KR20230074525A - 유전자 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 발현 리프레서(expression repressor) 및 발현 억제 시스템에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 63/082,555 및 2021년 9월 10일에 출원된 미국 가출원 63/242,957의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 9월 17일에 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 O2057-7017WO_SL.txt이며, 크기가 694,831 바이트이다.
유전자 발현의 오조절(mis regulation)은 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간에서) 많은 질환의 기저 원인이다. 단기간 동안 유전자 발현을 조절하는 기법은 존재하지만, 많은 질환의 치료는 유전자 발현의 안정적인 장기간 조절을 요구한다. 질환 연관 유전자의 발현을 안정적으로 변경시키는, 예를 들어 감소시키는 신규 도구, 시스템, 및 방법에 대한 필요성이 있다.
본 개시내용은 특히, 표적 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 사용될 수 있는 발현 리프레서(expression repressor) 및 발현 억제 시스템을 제공한다.
일부 양태에서, 발현 리프레서는 DNA 표적화 모이어티(DNA targeting moiety) 및 리프레서 도메인(repressor domain)을 포함하며, 표적 유전자의 발현을 조절할(예를 들어, 감소시킬) 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA 표적화 모이어티, 제1 리프레서 도메인, 및 제2 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일하다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 발현 억제 시스템을 특징으로 하며, 상기 발현 억제 시스템은 제1 DNA-표적화 모이어티 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 제2 DNA-표적화 모이어티 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열과 상이한 제2 DNA 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 (i) 제1 DNA-표적화 모이어티, 제1 리프레서 도메인, 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 (ii) 제2 DNA-표적화 모이어티 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인 3개 모두가 상이하다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 리프레서 도메인은 동일하다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 (i) 제1 DNA-표적화 모이어티, 제1 리프레서 도메인, 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 (ii) 제2 DNA-표적화 모이어티, 제1 리프레서 도메인 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인 4개 모두가 상이하다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 리프레서 도메인은 동일하다.
일반적으로, 발현 억제 시스템에 의한 표적 유전자의 발현의 조절은 제1 DNA 서열 및 제2 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서의 각각의 결합을 포함한다. 제1 및 제2 DNA 서열의 결합은 이들 부위에 대한 제1 및 제2 리프레서 도메인의 기능성을 국재화한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서 제1 및 제2 리프레서 도메인 둘 모두의 기능성을 사용하는 것은 제1 및/또는 제2 DNA 서열과 연관되거나 이를 포함하는 표적 유전자의 발현을 안정적으로 억제하는 것으로 여겨지며, 예를 들어 여기서 제1 및/또는 제2 DNA 서열은 표적 유전자 또는 하나 이상의 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소의 서열이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 제공하며, 상기 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템은 서열번호 1 내지 21의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌(genomic locus)에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하며, 여기서 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템은 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 발현 리프레서를 제공하며, 상기 발현 리프레서는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS)), 또는 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티(여기서, 선택적으로 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질을 포함함); 및 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS)), 또는 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티(여기서, 선택적으로 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질을 포함함), 제1 리프레서 도메인, 및 제2 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일하지 않다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 발현 억제 시스템을 제공하며, 상기 발현 억제 시스템은 (i) 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS)), 또는 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는 제1 DNA-표적화 모이어티(여기서, 선택적으로 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질을 포함함); 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS)), 또는 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는 제2 DNA-표적화 모이어티(여기서, 선택적으로 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질을 포함함); 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 제1 리프레서 도메인은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 제1 억제 도메인은 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 DNA-표적화 모이어티와 제2 DNA-표적화 모이어티는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 DNA-표적화 모이어티와 제2 DNA-표적화 모이어티는 상이하다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS)), 또는 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는 제1 DNA-표적화 모이어티(여기서, 선택적으로 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질을 포함함), 제1 리프레서 도메인, 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS)), 또는 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는 제2 DNA-표적화 모이어티(여기서, 선택적으로 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질을 포함함), 제1 리프레서 도메인, 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 제1 리프레서 도메인은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 제1 억제 도메인은 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 제2 리프레서 도메인은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 제2 억제 도메인은 상이하다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 발현 리프레서 또는 이의 성분(예를 들어, gRNA)을 인코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 제1 발현 리프레서, 제2 발현 리프레서, 둘 모두, 또는 이들의 성분(예를 들어, gRNA)을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 벡터, 핵산, 발현 억제 시스템, 또는 발현 리프레서를 포함하는 지질 나노입자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 또는 지질 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 제공하는 단계, 및 표적 유전자 및/또는 하나 이상의 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계들에 의해 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 표적 유전자의 과발현(over-expression)과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 핵산, 또는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 단계에 의해 병태를 치료한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 표적 유전자의 오조절과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 핵산, 또는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 단계에 의해 병태를 치료한다.
상기 언급된 임의의 방법 또는 조성물의 추가의 특징은 하기 열거된 구현예 중 하나 이상을 포함한다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 기재된 본 발명의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 하기 열거된 구현예에 의해 포함되고자 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌(예를 들어, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 전체적으로 참고로 포함된다. 예를 들어, 본 명세서에 언급된, 예를 들어 본 명세서의 임의의 표에 있는 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참고로 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서의 임의의 표에 있는 것을 포함한 본 명세서에 명시된 서열 수탁 번호는 2019년 9월 23일 현재 시점에서 최신의 데이터베이스 등록물을 지칭한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 수탁 번호를 참조할 때, 모든 서열 변이체가 포함된다.
열거된 구현예
1. 발현 리프레서로서,
DNA-표적화 모이어티, 및
리프레서 도메인
을 포함하며,
상기 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는, 발현 리프레서.
2. 구현예 1에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 슈퍼 인핸서, 또는 전사 개시 부위(TSS))에 결합하거나, 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는, 발현 리프레서.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티에 작동가능하게 연결된, 발현 리프레서.
4. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 리프레서 도메인은 링커를 통해 DNA-표적화 모이어티에 연결된, 발현 리프레서.
5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
6. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는, 발현 리프레서.
7. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 서열번호 47 내지 56 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열에 의해 인코딩되는, 발현 리프레서.
8. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 서열번호 57 내지 66, 90 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
9. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 57 또는 90의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
10. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 DNMT1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
11. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 DNMT3a/3L 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 59 또는 60의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
12. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 61의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
13. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 62의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는, 발현 리프레서.
14. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 63의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
15. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 64의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
16. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 64의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 선택적으로, 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는, 발현 리프레서.
17. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
18. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 제2 리프레서 도메인을 추가로 포함하는, 발현 리프레서.
19. 구현예 18에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 리프레서 도메인과 제2 리프레서 도메인 사이에 위치하는, 발현 리프레서.
20. 발현 리프레서로서,
DNA-표적화 모이어티,
제1 리프레서 도메인, 및
제2 리프레서 도메인
을 포함하며,
상기 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는, 발현 리프레서.
21. 임의의 선행하는 구현예에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 슈퍼 인핸서, 또는 전사 개시 부위(TSS))에 결합하거나, 상기 전사 조절 요소에 근접한 서열에 결합하는, 발현 리프레서.
22. 구현예 18 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일한, 발현 리프레서.
23. 구현예 18 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일하지 않은, 발현 리프레서.
24. 구현예 18 내지 구현예 23 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인과 제2 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티에 공유적으로 연결되는, 발현 리프레서.
25. 구현예 18 내지 구현예 24 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 제1 링커를 통해 DNA-표적화 모이어티에 연결되고, 제2 리프레서 도메인은 제2 링커를 통해 DNA-표적화 모이어티에 연결되는, 발현 리프레서.
26. 구현예 25에 있어서, 제1 링커는 제2 링커와 동일한, 발현 리프레서.
27. 구현예 25에 있어서, 제1 링커는 제2 링커와 동일하지 않은한, 발현 리프레서.
28. 구현예 18 내지 구현예 27 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는, 발현 리프레서.
29. 구현예 18 내지 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 제2 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
30. 구현예 25 내지 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인의 C-말단 단부는 제1 링커를 통해 DNA-표적화 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, 제2 리프레서 도메인의 N-말단 단부는 제2 링커를 통해 DNA-표적화 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는, 발현 리프레서.
31. 구현예 18 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 제1 리프레서 도메인은 서열번호 64의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 제1 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 제2 리프레서 도메인은 서열번호 61의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
32. 구현예 18 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 제1 리프레서 도메인은 서열번호 62의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 제1 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 제2 리프레서 도메인은 서열번호 61의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
33. 구현예 18 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 제1 리프레서 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 제1 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 제2 리프레서 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 발현 리프레서.
34. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는, 발현 리프레서.
35. 구현예 1 내지 구현예 34 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자(예를 들어, 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질), 징크 핑거 도메인, 또는 TAL 이펙터 분자를 포함하는, 발현 리프레서.
36. 구현예 35에 있어서, CRISPR/Cas 분자는 D10A, D839A, H840A, 및 N863A로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 발현 리프레서.
37. 구현예 1 내지 구현예 36 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 프로모터 영역, 인핸서 영역(예를 들어, 슈퍼 인핸서 영역), 또는 앵커 서열에 결합하는, 발현 리프레서.
38. 구현예 1 내지 구현예 37 중 어느 하나에 있어서, 리프레서 도메인은 DNMT1, DNMT3a/3L, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, 또는 FOG1을 포함하는, 발현 리프레서.
39. 구현예 18 내지 구현예 38 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNMT1, DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, 또는 FOG1을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT1, DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, 또는 FOG1을 포함하는, 발현 리프레서.
40. 구현예 1 내지 구현예 39 중 어느 하나에 있어서, 발현 리프레서는 서열번호 22 내지 32, 92, 95 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열에 의해 인코딩되는, 발현 리프레서.
41. 구현예 1 내지 구현예 40 중 어느 하나에 있어서, 발현 리프레서는 서열번호 33 내지 36, 38 내지 44, 67 내지 69, 93, 96 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
42. 구현예 1 내지 구현예 41 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 서열번호 45 또는 89 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열에 의해 인코딩되는, 발현 리프레서.
43. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 서열번호 46 또는 88 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
44. 구현예 18 내지 구현예 43 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 리프레서 도메인은 서열번호 47 내지 56, 90 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열에 의해 인코딩되고,
(ii) 제2 리프레서 도메인은 서열번호 47 내지 56, 90 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열에 의해 인코딩되는,
발현 리프레서.
45. 구현예 18 내지 구현예 43 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 리프레서 도메인은 서열번호 57 내지 66 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하고,
(ii) 제2 리프레서 도메인은 서열번호 57 내지 66 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함하는,
발현 리프레서.
46. 임의의 선행하는 구현예에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제 도메인, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 발현 리프레서.
47. 임의의 선행하는 구현예에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 gRNA, 예를 들어 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는 gRNA를 추가로 포함하며, 예를 들어 gRNA는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
48. 구현예 35 내지 구현예 47 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 도메인은 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질, 및 gRNA, 예를 들어 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는 gRNA를 포함하며, 예를 들어 gRNA는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하고, 리프레서 도메인은 DNMT1, DNMt3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, 또는 FOG1로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 발현 리프레서.
49. 구현예 35 내지 구현예 47 중 어느 하나에 있어서, DNA-표적화 도메인은 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질, 및 gRNA, 예를 들어 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는 gRNA를 포함하며, 예를 들어 gRNA는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하고, 제1 리프레서 도메인은 DNMT1, DNM T3a/3L, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, 또는 FOG1로부터 선택되는 모이어티를 포함하고, 제2 도메인은 DNMT1, DNMt3a/3L, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, 또는 FOG1로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 발현 리프레서.
50. 구현예 35 내지 구현예 49 중 어느 하나에 있어서, CRISPR/Cas 분자는 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는, 발현 리프레서.
51. 구현예 35 내지 구현예 50 중 어느 하나에 있어서, CRISPR/Cas 분자는 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 dCas9를 포함하는, 발현 리프레서.
52. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, (i) 하나 이상의 핵 국재화 신호 서열(nuclear localization signal sequence, NLS)을 포함하거나, (ii) NLS를 포함하지 않는, 발현 리프레서.
53. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, N 말단에 있는 제1 NLS를 포함하며, 예를 들어 제1 NLS는 서열번호 86의 서열을 갖는, 발현 리프레서.
54. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, C 말단에 있는 NLS, 예를 들어 제2 NLS를 포함하며, 예를 들어 제2 NLS는 서열번호 87의 서열을 갖는, 발현 리프레서.
55. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 제1 NLS와 제2 NLS는 동일한 서열을 갖는, 발현 리프레서.
56. 구현예 52 내지 구현예 55 중 어느 하나에 있어서, 제1 NLS와 제2 NLS는 상이한 서열을 갖는, 발현 리프레서.
57. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 태그를 포함하는, 발현 리프레서.
58. 구현예 57에 있어서, 에피토프 태그는 HA 태그, 예를 들어 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 HA 태그인, 발현 리프레서.
59. 구현예 37 내지 구현예 58 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 서열번호 81 또는 82의 서열, 또는 그것과 대비하여 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 변경을 갖는 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
60. 구현예 37 내지 구현예 58 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 서열번호 83 또는 84에 따른 서열, 또는 그것과 대비하여 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 변경을 갖는 서열을 포함하는, 발현 리프레서.
61. 구현예 37 내지 구현예 60 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 유전자와 동일한 염색체 상에 있는, 발현 리프레서.
62. 구현예 37 내지 구현예 61 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 표적 유전자의 상류(예를 들어, TSS의 상류 또는 프로모터의 상류)에 있는, 발현 리프레서.
63. 구현예 37 내지 구현예 61 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 표적 유전자의 하류(예를 들어, TSS의 하류 또는 프로모터의 상류)에 있는, 발현 리프레서.
64. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자좌에 대한 발현 리프레서의 결합은 세포 내의 표적 유전자의 발현을, 발현 리프레서의 부재 하에서의 표적 유전자의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소시키는, 발현 리프레서.
65. 선행하는 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자좌에 대한 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자의 발현을, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22일의 기간 동안 상당히 감소시키는, 발현 리프레서.
66. 구현예 18 내지 구현예 65 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 데메틸라제, 또는 히스톤 변형 복합체의 동원인자(recruiter)를 포함하는, 발현 리프레서.
67. 발현 억제 시스템으로서,
제1 DNA-표적화 모이어티 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및
제2 DNA-표적화 모이어티 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서
를 포함하며,
제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열과 상이한 제2 DNA 서열에 특이적으로 결합하고,
제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 상이한,
발현 억제 시스템.
68. 발현 억제 시스템으로서,
제1 DNA-표적화 모이어티 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및
제2 DNA-표적화 모이어티 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서
를 포함하며,
제1 또는 제2 리프레서 도메인은 MQ1 도메인 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하고,
제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 상이한,
발현 억제 시스템.
69. 구현예 67 또는 구현예 68에 있어서, 제1 발현 리프레서는 제3 리프레서 도메인을 추가로 포함하는, 발현 억제 시스템.
70. 구현예 67 내지 구현예 69 중 어느 하나에 있어서, 제2 발현 리프레서는 제4 리프레서 도메인을 추가로 포함하는, 발현 억제 시스템.
71. 구현예 67 내지 구현예 70 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열과 상이한 제2 DNA 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
72. 구현예 67 내지 구현예 70 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티와 제2 DNA-표적화 모이어티는 동일한 DNA 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
73. 구현예 67 내지 구현예 72 중 어느 하나에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 CRISPR/Cas 단백질 및 제1 가이드 RNA를 포함하는 제1 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제2 CRISPR/Cas 단백질 및 제2 가이드 RNA를 포함하는 제2 CRISPR/Cas 분자를 포함하는, 발현 억제 시스템.
74. 구현예 73에 있어서,
제1 CRISPR/Cas 단백질은 제2 가이드 RNA에 결합하지 않으며, 예를 들어 적어도 10, 20, 50, 100, 1000, 또는 10,000 nM의 KD로 결합하고, 제2 CRISPR/Cas 단백질은 제1 가이드 RNA에 결합하지 않으며, 예를 들어 적어도 10, 20, 50, 100, 1000, 또는 10,000 nM의 KD로 결합하는, 발현 억제 시스템.
75. 구현예 73 또는 구현예 74에 있어서:
제1 CRISPR/Cas 단백질은 제2 CRISPR/Cas 단백질과 상이한 아미노산 서열을 포함하는, 발현 억제 시스템.
76. 구현예 67 내지 구현예 75 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는, 발현 억제 시스템.
77. 구현예 67 내지 구현예 76 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는 제1 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 상이한 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는 제2 CRISPR/Cas 분자를 포함하는, 발현 억제 시스템.
78. 구현예 70 내지 구현예 77 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
79. 구현예 70 내지 구현예 78에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 이들 중 임의의 것의 SET 도메인으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 발현 억제 시스템.
80. 구현예 70 내지 구현예 79 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성(예를 들어, 라이신 데메틸라제 활성)을 포함하는, 발현 억제 시스템.
81. 구현예 70 내지 구현예 80 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 발현 억제 시스템.
82. 구현예 70 내지 구현예 81 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
83. 구현예 70 내지 구현예 82 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 발현 억제 시스템.
84. 구현예 70 내지 구현예 83 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
85. 구현예 70 내지 구현예 84 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 발현 억제 시스템.
86. 구현예 70 내지 구현예 85 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
87. 구현예 70 내지 구현예 86 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 리프레서 도메인은 KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 발현 억제 시스템.
88. 구현예 67 내지 구현예 87 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하는,
발현 억제 시스템.
89. 구현예 69 내지 구현예 88 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
(ii) 제3 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질(예를 들어, 상이한 단백질)을 포함하는,
발현 억제 시스템.
90. 구현예 69 내지 구현예 89 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
(ii) 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질(예를 들어, 상이한 단백질)을 포함하고,
(iii) 제3 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는,
발현 억제 시스템.
91. 구현예 70 내지 구현예 90 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
(ii) 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질(예를 들어, 상이한 단백질)을 포함하고,
(iii) 제3 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
(iv) 제4 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질(예를 들어, 상이한 단백질)을 포함하는,
발현 억제 시스템.
92. 구현예 70 내지 구현예 91 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
(ii) 제4 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질(예를 들어, 상이한 단백질)을 포함하는,
발현 억제 시스템.
93. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
94. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
95. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
96. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
97. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
98. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는(예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성은 서로 동일하거나 상이한), 발현 억제 시스템.
99. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
100. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
101. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
102. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
103. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하는(예를 들어, 히스톤 데메틸라제 활성은 서로 동일하거나 상이한), 발현 억제 시스템.
104. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
105. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
106. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
107. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하는(예를 들어, 히스톤 데아세틸라제 활성은 서로 동일하거나 상이한), 발현 억제 시스템.
108. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
109. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
110. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하는(예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제 활성은 서로 동일하거나 상이한), 발현 억제 시스템.
111. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는, 발현 억제 시스템.
112. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하는(예를 들어, DNA 데메틸라제 활성은 서로 동일하거나 상이한), 발현 억제 시스템.
113. 구현예 67 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하는(예를 들어, 전사 리프레서 활성은 서로 동일하거나 상이한), 발현 억제 시스템.
114. 구현예 67 내지 구현예 113 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 KRAB, SET 도메인(예를 들어, SETDB1, EZH2, G9A, 또는 SUV39H1의 SET 도메인), 히스톤 데메틸라제 LSD1, FOG1(예를 들어, FOG1의 N-말단 잔기), KAP1, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고;
제2 리프레서 도메인은 DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A), DNMT3B, DNMT3L, DNMT3A/3L 복합체, 박테리아 MQ1, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는,
발현 억제 시스템.
115. 구현예 67 내지 구현예 114 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 EZH2, G9A, SUV39H1, FOG1, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고;
제2 리프레서 도메인은 DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A), DNMT3B, DNMT3L, DNMT3A/3L, DNMT1, LSD1, FOG1, KRAB, HDAC8, 박테리아 MQ1, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는,
발현 억제 시스템.
116. 구현예 67 내지 구현예 115 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 리프레서 도메인은 KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KAP1, HDAC8, MQ1, DNMT1, DNMT3A, DNMT3a/3l, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고;
(ii) 제2 리프레서 도메인은 KRAB, FOG1, G9A, LSD1, HDAC8, EZH2, DNMT3a/3l, MQ1, DNMT1, DBMT3A, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는,
발현 억제 시스템.
117. 구현예 67 내지 구현예 116 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A)를 포함하는, 발현 억제 시스템.
118. 구현예 67 내지 구현예 115 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 발현 억제 시스템.
119. 구현예 67 내지 구현예 118 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 발현 억제 시스템.
120. 구현예 67 내지 구현예 119 중 어느 하나에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 발현 억제 시스템.
121. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
122. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
123. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
124. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
125. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
126. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
127. 구현예 67 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
128. 구현예 69 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제3 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제3 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고;
제2 리프레서 도메인은 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
129. 구현예 69 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제3 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제3 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
130. 구현예 69 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제3 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제3 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
131. 구현예 69 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제3 리프레서 도메인은 FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제3 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
132. 구현예 69 내지 구현예 120 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제3 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제3 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
133. 구현예 69 내지 구현예 130 중 어느 하나에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제1 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 N-말단에 있고,
제3 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제3 리프레서 도메인은 제1 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있고,
제2 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하며, 선택적으로 제2 리프레서 도메인은 제2 DNA-표적화 모이어티의 C-말단에 있는,
발현 억제 시스템.
134. 구현예 67 내지 구현예 133 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는, 발현 억제 시스템.
135. 구현예 67 내지 구현예 134 중 어느 하나에 있어서, 제2 DNA-표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는, 발현 억제 시스템.
136. 구현예 67 내지 구현예 135 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는, CRISPR/Cas 단백질(예를 들어, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 것) 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는, 발현 억제 시스템.
137. 구현예 67 내지 구현예 136 중 어느 하나에 있어서, 제2 DNA-표적화 모이어티는, CRISPR/Cas 단백질(예를 들어, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 것) 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는, 발현 억제 시스템.
138. 구현예 67 내지 구현예 137 중 어느 하나에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 CRISPR/Cas 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하고,
제2 DNA-표적화 모이어티는, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 상이한 CRISPR/Cas 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는,
발현 억제 시스템.
139. 구현예 135 내지 구현예 138 중 어느 하나에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 45 또는 89의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하고,
제2 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 45 또는 89의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는,
발현 억제 시스템.
140. 구현예 135 내지 구현예 138 중 어느 하나에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 46 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하고,
제2 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 46 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는,
발현 억제 시스템.
141. 구현예 67 내지 구현예 140 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 프로모터 서열에, 또는 프로모터 서열에 근접한 DNA에, 예를 들어 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
142. 구현예 67 내지 구현예 141 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 인핸서 서열에, 또는 인핸서 서열에 근접한 DNA에, 예를 들어 표적 유전자의 발현에 영향을 주고/주거나 그것에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
143. 구현예 67 내지 구현예 142 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자, 예를 들어 표적 유전자의 전사 개시 부위와 정지 코돈 사이에 포함된 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
144. 구현예 67 내지 구현예 143 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 전사 개시 부위에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
145. 구현예 67 내지 구현예 144 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 인트론, 예를 들어 표적 유전자의 인트론과 연관된 스플라이스 부위에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
146. 구현예 67 내지 구현예 145 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 엑손에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
147. 구현예 67 내지 구현예 146 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 앵커 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템.
148. 구현예 147에 있어서, 앵커 서열은 서열번호 81 또는 82의 서열, 또는 그것과 대비하여 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 변경을 갖는 서열을 포함하는, 발현 억제 시스템.
149. 구현예 147에 있어서, 앵커 서열은 서열번호 83 또는 84의 서열, 또는 그것과 대비하여 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 변경을 갖는 서열을 포함하는, 발현 억제 시스템.
150. 구현예 147 내지 구현예 149 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 유전자와 동일한 염색체 상에 있는, 발현 억제 시스템.
151. 구현예 147 내지 구현예 149 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 유전자와 상이한 염색체 상에 있는, 발현 억제 시스템.
152. 구현예 147 내지 구현예 151 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 표적 유전자의 상류(예를 들어, TSS의 상류 또는 프로모터의 상류)에 있는, 발현 억제 시스템.
153. 구현예 148 내지 구현예 151 중 어느 하나에 있어서, 앵커 서열은 표적 유전자의 하류(예를 들어, TSS의 하류 또는 프로모터의 상류)에 있는, 발현 억제 시스템.
154. 구현예 67 내지 구현예 141 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접한 제1 부위이고, 제2 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접한 제2 부위인, 발현 억제 시스템.
155. 구현예 67 내지 구현예 142 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접해 있고, 제2 DNA 서열은, 표적 유전자의 발현에 영향을 주거나 그것에 작동가능하게 연결된 인핸서 내에 있거나 그것에 근접해 있는, 발현 억제 시스템.
156. 구현예 67 내지 구현예 142 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은, 표적 유전자의 발현에 영향을 주거나 그것에 작동가능하게 연결된 인핸서 내에 있거나 그것에 근접해 있고, 제2 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접해 있는, 발현 억제 시스템.
157. 구현예 67 내지 구현예 141 또는 구현예 143 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은 표적 유전자의 전사 개시 부위를 포함하고, 제2 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접해 있는, 발현 억제 시스템.
158. 구현예 67 내지 구현예 140, 구현예 142 또는 구현예 143 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은 표적 유전자의 전사 개시 부위를 포함하고, 제2 DNA 서열은, 표적 유전자의 발현에 영향을 주거나 그것에 작동가능하게 연결된 인핸서 내에 있거나 그것에 근접해 있는, 발현 억제 시스템.
159. 구현예 67 내지 구현예 141 또는 구현예 143 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접해 있고, 제2 DNA 서열은 표적 유전자의 전사 개시 부위인, 발현 억제 시스템.
160. 구현예 67 내지 구현예 140, 구현예 142, 또는 구현예 143 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열은, 표적 유전자의 발현에 영향을 주거나 그것에 작동가능하게 연결된 인핸서 내에 있거나 그것에 근접해 있고, 제2 DNA 서열은 표적 유전자의 전사 개시 부위인, 발현 억제 시스템.
161. 구현예 67 내지 구현예 160 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열 사이의 거리는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개의 염기쌍 또는 이들 사이의 임의의 크기, 예를 들어 20 내지 500개의 염기쌍인, 발현 억제 시스템.
162. 구현예 67 내지 구현예 161 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열 사이의 거리는 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개 이하의 염기쌍 또는 이들 사이의 임의의 크기, 예를 들어 20 내지 500개의 염기쌍인, 발현 억제 시스템.
163. 구현예 67 내지 구현예 162 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열은 상이한 핵산, 예를 들어 상이한 염색체 상에 위치하는, 발현 억제 시스템.
164. 구현예 67 내지 구현예 163 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자는 β-2-마이크로글로불린, MYC, HSPA1B, GATA1, APOB, FOXP3, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL6, CXCL7, 및/또는 CXCL8인, 발현 억제 시스템.
165. 구현예 73 내지 구현예 164 중 어느 하나에 있어서, 제1 가이드 RNA는 제1 DNA 서열에 특이적인, 예를 들어 그것에 상보적인 서열을 포함하고, 제2 가이드 RNA는 제2 DNA 서열에 특이적인, 예를 들어 그것에 상보적인 서열을 포함하는, 발현 억제 시스템.
166. 구현예 67 내지 구현예 165 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제2 DNA 서열에 별로 결합하지 않고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 별로 결합하지 않는, 발현 억제 시스템.
167. 구현예 67 내지 구현예 166 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 100,000 nM의 KD로 제2 DNA 서열에 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 100,000 nM의 KD로 제1 DNA 서열에 결합하는, 발현 억제 시스템.
168. 구현예 67 내지 구현예 167 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합은 세포 내의 표적 유전자, 예를 들어 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
169. 구현예 168에 있어서, 발현은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 발현 리프레서의 부재 하에서의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되는, 발현 억제 시스템.
170. 구현예 67 내지 구현예 169 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자, 예를 들어 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 상당히 감소시키는, 발현 억제 시스템.
171. 구현예 67 내지 구현예 170 중 어느 하나에 있어서, 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은 세포 내의 표적 유전자, 예를 들어 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
172. 구현예 171에 있어서, 발현은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제2 발현 리프레서의 부재 하에서의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되는, 발현 억제 시스템.
173. 구현예 67 내지 구현예 172 중 어느 하나에 있어서, 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자, 예를 들어 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 상당히 감소시키는, 발현 억제 시스템.
174. 구현예 67 내지 구현예 173 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은 세포 내의 표적 유전자, 예를 들어, 제1 DNA 서열 및/또는 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
175. 구현예 174에 있어서, 발현은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 및 제2 발현 리프레서의 부재 하에서의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되는, 발현 억제 시스템.
176. 구현예 1 내지 구현예 175 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자, 예를 들어 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 상당히 감소시키는, 발현 억제 시스템.
177. 구현예 174 내지 구현예 176 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 발생되는 발현의 감소는 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 개별적으로 발생되는 발현의 감소보다 더 큰, 발현 억제 시스템.
178. 구현예 177에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합 중 어느 하나의 개별적인 결합보다 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.6×, 1.7×, 1.8×, 1.9×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 50×, 또는 100× 더 크게 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
179. 구현예 174 내지 구현예 178 중 어느 하나에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 발생되는 발현의 감소는 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 개별적으로 발생되는 발현의 감소보다 더 긴 시간(예를 들어, 더 많은 시간, 일 수, 또는 세포 분열 횟수) 동안 지속되는, 발현 억제 시스템.
180. 구현예 179에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합 중 어느 하나의 개별적인 결합보다 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.6×, 1.7×, 1.8×, 1.9×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 50×, 또는 100× 더 길게(예를 들어, 시간, 일 수, 또는 세포 분열 횟수로 측정될 때) 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
181. 구현예 174 내지 구현예 180 중 어느 하나에 있어서, 세포는 24, 36, 48, 60, 또는 72시간당 1회 이하(그리고 선택적으로, 24, 36, 48, 60, 또는 72시간당 적어도 1회)의 속도로 분할되고 있는, 발현 억제 시스템.
182. 구현예 174 내지 구현예 181 중 어느 하나에 있어서, 세포는 24, 36, 48, 60, 또는 72시간당 적어도 1회(그리고 선택적으로, 24, 36, 48, 60, 또는 72시간당 1회 이하)의 속도로 분할되고 있는, 발현 억제 시스템.
183. 구현예 174 내지 구현예 182 중 어느 하나에 있어서, 발현은 무기한으로(예를 들어, 실험적으로 측정될 수 있는 것보다 긴 기간 동안) 상당히 감소되는, 발현 억제 시스템.
184. 구현예 67 내지 구현예 183 중 어느 하나에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 S. 피오게네스(S. pyogenes) CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 dCas9; 또는 표 1로부터 선택되는 S. 아우레우스(S. aureus) CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9, 예를 들어 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 dCas9를 포함하고,
제2 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 S. 피오게네스 CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 dCas9; 또는 표 1로부터 선택되는 S. 아우레우스 CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9, 예를 들어 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는,
발현 억제 시스템.
185. 구현예 67 내지 구현예 184 중 어느 하나에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 dCas9, 예를 들어 dCas9, 예를 들어 D10A, D839A, H840A, 및 N863A 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하고;
제2 DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 dCas9, 예를 들어 dCas9, 예를 들어 D10A, D839A, H840A, 및 N863A 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는,
발현 억제 시스템.
186. 구현예 67 내지 구현예 185 중 어느 하나에 있어서,
제1 발현 리프레서는 표 1로부터 선택되는 S. 피오게네스 CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 제1 DNA-표적화 모이어티, 및 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 제1 리프레서 도메인을 포함하고;
제2 발현 리프레서는 표 1로부터 선택되는 S. 아우레우스 CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 제2 DNA-표적화 모이어티, 및 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 제2 리프레서 도메인을 포함하는,
발현 억제 시스템.
187. 폴리펩티드로서,
DNA-표적화 모이어티; 및
박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인
을 포함하는, 폴리펩티드.
188. 폴리펩티드로서,
DNA-표적화 모이어티,
MQ1, DNMT1, DNMT3a/3l, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 제1 리프레서 도메인, 및
MQ1, DNMT1, DNMT3a/3l, KRAB, G9A, HDAC8, LSD1, EZH2, FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 제2 리프레서 도메인
을 포함하는, 폴리펩티드.
189. 구현예 88a에 있어서, DNA-표적화 모이어티는 제1 리프레서 도메인과 제2 리프레서 도메인 사이에 위치하는, 폴리펩티드.
190. 구현예 67 내지 구현예 189 중 어느 하나의 발현 억제 시스템의 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산.
191. 구현예 67 내지 구현예 189 중 어느 하나의 발현 억제 시스템의 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산.
192. 구현예 67 내지 구현예 189 중 어느 하나의 발현 억제 시스템, 예를 들어 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산.
193. 구현예 190 내지 구현예 192 중 어느 하나에 있어서, RNA, 예를 들어 mRNA인, 핵산.
194. 발현 억제 시스템으로서,
구현예 67 내지 구현예 189 중 어느 하나의 발현 억제 시스템의 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 서열을 포함하는 제1 핵산; 및
구현예 67 내지 구현예 189 중 어느 하나의 발현 억제 시스템의 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산
을 포함하는, 발현 억제 시스템.
195. 구현예 187 내지 구현예 189 중 어느 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
196. 구현예 190 내지 구현예 193 또는 구현예 195 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 mRNA를 포함하는, 핵산.
197. 임의의 선행하는 구현예의 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
198. 선행하는 구현예 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, mRNA, 또는 벡터를 포함하는 지질 나노입자.
199. 구현예 198에 있어서, 이온화 가능한 지질, 예를 들어 양이온성 지질, 예를 들어 MC3, SSOP를 포함하는, 지질 나노입자.
200. 구현예 198 또는 구현예 199에 있어서, 중성 지질, 이온화 가능한 아민-함유 지질, 생분해성 알킨 지질, 스테로이드, 인지질, 다가불포화 지질, 구조 지질(예를 들어, 스테롤), PEG, 콜레스테롤, 또는 중합체 접합된 지질 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
201. 선행하는 구현예 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 또는 지질 나노입자를 포함하는 반응 혼합물.
202. 구현예 201에 있어서, 세포를 추가로 포함하는, 반응 혼합물.
203. 구현예 1 내지 구현예 202 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, mRNA, 벡터, 또는 나노입자를 포함하는 세포.
204. 구현예 203에 있어서, 세포는 간세포, 뉴런 세포, 내피 세포, 근세포, 및 림프구로부터 선택되는, 세포.
205. i) 세포, 및 ii) 구현예 1 내지 구현예 202 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 지질 나노입자, 또는 반응 혼합물를 제공하는 단계; 및
세포를 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 지질 나노입자, 또는 반응 혼합물과 접촉시키는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성되는 세포.
206. 구현예 1 내지 구현예 202 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 벡터, 지질 나노입자, 또는 반응 혼합물, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
207. 구현예 1 내지 구현예 202 중 어느 하나에 있어서, 제1 발현 리프레서는 태깅 또는 모니터링 모이어티, 절단성 모이어티(예를 들어, DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인 사이에 위치하거나, 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단부에 위치한 절단성 모이어티), 소분자, 막 전좌 폴리펩티드, 또는 약제(pharmacoagent) 모이어티로부터 선택되는 추가의 모이어티를 추가로 포함하는, 발현 억제 시스템.
208. 구현예 1 내지 구현예 202 중 어느 하나에 있어서, 제2 발현 리프레서는 태깅 또는 모니터링 모이어티, 절단성 모이어티(예를 들어, DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인 사이에 위치하거나, 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단부에 위치한 절단성 모이어티), 소분자, 막 전좌 폴리펩티드, 또는 약제 모이어티로부터 선택되는 추가의 모이어티를 추가로 포함하는, 발현 억제 시스템.
209. 세포 내의 표적 게놈 서열의 발현을 감소시키는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 204 또는 구현예 206 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 벡터, 지질 나노입자, 반응 혼합물, 세포, 또는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및
세포를 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 벡터, 지질 나노입자, 반응 혼합물, 세포, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 표적 게놈 서열의 발현을 감소시키는, 방법.
210. 세포 내의 표적 게놈 서열을 후성유전학적으로 변형시키는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 204 또는 구현예 206 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 폴리펩티드, 지질 나노입자, 반응 혼합물, 세포, 또는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및
세포를 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 폴리펩티드, 지질 나노입자, 반응 혼합물, 세포, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 표적 게놈 서열을 후성유전학적으로 변형시키는, 방법.
211. 구현예 209 또는 구현예 210에 있어서, 표적 게놈 서열은
표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 부위, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 예를 들어 β-2-마이크로글로불린(β2M)을 인코딩하는 유전자, MYC를 인코딩하는 유전자, HSPA1B를 인코딩하는 유전자, 또는 GATA1을 인코딩하는 유전자,
표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는
표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열
인, 방법.
212. 구현예 211에 있어서, 후성유전학적 변형은 표적 유전자의 발현의 감소를 초래하는, 방법.
213. 구현예 174 내지 구현예 212 중 어느 하나에 있어서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포인, 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 세포, 약제학적 조성물, 핵산, 벡터, 또는 방법.
214. 구현예 213에 있어서, 방법은 생체외(ex vivo)에서(예를 들어, 대상체 유래의 샘플에서) 또는 생체내(in vivo)에서(예를 들어, 발현 억제 시스템을 대상체에게 투여함으로써) 수행되는, 방법.
215. 구현예 209 내지 구현예 214 중 어느 하나에 있어서, 발현은, 발현 억제 시스템의 부재 하에서의 달리 유사한 세포에서의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되는, 방법.
216. 구현예 209 내지 구현예 214 중 어느 하나에 있어서, 발현은, 발현 억제 시스템과 접촉되지 않은 달리 유사한 세포에서의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되는, 방법.
217. 구현예 209 내지 구현예 216 중 어느 하나에 있어서, 발현은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 감소되는, 방법.
218. 구현예 215 내지 구현예 217 중 어느 하나에 있어서, 발현의 감소는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 RNA, 예를 들어 mRNA의 수준의 감소를 포함하는, 방법.
219. 구현예 215 내지 구현예 218 중 어느 하나에 있어서, 발현의 감소는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 수준의 감소를 포함하는, 방법.
220. 구현예 209 내지 구현예 219 중 어느 하나에 있어서, 제공하는 단계는 세포를, 표적 유전자를 포함하는 세포에 대한 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
221. 구현예 209 내지 구현예 220 중 어느 하나에 있어서, 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 제1 핵산 분자 상에 배치되고, 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 제2 핵산 분자 상에 배치되는, 방법.
222. 구현예 209 내지 구현예 221 중 어느 하나에 있어서, 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산과 동일한 핵산 분자 상에 배치되는, 방법.
223. 구현예 209 내지 구현예 222 중 어느 하나에 있어서, 투여하는 단계는 세포를 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자와 함께, 예를 들어 동시에 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
224. 구현예 209 내지 구현예 223 중 어느 하나에 있어서, 투여하는 단계는 세포를 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자와 별개로, 예를 들어 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
225. 구현예 209 내지 구현예 224 중 어느 하나에 있어서, 제공하는 단계는 세포를, 발현 억제 시스템, 또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터를 포함하는 소포(vesicle)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
226. 구현예 209 내지 구현예 225 중 어느 하나에 있어서, 제공하는 단계는 세포를, 발현 억제 시스템, 또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터를 포함하는 지질 나노입자(LNP)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
227. 구현예 209 내지 구현예 226 중 어느 하나에 있어서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함하고, 제공하는 단계는 제1 발현 리프레서를 투여하는 단계, 및 별개로 제2 발현 리프레서를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
228. 구현예 209 내지 구현예 227 중 어느 하나에 있어서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함하고, 제공하는 단계는 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서를 함께, 예를 들어 동시에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
229. 대상체에서 표적 유전자의 과발현과 연관된 병태를 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 204 또는 구현예 206 내지 구현예 208 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 폴리펩티드, 지질 나노입자, 반응 혼합물, 세포, 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하며,
상기 단계에 의해 대상체에서 표적 유전자의 과발현과 연관된 병태를 치료하는, 방법.
230. 대상체에서 표적 유전자의 오조절과 연관된 병태를 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 204 또는 구현예 206 내지 구현예 208 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 폴리펩티드, 지질 나노입자, 반응 혼합물, 세포, 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하며,
상기 단계에 의해 대상체에서 표적 유전자의 오조절과 연관된 병태를 치료하는, 방법.
231. 발현 억제 시스템을 포함하는 세포를 제조하는 방법으로서,
구현예 1 내지 구현예 201 또는 구현예 206 내지 구현예 208 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 폴리펩티드, 또는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및
세포를 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 발현 억제 시스템을 포함하는 세포를 제조하는, 방법.
232. 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법으로서,
구현예 67 내지 구현예 186, 구현예 207, 또는 구현예 208 중 어느 하나의 발현 억제 시스템의 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 제1 핵산을 제공하는 단계;
구현예 67 내지 구현예 186, 구현예 9207, 또는 구현예 208 중 어느 하나의 발현 억제 시스템의 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 제2 핵산을 제공하는 단계;
제1 핵산과 제2 핵산을 단일 핵산 분자로 조합하는(예를 들어, 라이게이션 또는 재조합하는) 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산을 제조하는, 방법.
233. 구현예 209 내지 구현예 228 또는 구현예 230 중 어느 하나의 방법에 의해 처리되거나 생성된 세포.
234. 구현예 233에 있어서, 세포는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 적어도 하나의 성분(예를 들어, 모든 성분)을 포함하지 않는, 세포.
235. 구현예 233 또는 구현예 234에 있어서, 표적 유전자의 발현은 구현예 209 내지 구현예 228 또는 구현예 230 중 어느 하나의 방법에 의해 접촉되지 않거나, 처리되지 않거나, 생성되지 않은 세포와 대비하여 감소되는, 세포.
236. 구현예 1 내지 구현예 208 중 어느 하나의 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 상기 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 하나 이상의 핵산, 벡터, 지질 나노입자, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 및 상기 조성물을 사용하여 세포 내의 유전자의 발현을 조절하기 위한, 예를 들어 감소시키기 위한 적어도 하나의 방법을 포함하는 한 세트의 설명서를 포함하는, 키트.
정의
앵커 서열: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "앵커 서열"은 앵커 서열-매개 연접부, 예를 들어 복합체를 형성하도록 충분히 결합하는 핵형성제(nucleating agent)에 의해 인식되는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 하나 이상의 CTCF 결합 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 유전자 코딩 영역 내에 위치되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 유전자간 영역 내에 위치되어 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 인핸서 또는 프로모터 중 어느 것에도 위치되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 임의의 전사 개시 부위로부터 적어도 400 bp, 적어도 450 bp, 적어도 500 bp, 적어도 550 bp, 적어도 600 bp, 적어도 650 bp, 적어도 700 bp, 적어도 750 bp, 적어도 800 bp, 적어도 850 bp, 적어도 900 bp, 적어도 950 bp, 또는 적어도 1kb 떨어져 위치되어 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 게놈 각인, 단일대립유전자 발현, 및/또는 단일대립유전자 후성유전학적 마크와 연관되어 있지 않은 영역 내에 위치되어 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 내인성 핵형성 폴리펩티드(예를 들어, CTCF)에 결합하는 기능, 제2 앵커 서열과 상호작용하여 앵커 서열-매개 연접부를 형성하는 기능, 또는 앵커 서열-매개 연접부 외부에 있는 인핸서에 대해 절연하는 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 기타 다른 앵커 서열(예를 들어, 상이한 상황에서 핵형성제(예를 들어, CTCF) 결합 모티프를 함유할 수 있는 서열)을 표적화하지 않고서, 특정 앵커 서열 또는 앵커 서열들을 특이적으로 표적화할 수 있는 기술이 제공되며; 그러한 표적화된 앵커 서열은 "표적 앵커 서열"로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 앵커 서열의 서열 및/또는 활성은 조절되는 반면, 표적화된 앵커 서열과 동일한 시스템 내에(예를 들어, 동일한 세포 내에 그리고/또는 일부 구현예에서는 동일한 핵산 분자(예를 들어, 동일한 염색체) 상에) 존재할 수 있는 하나 이상의 다른 앵커 서열의 서열 및/또는 활성은 조절되지 않는다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프에 인접한다.
앵커 서열-매개 연접부: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "앵커 서열-매개 연접부"는 DNA 내의 적어도 2개의 앵커 서열이, 이들 앵커 서열에 결합하여 앵커 서열들 사이의 공간적 근접 및 기능성 결합을 가능하게 하는 하나 이상의 폴리펩티드, 예컨대 핵형성 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 단백질 및/또는 핵산 실체(entity)(예컨대, RNA 또는 DNA)에 의한, 이들 적어도 2개의 앵커 서열의 물리적 상호작용 또는 결합을 통해 일어나고/나거나 유지되는 DNA 구조, 일부 경우에는 복합체를 지칭한다(예를 들어, 도 1 참조).
~ 와 연관된: 2개의 사건 또는 실체는, 그 용어가 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나의 존재, 수준, 형태 및/또는 기능이 나머지 다른 하나의 것과 상관 관계가 있다면, 서로 "연관되어" 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 특정 실체(예를 들어, 폴리펩티드, 유전자적 시그니처, 대사물, 미생물 등)는 그의 존재, 수준, 형태 및/또는 기능이 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐) 특정 질환, 장애, 또는 병태의 발병률 및/또는 감수성과 상관 관계가 있다면, 그러한 질환, 장애, 또는 병태과 연관되어 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 실체는, 그들이 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적 근접 상태에 있거나 이 상태를 유지한다면, 서로 물리적으로 "연관되어" 있다. 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 실체는 서로 공유적으로 연결되어 있으며; 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 실체는 서로 공유적으로 연결되어 있지 않고, 예를 들어 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기력(magnetism), 및 이들의 조합에 의해 비공유적으로 회합되어 있다. 일부 구현예에서, DNA 서열은, 핵산이 적어도 부분적으로 표적 게놈 또는 전사 복합체 내에 있고, DNA 서열 내의 유전자의 발현이 표적 게놈 또는 전사 복합체의 형성 또는 파괴에 의해 영향을 받을 때, 표적 게놈 또는 전사 복합체"와 연관되어" 있다.
도메인: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "도메인"은 실체의 섹션 또는 일부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, "도메인"은 실체의 특정 구조적 및/또는 기능적 특징과 연관되어 있으며, 이로써 도메인이 그의 모 실체의 나머지로부터 물리적으로 분리되어 있을 때, 그것은 특정 구조적 및/또는 기능적 특징을 실질적으로 또는 전체적으로 유지한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 도메인은, 그러한 (모) 실체로부터 분리되고 상이한 (수용자) 실체와 연결될 때, 모 실체에서 특징이 되게 한 하나 이상의 구조적 및/또는 기능적 특징을 수용자 실체 상에 실질적으로 유지하고/하거나 부여하는 실체의 일부분일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 도메인은 분자(예를 들어, 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산, 폴리펩티드 등)의 섹션 또는 일부분이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도메인은 폴리펩티드의 섹션이거나 이를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 도메인은 특정 구조 요소(예를 들어, 특정 아미노산 서열 또는 서열 모티프, 알파-나선 특성, 베타-시트 특성, 코일드-코일(coiled-coil) 특성, 랜덤 코일 특성 등)에 의해, 그리고/또는 특정 기능적 특징(예를 들어, 결합 활성, 효소 활성, 접힘 활성, 신호전달 활성 등)에 의해 특성화된다.
발현 리프레서: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 리프레서"는, 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키고, DNA 서열(예를 들어, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소와 연관된 DNA 서열)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 기능성을 갖는 작용물질(agent) 또는 실체를 지칭한다. 발현 리프레서는 적어도 하나의 DNA-표적화 모이어티 및 적어도 하나의 리프레서 도메인을 포함한다.
발현 억제 시스템: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 억제 시스템"은 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 복수의 발현 리프레서를 지칭한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서(또는 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산)는 단일 조성물, 혼합물, 또는 약제학적 조성물 내에 함께 존재한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서(또는 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산)는 별개의 조성물 또는 약제학적 조성물 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서는 동일한 세포 내에 동시에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서는 동일한 세포 내에 동시에 존재하지 않으며, 예를 들어 이들은 순차적으로 존재한다. 예를 들어, 제1 발현 리프레서가 제1 기간 동안 세포 내에 존재할 수 있고, 이어서 제2 발현 리프레서가 제2 기간 동안 세포 내에 존재할 수 있으며, 여기서 제1 기간 및 제2 기간은 중첩 또는 비중첩될 수 있다.
게놈 복합체 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "게놈 복합체"는 복수의 단백질 및/또는 기타 다른 성분(잠재적으로, 게놈 서열 요소를 포함함) 사이의 상호작용을 통해, 하나 이상의 염색체 상의 서로 이격된 2개의 게놈 서열 요소를 합친 복합체이다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 복합체의 하나 이상의 단백질 성분이 결합하는 앵커 서열이다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체는 앵커 서열-매개 연접부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 CTCF 결합 모티프, 프로모터 및/또는 인핸서일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 프로모터 및/또는 조절 부위(예를 들어, 인핸서) 중 적어도 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체 형성은 게놈 서열 요소(들)에서 그리고/또는 게놈 서열 요소(들)에 대한 단백질 성분(들) 중 하나 이상의 결합에 의해 핵형성된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 구현예에서 복합체의 형성을 통한 게놈 부위들의 공국재화(예를 들어, 연접)는 게놈 서열 요소(들)에서 또는 그 부근에서(일부 구현예에서는, 이들 사이를 포함함), DNA 토폴로지를 변경시킨다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체는 하나 이상의 루프를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체는 핵형성 폴리펩티드, 예컨대 CTCF 및/또는 코헤신(Cohesin)에 의해 핵형성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체는, 예를 들어 CTCF, 코헤신, 비-코딩 RNA(예를 들어, eRNA), 전사 기구 단백질(예를 들어, RNA 중합효소, 하나 이상의 전사 인자, 예를 들어 TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH 등으로 구성되는 군으로부터 선택된 것), 전사 조절인자(예를 들어, 메디에이터(Mediator), P300, 인핸서-결합 단백질, 리프레서-결합 단백질, 히스톤 변형제 등) 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체는 하나 이상의 폴리펩티드 성분 및/또는 하나 이상의 핵산 성분(예를 들어, 하나 이상의 RNA 성분)을 포함하며, 이들은, 일부 구현예에서, 복합체가 형성되지 않을 때 채택하지 않는 토폴로지 형상(예를 들어, 루프) 내로의 게놈 DNA의 신장(stretch)을 구속하도록 서로 그리고/또는 하나 이상의 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터 서열, 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열))과 상호작용할 수 있다.
핵산: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은, 그의 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 도입되거나 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 도입되거나 도입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 맥락으로부터 명백한 바와 같이, 일부 구현예에서 "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되는데, 펩티드 핵산은 당업계에 알려져 있고, 백본 내에 포스포디에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 가지며, 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 여겨진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합 대신에 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 핵산 내의 것들과 비교할 때 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 기능성 유전자 산물, 예컨대 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원로부터의 단리, 상보적 주형을 기반으로 한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내(in vitro)), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 상보체이거나 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
작동가능하게 연결된 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있게 하는 병치(juxtaposition)를 지칭한다. 기능성 요소, 예를 들어 유전자에 "작동가능하게 연결된" 전사 제어 요소는 기능성 요소, 예를 들어 유전자의 발현 및/또는 활성이 전사 제어 요소와 양립가능한 조건 하에서 달성되도록 하는 방식으로 연관되어 있다. 일부 구현예에서, "작동가능하게 연결된" 전사 제어 요소는 관심 코딩 요소, 예를 들어 유전자와 연속적이며(예를 들어, 공유적으로 연결되어 있으며); 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소는 관심 기능성 요소, 예를 들어 유전자에 대해 트랜스(trans)로 작용하거나 아니면 이로부터 떨어진 거리에서 작용한다. 일부 구현예에서, '작동가능하게 연결된'은 2개의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자 상에 포함되어 있음을 의미한다. 추가의 구현예에서, '작동가능하게 연결된'은 2개의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자 상에서, 예를 들어 1000, 500, 100, 50, 또는 10개의 서로의 염기쌍 이내에 서로 근접해 있거나 서로 직접 인접해 있음을 추가로 의미할 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드, 단백질 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해, 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기들로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대수에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이 용어는 당업계에서, 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드, 및 올리고머로 일반적으로 지칭되는 짧은 사슬, 및 당업계에서 단백질(이에는 많은 유형이 있음)로 일반적으로 지칭되는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다.
리프레서 도메인: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "리프레서 도메인"은 세포의 핵 내에 적절하게 국재화될 때 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 하나 이상의 기능성을 갖는 도메인을 지칭한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 폴리펩티드 및 핵산이거나 이를 포함한다. 리프레서 도메인과 연관된 기능성은, 예를 들어 유전자의 발현을 자극할 전사 인자의 동원을 차단하여, 표적 유전자의 발현에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 리프레서 도메인과 연관된 기능성은, 예를 들어 표적 유전자의 발현을 억제하는 염색체 토폴로지의 변화를 유도하는 후성유전학적 변형을 도입하거나, 그러한 후성유전학적 변형을 도입시키는 기타 다른 인자를 동원하여, 표적 유전자의 발현에 간접적으로 영향을 줄 수 있다.
특이적 결합: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 결합이 일어나게 될 환경에서, 가능한 결합 파트너들 사이를 구별하는 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 다른 잠재적인 표적들이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 결합제와 이의 파트너 사이의 회합도(degree of association)를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 구현예에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리도(degree of dissociation)를 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 이의 파트너와 또 다른 실체 사이의 대체 상호작용과 경쟁할 수 있는 결합제의 능력을 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 일정 범위의 농도에 걸쳐 그러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
실질적으로: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체적인 또는 거의 전체적인 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인 조건을 지칭한다. 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이, 설사 가능하다 하더라도, 거의 완료되지 않고/않거나 완료로 진행되지 않거나 절대적인 결과를 달성하거나 피하지 못한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는, 일부 구현예에서, 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재되어 있는 완료의 잠재적인 결여를 포착하는 데 사용될 수 있다.
증상이 감소된다: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "증상이 감소된다"는 특정 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상이 크기(예를 들어, 강도, 중증도 등) 및/또는 빈도가 감소될 때 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 증상의 개시의 지연은 그러한 증상의 빈도를 감소시키는 한 가지 형태인 것으로 여겨진다.
표적화: 작용물질 또는 실체는, 서로 접촉되게 한 조건 하에서 또 다른 표적화된 작용물질 또는 실체에 특이적으로 결합한다면, 본 개시내용에 따라 그러한 또 다른 작용물질 또는 실체를 "표적화"하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체(또는 이의 항원-결합 단편)는 그의 동종 에피토프 또는 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 특정 서열을 갖는 핵산은 실질적으로 상보적인 서열의 핵산을 표적화한다.
표적 유전자: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 유전자"는, 예를 들어 발현의 조절을 위해 표적화된 유전자를 의미한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 표적화된 게놈 복합체의 일부(예를 들어, 표적 게놈 복합체, 예를 들어 앵커 서열-매개 연접부 내부에 있는 것의 일부로서 게놈 서열의 적어도 일부를 갖는 유전자)이며, 이러한 게놈 복합체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 조절제에 의해 표적화된다. 일부 구현예에서, 조절은 표적 유전자의 발현의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)와 접촉시킴으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 세포, 예를 들어 대상체(예를 들어, 환자) 내의 세포에서 비정상적으로 발현된다(예를 들어, 과발현된다).
DNA-표적화 모이어티 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 발현 리프레서와 관련하여, 용어 "DNA-표적화 모이어티"는 DNA 서열(예를 들어, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소와 연관된 DNA 서열)에 특이적으로 결합하는 도메인을 의미한다.
치료제: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "치료제"는 대상체에게 투여될 때, 치료적 효과를 갖고/갖거나 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 이끌어내는 작용제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료제는 질환, 장애, 및/또는 병태를 경감시키고/시키거나, 호전시키고/시키거나, 완화하고/하거나, 억제하고/하거나, 예방하고/하거나, 이의 발병을 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생률을 감소시키는 데 사용될 수 있는 임의의 물질이다. 일부 구현예에서, 치료제는 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 포함한다.
치료적 유효량: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 치료 계획(therapeutic regimen)의 일부로서 투여될 때 원하는 생물학적 반응을 이끌어내는 물질(예를 들어, 치료제, 조성물, 및/또는 제형)의 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 물질의 치료적 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓거나 이에 취약한 대상체에게 투여될 때 그러한 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하고/하거나, 진단하고/하거나, 예방하고/하거나, 그의 발병을 지연시키기에 충분한 양이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질의 유효량은 원하는 생물학적 종점(들), 전달하려는 물질, 표적 세포(들) 또는 조직(들) 등과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하기 위한 제형 내의 화합물의 유효량은 그러한 질환, 장애, 및/또는 병태를 경감시키고/시키거나, 호전시키고/시키거나, 완화하고/하거나, 억제하고/하거나, 예방하고/하거나, 이의 발병을 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생률을 감소시키는 양이다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 단회 용량으로 투여되고; 일부 구현예에서는, 치료적 유효량을 전달하기 위해 다회 단위 용량이 요구된다.
본 발명의 구현예에 대한 하기의 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명할 목적으로, 도면에 현재 예시된 구현예가 나타나 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 나타낸 구현예의 정밀한 배열 및 수단으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 β2M의 전사 개시 부위 부근의 영역의 주요 특징을 보여주고 있는 게놈 브라우저(Genome Browser) 뷰(view)를 나타낸다. RNAseq(상위 레벨)는 β2M 유전자로부터의 mRNA 발현을 나타낸다. 앞서 기재된 양성 대조군(Cas9 표적화, GD-21547)은 녹색으로 표시되어 있다. β2M 프로모터 영역 내의 CpG 아일랜드에 청색 가이드(GD-28228 및 GD-28229)를 사용하여 Sp-dCas9-KRAB를 표적화하고, 주황색 가이드(GD-28171, GD-28172 및 GD-28173)를 사용하여 Sa-dCas9-MQ1을 표적화하였다(상위 레벨로부터 두 번째 레벨). 가이드를 (CpG 메틸화 트랙(하위 레벨)에 도시된) 프로모터 영역의 저메틸화(hypomethylation)에 기초하여 선택하였으며, 여기서 메틸화는 0부터 1까지(0부터 100%까지) 진행되며, 더 높은 메틸화는 적색 막대로 도시되어 있다. 각 막대는 CpG 부위를 나타낸다.
도 2는 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 HepG2 세포에서의 β-2-마이크로글로불린 발현(mRNA)의 % 변화의 그래프를 나타낸다. 제시된 β2M mRNA 수준은 비처리된 대조군(회색)과 대비하여 나타낸 값이다. 점은 생물학적 복제물을 나타낸다. 막대는 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 가이드 ID 번호는 x축 상에 제시되어 있다. dCas9로 처리된 샘플은 마젠타로; dCas9-KRAB는 녹색으로; sa-dCas9-MQ1은 담청색으로; dCas9-KRAB와 sa-dCas9-MQ1의 조합은 암청색으로 표시되어 있다. Cas9를 갖는 β2M-녹아웃(knockout) 양성 대조군은 주황색으로 표시되어 있다.
도 3은 72시간 후에 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 mRNA의 % 변화의 그래프(좌측), 및 72시간 후에 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 단백질 수준의 유세포측정 데이터의 그래프(우측)를 나타낸다. (좌측) 개별적으로의 dCas9-KRAB(녹색) 및 Sa-dCas9-MQ1(담청색) 이펙터 및 이들 이펙터의 조합(암청색)에 의한 처리는 비처리된 세포(회색) 및 dCas9로 처리된 세포(마젠타)와 대비하여 β2M mRNA의 감소를 초래한다. (우측) 유세포측정은 비처리된 세포 및 dCas9로 처리된 세포와 대비하여 dCas9-KRAB 및 Sa-dCas9-MQ1로 처리된 세포에서 감소된 β2M 면역형광을 갖는 집단을 보여주었다.
도 4는 22일 기간에 걸쳐 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 mRNA의 배수 변화(fold change)의 그래프를 나타낸다. 22일 기간에 걸쳐, 비형질감염된 세포(청색선) 및 dCas9 형질감염된 세포(적색선)는 β2M 발현을 변화시키지 않는 반면, dCas9-KRAB 형질감염된 세포(녹색선)는 형질감염 후 초기 일 수에서 β2M이 억제되었으며, 이때 최대 효과는 2일째에 나타났으며, 이러한 억제는 5일째 후에 상실된다. SadCas9-MQ1 형질감염된 세포(자색선)는 유의한 억제(4일째까지 최대 85%)를 보여주고, 이러한 억제는 유지되고, 이어서 도면에서 점선 바로 아래에 남아 있는 선으로 알 수 있는 바와 같이 서서히 상실된다. dCas9-KRAB + SadCas9-MQ1 조합 형질감염(주황색선)은 SadCas9 단독(자색선)에 대해 이미 관찰된 것보다 어떠한 추가의 억제도 제공하지 않았다.
도 5는 18일 기간에 걸쳐 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 mRNA의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 18일 기간에 걸쳐, 비처리된 세포는 β2M 발현을 변화시키지 않은 반면, dCas9-MQ1, dCas9-DNMT3a/3L(m), dCas9-DNMT3a/3L(hs), dCas9-DNMT1 및 dCas9-DNMT3B로 형질감염된 세포는 형질감염 후 유의한 β2M 억제를 보여준다.
도 6은 MYC 유전자의 상류에 위치된 CTCF 부위를 표적화하는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 MYC 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-DNMT3a/3L(h), dCas9-KRAB, FOG1-dCas9-FOG1, G9A-dCas9 + EZH2-dCas9, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+G9A-dCas9, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, 및 dCas9-MQ1+G9A-dCas9-KRAB로 처리된 세포가 48시간 및/또는 72시간 시점에서 MYC 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 7은 β2M 프로모터의 상류에 있는 영역을 표적화하는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 β2M 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1, dCas9-MQ1, FOG1-dCas9- FOG1, G9A-dCas9-KRAB, dCas9-DNMT3a/3L(h), G9A-dCas9, EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-KRAB, EZH2-dCas9-KRAB + dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1 + dCas9-HDAC8, dCas9-KRAB + FOG1-dCas9- FOG1, dCas9-MQ1 + G9A-dCas9-KRAB, G9A-dCas9 + EZH2-dCas9, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, 및 dCas9-MQ1 + dCas9-HDAC8로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 β2M 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 8은 HSPA1B 프로모터의 하류에 있는 영역을 표적화하는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 HSPA1B 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, EZH2-dCas9, dCas9-MQ1, dCas9-DNMT1, dCas9-DNMT3a/3L(h), dCas9-DNMT3a/3L(m), G9A-dCas9-KRAB, FOG1-dCas9-FOG1, G9A-dCas9, dCas9-KRAB, G9A-dCas9 + dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1 + G9A-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+EZH2-dCas9, G9A-dCas9+EZH2-dCas9, dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB, EZH2-dCas9 +dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1+dCas9-HDAC8, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, G9A-dCas9-KRAB+EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+G9A-dCas9 및 dCas9-MQ1+G9A-dCas9-KRAB로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 HSPA1B 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 9는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 GATA1 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1+dCas9-HDAC8, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, 및 G9A-dCas9+dCas9-HDAC8로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 GATA1 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 1은 β2M의 전사 개시 부위 부근의 영역의 주요 특징을 보여주고 있는 게놈 브라우저(Genome Browser) 뷰(view)를 나타낸다. RNAseq(상위 레벨)는 β2M 유전자로부터의 mRNA 발현을 나타낸다. 앞서 기재된 양성 대조군(Cas9 표적화, GD-21547)은 녹색으로 표시되어 있다. β2M 프로모터 영역 내의 CpG 아일랜드에 청색 가이드(GD-28228 및 GD-28229)를 사용하여 Sp-dCas9-KRAB를 표적화하고, 주황색 가이드(GD-28171, GD-28172 및 GD-28173)를 사용하여 Sa-dCas9-MQ1을 표적화하였다(상위 레벨로부터 두 번째 레벨). 가이드를 (CpG 메틸화 트랙(하위 레벨)에 도시된) 프로모터 영역의 저메틸화(hypomethylation)에 기초하여 선택하였으며, 여기서 메틸화는 0부터 1까지(0부터 100%까지) 진행되며, 더 높은 메틸화는 적색 막대로 도시되어 있다. 각 막대는 CpG 부위를 나타낸다.
도 2는 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 HepG2 세포에서의 β-2-마이크로글로불린 발현(mRNA)의 % 변화의 그래프를 나타낸다. 제시된 β2M mRNA 수준은 비처리된 대조군(회색)과 대비하여 나타낸 값이다. 점은 생물학적 복제물을 나타낸다. 막대는 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 가이드 ID 번호는 x축 상에 제시되어 있다. dCas9로 처리된 샘플은 마젠타로; dCas9-KRAB는 녹색으로; sa-dCas9-MQ1은 담청색으로; dCas9-KRAB와 sa-dCas9-MQ1의 조합은 암청색으로 표시되어 있다. Cas9를 갖는 β2M-녹아웃(knockout) 양성 대조군은 주황색으로 표시되어 있다.
도 3은 72시간 후에 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 mRNA의 % 변화의 그래프(좌측), 및 72시간 후에 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 단백질 수준의 유세포측정 데이터의 그래프(우측)를 나타낸다. (좌측) 개별적으로의 dCas9-KRAB(녹색) 및 Sa-dCas9-MQ1(담청색) 이펙터 및 이들 이펙터의 조합(암청색)에 의한 처리는 비처리된 세포(회색) 및 dCas9로 처리된 세포(마젠타)와 대비하여 β2M mRNA의 감소를 초래한다. (우측) 유세포측정은 비처리된 세포 및 dCas9로 처리된 세포와 대비하여 dCas9-KRAB 및 Sa-dCas9-MQ1로 처리된 세포에서 감소된 β2M 면역형광을 갖는 집단을 보여주었다.
도 4는 22일 기간에 걸쳐 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 mRNA의 배수 변화(fold change)의 그래프를 나타낸다. 22일 기간에 걸쳐, 비형질감염된 세포(청색선) 및 dCas9 형질감염된 세포(적색선)는 β2M 발현을 변화시키지 않는 반면, dCas9-KRAB 형질감염된 세포(녹색선)는 형질감염 후 초기 일 수에서 β2M이 억제되었으며, 이때 최대 효과는 2일째에 나타났으며, 이러한 억제는 5일째 후에 상실된다. SadCas9-MQ1 형질감염된 세포(자색선)는 유의한 억제(4일째까지 최대 85%)를 보여주고, 이러한 억제는 유지되고, 이어서 도면에서 점선 바로 아래에 남아 있는 선으로 알 수 있는 바와 같이 서서히 상실된다. dCas9-KRAB + SadCas9-MQ1 조합 형질감염(주황색선)은 SadCas9 단독(자색선)에 대해 이미 관찰된 것보다 어떠한 추가의 억제도 제공하지 않았다.
도 5는 18일 기간에 걸쳐 다양한 발현 리프레서 또는 대조군을 사용한 처리에 의한 β-2-마이크로글로불린 mRNA의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 18일 기간에 걸쳐, 비처리된 세포는 β2M 발현을 변화시키지 않은 반면, dCas9-MQ1, dCas9-DNMT3a/3L(m), dCas9-DNMT3a/3L(hs), dCas9-DNMT1 및 dCas9-DNMT3B로 형질감염된 세포는 형질감염 후 유의한 β2M 억제를 보여준다.
도 6은 MYC 유전자의 상류에 위치된 CTCF 부위를 표적화하는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 MYC 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-DNMT3a/3L(h), dCas9-KRAB, FOG1-dCas9-FOG1, G9A-dCas9 + EZH2-dCas9, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+G9A-dCas9, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, 및 dCas9-MQ1+G9A-dCas9-KRAB로 처리된 세포가 48시간 및/또는 72시간 시점에서 MYC 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 7은 β2M 프로모터의 상류에 있는 영역을 표적화하는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 β2M 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1, dCas9-MQ1, FOG1-dCas9- FOG1, G9A-dCas9-KRAB, dCas9-DNMT3a/3L(h), G9A-dCas9, EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-KRAB, EZH2-dCas9-KRAB + dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1 + dCas9-HDAC8, dCas9-KRAB + FOG1-dCas9- FOG1, dCas9-MQ1 + G9A-dCas9-KRAB, G9A-dCas9 + EZH2-dCas9, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, 및 dCas9-MQ1 + dCas9-HDAC8로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 β2M 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 8은 HSPA1B 프로모터의 하류에 있는 영역을 표적화하는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 HSPA1B 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, EZH2-dCas9, dCas9-MQ1, dCas9-DNMT1, dCas9-DNMT3a/3L(h), dCas9-DNMT3a/3L(m), G9A-dCas9-KRAB, FOG1-dCas9-FOG1, G9A-dCas9, dCas9-KRAB, G9A-dCas9 + dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1 + G9A-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+EZH2-dCas9, G9A-dCas9+EZH2-dCas9, dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB, EZH2-dCas9 +dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1+dCas9-HDAC8, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, G9A-dCas9-KRAB+EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+G9A-dCas9 및 dCas9-MQ1+G9A-dCas9-KRAB로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 HSPA1B 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
도 9는 상이한 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템으로 처리될 때 K-562 세포에서의 GATA1 발현의 배수 변화의 그래프를 나타낸다. 이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1+dCas9-HDAC8, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, 및 G9A-dCas9+dCas9-HDAC8로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 GATA1 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다.
본 개시내용은 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 사용을 통해 세포, 예를 들어 대상체 또는 환자의 세포 내의 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한, 예를 들어 감소시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-결합 모이어티 및 적어도 하나의 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 2개의 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 2개의 동일한 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 2개의 동일하지 않은 리프레서 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상의 발현 리프레서를 포함하며, 각각은 DNA-표적화 모이어티 및 적어도 하나의 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티들은 2개 이상의 상이한 DNA 서열을 표적화한다(예를 들어, 각 발현 리프레서는 상이한 DNA 서열을 표적화할 수 있다). 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 2개 이상의 상이한 DNA 서열을 표적화하는 발현 리프레서들을 포함하는 발현 억제 시스템의 사용은 단일 DNA 서열을 표적화하는 유사한 시스템에 비해 유리할 수 있는데, 그 이유는, 개별 발현 리프레서들이 그들의 표적 DNA 서열에 대한 결합을 위하여 서로 경쟁하지 않거나 서로 덜 경쟁할 것이며, 그럼으로써 리프레서 도메인들의 다양한 기능성의 월등한 국재화를 달성할 것이기 때문이다. 일부 구현예에서, 2개의 상이한 리프레서를 2개의 상이한 규정된 위치에 정밀하게 표적화하는, 예를 들어 제1 발현 리프레서는 전사 개시 부위의 상류에 있는 제1 위치에 표적화하고, 제2 발현 리프레서는 전사 개시 부위를 포함하는 제2 위치에 표적화하는 2개의 상이한 DNA-표적화 모이어티를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서들은 2개 이상의 상이한 리프레서 도메인을 포함한다(예를 들어, 각 발현 리프레서는 서로의 발현 리프레서로부터의 상이한 리프레서 도메인을 포함함). 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 2개 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서들을 포함하는 발현 억제 시스템의 사용은 2개 이상의 리프레서 도메인의 협력 작용과 연관된 표적 유전자의 발현에 대한 상승적 효과로 인해 단일 리프레서 도메인을 포함하는 유사한 시스템에 비해 유리할 수 있다.
발현 리프레서
본 개시내용의 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티 및 적어도 하나의 리프레서 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 1, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상의 리프레서 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 2개 이상의 상이한 DNA 서열(예를 들어, 1번째 및 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 9번째, 10번째, 11번째, 12번째, 및/또는 그 이상의 DNA 서열, 및 선택적으로 20번째, 19번째, 18번째, 17번째, 16번째, 15번째, 14번째, 13번째, 12번째, 11번째, 10번째, 9번째, 8번째, 6번째, 5번째, 4번째, 3번째, 또는 2번째 이하의 DNA 서열)을 표적화한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티 및 복수의 리프레서 도메인(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 리프레서 도메인(및 선택적으로, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 미만의 리프레서 도메인))을 포함하며, 각 리프레서 도메인은 하나 초과의 리프레서 도메인 중 또 다른 것과 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 제1 리프레서 도메인 및 제2 리프레서 도메인을 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 제1 리프레서 도메인 및 제2 리프레서 도메인을 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 동일하다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 제1 리프레서 도메인과 제2 리프레서 도메인 사이에 위치한다.
발현 리프레서는 복수의 리프레서 도메인을 포함할 수 있으며, 각 리프레서 도메인은 나머지 다른 리프레서 도메인과 상이한 기능성을 포함한다. 예를 들어, 발현 리프레서는 2개의 리프레서 도메인을 포함할 수 있으며, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸라제 기능성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 기능성을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현의 감소에 대해 서로 상보적인 기능성을 갖는 리프레서 도메인들을 포함하며, 이들 기능성은 함께, 발현의 억제를 가능하게 하고, 선택적으로, 개별적으로 존재할 때에는 발현을 억제하지 않거나 무시할 만한 정도로 억제한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 복수의 리프레서 도메인을 포함하며, 각 리프레서 도메인은 기타 다른 리프레서 도메인과 상보적이고, 각 리프레서 도메인은 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현의 감소에 대해 서로 상승작용하는 기능성을 갖는 리프레서 도메인들의 조합을 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서, 다수의 전사 활성화 후성유전학적 마커(예를 들어, 다수의 상이한 유형의 후성유전학적 마커 및/또는 주어진 유형의 더 광범위한 마킹)가 개별적으로, 단독으로의 개별적인 변형보다 더 효과적으로 발현을 함께 억제한다는 점에서(예를 들어, 발현의 더 큰 감소의 생성 및/또는 발현의 더 오래 지속된 감소), 게놈 유전자좌에 대한 후성유전학적 변형은 누적된다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 복수의 리프레서 도메인을 포함하며, 각 리프레서 도메인은 기타 다른 리프레서 도메인과 상승작용하며, 예를 들어 각 리프레서 도메인은 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, (서로 상승작용하는 복수의 리프레서 도메인을 포함하는) 발현 리프레서가 개별 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서보다 표적 유전자의 발현을 억제하는 데 더 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서는 개별 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서보다 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100×만큼 효과적이다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된 DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 펩티드 결합 및/또는 링커에 의해 연결되어, 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 위치한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는, 예를 들어 펩티드 결합 및/또는 링커에 의해 연결된 DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인을 포함하는, 융합 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 표적화 모이어티 및 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 표적화 모이어티와 복수의 이펙터 모이어티는, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된다(예를 들어, 표적화 모이어티와 복수의 이펙터 모이어티는 모두 일련의 공유 결합에 의해 연결되지만, 각 개별 모이어티는 기타 다른 모든 이펙터 모이어티와 공유 결합을 공유할 수 없다). 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 리프레서 도메인의 N-말단에 연결된 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 리프레서 도메인의 C-말단에 연결된 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 제1 리프레서 도메인의 C-말단에 연결되고 제2 리프레서 도메인의 N-말단에 연결된 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 리프레서 도메인의 N-말단에 배치된 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 리프레서 도메인의 C-말단에 배치된 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 비-펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 비-펩티드 결합에 의해 리프레서 도메인에 접합된다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티 및 복수의 리프레서 도메인을 포함하며, DNA-표적화 모이어티와 복수의 리프레서 도메인은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된다(예를 들어, DNA-표적화 모이어티와 복수의 리프레서 도메인은 모두 일련의 공유 결합에 의해 연결되지만, 각 개별 도메인 또는 모이어티는 기타 다른 모든 도메인 또는 모이어티와 공유 결합을 공유할 수 없다).
다른 구현예에서, 발현 리프레서는 공유적으로 연결되지 않은, 예를 들어 서로 비공유적으로 회합된 DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 리프레서 도메인에 비공유적으로 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하거나 그 반대로도 성립한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티 및 복수의 리프레서 도메인을 포함하며, DNA-표적화 모이어티와 적어도 하나의 리프레서 도메인은 공유적으로 연결되지 않으며, 예를 들어 서로 비공유적으로 회합되고, DNA-표적화 모이어티와 적어도 하나의 기타 다른 리프레서 도메인은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 리프레서는 표적 유전자에 근접해 있고/있거나 작동가능하게 연결된 게놈 서열 요소에 (예를 들어, DNA-표적화 모이어티를 통해) 결합한다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소에 대한 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자의 발현을 조절한다(예를 들어, 감소시킨다). 예를 들어, 게놈 서열 요소에 대한 전사 기구(transcription machinery)의 성분을 동원하거나 이의 동원을 억제하는 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자의 발현을 조절할(예를 들어, 감소시킬) 수 있다. 추가의 예로서, 효소 활성을 갖는 리프레서 도메인(예를 들어, 후성유전학적 변형 모이어티)을 포함하는 발현 리프레서의 결합은 리프레서 도메인의 국재화된 효소 활성을 통해 표적 유전자의 발현을 조절할(예를 들어, 감소시킬) 수 있다. 추가의 예로서, 게놈 서열 요소에 대한 발현 리프레서의 결합 및 발현 리프레서의 국재화된 효소 활성 둘 모두는 표적 유전자의 발현에 있어서의 생성되는 조절(예를 들어, 감소)에 기여할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 리프레서 도메인을 포함하며, 상기 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는, 리프레서 도메인이 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고, 제2 리프레서 도메인이 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하는 제1 리프레서 도메인, 및 리프레서 도메인이 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고, 제2 리프레서 도메인이 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하는 제2 리프레서 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티 및 리프레서 도메인을 포함하며, 리프레서 도메인, 예를 들어 EZH1, EZH2, G9A, SUV39H1, FOG1, SETDB1, 또는 SETDB2로부터 선택되는 리프레서 도메인의 C-말단 단부와 DNA-표적화 모이어티의 N-말단 단부는 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티 및 리프레서 도메인을 포함하며, 리프레서 도메인, 예를 들어 LSD1, HDAC8, MQ1, DNMT1, DNMT3a/3L, FOG1, 또는 KRAB로부터 선택되는 리프레서 도메인의 N-말단 단부와 DNA-표적화 모이어티의 C-말단 단부는 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티, 제1 리프레서 도메인 및 제2 리프레서 도메인을 포함하며, 제1 리프레서 도메인, 예를 들어 EZH1, EZH2, G9A, SUV39H1, FOG1, SETDB1, 또는 SETDB2로부터 선택되는 리프레서 도메인의 C-말단 단부와 DNA-표적화 모이어티의 N-말단 단부는 공유적으로 연결되고, DNA-표적화 모이어티의 C-말단 단부와 제2 리프레서 도메인, 예를 들어 LSD1, HDAC8, MQ1, DNMT1, DNMT3a/3L, FOG1, 또는 KRAB로부터 선택되는 리프레서 도메인의 N-말단 단부는 공유적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서는 조성물, 약제학적 조성물, 또는 혼합물 형태로 존재한다.
본 명세서의 구현예 중 몇몇은 복수의 발현 리프레서를 포함하는 시스템을 기재하지만, 본 출원은 또한, 예를 들어 단제(single agent)로서의 사용을 위하여, 또는 본 명세서에 명시될 필요가 없는 일반적인 제2 요법과의 병용물 형태로의 사용을 위하여 발현 리프레서들을 개별적으로 제공함이 이해된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 발현 억제 시스템의 일부이다.
발현 억제 시스템
본 개시내용의 발현 억제 시스템은 2개 이상의 발현 리프레서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 그 이상(그리고 선택적으로, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 이하)의 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상의 상이한 DNA 서열(예를 들어, 1번째 및 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 9번째, 10번째, 11번째, 12번째, 및/또는 그 이상의 DNA 서열, 및 선택적으로 20번째, 19번째, 18번째, 17번째, 16번째, 15번째, 14번째, 13번째, 12번째, 11번째, 10번째, 9번째, 8번째, 6번째, 5번째, 4번째, 3번째, 또는 2번째 이하의 DNA 서열)을 표적화한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 복수의 발현 리프레서를 포함하며, 복수의 발현 리프레서의 각 구성원은 복수의 발현 리프레서의 또 다른 구성원에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 제2 발현 리프레서에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용명의 발현 억제 시스템은 2개 이상의 발현 리프레서를 포함하며, 발현 리프레서들은 조성물, 약제학적 조성물, 또는 혼합물 형태로 함께 존재한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 발현 억제 시스템은 2개 이상의 발현 리프레서를 포함하며, 하나 이상의 발현 리프레서는 적어도 하나의 기타 다른 발현 리프레서와 혼합되지 않는다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 세포의 핵 내의 제1 발현 리프레서의 존재는 동일한 세포의 핵 내의 제2 발현 리프레서의 존재와 중첩되지 않으며, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서의 비중첩 존재를 통해 표적 유전자의 발현의 감소를 달성한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서들은 각각 상이한 DNA-표적화 모이어티를 포함한다(예를 들어, 제1, 제2, 제3, 또는 추가의 발현 리프레서는 각각 서로 상이한 DNA-표적화 모이어티를 포함한다). 예를 들어, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서는 제1 DNA-표적화 모이어티(예를 들어, Cas9 분자, TAL 이펙터 분자, 또는 Zn 핑거 도메인)를 포함하고, 제2 발현 리프레서는 제1 DNA-표적화 모이어티와 상이한 제2 DNA-표적화 모이어티(예를 들어, Cas9 분자, TAL 이펙터 분자, 또는 Zn 핑거 도메인)를 포함한다. 일부 구현예에서, '상이한'이란, 별개의 유형의 DNA-표적화 모이어티를 포함한다는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 제1 DNA-표적화 모이어티는 Cas9 분자를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, '상이한'이란, 동일한 유형의 DNA-표적화 모이어티의 별개의 변이체를 포함한다는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 제1 DNA-표적화 모이어티는 (예를 들어, 제1 종으로부터의) 제1 Cas9 분자를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 (예를 들어, 제2 종으로부터의) 제2 Cas9 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 발현 억제 시스템이 동일한 유형의 2개 이상의 DNA-표적화 모이어티, 예를 들어 2개 이상의 Cas9 분자를 포함할 때, DNA-표적화 모이어티들은 2개 이상의 상이한 DNA 서열에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 2개 이상의 Cas9 분자를 포함하는 발현 억제 시스템에서, 2개 이상의 Cas9 분자는, 이들 분자가 단지 이들의 표적 DNA 서열에 상응하는 gRNA에만 상당히 결합하도록(예를 들어, 또 다른 Cas9 분자의 표적에 상응하는 gRNA에는 별로 결합하지 않도록) 선택되거나 변경될 수 있다. 추가의 예에서, 2개 이상의 TAL 이펙터 분자를 포함하는 발현 억제 시스템에서, 2개 이상의 TAL 이펙터 분자는, 이들 분자가 단지 이들의 표적 DNA 서열에만 상당히 결합하도록(예를 들어, 또 다른 TAL 이펙터 분자의 표적 DNA 서열에는 별로 결합하지 않도록) 선택되거나 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 3개 이상의 발현 리프레서를 포함하며, 2개 이상의 발현 리프레서는 동일한 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 3개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 DNA-표적화 모이어티를 포함하고, 제3 발현 리프레서는 상이한 제2 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 추가로 예를 들어, 발현 억제 시스템은 4개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 DNA-표적화 모이어티를 포함하고, 제3 및 제4 발현 리프레서는 상이한 제2 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 추가로 예를 들어, 발현 억제 시스템은 5개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 DNA-표적화 모이어티를 포함하고, 제3 발현 리프레서 및 제4 발현 리프레서 둘 모두는 상이한 제2 DNA-표적화 모이어티를 포함하고, 제5 발현 리프레서는 상이한 제3 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 상기에 기재된 바와 같이, '상이한'이란, 상이한 유형의 DNA-표적화 모이어티를 포함한다는 것, 또는 동일한 유형의 DNA-표적화 모이어티의 별개의 변이체를 포함한다는 것을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서들은 각각 상이한 DNA 서열에 결합한다(예를 들어, 제1, 제2, 제3, 또는 추가의 발현 리프레서는 각각 서로 상이한 DNA 서열에 결합한다). 예를 들어, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제2 발현 리프레서는 제2 DNA 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, '상이한'이란, 하나의 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열과 또 다른 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열 사이에 동일하지 않은 적어도 하나의 위치가 존재한다는 것, 또는 하나의 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열 내에 존재하는 적어도 하나의 위치가 또 다른 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열 내에는 존재하지 않는다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 제1 발현 리프레서는 예시적인 제1 DNA 서열 5'-ATGATTGGATTTA-3'(서열번호 97)에 결합할 수 있고, 제2 발현 리프레서는 예시적인 제2 DNA 서열 5'-TGATTGGATTTAG-3'(서열번호 98)에 결합할 수 있으며; 상기 예에서, 예시적인 제1 DNA 서열과 예시적인 제2 DNA 서열은 상이하다. 추가로 예를 들어, 제1 발현 리프레서는 예시적인 제1 DNA 서열 5'-ATGATTgGATTTA-3' (서열번호 99)에 결합할 수 있고, 제2 발현 리프레서는 예시적인 제2 DNA 서열 5'-ATGATTcGATTTA-3' (서열번호 100)에 결합할 수 있으며; 상기 예에서, 예시적인 제1 DNA 서열과 예시적인 제2 DNA 서열은 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 DNA 서열은 제1 게놈 DNA 가닥 상에 위치할 수 있고, 제2 DNA 서열은 제2 게놈 DNA 가닥 상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 DNA 서열은 제2 DNA 서열과 동일한 게놈 DNA 가닥 상에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 3개 이상의 발현 리프레서를 포함하며, 2개 이상의 발현 리프레서는 동일한 DNA 서열에 결합한다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 3개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제3 발현 리프레서는 상이한 제2 DNA 서열에 결합한다. 추가로 예를 들어, 발현 억제 시스템은 4개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제3 발현 리프레서 및 제4 발현 리프레서 둘 모두는 제2 DNA 서열에 결합한다. 추가로 예를 들어, 발현 억제 시스템은 5개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제3 발현 리프레서 및 제4 발현 리프레서 둘 모두는 제2 DNA 서열에 결합하고, 제5 발현 리프레서는 제3 DNA 서열에 결합한다. 상기에 기재된 바와 같이, '상이한'이란, 하나의 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열과 또 다른 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열 사이에 동일하지 않은 적어도 하나의 위치가 존재한다는 것, 또는 하나의 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열 내에 존재하는 적어도 하나의 위치가 또 다른 발현 리프레서에 의해 결합된 DNA 서열 내에는 존재하지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개)의 발현 리프레서를 포함하며, 이들 발현 리프레서 중 복수개(예를 들어, 2개)는 상이한 DNA 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 그러한 구현예에서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 결합할 수 있고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제2 DNA 서열에 결합할 수 있으며, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열은 상이하고 중첩되지 않는다. 일부 그러한 구현예에서, 제1 DNA 서열은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 염기쌍(그리고 선택적으로, 500, 400, 300, 200, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 또는 50개 이하의 염기쌍)만큼 제2 DNA 서열로부터 분리되어 있다. 일부 그러한 구현예에서, 제1 DNA 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개 이하의 염기쌍(그리고 선택적으로, 0개의 염기쌍, 예를 들어 제1 서열과 제2 서열이 서로 직접 인접함)만큼 제2 DNA 서열로부터 분리되어 있다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서들은 각각 상이한 리프레서 도메인을 포함한다(예를 들어, 제1, 제2, 제3, 또는 추가의 발현 리프레서는 각각 서로 상이한 리프레서 도메인을 포함한다). 예를 들어, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서는 제1 리프레서 도메인(예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 기능성 단편을 포함함)을 포함하고, 제2 발현 리프레서는 제1 리프레서 도메인과 상이한 제2 리프레서 도메인(예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 기능성 단편을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, '상이한'이란, 별개의 유형의 리프레서 도메인을 포함한다는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제를 포함하거나, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 효소의 소분자 억제제를 포함한다. 다른 구현예에서, '상이한'이란, 동일한 유형의 리프레서 도메인의 별개의 변이체를 포함한다는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 제1 리프레서 도메인은 제1 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, 제1 부위 특이성 또는 아미노산 서열을 가짐)를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 제2 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, 제2 부위 특이성 또는 아미노산 서열을 가짐)를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하고, 제3 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 (i) 제1 리프레서 도메인 및 제3 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 (ii) 제2 리프레서 도메인 및 선택적으로 제4 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하고, 제3 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하고, 제4 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성(예를 들어, SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 이들 중 임의의 것의 SET 도메인)을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성(예를 들어, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성(예를 들어, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성(예를 들어, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 상이한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 동일한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 상이한 히스톤 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 동일한 히스톤 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 상이한 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 동일한 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 상이한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 동일한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 상이한 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 동일한 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 상이한 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 동일한 전사 리프레서 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 3개 이상의 발현 리프레서를 포함하며, 2개 이상의 발현 리프레서는 동일한 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 3개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 리프레서 도메인을 포함하고, 제3 발현 리프레서는 상이한 제2 리프레서 도메인을 포함한다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 4개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 리프레서 도메인을 포함하고, 제3 및 제4 발현 리프레서는 상이한 제2 리프레서 도메인을 포함한다. 추가로 예를 들어, 발현 억제 시스템은 5개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서 둘 모두는 제1 리프레서 도메인을 포함하고, 제3 발현 리프레서 및 제4 발현 리프레서 둘 모두는 상이한 제2 리프레서 도메인을 포함하고, 제5 발현 리프레서는 상이한 제3 리프레서 도메인을 포함한다. 상기에 기재된 바와 같이, '상이한'이란, 상이한 유형의 리프레서 도메인을 포함한다는 것 또는 동일한 유형의 리프레서 도메인의 별개의 변이체를 포함한다는 것을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성(예를 들어, SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 이들 중 임의의 것의 SET 도메인)을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성(예를 들어, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성(예를 들어, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성(예를 들어, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 상이한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 동일한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 상이한 히스톤 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 동일한 히스톤 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 상이한 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 동일한 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 상이한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 동일한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 상이한 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 동일한 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 상이한 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 리프레서 도메인은 전사 리프레서 활성을 포함하고, 나머지 다른 하나의 리프레서 도메인은 동일한 전사 리프레서 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 2개 이상의(예를 들어, 모든) 발현 리프레서는 서로 공유적으로 회합되지 않으며, 예를 들어 각 발현 리프레서는 임의의 다른 발현 리프레서와 공유적으로 회합되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 발현 억제 시스템의 2개 이상의 발현 리프레서는 서로 공유적으로 회합된다. 일 구현예에서, 발현 억제 시스템은, 예를 들어 융합 분자로서, 예를 들어 펩티드 결합 및 선택적으로 링커에 의해 연결된 융합 분자로서, 동일한 폴리펩티드 상에 배치된 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일 구현예에서, 발현 억제 시스템은 비-펩티드 결합에 의해 연결된, 예를 들어 서로 접합된 제1 발현 리프레서와 제2 발현 리프레서를 포함한다.
링커
본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템은 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 DNA-표적화 모이어티를 리프레서 도메인에, 리프레서 도메인을 또 다른 리프레서 도메인에, 또는 DNA-표적화 모이어티를 또 다른 DNA-표적화 모이어티에 연결할 수 있다. 링커는 화학 결합, 예를 들어 하나 이상의 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 공유적이다. 일부 구현예에서, 링커는 비공유적이다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 그러한 링커는 2 내지 30개, 5 내지 30개, 10 내지 30개, 15 내지 30개, 20 내지 30개, 25 내지 30개, 2 내지 25개, 5 내지 25개, 10 내지 25개, 15 내지 25개, 20 내지 25개, 2 내지 20개, 5 내지 20개, 10 내지 20개, 15 내지 20개, 2 내지 15개, 5 내지 15개, 10 내지 15개, 2 내지 10개, 5 내지 10개, 또는 2 내지 5개의 아미노산 길이, 또는 2, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 이상의 아미노산 길이(및 선택적으로 최대 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개의 아미노산 길이)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 제1 도메인 또는 모이어티를 제2 도메인 또는 모이어티로부터, 예를 들어 DNA-표적화 모이어티를 리프레서 도메인으로부터 이격시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 링커는, 예를 들어 2차 및 3차 구조의 분자 가요성을 제공하기 위하여, DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인 사이에 위치될 수 있다. 링커는 본 명세서에 기재된 가요성, 강성, 및/또는 절단성 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성을 제공하기 위하여 적어도 하나의 글리신, 알라닌, 및 세린 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 소수성 링커이며, 이에는, 예를 들어 음으로 하전된 설포네이트 기, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기가 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 조절제로부터 모이어티(예를 들어, 폴리펩티드)를 선택적으로 방출하도록 절단 가능하지만, 조기 절단을 방지하기에 충분히 안정적이어야 한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서의 하나 이상의 모이어티 및/또는 도메인은 하나 이상의 링커와 연결된다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인 사이에 위치된 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 DNA-표적화 모이어티와 제1 리프레서 도메인 사이에 위치된 제1 링커, 및 DNA-표적화 모이어티와 제2 리프레서 도메인 사이에 위치된 제2 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 링커와 제2 링커는 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 링커와 제2 링커는 상이할 수 있다.
당업자에 의해 알려진 바와 같이, 일반적으로 사용되는 가요성 링커는 Gly 및 Ser 잔기의 신장으로 주로 구성되는 서열을 갖는다("GS" 링커). 가요성 링커는 어느 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 하는 도메인/모이어티를 결합하는 데 유용할 수 있으며, 작은, 비극성(예를 들어, Gly) 또는 극성(예를 들어, Ser 또는 Thr) 아미노산을 포함할 수 있다. Ser 또는 Thr의 도입은 또한 물 분자와의 수소 결합을 형성함으로써 수용액 중에서의 링커의 안정성을 유지할 수 있으며, 이에 따라 링커와 모이어티/도메인 사이의 불리한 상호작용을 감소시킬 수 있다.
강성 링커는 도메인들/모이어티들 사이의 고정된 거리를 유지하는 데 그리고 그들의 독립적인 기능을 유지하는 데 유용하다. 강성 링커는 또한, 도메인들의 공간적 분리가 융합체 내의 하나 이상의 성분의 안정성 및 생물활성을 보존하는 데 중요할 때 유용할 수 있다. 강성 링커는 알파 나선-구조 또는 Pro-풍부 서열, (XP)n을 가질 수 있으며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 Ala, Lys, 또는 Glu를 지정한다.
절단성 링커는 생체내에서 유리 기능성 도메인을 방출할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 특정 조건 하에서, 예컨대 환원성 시약 또는 프로테아제의 존재 하에서 절단될 수 있다. 생체내 절단성 링커는 이황화물 결합의 가역적 성질을 이용할 수 있다. 한 예에는 2개의 Cys 잔기 사이의 트롬빈-감수성 서열(예를 들어, PRS)이 포함된다. CPRSC의 시험관내 트롬빈 처리는 트롬빈-감수성 서열의 절단을 초래하지만, 가역적 이황화물 결합은 온전하게 남아 있다. 그러한 링커는 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Chen et al. 2013. Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369]에 기재되어 있다. 융합체 내의 링커의 생체내 절단은 또한, 특정 조건 하에 생체내에서, 특정 세포 또는 조직에서 발현되거나 특정 세포 구획 내에 구속된 프로테아제에 의해 수행될 수 있다. 많은 프로테아제의 특이성은 구속된 구획 내에서 링커의 더 느린 절단을 제공한다.
본 명세서에 기재된 링커에 사용하기에 적합한 분자의 예에는 음으로 하전된 설포네이트 기; 지질, 예컨대 폴리 (--CH2--) 탄화수소 사슬, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기, 이의 불포화 변이체, 이의 하이드록실화 변이체, 이의 아미드화 또는 다른 방식으로의 N-함유 변이체; 비탄소 링커; 탄수화물 링커; 포스포디에스테르 링커, 또는 발현 리프레서의 2개 이상의 성분을 공유적으로 연결할 수 있는 기타 다른 분자가 포함된다. 비공유성 링커가 또한 포함되며, 이에는, 예를 들어 폴리펩티드가, 예를 들어, 류신, 이소류신, 발린, 또는 아마도 또한 알라닌, 페닐알라닌, 또는 심지어 티로신, 메티오닌, 글리신, 또는 기타 다른 소수성 잔기가 풍부한 일련의 잔기와 같은 폴리펩티드의 소수성 영역 또는 폴리펩티드의 소수성 확장을 통해 연결되는 소수성 지질 소구체가 있다. 발현 리프레서의 성분들은 전하-기반 화학을 사용하여 연결될 수 있으며, 이로써 발현 리프레서의 양으로 하전된 성분이 또 다른 성분의 음전하에 연결된다.
핵산
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, DNA-표적화 모이어티 및/또는 리프레서 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 당업자는 RNA의 핵산 서열은, 통상적으로 티민(T)이 우라실(U)로 대체된 것을 제외하고는, 상응하는 DNA 서열과 동일함을 인식하고 있다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(예를 들어, A, T, G, C를 포함함)로 표현될 때, 본 개시내용은 또한 "U"가 "T"를 대체하는 상응하는 RNA 서열(예를 들어, A, U, G, C를 포함함)을 제공함이 이해될 것이다. 폴리뉴클레오티드 서열을 기재하기 위해 본 명세서에서는 통상적인 표기가 사용된다: 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측단은 5'-단부이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 우측 방향은 5'-방향으로 지칭된다.
유전자 코드의 축퇴로 인해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 DNA-표적화 모이어티 및/또는 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서를 인코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있으며, 이들 중 일부는 본 명세서에 개시된 핵산 서열과 유사성, 예를 들어 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, 및 CGU 모두는 아미노산 아르기닌을 인코딩한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 지정된 본 개시내용의 핵산 분자 내의 모든 위치에서, 그러한 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고서 상기에 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티 및/또는 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산 서열은 포유동물, 예를 들어 인간에서 코돈 사용빈도에 따라 최적화된, 코돈-최적화된 코딩 영역의 일부 또는 전부일 수 있다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티 및/또는 하나 이상의 리프레서 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 단백질 발현을 증가시키고/시키거나 단백질 발현의 지속시간을 증가시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 핵산 서열에 의해 생성되는 단백질은 코돈 최적화되지 않은 핵산 서열에 의해 인코딩될 때의 단백질의 수준과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 높다.
일 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 예를 들어 리프레서 도메인은 MQ1, 예를 들어 박테리아 MQ1, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1은 스피로플라스마 모노비아이(Spiroplasma monobiae) MQ1, 예를 들어 균주 ATCC 33825로부터 유래되고/되거나 Uniprot ID P15840에 상응하는 MQ1이다. 일부 구현예에서, MQ1 리프레서 도메인은 서열번호 47의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 47의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, MQ1은 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터 도메인은 서열번호 90 또는 57, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 사용하기 위한 MQ1은, 예를 들어 야생형 MQ1(예를 들어, 서열번호 90 또는 서열번호 57)과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 야생형 MQ1과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 K297P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 N299C 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 E301Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 Q147L 치환을 포함한다(예를 들어, 그리고 야생형 MQ1과 대비하여 감소된 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는다). 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 K297P, N299C, 및 E301Y 치환을 포함한다(예를 들어, 그리고 야생형 MQ1과 대비하여 감소된 DNA 결합 친화도를 갖는다). 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 Q147L, K297P, N299C, 및 E301Y 치환을 포함한다(예를 들어, 그리고 야생형 MQ1과 대비하여 감소된 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성 및 DNA 결합 친화도를 갖는다). 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 모이어티/도메인을 또 다른 모이어티/도메인에 연결시키는, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 dCas9 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, MQ1이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인, 및, 예를 들어 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 dCas9 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 표적 유전자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 유전자)의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자 또는 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 MQ1, 예를 들어 박테리아 MQ1, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이펙터 모이어티는 크루펠-연관 박스(Krueppel-associated box, KRAB), 예를 들어 NP_056209.2에 따른 것, 또는 NM_015394.5에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, KRAB는 합성 KRAB 작제물이다. 일부 구현예에서, KRAB는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, KRAB 리프레서 도메인은 서열번호 51의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 51의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 KRAB는, 예를 들어 서열번호 61의 KRAB 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, KRAB 변이체는 서열번호 61과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, KRAB이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 서열번호 61의 KRAB 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 리프레서 도메인은 DNMT1, 예를 들어 인간 DNMT1, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT1은 인간 DNMT1, 예를 들어 Gene ID 1786에 상응하는 것, 예를 들어 UniPort ID P26358.2에 상응하는 것이다. 일부 구현예에서, DNMT1은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 리프레서 도메인은 서열번호 58에 따른 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, DNMT1은 서열번호 48의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 48의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 DNMT1은, 예를 들어 서열번호 58의 DNMT 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 야생형 DNMT1과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, DNMT1이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 DNMT1, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 리프레서 도메인은 DNMT3a/3L 복합체, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 융합 작제물이다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 DNMT3A, 예를 들어 인간 DNMT3A, 예를 들어 NP_072046.2에 따른 것 또는 NM_022552.4에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 마우스 DNMT3A, 예를 들어 NP_031898에 따른 것 또는 NM_007872에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 인간 DNMT3L, 예를 들어 NP_787063.1에 따른 것 또는 NM_175867.3에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 마우스 DNMT3L, 예를 들어 NP_001075164에 따른 것 또는 NM_001081695에 의해 인코딩된 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L은 서열번호 59 또는 60의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 리프레서 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 60, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, DNMT3a/3L은 서열번호 49 또는 서열번호 50의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 49 또는 50의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 DNMT3a/3L은, 예를 들어 서열번호 59 또는 서열번호 60의 DNMT3a/3L과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 변이체는 서열번호 59 또는 서열번호 60과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, DNMT3a/3L이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 DNMT3a/3L, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 리프레서 도메인은 DNMT3b, 예를 들어 인간 DNMT3b, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3b는 인간 DNMT3b, 예를 들어, NP_008823.1 또는 AOX21819.1에 따른 것 또는 NM_006892.4 또는 KX447429에 의해 인코딩된 단백질이다. 일부 구현예에서, DNMT3b는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 리프레서 도메인은 서열번호 85, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
DNMT3b
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이펙터 모이어티는 G9A, 예를 들어 NP_001350618.1에 따른 것, 또는 NM_001363689.1에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, G9A는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, G9A 리프레서 도메인은 서열번호 52의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 G9A는, 예를 들어 서열번호 62의 G9A 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, G9A 변이체는 서열번호 62와 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, G9A이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 서열번호 62의 G9A 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이펙터 모이어티는 HDAC8, 예를 들어 NP_001159890에 따른 것, 또는 NM_001166418에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC8은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, HDAC8 리프레서 도메인은 서열번호 53의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 53의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 HDAC8은, 예를 들어 서열번호 63의 HDAC8 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, HDAC8 변이체는 서열번호 63과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, HDAC8이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 서열번호 63의 HDAC8 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이펙터 모이어티는 LSD1, 예를 들어 NP_055828.2에 따른 것, 또는 NM_015013.4에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, KRAB는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, LSD1 리프레서 도메인은 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 54의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 LSD1은, 예를 들어 서열번호 64의 LSD1 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, LSD1 변이체는 서열번호 64와 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, LSD1이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 서열번호 64의 LSD1 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이펙터 모이어티는 EZH2, 예를 들어 NP-004447.2에 따른 것, 또는 NM_004456.5에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, EZH2는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, EZH2 리프레서 도메인은 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 55의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 EZH2는, 예를 들어 서열번호 65의 EZH2 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, EZH2 변이체는 서열번호 65와 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, EZH2이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 서열번호 65의 EZH2 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이펙터 모이어티는 FOG1, 예를 들어 NP_722520.2에 따른 것, 또는 NM_153813.3에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, FOG1은 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, FOG1 리프레서 도메인은 서열번호 56의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 56의 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 발현 리프레서에 사용하기 위한 FOG1은, 예를 들어 서열번호 66의 FOG1 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, FOG1 변이체는 서열번호 66과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, FOG1이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인 및 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 본 명세서에 기재된 추가의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 발현 리프레서는, 예를 들어 발현 억제 시스템 대신에, 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 발현 리프레서를 포함하며, 제1 발현 리프레서는 서열번호 66의 FOG1 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 기술은 표적 유전자를 특이적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 것으로 기재된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 발암유전자, 종양 억제인자, 또는 MYC 오조절 장애 관련 유전자이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 MYC이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 MHC 클래스 I 분자, 예를 들어 β2M이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 열충격 단백질, 예를 들어 HSPA1B를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 전사 인자, 예를 들어 GATA1이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 기술은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 대상체에게, 예를 들어 대상체의 세포 또는 조직의 핵에 전달하는 방법을 포함하는데, 이는, 그러한 모이어티를 융합 분자의 일부로서의 DNA-표적화 모이어티에 연결함으로써 수행된다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 핵 국재화 서열(NLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 NLS, 예를 들어 N-말단에 있는 SV40 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 NLS, 예를 들어 C-말단에 있는 뉴클레오플라스민 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 N-말단에 있는 제1 NLS 및 C-말단에 있는 제2 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 NLS와 제2 NLS는 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 NLS와 제2 NLS는 상이한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 SV40 NLS를 포함하며, 예를 들어 발현 리프레서는 PKKKRK(서열번호 86)에 따른 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 에피토프 태그, 예를 들어 HA 태그: YPYDVPDYA(서열번호 80)를 포함한다. 예를 들어, 발현 리프레서는 에피토프 태그의 2개의 카피를 포함할 수 있다.
에피토프 태그가 많은 연구 상황에서 유용하지만, 치료적 상황에서는 에피토프 태그를 생략하는 것이 때때로 바람직하다. 따라서, 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 에피토프 태그가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 본 명세서에 제공된 서열(또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열)을 포함하지만, 서열번호 80의 HA 태그가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 본 명세서에 제공된 서열(또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열)을 포함하지만, 서열번호 80의 HA 태그를 인코딩하는 영역이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 뉴클레오플라스민 NLS를 포함하며, 예를 들어 발현 리프레서는 KRPAATKKAGQAKKK(서열번호 87)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 NLS를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 에피토프 태그를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서 발현 리프레서는 HA 태그를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 80에 따른 HA 태그 서열을 포함하지 않는다.
DNA-표적화 모이어티
DNA-표적화 모이어티는 DNA 서열, 예를 들어 표적 유전자와 연관된 DNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 표적 유전자 내의, 이에 근접한, 그리고/또는 이에 작동가능하게 연결된 게놈 서열 요소(예를 들어, 프로모터, TSS, 또는 앵커 서열)에 결합한다. DNA 서열에 특이적으로 결합하는 임의의 분자 또는 화합물이 DNA-표적화 모이어티로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 성분을 표적화하고, 예를 들어 이에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)을 표적화하고, 예를 들어 이에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자, 또는 표적 유전자의 일부를 표적화하고, 예를 들어 이에 결합한다. DNA-표적화 모이어티의 표적은 이의 표적화된 성분으로서 지칭될 수 있다. 표적화된 성분은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 임의의 게놈 서열 요소, 또는 표적 유전자 그 자체일 수 있으며, 이에는 프로모터, 인핸서, 앵커 서열, 엑손, 인트론, UTR 인코딩 서열, 스플라이스 부위, 또는 전사 개시 부위가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 하나 이상의 표적 앵커 서열(예를 들어, 세포 내의 것)에 특이적으로 결합하고, 비표적화된 앵커 서열(예를 들어, 동일한 세포 내의 것)에는 특이적으로 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, TAL 이펙터 분자, Zn 핑거 도메인, 펩티드 핵산(PNA) 또는 핵산 분자이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 하나의 DNA-표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 복수의 발현 리프레서를 포함하며, 복수의 발현 리프레서의 각 구성원은 DNA-표적화 모이어티를 포함하며, 각 DNA-표적화 모이어티는 또 다른 DNA-표적화 모이어티에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제2 DNA-표적화 모이어티에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 DNA-표적화 모이어티는 또 다른 제1 DNA-표적화 모이어티에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 또 다른 제2 DNA-표적화 모이어티에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 DNA-표적화 모이어티는 단량체성 상태, 예를 들어 비이량체성 상태에서 기능성이다(예를 들어, DNA 서열에 결합한다).
일부 구현예에서, 표적화된 성분에 대한 표적화 모이어티의 결합은 또 다른 전사 인자, 게놈 복합체 성분, 또는 게놈 서열 요소에 대한 표적화된 성분의 결합 친화도를 감소시킨다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 또는 0.001 nM 이하의 KD(그리고 선택적으로, 적어도 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 또는 0.001 nM의 KD)로 그의 표적 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 0.001 nM 내지 500 nM, 예를 들어 0.1 nM 내지 5 nM, 예를 들어 약 0.5 nM의 KD로 그의 표적 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 100,000 nM의 KD로 비표적 서열에 결합한다(그리고 선택적으로, 비표적 서열에 별로 결합하지 않는다). 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 비표적 서열에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적화된 성분, 예를 들어 표적 유전자의 프로모터에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 표적화된 성분에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서의 DNA-표적화 모이어티는 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 또는 20개 이하의 뉴클레오티드(그리고 선택적으로, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90개의 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 분자의 발현 리프레서 또는 리프레서 도메인은 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 또는 100개 이하의 아미노산(그리고 선택적으로, 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 또는 1900개의 아미노산)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 분자의 발현 리프레서 또는 이펙터 모이어티는 100 내지 2000개, 100 내지 1900개, 100 내지 1800개, 100 내지 1700개, 100 내지 1600개, 100 내지 1500개, 100 내지 1400개, 100 내지 1300개, 100 내지 1200개, 100 내지 1100개, 100 내지 1000개, 100 내지 900개, 100 내지 800개, 100 내지 700개, 100 내지 600개, 100 내지 500개, 100 내지 400개, 100 내지 300개, 100 내지 200개, 200 내지 2000개, 200 내지 1900개, 200 내지 1800개, 200 내지 1700개, 200 내지 1600개, 200 내지 1500개, 200 내지 1400개, 200 내지 1300개, 200 내지 1200개, 200 내지 1100개, 200 내지 1000개, 200 내지 900개, 200 내지 800개, 200 내지 700개, 200 내지 600개, 200 내지 500개, 200 내지 400개, 200 내지 300개, 300 내지 2000개, 300 내지 1900개, 300 내지 1800개, 300 내지 1700개, 300 내지 1600개, 300 내지 1500개, 300 내지 1400개, 300 내지 1300개, 300 내지 1200개, 300 내지 1100개, 300 내지 1000개, 300 내지 900개, 300 내지 800개, 300 내지 700개, 300 내지 600개, 300 내지 500개, 300 내지 400개, 400 내지 2000개, 400 내지 1900개, 400 내지 1800개, 400 내지 1700개, 400 내지 1600개, 400 내지 1500개, 400 내지 1400개, 400 내지 1300개, 400 내지 1200개, 400 내지 1100개, 400 내지 1000개, 400 내지 900개, 400 내지 800개, 400 내지 700개, 400 내지 600개, 400 내지 500개, 500 내지 2000개, 500 내지 1900개, 500 내지 1800개, 500 내지 1700개, 500 내지 1600개, 500 내지 1500개, 500 내지 1400개, 500 내지 1300개, 500 내지 1200개, 500 내지 1100개, 500 내지 1000개, 500 내지 900개, 500 내지 800개, 500 내지 700개, 500 내지 600개, 600 내지 2000개, 600 내지 1900개, 600 내지 1800개, 600 내지 1700개, 600 내지 1600개, 600 내지 1500개, 600 내지 1400개, 600 내지 1300개, 600 내지 1200개, 600 내지 1100개, 600 내지 1000개, 600 내지 900개, 600 내지 800개, 600 내지 700개, 700 내지 2000개, 700 내지 1900개, 700 내지 1800개, 700 내지 1700개, 700 내지 1600개, 700 내지 1500개, 700 내지 1400개, 700 내지 1300개, 700 내지 1200개, 700 내지 1100개, 700 내지 1000개, 700 내지 900개, 700 내지 800개, 800 내지 2000개, 800 내지 1900개, 800 내지 1800개, 800 내지 1700개, 800 내지 1600개, 800 내지 1500개, 800 내지 1400개, 800 내지 1300개, 800 내지 1200개, 800 내지 1100개, 800 내지 1000개, 800 내지 900개, 900 내지 2000개, 900 내지 1900개, 900 내지 1800개, 900 내지 1700개, 900 내지 1600개, 900 내지 1500개, 900 내지 1400개, 900 내지 1300개, 900 내지 1200개, 900 내지 1100개, 900 내지 1000개, 1000 내지 2000개, 1000 내지 1900개, 1000 내지 1800개, 1000 내지 1700개, 1000 내지 1600개, 1000 내지 1500개, 1000 내지 1400개, 1000 내지 1300개, 1000 내지 1200개, 1000 내지 1100개, 1100 내지 2000개, 1100 내지 1900개, 1100 내지 1800개, 1100 내지 1700개, 1100 내지 1600개, 1100 내지 1500개, 1100 내지 1400개, 1100 내지 1300개, 1100 내지 1200개, 1200 내지 2000개, 1200 내지 1900개, 1200 내지 1800개, 1200 내지 1700개, 1200 내지 1600개, 1200 내지 1500개, 1200 내지 1400개, 1200 내지 1300개, 1300 내지 2000개, 1300 내지 1900개, 1300 내지 1800개, 1300 내지 1700개, 1300 내지 1600개, 1300 내지 1500개, 1300 내지 1400개, 1400 내지 2000개, 1400 내지 1900개, 1400 내지 1800개, 1400 내지 1700개, 1400 내지 1600개, 1400 내지 1500개, 1500 내지 2000개, 1500 내지 1900개, 1500 내지 1800개, 1500 내지 1700개, 1500 내지 1600개, 1600 내지 2000개, 1600 내지 1900개, 1600 내지 1800개, 1600 내지 1700개, 1700 내지 2000개, 1700 내지 1900개, 1700 내지 1800개, 1800 내지 2000개, 1800 내지 1900개, 또는 1900 내지 2000개의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템은 핵산, 예를 들어 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, 핵산은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 50% 초과의 리보뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 펩티드 핵산이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합 대신에 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3 -메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5 -프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 핵산 내의 것들과 비교할 때 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 기능성 유전자 산물, 예컨대 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원로부터의 단리, 상보적 주형을 기반으로 한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산은 약 2 내지 약 5000 nt, 약 10 내지 약 100 nt, 약 50 내지 약 150 nt, 약 100 내지 약 200 nt, 약 150 내지 약 250 nt, 약 200 내지 약 300 nt, 약 250 내지 약 350 nt, 약 300 내지 약 500 nt, 약 10 내지 약 1000 nt, 약 50 내지 약 1000 nt, 약 100 내지 약 1000 nt, 약 1000 내지 약 2000 nt, 약 2000 내지 약 3000 nt, 약 3000 내지 약 4000 nt, 약 4000 내지 약 5000 nt, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 상보체이거나 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 핵산이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 모이어티 내에 포함될 수 있는 핵산은 DNA, RNA, 및/또는 인공 또는 합성 핵산 또는 핵산 유사체 또는 모방체이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 펩티드 핵산(PNA), 펩티드-핵산 믹스머(mixmer), 펩티드- 올리고뉴클레오티드 접합체, 고정된 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 기타 다른 RNAi 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비코딩 RNA를 표적화하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화된 게놈 복합체와 연관된 특정 유전자의 발현 산물을 표적화하는 것들) 등 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 변형된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 화학적 변형, 예컨대 백본 결합, 당 분자, 및/또는 핵산 염기를 변경시키는 변형) 및/또는 인공 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 게놈 DNA, cDNA, 펩티드 핵산(PNA) 또는 펩티드 올리고뉴클레오티드 접합체, 고정된 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 폴리아미드, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드, 변형된 DNA, 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드, tRNA, mRNA, rRNA, 변형된 RNA, miRNA, gRNA, 및 siRNA 또는 기타 다른 RNA 또는 DNA 분자를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연 발생 DNA 또는 RNA 잔기가 아닌 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있고/있거나, 포스포디에스테르 결합이 아닌(예를 들어, 이를 테면 포스포로티오에이트 결합 등일 수 있는) 하나 이상의 결합을 포함할 수 있고/있거나, 예를 들어 2'O 변형, 예컨대 2'-OMeP와 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 합성 핵산을 제조하는 데 유용한 다양한 핵산 구조가 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, WO2017/062862l 및 WO2014/012081 참조), 당업자는 이들이 본 개시내용에 따라 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드, 예를 들어 퓨린 또는 피리미딘, 예를 들어 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 및 우라실에 추가하여 또는 그에 대한 대안으로서 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 뉴클레오시드 유사체는 5-플루오로우라실; 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 4-메틸벤즈이미다졸, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 디하이드로우리딘, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린, 3-니트로피롤, 이노신, 티오우리딘, 퀘우오신, 위오신, 디아미노퓨린, 이소구아닌, 이소시토신, 디아미노피리미딘, 2,4-디플루오로톨루엔, 이소퀴놀린, 피롤로[2,3-β]피리딘과 같은 뉴클레오시드 유사체, 및 퓨린 또는 피리미딘 측쇄와 염기쌍을 형성할 수 있는 임의의 기타 다른 물질을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
CRISPR/Cas
도메인
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함한다. CRISPR/Cas 분자는 클러스터화된 규칙적으로 사이 공간을 둔 짧은 회문성 반복(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 시스템에 관여하는 단백질, 예를 들어 Cas 단백질, 및 선택적으로, 가이드 RNA, 예를 들어 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 분자에 의해 포함된 gRNA는 CRISPR/Cas 단백질에 의해 비공유적으로 결합된다.
CRISPR 시스템은 원래 박테리아 및 고세균에서 발견된 적응 방어 시스템이다. CRISPR 시스템은 CRISPR-연관 또는 "Cas" 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 지칭되는 RNA-유도 뉴클레아제를 사용하여 외래 DNA를 절단한다. 예를 들어, 통상적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 엔도뉴클레아제는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 서열을 표적화하는 서열-특이적, 비-코딩 "가이드 RNA"에 의해 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열-편집할 게놈 내의 부위)로 지시된다. CRISPR 시스템의 3가지 클래스(I 내지 III)가 확인되었다. 클래스 II CRISPR 시스템은 (다수의 Cas 단백질이 아닌) 단일 Cas 엔도뉴클레아제를 사용한다. 하나의 클래스 II CRISPR 시스템은 Cas9와 같은 II형 Cas 엔도뉴클레아제, CRISPR RNA("crRNA"), 및 트랜스-활성화 crRNA("tracrRNA")를 포함한다. crRNA는 통상적으로 표적 DNA 서열에 상응하는 약 20-뉴클레오티드 RNA 서열인 "가이드 RNA"를 함유한다. crRNA는 또한 tracrRNA에 결합하여 RNase III에 의해 절단되는 부분적으로 이중 가닥인 구조를 형성하여 crRNA/tracrRNA 하이브리드를 생성하는 영역을 함유한다. 이어서 crRNA/tracrRNA 하이브리드는 Cas9 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 인식하고 절단하도록 지시한다. 표적 DNA 서열은 일반적으로 주어진 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 "프로토스페이서 인접 모티프"(protospacer adjacent motif: "PAM")에 인접하여야 하지만; PAM 서열은 주어진 게놈 전체에 걸쳐 나타난다. 다양한 원핵생물 종으로부터 확인된 CRISPR 엔도뉴클레아제는 고유한 PAM 서열 요건을 가지며; PAM 서열의 예로는 5'-NGG(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), 5'-NNAGAA(스트렙토코커스 써모필루스(thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(스트렙토코커스 써모필루스 CRISPR3), 및 5'-NNNGATT(네이세리아 메닝지디티스(Neisseria meningiditis))가 있다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-NGG와 회합되며, PAM 부위로부터(5'로부터) 3개 뉴클레오티드 상류의 위치에서 표적 DNA의 평활 말단(blunt-end) 절단을 수행한다. 또 다른 클래스 II CRISPR 시스템은, Cas9보다 작은 V 형 엔도뉴클레아제 Cpf1를 포함하며, 예에는 AsCpf1((아시다미노코커스(Acidaminococcus) 종 유래) 및 LbCpf1((라크노스피라세(Lachnospiraceae) 종 유래)이 포함된다. Cpf1-연관 CRISPR 어레이는 tracrRNA의 필요 없이 성숙한 crRNA로 처리되며; 즉, Cpf1 시스템은 표적 DNA 서열을 절단하기 위해 Cpf1 뉴클레아제 및 crRNA만을 필요로 한다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-TTN과 회합된다. Cpf1은 5'-CTA PAM 모티프도 인식할 수 있다. Cpf1은 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행(overhang)을 갖는 오프셋 또는 엇갈린 이중 가닥 파손을 도입함으로써, 예를 들어 코딩 가닥 상에서 PAM 부위로부터(3'로부터) 18개 뉴클레오티드 하류, 및 상보적 가닥 상에서 PAM 부위로부터 23개 뉴클레오티드 하류에 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 엇갈린 절단물을 갖는 표적 DNA를 절단하며; 그러한 오프셋 절단으로 인한 5-뉴클레오티드 오버행은 평활 말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다는, 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 더 정확한 게놈 편집을 가능하게 한다. 예를 들어 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759 - 771]을 참조한다.
다양한 CRISPR 연관(Cas) 유전자 또는 단백질이 본 개시내용에 의해 제공되는 기술에 사용될 수 있으며, Cas 단백질의 선택은 본 방법의 특정 조건에 따라 달라질 것이다. Cas 단백질의 특정 예는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cpf1, C2C1, 또는 C2C3을 포함하는 클래스 II 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질은 다양한 원핵생물 종들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 Cas 단백질, 예를 들어 특정 Cas9 단백질은 특정 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열을 인식하도록 선택된다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 도메인은 서열 표적화 폴리펩티드, 예컨대 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9를 포함한다. 특정 구현예에서, Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질은 박테리아 또는 고세균으로부터 수득되거나, 또는 알려진 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에서 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스(예를 들어, S. 피오게네스, 또는 S. 써모필루스), 프란시셀라(Francisella)(예를 들어, F. 노비시다(novicida)), 스타필로코커스(예를 들어, S. 아우레우스(aureus)), 아시다미노코커스(예를 들어, 아시다미노코커스 BV3L6), 네이세리아(예를 들어, N. 메닝지티디스), 크립토코커스, 코리네박테리움, 헤모필루스(Haemophilus), 유박테리움(Eubacterium), 파스퉤렐라(Pasteurella), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 또는 마리노박터(Marinobacter)에서 유래할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas 단백질이 결합 및/또는 기능하기 위한 표적 DNA 서열에 존재하거나 이에 인접하기 위해 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 필요로 한다. 일부 구현예에서, PAM은 5'에서 3'으로 NGG, YG, NNGRRT, NNNRRT, NGA, TYCV, TATV, NTTN, 또는 NNNGATT이거나, 이를 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 나타내고, Y는 C 또는 T를 나타내고, R은 A 또는 G를 나타내고, V는 A 또는 C 또는 G를 나타낸다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 표 1에 열거된 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 그의 PAM을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 E1369R, E1449H, 및 R1556A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 E782K, N968K, 및 R1015H 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 D1135V, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 S542R 및 K607R 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 S542R, K548V, 및 N552R 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
| 명칭 | 효소 | 종 | AA의 수 | PAM | PAM 인식을 변경시키기 위한 돌연변이 | 촉매적으로 사멸되게(catalytically dead) 하기 위한 돌연변이 |
| FnCas9 | Cas9 | 프란시셀라 노비시다 | 1629 | 5'-NGG-3' | Wt | D11A/H969A/N995A |
| FnCas9 RHA | Cas9 | 프란시셀라 노비시다 | 1629 | 5'-YG-3' | E1369R/E1449H/R1556A | D11A/H969A/N995A |
| SaCas9 | Cas9 | 스타필로코커스 아우레우스 | 1053 | 5'-NNGRRT-3' | Wt | D10A/H557A |
| SaCas9 KKH | Cas9 | 스타필로코커스 아우레우스 | 1053 | 5'-NNNRRT-3' | E782K/N968K/R1015H | D10A/H557A |
| SpCas9 | Cas9 | 스트렙토코커스 피오게네스 | 1368 | 5'-NGG-3' | Wt | D10A/D839A/H840A/N863A |
| SpCas9 VQR | Cas9 | 스트렙토코커스 피오게네스 | 1368 | 5'-NGA-3' | D1135V/R1335Q/T1337R | D10A/D839A/H840A/N863A |
| AsCpf1 RR | Cpf1 | 아시다미노코커스 종 BV3L6 | 1307 | 5'-TYCV-3' | S542R/K607R | E993A |
| AsCpf1 RVR | Cpf1 | 아시다미노코커스 종 BV3L6 | 1307 | 5'-TATV-3' | S542R/K548V/N552R | E993A |
| FnCpf1 | Cpf1 | 프란시셀라 노비시다 | 1300 | 5'-NTTN-3' | Wt | D917A/E1006A/D1255A |
| NmCas9 | Cas9 | 네이세리아 메닝지디티스 | 1082 | 5'-NNNGATT-3' | Wt | D16A/D587A/H588A/N611A |
일부 구현예에서, Cas 단백질은 뉴클레아제, 예를 들어, 뉴클레아제-결핍 Cas9를 탈활성화하도록 변형된다. 야생형 Cas9는 gRNA에 의해 표적화된 특이적인 DNA 서열에서 이중 가닥 파손(DSB)을 생성하는 한편, 변형된 기능기들을 갖는 다수의 CRISPR 엔도뉴클레아제가 이용가능하며, 예를 들어, Cas9의 "닉카제" 형태는 단일 가닥 파손만을 생성하고; 촉매적으로 비활성인 Cas9("dCas9")는 표적 DNA를 절단하지 않는다. 일부 구현예에서, DNA 서열에 결합하는 dCas9는 입체 장애에 의해 그 부위에서 전사를 방해할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 촉매적으로 비활성인 Cas9, 예를 들어 dCas9이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 촉매적으로 비활성인 돌연변이체 Cas9, 예를 들어 Cas9m4이거나 이를 포함한다. 많은 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, dCas9는 Cas 단백질의 각 엔도뉴클레아제 도메인 내의 돌연변이, 예를 들어 D10A 및 H840A 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D11A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H969A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 N995A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D11A, H969A, 및 N995A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H557A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A 및 H557A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D839A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H840A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 N863A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A 및 D839A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A, D839A, 및 H840A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A, D839A, H840A, 및 N863A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 E993A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D917A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 E1006A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D1255A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D917A, E1006A, 및 D1255A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D16A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D587A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H588A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 N611A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D16A, D587A, H588A, 및 N611A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서 또는 폴리펩티드에 관한 것이며, 하나 이상의 DNA-표적화 모이어티는 Cas 단백질, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9, 예를 들어 dCas9m4, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, dCas9는 서열번호 46 또는 88의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dCas9는 서열번호 45 또는 89의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:
가이드 RNA(gRNA)
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 gRNA를 포함하거나 이에 (예를 들어, 공유적으로) 연결된 Cas 분자를 포함할 수 있다. gRNA는 Cas-단백질 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열, 및 게놈 표적을 위한 사용자-정의된 약 20개의 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성되는 짧은 합성 RNA이다. 실제로, 가이드 RNA 서열은 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드) 길이를 갖고 표적화된 핵산 서열에 상보적이 되도록 일반적으로 설계된다. 효과적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위한 맞춤형 gRNA 생성기 및 알고리즘이 상업적으로 구매 가능하다. 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 유전자 편집이 또한 달성되었는데, 이는, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고, tracrRNA(뉴클레아제에 결합하기 위한 것) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집을 위하여 표적화된 서열로 가이드하기 위한 것) 둘 모두를 포함하는 조작된(합성) 단일 RNA 분자이다. 화학적으로 변형된 sgRNA가 또한 Cas 단백질과 함께 사용하기에 효과적인 것으로 입증되었으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
일부 구현예에서, gRNA는 표적 유전자와 연관된 DNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 요소이거나, 이를 포함하거나, 이와 중첩된다. 일부 구현예에서, gRNA는 표적 유전자와 연관된 DNA 서열에 적어도 90, 95, 99, 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 분자를 포함하는 DNA-표적화 모이어티와 함께 사용하기 위한 gRNA는 sgRNA이다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 분자와 함께 사용하기 위한 gRNA는 β-2-마이크로글로불린 발현과 연관된 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 그러한 gRNA는 하기로부터 선택되는 표적-결합 서열을 포함할 수 있다:
GD-28228: TCTCCTTGGTGGCCCGCCGT (서열번호 1),
GD-28229: GTCCCAAAGGCGCGGCGCTG (서열번호 2),
GD-28171: CCCTGCTCCCCGCCGAAAGGG (서열번호 3),
GD-28172: CTCTGGCTCCCCCAGCGCAGC (서열번호 4), 또는
GD-28173: GTGAACGCGTGGAGGGGCGCT (서열번호 5).
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 도메인과 함께 사용하기 위한 gRNA는 CTCF와 연관된 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 도메인과 함께 사용하기 위한 gRNA는 프로모터와 연관된 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, gRNA는 표 3에 열거된 표적 서열에 결합한다.
| 가이드 | 표적 | 표적 서열 | 게놈 좌표 | 서열번호 |
| GD-29639 | MYC | AGGGTGATGTTCATTAGCAG | chr8:128746082-128746104 | 11 |
| GD-29640 | MYC | TGCAGAAGGTCCGAAGAAAG | chr8:128746177-128746199 | 12 |
| GD-27634 | β2M | GAGACAGGTGACGGTCCCTG | chr15:45003632-45003654 | 13 |
| GD-29500 | β2M | GAGTCTCGTGATGTTTAAGA | chr15:45003545-45003567 | 14 |
| GD-29542 | HSPA1B | CCTGCCCTCTGATTGGTCCA | chr6:31795352-31795374 | 17 |
| GD-29544 | HSPA1B | GCCTCATCGAGCTTGGTGAT | chr6:31795429-31795451 | 18 |
| GD-29536 | GATA1 | CTGTGGTGTCAAAAGCACCA | chrX:48641126-48641148 | 19 |
| GD-29693 | GATA1 | GAACCCCAGAAGATGCCAGG | chrX:48641245-48641267 | 20 |
| GD-29499 | β2M 프로모터 | GGCGCGCACCCCAGATCGGA | chr15:45003481-45003503 | 21 |
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제2 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 CRISPR/Cas 분자는 제1 CRISPR/Cas 단백질 및 제1 가이드 RNA를 포함하고, 제2 CRISPR/Cas 분자는 제2 CRISPR/Cas 단백질 및 제2 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 CRISPR/Cas 단백질은 제2 가이드 RNA에 별로 결합하지 않으며(이것에 결합하지 않으며), 예를 들어 적어도 10, 20, 50, 100, 1000, 또는 10,000 nM의 KD로 결합하고, 제2 CRISPR/Cas 단백질은 제1 가이드 RNA에 별로 결합하지 않으며(예를 들어, 결합하지 않으며), 예를 들어 적어도 10, 20, 50, 100, 1000, 또는 10,000 nM의 KD로 결합한다.
TAL 이펙터 도메인
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자이거나 이를 포함한다. TAL 이펙터 분자, 예를 들어 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 TAL 이펙터 분자는 복수의 TAL 이펙터 도메인 또는 이의 단편들을 포함하며, 선택적으로 자연 발생 TAL 이펙터들의 하나 이상의 추가의 부분들을 포함한다(예를 들어, 복수의 TAL 이펙터 도메인들의 N- 및/또는 C-말단). 많은 TAL 이펙터가 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Thermo Fisher Scientific으로부터 상업적으로 구매 가능하다.
TALE는 숙주 식물에서의 유전자 발현을 조절하고, 박테리아 콜로니화 및 생존을 용이하게 하는 식물 병원체 잔토모나스(Xanthomonas)를 포함하는 박테리아성 병원체의 다양한 종에 의해 분비된 천연 이펙터 단백질이다. TAL 이펙터의 특이적 결합은 통상적으로 33 또는 34개의 아미노산의 나란히 정렬된 거의 동일한 반복부들의 중심 반복 도메인을 기준으로 한다(반복부-가변 이(di)-잔기, RVD 도메인).
TAL 이펙터 패밀리의 구성원들은 그들의 반복부들의 수와 순서에서 주로 상이하다. 반복부들의 수는 1.5 내지 33.5개의 반복부 범위이며, C-말단 반복부는 보통 길이가 더 짧고(예를 들어, 약 20개 아미노산), 일반적으로 "절반-반복부"로서 지칭된다. TAL 이펙터의 각 반복부는 상이한 염기쌍 특이성을 나타내는 상이한 반복부 유형과 하나의 반복-대-하나의 염기쌍 상관관계를 특징으로 한다(하나의 반복부는 표적 유전자 서열 상에서 하나의 염기쌍을 인식함). 일반적으로, 반복부의 수가 더 적을수록, 단백질-DNA 상호작용은 더 약해진다. 다수의 6.5개 반복부는 리포터 유전자의 전사를 활성화하기에 충분한 것으로 나타났다(Scholze et al., 2010).
반복부 대 반복부 변이는 아미노산 위치 12 및 13에서 주로 발생하며, 따라서 이는 "초가변"으로 지칭되고, 표적 DNA 프로모터 서열과의 상호작용의 특이성을 담당하며, 이는 예시적인 반복부 가변 이-잔기(RVD) 및 이들의 핵산 염기 표적에 대한 상동성을 열거한 표 2에 나타낸 바와 같다.
| 표적 | 가능한 RVD 아미노산 조합 | ||||||||||||
| A | NI | NN | CI | HI | KI | ||||||||
| G | NN | GN | SN | VN | LN | DN | QN | EN | HN | RH | NK | AN | FN |
| C | HD | RD | KD | ND | AD | ||||||||
| T | NG | HG | VG | IG | EG | MG | YG | AA | EP | VA | QG | KG | RG |
이에 따라, TAL 이펙터의 반복부를 표적 특이적 DAN 서열로 변형하는 것이 가능하다. 추가의 연구는, RVD NK가 G를 표적화할 수 있음을 나타내었다. TAL 이펙터의 표적 부위는 또한 제1 반복부에 의해 표적화되는 5' 염기에 측접하는 T를 포함하는 경향도 있지만, 이러한 인식의 정확한 기작은 알려지지 않았다. 113개가 넘는 TAL 이펙터 서열이 오늘날까지 알려졌다. 잔토모나스로부터의 TAL 이펙터의 비제한적 예는 Hax2, Hax3, Hax4, AvrXa7, AvrXa10 및 AvrBs3를 포함한다.
이에 따라, 본 발명의 TAL 이펙터 분자의 TAL 이펙터 도메인은 임의의 박테리아 종(예를 들어, 잔토모나스 종, 예컨대 아프리카 균주인, 잔토모나스 오리제(oryzae) pv. 오리제(Yu et al. 2011), 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 라파니(campestris pv. raphani) 균주 756C 및 잔토모나스오리제 pv. 오리지콜라(oryzicola) 균주 BLS256(Bogdanove et al. 2011)으로부터의 TAL 이펙터로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따른 TAL 이펙터 도메인은 RVD 도메인뿐만 아니라 자연 발생 TAL 이펙터로부터의 측접 서열(들)(RVD 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 측부 상에서의 서열)도 포함한다. 이는 자연 발생 TAL 이펙터의 RVD보다 더 많거나 더 적은 반복부들을 포함할 수 있다. 본 발명의 TAL 이펙터 분자는 상기 코드를 기반으로 한 소정의 DNA 서열 및 당업계에 알려진 다른 것들을 표적화하도록 설계된다. TAL 이펙터 도메인의 수(예를 들어, 반복부(단량체 또는 모듈)) 및 그의 특이적 서열은 원하는 DNA 표적 서열을 기반으로 하여 선택된다. 예를 들어, TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부들은 특이적 표적 서열에 맞도록 제거 또는 부가될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 TAL 이펙터 분자는 6.5 내지 33.5개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 TAL 이펙터 분자는 8 내지 33.5개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부, 예를 들어 10 내지 25개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부, 예를 들어 10 내지 14개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부를 포함한다.
일부 구현예에서, TAL 이펙터 분자는 DNA 표적 서열에 대한 완전한 매치에 상응하는 TAL 이펙터 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 표적 서열 상에서 반복부와 표적 염기쌍 사이의 미스매치는 TAL 이펙터 분자를 포함하는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서의 기능을 가능하게 하는 한 허용된다. 일반적으로, TALE 결합은 미스매치의 수와 역의 상관관계를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 발현 리프레서의 TAL 이펙터 분자는 표적 DNA 서열과, 7개의 미스매치, 6개의 미스매치, 5개의 미스매치, 4개의 미스매치, 3개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 1개의 미스매치 이하를 포함하고, 선택적으로는 미스매치가 없다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일반적으로 TAL 이펙터 분자 내 TAL 이펙터 도메인의 수가 더 적을수록, 더 적은 수의 미스매치가 용인될 것이고, TAL 이펙터 분자를 포함하는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서의 기능을 여전히 허용할 것이다. 결합 친화도는 매칭되는 반복부-DNA 조합의 합에 따라 달라지는 것으로 생각된다. 예를 들어, 25개 이상의 TAL 이펙터 도메인을 갖는 TAL 이펙터 분자는 최대 7개의 미스매치를 용인할 수 있다.
TAL 이펙터 도메인에 더하여, 본 발명의 TAL 이펙터 분자는 자연 발생 TAL 이펙터로부터 유래된 추가의 서열들을 포함할 수 있다. TAL 이펙터 분자의 TAL 이펙터 도메인의 각각의 측면에 포함된 C-말단 및/또는 N-말단 서열(들)의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들어 문헌[Zhang et al. (2011)]의 연구를 기반으로 하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 상기 문헌[Zhang et al.]은 Hax3 유래된 TAL-이펙터를 기반으로 한 단백질에서 많은 C-말단 및 N-말단 절단 돌연변이체를 특성화하였으며, 표적 서열에 대한 최적 결합 및 이에 따라 전사 활성화에 기여하는, 주요 요소를 확인하였다. 일반적으로, 전사 활성은 N-말단의 길이와 역의 상관관계에 있는 것으로 밝혀졌다. C-말단에 대하여, Hax 3 서열의 최초 68개 아미노산 내 DNA 결합 잔기에 중요한 요소가 확인되었다. 이에 따라 일부 구현예에서, 자연 발생 TAL 이펙터의 TAL 이펙터 도메인의 C-말단부 상에서 최초 68개 아미노산은 본 발명의 발현 리프레서의 TAL 이펙터 분자 내에 포함된다. 따라서, 일 구현예에서 본 발명의 TAL 이펙터 분자는 1) 자연 발생 TAL 이펙터로부터 유래된 하나 이상의 TAL 이펙터 도메인; 2) TAL 이펙터 도메인의 N-말단부에 대한 자연 발생 TAL 이펙터로부터 적어도 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 170, 180, 190, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280개 이상의 아미노산; 및/또는 3) TAL 이펙터의 C-말단부 상에서 자연 발생 TAL 이펙터로부터의 적어도 68, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 170, 180, 190, 200, 220, 230, 240, 250, 260개 이상의 아미노산을 포함한다.
Zn 링거 도메인
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 Zn 핑거 도메인이거나, 또는 이를 포함한다. Zn 핑거 도메인은 Zn 핑거 단백질, 예를 들어, 자연 발생 Zn 핑거 단백질 또는 조작된 Zn 핑거 단백질, 또는 이의 단편을 포함한다. 많은 Zn 핑거 단백질이 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 구매 가능하다.
일부 구현예에서, Zn 핑거 도메인은, 선택된 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작된, 비자연 발생 Zn 핑거 단백질을 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된, 문헌[Beerli, et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; 문헌[Pabo, et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; 문헌[Isalan, et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; 문헌[Segal, et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; 문헌[Choo, et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참조한다.
조작된 Zn 핑거 단백질은, 자연 발생 Zn 핑거 단백질과 비교하여, 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 이에 제한되지는 않지만 합리적 설계(rational design) 및 다양한 유형의 선택을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중자(또는 사중자) 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 Zn 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중자 또는 사중자 뉴클레오티드 서열은, 특정 삼중자 또는 사중자 서열에 결합하는 징크 핑거의 아미노산 서열 하나 이상과 회합된다. 예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261호를 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하여 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 국제 특허 공개 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; 및 WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 추가의 징크 핑거 단백질에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 국제 특허 공개 WO 02/077227에 기재되어 있다.
추가적으로, 이들 및 기타 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 징크 핑거 단백질은 임의의 적합한 링커 서열을 함께 사용하여 연결될 수 있으며, 이는 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함한다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해, 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별적인 징크 핑거들간에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가적으로, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 공동 소유된 국제 특허 공개 WO 02/077227에 기재되어 있다.
Zn 핑거 단백질 및 융합 단백질의 설계 및 구축 방법(및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)는 당업자에게 알려져 있으며, 미국 특허 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 및 6,200,759; 국제 특허 공개 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536; 및 WO 03/016496에 상세하게 기재되어 있다.
추가적으로, 이들 및 기타 참고 문헌에 개시된 바와 같이, Zn 핑거 단백질 및/또는 다중-핑거 Zn 핑거 단백질은, 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함하는, 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여, 예를 들어 융합 단백질로서, 함께 연결될 수 있다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949 참조한다. 본 명세서에 기재된 Zn 핑거 도메인은, 개별적인 징크 핑거 단백질 및/또는 Zn 핑거 도메인의 다중-핑거 Zn 핑거 단백질간에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 DNA 서열에 (서열-특이적 방식으로) 결합하는 조작된 징크 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 도메인은 하나의 Zn 핑거 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, Zn 핑거 도메인은 복수의 Zn 핑거 단백질(또는 이의 단편), 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 Zn 핑거 단백질(및 선택적으로 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 이하의 Zn 핑거 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 도메인은 적어도 3개의 Zn 핑거 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 도메인은 4, 5, 또는 6개의 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 도메인은 8, 9, 10, 11 또는 12개의 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, 3개의 Zn 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 도메인은 9 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, 4개의 Zn 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 도메인은 12 내지 14개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, 6개의 Zn 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 도메인은 18 내지 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 서열을 인식한다.
일부 구현예에서, Zn 핑거 도메인은 양손(two-handed) Zn 핑거 단백질을 포함한다. 양손 징크 핑거 단백질은, 징크 핑거 단백질의 2개의 클러스터가 개재하는 아미노산들에 의해 분리되어, 2개의 징크 핑거 도메인이 2개의 불연속적인 표적 DNA 서열에 결합되도록 하는 단백질들이다. 징크 핑거 결합 단백질의 양손 유형의 예는 SIP1며, 여기서 4개의 징크 핑거 단백질의 클러스터는 단백질의 아미노 말단에 위치되고, 3개의 징크 핑거 단백질의 클러스터는 카르복실 말단에 위치한다(문헌[Remade, et al. (1999) EMBO Journal 18(18):5073-5084] 참조). 이들 단백질의 징크 핑거의 각 클러스터는 독특한 표적 서열에 결합할 수 있고, 2개의 표적 서열 사이의 간격은 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
핵산 분자
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 뉴클레아제로부터의 DNA-결합 도메인이거나 이를 포함한다. 예를 들어, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII과 같은 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열이 알려져 있다. 또한, 미국 특허 5,420,032; 6,833,252; 문헌[Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; 문헌[Dujon, et al. (1989) Gene 82:115-118]; 문헌[Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127]; 문헌[Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; 문헌[Gimble, et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180]; 문헌[Argast, et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성이 비천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chevalier, et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905]; 문헌[Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962]; 문헌[Ashworth, et al. (2006) Nature 441:656-659]; 문헌[Paques, et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 2007/0117128을 참조한다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 핵산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티 내에 포함될 수 있는 핵산은 DNA, RNA, 및/또는 인공 또는 합성 핵산 또는 핵산 유사체 또는 모방체이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 펩티드 핵산(PNA), 펩티드- 올리고뉴클레오티드 접합체, 고정된 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 기타 다른 RNAi 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비코딩 RNA를 표적화하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화된 게놈 복합체와 연관된 특정 유전자의 발현 산물을 표적화하는 것들) 등 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연 발생 DNA 또는 RNA 잔기가 아닌 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있고/있거나, 포스포디에스테르 결합이 아닌(예를 들어, 이를 테면 포스포로티오에이트 결합 등일 수 있는) 하나 이상의 결합을 포함할 수 있고/있거나, 예를 들어 2'O 변형, 예컨대 2'-OMeP와 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 합성 핵산을 제조하는 데 유용한 다양한 핵산 구조가 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, WO2017/062862l 및 WO2014/012081 참조), 당업자는 이들이 본 개시내용에 따라 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
발현 리프레서에, 예를 들어 DNA-표적화 모이어티에 사용하기에 적합한 핵산은 DNA, RNA, 변형된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 화학적 변형, 예컨대 백본 결합, 당 분자, 및/또는 핵산 염기를 변경시키는 변형), 및 인공 핵산을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, 펩티드 핵산(PNA) 또는 펩티드 올리고뉴클레오티드 접합체, 고정된 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 폴리아미드, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드, 변형된 DNA, 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드, tRNA, mRNA, rRNA, 변형된 RNA, miRNA, gRNA, 및 siRNA 또는 기타 다른 RNA 또는 DNA 분자를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 약 15 내지 200개, 20 내지 200개, 30 내지 200개, 40 내지 200개, 50 내지 200개, 60 내지 200개, 70 내지 200개, 80 내지 200개, 90 내지 200개, 100 내지 200개, 110 내지 200개, 120 내지 200개, 130 내지 200개, 140 내지 200개, 150 내지 200개, 160 내지 200개, 170 내지 200개, 180 내지 200개, 190 내지 200개, 215 내지 190개, 20 내지 190개, 30 내지 190개, 40 내지 190개, 50 내지 190개, 60 내지 190개, 70 내지 190개, 80 내지 190개, 90 내지 190개, 100 내지 190개, 110 내지 190개, 120 내지 190개, 130 내지 190개, 140 내지 190개, 150 내지 190개, 160 내지 190개, 170 내지 190개, 180 내지 190개, 15 내지 180개, 20 내지 180개, 30 내지 180개, 40 내지 180개, 50 내지 180개, 60 내지 180개, 70 내지 180개, 80 내지 180개, 90 내지 180개, 100 내지 180개, 110 내지 180개, 120 내지 180개, 130 내지 180개, 140 내지 180개, 150 내지 180개, 160 내지 180개, 170 내지 180개, 15 내지 170개, 20 내지 170개, 30 내지 170개, 40 내지 170개, 50 내지 170개, 60 내지 170개, 70 내지 170개, 80 내지 170개, 90 내지 170개, 100 내지 170개, 110 내지 170개, 120 내지 170개, 130 내지 170개, 140 내지 170개, 150 내지 170개, 160 내지 170개, 15 내지 160개, 20 내지 160개, 30 내지 160개, 40 내지 160개, 50 내지 160개, 60 내지 160개, 70 내지 160개, 80 내지 160개, 90 내지 160개, 100 내지 160개, 110 내지 160개, 120 내지 160개, 130 내지 160개, 140 내지 160개, 150 내지 160개, 215 내지 150개, 20 내지 150개, 30 내지 150개, 40 내지 150개, 50 내지 150개, 60 내지 150개, 70 내지 150개, 80 내지 150개, 90 내지 150개, 100 내지 150개, 110 내지 150개, 120 내지 150개, 130 내지 150개, 140 내지 150개, 15 내지 140개, 20 내지 140개, 30 내지 140개, 40 내지 140개, 50 내지 140개, 60 내지 140개, 70 내지 140개, 80 내지 140개, 90 내지 140개, 100 내지 140개, 110 내지 140개, 120 내지 140개, 130 내지 140개, 15 내지 130개, 20 내지 130개, 30 내지 130개, 40 내지 130개, 50 내지 130개, 60 내지 130개, 70 내지 130개, 80 내지 130개, 90 내지 130개, 100 내지 130개, 110 내지 130개, 120 내지 130개, 215 내지 120개, 20 내지 120개, 30 내지 120개, 40 내지 120개, 50 내지 120개, 60 내지 120개, 70 내지 120개, 80 내지 120개, 90 내지 120개, 100 내지 120개, 110 내지 120개, 15 내지 110개, 20 내지 110개, 30 내지 110개, 40 내지 110개, 50 내지 110개, 60 내지 110개, 70 내지 110개, 80 내지 110개, 90 내지 110개, 100 내지 110개, 15 내지 100개, 20 내지 100개, 30 내지 100개, 40 내지 100개, 50 내지 100개, 60 내지 100개, 70 내지 100개, 80 내지 100개, 90 내지 100개, 15 내지 90개, 20 내지 90개, 30 내지 90개, 40 내지 90개, 50 내지 90개, 60 내지 90개, 70 내지 90개, 80 내지 90개, 15 내지 80개, 20 내지 80개, 30 내지 80개, 40 내지 80개, 50 내지 80개, 60 내지 80개, 70 내지 80개, 15 내지 70개, 20 내지 70개, 30 내지 70개, 40 내지 70개, 50 내지 70개, 60 내지 70개, 15 내지 60개, 20 내지 60개, 30 내지 60개, 40 내지 60개, 50 내지 60개, 15 내지 50개, 20 내지 50개, 30 내지 50개, 40 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 40개, 30 내지 40개, 15 내지 30개, 20 내지 30개, 또는 15 내지 20개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 뉴클레오티드 길이를 갖는 핵산을 포함한다.
리프레서 도메인
본 개시내용의 발현 리프레서는 하나 이상의 리프레서 도메인을 포함한다. 리프레서 도메인은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 일부로서 사용될 때, 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 하나 이상의 기능성을 갖는다.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 히스톤 변형 기능성, 예를 들어 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데메틸라제, 또는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 기능성은 H3K9 표적화 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 기능성은 H3K56 표적화 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 기능성은 H3K27 표적화 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 데메틸라제 기능성은 1개, 2개, 또는 3개의 메틸 기를 전달한다. 일부 구현예에서, 히스톤 데메틸라제 기능성은 H3K4 표적화 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 이들 중 임의의 것의 SET 도메인으로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 후성유전학적 변형 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 DNA 변형 기능성, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3L 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 전사 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 리프레서는 전사, 예를 들어 표적 유전자의 전사를 자극하거나 촉진하는 인자의 동원을 차단한다. 일부 구현예에서, 전사 리프레서는 전사, 예를 들어 표적 유전자의 전사를 억제하는 인자를 동원한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인, 예를 들어 전사 리프레서는 KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 후성유전학적 변형을, 예를 들어 직접적으로 또는 간접적으로 촉진한다. 예를 들어, 리프레서 도메인은 염색질을 후성유전학적으로 변형시키는 내인성 단백질을 동원함으로써 후성유전학적 변형을 간접적으로 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 후성유전학적 변형을 촉매함으로써 후성유전학적 변형을 직접적으로 촉진할 수 있는데, 여기서 리프레서 도메인은 효소 활성을 포함하고, 후성유전학적 마크를 염색질 상에 직접 배치한다.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 본 명세서에 기재된 기능성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 하기로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다:
KRAB(예를 들어, NP_056209.2에 따른 것 또는 NM_015394.5에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 61에 따른 것);
SET 도메인(예를 들어, 하기의 SET 도메인:
SETDB1(예를 들어, NP_001353347.1에 따른 것 또는 NM_001366418.1에 의해 인코딩된 단백질);
EZH2(예를 들어, NP-004447.2에 따른 것 또는 NM_004456.5에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 65에 따른 것);
G9A(예를 들어, NP_001350618.1에 따른 것 또는 NM_001363689.1에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 62에 따른 것); 또는
SUV39H1(예를 들어, NP_003164.1에 따른 것 또는 NM_003173.4에 의해 인코딩된 단백질));
히스톤 데메틸라제 LSD1(예를 들어, NP_055828.2에 따른 것 또는 NM_015013.4에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 64에 따른 것);
FOG1(예를 들어, FOG1의 N-말단 잔기)(예를 들어, NP_722520.2에 따른 것 또는 NM_153813.3에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 66에 따른 것);
KAP1(예를 들어, NP_005753.1에 따른 것 또는 NM_005762.3에 의해 인코딩된 단백질); 또는
HDAC8(예를 들어, NP_001159890에 따른 것 또는 NM_001166418에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 63에 따른 것);
이들 중 임의의 것의 기능성 단편 또는 변이체, 또는
상기 언급된 임의의 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 하기로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다:
DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A)(예를 들어, NP_072046.2에 따른 것
또는 NM_022552.4에 의해 인코딩된 단백질, 예를 들어 서열번호 58에 따른 것);
DNMT3B(예를 들어, AOX21819.1에 따른 것
또는 NM_006892.4 또는 KX447429에 의해 인코딩된 단백질);
DNMT3L(예를 들어, NP_787063.1에 따른 것
또는 NM_175867.3에 의해 인코딩된 단백질);
DNMT3A/3L 복합체(예를 들어, 서열번호 59 또는 60에 따른 것),
박테리아 MQ1(예를 들어, CAA35058.1 또는 P15840.3에 따른 것, 예를 들어 서열번호 57 또는 90에 따른 것);
이들 중 임의의 것의 기능성 단편, 또는
상기 언급된 임의의 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 효소 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, DNA-결합 도메인은 나선-헤어핀-나선(HhH) 모티프를 포함한다. HhH 구조 모티프를 갖는 DNA-결합 단백질은 단백질 백본 질소와 DNA 포스페이트 기 사이의 수소 결합의 형성을 통해 일어나는 서열 비특이적 DNA 결합에 관여할 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-결합 도메인은 나선-루프-나선(HLH) 모티프를 포함한다. HLH 구조 모티프를 갖는 DNA-결합 단백질은 전사 조절 단백질이며, 매우 다양한 개발 과정에 주로 관련되어 있다. 잔기의 관점에서 HTH 또는 HhH 모티프보다 HLH 구조 모티프가 더 길다. 이들 단백질 중 다수는 상호작용하여 동종- 및 이종-이량체를 형성한다. 구조 모티프는, N-말단 나선이 DNA에 결합되면서 2개의 긴 나선 영역으로 구성되지만, 복합체 영역은 단백질이 이량체화될 수 있게 한다.
일부 구현예에서, DNA-결합 도메인은 류신 지퍼 모티프를 포함한다. 일부 전사 인자에서는, 이량체 결합 부위가 DNA와 함께 류신 지퍼를 형성한다. 이 모티프는 2개의 양친매성 나선을 포함하며, 각 하위단위로부터 하나씩 유래되며, 서로 상호작용하여 왼손방향 코일드-코일 슈퍼 2차 구조를 발생시킨다. 류신 지퍼는 한쪽 나선 내의 규칙적으로 이격된 류신 잔기와 인접한 나선으로부터의 류신의 상호감합(interdigitation)이다. 대개, 류신 지퍼에 관여하는 나선은 헵타드(heptad) 서열(abcdefg)을 나타내며, 이때 잔기 a 및 d는 소수성이고, 기타 다른 잔기는 친수성이다. 류신 지퍼 모티프는 동종이량체 형성 또는 이종이량체 형성 중 어느 하나를 매개할 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-결합 도메인은 Zn 핑거 도메인을 포함하며, 여기서 Zn++ 이온은 2개의 Cys 및 2개의 His 잔기에 의해 배위된다. 그러한 전사 인자는 화학량론 ββ'α를 갖는 삼량체를 포함한다. Zn++ 배위의 겉보기 효과는 소수성 코어 잔기 대신에 작은 복합체 구조의 안정화이다. 각 Zn-핑거는 이중 나선의 주요 홈(groove) 내의 연속적인 삼중 염기쌍 세그먼트와 입체구조적으로 동일한 방식으로 상호작용한다. 단백질-DNA 상호작용은 다음 2개의 인자에 의해 결정된다: (i) α-나선과 DNA 세그먼트 사이, 대개 Arg 잔기와 구아닌 염기 사이의 H-결합 상호작용. (ii) DNA 포스페이트 백본과의, 대개 Arg 및 His와의 H-결합 상호작용. 대안적인 Zn-핑거 모티프는 Zn++를 6개의 Cys로 킬레이트화한다.
예시적인 리프레서 도메인은 하기를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다: 유비퀴틴, 유비퀴틴 리가제 억제제로서의 바이사이클릭 펩티드, 전사 인자, DNA 및 단백질 변형 효소, 예컨대 토포이소머라제, 토포이소머라제 억제제, 예컨대 토포테칸, DNA 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 DNMT 패밀리(예를 들어, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L), 단백질 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, 바이러스 라이신 메틸트랜스퍼라제(vSET), 단백질-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SMYD2), 데아미나제(예를 들어, APOBEC, UG1), 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 제스트 인핸서 상동체 2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2), PRMT1, 히스톤-라이신-N-메틸트랜스퍼라제(Setdb1), 히스톤 메틸트랜스퍼라제(SET2), 진정 염색질(euchromatic) 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 2(G9A), 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SUV39H1), 및 G9a), 히스톤 데아세틸라제(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8), DNA 탈메틸화에서 역할을 갖는 효소(예를 들어, TET 패밀리 효소는 5-메틸시토신의 5-하이드록시메틸시토신 및 더 고차의 산화적 유도체로의 산화를 촉매함), 단백질 데메틸라제, 예컨대 KDM1A 및 라이신-특이적 히스톤 데메틸라제 1(LSD1), 전사 리프레서(예를 들어, KRAB, FOG1), 헬리카제, 예컨대 DHX9, 데아세틸라제(예를 들어, 시르투인(sirtuin) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7), 키나제, 포스파타제, DNA 삽입제, 예컨대 에티듐 브로마이드, SYBR 그린, 및 프로플라빈, 유출 펌프(efflux pump) 억제제, 예컨대 페닐알라닌 아르기닐 β-나프틸아미드 또는 퀴놀린 유도체와 같은 펩티드모방체, 핵 수용체 활성화제 및 억제제, 프로테아좀 억제제, 리소좀 저장 질환에 관여하는 것들과 같은 효소에 대한 경쟁적 억제제, 단백질 합성 억제제, 뉴클레아제(예를 들어, Cpf1, Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제), 이들 중 하나 이상의 융합체(예를 들어, dCas9-DNMT, dCas9-APOBEC, dCas9-UG1), 및 단백질 유래 특정 도메인, 예컨대 KRAB 도메인.
일부 구현예에서, 당업자에게 알려진 방법에 의해 리프레서 도메인으로서 사용하기에 적합한 것으로 후보 도메인이 결정될 수 있다. 예를 들어, 후보 리프레서 도메인이 세포의 핵 내에 존재하고, (예를 들어, 표적 유전자 또는 상기 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소에, 예를 들어 DNA-표적화 모이어티를 통해) 적절하게 국재화될 때, 후보 리프레서 도메인이 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는지, 예를 들어 표적 유전자에 의해 인코딩된 RNA 전사체의 수준을 감소시키는지(예를 들어, RNASeq 또는 노턴 블롯(Northern blot)에 의해 측정되는 바와 같음), 또는 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 감소시키는지(예를 들어, ELISA에 의해 측정되는 바와 같음)의 여부를 검정함으로써 후보 리프레서 도메인이 시험될 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 복수의 발현 리프레서를 포함하며, 복수의 발현 리프레서의 각 구성원은 리프레서 도메인을 포함하며, 각 리프레서 도메인은 또 다른 리프레서 도메인에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 리프레서 도메인은 또 다른 제1 리프레서 도메인에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않고, 제2 리프레서 도메인은 또 다른 제2 리프레서 도메인에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 리프레서 도메인은 단량체성 상태, 예를 들어 비이량체성 상태에서 기능성이다.
일부 구현예에서, 리프레서 도메인은 후성유전학적 변형 모이어티, 예를 들어 염색질의 2차원 구조를 조절하는(즉, 염색질의 2차원 표현을 변경시키는 방식으로 염색질의 구조를 조절하는) 후성유전학적 변형 모이어티이거나 이를 포함한다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 유용한 후성유전학적 변형 모이어티는 후성유전학적 마커, 예를 들어 DNA 메틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 아세틸화, 히스톤 수모화(sumoylation), 히스톤 인산화, 및 RNA-연관 침묵에 영향을 주는 작용제를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 서열 요소에 표적화될 수 있는 예시적인 후성유전학적 효소는 DNA 메틸라제(예를 들어, DNMT3a, DNMT3b, DNMTL), DNA 탈메틸화(예를 들어, TET 패밀리), 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3), 시르투인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, 라이신-특이적 히스톤 데메틸라제 1(LSD1), 히스톤-라이신-N-메틸트랜스퍼라제(Setdb1), 진정 염색질 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 2(G9a), 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SUV39H1), 제스트 인핸서 상동체 2(EZH2), 바이러스 라이신 메틸트랜스퍼라제(vSET), 히스톤 메틸트랜스퍼라제(SET2), 및 단백질-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SMYD2)를 포함한다. 그러한 후성유전학적 변형제의 예는, 예를 들어 문헌[de Groote et al. Nuc. Acids Res. (2012):1-18]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서, 예를 들어 본 발명에 유용한 후성유전학적 변형 모이어티를 포함하는 발현 리프레서는 문헌[Koferle et al. Genome Medicine 7.59 (2015):1-3]에 기재된 작제물이거나 이를 포함하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 문헌[Koferle et al.]의 표 1에서 확인되는 작제물, 예를 들어 표 1에 기재된 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, DNA 탈메틸화, 또는 H3K4 및/또는 H3K9 히스톤 데메틸라제(예를 들어, dCas9-p300, TALE-TET1, ZF-DNMT3A, 또는 TALE-LSD1)이거나 이를 포함한다.
추가의 모이어티
발현 리프레서는 (예를 들어, 하나 이상의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 리프레서 도메인에 추가하여) 하나 이상의 추가의 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 모이어티는 태깅 또는 모니터링 모이어티, 절단성 모이어티(예를 들어, DNA-표적화 모이어티와 리프레서 도메인 사이에 위치하거나, 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단부에 위치한 절단성 모이어티), 소분자, 막 전좌 폴리펩티드, 또는 약제 모이어티로부터 선택된다.
예시적인
발현 리프레서
하기의 예시적인 발현 리프레서는 단지 예시 목적으로 제시되며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 MQ1, 예를 들어 박테리아 MQ1을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 91(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 플라스미드), 서열번호 22(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA)) 및/또는 서열번호 92(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 22, 91 또는 92의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 서열번호 45 또는 89의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/되거나, 리프레서 도메인은 서열번호 47의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
dCas9-MQ1(MR-28125) mRNA 서열:
Sa-dCas9-MQ1(PL-27695) 플라스미드 DNA 서열:
Sa-dCas9-MQ1(MR-28126) 발현된 mRNA 서열:
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 93, 33, 67, 또는 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 93, 33, 67, 68의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
Sa-dCas9-MQ1 단백질 서열:
dCas9-MQ1 아미노산 서열
HA 태그를 갖지 않는 Sa-dCas9-MQ1
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-MQ1
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 KRAB를 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 94(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 플라스미드) 및/또는 95(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 94 또는 95의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
Sp-dCas9-KRAB(PL-27687) 플라스미드 DNA 서열:
Sp-dCas9-KRAB(MR-28122) 발현된 mRNA 서열:
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 96 또는 72의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 72 또는 96의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
Sp-dCas9-KRAB 단백질 서열:
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 DNMT1을 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 DNMT1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 23(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 23의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT1 (MR-29419)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 34 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 34 또는 69의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-DNMT
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 DNMT3a/3L을 포함하는 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 24(예를 들어, 완전 인간 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA)) 및/또는 25(예를 들어, 키메라 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 24 또는 25의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT 3a/3L(h)(MR-29414)
dCas9-DNMT3a/3L(m)(MR-28195)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 35, 36, 70, 또는 71의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 35, 36, 70, 또는 71의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT3a/3L(h)
dCas9-DNMT3a/3l(m)
HA 태그를 갖지 않는 dCas-DNMT3a/3L(h)
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-DNMT3a/3L(m)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 G9A를 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 G9A 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 26(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 26의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
G9A-dCas9 (MR-29387)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 38 또는 73의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 38 또는 73의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
G9a-dCas9
HA 태그를 갖지 않는 G9A-dCas9
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 HDAC8을 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 HDAC8 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 27(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 27의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-HDAC8(MR-29439)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 39 또는 74의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 39 또는 74의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-HDAC8
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-HDAC8
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 LSD1을 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 LSD1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 28(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 28의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-LSD1(MR-29129)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 40 또는 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 40 또는 75의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-LSD1
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-LSD1
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 EZH2를 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 EZH2 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 29(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 29의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9(MR-28938)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 41 또는 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 41 또는 76의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9
HA 태그를 갖지 않는 EZH2-dCas9
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 EZH2, 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제1 리프레서 도메인, 및 KRAB, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함하는 제2 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 30(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 30의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9-KRAB(MR-29448)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 42 또는 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 42 또는 77의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9-KRAB
HA 태그를 갖지 않는 EZH2-dCas9-KRAB
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 G9A를 포함하는 제1 리프레서 도메인, 예를 들어 G9A 도메인, 및 KRAB를 포함하는 제2 리프레서 도메인, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 31(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 31의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
G9A-dCas9-KRAB(MR-29442)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 43 또는 78의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 42 또는 77의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
G9A-dCas9-KRAB
HA 태그를 갖지 않는 G9A-dCas9-KRAB
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 FOG1을 포함하는 제1 리프레서 도메인, 예를 들어 FOG1 도메인, 및 FOG1을 포함하는 제2 리프레서 도메인, 예를 들어 FOG1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 32(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 32의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
FOG1-dCas9-FOG1(MR-29434)
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 44 또는 79의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 44 또는 79의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
FOG1-dCas9-FOG1
HA 태그를 갖지 않는 FOG1-dCas9-FOG1
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 DNA-표적화 모이어티, 및 DNMT를 포함하는 리프레서 도메인, 예를 들어 DNMT3b 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 15(예를 들어, 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA))의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT3b
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 서열번호 16 또는 37의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서는 서열번호 16 또는 37의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 이것과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 위치에서 상이한 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT3b
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-DNMT3b
기능적 특성
본 개시내용의 발현 억제 시스템은 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현의 감소는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 RNA, 예를 들어 mRNA의 수준의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현의 감소는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 수준의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현의 감소는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA 및 단백질의 수준의 둘 모두의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 표적 유전자의 발현은 발현 억제 시스템에 의해 접촉되지 않거나 이를 포함하지 않는 세포 내의 표적 유전자의 발현의 수준보다 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100× 더 낮다. 표적 유전자의 발현은 RT-PCR, ELISA, 웨스턴 블롯을 포함한 당업자에게 알려진 방법, 및 실시예 2 내지 실시예 4의 방법에 의해 검정될 수 있다.
본 개시내용의 발현 억제 시스템은 일정 기간 동안 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 표적 유전자의 발현은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 상당히 감소된다. 선택적으로, 발현 억제 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 표적 유전자의 발현은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하의 기간 동안 상당히 감소된다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서 또는 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 표적의 발현은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열 동안 상당히 감소된다. 본 개시내용의 발현 리프레서 또는 시스템은 표적 영역 내의 CpG 뉴클레오티드를 메틸화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 메틸화는 본 명세서에 개시된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템에 의한 처리 후 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 15일, 또는 적어도 22일 동안 지속된다.
발현 억제 시스템은 복수의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 각 발현 리프레서는 또 다른 발현 리프레서의 리프레서 도메인과 상이한 기능성을 갖는 리프레서 도메인을 포함한다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 2개의 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 발현 리프레서는 히스톤 데아세틸라제 기능성을 포함하는 제1 리프레서 도메인을 포함하고, 제2 발현 리프레서는 DNA 메틸트랜스퍼라제 기능성을 포함하는 제2 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자의 발현의 억제에 대해 서로 상보적인 기능성을 갖는 리프레서 도메인들의 조합을 포함하는 발현 리프레서를 포함하며, 예를 들어 이들 기능성은 함께, 발현의 억제를 가능하게 하고, 선택적으로, 개별적으로 존재할 때에는 발현을 억제하지 않거나 무시할 만한 정도로 억제한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 복수의 발현 리프레서를 포함하며, 각 발현 리프레서는 서로의 발현 리프레서의 리프레서 도메인과 상보적인 리프레서 도메인을 포함하며, 예를 들어 각 리프레서 도메인은 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은, 표적 유전자의 발현의 억제에 대해 서로 상승작용하는 기능성을 갖는 리프레서 도메인들의 조합을 포함하는 발현 리프레서들을 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 다수의 억제 후성유전학적 마커(예를 들어, 다수의 상이한 유형의 후성유전학적 마커 및/또는 주어진 유형의 더 광범위한 마킹)가 개별적으로, 단독으로의 개별적인 변형보다 더 효과적으로 발현을 함께 감소시킨다는 점에서(예를 들어, 발현의 더 큰 감소의 생성 및/또는 발현의 더 오래 지속된 감소), 게놈 유전자좌에 대한 후성유전학적 변형은 누적되는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 복수의 발현 리프레서를 포함하며, 각 발현 리프레서는 서로의 발현 리프레서의 리프레서 도메인과 상승작용하는 리프레서 도메인을 포함하며, 예를 들어 각 리프레서 도메인은 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, (서로 상승작용하는 복수의 상이한 리프레서 도메인을 포함하는 복수의 발현 리프레서를 포함하는) 발현 억제 시스템이 개별 발현 리프레서, 예를 들어 그리고, 그의 단일 리프레서 도메인보다 표적 유전자의 발현을 억제하는 데 더 효과적이다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 개별 발현 리프레서보다 표적 유전자의 발현을 억제하는 데 있어서 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100×만큼 효과적이다. 후성유전학적 마커의 수준은 전체 게놈 중아황산염 서열분석, 감소된 표현의 중아황산염 서열분석, 중아황산염 앰플리콘 서열분석, 메틸화 어레이, 파이로시퀀싱, ChIP-seq, 또는 ChIP-qPCR을 포함한 당업자에게 알려진 방법에 의해 검정될 수 있다.
리프레서의 조합
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함하며, 제1 리프레서 도메인과 제2 리프레서 도메인은 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 제1 후성유전학적 변형 모이어티(예를 들어, 제1 후성유전학적 마커를 증가시키거나 감소시키는 것) 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 제2 후성유전학적 변형 모이어티(예를 들어, 제2 후성유전학적 마커를 증가시키거나 감소시키는 것) 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 히스톤 데아세틸라제 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 기능성 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB(예를 들어, KRAB 도메인), SET 도메인(예를 들어, SETDB1 EZH2, G9A, 또는 SUV39H1의 SET 도메인), 히스톤 데메틸라제 LSD1, FOG1(예를 들어, FOG1의 N-말단 잔기), HDAC8, MQ1, DNMT1, DNMT3a/3l, 또는 KAP1, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 KRAB(예를 들어, KRAB 도메인), SET 도메인(예를 들어, SETDB1 EZH2, G9A, 또는 SUV39H1의 SET 도메인), 히스톤 데메틸라제 LSD1, FOG1(예를 들어, FOG1의 N-말단 잔기), DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A), DNMT3B, DNMT3L, DNMT3A/3L 복합체, 또는 박테리아 MQ1, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT3A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT3B 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT3L 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT3A/3L 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 SET 도메인 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 LSD1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 FOG1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 리프레서 도메인은 KAP1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서(여기서, 제1 발현 리프레서는 dCas9-MQ1, dCas9-DNMT1, dCas9-DNMT3a/3l, G9A-dCas9, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1, EZH2-dCas9, EZH2-dCas9-KRAB, G9a-dCas9-KRAB, 및 Fog1-dCas9-Fog1로부터 선택되는 발현 리프레서임) 및 제2 발현 리프레서(여기서, 제2 발현 리프레서는 dCas9-MQ1, dCas9-DNMT1, dCas9-DNMT3a/3l, G9A-dCas9, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1, EZH2-dCas9, EZH2-dCas9-KRAB, G9a-dCas9-KRAB, 및 Fog1-dCas9-Fog1로부터 선택되는 발현 리프레서임)를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 제1 핵산(여기서, 발현은 제1 프로모터 또는 IRES에 의해 구동됨), 및 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 제2 핵산(여기서, 발현은 제2 프로모터 또는 IRES에 의해 구동됨)에 의해 인코딩된다.
표적 부위
본 명세서에 개시된 발현 억제 시스템은 세포, 예를 들어 대상체 또는 환자의 세포 내의 표적 유전자의 발현을 조절하기에, 예를 들어 감소시키기에 유용하다. 표적 유전자는 당업자에게 알려진 임의의 유전자일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 대상체, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간, 소, 말, 양, 닭, 래트, 마우스, 고양이, 또는 개에서의 질환 또는 병태과 연관되어 있다. 표적 유전자는 코딩 서열, 예를 들어 엑손, 및/또는 비-코딩 서열, 예를 들어 인트론, 3'UTR, 또는 5'UTR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다.
본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템의 발현 리프레서에 사용하기에 적합한 DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 앵커 서열(예를 들어, 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부는, 그러한 연접부의 파괴가 표적 유전자의 발현을 변경시킨다면, 표적 유전자에 작동가능하게 연결됨)) 내의 임의의 부위에 결합할, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 엑손 내의 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 인트론 내의 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 엑손 및 인트론의 경계에 있는 부위, 예를 들어 스플라이스 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 5'UTR 내의 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 3'UTR 내의 부위에 결합한다. 표적 유전자는 β-2-마이크로글로불린을 인코딩하는 유전자, MYC를 인코딩하는 유전자, HSPA1B를 인코딩하는 유전자, GATA1을 인코딩하는 유전자, APOB를 인코딩하는 유전자, FOXP3을 인코딩하는 유전자, CXCL1을 인코딩하는 유전자, CXCL2를 인코딩하는 유전자, CXCL3을 인코딩하는 유전자, CXCL4를 인코딩하는 유전자, CXCL5를 인코딩하는 유전자, CXCL6을 인코딩하는 유전자, CXCL7을 인코딩하는 유전자, 및 CXCL8을 인코딩하는 유전자를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터의 일부분 또는 그 안의 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자의 전사 개시 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 인핸서의 일부분 또는 그 안의 부위에 결합한다. 프로모터는 통상적으로, 연관된 유전자의 전사를 개시하는 서열 요소이다. 프로모터는 통상적으로 유전자의 5' 단부 부근에 있되, 그의 전사 개시 부위로부터 멀리 떨어져 있지 않다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 진핵 세포에서의 단백질-코딩 유전자의 전사는 통상적으로, RNA 중합효소 II를 전사 개시 부위로 유도하는 전개시 복합체(preinitiation complex)로서의 코어 프로모터 서열에 대한 일반적인 전사 인자(예를 들어, TFIID, TFIIE, TFIIH 등) 및 메디에이터의 결합에 의해 개시되고, 많은 경우에 1차 전사체의 RNA 중합효소 탈출 및 신장이 개시된 후조차도 코어 프로모터 서열에 결합된 상태로 남아 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 TATA, Inr, DPE, 또는 BRE와 같은 서열 요소를 포함하지만, 당업자는 그러한 서열이 프로모터를 정의하는 데 반드시 필요한 것은 아님을 잘 인식하고 있다. 당업자는 유전자와 연관된 다양한 양성(예를 들어, 인핸서) 또는 음성(예를 들어, 리프레서 또는 사일런서) 전사 제어 요소에 익숙하다. 일부 구현예에서, 전사 제어 요소는 전사 인자 결합 부위이다. 통상적으로, 동종 조절 단백질이 그러한 전사 제어 요소에 결합될 때, 연관된 유전자(들)로부터의 전사가 변경된다(예를 들어, 증가되거나 감소된다).
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 앵커 서열, 예를 들어 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부는, 그러한 연접부의 파괴가 표적 유전자의 발현을 변경시킨다면, 표적 유전자에 작동가능하게 연결됨)에 결합한다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 인간 CXCL1 내지 CXCL8을 포함하는 앵커 서열 매개 연접부(ASMC)의 앵커 서열에 결합하거나 그것에 근접한다. 일반적으로, 앵커 서열은 게놈 복합체 성분이 특이적으로 결합하는 게놈 서열 요소이다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분의 결합은 복합체 형성, 예를 들어 앵커 서열-매개 연접부 형성을 핵형성한다. 각 앵커 서열-매개 연접부는 하나 이상, 예를 들어 복수의 앵커 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 표적 유전자의 발현을 변경시키도록, 예를 들어 억제하도록 파괴될 수 있다. 그러한 파괴는, 예를 들어 DNA의 토폴로지 구조를 변경시킴으로써, 예를 들어 전사 제어 요소(예를 들어, 인핸싱 및 침묵/억제 서열)와 상호작용할 수 있는 표적 유전자의 능력을 조절함으로써, 유전자 발현을 조절할 수 있다.
본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템의 발현 리프레서에 사용하기에 적합한 DNA-표적화 모이어티는 표적 유전자에 근접한 부위(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소에 근접한 부위, 또는 앵커 서열, 예를 들어 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부는, 그러한 연접부의 파괴가 표적 유전자의 발현을 변경시킨다면, 표적 유전자에 작동가능하게 연결됨)에 근접한 부위에 결합할, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, '근접한'은, 제1 부위에서의 발현 리프레서의 결합 및/또는 발현 리프레서에 의한 제1 부위의 변형이 나머지 다른 한쪽 부위의 결합 및/또는 변형과 동일하거나 실질적으로 동일한 효과를 생성하도록 할 2개의 부위, 예를 들어 핵산 부위의 접근(closeness)을 지칭한다. 예를 들어, DNA-표적화 모이어티는 인핸서(제2 부위)에 근접한 제1 부위에 결합할 수 있고, 상기 DNA-표적화 모이어티와 연관된 리프레서 도메인은, 표적 유전자의 발현에 대한 인핸서의 효과가 마치 제2 부위(인핸서 서열)가 결합되고/되거나 변형된 것처럼 실질적으로 동일하게 변형되도록 제1 부위를 후성유전학적으로 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자에 근접한 부위(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소에 근접한 부위, 또는 앵커 서열에 근접한 부위는 표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 전사 제어 요소, 또는 앵커 서열로부터 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 또는 25개 미만의 염기쌍만큼(그리고 선택적으로, 표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 전사 제어 요소, 또는 앵커 서열)로부터 적어도 20, 25, 50, 100, 200, 또는 300개의 염기쌍만큼) 떨어져 있다.
본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템의 발현 리프레서에 사용하기에 적합한 DNA-표적화 모이어티는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍(그리고 선택적으로, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 또는 염기쌍)을 포함하는 부위에 결합할, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함하는 부위에 결합한다.
본 개시내용의 발현 억제 시스템은 2개 이상의 발현 리프레서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서들은 각각 상이한 DNA-표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은, 예를 들어 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내의 제1 부위에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및, 예를 들어 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내의 제2 부위에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 제1 부위와 제2 부위는 상이한 비중첩 부위일 수 있으며, 예를 들어 제1 부위와 제2 부위는 공통적으로 어떠한 서열도 공유하지 않는다. 제1 부위와 제2 부위는 상이하지만 중첩된 부위일 수 있으며, 예를 들어 제1 부위와 제2 부위는 상이한 서열을 포함하지만, 공통적으로 얼마간의 서열을 공유한다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 서열번호 1 내지 21로부터 선택되는 서열 또는 그것과 대비하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 변경을 갖는 서열에 결합한다.
ACGGCGGGCCACCAAGGAGA(서열번호 6)
CAGCGCCGCGCCTTTGGGAC(서열번호 7)
CCCTTTCGGCGGGGAGCAGGG(서열번호 8)
GCTGCGCTGGGGGAGCCAGAG(서열번호 9)
AGCGCCCCTCCACGCGTTCAC(서열번호 10)
일부 구현예에서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나를 포함하는 서열에 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나를 포함하는 서열에 결합하며, 제1 DNA-표적화 모이어티와 제2 DNA-표적화 모이어티는 동일한 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나를 포함하는 서열에 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나를 포함하는 서열에 결합하며, 제1 표적화 모이어티와 제2 표적화 모이어티는 상이한 서열에 결합한다.
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 본 명세서에 제시된 서열, 예를 들어 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나를 갖는 게놈 유전자좌에 결합한다. 많은 경우에, 결합되는 게놈 유전자좌는 이중 가닥 DNA를 포함하고, 이 유전자좌는 그의 센스 가닥 또는 그의 안티센스 가닥의 서열을 제공함으로써 기재될 수 있음이 이해된다. 따라서, 제공된 스페이서 서열을 갖는 gRNA는 발현 리프레서가 특정 게놈 유전자좌에 결합되게 할 수 있으며, 여기서 게놈 유전자좌의 한쪽 가닥은 스페이서 서열과 유사하거나 동일한 서열을 갖고, 게놈 유전자좌의 나머지 다른 한쪽 가닥은 상보적 서열을 갖는다. 통상적으로, 게놈 유전자좌에 대한 gRNA 결합은 게놈 유전자좌의 약간의 풀림(unwinding) 및 gRNA 스페이서와 이 스페이서와 상보적인 가닥의 쌍형성을 수반할 것이다.
일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프, 예를 들어 다음과 같은 CTCF-결합 모티프를 포함한다: N(T/C/G)N(G/A/T)CC(A/T/G)(C/G)(C/T/A)AG(G/A)(G/T)GG(C/A/T)(G/A)(C/G)(C/T/A)(G/A/C)(서열번호 81)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임).
CTCF-결합 모티프는 또한 반대 배향일 수 있으며, 예를 들어 (G/A/C)(C/T/A)(C/G)(G/A)(C/A/T)GG(G/T)(G/A)GA(C/T/A)(C/G)(A/T/G)CC(G/A/T)N(T/C/G)N(서열번호 82)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)이다.
일부 구현예에서, 앵커 서열은 서열번호 81 또는 서열번호 82를 포함하거나, 서열번호 81 또는 서열번호 82 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프, 예를 들어 다음과 같은 YY1-결합 모티프를 포함한다: CCGCCATNTT(서열번호 83)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임).
YY1-결합 모티프는 또한 반대 배향일 수 있으며, 예를 들어 AANATGGCGG(서열번호 84)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)이다.
본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템의 발현 리프레서에 사용하기에 적합한 표적화 모이어티는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍(그리고 선택적으로, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 또는 염기쌍)을 포함하는 부위에 결합할, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 모이어티는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함하는 부위에 결합한다.
본 개시내용의 발현 억제 시스템은 2개 이상의 발현 리프레서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서들은 각각 상이한 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 엑손 인트론 경계(예를 들어, 스플라이스 부위)에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제1 발현 리프레서, 및 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 결합하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 제2 발현 리프레서를 포함한다.
기타 다른 조성물
핵산 및 벡터
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템은 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 통해 제공될 수 있으며, 핵산은 관심 시스템 내에서(예를 들어, 특정 세포, 조직, 유기체 등 내에서) 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들)의 발현을 달성하기에 충분한 기타 다른 서열과 연관되어 있다.
일부 특정 구현예에서, 본 개시내용은 발현 억제 시스템, 하나 이상의 발현 리프레서, 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산의 조성물을 제공한다. 일부 그러한 구현예에서, 제공된 핵산은 DNA, RNA, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 핵산 모이어티 또는 실체이거나 이를 포함할 수 있으며, 본 명세서에 기재되거나 당업계에서 달리 이용 가능한 임의의 기술(예를 들어, 합성, 클로닝, 증폭, 시험관내 또는 생체내 전사 등)에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템, 하나 이상의 발현 리프레서, 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 제공된 핵산은 관심 시스템 내에서(예를 들어, 특정 세포, 조직, 유기체 등 내에서) 제공된 핵산의 통합, 복제, 및/또는 발현을 달성하기에 적절하고/하거나 충분한 하나 이상의 복제, 통합, 및/또는 발현 신호와 조작적으로 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템을 전달하기 위한 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들)의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 전달하기 위한 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들)의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 RNA, 예를 들어 mRNA이거나 이를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 또는 본 명세서에 기재된 단백질을 인코딩하는 핵산이 벡터 내로 도입될 수 있다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 것들을 포함한 벡터가 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구인데, 그 이유는, 이들은 이식유전자의 장기간의 안정한 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문이다. 벡터의 예에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열화 벡터가 포함된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 다양한 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다.
천연 또는 합성 핵산의 발현은 통상적으로 관심 유전자를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고 작제물을 발현 벡터 내로 도입함으로써 달성된다. 벡터는 진핵세포에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 통상적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현에 유용한 프로모터를 함유한다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸싱 서열은 전사 개시의 빈도를 조절할 수 있다. 통상적으로, 이들 서열은 전사 개시 부위의 30 내지 110 bp 상류 영역 내에 위치되지만, 다수의 프로모터가 마찬가지로 전사 개시 부위의 하류에 기능성 요소를 포함하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소간의 간격은 빈번하게 가요성이어서, 요소들이 서로에 대해 역전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서는, 활성의 감소가 시작되기 전에 프로모터 요소간의 간격이 증가되어 50 bp로 떨어질 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들이 전사를 활성화하도록 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 나타난다.
적합한 프로모터의 한 예는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 강력한 구성적 프로모터 서열로서, 이것에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 프로모터는 연장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있으며, 이에는 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대 제한 없이, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 개시내용은 임의의 특정 프로모터 또는 프로모터 카테고리(예를 들어, 구성적 프로모터)의 사용으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 프로모터가 본 개시내용의 일부로서 고려된다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 사용은, 그것에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 요구될 때, 그러한 발현을 켤 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 사용은, 발현이 요구되지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예에는 메탈로티오닌(metallothionine) 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 도입하려는 발현 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 어느 하나 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 일부 양태에서, 선택가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에서 운반되어 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두에는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기에 적절한 전사 제어 서열이 측접될 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는, 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하는 데 그리고/또는 전사 제어 서열의 기능성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는, (리포터 유전자의) 수용자 공급원에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 어떠한 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소 활성 또는 시각화 가능한 형광에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 최고 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 측접 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 확인된다. 그러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어, 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용물질을 평가하는 데 사용될 수 있다.
세포
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 포함하는 세포에 관한 것이다. 당업자에게 알려진 임의의 세포, 예를 들어 세포주, 예를 들어 재조합 폴리펩티드의 발현에 적합한 세포주가 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템을 포함하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 세포주가 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 세포주가 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터를 발현하거나 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 제1 발현 리프레서의 제1 성분을 인코딩하는 제1 핵산, 및 발현 억제 시스템, 예를 들어 제2 발현 리프레서의 제2 성분을 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포가 2개 이상의 발현 리프레서를 포함하는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 경우, 각 발현 리프레서를 인코딩하는 서열은 별개의 핵산 분자 상에, 예를 들어 상이한 벡터 상에, 예를 들어 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 제1 벡터 및 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 제2 백터 상에 배치된다. 일부 구현예에서, 각 발현 리프레서를 인코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자 상에, 예를 들어 동일한 벡터 상에 배치된다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산의 일부 또는 전부가 세포의 게놈 DNA 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 세포의 게놈 DNA 내로 통합되고, 발현 억제 시스템의 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 세포의 게놈 DNA 내로 통합되지 않는다(예를 들어, 벡터 상에 위치한다). 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템의 제1 및 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산(들)은, 예를 들어 게놈 DNA 내의 동일한(예를 들어, 인접하거나 공국재화된) 또는 상이한 부위에서 세포의 게놈 DNA 내로 통합된다.
본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템 또는 발현 리프레서를 포함하고/하거나 발현할 수 있는 세포의 예에는 간세포, 뉴런 세포, 내피 세포, 근세포, 및 림프구가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 방법 또는 공정에 의해 제조된 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템을 제공하는 단계, 세포를 제공하는 단계, 세포를 발현 억제 시스템(또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 억제 시스템 또는 핵산을 포함하는 조성물)과 접촉시키는 단계를 수행함으로써 생성되는 세포를 제공한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템과 접촉된 세포는 발현 억제 시스템에 의해 접촉되지 않은 유사한 세포와 비교하여, 표적 유전자의 발현의 감소 및/또는 표적 유전자, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열과 연관된 후성유전학적 마커의 변형을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 상기의 표적 유전자의 발현의 감소 및/또는 후성유전학적 마커의 변형을 나타내는 세포가 발현 억제 시스템을 포함하지 않는다. 발현의 감소 및/또는 후성유전학적 마커의 변형은, 예를 들어, 발현 억제 시스템과의 접촉 후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 지속될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템에 의해 사전에 접촉된 세포는 발현 억제 시스템이 세포 내에 더 이상 존재하지 않게 된 후에 발현의 감소 및/또는 후성유전학적 마커의 변형을 보유하며, 예를 들어, 발현 억제 시스템이 세포 내에 더 이상 존재하지 않게 된 후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 보유한다.
발현 억제 시스템 및/또는 발현 리프레서의 제조 방법
일부 구현예에서, 발현 리프레서는 단백질이거나 이를 포함하며, 이에 따라 단백질의 제조 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들)는 하나 이상의 단백질을 포함하며, 이에 따라 단백질의 제조 방법에 의해 생성될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, (본 명세서에 기재된 바와 같은 조절제 내에 포함될 수 있는) 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에서 일상적이다. 일반적으로, 문헌[Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005)]; 및 문헌[Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, Springer (2013)]을 참조한다.
본 개시내용의 조성물의 단백질 또는 폴리펩티드는 표준 고상(solid phase) 기법을 사용함으로써 생화학적으로 합성될 수 있다. 그러한 방법은 전체 고상 합성 방법, 부분 고상 합성 방법, 단편 축합, 고전적 용액 합성을 포함한다. 이들 방법은 펩티드가 비교적 짧을 때(예를 들어, 10 kDa) 그리고/또는 그것이 재조합 기법에 의해 생성될 수 없을 때(즉, 핵산 서열에 의해 인코딩되지 않을 때) 사용될 수 있으며, 이에 따라 상이한 화학을 수반한다.
고상 합성 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌[John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984]; 및 문헌[Coin, I., et al., Nature Protocols, 2:3247-3256, 2007]에 의해 추가로 기재되어 있다.
더 긴 펩티드의 경우, 재조합 방법이 사용될 수 있다. 재조합 치료용 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에서 일상적이다. 일반적으로, 문헌[Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005)]; 및 문헌[Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, Springer (2013)]을 참조한다.
재조합 단백질은 또한 곤충 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포를 사용하여 적절한 프로모터 제어 하에 생산될 수도 있지만, 치료적 약학 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하기 위한 예시적인 방법은 포유동물 세포에서의 발현을 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터, 및 기타 5' 또는 3' 측접하는 비-전사 서열과 같은 비-전사 요소들, 및 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 및 종료 서열과 같은 5' 또는 3' 비번역 서열을 포함할 수 있다. SV40 바이러스 게놈, 예를 들어 SV40 기원으로부터 유래된 DNA 서열, 초기 프로모터, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위는 이종 DNA 서열의 발현에 필요한 기타 유전자 요소를 제공하는 데 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와의 사용을 위한 적절한 클로닝과 발현 벡터가 문헌[Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)]에 기재되어 있다.
대량의 단백질 또는 폴리펩티드가 필요한 경우, 그것은 문헌[Brian Bray, Nature Reviews Drug Discovery, 2:587-593, 2003]; 및 문헌[Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463]에 기재된 바와 같은 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 단백질 발현 및 제조를 위해 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예에는 CHO 세포, COS 세포, HeLA 및 BHK 세포주가 포함된다. 단백질 치료제의 생산을 위한 숙주 세포 배양의 과정은 문헌[Zhou and Kantardjieff (Eds.), Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology), Springer (2014)]에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 재조합 단백질을 인코딩하는, 벡터, 예컨대 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터는 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 재조합 단백질을 인코딩하는 벡터, 예컨대 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 캡슐화하는 지질 나노입자는 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
단백질은 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 아미노산은, 예를 들어 하나 이상의 펩티드 결합의 형성을 통해 폴리펩티드 사슬 내로 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 비천연 아미노산이고; 일부 구현예에서, 아미노산은 D-아미노산이며; 일부 구현예에서, 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 자연 발생 펩티드에서 일반적으로 발견되는 20개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "비표준 아미노산"은 그것이 합성에 의해 제조되는지 또는 천연 공급원으로부터 수득되는지의 여부에 관계 없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 내의 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함한 아미노산은 상기 일반적인 구조와 비교하여 구조적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조와 비교하여 메틸화, 아미드화, 아세틸화, PEG화, 글리코실화, 인산화, 및/또는 치환(예를 들어, 아미노 기, 카르복실산 기, 하나 이상의 양성자, 및/또는 하이드록실 기의 치환)에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 변형은, 예를 들어 달리 동일한 비변형된 아미노산을 함유하는 것와 비교하여, 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 순환 반감기를 변경시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 변형은, 달리 동일한 비변형된 아미노산을 함유하는 것와 비교하여, 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 관련 활성을 유의하게 변경시키지 않는다. 맥락으로부터 명백한 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 "아미노산"은 유리 아미노산을 지칭하는 데 사용될 수 있으며; 일부 구현예에서 그것은 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 지칭하는 데 사용될 수 있다.
단백질 치료제의 정제는 문헌[Franks, Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization, Humana Press (2013)]; 및 문헌[Cutler, Protein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010)]에 기재되어 있다. 단백질 치료제의 제형은 문헌[Meyer (Ed.), Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic, Woodhead Publishing Series (2012)]에 기재되어 있다.
약제학적 조성물, 제형, 전달, 및 투여
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 포함하는 약제학적 조성물, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및/또는 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 세포, 조직, 기관, 및/또는 대상체에게 전달하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 당업자에게 알려진 약제학적으로 허용되는 담체)와 함께 제형화된 활성제(예를 들어, 발현 리프레서 또는 발현 수용체의 핵산, 예를 들어 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들), 또는 이를 인코딩하는 핵산)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 사전결정된 치료적 효과를 달성할 통계학적으로 유의한 확률을 보여주는 치료 계획에 투여하기에 적절한 단위 용량으로 존재한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 발현 리프레서를 포함하는 약제학적 조성물은 발현 리프레서 또는 이를 인코딩하는 핵산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 발현 억제 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 발현 억제 시스템의 각각의 발현 리프레서 또는 이를 인코딩하는 핵산(들)을 포함한다(예를 들어, 발현 억제 시스템이 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함한다면, 약제학적 조성물은 제1 및 제2 발현 리프레서를 포함한다). 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 복수의 발현 리프레서를 포함하는 발현 억제 시스템의 발현 리프레서 전부보다 적게 포함한다. 예를 들어, 발현 억제 시스템은 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서를 포함할 수 있으며, 제1 약제학적 조성물은 제1 발현 리프레서 또는 이를 인코딩하는 핵산를 포함할 수 있고 제2 약제학적 조성물은 제2 발현 리프레서 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 형태로의 투여를 위해 특수하게 제형화될 수 있으며, 이에는 하기에 맞게 구성된 것들이 포함된다: 경구 투여, 예를 들어 드렌치(drench)(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어 협측, 설하, 및 전신 흡수를 목표로 한 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 비경구 투여, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 투여, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출 제형으로서의 주사; 국소 적용, 예를 들어 피부, 폐, 또는 구강에 적용되는 크림, 연고, 또는 제어-방출 패치 또는 스프레이로서의 적용; 질내 또는 직장내 투여, 예를 들어 페서리(pessary), 크림, 또는 폼(foam)으로서의 투여; 설하 투여; 안내 투여(ocularly); 경피 투여; 또는 비강, 폐, 및/또는 기타 다른 점막 표면 투여.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 적절한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이득/위험 비에 부합하면서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상 화합물을 하나의 기관, 또는 신체의 일부분을 또 다른 기관, 또는 신체의 일부분으로 운반 또는 수송하는 데 관여하는 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각 담체는, 제형의 나머지 다른 성분들과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용되어야" 한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질은 하기를 포함한다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말형 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열성 물(pyrogen-free water); 등장 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약제학적 제형에 사용되는 기타 다른 무독성 상용성 물질.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적 맥락에서 사용하기에 적절한 그러한 화합물의 염, 즉, 올바른 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 효과/위험 비에 부합하는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge외 다수는 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)]에서 약제학적으로 허용되는 염을 상세히 기재한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 비독성 산 부가 염을 포함하지만 이로 한정되지 않으며, 이때 비독성 산 부가 염은 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 함께 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산, 또는 말론산과 함께 형성되는 아미노 기의 염이거나, 당업계에서 사용되는 다른 방법, 예컨대 이온 교환을 사용함으로써 형성된 것이다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이셀페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄퍼레이트, 캄퍼설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 대표적인 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 할라이드, 하이드록사이드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 설포네이트, 및 아릴 설포네이트와 같은 반대이온을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는, 일반적으로 안전하고, 비독성이고, 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 포함하고, 인간의 약제학적 용도뿐만 아니라 수의용 용도에 허용되는 부형제를 포함한다. 그러한 부형제는 고체, 액체, 반고체이거나, 에어로졸 조성물의 경우에는 가스상일 수 있다.
약제학적 제제는, 정제 형태에 대해서는 필요에 따라 밀링, 혼합, 과립화, 및 압축을; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태에 대해서는 밀링, 혼합, 및 충전을 수반하는 통상적인 조제 기법에 따라 제조될 수 있다. 액체 담체가 사용될 때, 제제는 시럽, 엘릭서, 에멀젼 또는 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 그러한 액체 제형은 직접 os(경구) 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통한 세포 및/또는 대상체에 대한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 대상체에 대한 투여 방식은 주사, 주입, 흡입, 비강내, 안내(intraocular), 국소 전달, 캐뉼러내 전달, 또는 섭취를 포함할 수 있다. 주사는, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수강내, 뇌실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 에어로졸 흡입, 예를 들어 네뷸라이제이션에 의한 에어로졸 흡입을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 전신(예를 들어, 경구, 직장, 비강, 설하, 협측, 또는 비경구), 장내(예를 들어, 전신에 미치는 효과를 갖지만, 위장관을 통해 전달됨), 또는 국부(예를 들어, 피부 상에의 국부 적용, 유리체강내 주사) 투여이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조성물이 전신 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 비경구외(non-parenteral) 투여이고, 치료제는 비경구 치료제이다. 일부 구현예에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 점적주입에 의함), 협측, 진피(이는, 예를 들어 진피, 피내, 피간, 경피 등에 대한 국소 투여 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있음), 장내, 동맥내, 피내, 위내, 수내, 근육내, 비강내, 복막내, 수강내, 정맥내, 뇌실내, 특정 기관 내(예를 들어, 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(tracheal)(예를 들어, 기관내 점적주입에 의함), 질내, 유리체 투여 등일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 투여는 단회 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 복수의 용량이 시간적으로 분리됨) 및/또는 주기적(예를 들어, 개별 용량이 공통된 기간에 의해 분리됨) 투여를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투여(예를 들어, 관류)를 수반할 수 있다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료적 유효량은 주어진 대상체에서 치료 효능의 관점에서 가장 효과적인 결과를 가져오게 될 조성물의 양이다. 이 양은 치료적 화합물의 특성(활성, 약동학적 특성, 약력학적 특성, 및 생체이용률을 포함함), 대상체의 생리학적 조건(연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 전반적인 신체적 상태, 주어진 투여량에 대한 반응, 및 투약물의 유형을 포함함), 제형에서의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 성질, 및/또는 투여 경로를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 치료제를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 게놈 복합체 조절제는 치료제이고/이거나 치료제의 전달은 치료제의 부재 하에서의 유전자 발현과 대비하여 유전자 발현의 변화를 야기한다.
본 명세서의 다양한 구현예에 제공된 바와 같은 방법이 본 명세서에 기재된 임의의 일부 양태에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 특정 세포, 또는 하나 이상의 특정 조직에 표적화된다.
예를 들어, 일부 구현예에서 하나 이상의 조성물은 상피, 결합, 근육, 및/또는 신경 조직 또는 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 조성물은, 예를 들어 다음과 같은 특정 기관계의 세포 또는 조직에 표적화된다: 심혈관계(심장, 혈관계); 소화계(식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 장, 결장, 직장 및 항문); 내분비계(시상하부, 뇌하수체, 송과체 또는 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신); 배설계(신장, 요관, 방광); 림프계(림프, 림프절, 림프관, 편도선, 인두편도, 흉선, 비장); 외피계(피부, 모발, 손발톱); 근육계(예를 들어, 골격근); 신경계(뇌, 척수, 신경); 생식기계(난소, 자궁, 유선, 고환, 수정관, 정낭, 전립선); 호흡계(인두, 후두, 기관, 기관지, 폐, 횡격막); 골격계(뼈, 연골); 및/또는 이들의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 혈액-뇌 장벽, 태반막, 또는 혈액-고환 장벽을 횡단한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 약제학적 조성물은 전신 투여된다.
일부 구현예에서, 투여는 비경구외 투여이고, 치료제는 비경구 치료제이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 활성제 단독과 비교하여 개선된 PK/PD, 예를 들어 증가된 약동학적 특성 또는 약력학적 특성, 예컨대 개선된 표적화, 흡수, 또는 수송(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 개선되거나 그 이상임)을 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료제 단독과 비교하여 바람직하지 않은 효과의 감소, 예컨대 비표적 위치로의 확산, 탈표적(off-target) 활성, 또는 독성 대사의 감소를 갖는다(예를 들어, 활성제 단독과 대비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 그 이상이 감소됨). 일부 구현예에서, 조성물은 활성제 단독과 비교하여 (예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 그 이상) 치료제의 효능을 증가시키고/시키거나 독성을 감소시킨다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 예를 들어 담체, 예컨대 약제학적 담체 및/또는 중합체 담체, 예를 들어 리포좀 또는 소포를 포함하는 것으로 제형화되고, 알려진 방법에 의해 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 농업용 동물 또는 가축 동물, 예를 들어 소, 개, 고양이, 말, 돼지)에게 전달될 수 있다. 그러한 방법은 형질감염(예를 들어, 지질-매개, 양이온성 중합체, 인산칼슘); 전기천공 또는 막 파괴(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)) 및 바이러스 전달(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV)의 기타 다른 방법을 포함한다. 전달 방법은 또한, 예를 들어 문헌[Gori et al., Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. July 2015, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074]; 및 문헌[Zuris et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2014 Oct 30;33(1):73-80]에 기재되어 있다.
리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단층(unilamellar) 또는 다층(multilamellar) 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구형의 소포 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성, 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 생체적합성이고, 비독성이며, 친수성 및 친유성 약물 분자 둘 모두를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고(cargo)를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소포는 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만, 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 일반적으로 사용된다. 소포는, 제한 없이, DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB를 단독으로 또는 콜레스테롤과 함께 포함하여 DOTMA와 콜레스테롤, DOTAP와 콜레스테롤, DOTIM과 콜레스테롤, 및 DDAB와 콜레스테롤을 생성할 수 있다. 다층 소포 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 6,693,086을 참조하며, 다층 소포 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 소포 형성이 자발적일 수 있지만, 그것은 또한 균질기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 전단 형태로 힘을 인가함으로써 촉진될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이, 크기 감소 필터를 통해 압출함으로써 압출된 지질이 제조될 수 있으며, 압출된 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 질환, 장애, 및/또는 병태의 증상을 경감시키는 충분한 계획에 의해 투여되는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 투여함으로써 치료제를 전달하는 방법을 제공한다.
용도
본 개시내용은 추가로 본 명세서에 개시된 발현 억제 시스템의 용도에 관한 것이다. 특히, 일부 구현예에서 그러한 제공된 기술은 표적 유전자 발현의 조절, 예를 들어 억제를 달성하는 데, 그리고 예를 들어, 이를 테면 세포 내에서의 표적 유전자 활성, 전달, 및 침투의 제어를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 체세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 포유류 체세포이다. 일부 구현예에서, 포유류 체세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 포유류 체세포는 비배아 세포이다.
투여량
투여되는 작용제 또는 조성물의 투여량은, 예를 들어 치료되는 병태, 질환의 중증도, 대상체의 개별 파라미터(연령, 생리학적 조건, 크기 및 체중), 치료 지속기간, (존재하는 경우) 수행될 치료의 유형, 특정 투여 경로 및 유사한 인자에 기반하여 달라질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 작용제의 투여되는 용량은 그러한 다양한 파라미터에 좌우될 수 있다. 투여되는 조성물의 투여량은 또한 대상체의 성별, 전반적인 의학적 상태, 및 치료하려는 장애의 중증도와 같은 기타 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 대상체에게 상황에 따라 본 명세서에 개시된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템 또는 발현 리프레서들의 조합의 투여량을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에게는 상황에 따라 본 명세서에 개시된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템 또는 발현 리프레서들의 조합의 투여량이 제공된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료적 유효량은 주어진 대상체에서 치료 효능의 관점에서 가장 효과적인 결과를 가져오게 될 조성물의 양이다. 이 양은 치료적 화합물의 특성(활성, 약동학적 특성, 약력학적 특성, 및 생체이용률을 포함함), 대상체의 생리학적 조건(연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 전반적인 신체적 상태, 주어진 투여량에 대한 반응, 및 투약물의 유형을 포함함), 제형에서의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 성질, 및/또는 투여 경로를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
지질 나노입자
본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템은 입자를 포함한 임의의 생물학적 전달 시스템/제형, 예를 들어 나노입자 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 나노입자는 치수(예를 들어, 직경)가 약 1 내지 약 1000 나노미터, 약 1 내지 약 500 나노미터 크기, 약 1 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 75 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 및 이들 사이의 임의의 범위인 입자를 포함한다. 나노입자는 나노규모 치수들의 복합 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 나노입자는 통상적으로 구형이지만, 나노입자 조성에 따라 상이한 모폴로지가 가능하다. 나노입자의 외부 환경과 접촉해 있는 나노입자의 일부분은 일반적으로 나노입자의 표면으로서 확인된다. 일부 구현예에서, 나노입자는 최대 치수가 25 nm 내지 200 nm의 범위이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 나노입자는 고체, 반고체, 에멀젼, 또는 콜로이드성 나노입자를 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 형태로 제공될 수 있는 전달 시스템을 포함한다. 나노입자 전달 시스템은 지질-기반 시스템, 리포좀, 미셀, 마이크로-소포, 엑소솜, 또는 유전자 총(gene gun)을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 나노입자는 지질 나노입자(LNP)이다. 일부 구현예에서, LNP는 분자간력에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다.
일부 구현예에서, LNP는 다수의 성분, 예를 들어 3개 또는 4개의 성분을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 발현 리프레서, 또는 상기 발현 리프레서를 포함하는 약제학적 조성물(또는 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 리프레서 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)이 LNP 내에 캡슐화된다. 일 구현예에서, 발현 억제 시스템, 또는 상기 발현 억제 시스템을 포함하는 약제학적 조성물(또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 억제 시스템 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)이 LNP 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산과 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 동일한 LNP 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산과 제2 발현 리프레서를 인코딩하는 핵산은 상이한 LNP 내에 존재한다. LNP의 제조 및 조절제 캡슐화가 사용될 수 있고/있거나 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, December 2011]으로부터 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 지질 나노입자 조성물은 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현에 유용하다. 일부 구현예에서, 핵산은, 지질 나노입자 내에 존재할 때, 수용액 중에서 뉴클레아제에 의한 분해에 저항한다.
일부 구현예에서, LNP 제형은 CCD 지질, 중성 지질, 및/또는 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 양이온성 지질, 또는 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질은 pH에 따라 양으로 하전된 형태 또는 중성 형태로 존재할 수 있는 양이온성 지질이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은, 예를 들어 생리학적 조건 하에서 양으로 하전될 수 있는 지질이다. 일부 구현예에서, 지질 입자는 중성 지질, 이온화 가능한 아민-함유 지질, 생분해성 알킨 지질, 스테로이드, 인지질(다가불포화 지질을 포함함), 구조 지질(예를 들어, 스테롤), PEG, 콜레스테롤, 및 중합체 접합된 지질 중 하나 이상과 함께 제형 내에 양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP 제형(예를 들어, MC3 및/또는 SSOP)은 콜레스테롤, PEG, 및/또는 헬퍼 지질을 포함한다. LNP는, 예를 들어 미소구체, 예컨대 단층 및 다층 소포, 라멜라 상 지질 이중층일 수 있으며, 이는 일부 구현예에서 실질적으로 구형이다.
일부 구현예에서, LNP는 수성 코어, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서 또는 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, LNP 제형을 위한 카고는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서 또는 시스템을 인코딩하는 핵산은 LNP, 예를 들어 양이온성 지질을 포함하는 LNP의 표면에 흡착될 수 있다. 일부 구현예에서, 카고, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서 또는 시스템을 인코딩하는 핵산은 LNP와 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 카고, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 리프레서 또는 시스템을 인코딩하는 핵산은 LNP 내에 캡슐화되며, 예를 들어 완전 캡슐화 및/또는 부분 캡슐화될 수 있다.
일부 구현예에서, 카고를 포함하는 LNP는 전신 전달, 예를 들어 유기체 내에서 활성제의 폭넓은 노출을 초래할 수 있는 카고의 치료적 유효 용량의 전달을 위해 투여될 수 있다. 지질 나노입자의 전신 전달은, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 피하, 및 복막내 전달을 포함한 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 카고를 포함하는 LNP는 국부 전달, 예를 들어 유기체 내의 표적 부위로의 활성제의 직접 전달을 위해 투여될 수 있다.
LNP는 에멀젼 중에 분산상으로서, 미셀로서, 또는 현탁액 중에 내부상으로서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 생분해성이다. 일부 구현예에서, LNP는 치료적 유효 용량에서 세포독성 수준으로 축적되지 않거나 생체내에서 독성을 야기하지 않는다. 일부 구현예에서, LNP는 치료적 유효 용량으로 반복 투여 후에 세포독성 수준으로 축적되지 않거나 생체내에서 독성을 야기하지 않는다. 일부 구현예에서, LNP는 치료적 유효 용량에서 실질적으로 유해한 효과로 이어지는 선천성 면역 반응을 야기하지 않는다.
일부 구현예에서, 사용되는 LNP는 화학식 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘트-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노네이트 또는 ssPalmO-페닐-P4C2(ssPalmOPhe, SS-OP)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 화학식 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘트-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노네이트(MC3), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG), 예를 들어 MC3 LNP 또는 ssPalmO-페닐-P4C2(ssPalmOPhe, SS-OP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG), 예를 들어 SSOP-LNP를 포함한다.
리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단층 또는 다층 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구형의 소포 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성, 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 생체적합성이고, 비독성이며, 친수성 및 친유성 약물 분자 둘 모두를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고(cargo)를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소포는 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만, 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 일반적으로 사용된다. 소포는, 제한 없이, DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB를 단독으로 또는 콜레스테롤과 함께 포함하여 DOTMA와 콜레스테롤, DOTAP와 콜레스테롤, DOTIM과 콜레스테롤, 및 DDAB와 콜레스테롤을 생성할 수 있다. 다층 소포 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 6,693,086을 참조하며, 다층 소포 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 소포 형성이 자발적일 수 있지만, 그것은 또한 균질기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 전단 형태로 힘을 인가함으로써 촉진될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이, 크기 감소 필터를 통해 압출함으로써 압출된 지질이 제조될 수 있으며, 압출된 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 질환, 장애, 및/또는 병태의 증상을 경감시키는 충분한 계획에 의해 투여되는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 투여함으로써 치료제를 전달하는 방법을 제공한다.
유전자 발현의 조절
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 발현 리프레서(또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 리프레서 핵산을 포함하는 약제학적 조성물) 또는 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템(또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 억제 시스템 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)을 제공하는 단계, 및 표적 유전자, 및/또는 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소(들)를 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 것은 참조값, 예를 들어 발현 억제 시스템의 발현 리프레서의 부재 하에서의 표적 유전자의 전사와 비교하여 표적 유전자의 전사의 조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법은 생체외에서, 예를 들어 대상체, 예를 들어 포유류 대상체, 예를 들어 인간 대상체 유래의 세포 상에서 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법은 생체내에서, 예를 들어 포유류 대상체, 예를 들어 인간 대상체 상에서 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법은 시험관내에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포 또는 세포주 상에서 사용된다.
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 대상체에서 표적 유전자의 과발현과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템(또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 억제 시스템 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 유전자의 과발현과 연관된 병태는 당업자에게 알려져 있다. 그러한 병태는 대사 장애, 신경근육 장애, 암(예를 들어, 고형 종양), 섬유증, 당뇨병, 우레아 장애, 면역 장애, 염증, 및 관절염을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 대상체에서 표적 유전자의 발현의 오조절과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템(또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 억제 시스템 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 발현 억제 시스템은 표적 유전자의 발현을 조절하는 유전자를 표적화하여(이의 발현을 감소시켜), 조절 유전자의 발현을 변경시킴으로써 표적 유전자의 발현을 변경시키는 데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 유전자의 발현의 오조절과 연관된 병태는 당업자에게 알려져 있다. 그러한 병태는 대사 장애, 신경근육 장애, 암(예를 들어, 고형 종양), 섬유증, 당뇨병, 우레아 장애, 면역 장애, 염증, 및 관절염을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 방법 및 조성물은 표적 유전자의 전사를 안정하게 또는 일시적으로 변경시킴으로써(예를 들어, 감소시킴으로써) 표적 유전자의 과발현 또는 오조절과 연관된 병태를 치료할 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 또는 더 긴 시간 동안 또는 이들 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 그러한 조절은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 지속된다. 선택적으로, 그러한 조절은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하의 기간 동안 지속된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법 또는 조성물은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 표적 유전자의 발현 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%(그리고 선택적으로, 최대 100%)만큼 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 상기 표적 유전자와 회합된 게놈 복합체, 예를 들어 앵커 서열-매개 연접부를 파괴함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 유전자는 연접부 내에 적어도 부분적으로 존재할 수 있거나(즉, 제1 앵커 서열과 제2 앵커 서열 사이에 서열식(sequence-wise)으로 위치할 수 있거나), 제1 앵커 서열과 제2 앵커 서열 사이에 서열식으로 위치하지 않고 동일한 염색체 상에 그리고 적어도 제1 또는 제2 앵커 서열에 충분히 근접하여 위치하여 그의 발현이 앵커 서열-매개 연접부의 토폴로지를 제어함으로써 조절될 수 있게 한다는 점에서 상기 유전자는 연접부의 외부에 있을 수 있다. 당업자는 2개의 요소 사이의(예를 들어, 유전자와 앵커 서열-매개 연접부 사이의) 3차원 공간의 거리는 일부 구현예에서 염기쌍의 관점에서의 거리보다 더 많이 관련되어 있을 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 외부에 있지만 연관된 유전자는 제1 또는 제2 앵커 서열의 2 Mb 이내, 1.9 Mb 이내, 1.8 Mb 이내, 1.7 Mb 이내, 1.6 Mb 이내, 1.5 Mb 이내, 1.4 Mb 이내, 1.3 Mb 이내, 1.3 Mb 이내, 1.2 Mb 이내, 1.1 Mb 이내, 1 Mb 이내, 900 kb 이내, 800 kb 이내, 700 kb 이내, 500 kb 이내, 400 kb 이내, 300 kb 이내, 200 kb 이내, 100 kb 이내, 50 kb 이내, 20 kb 이내, 10 kb 이내, 또는 5 kb 이내에 위치한다.
일부 구현예에서, 유전자의 발현을 조절하는 것은 유전자에 대한 전사 제어 서열의 접근성을 변경시키는 것을 포함한다. 전사 제어 서열은, 앵커 서열-매개 연접부의 내부에 있든 외부에 있든 관계없이, 인핸싱 서열 또는 침묵(또는 억제) 서열일 수 있다.
후성유전학적 변형
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 표적 유전자, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 앵커 서열(예를 들어, 표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열)을 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 발현 억제 시스템(예를 들어, 발현 리프레서(들)), 또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 발현 억제 시스템 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 발현 억제 시스템과 접촉시켜, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소의 DNA 메틸화를 증가 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소와 연관된 히스톤의 히스톤 메틸화를 증가 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소와 연관된 히스톤의 히스톤 아세틸화를 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소와 연관된 히스톤의 히스톤 수모일화를 증가 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소와 연관된 히스톤의 히스톤 인산화를 증가 또는 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 그러한 부위에서의 후성유전학적 변형의 수준 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%(그리고 선택적으로, 최대 100%)만큼 후성유전학적 변형의 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 그러한 부위에서의 후성유전학적 변형의 수준 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000%(그리고 선택적으로, 최대 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 2000%)만큼 후성유전학적 변형의 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소의 후성유전학적 변형은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적 유전자의 발현의 수준을 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 후성유전학적 변형은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 또는 더 긴 시간 동안 또는 이들 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 그러한 조절은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 지속된다. 선택적으로, 그러한 조절은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하의 기간 동안 지속된다.
일부 구현예에서, 표적 유전자, 또는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용하기 위한 발현 억제 시스템은 후성유전학적 변형 모이어티이거나 이를 포함하는 리프레서 도메인을 포함하는 발현 리프레서를 포함한다.
예를 들어, 리프레서 도메인은 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 후성유전학적 변형 모이어티이거나 이를 포함할 수 있으며, 내인성 또는 자연 발생 표적 서열(예를 들어, 표적 유전자 또는 전사 제어 요소)이 그의 메틸화를 증가시키도록(예를 들어, 전사 인자와 표적 유전자 또는 전사 제어 요소의 일부분과의 상호작용을 감소시키도록, 앵커 서열에 대한 핵형성 단백질의 결합을 감소시키도록, 그리고/또는 앵커 서열-매개 연접부를 파괴하거나 방해하도록) 변경될 수 있거나, 그의 메틸화를 감소시키도록(예를 들어, 전사 인자와 표적 유전자 또는 전사 제어 요소의 일부분의 상호작용을 증가시키도록, 앵커 서열에 대한 핵형성 단백질의 결합을 증가시키도록, 그리고/또는 앵커 서열-매개 연접부의 강도를 촉진하거나 증가시키도록) 변경될 수 있다.
키트
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템(예를 들어, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들)), 및 상기 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템 또는 이의 성분(예를 들어, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들))을 인코딩하는 핵산, 및 상기 핵산 및/또는 상기 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템 또는 이의 성분(예를 들어, 발현 억제 시스템의 발현 리프레서(들))을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포, 및 상기 세포, 핵산, 및/또는 상기 발현 억제 시스템의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)의 단위 투여량, 또는 본 명세서에 기재된 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터의 단위 투여량을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 b) 상기 조성물을 사용하여 질환을 치료하거나 세포 내의 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한, 예를 들어 감소시키기 위한 적어도 하나의 방법을 포함하는 한 세트의 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 상기 조성물을 위한 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자)을 선택적으로 포함할 수 있다. 이들 시약은 부형제 및/또는 전달 비히클 중에 현탁된 상태로 제공될 수 있거나, 별개의 성분으로서 제공될 수 있는데, 이는 나중에 부형제 및/또는 전달 비히클과 배합될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 조성물과 공동투여되는 추가의 치료제를 선택적으로 함유하여 원하는 표적 유전자 발현에 영향을 줄 수 있다. 설명 자료는 통상적으로 서면 자료 또는 인쇄 자료를 포함하지만, 이들은 그러한 것으로 제한되지 않는다. 그러한 설명서를 저장하고 이것을 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 고려된다. 그러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 매체는 그러한 설명 자료를 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 발현 리프레서, 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)의 단위 투여량, 또는 본 명세서에 기재된 발현 억제 시스템, 예를 들어 발현 리프레서(들)를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터의 단위 투여량을 포함한다.
하기 실시예는 본 개시내용의 일부 구현예를 추가로 설명하기 위해 제공되지만, 본 개시내용의 범주를 제한하고자 하지 않으며; 그들의 예시적인 성질로 인해 당업자에게 알려진 기타 다른 절차, 방법, 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 표적 선택 및 가이드 설계
본 개시내용의 발현 억제 시스템을 사용한 하향조절을 위하여 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 표적화하였다. S. 피오게네스 dCas9 및 KRAB 도메인(Sp-dCas9-KRAB, 서열번호 91 내지 93에 상응함)을 포함하는 제1 발현 리프레서 및 S. 아우레우스 dCas9 및 MQ1(Sa-dCas9-MQ1, 서열번호 94 내지 96에 상응함)을 포함하는 제2 발현 리프레서를 사용하였다. 가이드 RNA(서열번호 1 내지 5에 상응하는 표적-결합 서열을 포함함)는 각 발현 리프레서를 β2M 유전자의 프로모터 영역 내의 CpG 저메틸화의 영역에 표적화하였으며(도 1), 여기서 메틸화는 0부터 1까지(0부터 100%까지) 진행되며, 더 높은 메틸화는 적색 막대로 도시되어 있다. 각 막대는 CpG 부위를 나타낸다. β2M 프로모터 영역 내의 CpG 아일랜드에 청색 가이드(GD-28228 및 GD-28229)를 사용하여 Sp-dCas9-KRAB를 표적화하고, 주황색 가이드(GD-28171, GD-28172 및 GD-28173)를 사용하여 Sa-dCas9-MQ1을 표적화하였다.
실시예 2: 1개 또는 2개의 발현 리프레서를 사용한 β2M 발현 억제
실시예 1의 가이드 RNA를 사용하여 Sp-dCas9-KRAB 발현 리프레서, Sa-dCas9-MQ1 발현 리프레서, 또는 둘 모두를 β2M의 프로모터 영역에 표적화하였으며, β2M 발현에 대한 효과를 qPCR에 의해 모니터링하였다. 발현 리프레서(들) 및 가이드 RNA(들)를 인코딩하는 mRNA를 지질 나노입자(LNP)로 세포에 전달하였다.
HepG2 세포를 100 μL의 RPMI(+10% FBS, +Penn/Strep) 중에, 30,000개의 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트 내에 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 부착되게 한 후, 가이드당 0.125 ug의 RNA(1:1 mRNA:sgRNA(중량 기준))로 처리하였다. RNA를 COATSOME SS-OP 이온화 가능한 지질(NOF America)을 사용하여 제형화된 LNP에 의해 전달하였다. 2개의 가이드를 사용하여 제조된 "공동제형화된" 것으로 기재된 샘플을 제외하면, LNP를 1개의 mRNA 및 1개의 가이드를 사용하여 제형화하여 동일한 mRNA:가이드 중량비를 유지하였다. 세포를 72시간 동안 LNP와 함께 인큐베이션하였으며, 이후에 qPCR에 의한 β2M mRNA 분석을 위해 세포를 수집하였으며(도 2), 이때 β2M mRNA 수준은 비처리된 대조 세포와 대비하여 제공되어 있다.
β2M 프로모터에 표적화된 dCas9 단독은 β2M mRNA 수준을 감소시키지 않았다. 이 데이터는 Sp-dCas9-KRAB 또는 Sa-dCas9-MQ1 단독이 β2M mRNA 수준을 감소시켰음을 보여주며, 이때 감소의 얼마간의 변동은 사용된 가이드 RNA(들)에 좌우된다. Sp-dCas9-KRAB와 Sa-dCas9-MQ1의 조합은 어느 것인가의 발현 리프레서 단독보다 평균적으로 더 많이 β2M mRNA 수준을 감소시켰으며, 이때 역시 감소의 얼마간의 변동은 사용된 가이드 RNA(들)에 좌우된다. 1개 또는 2개의 발현 리프레서를 포함하는 발현 억제 시스템의 사용은 표적 유전자의 발현을 감소시켰다. 2개의 발현 리프레서를 포함하는 발현 억제 시스템은 표적 유전자의 발현을 단일 발현 리프레서보다 더 많이 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 3:
용량에 걸쳐 β2M
발현
억제 및 유세포측정의 사용
실시예 1의 가이드 RNA(Sp-dCas9 및 Sp-dCas9-KRAB에 대해서는 GD-28228; Sa-dCas9-MQ1에 대해서는 GD-28172; 또는 Sp-dCas9-KRAB 및 Sa-dCas9-MQ1에 대해서는 GD-28228 및 GD-28172)를 사용하여 Sp-dCas9-KRAB 발현 리프레서, Sa-dCas9-MQ1 발현 리프레서, 또는 둘 모두를 β2M의 프로모터 영역에 표적화하였으며, β2M 발현에 대한 효과를 qPCR에 의해 그리고 또한 유세포측정에 의해(형광 β2M을 사용하여 β2M 단백질 수준을 모니터링함) 모니터링하였다. 발현 리프레서(들) 및 가이드 RNA(들)를 인코딩하는 mRNA를 상이한 투여량 및 제형에서 LNP로 세포에 전달하였다.
HepG2 세포를 1.5 mL의 RPMI(+10% FBS, +Penn/Strep) 중에, 330,000개의 세포/웰의 밀도로 12웰 플레이트 내에 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 부착되게 한 후, 1 mL의 배지 중에 가이드당 1.25 ug 또는 2.5 ug의 RNA(1:1 mRNA:sgRNA(중량 기준))로 처리하였다. RNA를 COATSOME SS-OP 이온화 가능한 지질(NOF America)을 사용하여 제형화된 LNP에 의해 전달하였다. 2개의 가이드를 사용하여 제조된 "공동제형화된" 것으로 기재된 샘플을 제외하면, LNP를 1개의 mRNA 및 1개의 가이드를 사용하여 제형화하여 동일한 mRNA:가이드 중량비를 유지하였다. 세포를 72시간 동안 LNP와 함께 인큐베이션하였으며, 이후에 FACS 및 qPCR에 의한 mRNA 분석을 위해 세포를 수집하였다.
실시예 2에서 알 수 있는 바와 같이, β2M 프로모터에 표적화된 dCas9 단독은 β2M mRNA 수준을 감소시키지 않았다. Sp-dCas9-KRAB 또는 Sa-dCas9-MQ1 단독, 및 Sp-dCas9-KRAB와 Sa-dCas9-MQ1의 조합은 β2M mRNA 수준을 감소시켰다(도 3). 발현 리프레서(단독 또는 조합)의 1.25 ug/ml 및 2.5 ug/ml 용량 둘 모두는 β2M mRNA 수준을 감소시켰으며, 이때 더 높은 용량의 Sp-dCas9-KRAB가 더 낮은 용량보다 더 큰 감소를 제공하는 것으로 나타났다. β2M 단백질 수준의 FACS 모니터링은, Sp-dCas9-KRAB 또는 Sa-dCas9-MQ1 처리된 세포가 비처리된 수준의 β2M 단백질을 갖는 세포 집단의 감소 및 감소된 수준의 β2M 단백질을 갖는 세포의 새로운 집단의 출현을 나타내었음을 보여주었다. 이들 데이터는 실시예 2의 데이터와 일치하며, 이는 1개 또는 2개의 발현 리프레서를 포함하는 발현 억제 시스템의 사용이 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 개별 발현 리프레서는 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 역시 감소시킴을 보여준다.
실시예 4:
시간 경과에 따른 β2M
발현
억제
실시예 1의 가이드 RNA(Sp-dCas9 및 Sp-dCas9-KRAB에 대해서는 GD-28228; Sa-dCas9-MQ1에 대해서는 GD-28172; 또는 Sp-dCas9-KRAB 및 Sa-dCas9-MQ1에 대해서는 GD-28228 및 GD-28172)를 사용하여 Sp-dCas9-KRAB 발현 리프레서, Sa-dCas9-MQ1 발현 리프레서, 또는 둘 모두를 β2M의 프로모터 영역에 표적화하였으며, β2M 발현에 대한 효과를 qPCR에 의해 모니터링하였다. 세포를 형질감염 후 상이한 일 수에서 수집하여, 발현 변화를 위하여 총 RNA 및 프로브를 추출하였다.
K562 세포를 24웰 플레이트 내에서 플레이팅하고, 다음을 봉입한 MC3-기반 LNP 제형으로 형질감염시켰다: β2M 표적화 가이드 RNA와 함께 dCas9 mRNA, β2M 표적화 가이드 RNA와 함께 Sp-dCas9-KRAB mRNA, β2M 표적화 가이드 RNA와 함께 Sa-dCas9-MQ1 mRNA, 또는 β2M 표적화 가이드 RNA와 함께 Sp-dCas9-KRAB 및 Sa-dCas9-MQ1 mRNA의 혼합물. 세포를 형질감염 후 상이한 일 수에서 수집하여, β2M mRNA의 발현 변화를 위하여 총 RNA 및 프로브를 추출하였다(도 4). 점선은 시간 경과에 따른 평균 비처리된 β2M mRNA 수준(상부) 및 형질감염 후 24시간 시점에서의 β2M mRNA의 평균 녹다운 수준(하부)을 나타낸다.
22일 기간에 걸쳐, 비형질감염된 세포(청색선) 및 dCas9 형질감염된 세포(적색선)는 β2M 발현을 변화시키지 않는 반면, Sp-dCas9-KRAB 형질감염된 세포(녹색선)는 형질감염 후 초기 일 수에서 더 낮은 β2M mRNA 수준을 가졌으며, 이때 최대 효과는 2일째에서 나타났으며, 이러한 억제는 5일째 5 후에 상실된다. Sa-dCas9-MQ1 형질감염된 세포(자색선)는 β2M mRNA 수준의 유의한 억제(4일째까지 최대 85%)를 보여주고, 이러한 억제는 유지되고, 이어서 시험 기간의 종료 시점에서 도면에서 점선 바로 아래에 남아 있는 선으로 알 수 있는 바와 같이 서서히 억제가 다소 감소된다. Sp-dCas9-KRAB 및 Sa-dCas9-MQ1 조합 형질감염(주황색선)은 Sa-dCas9-MQ1 단독(자색선)에 대해 이미 관찰된 것보다 어떠한 추가의 억제도 제공하지 않았다.
이들 데이터는 1개 또는 2개의 발현 리프레서를 포함하는 발현 억제 시스템의 사용이 표적 유전자의 발현을 감소시킨다는 것을 보여준다. 개별 발현 리프레서, 예컨대 MQ1을 포함하는 것들은 연장된 지속기간 동안 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 하나 초과의 발현 리프레서를 포함하고, 예를 들어 이들 중 하나가 MQ1을 포함하는 발현 리프레서인 발현 억제 시스템은 연장된 지속기간 동안 마찬가지로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
실시예 5:
DNA
메틸트랜스퍼라제에 의한 프로모터 메틸화 후의 B2M
발현의 지속 가능한 억제
이 실시예는 다양한 DNMT를 함유하는 LNP, 및 dCas9 융합체를 B2M 프로모터 영역에 표적화하는 가이드를 함유하는 LNP를 사용한 처리에 의한 B2M 프로모터 영역의 메틸화가 B2M 발현의 지속 가능한 억제를 야기함을 입증한다.
K-562 세포를 750 μL의 성장 배지(RPMI + 10% FBS + Pen/Strep) 중에, 웰당 200,000개의 세포의 밀도로 24웰 플레이트 내에 시딩하였다. 이펙터, dCas9-MQ1(서열번호 33), dCas9-DNMT3a/3L(m)("m"은, 3a 영역은 인간 서열을 갖지만 3L 영역은 마우스 서열을 가짐을 나타냄)(서열번호 36), dCas9-DNMT3a/3L(h)("h"는 3a 영역 및 3L 영역 둘 모두 인간 서열을 가짐을 나타냄)(서열번호 35), dCas9-DNMT1(서열번호 35), 및 dCas9-DNMT3B를 인코딩하는 mRNA를 Precision NanoSystems NanoAssemblr Spark 기기를 사용하여 MC3 지질 중에 제형화하였다. 서열번호 21의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 개별 제형에 대해 동일한 기기에서 동일한 지질 중에 제형화하였다. 스톡 LNP 농도는 100 μg/mL였다. 세포를 1.25 μg/mL의 최종 지질 농도에서 1:1 비로 mRNA를 캡슐화하는 LNP와 sgRNA를 캡슐화하는 LNP로 처리하고, 이후에 인큐베이션하였다. 각 이펙터 및 가이드 조합을 4회 반복하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 상이한 시점에서, 200 μL의 세포를 취출하고 처리하여, 발현 변화를 위하여 총 RNA 및 프로브를 추출하고, 200 μL의 세포를 550 μL의 신선한 배지 중으로 옮겼다. 이 절차는 초기 형질감염 후 18일이 될 때까지 계속되었다. RNA를 RNeasy 96 Plus 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하고, LunaScript RT SuperMix(New England Biolabs)를 사용하여 cDNA로 전환시키고, TaqManTM Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 B2M 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트 검정을 사용하는 RT-qPCR을 위해 사용하였다. 데이터는 ddCT 방법을 사용하여, 비형질감염된 대조군 대비 배수 변화로서 제시되어 있다.
결과는 이 실시예에 기재된 모든 작제물이 처리 후 4일 시점에서 비처리된 샘플 대비 약 35% 내지 60% 범위로 B2M 발현을 억제할 수 있었음을 보여준다(도 5). 모든 작제물은 8일의 종료 시점에서 비처리된 샘플 대비 약 15% 내지 30%의 범위로 B2M 발현을 억제할 수 있었다. 13일의 종료 시점에서, 모든 이펙터는 B2M 발현을 약 45 내지 55%만큼 억제할 수 있었으며, 18일의 종료 시점에서 모든 이펙터는 비처리된 샘플 대비 약 30 내지 40%만큼 B2M 발현을 억제할 수 있었다(도 5).
실시예 6:
K-562 세포에서 MYC 유전자의 상류에 위치한 CTCF 부위를 표적화함으로써 MYC 발현을 하향조절하는 지속 가능한 리프레서 또는 리프레서 시스템의 확인
이 실시예는 MYC 유전자의 상류에 위치한 CTCF 부위를 표적화함으로써 MYC 발현을 하향조절하는 개별 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 확인을 보여준다.
K-562 세포를 100 μL의 성장 배지(RPMI + 10% FBS + Pen/Strep) 중에, 1×106개의 세포/mL의 밀도로 96웰 플레이트 내에서 성장시켰다. GD-29639(서열번호 11)와 GD-29640(서열번호 12)을 1:1 비로 혼합함으로써 sgRNA 풀을 제조하였다. 각 웰마다 표 4의 이펙터 또는 이펙터 조합을 인코딩하는 5 μl의 mRNA를 첨가함으로써 억제 마스터 플레이트를 제조하였다. 첨가 후에, 17.5 ng의 각 mRNA 또는 mRNA의 조합이 각 웰마다 존재하였다. 플레이팅 후에, 마스터 플레이트를 형질감염 시까지 동결된 상태로 저장하였다.
| 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템 | |
| 1 | 이펙터 없음(비처리됨) |
| 2 | dCas9 |
| 3 | dCas9-DNMT1 |
| 4 | dCas9-DNMT3B |
| 5 | G9A-dCas9 |
| 6 | dCas9-MQ1 |
| 7 | dCas9-HDAC8 |
| 8 | dCas9-DNMT3a/3L(h) |
| 9 | dCas9-DNMT3a/3L(m) |
| 10 | EZH2-dCas9 |
| 11 | dCas9-LSD1 |
| 12 | dCas9-KRAB |
| 13 | EZH2-dCas9-KRAB |
| 14 | G9A-dCas9-KRAB |
| 15 | FOG1-dCas9- FOG1 |
| 16 | dCas9-KRAB + FOG1-dCas9- FOG1 |
| 17 | EZH2-dCas9-KRAB + dCas9-HDAC8 |
| 18 | dCas9-LSD1 + dCas9-HDAC8 |
| 19 | G9A-dCas9-KRAB + EZH2-dCas9-KRAB |
| 20 | G9A-dCas9 + dCas9-HDAC8 |
| 21 | EZH2-dCas9 + dCas9-HDAC8 |
| 22 | dCas9-LSD1 + G9A-dCas9-KRAB |
| 23 | dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB |
| 24 | dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9 |
| 25 | G9A-dCas9-KRAB + dCas9-HDAC8 |
| 26 | G9A-dCas9 + EZH2-dCas9 |
| 27 | dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB |
| 28 | dCas9-LSD1 + G9A-dCas9 |
| 29 | dCas9-MQ1 + dCas9-HDAC8 |
| 30 | dCas9-MQ1 + G9A-dCas9-KRAB |
형질감염 전에, 5 μl의 sgRNA 풀을 각 웰마다 첨가하여 8.75 ng의 각 sgRNA가 각 웰마다 존재하도록 하였다. 이펙터 mRNA-sgRNA 믹스를 각 웰마다 40 μl의 총 부피가 되도록 Opti-MEM 배지(Thermo Fisher)를 사용하여 희석시켰다. LipofectamineTM MessengarMAXTM(Thermo Fisher)와 Opti-MEM의 형질감염 마스터 믹스를 표 5에 기재된 바와 같이 100 ng의 총 RNA당 0.3 μL의 LipofectamineTM MessengarMAXTM의 비를 사용하여 제조하였다. 형질감염 직전에, 35 μL의 형질감염 마스터 믹스를 RNA가 담긴 각 웰마다 첨가하여 최종 부피가 75 μl가 되게 하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고 이를 사용하여 K-562 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후에, 세포를 표준 인큐베이터 내에서 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
| 시약 | 웰당 | 96웰 플레이트당 | 2개의 96웰 플레이트당 | 4개의 96웰 플레이트당 |
| MessengerMax(μL) | 4.2 | 189 | 378 | 756 |
| Optimem(μL) | 30.8 | 1386 | 2772 | 5544 |
형질감염 후 24시간 시점에서, 100 μL의 신선한 배지를 각 웰마다 첨가하였다. 형질감염 후 48시간 시점에서 샘플 수집이 시작되고, 6일까지 계속되었다. 세포 현탁액 샘플을 48시간, 72시간, 및 144시간 시점에서 수집하였다. 분석을 위하여 샘플을 취출할 때마다, 등가 부피의 신선한 배지를 첨가하고, 인큐베이션을 계속하였다. RNA를 Rneasy® Plus 96 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하고, LunaScript® RT SuperMix(New England Biolabs)를 사용하여 cDNA로 전환시키고, TaqmanTM Fast Advanced Master Mix(Thermo Scientific)와 함께 MYC 특이적 Taqman 프라이머/프로브 세트 검정을 사용하는 RT-qPCR을 위해 사용하였다. 데이터는 ddCT 방법을 사용하여, dCas9 처리된 대조군 대비 배수 변화로서 제시하였다. 비처리된 샘플 및 dCas9 샘플을 보정물(calibrator)로서 사용하였다.
이 실험은, 적어도, dCas9-DNMT3a/3L(h), dCas9-KRAB, FOG1-dCas9-FOG1, G9A-dCas9 + EZH2-dCas9, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+G9A-dCas9, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, 및 dCas9-MQ1+G9A-dCas9-KRAB로 처리된 세포가 48시간 및/또는 72시간 시점에서 MYC 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다(도 6).
실시예 7:
K-562 세포에서 β2M 전사 개시 부위의 상류에 있는 영역을 표적화함으로써 β2M 발현을 하향조절하는 지속 가능한 리프레서 또는 억제 시스템의 확인
이 실시예는 β2M 프로모터의 상류 영역을 표적화함으로써 B2M 발현을 하향조절하는 개별 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 확인을 보여준다.
K-562 세포를 100 μL의 성장 배지(RPMI + 10% FBS + Pen/Strep) 중에, 1×106개의 세포/mL의 밀도로 96웰 플레이트 내에서 성장시켰다. GD-27634(서열번호 13)와 GD-29500(서열번호 14)을 1:1 비로 혼합함으로써 sgRNA 풀을 제조하였다. 표 X에 기재된 바와 같은 이펙터와 sgRNA 풀 믹스를 사용하여 실시예 6에 기재된 프로토콜에 따라 세포를 형질감염시켰다. 세포 현탁액 샘플을 48시간, 72시간, 144시간, 192시간, 및 240시간 시점에서 수집하고, 실시예 6에 기재된 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 데이터는 ddCT 방법을 사용하여, dCas9 처리된 대조군 대비 배수 변화로서 제시하였다. 비처리된 샘플 및 dCas9 샘플을 보정물로서 사용하였다.
이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1, dCas9-MQ1, FOG1-dCas9- FOG1, G9A-dCas9-KRAB, dCas9-DNMT3a/3L(h), G9A-dCas9, EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-KRAB, EZH2-dCas9-KRAB + dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1 + dCas9-HDAC8, dCas9-KRAB + FOG1-dCas9- FOG1, dCas9-MQ1 + G9A-dCas9-KRAB, G9A-dCas9 + EZH2-dCas9, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, 및 dCas9-MQ1 + dCas9-HDAC8로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 β2M 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다(도 7).
실시예 8:
K-562 세포에서 HSPA1B 전사 개시 부위의 하류에 있는 영역을 표적화함으로써 HSPA1B 발현을 하향조절하는 지속 가능한 리프레서 또는 억제 시스템의 확인
이 실시예는 HSPA1B 프로모터의 하류 영역을 표적화함으로써 HSPA1B 발현을 하향조절하는 개별 발현 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 확인을 보여준다.
K-562 세포를 100 μL의 성장 배지(RPMI + 10% FBS + Pen/Strep) 중에, 1×106개의 세포/mL의 밀도로 96웰 플레이트 내에서 성장시켰다. GD-29542(서열번호 17)와 GD-29544(서열번호 18)을 1:1 비로 혼합함으로써 sgRNA 풀을 제조하였다. 표 4에 기재된 바와 같은 이펙터와 sgRNA 풀 믹스를 사용하여 실시예 6에 기재된 프로토콜에 따라 세포를 형질감염시켰다. 세포 현탁액 샘플을 48시간, 72시간, 및 144시간 시점에서 수집하고, 실시예 6에 기재된 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 데이터는 ddCT 방법을 사용하여, dCas9 처리된 대조군 대비 배수 변화로서 제시하였다. 비처리된 샘플 및 dCas9 샘플을 보정물로서 사용하였다.
이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, EZH2-dCas9, dCas9-MQ1, dCas9-DNMT1, dCas9-DNMT3a/3L(h), dCas9-DNMT3a/3L(m), G9A-dCas9-KRAB, FOG1-dCas9-FOG1, G9A-dCas9, dCas9-KRAB, G9A-dCas9 + dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1 + G9A-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+EZH2-dCas9, G9A-dCas9+EZH2-dCas9, dCas9-LSD1 + EZH2-dCas9-KRAB, EZH2-dCas9 +dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1+dCas9-HDAC8, dCas9-MQ1 + EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, G9A-dCas9-KRAB+EZH2-dCas9-KRAB, dCas9-LSD1+G9A-dCas9 및 dCas9-MQ1+G9A-dCas9-KRAB로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 HSPA1B 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다(도 8).
실시예 9:
K-562 세포에서 GATA1 발현을 하향조절하는 지속 가능한 리프레서 또는 억제 시스템의 확인
이 실시예는 K-562 세포에서 GATA1 발현을 하향조절하는 개별 억제 리프레서 또는 발현 억제 시스템의 확인을 보여준다.
K-562 세포를 100 μL의 성장 배지(RPMI + 10% FBS + Pen/Strep) 중에, 1×106개의 세포/mL의 밀도로 96웰 플레이트 내에서 성장시켰다. GD-29536(서열번호 19)와 GD-29693(서열번호 20)을 1:1 비로 혼합함으로써 sgRNA 풀을 제조하였다. 표 4에 기재된 바와 같은 이펙터와 sgRNA 풀 믹스를 사용하여 실시예 6에 기재된 프로토콜에 따라 세포를 형질감염시켰다. 세포 현탁액 샘플을 48시간, 72시간, 및 144시간 시점에서 수집하고, 실시예 6에 기재된 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 데이터는 ddCT 방법을 사용하여, dCas9 처리된 대조군 대비 배수 변화로서 제시하였다. 비처리된 샘플 및 dCas9 샘플을 보정물로서 사용하였다.
이 데이터는, 적어도, dCas9-HDAC8, dCas9-LSD1+dCas9-HDAC8, dCas9-MQ1+dCas9-HDAC8, 및 G9A-dCas9+dCas9-HDAC8로 처리된 세포가 48시간, 72시간 및/또는 144시간 시점에서 GATA1 발현의 억제를 나타내었음을 보여주었다(도 9).
균등물
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 예시하고자 하는 것이고, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 규정되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다른 양태, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING GENE EXPRESSION
<130> O2057-7017WO
<140>
<141>
<150> 63/242,957
<151> 2021-09-10
<150> 63/082,555
<151> 2020-09-24
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1
tctccttggt ggcccgccgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 2
gtcccaaagg cgcggcgctg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 3
ccctgctccc cgccgaaagg g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 4
ctctggctcc cccagcgcag c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 5
gtgaacgcgt ggaggggcgc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 6
acggcgggcc accaaggaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 7
cagcgccgcg cctttgggac 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 8
ccctttcggc ggggagcagg g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 9
gctgcgctgg gggagccaga g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 10
agcgcccctc cacgcgttca c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 11
agggtgatgt tcattagcag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 12
tgcagaaggt ccgaagaaag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 13
gagacaggtg acggtccctg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 14
gagtctcgtg atgtttaaga 20
<210> 15
<211> 5533
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 15
aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60
agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccga caagaagtac agcatcggcc 120
tggccatcgg caccaacagc gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca 180
gcaagaagtt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg 240
gcgccctgct gttcgacagc ggcgagaccg ccgaggccac ccggctgaag cggaccgccc 300
ggcggcggta cacccggcgg aagaaccgga tctgctacct gcaggagatc ttcagcaacg 360
agatggccaa ggtggacgac agcttcttcc accggctgga ggagagcttc ctggtggagg 420
aggacaagaa gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc 480
acgagaagta ccccaccatc taccacctgc ggaagaagct ggtggacagc accgacaagg 540
ccgacctgcg gctgatctac ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc 600
tgatcgaggg cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg 660
tgcagaccta caaccagctg ttcgaggaga accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca 720
aggccatcct gagcgcccgg ctgagcaaga gccggcggct ggagaacctg atcgcccagc 780
tgcccggcga gaagaagaac ggcctgttcg gcaacctgat cgccctgagc ctgggcctga 840
cccccaactt caagagcaac ttcgacctgg ccgaggacgc caagctgcag ctgagcaagg 900
acacctacga cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc 960
tgttcctggc cgccaagaac ctgagcgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgcgggtga 1020
acaccgagat caccaaggcc cccctgagcg ccagcatgat caagcggtac gacgagcacc 1080
accaggacct gaccctgctg aaggccctgg tgcggcagca gctgcccgag aagtacaagg 1140
agatcttctt cgaccagagc aagaacggct acgccggcta catcgacggc ggcgccagcc 1200
aggaggagtt ctacaagttc atcaagccca tcctggagaa gatggacggc accgaggagc 1260
tgctggtgaa gctgaaccgg gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca 1320
gcatccccca ccagatccac ctgggcgagc tgcacgccat cctgcggcgg caggaggact 1380
tctacccctt cctgaaggac aaccgggaga agatcgagaa gatcctgacc ttccggatcc 1440
cctactacgt gggccccctg gcccggggca acagccggtt cgcctggatg acccggaaat 1500
ccgaggagac catcaccccc tggaacttcg aggaggtggt ggacaagggc gccagcgccc 1560
agagcttcat cgagcggatg accaacttcg acaagaacct gcccaacgag aaggtgctgc 1620
ccaagcacag cctgctgtac gagtacttca ccgtgtacaa cgagctgacc aaggtgaagt 1680
acgtgaccga gggcatgcgg aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaag aaggccatcg 1740
tggacctgct gttcaagacc aaccggaagg tgaccgtgaa gcagctgaag gaggactact 1800
tcaagaagat cgagtgcttc gacagcgtgg agatcagcgg cgtggaggac cggttcaacg 1860
ccagcctggg cacctaccac gacctgctga agatcatcaa ggacaaggac ttcctggaca 1920
acgaggagaa cgaggacatc ctggaggaca tcgtgctgac cctgaccctg ttcgaggacc 1980
gggagatgat cgaggagcgg ctgaaaacct acgcccacct gttcgacgac aaggtgatga 2040
agcagctgaa gcggcggcgg tacaccggct ggggccggct gagccggaag ctgatcaacg 2100
gcatccggga caagcagagc ggcaagacca tcctggactt cctgaaatcc gacggcttcg 2160
ccaaccggaa cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gaccttcaag gaggacatcc 2220
agaaggccca ggtgagcggc cagggcgaca gcctgcacga gcacatcgcc aacctggccg 2280
gcagccccgc catcaagaag ggcatcctgc agaccgtgaa ggtggtggac gagctggtga 2340
aggtgatggg ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga gatggcccgg gagaaccaga 2400
ccacccagaa gggccagaag aacagccggg agcggatgaa gcggatcgag gagggcatca 2460
aggagctggg cagccagatc ctgaaggagc accccgtgga gaacacccag ctgcagaacg 2520
agaagctgta cctgtactac ctgcagaacg gccgggacat gtacgtggac caggagctgg 2580
acatcaaccg gctgagcgac tacgacgtgg ccgccatcgt gccccagagc ttcctgaagg 2640
acgacagcat cgacaacaag gtgctgaccc ggagcgacaa ggcccggggc aagagcgaca 2700
acgtgcccag cgaggaggtg gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg 2760
ccaagctgat cacccagcgg aagttcgaca acctgaccaa ggccgagcgg ggcggcctga 2820
gcgagctgga caaggccggc ttcatcaagc ggcagctggt ggagacccgg cagatcacca 2880
agcacgtggc ccagatcctg gacagccgga tgaacaccaa gtacgacgag aacgacaagc 2940
tgatccggga ggtgaaggtg atcaccctga aatccaagct ggtgagcgac ttccggaagg 3000
acttccagtt ctacaaggtg cgggagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc 3060
tgaacgccgt ggtgggcacc gccctgatca agaagtaccc caagctggag agcgagttcg 3120
tgtacggcga ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaga 3180
tcggcaaggc caccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttc ttcaagaccg 3240
agatcaccct ggccaacggc gagatccgga agcggcccct gatcgagacc aacggcgaga 3300
ccggcgagat cgtgtgggac aagggccggg acttcgccac cgtgcggaag gtgctgagca 3360
tgccccaggt gaacatcgtg aagaaaaccg aggtgcagac cggcggcttc agcaaggaga 3420
gcatcctgcc caagcggaac agcgacaagc tgatcgcccg gaagaaggac tgggacccca 3480
agaagtacgg cggcttcgac agccccaccg tggcctacag cgtgctggtg gtggccaagg 3540
tggagaaggg caagagcaag aagctgaaat ccgtgaagga gctgctgggc atcaccatca 3600
tggagcggag cagcttcgag aagaacccca tcgacttcct ggaggccaag ggctacaagg 3660
aggtgaagaa ggacctgatc atcaagctgc ccaagtacag cctgttcgag ctggagaacg 3720
gccggaagcg gatgctggcc agcgccggcg agctgcagaa gggcaacgag ctggccctgc 3780
ccagcaagta cgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta cgagaagctg aagggcagcc 3840
ccgaggacaa cgagcagaag cagctgttcg tggagcagca caagcactac ctggacgaga 3900
tcatcgagca gatcagcgag ttcagcaagc gggtgatcct ggccgacgcc aacctggaca 3960
aggtgctgag cgcctacaac aagcaccggg acaagcccat ccgggagcag gccgagaaca 4020
tcatccacct gttcaccctg accaacctgg gcgcccccgc cgccttcaag tacttcgaca 4080
ccaccatcga ccggaagcgg tacaccagca ccaaggaggt gctggacgcc accctgatcc 4140
accagagcat caccggcctg tacgagaccc ggatcgacct gagccagctg ggcggcgaca 4200
gcggcggcaa gcggcccgcc gccaccaaga aggccggcca ggccaagaag aagaagtcgg 4260
gcgggggtgg ctcagtggac gtgctgagga gaaggaagga ctggaacgtg agactgcaag 4320
ccttcttcac cagcgacacc ggactggaat acgaggcccc taagctgtac cccgccattc 4380
ccgccgctag acgcagaccc attagagtgc tctctctgtt tgacggaatc gccaccggct 4440
atctggtgct gaaagagctg ggcatcaagg tgggcaaata cgtggccagc gaggtgtgcg 4500
aggagtctat cgccgtcgga accgtgaaac acgagggaaa catcaaatac gtgaacgacg 4560
tgaggaacat caccaagaaa aacatcgagg agtggggccc cttcgatctc gtgatcggcg 4620
gcagcccttg caacgatctc tccaatgtga accccgccag aaagggactg tacgagggca 4680
ccggcagact gttcttcgag ttctaccatc tgctgaacta cagcagaccc aaggagggcg 4740
acgacagacc cttcttctgg atgttcgaaa acgtggtcgc catgaaggtg ggcgataaga 4800
gggacatcag cagatttctg gagtgtaacc ccgtcatgat cgatgccatt aaggtcagcg 4860
ccgcccacag agctaggtac ttctggggaa atctgcccgg catgaataga cccgtgatcg 4920
cttccaagaa cgacaagctg gagctgcaag actgtctgga gtacaataga atcgctaagc 4980
tcaagaaggt ccagaccatc accacaaaat ccaacagcat caagcaaggc aagaaccagc 5040
tgttccccgt ggtcatgaac ggcaaggagg atgtgctctg gtgcaccgag ctggagagga 5100
tctttggctt ccccgtgcac tataccgatg tgtccaacat gggaagaggc gctagacaga 5160
aactgctggg aagaagctgg agcgtgcccg tgattagaca cctcttcgcc cctctgaagg 5220
attacttcgc ttgcgaggga ggtggcggat cgggaaagcg gcccgccgcc accaagaagg 5280
ccggtcaggc caagaagaag aagggcagct acccctacga cgtgcccgac tacgcctgag 5340
cggccgctta attaagctgc cttctgcggg gcttgccttc tggccatgcc cttcttctct 5400
cccttgcacc tgtacctctt ggtctttgaa taaagcctga gtaggaagtc tagaaaaaaa 5460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5520
aaaaaaaaaa aaa 5533
<210> 16
<211> 1763
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
20 25 30
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
35 40 45
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
65 70 75 80
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
100 105 110
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
115 120 125
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
130 135 140
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
145 150 155 160
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
165 170 175
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
180 185 190
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
195 200 205
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
210 215 220
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
245 250 255
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
260 265 270
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
275 280 285
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
290 295 300
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
305 310 315 320
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
325 330 335
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
355 360 365
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
370 375 380
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
385 390 395 400
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
405 410 415
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
420 425 430
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
435 440 445
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
450 455 460
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
465 470 475 480
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
485 490 495
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
500 505 510
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
515 520 525
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
530 535 540
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
545 550 555 560
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
565 570 575
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
580 585 590
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
595 600 605
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
610 615 620
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
625 630 635 640
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
645 650 655
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
660 665 670
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
675 680 685
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
690 695 700
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
705 710 715 720
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
725 730 735
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
740 745 750
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
755 760 765
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
770 775 780
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
785 790 795 800
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
805 810 815
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
820 825 830
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
835 840 845
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Ala Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
850 855 860
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg
865 870 875 880
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
885 890 895
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
900 905 910
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
915 920 925
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
930 935 940
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
945 950 955 960
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
965 970 975
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
980 985 990
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
995 1000 1005
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu
1010 1015 1020
Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile
1025 1030 1035
Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe
1040 1045 1050
Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu
1055 1060 1065
Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly
1070 1075 1080
Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr
1085 1090 1095
Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys
1100 1105 1110
Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro
1115 1120 1125
Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp
1130 1135 1140
Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser
1145 1150 1155
Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu
1160 1165 1170
Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser
1175 1180 1185
Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr
1190 1195 1200
Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala
1220 1225 1230
Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1235 1240 1245
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
1250 1255 1260
Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His
1265 1270 1275
Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser
1280 1285 1290
Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser
1295 1300 1305
Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu
1310 1315 1320
Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala
1325 1330 1335
Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr
1340 1345 1350
Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1355 1360 1365
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly
1370 1375 1380
Asp Ser Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln
1385 1390 1395
Ala Lys Lys Lys Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Val Leu
1400 1405 1410
Arg Arg Arg Lys Asp Trp Asn Val Arg Leu Gln Ala Phe Phe Thr
1415 1420 1425
Ser Asp Thr Gly Leu Glu Tyr Glu Ala Pro Lys Leu Tyr Pro Ala
1430 1435 1440
Ile Pro Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe
1445 1450 1455
Asp Gly Ile Ala Thr Gly Tyr Leu Val Leu Lys Glu Leu Gly Ile
1460 1465 1470
Lys Val Gly Lys Tyr Val Ala Ser Glu Val Cys Glu Glu Ser Ile
1475 1480 1485
Ala Val Gly Thr Val Lys His Glu Gly Asn Ile Lys Tyr Val Asn
1490 1495 1500
Asp Val Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asn Ile Glu Glu Trp Gly Pro
1505 1510 1515
Phe Asp Leu Val Ile Gly Gly Ser Pro Cys Asn Asp Leu Ser Asn
1520 1525 1530
Val Asn Pro Ala Arg Lys Gly Leu Tyr Glu Gly Thr Gly Arg Leu
1535 1540 1545
Phe Phe Glu Phe Tyr His Leu Leu Asn Tyr Ser Arg Pro Lys Glu
1550 1555 1560
Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe Trp Met Phe Glu Asn Val Val Ala
1565 1570 1575
Met Lys Val Gly Asp Lys Arg Asp Ile Ser Arg Phe Leu Glu Cys
1580 1585 1590
Asn Pro Val Met Ile Asp Ala Ile Lys Val Ser Ala Ala His Arg
1595 1600 1605
Ala Arg Tyr Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly Met Asn Arg Pro Val
1610 1615 1620
Ile Ala Ser Lys Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln Asp Cys Leu Glu
1625 1630 1635
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1640 1645 1650
Lys Ser Asn Ser Ile Lys Gln Gly Lys Asn Gln Leu Phe Pro Val
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Val Met Asn Gly Lys Glu Asp Val Leu Trp Cys Thr Glu Leu Glu
1670 1675 1680
Arg Ile Phe Gly Phe Pro Val His Tyr Thr Asp Val Ser Asn Met
1685 1690 1695
Gly Arg Gly Ala Arg Gln Lys Leu Leu Gly Arg Ser Trp Ser Val
1700 1705 1710
Pro Val Ile Arg His Leu Phe Ala Pro Leu Lys Asp Tyr Phe Ala
1715 1720 1725
Cys Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1730 1735 1740
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp
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Val Pro Asp Tyr Ala
1760
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<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
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cctgccctct gattggtcca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 18
gcctcatcga gcttggtgat 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 19
ctgtggtgtc aaaagcacca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 20
gaaccccaga agatgccagg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 21
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<210> 22
<211> 5704
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 22
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agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccga caagaagtac agcatcggcc 120
tggccatcgg caccaacagc gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca 180
gcaagaagtt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg 240
gcgccctgct gttcgacagc ggcgagaccg ccgaggccac ccggctgaag cggaccgccc 300
ggcggcggta cacccggcgg aagaaccgga tctgctacct gcaggagatc ttcagcaacg 360
agatggccaa ggtggacgac agcttcttcc accggctgga ggagagcttc ctggtggagg 420
aggacaagaa gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc 480
acgagaagta ccccaccatc taccacctgc ggaagaagct ggtggacagc accgacaagg 540
ccgacctgcg gctgatctac ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc 600
tgatcgaggg cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg 660
tgcagaccta caaccagctg ttcgaggaga accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca 720
aggccatcct gagcgcccgg ctgagcaaga gccggcggct ggagaacctg atcgcccagc 780
tgcccggcga gaagaagaac ggcctgttcg gcaacctgat cgccctgagc ctgggcctga 840
cccccaactt caagagcaac ttcgacctgg ccgaggacgc caagctgcag ctgagcaagg 900
acacctacga cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc 960
tgttcctggc cgccaagaac ctgagcgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgcgggtga 1020
acaccgagat caccaaggcc cccctgagcg ccagcatgat caagcggtac gacgagcacc 1080
accaggacct gaccctgctg aaggccctgg tgcggcagca gctgcccgag aagtacaagg 1140
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aggaggagtt ctacaagttc atcaagccca tcctggagaa gatggacggc accgaggagc 1260
tgctggtgaa gctgaaccgg gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca 1320
gcatccccca ccagatccac ctgggcgagc tgcacgccat cctgcggcgg caggaggact 1380
tctacccctt cctgaaggac aaccgggaga agatcgagaa gatcctgacc ttccggatcc 1440
cctactacgt gggccccctg gcccggggca acagccggtt cgcctggatg acccggaaat 1500
ccgaggagac catcaccccc tggaacttcg aggaggtggt ggacaagggc gccagcgccc 1560
agagcttcat cgagcggatg accaacttcg acaagaacct gcccaacgag aaggtgctgc 1620
ccaagcacag cctgctgtac gagtacttca ccgtgtacaa cgagctgacc aaggtgaagt 1680
acgtgaccga gggcatgcgg aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaag aaggccatcg 1740
tggacctgct gttcaagacc aaccggaagg tgaccgtgaa gcagctgaag gaggactact 1800
tcaagaagat cgagtgcttc gacagcgtgg agatcagcgg cgtggaggac cggttcaacg 1860
ccagcctggg cacctaccac gacctgctga agatcatcaa ggacaaggac ttcctggaca 1920
acgaggagaa cgaggacatc ctggaggaca tcgtgctgac cctgaccctg ttcgaggacc 1980
gggagatgat cgaggagcgg ctgaaaacct acgcccacct gttcgacgac aaggtgatga 2040
agcagctgaa gcggcggcgg tacaccggct ggggccggct gagccggaag ctgatcaacg 2100
gcatccggga caagcagagc ggcaagacca tcctggactt cctgaaatcc gacggcttcg 2160
ccaaccggaa cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gaccttcaag gaggacatcc 2220
agaaggccca ggtgagcggc cagggcgaca gcctgcacga gcacatcgcc aacctggccg 2280
gcagccccgc catcaagaag ggcatcctgc agaccgtgaa ggtggtggac gagctggtga 2340
aggtgatggg ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga gatggcccgg gagaaccaga 2400
ccacccagaa gggccagaag aacagccggg agcggatgaa gcggatcgag gagggcatca 2460
aggagctggg cagccagatc ctgaaggagc accccgtgga gaacacccag ctgcagaacg 2520
agaagctgta cctgtactac ctgcagaacg gccgggacat gtacgtggac caggagctgg 2580
acatcaaccg gctgagcgac tacgacgtgg ccgccatcgt gccccagagc ttcctgaagg 2640
acgacagcat cgacaacaag gtgctgaccc ggagcgacaa ggcccggggc aagagcgaca 2700
acgtgcccag cgaggaggtg gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg 2760
ccaagctgat cacccagcgg aagttcgaca acctgaccaa ggccgagcgg ggcggcctga 2820
gcgagctgga caaggccggc ttcatcaagc ggcagctggt ggagacccgg cagatcacca 2880
agcacgtggc ccagatcctg gacagccgga tgaacaccaa gtacgacgag aacgacaagc 2940
tgatccggga ggtgaaggtg atcaccctga aatccaagct ggtgagcgac ttccggaagg 3000
acttccagtt ctacaaggtg cgggagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc 3060
tgaacgccgt ggtgggcacc gccctgatca agaagtaccc caagctggag agcgagttcg 3120
tgtacggcga ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaga 3180
tcggcaaggc caccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttc ttcaagaccg 3240
agatcaccct ggccaacggc gagatccgga agcggcccct gatcgagacc aacggcgaga 3300
ccggcgagat cgtgtgggac aagggccggg acttcgccac cgtgcggaag gtgctgagca 3360
tgccccaggt gaacatcgtg aagaaaaccg aggtgcagac cggcggcttc agcaaggaga 3420
gcatcctgcc caagcggaac agcgacaagc tgatcgcccg gaagaaggac tgggacccca 3480
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tggagaaggg caagagcaag aagctgaaat ccgtgaagga gctgctgggc atcaccatca 3600
tggagcggag cagcttcgag aagaacccca tcgacttcct ggaggccaag ggctacaagg 3660
aggtgaagaa ggacctgatc atcaagctgc ccaagtacag cctgttcgag ctggagaacg 3720
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tcatcgagca gatcagcgag ttcagcaagc gggtgatcct ggccgacgcc aacctggaca 3960
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tcatccacct gttcaccctg accaacctgg gcgcccccgc cgccttcaag tacttcgaca 4080
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acctgagcca gcagggcatc cagaagggca tgaagcgggg cagcggcacc cggagcggcc 4740
tgctgtggga gatcgagcgg gccctggaca gcaccgagaa gaacgacctg cccaagtacc 4800
tgctgatgga gaacgtgggc gccctgctgc acaagaagaa cgaggaggag ctgaaccagt 4860
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tggagctgcc caagggcgac aagaagccca agagcatcaa gaaggtgctg aacaagatcg 5040
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tcggcttcga cagccaggac ggcaagcggg tgaacgagat cgagttcctg accgagaacc 5340
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ctgtacctct tggtctttga ataaagcctg agtaggaagt ctagaaaaaa aaaaaaaaaa 5640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5700
aaaa 5704
<210> 23
<211> 6010
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 23
aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60
agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccga caagaagtac agcatcggcc 120
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aggacaagaa gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc 480
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ccgacctgcg gctgatctac ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc 600
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aggccatcct gagcgcccgg ctgagcaaga gccggcggct ggagaacctg atcgcccagc 780
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cccagaaggg agatgtggaa atgctctgtg gaggccctcc ttgccaaggc ttctccggca 4560
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<211> 6202
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 24
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<211> 6205
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 25
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 26
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gcttcgagaa gaaccccatc gacttcctgg aggccaaggg ctacaaggag gtgaagaagg 3840
acctgatcat caagctgccc aagtacagcc tgttcgagct ggagaacggc cggaagcgga 3900
tgctggccag cgccggcgag ctgcagaagg gcaacgagct ggccctgccc agcaagtacg 3960
tgaacttcct gtacctggcc agccactacg agaagctgaa gggcagcccc gaggacaacg 4020
agcagaagca gctgttcgtg gagcagcaca agcactacct ggacgagatc atcgagcaga 4080
tcagcgagtt cagcaagcgg gtgatcctgg ccgacgccaa cctggacaag gtgctgagcg 4140
cctacaacaa gcaccgggac aagcccatcc gggagcaggc cgagaacatc atccacctgt 4200
tcaccctgac caacctgggc gcccccgccg ccttcaagta cttcgacacc accatcgacc 4260
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ccagagagga agtgcagctg gtgggcgcca gccacatgga gcagaaggct acagcccccg 4560
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gtcaggccaa gaagaagaag ggcagctacc cctacgacgt gcccgactac gcctgagcgg 4680
ccgcttaatt aagctgcctt ctgcggggct tgccttctgg ccatgccctt cttctctccc 4740
ttgcacctgt acctcttggt ctttgaataa agcctgagta ggaagtctag aaaaaaaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860
aaaaaaaaaa 4870
<210> 33
<211> 1820
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 33
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 34
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Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val
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Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu
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Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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945 950 955 960
Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu
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<211> 1542
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 44
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245 250 255
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Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile
370 375 380
Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His
385 390 395 400
His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro
405 410 415
Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala
420 425 430
Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile
435 440 445
Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys
450 455 460
Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly
465 470 475 480
Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg
485 490 495
Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile
500 505 510
Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala
515 520 525
Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr
530 535 540
Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala
545 550 555 560
Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn
565 570 575
Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val
580 585 590
Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys
595 600 605
Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu
610 615 620
Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr
625 630 635 640
Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu
645 650 655
Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile
660 665 670
Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu
675 680 685
Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile
690 695 700
Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met
705 710 715 720
Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg
725 730 735
Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu
740 745 750
Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu
755 760 765
Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln
770 775 780
Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala
785 790 795 800
Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val
805 810 815
Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val
820 825 830
Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn
835 840 845
Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly
850 855 860
Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn
865 870 875 880
Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val
885 890 895
Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Ala Ala
900 905 910
Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val
915 920 925
Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser
930 935 940
Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn
945 950 955 960
Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu
965 970 975
Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln
980 985 990
Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp
995 1000 1005
Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg
1010 1015 1020
Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe
1025 1030 1035
Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr
1040 1045 1050
His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala
1055 1060 1065
Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly
1070 1075 1080
Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu
1115 1120 1125
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu
1130 1135 1140
Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val
1145 1150 1155
Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln
1160 1165 1170
Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser
1175 1180 1185
Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr
1190 1195 1200
Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val
1205 1210 1215
Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys
1220 1225 1230
Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys
1235 1240 1245
Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys
1250 1255 1260
Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu
1265 1270 1275
Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln
1280 1285 1290
Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu
1295 1300 1305
Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp
1310 1315 1320
Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu
1325 1330 1335
Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile
1340 1345 1350
Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys
1355 1360 1365
His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His
1370 1375 1380
Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr
1385 1390 1395
Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu
1400 1405 1410
Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr
1415 1420 1425
Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Gly Gly
1430 1435 1440
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys
1445 1450 1455
Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Arg Lys Gln Ser Asn Pro
1460 1465 1470
Arg Gln Ile Lys Arg Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala Arg Glu Glu
1475 1480 1485
Val Gln Leu Val Gly Ala Ser His Met Glu Gln Lys Ala Thr Ala
1490 1495 1500
Pro Glu Ala Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Arg Pro
1505 1510 1515
Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser
1520 1525 1530
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1535 1540
<210> 45
<211> 4101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 45
gacaagaagt acagcatcgg cctggccatc ggcaccaaca gcgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca gcggcgagac cgccgaggcc 180
acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240
ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccaccggctg 300
gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660
ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720
atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780
gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgagcga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgccagcatg 960
atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020
cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140
aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260
atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caacagccgg 1380
ttcgcctgga tgacccggaa atccgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440
gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgacaagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtac 1560
aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatgc ggaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa ggtgaccgtg 1680
aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct tcgacagcgt ggagatcagc 1740
ggcgtggagg accggttcaa cgccagcctg ggcacctacc acgacctgct gaagatcatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca tcctggagga catcgtgctg 1860
accctgaccc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc ggctgaaaac ctacgcccac 1920
ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc ggtacaccgg ctggggccgg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcaga gcggcaagac catcctggac 2040
ttcctgaaat ccgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg gccagggcga cagcctgcac 2160
gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccc gccatcaaga agggcatcct gcagaccgtg 2220
aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga agaacagccg ggagcggatg 2340
aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga tcctgaagga gcaccccgtg 2400
gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa cggccgggac 2460
atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgagcg actacgacgt ggccgccatc 2520
gtgccccaga gcttcctgaa ggacgacagc atcgacaaca aggtgctgac ccggagcgac 2580
aaggcccggg gcaagagcga caacgtgccc agcgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccagc ggaagttcga caacctgacc 2700
aaggccgagc ggggcggcct gagcgagctg gacaaggccg gcttcatcaa gcggcagctg 2760
gtggagaccc ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc tggacagccg gatgaacacc 2820
aagtacgacg agaacgacaa gctgatccgg gaggtgaagg tgatcaccct gaaatccaag 2880
ctggtgagcg acttccggaa ggacttccag ttctacaagg tgcgggagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca ccgccctgat caagaagtac 3000
cccaagctgg agagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggccc 3180
ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg acaagggccg ggacttcgcc 3240
accgtgcgga aggtgctgag catgccccag gtgaacatcg tgaagaaaac cgaggtgcag 3300
accggcggct tcagcaagga gagcatcctg cccaagcgga acagcgacaa gctgatcgcc 3360
cggaagaagg actgggaccc caagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctac 3420
agcgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagagca agaagctgaa atccgtgaag 3480
gagctgctgg gcatcaccat catggagcgg agcagcttcg agaagaaccc catcgacttc 3540
ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcatcaagct gcccaagtac 3600
agcctgttcg agctggagaa cggccggaag cggatgctgg ccagcgccgg cgagctgcag 3660
aagggcaacg agctggccct gcccagcaag tacgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tacgagaagc tgaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtggagcag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttcagcaa gcgggtgatc 3840
ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg agcgcctaca acaagcaccg ggacaagccc 3900
atccgggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc tgaccaacct gggcgccccc 3960
gccgccttca agtacttcga caccaccatc gaccggaagc ggtacaccag caccaaggag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac ccggatcgac 4080
ctgagccagc tgggcggcga c 4101
<210> 46
<211> 1367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
450 455 460
Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val
465 470 475 480
Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn
485 490 495
Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val
545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
565 570 575
Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
595 600 605
Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu
610 615 620
Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His
625 630 635 640
Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
660 665 670
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala
675 680 685
Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
690 695 700
Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His
705 710 715 720
Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile
725 730 735
Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu
770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu
820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Ala Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
930 935 940
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
945 950 955 960
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val
980 985 990
Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1025 1030 1035
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn
1040 1045 1050
Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr
1055 1060 1065
Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg
1070 1075 1080
Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu
1085 1090 1095
Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg
1100 1105 1110
Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys
1115 1120 1125
Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu
1130 1135 1140
Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe
1160 1165 1170
Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu
1175 1180 1185
Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe
1190 1195 1200
Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu
1205 1210 1215
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn
1220 1225 1230
Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1265 1270 1275
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
1280 1285 1290
Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile
1295 1300 1305
Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe
1310 1315 1320
Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
1340 1345 1350
Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 47
<211> 1155
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
MQ1 repressor domain sequence
<400> 47
agcaaggtgg agaacaagac caagaagctg cgggtgttcg aggccttcgc cggcatcggc 60
gcccagcgga aggccctgga gaaggtgcgg aaggacgagt acgagatcgt gggcctggcc 120
gagtggtacg tgcccgccat cgtgatgtac caggccatcc acaacaactt ccacaccaag 180
ctggagtaca agagcgtgag ccgggaggag atgatcgact acctggagaa caagaccctg 240
agctggaaca gcaagaaccc cgtgagcaac ggctactgga agcggaagaa ggacgacgag 300
ctgaagatca tctacaacgc catcaagctg agcgagaagg agggcaacat cttcgacatc 360
cgggacctgt acaagcggac cctgaagaac atcgacctgc tgacctacag cttcccctgc 420
caggacctga gccagcaggg catccagaag ggcatgaagc ggggcagcgg cacccggagc 480
ggcctgctgt gggagatcga gcgggccctg gacagcaccg agaagaacga cctgcccaag 540
tacctgctga tggagaacgt gggcgccctg ctgcacaaga agaacgagga ggagctgaac 600
cagtggaagc agaagctgga gagcctgggc taccagaaca gcatcgaggt gctgaacgcc 660
gccgacttcg gcagcagcca ggcccggcgg cgggtgttca tgatcagcac cctgaacgag 720
ttcgtggagc tgcccaaggg cgacaagaag cccaagagca tcaagaaggt gctgaacaag 780
atcgtgagcg agaaggacat cctgaacaac ctgctgaagt acaacctgac cgagttcaag 840
aaaaccaaga gcaacatcaa caaggccagc ctgatcggct acagcaagtt caacagcgag 900
ggctacgtgt acgaccccga gttcaccggc cccaccctga ccgccagcgg cgccaacagc 960
cggatcaaga tcaaggacgg cagcaacatc cggaagatga acagcgacga gaccttcctg 1020
tacatcggct tcgacagcca ggacggcaag cgggtgaacg agatcgagtt cctgaccgag 1080
aaccagaaga tcttcgtgtg cggcaacagc atcagcgtgg aggtgctgga ggccatcatc 1140
gacaagatcg gcggc 1155
<210> 48
<211> 1440
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
DNMT1 sequence
<400> 48
gtggatctga ggacactcga cgtgtttagc ggatgcggcg gactctccga aggcttccac 60
caagccggaa tttccgacac actctgggcc attgagatgt gggaccccgc cgctcaagcc 120
ttcagactga ataatcccgg ctccaccgtg ttcaccgagg actgcaacat tctgctgaag 180
ctggtgatgg ctggcgaaac caccaactct agaggccaga ggctgcccca gaagggagat 240
gtggaaatgc tctgtggagg ccctccttgc caaggcttct ccggcatgaa caggttcaac 300
tctagaacat acagcaagtt caagaactct ctggtcgtga gctttctgag ctactgcgac 360
tactatagac ctaggttctt tctgctggag aacgtgagaa atttcgtgtc cttcaagagg 420
agcatggtgc tgaagctgac actgaggtgt ctggtgagga tgggctacca gtgcacattc 480
ggagtgctgc aagctggcca gtacggcgtg gcccagacca gaaggagggc catcattctg 540
gctgctgccc ccggcgagaa actccctctg ttccccgagc ccctccacgt gttcgcccct 600
agagcttgcc agctgagcgt ggtggtcgac gataagaagt tcgtgagcaa catcacaagg 660
ctgtccagcg gacccttcag aaccattacc gtgagggata ccatgtccga cctccccgag 720
gtgaggaatg gcgccagcgc tctggagatt tcctacaacg gcgaacctca gagctggttc 780
caaaggcagc tgagaggcgc tcagtatcag cccattctga gggaccacat ctgcaaagat 840
atgagcgctc tggtggccgc tagaatgaga catattcctc tggcccccgg cagcgactgg 900
agagatctgc ccaatattga ggtgagactc agcgacggaa caatggctag aaaactgagg 960
tacacccatc atgatagaaa gaacggaagg agcagcagcg gcgctctgag aggagtgtgt 1020
agctgcgtgg aagctggcaa ggcttgcgat cccgccgcta ggcagttcaa taccctcatc 1080
ccttggtgtc tgcctcacac cggcaacaga cacaatcatt gggctggact gtatggaagg 1140
ctcgaatggg acggcttttt cagcaccacc gtgaccaatc ccgaacctat gggcaagcaa 1200
ggaagggtgc tccaccccga gcagcataga gtcgtgtccg tgagagaatg cgctagaagc 1260
caaggcttcc ccgacaccta tagactgttc ggcaacattc tggataagca cagacaagtg 1320
ggaaatgctg tccctcctcc tctggccaag gctatcggac tggagatcaa gctgtgtatg 1380
ctcgccaaag ctagggagag cgcttccgcc aagattaagg aggaggaggc cgccaaggac 1440
<210> 49
<211> 1626
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
DNMT3a/3L sequence
<400> 49
aaccacgacc aggagttcga cccccccaag gtgtaccccc ccgtgcccgc cgagaagcgg 60
aagcccatcc gggtgctgag cctgttcgac ggcatcgcca ccggcctgct ggtgctgaag 120
gacctgggca tccaggtgga ccggtacatc gccagcgagg tgtgcgagga cagcatcacc 180
gtgggcatgg tgcggcacca gggcaagatc atgtacgtgg gcgacgtgcg gagcgtgacc 240
cagaagcaca tccaggagtg gggccccttc gacctggtga tcggcggcag cccctgcaac 300
gacctgagca tcgtgaaccc cgcccggaag ggcctgtacg agggcaccgg ccggctgttc 360
ttcgagttct accggctgct gcacgacgcc cggcccaagg agggcgacga ccggcccttc 420
ttctggctgt tcgagaacgt ggtggccatg ggcgtgagcg acaagcggga catcagccgg 480
ttcctggaga gcaaccccgt gatgatcgac gccaaggagg tgagcgccgc ccaccgggcc 540
cggtacttct ggggcaacct gcccggcatg aaccggcccc tggccagcac cgtgaacgac 600
aagctggagc tgcaggagtg cctggagcac ggccggatcg ccaagttcag caaggtgcgg 660
accatcacca cccggagcaa cagcatcaag cagggcaagg accagcactt ccccgtgttc 720
atgaacgaga aggaggacat cctgtggtgc accgagatgg agcgggtgtt cggcttcccc 780
gtgcactaca ccgacgtgag caacatgagc cggctggccc ggcagcggct gctgggccgg 840
agctggagcg tgcccgtgat ccggcacctg ttcgcccccc tgaaggagta cttcgcctgc 900
gtgagcagcg gcaacagcaa cgccaacagc cggggcccca gcttcagcag cggcctggtg 960
cccctgagcc tgcggggcag ccacatgaat cctctggaga tgttcgagac agtgcccgtg 1020
tggagaaggc aacccgtgag ggtgctgagc ctcttcgagg acattaagaa ggagctgacc 1080
tctctgggct ttctggaatc cggcagcgac cccggccagc tgaaacacgt ggtggacgtg 1140
accgacacag tgaggaagga cgtggaagag tggggcccct ttgacctcgt gtatggagcc 1200
acacctcctc tcggccacac atgcgatagg cctcccagct ggtatctctt ccagttccac 1260
agactgctcc agtacgccag acctaagccc ggcagcccca gacccttctt ctggatgttc 1320
gtggacaatc tggtgctgaa caaggaggat ctggatgtgg ccagcagatt tctggagatg 1380
gaacccgtga caatccccga cgtgcatggc ggctctctgc agaacgccgt gagagtgtgg 1440
tccaacatcc ccgccattag aagcagacac tgggctctgg tgagcgagga ggaactgtct 1500
ctgctggccc agaataagca gtcctccaag ctggccgcca agtggcccac caagctggtg 1560
aagaactgct ttctgcctct gagggagtat ttcaagtatt tcagcaccga actgaccagc 1620
agcctg 1626
<210> 50
<211> 1629
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
DNMT3a/3L sequence
<400> 50
aaccacgacc aggagttcga cccccccaag gtgtaccccc ccgtgcccgc cgagaagcgg 60
aagcccatcc gggtgctgag cctgttcgac ggcatcgcca ccggcctgct ggtgctgaag 120
gacctgggca tccaggtgga ccggtacatc gccagcgagg tgtgcgagga cagcatcacc 180
gtgggcatgg tgcggcacca gggcaagatc atgtacgtgg gcgacgtgcg gagcgtgacc 240
cagaagcaca tccaggagtg gggccccttc gacctggtga tcggcggcag cccctgcaac 300
gacctgagca tcgtgaaccc cgcccggaag ggcctgtacg agggcaccgg ccggctgttc 360
ttcgagttct accggctgct gcacgacgcc cggcccaagg agggcgacga ccggcccttc 420
ttctggctgt tcgagaacgt ggtggccatg ggcgtgagcg acaagcggga catcagccgg 480
ttcctggaga gcaaccccgt gatgatcgac gccaaggagg tgagcgccgc ccaccgggcc 540
cggtacttct ggggcaacct gcccggcatg aaccggcccc tggccagcac cgtgaacgac 600
aagctggagc tgcaggagtg cctggagcac ggccggatcg ccaagttcag caaggtgcgg 660
accatcacca cccggagcaa cagcatcaag cagggcaagg accagcactt ccccgtgttc 720
atgaacgaga aggaggacat cctgtggtgc accgagatgg agcgggtgtt cggcttcccc 780
gtgcactaca ccgacgtgag caacatgagc cggctggccc ggcagcggct gctgggccgg 840
agctggagcg tgcccgtgat ccggcacctg ttcgcccccc tgaaggagta cttcgcctgc 900
gtgagcagcg gcaacagcaa cgccaacagc cggggcccca gcttcagcag cggcctggtg 960
cccctgagcc tgcggggcag ccacatgggc cccatggaga tctacaagac cgtgagcgcc 1020
tggaagcggc agcccgtgcg ggtgctgagc ctgttccgga acatcgacaa ggtgctgaaa 1080
tccctgggct tcctggagag cggcagcggc agcggcggcg gcaccctgaa gtacgtggag 1140
gacgtgacca acgtggtgcg gcgggacgtg gagaagtggg gccccttcga cctggtgtac 1200
ggcagcaccc agcccctggg cagcagctgc gaccggtgcc ccggctggta catgttccag 1260
ttccaccgga tcctgcagta cgccctgccc cggcaggaga gccagcggcc cttcttctgg 1320
atcttcatgg acaacctgct gctgaccgag gacgaccagg agaccaccac ccggttcctg 1380
cagaccgagg ccgtgaccct gcaggacgtg cggggccggg actaccagaa cgccatgcgg 1440
gtgtggagca acatccccgg cctgaaatcc aagcacgccc ccctgacccc caaggaggag 1500
gagtacctgc aggcccaggt gcggagccgg agcaagctgg acgcccccaa ggtggacctg 1560
ctggtgaaga actgcctgct gcccctgcgg gagtacttca agtacttcag ccagaacagc 1620
ctgcccctg 1629
<210> 51
<211> 288
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
KRAB sequence
<400> 51
gacgccaaga gcctgaccgc ctggagccgg accctggtga ccttcaagga cgtgttcgtg 60
gacttcaccc gggaggagtg gaagctgctg gacaccgccc agcagatcct gtaccggaac 120
gtgatgctgg agaactacaa gaacctggtg agcctgggct accagctgac caagcccgac 180
gtgatcctgc ggctggagaa gggcgaggag ccctggctgg tggagcggga gatccaccag 240
gagacccacc ccgacagcga gaccgccttc gagatcaaga gcagcgtg 288
<210> 52
<211> 846
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
G9A sequence
<400> 52
ggaaataggg ctatcagaac cgagaagatc atctgtaggg acgtggctag aggctacgag 60
aacgtgccca ttccttgcgt gaatggcgtg gatggcgaac cttgccccga ggactacaaa 120
tacatctccg agaactgcga aaccagcaca atgaacatcg acagaaacat cacccacctc 180
cagcactgca catgtgtgga tgactgctcc tccagcaact gtctgtgcgg ccagctctcc 240
atcagatgct ggtacgacaa ggacggcaga ctgctgcaag agttcaacaa gatcgaaccc 300
cctctcatct tcgagtgtaa ccaagcttgc agctgctgga gaaactgcaa gaatagagtg 360
gtccagagcg gcatcaaggt gagactgcaa ctgtacagaa ccgccaagat gggatgggga 420
gtgagggctc tgcaaaccat tccccaaggc accttcatct gcgaatacgt gggcgaactg 480
atctccgacg ccgaagctga cgtgagagag gacgacagct atctcttcga tctggacaat 540
aaggacggcg aggtgtactg catcgacgct agatattacg gcaacatctc tagattcatc 600
aaccacctct gcgatcccaa catcattccc gtgagggtgt tcatgctgca ccaagatctg 660
aggttcccta gaatcgcctt cttcagctct agagacatca gaaccggcga ggagctgggc 720
ttcgattacg gcgatagatt ctgggacatc aagtccaagt acttcacatg ccagtgcggc 780
agcgagaagt gtaagcacag cgctgaggcc attgctctgg agcagtctag actggccaga 840
ctggat 846
<210> 53
<211> 1128
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
HDAC8 sequence
<400> 53
gaggagcccg aggagcccgc cgatagcgga caatctctgg tgcccgtcta catctacagc 60
cccgaatatg tgagcatgtg tgattccctc gccaagatcc ctaagagagc cagcatggtg 120
cattctctga tcgaggccta cgctctgcat aagcaaatga ggatcgtgaa gcccaaggtc 180
gccagcatgg aagagatggc cacctttcac accgatgcct acctccaaca tctccagaag 240
gtgtcccaag agggcgacga cgaccacccc gactccattg agtacggact gggctatgat 300
tgccccgcca ccgagggcat ctttgactat gccgccgcta tcggcggagc taccatcaca 360
gccgcccagt gtctgattga tggcatgtgc aaggtcgcca tcaactggtc cggaggctgg 420
catcatgcca agaaggatga ggcctccggc ttctgttatc tgaatgacgc cgtgctgggc 480
attctgagac tgaggaggaa attcgagagg attctgtacg tggatctgga tctgcatcac 540
ggagatggag tcgaagatgc cttcagcttc accagcaagg tgatgacagt ctctctgcac 600
aagttctccc ccggcttctt tcccggaacc ggcgacgtgt ccgacgtggg actgggcaag 660
ggaaggtact acagcgtgaa cgtgcccatt caagacggca tccaagacga gaagtactac 720
cagatctgcg agtccgtgct caaggaggtc taccaagcct tcaatcctaa ggctgtcgtg 780
ctccaactgg gagctgatac cattgctggc gatcccatgt gcagcttcaa tatgacaccc 840
gtcggaatcg gcaagtgcct caagtacatc ctccagtggc agctcgccac cctcattctc 900
ggaggaggcg gatacaatct ggctaatacc gccagatgct ggacctatct gaccggcgtg 960
attctgggca aaacactgag cagcgaaatc cccgaccacg agtttttcac cgcttacggc 1020
cccgactacg tgctggagat cacccccagc tgcagacccg atagaaacga accccataga 1080
atccagcaaa ttctgaacta tatcaagggc aacctcaagc acgtcgtg 1128
<210> 54
<211> 2553
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
LSD1 sequence
<400> 54
ctctccggaa agaaagccgc cgctgccgct gccgccgctg ctgctgccgc taccggcaca 60
gaagctggcc ccggaacagc tggcggaagc gaaaacggaa gcgaagtggc tgcccagccc 120
gccggactgt ccggacccgc cgaggtggga cccggcgctg tcggcgaaag gacccccaga 180
aaaaaggagc ctcctagagc cagccctccc ggcggactcg ccgaacctcc cggcagcgct 240
ggacctcaag ccggacctac agtggtgccc ggcagcgcta cacctatgga gaccggcatc 300
gctgagaccc ccgagggaag gagaaccagc agaaggaaga gagccaaggt ggagtacaga 360
gagatggatg agtctctggc taacctcagc gaggacgagt actactccga ggaggaaagg 420
aatgccaagg ccgagaagga gaagaagctg ccccctcctc cccctcaagc cccccccgag 480
gaggagaacg agtccgagcc cgaggaaccc agcggagtgg aaggagccgc ctttcagtcc 540
agactgcccc acgacagaat gacatcccaa gaggccgctt gctttcccga cattatttcc 600
ggccctcagc agacccagaa ggtgtttctg ttcattagaa atagaacact ccagctgtgg 660
ctcgacaacc ccaagatcca gctgaccttc gaggctaccc tccaacagct ggaggccccc 720
tacaatagcg ataccgtgct ggtgcacaga gtgcacagct atctggagag gcacggcctc 780
attaacttcg gcatttacaa gcggatcaag cccctgccca ccaagaaaac aggcaaggtg 840
atcatcatcg gcagcggcgt gagcggcctg gccgccgccc ggcagctgca gagcttcggc 900
atggacgtga ccctgctgga ggcccgggac cgggtgggcg gccgggtggc caccttccgg 960
aagggcaact acgtggccga cctgggcgcc atggtggtga ccggcctggg cggcaacccc 1020
atggccgtgg tgagcaagca ggtgaacatg gagctggcca agatcaagca gaagtgcccc 1080
ctgtacgagg ccaacggcca ggccgtgccc aaggagaagg acgagatggt ggagcaggag 1140
ttcaaccggc tgctggaggc caccagctac ctgagccacc agctggactt caacgtgctg 1200
aacaacaagc acgtgagcct gggccaggcc ctggaggtgg tgatccagct gcaggagaag 1260
cacgtgaagg acgagcagat cgagcactgg aagaagatcg tgaaaacaca ggaggagctg 1320
aaggagctgc tgaacaagat ggtgaacctg aaggagaaga tcaaggagct gcaccagcag 1380
tacaaggagg ccagcgaggt gaagcccccc cgggacatca ccgccgagtt cctggtcaaa 1440
agcaagcacc gggacctgac cgccctgtgc aaggagtacg acgagctggc cgagacccag 1500
ggcaagctgg aggagaagct gcaggagctg gaggccaacc cccccagcga cgtgtacctg 1560
agcagccggg accggcagat cctggactgg cacttcgcca acctggagtt cgccaacgcc 1620
acccccctga gcaccctgag cctgaagcac tgggaccagg acgacgactt cgagttcacc 1680
ggcagccacc tgaccgtgcg gaacggctac agctgcgtgc ccgtggccct ggccgagggc 1740
ctggacatca agctgaacac cgccgtgcgg caggtgcggt acaccgccag cggctgcgag 1800
gtgatcgccg tgaacacccg gagcaccagc cagaccttca tctacaagtg cgacgccgtg 1860
ctgtgcaccc tgcccctggg cgtgctgaag cagcagcccc ccgccgtgca gttcgtgccc 1920
cccctgcccg agtggaaaac aagcgccgtg cagcggatgg gcttcggcaa cctgaacaag 1980
gtggtgctgt gcttcgaccg ggtgttctgg gaccccagcg tgaacctgtt cggccacgtg 2040
ggcagcacca ccgccagccg gggcgagctg ttcctgttct ggaacctgta caaggccccc 2100
atcctgctgg ccctggtggc cggcgaggcc gccggcatca tggagaacat cagcgacgac 2160
gtgatcgtgg gccggtgcct ggccatcctg aagggcatct tcggcagcag cgccgtgccc 2220
cagcccaagg agaccgtggt gagccggtgg cgggccgacc cctgggcccg gggcagctac 2280
agctacgtgg ccgccggcag cagcggcaac gactacgacc tgatggccca gcccatcacc 2340
cccggcccca gcatccccgg cgccccccag cccatccccc ggctgttctt cgccggcgag 2400
cacaccatcc ggaactaccc cgccaccgtg cacggcgccc tgctgagcgg cctgcgggag 2460
gcaggacgga tcgccgacca gttcctgggc gccatgtaca ccctgccccg gcaggccacc 2520
cccggcgtgc ccgcccagca gagccccagc atg 2553
<210> 55
<211> 2235
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
EZH2 sequence
<400> 55
ggccagaccg gcaagaagag cgagaagggc cccgtgtgct ggcggaagcg ggtgaagagc 60
gagtacatgc ggctgcggca gctgaagcgg ttccggcggg ccgacgaggt gaagagcatg 120
ttcagcagca accggcagaa gatcctggag cggaccgaga tcctgaacca ggagtggaag 180
cagcggcgaa tccagcccgt gcacatcctg accagcgtga gcagcctgcg gggcacccgg 240
gagtgcagcg tgaccagcga cctggacttc cccacccagg tgatccccct aaagaccctg 300
aacgccgtgg ccagcgtgcc catcatgtac agctggagcc ccctgcagca gaacttcatg 360
gtggaggacg agaccgtgct gcacaacatc ccctacatgg gcgacgaggt gctggaccag 420
gacggcacct tcatcgagga gctgatcaag aactacgacg gcaaggtgca cggcgaccgg 480
gagtgcggct tcatcaacga cgagatcttc gtggagctgg tgaacgccct gggccagtac 540
aacgacgacg acgacgacga cgacggcgac gaccccgagg agcgggagga gaagcagaag 600
gacctggagg accaccggga cgacaaggag agccggcccc cccggaagtt ccccagcgac 660
aagatcttcg aggccatcag cagcatgttc cccgacaagg gcaccgccga ggagctgaag 720
gagaagtaca aggagctgac cgagcagcag ctgcccggcg ccctgccccc cgagtgcacc 780
cccaacatcg acggccccaa cgccaagagc gtgcagcggg agcagagcct gcacagcttc 840
cacaccctgt tctgccggcg gtgcttcaag tacgactgct tcctgcaccc cttccacgcc 900
acccccaaca cctacaagcg gaagaacacc gagaccgccc tggacaacaa gccctgcggc 960
ccccagtgct accagcacct ggagggcgcc aaggagttcg ccgccgccct gaccgccgag 1020
cggatcaaga ccccccccaa gcggcccggc ggccggcggc ggggccggct gcccaacaac 1080
agcagccggc ccagcacccc caccatcaac gtgctggaga gcaaggacac cgacagcgac 1140
cgggaggccg gcaccgagac cggcggcgag aacaacgaca aggaggagga ggagaagaag 1200
gacgagacca gcagcagcag cgaggccaac agccggtgcc agacccccat caagatgaag 1260
cccaacatcg agccccccga gaacgtggag tggagcggcg ccgaggccag catgttccgg 1320
gtgctgatcg gcacctacta cgacaacttc tgcgccatcg cccggctgat cggcaccaag 1380
acctgccggc aggtgtacga gttccgggtg aaggagagca gcatcatcgc ccccgccccc 1440
gccgaggacg tggacacccc cccccggaag aagaagcgga agcaccggct gtgggccgcc 1500
cactgccgga agatccagct gaagaaggac ggcagcagca accacgtgta caactaccag 1560
ccctgcgacc acccccggca gccctgcgac agcagctgcc cctgcgtgat cgcccagaac 1620
ttctgcgaga agttctgcca gtgcagcagc gagtgccaga accggttccc cggctgccgg 1680
tgcaaggccc agtgcaacac caagcagtgc ccctgctacc tggccgtgcg ggagtgcgac 1740
cccgacctgt gcctgacctg cggcgccgcc gaccactggg acagcaagaa cgtgagctgc 1800
aagaactgca gcatccagcg gggcagcaag aagcacctgc tgctggcccc cagcgacgtg 1860
gccggctggg gcatcttcat caaggacccc gtgcagaaga acgagttcat cagcgagtac 1920
tgcggcgaga tcatcagcca ggacgaggcc gaccggcggg gcaaggtgta cgacaagtac 1980
atgtgcagct tcctgttcaa cctgaacaac gacttcgtgg tggacgccac ccggaagggc 2040
aacaagatcc ggttcgccaa ccacagcgtg aaccccaact gctacgccaa ggtgatgatg 2100
gtgaacggcg accaccggat cggcatcttc gccaagcggg ccatccagac cggcgaggag 2160
ctgttcttcg actaccggta cagccaggcc gacgccctga agtacgtggg catcgagcgg 2220
gagatggaga tcccc 2235
<210> 56
<211> 132
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
FOG1 sequence
<400> 56
agcagaagga agcagagcaa ccccagacaa atcaagagat ctctgggcga catggaggcc 60
agagaggaag tgcagctggt gggcgccagc cacatggagc agaaggctac agcccccgag 120
gcccccagcc cc 132
<210> 57
<211> 385
<212> PRT
<213> Spiroplasma monobiae
<400> 57
Ser Lys Val Glu Asn Lys Thr Lys Lys Leu Arg Val Phe Glu Ala Phe
1 5 10 15
Ala Gly Ile Gly Ala Gln Arg Lys Ala Leu Glu Lys Val Arg Lys Asp
20 25 30
Glu Tyr Glu Ile Val Gly Leu Ala Glu Trp Tyr Val Pro Ala Ile Val
35 40 45
Met Tyr Gln Ala Ile His Asn Asn Phe His Thr Lys Leu Glu Tyr Lys
50 55 60
Ser Val Ser Arg Glu Glu Met Ile Asp Tyr Leu Glu Asn Lys Thr Leu
65 70 75 80
Ser Trp Asn Ser Lys Asn Pro Val Ser Asn Gly Tyr Trp Lys Arg Lys
85 90 95
Lys Asp Asp Glu Leu Lys Ile Ile Tyr Asn Ala Ile Lys Leu Ser Glu
100 105 110
Lys Glu Gly Asn Ile Phe Asp Ile Arg Asp Leu Tyr Lys Arg Thr Leu
115 120 125
Lys Asn Ile Asp Leu Leu Thr Tyr Ser Phe Pro Cys Gln Asp Leu Ser
130 135 140
Gln Gln Gly Ile Gln Lys Gly Met Lys Arg Gly Ser Gly Thr Arg Ser
145 150 155 160
Gly Leu Leu Trp Glu Ile Glu Arg Ala Leu Asp Ser Thr Glu Lys Asn
165 170 175
Asp Leu Pro Lys Tyr Leu Leu Met Glu Asn Val Gly Ala Leu Leu His
180 185 190
Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Asn Gln Trp Lys Gln Lys Leu Glu Ser
195 200 205
Leu Gly Tyr Gln Asn Ser Ile Glu Val Leu Asn Ala Ala Asp Phe Gly
210 215 220
Ser Ser Gln Ala Arg Arg Arg Val Phe Met Ile Ser Thr Leu Asn Glu
225 230 235 240
Phe Val Glu Leu Pro Lys Gly Asp Lys Lys Pro Lys Ser Ile Lys Lys
245 250 255
Val Leu Asn Lys Ile Val Ser Glu Lys Asp Ile Leu Asn Asn Leu Leu
260 265 270
Lys Tyr Asn Leu Thr Glu Phe Lys Lys Thr Lys Ser Asn Ile Asn Lys
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Ala Ser Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Phe Asn Ser Glu Gly Tyr Val Tyr
290 295 300
Asp Pro Glu Phe Thr Gly Pro Thr Leu Thr Ala Ser Gly Ala Asn Ser
305 310 315 320
Arg Ile Lys Ile Lys Asp Gly Ser Asn Ile Arg Lys Met Asn Ser Asp
325 330 335
Glu Thr Phe Leu Tyr Ile Gly Phe Asp Ser Gln Asp Gly Lys Arg Val
340 345 350
Asn Glu Ile Glu Phe Leu Thr Glu Asn Gln Lys Ile Phe Val Cys Gly
355 360 365
Asn Ser Ile Ser Val Glu Val Leu Glu Ala Ile Ile Asp Lys Ile Gly
370 375 380
Gly
385
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
DNMT1 sequence
<400> 58
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Thr Val Phe Thr Glu Asp Cys Asn Ile Leu Leu Lys Leu Val Met Ala
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65 70 75 80
Val Glu Met Leu Cys Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser Gly Met
85 90 95
Asn Arg Phe Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn Ser Leu Val
100 105 110
Val Ser Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro Arg Phe Phe Leu
115 120 125
Leu Glu Asn Val Arg Asn Phe Val Ser Phe Lys Arg Ser Met Val Leu
130 135 140
Lys Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met Gly Tyr Gln Cys Thr Phe
145 150 155 160
Gly Val Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Val Ala Gln Thr Arg Arg Arg
165 170 175
Ala Ile Ile Leu Ala Ala Ala Pro Gly Glu Lys Leu Pro Leu Phe Pro
180 185 190
Glu Pro Leu His Val Phe Ala Pro Arg Ala Cys Gln Leu Ser Val Val
195 200 205
Val Asp Asp Lys Lys Phe Val Ser Asn Ile Thr Arg Leu Ser Ser Gly
210 215 220
Pro Phe Arg Thr Ile Thr Val Arg Asp Thr Met Ser Asp Leu Pro Glu
225 230 235 240
Val Arg Asn Gly Ala Ser Ala Leu Glu Ile Ser Tyr Asn Gly Glu Pro
245 250 255
Gln Ser Trp Phe Gln Arg Gln Leu Arg Gly Ala Gln Tyr Gln Pro Ile
260 265 270
Leu Arg Asp His Ile Cys Lys Asp Met Ser Ala Leu Val Ala Ala Arg
275 280 285
Met Arg His Ile Pro Leu Ala Pro Gly Ser Asp Trp Arg Asp Leu Pro
290 295 300
Asn Ile Glu Val Arg Leu Ser Asp Gly Thr Met Ala Arg Lys Leu Arg
305 310 315 320
Tyr Thr His His Asp Arg Lys Asn Gly Arg Ser Ser Ser Gly Ala Leu
325 330 335
Arg Gly Val Cys Ser Cys Val Glu Ala Gly Lys Ala Cys Asp Pro Ala
340 345 350
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355 360 365
Asn Arg His Asn His Trp Ala Gly Leu Tyr Gly Arg Leu Glu Trp Asp
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Gly Arg Val Leu His Pro Glu Gln His Arg Val Val Ser Val Arg Glu
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Ala Lys Ala Ile Gly Leu Glu Ile Lys Leu Cys Met Leu Ala Lys Ala
450 455 460
Arg Glu Ser Ala Ser Ala Lys Ile Lys Glu Glu Glu Ala Ala Lys Asp
465 470 475 480
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<212> PRT
<213> Unknown
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<223> Description of Unknown:
DNMT3a/3L sequence
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355 360 365
Ser Asp Pro Gly Gln Leu Lys His Val Val Asp Val Thr Asp Thr Val
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<213> Unknown
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<223> Description of Unknown:
DNMT3a/3L sequence
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340 345 350
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<213> Unknown
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<223> Description of Unknown:
KRAB sequence
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<213> Homo sapiens
<400> 62
Gly Asn Arg Ala Ile Arg Thr Glu Lys Ile Ile Cys Arg Asp Val Ala
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195 200 205
Ile Pro Val Arg Val Phe Met Leu His Gln Asp Leu Arg Phe Pro Arg
210 215 220
Ile Ala Phe Phe Ser Ser Arg Asp Ile Arg Thr Gly Glu Glu Leu Gly
225 230 235 240
Phe Asp Tyr Gly Asp Arg Phe Trp Asp Ile Lys Ser Lys Tyr Phe Thr
245 250 255
Cys Gln Cys Gly Ser Glu Lys Cys Lys His Ser Ala Glu Ala Ile Ala
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Leu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Arg Leu Asp
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Ala Asp Ser Gly Gln Ser Leu Val Pro Val
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Tyr Ile Tyr Ser Pro Glu Tyr Val Ser Met Cys Asp Ser Leu Ala Lys
20 25 30
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35 40 45
Leu His Lys Gln Met Arg Ile Val Lys Pro Lys Val Ala Ser Met Glu
50 55 60
Glu Met Ala Thr Phe His Thr Asp Ala Tyr Leu Gln His Leu Gln Lys
65 70 75 80
Val Ser Gln Glu Gly Asp Asp Asp His Pro Asp Ser Ile Glu Tyr Gly
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Leu Gly Tyr Asp Cys Pro Ala Thr Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Ala Ala
100 105 110
Ala Ile Gly Gly Ala Thr Ile Thr Ala Ala Gln Cys Leu Ile Asp Gly
115 120 125
Met Cys Lys Val Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Trp His His Ala Lys
130 135 140
Lys Asp Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Leu Asn Asp Ala Val Leu Gly
145 150 155 160
Ile Leu Arg Leu Arg Arg Lys Phe Glu Arg Ile Leu Tyr Val Asp Leu
165 170 175
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Lys Val Met Thr Val Ser Leu His Lys Phe Ser Pro Gly Phe Phe Pro
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Gly Thr Gly Asp Val Ser Asp Val Gly Leu Gly Lys Gly Arg Tyr Tyr
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Ser Val Asn Val Pro Ile Gln Asp Gly Ile Gln Asp Glu Lys Tyr Tyr
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Gln Ile Cys Glu Ser Val Leu Lys Glu Val Tyr Gln Ala Phe Asn Pro
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Lys Ala Val Val Leu Gln Leu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Asp Pro
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Tyr Asn Leu Ala Asn Thr Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Leu Thr Gly Val
305 310 315 320
Ile Leu Gly Lys Thr Leu Ser Ser Glu Ile Pro Asp His Glu Phe Phe
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340 345 350
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Lys Gly Asn Leu Lys His Val Val
370 375
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Leu Ser Gly Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Gly Thr Glu Ala Gly Pro Gly Thr Ala Gly Gly Ser Glu Asn
20 25 30
Gly Ser Glu Val Ala Ala Gln Pro Ala Gly Leu Ser Gly Pro Ala Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Thr Gly Ile Ala Glu Thr Pro Glu Gly Arg Arg Thr Ser Arg Arg
100 105 110
Lys Arg Ala Lys Val Glu Tyr Arg Glu Met Asp Glu Ser Leu Ala Asn
115 120 125
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130 135 140
Glu Lys Glu Lys Lys Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala Pro Pro Glu
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Glu Glu Asn Glu Ser Glu Pro Glu Glu Pro Ser Gly Val Glu Gly Ala
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Phe Leu Phe Ile Arg Asn Arg Thr Leu Gln Leu Trp Leu Asp Asn Pro
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Lys Ile Gln Leu Thr Phe Glu Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ala Pro
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Pro Thr Lys Lys Thr Gly Lys Val Ile Ile Ile Gly Ser Gly Val Ser
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Gly Leu Ala Ala Ala Arg Gln Leu Gln Ser Phe Gly Met Asp Val Thr
290 295 300
Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Val Ala Thr Phe Arg
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Gly Gly Asn Pro Met Ala Val Val Ser Lys Gln Val Asn Met Glu Leu
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Ala Lys Ile Lys Gln Lys Cys Pro Leu Tyr Glu Ala Asn Gly Gln Ala
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Leu Glu Ala Thr Ser Tyr Leu Ser His Gln Leu Asp Phe Asn Val Leu
385 390 395 400
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850
<210> 65
<211> 745
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg Lys
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Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp Pro
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Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp Asp
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Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe Glu
210 215 220
Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu Lys
225 230 235 240
Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu Pro
245 250 255
Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val Gln
260 265 270
Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg Cys
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Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe His Ala Thr Pro Asn Thr
290 295 300
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Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala Ala
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 69
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
20 25 30
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
35 40 45
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
65 70 75 80
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
100 105 110
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
115 120 125
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
130 135 140
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
145 150 155 160
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
165 170 175
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
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210 215 220
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
245 250 255
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
260 265 270
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
275 280 285
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
290 295 300
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
305 310 315 320
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
325 330 335
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
355 360 365
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
435 440 445
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
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565 570 575
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595 600 605
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625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
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965 970 975
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Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
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1340 1345 1350
Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1355 1360 1365
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly
1370 1375 1380
Asp Ser Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln
1385 1390 1395
Ala Lys Lys Lys Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Leu Arg
1400 1405 1410
Thr Leu Asp Val Phe Ser Gly Cys Gly Gly Leu Ser Glu Gly Phe
1415 1420 1425
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1430 1435 1440
Asp Pro Ala Ala Gln Ala Phe Arg Leu Asn Asn Pro Gly Ser Thr
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Val Phe Thr Glu Asp Cys Asn Ile Leu Leu Lys Leu Val Met Ala
1460 1465 1470
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Gly Met Asn Arg Phe Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn
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Ser Leu Val Val Ser Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro
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1535 1540 1545
Arg Ser Met Val Leu Lys Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met
1550 1555 1560
Gly Tyr Gln Cys Thr Phe Gly Val Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly
1565 1570 1575
Val Ala Gln Thr Arg Arg Arg Ala Ile Ile Leu Ala Ala Ala Pro
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Pro Arg Ala Cys Gln Leu Ser Val Val Val Asp Asp Lys Lys Phe
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1670 1675 1680
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1730 1735 1740
Ala Leu Arg Gly Val Cys Ser Cys Val Glu Ala Gly Lys Ala Cys
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Ala Lys Ile Lys Glu Glu Glu Ala Ala Lys Asp Gly Gly Gly Gly
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Lys Lys Lys Gly Ser
1910
<210> 70
<211> 1977
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 70
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
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Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
35 40 45
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
65 70 75 80
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
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Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
100 105 110
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
115 120 125
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
130 135 140
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
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Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
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Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
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Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
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Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
210 215 220
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
245 250 255
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
260 265 270
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
275 280 285
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
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Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
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Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
325 330 335
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340 345 350
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
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Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
530 535 540
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
545 550 555 560
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
565 570 575
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
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595 600 605
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Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
690 695 700
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Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
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885 890 895
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
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915 920 925
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
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Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
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355 360 365
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
370 375 380
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
385 390 395 400
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
405 410 415
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
420 425 430
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
435 440 445
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
450 455 460
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
465 470 475 480
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
485 490 495
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
500 505 510
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
515 520 525
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
530 535 540
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
545 550 555 560
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
565 570 575
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
580 585 590
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
595 600 605
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
610 615 620
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
625 630 635 640
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
645 650 655
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
660 665 670
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
675 680 685
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
690 695 700
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
705 710 715 720
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
725 730 735
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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805 810 815
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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
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850 855 860
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Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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1040 1045 1050
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1070 1075 1080
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1100 1105 1110
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1220 1225 1230
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Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser
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1310 1315 1320
Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala
1325 1330 1335
Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr
1340 1345 1350
Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1355 1360 1365
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Asp Ser Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln
1385 1390 1395
Ala Lys Lys Lys Lys Glu Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Gly Lys
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Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly
1415 1420 1425
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1430 1435 1440
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Leu Ala Ala Ala Arg Gln Leu Gln Ser Phe Gly Met Asp Val Thr
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Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Val Ala Thr Phe
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1730 1735 1740
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1790 1795 1800
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1940 1945 1950
Thr Leu Ser Leu Lys His Trp Asp Gln Asp Asp Asp Phe Glu Phe
1955 1960 1965
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1970 1975 1980
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1985 1990 1995
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2000 2005 2010
Asn Thr Arg Ser Thr Ser Gln Thr Phe Ile Tyr Lys Cys Asp Ala
2015 2020 2025
Val Leu Cys Thr Leu Pro Leu Gly Val Leu Lys Gln Gln Pro Pro
2030 2035 2040
Ala Val Gln Phe Val Pro Pro Leu Pro Glu Trp Lys Thr Ser Ala
2045 2050 2055
Val Gln Arg Met Gly Phe Gly Asn Leu Asn Lys Val Val Leu Cys
2060 2065 2070
Phe Asp Arg Val Phe Trp Asp Pro Ser Val Asn Leu Phe Gly His
2075 2080 2085
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2090 2095 2100
Asn Leu Tyr Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ala Leu Val Ala Gly Glu
2105 2110 2115
Ala Ala Gly Ile Met Glu Asn Ile Ser Asp Asp Val Ile Val Gly
2120 2125 2130
Arg Cys Leu Ala Ile Leu Lys Gly Ile Phe Gly Ser Ser Ala Val
2135 2140 2145
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2150 2155 2160
Trp Ala Arg Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Ala Ala Gly Ser Ser Gly
2165 2170 2175
Asn Asp Tyr Asp Leu Met Ala Gln Pro Ile Thr Pro Gly Pro Ser
2180 2185 2190
Ile Pro Gly Ala Pro Gln Pro Ile Pro Arg Leu Phe Phe Ala Gly
2195 2200 2205
Glu His Thr Ile Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Val His Gly Ala Leu
2210 2215 2220
Leu Ser Gly Leu Arg Glu Ala Gly Arg Ile Ala Asp Gln Phe Leu
2225 2230 2235
Gly Ala Met Tyr Thr Leu Pro Arg Gln Ala Thr Pro Gly Val Pro
2240 2245 2250
Ala Gln Gln Ser Pro Ser Met Ser Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala
2255 2260 2265
Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser
2270 2275 2280
<210> 76
<211> 2168
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 76
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg Lys Arg
20 25 30
Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe Arg Arg
35 40 45
Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys Ile Leu
50 55 60
Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg Ile Gln
65 70 75 80
Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr Arg Glu
85 90 95
Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile Pro Leu
100 105 110
Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser Trp Ser
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe Glu Ala
225 230 235 240
Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu Pro Pro
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala Ala Leu
340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr Pro Ile
420 425 430
Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp Ser Gly
435 440 445
Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr Asp Asn
450 455 460
Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg Gln Val
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Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala Pro Ala
485 490 495
Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His Arg Leu
500 505 510
Trp Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly Ser Ser
515 520 525
Asn His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln Pro Cys
530 535 540
Asp Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu Lys Phe
545 550 555 560
Cys Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys Arg Cys
565 570 575
Lys Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala Val Arg
580 585 590
Glu Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp His Trp
595 600 605
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610 615 620
Lys Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp Gly Ile
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Phe Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu Tyr Cys
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Gly Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys Val Tyr
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675 680 685
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690 695 700
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740 745 750
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Pro Asp Lys Lys Tyr
770 775 780
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785 790 795 800
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
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1040 1045 1050
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1130 1135 1140
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1190 1195 1200
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1310 1315 1320
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1355 1360 1365
Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys
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1385 1390 1395
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Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile
1445 1450 1455
Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met
1460 1465 1470
Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln
1475 1480 1485
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1490 1495 1500
Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln
1505 1510 1515
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1520 1525 1530
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1535 1540 1545
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1550 1555 1560
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His
1565 1570 1575
Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr
1580 1585 1590
Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp
1595 1600 1605
Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Ala Ala Ile Val Pro Gln
1610 1615 1620
Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg
1625 1630 1635
Ser Asp Lys Ala Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu
1640 1645 1650
Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
1655 1660 1665
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu
1670 1675 1680
Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg
1685 1690 1695
Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile
1700 1705 1710
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1715 1720 1725
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1730 1735 1740
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1745 1750 1755
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1760 1765 1770
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1775 1780 1785
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
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1085 1090 1095
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr
1100 1105 1110
Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp
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Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile
1130 1135 1140
Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val
1145 1150 1155
Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met
1160 1165 1170
Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
1175 1180 1185
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
1190 1195 1200
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn
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Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr
1220 1225 1230
Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val
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Ala Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp
1250 1255 1260
Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg Gly Lys Ser Asp
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Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp
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Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
1310 1315 1320
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
1325 1330 1335
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr
1340 1345 1350
Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu
1355 1360 1365
Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr
1370 1375 1380
Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr
1385 1390 1395
Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys
1400 1405 1410
Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val
1415 1420 1425
Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr
1430 1435 1440
Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr
1445 1450 1455
Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile
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Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg
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Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn
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1505 1510 1515
Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys
1520 1525 1530
Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr
1535 1540 1545
Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys
1550 1555 1560
Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile
1565 1570 1575
Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu
1580 1585 1590
Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu
1595 1600 1605
Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met
1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu
1640 1645 1650
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1670 1675 1680
Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp
1685 1690 1695
Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg
1700 1705 1710
Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu
1715 1720 1725
Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg
1730 1735 1740
Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile
1745 1750 1755
His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser
1760 1765 1770
Gln Leu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1775 1780 1785
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1790 1795 1800
Asp Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr Phe
1805 1810 1815
Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu
1820 1825 1830
Asp Thr Ala Gln Gln Ile Leu Tyr Arg Asn Val Met Leu Glu Asn
1835 1840 1845
Tyr Lys Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Asp
1850 1855 1860
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1880 1885 1890
Glu Ile Lys Ser Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Arg Pro
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Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser
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<210> 79
<211> 1533
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 79
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe
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325 330 335
Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala
340 345 350
Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu
355 360 365
Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile
370 375 380
Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His
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Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys
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Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly
465 470 475 480
Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg
485 490 495
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500 505 510
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595 600 605
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Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu
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Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg
725 730 735
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850 855 860
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Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val
885 890 895
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980 985 990
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Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr
1040 1045 1050
His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala
1055 1060 1065
Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly
1070 1075 1080
Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu
1085 1090 1095
Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn
1100 1105 1110
Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu
1115 1120 1125
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu
1130 1135 1140
Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val
1145 1150 1155
Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln
1160 1165 1170
Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser
1175 1180 1185
Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr
1190 1195 1200
Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val
1205 1210 1215
Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys
1220 1225 1230
Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys
1235 1240 1245
Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys
1250 1255 1260
Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu
1265 1270 1275
Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln
1280 1285 1290
Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu
1295 1300 1305
Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp
1310 1315 1320
Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu
1325 1330 1335
Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile
1340 1345 1350
Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys
1355 1360 1365
His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His
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Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr
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1430 1435 1440
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys
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Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Arg Lys Gln Ser Asn Pro
1460 1465 1470
Arg Gln Ile Lys Arg Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala Arg Glu Glu
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1490 1495 1500
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
HA tag sequence
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1 5
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CTCF-binding motif sequence
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<220>
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<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CTCF-binding motif sequence
<220>
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<222> (18)..(18)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(20)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 82
vhsrhggkrg ahsdccdnbn 20
<210> 83
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
YY1-binding motif sequence
<220>
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<222> (8)..(8)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 83
ccgccatntt 10
<210> 84
<211> 10
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
YY1-binding motif sequence
<220>
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<222> (3)..(3)
<223> a, c, t, g, unknown or other
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<210> 85
<211> 780
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
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100 105 110
Ser Arg Glu Arg His Arg Pro Ser Pro Arg Ser Thr Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Gly Arg Asn His Val Asp Glu Ser Pro Val Glu Phe Pro Ala Thr Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Arg Arg Ala Thr Ala Ser Ala Gly Thr Pro Trp Pro Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ser Ser Tyr Leu Thr Ile Asp Leu Thr Asp Asp Thr Glu Asp
165 170 175
Thr His Gly Thr Pro Gln Ser Ser Ser Thr Pro Tyr Ala Arg Leu Ala
180 185 190
Gln Asp Ser Gln Gln Gly Gly Met Glu Ser Pro Gln Val Glu Ala Asp
195 200 205
Ser Gly Asp Gly Asp Ser Ser Glu Tyr Gln Val Ser Ala Asp Lys Leu
210 215 220
Val Ala Leu Gly Leu Phe Ser Gln His Phe Asn Leu Ala Thr Phe Asn
225 230 235 240
Lys Leu Val Ser Tyr Arg Lys Ala Met Tyr His Ala Leu Glu Lys Ala
245 250 255
Arg Val Arg Ala Gly Lys Thr Phe Pro Ser Ser Pro Gly Asp Ser Leu
260 265 270
Glu Asp Gln Leu Lys Pro Met Leu Glu Trp Ala His Gly Gly Phe Lys
275 280 285
Pro Thr Gly Ile Glu Gly Leu Lys Pro Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Lys Thr Arg Arg Arg Thr Ala Asp Asp Ser Ala Thr Ser Asp Tyr Cys
305 310 315 320
Pro Ala Pro Lys Arg Leu Lys Thr Asn Cys Tyr Asn Asn Gly Lys Asp
325 330 335
Arg Gly Asp Glu Asp Gln Ser Arg Glu Gln Met Ala Ser Asp Val Ala
340 345 350
Asn Asn Lys Ser Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Ser Cys Gly Arg Lys
355 360 365
Asn Pro Val Ser Phe His Pro Leu Phe Glu Gly Gly Leu Cys Gln Thr
370 375 380
Cys Arg Asp Arg Phe Leu Glu Leu Phe Tyr Met Tyr Asp Asp Asp Gly
385 390 395 400
Tyr Gln Ser Tyr Cys Thr Val Cys Cys Glu Gly Arg Glu Leu Leu Leu
405 410 415
Cys Ser Asn Thr Ser Cys Cys Arg Cys Phe Cys Val Glu Cys Leu Glu
420 425 430
Val Leu Val Gly Thr Gly Thr Ala Ala Glu Ala Lys Leu Gln Glu Pro
435 440 445
Trp Ser Cys Tyr Met Cys Leu Pro Gln Arg Cys His Gly Val Leu Arg
450 455 460
Arg Arg Lys Asp Trp Asn Val Arg Leu Gln Ala Phe Phe Thr Ser Asp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Glu Tyr Glu Ala Pro Lys Leu Tyr Pro Ala Ile Pro Ala
485 490 495
Ala Arg Arg Arg Pro Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe Asp Gly Ile Ala
500 505 510
Thr Gly Tyr Leu Val Leu Lys Glu Leu Gly Ile Lys Val Gly Lys Tyr
515 520 525
Val Ala Ser Glu Val Cys Glu Glu Ser Ile Ala Val Gly Thr Val Lys
530 535 540
His Glu Gly Asn Ile Lys Tyr Val Asn Asp Val Arg Asn Ile Thr Lys
545 550 555 560
Lys Asn Ile Glu Glu Trp Gly Pro Phe Asp Leu Val Ile Gly Gly Ser
565 570 575
Pro Cys Asn Asp Leu Ser Asn Val Asn Pro Ala Arg Lys Gly Leu Tyr
580 585 590
Glu Gly Thr Gly Arg Leu Phe Phe Glu Phe Tyr His Leu Leu Asn Tyr
595 600 605
Ser Arg Pro Lys Glu Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe Trp Met Phe Glu
610 615 620
Asn Val Val Ala Met Lys Val Gly Asp Lys Arg Asp Ile Ser Arg Phe
625 630 635 640
Leu Glu Cys Asn Pro Val Met Ile Asp Ala Ile Lys Val Ser Ala Ala
645 650 655
His Arg Ala Arg Tyr Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly Met Asn Arg Pro
660 665 670
Val Ile Ala Ser Lys Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln Asp Cys Leu Glu
675 680 685
Tyr Asn Arg Ile Ala Lys Leu Lys Lys Val Gln Thr Ile Thr Thr Lys
690 695 700
Ser Asn Ser Ile Lys Gln Gly Lys Asn Gln Leu Phe Pro Val Val Met
705 710 715 720
Asn Gly Lys Glu Asp Val Leu Trp Cys Thr Glu Leu Glu Arg Ile Phe
725 730 735
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740 745 750
Arg Gln Lys Leu Leu Gly Arg Ser Trp Ser Val Pro Val Ile Arg His
755 760 765
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770 775 780
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> Simian virus 40
<400> 86
Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Nucleoplasmin bipartite NLS sequence
<400> 87
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 88
<211> 1053
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 88
Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
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Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
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115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
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165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp Ala Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
755 760 765
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile
770 775 780
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
820 825 830
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
835 840 845
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
850 855 860
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
865 870 875 880
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
885 890 895
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
900 905 910
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
915 920 925
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
930 935 940
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
945 950 955 960
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
965 970 975
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
980 985 990
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met
995 1000 1005
Asn Asp Lys Arg Pro Pro His Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys
1010 1015 1020
Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu
1025 1030 1035
Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
1040 1045 1050
<210> 89
<211> 3159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 89
gccaagcgga actacatcct gggcctggcc atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc 60
atcgactacg agacccggga cgtgatcgac gccggcgtgc ggctgttcaa ggaggccaac 120
gtggagaaca acgagggccg gcggagcaag cggggcgccc ggcggctgaa gcggcggcgg 180
cggcaccgga tccagcgggt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac 240
agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gcccgggtga agggcctgag ccagaagctg 300
agcgaggagg agttcagcgc cgccctgctg cacctggcca agcggcgggg cgtgcacaac 360
gtgaacgagg tggaggagga caccggcaac gagctgagca ccaaggagca gatcagccgg 420
aacagcaagg ccctggagga gaagtacgtg gccgagctgc agctggagcg gctgaagaag 480
gacggcgagg tgcggggcag catcaaccgg ttcaagacca gcgactacgt gaaggaggcc 540
aagcagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc 600
tacatcgacc tgctggagac ccggcggacc tactacgagg gccccggcga gggcagcccc 660
ttcggctgga aggacatcaa ggagtggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc 720
cccgaggagc tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac 780
gacctgaaca acctggtgat cacccgggac gagaacgaga agctggagta ctacgagaag 840
ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc 900
aaggagatcc tggtgaacga ggaggacatc aagggctacc gggtgaccag caccggcaag 960
cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acatcaccgc ccggaaggag 1020
atcatcgaga acgccgagct gctggaccag atcgccaaga tcctgaccat ctaccagagc 1080
agcgaggaca tccaggagga gctgaccaac ctgaacagcg agctgaccca ggaggagatc 1140
gagcagatca gcaacctgaa gggctacacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc 1200
aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgccat cttcaaccgg 1260
ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg agccagcaga aggagatccc caccaccctg 1320
gtggacgact tcatcctgag ccccgtggtg aagcggagct tcatccagag catcaaggtg 1380
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcatcatcga gctggcccgg 1440
gagaagaaca gcaaggacgc ccagaagatg atcaacgaga tgcagaagcg gaaccggcag 1500
accaacgagc ggatcgagga gatcatccgg accaccggca aggagaacgc caagtacctg 1560
atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gagggcaagt gcctgtacag cctggaggcc 1620
atccccctgg aggacctgct gaacaacccc ttcaactacg aggtggacgc catcatcccc 1680
cggagcgtga gcttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tggtgaagca ggaggagaac 1740
agcaagaagg gcaaccggac ccccttccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc 1800
tacgagacct tcaagaagca catcctgaac ctggccaagg gcaagggccg gatcagcaag 1860
accaagaagg agtacctgct ggaggagcgg gacatcaacc ggttcagcgt gcagaaggac 1920
ttcatcaacc ggaacctggt ggacacccgg tacgccaccc ggggcctgat gaacctgctg 1980
cggagctact tccgggtgaa caacctggac gtgaaggtga aatccatcaa cggcggcttc 2040
accagcttcc tgcggcggaa gtggaagttc aagaaggagc ggaacaaggg ctacaagcac 2100
cacgccgagg acgccctgat catcgccaac gccgacttca tcttcaagga gtggaagaag 2160
ctggacaagg ccaagaaggt gatggagaac cagatgttcg aggagaagca ggccgagagc 2220
atgcccgaga tcgagaccga gcaggagtac aaggagatct tcatcacccc ccaccagatc 2280
aagcacatca aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcccaac 2340
cggaagctga tcaacgacac cctgtacagc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg 2400
atcgtgaaca acctgaacgg cctgtacgac aaggacaacg acaagctgaa gaagctgatc 2460
aacaagagcc ccgagaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaagctg 2520
aagctgatca tggagcagta cggcgacgag aagaaccccc tgtacaagta ctacgaggag 2580
accggcaact acctgaccaa gtacagcaag aaggacaacg gccccgtgat caagaagatc 2640
aagtactacg gcaacaagct gaacgcccac ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc 2700
cggaacaagg tggtgaagct gagcctgaag ccctaccggt tcgacgtgta cctggacaac 2760
ggcgtgtaca agttcgtgac cgtgaagaac ctggacgtga tcaagaagga gaactactac 2820
gaggtgaaca gcaagtgcta cgaggaggcc aagaagctga agaagatcag caaccaggcc 2880
gagttcatcg ccagcttcta caagaacgac ctgatcaaga tcaacggcga gctgtaccgg 2940
gtgatcggcg tgaacaacga cctgctgaac cggatcgagg tgaacatgat cgacatcacc 3000
taccgggagt acctggagaa catgaacgac aagcggcccc cccacatcat caagaccatc 3060
gccagcaaga cccagagcat caagaagtac agcaccgaca tcctgggcaa cctgtacgag 3120
gtgaaatcca agaagcaccc ccagatcatc aagaagggc 3159
<210> 90
<211> 386
<212> PRT
<213> Spiroplasma monobiae
<400> 90
Met Ser Lys Val Glu Asn Lys Thr Lys Lys Leu Arg Val Phe Glu Ala
1 5 10 15
Phe Ala Gly Ile Gly Ala Gln Arg Lys Ala Leu Glu Lys Val Arg Lys
20 25 30
Asp Glu Tyr Glu Ile Val Gly Leu Ala Glu Trp Tyr Val Pro Ala Ile
35 40 45
Val Met Tyr Gln Ala Ile His Asn Asn Phe His Thr Lys Leu Glu Tyr
50 55 60
Lys Ser Val Ser Arg Glu Glu Met Ile Asp Tyr Leu Glu Asn Lys Thr
65 70 75 80
Leu Ser Trp Asn Ser Lys Asn Pro Val Ser Asn Gly Tyr Trp Lys Arg
85 90 95
Lys Lys Asp Asp Glu Leu Lys Ile Ile Tyr Asn Ala Ile Lys Leu Ser
100 105 110
Glu Lys Glu Gly Asn Ile Phe Asp Ile Arg Asp Leu Tyr Lys Arg Thr
115 120 125
Leu Lys Asn Ile Asp Leu Leu Thr Tyr Ser Phe Pro Cys Gln Asp Leu
130 135 140
Ser Gln Gln Gly Ile Gln Lys Gly Met Lys Arg Gly Ser Gly Thr Arg
145 150 155 160
Ser Gly Leu Leu Trp Glu Ile Glu Arg Ala Leu Asp Ser Thr Glu Lys
165 170 175
Asn Asp Leu Pro Lys Tyr Leu Leu Met Glu Asn Val Gly Ala Leu Leu
180 185 190
His Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Asn Gln Trp Lys Gln Lys Leu Glu
195 200 205
Ser Leu Gly Tyr Gln Asn Ser Ile Glu Val Leu Asn Ala Ala Asp Phe
210 215 220
Gly Ser Ser Gln Ala Arg Arg Arg Val Phe Met Ile Ser Thr Leu Asn
225 230 235 240
Glu Phe Val Glu Leu Pro Lys Gly Asp Lys Lys Pro Lys Ser Ile Lys
245 250 255
Lys Val Leu Asn Lys Ile Val Ser Glu Lys Asp Ile Leu Asn Asn Leu
260 265 270
Leu Lys Tyr Asn Leu Thr Glu Phe Lys Lys Thr Lys Ser Asn Ile Asn
275 280 285
Lys Ala Ser Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Phe Asn Ser Glu Gly Tyr Val
290 295 300
Tyr Asp Pro Glu Phe Thr Gly Pro Thr Leu Thr Ala Ser Gly Ala Asn
305 310 315 320
Ser Arg Ile Lys Ile Lys Asp Gly Ser Asn Ile Arg Lys Met Asn Ser
325 330 335
Asp Glu Thr Phe Leu Tyr Ile Gly Phe Asp Ser Gln Asp Gly Lys Arg
340 345 350
Val Asn Glu Ile Glu Phe Leu Thr Glu Asn Gln Lys Ile Phe Val Cys
355 360 365
Gly Asn Ser Ile Ser Val Glu Val Leu Glu Ala Ile Ile Asp Lys Ile
370 375 380
Gly Gly
385
<210> 91
<211> 7433
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 91
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggtac 420
ctaatacgac tcactataag gaaataagag agaaaagaag agtaagaaga aatataagag 480
ccaccatggc ccccaagaag aagcggaagg tgggcatcca cggcgtgccc gccgccgcca 540
agcggaacta catcctgggc ctggccatcg gcatcaccag cgtgggctac ggcatcatcg 600
actacgagac ccgggacgtg atcgacgccg gcgtgcggct gttcaaggag gccaacgtgg 660
agaacaacga gggccggcgg agcaagcggg gcgcccggcg gctgaagcgg cggcggcggc 720
accggatcca gcgggtgaag aagctgctgt tcgactacaa cctgctgacc gaccacagcg 780
agctgagcgg catcaacccc tacgaggccc gggtgaaggg cctgagccag aagctgagcg 840
aggaggagtt cagcgccgcc ctgctgcacc tggccaagcg gcggggcgtg cacaacgtga 900
acgaggtgga ggaggacacc ggcaacgagc tgagcaccaa ggagcagatc agccggaaca 960
gcaaggccct ggaggagaag tacgtggccg agctgcagct ggagcggctg aagaaggacg 1020
gcgaggtgcg gggcagcatc aaccggttca agaccagcga ctacgtgaag gaggccaagc 1080
agctgctgaa ggtgcagaag gcctaccacc agctggacca gagcttcatc gacacctaca 1140
tcgacctgct ggagacccgg cggacctact acgagggccc cggcgagggc agccccttcg 1200
gctggaagga catcaaggag tggtacgaga tgctgatggg ccactgcacc tacttccccg 1260
aggagctgcg gagcgtgaag tacgcctaca acgccgacct gtacaacgcc ctgaacgacc 1320
tgaacaacct ggtgatcacc cgggacgaga acgagaagct ggagtactac gagaagttcc 1380
agatcatcga gaacgtgttc aagcagaaga agaagcccac cctgaagcag atcgccaagg 1440
agatcctggt gaacgaggag gacatcaagg gctaccgggt gaccagcacc ggcaagcccg 1500
agttcaccaa cctgaaggtg taccacgaca tcaaggacat caccgcccgg aaggagatca 1560
tcgagaacgc cgagctgctg gaccagatcg ccaagatcct gaccatctac cagagcagcg 1620
aggacatcca ggaggagctg accaacctga acagcgagct gacccaggag gagatcgagc 1680
agatcagcaa cctgaagggc tacaccggca cccacaacct gagcctgaag gccatcaacc 1740
tgatcctgga cgagctgtgg cacaccaacg acaaccagat cgccatcttc aaccggctga 1800
agctggtgcc caagaaggtg gacctgagcc agcagaagga gatccccacc accctggtgg 1860
acgacttcat cctgagcccc gtggtgaagc ggagcttcat ccagagcatc aaggtgatca 1920
acgccatcat caagaagtac ggcctgccca acgacatcat catcgagctg gcccgggaga 1980
agaacagcaa ggacgcccag aagatgatca acgagatgca gaagcggaac cggcagacca 2040
acgagcggat cgaggagatc atccggacca ccggcaagga gaacgccaag tacctgatcg 2100
agaagatcaa gctgcacgac atgcaggagg gcaagtgcct gtacagcctg gaggccatcc 2160
ccctggagga cctgctgaac aaccccttca actacgaggt ggacgccatc atcccccgga 2220
gcgtgagctt cgacaacagc ttcaacaaca aggtgctggt gaagcaggag gagaacagca 2280
agaagggcaa ccggaccccc ttccagtacc tgagcagcag cgacagcaag atcagctacg 2340
agaccttcaa gaagcacatc ctgaacctgg ccaagggcaa gggccggatc agcaagacca 2400
agaaggagta cctgctggag gagcgggaca tcaaccggtt cagcgtgcag aaggacttca 2460
tcaaccggaa cctggtggac acccggtacg ccacccgggg cctgatgaac ctgctgcgga 2520
gctacttccg ggtgaacaac ctggacgtga aggtgaaatc catcaacggc ggcttcacca 2580
gcttcctgcg gcggaagtgg aagttcaaga aggagcggaa caagggctac aagcaccacg 2640
ccgaggacgc cctgatcatc gccaacgccg acttcatctt caaggagtgg aagaagctgg 2700
acaaggccaa gaaggtgatg gagaaccaga tgttcgagga gaagcaggcc gagagcatgc 2760
ccgagatcga gaccgagcag gagtacaagg agatcttcat caccccccac cagatcaagc 2820
acatcaagga cttcaaggac tacaagtaca gccaccgggt ggacaagaag cccaaccgga 2880
agctgatcaa cgacaccctg tacagcaccc ggaaggacga caagggcaac accctgatcg 2940
tgaacaacct gaacggcctg tacgacaagg acaacgacaa gctgaagaag ctgatcaaca 3000
agagccccga gaagctgctg atgtaccacc acgaccccca gacctaccag aagctgaagc 3060
tgatcatgga gcagtacggc gacgagaaga accccctgta caagtactac gaggagaccg 3120
gcaactacct gaccaagtac agcaagaagg acaacggccc cgtgatcaag aagatcaagt 3180
actacggcaa caagctgaac gcccacctgg acatcaccga cgactacccc aacagccgga 3240
acaaggtggt gaagctgagc ctgaagccct accggttcga cgtgtacctg gacaacggcg 3300
tgtacaagtt cgtgaccgtg aagaacctgg acgtgatcaa gaaggagaac tactacgagg 3360
tgaacagcaa gtgctacgag gaggccaaga agctgaagaa gatcagcaac caggccgagt 3420
tcatcgccag cttctacaag aacgacctga tcaagatcaa cggcgagctg taccgggtga 3480
tcggcgtgaa caacgacctg ctgaaccgga tcgaggtgaa catgatcgac atcacctacc 3540
gggagtacct ggagaacatg aacgacaagc ggccccccca catcatcaag accatcgcca 3600
gcaagaccca gagcatcaag aagtacagca ccgacatcct gggcaacctg tacgaggtga 3660
aatccaagaa gcacccccag atcatcaaga agggcaagcg gcccgccgcc accaagaagg 3720
ccggccaggc caagaagaag aaggcccggg acagcaaggt ggagaacaag accaagaagc 3780
tgcgggtgtt cgaggccttc gccggcatcg gcgcccagcg gaaggccctg gagaaggtgc 3840
ggaaggacga gtacgagatc gtgggcctgg ccgagtggta cgtgcccgcc atcgtgatgt 3900
accaggccat ccacaacaac ttccacacca agctggagta caagagcgtg agccgggagg 3960
agatgatcga ctacctggag aacaagaccc tgagctggaa cagcaagaac cccgtgagca 4020
acggctactg gaagcggaag aaggacgacg agctgaagat catctacaac gccatcaagc 4080
tgagcgagaa ggagggcaac atcttcgaca tccgggacct gtacaagcgg accctgaaga 4140
acatcgacct gctgacctac agcttcccct gccaggacct gagccagcag ggcatccaga 4200
agggcatgaa gcggggcagc ggcacccgga gcggcctgct gtgggagatc gagcgggccc 4260
tggacagcac cgagaagaac gacctgccca agtacctgct gatggagaac gtgggcgccc 4320
tgctgcacaa gaagaacgag gaggagctga accagtggaa gcagaagctg gagagcctgg 4380
gctaccagaa cagcatcgag gtgctgaacg ccgccgactt cggcagcagc caggcccggc 4440
ggcgggtgtt catgatcagc accctgaacg agttcgtgga gctgcccaag ggcgacaaga 4500
agcccaagag catcaagaag gtgctgaaca agatcgtgag cgagaaggac atcctgaaca 4560
acctgctgaa gtacaacctg accgagttca agaaaaccaa gagcaacatc aacaaggcca 4620
gcctgatcgg ctacagcaag ttcaacagcg agggctacgt gtacgacccc gagttcaccg 4680
gccccaccct gaccgccagc ggcgccaaca gccggatcaa gatcaaggac ggcagcaaca 4740
tccggaagat gaacagcgac gagaccttcc tgtacatcgg cttcgacagc caggacggca 4800
agcgggtgaa cgagatcgag ttcctgaccg agaaccagaa gatcttcgtg tgcggcaaca 4860
gcatcagcgt ggaggtgctg gaggccatca tcgacaagat cggcggcccc agcagcggcg 4920
gcaagcggcc cgccgccacc aagaaggccg gccaggccaa gaagaagaag ggcagctacc 4980
cctacgacgt gcccgactac gcctgagcgg ccgcttaatt aagctgcctt ctgcggggct 5040
tgccttctgg ccatgccctt cttctctccc ttgcacctgt acctcttggt ctttgaataa 5100
agcctgagta ggaagtctag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgtcttctt catcgcctgc 5220
agatcccaat ggcgcgccga gcttggctcg agcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 5280
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 5340
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 5400
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 5460
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 5520
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 5580
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 5640
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 5700
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 5760
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 5820
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 5880
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 5940
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6000
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6060
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 6120
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 6180
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 6240
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 6300
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 6360
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 6420
gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc 6480
atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag 6540
gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat 6600
taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga 6660
atccggtgag aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc 6720
attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc 6780
ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg 6840
caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc 6900
ttctaatacc tggaatgctg ttttcccagg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc 6960
aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag 7020
tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa 7080
ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt 7140
atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct 7200
agagcaagac gtttcccgtt gaatatggct catactcttc ctttttcaat attattgaag 7260
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 7320
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 7380
tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 7433
<210> 92
<211> 4762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 92
aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60
agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgc caagcggaac tacatcctgg 120
gcctggccat cggcatcacc agcgtgggct acggcatcat cgactacgag acccgggacg 180
tgatcgacgc cggcgtgcgg ctgttcaagg aggccaacgt ggagaacaac gagggccggc 240
ggagcaagcg gggcgcccgg cggctgaagc ggcggcggcg gcaccggatc cagcgggtga 300
agaagctgct gttcgactac aacctgctga ccgaccacag cgagctgagc ggcatcaacc 360
cctacgaggc ccgggtgaag ggcctgagcc agaagctgag cgaggaggag ttcagcgccg 420
ccctgctgca cctggccaag cggcggggcg tgcacaacgt gaacgaggtg gaggaggaca 480
ccggcaacga gctgagcacc aaggagcaga tcagccggaa cagcaaggcc ctggaggaga 540
agtacgtggc cgagctgcag ctggagcggc tgaagaagga cggcgaggtg cggggcagca 600
tcaaccggtt caagaccagc gactacgtga aggaggccaa gcagctgctg aaggtgcaga 660
aggcctacca ccagctggac cagagcttca tcgacaccta catcgacctg ctggagaccc 720
ggcggaccta ctacgagggc cccggcgagg gcagcccctt cggctggaag gacatcaagg 780
agtggtacga gatgctgatg ggccactgca cctacttccc cgaggagctg cggagcgtga 840
agtacgccta caacgccgac ctgtacaacg ccctgaacga cctgaacaac ctggtgatca 900
cccgggacga gaacgagaag ctggagtact acgagaagtt ccagatcatc gagaacgtgt 960
tcaagcagaa gaagaagccc accctgaagc agatcgccaa ggagatcctg gtgaacgagg 1020
aggacatcaa gggctaccgg gtgaccagca ccggcaagcc cgagttcacc aacctgaagg 1080
tgtaccacga catcaaggac atcaccgccc ggaaggagat catcgagaac gccgagctgc 1140
tggaccagat cgccaagatc ctgaccatct accagagcag cgaggacatc caggaggagc 1200
tgaccaacct gaacagcgag ctgacccagg aggagatcga gcagatcagc aacctgaagg 1260
gctacaccgg cacccacaac ctgagcctga aggccatcaa cctgatcctg gacgagctgt 1320
ggcacaccaa cgacaaccag atcgccatct tcaaccggct gaagctggtg cccaagaagg 1380
tggacctgag ccagcagaag gagatcccca ccaccctggt ggacgacttc atcctgagcc 1440
ccgtggtgaa gcggagcttc atccagagca tcaaggtgat caacgccatc atcaagaagt 1500
acggcctgcc caacgacatc atcatcgagc tggcccggga gaagaacagc aaggacgccc 1560
agaagatgat caacgagatg cagaagcgga accggcagac caacgagcgg atcgaggaga 1620
tcatccggac caccggcaag gagaacgcca agtacctgat cgagaagatc aagctgcacg 1680
acatgcagga gggcaagtgc ctgtacagcc tggaggccat ccccctggag gacctgctga 1740
acaacccctt caactacgag gtggacgcca tcatcccccg gagcgtgagc ttcgacaaca 1800
gcttcaacaa caaggtgctg gtgaagcagg aggagaacag caagaagggc aaccggaccc 1860
ccttccagta cctgagcagc agcgacagca agatcagcta cgagaccttc aagaagcaca 1920
tcctgaacct ggccaagggc aagggccgga tcagcaagac caagaaggag tacctgctgg 1980
aggagcggga catcaaccgg ttcagcgtgc agaaggactt catcaaccgg aacctggtgg 2040
acacccggta cgccacccgg ggcctgatga acctgctgcg gagctacttc cgggtgaaca 2100
acctggacgt gaaggtgaaa tccatcaacg gcggcttcac cagcttcctg cggcggaagt 2160
ggaagttcaa gaaggagcgg aacaagggct acaagcacca cgccgaggac gccctgatca 2220
tcgccaacgc cgacttcatc ttcaaggagt ggaagaagct ggacaaggcc aagaaggtga 2280
tggagaacca gatgttcgag gagaagcagg ccgagagcat gcccgagatc gagaccgagc 2340
aggagtacaa ggagatcttc atcacccccc accagatcaa gcacatcaag gacttcaagg 2400
actacaagta cagccaccgg gtggacaaga agcccaaccg gaagctgatc aacgacaccc 2460
tgtacagcac ccggaaggac gacaagggca acaccctgat cgtgaacaac ctgaacggcc 2520
tgtacgacaa ggacaacgac aagctgaaga agctgatcaa caagagcccc gagaagctgc 2580
tgatgtacca ccacgacccc cagacctacc agaagctgaa gctgatcatg gagcagtacg 2640
gcgacgagaa gaaccccctg tacaagtact acgaggagac cggcaactac ctgaccaagt 2700
acagcaagaa ggacaacggc cccgtgatca agaagatcaa gtactacggc aacaagctga 2760
acgcccacct ggacatcacc gacgactacc ccaacagccg gaacaaggtg gtgaagctga 2820
gcctgaagcc ctaccggttc gacgtgtacc tggacaacgg cgtgtacaag ttcgtgaccg 2880
tgaagaacct ggacgtgatc aagaaggaga actactacga ggtgaacagc aagtgctacg 2940
aggaggccaa gaagctgaag aagatcagca accaggccga gttcatcgcc agcttctaca 3000
agaacgacct gatcaagatc aacggcgagc tgtaccgggt gatcggcgtg aacaacgacc 3060
tgctgaaccg gatcgaggtg aacatgatcg acatcaccta ccgggagtac ctggagaaca 3120
tgaacgacaa gcggcccccc cacatcatca agaccatcgc cagcaagacc cagagcatca 3180
agaagtacag caccgacatc ctgggcaacc tgtacgaggt gaaatccaag aagcaccccc 3240
agatcatcaa gaagggcaag cggcccgccg ccaccaagaa ggccggccag gccaagaaga 3300
agaaggcccg ggacagcaag gtggagaaca agaccaagaa gctgcgggtg ttcgaggcct 3360
tcgccggcat cggcgcccag cggaaggccc tggagaaggt gcggaaggac gagtacgaga 3420
tcgtgggcct ggccgagtgg tacgtgcccg ccatcgtgat gtaccaggcc atccacaaca 3480
acttccacac caagctggag tacaagagcg tgagccggga ggagatgatc gactacctgg 3540
agaacaagac cctgagctgg aacagcaaga accccgtgag caacggctac tggaagcgga 3600
agaaggacga cgagctgaag atcatctaca acgccatcaa gctgagcgag aaggagggca 3660
acatcttcga catccgggac ctgtacaagc ggaccctgaa gaacatcgac ctgctgacct 3720
acagcttccc ctgccaggac ctgagccagc agggcatcca gaagggcatg aagcggggca 3780
gcggcacccg gagcggcctg ctgtgggaga tcgagcgggc cctggacagc accgagaaga 3840
acgacctgcc caagtacctg ctgatggaga acgtgggcgc cctgctgcac aagaagaacg 3900
aggaggagct gaaccagtgg aagcagaagc tggagagcct gggctaccag aacagcatcg 3960
aggtgctgaa cgccgccgac ttcggcagca gccaggcccg gcggcgggtg ttcatgatca 4020
gcaccctgaa cgagttcgtg gagctgccca agggcgacaa gaagcccaag agcatcaaga 4080
aggtgctgaa caagatcgtg agcgagaagg acatcctgaa caacctgctg aagtacaacc 4140
tgaccgagtt caagaaaacc aagagcaaca tcaacaaggc cagcctgatc ggctacagca 4200
agttcaacag cgagggctac gtgtacgacc ccgagttcac cggccccacc ctgaccgcca 4260
gcggcgccaa cagccggatc aagatcaagg acggcagcaa catccggaag atgaacagcg 4320
acgagacctt cctgtacatc ggcttcgaca gccaggacgg caagcgggtg aacgagatcg 4380
agttcctgac cgagaaccag aagatcttcg tgtgcggcaa cagcatcagc gtggaggtgc 4440
tggaggccat catcgacaag atcggcggcc ccagcagcgg cggcaagcgg cccgccgcca 4500
ccaagaaggc cggccaggcc aagaagaaga agggcagcta cccctacgac gtgcccgact 4560
acgcctgagc ggccgcttaa ttaagctgcc ttctgcgggg cttgccttct ggccatgccc 4620
ttcttctctc ccttgcacct gtacctcttg gtctttgaat aaagcctgag taggaagtct 4680
agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 4762
<210> 93
<211> 1506
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 93
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser
20 25 30
Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala
35 40 45
Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg
50 55 60
Arg Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg
65 70 75 80
Ile Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp
85 90 95
His Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly
100 105 110
Leu Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His
115 120 125
Leu Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp
130 135 140
Thr Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys
145 150 155 160
Ala Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys
165 170 175
Lys Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp
180 185 190
Tyr Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His
195 200 205
Gln Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr
210 215 220
Arg Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp
225 230 235 240
Lys Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu
260 265 270
Tyr Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu
275 280 285
Asn Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val
290 295 300
Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile
305 310 315 320
Leu Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly
325 330 335
Lys Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile
340 345 350
Thr Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile
355 360 365
Ala Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu
370 375 380
Leu Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile
385 390 395 400
Ser Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala
405 410 415
Ile Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile
420 425 430
Ala Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser
435 440 445
Gln Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser
450 455 460
Pro Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala
465 470 475 480
Ile Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala
485 490 495
Arg Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln
500 505 510
Lys Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr
515 520 525
Thr Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His
530 535 540
Asp Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu
545 550 555 560
Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp Ala Ile Ile
565 570 575
Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val
580 585 590
Lys Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr
595 600 605
Leu Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His
610 615 620
Ile Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys
625 630 635 640
Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys
645 650 655
Asp Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly
660 665 670
Leu Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val
675 680 685
Lys Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys
690 695 700
Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu
705 710 715 720
Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys
725 730 735
Lys Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu
740 745 750
Lys Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys
755 760 765
Glu Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys
770 775 780
Asp Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu
785 790 795 800
Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr
805 810 815
Leu Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys
820 825 830
Leu Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His
835 840 845
His Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr
850 855 860
Gly Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn
865 870 875 880
Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys
885 890 895
Ile Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp
900 905 910
Asp Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro
915 920 925
Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr
930 935 940
Val Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn
945 950 955 960
Ser Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln
965 970 975
Ala Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn
980 985 990
Gly Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg
995 1000 1005
Ile Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu
1010 1015 1020
Asn Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro His Ile Ile Lys Thr Ile Ala
1025 1030 1035
Ser Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly
1040 1045 1050
Asn Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys
1055 1060 1065
Lys Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys
1070 1075 1080
Lys Lys Lys Ala Arg Asp Ser Lys Val Glu Asn Lys Thr Lys Lys
1085 1090 1095
Leu Arg Val Phe Glu Ala Phe Ala Gly Ile Gly Ala Gln Arg Lys
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Lys Val Arg Lys Asp Glu Tyr Glu Ile Val Gly Leu
1115 1120 1125
Ala Glu Trp Tyr Val Pro Ala Ile Val Met Tyr Gln Ala Ile His
1130 1135 1140
Asn Asn Phe His Thr Lys Leu Glu Tyr Lys Ser Val Ser Arg Glu
1145 1150 1155
Glu Met Ile Asp Tyr Leu Glu Asn Lys Thr Leu Ser Trp Asn Ser
1160 1165 1170
Lys Asn Pro Val Ser Asn Gly Tyr Trp Lys Arg Lys Lys Asp Asp
1175 1180 1185
Glu Leu Lys Ile Ile Tyr Asn Ala Ile Lys Leu Ser Glu Lys Glu
1190 1195 1200
Gly Asn Ile Phe Asp Ile Arg Asp Leu Tyr Lys Arg Thr Leu Lys
1205 1210 1215
Asn Ile Asp Leu Leu Thr Tyr Ser Phe Pro Cys Gln Asp Leu Ser
1220 1225 1230
Gln Gln Gly Ile Gln Lys Gly Met Lys Arg Gly Ser Gly Thr Arg
1235 1240 1245
Ser Gly Leu Leu Trp Glu Ile Glu Arg Ala Leu Asp Ser Thr Glu
1250 1255 1260
Lys Asn Asp Leu Pro Lys Tyr Leu Leu Met Glu Asn Val Gly Ala
1265 1270 1275
Leu Leu His Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Asn Gln Trp Lys Gln
1280 1285 1290
Lys Leu Glu Ser Leu Gly Tyr Gln Asn Ser Ile Glu Val Leu Asn
1295 1300 1305
Ala Ala Asp Phe Gly Ser Ser Gln Ala Arg Arg Arg Val Phe Met
1310 1315 1320
Ile Ser Thr Leu Asn Glu Phe Val Glu Leu Pro Lys Gly Asp Lys
1325 1330 1335
Lys Pro Lys Ser Ile Lys Lys Val Leu Asn Lys Ile Val Ser Glu
1340 1345 1350
Lys Asp Ile Leu Asn Asn Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Thr Glu Phe
1355 1360 1365
Lys Lys Thr Lys Ser Asn Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ile Gly Tyr
1370 1375 1380
Ser Lys Phe Asn Ser Glu Gly Tyr Val Tyr Asp Pro Glu Phe Thr
1385 1390 1395
Gly Pro Thr Leu Thr Ala Ser Gly Ala Asn Ser Arg Ile Lys Ile
1400 1405 1410
Lys Asp Gly Ser Asn Ile Arg Lys Met Asn Ser Asp Glu Thr Phe
1415 1420 1425
Leu Tyr Ile Gly Phe Asp Ser Gln Asp Gly Lys Arg Val Asn Glu
1430 1435 1440
Ile Glu Phe Leu Thr Glu Asn Gln Lys Ile Phe Val Cys Gly Asn
1445 1450 1455
Ser Ile Ser Val Glu Val Leu Glu Ala Ile Ile Asp Lys Ile Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Ser Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala
1475 1480 1485
Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1490 1495 1500
Asp Tyr Ala
1505
<210> 94
<211> 7499
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 94
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggtac 420
ctaatacgac tcactataag gaaataagag agaaaagaag agtaagaaga aatataagag 480
ccaccatggc ccccaagaag aagcggaagg tgggcatcca cggcgtgccc gccgccgaca 540
agaagtacag catcggcctg gccatcggca ccaacagcgt gggctgggcc gtgatcaccg 600
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aggagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac cggctggagg 840
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tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgcgg aagaagctgg 960
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agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca 1080
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tggaggaccg gttcaacgcc agcctgggca cctaccacga cctgctgaag atcatcaagg 2340
acaaggactt cctggacaac gaggagaacg aggacatcct ggaggacatc gtgctgaccc 2400
tgaccctgtt cgaggaccgg gagatgatcg aggagcggct gaaaacctac gcccacctgt 2460
tcgacgacaa ggtgatgaag cagctgaagc ggcggcggta caccggctgg ggccggctga 2520
gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagagcgg caagaccatc ctggacttcc 2580
tgaaatccga cggcttcgcc aaccggaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga 2640
ccttcaagga ggacatccag aaggcccagg tgagcggcca gggcgacagc ctgcacgagc 2700
acatcgccaa cctggccggc agccccgcca tcaagaaggg catcctgcag accgtgaagg 2760
tggtggacga gctggtgaag gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaga 2820
tggcccggga gaaccagacc acccagaagg gccagaagaa cagccgggag cggatgaagc 2880
ggatcgagga gggcatcaag gagctgggca gccagatcct gaaggagcac cccgtggaga 2940
acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaacggc cgggacatgt 3000
acgtggacca ggagctggac atcaaccggc tgagcgacta cgacgtggcc gccatcgtgc 3060
cccagagctt cctgaaggac gacagcatcg acaacaaggt gctgacccgg agcgacaagg 3120
cccggggcaa gagcgacaac gtgcccagcg aggaggtggt gaagaagatg aagaactact 3180
ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatca cccagcggaa gttcgacaac ctgaccaagg 3240
ccgagcgggg cggcctgagc gagctggaca aggccggctt catcaagcgg cagctggtgg 3300
agacccggca gatcaccaag cacgtggccc agatcctgga cagccggatg aacaccaagt 3360
acgacgagaa cgacaagctg atccgggagg tgaaggtgat caccctgaaa tccaagctgg 3420
tgagcgactt ccggaaggac ttccagttct acaaggtgcg ggagatcaac aactaccacc 3480
acgcccacga cgcctacctg aacgccgtgg tgggcaccgc cctgatcaag aagtacccca 3540
agctggagag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg 3600
ccaagagcga gcaggagatc ggcaaggcca ccgccaagta cttcttctac agcaacatca 3660
tgaacttctt caagaccgag atcaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcccctga 3720
tcgagaccaa cggcgagacc ggcgagatcg tgtgggacaa gggccgggac ttcgccaccg 3780
tgcggaaggt gctgagcatg ccccaggtga acatcgtgaa gaaaaccgag gtgcagaccg 3840
gcggcttcag caaggagagc atcctgccca agcggaacag cgacaagctg atcgcccgga 3900
agaaggactg ggaccccaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctacagcg 3960
tgctggtggt ggccaaggtg gagaagggca agagcaagaa gctgaaatcc gtgaaggagc 4020
tgctgggcat caccatcatg gagcggagca gcttcgagaa gaaccccatc gacttcctgg 4080
aggccaaggg ctacaaggag gtgaagaagg acctgatcat caagctgccc aagtacagcc 4140
tgttcgagct ggagaacggc cggaagcgga tgctggccag cgccggcgag ctgcagaagg 4200
gcaacgagct ggccctgccc agcaagtacg tgaacttcct gtacctggcc agccactacg 4260
agaagctgaa gggcagcccc gaggacaacg agcagaagca gctgttcgtg gagcagcaca 4320
agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt cagcaagcgg gtgatcctgg 4380
ccgacgccaa cctggacaag gtgctgagcg cctacaacaa gcaccgggac aagcccatcc 4440
gggagcaggc cgagaacatc atccacctgt tcaccctgac caacctgggc gcccccgccg 4500
ccttcaagta cttcgacacc accatcgacc ggaagcggta caccagcacc aaggaggtgc 4560
tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacccgg atcgacctga 4620
gccagctggg cggcgacaag cggcccgccg ccaccaagaa ggccggccag gccaagaaga 4680
agaaggccag cgacgccaag agcctgaccg cctggagccg gaccctggtg accttcaagg 4740
acgtgttcgt ggacttcacc cgggaggagt ggaagctgct ggacaccgcc cagcagatcc 4800
tgtaccggaa cgtgatgctg gagaactaca agaacctggt gagcctgggc taccagctga 4860
ccaagcccga cgtgatcctg cggctggaga agggcgagga gccctggctg gtggagcggg 4920
agatccacca ggagacccac cccgacagcg agaccgcctt cgagatcaag agcagcgtga 4980
gcggcggcaa gcggcccgcc gccaccaaga aggccggcca ggccaagaag aagaagggca 5040
gctaccccta cgacgtgccc gactacgcct gagcggccgc ttaattaagc tgccttctgc 5100
ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc acctgtacct cttggtcttt 5160
gaataaagcc tgagtaggaa gtctagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaattgt cttcttcatc 5280
gcctgcagat cccaatggcg cgccgagctt ggctcgagca tggtcatagc tgtttcctgt 5340
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 5400
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 5460
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 5520
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 5580
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 5640
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 5700
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 5760
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 5820
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 5880
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 5940
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6000
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6060
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6120
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 6180
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6240
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6300
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 6360
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 6420
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 6480
cagttagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 6540
aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 6600
ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 6660
acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 6720
gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagttt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg 6780
ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga 6840
ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 6900
cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg 6960
atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccagggatc gcagtggtga gtaaccatgc 7020
atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca 7080
gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag 7140
aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc 7200
gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg 7260
cggcctagag caagacgttt cccgttgaat atggctcata ctcttccttt ttcaatatta 7320
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 7380
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 7440
aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 7499
<210> 95
<211> 4828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 95
aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60
agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccga caagaagtac agcatcggcc 120
tggccatcgg caccaacagc gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca 180
gcaagaagtt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg 240
gcgccctgct gttcgacagc ggcgagaccg ccgaggccac ccggctgaag cggaccgccc 300
ggcggcggta cacccggcgg aagaaccgga tctgctacct gcaggagatc ttcagcaacg 360
agatggccaa ggtggacgac agcttcttcc accggctgga ggagagcttc ctggtggagg 420
aggacaagaa gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc 480
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ccgacctgcg gctgatctac ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc 600
tgatcgaggg cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg 660
tgcagaccta caaccagctg ttcgaggaga accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca 720
aggccatcct gagcgcccgg ctgagcaaga gccggcggct ggagaacctg atcgcccagc 780
tgcccggcga gaagaagaac ggcctgttcg gcaacctgat cgccctgagc ctgggcctga 840
cccccaactt caagagcaac ttcgacctgg ccgaggacgc caagctgcag ctgagcaagg 900
acacctacga cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc 960
tgttcctggc cgccaagaac ctgagcgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgcgggtga 1020
acaccgagat caccaaggcc cccctgagcg ccagcatgat caagcggtac gacgagcacc 1080
accaggacct gaccctgctg aaggccctgg tgcggcagca gctgcccgag aagtacaagg 1140
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tgctggtgaa gctgaaccgg gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca 1320
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tctacccctt cctgaaggac aaccgggaga agatcgagaa gatcctgacc ttccggatcc 1440
cctactacgt gggccccctg gcccggggca acagccggtt cgcctggatg acccggaaat 1500
ccgaggagac catcaccccc tggaacttcg aggaggtggt ggacaagggc gccagcgccc 1560
agagcttcat cgagcggatg accaacttcg acaagaacct gcccaacgag aaggtgctgc 1620
ccaagcacag cctgctgtac gagtacttca ccgtgtacaa cgagctgacc aaggtgaagt 1680
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tggacctgct gttcaagacc aaccggaagg tgaccgtgaa gcagctgaag gaggactact 1800
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ccagcctggg cacctaccac gacctgctga agatcatcaa ggacaaggac ttcctggaca 1920
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gggagatgat cgaggagcgg ctgaaaacct acgcccacct gttcgacgac aaggtgatga 2040
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gcatccggga caagcagagc ggcaagacca tcctggactt cctgaaatcc gacggcttcg 2160
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gcagccccgc catcaagaag ggcatcctgc agaccgtgaa ggtggtggac gagctggtga 2340
aggtgatggg ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga gatggcccgg gagaaccaga 2400
ccacccagaa gggccagaag aacagccggg agcggatgaa gcggatcgag gagggcatca 2460
aggagctggg cagccagatc ctgaaggagc accccgtgga gaacacccag ctgcagaacg 2520
agaagctgta cctgtactac ctgcagaacg gccgggacat gtacgtggac caggagctgg 2580
acatcaaccg gctgagcgac tacgacgtgg ccgccatcgt gccccagagc ttcctgaagg 2640
acgacagcat cgacaacaag gtgctgaccc ggagcgacaa ggcccggggc aagagcgaca 2700
acgtgcccag cgaggaggtg gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg 2760
ccaagctgat cacccagcgg aagttcgaca acctgaccaa ggccgagcgg ggcggcctga 2820
gcgagctgga caaggccggc ttcatcaagc ggcagctggt ggagacccgg cagatcacca 2880
agcacgtggc ccagatcctg gacagccgga tgaacaccaa gtacgacgag aacgacaagc 2940
tgatccggga ggtgaaggtg atcaccctga aatccaagct ggtgagcgac ttccggaagg 3000
acttccagtt ctacaaggtg cgggagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc 3060
tgaacgccgt ggtgggcacc gccctgatca agaagtaccc caagctggag agcgagttcg 3120
tgtacggcga ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaga 3180
tcggcaaggc caccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttc ttcaagaccg 3240
agatcaccct ggccaacggc gagatccgga agcggcccct gatcgagacc aacggcgaga 3300
ccggcgagat cgtgtgggac aagggccggg acttcgccac cgtgcggaag gtgctgagca 3360
tgccccaggt gaacatcgtg aagaaaaccg aggtgcagac cggcggcttc agcaaggaga 3420
gcatcctgcc caagcggaac agcgacaagc tgatcgcccg gaagaaggac tgggacccca 3480
agaagtacgg cggcttcgac agccccaccg tggcctacag cgtgctggtg gtggccaagg 3540
tggagaaggg caagagcaag aagctgaaat ccgtgaagga gctgctgggc atcaccatca 3600
tggagcggag cagcttcgag aagaacccca tcgacttcct ggaggccaag ggctacaagg 3660
aggtgaagaa ggacctgatc atcaagctgc ccaagtacag cctgttcgag ctggagaacg 3720
gccggaagcg gatgctggcc agcgccggcg agctgcagaa gggcaacgag ctggccctgc 3780
ccagcaagta cgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta cgagaagctg aagggcagcc 3840
ccgaggacaa cgagcagaag cagctgttcg tggagcagca caagcactac ctggacgaga 3900
tcatcgagca gatcagcgag ttcagcaagc gggtgatcct ggccgacgcc aacctggaca 3960
aggtgctgag cgcctacaac aagcaccggg acaagcccat ccgggagcag gccgagaaca 4020
tcatccacct gttcaccctg accaacctgg gcgcccccgc cgccttcaag tacttcgaca 4080
ccaccatcga ccggaagcgg tacaccagca ccaaggaggt gctggacgcc accctgatcc 4140
accagagcat caccggcctg tacgagaccc ggatcgacct gagccagctg ggcggcgaca 4200
agcggcccgc cgccaccaag aaggccggcc aggccaagaa gaagaaggcc agcgacgcca 4260
agagcctgac cgcctggagc cggaccctgg tgaccttcaa ggacgtgttc gtggacttca 4320
cccgggagga gtggaagctg ctggacaccg cccagcagat cctgtaccgg aacgtgatgc 4380
tggagaacta caagaacctg gtgagcctgg gctaccagct gaccaagccc gacgtgatcc 4440
tgcggctgga gaagggcgag gagccctggc tggtggagcg ggagatccac caggagaccc 4500
accccgacag cgagaccgcc ttcgagatca agagcagcgt gagcggcggc aagcggcccg 4560
ccgccaccaa gaaggccggc caggccaaga agaagaaggg cagctacccc tacgacgtgc 4620
ccgactacgc ctgagcggcc gcttaattaa gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc 4680
atgcccttct tctctccctt gcacctgtac ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg 4740
aagtctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4828
<210> 96
<211> 1528
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 96
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
20 25 30
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
35 40 45
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
65 70 75 80
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
100 105 110
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
115 120 125
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
130 135 140
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
145 150 155 160
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
165 170 175
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
180 185 190
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
195 200 205
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
210 215 220
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
245 250 255
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
260 265 270
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
275 280 285
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
290 295 300
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
305 310 315 320
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
325 330 335
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
355 360 365
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
370 375 380
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
385 390 395 400
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
405 410 415
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
420 425 430
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
435 440 445
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
450 455 460
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
465 470 475 480
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
485 490 495
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
500 505 510
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
515 520 525
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
530 535 540
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
545 550 555 560
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
565 570 575
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
580 585 590
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
595 600 605
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
610 615 620
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
625 630 635 640
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
645 650 655
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
660 665 670
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
675 680 685
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
690 695 700
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
705 710 715 720
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
725 730 735
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
740 745 750
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
755 760 765
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
770 775 780
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
785 790 795 800
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
805 810 815
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
820 825 830
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
835 840 845
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Ala Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
850 855 860
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg
865 870 875 880
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
885 890 895
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
900 905 910
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
915 920 925
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
930 935 940
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
945 950 955 960
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
965 970 975
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
980 985 990
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
995 1000 1005
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu
1010 1015 1020
Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile
1025 1030 1035
Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe
1040 1045 1050
Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu
1055 1060 1065
Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly
1070 1075 1080
Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr
1085 1090 1095
Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys
1100 1105 1110
Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro
1115 1120 1125
Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp
1130 1135 1140
Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser
1145 1150 1155
Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu
1160 1165 1170
Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser
1175 1180 1185
Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr
1190 1195 1200
Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala
1220 1225 1230
Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1235 1240 1245
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
1250 1255 1260
Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His
1265 1270 1275
Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser
1280 1285 1290
Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser
1295 1300 1305
Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu
1310 1315 1320
Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala
1325 1330 1335
Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr
1340 1345 1350
Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1355 1360 1365
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly
1370 1375 1380
Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys
1385 1390 1395
Lys Lys Ala Ser Asp Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr
1400 1405 1410
Leu Val Thr Phe Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu
1415 1420 1425
Trp Lys Leu Leu Asp Thr Ala Gln Gln Ile Leu Tyr Arg Asn Val
1430 1435 1440
Met Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu
1445 1450 1455
Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro
1460 1465 1470
Trp Leu Val Glu Arg Glu Ile His Gln Glu Thr His Pro Asp Ser
1475 1480 1485
Glu Thr Ala Phe Glu Ile Lys Ser Ser Val Ser Gly Gly Lys Arg
1490 1495 1500
Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly
1505 1510 1515
Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1520 1525
<210> 97
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 97
atgattggat tta 13
<210> 98
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 100
atgattcgat tta 13
Claims (42)
- 발현 억제 시스템으로서,
제1 DNA-표적화 모이어티(DNA-targeting moiety) 및 제1 리프레서 도메인(repressor domain)을 포함하는 제1 발현 리프레서(expression repressor), 및
제2 DNA-표적화 모이어티 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서
를 포함하며,
제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열과 상이한 제2 DNA 서열에 특이적으로 결합하고,
제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 상이한, 발현 억제 시스템. - 발현 억제 시스템으로서,
제1 DNA-표적화 모이어티 및 제1 리프레서 도메인을 포함하는 제1 발현 리프레서, 및
제2 DNA-표적화 모이어티 및 제2 리프레서 도메인을 포함하는 제2 발현 리프레서
를 포함하며,
제1 또는 제2 리프레서 도메인은 MQ1 도메인 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하고,
제1 리프레서 도메인은 제2 리프레서 도메인과 상이한, 발현 억제 시스템. - 제2항에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열과 상이한 제2 DNA 서열에 특이적으로 결합하거나;
제1 DNA-표적화 모이어티와 제2 DNA-표적화 모이어티는 동일한 DNA 서열에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는 제1 CRISPR/Cas 단백질 및 제1 가이드 RNA를 포함하는 제1 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제2 CRISPR/Cas 단백질 및 제2 가이드 RNA를 포함하는 제2 CRISPR/Cas 분자를 포함하는, 발현 억제 시스템. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 CRISPR/Cas 단백질은 제2 CRISPR/Cas 단백질과 상이한 아미노산 서열을 포함하는, 발현 억제 시스템. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는 제1 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 표 1로부터 선택되는 상이한 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)를 포함하는 제2 CRISPR/Cas 분자를 포함하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 리프레서 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성(예를 들어, SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 이들 중 임의의 것의 SET 도메인으로부터 선택되는 단백질), 히스톤 데메틸라제 활성(예를 들어, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질), 히스톤 데아세틸라제 활성(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질), DNA 메틸트랜스퍼라제 활성(예를 들어, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질), 또는 전사 리프레서 활성(예를 들어, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질)을 포함하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하고,
제2 리프레서 도메인은 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 상이한 단백질을 포함하는, 발현 억제 시스템. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A)를 포함하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리프레서 도메인은 KRAB를 포함하고, 제2 리프레서 도메인은 박테리아 MQ1을 포함하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는, CRISPR/Cas 단백질(예를 들어, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 것) 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 DNA-표적화 모이어티는, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 CRISPR/Cas 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하고,
제2 DNA-표적화 모이어티는, 표 1로부터 선택되는 Cas 단백질 또는 Cpf1 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이거나 이를 포함하는 상이한 CRISPR/Cas 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는, 발현 억제 시스템. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 DNA-표적화 모이어티는,
프로모터 서열, 또는 프로모터 서열에 근접한 DNA, 예를 들어 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열;
인핸서 서열, 또는 인핸서 서열에 근접한 DNA, 예를 들어 표적 유전자의 발현에 영향을 주고/주거나 그것에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열;
표적 유전자, 예를 들어 표적 유전자의 전사 개시 부위와 정지 코돈 사이에 포함된 서열;
표적 유전자의 전사 개시 부위;
표적 유전자의 인트론, 예를 들어 인트론과 연관된 스플라이스 부위; 또는
표적 유전자의 엑손
에 특이적으로 결합하는, 발현 억제 시스템. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접한 제1 부위이고, 제2 DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 내에 있거나 그것에 근접한 제2 부위인, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열 사이의 거리는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개의 염기쌍 또는 이들 사이의 임의의 크기, 예를 들어 20 내지 500개의 염기쌍인, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열 사이의 거리는 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개 이하의 염기쌍 또는 이들 사이의 임의의 크기, 예를 들어 20 내지 500개의 염기쌍인, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자는 β-2-마이크로글로불린, MYC, HSPA1B, GATA1, APOB, FOXP3, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL6, CXCL7, 및/또는 CXCL8인, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-표적화 모이어티는 제2 DNA 서열에 별로 결합되지 않고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 별로 결합하지 않으며, 예를 들어 제1 DNA-표적화 모이어티는 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 100,000 nM의 KD로 제2 DNA 서열에 결합하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 100,000 nM의 KD로 제1 DNA 서열에 결합하는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및/또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은 세포 내의 표적 유전자, 예를 들어 제1 및/또는 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을, 예를 들어 제1 및/또는 제2 발현 리프레서의 부재 하에서의 발현 대비 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소시키는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 DNA 서열에 대한 제1 및/또는 제2 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자, 예를 들어 제1 및/또는 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 상당히 감소시키는, 발현 억제 시스템.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 발현은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 및 제2 발현 리프레서의 부재 하에서의 발현 대비 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되는, 발현 억제 시스템.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은 표적 유전자, 예를 들어 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 발현을, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 상당히 감소시키는, 발현 억제 시스템.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 발생되는 발현의 감소는 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 개별적으로 발생되는 발현의 감소보다 더 큰, 발현 억제 시스템.
- 제25항에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합 중 어느 하나의 개별적인 결합보다 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.6×, 1.7×, 1.8×, 1.9×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 50×, 또는 100× 더 크게 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 발생되는 발현의 감소는 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합으로부터 개별적으로 발생되는 발현의 감소보다 더 긴 시간 동안(예를 들어, 더 많은 시간, 일 수, 또는 세포 분열 횟수) 지속되는, 발현 억제 시스템.
- 제27항에 있어서, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 및 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합은, 예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 제1 DNA 서열에 대한 제1 발현 리프레서의 결합 또는 제2 DNA 서열에 대한 제2 발현 리프레서의 결합 중 어느 하나의 개별적인 결합보다 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.6×, 1.7×, 1.8×, 1.9×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 50×, 또는 100× 더 길게(예를 들어, 시간, 일 수, 또는 세포 분열 횟수로 측정될 때) 발현을 감소시키는, 발현 억제 시스템.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 발현 리프레서는 표 1로부터 선택되는 S. 피오게네스(S. pyogenes) CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 제1 DNA-표적화 모이어티, 및 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 제1 리프레서 도메인을 포함하고;
제2 발현 리프레서는 표 1로부터 선택되는 S. 아우레우스(S. aureus) CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이체), 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 제2 DNA-표적화 모이어티, 및 박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 제2 리프레서 도메인을 포함하는, 발현 억제 시스템. - 폴리펩티드로서,
DNA-표적화 모이어티; 및
박테리아 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 리프레서 도메인
을 포함하는, 폴리펩티드. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의
제1 발현 리프레서,
제2 발현 리프레서,
발현 억제 시스템(예를 들어, 제1 발현 리프레서 및 제2 발현 리프레서), 또는 폴리펩티드
를 인코딩하는 핵산. - 제31항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 또는 벡터, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 세포 내의 표적 게놈 서열의 발현을 감소시키는 방법으로서,
제1항 내지 제32항 또는 제34항 중 어느 한 항의 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 약제학적 조성물, 또는 벡터를 제공하는 단계; 및
세포를 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 약제학적 조성물, 또는 벡터와 접촉시키는 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 표적 게놈 서열의 발현을 감소시키는, 방법. - 세포 내의 표적 게놈 서열을 후성유전학적으로 변형시키는 방법으로서,
제1항 내지 제32항 또는 제34항 중 어느 한 항의 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 약제학적 조성물, 또는 벡터를 제공하는 단계; 및
세포를 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 폴리펩티드, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 표적 게놈 서열을 후성유전학적으로 변형시키는, 방법. - 제35항 또는 제36항에 있어서, 표적 게놈 서열은
표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 부위, 예를 들어 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 예를 들어 β-2-마이크로글로불린(β2M)을 인코딩하는 유전자,
표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는
표적 유전자에 근접하거나, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열
인, 방법. - 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 발현은,
발현 억제 시스템의 부재 하에서의 달리 유사한 세포에서의 발현 대비 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%만큼 감소되고/되거나;
예를 들어 ELISA에 의해 또는 실시예 2 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 세포 분열의 기간 동안 감소되는, 방법. - 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 발현의 감소는
표적 유전자에 의해 인코딩되는 RNA, 예를 들어 mRNA의 수준; 및/또는
표적 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 수준
의 감소를 포함하는, 방법. - 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제공하는 단계는
세포를 표적 유전자를 포함하는 세포에 대한 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터와 접촉시키는 단계; 또는
세포를 발현 억제 시스템, 또는 발현 억제 시스템을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터를 포함하는 지질 나노입자(LNP)와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 대상체에서 표적 유전자의 과발현(over-expression) 또는 오조절(mis-regulation)과 연관된 병태를 치료하는 방법으로서,
제1항 내지 제32항 또는 제34항 중 어느 한 항의 발현 억제 시스템, 핵산, 폴리펩티드, 약제학적 조성물, 또는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하며,
상기 단계에 의해 대상체에서 표적 유전자의 과발현과 연관된 병태를 치료하는, 방법. - 발현 억제 시스템을 포함하는 세포를 제조하는 방법으로서,
제1항 내지 제29항, 제31항, 제32항 또는 제34항 중 어느 한 항의 발현 억제 시스템, 핵산, 약제학적 조성물, 또는 벡터를 제공하는 단계; 및
세포를 발현 억제 시스템, 핵산, 벡터, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
상기 단계들에 의해 발현 억제 시스템을 포함하는 세포를 제조하는, 방법.
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