JP2023543218A - 遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するための発現リプレッサー及び発現抑制系に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０８２，５５５号明細書及び２０２１年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／２４２，９５７号明細書の利益を主張する。前述した出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０８２，５５５号明細書及び２０２１年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／２４２，９５７号明細書の利益を主張する。前述した出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年９月１７日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｏ２０５７－７０１７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは６９４，８３１バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年９月１７日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｏ２０５７－７０１７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは６９４，８３１バイトである。
遺伝子発現の誤調節は、多くの疾患（例えば、哺乳類、例えばヒト）の根本的な原因である。遺伝子発現を短期間調節する技術は存在するが、多くの疾患の治療には、遺伝子発現の安定した長期にわたる調節が必要である。疾患関連遺伝子の発現を安定的に変化させる、例えば、低減するための新規なツール、システム、及び方法が必要とされる。
本開示は、とりわけ、標的遺伝子の発現を調節するために使用され得る発現リプレッサー及び発現抑制系を提供する。
いくつかの態様では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、標的遺伝子の発現を調節（例えば低減）することができるリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、第１リプレッサードメインと、第２リプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインとは異なる。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインと同一である。
いくつかの態様では、本開示は、第１ＤＮＡターゲティング部分及び第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、第２ＤＮＡターゲティング部分及び第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含む発現抑制系を特徴とする。一部の実施形態では、第１ＤＮＡターゲティング部分は、第１ＤＮＡ配列に特異的に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分は、第１ＤＮＡ配列とは異なる第２ＤＮＡ配列に特異的に結合する。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインとは異なる。一部の実施形態では、発現抑制系は、以下：（ｉ）第１ＤＮＡターゲティング部分、第１リプレッサードメイン、及び第２リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、（ｉｉ）第２ＤＮＡターゲティング部分、及び第１リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインの３つ全てが異なる。一部の実施形態では、少なくとも２つのリプレッサードメインは同一である。一部の実施形態では、発現抑制系は、以下：（ｉ）第１ＤＮＡターゲティング部分、第１リプレッサードメイン、及び第２リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、（ｉｉ）第２ＤＮＡターゲティング部分、第１リプレッサードメイン、及び第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインの４つ全てが異なる。一部の実施形態では、少なくとも２つのリプレッサードメインは同一である。
一般に、発現抑制系による標的遺伝子の発現の調節は、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーのそれぞれ第１及び第２ＤＮＡ配列への結合を含む。第１及び第２ＤＮＡ配列の結合は、第１及び第２リプレッサードメインの機能をそれらの部位に局在させる。理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態では、第１及び第２リプレッサードメインの両方の機能を使用すれば、第１及び／若しくは第２ＤＮＡ配列に結合するか、又はそれを含む標的遺伝子の発現を安定に抑制すると考えられ、例えば、この場合、第１及び／若しくは第２ＤＮＡ配列は、標的遺伝子の配列又は１つ以上の作動可能に連結した転写制御エレメントであるか、又はそれを含む。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～２１の配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するターゲティング部分を含む発現リプレッサー又は発現抑制系を提供し、ここで、上記発現リプレッサー又は発現抑制系は、標的遺伝子の発現を低減することができる。
いくつかの態様では、本開示は、以下：標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合するＤＮＡターゲティング部分（任意選択で、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む）と；リプレッサードメインと、を含む発現リプレッサーを提供する。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合するＤＮＡターゲティング部分（任意選択で、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む）と、第１リプレッサードメインと、第２リプレッサードメインと、を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインと同一である。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインと同一ではない。
いくつかの態様では、本開示は、以下：（ｉ）標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合する第１ＤＮＡターゲティング部分（任意選択で、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む）と；第１リプレッサードメインと、を含む第１発現リプレッサー；及び標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合する第２ＤＮＡターゲティング部分（任意選択で、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む）と；第１リプレッサードメインと、を含む第２発現リプレッサーを含む発現制御系を提供する。一部の実施形態では、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーの第１リプレッサードメインは同一である。一部の実施形態では、第１及び第２発現リプレッサーの第１抑制ドメインは異なる。一部の実施形態では、第１ＤＮＡターゲティング部分と第２ＤＮＡターゲティング部分は同一である。一部の実施形態では、第１ＤＮＡターゲティング部分と第２ＤＮＡターゲティング部分は異なる。一部の実施形態では、発現制御系は、以下：標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合する第１ＤＮＡターゲティング部分（任意選択で、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む）と；第１リプレッサードメインと、第２リプレッサードメインと、を含む第１発現リプレッサー；及び標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合する第２ＤＮＡターゲティング部分（任意選択で、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む）と；第１リプレッサードメインと、第２リプレッサードメインと、を含む第２発現リプレッサーを含む。一部の実施形態では、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーの第１リプレッサードメインは、同一である。一部の実施形態では、第１及び第２発現リプレッサーの第１抑制ドメインは、異なる。一部の実施形態では、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーの第２リプレッサードメインは同一である。一部の実施形態では、第１及び第２発現リプレッサーの第２抑制ドメインは異なる。
いくつかの態様では、本開示は、発現リプレッサー又はその成分（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、第１発現リプレッサー、第２発現リプレッサー、その両方、又はその成分（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸に関する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターに関する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、又はベクターを含む細胞に関する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のベクター、核酸、発現抑制系、又は発現リプレッサーを含む脂質ナノ粒子に関する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、又は脂質ナノ粒子を含む反応混合物に関する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の発現抑制系、核酸、又はベクターを含む医薬組成物に関する。
いくつかの態様では、本開示は、標的遺伝子の発現を低減する方法に関し、これは、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系を用意するステップ、並びに標的遺伝子及び／又は１つ以上の作動可能に連結した転写制御エレメントを発現リプレッサー又は発現抑制系と接触させるステップを含み、それにより、標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における標的遺伝子の過剰発現に関連する状態を治療する方法に関し、これは、本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、核酸、又はベクターを上記対象に投与するステップを含み、それによって上記状態を治療する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における標的遺伝子の誤調節に関連する状態を治療する方法に関し、これは、本明細書に記載される発現リプレッサー又は発現抑制系、核酸、又はベクターを上記対象に投与するステップを含み、それによって上記状態を治療する。
前述した方法又は組成物のいずれかの別の特徴は、以下に列挙される実施形態の１つ又は複数を含む。
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識するか、又は常用的な実験を用いるだけでそれらを確認することができるだろう。こうした同等物は、以下に列挙される実施形態に包含されることが意図される。
本明細書に挙げる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書、例えば、本明細書のいずれかの表で参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示しない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０１９年９月２３日現在のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質が、複数の配列アクセッション番号を示す場合には、全ての配列変異体が包含される。
実施形態の列挙
１．以下：
ＤＮＡターゲティング部分と、
リプレッサードメインと
を含む、発現リプレッサーであって、
上記発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減することができる、発現リプレッサー。
１．以下：
ＤＮＡターゲティング部分と、
リプレッサードメインと
を含む、発現リプレッサーであって、
上記発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減することができる、発現リプレッサー。
２．上記ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサー、スーパーエンハンサー、若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））に結合するか、又は上記転写調節エレメントに近接した配列に結合する、実施形態１に記載の発現リプレッサー。
３．上記リプレッサードメインが、上記ＤＮＡターゲティング部分に共有結合的に連結されている、実施形態１又は２に記載の発現リプレッサー。
４．上記リプレッサードメインが、リンカーを介して上記ＤＮＡターゲティング部分に連結されている、実施形態１又は２の発現リプレッサー。
５．上記リプレッサードメインが、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１～４のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６．上記リプレッサードメインが、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、実施形態１～４のいずれかに記載の発現リプレッサー。
７．上記リプレッサードメインが、配列番号４７～５６のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によってコードされる、実施形態１～６のいずれかに記載の発現リプレッサー。
８．上記リプレッサードメインが、配列番号５７～６６、９０のいずれかに記載のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の発現リプレッサー。
９．上記リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号５７若しくは９０のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１０．上記リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ１又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号５８のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１１．上記リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号５９若しくは６０のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１２．上記リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号６１のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１３．上記リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号６２のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１４．上記リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号６３のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１５．上記リプレッサードメインが、ＬＳＤ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１６．上記リプレッサードメインが、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、任意選択で、上記リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１７．上記リプレッサードメインが、ＦＯＧ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、上記リプレッサードメインは、配列番号６６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１８．第２リプレッサードメインをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
１９．上記ＤＮＡターゲティング部分が、上記リプレッサードメインと第２リプレッサードメインとの間に位置する、実施形態１８に記載の発現リプレッサー。
２０．以下：
ＤＮＡターゲティング部分、
第１リプレッサードメイン及び
第２リプレッサードメイン、
を含む発現リプレッサーであって、上記発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減することができる、発現リプレッサー。
ＤＮＡターゲティング部分、
第１リプレッサードメイン及び
第２リプレッサードメイン、
を含む発現リプレッサーであって、上記発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減することができる、発現リプレッサー。
２１．上記ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子に作動可能に連結した転写調節エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサー、スーパーエンハンサー、若しくは転写開始部位（ＴＳＳ））に結合するか、又は前記転写調節エレメントに近接した配列に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
２２．第１リプレッサードメインが、第２リプレッサードメインと同一である、実施形態１８～２１のいずれかに記載の発現リプレッサー。
２３．第１リプレッサードメインが、第２リプレッサードメインと同一ではない、実施形態１８～２１のいずれかに記載の発現リプレッサー。
２４．第１リプレッサードメイン及び第２リプレッサードメインが、ＤＮＡターゲティング部分に共有結合で連結されている、実施形態１８～２３のいずれかに記載の発現リプレッサー。
２５．第１リプレッサードメインが、第１リンカーを介してＤＮＡターゲティング部分に連結され、第２リプレッサードメインが、第２リンカーを介してＤＮＡターゲティング部分に連結される、実施形態１８～２４のいずれかに記載の発現リプレッサー。
２６．第１リンカーが、第２リンカーと同一である、実施形態２５に記載の発現リプレッサー。
２７．第１リンカーが、第２リンカーと同一ではない、実施形態２５に記載の発現リプレッサー。
２８．第１リプレッサードメインが、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、実施形態１８～２７のいずれかに記載の発現リプレッサー。
２９．第２リプレッサードメインが、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～２８のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３０．第１リプレッサードメインのＣ末端が、第１リンカーを介してＤＮＡターゲティング部分のＮ末端に連結され、第２リプレッサードメインのＮ末端が、第２リンカーを介してＤＮＡターゲティング部分のＣ末端に連結されている、実施形態２５～２９のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３１．以下：
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第１リプレッサードメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；且つ
第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第２リプレッサードメインは、配列番号６１のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～３０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第１リプレッサードメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；且つ
第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第２リプレッサードメインは、配列番号６１のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～３０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３２．以下：
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第１リプレッサードメインは、配列番号６２のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；且つ
第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第２リプレッサードメインは、配列番号６１のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～３０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第１リプレッサードメインは、配列番号６２のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；且つ
第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第２リプレッサードメインは、配列番号６１のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～３０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３３．以下：
第１リプレッサードメインが、ＦＯＧ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第１リプレッサードメインは、配列番号６６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；且つ
第２リプレッサードメインが、ＦＯＧ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第２リプレッサードメインは、配列番号６６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～３０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
第１リプレッサードメインが、ＦＯＧ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第１リプレッサードメインは、配列番号６６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；且つ
第２リプレッサードメインが、ＦＯＧ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、ここで、第２リプレッサードメインは、配列番号６６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、実施形態１８～３０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３４．上記ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合する、実施形態１～３３のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３５．上記ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質）、ジンクフィンガードメイン、又はＴＡＬエフェクター分子を含む、実施形態１～３４のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３６．上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子が、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａから選択される１つ以上の変異を含む、実施形態３５に記載の発現リプレッサー。
３７．上記ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子のプロモータ領域、エンハンサー領域（例えば、スーパーエンハンサー領域）、又はアンカー配列に結合する、実施形態１～３６のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３８．リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、又はＦＯＧ１を含む、実施形態１～３７のいずれかに記載の発現リプレッサー。
３９．第１リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、又はＦＯＧ１を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、又はＦＯＧ１を含む、実施形態１８～３８のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４０．上記発現リプレッサーが、配列番号２２～３２、９２、９５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によりコードされる、実施形態１～３９のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４１．上記発現リプレッサーが、配列番号３３～３６、３８～４４、６７～６９、９３、９６のいずれかから選択されるアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む、実施形態１～４０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４２．上記ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４５若しくは８９のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によりコードされる、実施形態１～４１のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４３．上記ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４６若しくは８８のいずれかに記載のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む、実施形態１～４２のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４４．以下：
（ｉ）第１リプレッサードメインが、配列番号４７～５６、９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によりコードされ、且つ
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、配列番号４７～５６、９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によりコードされる、
実施形態１８～４３のいずれかに記載の発現リプレッサー。
（ｉ）第１リプレッサードメインが、配列番号４７～５６、９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によりコードされ、且つ
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、配列番号４７～５６、９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列によりコードされる、
実施形態１８～４３のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４５．以下：
（ｉ）第１リプレッサードメインが、配列番号５７～６６のいずれかに記載のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、且つ
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、配列番号５７～６６のいずれかに記載のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む、
実施形態１８～４３のいずれかに記載の発現リプレッサー。
（ｉ）第１リプレッサードメインが、配列番号５７～６６のいずれかに記載のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含み、且つ
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、配列番号５７～６６のいずれかに記載のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む、
実施形態１８～４３のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４６．上記ＤＮＡターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼドメイン、又はオリゴヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４７．上記ＤＮＡターゲティング部分が、ｇＲＮＡ、例えば、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するｇＲＮＡをさらに含み、例えば、ここで、上記ｇＲＮＡは、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４８．上記ＤＮＡターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と、ｇＲＮＡ、例えば、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するｇＲＮＡとを含み、例えば、ここで、上記ｇＲＮＡは、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む配列を含み、且つ、上記リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭｔ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、又はＦＯＧ１から選択される部分を含む、実施形態３５～４７のいずれかに記載の発現リプレッサー。
４９．上記ＤＮＡターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と、ｇＲＮＡ、例えば、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するｇＲＮＡとを含み、例えば、ここで、上記ｇＲＮＡは、配列番号１～２１のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む配列を含み、第１リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭ Ｔ３ａ／３Ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、又はＦＯＧ１から選択される部分を含み、且つ、第２ドメインが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭｔ３ａ／３Ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、又はＦＯＧ１から選択される部分を含む、実施形態３５～４７のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５０．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質、又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含む、実施形態３５～４９のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子が、触媒として不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、ｄＣａｓ９を含む、実施形態３５～５０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５２．（ｉ）１つ以上の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）を含むか、又は（ｉｉ）ＮＬＳを含まない、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５３．Ｎ末端に第１ＮＬＳを含み、例えば、第１ＮＬＳが、配列番号８６の配列を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５４．Ｃ末端に、例えば、配列番号８７の配列を有するＮＬＳ、例えば第２ＮＬＳを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５５．第１及び第２ＮＬＳが、同じ配列を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５６．第１及び第２ＮＬＳが、異なる配列を有する、実施形態５２～５５のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５７．エピトープタグを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
５８． 上記エピトープタグが、ＨＡタグ、例えば、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＡタグである、実施態様５７に記載の発現リプレッサー。
５９．上記アンカー配列が、配列番号８１若しくは８２の配列、又はそれに対して８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の改変を有する配列を含む、実施形態３７～５８のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６０．上記アンカー配列が、配列番号８３若しくは８４に記載の配列、又はそれに対して８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の改変を有する配列を含む、実施形態３７～５８のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６１．上記アンカー配列が、上記遺伝子と同じ染色体上にある、実施形態３７～６０のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６２．上記アンカー配列が、上記標的遺伝子の上流（例えば、ＴＳＳの上流又は上記プロモータの上流）にある、実施形態３７～６１のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６３．上記アンカー配列が、上記標的遺伝子の下流（例えば、ＴＳＳの下流又はプロモータの上流）にある、実施形態３７～６１のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６４．上記発現リプレッサーと標的遺伝子座の結合が、上記発現リプレッサーの非存在下での標的遺伝子の発現と比較して、細胞における上記標的遺伝子の発現を１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６５．上記発現リプレッサーと標的遺伝子座の結合が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２日の期間にわたり上記標的遺伝子の発現を、認め得るほどに低減する、先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６６．第１及び／又は第２リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストン修飾複合体のリクルーターを含む、実施形態１８～６５のいずれかに記載の発現リプレッサー。
６７．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとを含む第１発現リプレッサー、及び
第２ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとを含む第２発現リプレッサー
を含む発現抑制系であって、
第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列に特異的に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列とは異なる第２ＤＮＡ配列に特異的に結合し、
第１リプレッサードメインが、第２リプレッサードメインとは異なる、
発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとを含む第１発現リプレッサー、及び
第２ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとを含む第２発現リプレッサー
を含む発現抑制系であって、
第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列に特異的に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列とは異なる第２ＤＮＡ配列に特異的に結合し、
第１リプレッサードメインが、第２リプレッサードメインとは異なる、
発現抑制系。
６８．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとを含む第１発現リプレッサー、及び
第２ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとを含む第２発現リプレッサー
を含む発現抑制系であって、
第１又は第２リプレッサードメインが、ＭＱ１ドメイン又はその機能性変異体若しくは断片を含み、
第１リプレッサードメインが、第２リプレッサードメインとは異なる、
発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとを含む第１発現リプレッサー、及び
第２ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとを含む第２発現リプレッサー
を含む発現抑制系であって、
第１又は第２リプレッサードメインが、ＭＱ１ドメイン又はその機能性変異体若しくは断片を含み、
第１リプレッサードメインが、第２リプレッサードメインとは異なる、
発現抑制系。
６９．第１発現リプレッサーが、第３リプレッサードメインをさらに含む、実施形態６７又は６８に記載の発現抑制系。
７０．第２発現リプレッサーが、第４リプレッサードメインをさらに含む、実施形態６７～６９のいずれかに記載の発現抑制系。
７１．第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列に特異的に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列とは異なる第２ＤＮＡ配列に特異的に結合する、実施形態６７～７０のいずれかに記載の発現抑制系。
７２．第１ＤＮＡターゲティング部分及び第２ＤＮＡターゲティング部分が、同じＤＮＡ配列に特異的に結合する、実施形態６７～７０のいずれかに記載の発現抑制系。
７３．第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡを含む第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含み、第２ＤＮＡターゲティング部分が、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第２ガイドＲＮＡとを含む第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、実施形態６７～７２のいずれかに記載の発現抑制系。
７４．第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、第２ガイドＲＮＡに結合せず、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００、又は１０，０００ｎＭのＫＤで結合し、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、第１ガイドＲＮＡに結合せず、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００、又は１０，０００ｎＭのＫＤで結合する、実施形態７３に記載の発現抑制系。
７５．第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む、実施形態７３又は７４のいずれかに記載の発現抑制系。
７６．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、実施形態６７～７５のいずれかに記載の発現抑制系。
７７．第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含む第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含み、第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択される異なるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質、又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含む第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、実施形態６７～７６のいずれかに記載の発現抑制系。
７８．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む、実施形態７０～７７のいずれかに記載の発現抑制系。
７９．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片、例えば、そのいずれかのＳＥＴドメインから選択されるタンパク質を含む、実施形態７０～７８の発現抑制系。
８０．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性（例えば、リジンデメチラーゼ活性）を含む、実施形態７０～７９のいずれかに記載の発現抑制系。
８１．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６（又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）から選択されるタンパク質を含む、実施形態７０～８０のいずれかに記載の発現抑制系。
８２．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含む、実施形態７０～８１のいずれかに記載の発現抑制系。
８３．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそれらのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、実施形態７０～８２のいずれかに記載の発現抑制系。
８４．第１、第２、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む、実施形態７０～８３のいずれかに記載の発現抑制系。
８５．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、又はそれらのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、実施形態７０～８４の発現抑制系。
８６．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含む、実施形態７０～８５のいずれかに記載の発現抑制系。
８７．第１、第２、第３、又は第４リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、実施形態７０～８６の発現抑制系。
８８．以下：
第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む、
実施形態６７～８７のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む、
実施形態６７～８７のいずれかに記載の発現抑制系。
８９．以下：
（ｉ）第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第３リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含む、
実施形態６９～８８のいずれかに記載の発現抑制系。
（ｉ）第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第３リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含む、
実施形態６９～８８のいずれかに記載の発現抑制系。
９０．以下：
（ｉ）第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含み、
（ｉｉｉ）第３リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６９～８９のいずれかに記載の発現抑制系。
（ｉ）第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含み、
（ｉｉｉ）第３リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６９～８９のいずれかに記載の発現抑制系。
９１．以下：
（ｉ）第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含み、
（ｉｉｉ）第３リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｖ）第４リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含む、
実施形態７０～９０のいずれかに記載の発現抑制系。
（ｉ）第１リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含み、
（ｉｉｉ）第３リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｖ）第４リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含む、
実施形態７０～９０のいずれかに記載の発現抑制系。
９２．以下：
（ｉ）第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第４リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含む、
実施形態７０～９１のいずれかに記載の発現抑制系。
（ｉ）第２リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ちＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、
（ｉｉ）第４リプレッサードメインが、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質（例えば、異なるタンパク質）を含む、
実施形態７０～９１のいずれかに記載の発現抑制系。
９３．第１リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
９４．第１リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
９５．第１リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
９６．第１リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
９７．第１リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
９８．第１リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む（例えば、この場合、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は、互いに同一であるか、又は異なる）、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
９９．第１リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１００．第１リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０１．第１リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインがＤＮＡデメチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０２．第１リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０３．第１リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ヒストンデメチラーゼ活性を含む（例えば、この場合、ヒストンデメチラーゼ活性は、互いに同じであるか、又は異なる）、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０４．第１リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０５．第１リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０６．第１リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが転写リプレッサー活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０７．第１リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ヒストンデアセチラーゼ活性を含む（例えば、ヒストンデアセチラーゼ活性は互いに同じであるか、又は異なる）、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０８．第１リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１０９．第１リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１１０．第１リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む（例えば、この場合、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性は、互いに同一であるか、又は異なる）、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１１１．第１リプレッサードメインが、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含む、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１１２．第１リプレッサードメインが、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む（例えば、この場合、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性は、互いに同じであるか、又は異なる）、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１１３．第１リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含み、第２リプレッサードメインが、転写リプレッサー活性を含む（例えば、この場合、転写リプレッサー活性は、互いに同じであるか、又は異なる）、実施形態６７～９２のいずれかに記載の発現抑制系。
１１４．以下：
第１リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、ＳＥＴドメイン（例えば、ＳＥＴＤＢ１、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、又はＳＵＶ３９Ｈ１のＳＥＴドメイン）、ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１、ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）、ＫＡＰ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体、細菌性ＭＱ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６７～１１３のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、ＳＥＴドメイン（例えば、ＳＥＴＤＢ１、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、又はＳＵＶ３９Ｈ１のＳＥＴドメイン）、ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１、ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）、ＫＡＰ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体、細菌性ＭＱ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６７～１１３のいずれかに記載の発現抑制系。
１１５．以下：
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＦＯＧ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ、ＤＮＭＴ１、ＬＳＤ１、ＦＯＧ１、ＫＲＡＢ、ＨＤＡＣ８、細菌性ＭＱ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６７～１１４のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＦＯＧ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ、ＤＮＭＴ１、ＬＳＤ１、ＦＯＧ１、ＫＲＡＢ、ＨＤＡＣ８、細菌性ＭＱ１、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６７～１１４のいずれかに記載の発現抑制系。
１１６．以下：
（ｉ）第１リプレッサードメインが、以下：ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＡＰ１、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、以下：ＫＲＡＢ、ＦＯＧ１、Ｇ９Ａ、ＬＳＤ１、ＨＤＡＣ８、ＥＺＨ２、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＢＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６７～１１５のいずれかの発現抑制系。
（ｉ）第１リプレッサードメインが、以下：ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＡＰ１、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
（ｉｉ）第２リプレッサードメインが、以下：ＫＲＡＢ、ＦＯＧ１、Ｇ９Ａ、ＬＳＤ１、ＨＤＡＣ８、ＥＺＨ２、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＢＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、
実施形態６７～１１５のいずれかの発現抑制系。
１１７．第１リプレッサードメインが、ＫＲＡＢを含み、第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）を含む、実施形態６７～１１６のいずれかに記載の発現抑制系。
１１８．第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含む、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の発現抑制系。
１１９．第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又は機能的変異体若しくはそのフラグメントを含み、第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又は機能的変異体若しくはそのフラグメントを含む、実施形態６７～１１８のいずれかに記載の発現抑制系。
１２０．第１リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能的変異体若しくはそのフラグメントを含み、第２リプレッサードメインが、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含む、実施形態６７～１１９のいずれかに記載の発現抑制系。
１２１．以下：
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２２．以下：
第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２３．以下：
第１リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２４．以下：
第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２５．以下：
第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２６．以下：
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２７．以下：
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６７～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２８．以下：
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、上記第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、上記第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり；
第２リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１２９．以下：
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１３０．以下：
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１３１．以下：
第１リプレッサードメインが、ＦＯＧ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＦＯＧ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＦＯＧ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＦＯＧ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１３２．以下：
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１２０のいずれかに記載の発現抑制系。
１３３．以下：
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１３０のいずれかに記載の発現抑制系。
第１リプレッサードメインが、Ｇ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第１リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端であり、
第３リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第３リプレッサードメインは、第１ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端であり、
第２リプレッサードメインが、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片を含み、任意選択で、第２リプレッサードメインは、第２ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端である、
実施形態６９～１３０のいずれかに記載の発現抑制系。
１３４．第１ＤＮＡターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドから選択される、実施形態６７～１３３のいずれかに記載の発現抑制系。
１３５．第２ＤＮＡターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドから選択される、実施形態６７～１３４のいずれかに記載の発現抑制系。
１３６．第１ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含む）と、ガイドＲＮＡと、を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、若しくはそれを含む、実施形態６７～１３５のいずれかに記載の発現抑制系。
１３７．第２ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含む）と、ガイドＲＮＡと、を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、若しくはそれを含む、実施形態６７～１３６のいずれかに記載の発現抑制系。
１３８．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含む異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
実施形態６７～１３７のいずれかに記載の発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含む異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
実施形態６７～１３７のいずれかに記載の発現抑制系。
１３９．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４５又は８９の核酸配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４５又は８９の核酸配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
実施形態１３５～１３８のいずれかに記載の発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４５又は８９の核酸配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４５又は８９の核酸配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
実施形態１３５～１３８のいずれかに記載の発現抑制系。
１４０．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４６又は８８のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４６又は８８のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
実施形態１３５～１３８のいずれかに記載の発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４６又は８８のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、配列番号４６又は８８のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
実施形態１３５～１３８のいずれかに記載の発現抑制系。
１４１．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、プロモータ配列に特異的に結合するか、又はプロモータ配列、例えば、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ配列に近接するＤＮＡに特異的に結合する、実施形態６７～１４０のいずれかに記載の発現抑制系。
１４２．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、エンハンサー配列に特異的に結合するか、又はエンハンサー配列、例えば、標的遺伝子の発現に影響を及ぼし、且つ／若しくは標的遺伝子に作動可能に連結したエンハンサー配列に近接するＤＮＡに特異的に結合する、実施形態６７～１４１のいずれかに記載の発現抑制系。
１４３．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子、例えば、標的遺伝子の転写開始部位と終止コドンとの間に含まれる配列に特異的に結合する、実施形態６７～１４２のいずれかに記載の発現抑制系。
１４４．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子の転写開始部位に特異的に結合する、実施形態６７～１４３のいずれかに記載の発現抑制系。
１４５．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子のイントロン、例えば、イントロンに関連するスプライス部位に特異的に結合する、実施形態６７～１４４のいずれかに記載の発現抑制系。
１４６．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、標的遺伝子のエキソンに特異的に結合する、実施形態６７～１４５のいずれかに記載の発現抑制系。
１４７．第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、アンカー配列に特異的に結合する、実施形態６７～１４６のいずれかに記載の発現抑制系。
１４８．上記アンカー配列が、配列番号８１若しくは８２の配列、又はそれに対して８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の改変を有する配列を含む、実施形態１４７に記載の発現抑制系。
１４９．上記アンカー配列が、配列番号８３若しくは８４の配列、又はそれに対して８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の改変を有する配列を含む、実施形態１４７に記載の発現抑制系。
１５０．上記アンカー配列が、上記遺伝子と同じ染色体上にある、実施形態１４７～１４９のいずれかに記載の発現抑制系。
１５１．上記アンカー配列が、上記遺伝子とは異なる染色体上にある、実施形態１４７～１４９のいずれかに記載の発現抑制系。
１５２．上記アンカー配列が、標的遺伝子の上流（例えば、ＴＳＳの上流又はプロモータの上流）にある、実施形態１４７～１５１のいずれかに記載の発現抑制系。
１５３．上記アンカー配列が、標的遺伝子の下流（例えば、ＴＳＳの下流又はプロモータの上流）にある、実施形態１４８～１５１のいずれかに記載の発現抑制系。
１５４．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内又はそれに近接する第１部位であり、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内又はそれに近接する第２部位である、実施形態６７～１４１のいずれかに記載の発現抑制系。
１５５．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内であるか、又はそれに近接し、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の発現に影響を及ぼすか、若しくはそれに作動可能に連結したエンハンサー内であるか、又はそれに近接している、実施形態６７～１４２のいずれかに記載の発現抑制系。
１５６．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の発現に影響を与えるか、若しくはそれに作動可能に連結したエンハンサー内であるか、又はそれに近接し、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内であるか、又はそれに近接している、実施形態６７～１４２のいずれかに記載の発現抑制系。
１５７．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を含み、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内であるか、又はそれに近接している、実施形態６７～１４１又は１４３のいずれかに記載の発現抑制系。
１５８．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を含み、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の発現に影響を及ぼすか、若しくはそれに作動可能に連結したエンハンサー内であるか、又はそれに近接している、実施形態６７～１４０、１４２又は１４３のいずれかに記載の発現抑制系。
１５９．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内であるか、又はそれに近接し、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位である、実施例６７～１４１又は１４３のいずれかに記載の発現抑制系。
１６０．第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の発現に影響を及ぼすか、若しくはそれに作動可能に連結したエンハンサー内であるか、又はそれに近接し、第２ＤＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位である、実施形態６７～１４０、１４２、又は１４３のいずれかに記載の発現抑制系。
１６１．第１ＤＮＡ配列と第２ＤＮＡ配列との間の距離が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、若しくは１０００塩基対、又はその間の任意のサイズ、例えば、２０～５００塩基対である、実施形態６７～１６０のいずれかに記載の発現抑制系。
１６２．第１ＤＮＡ配列と第２ＤＮＡ配列との間の距離が、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、若しくは１０００塩基対以下、又はその間の任意のサイズ、例えば、２０～５００塩基対である、実施形態６７～１６１のいずれかに記載の発現抑制系。
１６３．第１ＤＮＡ配列と第２ＤＮＡ配列が、異なる核酸、例えば、異なる染色体上に位置する、実施形態６７～１６２のいずれかに記載の発現抑制系。
１６４．上記標的遺伝子が、β－２－ミクログロブリン、ＭＹＣ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＧＡＴＡ１、ＡＰＯＢ、ＦＯＸＰ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及び／又はＣＸＣＬ８である、実施形態６７～１６３のいずれかに記載の発現抑制系。
１６５．第１ガイドＲＮＡが、第１ＤＮＡ配列に特異的な、例えば、相補的な配列を含み、第２ガイドＲＮＡは、第２ＤＮＡ配列に特異的な、例えば、相補的な配列を含む、実施形態７３～１６４のいずれかに記載の発現抑制系。
１６６．第１ＤＮＡターゲティング部分が、第２ＤＮＡ配列に、認め得るほどに結合せず、且つ第２ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列に、認め得るほどに結合しない、実施形態６７～１６５のいずれかに記載の発現抑制系。
１６７．第１ＤＮＡターゲティング部分が、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、又は１００，０００ｎＭのＫＤで第２ＤＮＡ配列に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分が、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、又は１００，０００ｎＭのＫＤで第１ＤＮＡ配列に結合する、実施形態６７～１６６のいずれかに記載の発現抑制系。
１６８．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合が、標的遺伝子、例えば、細胞における第１ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を低減する、実施形態６７～１６７のいずれかに記載の発現抑制系。
１６９．例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、発現が、第１発現リプレッサーの非存在下での発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、実施形態１６８に記載の発現抑制系。
１７０．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、標的遺伝子、例えば、第１ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０細胞分裂の期間にわたって、認め得るほどに低減する、実施形態６７～１６９のいずれかに記載の発現抑制系。
１７１．第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合が、細胞における標的遺伝子、例えば、第２ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を低減する、実施形態６７～１７０のいずれかに記載の発現抑制系。
１７２．例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、発現が、第２発現リプレッサーの非存在下での発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、実施形態１７１に記載の発現抑制系。
１７３．第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、標的遺伝子、例えば、第２ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０細胞分裂の期間にわたって、認め得るほどに低減する、実施形態６７～１７２のいずれかに記載の発現抑制系。
１７４．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合及び第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合が、細胞内の標的遺伝子、例えば、第１ＤＮＡ配列及び／又は第２ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を低減する、実施形態６７～１７３のいずれかに記載の発現抑制系。
１７５．例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、発現が、第１及び第２発現リプレッサーの非存在下での発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、実施形態１７４の発現抑制系。
１７６．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合及び第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合が、標的遺伝子、例えば、第１ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０細胞分裂の期間にわたって、認め得るほどに低減する、実施形態１～１７５のいずれかに記載の発現抑制系。
１７７．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合及び第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合によって起こる発現の低減が、第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合又は第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合によって個別に起こる発現の低減よりも大きい、実施形態１７４～１７６のいずれかに記載の発現抑制系。
１７８．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合及び第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合又は第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合の各々いずれかよりも、発現を１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、５０×、又は１００×多く低減する、実施形態１７７の発現抑制系。
１７９．第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合及び第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合によって起こる発現が、第１発現リプレッサーと第１ＤＮＡ配列との結合又は第２発現リプレッサーと第２ＤＮＡ配列との結合によって個別に起こる発現の低減よりも長い時間（例えば、より多くの時間、日数、又は細胞分裂）にわたって持続する、実施形態１７４～１７８に記載の発現抑制系。
１８０．第１発現リプレッサーの第１ＤＮＡ配列への結合及び第２発現リプレッサーの第２ＤＮＡ配列への結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、第１発現リプレッサーの第１ＤＮＡ配列への結合又は第２発現リプレッサーの第２ＤＮＡ配列への結合の各々いずれかよりも発現を１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、５０×、又は１００×長く（例えば時間、日数、若しくは細胞分裂で測定して）低減する、実施形態１７９の発現抑制系。
１８１．上記細胞が、２４、３６、４８、６０、又は７２時間毎に１回以下（任意選択で、２４、３６、４８、６０、又は７２時間毎に少なくとも１回）の速度で分裂する、実施形態１７４～１８０のいずれかに記載の発現抑制系。
１８２．上記細胞が、２４、３６、４８、６０、又は７２時間毎に少なくとも１回（また任意選択で、２４、３６、４８、６０、又は７２時間毎に１回以下）の速度で分裂する、実施形態１７４～１８１のいずれかに記載の発現抑制系。
１８３．発現が、無期限に（例えば、実験で測定可能な期間より長い期間にわたって）認め得るほどに低減する、実施形態１７４～１８２のいずれかに記載の発現抑制系。
１８４．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号４６のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９；又は表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号８８のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９を含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号４６のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９；又は表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号８８のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、
実施形態６７～１８３のいずれかに記載の発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号４６のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９；又は表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号８８のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９を含み、
第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号４６のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９；又は表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９、例えば、配列番号８８のアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、
実施形態６７～１８３のいずれかに記載の発現抑制系。
１８５．以下：
第１ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、触媒として不活性なｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａ変異から選択される１つ以上の突然変異を有するｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含み；
第２ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、触媒として不活性なｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａ変異から選択される１つ以上の突然変異を有するｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、
実施形態６７～１８４のいずれかに記載の発現抑制系。
第１ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、触媒として不活性なｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａ変異から選択される１つ以上の突然変異を有するｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含み；
第２ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、触媒として不活性なｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａ変異から選択される１つ以上の突然変異を有するｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、
実施形態６７～１８４のいずれかに記載の発現抑制系。
１８６．以下：
第１発現リプレッサーが、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む第１ＤＮＡターゲティング部分と、ＫＲＡＢ又はその機能的変異体若しくは断片を含む第１リプレッサードメインとを含み；
第２発現リプレッサーが、表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む第２ＤＮＡターゲティング部分と、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含む第２リプレッサードメインとを含む、
実施形態６７～１８５のいずれかに記載の発現抑制系。
第１発現リプレッサーが、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む第１ＤＮＡターゲティング部分と、ＫＲＡＢ又はその機能的変異体若しくは断片を含む第１リプレッサードメインとを含み；
第２発現リプレッサーが、表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む第２ＤＮＡターゲティング部分と、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含む第２リプレッサードメインとを含む、
実施形態６７～１８５のいずれかに記載の発現抑制系。
１８７．以下：
ＤＮＡターゲティング部分と；
細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインと、
を含むポリペプチド。
ＤＮＡターゲティング部分と；
細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインと、
を含むポリペプチド。
１８８．以下：
ＤＮＡターゲティング部分と；
ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、ＦＯＧ１、又はその機能的変異体若しくは断片を含む第１リプレッサードメインと、
ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、ＦＯＧ１、又はその機能的変異体若しくは断片を含む第２リプレッサードメインと、
を含むポリペプチド。
ＤＮＡターゲティング部分と；
ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、ＦＯＧ１、又はその機能的変異体若しくは断片を含む第１リプレッサードメインと、
ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、ＬＳＤ１、ＥＺＨ２、ＦＯＧ１、又はその機能的変異体若しくは断片を含む第２リプレッサードメインと、
を含むポリペプチド。
１８９．上記ＤＮＡターゲティング部分が、第１リプレッサードメインと第２リプレッサードメインとの間に位置する、実施形態８８ａに記載のポリペプチド。
１９０．実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系の第１発現リプレッサーをコードする核酸。
１９１．実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系の第２発現リプレッサーをコードする核酸。
１９２．実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系、例えば、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーをコードする核酸。
１９３．ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである、実施形態１９０～１９２のいずれかに記載の核酸。
１９４．以下：
実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系の第１発現リプレッサーをコードする配列を含む第１核酸と；
実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系の第２発現リプレッサーをコードする配列を含む第２核酸と
を含む発現抑制系。
実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系の第１発現リプレッサーをコードする配列を含む第１核酸と；
実施形態６７～１８９のいずれかに記載の発現抑制系の第２発現リプレッサーをコードする配列を含む第２核酸と
を含む発現抑制系。
１９５．実施形態１８７～１８９のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
１９６．上記核酸が、ｍＲＮＡを含む、実施形態１９０～１９３又は１９５のいずれかに記載の核酸。
１９７．いずれかの先行する実施形態に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系をコードする核酸を含むベクター。
１９８．先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ｍＲＮＡ、又はベクターを含む、脂質ナノ粒子。
１９９．イオン化脂質、例えば、カチオン性脂質、例えば、ＭＣ３、ＳＳＯＰを含む、実施形態１９８に記載の脂質ナノ粒子。
２００．中性脂質、イオン化アミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、リン脂質、多価不飽和脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール、又はポリマーコンジュゲート脂質のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態１９８又は１９９の脂質ナノ粒子。
２０１．先行する実施形態のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、又は脂質ナノ粒子を含む、反応混合物。
２０２．細胞をさらに含む、実施形態２０１の反応混合物。
２０３．実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ｍＲＮＡ、ベクター、又はナノ粒子を含む細胞。
２０４．上記細胞が、肝細胞、神経細胞、内皮細胞、筋細胞、及びリンパ球から選択される、実施形態２０３に記載の細胞。
２０５．以下：
ｉ）細胞及びｉｉ）実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、ポリペプチド、核酸、ベクター、脂質ナノ粒子、又は反応混合物を用意するステップと；
上記細胞を上記発現リプレッサー、発現抑制系、ポリペプチド、核酸、ベクター、脂質ナノ粒子、又は反応混合物と接触させるステップ
を含む方法によって生産される細胞。
ｉ）細胞及びｉｉ）実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、ポリペプチド、核酸、ベクター、脂質ナノ粒子、又は反応混合物を用意するステップと；
上記細胞を上記発現リプレッサー、発現抑制系、ポリペプチド、核酸、ベクター、脂質ナノ粒子、又は反応混合物と接触させるステップ
を含む方法によって生産される細胞。
２０６．実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、又は反応混合物、及び少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
２０７．第１発現リプレッサーが、タグ付け若しくはモニタリング部分、切断可能な部分（例えば、ＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインの間、又はポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に位置する切断可能な部分）、小分子、膜転移ポリペプチド、又は薬物（ｐｈａｒｍａｃｏａｇｅｎｔ）部分から選択される追加の部分をさらに含む、
実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現抑制系。
実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現抑制系。
２０８．第２発現リプレッサーが、タグ付け若しくはモニタリング部分、切断可能な部分（例えば、ＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインの間、又はポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に位置する切断可能な部分）、小分子、膜転移ポリペプチド、又は薬物（ｐｈａｒｍａｃｏａｇｅｎｔ）部分から選択される追加の部分をさらに含む、実施形態１～２０２のいずれかに記載の発現抑制系。
２０９．細胞における標的ゲノム配列の発現を低減する方法であって、以下：
実施形態１～２０４又は２０６のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を用意するステップと；
発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、
これによって、上記標的ゲノム配列の発現を低減する方法。
実施形態１～２０４又は２０６のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を用意するステップと；
発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、
これによって、上記標的ゲノム配列の発現を低減する方法。
２１０．細胞内の標的ゲノム配列をエピジェネティック的に修飾する方法であって、
実施形態１～２０４又は２０６のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を用意するステップと；
発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、
これによって、上記標的ゲノム配列をエピジェネティック的に修飾する方法。
実施形態１～２０４又は２０６のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を用意するステップと；
発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ポリペプチド、ベクター、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、
これによって、上記標的ゲノム配列をエピジェネティック的に修飾する方法。
２１１．上記標的ゲノム配列が、以下：
標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内の部位、例えば、エキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、例えば、β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする遺伝子、ＭＹＣをコードする遺伝子、ＨＳＰＡ１Ｂをコードする遺伝子、又はＧＡＴＡ１をコードする遺伝子、
標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメント、又は
標的遺伝子に近接するか、若しくは標的遺伝子に作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションと関連するアンカー配列
である、実施形態２０９又は２１０に記載の方法。
標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内の部位、例えば、エキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、例えば、β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする遺伝子、ＭＹＣをコードする遺伝子、ＨＳＰＡ１Ｂをコードする遺伝子、又はＧＡＴＡ１をコードする遺伝子、
標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメント、又は
標的遺伝子に近接するか、若しくは標的遺伝子に作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションと関連するアンカー配列
である、実施形態２０９又は２１０に記載の方法。
２１２．上記エピジェネティック修飾が、上記標的遺伝子の発現の低減を招く、実施形態２１１に記載の方法。
２１３．上記細胞が、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、実施形態１７４～２１２のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、細胞、医薬組成物、核酸、ベクター、又は方法。
２１４．上記方法が、エクスビボ（例えば、対象からのサンプル中）又はインビボ（例えば、発現抑制系を対象に投与することによって）で実施される、実施形態２１３に記載の方法。
２１５．発現が、上記発現抑制系の非存在下である以外は類似の細胞における発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、実施形態２０９～２１４のいずれかに記載の方法。
２１６．発現が、上記発現抑制系と接触させていない以外は類似の細胞における発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、実施形態２０９～２１４のいずれかに記載の方法。
２１７．例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、発現が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０細胞分裂の期間にわたって低減する、実施形態２０９～２１６のいずれかに記載の方法。
２１８．発現の低減が、上記標的遺伝子によってコードされるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのレベルの低下を含む、実施形態２１５～２１７のいずれかに記載の方法。
２１９．発現の低減は、上記標的遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの低下を含む、実施形態２１５～２１８のいずれかに記載の方法。
２２０．発現抑制系をコードする核酸、例えば、ベクターと、上記標的遺伝子を含む細胞を接触させるステップを含む、実施形態２０９～２１９のいずれかに記載の方法。
２２１．第１発現リプレッサーをコードする核酸が、第１核酸分子上に配置され、第２発現リプレッサーをコードする核酸が、第２核酸分子上に配置される、実施形態２０９～２２０のいずれかに記載の方法。
２２２．第１発現リプレッサーをコードする核酸が、第２発現リプレッサーをコードする核酸と同じ核酸分子上に配置される、実施形態２０９～２２１のいずれかに記載の方法。
２２３．第１核酸分子及び第２核酸分子を一緒に、例えば、同時に上記細胞と接触させるステップを含む、実施形態２０９～２２２のいずれかに記載の方法。
２２４．第１核酸分子及び第２核酸分子を個別に、例えば、順次上記細胞と接触させるステップを含む、実施形態２０９～２２３のいずれかに記載の方法。
２２５．用意するステップが、上記発現抑制系、又は上記発現抑制系をコードする核酸、例えば、ベクターを含む小胞と上記細胞を接触させることを含む、実施形態２０９～２２４のいずれかに記載の方法。
２２６．用意するステップが、上記発現抑制系、又は上記発現抑制系をコードする核酸、例えば、ベクターを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と上記細胞を接触させることを含む、実施形態２０９～２２５のいずれかに記載の方法。
２２７．上記発現抑制系が、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含み、且つ、用意するステップが、第１発現リプレッサーを投与すること、並びに個別に、第２発現リプレッサーを投与することを含む、実施形態２０９～２２６のいずれかに記載の方法。
２２８．上記発現抑制系が、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含み、且つ、用意するステップが、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを一緒に、例えば同時に投与することを含む、実施形態２０９～２２７のいずれかに記載の方法。
２２９．対象における標的遺伝子の過剰発現に関連する状態を治療する方法であって、以下：
実施形態１～２０４又は２０６～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を対象に投与するステップを含み、
それによって、対象における標的遺伝子の過剰発現に関連する状態を治療する方法。
実施形態１～２０４又は２０６～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を対象に投与するステップを含み、
それによって、対象における標的遺伝子の過剰発現に関連する状態を治療する方法。
２３０．対象における標的遺伝子の誤調節に関連する状態を治療する方法であって、
実施形態１～２０４又は２０６～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を上記対象に投与するステップを含み、
それによって、対象における標的遺伝子の誤調節に関連する状態を治療する方法。
実施形態１～２０４又は２０６～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、脂質ナノ粒子、反応混合物、細胞、又は医薬組成物を上記対象に投与するステップを含み、
それによって、対象における標的遺伝子の誤調節に関連する状態を治療する方法。
２３１．発現抑制系を含む細胞を作製する方法であって、この方法は、
実施形態１～２０１又は２０６～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、又は医薬組成物を用意するステップと；
上記発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、又は医薬組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、
それによって、発現抑制系を含む細胞を作製する方法。
実施形態１～２０１又は２０６～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、又は医薬組成物を用意するステップと；
上記発現リプレッサー、発現抑制系、核酸、ベクター、又は医薬組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、
それによって、発現抑制系を含む細胞を作製する方法。
２３２．発現抑制系をコードする核酸を作製する方法であって、この方法は、
実施形態６７～１８６、２０７、又は２０８のいずれかに記載の発現抑制系の第１発現リプレッサーをコードする第１核酸を用意するステップと、
実施形態６７～１８６、９２０７、又は２０８のいずれかに記載の発現抑制系の第２発現リプレッサーをコードする第２核酸を用意するステップと、
第１核酸及び第２核酸を単一の核酸分子に結合する（例えば、連結する、若しくは組換える）ステップと、
を含み、
それによって、発現抑制系をコードする核酸を作製する方法。
実施形態６７～１８６、２０７、又は２０８のいずれかに記載の発現抑制系の第１発現リプレッサーをコードする第１核酸を用意するステップと、
実施形態６７～１８６、９２０７、又は２０８のいずれかに記載の発現抑制系の第２発現リプレッサーをコードする第２核酸を用意するステップと、
第１核酸及び第２核酸を単一の核酸分子に結合する（例えば、連結する、若しくは組換える）ステップと、
を含み、
それによって、発現抑制系をコードする核酸を作製する方法。
２３３．実施形態２０９～２２８又は２３０のいずれかに記載の方法によって処理又は生産される細胞。
２３４．上記細胞が、上記発現抑制系、例えば、上記発現抑制系の少なくとも１つの成分（例えば、全ての成分）を含まない、実施形態２３３に記載の細胞。
２３５．上記標的遺伝子の発現が、実施形態２０９～２２８又は２３０のいずれかに記載の方法によって接触、処理、若しくは生産されていない細胞と比較して低減される、実施形態２３３又は２３４のいずれかに記載の細胞。
２３６．実施形態１～２０８のいずれかに記載の発現リプレッサー、発現抑制系、前記発現リプレッサー若しくは発現抑制系をコードする１つ以上の核酸、ベクター、脂質ナノ粒子、又は医薬組成物を含む組成物、並びに例えば、前記組成物を用いて細胞内の遺伝子の発現を調節、例えば、低減するための少なくとも１つの調節方法を含む説明書一式を含む容器を含むキット。
定義
アンカー配列：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列」は、核形成薬剤により認識される核酸配列であって、十分に結合して、アンカー配列媒介接合部、例えば複合体を形成する核酸配列を指す。一部の実施形態では、アンカー配列は、１つ又は複数のＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子コーディング領域内に位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子間領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、エンハンサー又はプロモータ内のいずれにも位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、任意の転写開始部位から少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも５５０ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも６５０ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８５０ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも９５０ｂｐ、又は少なくとも１ｋｂ離れて位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、ゲノム刷り込み、単一対立遺伝子の発現、及び／又は単一対立遺伝子のエピジェネティックマークと関連しない領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、内因性核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）との結合、第２アンカー配列との相互作用によるアンカー配列媒介コンジュゲーションの形成、又はアンカー配列媒介コンジュゲーションの外側にあるエンハンサーに対する遮蔽から選択される１つ以上の機能を有する。本開示の一部の実施形態では、他のアンカー配列（例えば、別の状況での核形成薬剤（例えば、ＣＴＣＦ）結合モチーフを含有し得る配列）をターゲティングすることなく、特定の１つ又は複数のアンカー配列を特異的にターゲティングすることができる技術が提供され；こうした標的化アンカー配列は、「標的アンカー配列」と呼ばれることもある。一部の実施形態では、標的アンカー配列の配列及び／又は活性は調節されるが、標的化アンカー配列と同じシステム内（例えば、同じ細胞内及び／又は一部の実施形態では、同じ核酸分子、例えば、同じ染色体上）に存在し得る１つ若しくは複数の他のアンカー配列の配列及び／又は活性は調節されない。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフを含むか、又は核形成ポリペプチド結合モチーフである。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフに隣接している。
アンカー配列：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列」は、核形成薬剤により認識される核酸配列であって、十分に結合して、アンカー配列媒介接合部、例えば複合体を形成する核酸配列を指す。一部の実施形態では、アンカー配列は、１つ又は複数のＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子コーディング領域内に位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子間領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、エンハンサー又はプロモータ内のいずれにも位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、任意の転写開始部位から少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも５５０ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも６５０ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８５０ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも９５０ｂｐ、又は少なくとも１ｋｂ離れて位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、ゲノム刷り込み、単一対立遺伝子の発現、及び／又は単一対立遺伝子のエピジェネティックマークと関連しない領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、内因性核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）との結合、第２アンカー配列との相互作用によるアンカー配列媒介コンジュゲーションの形成、又はアンカー配列媒介コンジュゲーションの外側にあるエンハンサーに対する遮蔽から選択される１つ以上の機能を有する。本開示の一部の実施形態では、他のアンカー配列（例えば、別の状況での核形成薬剤（例えば、ＣＴＣＦ）結合モチーフを含有し得る配列）をターゲティングすることなく、特定の１つ又は複数のアンカー配列を特異的にターゲティングすることができる技術が提供され；こうした標的化アンカー配列は、「標的アンカー配列」と呼ばれることもある。一部の実施形態では、標的アンカー配列の配列及び／又は活性は調節されるが、標的化アンカー配列と同じシステム内（例えば、同じ細胞内及び／又は一部の実施形態では、同じ核酸分子、例えば、同じ染色体上）に存在し得る１つ若しくは複数の他のアンカー配列の配列及び／又は活性は調節されない。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフを含むか、又は核形成ポリペプチド結合モチーフである。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフに隣接している。
アンカー配列媒介接合部：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列媒介接合部」は、核形成ポリペプチドなどの１つ若しくは複数のポリペプチド、又は１つ若しくは複数のタンパク質及び／又は核酸実体（例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡなど）によるＤＮＡ内の少なくとも２つのアンカー配列の物理的相互作用若しくは結合によって起こる、及び／又はそれにより維持されるＤＮＡ構造、ある場合では複合体を指し、これは、アンカー配列と結合して、アンカー配列同士の空間的近接及び機能的連結を可能にする（例えば、図１を参照）。
と関連する：この用語が本明細書で用いられるとき、２つの事象又は実体は、その一方の存在、レベル、形態及び／又は機能が、他方のものと相関する場合に、互いに「関連する」。例えば、一部の実施形態では、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝物、微生物など）は、その存在、レベル、形態及び／又は機能が、特定の疾患、障害、若しくは病状の発生率及び／又はそれに対する感受性と相関する場合に、その疾患、障害、又は病状と関連すると考えられる。一部の実施形態では、２つ以上の実体は、それらが直接又は間接的に相互作用して、互いに物理的に近接し、且つ／又は物理的に近接したままであれば、互いに物理的に「関連する」。一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合しており；一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びそれらの組合せにより、非共有結合している。一部の実施形態では、核酸が、標的ゲノム又は転写複合体内に少なくとも部分的に存在し、ＤＮＡ配列における遺伝子の発現が、標的ゲノム若しくは転写複合体の形成又は崩壊による影響を受ける場合、ＤＮＡ配列は、標的ゲノム又は転写複合体と「関連」する。
ドメイン：本明細書で用いられるとき、用語「ドメイン」は、或る実体のセクション又は部分を指す。一部の実施形態では、「ドメイン」は、当該実体の特定の構造及び／又は機能的特徴と関連しており、ドメインがその親実体の残りから物理的に分離されたとき、それは、上記の特定の構造及び／又は機能的特徴を実質的に若しくは完全に保持する。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、ドメインは、（親）実体から分離されて、別の（レシピエント）実体と連結されると、レシピエント実体に、親実体においてそれを特徴付けた１つ若しくは複数の構造及び／又は機能的特徴を実質的に保持し、且つ／又は付与する実体の１部分であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、ドメインは、或る分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、ポリペプチドなど）のセクション若しくは１部分であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ドメインは、ポリペプチドのセクションであるか、又はそれを含む。いくつかのそうした実施形態では、ドメインは、特定の構造エレメント（例えば、特定のアミノ酸配列若しくは配列モチーフ、α－ヘリックス特徴、β－シート特徴、コイルドコイル特徴、ランダムコイル特徴など）、及び／又は特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、フォールディング活性、シグナル伝達活性など）を特徴とする。
発現リプレッサー：本明細書で用いられるとき、「発現リプレッサー」という用語は、細胞内の標的遺伝子の発現を低減し、ＤＮＡ配列（例えば、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列、又は標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメント）に特異的に結合する１つ以上の機能性を有する薬剤又は実体を指す。発現リプレッサーは、少なくとも１つのＤＮＡターゲティング部分と、少なくとも１つのリプレッサードメインを含む。
発現抑制系：本明細書で用いられるとき、「発現抑制系」という用語は、細胞内の標的遺伝子の発現を低減する複数の発現リプレッサーを指す。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサー（又は第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーをコードする核酸）は、単一の組成物、混合物、又は医薬組成物中に一緒に存在する。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサー（又は第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーをコードする核酸）は、個別の組成物又は医薬組成物中に存在する。一部の実施形態では、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーは、同時に同じ細胞内に存在する。一部の実施形態では、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーは、同時に同じ細胞内に存在せず、例えば、それらは順次存在する。例えば、第１発現リプレッサーが、第１の期間、細胞内に存在した後、第２発現リプレッサーが、第２の期間、細胞内に存在してもよく、ここで、第１及び第２の期間は、重複又は非重複のいずれでもよい。
ゲノム複合体：本明細書で用いられるとき、用語「ゲノム複合体」は、複数のタンパク質及び／又は他の成分（恐らく、ゲノム配列エレメントを含む）同士の相互作用によって、１つ若しくは複数の染色体上で互いに間隔をあけた２つのゲノム配列エレメントを一緒にする複合体である。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、複合体の１つ又は複数のタンパク質成分が結合するアンカー配列である。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部を含んでもよい。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、ＣＴＣＦ結合モチーフ、プロモータ及び／又はエンハンサーであってもよいし、又はそれを含んでもよい。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、プロモータ及び／又は調節部位（例えば、エンハンサー）の少なくとも１つ又はその両方を含む。一部の実施形態では、複合体形成は、ゲノム配列エレメントにおいて、且つ／又はゲノム配列エレメントと１つ若しくは複数のタンパク質成分の結合により核形成される。当業者には理解されるように、一部の実施形態では、複合体の形成によるゲノム部位の共局在化（例えば、共役）によって、ゲノム配列エレメントにおける、又はその付近で（例えば、一部の実施形態では、配列間）のＤＮＡトポロジーが変更される。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、アンカー配列媒介コンジュゲーションを含み、これは、１つ以上のループを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、ＣＴＣＦ及び／又はコヒーシンなどの核形成ポリペプチドにより核形成される。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、以下：ＣＴＣＦ、コヒーシン、ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｅＲＮＡ、転写機構タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨなどからなる群から選択される１つ若しくは複数の転写因子）、転写調節因子（例えば、メディエータ（Ｍｅｄｉａｔｏｒ）、Ｐ３００、エンハンサー結合タンパク質、リプレッサー結合タンパク質、ヒストン修飾因子など）のうち１つ又は複数を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、１つ若しくは複数のポリペプチド成分及び／又は１つ若しくは複数の核酸成分（例えば、１つ若しくは複数のＲＮＡ成分）を含み、それらは、一部の実施形態では、互いに及び／又は１つ若しくは複数のゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ配列、調節配列（例えば、エンハンサー配列）と相互作用することにより、ゲノムＤＮＡの１区間を、複合体が形成されなければ採用されないトポロジー立体配置（例えば、ループ）中に閉じ込め得る。
核酸：本明細書で用いられるとき、その最も広い意味で、「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、若しくは組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、若しくは組み込むことができる化合物及び／又は物質である。文脈から明らかなように、一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し；一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、又はＲＮＡを含み；一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか又はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、それを含むか、又はそれから成る。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それを含むか、又はそれから成る。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点で、核酸とは異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」を含むか、又はそれから成り、これは、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本開示の範囲に含まれるとみなされる。代替的に、又は追加的に、一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／又は５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、又はそれから成る。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、及びこれらの組合せ）であるか、それを含むか、又はそれから成る。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸におけるものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的な鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボ又はインビトロ）、組換え細胞又は組換え系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。一部の実施形態では、核酸は、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基である。一部の実施形態では、核酸は、部分的又は完全に一本鎖であり；一部の実施形態では、核酸は、部分的又は完全に二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、又はポリペプチドをコードする配列の補体である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
作動可能に連結した：本明細書で用いられるとき、語句「作動可能に連結した」は、記載される成分が、その意図される様式でそれらを機能させることが可能な関係にある並置を指す。機能性エレメント、例えば、遺伝子と「作動可能に連結した」転写制御エレメントは、機能性エレメント、例えば、遺伝子の発現及び／又は活性が、転写制御エレメントと適合する条件下で達成されるように、結合されている。一部の実施形態では、「作動可能に連結した」転写制御エレメントは、目的のコーディングエレメント、例えば、遺伝子と連続的であり（例えば、共有している）；一部の実施形態では、作動可能に連結した転写制御エレメントは、目的の機能性エレメント、例えば、遺伝子に対してトランスで、或いはそうでなければそれから一定の距離の地点で作用する。一部の実施形態では、作動可能に連結したとは、２つの核酸配列が、同じ核酸分子上に含まれることを意味する。別の実施形態では、作動可能に連結したとは、さらに、２つの核酸配列が、同じ核酸分子上で互いに近接しており、例えば、互いに１０００、５００、１００、５０、若しくは１０塩基対内にあるか、又は互いに隣接していることを意味する場合もある。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質：本明細書で用いられるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合で連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有していなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で用いられるとき、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーと呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質（多くの種類がある）と呼ばれる長鎖の両方を指す。
リプレッサードメイン：本明細書で用いられるとき、用語「リプレッサードメイン」は、細胞の核内に適切に局在したときに細胞における標的遺伝子の発現を低減する１つ以上の機能性を有するドメインを指す。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ポリペプチドであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ポリペプチド及び核酸であるか、又はそれを含む。リプレッサードメインに関連する機能性は、標的遺伝子の発現に直接影響を及ぼす可能性があり、例えば、遺伝子の発現を刺激することになる転写因子の動員を阻止する。リプレッサードメインに関連する機能性は、標的遺伝子の発現に間接的に影響を与える可能性があり、例えば、エピジェネティック修飾を導入するか、又は標的遺伝子の発現を阻害する染色体トポロジーの変化を誘導するエピジェネティック修飾を導入する他の因子を動員する。
特異的結合：本明細書で用いられるとき、用語「特異的結合」は、結合が起こる環境において可能な結合パートナー同士を識別する能力を指す。一部の実施形態では、他の潜在的な標的が存在する場合に、１つの特定の標的と相互作用する結合剤は、それが相互作用する標的に「特異的に結合する」と言われる。一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の会合の程度を検出又は決定することによって評価され；一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤－パートナー複合体の解離の程度を検出又は決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、そのパートナーと別の実体との間の代替的相互作用と競合する結合剤の能力を検出又は決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、様々な濃度でこのような検出又は決定を実施することによって評価される。
実質的に：本明細書で用いられるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴若しくは特性の全範囲若しくはほぼ全範囲又は程度を呈示する質的条件を指す。当業者には、生物学的及び化学的現象は、完了に到達する、且つ／又は完全性まで進行する、又は絶対的結果を達成若しくは回避することが、もしあるとしても、稀であるのは理解されよう。従って、用語「実質的に」は、本明細書のいくつかの実施形態において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性を捉えるために使用される場合もある。
症状が軽減される：本明細書で用いられるとき、「症状が軽減される」という語句は、特定の疾患、障害又は状態の１つ以上の症状の程度（例えば、強度、重症度など）及び／又は頻度が減少する場合に使用され得る。一部の実施形態では、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度を減少させる１つの形態と考えられる。
標的：薬剤又は実体は、それらが互いに接触する条件下で、標的化薬剤又は実体と特異的に結合する場合、本開示に従って、別の薬剤又は実体を「ターゲティングする」とみなされる。一部の実施形態では、例えば、抗体（又はその抗原結合断片）は、そのコグネイトエピトープ若しくは抗原をターゲティングする。一部の実施形態では、特定の配列を有する核酸は、実質的に相補的な配列の核酸をターゲティングする。
標的遺伝子：本明細書で用いられるとき、用語「標的遺伝子」とは、調節、例えば発現の調節のためにターゲティングされる遺伝子を意味する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、標的化ゲノム複合体の一部（例えば、アンカー配列媒介コンジュゲーション内部で、標的ゲノム複合体の一部としてそのゲノム配列の少なくとも一部を有する遺伝子）であり、このゲノム複合体は、本明細書に記載される１つ以上の調節剤によってターゲティングされる。一部の実施形態では、調節は、標的遺伝子の発現の阻害を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、標的遺伝子又は標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメントを、本明細書に記載される発現抑制系、例えば発現リプレッサーと接触させることによって調節される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、細胞、例えば、対象（例えば患者）の細胞で異常に発現（例えば、過剰発現）される。
ＤＮＡターゲティング部分：本明細書で用いられるとき、発現リプレッサーと関連して、用語「ＤＮＡターゲティング部分」とは、ＤＮＡ配列に特異的に結合するドメイン（例えば、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列、又は標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメント）を意味する。
治療薬：本明細書で用いられるとき、「治療薬」という語句は、対象に投与されたとき、治療効果を有し、且つ／又は所望の生物学的及び／又は薬理学的効果を誘発する薬剤を指す。一部の実施形態では、治療薬は、疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ以上の症状又は特徴の緩和、改善、軽減、阻害、予防、発症の遅延、重症度の低下、及び／又は発生率の低下に使用することができる任意の物質である。一部の実施形態では、治療薬は、本明細書に記載の発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを含む。一部の実施態様では、治療薬は、本明細書に記載の発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸を含む。一部の実施態様では、治療薬は、本明細書に記載の医薬組成物を含む。
治療有効量：本明細書で用いられるとき、用語「治療有効量」は、治療レジメンの一環として投与されると、所望の生物学的応答を誘発する物質（例えば、治療薬、組成物、及び／又は製剤）の量を意味する。一部の実施形態では、或る物質の治療有効量は、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しているか、若しくは罹患しやすい対象に投与されると、疾患、障害、及び／又は病状を治療、診断、予防する、且つ／又はその発症を遅延させるのに十分な量である。当業者には理解されるように、或る物質の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達しようとする物質、標的細胞又は組織などの要因に応じて変動し得る。例えば、一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状を治療するための製剤中の化合物の有効量は、疾患、障害、及び／又は病状の１つ若しくは複数の症状又は特徴を改善、緩和、軽減、阻害、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低減させ、且つ／又はその発生率を低下させる量である。一部の実施形態では、治療有効量は、単一用量で投与され；一部の実施形態では、治療有効量を送達するために、複数回用量が必要とされる。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば、よりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、本明細書に例示される実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の詳細な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
本開示は、発現リプレッサー又は発現抑制系の使用を通じて、例えば、対象又は患者の細胞における標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減するための技術を提供する。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡ結合部分と、少なくとも１つのリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、２つのリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、２つの同一のリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、２つの非同一リプレッサードメインを含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み、その各々が、ＤＮＡターゲティング部分と、少なくとも１つのリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、２つ以上の異なるＤＮＡ配列をターゲティングする（例えば、各発現リプレッサーは、異なるＤＮＡ配列をターゲティングし得る）。理論に縛られることは望まないが、２つ以上の異なるＤＮＡ配列をターゲティングする発現リプレッサーを含む発現抑制系の使用は、個々の発現リプレッサーが、それらの標的ＤＮＡ配列への結合に関して互いに競合しないか、又は互いに低競合であり、それにより、リプレッサードメインの様々な機能の優れた局在化を達成するため、単一のＤＮＡ配列をターゲティングする類似の系よりも有利となり得る。一部の実施形態では、２つの異なるＤＮＡターゲティング部分を用いて、２つの異なる規定位置に２つの異なるリプレッサーをターゲットさせる、例えば、転写開始部位上流の第１位置に第１発現リプレッサーを、また、転写開始部位を含む第２位置に第２発現リプレッサーを正確にターゲティングさせることは、有利となり得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、２つ以上の異なるリプレッサードメインを含む（例えば、各発現リプレッサーは、他方の発現リプレッサーとは互いに異なるリプレッサードメインを含む）。理論に縛られることは望まないが、２つ以上のリプレッサードメインを含む発現リプレッサーを含む発現抑制系の使用は、２つ以上のリプレッサードメインの協調作用に関連する標的遺伝子の発現に対する相乗効果のために、単一のリプレッサードメインを含む類似の系よりも有利であり得る。
発現リプレッサー
本開示の発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、少なくとも１つのリプレッサードメインを含み得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のリプレッサードメインを含み得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、２つ以上の異なるＤＮＡ配列（例えば、第１及び第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、及び／又はそれ以上のＤＮＡ配列、並びに任意選択で、多くとも第２０、第１９、第１８、第１７、第１６、第１５、第１４、第１３、第１２、第１１、第１０、第９、第８、第６、第５、第４、第３、又は第２ＤＮＡ配列）をターゲティングする。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分及び複数のリプレッサードメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のリプレッサードメイン（及び任意選択で、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２未満のリプレッサードメイン））を含み、これらは各々、２つ以上のリプレッサードメインの他のものと同一でも異なっていてもよい。
本開示の発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、少なくとも１つのリプレッサードメインを含み得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のリプレッサードメインを含み得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、２つ以上の異なるＤＮＡ配列（例えば、第１及び第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、及び／又はそれ以上のＤＮＡ配列、並びに任意選択で、多くとも第２０、第１９、第１８、第１７、第１６、第１５、第１４、第１３、第１２、第１１、第１０、第９、第８、第６、第５、第４、第３、又は第２ＤＮＡ配列）をターゲティングする。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分及び複数のリプレッサードメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のリプレッサードメイン（及び任意選択で、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２未満のリプレッサードメイン））を含み、これらは各々、２つ以上のリプレッサードメインの他のものと同一でも異なっていてもよい。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、第１リプレッサードメインと第２リプレッサードメインを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインと同一ではない。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、第１リプレッサードメインと第２リプレッサードメインを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインと同一である。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、第１リプレッサードメインと第２リプレッサードメインの間に位置する。
発現リプレッサーは、複数のリプレッサードメインを含んでもよく、ここで、各リプレッサードメインは、他のリプレッサードメインとは異なる機能性を含む。例えば、発現リプレッサーは、２つのリプレッサードメインを含んでもよく、ここで、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡメチラーゼ機能性を含み、第２リプレッサードメインは、転写リプレッサー機能性を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、その機能性が、標的遺伝子の発現低減に関して互いに相補的であるリプレッサードメインを含み、ここで、機能性は一緒になって発現の阻害を可能にし、また、任意選択で、個別に存在する場合には、発現を阻害しないか、又は阻害するとしても無視できる程度である。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、複数のリプレッサードメインを含み、ここで、各リプレッサードメインは、他のリプレッサードメインを補完し、各リプレッサードメインは、標的遺伝子の発現を低減する。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現の低減に関して機能性が互いに相乗作用するリプレッサードメインの組合せを含む。理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態では、複数の転写活性化エピジェネティックマーカー（例えば、複数の異なるタイプのエピジェネティックマーカー及び／又は所与のタイプのより広範なマーキング）はそれぞれが一緒に、個別の修飾単独よりも効果的に発現を阻害する（例えば、より大きな発現の低減及び／又はより長い発現の持続的低減をもたらす）ことから、ゲノム遺伝子座に対するエピジェネティック修飾は累積的である。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、複数のリプレッサードメインを含み、ここで、各リプレッサードメインは、他のリプレッサードメインと相乗作用し、例えば、各リプレッサードメインは標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、発現リプレッサー（互いに相乗作用する複数のリプレッサードメインを含む）は、個別のリプレッサードメインを含む発現リプレッサーよりも標的遺伝子の発現を阻害するのに有効である。一部の実施形態では、前記複数のリプレッサードメインを含む発現リプレッサーは、個別のリプレッサードメインを含む発現リプレッサーに比して、標的遺伝子の発現を低減するのに少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×有効である。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、例えば、ペプチド結合により共有結合されているＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインは、同じポリペプチド鎖上に位置し、例えば、１つ以上のペプチド結合及び／又はリンカーによって連結されている。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、融合分子であるか、又は融合分子を含み、例えば、ペプチド結合及び／又はリンカーによって連結されたＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ターゲティング部分と複数のエフェクター部分を含み、ここで、ターゲティング部分と複数のエフェクター部分は、例えば、ペプチド結合によって共有結合で連結されている（例えば、ターゲティング部分と複数のエフェクター部分は、全て、一連の共有結合によって連結されているが、個別の部分は各々、他の全てのエフェクター部分と共有結合を共有しない場合もある）。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、同じポリペプチド鎖上のリプレッサードメインのＮ末端に連結されたＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、同じポリペプチド鎖上のリプレッサードメインのＣ末端に連結されたＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、第１リプレッサードメインのＣ末端に連結され、且つ、同じポリペプチド鎖上の第２リプレッサードメインのＮ末端に連結されたＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、同じポリペプチド鎖上のリプレッサードメインのＮ末端に配置されるＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、同じポリペプチド鎖上にリプレッサードメインのＣ末端に配置されているＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、非ペプチド結合によって共有結合されたＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、非ペプチド結合によってリプレッサードメインに共役している。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、複数のリプレッサードメインを含み、ここで、ＤＮＡターゲティング部分と複数のリプレッサードメインは、例えば、ペプチド結合により共有結合で連結されている（例えば、ＤＮＡターゲティング部分と複数のリプレッサードメインは、全て、一連の共有結合によって連結されているが、個別のドメイン又は部分は各々、他の全てのドメイン又は部分と共有結合を共有しない場合もある）。
他の実施形態において、発現リプレッサーは、共有結合的に連結されていない、例えば互いに非共有結合的に結合されたＤＮＡターゲティング部分及びリプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、非共有結合的にリプレッサードメインに結合するＤＮＡターゲティング部分を含むか、又はその逆である。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と複数のリプレッサードメインを含み、ここで、ＤＮＡターゲティング部分と少なくとも１つのリプレッサードメインは、共有結合的に連結されておらず、例えば、互いに非共有結合的に結合され、ここで、ＤＮＡターゲティング部分と少なくとも１つの他のリプレッサードメインは、例えば、ペプチド結合により共有結合的に連結されている。
一般に、本明細書に記載の発現リプレッサーは、標的遺伝子に近接し、且つ／又は作動可能に連結したゲノム配列エレメントに（例えば、ＤＮＡターゲティング部分を介して）結合する。一部の実施形態では、ゲノム配列要素への発現リプレッサーの結合は、標的遺伝子の発現を調節する（例えば、低減する）。例えば、転写機構の成分を動員するか、又はその動員を阻害するリプレッサードメインを含む発現リプレッサーと、ゲノム配列エレメントとの結合は、標的遺伝子の発現を調節（例えば、低減）し得る。別の例として、酵素活性を有するリプレッサードメインを含む発現リプレッサー（例えば、エピジェネティック修飾部分）との結合は、リプレッサードメインの局在化酵素活性を介して標的遺伝子の発現を調節（例えば、低減）し得る。さらに別の例として、ゲノム配列エレメントと発現リプレッサーの結合及び発現リプレッサーの局在化酵素活性の両方が、その結果として生じる標的遺伝子の発現の調節（例えば、低減）に寄与し得る。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、リプレッサードメインを含み、ここで、リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、第２リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、第１リプレッサードメイン（リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、第２リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む）と、第２リプレッサードメイン（リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、第２リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む）と、を含む。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、リプレッサードメインを含み、ここで、リプレッサードメイン、例えば、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＦＯＧ１、ＳＥＴＤＢ１、又はＳＥＴＤＢ２から選択されるリプレッサードメインのＣ末端と、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端は、共有結合的に連結されている。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と、リプレッサードメインを含み、ここで、リプレッサードメイン、例えば、ＬＳＤ１、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＦＯＧ１、又はＫＲＡＢから選択されるリプレッサードメインのＮ末端と、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端は、共有結合的に連結されている。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分、第１リプレッサードメイン及び第２リプレッサードメインを含み、ここで、第１リプレッサードメイン、例えば、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＦＯＧ１、ＳＥＴＤＢ１、又はＳＥＴＤＢ２から選択されるリプレッサードメインのＣ末端と、ＤＮＡターゲティング部分のＮ末端は、共有結合的に連結されており、ＤＮＡターゲティング部分のＣ末端と第２リプレッサードメイン、例えばＬＳＤ１、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＦＯＧ１、又はＫＲＡＢから選択されるリプレッサードメインのＮ末端は、共有結合的に連結されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示される発現リプレッサーは、組成物、医薬組成物、又は混合物中に存在する。
本明細書に記載の実施形態のいくつかにより、複数の発現リプレッサーを含む系を説明するが、本出願は、例えば、単剤として使用するための、又は本明細書で明示する必要のない一般的な第２の療法と組み合わせて使用するための発現リプレッサーを個別に提供することが理解される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現リプレッサーは、例えば、以下に説明されるような発現抑制系の一部である。
発現抑制系
本開示の発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上（及び任意選択で１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２以下）の発現リプレッサーを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上の異なるＤＮＡ配列（例えば、第１及び第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、及び／又はそれ以上のＤＮＡ配列、並びに任意選択で、多くとも第２０、第１９、第１８、第１７、第１６、第１５、第１４、第１３、第１２、第１１、第１０、第９、第８、第６、第５、第４、第３、又は第２ＤＮＡ配列）をターゲティングする。一部の実施形態では、発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含み、ここで、複数の発現リプレッサーの各メンバーは、複数の発現リプレッサーの別のメンバーに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサーは、第２発現リプレッサーに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。
本開示の発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上（及び任意選択で１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２以下）の発現リプレッサーを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上の異なるＤＮＡ配列（例えば、第１及び第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、及び／又はそれ以上のＤＮＡ配列、並びに任意選択で、多くとも第２０、第１９、第１８、第１７、第１６、第１５、第１４、第１３、第１２、第１１、第１０、第９、第８、第６、第５、第４、第３、又は第２ＤＮＡ配列）をターゲティングする。一部の実施形態では、発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含み、ここで、複数の発現リプレッサーの各メンバーは、複数の発現リプレッサーの別のメンバーに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサーは、第２発現リプレッサーに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。
一部の実施形態では、本開示の発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み、ここで、発現リプレッサーは、組成物、医薬組成物、又は混合物中に一緒に存在する。一部の実施形態では、本開示の発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み、この場合、１つ以上の発現リプレッサーは、少なくとも１つの他の発現リプレッサーと混合されない。例えば、発現抑制系は、第１発現リプレッサーと、第２発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、細胞の核における第１発現リプレッサーの存在は、同じ細胞の核における第２発現リプレッサーの存在と重複せず、ここで、発現抑制系は、第１及び第２発現リプレッサーの重複しない存在によって標的遺伝子の発現の低減を達成する。
一部の実施形態では、発現抑制系の発現リプレッサーは、各々、異なるＤＮＡターゲティング部分を含む（例えば、第１、第２、第３、又はさらなる発現リプレッサーは、各々、互いに異なるＤＮＡターゲティング部分を含む）。例えば、発現抑制系は、第１発現リプレッサーと、第２発現リプレッサーを含んでもよく、その場合、第１発現リプレッサーは、第１ＤＮＡターゲティング部分（例えば、Ｃａｓ９分子、ＴＡＬエフェクター分子、又はＺｎフィンガードメイン）を含み、第２発現リプレッサーは、第１ＤＮＡターゲティング部分とは異なる第２ＤＮＡターゲティング部分（例えば、Ｃａｓ９分子、ＴＡＬエフェクター分子、又はＺｎフィンガードメイン）を含む。一部の実施形態では、異なるとは、異なるタイプのＤＮＡターゲティング部分を含むことを意味することができ、例えば、第１ＤＮＡターゲティング部分は、Ｃａｓ９分子を含み、第２ＤＮＡターゲティング部分は、ＴＡＬエフェクター分子を含む。他の実施形態では、異なるとは、同じタイプのＤＮＡターゲティング部分の別個の変異体を含むことを意味することができ、例えば、第１ＤＮＡターゲティング部分は、第１Ｃａｓ９分子（例えば、第１種由来）を含み、第２ＤＮＡターゲティング部分は、第２Ｃａｓ９分子（例えば、第２種由来）を含む。一実施形態では、発現抑制系が、同じタイプの２つ以上のＤＮＡターゲティング部分、例えば、２つ以上のＣａｓ９分子を含む場合、ＤＮＡターゲティング部分は、２つ以上の異なるＤＮＡ配列に特異的に結合する。例えば、２つ以上のＣａｓ９分子を含む発現抑制系において、２つ以上のＣａｓ９分子は、それらがそれらの標的ＤＮＡ配列に対応するｇＲＮＡにのみ、認め得るほどに結合するように（例えば、別のＣａｓ９分子の標的に対応するｇＲＮＡには認め得るほどに結合しない）ように選択又は改変され得る。さら別の例では、２つ以上のＴＡＬエフェクター分子を含む発現抑制系において、２つ以上のＴＡＬエフェクター分子は、それらが、それらの標的ＤＮＡ配列にのみ、認め得るほどに結合するように（例えば、別のＴＡＬエフェクター分子の標的ＤＮＡ配列には認め得るほどに結合しない）ように選択又は改変され得る。
一部の実施形態では、発現抑制系は、３つ以上の発現リプレッサーを含み、２つ以上の発現リプレッサーは、同じＤＮＡターゲティング部分を含む。例えば、発現抑制系は、３つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは両方とも第１ＤＮＡターゲティング部分を含み、第３発現リプレッサーは、第２の異なるＤＮＡターゲティング部分を含む。別の例として、発現抑制系は、４つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは両方とも第１ＤＮＡターゲティング部分を含み、第３及び第４発現リプレッサーは、第２の異なるＤＮＡターゲティング部分を含む。さらに別の例として、発現抑制系は、５つの発現リプレッサーを含んでもよく、ここで、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１ＤＮＡターゲティング部分を含み、第３及び第４発現リプレッサーは、両方とも第２の異なるＤＮＡターゲティング部分を含み、第５の発現リプレッサーは、第３の異なるＤＮＡターゲティング部分を含む。前述のように、異なるとは、異なるタイプのＤＮＡターゲティング部分を含むか、又は同じタイプのＤＮＡターゲティング部分の異なる変異体を含むことを意味し得る。
一部の実施形態では、発現抑制系の発現リプレッサーは、各々異なるＤＮＡ配列に結合する（例えば、第１、第２、第３、又はさらなる発現リプレッサーは、各々互いに異なるＤＮＡ配列に結合する）。例えば、発現抑制系は、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーを含んでよく、この場合、第１発現リプレッサーは、第１ＤＮＡ配列に結合し、第２発現リプレッサーは、第２ＤＮＡ配列に結合する。一部の実施形態では、異なるとは、１つの発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列と、別の発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列との間に同一ではない少なくとも１つの位置が存在すること、又は、１つの発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列中に少なくとも１つの位置が存在し、それは、別の発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列中には存在しないすることを意味し得る。例えば、第１発現リプレッサーは、第１の例示的なＤＮＡ配列５’－ＡＴＧＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡ－３’（配列番号９７）に結合してもよく、第２発現リプレッサーは、第２の例示的なＤＮＡ配列５’－ＴＧＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡＧ－３’（配列番号９８）に結合してもよく；前記例では、第１及び第２の例示的なＤＮＡ配列は異なっている。別の例として、第１発現リプレッサーは、第１の例示的なＤＮＡ配列５’－ＡＴＧＡＴＴｇＧＡＴＴＴＡ－３’（配列番号：９９）に結合してもよく、第２発現リプレッサーは、第２例示的なＤＮＡ配列５’－ＡＴＧＡＴＴｃＧＡＴＴＴＡ－３’（配列番号１００）に結合してもく；前記例では、第１及び第２の例示的なＤＮＡ配列は異なっている。一部の実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第１ゲノムＤＮＡ鎖上に位置してもよく、第２ＤＮＡ配列は、第２ゲノムＤＮＡ鎖上に位置してもよい。一部の実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第２ＤＮＡ配列と同じゲノムＤＮＡ鎖上に位置し得る。
一部の実施形態では、発現抑制系は、３つ以上の発現リプレッサーを含み、２つ以上の発現リプレッサーは、同じＤＮＡ配列に結合する。例えば、発現抑制系は、３つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１ＤＮＡ配列に結合し、第３発現リプレッサーは第２の異なるＤＮＡ配列に結合する。別の例として、発現抑制系は、４つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１ＤＮＡ配列に結合し、第３及び第４発現リプレッサーは、両方とも第２のＤＮＡ配列に結合する。さらに別の例として、発現抑制系は、５つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１ＤＮＡ配列に結合し、第３及び第４発現リプレッサーは、両方とも第２ＤＮＡ配列に結合し、第５の発現リプレッサーは第３のＤＮＡ配列に結合する。前述のように、異なるとは、１つの発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列と、別の発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列との間に同一ではない少なくとも１つの位置が存在すること、又は１つの発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列中に存在し、且つ別の発現リプレッサーが結合するＤＮＡ配列中には存在しない少なくとも１つの位置が存在することを意味し得る。
一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ）の発現リプレッサーを含み、複数（例えば、２つ）の発現リプレッサーは、異なるＤＮＡ配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む。このような実施形態では、第１ＤＮＡターゲティング部分は、第１ＤＮＡ配列に結合してもよく、第２ＤＮＡターゲティング部分は、第２ＤＮＡ配列に結合してもよく、ここで、第１及び第２ＤＮＡ配列は異なっており、重複しない。いくつかのこうした実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第２ＤＮＡ配列から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対（及び任意選択で、多くとも５００、４００、３００、２００、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、又は５０塩基対）だけ隔てられている。いくつかのこうした実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第２ＤＮＡ配列から多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対（及び任意選択で、塩基対なし、例えば、第１配列と第２配列は互いに直接隣接している）だけ隔てられている。
一部の実施形態では、発現抑制系の発現リプレッサーは、それぞれ、異なるリプレッサードメインを含む（例えば、第１、第２、第３、又はさらなる発現リプレッサーは、それぞれ、互いに異なるリプレッサードメインを含む）。例えば、発現抑制系は、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１発現リプレッサーは、第１リプレッサードメイン（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ又はその機能性断片を含む）を含み、第２発現リプレッサーは、第１リプレッサードメインとは異なる第２リプレッサードメイン（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ又はその機能性断片を含む）を含む。一部の実施形態では、異なるとは、異なるタイプのリプレッサードメインを含むことを意味することができ、例えば、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むか、又は第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼを含み、第２リプレッサードメインは、酵素の小分子阻害剤を含む。他の実施形態では、異なるとは、同じタイプのリプレッサードメインの異なる変異体を含むことを意味することができ、例えば、第１リプレッサードメインは、第１ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、第１部位特異性又はアミノ酸配列を有する）を含み、第２リプレッサードメインは、第２ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、第２部位特異性又はアミノ酸配列を有する）を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、第２リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、第２リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含み、第３リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、（ｉ）第１リプレッサードメイン及び第３リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、（ｉｉ）第２リプレッサードメイン及び任意選択で第４リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み、第２リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含み、第３リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含み、第４リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片、例えば、そのいずれかのＳＥＴドメイン）を含み、第２リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性（例えば、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、転写リプレッサー活性（例えば、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、異なるヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、同じヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、異なるヒストンデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、同じヒストンデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインはＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、異なるヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、同じヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、異なるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、同じＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、異なるＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２リプレッサードメインは、同じＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含み、第２リプレッサードメインは、異なる転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含み、第２リプレッサードメインは、同じ転写リプレッサー活性を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、３つ以上の発現リプレッサーを含み、２つ以上の発現リプレッサーは、同じＤＮＡターゲティング部分を含む。例えば、発現抑制系は、３つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１リプレッサードメインを含み、第３発現リプレッサーは、第２の異なるリプレッサードメインを含む。別の例として、発現抑制系は、４つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１リプレッサードメインを含み、第３及び第４発現リプレッサーは、第２の異なるリプレッサードメインを含む。さらに別の例として、発現抑制系は、５つの発現リプレッサーを含んでもよく、この場合、第１及び第２発現リプレッサーは、両方とも第１リプレッサードメインを含み、第３及び第４発現リプレッサーは、両方とも第２の異なるリプレッサードメインを含み、第５の発現リプレッサーは、第３の異なるリプレッサードメインを含む。前述のように、異なるとは、異なるタイプのリプレッサードメインを含むか、又は同じタイプのリプレッサードメインの別個の変異体を含むことを意味し得る。
一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片、例えば、そのいずれかのＳＥＴドメイン）を含み、他のリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性（例えば、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、転写リプレッサー活性（例えば、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片）を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、異なるヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、同じヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、異なるヒストンデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、同じヒストンデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、異なるヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、同じヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、異なるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、同じＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、異なるＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、他のリプレッサードメインは、同じＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含み、他のリプレッサードメインは、異なる転写リプレッサー活性を含む。一部の実施形態では、２つのリプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を含み、他のリプレッサードメインは、同じ転写リプレッサー活性を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系の２つ以上の（例えば、全ての）発現リプレッサーは、互いに共有結合的に結合しておらず、例えば、各発現リプレッサーは、他の任意の発現リプレッサーと共有結合的に結合していない。別の実施形態において、発現抑制系の２つ以上の発現リプレッサーは、互いに共有結合的に結合している。実施形態において、発現抑制系は、同じポリペプチド上に配置された第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含み、これらは、例えば、融合分子として、例えば、ペプチド結合及び任意選択でリンカーにより連結されている。一実施形態において、発現抑制系は、非ペプチド結合によって連結された、例えば互いに共役している第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含む。
リンカー
本明細書に開示される発現リプレッサー又は発現抑制系は、１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、ＤＮＡターゲティング部分をリプレッサードメインに、リプレッサードメインを別のリプレッサードメインに、又はＤＮＡターゲティング部分を別のＤＮＡターゲティング部分に連結することができる。リンカーは、化学結合、例えば、１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の実施形態では、リンカーは共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは非共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。こうしたリンカーは、２～３０、５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０、２～２５、５～２５、１０～２５、１５～２５、２０～２５、２～２０、５～２０、１０～２０、１５～２０、２～１５、５～１５、１０～１５、２～１０、５～１０、若しくは２～５アミノ酸長、又は２、５、１０、１５、２０、２５、又は３０アミノ酸長以上（及び任意選択で最大５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、又は５アミノ酸長）であり得る。一部の実施形態では、リンカーを使用して、第２ドメイン又は部分から第１ドメイン又は部分を、例えば、リプレッサードメインからＤＮＡターゲティング部分を隔てることができる。一部の実施形態では、例えば、二次及び三次構造の分子柔軟性を提供するように、例えば、リンカーをＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインとの間に配置することができる。リンカーは、本明細書に記載されるフレキシブル、リジッド、及び／又は切断可能なリンカーを含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、柔軟性を提供するために、少なくとも１つのグリシン、アラニン、及びセリンアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、疎水性リンカー、例えば、負荷電スルホネート基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、又はピロリン酸ジエステル基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、調節剤から部分（例えば、ポリペプチド）を選択的に放出するように切断可能であるが、早期切断を防止するのに十分安定している。
本明細書に開示される発現リプレッサー又は発現抑制系は、１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、ＤＮＡターゲティング部分をリプレッサードメインに、リプレッサードメインを別のリプレッサードメインに、又はＤＮＡターゲティング部分を別のＤＮＡターゲティング部分に連結することができる。リンカーは、化学結合、例えば、１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の実施形態では、リンカーは共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは非共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。こうしたリンカーは、２～３０、５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０、２～２５、５～２５、１０～２５、１５～２５、２０～２５、２～２０、５～２０、１０～２０、１５～２０、２～１５、５～１５、１０～１５、２～１０、５～１０、若しくは２～５アミノ酸長、又は２、５、１０、１５、２０、２５、又は３０アミノ酸長以上（及び任意選択で最大５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、又は５アミノ酸長）であり得る。一部の実施形態では、リンカーを使用して、第２ドメイン又は部分から第１ドメイン又は部分を、例えば、リプレッサードメインからＤＮＡターゲティング部分を隔てることができる。一部の実施形態では、例えば、二次及び三次構造の分子柔軟性を提供するように、例えば、リンカーをＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインとの間に配置することができる。リンカーは、本明細書に記載されるフレキシブル、リジッド、及び／又は切断可能なリンカーを含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、柔軟性を提供するために、少なくとも１つのグリシン、アラニン、及びセリンアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、疎水性リンカー、例えば、負荷電スルホネート基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、又はピロリン酸ジエステル基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、調節剤から部分（例えば、ポリペプチド）を選択的に放出するように切断可能であるが、早期切断を防止するのに十分安定している。
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現リプレッサーの１つ以上の部分及び／又はドメインは、１つ以上のリンカーと連結している。一部の実施形態では、発現抑制は、ＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインとの間に位置するリンカーを含み得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとの間に位置する第１リンカーと、ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとの間に位置する第２リンカーとを含み得る。一部の実施形態では、第１リンカー及び第２リンカーは、同一であってもよい。一部の実施形態では、第１リンカー及び第２リンカーは、異なっていてもよい。
当業者には周知のように、一般に使用されるフレキシブルリンカーは、主にＧｌｙ残基及びＳｅｒ残基の区間から成る配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。フレキシブルリンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメイン／部分を結合するのに有用であり得、低、非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組み込みはまた、水分子と共に水素結合を形成することにより、水溶液中のリンカーの安定性を維持することができるため、リンカーと部分／ドメインとの間の好ましくない相互作用を低減することもできる。
リジッドリンカーは、ドメイン／部分間の距離を一定に保ち、それらの独立した機能を維持するのに有用である。リジッドリンカーはまた、融合物中の１つ以上の成分の安定性又は生物活性を維持するためにドメインの空間的分離が重要である場合にも有用となり得る。リジッドリンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列（ＸＰ）ｎ（Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕを示す）を有し得る。
切断可能なリンカーは、インビボで遊離機能性ドメインを放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在などの特定の条件下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆的な性質を利用してもよい。１つの例は、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）を含む。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断が起こるが、可逆的なジスルフィド結合はインタクトなままである。このようなリンカーは公知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。融合物中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞又は組織において、特定の条件下、インビボで発現されるか、又は特定の細胞コンパートメント内に拘束されるプロテアーゼによっても実施される得る。多くのプロテアーゼの特異性により、拘束されたコンパートメント内のリンカーの切断が遅くなる。
本明細書に記載のリンカーでの使用に適した分子の例としては、負荷電スルホネート基；脂質、例えば、ポリ（－ＣＨ２－）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和変異体、そのヒドロキシル化変異体、そのアミド化若しくはそうでなければＮ含有変異体；非炭素リンカー；炭水化物リンカー；ホスホジエステルリンカー、又は発現リプレッサーの２つ以上の成分を共有結合的に連結することができる他の分子が挙げられる。例えば、ポリペプチドの疎水性領域又はポリペプチドの疎水性伸長、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、若しくは恐らくまたアラニン、フェニルアラニン、或いはチロシン、メチオニン、グリシン、又は他の疎水性残基に富む一連の残基を介して、ポリペプチドが連結される疎水性脂質球などの非共有結合性リンカーも含まれる。発現リプレッサーの成分は、発現リプレッサーの正荷電成分が別の成分の負電荷に連結されるように、電荷に基づく化学を用いて連結してもよい。
核酸
一態様において、本開示は、本明細書に記載の発現リプレッサー、発現抑制系、ＤＮＡターゲティング部分及び／又はリプレッサードメインをコードする核酸配列を提供する。当業者は、ＲＮＡの核酸配列が、典型的にはチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）によって置換されることを除き、対応するＤＮＡ配列と同一であることを認識している。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃを含む）によって表される場合、本開示はまた、「Ｔ」が「Ｕ」に置換される、対応するＲＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃを含む）を提供する。本明細書では従来の表記法を使用して、ポリヌクレオチド配列を記述する：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。
一態様において、本開示は、本明細書に記載の発現リプレッサー、発現抑制系、ＤＮＡターゲティング部分及び／又はリプレッサードメインをコードする核酸配列を提供する。当業者は、ＲＮＡの核酸配列が、典型的にはチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）によって置換されることを除き、対応するＤＮＡ配列と同一であることを認識している。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃを含む）によって表される場合、本開示はまた、「Ｔ」が「Ｕ」に置換される、対応するＲＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃを含む）を提供する。本明細書では従来の表記法を使用して、ポリヌクレオチド配列を記述する：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。
遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載されるＤＮＡターゲティング部分及び／又はリプレッサードメインを含む発現リプレッサーをコードする多数のヌクレオチド配列が産生され得るが、そのうちのいくつかは、本明細書に開示される核酸配列との類似性、例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有することが当業者には理解されよう。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、及びＣＧＵは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンにより指定される本開示の核酸分子中の全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、前述の対応するコドンのいずれかに改変され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分及び／又は１つ以上のリプレッサードメインを含む発現リプレッサーをコードする核酸配列は、哺乳動物、例えば、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化されたコドン最適化コード領域の一部又は全部であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分及び／又は１つ以上のリプレッサードメインをコードする核酸配列は、タンパク質発現を増加させる、及び／又はタンパク質発現の持続時間を増加させるために最適化されたコドンである。一部の実施形態では、コドン最適化核酸配列によって産生されるタンパク質は、コドン最適化されていない核酸配列によりコードされる場合のタンパク質のレベルと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％高い。
一態様では、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ＤＮＡターゲティング部分及び１つ以上のリプレッサードメインを含むポリペプチドに関し、例えば、この場合、リプレッサードメインは、ＭＱ１、例えば、細菌性ＭＱ１、又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＭＱ１は、スピロプラズマ・モノビアエ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｍｏｎｏｂｉａｅ）ＭＱ１、例えば、ＡＴＣＣ ３３８２５株由来及び／又はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１５８４０に対応するＭＱ１である。一部の実施形態では、ＭＱ１リプレッサードメインは、配列番号４７のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号４７の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＭＱ１は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクタードメインは、配列番号９０若しくは５７、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドに使用されるＭＱ１は、変異体、例えば、野生型ＭＱ１（例えば、配列番号９０又は配列番号５７）に対して１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、野生型ＭＱ１に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｋ２９７Ｐ置換を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｎ２９９Ｃ置換を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｅ３０１Ｙ置換を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｑ１４７Ｌ置換を含む（例えば、それと共に、野生型ＭＱ１と比較してＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性が低下している）。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｋ２９７Ｐ、Ｎ２９９Ｃ、及びＥ３０１Ｙ置換を含む（例えば、それと共に、野生型ＭＱ１と比較してＤＮＡ結合親和性が低下している）。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｑ１４７Ｌ、Ｋ２９７Ｐ、Ｎ２９９Ｃ、及びＥ３０１Ｙ置換を含む（例えば、それと共に、野生型ＭＱ１と比較してＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性及びＤＮＡ結合親和性が低下している）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の１つ以上のリンカー、例えば、部分／ドメインを別の部分／ドメインに連結するリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えばｄＣａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含むＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＱ１であるか、又はそれを含むリプレッサードメインと、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えばｄＣａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含むＤＮＡターゲティング部分と、を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、標的遺伝子（例えば、本明細書に記載される標的遺伝子）の発現を低減する。一部の実施形態では、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は本明細書に記載の標的遺伝子若しくは転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、上記ポリペプチドを、例えば、発現抑制系の代わりに使用してもよい。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、又は４つの）発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサーは、ＭＱ１、例えば、細菌性ＭＱ１、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ターゲティング部分と、１つ以上のエフェクター部分を含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、エフェクター部分は、例えば、ＮＰ＿０５６２０９．２に記載のＫｒｕｅｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢ）、若しくはＮＭ＿０１５３９４．５によりコードされるタンパク質、又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＢは、合成ＫＲＡＢ構築物である。一部の実施形態では、ＫＲＡＢは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬＤＴＡＱＱＩＬＹＲＮＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦＥＩＫＳＳＶ（配列番号６１）
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬＤＴＡＱＱＩＬＹＲＮＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦＥＩＫＳＳＶ（配列番号６１）
一部の実施形態では、ＫＲＡＢリプレッサードメインは、配列番号５１のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５１の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーに使用されるＫＲＡＢは、変異体、例えば、配列番号６１のＫＲＡＢ配列に対して１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＢ変異体は、配列番号６１に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、ＫＲＡＢ及びＤＮＡターゲティング部分であるか、又はそれを含むリプレッサードメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、本明細書に記載される追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、例えば、発現抑制系の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサーは、配列番号６１のＫＲＡＢ配列、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様では、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ＤＮＡターゲティング部分及び１つ以上のリプレッサードメインを含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ１、例えば、ヒトＤＮＭＴ１、又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ１は、ヒトＤＮＭＴ１であり、これは、例えば、遺伝子ＩＤ １７８６に対応し、例えば、ＵｎｉＰｏｒｔ ＩＤ Ｐ２６３５８．２に対応する。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のリプレッサードメインは、配列番号５８に記載の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＭＴ１は、配列番号４８のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号４８の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーに使用されるＤＮＭＴ１は、変異体、例えば、配列番号５８のＤＮＭＴ配列に対して１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、野生型ＤＮＭＴ１に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＤＮＭＴ１及びターゲティング部分であるか又はそれを含むリプレッサードメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサーは、ＤＮＭＴ１、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ＤＮＡターゲティング部分及び１つ以上のリプレッサードメインを含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体、又はその機能性変異体若しくは断片であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、融合構築物である。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、ＤＮＭＴ３Ａ、例えば、ＮＰ＿０７２０４６．２に記載のヒトＤＮＭＴ３Ａ、又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質を含む）。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、例えば、ＮＰ＿０３１８９８に記載のマウスＤＮＭＴ３Ａ、又はＮＭ＿００７８７２によりコードされるタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、ヒトＤＮＭＴ３Ｌ（例えば、ＮＰ＿７８７０６３．１に記載される通り、又はＮＭ＿１７５８６７．３によりコードされるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、マウスＤＮＭＴ３Ｌ（例えば、ＮＰ＿００１０７５１６４に記載される通り、又はＮＭ＿００１０８１６９５によりコードされるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌは、配列番号５９又は６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のリプレッサードメインは、配列番号５９若しくは配列番号６０、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌは、配列番号４９又は配列番号５０のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号４９若しくは５０の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーに使用されるＤＮＭＴ３ａ／３Ｌは、配列番号５９又は配列番号６０のＤＮＭＴ３ａ／３Ｌに対して、例えば、１つ以上の変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ変異体は、配列番号５９又は配列番号６０に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌであるか、又はそれを含むリプレッサードメインと、ＤＮＡターゲティング部分とを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、又は４つの）発現リプレッサーを含み、ここで、第１発現リプレッサーは、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ＤＮＡターゲティング部分と、１つ以上のリプレッサードメインを含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３ｂ、例えば、ヒトＤＮＭＴ３ｂ、又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ｂは、ヒトＤＮＭＴ３ｂ、例えば、ＮＰ＿００８８２３．１若しくはＡＯＸ２１８１９．１に記載の通りであるか、又はＮＭ＿００６８９２．４若しくはＫＸ４４７４２９によりコードされるタンパク質である。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ｂは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のリプレッサードメインは、配列番号８５、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
ＤＮＭＴ３ｂ
ＤＮＭＴ３ｂ
別の態様では、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ターゲティング部分と、１つ以上のエフェクター部分を含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、エフェクター部分は、例えば、ＮＰ＿００１３５０６１８．１に記載のＧ９Ａ又はＮＭ＿００１３６３６８９．１によりコードされるタンパク質又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、Ｇ９Ａは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む：
一部の実施形態では、Ｇ９Ａリプレッサードメインは、配列番号５２のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５２の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーに使用されるＧ９Ａは、配列番号６２のＧ９Ａ配列に対して、例えば、１つ以上の変異を含む変異体である。一部の実施形態では、Ｇ９Ａ変異体は、配列番号６２に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、Ｇ９Ａであるか、又はそれを含むリプレッサードメインと、ＤＮＡターゲティング部分とを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、例えば、発現抑制系の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、この場合、第１発現リプレッサーは、配列番号６２のＧ９Ａ配列、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ターゲティング部分と、１つ以上のエフェクター部分を含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、エフェクター部分は、例えば、ＮＰ＿００１１５９８９０に記載のＨＤＡＣ８、又はＮＭ＿００１１６６４１８によりコードされるタンパク質又はその機能性変異体若しくは断片を含む。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ８は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む：
一部の実施形態では、ＨＤＡＣ８リプレッサードメインは、配列番号５３のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５３の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーに使用されるＨＤＡＣ８は、配列番号６３のＨＤＡＣ８配列に対して、例えば、１つ以上の変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ８変異体は、配列番号６３に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、ＨＤＡＣ８であるか、又はそれを含むリプレッサードメインと、ＤＮＡターゲティング部分とを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、例えば、発現抑制系の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、この場合、第１発現リプレッサーは、配列番号６３のＨＤＡＣ８配列、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ターゲティング部分と、１つ以上のエフェクター部分を含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、エフェクター部分は、例えば、ＮＰ＿０５５８２８．２に記載のＬＳＤ１、又はＮＭ＿０１５０１３．４によりコードされるタンパク質又はその機能性変異体若しくは断片を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＢは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む：
一部の実施形態では、ＬＳＤ１リプレッサードメインは、配列番号５４のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５４の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーに使用されるＬＳＤ１は、配列番号６４のＬＳＤ１配列に対して、例えば、１つ以上の変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＬＳＤ１変異体は、配列番号６４に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、ＬＳＤ１であるか、又はそれを含むリプレッサードメインと、ＤＮＡターゲティング部分とを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、例えば、発現抑制系の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、この場合、第１発現リプレッサーは、配列番号６４のＬＳＤ１配列、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ターゲティング部分と、１つ以上のエフェクター部分を含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、エフェクター部分は、例えば、ＮＰ＿００４４４７．２に記載のＥＺＨ２、又はＮＭ＿００４４５６．５によりコードされるタンパク質又はその機能性変異体若しくは断片を含む。一部の実施形態では、ＥＺＨ２は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む：
一部の実施形態では、ＥＺＨ２リプレッサードメインは、配列番号５５のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５５の配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーで使用されるＥＺＨ２は、配列番号６５のＥＺＨ２配列に対して、例えば、１つ以上の変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＥＺＨ２変異体は、配列番号６５に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、ＥＺＨ２であるか又はそれを含むリプレッサードメインと、ＤＮＡターゲティング部分とを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、例えば、発現抑制系の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、この場合、第１発現リプレッサーは、配列番号６５のＥＺＨ２配列、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ターゲティング部分と、１つ以上のエフェクター部分とを含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、エフェクター部分は、例えば、ＮＰ＿７２２５２０．２に記載のＦＯＧ１、又はＮＭ＿１５３８１３．３によりコードされるタンパク質又はその機能性変異体若しくは断片を含む。一部の実施形態では、ＦＯＧ１は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む：
ＳＲＲＫＱＳＮＰＲＱＩＫＲＳＬＧＤＭＥＡＲＥＥＶＱＬＶＧＡＳＨＭＥＱＫＡＴＡＰＥＡＰＳＰ（配列番号６６）
ＳＲＲＫＱＳＮＰＲＱＩＫＲＳＬＧＤＭＥＡＲＥＥＶＱＬＶＧＡＳＨＭＥＱＫＡＴＡＰＥＡＰＳＰ（配列番号６６）
一部の実施形態では、ＦＯＧ１リプレッサードメインは、配列番号５６のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５６の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は発現リプレッサーで使用されるＦＯＧ１は、配列番号６６のＦＯＧ１配列に対して、例えば、１つ以上の変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＦＯＧ１変異体は、配列番号６６に対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、ＦＯＧ１であるか、又はそれを含むリプレッサードメインと、ＤＮＡターゲティング部分とを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は発現リプレッサーは、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、状態を治療する方法、又は標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で、例えば、発現抑制系の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、発現抑制系は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の発現リプレッサーを含み、この場合、第１発現リプレッサーは、配列番号６６のＦＯＧ１配列、又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインを含む。
一部の実施形態において、提供される技術は、標的遺伝子を特異的にターゲティングするｇＲＮＡを含むものとして記載される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、又はＭＹＣ誤調節障害関連遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＭＹＣである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ分子、例えば、β２Ｍである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、熱ショックタンパク質、例えば、ＨＳＰＡ１Ｂをコードする。一部の実施形態では、標的遺伝子は、転写因子、例えば、ＧＡＴＡ１である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される技術は、本明細書に記載される１つ以上の発現リプレッサー又は発現抑制系を、そうした部分を融合分子の一部としてＤＮＡターゲティング部分に連結することにより、対象、例えば、細胞の核又は対象の組織に送達する方法を含む。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＮＬＳ、例えば、Ｎ末端におけるＳＶ４０ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＮＬＳ、例えば、Ｃ末端にヌクレオプラスミンＮＬＳを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、Ｎ末端の第１ＮＬＳ及びＣ末端の第２ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、第１及び第２ＮＬＳは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、第１及び第２ＮＬＳは、異なる配列を有する。一部の実施形態では、発現抑制リプレッサーは、ＳＶ４０ＮＬＳを含み、例えば、発現リプレッサーは、ＰＫＫＫＲＫ（配列番号８６）に記載の配列を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、エピトープタグ、例えば、ＨＡタグ：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号８０）を含む。例えば、発現リプレッサーは、エピトープタグの２つのコピーを含み得る。
エピトープタグは、多くの研究に関して有用であるが、治療に関しては、エピトープタグを省くことが望ましい場合がある。従って、一部の実施形態では、発現リプレッサーにはエピトープタグがない。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、本明細書に提供される配列（或いは、それに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列）を含むが、配列番号８０のＨＡタグが欠失している。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、本明細書に提供される配列（或いは、それに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差を有する配列）を含むが、配列番号８０のＨＡタグをコードする領域が欠失している。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ヌクレオプラスミンＮＬＳを含み、例えば、発現リプレッサーは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫ（配列番号８７）の配列を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＮＬＳを含まない。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、エピトープタグを含まない。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ＨＡタグを含まない。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号８０に記載のＨＡタグ配列を含まない。
ＤＮＡターゲティング部分
ＤＮＡターゲティング部分は、ＤＮＡ配列、例えば、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列に特異的に結合することができ、例えば、標的遺伝子に近接し、且つ／又はそれと作動可能に連結したゲノム配列要素（例えば、プロモータ、ＴＳＳ、又はアンカー配列）に結合する。ＤＮＡ配列に特異的に結合する任意の分子又は化合物を、ＤＮＡターゲティング部分として使用してもよい。
ＤＮＡターゲティング部分は、ＤＮＡ配列、例えば、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列に特異的に結合することができ、例えば、標的遺伝子に近接し、且つ／又はそれと作動可能に連結したゲノム配列要素（例えば、プロモータ、ＴＳＳ、又はアンカー配列）に結合する。ＤＮＡ配列に特異的に結合する任意の分子又は化合物を、ＤＮＡターゲティング部分として使用してもよい。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の成分をターゲティングし、例えば、それに結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列（例えば、プロモータ又はエンハンサー）をターゲティングし、例えば、それに結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子、又は標的遺伝子の一部をターゲティングし、例えば、それに結合する。ＤＮＡターゲティング部分の標的は、その標的化成分と呼ばれ得る。標的化成分は、標的遺伝子に作動可能に連結した任意のゲノム配列要素、又は標的遺伝子自体であってもよく、限定はされないが、プロモータ、エンハンサー、アンカー配列、エキソン、イントロン、ＵＴＲコード配列、スプライス部位、又は転写開始部位を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、１つ以上の標的アンカー配列（例えば、細胞内）に特異的に結合し、非標的アンカー配列（例えば、同じ細胞内）には結合しない。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬエフェクター分子、Ｚｎフィンガードメイン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又は核酸分子であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、１つのＤＮＡターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含み、ここで、複数の発現リプレッサーの各メンバーは、ＤＮＡターゲティング部分を含み、ここで、各ＤＮＡターゲティング部分は、別のＤＮＡターゲティング部分に検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１ＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、第２ＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１ＤＮＡターゲティング部分は、第２ＤＮＡターゲティング部分に検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１ＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、第２ＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１ＤＮＡターゲティング部分は、別の第１ＤＮＡターゲティング部分に検出可能に結合せず、例えば、結合せず、また、第２ＤＮＡターゲティング部分は、別の第２ＤＮＡターゲティング部分に検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるＤＮＡターゲティング部分は、単量体、例えば、非二量体状態で機能性である（例えば、ＤＮＡ配列に結合する）。
一部の実施形態では、ターゲティング部分が標的化成分に結合すると、別の転写因子、ゲノム複合体成分、又はゲノム配列要素に対する標的化成分の結合親和性を低下させる。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、又は０．００１ｎＭ以下のＫＤ（及び任意選択で、少なくとも５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、又は０．００１ｎＭのＫＤ）でその標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、０．００１ｎＭ～５００ｎＭ、例えば、０．１ｎＭ～５ｎＭ、例えば、約０．５ｎＭのＫＤでその標的配列に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、又は１００，０００ｎＭのＫＤで非標的配列に結合する（及び任意選択で、非標的配列に、認め得るほどに結合しない）。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、非標的配列に結合しない。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的化成分に相補的な核酸配列、例えば、標的遺伝子のプロモータを含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的化成分と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％相補的である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、発現リプレッサーのＤＮＡターゲティング部分は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０以下のヌクレオチド（及び任意選択的に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０のヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサー又は融合分子のリプレッサードメインは、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、又は１００以下のアミノ酸（及び任意選択的に、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、又は１９００のアミノ酸）を含む。一部の実施形態では、発現リプレッサー又は融合分子のエフェクター部分は、１００～２０００、１００～１９００、１００～１８００、１００～１７００、１００～１６００、１００～１５００、１００～１４００、１００～１３００、１００～１２００、１００～１１００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～２０００、２００～１９００、２００～１８００、２００～１７００、２００～１６００、２００～１５００、２００～１４００、２００～１３００、２００～１２００、２００～１１００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～２０００、３００～１９００、３００～１８００、３００～１７００、３００～１６００、３００～１５００、３００～１４００、３００～１３００、３００～１２００、３００～１１００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００、３００～４００、４００～２０００、４００～１９００、４００～１８００、４００～１７００、４００～１６００、４００～１５００、４００～１４００、４００～１３００、４００～１２００、４００～１１００、４００～１０００、４００～９００、４００～８００、４００～７００、４００～６００、４００～５００、５００～２０００、５００～１９００、５００～１８００、５００～１７００、５００～１６００、５００～１５００、５００～１４００、５００～１３００、５００～１２００、５００～１１００、５００～１０００、５００～９００、５００～８００、５００～７００、５００～６００、６００～２０００、６００～１９００、６００～１８００、６００～１７００、６００～１６００、６００～１５００、６００～１４００、６００～１３００、６００～１２００、６００～１１００、６００～１０００、６００～９００、６００～８００、６００～７００、７００～２０００、７００～１９００、７００～１８００、７００～１７００、７００～１６００、７００～１５００、７００～１４００、７００～１３００、７００～１２００、７００～１１００、７００～１０００、７００～９００、７００～８００、８００～２０００、８００～１９００、８００～１８００、８００～１７００、８００～１６００、８００～１５００、８００～１４００、８００～１３００、８００～１２００、８００～１１００、８００～１０００、８００～９００、９００～２０００、９００～１９００、９００～１８００、９００～１７００、９００～１６００、９００～１５００、９００～１４００、９００～１３００、９００～１２００、９００～１１００、９００～１０００、１０００～２０００、１０００～１９００、１０００～１８００、１０００～１７００、１０００～１６００、１０００～１５００、１０００～１４００、１０００～１３００、１０００～１２００、１０００～１１００、１１００～２０００、１１００～１９００、１１００～１８００、１１００～１７００、１１００～１６００、１１００～１５００、１１００～１４００、１１００～１３００、１１００～１２００、１２００～２０００、１２００～１９００、１２００～１８００、１２００～１７００、１２００～１６００、１２００～１５００、１２００～１４００、１２００～１３００、１３００～２０００、１３００～１９００、１３００～１８００、１３００～１７００、１３００～１６００、１３００～１５００、１３００～１４００、１４００～２０００、１４００～１９００、１４００～１８００、１４００～１７００、１４００～１６００、１４００～１５００、１５００～２０００、１５００～１９００、１５００～１８００、１５００～１７００、１５００～１６００、１６００～２０００、１６００～１９００、１６００～１８００、１６００～１７００、１７００～２０００、１７００～１９００、１７００～１８００、１８００～２０００、１８００～１９００、又は１９００～２０００アミノ酸を含む。
本明細書に開示される発現リプレッサー又は発現抑制系は、核酸、例えば、１つ以上の核酸を含み得る。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡであるか、又はそれを含み；一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、５０％未満のリボヌクレオチドであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の核酸アナログであるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸アナログは、それがリン酸ジエステル骨格を利用しない点で、核酸とは異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数のペプチド核酸であるか、それを含むか、又はそれから構成される。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合ではなく、１つ若しくは複数のホスホロチオエート及び／又は５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数のヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、及びそれらの組合せ）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸に存在するものと比較して、１つ若しくは複数の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然の供給源からの単離、相補性鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボ若しくはインビトロ）、組換え細胞若しくは系中での生殖、及び化学合成のうちの１つ又は複数により調製される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基長又はそれ以上である。一部の実施形態では、核酸は、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、核酸は、一部が、又は完全に一本鎖であり；一部の実施形態では、核酸は、一部が、又は完全に二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、又はポリペプチドをコードする配列の補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、核酸を含むか、又は核酸である。
一部の実施形態では、部分に含まれ得る核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は人工若しくは合成核酸又は核酸アナログ若しくは模倣物であってもよいし、或いはそれを含有してもよい。例えば、一部の実施形態では、核酸は、以下：ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド－核酸ｍｉｘｍｅｒ、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくは他のＲＮＡｉ分子（例えば、本明細書に記載されるノンコーディングＲＮＡをターゲティングするもの、及び／又は本明細書に記載される標的化ゲノム複合体に関連する特定の遺伝子の発現産物をターゲティングするもの）などのうちの１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る。核酸配列として、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、化学修飾、例えば、骨格連結、糖分子、及び／若しくは核酸塩基を変更する修飾など）、並びに／又は人工核酸を挙げることができる。一部の実施形態では、核酸配列として、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、修飾ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子が挙げられる。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ残基ではない１つ若しくは複数の残基を含んでもよく、リン酸ジエステル結合ではない１つ若しくは複数の連結（例えば、ホスホロチオエート結合などであり得る）を含んでもよく、且つ／又は例えば、２’－ＯＭｅＰといった２’Ｏ修飾などの１つ若しくは複数の修飾を含んでもよい。合成核酸を調製するのに有用な種々の核酸構造は当技術分野で公知であり（例えば、国際公開第２０１７／０６２８６２ｌ号パンフレット及び同第２０１４／０１２０８１号パンフレットを参照）、当業者は、これらが、本開示に従って使用され得ることを理解されよう。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、１つ又は複数の天然ヌクレオシドに加えて、又はそれに代わるものとして、例えば、プリン若しくはピリミジン、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、１つ若しくは複数のヌクレオシドアナログを含んでもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、１つ又は複数のヌクレオシドアナログを含む。ヌクレオシドアナログとして、限定されないが、ヌクレオシドアナログ、例えば、５－フルオロウラシル；５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、４－メチルベンズイミダゾール、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ジヒドロウリジン、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、３－ニトロピロール、イノシン、チオウリジン、キューオシン、ワイオシン、ジアミノプリン、イソグアニン、イソシトシン、ジアミノピリミジン、２，４－ジフルオロトルエン、イソキノリン、ピロロ［２，３－β］ピリジン、及びプリン又はピリミジン側鎖と塩基対合することができるいずれか他のものが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）システムに関与するタンパク質、例えばＣａｓタンパク質、及び任意選択で、ガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子に含まれるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質によって非共有結合的に結合される。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）システムに関与するタンパク質、例えばＣａｓタンパク質、及び任意選択で、ガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子に含まれるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質によって非共有結合的に結合される。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌及び古細菌中に最初に発見された適応型防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連又は「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９若しくはＣｐｆ１）と呼ばれるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて、外来ＤＮＡを切断する。例えば、典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列をターゲティングする配列特異的、ノンコーディング「ガイドＲＮＡ」により標的ヌクレアーゼ配列（例えば、配列編集しようとするゲノム内の部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ～ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。１クラスのＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、及びトランス作用性ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）を含む。ｃｒＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」を含み、これは、典型的には約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列であり、標的ＤＮＡ配列に対応する。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して、部分的二本鎖構造を形成する領域を含み、この構造が、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが得られる。次に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを指令して、標的ＤＮＡ配列を認識させ、これを切断させる。標的ＤＮＡ配列は、概して、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的な「プロトスペーサ隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）と隣接していなければならないが；ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体にわたって出現する。多様な原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例としては、５’－ＮＧＧ（化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’－ＮＮＡＧＡＡ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’－ＮＧＧＮＧ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）、及び５’－ＮＮＮＧＡＴＴ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドグルカナーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇ－リッチＰＡＭ部位、例えば、５’－ＮＧＧと結合し、ＰＡＭ部位から（その５’側）３ヌクレオチド上流の位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ；言い換えれば、Ｃｐｆ１システムは、標的ＤＮＡ配列を切断するために、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼとｃｒＲＮＡしか必要としない。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｔ－リッチＰＡＭ部位、例えば、５‘－ＴＴＮと結合する。Ｃｐｆ１はまた、５’－ＣＴＡ ＰＡＭモチーフも認識する。Ｃｐｆ１は、４－若しくは５－ヌクレオチド５’オーバーハングを有するオフセット又はスタッガード二本鎖切断を導入する、例えば、コーディング鎖上のＰＡＭから（その３’側）１８ヌクレオチド下流及び相補鎖上のＰＡＭから２３ヌクレオチド下流に位置する５－ヌクレオチドオフセット又はスタッガード切断を用いて標的ＤＮＡを切断することにより、標的ＤＮＡを切断し；こうしたオフセット切断によって生じる５－ヌクレオチドオーバーハングは、平滑末端切断ＤＮＡでの挿入によるものと比較して、相同組換えによるＤＮＡ挿入によってさらに正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１を参照されたい。
多種多様なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子又はタンパク質を、本開示に提供される技術で使用することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は、本方法の特定の条件に応じて変化し得る。Ｃａｓタンパク質の具体的な例として、クラスＩＩシステムが挙げられ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、多様な原核生物種のいずれに由来するものでもよい。一部の実施形態では、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質は、特定のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分として、配列ターゲティングポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９が挙げられる。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、細菌若しくは古細菌から取得するか、又は公知の方法を用いて合成してもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌に由来するものであってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、若しくはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、スタフィロコッカッス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィラス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、又はマリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）に由来するものであってよい。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が結合及び／又は機能するために、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的ＤＮＡ配列中に存在するか、若しくはそれと隣接する必要がある。一部の実施形態では、ＰＡＭは、５’から３’に、ＮＧＧ、ＹＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＡ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＴＴＮ、又はＮＮＮＧＡＴＴであるか、又はそれを含み、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、Ｙは、Ｃ又はＴを表し、Ｒは、Ａ又はＧを表し、Ｖは、Ａ又はＣ又はＧを表す。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、表１に挙げるタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、そのＰＡＭを変更する１つ又は複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ１３６９Ｒ、Ｅ１４４９Ｈ、及びＲ１５５６Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、及びＲ１０１５Ｈ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、及びＮ５５２Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を修飾して、ヌクレアーゼを不活性化する（例えば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９）。野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡがターゲティングする特定のＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するのに対し、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが入手可能であり、例えば：Ｃａｓ９の「ニッカーゼ」バージョンは、一本鎖切断のみを生成し；触媒として不活性のＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しない。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列とｄＣａｓ９の結合は、立体障害により当該部位の転写に干渉する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、触媒として不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、触媒として不活性な変異体Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４であるか、又はそれを含む。触媒として不活性の多くのＣａｓ９タンパク質が当技術分野で知られている。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインに突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１１Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対するＨ９６９Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対するＮ９９５Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対するＤ１１Ａ、Ｈ９６９Ａ、及びＮ９９５Ａ突然変異又は類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１０Ａ突然変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｈ５５７Ａ変異又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１０Ａ及びＨ５５７Ａ変異又は類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ８３９Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＨ８４０Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＮ８６３Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１０Ａ及びＤ８３９Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、及びＨ８４０Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａ変異又は類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＥ９９３Ａ変異又は類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ９１７Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＥ１００６Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１２５５Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ変異又は類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１６Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ５８７Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＨ５８８Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＮ６１１Ａ変異又は類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、前記位置に対応するアミノ酸に対してＤ１６Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、及びＮ６１１Ａの変異又は類似の置換を含む。
別の態様において、本開示は、１つ以上の（例えば、１つの）ＤＮＡターゲティング部分と、１つ以上のリプレッサードメインとを含む発現リプレッサー又はポリペプチドに関し、この場合、１つ以上のＤＮＡターゲティング部分は、Ｃａｓタンパク質、例えば、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９ｍ４、又はその機能性変異体若しくは断片を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、配列番号４６又は８８のアミノ酸配列を含む：
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、配列番号４５又は８９の核酸配列によりコードされる：
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ｇＲＮＡを含むか、又はそれと（例えば、共有）結合したＣａｓ分子を含み得る。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ－タンパク質結合に必要な「スカフォールド」配列と、ゲノム標的のためのユーザ定義の約２０ヌクレオチドターゲティング配列から構成される短い合成ＲＮＡである。実際には、ガイドＲＮＡ配列は、概して１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の間の長さを有するように設計され、且つ標的化核酸配列に対して相補的である。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用する目的で市販されている。遺伝子編集はまた、キメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）、操作（合成）単一ＲＮＡ分子を用いても達成されており、これは、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）と、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のためにターゲティングされる配列にヌクレアーゼを誘導する）の両方を含有する。キメラ編集ｓｇＲＮＡはまた、Ｃａｓタンパク質と一緒に使用する上で有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ｇＲＮＡを含むか、又はそれと（例えば、共有）結合したＣａｓ分子を含み得る。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ－タンパク質結合に必要な「スカフォールド」配列と、ゲノム標的のためのユーザ定義の約２０ヌクレオチドターゲティング配列から構成される短い合成ＲＮＡである。実際には、ガイドＲＮＡ配列は、概して１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の間の長さを有するように設計され、且つ標的化核酸配列に対して相補的である。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用する目的で市販されている。遺伝子編集はまた、キメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）、操作（合成）単一ＲＮＡ分子を用いても達成されており、これは、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）と、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のためにターゲティングされる配列にヌクレアーゼを誘導する）の両方を含有する。キメラ編集ｓｇＲＮＡはまた、Ｃａｓタンパク質と一緒に使用する上で有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列と相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御エレメントであるか、それを含むか、又はそれと重複する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列に対して少なくとも９０、９５、９９、又は１００％相補的である核酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子を含むＤＮＡターゲティング部分と一緒に使用されるｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子と一緒に使用されるｇＲＮＡは、β－２－ミクログロブリン発現に関連する標的配列に特異的に結合する。このようなｇＲＮＡは、以下から選択される標的結合配列を含み得る：
ＧＤ－２８２２８：ＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＧＣＣＧＴ（配列番号１）、
ＧＤ－２８２２９：ＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧ（配列番号２）、
ＧＤ－２８１７１：ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧＧＧ（配列番号３）、
ＧＤ－２８１７２：ＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣ（配列番号４）、又は
ＧＤ－２８１７３：ＧＴＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＴ（配列番号５）。
ＧＤ－２８２２８：ＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＧＣＣＧＴ（配列番号１）、
ＧＤ－２８２２９：ＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧ（配列番号２）、
ＧＤ－２８１７１：ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧＧＧ（配列番号３）、
ＧＤ－２８１７２：ＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣ（配列番号４）、又は
ＧＤ－２８１７３：ＧＴＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＴ（配列番号５）。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインと一緒に使用されるｇＲＮＡは、ＣＴＣＦに関連する標的配列に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインと一緒に使用されるｇＲＮＡは、プロモータに関連する標的配列に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表３に列挙される標的配列に結合する。
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１ＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、第２ＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１ＤＮＡターゲティング部分は、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むか、又はそれであり、第２ＤＮＡターゲティング部分は、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むか、又はそれである。一部の実施形態では、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と、第１ガイドＲＮＡを含み、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と、第２ガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、第２ガイドＲＮＡと、認め得るほどに結合せず（例えば、結合せず）、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００、又は１０，０００ｎＭのＫＤで結合し、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、第１ガイドＲＮＡと、認め得るほどに結合せず（例えば、結合せず）、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００、又は１０，０００ｎＭのＫＤで結合する。
ＴＡＬエフェクタードメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ＴＡＬエフェクター分子であるか、又はそれを含む。ＴＡＬエフェクター分子、例えば、ＤＮＡ配列に特異的に結合するＴＡＬエフェクター分子は、複数のエフェクタードメイン又はその断片と、任意選択的に天然に存在するＴＡＬエフェクター（例えば、複数のＴＡＬエフェクタードメインのＮ－及び／又はＣ－末端）の１つ若しくは複数の別の部分を含む。多くのＴＡＬエフェクターは、当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ＴＡＬエフェクター分子であるか、又はそれを含む。ＴＡＬエフェクター分子、例えば、ＤＮＡ配列に特異的に結合するＴＡＬエフェクター分子は、複数のエフェクタードメイン又はその断片と、任意選択的に天然に存在するＴＡＬエフェクター（例えば、複数のＴＡＬエフェクタードメインのＮ－及び／又はＣ－末端）の１つ若しくは複数の別の部分を含む。多くのＴＡＬエフェクターは、当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
ＴＡＬＥは、宿主植物における遺伝子発現を調節して、細菌のコロニー形成及び生存を促進する植物病原菌キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などの多くの病原菌種により分泌される天然のタンパク質である。ＴＡＬエフェクターの特異的な結合は、典型的には３３又は３４アミノ酸のタンデムに配列されたほぼ同一の反復配列から成る中央リピートドメイン（リピート可変二残基、ＲＶＤドメイン）に基づく。
ＴＡＬエフェクターファミリーのメンバーは、主にそれらのリピートの数及び順序が異なる。反復配列の数は、１．５～３３．５リピートの範囲であり、Ｃ－末端リピートは、通常、長さが短く（例えば、約２０アミノ酸）、一般に「ハーフリピート」と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターの各リピートは、異なる塩基対特異性を呈示する異なるリピートタイプとの１リピート対１塩基対相関を特徴とする（１リピートが、標的遺伝子配列上の１塩基対を認識する）。概して、リピートの数が少ないほど、タンパク質－ＤＮＡ相互作用が弱くなる。６．５リピートの数は、リポータ遺伝子の転写を活性化する上で十分であることが判明している（Ｓｃｈｏｌｚｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
リピート対リピートの変化は、主としてアミノ酸位置１２及び１３で起こり、そのため、これらは、「超可変」と呼ばれており、また、これは、例示的なリピート可変二残基（ＲＶＤ）及び核酸塩基標的とのそれらの対応を列記する表２に示すように、標的ＤＮＡプロモータ配列との相互作用の特異性の原因となる。
従って、特定のＤＮＡ配列をターゲティングするように、ＴＡＬエフェクターのリピートを修飾することが可能である。さらなる研究から、ＲＶＤ ＮＫがＧをターゲティングすることができることが明らかにされている。ＴＡＬエフェクターの標的部位は、最初のリピートがターゲティングする５’塩基とフランキングするＴを含む傾向もあるが、この認識の厳密な機構は不明である。現在までに１１３を超えるＴＡＬエフェクター配列がわかっている。キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からのＴＡＬエフェクターの非限定的な例として、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４、ＡｖｒＸａ７、ＡｖｒＸａ１０及びＡｖｒＢｓ３が挙げられる。
従って、本発明のＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメインは、任意の細菌種（例えば、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種、例えば、白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．Ｏｒｙｚａｅ）のアフリカ株（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）、アブラナ科野菜斑点細菌病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｒａｐｈａｎｉ）株７５６Ｃ及びイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）株ＢＬＳ２５６（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）由来のＴＡＬエフェクターから得ることができる。本明細書で使用される場合、本発明に従うＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＶＤドメイン、並びにやはり天然に存在するＴＡＬエフェクター由来のフランキング配列（ＲＶＤドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端上の配列）を含む。これは、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＲＶＤより多いか、又は少ないリピートを含み得る。本発明のＴＡＬエフェクター分子は、前述のコード及び当技術分野で既知の他のコードに基づく所与のＤＮＡ配列をターゲティングするように設計される。ＴＡＬエフェクタードメイン（例えば、リピート（モノマー又はモジュール）の数及びそれらの配列は、所望のＤＮＡ標的配列に基づいて選択される。例えば、特定の標的配列に合わせるために、ＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを除去又は付加してもよい。一実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、６．５～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。一実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、８～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～２５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～１４のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクター分子は、ＤＮＡ標的配列との完全なマッチに対応するＴＡＬエフェクタードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的配列上のリピートと標的塩基対との間のミスマッチは、それが、発現抑制システム、例えば、ＴＡＬエフェクター分子を含む発現リプレッサーの機能を可能にする場合に限って許容される。一般に、ＴＡＬＥ結合は、ミスマッチの数と逆相関する。一部の実施形態では、本発明の発現リプレッサーのＴＡＬエフェクター分子は、標的ＤＮＡ配列に対して、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つ以下のミスマッチ、また任意選択的にゼロのミスマッチを含む。理論に束縛されることは望まないが、一般に、ＴＡＬエフェクター分子中のＴＡＬエフェクタードメインの数が少ないほど、より少数のミスマッチが許容され、これは、発現抑制システム、例えば、ＴＡＬエフェクター分子を含む発現リプレッサーの機能を依然として可能にする。結合親和性は、マッチするリピート－ＤＮＡ組合せの合計に依存すると考えられる。例えば、２５以上のＴＡＬエフェクタードメインを有するＴＡＬエフェクター分子は、最大７つのミスマッチを許容することができる。
ＴＡＬエフェクタードメインに加えて、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来する追加の配列を含んでもよい。ＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメイン部分の両側に含まれるＣ－末端及び／又はＮ－末端配列の長さは、変動し得、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）の研究に基づいて、当業者により選択することができる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、Ｈａｘ３由来のＴＡＬエフェクターベースのタンパク質中のいくつかのＣ－末端及びＮ－末端切断変異体を特性決定し、標的配列との最適な結合、従って転写の活性化に寄与する重要なエレメントを同定した。概して、転写活性は、Ｎ－末端の長さと逆相関することが判明した。Ｃ－末端に関しては、Ｈａｘ３配列の最初の６８アミノ酸内のＤＮＡ結合残基に重要なエレメントが同定された。従って、一部の実施形態では、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＴＡＬエフェクタードメインのＣ－末端側の最初の６８アミノ酸は、本発明の発現リプレッサーのＴＡＬエフェクター分子に含まれる。従って、一実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、以下：１）天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の１つ若しくは複数のＴＡＬエフェクタードメイン；２）ＴＡＬエフェクタードメインのＮ－末端側の天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の少なくとも７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０以上のアミノ酸；及び／又は３）ＴＡＬエフェクターのＣ－末端側の少なくとも６８、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０以上のアミノ酸を含む。
Ｚｎフィンガードメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、Ｚｎフィンガードメインであるか、又はそれを含む。Ｚｎフィンガードメインは、Ｚｎフィンガータンパク質、例えば、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質若しくは操作されたＺｎフィンガータンパク質、又はその断片を含む。多くのＺｎフィンガータンパク質は、当業者に周知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、Ｚｎフィンガードメインであるか、又はそれを含む。Ｚｎフィンガードメインは、Ｚｎフィンガータンパク質、例えば、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質若しくは操作されたＺｎフィンガータンパク質、又はその断片を含む。多くのＺｎフィンガータンパク質は、当業者に周知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、選択した標的ＤＮＡ配列に結合するように操作された非天然のＺｎフィンガータンパク質を含む。例えば、以下を参照されたい：Ｂｅｅｒｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第６，５９９，６９２号明細書；同第６，５０３，７１７号明細書；同第６，６８９，５５８号明細書；同第７，０３０，２１５号明細書；同第６，７９４，１３６号明細書；同第７，０６７，３１７号明細書；同第７，２６２，０５４号明細書；同第７，０７０，９３４号明細書；同第７，３６１，６３５号明細書；同第７，２５３，２７３号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；同第２００７／０２１８５２８号明細書；同第２００５／０２６７０６１号明細書（全て、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
操作Ｚｎフィンガータンパク質は、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質と比較して、新たな結合特異性を有し得る。操作方法として、限定されないが、合理的設計及び様々なタイプの選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（クアドルプレット）ヌクレオチド配列と個別のＺｎフィンガーアミノ酸配列の使用を含み、ここで、トリプレット又はクアドルプレットヌクレオチド配列は各々、上記の特定のトリプレット又はクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ若しくは複数のアミノ酸配列と結合している。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号明細書及び同第６，５３４，２６１号明細書（それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法が、以下：米国特許第５，７８９，５３８号明細書；同第５，９２５，５２３号明細書；同第６，００７，９８８号明細書；同第６，０１３，４５３号明細書；同第６，４１０，２４８号明細書；同第６，１４０，４６６号明細書；同第６，２００，７５９号明細書；及び同第６，２４２，５６８号明細書；並びに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；同第９８／５３０５７号パンフレット；同第００／２７８７８号パンフレット；及び同第０１／８８１９７号パンフレット並びに英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。加えて、ジンクフィンガータンパク質に対する結合特異性の増強が、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
さらに、上記の参照文献及びその他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／又はマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、任意の好適なリンカー配列を用いて互いに連結されていてもよく、そうしたリンカーとして例えば、長さが５アミノ酸以上のリンカーが挙げられる。また、長さが６アミノ酸以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、当該タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強については、例えば、共同所有国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のためのＺｎフィンガータンパク質及び方法は、当業者には周知であり、以下に詳しく記載されている：米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；同第７８９，５３８号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第５，９２５，５２３号明細書；同第６，００７，９８８号明細書；同第６，０１３，４５３号明細書；及び同第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；同第９６／０６１６６号パンフレット；同第９８／５３０５７号パンフレット；同第９８／５４３１１号パンフレット；同第００／２７８７８号パンフレット；同第０１／６０９７０号パンフレット；同第０１／８８１９７号パンフレット；同第０２／０９９０８４号パンフレット；同第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレット；及び同第０３／０１６４９６号パンフレット。
さらに、上記の、及びその他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガータンパク質及び／又はマルチフィンガーＺｎフィンガータンパク質は、例えば、融合タンパク質と同様に、任意の好適なリンカー配列を用いて互いに連結されていてもよく、そうしたリンカーとして例えば、長さが５アミノ酸以上のリンカーが挙げられる。また、長さが６アミノ酸以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるＺｎフィンガードメインは、当該Ｚｎフィンガードメインの個々のジンクフィンガータンパク質及び／又はマルチフィンガーＺｎフィンガータンパク質の間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。
特定の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的ＤＮＡ配列に（配列特異的に）結合する操作ジンクフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガードメインを含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、１つのＺｎフィンガータンパク質又はその断片を含む。別の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、複数のＺｎフィンガータンパク質（又はその断片）、例えば、２、３、４、５、６以上のＺｎフィンガータンパク質（及び任意選択的に、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、若しくは２以下のフィンガータンパク質）を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、少なくとも３つのＺｎフィンガータンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、４、５、又は６つのフィンガーを含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、８、９、１０、１１、又は１２のフィンガーを含む。一部の実施形態では、３つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガードメインは、９又は１０ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、４つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガードメインは、１２～１４ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、６つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガードメインは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは、２枝型（ｔｗｏ ｈａｎｄｅｄ）Ｚｎフィンガータンパク質を含む。２枝型Ｚｎフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続標的部位に結合するように、ジンクフィンガータンパク質の２つのクラスターが、アミノ酸を介在することにより隔てられている、タンパク質である。２枝型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、この場合、４個のジンクフィンガータンパク質のクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３個のＺｎフィンガータンパク質のクラスターが、カルボキシル末端に位置する（Ｒｅｍａｄｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１８（１８）：５０７３－５０８４を参照）。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、ユニークな標的配列に結合することができ、２つの標的配列間のスペーシングは、多くのヌクレオチドを含むことができる。
核酸分子
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩが知られている。また、以下の文献も参照されたい：米国特許第５，４２０，０３２号；同第６，８３３，２５２号明細書；Ｂｅｌｆｏｒｔ，ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８；Ｇｉｍｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ。加えて、非天然標的部位に結合するように、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書を参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩが知られている。また、以下の文献も参照されたい：米国特許第５，４２０，０３２号；同第６，８３３，２５２号明細書；Ｂｅｌｆｏｒｔ，ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８；Ｇｉｍｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ。加えて、非天然標的部位に結合するように、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書を参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、核酸を含むか、又は核酸である。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分に含まれ得る核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は人工若しくは合成核酸又は核酸類似体若しくは模倣物であるか、又はそれを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ分子（例えば、本明細書に記載の非コードＲＮＡをターゲティングし、且つ／又は本明細書に記載の標的ゲノム複合体と結合した特定の遺伝子の発現産物をターゲティングするもの）などのうち１つ以上であってもよいし、又はそれらを含んでもよい。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ残基ではない１つ以上の残基を含んでもよく、ホスホジエステル結合ではない（例えば、ホスホロチオエート結合などであり得る）１つ以上の結合を含んでもよく、且つ／又は、例えば、２’－ＯＭｅＰのような２’Ｏ修飾などの１つ以上の修飾を含んでもよい。合成核酸を調製するのに有用な様々な核酸構造は、当技術分野で公知であり（例えば、国際公開第２０１７／０６２８６２ｌ号及び同第２０１４／０１２０８１号パンフレットを参照）、当業者は、本開示に従ってそれらが使用され得ることを理解されよう。
発現リプレッサー、例えば、ＤＮＡターゲティング部分における使用に適した核酸として、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、骨格結合、糖分子、及び／又は核酸塩基を改変する修飾などの化学修飾）、並びに人工核酸を挙げることができる。一部の実施形態では、核酸として、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、修飾ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子が挙げられる。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、長さが約１５～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１６０～２００、１７０～２００、１８０～２００、１９０～２００、２１５～１９０、２０～１９０、３０～１９０、４０～１９０、５０～１９０、６０～１９０、７０～１９０、８０～１９０、９０～１９０、１００～１９０、１１０～１９０、１２０～１９０、１３０～１９０、１４０～１９０、１５０～１９０、１６０～１９０、１７０～１９０、１８０～１９０、１５～１８０、２０～１８０、３０～１８０、４０～１８０、５０～１８０、６０～１８０、７０～１８０、８０～１８０、９０～１８０、１００～１８０、１１０～１８０、１２０～１８０、１３０～１８０、１４０～１８０、１５０～１８０、１６０～１８０、１７０～１８０、１５～１７０、２０～１７０、３０～１７０、４０～１７０、５０～１７０、６０～１７０、７０～１７０、８０～１７０、９０～１７０、１００～１７０、１１０～１７０、１２０～１７０、１３０～１７０、１４０～１７０、１５０～１７０、１６０～１７０、１５～１６０、２０～１６０、３０～１６０、４０～１６０、５０～１６０、６０～１６０、７０～１６０、８０～１６０、９０～１６０、１００～１６０、１１０～１６０、１２０～１６０、１３０～１６０、１４０～１６０、１５０～１６０、２１５～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０、１１０～１５０、１２０～１５０、１３０～１５０、１４０～１５０、１５～１４０、２０～１４０、３０～１４０、４０～１４０、５０～１４０、６０～１４０、７０～１４０、８０～１４０、９０～１４０、１００～１４０、１１０～１４０、１２０～１４０、１３０～１４０、１５～１３０、２０～１３０、３０～１３０、４０～１３０、５０～１３０、６０～１３０、７０～１３０、８０～１３０、９０～１３０、１００～１３０、１１０～１３０、１２０～１３０、２１５～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０、１１０～１２０、１５～１１０、２０～１１０、３０～１１０、４０～１１０、５０～１１０、６０～１１０、７０～１１０、８０～１１０、９０～１１０、１００～１１０、１５～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、１５～９０、２０～９０、３０～９０、４０～９０、５０～９０、６０～９０、７０～９０、８０～９０、１５～８０、２０～８０、３０～８０、４０～８０、５０～８０、６０～８０、７０～８０、１５～７０、２０～７０、３０～７０、４０～７０、５０～７０、６０～７０、１５～６０、２０～６０、３０～６０、４０～６０、５０～６０、１５～５０、２０～５０、３０～５０、４０～５０、１５～４０、２０～４０、３０～４０、１５～３０、２０～３０、若しくは１５～２０ヌクレオチド、又はこれらの間の任意の範囲である核酸を含む。
リプレッサードメイン
本開示の発現リプレッサーは、１つ以上のリプレッサードメインを含む。リプレッサードメインは、本明細書に記載される発現リプレッサー又は発現抑制系の一部として使用されると、細胞における標的遺伝子の発現を低減する１つ以上の機能性を有する。
本開示の発現リプレッサーは、１つ以上のリプレッサードメインを含む。リプレッサードメインは、本明細書に記載される発現リプレッサー又は発現抑制系の一部として使用されると、細胞における標的遺伝子の発現を低減する１つ以上の機能性を有する。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ヒストン修飾機能性、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能性は、Ｈ３Ｋ９ターゲティングメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能性は、Ｈ３Ｋ５６ターゲティングメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能性は、Ｈ３Ｋ２７ターゲティングメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ又はデメチラーゼ機能性は、１つ、２つ、又は３つのメチル基を転移する。一部の実施形態では、ヒストンデメチラーゼ機能性は、Ｈ３Ｋ４ターゲティングデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片、例えば、そのいずれかのＳＥＴドメインから選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、エピジェネティック修飾部分を含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ＤＮＡ修飾機能性、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、転写リプレッサーを含む。一部の実施形態では、転写リプレッサーは、例えば、標的遺伝子の転写を刺激又は促進する因子の動員を阻止する。一部の実施形態では、転写リプレッサーは、例えば、標的遺伝子の転写を阻害する因子を動員する。一部の実施形態では、リプレッサードメイン、例えば、転写リプレッサーは、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、エピジェネティック修飾を、例えば、直接、又は間接的に促進する。例えば、リプレッサードメインは、クロマチンをエピジェネティック的に修飾する内因性タンパク質を動員することによって、エピジェネティック修飾を間接的に促進することができる。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、エピジェネティック修飾を触媒することによりエピジェネティック修飾を直接促進することができ、この場合、リプレッサードメインは、酵素活性を含み、クロマチン上にエピジェネティックマークを直接配置する。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、本明細書に記載の機能性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、以下から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む：
ＫＲＡＢ（例えば、ＮＰ＿０５６２０９．２に記載のもの、又はＮＭ＿０１５３９４．５によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６１に記載のもの）；
ＳＥＴドメイン（例えば、下記：
ＳＥＴＤＢ１（例えば、ＮＰ＿００１３５３３４７．１に記載のもの、若しくはＮＭ＿００１３６６４１８．１によりコードされるタンパク質）；
ＥＺＨ２（例えば、ＮＰ－００４４４７．２に記載のもの、若しくはＮＭ＿００４４５６．５によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６５に記載のもの）；
Ｇ９Ａ（例えば、ＮＰ＿００１３５０６１８．１に記載のもの、又はＮＭ＿００１３６３６８９．１によりコードされるタンパク質；例えば、配列番号６２に記載のもの）；又は
ＳＵＶ３９Ｈ１（例えば、ＮＰ＿００３１６４．１に記載のもの、若しくはＮＭ＿００３１７３．４によりコードされるタンパク質）
のＳＥＴドメイン）；
ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１（例えば、ＮＰ＿０５５８２８．２に記載のもの、若しくはＮＭ＿０１５０１３．４によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６４に記載のもの）；
ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）（例えば、ＮＰ＿７２２５２０．２に記載のもの、若しくはＮＭ＿１５３８１３．３によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６６に記載のもの）；
ＫＡＰ１（例えば、ＮＰ＿００５７５３．１に記載のもの、若しくはＮＭ＿００５７６２．３によりコードされるタンパク質）；又は
ＨＤＡＣ８（例えば、ＮＰ＿００１１５９８９０に記載のもの、若しくはＮＭ＿００１１６６４１８によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６３に記載のもの）；
それらの機能性断片又はそのいずれかの変異体、或いは
上に参照した配列のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、以下から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む：
ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）（例えば、ＮＰ＿０７２０４６．２に記載のもの、又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号５８に記載のもの）；
ＤＮＭＴ３Ｂ（例えば、ＡＯＸ２１８１９．１に記載のもの、又はＮＭ＿００６８９２．４若しくはＫＸ４４７４２９によりコードされるタンパク質）；
ＤＮＭＴ３Ｌ（例えば、ＮＰ＿７８７０６３．１に記載のもの、又はＮＭ＿１７５８６７．３によりコードされるタンパク質）；
ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体（例えば、配列番号５９又は６０に記載のもの）、
細菌性ＭＱ１（例えば、ＣＡＡ３５０５８．１又はＰ１５８４０．３に記載のもの、例えば、配列番号５７又は９０に記載のもの）；
それらのいずれかの機能性断片、又は
上に参照した配列のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。
ＫＲＡＢ（例えば、ＮＰ＿０５６２０９．２に記載のもの、又はＮＭ＿０１５３９４．５によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６１に記載のもの）；
ＳＥＴドメイン（例えば、下記：
ＳＥＴＤＢ１（例えば、ＮＰ＿００１３５３３４７．１に記載のもの、若しくはＮＭ＿００１３６６４１８．１によりコードされるタンパク質）；
ＥＺＨ２（例えば、ＮＰ－００４４４７．２に記載のもの、若しくはＮＭ＿００４４５６．５によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６５に記載のもの）；
Ｇ９Ａ（例えば、ＮＰ＿００１３５０６１８．１に記載のもの、又はＮＭ＿００１３６３６８９．１によりコードされるタンパク質；例えば、配列番号６２に記載のもの）；又は
ＳＵＶ３９Ｈ１（例えば、ＮＰ＿００３１６４．１に記載のもの、若しくはＮＭ＿００３１７３．４によりコードされるタンパク質）
のＳＥＴドメイン）；
ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１（例えば、ＮＰ＿０５５８２８．２に記載のもの、若しくはＮＭ＿０１５０１３．４によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６４に記載のもの）；
ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）（例えば、ＮＰ＿７２２５２０．２に記載のもの、若しくはＮＭ＿１５３８１３．３によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６６に記載のもの）；
ＫＡＰ１（例えば、ＮＰ＿００５７５３．１に記載のもの、若しくはＮＭ＿００５７６２．３によりコードされるタンパク質）；又は
ＨＤＡＣ８（例えば、ＮＰ＿００１１５９８９０に記載のもの、若しくはＮＭ＿００１１６６４１８によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号６３に記載のもの）；
それらの機能性断片又はそのいずれかの変異体、或いは
上に参照した配列のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、以下から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む：
ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）（例えば、ＮＰ＿０７２０４６．２に記載のもの、又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質、例えば、配列番号５８に記載のもの）；
ＤＮＭＴ３Ｂ（例えば、ＡＯＸ２１８１９．１に記載のもの、又はＮＭ＿００６８９２．４若しくはＫＸ４４７４２９によりコードされるタンパク質）；
ＤＮＭＴ３Ｌ（例えば、ＮＰ＿７８７０６３．１に記載のもの、又はＮＭ＿１７５８６７．３によりコードされるタンパク質）；
ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体（例えば、配列番号５９又は６０に記載のもの）、
細菌性ＭＱ１（例えば、ＣＡＡ３５０５８．１又はＰ１５８４０．３に記載のもの、例えば、配列番号５７又は９０に記載のもの）；
それらのいずれかの機能性断片、又は
上に参照した配列のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、ポリペプチドであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、リプレッサードメインは、酵素活性を有する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヘリックス－ヘアピン－ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフを含む。ＨｈＨ構造モチーフを有するＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質骨格窒素とＤＮＡリン酸基との間の水素結合の形成によって生じる非配列特異的ＤＮＡ結合に関与している可能性がある。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヘリックス－ループ－ヘリックス（ＨＬＨ）モチーフを含む。ＨＬＨ構造モチーフを有するＤＮＡ結合タンパク質は、転写調節タンパク質であり、主に多様な発生過程に関連している。ＨＬＨ構造モチーフは、残基に関して、ＨＴＨ又はＨｈＨモチーフよりも長い。これらのタンパク質の多くは、相互作用して、ホモダイマー及びヘテロダイマーを形成する。構造モチーフは、ＤＮＡに結合するＮ末端ヘリックスを有する２つの長いヘリックス領域で構成されるが、複合体領域は、タンパク質の二量体化を可能にする。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ロイシンジッパーモチーフを含む。いくつかの転写因子では、ＤＮＡとの二量体結合部位が、ロイシンジッパーを形成する。このモチーフは、各サブユニットから１つずつ、２つの両親媒性ヘリックスを含み、互いに相互作用して、左巻きのコイルドコイル超二次構造をもたらす。ロイシンジッパーは、１つのヘリックス内に規則的な間隔を置くロイシン残基と、隣接するヘリックスからのロイシンとの相互篏合である。ほとんどの場合、ロイシンジッパーに関与するヘリックスは、残基ａ及びｄが疎水性であり、他の残基が親水性であるヘプタッド（ｈｅｐｔａｄ）配列（ａｂｃｄｅｆｇ）を示す。ロイシンジッパーモチーフは、ホモ又はヘテロ二量体形成のいずれかを媒介することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｚｎフィンガードメインを含み、ここで、Ｚｎ＋＋イオンは、２つのＣｙｓ及び２つのＨｉｓ残基によって配位される。このような転写因子は、化学量論ββ’αを有する三量体を含む。Ｚｎ＋＋配位の明らかな効果は、疎水性コア残基ではなく、小さな複合体構造の安定化である。各Ｚｎフィンガーは、二重らせんの主溝における連続した三重塩基対セグメントと立体構造的に同一の方法で相互作用する。タンパク質－ＤＮＡ相互作用は、以下：（ｉ）αヘリックスとＤＮＡセグメント間、主としてＡｒｇ残基とグアニン塩基の間の、Ｈ結合相互作用、（ｉｉ）ＤＮＡリン酸骨格、主にＡｒｇ及びＨｉｓとのＨ結合相互作用の２つの要因によって決定される。代替的Ｚｎフィンガーモチーフは、Ｚｎ＋＋を６ Ｃｙｓとキレート化する。
例示的なリプレッサードメインは、以下を含むが、これらに限定されない：ユビキチン、ユビキチンリガーゼ阻害剤としての二環式ペプチド、転写因子、トポイソメラーゼなどのＤＮＡ及びタンパク質修飾酵素、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＭＴファミリー（例えば、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、タンパク質リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）、デアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、ＵＧ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ＰＲＭＴ１、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、ユークロマチンヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ）、ヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、及びＧ９ａ）、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８）、ＤＮＡ脱メチル化に役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリー酵素は、５－メチルシトシンから５－ヒドロキシメチルシトシンへの酸化及びより高度な酸化誘導体を触媒する）、ＫＤＭ１Ａ及びリシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）などのタンパク質デメチラーゼ、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＦＯＧ１）、ＤＨＸ９などのヘリカーゼ、デアセチラーゼ（例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、若しくは７）、キナーゼ、ホスファターゼ、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーン、及びプロフラビンなどのＤＮＡインターカレート剤、フェニルアラニンアルギニルβ－ナフチルアミド若しくはキノリン誘導体のようなペプチド模倣薬などの排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤及び阻害剤、プロテアソーム阻害剤、リソソーム蓄積症に関与するものなどの酵素の競合阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、それらの１つ以上の融合物（例えば、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ、ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ、ｄＣａｓ９－ＵＧ１）、並びにＫＲＡＢドメインなどのタンパク質由来の特異的ドメインが挙げられる。
一部の実施形態では、候補ドメインは、当業者に周知の方法によってリプレッサードメインとしての使用に適していると決定することができる。例えば、候補リプレッサードメインが、細胞の核内に存在し、適切に局在化されている（例えば、標的遺伝子に、又は、例えば、ＤＮＡターゲティング部分を介して前記標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメントに）とき、候補リプレッサードメインが、細胞内の標的遺伝子の発現を低減するか、例えば、標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ転写産物のレベルを低減する（例えば、ＲＮＡＳｅｑ若しくはノーザンブロットによって測定して）か、又は標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを低下させる（例えば、ＥＬＩＳＡによって測定して）か否かをアッセイすることにより試験することができる。
一部の実施形態では、発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含み、この場合、複数の発現リプレッサーの各メンバーは、リプレッサードメインを含み、ここで、各リプレッサードメインは、別のリプレッサードメインに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、第２リプレッサードメインに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、発現抑制系は、第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと、第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含み、ここで、第１リプレッサードメインは、別の第１リプレッサードメインに検出可能に結合せず、例えば、結合せず、第２リプレッサードメインは、別の２番目のリプレッサードメインに検出可能に結合せず、例えば、結合しない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるリプレッサードメインは、単量体、例えば非二量体の状態で機能性である。
一部の実施形態では、リプレッサードメインは、エピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含み、例えば、クロマチンの二次元構造を調節する（即ち、クロマチンの構造を、その二次元提示を改変するように調節する）。
本開示の方法及び組成物において有用なエピジェネティック修飾部分は、エピジェネティックマーカー、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンＳＵＭＯ化、ヒストンリン酸化、及びＲＮＡ関連サイレンシングに影響を及ぼす薬剤を含む。本明細書に記載のゲノム配列要素にターゲティングさせることができる例示的なエピジェネティック酵素としては、ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、ＤＮＡ脱メチル化（例えば、ＴＥＴファミリー）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、又は７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ユークロマチンヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ゼステ（ｚｅｓｔｅ）ホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサー、ウイルス性リシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、及びタンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）が挙げられる。このようなエピジェネティック修飾剤の例は、例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．（２０１２）：１－１８に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書において有用な発現リプレッサー（例えば、エピジェネティック修飾部分を含む）は、参照により本明細書に組み込まれるＫｏｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７．５９（２０１５）：１－３に記載の構築物を含むか又はそうした構築物である。例えば、一部の実施形態では、発現リプレッサーは、Ｋｏｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．の表１に見出される構築物、例えば、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化、又は表１に記載のＨ３Ｋ４及び／若しくはＨ３Ｋ９ヒストンデメチラーゼ（例えば、ｄＣａｓ９－ｐ３００、ＴＡＬＥ－ＴＥＴ１、ＺＦ－ＤＮＭＴ３Ａ、若しくはＴＡＬＥ－ＬＳＤ１）を含むか、又はそうした構築物である。
追加部分
発現リプレッサーは、１つ以上の追加部分（例えば、１つ以上のＤＮＡターゲティング部分及び１つ以上のリプレッサードメインに加えて）をさらに含み得る。一部の実施形態では、追加部分は、タグ付け又はモニタリング部分、切断可能な部分（例えば、ＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインの間に位置する切断可能な部分、又はポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に位置する切断可能な部分）、小分子、膜転位ポリペプチド、又は薬剤部分から選択される。
発現リプレッサーは、１つ以上の追加部分（例えば、１つ以上のＤＮＡターゲティング部分及び１つ以上のリプレッサードメインに加えて）をさらに含み得る。一部の実施形態では、追加部分は、タグ付け又はモニタリング部分、切断可能な部分（例えば、ＤＮＡターゲティング部分とリプレッサードメインの間に位置する切断可能な部分、又はポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に位置する切断可能な部分）、小分子、膜転位ポリペプチド、又は薬剤部分から選択される。
例示的な発現リプレッサー
以下の例示的な発現リプレッサーは、あくまで例示を目的として提示されており、限定を意図するものではない。
以下の例示的な発現リプレッサーは、あくまで例示を目的として提示されており、限定を意図するものではない。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＭＱ１、例えば、細菌性ＭＱ１を含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号９１（例えば、発現リプレッサーをコードするプラスミド）、配列番号２２（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ））及び／又は配列番号９２（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２２、９１若しくは９２の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、配列番号４５又は８９の核酸配列によりコードされ、且つ／又はリプレッサードメインは、配列番号４７の核酸配列によりコードされる。
ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＭＲ－２８１２５）ｍＲＮＡ配列：
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＰＬ－２７６９５）プラスミドＤＮＡ配列：
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＭＲ－２８１２６）発現ｍＲＮＡ配列：
ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＭＲ－２８１２５）ｍＲＮＡ配列：
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＰＬ－２７６９５）プラスミドＤＮＡ配列：
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＭＲ－２８１２６）発現ｍＲＮＡ配列：
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号９３、３３、６７、又は６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号９３、３３、６７、若しくは６８のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１タンパク質配列：
ｄＣａｓ９－ＭＱ１アミノ酸配列
ＨＡタグのないＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＭＱ１
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１タンパク質配列：
ｄＣａｓ９－ＭＱ１アミノ酸配列
ＨＡタグのないＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＭＱ１
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号９４（例えば、発現リプレッサーをコードするプラスミド）及び／又は９５（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号９４若しくは９５の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＰＬ－２７６８７）プラスミドＤＮＡ配列：
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２８１２２）発現ｍＲＮＡ配列：
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＰＬ－２７６８７）プラスミドＤＮＡ配列：
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２８１２２）発現ｍＲＮＡ配列：
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号９６又は７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号７２若しくは９６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質配列：
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質配列：
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＤＮＭＴ１、例えば、ＤＮＭＴ１ドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号２３（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号２３の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１（ＭＲ－２９４１９）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１（ＭＲ－２９４１９）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３４又は６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号３４又は６９のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１
ＨＡタグを含まないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１
ＨＡタグを含まないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号２４（例えば、完全ヒト発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ）及び／又は２５（例えば、キメラ発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号２４又は２５の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）（ＭＲ－２９４１４）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）（ＭＲ－２８１９５）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）（ＭＲ－２９４１４）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）（ＭＲ－２８１９５）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３５、３６、７０、又は７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号３５、３６、７０、又は７１のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、Ｇ９Ａ、例えば、Ｇ９Ａドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号２６（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号２６の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９（ＭＲ－２９３８７）
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９（ＭＲ－２９３８７）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３８又は７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号３８又は７３のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９
ＨＡタグのないＧ９Ａ－ｄＣａｓ９
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９
ＨＡタグのないＧ９Ａ－ｄＣａｓ９
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＨＤＡＣ８、例えば、ＨＤＡＣ８ドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号２７（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号２７の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８（ＭＲ－２９４３９）
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８（ＭＲ－２９４３９）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３９又は７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号３９又は７４のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＬＳＤ１、例えば、ＬＳＤ１ドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号２８（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号２８の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１（ＭＲ－２９１２９）
ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１（ＭＲ－２９１２９）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号４０又は７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号４０若しくは７５のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＬＳＤ１
ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１
ＨＡタグのないｄＣａｓ９－ＬＳＤ１
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＥＺＨ２、例えば、ＥＺＨ２ドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号２９（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号２９の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９（ＭＲ－２８９３８）
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９（ＭＲ－２８９３８）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号４１又は７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号４１若しくは７６のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９
ＨＡタグのないＥＺＨ２－ｄＣａｓ９
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９
ＨＡタグのないＥＺＨ２－ｄＣａｓ９
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＥＺＨ２、例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む第１リプレッサードメインと、ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む第２リプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３０（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号３０の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２９４４８）
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２９４４８）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号４２又は７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号４２若しくは７７のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
ＨＡタグのないＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
ＨＡタグのないＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、Ｇ９Ａ、例えば、Ｇ９Ａドメインを含む第１リプレッサードメインと、ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む第２リプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３１（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号３１の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２９４４２）
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２９４４２）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号４３又は７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号４２若しくは７７のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
ＨＡタグのないＧ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
ＨＡタグのないＧ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＦＯＧ１、例えば、ＦＯＧ１ドメインを含む第１リプレッサードメインと、ＦＯＧ１、例えば、ＦＯＧ１ドメインを含む第２リプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号３２（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号３２の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１（ＭＲ－２９４３４）
ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１（ＭＲ－２９４３４）
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号４４又は７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号４４若しくは７９のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１
ＨＡタグのないＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１
ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１
ＨＡタグのないＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含むＤＮＡターゲティング部分と、ＤＮＭＴ、例えば、ＤＮＭＴ３ｂドメインを含むリプレッサードメインとを含む。一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号１５（例えば、発現リプレッサーをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、配列番号１５の核酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ｂ
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ｂ
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、配列番号１６又は３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサーは、配列番号１６若しくは３７のアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、又はそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の差がある配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ｂ
ＨＡタグを含まないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ｂ
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ｂ
ＨＡタグを含まないｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ｂ
機能的特徴
本開示の発現抑制系を使用して、細胞での標的遺伝子の発現を低減することができる。一部の実施形態では、発現の低減は、標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのレベルを低下させることを含む。一部の実施形態では、発現の低減は、標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを低下させることを含む。一部の実施形態では、発現の低減は、標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの両方を低下させることを含む。一部の実施形態では、発現抑制系と接触させるか、又はそれを含む細胞における標的遺伝子の発現は、発現抑制系と接触さていないか、又はそれを含まない細胞における標的遺伝子の発現レベルに比して少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×である。標的遺伝子の発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及び実施例２～４の方法を含め、当業者には周知の方法によりアッセイすることができる。
本開示の発現抑制系を使用して、細胞での標的遺伝子の発現を低減することができる。一部の実施形態では、発現の低減は、標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのレベルを低下させることを含む。一部の実施形態では、発現の低減は、標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを低下させることを含む。一部の実施形態では、発現の低減は、標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの両方を低下させることを含む。一部の実施形態では、発現抑制系と接触させるか、又はそれを含む細胞における標的遺伝子の発現は、発現抑制系と接触さていないか、又はそれを含まない細胞における標的遺伝子の発現レベルに比して少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×である。標的遺伝子の発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及び実施例２～４の方法を含め、当業者には周知の方法によりアッセイすることができる。
本開示の発現抑制系は、細胞における標的遺伝子の発現を一定期間低減するために使用することができる。一部の実施形態では、発現抑制系と接触させるか、又はそれを含む細胞における標的遺伝子の発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年（例えば、無期限）にわたって、認め得るほどに低減される。任意選択で、発現抑制系と接触させるか、又はそれを含む細胞における標的遺伝子の発現は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１年以下にわたって、認め得るほどに低減する。
一部の実施形態では、発現リプレッサー若しくは系と接触させるか、又はそれを含む細胞における標的の発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０細胞分裂にわたって、認め得るほどに低減する。本開示の発現リプレッサー又は系を使用して、標的領域中のＣｐＧヌクレオチドをメチル化することができる。一部の実施形態では、メチル化は、本明細書に開示される発現リプレッサー又は発現抑制系による治療後、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、若しくは少なくとも２２日間持続する。
発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含んでもよく、ここで、発現リプレッサーは各々、別の発現リプレッサーのリプレッサードメインとは異なる機能性を備えるリプレッサードメインを含む。例えば、発現抑制系は、２つの発現リプレッサーを含んでもよく、ここで、第１発現リプレッサーは、ヒストンデアセチラーゼ機能性を含む第１リプレッサードメインを含み、第２発現リプレッサーは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ機能性を含む第２リプレッサードメインを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子の発現の阻害に関してその機能性が互いに相補的であるリプレッサードメインの組合せを有する発現リプレッサーを含み、例えば、機能性が一緒になって発現の阻害を可能にし、任意選択で、個々に存在する場合には発現を阻害しないか、又は阻害するとしても無視できる程度である。一部の実施形態では、発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含み、ここで、各発現リプレッサーは、互いの発現リプレッサーのリプレッサードメインを補完するリプレッサードメインを含み、例えば、各リプレッサードメインは、標的遺伝子の発現を低減する。
一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子の発現の阻害に関してその機能性が互いに相乗作用するリプレッサードメインの組合せを有する発現リプレッサーを含む。理論に縛られることは望まないが、複数の抑制性エピジェネティックマーカー（例えば、複数の異なるタイプのエピジェネティックマーカー及び／又は所与のタイプのより広範なマーキング）は、各々が一緒になって、個別の修飾単独よりも効率的に発現を抑制する（例えば、より大きな発現の低減及び／又はより長い発現の低減をもたらす）ことから、ゲノム遺伝子座に対するエピジェネティックな修飾は累積的であると考えられる。一部の実施形態では、発現抑制系は、複数の発現リプレッサーを含み、ここで、各発現リプレッサーは、他の発現リプレッサーのリプレッサードメインと互いに相乗作用するリプレッサードメインを含み、例えば、各リプレッサードメインは、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、発現抑制系（互いに相乗作用する複数の異なるリプレッサードメインを含む複数の発現リプレッサーを含む）は、個々の発現リプレッサー、例えば、その単一のリプレッサードメインよりも標的遺伝子の発現を阻害するのに有効である。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子の発現を阻害するのに、個別の発現リプレッサーと比して少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×有効である。エピジェネティックマーカーのレベルは、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、縮小表現バイサルファイトシーケンシング、バイサルファイトアンプリコンシーケンシング、メチル化アレイ、パイロシーケンシング、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、又はＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを含め、当業者に周知の方法によってアッセイすることができる。
リプレッサーの組合せ
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含み、この場合、第１リプレッサードメインと第２リプレッサードメインは互いに異なる。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第１エピジェネティック修飾部分（例えば、第１エピジェネティックマーカーを増加若しくは減少させる）若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、第２エピジェネティック修飾部分（例えば、第２エピジェネティックマーカーを増加若しくは減少させる）若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１リプレッサードメインを含む第１発現リプレッサーと第２リプレッサードメインを含む第２発現リプレッサーとを含み、この場合、第１リプレッサードメインと第２リプレッサードメインは互いに異なる。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、第１エピジェネティック修飾部分（例えば、第１エピジェネティックマーカーを増加若しくは減少させる）若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、第２エピジェネティック修飾部分（例えば、第２エピジェネティックマーカーを増加若しくは減少させる）若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ若しくはその機能性断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ（例えば、ＫＲＡＢドメイン）、ＳＥＴドメイン（例えば、ＳＥＴＤＢ１ ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、若しくはＳＵＶ３９Ｈ１のＳＥＴドメイン）、ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１、ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、若しくはＫＡＰ１、又はそれらのいずれかの機能性断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ（例えば、ＫＲＡＢドメイン）、ＳＥＴドメイン（例えば、ＳＥＴＤＢ１ ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、若しくはＳＵＶ３９Ｈ１のＳＥＴドメイン）、ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１、ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体、若しくは細菌性ＭＱ１、又はそのいずれかの機能性断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含むか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片であるか又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ又はその機能性変異体若しくは断片であるか又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ｂ又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ｌ又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＳＥＴドメイン又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＬＳＤ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＦＯＧ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、第１リプレッサードメインは、ＫＡＰ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含み、第２リプレッサードメインは、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１発現リプレッサー（第１発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｇ９ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、及びＦｏｇ１－ｄＣａｓ９－Ｆｏｇ１から選択される発現リプレッサーである）と、第２発現リプレッサー（第２発現リプレッサーは、ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｇ９ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、及びＦｏｇ１－ｄＣａｓ９－Ｆｏｇ１から選択される発現リプレッサーである）と、を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、第１発現リプレッサーをコードする第１核酸（発現は、第１プロモータ又はＩＲＥＳによって駆動される）と、第２発現リプレッサーをコードする第２核酸（発現は、第２プロモータ又はＩＲＥＳによって駆動される）によってコードされる。
標的部位
本明細書に開示される発現抑制系は、細胞内、例えば、対象又は患者における標的遺伝子の発現を調節、例えば低減するのに有用である。標的遺伝子は、当業者に公知の任意の遺伝子であり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、マウス、ネコ、又はイヌにおける疾患又は状態に関連する。標的遺伝子は、コード配列、例えば、エキソン、及び／又は非コード配列、例えば、イントロン、３’ＵＴＲ、又は５’ＵＴＲを含み得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、転写制御エレメントに作動可能に連結される。
本明細書に開示される発現抑制系は、細胞内、例えば、対象又は患者における標的遺伝子の発現を調節、例えば低減するのに有用である。標的遺伝子は、当業者に公知の任意の遺伝子であり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、マウス、ネコ、又はイヌにおける疾患又は状態に関連する。標的遺伝子は、コード配列、例えば、エキソン、及び／又は非コード配列、例えば、イントロン、３’ＵＴＲ、又は５’ＵＴＲを含み得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、転写制御エレメントに作動可能に連結される。
本明細書に記載の発現抑制系の発現リプレッサーにおける使用に適したＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子内の任意の部位、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント、又はアンカー配列（例えば、標的遺伝子に近接してるか、若しくは標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーション（例えば、アンカー配列媒介コンジュゲーションは、コンジュゲーションの崩壊が標的遺伝子の発現を変化させる場合、標的遺伝子に作動可能に連結されている））に関連するアンカー配列に結合し得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子のエキソン内の部位に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子のイントロン内の部位に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子のエキソンとイントロンの境界にある部位、例えば、スプライス部位に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子の５’ＵＴＲ内の部位に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子の３’ＵＴＲ内の部位に結合する。標的遺伝子として、限定はされないが、β－２－ミクログロブリンをコードする遺伝子、ＭＹＣをコードする遺伝子、ＨＳＰＡ１Ｂをコードする遺伝子、ＧＡＴＡ１をコードする遺伝子、ＡＰＯＢをコードする遺伝子、ＦＯＸＰ３をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ３をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ４をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ５をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ６をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ７をコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ８をコードする遺伝子が挙げられる。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント、例えば、プロモータ又はエンハンサーに結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子と作動可能に連結したプロモータの一部又はプロモータ内の部位に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子の転写開始部位に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子と作動可能に連結したエンハンサーの１部分又はエンハンサー内の１部位に結合する。プロモータは、典型的には、関連遺伝子の転写を開始する配列要素である。プロモータは、典型的に、遺伝子の５’末端付近にあり、その転写開始部位からそれほど遠くない。当業者には認識されるように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを転写開始部位に向ける転写開始前複合体は、多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼが離脱し、一次転写産物の伸長が開始された後であってもコアプロモータ配列に結合したままであることから、真核細胞におけるタンパク質コード遺伝子の転写は、典型的には、一般的転写因子（例えば、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＨなど）及びメディエータとコアプロモータ配列との結合によって開始される。一部の実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡ、Ｉｎｒ、ＤＰＥ、又はＢＲＥなどの配列要素を含むが、当業者は、そのような配列がプロモータを定義するために必ずしも必要ではないことを十分に認識している。当業者は、遺伝子に関連する様々な陽性（例えば、エンハンサー）又は陰性（例えば、リプレッサー若しくはサイレンサー）転写制御エレメントに精通している。一部の実施形態では、転写制御エレメントは、転写因子結合部位である。典型的には、同族の調節タンパク質がそのような転写制御エレメントに結合すると、関連遺伝子からの転写が変化する（例えば、増大又は低減する）。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、アンカー配列、例えば、標的遺伝子に近接するアンカー配列、又は標的遺伝子に作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーション（例えば、アンカー配列媒介コンジュゲーションは、コンジュゲーションの崩壊が標的遺伝子の発現を変化させる場合、標的遺伝子に作動可能に連結されている）に関連するアンカー配列に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、複数の標的遺伝子、例えば、ヒトＣＸＣＬ１－８を含むアンカー配列媒介コンジュゲーション（ＡＳＭＣ）のアンカー配列に結合するか、又はそれに近接している。一般に、アンカー配列は、ゲノム複合体成分が特異的に結合するゲノム配列要素である。一部の実施形態では、ゲノム複合体成分とアンカー配列との結合は、複合体形成、例えば、アンカー配列媒介コンジュゲーション形成の核となる。各アンカー配列媒介コンジュゲーションは、１つ以上、例えば、複数のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介連結を崩壊させて、標的遺伝子の発現を変化させる、例えば、阻害することができる。そのような崩壊は、例えば、ＤＮＡのトポロジー構造を変化させることによって、例えば、標的遺伝子が、転写制御エレメント（例えば、増強及びサイレンシング／抑制配列）と相互作用する能力を調節することによって、遺伝子発現を調節することができる。
本明細書に記載の発現抑制系の発現リプレッサーにおける使用に適したＤＮＡターゲティング部分は、標的遺伝子に近接する部位（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、又はスプライス部位）、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに近接しているか、又はアンカー配列、例えば、標的遺伝子に近接しているか、若しくは標的遺伝子に作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーション（例えば、アンカー配列媒介コンジュゲーションは、コンジュゲーションの崩壊が標的遺伝子の発現を変化させる場合、標的遺伝子に作動可能に連結されている）に関連するアンカー配列に結合し得る。本明細書で用いられるとき、近接（した）とは、第１部位での発現リプレッサーの結合及び／又は発現リプレッサーによる第１部位の修飾が、他方の部位の結合及び／又は修飾と同じか、若しくは実質的に同じ作用を生じるような、２つの部位、例えば、核酸部位の接近性を指す。例えば、ＤＮＡターゲティング部分は、エンハンサー（第２部位）と近接した第１部位に結合することができ、前記ＤＮＡターゲティング部分と結合したリプレッサー部分は、あたかも第２部位（エンハンサー配列）が結合及び／又は修飾されたのと実質的に同様に、標的遺伝子の発現に対するエンハンサーの作用が修飾されるように、第１部位をエピジェネティック的に修飾することができる。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）に近接する、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御配列に近接する、又はアンカー配列に近接する部位は、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、転写制御エレメント、又はアンカー配列から５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、若しくは２５塩基対未満（及び任意選択的に、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、転写制御エレメント、又はアンカー配列から少なくとも２０、２５、５０、１００、２００、若しくは３００塩基対）にある。
本明細書に記載の発現抑制系の発現リプレッサーでの使用に適したＤＮＡターゲティング部分は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０ヌクレオチド又は塩基対（並びに任意選択で多くとも５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、若しくは１０ヌクレオチド又は塩基対）を含む部位に結合することができ、例えば、それに特異的に結合し得る。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０ヌクレオチド又は塩基対を含む部位に結合する。
本開示の発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み得る。一部の実施形態では、発現抑制系の発現リプレッサーは各々、異なるＤＮＡターゲティング部分を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサー（例えば、プロモータ又はエンハンサー）とを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、例えば、標的遺伝子と作動可能に連結したプロモータにおいて、第１部位に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、例えば、標的遺伝子と作動可能に連結したプロモータにおいて、第２部位に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。第１部位及び第２部位は、異なり、且つ重複しない部位であってもよく、例えば、第１部位及び第２部位は、いかなる配列も共通に共有しない。第１部位及び第２部位は異なるが、重複する部位、例えば、第１部位と第２部位は異なる配列を含むが、いくつかの配列を共有している。
一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、配列番号１～２１から選択される配列、又はそれに対して１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の改変を有する配列に結合する。
ＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡ（配列番号６）
ＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣ（配列番号７）
ＣＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号８）
ＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧ（配列番号９）
ＡＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣ（配列番号１０）
ＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡ（配列番号６）
ＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣ（配列番号７）
ＣＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号８）
ＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧ（配列番号９）
ＡＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣ（配列番号１０）
一部の実施形態では、第１ＤＮＡターゲティング部分は、配列番号１～２１のいずれか１つを含む配列に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分は、配列番号１～２１のいずれか１つを含む配列に結合し、ここで、第１及び第２ＤＮＡターゲティング部分は、同じ配列に結合する。一部の実施形態では、第１ＤＮＡターゲティング部分は、配列番号１～２１のいずれか１つを含む配列に結合し、第２ＤＮＡターゲティング部分は、配列番号１～２１のいずれか１つを含む配列に結合し、ここで、第１及び第２ターゲティング部分は、異なる配列に結合する。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、本明細書に記載の配列、例えば、配列番号１～２１のいずれか１つを有するゲノム遺伝子座に結合する。多くの場合、結合されるゲノム遺伝子座は、二本鎖ＤＮＡを含み、この遺伝子座は、そのセンス鎖又はそのアンチセンス鎖の配列を付与することによって表現され得ることが理解される。従って、所与のスペーサー配列を有するｇＲＮＡは、発現リプレッサーを特定のゲノム遺伝子座に結合させることができ、ここで、ゲノム遺伝子座の一方の鎖は、スペーサー配列と類似又は同一の配列を有し、ゲノム遺伝子座の他方の鎖は、相補配列を有する。典型的には、ｇＲＮＡとゲノム遺伝子座との結合は、ゲノム遺伝子座の一部の巻き戻し及びｇＲＮＡスペーサーとスペーサーが相補的である鎖との対合を伴うことになる。
一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフ、例えば、ＣＴＣＦ－結合モチーフ：
Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号８１）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）
を含む。
Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号８１）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）
を含む。
ＣＴＣＦ－結合モチーフはまた、逆配向、例えば、
（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号８２）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）
であってもよい。
（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号８２）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）
であってもよい。
一部の実施形態では、アンカー配列は、配列番号８１若しくは配列番号８２又は配列番号８１若しくは配列番号８２のいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフ、例えば、ＹＹ１結合モチーフ：ＣＣＧＣＣＡＴＮＴＴ（配列番号８３）を含み、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。
ＹＹ１結合モチーフはまた、反対の配向、例えば、ＡＡＮＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号８４）であってもよく、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。
本明細書に記載の発現抑制系の発現リプレッサーでの使用に適したターゲティング部分は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０ヌクレオチド又は塩基対（並びに任意選択で多くとも５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、若しくは１０ヌクレオチド又は塩基対）を含む部位に結合することができ、例えば、それに特異的に結合し得る。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０ヌクレオチド又は塩基対を含む部位に結合する。
本開示の発現抑制系は、２つ以上の発現リプレッサーを含み得る。一部の実施形態では、発現抑制系の発現リプレッサーは各々、異なるターゲティング部分を含む。
一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを備える。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子、例えば、エキソン、イントロン、又はエキソンイントロン境界（例えば、スプライス部位）に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。一部の実施形態では、発現抑制系は、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第１発現リプレッサーと、標的遺伝子に近接しているか、又は標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列に結合するＤＮＡターゲティング部分を含む第２発現リプレッサーとを含む。
その他の組成物
核酸及びベクター
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系をコードする核酸にも関する。一部の実施形態では、発現抑制系は、発現抑制系をコードする核酸を含む組成物を介して提供されてもよく、例えば、発現抑制系の発現リプレッサーであり、この場合、核酸は、目的の系（例えば、特定の細胞、組織、生物など）において、発現抑制系、例えば、発現抑制系の発現リプレッサーの発現を達成するのに十分な他の配列と結合している。
核酸及びベクター
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系をコードする核酸にも関する。一部の実施形態では、発現抑制系は、発現抑制系をコードする核酸を含む組成物を介して提供されてもよく、例えば、発現抑制系の発現リプレッサーであり、この場合、核酸は、目的の系（例えば、特定の細胞、組織、生物など）において、発現抑制系、例えば、発現抑制系の発現リプレッサーの発現を達成するのに十分な他の配列と結合している。
いくつかの特定の実施形態において、本開示は、発現抑制系をコード、１つ以上の発現リプレッサー、又はそのポリペプチド部分する核酸の組成物を提供する。いくつかのそうした実施形態において、提供される核酸は、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意の他の核酸部分若しくは実体であってもよいし、又はそれを含んでもよく、本明細書に記載されるか、或いは当技術分野で利用可能な任意の技術（例えば、合成、クローニング、増幅、インビトロ又はインビボ転写など）によって調製され得る。一部の実施形態では、発現抑制系、１つ以上の発現リプレッサー、又はそのポリペプチド部分をコードする記載の核酸は、目的の系（例えば、特定の細胞、組織、生物など）における記載の核酸の組込み、複製、及び／又は発現を達成するのに適切且つ／又は十分な１つ以上の複製、組込み、及び／又は発現シグナルに作動可能に結合し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の発現抑制系を送達するための組成物は、発現抑制系の１つ以上の成分、例えば、本明細書に記載の発現抑制系の発現リプレッサーをコードする１つ以上の核酸を含むベクター、例えば、ウイルスベクターであるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系を送達するための組成物は、発現リプレッサー又は発現抑制系の１つ以上の成分、例えば、本明細書に記載の発現抑制系の発現リプレッサーをコードする１つ以上の核酸を含むＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであるか、又はそれを含む。
本明細書に記載のような核酸又は本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸は、ベクター中に組み込まれてもよい。ベクター、例えばレンチウイルスなどのレトロウイルス由来のものは、導入遺伝子の長期の安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期遺伝子導入を達成するために好適なツールである。ベクターの例として、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、種々のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに説明されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、限定はされないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモータ配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１以上の選択可能マーカーを有する。
天然又は合成核酸の発現は、典型的には目的の遺伝子をコードする核酸をプロモータに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、真核生物における複製及び組み込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現にとって有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモータを有する。
追加的なプロモータ領域、例えば増強配列は、転写開始の頻度を調節してもよい。典型的には、これらの配列は転写開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、近年、いくつかのプロモータが同様に転写開始部位の下流に機能的要素を有することが示されている。プロモータ領域間のスペーシングはフレキシブルであることが多いことから、プロモータ機能は、領域が互いに対して反転又は移動されるとき、保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータでは、プロモータ領域間のスペーシングは、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモータに応じて、転写を活性化するため、各領域が協同的又は非依存的に機能し得るように思われる。
好適なプロモータの一例が、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで駆動する能力がある強力な構成的プロモータ配列である。いくつかの実施形態では、好適なプロモータが伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかし、他の構成的プロモータ配列、例えば限定はされないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、並びにヒト遺伝子プロモータ、例えば限定はされないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータも使用されてもよい。
本開示は、任意の特定のプロモータ又はプロモータのカテゴリー（例えば構成的プロモータ）の使用に限定されるように解釈されるべきではない。例えば、いくつかの実施形態では、誘導性プロモータが本開示の一部として検討される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの使用により、それが作動可能に連結される対象のポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が所望されるときに活性化する能力がある分子スイッチが提供される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの使用により、発現を、所望されないときに不活性化する能力がある分子スイッチが提供される。誘導性プロモータの例として、限定はされないが、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げられる。
いくつかの実施形態では、導入されるべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染されることが探求された細胞の集団から細胞を発現する同定及び選択を促進するため、選択可能マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は双方を有し得る。いくつかの態様では、選択可能マーカーは、ＤＮＡの分離片に対して実施され、同時トランスフェクション法において使用されてもよい。宿主細胞内での発現を可能にするため、選択可能マーカーとレポーター遺伝子の双方は、適切な転写調節配列と隣接されてもよい。有用な選択可能マーカーは、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏなどを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、且つ／又は転写調節配列の機能性を評価するため、レポーター遺伝子が使用されてもよい。一般に、レポーター遺伝子は、（レポーター遺伝子の）レシピエント供給源中に存在しないか又はそれによって発現され、且ついくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性又は可視化可能な蛍光により発現が明らかにされるようなポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてからの好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）を含んでもよい。好適な発現系は、周知であり、公知の技術を用いて調製されるか又は商業的に得られてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルでの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物は、プロモータとして同定される。かかるプロモータ領域は、レポーター遺伝子に連結され、薬剤のプロモータ駆動転写を調節する能力について評価するため、使用されてもよい。
細胞
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系を含む細胞に関する。当業者には周知である任意の細胞、例えば、細胞株、例えば、組換えポリペプチドの発現に適した細胞株は、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系を含有するのに好適である。一部の実施形態では、細胞、例えば、細胞株を用いて、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを発現させることができる。一部の実施形態では、細胞、例えば、細胞株を用いて、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸、例えば、ベクターを発現又は増幅させることができる。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸を含む。
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系を含む細胞に関する。当業者には周知である任意の細胞、例えば、細胞株、例えば、組換えポリペプチドの発現に適した細胞株は、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系を含有するのに好適である。一部の実施形態では、細胞、例えば、細胞株を用いて、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを発現させることができる。一部の実施形態では、細胞、例えば、細胞株を用いて、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸、例えば、ベクターを発現又は増幅させることができる。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、細胞は、発現リプレッサー又は発現抑制系の第１成分、例えば、第１発現リプレッサーをコードする第１核酸と、発現抑制系の第２成分、例えば、第２発現リプレッサーをコードする第２核酸を含む。細胞が、２つ以上の発現リプレッサーを含む発現抑制系をコードする核酸を含む一部の実施形態では、各発現リプレッサーをコードする配列は、個別の核酸分子上、例えば、異なるベクター上、例えば、第１発現リプレッサーをコードする第１ベクター及び第２発現リプレッサーをコードする第２ベクター上に配置される。一部の実施形態では、各発現リプレッサーをコードする配列は、同じ核酸分子上、例えば、同じベクター上に配置される。一部の実施形態では、発現抑制系をコードする核酸の一部又は全部が細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。一部の実施形態では、発現抑制系の第１発現リプレッサーをコードする核酸は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、発現抑制系の第２発現リプレッサーをコードする核酸は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない（例えば、ベクター上に位置する）。一部の実施形態では、発現抑制系の第１及び第２発現リプレッサーをコードする核酸は、細胞のゲノムＤＮＡに、例えば、ゲノムＤＮＡ中の同じ（例えば、隣接若しくは共局在した）又は異なる部位に組み込まれる。
本明細書に記載される発現抑制系又は発現リプレッサーを含み得る及び／又は発現し得る細胞の例としては、肝細胞、神経細胞、内皮細胞、筋細胞、及びリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の方法又はプロセスによって作製された細胞に関する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の発現抑制系を用意するステップ、細胞を用意するステップ、及び上記細胞を上記発現抑制系（又は上記発現抑制系をコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む組成物）と接触させることによって生産される細胞を提供する。理論に縛られることは望まないが、本明細書に記載の発現抑制系と接触させた細胞は、発現抑制系と接触させていない類似のものと比較して、以下：標的遺伝子の発現の低減及び／又は標的遺伝子に関連するエピジェネティックマーカー、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント、又は標的遺伝子と近接しているか、若しくは標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列の修飾を呈示し得る。一部の実施形態では、前記標的遺伝子の発現の低減及び／又はエピジェネティックマーカーの修飾を示す細胞は、発現抑制系を含まない。エピジェネティックマーカーの発現低減及び／又は修飾は、発現抑制系との接触後、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続し得る。一部の実施形態では、発現抑制系と事前に接触させた細胞は、発現抑制系が細胞内に存在しなくなった後、標的遺伝子の発現の低減及び／又はエピジェネティックマーカーの修飾を、例えば、発現抑制系が細胞内に存在しなくなった後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４年、又は５年間にわたって（例えば、無期限に）保持する。
発現抑制系及び／又は発現リプレッサーの製造方法
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、タンパク質を含むか、又はタンパク質であり、従って、タンパク質を作製する方法によって産生され得る。一部の実施形態では、発現抑制系、例えば、発現抑制系の発現リプレッサーは、１つ以上のタンパク質を含み、従って、タンパク質を作製する方法によって生産され得る。当業者には理解されるように、タンパク質又はポリペプチド（本明細書に記載の調節剤に含有され得る）を作製する方法は、当技術分野で常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
一部の実施形態では、発現リプレッサーは、タンパク質を含むか、又はタンパク質であり、従って、タンパク質を作製する方法によって産生され得る。一部の実施形態では、発現抑制系、例えば、発現抑制系の発現リプレッサーは、１つ以上のタンパク質を含み、従って、タンパク質を作製する方法によって生産され得る。当業者には理解されるように、タンパク質又はポリペプチド（本明細書に記載の調節剤に含有され得る）を作製する方法は、当技術分野で常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
本開示の組成物のタンパク質又はポリペプチドは、標準的な固相技術を用いて生化学的に合成することができる。こうした方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成方法、フラグメント凝縮、古典的溶液合成が挙げられる。これらの方法は、ペプチドが比較的短い（例えば、１０ｋＤａ）場合、且つ／又はそれを組換え技術により生産することができない（即ち、核酸配列によりコードされない）ため、別の化学を必要とする場合に使用することができる。
固相合成法は、当技術分野で公知であり、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４；及びＣｏｉｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２：３２４７－３２５６，２００７により詳しく記載されている。
より長いペプチドの場合、組換え法を使用することができる。組換え治療用ポリペプチドを作製する方法は、当技術分野において常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
治療薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞における発現を含むが、適切なプロモータの制御下で、昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を用いて組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに終結配列を含み得る。異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを取得するために、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いてもよい。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、以下：Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
多量のタンパク質又はポリペプチドが要望される場合には、以下：Ｂｒｉａｎ Ｂｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：５８７－５９３，２００３；及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３に記載されるような技術を用いて、それを生成することができる。
様々な哺乳動物細胞培養システムを使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現システムの例として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養のプロセスは、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載される組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを含有してもよい。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを封入する脂質ナノ粒子を含み得る。一部の実施形態では、ベクターを封入する脂質ナノ粒子、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含んでもよい。
タンパク質は、１つ又は複数のアミノ酸を含む。アミノ酸は、例えば、１つ又は複数のペプチド結合を介して、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造：Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに共通して存在する２０の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成により調製されたか、又は天然供給源から得られたかにかかわらず、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。一部の実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ－及び／又はアミノ－末端アミノ酸を含め、アミノ酸は、上の一般的な構造と比較して、構造修飾を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造と比較して、（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ若しくは複数のプロトン、及び／又はヒドロキシル基の）メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び／又は置換により修飾されていてもよい。一部の実施形態では、こうした修飾は、例えば、そうでなければ同じ非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変更し得る。一部の実施形態では、こうした修飾は、そうでなければ同じ非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連活性を有意に変更しない。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、用語「アミノ酸」は、遊離アミノ酸を示すために使用される場合もあり；一部の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸残基を示すために使用される場合もある。
タンパク質治療薬の精製は、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。タンパク質治療薬の製剤は、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
医薬組成物、製剤、送達、及び投与
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを含む医薬組成物、本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸を含む医薬組成物、並びに／又は本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを細胞、組織、器官、及び／若しくは対象に送達する組成物に関する。
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを含む医薬組成物、本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸を含む医薬組成物、並びに／又は本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを細胞、組織、器官、及び／若しくは対象に送達する組成物に関する。
本明細書で用いられるとき、用語「医薬組成物」は、１つ又は複数の薬学的に許容できる担体（例えば、業者に公知の薬学的に許容できる担体）と一緒に製剤化された活性薬剤（例えば、発現リプレッサー又は発現受容体の核酸、例えば、発現抑制系、例えば、発現抑制系の発現リプレッサー、又はそれをコードする核酸）を指す。一部の実施形態では、活性薬剤は、関連集団に投与されると、予定された治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。一部の実施形態では、本開示の発現リプレッサーを含む医薬組成物は、発現リプレッサー又はそれをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の発現抑制系を含む医薬組成物は、発現抑制系の発現リプレッサー又はそれをコードする核酸の各々を含む（例えば、発現抑制系が、第１発現リプレッサーと第２発現リプレッサーを含む場合、医薬組成物は第１及び第２発現リプレッサーを含む）。一部の実施形態では、医薬組成物は、複数の発現リプレッサーを含む発現抑制系の全ての発現リプレッサーよりも少ない発現リプレッサーを含む。例えば、発現抑制系は、第１発現リプレッサー及び第２発現リプレッサーを含むことができ、第１医薬組成物は、第１発現リプレッサー又はそれをコードする核酸を含み得ると共に、第２医薬組成物は、第２発現リプレッサー又はそれをコードする核酸を含み得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化することができ、以下：経口投与、例えば、飲薬（水性若しくは非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内若しくは硬膜外注射（例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液として）、又は持続放出製剤；例えば、クリーム、軟膏、又は皮膚、肺、若しくは口腔に適用される制御放出パッチ若しくはスプレーとしての局所適用；例えば、ペッサリー、クリーム、若しくはフォームとしての膣内若しくは直腸内；舌下；眼内；経皮；或いは鼻、肺、及び／又は他の粘膜表面のために設計されたものが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容できる」は、信頼できる医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の障害若しくは合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織と接触した使用に適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる担体」とは、主題の組成物を１つの器官、若しくは身体の部分から、別の器官、若しくは身体の部分に運搬又は輸送するのに関与する液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、若しくは溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、且つ患者に対して有害ではないという意味で「許容できる」ものでなければならない。
一部の実施形態では、例えば、薬学的に許容できる担体として役立ち得る物質として、以下：ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ無水物；並びに医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる塩」は、医薬関連での使用に適した化合物の塩、即ち、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを起こすことなく、ヒト及び下等動物の組織と接触した使用に適しており、且つ妥当なベネフィット／リスク比に見合う塩を指す。薬学的に許容できる塩は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９（１９７７）に薬学的に許容できる塩を記載している。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、限定されないが、非毒性酸付加塩が挙げられ、これは、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸、又は酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸若しくはマロン酸などの有機酸と共に形成されるか、或いはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を用いることにより形成されるアミノ基の塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、限定されないが、以下：アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、適切であれば、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、並びにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、１～６個の炭素原子を有するアルキル、スルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成されるアミンカチオンが挙げられる。
様々な実施形態では、本開示は、薬学的に許容できる賦形剤と共に、本明細書に記載の医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤は、一般に安全、非毒性で、望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を含み、且つヒト医薬品用途と同様に動物用途にも許容できる賦形剤を含む。こうした賦形剤は、固体、液体、半固体であってもよいし、又はエアロゾル組成物の場合には、気体であってもよい。
医薬調製物は、錠剤の場合、粉砕、混合、顆粒化、及び必要に応じて圧縮；硬質ゼラチンカプセル剤形の場合、粉砕、混合及び充填を含む従来の製剤技術に従って製造することができる。液体担体を用いる場合、調製物は、シロップ、エレキシル、エマルジョン又は水性若しくは非水性溶液又は懸濁液の形態であってよい。こうした液体製剤は、直接経口投与され得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、任意の投与経路を介して、細胞及び／又は対象に送達するために、製剤化され得る。対象への投与方法としては、注射、注入、吸入、鼻内、眼内、局所送達、カニューレ内送達、又は摂取を挙げることができる。注射としては、限定しないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、血管内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、並びに胸骨内注射及び注入が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、例えば、噴霧法を用いたエアロゾル吸入を含む。一部の実施形態では、投与は、全身（例えば、経口、直腸、鼻内、舌下、口腔、若しくは非経口）、経腸（例えば、全身作用だが、消化管を介して送達される）、又は局所（例えば、皮膚への局所適用、硝子体内注射）である。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物は、全身投与される。一部の実施形態では、投与は注射ではなく、且つ、治療薬は非経口治療薬である。一部の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支内点滴による）、口腔、皮膚（例えば、真皮、皮内、皮内、経皮などに対する局所の１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻内、経口、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内点滴により）、膣内、硝子体などであってよい。一部の実施形態では、投与は、単回用量であり得る。一部の実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間間隔をあけた複数回用量）及び／又は定期的（例えば、共通の時間間隔を開けた個別の用量）な投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたり連続した投薬（例えば、灌流）を含み得る。
本開示に従う医薬組成物は、治療有効量で投与され得る。正確な治療有効量は、所与の対象の治療の効力に関して最も有効な結果をもたらすと考えられる組成物の量である。この量は、様々な要因に応じて変動するが、そうした要因として、限定されないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、及び生体利用可能性など）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、健康状態全般、所与の用量に対する応答性、並びに薬剤の種類など）、製剤中の薬学的に許容できる１つ若しくは複数の担体、及び／又は投与経路が挙げられる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、治療薬の送達方法を提供し、ここで、ゲノム複合体調節剤が治療薬であり、且つ／又は治療薬の送達は、治療薬の非存在下での遺伝子発現に比して、遺伝子発現の変化を引き起こす。
本明細書の様々な実施形態で提供される方法を、本明細書に描写されるいくつかの態様のいずれに使用してもよい。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物を特定の細胞、又は１つ若しくは複数の特定の組織に対してターゲティングさせる。
例えば、一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物を、上皮、結合、筋肉、及び／又は神経組織若しくは細胞に対してターゲティングさせる。一部の実施形態では、組成物を、特定の器官系、例えば、心血管系（心臓、血管）；消化系（食道、胃、肝臓、膀胱、膵臓、腸、結腸、直腸及び肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体若しくは松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排出系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、毛髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）；及び／又はそれらの組合せの細胞又は組織にターゲティングさせる。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、血液脳関門、胎盤膜、又は血液精巣関門を通過する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、全身投与される。
一部の実施形態では、投与は注射によるものではなく、且つ治療薬は非経口治療薬である。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、活性薬剤単独と比較して、ＰＫ／ＰＤの改善、例えば、増加した薬物動態又は薬物力学、例えば、ターゲティング、吸収、若しくは輸送の改善（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上の改善）を有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、活性薬剤単独と比較して、低減した望ましくない作用、例えば、低減した非標的位置への拡散、オフターゲット活性、又は毒性代謝産物（例えば、治療薬単独と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上の低減）を有する。一部の実施形態では、組成物は、活性薬剤単独と比較して、治療薬の効力を増大し、且つ／又は治療薬の毒性を低減する（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、製剤用担体及び／又はポリマー担体、例えば、リポソーム若しくは小胞体などの担体を含め、製剤化して、公知の方法により、それを必要とする対象（例えば、ヒト又はヒト以外の農場若しくは家畜動物、例えば、畜牛、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達される。こうした方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオンポリマー、リン酸カルシウム）；エレクトロポレーション又は他の膜破壊（例えば、ヌクレオフェクション）及びウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）が挙げられる。さらに送達方法は、例えば、以下：Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５，２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．にも記載されている。タンパク質のカチオン脂質媒介送達は、インビトロ及びインビボで効率的なタンパク質ベースのゲノム編集を可能にする。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０。
リポソームは、内部水性区画を囲む単層又は多重層の脂質二重層並びに比較的不透過性の外部親油性リン脂質二重層から構成された球状小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってもよい。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬剤分子の双方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素により分解から保護し、それらの負荷を生物学的膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を通じて輸送し得る（例えば、レビューとして、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作成され得るが、薬物担体としてのリポソームを作成するため、リン脂質が最も一般的に使用される。小胞は、限定はされないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢを単独で含むか、又はコレステロールと一緒に含み、ＤＯＴＭＡ及びコレステロール、ＤＯＴＡＰ及びコレステロール、ＤＯＴＩＭ及びコレステロール、並びにＤＤＡＢ及びコレステロールを生成してもよい。多重膜小胞脂質を調製するための方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重膜小胞脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される）。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成は自発的であり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出成形装置に使用により振盪の形態で力を加えることにより促進され得る（例えば、レビューとして、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押し出された脂質は、サイズを低減するフィルターを介して押し出すことにより調製可能であり、それはＴｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載の通りである（押し出された脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される）。
本明細書に記載される方法及び組成物は、疾患、障害及び／又は病状の症状を緩和するのに十分なレジメンにより投与される医薬組成物を含み得る。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を投与することにより、治療薬を送達する方法を提供する。
使用
本開示は、さらに、本明細書に開示される発現抑制系の使用にも関する。中でも、一部の実施形態では、提供されるこうした技術は、標的遺伝子発現の調節、例えば、抑制を達成し、例えば、細胞において、例えば、標的遺伝子活性、送達、及び透過の制御を可能にする。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞である。例えば、一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の体細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、初代細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、非胚性細胞である。
本開示は、さらに、本明細書に開示される発現抑制系の使用にも関する。中でも、一部の実施形態では、提供されるこうした技術は、標的遺伝子発現の調節、例えば、抑制を達成し、例えば、細胞において、例えば、標的遺伝子活性、送達、及び透過の制御を可能にする。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞である。例えば、一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の体細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、初代細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、非胚性細胞である。
投与量
投与される薬剤又は組成物の投与量は、例えば、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズ及び体重を含む対象の個別のパラメータ、治療期間、実施される治療のタイプ（もしあれば）、具体的な投与経路及び類似の要因に基づいて変動し得る。従って、本明細書に記載の薬剤の投与用量は、このような様々なパラメータに依存し得る。投与された組成物の投与量はまた、対象の性別、全身の医学的症状、及び治療しようとする障害の重症度などの他の要因に応じて変動し得る。状況に応じて、所定投与量の本明細書に開示される発現リプレッサー若しくは発現抑制系又は発現リプレッサーの組合せを対象に提供することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、状況に応じて、所定投与量の本明細書に開示される発現リプレッサー、若しくは発現抑制系又は発現リプレッサーの組合せを対象に提供する。
投与される薬剤又は組成物の投与量は、例えば、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズ及び体重を含む対象の個別のパラメータ、治療期間、実施される治療のタイプ（もしあれば）、具体的な投与経路及び類似の要因に基づいて変動し得る。従って、本明細書に記載の薬剤の投与用量は、このような様々なパラメータに依存し得る。投与された組成物の投与量はまた、対象の性別、全身の医学的症状、及び治療しようとする障害の重症度などの他の要因に応じて変動し得る。状況に応じて、所定投与量の本明細書に開示される発現リプレッサー若しくは発現抑制系又は発現リプレッサーの組合せを対象に提供することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、状況に応じて、所定投与量の本明細書に開示される発現リプレッサー、若しくは発現抑制系又は発現リプレッサーの組合せを対象に提供する。
本開示による医薬組成物は、治療有効量で送達され得る。正確な治療有効量は、所与の対象における治療の有効性に関して最も効果的な結果をもたらし得る組成物の量である。この量は、限定はされないが、以下：治療用化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティなど）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及び病期、全身の健康状態、所与の投与量に対する応答性、及び薬物療法の種類など）、薬学的に許容できる担体若しくは製剤中の担体の性質、及び／又は投与経路を含む様々な要因に応じて変動し得る。
脂質ナノ粒子
本明細書に記載される発現リプレッサー又は発現抑制系は、粒子を含む任意の生物学的送達システム／製剤、例えば、ナノ粒子送達システムを用いて送達することができる。ナノ粒子は、約１～約１０００ナノメートル、約１～約５００ナノメートルのサイズ、約１～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約７５ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、及びそれらの間の任意の範囲の寸法（例えば、粒径）を有する粒子を含む。ナノ粒子は、ナノスケールの寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的には球形であるが、ナノ粒子組成に応じて異なる形態が可能である。ナノ粒子の外部の環境に接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面として識別される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。本明細書に記載されるナノ粒子は、限定はされないが、固体、半固体、エマルジョン、又はコロイドナノ粒子を含む任意の形態で提供され得る送達システムを含む。ナノ粒子送達システムは、脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小小胞体、エキソソーム、又は遺伝子銃を含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。
本明細書に記載される発現リプレッサー又は発現抑制系は、粒子を含む任意の生物学的送達システム／製剤、例えば、ナノ粒子送達システムを用いて送達することができる。ナノ粒子は、約１～約１０００ナノメートル、約１～約５００ナノメートルのサイズ、約１～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約７５ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、及びそれらの間の任意の範囲の寸法（例えば、粒径）を有する粒子を含む。ナノ粒子は、ナノスケールの寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的には球形であるが、ナノ粒子組成に応じて異なる形態が可能である。ナノ粒子の外部の環境に接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面として識別される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。本明細書に記載されるナノ粒子は、限定はされないが、固体、半固体、エマルジョン、又はコロイドナノ粒子を含む任意の形態で提供され得る送達システムを含む。ナノ粒子送達システムは、脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小小胞体、エキソソーム、又は遺伝子銃を含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、複数の成分、例えば、３～４個の成分を含み得る。一実施形態において、発現リプレッサー又は前記発現リプレッサーを含む医薬組成物（又はそれをコードする核酸、又は前記発現リプレッサー核酸を含む医薬組成物）は、ＬＮＰに封入される。一実施形態において、発現抑制系又は前記発現抑制系を含む医薬組成物（又はそれをコードする核酸、若しくは前記発現抑制系核酸を含む医薬組成物）は、ＬＮＰに封入される。一部の実施形態では、第１発現リプレッサーをコードする核酸及び第２発現リプレッサーをコードする核酸は、同じＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、第１発現リプレッサーをコードする核酸と第２発現リプレッサーをコードする核酸は、異なるＬＮＰ中に存在する。ＬＮＰの調製及び調節剤封入は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１）から使用してもよいし、且つ／又は改変してもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示される脂質ナノ粒子組成物は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現に有用である。一部の実施形態では、核酸は、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＣＣＤ脂質、中性脂質、及び／又はヘルパー脂質を含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、イオン化脂質を含む。一部の実施形態では、イオン化脂質は、カチオン性脂質、イオン化カチオン性脂質、又は容易にプロトン化することができるアミン含有脂質であってもよい。一部の実施形態では、脂質は、ｐＨに応じて正荷電又は中性形態で存在し得るカチオン性脂質である。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、生理学的条件下で正荷電することができる脂質である。一部の実施形態では、脂質粒子は、以下：中性脂質、イオン化アミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール、及びポリマー共役脂質などのリン脂質のうちの１つ以上と一緒に、製剤中にカチオン性脂質を含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤（例えば、ＭＣ３及び／若しくはＳＳＯＰ）は、コレステロール、ＰＥＧ、並びに／又はヘルパー脂質を含む。ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（単層小胞及び多重層小胞、一部の実施形態では、実質的に球状であるラメラ相脂質二重層などであってもよい。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、水性コア、例えば、本明細書に開示されるような発現リプレッサー又は系をコードする核酸を含むことができる。本開示の一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のカーゴは、少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ、例えば、発現リプレッサー、又は本明細書に開示されるような系をコードする核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。一部の実施形態では、カーゴ、例えば、発現リプレッサー、又は本明細書に開示されるような系をコードする核酸をＬＮＰと結合させてもよい。一部の実施形態では、カーゴ、例えば、発現リプレッサー、又は本明細書に開示されるような系をコードする核酸は、ＬＮＰに封入してもよく、例えば、完全に封入しても、及び／又は部分的に封入してもよい。
一部の実施形態では、カーゴを含むＬＮＰは、全身送達、例えば、生物内での活性剤の広範な曝露を達成し得る治療有効用量のカーゴの送達のために投与することができる。脂質ナノ粒子の全身送達は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、及び腹腔内送達を含む当技術分野で知られる任意の手段によるものであってよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の全身送達は、静脈内送達によるものである。一部の実施形態では、カーゴを含むＬＮＰは、局所送達、例えば、生物内の標的部位への活性剤の直接送達のために投与され得る。
ＬＮＰは、エマルジョン、ミセル中の分散相、又は懸濁液中の内相として製剤化することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰは、生分解性である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、治療有効用量で細胞毒性レベルまで蓄積しないか、又はインビボで毒性を引き起こさない。一部の実施形態では、ＬＮＰは、治療有効用量で反復投与した後、細胞毒性レベルまで蓄積しないか、又はインビボで毒性を引き起こさない。一部の実施形態では、ＬＮＰは、治療有効用量で実質的に有害作用をもたらす自然免疫応答を引き起こさない。
一部の実施形態では、使用されるＬＮＰは、式（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコント－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート又はｓｓＰａｌｍＯ－フェニル－Ｐ４Ｃ２（ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ、ＳＳ－ＯＰ）を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、式、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコント－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、例えば、ＭＣ３ＬＮＰ又はｓｓＰａｌｍＯ－フェニル－Ｐ４Ｃ２（ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ、ＳＳ－ＯＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、例えば、ＳＳＯＰ－ＬＮＰを含む。
リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重層と、比較的不浸透性の外側親油性リン脂質二重層とから構成される球状小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性、又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性の薬物分子の両方を送達し、血漿酵素による分解からカーゴを保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してそのロードを輸送することができる（例えば、検討のためにＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作製することができるが、薬物担体としてのリポソームを生成するためには、リン脂質が最も一般的に使用されている。小胞は、限定はされないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢを単独で又はコレステロールと一緒に含有して、ＤＯＴＭＡとコレステロール、ＤＯＴＡＰとコレステロール、ＤＯＴＩＭとコレステロール、及びＤＤＡＢとコレステロールを生成する。多重層小胞脂質の調製方法は、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい；多重層小胞脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜を水溶液と混合すると、小胞形成は自発的になり得るが、ホモジナイザー、超音波処理装置、又は押出装置を用いて振盪の形態で力を加えることにより促進することもできる（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押し出された脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されているように、サイズ縮小フィルターを通して押し出すことにより調製することができ、押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に提供される方法及び組成物は、疾患、障害、及び／又は状態の症状を緩和するのに十分なレジメンによって投与される医薬組成物を含み得る。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を投与することによって治療薬を送達する方法を提供する。
遺伝子発現の調節
本開示はさらに、一部には、標的遺伝子の発現を調節する方法、例えば、低減する方法に関し、これは、本明細書に記載の発現リプレッサー（又はそれをコードする核酸、又は前記発現リプレッサー核酸を含む医薬組成物）又は発現抑制系（又はそれをコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む医薬組成物）を用意するステップと、標的遺伝子、及び／又は作動可能に連結した転写制御エレメントを上記発現リプレッサー又は発現抑制系と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現の調節、例えば、低減は、参照値、例えば、発現リプレッサー又は発現抑制系の非存在下での標的遺伝子の転写と比較した、標的遺伝子の転写の調節を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、対象、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象由来の細胞に対して、エクスビボで使用される。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象に対して、インビボで使用される。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、本明細書に記載される細胞又は細胞株に対して、インビボで使用される。
本開示はさらに、一部には、標的遺伝子の発現を調節する方法、例えば、低減する方法に関し、これは、本明細書に記載の発現リプレッサー（又はそれをコードする核酸、又は前記発現リプレッサー核酸を含む医薬組成物）又は発現抑制系（又はそれをコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む医薬組成物）を用意するステップと、標的遺伝子、及び／又は作動可能に連結した転写制御エレメントを上記発現リプレッサー又は発現抑制系と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現の調節、例えば、低減は、参照値、例えば、発現リプレッサー又は発現抑制系の非存在下での標的遺伝子の転写と比較した、標的遺伝子の転写の調節を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、対象、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象由来の細胞に対して、エクスビボで使用される。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象に対して、インビボで使用される。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、本明細書に記載される細胞又は細胞株に対して、インビボで使用される。
本開示はさらに、一部には、対象における標的遺伝子の過剰発現に関連する状態を治療する方法にも関し、これは、本明細書に記載の発現抑制系（又はそれをコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含む。特定の遺伝子の過剰発現に関連する状態は、当業者に公知である。このような状態として、限定はされないが、代謝障害、神経筋障害、癌（例えば、固形腫瘍）、線維症、糖尿病、尿素障害、免疫障害、炎症、及び関節炎が挙げられる。
本開示はさらに、一部には、対象における標的遺伝子の発現の誤調節に関連する病状を治療する方法にも関し、これは、本明細書に記載の発現抑制系（又はそれをコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含む。理論に束縛されることは望まないが、発現抑制系を用いて、標的遺伝子の発現を調節する遺伝子をターゲティング（例えば、その発現を低減）し、このようにして調節遺伝子の発現を変更することにより、標的遺伝子の発現を変更すると考えられる。特定の遺伝子の発現の誤調節に関連する病状は、当業者には周知である。こうした病状として、限定されないが、代謝障害、神経筋障害、癌（例えば、固形腫瘍）、繊維症、糖尿病、尿素障害、免疫障害、炎症、及び関節炎が挙げられる。
本明細書に提供される方法及び組成物は、標的遺伝子の転写を安定的、又は一過性変更（例えば、低減）することにより、標的遺伝子の過剰発現又は誤調節に関連する病状を治療することができる。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間持続する。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続する。任意選択的に、こうした調節は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって持続する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法又は組成物は、組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における標的遺伝子の発現と比較して、細胞における標的遺伝子の発現を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００％（及び場合によっては最大１００％）低減することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、標的遺伝子と関連するゲノム複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部を妨害することにより、標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減し得る。アンカー配列媒介接合部と関連する遺伝子は、少なくとも部分的に、接合部内（即ち、第１及び第２アンカー配列の間に配列様に位置する）にあってもよいし、又は第１及び第２アンカー配列の間に配列様に位置していないという点で接合部の外部であってもよいが、上記遺伝子は、同じ染色体上で、しかも、アンカー配列媒介接合部のトポロジーを制御することによりその発現を調節することができるように、少なくとも第１又は第２アンカー配列と十分に近接して位置する。当業者は、２つのエレメント同士（例えば、上記遺伝子とアンカー配列媒介接合部の間）の三次元空間中での距離が、一部の実施形態において、塩基対に関する距離よりも重要となり得ることは理解されよう。一部の実施形態では、外部ではあるが、関連する遺伝子は、第１又は第２アンカー配列から２Ｍｂ以内、１．９Ｍｂ以内、１．８Ｍｂ以内、１．７Ｍｂ以内、１．６Ｍ以内、１．５Ｍｂ以内、１．４Ｍｂ以内、１．３Ｍｂ以内、１．３Ｍｂ以内、１．２Ｍｂ以内、１．１Ｍｂ以内、１Ｍｂ以内、９００ｋｂ以内、８００ｋｂ以内、７００ｋｂ以内、５００ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、３００ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、５０ｋｂ以内、２０ｋｂ以内、１０ｋｂ以内、又は５ｋｂ以内に位置する。
一部の実施形態では、遺伝子の発現の調節は、遺伝子に対する転写制御配列の到達性を変更することを含む。転写制御配列は、アンカー配列媒介接合部の内部又は外部にかかわらず、増強配列又はサイレンシング（若しくは抑制）配列であり得る。
エピジェネティック修飾
本開示はさらに、一部には、標的遺伝子、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント、又はアンカー配列（例えば、標的遺伝子と近接しているか、若しくは標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列）をエピジェネティック的に修飾する方法に関し、この方法は、発現抑制系（例えば、発現リプレッサー）、又はそれをコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む医薬組成物を用意するステップと；標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントを発現抑制系と接触させ、それにより、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾するステップを含む。
本開示はさらに、一部には、標的遺伝子、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメント、又はアンカー配列（例えば、標的遺伝子と近接しているか、若しくは標的遺伝子と作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションに関連するアンカー配列）をエピジェネティック的に修飾する方法に関し、この方法は、発現抑制系（例えば、発現リプレッサー）、又はそれをコードする核酸、又は前記発現抑制系若しくは核酸を含む医薬組成物を用意するステップと；標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントを発現抑制系と接触させ、それにより、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾するステップを含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントのＤＮＡメチル化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに関連するヒストンのヒストンメチル化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに関連するヒストンのヒストンアセチル化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに関連するヒストンのヒストンＳＵＭＯ化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに関連するヒストンのヒストンリン酸化の増大若しくは低減を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、エピジェネティック修飾のレベルを、上記組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における当該部位でのエピジェネティック修飾のレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００％）低減し得る。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、エピジェネティック修飾のレベルを、上記組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における当該部位でのエピジェネティック修飾のレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００％（及び任意選択的に、最大２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又は２０００％）増大し得る。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントのエピジェネティック修飾により、例えば、本明細書に記載されるように、標的遺伝子の発現のレベルを修飾することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により達成されるエピジェネティック修飾は、少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の時間持続する。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続する。任意選択的に、こうした調節は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって持続する。
一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法に使用される発現抑制系は、エピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含むリプレッサードメインを有する発現リプレッサーを含む。
例えば、リプレッサードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有するエピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含んでもよく、内因性又は天然に存在する標的配列（例えば、標的遺伝子若しくは転写制御エレメント）は、そのメチル化を増大するように改変（例えば、転写因子若しくは転写制御エレメントの一部と標的遺伝子の相互作用の低減、核形成タンパク質とアンカー配列の結合の低減、及び／又はアンカー配列媒介コンジュゲーションの破壊又は防止）してもよいし、或いはそのメチル化を低減するように改変（例えば、転写因子若しくは転写制御エレメントの一部と標的遺伝子の相互作用の増大、核形成タンパク質とアンカー配列の結合の増大、及び／又はアンカー配列媒介コンジュゲーションの促進又は強度の増加）してもよい。
キット
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを含むキットにも関する。一部の実施形態では、キットは、発現リプレッサー又は発現抑制系（例えば、発現抑制系の発現リプレッサー）と、前記発現リプレッサー又は発現抑制系の使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、発現リプレッサー又は発現抑制系若しくはその成分（例えば、発現抑制系の発現リプレッサー）をコードする核酸と、前記核酸及び／又は前記発現リプレッサー若しくは発現抑制系の使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、発現リプレッサー又は発現抑制系若しくはその成分（例えば、発現抑制系の発現リプレッサー）をコードする核酸を含む細胞）と、前記細胞、核酸、及び／又は前記発現抑制系の使用説明書とを含む。
本開示はさらに、一部には、本明細書に記載の発現リプレッサー又は発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを含むキットにも関する。一部の実施形態では、キットは、発現リプレッサー又は発現抑制系（例えば、発現抑制系の発現リプレッサー）と、前記発現リプレッサー又は発現抑制系の使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、発現リプレッサー又は発現抑制系若しくはその成分（例えば、発現抑制系の発現リプレッサー）をコードする核酸と、前記核酸及び／又は前記発現リプレッサー若しくは発現抑制系の使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、発現リプレッサー又は発現抑制系若しくはその成分（例えば、発現抑制系の発現リプレッサー）をコードする核酸を含む細胞）と、前記細胞、核酸、及び／又は前記発現抑制系の使用説明書とを含む。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーの単位投与量、又は本明細書に記載の発現リプレッサー若しくは発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸、例えば、ベクターの単位投与量を含む。
一部の実施形態では、キットは、ｂ）疾患を治療するか、又は前記組成物を有する細胞内の標的遺伝子の発現を調節、例えば、低減するための少なくとも１つの方法を含む一連の説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、任意選択で、前記組成物のための送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）を含むことができる。試薬は、賦形剤及び／又は送達ビヒクルに懸濁させて提供してもよいし、又は、別個の成分として提供してもよく、これは、後に賦形剤及び／又は送達ビヒクルと組み合わせることができる。一部の実施形態では、キットは、所望の標的遺伝子発現に影響を及ぼすために、組成物と同時投与しようとする追加の治療薬を任意選択で含有してもよい。説明資料は通常、書面又は印刷物を含むが、それらに限定されない。そのような命令を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が企図される。そうした媒体として、限定はされないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。このような媒体には、そうした説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれ得る。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の発現リプレッサー、発現抑制系、例えば、発現リプレッサーを単位投与量で、又は本明細書に記載の発現抑制系、例えば、発現リプレッサーをコードする核酸、例えば、ベクターを単位投与量で含む。
以下の実施例は、本開示の一部の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本開示の範囲の限定を意図するものではなく；それらの例示的な性質から、当業者には周知の他の手順、方法、又は技術が代替的に使用され得ることは理解されよう。
実施例１：標的の選択及びガイドの設計
本開示の発現抑制系を用いて、β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を下方制御のためにターゲティングした。化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９及びＫＲＡＢドメインを含む第１発現リプレッサー（Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、配列番号９１～９３に対応）と、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９及びＭＱ１を含む第２発現リプレッサー（Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１、配列番号９４～９６に対応）を使用した。ガイドＲＮＡ（配列番号１～５に対応する標的結合配列を含む）は、各発現リプレッサーをβ２Ｍ遺伝子のプロモータ領域内のＣｐＧ低メチル化の領域にターゲティングさせた（図１）が、この場合、メチル化は０から１（０から１００％）まで進行し、より高いメチル化は、赤いバーで表される。各バーは、ＣｐＧ部位を表す。β２Ｍプロモータ領域内のＣｐＧアイランドに、青色のガイド（ＧＤ－２８２２８及びＧＤ－２８２２９）を用いて、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢをターゲティングさせ、またオレンジ色のガイド（ＧＤ－２８１７１、ＧＤ－２８１７２及びＧＤ－２８１７３）を用いて、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１をターゲティングさせた。
本開示の発現抑制系を用いて、β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を下方制御のためにターゲティングした。化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９及びＫＲＡＢドメインを含む第１発現リプレッサー（Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、配列番号９１～９３に対応）と、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９及びＭＱ１を含む第２発現リプレッサー（Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１、配列番号９４～９６に対応）を使用した。ガイドＲＮＡ（配列番号１～５に対応する標的結合配列を含む）は、各発現リプレッサーをβ２Ｍ遺伝子のプロモータ領域内のＣｐＧ低メチル化の領域にターゲティングさせた（図１）が、この場合、メチル化は０から１（０から１００％）まで進行し、より高いメチル化は、赤いバーで表される。各バーは、ＣｐＧ部位を表す。β２Ｍプロモータ領域内のＣｐＧアイランドに、青色のガイド（ＧＤ－２８２２８及びＧＤ－２８２２９）を用いて、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢをターゲティングさせ、またオレンジ色のガイド（ＧＤ－２８１７１、ＧＤ－２８１７２及びＧＤ－２８１７３）を用いて、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１をターゲティングさせた。
実施例２：１つ又は２つの発現リプレッサーを用いたβ２Ｍ発現抑制
実施例１のガイドＲＮＡを用いて、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現リプレッサー、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１発現リプレッサー、又はその両方をβ２Ｍのプロモータ領域にターゲティングさせ、β２Ｍ発現に対する効果をｑＰＣＲによりモニターした。発現リプレッサー及びガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の細胞に送達した。
実施例１のガイドＲＮＡを用いて、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現リプレッサー、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１発現リプレッサー、又はその両方をβ２Ｍのプロモータ領域にターゲティングさせ、β２Ｍ発現に対する効果をｑＰＣＲによりモニターした。発現リプレッサー及びガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の細胞に送達した。
ＨｅｐＧ２細胞を１００μＬのＲＰＭＩ（＋１０％ＦＢＳ、＋Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ）中３０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。細胞を２４時間にわたり付着させた後、ガイド当たり０．１２５ｕｇのＲＮＡ（１：１のｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ重量比）で処理した。ＲＮＡは、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＳＳ－ＯＰイオン化脂質（ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて製剤化したＬＮＰにより送達された。ＬＮＰは、同じｍＲＮＡ：ガイド重量比を維持しながら、２つのガイドで調製した「共製剤化」と記されたサンプルを除き、１つのｍＲＮＡと１つのガイドを用いて製剤化した。細胞をＬＮＰと一緒に７２時間インキュベートした後、細胞を回収し、ｑＰＣＲによるβ２Ｍ ｍＲＮＡ分析に付し、未処理の対照細胞と比較してβ２Ｍ ｍＲＮＡレベルを取得した（図２）。
ｄＣａｓ９を単独でβ２Ｍプロモータにターゲティングさせたところ、β２Ｍ ｍＲＮＡレベルは低下しなかった。データは、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ又はＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１が単独でβ２Ｍ ｍＲＮＡレベルを低下させ、使用するガイドＲＮＡによって低下に多少のばらつきがあることを示す。Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ及びＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１は一緒に用いると、いずれかの発現リプレッサー単独の場合よりも平均してβ２Ｍ ｍＲＮＡレベルを低下させ、やはり使用するガイドＲＮＡ応じて低下に多少のばらつきがあった。１つ又は２つの発現リプレッサーを含む発現抑制系を使用すると、標的遺伝子の発現が低下した。２つの発現リプレッサーを含む発現抑制系は、単一の発現リプレッサーよりも標的遺伝子の発現を低下させたことがわかった。
実施例３：用量間及びフローサイトメトリーを用いたβ２Ｍ発現抑制
実施例１のガイドＲＮＡ（Ｓｐ－ｄＣａｓ９及びＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢについてはＧＤ－２８２２８；Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８１７２；又はＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ及びＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８２２８及びＧＤ－２８１７２）を使用して、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現リプレッサー、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１発現リプレッサー、又はその両方をβ２Ｍのプロモータ領域にターゲティングさせ、β２Ｍ発現への影響をｑＰＣＲ、さらにまたフローサイトメトリー（蛍光β２Ｍを用いてβ２Ｍタンパク質レベルをモニターする）によってモニターした。発現リプレッサー及びガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、異なる投与量及び製剤のＬＮＰで細胞に送達された。
実施例１のガイドＲＮＡ（Ｓｐ－ｄＣａｓ９及びＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢについてはＧＤ－２８２２８；Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８１７２；又はＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ及びＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８２２８及びＧＤ－２８１７２）を使用して、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現リプレッサー、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１発現リプレッサー、又はその両方をβ２Ｍのプロモータ領域にターゲティングさせ、β２Ｍ発現への影響をｑＰＣＲ、さらにまたフローサイトメトリー（蛍光β２Ｍを用いてβ２Ｍタンパク質レベルをモニターする）によってモニターした。発現リプレッサー及びガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、異なる投与量及び製剤のＬＮＰで細胞に送達された。
ＨｅｐＧ２細胞を１２ウェルプレートに１．５ｍＬのＲＰＭ１（＋１０％ＦＢＳ、＋Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ）中３３０，０００細胞／ウェルの密度で接種した。細胞を２４時間付着させた後、１ｍＬ培地中、ガイド当たり１．２５ｕｇ又は２．５ｕｇのＲＮＡ（１：１のｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ重量比）で処理した。ＲＮＡは、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＳＳ－ＯＰイオン化脂質（ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて製剤化したＬＮＰにより送達された。ＬＮＰは、同じｍＲＮＡ：ガイド重量比を維持しながら、２つのガイドで調製した「共製剤化」と記されたサンプルを除き、１つのｍＲＮＡと１つのガイドを用いて製剤化した。細胞をＬＮＰと一緒に７２時間インキュベートした後、細胞を回収し、ｑＰＣＲによるＦＡＣＳ及びｍＲＮＡ分析に付した。
実施例２に見られたように、ｄＣａｓ９単独でβ２Ｍプロモータをターゲティングさせると、β２Ｍ ｍＲＮＡレベルを低下させなかった。Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ又はＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１単独、並びにＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢとＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１を併用すると、β２Ｍ ｍＲＮＡレベルが低下した（図３）。１．２５ｕｇ／ｍｌ及び２．５ｕｇ／ｍｌ用量の発現リプレッサーは（単独又は併用）いずれも、β２Ｍ ｍＲＮＡレベルを低下させ、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢの用量が高い方が低用量よりも大きな低下をもたらすことがわかった。β２Ｍタンパク質レベルのＦＡＣＳモニタリングは、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ又はＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１処理細胞が、未処理レベルのβ２Ｍタンパク質を有する細胞の集団の減少及びβ２Ｍタンパク質のレベルが低下した細胞の新たな集団の出現を示したことを明らかにした。これらのデータは、実施例２のものと一致しており、１つ又は２つの発現リプレッサーを含む発現抑制系の使用は、標的遺伝子の発現を低減し、個別の発現リプレッサーは、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルも低下させることを示している。
実施例４：β２Ｍ発現の経時的抑制
実施例１のガイドＲＮＡ（Ｓｐ－ｄＣａｓ９及びＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢについてはＧＤ－２８２２８；Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８１７２；又はＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ及びＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８２２８及びＧＤ－２８１７２）を使用して、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現リプレッサー、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１発現リプレッサー、又はその両方をβ２Ｍのプロモータ領域にターゲティングさせ、β２Ｍ発現に対する影響をｑＰＣＲによりモニターした。トランスフェクション後の異なる日に細胞を回収し、発現変化について全ＲＮＡ及びプローブを取得した。
実施例１のガイドＲＮＡ（Ｓｐ－ｄＣａｓ９及びＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢについてはＧＤ－２８２２８；Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８１７２；又はＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ及びＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１についてはＧＤ－２８２２８及びＧＤ－２８１７２）を使用して、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ発現リプレッサー、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１発現リプレッサー、又はその両方をβ２Ｍのプロモータ領域にターゲティングさせ、β２Ｍ発現に対する影響をｑＰＣＲによりモニターした。トランスフェクション後の異なる日に細胞を回収し、発現変化について全ＲＮＡ及びプローブを取得した。
Ｋ５６２細胞を２４ウェルプレートに接種した後、以下：β２ＭターゲティングガイドＲＮＡを有するｄＣａｓ９ ｍＲＮＡ、β２ＭターゲティングガイドＲＮＡを有するＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ｍＲＮＡ、β２ＭターゲティングガイドＲＮＡを有するＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１ ｍＲＮＡ、又はβ２ＭターゲティングガイドＲＮＡを有するＳｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢとＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１ ｍＲＮＡの混合物を封入するＭＣ３ベースのＬＮＰ製剤でトランスフェクトした。トランスフェクション後の異なる日に細胞を回収し、β２Ｍ ｍＲＮＡの発現変化について全ＲＮＡ及びプローブを取得した（図４）。点線は、経時的な平均未処理β２Ｍ ｍＲＮＡレベル（上）及びトランスフェクションから２４時間後のβ２Ｍ ｍＲＮＡの平均ノックダウンレベル（下）を示す。
２２日間にわたり、非トランスフェクト細胞（青色の線）及びｄＣａｓ９トランスフェクト細胞（赤色の線）は、β２Ｍ発現を変化させないが、Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（緑色の線）トランスフェクト細胞は、トランスフェクション後最初の数日間はβ２Ｍ ｍＲＮＡレベルが低く、２日目に最大の効果を示すが、抑制は５日目以降に失われる。Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（紫色の線）トランスフェクト細胞は、β２Ｍ ｍＲＮＡレベルの有意な抑制（４日目までに最大８５％）を示し、抑制は保持され、その後、抑制はゆっくりと低下し、試験期間の終了時の図の点線のすぐ下に残る線に見られるように幾分か認められる。Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢとＳａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１を組み合わせたトランスフェクション（オレンジ色の線）は、Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１単独ですでに観察されているもの（紫色の線）を超える抑制をもたらさなかった。
これらのデータは、１つ又は２つの発現リプレッサーを含む発現抑制系の使用が標的遺伝子の発現を低減することを示している。ＭＱ１を含むものなどの個々の発現リプレッサーは、標的遺伝子の発現を長期間にわたって抑制することができ、また、複数の発現リプレッサーを含む発現抑制系（例えば、そのうちの１つは、ＭＱ１を含む発現リプレッサーである）も同様に、標的遺伝子の発現を長期間にわたって抑制することができる。
実施例５：ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるプロモータメチル化後のＢ２Ｍ発現の持続的な抑制
この実施例は、様々なＤＮＭＴを含むＬＮＰ、及びＢ２Ｍプロモータ領域にｄＣａｓ９融合物をターゲティングさせるガイドを含むＬＮＰを用いた処理によるＢ２Ｍプロモータ領域のメチル化が、Ｂ２Ｍ発現の持続的な抑制をもたらすことを実証する。
この実施例は、様々なＤＮＭＴを含むＬＮＰ、及びＢ２Ｍプロモータ領域にｄＣａｓ９融合物をターゲティングさせるガイドを含むＬＮＰを用いた処理によるＢ２Ｍプロモータ領域のメチル化が、Ｂ２Ｍ発現の持続的な抑制をもたらすことを実証する。
Ｋ－５６２細胞を、７５０μＬの増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中ウェル当たり２００，０００細胞の密度で２４ウェルプレートに接種した。エフェクターをコードするｍＲＮＡ、ｄＣａｓ９－ＭＱ１（配列番号３３）、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）（「ｍ」は、３ａ領域はヒト配列を有するが、３Ｌ領域はマウス配列を有することを示す）（配列番号３６）、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ（「ｈ」は、３ａ領域及び３Ｌ領域の両方がヒト配列を有することを示す）（配列番号３５）、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１（配列番号３５）、及びｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ｂは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｓｐａｒｋ装置を用いて、ＭＣ３脂質中に製剤化した。配列番号２１のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、個別の製剤中に同じ装置で同じ脂質に製剤化した。ストックＬＮＰ濃度は、１００μｇ／ｍＬであった。最終脂質濃度１．２５μｇ／ｍＬの１：１比で、ｍＲＮＡを封入したＬＮＰとｓｇＲＮＡを封入したＬＮＰにより細胞を処理した後、インキュベートした。各エフェクター及びガイド組合せを４回反復でトランスフェクトした。トランスフェクション後の異なる時点で、２００μＬの細胞を取り出し、処理して、発現変化のために全ＲＮＡ及びプローブを抽出し、２００μＬの細胞を５５０μＬの新鮮な培地に移した。この手順を、最初のトランスフェクションから１８日後まで続けた。ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡに変換した後、Ｂ２Ｍ特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットアッセイと共にＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＲＴ－ｑＰＣＲに使用した。データは、ｄｄＣＴ法を用いて非トランスフェクト対照と比較した倍率変化として表示される。
結果は、本実施例に記載される全ての構築物が、処理から４日後に、未処理サンプルと比較して約３５％～６０％の範囲でＢ２Ｍ発現を抑制することができたことを示している（図５）。全ての構築物は、８日の終了時に、未処理のサンプルと比較して約１５％～３０％の範囲でＢ２Ｍ発現を抑制することができた。１３日の終了時には、全てのエフェクターが、Ｂ２Ｍ発現を未処理のサンプルと比較して約４５～５５％抑制することができ、１８日の終了時には、全てのエフェクターが、Ｂ２Ｍ発現を未処理のサンプルと比較して、約３０～４０％抑制することができた（図５）。
実施例６：Ｋ－５６２細胞におけるＭＹＣ遺伝子の上流に位置するＣＴＣＦ部位をターゲティングすることにより、ＭＹＣ発現を下方制御する持続性リプレッサー又はリプレッサー系の同定
この実施例は、ＭＹＣ遺伝子の上流に位置するＣＴＣＦ部位をターゲティングすることによってＭＹＣ発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
この実施例は、ＭＹＣ遺伝子の上流に位置するＣＴＣＦ部位をターゲティングすることによってＭＹＣ発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
Ｋ－５６２細胞は、１００μＬの増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中１×１０６細胞／ｍＬの密度で、９６ウェルプレート内に増殖させた。ＧＤ－２９６３９（配列番号１１）とＧＤ－２９６４０（配列番号１２）を１：１比で混合することにより、ｓｇＲＮＡプールを調製した。表４のエフェクター又はエフェクターの組合せをコードするｍＲＮＡを５μｌずつ各ウェルに添加することにより、抑制マスタープレートを調製した。添加後、各ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの組合せは１７．５ｎｇで各ウェルに存在した。マスタープレートを平板培養した後、トランスフェクションの時点まで凍結して保存した。
トランスフェクションの前に、５μｌのｓｇＲＮＡプールを各ウェルに添加し、各ｓｇＲＮＡが８．７５ｎｇずつ各ウェルに存在するようにした。エフェクターｍＲＮＡ－ｓｇＲＮＡミックスをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で各ウェル中４０μｌの総体積まで希釈した。表５に記載のように、総ＲＮＡ１００ｎｇ当たり０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇａｒＭＡＸＴＭの比を用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇａｒＭＡＸＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とＯｐｔｉ－ＭＥＭのトランスフェクションマスターミックスを調製した。トランスフェクションの直前に、３５μＬのトランスフェクションマスターミックスを、ＲＮＡを含有する各ウェルに添加して、最終体積を７５μｌにし、室温で５分間インキュベートした後、これを使用して、Ｋ－５６２細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、標準インキュベーター内で細胞を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
トランスフェクションの２４時間後、１００μＬの新鮮な培地を各ウェルに添加した。サンプル採取は、トランスフェクションの４８時間後に開始し、６日まで継続した。細胞懸濁液サンプルは、４８時間、７２時間、及び１４４時間の時点で採取した。分析のためにサンプルを除去するたびに、等量の新鮮な培地を添加し、インキュベーションを継続した。Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを抽出し、ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡに変換した後、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、ＭＹＣ特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットアッセイを用いたＲＴ－ｑＰＣＲに使用した。データは、ｄｄＣＴ法を用いてｄＣａｓ９処理対照と比較した倍率変化として表示される。未処理及びｄＣａｓ９サンプルをキャリブレーターとして使用した。
実験により、少なくとも、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、及びｄＣａｓ９－ＭＱ１＋Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢで処理された細胞が、４８時間及び／又は７２時間の時点でＭＹＣ発現の抑制を示すことが明らかにされた（図６）。
実施例７：Ｋ－５６２細胞におけるβ２Ｍ転写開始部位の上流領域をターゲティングすることによりβ２Ｍ発現を下方制御する持久性リプレッサー又は抑制系の同定
この実施例は、β２Ｍプロモータの上流領域をターゲティングすることによりＢ２Ｍ発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
この実施例は、β２Ｍプロモータの上流領域をターゲティングすることによりＢ２Ｍ発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
Ｋ－５６２細胞は、１００μＬの増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中１×１０６細胞／ｍＬの密度で９６ウェルプレート内に増殖させた。ＧＤ－２７６３４（配列番号１３）とＧＤ－２９５００（配列番号１４）を１：１比で混合することにより、ｓｇＲＮＡプールを調製した。表Ｘに記載されるエフェクター及びｓｇＲＮＡプールミックスを使用して、実施例６に記載したプロトコルに従い、細胞をトランスフェクトした。細胞懸濁液サンプルは、４８時間、７２時間、１４４時間、１９２時間、及び２４０時間の時点で採取し、実施例６に記載のプロトコルを用いて処理した。データは、ｄｄＣＴ法を用いてｄＣａｓ９処理対照と比較した倍率変化として表示される。未処理及びｄＣａｓ９サンプルをキャリブレーターとして使用した。
データから、少なくとも、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１、ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ＋ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、及びｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８で処理された細胞が、４８時間、７２時間、及び／又は１４４時間の時点でβ２Ｍ発現の抑制を示したことが明らかにされた（図７）。
実施例８：Ｋ－５６２細胞におけるＨＳＰＡ１Ｂ転写開始部位の下流領域をターゲティングすることによりＨＳＰＡ１Ｂ発現を下方制御する持続性リプレッサー又は抑制系の同定
この実施例は、ＨＳＰＡ１Ｂプロモータの下流領域をターゲティングすることによりＨＳＰＡ１Ｂ発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
この実施例は、ＨＳＰＡ１Ｂプロモータの下流領域をターゲティングすることによりＨＳＰＡ１Ｂ発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
Ｋ－５６２細胞は、１００μＬの増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中１×１０６細胞／ｍＬの密度で９６ウェルプレート内に増殖させた。ＧＤ－２９５４２（配列番号１７）とＧＤ－２９５４４（配列番号１８）を１：１比で混合してｓｇＲＮＡプールを調製した。表４に記載されるエフェクター及びｓｇＲＮＡプールミックスを使用して、実施例６に記載したプロトコルに従い、細胞をトランスフェクトした。細胞懸濁液サンプルは、４８時間、７２時間、及び１４４時間の時点で採取し、実施例６に記載のプロトコルを用いて処理した。データは、ｄｄＣＴ法を用いてｄＣａｓ９処理対照と比較した倍率変化として表示される。未処理及びｄＣａｓ９サンプルをキャリブレーターとして使用した。
データから、少なくとも、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｍ）、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ＦＯＧ１－ｄＣａｓ９－ＦＯＧ１、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ＋ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９、及びｄＣａｓ９－ＭＱ１＋Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢで処理された細胞が、４８時間、７２時間、及び／又は１４４時間の時点でＨＳＰＡ１Ｂ発現の抑制を示したことが明らかにされた（図８）。
実施例９：Ｋ－５６２細胞におけるＧＡＴＡ１発現を下方制御する持久性リプレッサー又は抑制系の同定
この実施例は、Ｋ－５６２細胞におけるＧＡＴＡ１発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
この実施例は、Ｋ－５６２細胞におけるＧＡＴＡ１発現を下方制御する個々の発現リプレッサー又は発現抑制系の同定を示す。
Ｋ－５６２細胞は、１００μＬの増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中１×１０６細胞／ｍＬの密度で９６ウェルプレート中に増殖させた。ＧＤ－２９５３６（配列番号１９）とＧＤ－２９６９３（配列番号２０）を１：１比で混合することにより、ｓｇＲＮＡプールを調製した。表４に記載されるエフェクター及びｓｇＲＮＡプールミックスを使用して、実施例６に記載したプロトコルに従い、細胞をトランスフェクトした。細胞懸濁液サンプルは、４８時間、７２時間、及び１４４時間の時点で採取し、実施例６に記載のプロトコルを用いて処理した。データは、ｄｄＣＴ法を用いてｄＣａｓ９処理対照と比較した倍率変化として表示される。未処理及びｄＣａｓ９サンプルをキャリブレーターとして使用した。
データから、少なくとも、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＬＳＤ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ｄＣａｓ９－ＭＱ１＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、及びＧ９Ａ－ｄＣａｓ９＋ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８で処理された細胞が、４８時間、７２時間、及び／又は１４４時間の時点でＧＡＴＡ１発現の抑制を示したことが明らかにされた（図９）。
同等物
本発明をその詳細な記載と一緒に説明してきたが、以上の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するためであって、限定することを意図しないことを理解されたい。いくつかの態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
本発明をその詳細な記載と一緒に説明してきたが、以上の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するためであって、限定することを意図しないことを理解されたい。いくつかの態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (42)
- 第１ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとを含む第１発現リプレッサー、及び
第２ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとを含む第２発現リプレッサー
を含む発現抑制系であって、
前記第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列に特異的に結合し、前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、前記第１ＤＮＡ配列とは異なる第２ＤＮＡ配列に特異的に結合し、
前記第１リプレッサードメインが、前記第２リプレッサードメインとは異なる、
発現抑制系。 - 第１ＤＮＡターゲティング部分と第１リプレッサードメインとを含む第１発現リプレッサー、及び
第２ＤＮＡターゲティング部分と第２リプレッサードメインとを含む第２発現リプレッサー
を含む発現抑制系であって、
前記第１又は第２リプレッサードメインが、ＭＱ１ドメイン又はその機能性変異体若しくは断片を含み、
前記第１リプレッサードメインが、前記第２リプレッサードメインとは異なる、
発現抑制系。 - 前記第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＤＮＡ配列に特異的に結合し、前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、前記第１ＤＮＡ配列とは異なる第２ＤＮＡ配列に特異的に結合するか；又は
前記第１ＤＮＡターゲティング部分及び前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、同じＤＮＡ配列に特異的に結合する、
請求項２に記載の発現抑制系。 - 前記第１ＤＮＡターゲティング部分が、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡを含む第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含み、前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第２ガイドＲＮＡとを含む第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の発現抑制系。 - 前記第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、前記第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の発現抑制系。 - 前記第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含む第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含み、前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択される異なるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質、又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）を含む第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１又は第２リプレッサードメインが、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質、例えば、そのいずれかのＳＥＴドメイン）、ヒストンデメチラーゼ活性（例えば、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）、ヒストンデアセチラーゼ活性（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）、或いは転写リプレッサー活性（例えば、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１リプレッサードメインが、以下：ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含み；
前記第２リプレッサードメインが、以下：ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（即ち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（即ち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択される異なるタンパク質を含む、
、請求項１～８のいずれか１項に記載の発現抑制系。 - 前記第１リプレッサードメインが、ＫＲＡＢを含み、前記第２リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１リプレッサードメインが、ＫＲＡＢを含み、前記第２リプレッサードメインが、細菌性ＭＱ１を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含む）と、ガイドＲＮＡと、を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、若しくはそれを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含み、
前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、表１から選択されるＣａｓタンパク質若しくはＣｐｆ１タンパク質又はそのいずれかの変異体（例えば、突然変異体）であるか、若しくはそれを含む異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、
請求項１～１３のいずれか１項に記載の発現抑制系。 - 前記第１又は第２ＤＮＡターゲティング部分が、以下：
プロモータ配列、又はプロモータ配列、例えば、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ配列に近接するＤＮＡ
エンハンサー配列、又はエンハンサー配列、例えば、標的遺伝子の発現に影響を及ぼし、且つ／若しくは標的遺伝子に作動可能に連結したエンハンサー配列に近接するＤＮＡ；
標的遺伝子、例えば、標的遺伝子の転写開始部位と終止コドンとの間に含まれる配列；
標的遺伝子の転写開始部位；
標的遺伝子のイントロン、例えば、イントロンに関連するスプライス部位；或いは
標的遺伝子のエキソン
に特異的に結合する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の発現抑制系。 - 前記第１ＤＮＡ配列が、標的遺伝子に作動可能に連結したプロモータ内又はそれに近接する第１部位であり、前記第２ＤＮＡ配列が、前記標的遺伝子に作動可能に連結した前記プロモータ内又はそれに近接する第２部位である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１ＤＮＡ配列と前記第２ＤＮＡ配列との間の距離が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、若しくは１０００塩基対、又はその間の任意のサイズ、例えば、２０～５００塩基対である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１ＤＮＡ配列と前記第２ＤＮＡ配列との間の距離が、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、若しくは１０００塩基対以下、又はその間の任意のサイズ、例えば、２０～５００塩基対である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記標的遺伝子が、β－２－ミクログロブリン、ＭＹＣ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＧＡＴＡ１、ＡＰＯＢ、ＦＯＸＰ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及び／又はＣＸＣＬ８である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１ＤＮＡターゲティング部分が、前記第２ＤＮＡ配列に、認め得るほどに結合せず、且つ前記第２ＤＮＡターゲティング部分が、前記第１ＤＮＡ配列に、認め得るほどに結合せず、例えば、前記第１ＤＮＡターゲティング部分は、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、又は１００，０００ｎＭのＫＤで前記第２ＤＮＡ配列に結合し、前記第２ＤＮＡターゲティング部分は、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、又は１００，０００ｎＭのＫＤで前記第１ＤＮＡ配列に結合する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合及び／又は前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合が、標的遺伝子、例えば、細胞における前記第１及び／又は第２ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を、前記第１及び／又は第２発現リプレッサーの非存在下での発現と比較して、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１及び／又は第２発現リプレッサーと前記第１及び／又は第２ＤＮＡ配列との結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、標的遺伝子、例えば、前記第１及び／又は第２ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０細胞分裂の期間にわたって、認め得るほどに低減する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、発現が、前記第１及び第２発現リプレッサーの非存在下での発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減する、請求項２１又は２２のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合及び前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合が、標的遺伝子、例えば、前記第１ＤＮＡ配列に作動可能に連結した標的遺伝子の発現を、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０細胞分裂の期間にわたって、認め得るほどに低減する、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合及び前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合によって起こる発現の低減が、前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合又は前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合によって個別に起こる発現の低減よりも大きい、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合及び前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合又は前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合の各々いずれかよりも、発現を１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、５０×、又は１００×多く低減する、請求項２５に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合及び前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合によって起こる発現の低減が、前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合又は前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合によって個別に起こる発現の低減よりも長い時間（例えば、より多くの時間、日数、又は細胞分裂）にわたって持続する、請求項２１～２６のいずれか１項に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合及び前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合が、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、前記第１発現リプレッサーと前記第１ＤＮＡ配列との結合又は前記第２発現リプレッサーと前記第２ＤＮＡ配列との結合の各々いずれかよりも、発現を１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、５０×、又は１００×長く（例えば時間、日数、若しくは細胞分裂で測定して）低減する、請求項２７に記載の発現抑制系。
- 前記第１発現リプレッサーが、表１から選択される化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む第１ＤＮＡターゲティング部分と、ＫＲＡＢ又はその機能的変異体若しくは断片を含む第１リプレッサードメインとを含み；
前記第２発現リプレッサーが、表１から選択される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質若しくはその変異体（例えば、突然変異体）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む第２ＤＮＡターゲティング部分と、細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含む第２リプレッサードメインとを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の発現抑制系。 - ＤＮＡターゲティング部分と；
細菌性ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは断片を含むリプレッサードメインと、
を含むポリペプチド。 - 請求項１～３０のいずれか１項に記載の
第１発現リプレッサー、
第２発現リプレッサー、
発現抑制系（例えば、前記第１発現リプレッサーと前記第２発現リプレッサー）、又はポリペプチド
をコードする核酸。 - 請求項３１に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項１～３２のいずれか１項に記載の発現抑制系、核酸、ベクター、又はポリペプチドを含む、細胞。
- 請求項１～３２のいずれか１項に記載の発現抑制系、核酸、ポリペプチド、又はベクター、及び少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤若しくは担体を含む医薬組成物。
- 細胞における標的ゲノム配列の発現を低減する方法であって、以下：
請求項１～３２若しくは３４のいずれか１項に記載の発現抑制系、核酸、ポリペプチド、医薬組成物、又はベクターを用意するステップと；
前記発現抑制系、核酸、ポリペプチド、医薬組成物、又はベクターと前記細胞を接触させるステップとを含み、
これによって、前記標的ゲノム配列の発現を低減する方法。 - 細胞内の標的ゲノム配列をエピジェネティック的に修飾する方法であって、
請求項１～３２若しくは３４のいずれか１項に記載の発現抑制系、核酸、ポリペプチド、医薬組成物、又はベクターを用意するステップと；
前記発現抑制系、核酸、ベクター、ポリペプチド、又は医薬組成物と前記細胞を接触させるステップとを含み、
これによって、前記標的ゲノム配列をエピジェネティック的に修飾する方法。 - 前記標的ゲノム配列が、以下：
標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内の部位、例えば、エキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、例えば、β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする前記遺伝子、
標的遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメント、又は
標的遺伝子に近接するか、若しくは前記標的遺伝子に作動可能に連結したアンカー配列媒介コンジュゲーションと関連するアンカー配列
である、
請求項３５又は３６のいずれか１項に記載の方法。 - 発現が、以下：
前記発現抑制系の非存在下である以外は類似の細胞における発現と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減し；且つ／又は
例えば、ＥＬＩＳＡによって又は実施例２～４に記載のように測定した場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０細胞分裂の期間にわたって低減する、
請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。 - 前記発現の低減が、以下：
前記標的遺伝子によってコードされるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのレベルの低下；及び／又は
前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの低下を含む、
請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。 - 用意するステップが、以下：
前記標的遺伝子を含む前記細胞に対して前記発現抑制系をコードする、核酸、例えば、ベクターと、前記細胞を接触させること；又は
前記発現抑制系、又は前記発現抑制系をコードする核酸、例えば、ベクターを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と前記細胞を接触させることを含む、
請求項３５～３９のいずれか１項に記載の方法。 - 対象における標的遺伝子の過剰発現又は誤調節に関連する状態を治療する方法であって、以下：
請求項１～３２又は３４のいずれか１項に記載の発現抑制系、核酸、ポリペプチド、医薬組成物、又はベクターを前記対象に投与するステップを含み、
それによって、対象における標的遺伝子の過剰発現に関連する状態を治療する方法。 - 発現抑制系を含む細胞を作製する方法であって、前記方法は、以下：
請求項１～２９、３１、３２又は３４のいずれか１項に記載の発現抑制系、核酸、医薬組成物、又はベクターを用意するステップと；
前記発現抑制系、核酸、ベクター、又は医薬組成物と前記細胞を接触させるステップとを含み、
それによって、発現抑制系を含む細胞を作製する方法。
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