisina N-metiltransferasa eucromática 2 (EHMT2, también conocida como G9a): una histona metiltransferasa que cataliza la dimetilación de la histona H3 lisina-9 y recluta varias histonas desacetilasas;
• Dominio SET 1 bifurcado (SETDB1): una histona metiltransferasa que deposita histona H3 lisina-9 diand trimetilación (dos marcas de histona asociadas con la represión transcripcional);
• Proteína homóloga cromobox 5 (CBX5, también conocida como HP1a): un componente de la heterocromatina que reconoce y se une a la histona H3K9me, lo que lleva a la represión epigenética;
• ADN similar a (citosina-5)-metiltransferasa 3 (DNMT3L): un ADN metiltransferasa catalíticamente inactivo que activa DNMT3A al unirse a su dominio catalítico;
• Potenciador del homólogo 2 de Zeste (EZH2): la subunidad catalítica del complejo polycomb represor 2, que metila la lisina-9 y la lisina-27 de la histona H3, creando así sitios de unión para el complejo polycomb canónico represor 1; • Supresor del homólogo 2 de la variedad 4-20 (SUV420H2): una histona metiltransferasa que trimetila específicamente la lisina-20 de la histona H4 (una marca de histona específica asociada con la represión transcripcional en la heterocromatina pericéntrica); y
• Proteína 1 potenciadora similar a la transducina (TLE1): un correpresor transcripcional asociado a la cromatina que se une e inhibe la actividad de varios factores de transcripción.
Generamos nuevos ATR que contenían los dominios efectores de estas proteínas y el dominio de unión al ADN de tetR. De ahora en adelante, los nuevos ATR se denominarán: tetR:SET (SETDB1); tetR:H (HP1-a); tetR:T (TLE1); tetR:GS o tetR:GL (según la longitud del dominio efector clonado de G9a); tetR:ES o tetR:EL (según la longitud del dominio efector clonado de EZH2); tetR:D3L (DNMT3L); y tetR:SUV (SUV420H2). Las secuencias de aminoácidos de los dominios efectores se enumeran en la Tabla 1.
Inicialmente, probamos la actividad de estos ATR novedosos en la línea celular reportera LV/TetO7 K562 mediante el uso de Bid.LV de integración estándar y encontramos que, entre los nuevos ATR, tetR:SET, tetR:GS y tetR:H indujeron eficientemente silenciamiento cuando se expresa de forma individual y estable (Figura 6A; los datos se representan como media±SEM, n=3). Sin embargo, ninguno de estos ATR alcanzó la eficiencia de silenciamiento de tetR:K y tetR:D3A. A diferencia de tetR:GS, tetR:GL no fue eficiente en este entorno experimental, lo que sugiere que la inclusión de repeticiones de anquirina en esta versión más larga de G9A estaba afectando negativamente la eficiencia del silenciamiento. La ineficiencia de tetR:T, tetR:SUV, tetR:ES y tetR:EL en este entorno experimental puede deberse a la inactividad biológica intrínseca de los dominios elegidos o a la ausencia en esta línea celular de interactuadores endógenos necesarios para la actividad de estas proteínas. Además, notamos una disminución en el porcentaje de células transducidas a lo largo del tiempo para algunos de los ATR utilizados (Figura 6B; los datos se representan como media±SEM, n=3). Estos datos indican una desventaja de crecimiento de las células que expresan de manera estable los ATR, lo que fortalece la justificación del uso de enfoques de administración transitoria para expresar de manera segura los ATR.
Luego evaluamos si el silenciamiento inducido por los nuevos ATR podría mantenerse incluso en ausencia de los ATR en el locus diana. Con este objetivo, 18 días después de la transducción de Bid.LV-ATR, tratamos las muestras con doxy y monitoreamos la expresión de eGFP mediante análisis de citometría de flujo (Figura 6C; los datos se representan como media±SEM, n = 3). Como se esperaba, el silenciamiento inducido por tetR:D3A se mantuvo después de la administración de doxy. Considerando las otras muestras, el silenciamiento se mantuvo solo en una fracción de las células originalmente reprimidas, lo cual varió entre los diferentes ATR. En particular, el silenciamiento inducido por tetR:K resultó ser más estable que los demás, manteniéndose hasta en un 45,8% de las células originalmente reprimidas. Esto contrasta con lo observado utilizando la línea celular reportera AAVS1TetO7 K562, en la que 7 días después de la administración de doxy, eGFP se reactivó completamente en todas las células transducidas. Estos datos indican un papel en el posicionamiento de TetO7 en relación con el promotor de hPGK y/o los entornos epigenéticos en los que se integra el casete podrían desempeñar un papel importante en el mantenimiento del estado represivo inducido por tetR:K.
Luego probamos la eficacia de los ATR tras su administración transitoria en la misma línea celular reportera LV/TetO7 K562. En particular, probamos los ATR individualmente (Figura 7A) o en combinación con tetR:D3A (Figura 7B), tetR:K (Figura 7C) o con la combinación tetR:K tetR:D3A (Figura 7D). Para apreciar mejor cualquier aumento eventual en la eficiencia de silenciamiento por encima de los niveles medidos en los controles positivos, estos experimentos se realizaron utilizando dosis no saturadas de los plásmidos que expresan ATR. tetR:T no se probó en este experimento, ya que no estaba disponible en el mismo esqueleto de plásmido como los otros ATR en el momento del experimento.
Al seguir la expresión de eGFP en las células tratadas a lo largo del tiempo mediante citometría de flujo, encontramos que cuando se expresan individualmente, ninguno de los ATR indujo eficientemente el silenciamiento, con tetR:K, tetR:D3A y tetR:SET reprimiendo solo hasta el 1 %. de la célula (Figura 7A; los datos se representan como media±SEM, n=3). Cuando se combinaron con tetR:D3A (Figura 7B; los datos se representan como media±SEM, n=3), todos los nuevos ATR otorgaron una ganancia en la eficiencia de silenciamiento. Sin embargo, solo se logró una eficiencia similar a la medida con la condición tetR:K+ tetR:D3A cuando se combinó tetR:D3A con ya sea tetR:SET o tetR:D3L. Además, cuando se coadministró con tetR:K (Figura 7C; los datos se representan como media±SEM, n=3), solo tetR:D3L entre los nuevos ATR sinergizó mejor que tetR:D3A. Finalmente, al agregar uno de los nuevos ATR a la combinación tetR:K tetR:D3A (Figura 7D; los datos se representan como media±SEM, n=3), la mayoría de los ATR aumentaron la eficiencia de silenciamiento, lo que indica una actividad biológica también para esos ATR. que no estaban funcionando cuando se administraron de forma estable, pero individualmente (Figura 6A). Es importante destacar que este experimento identificó la combinación tetR:K tetR:D3A tetR:D3L como la combinación de mejor rendimiento, mostrando una eficiencia sorprendente considerando las bajas dosis de plásmido empleadas en estos experimentos. Específicamente, la combinación tetR:K tetR:D3A tetR:D3L resultó en un aumento de 4,1 plegamientos en la eficiencia de silenciamiento en comparación con la combinación tetR:K tetR:D3A (Figura 7E; los datos se representan como media±SEM, n=3; *** p<0,0001, anova unidireccional y prueba posterior de Bonferroni). Dado el incremento en la eficiencia de silenciamiento en comparación con las combinaciones tetR:D3A tetR:D3L, tetR:K tetR:D3A y tetR:D3L tetR:K, los tres ATR juegan un papel relevante en el coctel tetR:K tetR:D3A tetR:D3L. Curiosamente, a partir de la evidencia de que tetR:SET pudo generar sinergia tanto con tetR:D3A como con tetR:D3A tetR:K (véase la Figura 7E), volvimos a cargar un experimento similar con dosis de ATR aún más bajas y descubrimos que tetR:SET era también capaz de generar una sinergia significativa con la combinación tetR:D3A tetR:D3L (Figura 7F; tetR:D3L se muestra como tetR:L). Estos datos indican que la combinación tetR:D3A tetR:D3L tetR:SET puede ser una alternativa válida a la combinación tetR:D3A tetR:D3L tetR:K, incluso con una menor eficiencia de silenciamiento.
La inclusión de tetR:D3L en la combinación tetR:K tetR:D3A permite rescatar la eficiencia de silenciamiento en tipos de células refractarias
Luego nos preguntamos si el uso de la combinación tetR:K tetR:D3A tetR:D3L fue capaz de superar el bloqueo observado en las células B-linfoblastoides (ver la Figura 5D). Para abordar esta pregunta, la línea celular de B-linfoblastoides reporteros TetO7.LV se transfectó con ARNm transcritos in vitro que codifican para los tres ATR, ya sea solos o en diferentes combinaciones (Figura 7G; tetR:D3A mostrado como tetR:D; tetR:D3L mostrado como tetR:L; los datos están representados como media±SEM, n=3). Como se esperaba de experimentos anteriores, la administración conjunta de tetR:K tetR:D3A dio como resultado una onda transitoria de silenciamiento que se borró por completo después de la dilución de los ARNm transfectados, lo que resultó en la ausencia de células negativas para eGFP. Sin embargo, tanto tetR:D3A tetR:D3L como tetR:D3L tetR:K fueron capaces de inducir altos niveles de silenciamiento (50 % y 60 %, respectivamente). Estos niveles son sustancialmente más altos que los observados en condiciones en las que los ATR se administraron solos (14 % para tetR:D3A y niveles comparables a las muestras no tratadas para células transfectadas con tetR:K y tetR:D3L). Sorprendentemente, cuando los tres ATR se administraron juntos, la mayoría de las células se volvieron negativas para eGFP (hasta un 80 %), lo que demuestra claramente que la adición de un solo factor a la mezcla tetR:D3A/tetR:K fue suficiente para restaurar la inducción del silenciamiento y mantenimiento en líneas celulares previamente refractarias. Con base en estos resultados prometedores, también nos preguntamos si nuestra plataforma de silenciamiento podría ser efectiva en tipos de células experimentalmente relevantes derivados de otros organismos, como ratones.
Para responder a esta pregunta, primero transducimos la línea celular murina NIH/3T3 con TetO7.LV, clasificamos las células para obtener una población pura positiva para eGFP (que alberga en promedio 1 copia del vector por célula), y finalmente los transfectamos con ARNm que codifican los ATR basados en tetR, los cuales se administraron individualmente o en combinación. Sorprendentemente, el análisis de citometría de flujo de las células tratadas mostró un silenciamiento eficaz y a largo plazo también en este modelo celular: una sola administración de tetR:D3A tetR:D3L o de la combinación de ATR triple condujo a una eficiencia de silenciamiento génico del 45 % o del 80 % respectivamente (Figura 7H). Por otro lado, la combinación tetR:D3A tetR:K no funcionó, como se observó previamente en células B-linfoblastoide.
Silenciamiento efectivo mediante la administración conjunta transitoria de ATR equipados con dominios de unión a ADN personalizados
El objetivo principal de este proyecto fue desarrollar una plataforma de terapia epigenética que se puede utilizar para silenciar la expresión de cualquier gen de interés. Aunque ya hemos identificado dominios efectores que cuando se fusionan con el tetR cooperan sinérgicamente para silenciar al promotor cercano al elemento TetO7, la naturaleza artificial del sistema procariótico TetO7/tetR dificulta la aplicación terapéutica de esta tecnología. Además, el elemento TetO7 puede adaptarse con alta avidez a 7 dímeros tetR, lo que conduce a una homo o heterodimerización estocástica de los ATR en este elemento. Esta ocurrencia puede favorecer interacciones positivas mutuas entre represores. Por estas razones, quedan varias preguntas por abordar para traducir los hallazgos obtenidos con el sistema TetO7/tetR a una situación en la que cada uno de los ATR tiene un sitio de unión único pero independiente en el gen diana. En particular, se desconoce si un elemento (definido como una secuencia genómica dada que contiene el sitio de unión para cada uno de los represores, en lo sucesivo denominado "Elemento silenciador") sería suficiente para silenciar un gen de interés. Además, el orden relativo y la orientación en la que se disponen los dos represores en el elemento silenciador, y la distancia entre sus sitios de unión, podrían representar determinantes importantes para la actividad del complejo represivo. Cabe señalar que es imposible definir estos determinantes en función de la literatura o probándolos empíricamente en un gen endógeno, ya que requeriría diseñar varios ATR diferentes, cada uno con su propio sitio de unión y afinidad.
Para abordar estas preguntas, desarrollamos un modelo celular diseñado ad hoc que informa fácilmente la actividad silenciadora de los ATR que contienen un efector similar al activador de la transcripción (TALE; Gaj, T. et al. (2013) Trends Biotechnol. 31: 397-405) dominios de unión a ADN. En este conjunto de experimentos, probamos inicialmente los ATR correspondientes a la combinación tetR:K tetR:D3A.
Brevemente, fusionamos los dominios KRAB y DNMT3A con los dominios de unión a ADN de dos TALE que reconocen dos sitios diana genómicos diferentes con alta eficiencia (las secuencias de aminoácidos de los dos TALE se enumeran en la Tabla 2). Usando este enfoque, obtuvimos dos proteínas de fusión TALE:KRAB (en lo sucesivo, TALE:K) y dos proteínas de fusión TALE:DNMT3A (en lo sucesivo, TALE:D3A) correspondientes a cada uno de los dos sitios diana genómicos. Paralelamente, insertamos los dos sitios diana de TALE, espaciados por secuencias de nucleótidos progresivamente más largas (5, 10, 15, 20, 25 y 30 pb), corriente arriba del promotor hPGK de un casete de expresión de eGFP, y luego administramos estas construcciones de manera semialeatoria en el genoma de la línea celular K562 por transducción de vector lentiviral estándar. Es de destacar que los sitios de destino para los dos TALE se colocaron de tal manera que la unión de los represores TALE se produce en una configuración de cabeza a cola (H-T). En la Figura 8A se muestra una representación esquemática de estos vectores (a la izquierda se muestra el vector que contiene los sitios de unión para la configuración TALE:K^TALE:D3A; a la derecha se muestra el vector que contiene los sitios de unión para la configuración TALE:D3A ^ TALE:K. Luego clasificamos para purificar las células que expresan eGFP y transfectamos estas líneas con ARNm transcritos in vitro que codifican para TALE:K o TALE:D3A, solos o en combinación. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo de evolución temporal para medir el alcance y la duración del silenciamiento. Los ejemplos representativos de estos análisis se pueden ver en la Figura 8, en la que informamos las eficiencias de silenciamiento (% de células negativas para eGFP) de los ATR indicados con respecto a la longitud de los espaciadores (Figura 8B; los datos se representan como media±SEM, n =3), y la cinética de silenciamiento del casete de expresión de eGFP medido en la línea celular con el espaciador de 25 pb (Figura 8C; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0,0001 y **p< 0,001, anova bidireccional y prueba posterior de Bonferroni).
A partir de estos experimentos encontramos que: i) la administración conjunta de TALE:D3A y TALE:K dio como resultado el silenciamiento completo del casete de expresión de eGFP en hasta el 25 % de las células tratadas; ii) el orden relativo de unión de los dos ATR en el locus diana impactó en la eficiencia general de silenciamiento, con la configuración TALE:D3A^TALE:K funcionando de 2,2 a 5,4 plegamientos mejor que la opuesta; iii) entre las longitudes de espaciador probadas, las de 25 y 30 pb se desempeñaron mejor que las otras; y iv) la administración individual de TALE:K o t A l E:D3A dio como resultado un silenciamiento bajo (3 %) o nulo del casete de expresión de eGFP, respectivamente.
Teniendo en cuenta el impacto significativo de las variables estructurales (como la longitud del espaciador y el orden relativo de unión de los dos ATR en la secuencia diana) en la eficiencia de silenciamiento, luego nos preguntamos si pasar a una configuración cabeza a cabeza (H-H) en la que los Ctermini de los dos ATR se enfrentan podría ser beneficiosa para nuestra estrategia. Para pasar de la configuración de cabeza a cola a la de cabeza a cabeza, a partir del casete reportero descrito en la Figura 8, mantuvimos el sitio de unión 5' TALE inalterado, mientras cambiamos la orientación del sitio de unión 3' TALE. Este simple cambio nos permitió utilizar los mismos cuatro ATR empleados en los experimentos anteriores. También generamos seis casetes de reportero eGFP que difieren en la longitud del espaciador entre los dos sitios diana TALE (5, 10, 15, 20, 25 y 30 pb) y administramos estas construcciones a las células K562 a través de la transducción del vector lentiviral (un esquema de estos vectores es se muestra en la Figura 9A). A continuación, las células transducidas se clasificaron para obtener poblaciones de eGFP+ puras y se sometieron a electroporación con plásmidos que codifican TALE:K o TALE:D3A, solos o en combinación. A continuación, las células tratadas se analizaron mediante citometría de flujo de evolución temporal para medir el alcance y la duración del silenciamiento. Para comparar estrictamente la configuración de cabeza a cabeza con la de cabeza a cola, incluimos la línea celular que contiene el espaciador de 25 pb y la configuración H-T, TALE:D3A^TALE:K descrita en la Figura 8C en este experimento. Los resultados de estos experimentos indicaron que: i) la administración conjunta de TALE:K y TALE:D3A resultó en una sinergia evidente incluso en la configuración H-H, lo que permitió el silenciamiento a largo plazo del casete reportero en hasta el 34,7 % de las células tratadas (Figura 9B, los datos se representan como media±SEM, n=3); ii) la administración individual de TALE:K o TALE:D3A resultó en un silenciamiento permanente bajo (hasta 7,1%) o ausente, respectivamente; y iii) el orden relativo de unión de los dos ATR en el locus diana impactó en la eficiencia general de silenciamiento, con la configuración TALE:D3A^TALE:K realizando de 1,3 a 1,7 plegamientos mejor que la opuesta (Figura 9C; los datos son representada como media±SEM, n=3). Sin embargo, el orden relativo de unión parece tener un mayor impacto en la eficiencia de silenciamiento en la configuración de cabeza a cola que en la configuración de cabeza a cabeza (compare la Figura 8 con la Figura 9). Una tendencia en forma de campana parece describir el impacto de las longitudes de espaciador probadas en la eficiencia de silenciamiento de la configuración H-H, con el espaciador de 15 pb funcionando mejor tanto en la configuración TALE:D3A^TALE:K como en la configuración TALE:K^t A l E:D3A (incluso superando el espaciador de 25 pb en el experimento de cabeza a cola). Sin embargo, la diferencia entre la configuración cabeza a cabeza de 15 pb y la configuración cabeza a cola de 25 pb fue mínima (34,7 % frente a 26,8 % de células eGFP a largo plazo, respectivamente, es decir, un aumento de 1,3 plegamientos).
En general, estos datos muestran por primera vez, según nuestro conocimiento, la viabilidad de lograr el silenciamiento epigenético permanente de un gen diana deseado tras la administración transitoria de una combinación de ATR equipados con dominios de unión a ADN personalizados. Además, a partir de estos estudios pudimos definir reglas para la selección de sitios de unión de TALE que pueden usarse para la identificación de elementos silenciadores en un gen diana deseado. Al apuntar a múltiples elementos silenciadores en la secuencia reguladora de este gen, deberíamos poder aumentar la eficiencia del silenciamiento.
En paralelo a estos estudios, desarrollamos ATR bipartitos acoplando dos dominios efectores en el mismo TALE, es decir, el dominio KRAB en el N terminal y el dominio DNMT3A en el C terminal de los TALE (Figura 10A). Incluso si la transfección transitoria de las proteínas individuales no fue suficiente para inducir niveles apreciables de silenciamiento génico, su combinación fue suficiente para silenciar eGFP en hasta el 7 % de las células tratadas (Figura 10B; los datos se representan como media±SEM, n=3). Las ventajas proporcionadas por este enfoque son que se pueden administrar múltiples dominios efectores al mismo sitio diana mientras se reduce la cantidad de ARNm diferentes necesarios para producir y transfectar.
Silenciamiento epigenético permanente en HSPC humanas mediante el uso de diferentes combinaciones de ATR
Las células madre hematopoyéticas primarias (HSPC) son un tipo de célula humana clínicamente relevante para la mayoría de las aplicaciones de terapia génica ex-vivo (Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158; Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151; Aiuti, A. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 360, 447-458; Cartier, N. et al. (2009) Science 326: 818-23; Hacein-Bey-Abina, S. et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 355-64; Cavazzana-Calvo, M. et al. (2010) Nature 467: 318-22) debido a su capacidad de auto-renovación de por vida y potencial de diferenciación multilinaje. La diferenciación de HSPC se acompaña de una remodelación global de la cromatina, lo que da como resultado una transición progresiva de una configuración de cromatina abierta a una más compacta y represiva. Como tal, este tipo de célula representa el modelo más apropiado y estricto para probar la eficacia y demostrar la estabilidad de nuestra plataforma epigenética. Para evaluar si la administración de varias combinaciones de ATR fue suficiente para inducir niveles significativos de silenciamiento en HSPC humanas, transducimos células CD34+derivadas de sangre de cordón umbilical humano de individuos sanos con el reportador TetO7/eGFP LV descrito en la figura 5A. Luego transfectamos las células con ARNm transcritos in vitro que codifican tetR:D3A, tetR:K o tetR:D3L, solos o en combinación. A continuación, las células transfectadas y no transfectadas se cultivaron en cultivo líquido durante 2 semanas en condiciones de diferenciación mieloide o se sembraron en placas en medios semisólidos para un ensayo de Células unitarias formadoras de colonias (CFU-C por sus siglas en inglés) (para conocer el diseño de estos experimentos, consulte la Figura 11A).
Los análisis de citometría de flujo de las células cultivadas en cultivo líquido mostraron que el tratamiento con tetR:K dio como resultado una onda transitoria de represión de eGFP que luego se mantuvo en hasta el 20 % de las células tratadas hasta el final del experimento (Figura 11B; los datos se representan como media±SEM, n=3). Se observó un fenotipo similar en células CD34+ transfectadas con ARNm que codifica tetR:D3A y tetR:D3L. El tratamiento con la combinación tetR:K/tetR:D3A o con la combinación tetR:D3A/tetR:D3L dio como resultado un efecto cooperativo, mostrando que hasta el 40 % de las células tratadas silenciaron completamente la expresión de eGFP. Sorprendentemente, al combinar tetR:D3L/tetR:K o tetR:D3L/tetR:K/tetR:D3A alcanzamos hasta un 90 % de silenciamiento del gen reportero.
Es importante destacar que se observaron niveles similares de silenciamiento en células eritroides y mieloides que se originaron en el ensayo de CFU-C (Figura 11C; los datos se representan como media±SEM, n=3), lo que indica que el silenciamiento se mantuvo incluso tras la diferenciación de HSPC.
Silenciamiento epigenético permanente en linfocitos T humanos mediante el uso de diferentes combinaciones de ATR
Para evaluar si la administración de varias combinaciones de ATR fue suficiente para inducir niveles significativos de silenciamiento en linfocitos T humanos, un tipo de célula clínicamente relevante para muchas aplicaciones de terapia génica basada en células, incluida la inmunoterapia contra el cáncer, transducimos células T humanas de individuos sanos con el TetO7/reportero de eGFP LV descrito en la Figura 5A. Luego transfectamos las células con ARNm transcritos in vitro que codifican tetR:D3A, tetR:K o tetR:D3L, solos o en varias combinación. A continuación, las células transfectadas y no transfectadas se mantuvieron en cultivo líquido durante 3 semanas en medios enriquecidos con IL-15 e IL-7 antes de la reactivación (para ver el diseño de estos experimentos, consulte la Figura 12A).
Los análisis de citometría de flujo de las células mostraron que el tratamiento con ATR individuales y tetR:D3A/tetR:K dio como resultado una represión de eGFP nula o transitoria. Por otra parte, el tratamiento con todas las demás combinaciones ATR posibles dio como resultado el silenciamiento permanente del gen reportero. Es importante destacar que los niveles de silenciamiento medidos durante la fase inicial de proliferación celular y en la fase de reposo fueron superponibles, lo que indica que el silenciamiento se mantiene incluso después de que los estados transcripcional y metabólico de las células hayan cambiado (Figura 12B; los datos se representan como media±SEM, n=3).
Silenciamiento epigenético permanente de un gen endógeno humano utilizando ATR personalizados
Para evaluar si los resultados obtenidos con el sistema reportero eGFP también podrían traducirse a un gen endógeno incrustado en su contexto epigenético natural, generamos TALE personalizados dirigidos a la región promotora del gen p2-Microglobulina (B2M) (las secuencias de aminoácidos de estos TALE y las secuencias de nucleótidos de sus sitios de unión correspondientes se enumeran en la Tabla 3) y fusionaron estos TALE con los dominios efectores KRAB, DNMT3A y DNMT3L (para un esquema del sistema, consulte la Figura 13A) . La longitud del espaciador entre el primero y el segundo, o entre el segundo y el tercero TALE es de 1 o 20 pb, respectivamente. Luego, cotransfectamos células HEK-293T con los plásmidos que codifican estos nuevos ATR y analizamos las células mediante citometría de flujo para determinar la expresión de B2M.
A los 50 días después de la transfección, cuando el porcentaje de células negativas para B2M era estable, medimos una fracción significativa de células negativas para B2M solo en las condiciones tratadas con las combinaciones TALE:D3A TALE:D3L y TALE:D3A TALE :D3L TALE:K (Figura 13B; los datos se representan como media±SEM, n=3; ***p<0.0001, anova unidireccional y prueba posterior de Bonferroni). Sorprendentemente, hasta el 80% de las células tratadas con todos los ATR perdieron permanentemente la expresión de superficie de B2M. En experimentos paralelos, clasificamos las células B2M-negativas y las B2M-positivas, y las analizamos para determinar la expresión superficial de moléculas MHC-I, que requieren que B2M se presente en la membrana plasmática. Encontramos que, contrariamente a las células positivas para B2M, casi todas las células negativas para B2M también fueron negativas para la expresión de MHC-I (Figura 13C). También realizamos el análisis de expresión génica de células clasificadas B2M-negativas y B2M-positivas y encontramos que las células negativas expresaban ~100 plegamientos menos B2M que las células positivas (Figura 13D; los datos se representan como media±SEM, n=3). Luego, evaluamos si los tres dominios efectores eran capaces de inducir un silenciamiento epigenético permanente también cuando se dirigían al gen B2M a través del sistema CRISPR/Cas9 guiado por ARN. Con este objetivo, fusionamos en marco a un Cas9 catalíticamente muerto (D10A H840A; dCas9; secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 4) los dominios efectores KRAB, DNMT3A o DNMT3L (Figura 13E; dibujos superiores), y diseñamos 11 ARN guía (ARNg; secuencias de nucleótidos enumeradas en la Tabla 4) dirigidas a la región promotora del gen B2M (Figura 13E; esquema inferior, las flechas indican la ubicación de los sitios diana de CRISPR/dCas9). Luego, cotransfectamos células HEK-293T con plásmidos que expresan los 11 ARNg B2M junto con todas las combinaciones posibles de los plásmidos que codifican las proteínas de fusión dCas9. El análisis de citometría de flujo de las células HEK-293T tratadas 33 días después de la transfección mostró que solo las combinaciones dCas9:K dCas9:D3L, dCas9:D3A dCas9:D3L y dCas9:K dCas9:D3a dCas9:D3L pudieron inducir el silenciamiento del gen B2M (Figura 13F; los datos se representan como media±SEM, n=3). Luego evaluamos si el silenciamiento de B2M era resistente al tratamiento con IFN-y, un potente inductor de la expresión de B2M (Vraetz, T. et al. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14: 2137-43; Gobin, S.J. et al. (2003) Blood 101: 3058-64). Para este experimento, utilizamos células de tipo salvaje y negativas para B2M, las últimas se clasificaron de las condiciones tratadas con triple ATR descritas en la Figura 13B y 13F. Como se esperaba, el tratamiento con IFN-y provocó una regulación positiva significativa en la expresión del gen 2'-5'-oligoadenilato sintetasa 1 (OAS1) (>100 plegamientos) en todos los tipos de células analizados (Figura 13G). Por otro lado, mientras que las células de tipo salvaje regularon al alza significativamente la expresión de B2M tras el tratamiento con IFN-y tanto a nivel transcripcional como proteico, no se midió ningún aumento en la expresión de este gen en las células negativas para B2M (Figura 13G y Figura 113H respectivamente).
Con el fin de evaluar si el silenciamiento inducido por nuestros ATR estaba asociado con la deposición de marcas epigenéticas represivas en el gen diana, analizamos el estado epigenético del gen B2M en células de tipo salvaje y silenciadas. Con este fin, clasificamos hasta la pureza las células tratadas con el plásmido que codifica la triple combinación TALE:ATR para obtener una población pura de células silenciadas (Figura 14A, que muestra un diagrama de puntos FACS representativo). Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) seguida de análisis de PCR cuantitativo para la ARN polimerasa II (ARN PoIII) en la región promotora y el cuerpo genético de B2M mostró ausencia completa de esta proteína en células silenciadas, mientras que estaba altamente enriquecida en la región promotora de células no tratadas (el gen PPP1R12C y CCR5 se usaron como controles positivos o negativos para estos experimentos, respectivamente; Figura 14B). También realizamos análisis de bisulfito de isla de CpG de B2M y se encontró que, en las células no tratadas, la región promotora estaba casi privada de 5 mC al nivel de las CpG (menos del 1 %), mientras que la misma región en las células silenciadas estaba muy decorada con metilación del a Dn de novo (más del 80 % en promedio) (Figura 14C). La metilación del ADN también fue responsable del mantenimiento del silenciamiento, ya que el tratamiento con AZA se asoció con la reexpresión del gen B2M en células previamente silenciadas (Figura 14D). Finalmente, para abordar si el silenciamiento se limitó al gen B2M, realizamos un análisis transcripcional del locus de B2M por RT-qPCR (esquema superior de la Figura 14E), y se descubrió que el único gen que estaba regulado a la baja tras la administración transitoria de la combinación triple ATR era B2M, mientras que la expresión de su gen vecino no se vio afectada (Figura 14E).
En paralelo a estos experimentos, también probamos el silenciamiento del gen B2M en células K-562. Debido a que esta línea celular no expresa el MHC-I, que es estrictamente necesario para la expresión en la superficie de B2M, dirigimos la secuencia de codificación del marcador fluorescente tdTomato al primer intrón del gen B2M para informar fielmente sobre el estado transcripcional de B2M (Figura 15A). Después de la selección de genes mediante CRISPR/Cas9, las células positivas para tdTomato se clasificaron y luego se sometieron a electroporación con plásmidos que codifican ATR basados en TALE o CRISPR/dCas9 contra el promotor/potenciador B2M (las secuencias diana de estos ATR son las mismas que las de la Figura 13). Con respecto a los ATR basados en TALE, encontramos que tanto las combinaciones TALE:D3L TALE:K como TALE:D3A TALE:D3L TALE:K fueron capaces de silenciar de manera estable la expresión B2M, siendo la combinación triple de ATR la de mejor desempeño (Figura 15B). La optimización de Condon de los dominios efectores de los ATR basados en TALE mejoró la eficiencia de silenciamiento de las combinaciones mencionadas anteriormente (Figura 15B; compare las barras rojas contra las barras verdes). Con respecto a la actividad de silenciamiento de los ATR basados en CRISPR/dCas9, encontramos que todos menos la combinación dCas9:D3A dCas9:K fue capaz de inducir una alta eficiencia de silenciamiento del gen B2M (hasta el 55 % de las células silenciadas de manera estable; Figura 15C). Finalmente, la selección de dCas9 fusionado con el dominio catalítico de la enzima TET1 (que se sabe que desmetila el ADN; Maeder, M.L. et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 1137-42) al promotor/potenciador B2M de células silenciadas clasificadas dio como resultado la reactivación de la expresión de este gen (Figura 15D), corroborando aún más la noción de que el silenciamiento inducido por la combinación triple ATR depende de la metilación del ADN.
Para evaluar si el silenciamiento de B2M también podría ser efectivo en linfocitos T humanos primarios, electroporamos células T humanas de un donante sano con ARNm transcritos in vitro que codifican los ATR TALE:K TALE:D3A TALE:D3L descritos anteriormente. A continuación, las células transfectadas y no transfectadas se mantuvieron en cultivo líquido durante 2 semanas en medios enriquecidos con IL-15 e IL-7 (esquema experimental en la Figura 16A). Los análisis de citometría de flujo de las células mostraron que el tratamiento con los ATR TALE:K TALE:D3A TALE:D3L dio como resultado el silenciamiento del gen B2M (cinética de silenciamiento en la Figura 16B, diagramas FACS en la Figura 16C).
Curiosamente, la deconvolución funcional de 7 ARNg en cuartetos hasta singuletes individuales mostró que incluso un ARNg fue suficiente para impulsar el silenciamiento eficiente de B2M tanto con la combinación triple como con dCas9:D3A dCas9:D3L (Figura 17). Inesperadamente, algunos de los ARNg individuales pudieron inducir eficiencias de silenciamiento comparables a las medidas en el grupo de 7 ARNg. Además, en varios casos, observamos que la combinación triple de ATR funcionaba mejor que la combinación dCas9:D3A dCas9:D3L. En conjunto, estos datos indican que incluso un ARNg bien posicionado que une los tres ATR en el gen diana puede inducir su silenciamiento eficiente.
De manera similar, también investigamos si una sola proteína TALE era suficiente para inducir un silenciamiento epigenético permanente y eficiente. Con este objetivo, generamos cuatro proteínas TALE, a cada una de las cuales fusionamos los tres dominios efectores diferentes, a saber, KRAB, DNMT3A y DNMT3L (Figura 17B; esquema a la izquierda). Como modelo, utilizamos las proteínas TALE dirigidas al gen B2M y la línea celular reportera K562 B2M tdTomato descrita anteriormente (Figura 13A y 15A, respectivamente). Inesperadamente, también en las condiciones en las que los dominios represores competían por el mismo sitio de unión en el gen B2M, obtuvimos un silenciamiento génico eficiente y permanente del gen B2M (Figura 17B, barras grises en el histograma). Es muy probable que el diferente grado de eficiencia refleje la diferente afinidad de unión de los TALE, y algunos de estos funcionan tan eficientemente como la condición de control en la que cada dominio efector se fusionó con un dominio de unión al ADN diferente (Figura 17B; barra azul oscuro en el histograma).
En general, estos datos muestran por primera vez, según nuestro conocimiento, el silenciamiento permanente de un gen endógeno en células humanas utilizando ATR personalizados. Es importante destacar que el silenciamiento fue completamente resistente a los estímulos externos que inciden en el promotor/potenciador de B2M, lo que proporciona otra línea de evidencia de la estabilidad de las modificaciones epigenéticas depuestas por la combinación triple de ATR. Además, proporcionamos evidencia de la amplia aplicabilidad de nuestra estrategia al unir los dominios represores al gen endógeno por medio de dos tecnologías de unión de ADN diferentes, a saber, TALE y CRISPR/Cas9.
La expresión transitoria de un DNMT3L no objetivo mejora y rescata la eficiencia de silenciamiento del DNMT3A ATR basados en KRAB en tipos de células refractarias
Con el fin de reducir la cantidad de ATR diferentes para diseñar y construir, investigamos si al menos uno de los dominios efectores puede administrarse a las células sin un dominio de unión al ADN, y aún puede cooperar de manera efectiva con los otros dos ATR dirigidos al gen de interés deseado. Para evaluar si la administración de un DNMT3L no dirigido (en adelante, D3L) podría ser tan eficaz como su contraparte dirigida en cooperación con los otros dos dominios efectores (específicamente DNMT3A y KRAB), inicialmente aprovechamos el sistema TetO7/tetR. Por lo tanto, transfectamos las células B-linfoblastoides reporteras TetO7.LV con los ARNm transcritos in vitro que codifican para los ATR basados en tetR y para el D3L no dirigido, y medidos mediante análisis de citometría de flujo de curso temporal, el porcentaje de células negativas para eGFP en las diferentes condiciones de transfección (Figura 18A; los datos se representan como media±rango, n= 2). A los 27 días después de la transfección, encontramos poco o ningún silenciamiento en las células tratadas con los ATR individuales o con la combinación tetR:K tetR:D3A. En cambio, hasta el 70 % de las células tratadas con la combinación de los 3 ATR se vuelven negativas para eGFP. El tetR:D3L dirigido también se sinergizó con tetR:K o tetR:D3A, aunque los niveles de silenciamiento medidos en estas dos condiciones experimentales fueron 3,5 plegamientos más bajos (~20 % de células negativas para eGFP) que los medidos con la combinación de triple ATR (Figura 18A; compare las condiciones plus tetR:D3L). Estos datos están en línea con los encontrados previamente con la línea de células B-linfoblastoides TetO7.LV reporteras, en la que la caída inesperada en la eficiencia de silenciamiento de la combinación tetR:D3A tetR:K se rescató por completo mediante la inclusión de tetR:D3L en el cpctel (ver la Figura 7G para la comparación). Cuando el D3L no dirigido se administró solo o en combinación con tetR:K, no se encontraron células negativas para eGFP. Por otro lado, D3L fue capaz de crear una sinergia efectiva con la combinación tetR:D3A y tetR:D3A tetR:K (Figura 18A; consulte las condiciones de plus D3L). Es importante destacar que los niveles de silenciamiento medidos en estas dos condiciones experimentales fueron comparables a los encontrados al unir DNMT3L y DNMT3A; o DNMT3L, DNMT3A y KRAB a la secuencia TetO7. Estos datos indican que el D3L no dirigido puede generar sinergias de manera efectiva con la combinación KRAB DNMT3A.
Luego evaluamos si estos hallazgos también eran ciertos con los ATR basados en dominios de unión a ADN personalizados. Con este fin, seleccionamos 4 sitios de unión de TALE diferentes en la región promotora de B2M y construimos los dominios de unión a ADN de TALE correspondientes (en la Figura 18B se muestra un esquema del locus de B2M que muestra los diferentes sitios de unión de TALE; las secuencias de aminoácidos de TALE A y las secuencias de nucleótidos de sus sitios de unión correspondientes se enumeran en la Tabla 5; los TALE B, C y D se describieron previamente y corresponden a TALE # 1, # 2 y # 3 de la Tabla 3). Cada uno de estos TALE estaba equipado con KRAB o DNMT3A. Los 4 sitios de unión a TALE diferentes constituyen dos módulos de silenciamiento independientes (Módulo 1: sitio A más sitio B; Módulo 2: sitio C más sitio D), en los que TALE:D3A y TALE:K pueden unirse en dos órdenes diferentes (sitio A: K-sitioB:D3A o sitioA:D3A-sitioB:K). Luego transfectamos células HEK-293T con plásmidos que codifican para los ATR basados en TALE y para el D3L no dirigido, y medimos mediante análisis de citometría de flujo de curso de tiempo el porcentaje de células negativas dobles B2M/MHCl en las diferentes condiciones de transfección (Figura 18C). A los 12 días posteriores a la transfección, medimos una fracción baja de células negativas para B2M/MHCl en todas las condiciones tratadas con la combinación TALE:D3A TALE:K (gráficos superiores en la Figura 18C). Por otro lado, el tratamiento conjunto de las células con la combinación de los dos ATR más el D3L no dirigido dio como resultado en promedio un aumento de 5 plegamientos en la eficiencia del silenciamiento (diagramas inferiores de la Figura 18C) sobre los niveles medidos en ausencia de D3L. Este aumento fue independiente del orden relativo de unión de las proteínas TALE en el promotor B2M y se confirmó para ambos módulos de silenciamiento.
Finalmente, realizamos experimentos similares utilizando ATR basados en el sistema CRISPR/Cas9 (Figura 18D; los datos se representan como media±SEM, n=3). Aquí, encontramos que la expresión transitoria de D3L en células HEK-293T transfectadas con los ATR dCas9:K dCas9:D3A más los ARNg B2M (los utilizados en la Figura 13E) dieron como resultado niveles de silenciamiento génico comparables a los obtenidos con la combinación triple de los ATR basados en dCas9 más los ARNg B2M (Figura 18D). Se obtuvieron resultados similares al administrar D3L con DNMT3A ATR.
En general, estos datos muestran claramente que el DNMT3L no dirigido puede reemplazar efectivamente a su contraparte dirigida en nuestro cóctel de ATRs.
La expresión transitoria de un DNMT3B no dirigido rescata la eficiencia de silenciamiento de los ATR basados en DNMT3A KRAB en tipos de células refractarias
Teniendo en cuenta el papel de la DNMT3B en el establecimiento de la metilación del ADN de novo, nos preguntamos si el DNMT3B endógeno podría cooperar con nuestros ATR. Para responder a esta pregunta, realizamos una desactivación genética de DNMT3B mediante CRISPR/Cas9 en la línea celular reportera TetO7.LV K562. Para hacer esto, transducimos las células con dos vectores lentivirales, uno que codifica una nucleasa Cas9 inducible por doxiciclina (Wang, T. et al. (2014) Science 343: 80-4) y otro que codifica tanto un ARNg contra el exón 2 del gen DNMT3B y el marcador ALNGFR (esquema de los vectores en la Figura 19A; diagrama FACS en el medio para las células doblemente transducidas). Tras la activación de Cas9 mediante la administración de doxiciclina, sometimos a electroporación las células con plásmidos que codifican las diferentes combinaciones de los ATR y luego medimos mediante citometría de flujo la eficacia del silenciamiento en las células positivas y negativas para ALNGFR. Al comparar estos números, podemos apreciar si la inactivación del gen DNMT3B mejora o no la eficiencia de silenciamiento de las diferentes combinaciones de ATR. Aquí, observamos que la subpoblación que expresa los ARNg anti-DNMT3B (es decir, células positivas para ALNGFR) fue menos permisiva que las células de tipo salvaje (es decir, aquellas negativas para ALNGFR) al silenciamiento mediante la combinación tetRK tetR:D3A (Figura 19B y Figura 19C; diagrama FACS superior derecho), lo que indica que el endógeno DNMT3B es un socio relevante de estos dos ATR. Sorprendentemente, la desactivación genética de DNMT3B aumentó la eficiencia de silenciamiento de la combinación tetR:K tetR:D3A tetR:D3L, lo que sugiere que en este caso DNMT3B actúa como un señuelo para estos ATR (Figura 19B y Figura 19C; diagrama FACS inferior derecho). Para todas las demás combinaciones de ATR y el ATR individual, la inactivación de DNMT3B no causó ninguna diferencia significativa en la eficiencia de silenciamiento en comparación con las células de tipo salvaje. Además, teniendo en cuenta que, en contraste con las células K562, la línea celular B-linfoblastoide descrita anteriormente carece de expresión de DNMT3B (medida por análisis RT-qPCR), nos preguntamos si la sobreexpresión de DNMT3B podría aumentar la eficiencia de silenciamiento de ATR en esta línea celular refractaria a la combinación DNMT3A KRAB. En particular, transfectamos transitoriamente la línea celular reportera del B-linfoblastoides TetO7.LV con un ARNm que codifica el DNMT3B de longitud completa (sin fusionarlo con el dominio de unión a ADN tetR; la secuencia de aminoácidos del DNMT3B se encuentra en la Tabla 1) con o sin los dos ATR. Sorprendentemente, la sobreexpresión de DNMT3B rescató significativamente la actividad de la combinación tetR:K tetR:D3A, lo que permitió el silenciamiento estable de eGFP en el 52 % de las células tratadas, con un aumento de 65 plegamientos en comparación con tetR:K tetR:D3A solo (Figura 19C). Cabe destacar que la sobreexpresión de DNMT3B generó también un aumento de 2,9 plegamientos en la eficiencia de silenciamiento de la condición tetR:D3A (Figura 19D).
En general, estos datos muestran claramente que el DNMT3B no dirigido puede rescatar eficazmente la actividad de la combinación DNMT3A KRAB en tipos de células refractarias.
Silenciamiento del gen BCL11A mediante ATR basados en CRISPR/dCas9 y TALE.
Luego explotamos la combinación ATR para silenciar BCL11A, un gen cuya represión se ha propuesto como una posible intervención terapéutica para la p-talasemia y la anemia de células falciformes. Para evaluar fácilmente la actividad de los ATR en el gen BCL11A, nos dirigimos al transgén tdTomato dentro del tercer exón del gen en células B-linfoblastoides humanas mediante la selección de genes con tecnología basada en CRISPR/Cas (Figura 20A). Esta estrategia de selección permite expresar el transgén tdTomato a partir de las secuencias reguladoras del gen BCL11A, informando así fielmente el nivel de expresión de este gen. Luego, enriquecimos hasta casi la pureza las células positivas para tdTomato mediante clasificación celular y seleccionamos a 4 islas de CpG en la región promotora/potenciadora de este gen con ATR basados en CRISPR/dCas9 que contenían DNMT3A o DNMT3L. Cada una de las 4 islas de CpG se interrogó individualmente utilizando un grupo separado de ARNg (también conocido como CRISPR; las secuencias de nucleótidos de los ARNg se reportan en la Tabla 6). Al comparar la expresión de tdTomato entre los controles tratados y no tratados, pudimos medir la contribución relativa de cada isla a la expresión de BCL11A (Figura 20B). En comparación con las células tratadas con control, el silenciamiento de cada isla CpG se asoció con una represión estable a largo plazo de expresión de BCL11A (que se muestra aquí como % de células negativas para tdTomato), aunque el grado de silenciamiento de este gen varió según la isla CpG diana de los ATR. Luego seleccionamos la isla CpG 31 y 38 para estudios adicionales con el objetivo de evaluar la actividad de la combinación triple ATR. En estos estudios también incluimos todas las combinaciones posibles de ATR doble y los ATR únicos basados en KRAB. Sorprendentemente, todas las condiciones probadas fueron capaces de inducir niveles significativos de silenciamiento génico, con la edición epigenética de CpG 38 (la isla con mejor respuesta en los experimentos anteriores) con la combinación de triple ATR que resultó en un silenciamiento génico de hasta el 55 % (Figura 20C). Finalmente, diseñamos 17 ATR basados en TALE diferentes dirigidos a la isla CpG 31 y 38 (7 y 10 proteínas TALE, respectivamente; las secuencias de aminoácidos de estos TALE y sus secuencias diana afines se enumeran en la Tabla 7; Esquemas superiores de la Figura 20D), y se probó su actividad silenciadora ya sea como una combinación triple-ATR o como ATR basado en KRAB. El silenciamiento de ambas islas CpG con todas las combinaciones triples de ATR resultó en un silenciamiento efectivo y a largo plazo de BCL11A (alcanzando hasta el 55% de las células negativas para tdTomato), mientras que el silenciamiento con TALE:KRAB se asoció con diferentes grados de silenciamiento génico, siendo algunos tan eficientes como la combinación triple de ATR, mientras que otros fueron completamente inactivos. En general, estos datos muestran la viabilidad de silenciar permanentemente el gen BCL11A humano.
Silenciamiento de genes endógenos humanos adicionales utilizando ATR basados en CRISPR/dCas9.
Finalmente desafiamos nuestra tecnología de silenciamiento epigenético contra dos genes endógenos humanos adicionales, que son el receptor 1 de interferón (alfa, beta y omega) (IFNAR1) y el gen del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA). Ambos genes muestran una isla CpG en la región promotora/potenciadora del gen. Por lo tanto, diseñamos 13 ARNg contra la isla Isla CpG de IFNAR1 (Figura 20E, Arriba) 3 ARNg contra la isla CpG VEGFA (Figura 20F, Arriba) (las secuencias de nucleótidos de los ARNg se informan en la Tabla 6). Curiosamente, mediante la electroporación de células K562 con plásmidos que codifican el grupo de 13 ARNg contra el gen IFNAR1 más la combinación triple de ATR basada en dCas9, logramos una regulación a la baja a largo plazo del nivel de transcripción de IFNAR1 (cambio de 0,22 plegamientos) en las células tratadas en comparación con la muestra no tratada (Figura 20E, abajo). Además, mediante la electroporación de células K562 con plásmidos que codifican el grupo de 3 ARNg contra el gen VEGFA más la combinación triple de ATR basada en dCas9, logramos una regulación a la baja a largo plazo del nivel de transcripción de VEGFA (cambio de 0,57 plegamientos) en las células tratadas en comparación con la muestra no tratada (Figura 20F, abajo). En general, estos datos muestran la viabilidad de silenciar varios genes endógenos humanos mediante ATR basados en CRISPR/dCas9.
Material y métodos
Vectores lentivirales y construcciones A TR
Los vectores lentivirales (LV) reporteros ATR que contienen la secuencia TetO7 o los sitios de unión TALE, y los LV que expresan ARNg de DNMT3B se generaron a partir de la construcción de transferencia autoinactivante pCCLsin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre (Follenzi, A. et al. (2000) Nat. Genet. 25: 217-22), mientras que los Bid.LV que expresan ATR se generaron a partir de la construcción de transferencia pCCLsin.cPPT.dLNGFR.mhCMV.hPGK.GFP.Wpre (Gentner, B. et al. (2010) Sci. Transl. Med. 2: 58ra84). El vector de expresión de Cas9 inducible por doxiciclina se obtuvo de Addgene (pCW-Cas9; #50661; Wang, T. et al. (2014) Science 343: 80-4). Los stocks de LV se prepararon como se describió anteriormente (Follenzi, A. et al. (2002) Methods Mol. Med. 69: 259-74). Brevemente, las células HEK293T se cotransfectaron mediante precipitación con fosfato de calcio con el plásmido de construcción de transferencia, el plásmido de empaquetamiento pMD.Lg/pRRE, el plásmido que codifica la envoltura pMD2.VSV-G y pRSV-Rev en las siguientes cantidades: 35/12,5/9/6,25 mg de ADN por plato de 15 cm, respectivamente. Las partículas de vector se concentraron 300 plegamientos mediante ultracentrifugación y se titularon mediante dilución en serie en células HEK293T como se describió anteriormente (Cantore, A. et al. (2015) Sci. Transl. Med. 7: 277ra28). Todos los demás ATR basados en tetR se generaron reemplazando el dominio KRAB en tetR:KRAB (que se analiza en Szulc, J. et al. (2006) Nat. Methods 3: 109-16) con los otros dominios efectores relevantes. Los ATR basados en TALE se generaron utilizando una versión modificada del Golden Gate TALEN Kit 2.0a (Addgene, Kit#1000000024; Cermak, T. et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39: e82) que contiene los siguientes cambios arquitectónicos: las subregiones Golden Gate TALE C y N-terminal se reemplazaron con las eliminaciones de terminales 163 y 63, respectivamente. Estas construcciones se adaptaron para acomodar en marco los dominios efectores. Los ATR basados en Cas9 se generaron reemplazando el transactivador VP160 de la expresión del plásmido pAC154-dual-dCas9VP160-sg (Addgene #48240; Cheng, A.W. et al. (2013) Cell Res.
23: 1163-71) con los dominios efectores o con el dominio catalítico de TET1.
Condiciones y diseño del cultivo celular.
Se mantuvieron linfocitos B inmortalizados con virus Epstein-Barr humano (células B-linfoblastoides) y células U-937 en RPMI-1640 (Sigma); HEK293T y K-562 en IMDM (Sigma); NIH/3T3 en DMEM (Sigma). Todos los medios se complementaron con FBS al 10 % (suero bovino fetal; EuroClone), L-glutamina (EuroClone) y penicilina/estreptomicina al 1 % (concentración final de 100 U/ml; EuroClone). Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5%. Las líneas celulares reporteras se generaron transduciendo las células con los LV reporteros de ATR indicados a una Multiplicidad de Infección (MOI) de 0,1, y luego se enriquecieron para la expresión de eGFP utilizando un clasificador de células MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las líneas celulares reporteras con integración dirigida se generaron de la siguiente manera: i) para la inserción del casete eGFP en el locus AAVS1, cotransfectamos una construcción donante (que contiene la secuencia TetO7 corriente abajo o corriente arriba del casete; 1,5 mg de plásmido donante) y el AAVS1-ZFNs descrito anteriormente en formas o mRNAs (0,5 mg cada ZFN; Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9). Luego, se obtuvieron clones derivados de una sola célula mediante placas de dilución limitada y se analizaron mediante transferencia de Southern para confirmar la integración dirigida del casete como se describió anteriormente (Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9); ii) para la inserción del casete tdTomato dentro del tercer exón de BCL11A, cotransfectamos una construcción donante que contenía el transgén tdTomato fusionado con el péptido autocatalítico 2A (2 mg), junto con un plásmido que codifica Cas9 (1 mg) y otro que expresa un ARNg dirigido al exón 3 (125 ng; secuencia del ARNg: 5'-GGAGCTCTAATCCCCACGCCTGG-3'); iii) se usó una estrategia de selección similar a la utilizada para BCL11A para insertar un casete de aceptor de empalme-IRES-tdTomato en el intrón 1 de B2M (secuencia del ARNg: 5'-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3'). Ambas líneas celulares tdTomato se generaron mediante clasificación FACS de las células positivas.
Para probar la actividad de los ATR, las líneas celulares reporteras se transdujeron con Bid.LV que expresa ATR a una MOI de 10, o se transfectaron con plásmidos o ARNm transcritos in vitro que expresan los a Tr (4D-NucleofectorTM System; Lonza) según las instrucciones del fabricante para K-562, U937 y NIH/3T3, o utilizando el programa de pulsos EW-113 y la solución SF para células B-linfoblastoides. Rutinariamente transfectamos 2 mg de ácido nucleico (tanto plásmido como ARNm transcrito in vitro) para cada ATR basado en tetRor TALE, a excepción de los experimentos realizados en condiciones no saturadas en las que usamos 500 ng de plásmido que codifica para cada uno de los ATR. Por otro lado, electroporamos 1-2 mg de plásmido que codifica los ATR basados en dCas9 y 125-250 ng de plásmidos que expresan los ARNg. Los ARNm transcritos in vitro se produjeron como se describió previamente (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-40). Cuando se indicó, las células se trataron con 5-Aza-2-desoxicitidina 1 mM (AZA, Sigma) o con 12 mg/ml de doxiciclina (Sigma). El medio que contenía AZA se reemplazó todos los días y las células se analizaron mediante citometría de flujo los días 4 y 7 después del tratamiento. Cuando se indicó, las células se trataron con 500 U/ml de IFN-y humano recombinante (R&D Systems). El medio que contenía IFN-y se reemplazó todos los días y las células se analizaron mediante citometría de flujo los días 2 y 4 después del tratamiento. Las células CD34+ derivadas de sangre de cordón umbilical de donantes sanos se adquirieron de Lonza. Se estimularon 106 células CD340/ml durante la noche en medio StemSpan sin suero (StemCell Technologies) suplementado con penicilina, estreptomicina y las siguientes citocinas humanas de acción temprana: Factor de células madre (SCF por sus siglas en inglés) 50 ng/mL, ligando Flt3 (Flt3-L) 50 ng/mL, trombopoyetina (TPO) 50 ng/mL e interleucina 6 (IL-6) 50 ng/mL (todos adquiridos de Peprotech). A continuación, las células se transdujeron con el reportero LV de TetO7 a una MOI de 30-50. Después de 48 horas, las células se sometieron a electroporación con 2 mg de los ARNm codificadores de ATR (P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit, programa EO-100; Lonza). Se añadió 1 mM de SR1 (BioVision Inc.) en cada cambio de medio. Después de una semana en medio estimulante, las células se cultivaron en cultivo líquido en IMDM 10% FBS. Para los ensayos de CFC, se sembraron 800 células/placa un día después de la electroporación en medio basado en metilcelulosa (MethoCult H4434, StemCell Technologies). Dos semanas después de la siembra, las colonias se contaron e identificaron según criterios morfológicos y se analizaron por citometría de flujo.
Se aislaron linfocitos T en reposo a partir de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC por sus siglas en inglés) de donantes sanos mediante leucoféresis y separación en gradiente de Ficoll-Hypaque. Las células se activaron y clasificaron utilizando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD3 y CD28 (ClinExVivo CD3/CD28; Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y se cultivaron a una concentración de 1 x 106 células por mL en RPMI (Sigma) suplementado con penicilina, estreptomicina, 10% FBS y 5 ng/mL de IL-7 e IL-15 (PeproTech) como se describió previamente (Kaneko, S. et al. (2009) Blood 113: 1006-15). Después de tres días de cultivo, las células se transdujeron con el reportero TetO7 del LV a una MOI de 10. Tres días después de la transducción, las células se lavaron y electroplacaron con 2 mg de ARNm que codificaba los ATR. Para probar la resistencia al silenciamiento de la estimulación con TCR policlonal, cocultivamos los linfocitos T tratados en masa con un grupo de PMBC irradiadas con 6000 rad de donantes no relacionados y células JY irradiadas con 10000 rad en presencia de anticuerpo anti-CD3 (OKT3) 30 ng/ mL (Orthoclone, Milán, Italia) e IL-2 recombinante humana 50 U/mL (PrepoTech). En cuanto al silenciamiento de B2M en linfocitos T primarios, estas células se aislaron de PBMC de un donante sano mediante leucaféresis, separación en gradiente de Ficoll-Hypaque y selección final con el kit Pan T Cell Isolation (Miltenyi Biotec). Luego, las células T se activaron con perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD3 y CD28 (ClinExVivo CD3/CD28; Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y se cultivaron a una concentración de 1 x 106 células por mL en RPMI (Sigma) suplementado con penicilina, estreptomicina, 10% FBS y 5 ng/mL de IL-7 e IL-15 (PeproTech) como se describió previamente (Kaneko, S. et al. (2009) Blood 113: 1006-15). Después de tres días de cultivo, las células se sometieron a electroporación con ARNm transcrito in vitro que codifica para ATR basados en TALE y mantenido en cultivo durante 2 semanas más, con la remoción de las perlas 4 días después de la electroporación. El Comité de Bioética de1Hospital San Raffaele aprobó el uso de células CD34+ derivadas de CB humanas y de linfocitos T primarios.
Citometría de flujo y análisis de expresión génica
Para el análisis inmunofenotípico de células transducidas con Bid.LV, células CD34+ y su progenie, y linfocitos T (realizado por FACSCanto II; BD Pharmingen) usamos los siguientes anticuerpos.
Figure imgf000054_0002
Se excluyeron del análisis las células no viables positivas para aminoactinomicina D (7-AAD), y se puntuaron 1-5 x 105 células viables por análisis. Se usaron como controles células teñidas con FMO y con una sola tinción.
Para los análisis de expresión génica, el ARN total extraído de 2-6 x 106 células (kit RNeasy Mini; Qiagen) se transcribió inversamente utilizando examinadores aleatorios de acuerdo con el protocolo del fabricante SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Analizamos 15-100 ng de ADNc de células K-562 y HEK293T por triplicado con ensayos de Expresión Génica TaqMan (Applied Biosystems).
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
El ensayo de expresión génica utilizado para detectar el transcrito de eGFP se describió previamente (Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861 -9). Las PCR en tiempo real se realizaron con un sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 (Applied Biosystems) y se utilizó un programa informático dedicado para extraer datos sin procesar (Ct y fluorescencia sin procesar). Los genes con un valor de Ct >37 se excluyeron de los análisis. El nivel d e expresión relativo de cada gen se calculó mediante el método AACt, normalizado a la expresión HPRT o B2M (controles de genes de limpieza), y representado como cambio de plegamiento en relación con las muestras tratadas de forma simulada (calibrador).
Análisis moleculares
Para la secuenciación con bisulfito, el ADN genómico se extrajo con el kit DNeasy Blood & Tissue o el kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN) y luego se trató con el kit EpiTect Bisulfite (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los productos convertidos luego se usaron para amplificar por PCR la región promotora de B2M utilizando los cebadores enumerados a continuación. Los fragmentos de PCR se purificaron y clonaron en pCRII-TOPO TA (Invitrogen), y de cinco a diez clones de cada muestra se verificaron mediante secuenciación utilizando el cebador universal M13.
Figure imgf000055_0002
El análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se realizó como se describió previamente (Lombardo, A. et al. (2011) Nat. Methods 8: 861-9) usando 5-10 mg de anticuerpos de grado ChIP (Abcam) generados contra e1H3 humano o la repetición YSPTSPS de la ARN polimerasa II CTD. Los isotipos de IgG también se usaron como controles. Los cebadores utilizados para estos estudios se enumeran a continuación. El porcentaje de enriquecimiento de ARN PoIII para cada sitio investigado se calculó mediante el método ACt utilizando el Input como normalizador.
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Figure imgf000056_0001
Análisis estadístico
Se usó la prueba ANOVA unidireccional con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni para evaluar la significación estadística de las diferencias en la expresión génica entre todas las muestras (P < 0,05).
Tabla 1
ZNF10
ALSPQHSAVTQGSIIKNKEGMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYK NLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSV DNMT3A
TYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVD RYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEG TGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYF WGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCT EMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV EZH2 (variante corta) NVSCKNCSIQRGSKKHLLLAPSDVAGWGIFIKDPVQKNEFISEYCGEIISQDEADRRGKVYDKYMCSF LFNLNNDFVVDATRKGNKIRFANHSVNPNCYAKVMMVNGDHRIGIFAKRAIQTGEELFFDYRYSQADA LKYVGIEREMEIP EZH2 (variante larga) RLWAAHCRKIQLKKDGSSNHVYNYQPCDHPRQPCDSSCPCVIAQNFCEKFCQCSSECQNRFPGCRCKA QCNTKQCPCYLAVRECDPDLCLTCGAADHWDSKNVSCKNCSIQRGSKKHLLLAPSDVAGWGIFIKDPV QKNEFISEYCGEIISQDEADRRGKVYDKYMCSFLFNLNNDFVVDATRKGNKIRFANHSVNPNCYAKVM MVNGDHRIGIFAKRAIQTGEELFFDYRYSQADALKYVGIEREMEIP TLE1
MFPQSRHPTPHQAAGQPFKFTIPESLDRIKEEFQFLQAQYHSLKLECEKLASEKTEMQRHYVMYYEMS YGLNIEMHKQTEIAKRLNTICAQVIPFLSQEHQQQVAQAVERAKQVTMAELNAIIGQQQLQAQHLSHG
G9A (variante corta) LNRKLRLGVGNRAIRTEKIICRDVARGYENVPIPCVNGVDGEPCPEDYKYISENCETSTMNIDRNITH LQHCTCVDDCSSSNCLCGQLSIRCWYDKDGRLLQEFNKIEPPLIFECNQACSCWRNCKNRVVQSGIKV RLQLYRTAKMGWGVRALQTIPQGTFICEYVGELISDAEADVREDDSYLFDLDNKDGEVYCIDARYYGN ISRFINHLCDPNIIPVRVFMLHQDLRFPRIAFFSSRDIRTGEELGFDYGDRFWDIKSKYFTCQCGSEK CKHSAEAIALEQSRLARLDPHPELLPELGSLPPVNT
G9A (variante larga) LEKALVIQESERRKKLRFHPRQLYLSVKQGELQKVILMLLDNLDPNFQSDQQSKRTPLHAAAQKGSVE ICHVLLQAGANINAVDKQQRTPLMEAVVNNHLEVARYMVQRGGCVYSKEEDGSTCLHHAAKIGNLEMV SLLLSTGQVDVNAQDSGGWTPIIWAAEHKHIEVIRMLLTRGADVTLTDNEENICLHWASFTGSAAIAE VLLNARCDLHAVNYHGDTPLHIAARESYHDCVLLFLSRGANPELRNKEGDTAWDLTPERSDVWFALQL NRKLRLGVGNRAIRTEKIICRDVARGYENVPIPCVNGVDGEPCPEDYKYISENCETSTMNIDRNITHL QHCTCVDDCSSSNCLCGQLSIRCWYDKDGRLLQEFNKIEPPLIFECNQACSCWRNCKNRVVQSGIKVR LQLYRTAKMGWGVRALQTIPQGTFICEYVGELISDAEADVREDDSYLFDLDNKDGEVYCIDARYYGNI SRFINHLCDPNIIPVRVFMLHQDLRFPRIAFFSSRDIRTGEELGFDYGDRFWDIKSKYFTCQCGSEKC KHSAEAIALEQSRLARLDPHPELLPELGSLPPVNT SETDB1 MSSLPGCIGLDAATATVESEEIAELQQAVVEELGISMEELRHFIDEELEKMDCVQQRKKQLAELETWV IQKESEVAHVDQLFDDASRAVTNCESLVKDFYSKLGLQYRDSSSEDESSRPTEIIEIPDEDDDVLSID SGDAGSRTPKDQKLREAMAALRKSAQDVQKFMDAVNKKSSSQDLHKGTLSQMSGELSKDGDLIVSMRI LGKKRTKTWHKGTLIAIQTVGPGKKYKVKFDNKGKSLLSGNHIAYDYHPPADKLYVGSRVVAKYKDGN QVWLYAGIVAETPNVKNKLRFLIFFDDGYASYVTQSELYPICRPLKKTWEDIEDISCRDFIEEYVTAY PNRPMVLLKSGQLIKTEWEGTWWKSRVEEVDGSLVRILFLDDKRCEWIYRGSTRLEPMFSMKTSSASA LEKKQGQLRTRPNMGAVRSKGPVVQYTQDLTGTGTQFKPVEPPQPTAPPAPPFPPAPPLSPQAGDSDL ESQLAQSRKQVAKKSTSFRPGSVGSGHSSPTSPALSENVSGGKPGINQTYRSPLGSTASAPAPSALPA PPAPPVFHGMLERAPAEPSYRAPMEKLFYLPHVCSYTCLSRVRPMRNEQYRGKNPLLVPLLYDFRRMT ARRRVNRKMGFHVIYKTPCGLCLRTMQEIERYLFETGCDFLFLEMFCLDPYVLVDRKFQPYKPFYYIL DITYGKEDVPLSCVNEIDTTPPPQVAYSKERIPGKGVFINTGPEFLVGCDCKDGCRDKSKCACHQLTI QATACTPGGQINPNSGYQYKRLEECLPTGVYECNKRCKCDPNMCTNRLVQHGLQVRLQLFKTQNKGWG IRCLDDIAKGSFVCIYAGKILTDDFADKEGLEMGDEYFANLDHIESVENFKEGYESDAPCSSDSSGVD LKDQEDGNSGTEDPEESNDDSSDDNFCKDEDFSTSSVWRSYATRRQTRGQKENGLSETTSKDSHPPDL GPPHIPVPPSIPVGGCNPPSSEETPKNKVASWLSCNSVSEGGFADSDSHSSFKTNEGGEGRAGGSRME AEKASTSGLGIKDEGDIKQAKKEDTDDRNKMSVVTESSRNYGYNPSPVKPEGLRRPPSKTSMHQSRRL MASAQSNPDDVLTLSSSTESEGESGTSRKPTAGQTSATAVDSDDIQTISSGSEGDDFEDKKNMTGPMK RQVAVKSTRGFALKSTHGIAIKSTNMASVDKGESAPVRKNTRQFYDGEESCYIIDAKLEGNLGRYLNH SCSPNLFVQNVFVDTHDLRFPWVAFFASKRIRAGTELTWDYNYEVGSVEGKELLCCCGAIECRGRLL SUV420H2 MGPDRVTARELCENDDLATSLVLDPYLGFRTHKMNVSPVPPLRRQQHLRSALETFLRQRDLEAAYRAL TLGGWTARYFQSRGPRQEAALKTHVYRYLRAFLPESGFTILPCTRYSMETNGAKIVSTRAWKKNEKLE LLVGCIAELREADEGLLRAGENDFSIMYSTRKRSAQLWLGPAAFINHDCKPNCKFVPADGNAACVKVL RDIEPGDEVTCFYGEGFFGEKNEHCECHTCERKGEGAFRTRPREPALPPRPLDKYQLRETKRRLQQGL DSGSRQG HP1-a MGKKTKRTADSSSSEDEEEYVVEKVLDRRVVKGQVEYLLKWKGFSEEHNTWEPEKNLDCPELISEFMK KYKKMKEGENNKPREKSESNKRKSNFSNSADDIKSKKKREQSNDIARGFERGLEPEKIIGATDSCGDL MFLMKWKDTDEADLVLAKEANVKCPQIVIAFYEERLTWHAYPEDAENKEKETAKS DNMT3L MAAIPALDPEAEPSMDVILVGSSELSSSVSPGTGRDLIAYEVKANQRNIEDICICCGSLQVHTQHPLF EGGICAPCKDKFLDALFLYDDDGYQSYCSICCSGETLLICGNPDCTRCYCFECVDSLVGPGTSGKVHA MSNWVCYLCLPSSRSGLLQRRRKWRSQLKAFYDRESENPLEMFETVPVWRRQPVRVLSLFEDIKKELT SLGFLESGSDPGQLKHVVDVTDTVRKDVEEWGPFDLVYGATPPLGHTCDRPPSWYLFQFHRLLQYARP KPGSPRPFFWMFVDNLVLNKEDLDVASRFLEMEPVTIPDVHGGSLQNAVRVWSNIPAIRSRHWALVSE EELSLLAQNKQSSKLAAKWPTKLVKNCFLPLREYFKYFSTELTSSL DNMT3B
MVAELISEEDLEFMKGDTRHLNGEEDAGGREDSILVNGACSDQSSDSPPILEAIRTPEIRGRRSSSRL SKREVSSLLSYTQDLTGDGDGEDGDGSDTPVMPKLFRETRTRSESPAVRTRNNNSVSSRERHRPSPRS TRGRQGRNHVDESPVEFPATRSLRRRATASAGTPWPSPPSSYLTIDLTDDTEDTHGTPQSSSTPYARL AQDSQQGGMESPQVEADSGDGDSSEYQDGKEFGIGDLVWGKIKGFSWWPAMVVSWKATSKRQAMSGMR WVQWFGDGKFSEVSADKLVALGLFSQHFNLATFNKLVSYRKAMYHALEKARVRAGKTFPSSPGDSLED QLKPMLEWAHGGFKPTGIEGLKPNNTQPENKTRRRTADDSATSDYCPAPKRLKTNCYNNGKDRGDEDQ SREQMASDVANNKSSLEDGCLSCGRKNPVSFHPLFEGGLCQTCRDRFLELFYMYDDDGYQSYCTVCCE GRELLLCSNTSCCRCFCVECLEVLVGTGTAAEAKLQEPWSCYMCLPQRCHGVLRRRKDWNVRLQAFFT SDTGLEYEAPKLYPAIPAARRRPIRVLSLFDGIATGYLVLKELGIKVGKYVASEVCEESIAVGTVKHE GNIKYVNDVRNITKKNIEEWGPFDLVIGGSPCNDLSNVNPARKGLYEGTGRLFFEFYHLLNYSRPKEG DDRPFFWMFENVVAMKVGDKRDISRFLECNPVMIDAIKVSAAHRARYFWGNLPGMNRPVIASKNDKLE LQDCLEYNRIAKLKKVQTITTKSNSIKQGKNQLFPVVMNGKEDVLWCTELERIFGFPVHYTDVSNMGR GARQKLLGRSWSVPVIRHLFAPLKDYFACE
Tabla 2
TALE hacia adelante
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQ VVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVA
TALE reverso
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQ VVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVA
Secuencias de nucleótidos de los sitios de unión TALE correspondientes
TALE hacia adelante
5'-TACCCAGATTGGCCCCACT-3'
TALE reverso
5'-TACCTAGAGGAGAAAGGTT-3'
Tabla 3
Secuencias de aminoácidos de los TALE que se dirigen a la región promotora B2M
TALE #1
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG TALE #2
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG TALE #3
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencias de nucleótidos de los sitios de unión TALE correspondientes
TALE #1
5'-TCTCTCCTACCCTCCCGCT-3'
TALE #2
5'-TGGTCCTTCCTCTCCCGCT-3'
TALE #3
5'-TCGCTCCGTGACTTCCCTT-3'
Tabla 4.
Cas9 catalíticamente inactivo (dCas9)
MGGRRVRWEVYISRALWLTREPTAYWLIEINTTHYRETQATGATMYPYDVPDYASPKKKRKVEASDKK YSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRY TRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRK KLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDA KAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLD NLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLP EKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPH QIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAI VDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDIL EDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLK SDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMG RHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGR DMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLN AKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVI TLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAK SEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQV NIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSV KELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELAL PSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNK HRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ LGGDSPKKKRKVG
Secuencias de nucleótidos de los sitios diana de los ARNg B2M
ARNg #1
TATAAGTGGAGGCGTCGCGC ARNg #2
GCCCGAATGCTGTCAGCTTC ARNg #3
TGCGTCGCTGGCTTGGAGAC ARNg #4
CCAATCAGGACAAGGCCCGC ARNg #5
AGGGTAGGAGAGACTCACGC ARNg #6
GCGGGCCACCAAGGAGAACT ARNg #7
GCTACTCTCTCTTTCTGGCC ARNg #8
CTCCCGCTCTGCACCCTCTG ARNg #9
TTTGGCCTACGGCGACGGGA ARNg #10
GGGGCAAGTAGCGCGCGTCC ARNg #11
TAGTCCAGGGCTGGATCTCG
Secuencias de nucleótidos de los ARNg de B2M ARNg #1: UAUAAGUGGAGGCGUCGCGC
ARNg #2: GCCCGAAUGCUGUCAGCUUC
ARNg #3: UGCGUCGCUGGCUUGGAGAC
ARNg #4: CCAAUCAGGACAAGGCCCGC
ARNg #5: AGGGUAGGAGAGACUCACGC
ARNg #6: GCGGGCCACCAAGGAGAACU
ARNg #7: GCUACUCUCUCUUUCUGGCC
ARNg #8: CUCCCGCUCUGCACCCUCUG
ARNg #9: UUUGGCCUACGGCGACGGGA
ARNg #10: GGGGCAAGUAGCGCGCGUCC
ARNg #11: UAGUCCAGGGCUGGAUCUCG
Tabla 5.
Secuencia de aminoácidos del TALE A dirigida a la región promotora B2M
TALE A
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
TALE A
5'-TGCTCGCGCTACTCTCTCT-3'
Tabla 6
Secuencias de nucleótidos de los ARNg dirigidos a BCL11A
ARNg #1 contra CpG 105 GCCUUUCUGCAGACGUUCCC
ARNg #2 contra CpG 105 UGGGUGUGCGCCUUGGCCGG
ARNg #3 contra CpG 105 CGGUGGUGAGAUGACCGCCU
ARNg #4 contra CpG 105 GGAAUGUGCUCACGGCGCCG
ARNg #5 contra CpG 105 GACUGCCCGCGCUUUGUCCU
ARNg #6 contra CpG 105 CCAGAGUCUGGCCCCCGGAG
ARNg #7 contra CpG 105 UCUGCGACCCUUAGGAGCCG
ARNg #8 contra CpG 105 GAGCGCCCCGCCAAGCGACU
ARNg #9 contra CpG 105 CAAGUCUCCAGGAGCCCGCG
ARNg #10 contra CpG 105 CGCGGAAUCCAGCCUAAGUU
ARNg #11 contra CpG 105: CCCGCUGCGGAGCUGUAACU
ARNg #1 contra CpG 31 CGCUCCUGAGUCCGCGGAGU
ARNg #2 contra CpG 31 CACGGCUCUCCCCGUCGCCG
ARNg #3 contra CpG 31 CCGCCUUUUGUUCCGGCCAG
ARNg #4 contra CpG 31 GCGCGAGGAGCCGGCACAAA
ARNg #5 contra CpG 31 GCCACUUUCUCACUAUUGUG
ARNg #6 contra CpG 31 GCUGCCUCUGAGGUUCGGUC
ARNg #7 contra CpG 31 AAGGGCAGGAGCUAGGGCCG
ARNg #8 contra CpG 31 GAGCCCGGACUGCUGCCUCC
ARNg #1 contra CpG 38 GUUUACAAGCACCGCGUGUG
ARNg #2 contra CpG 38 AACAGACAGAGGACCGAGCG
ARNg #3 contra CpG 38 GGCGCCGGGUGGGCGAUCCG
ARNg #4 contra CpG 38 GGUCGGGCAAGGCCCGGGCG
ARNg #5 contra CpG 38 AAGAGGUCUCGGCAUUGUGC
ARNg #6 contra CpG 38 GUUCCACAGCUUCGGGACCG
ARNg #7 contra CpG 38 GAAAUCGGCUGGGUGAAACU
ARNg #8 contra CpG 38 GCAGUGUCUCCGCGCCAGCC
ARNg #9 contra CpG 38 CCUCCCCUCCCCUCCGCCCU
ARNg #1 contra CpG 115 : UCCUCCUGUCCCGGGGUUAA
ARNg #2 contra CpG 115 : CAUCUUUUGGGACACUCUAGG
ARNg #3 contra CpG 115 : AAGUCAGGCCCUUCUUCGGAA
ARNg #4 contra CpG 115 : GCAGCCUGGACUGCGCGCCC
ARNg #5 contra CpG 115 : UGCCCGGCGAUUCUCGUCCG
ARNg #6 contra CpG 115 : UGAGCCAUUCGGUCGCUAGG
ARNg #7 contra CpG 115 : GGUGGUACUGAGGACCGGGA
ARNg #8 contra CpG 115 : AUUUUCUGGGUGCUCAGAGG
ARNg #9 contra CpG 115 : UGGUCUCAGCUCGCGCACGG
ARNg #10 contra CpG 115: ACAAAGACAUACGGGGUGAU
Secuencias de nucleótidos de los ARNg dirigidos a IFNAR1
ARNg #1: AGGAACGGCGCGUGCGCGGA
ARNg #2: AAGAGGCGGCGCGUGCGUAG
ARNg #3: GGGCGGUGUGACUUAGGACG
ARNg #4: CCAGAUGAUGGUCGUCCUCC
ARNg #5: GACCCUAGUGCUCGUCGCCG
ARNg #6: UGGGUGUUGUCCGCAGCCGC
ARNg #7: ACGGGGGCGGCGAUGCUGUU
ARNg #8: GACCGAAGGUUUCCCAGACU
ARNg #9: GUCGGGUUUAAUCUUUGGCG
ARNg #10: CGCUCCCGAGGACCCGUACA
ARNg #11: CGGGUCCCACCCCCGUGAAA
ARNg #12: UCAAAC UCGACACAAAGCU C
ARNg #13: GCGGAGCCGCGGUACUUUCC
Secuencias de nucleótidos de los ARNg dirigidos a VEGFA
ARNg #1: GGCGCGCGCGCUAGGUGGGA
ARNg #2: AGAGAGGCUCACCGCCCACG
ARNg #3: GUACGUGCGGUGACUCCGGU
Tabla 7
Secuencia de aminoácidos de los TALE dirigidos al gen BCL11A
TALE BCL11A #1
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCCAAAAGCCAGTCTCACC -3'
TALE BCL11A #2
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCTCCCCGGGAATCGTTTT -3'
TALE BCL11A #3
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ
VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente 5'TCCTCCCGCTGCACACTTG -3'
TALE BCL11A #4
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente 5'TAGTCATCCCCACAATAGT -3'
TALE BCL11A #5
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente 5'TCCCGCTGCCTTTTGTGCC -3'
TALE BCL11A #6
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCCTCGCGCTTGCCCTCCC -3'
TALE BCL11A #7
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCCCCCGGCCCTAGCTCCT -3'
TALE BCL11A #8
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCCTGGTCCGCCCCCAGCA -3'
TALE BCL11A #9
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TGCCGAGACCTCTTCTCGA -3'
TALE BCL11A #10
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVKRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCGGCTTTGCAAAGCATTT -3'
TALE BCL11A #11
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TGCAAAGCCGAGTTTCACC -3'
TALE BCL11A #12
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNHGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TACAGTTGCCCTGCAAAAT -3'
TALE BCL11A #13
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCCGCCCTGGGTACTTTCT -3'
TALE BCL11A #14
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCTCTTGTCCACAGCTCGG -3'
TALE BCL11A #15
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCTCCCGCTGACTGCGCCT -3'
TALE BCL11A #16
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidos del sitio de unión TALE correspondiente
5'TCCCTTGCTGCCAAACTTT -3'
TALE BCL11A #17
MGKPIPNPLLGLDSTGGMAPKKKRKVDGGVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHA HIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQ LLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQ VVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRR IPERTSHRVAGSGGG
Secuencia de nucleótidosdelsitiode uniónTALE correspondiente
5'TGGGCCCTCACGCCTTTCT -3'

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde la composición comprende una combinación de represores de transcripción artificial (ATR) seleccionados del grupo que consiste en: (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); (b) y (d); y (c) y (d); o polinucleótidos que los codifican, donde:
(a) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB;
(b) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L; y
(d) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
2. Un kit para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde el kit comprende una combinación de represores de transcripción artificial (ATR) seleccionados del grupo que consiste en: (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); (b) y (d); y (c) y (d), o polinucleótidos que los codifican, donde:
(a) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB;
(b) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L; y
(d) es un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1,
y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
3. La composición o kit de la reivindicación 1 ó 2, donde:
(i) el dominio KRAB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7;
(ii) el dominio DNMT3A comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con SEQ ID NO: 8; el dominio DNMT3B comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con SEQ ID NO: 9 o 36; y/o el dominio DNMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con SEQ ID NO: 10;
(iii) el dominio DNMT3L comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con SEQ ID NO: 11;
(iv) el dominio SETDB1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con SEQ ID NO: 12 o 13; y/o
(v) el dominio de unión al ADN de (a), (b), (c) o (d) comprende un dominio seleccionado independientemente de un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un dominio CRISPR/ sistema cas.
4. La composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB; un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A; y un ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótidos que lo codifican.
5. La composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los polinucleótidos que codifican los ATR están en forma de un solo vector o están comprendidos dentro de vectores separados.
6. La composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN, o un polinucleótido que la codifica, donde la proteína efectora separada que no está unida operativamente a un dominio de unión a ADN comprende un dominio seleccionado de los grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1.
7. La composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los ATR, o los polinucleótidos que los codifican, están en forma de una composición farmacéutica que comprende además un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. La composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, preferiblemente donde los ATR, o los polinucleótidos que los codifican, son una preparación combinada para la administración a un sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado, preferiblemente donde:
(i) la expresión transitoria de los ATR en una célula silencia la diana;
(ii) la administración de los ATR a una célula silencia permanentemente la diana;
(iii) la administración de los ATR a una célula silencia permanentemente la diana en la progenie de la célula; y/o (iv) se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
9. Un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB, o polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, dodne el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótidos que lo codifican, y donde los dominios de unión al ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
10. Un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, o un polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio KRAB, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, y/o un cuarto ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótidos que lo codifican, y donde los dominios de unión a ADN de las diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
11. Un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el ATR se administra a un sujeto simultáneamente , secuencialmente o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio KRAB, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y/o un cuarto ATR que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótidos que lo codifican, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
12. Un represor de transcripción artificial (ATR) que comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a un dominio SETDB1, o polinucleótido que lo codifica, para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, dodne el ATR se administra a un sujeto de forma simultánea, secuencial o por separado en combinación con un segundo ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1, y/o un tercer ATR que comprende un dominio de unión al ADN unido operativamente a un dominio DNMT3L, o polinucleótido que lo codifica, y donde los dominios de unión al ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
13. Uso de la composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el uso es in vitro o ex vivo, opcionalmente donde se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
14. Un represor de transcripción artificial (ATR) para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde el ATR comprende un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de los grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1,
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente al dominio de unión a ADN se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d), preferiblemente donde el dominio de unión a ADN comprende un dominio de unión a ADN TALE , un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas, y donde el dominio de unión a ADN se une a un sitio de unión seleccionado del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen diana o elemento genético; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana.
15. Un polinucleótido que codifica el ATR de la reivindicación 14.
16. Una composición para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde la composición comprende dos o más represores de transcripción artificial (ATR) diferentes, o polinucleótidos que los codifican, donde los dos o más ATR diferentes comprenden individualmente un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1,
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente a cada dominio de unión al ADN individual se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d), preferiblemente donde los dominios de unión al ADN de los dos o más ATR diferentes se seleccionan individualmente del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas, y donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
17. Un kit para silenciar un gen diana, un elemento genético o una variante de corte y empalme, donde el kit comprende dos o más represores de transcripción artificial (ATR) diferentes, o polinucleótidos que los codifican, donde los dos o más ATR diferentes comprenden individualmente un dominio de unión a ADN unido operativamente a dos o más dominios seleccionados de grupos (a), (b), (c) o (d):
(a) un dominio KRAB;
(b) un dominio DNMT3A, DNMT3B o DNMT1;
(c) un dominio DNMT3L; y
(d) un dominio SETDB1,
donde al menos dos de los dominios unidos operativamente a cada dominio de unión al ADN individual se seleccionan de diferentes grupos (a), (b), (c) o (d), preferiblemente donde los dominios de unión al ADN de los dos o más ATR diferentes se seleccionan individualmente del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN TALE, un dominio de dedo de zinc, un dominio de unión a ADN tetR, una meganucleasa o un sistema CRISPR/Cas, donde los dominios de unión a ADN de los diferentes ATR:
(i) se unen a sitios de unión seleccionados independientemente del grupo que consiste en: un sitio de unión dentro del gen o elemento genético diana; un sitio de unión dentro de una secuencia reguladora para el gen diana; y un sitio de unión dentro de un sitio de corte y empalme para el gen diana; y
(ii) se unen a diferentes sitios de unión o al mismo sitio de unión.
18. El ATR, polinucleótido, composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones 14-17 para usarse en terapia para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, opcionalmente donde se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
19. Uso de ATR, polinucleótido, composición o kit de cualquiera de las reivindicaciones 14-17 para silenciar un gen diana, elemento genético o variante de corte y empalme, donde el uso es in vitro o ex vivo, opcionalmente donde se silencian múltiples genes diana, elementos genéticos o variantes de corte y empalme.
20. Una célula que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1,3, 4 o 16, el ATR de la reivindicación 14 o el polinucleótido de la reivindicación 15.
21. Una célula, donde dicha célula es descendiente de la célula de la reivindicación 20, y donde el gen diana, el elemento genético o la variante de corte y empalme permanecen silenciados.
22. La célula de la reivindicación 20 o 21 para usarse en terapia.
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