CN116829175A

CN116829175A - 用于调节myc表达的组合物和方法

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Publication number: CN116829175A
Application number: CN202180093730.9A
Authority: CN
Inventors: A·E·维特; J·D·法雷利; A·W·谢德格; W·T·小塞纳佩迪斯; J·M·肯尼迪; H·贝拉格扎尔; D·亚拉尔; E·李
Original assignee: Flagship Pioneering Innovations V Inc
Current assignee: Flagship Pioneering Innovations V Inc
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-09-29

Abstract

本披露涉及用于降低细胞中MYC基因表达的组合物和方法。在一些实施例中，表达阻遏物包含结合MYC启动子、锚序列或超级增强子的靶向部分。在一些实施例中，该表达阻遏物包含阻遏转录或使DNA甲基化的效应子部分。还披露了包含两个表达阻遏物的系统。这些组合物可用于例如治疗癌症，例如HCC或NSCLC。

Description

用于调节MYC表达的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下的优先权：2020年12月15日提交的美国临时申请63/125,833，2021年1月13日提交的美国临时申请63/137,097，2021年6月21日提交的美国临时申请63/212,991以及于2021年11月18日提交的美国临时申请63/281,022，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过援引以其全文并入本文。于2021年12月6日创建的所述ASCII副本命名为O2057-7029WO_SL.txt且大小为624,274字节。

背景技术

基因表达的错误调节是许多疾病(例如，哺乳动物，例如人)的根本原因，例如肿瘤、神经系统疾病、代谢障碍和肥胖症。转录因子MYC的错误调节在多种人肿瘤和慢性肝病中发挥着核心作用。由于多种因素，例如缺乏明确的配体结合位点、缺乏维持正常组织所必需的生理功能等，MYC蛋白被认为是“不可成药的”。调节MYC基因表达的技术为治疗这些疾病提供了一种可行的替代方法。需要新的工具、系统和方法来稳定地改变(例如，减少)疾病相关基因(例如MYC)的表达。

发明内容

本披露尤其提供可用于调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)表达的表达阻遏物和表达阻遏物系统。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含结合靶基因启动子(例如，MYC启动子)的靶向部分，和任选的效应子部分，其中表达阻遏物能够降低靶基因(例如，MYC)的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合靶基因基因座(例如MYC)的靶向部分，以及包含MQ1或其片段或变体的效应子部分，其中表达阻遏物能够降低靶基因(例如MYC)的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合位于MYC的超级增强子区域中的调节元件的靶向部分，和任选的效应子部分，其中表达阻遏物能够降低MYC的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合位于靶基因(例如，MYC)的超级增强子区域中的调节元件的靶向部分，和效应子部分(例如，KRAB或MQ1，或其片段或变体)，其中表达阻遏物能够降低靶基因(例如，MYC)的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合位于靶基因(例如，MYC)的超级增强子区域中的调节元件的靶向部分，其中靶向部分包含锌指结构域，其中表达阻遏物能够降低靶基因(例如，MYC)的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合位于MYC的超级增强子区域中的调节元件的靶向部分以及效应子部分，其中靶向部分包含锌指结构域或TAL效应子结构域，其中效应子部分包含转录阻遏物(例如，KRAB或其片段或变体)或DNA甲基转移酶(例如，MQ1或其片段或变体)；其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合靶基因基因座(例如MYC)的靶向部分，其中靶向部分包含锌指结构域，其中表达阻遏物能够降低靶基因(例如MYC)的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合基因组基因座的靶向部分，该基因组基因座包含SEQ ID NO:1、3、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、109、110、或75、76、78、79、80、81、84、85、86的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，其中表达阻遏物能够降低MYC的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：结合基因组基因座的靶向部分，该基因组基因座包含SEQ ID NO:2或77、82、83的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸，并且其中表达阻遏物能够降低靶基因(例如，MYC)的表达。在一些实施例中，表达阻遏物包含效应子部分。

在一些方面，本披露提供了包含靶向部分的表达阻遏物，其中靶向部分结合位于SEQ ID NO:4上游或下游1400nt内的基因组基因座。

在一些方面，本披露提供了包含靶向部分的表达阻遏物，其中靶向部分结合包含SEQ ID NO:4、77、82或83的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

在一些方面，本披露提供了包含靶向部分的表达阻遏物，其中靶向部分结合包含SEQ ID NO:83、96或108的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

在一些方面，本披露提供了包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的系统，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分，其中该第一表达阻遏物与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))或转录调节元件近侧的序列结合，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分，其中该第二表达阻遏物结合包含靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列。

在一些方面，本披露提供了包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的系统，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分，其中该第一表达阻遏物与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))或转录调节元件近侧的序列结合，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分，其中该第二表达阻遏物结合位于靶基因(例如MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座。

在一些实施例中，第一靶向部分特异性结合第一DNA序列，并且第二靶向部分特异性结合不同于第一DNA序列的第二DNA序列。在一些实施例中，第一效应子部分不同于第二效应子部分。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：包含CRISPR/Cas分子(例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白)的靶向部分，该靶向部分结合可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))，或所述转录调节元件近侧的序列；和包含MQ1或其功能变体或片段的效应子部分。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：包含CRISPR/Cas分子(例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白)的靶向部分以及效应子部分，该靶向部分结合至位于靶基因(例如，MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座，该效应子部分包含KRAB、MQ1或其功能变体或片段，其中该表达阻遏物能够降低靶基因(例如，MYC)的表达。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：包含CRISPR/Cas分子(例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白)的靶向部分，该靶向部分结合包含靶基因(例如，MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列；和包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：包含锌指分子的靶向部分，该靶向部分结合可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))，或所述转录调节元件近侧的序列；和包含MQ1或其功能变体或片段的效应子部分。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：包含锌指分子的靶向部分，该靶向部分结合包含靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列；和包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分。

在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：包含锌指分子的靶向部分和包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分，该靶向部分结合位于靶基因(例如，MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座。

在一些方面，本披露涉及编码第一表达阻遏物、第二表达阻遏物、两者或其组分(例如，gRNA，mRNA)的核酸。在一些实施例中，编码表达阻遏物系统的核酸是多顺反子序列。在一些实施例中，多顺反子序列是双顺反子序列。

在一些方面，本披露涉及包含本文描述的核酸、系统或表达阻遏物的载体。在另一方面，本披露涉及包含本文所述的载体、核酸、系统或表达阻遏物的脂质纳米颗粒。在另一方面，本披露涉及包含本文所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体或脂质纳米颗粒的反应混合物。在另一方面，本披露涉及包含本文所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或反应混合物的药物组合物。

在一些方面，本披露涉及降低靶基因的表达的方法，该方法包括提供本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统，并使该靶基因和/或一个或多个可操作地连接的转录控制元件与该表达阻遏物或该表达阻遏系统接触，从而降低该靶基因的表达。

在一些方面，本披露涉及治疗与受试者中靶基因(例如MYC)的过表达相关的病症的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的表达阻遏物或系统、核酸或载体，从而治疗该病症。

在一些方面，本披露涉及治疗受试者中与靶基因(例如MYC)的错误调控相关的病症的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的表达阻遏物、系统、核酸或载体，从而治疗该病症。

在一些方面，本披露提供了一种降低细胞中靶基因(例如，MYC)的表达的方法，该方法包括：使该细胞与系统接触从而降低该细胞中该靶基因(例如MYC)的表达，该系统包含：第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分，其中该第一表达阻遏物与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))结合，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分，其中该第二表达阻遏物结合包含靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列。

在一些方面，本披露提供了一种降低细胞中靶基因(例如，MYC)的表达的方法，该方法包括：使该细胞与系统接触从而降低该细胞中该靶基因(例如MYC)的表达，该系统包含：第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分，其中该第一表达阻遏物与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))结合，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分，其中该第二表达阻遏物结合位于靶基因(例如MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座。

本披露进一步部分地提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：a)容器，该容器包含组合物，该组合物包含表达阻遏物，该表达阻遏物包含与靶基因(例如，MYC)启动子结合的靶向部分和能够调节例如降低靶基因(例如，MYC)的表达的效应子部分，和b)一组说明书，其包含用于用所述组合物调节细胞内靶基因(例如，MYC)的表达的至少一种方法。

本披露进一步部分地提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：a)容器，该容器包含组合物，该组合物包含表达阻遏物，该表达阻遏物包含与位于靶基因(例如，MYC)的超级增强子区域中的基因座结合的靶向部分和能够调节例如降低靶基因(例如，MYC)的表达的效应子部分，和b)一组说明书，其包含用于用所述组合物调节细胞内靶基因(例如，MYC)的表达的至少一种方法。

在一些方面，试剂盒包含a)容器，该容器包含组合物，该组合物包含含有两个表达阻遏物的系统，该两个表达阻遏物包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分，其中该第一表达阻遏物与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))或转录调节元件近侧的序列结合，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分，其中该第二表达阻遏物结合包含靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列。

在一些方面，试剂盒包含a)容器，该容器包含组合物，该组合物包含含有两个表达阻遏物的系统，该两个表达阻遏物包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分，其中该第一表达阻遏物与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))或转录调节元件近侧的序列结合，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分，其中该第二表达阻遏物结合位于靶基因(例如MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座。

在一些实施例中，该试剂盒进一步包括b)一套说明书，其包括至少一种用所述组合物治疗疾病或调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)在细胞内的表达的方法。在一些实施例中，试剂盒可以任选地包括用于所述组合物的递送媒剂(例如，脂质纳米颗粒)。试剂可以悬浮在赋形剂和/或递送媒剂中提供，或者可以作为单独的组分提供，该单独的组分随后可以与赋形剂和/或递送媒剂组合。在一些实施例中，试剂盒可以任选地包含另外的治疗剂以与组合物共同以影响期望的靶基因表达，例如MYC基因表达调节。虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。任何能够存储此类说明并将它们传送给最终用户的介质都在本发明考虑之列。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可能包括提供此类说明材料的互联网站点的地址。

任何前述方法或组合物的附加特征包括以下列举的实施例中的一个或多个。

本领域技术人员将会认识到，或者仅使用常规实验就能够确定本文所述本披露的具体实施例的许多等同形式。这样的等同形式意在由以下列举的实施例所涵盖。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文而结合。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用而结合。除非另外指明，否则本文指定的序列登录号(包括本文任一表中)是指截至2020年12月15日的数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。

列举的实施例

1.一种表达阻遏物，其包含：

结合MYC启动子的靶向部分，以及

任选地，效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

2.如实施例1所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合位于SEQ ID NO:4、199或201上游或下游1400、1200、1000、800、600、400或200nt内的基因组基因座。

3.如实施例1中所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合包含SEQ ID NO:4、77、82、83、85、199或201的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

4.一种表达阻遏物，其包含：

结合基因组基因座的靶向部分，该基因组基因座包含SEQ ID NO:3、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、109、110、75、76、78、79、80、81、84、85、86、190、191、192、200、或202的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸以及

任选地，效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

5.一种表达阻遏物，其包含：

结合包含SEQ ID NO:2、77、82、83、199或201的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分，以及

任选地，效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

6.一种表达阻遏物，其包含：

结合MYC基因座的靶向部分，以及

包含MQ1或其片段或变体的效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

7.一种表达阻遏物，其包含：

结合MYC超级增强子区域中的基因座的靶向部分，

任选地效应子部分，例如包含DNA甲基转移酶的效应子部分，其中任选地该效应子部分包含MQ1或其片段或变体，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

8.一种表达阻遏物，其包含：

结合MYC超级增强子区域中的基因座的靶向部分，

包含转录阻遏物的效应子部分，其中任选地，该效应子部分包含KRAB或其片段或变体，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

9.如实施例7或8中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合包含SEQ IDNO:96-110、83、199、201中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

10.如实施例7-9中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合包含GRCh37:chr8:129162465-129212140的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座，使用hg19参考基因组。

11.如实施例7-10中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合包含SEQ IDNO:96或108的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

12.如实施例7-11中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含锌指结构域或TAL效应子结构域。

13.一种表达阻遏物，其包含：

结合基因座(例如，MYC基因座)的靶向部分，

包含EZH2或其片段或变体的第一效应子部分，以及

包含KRAB或其片段或变体的第二效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低该基因座处的表达，例如降低MYC的表达。

14.如实施例13所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合MYC启动子、超级增强子区或锚序列。

15.如实施例13或14所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含TAL效应子结构域、CRISPR/Cas结构域或锌指结构域。

16.如实施例13-15中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一效应子部分是第二效应子的N末端，或其中该第一效应子是第二效应子部分的C末端。

17.一种表达阻遏物，其包含：

结合MYC基因座的靶向部分，其中该靶向部分包含锌指结构域，以及

任选地，效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

18.一种表达阻遏物，其包含：

包含CRISPR/Cas结构域(例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白)的靶向部分，该靶向部分结合可操作地连接至MYC基因的转录调节元件(例如启动子、增强子、超级增强子或转录起始位点(TSS))，或所述转录调节元件近侧的序列；以及

包含MQ1或其功能变体或片段的效应子部分。

19.一种表达阻遏物，其包含：

包含CRISPR/Cas结构域(例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白)的靶向部分，该靶向部分结合可操作地连接至MYC基因的转录调节元件(例如启动子、增强子或转录起始位点(TSS))，或所述转录调节元件近侧的序列；以及

包含MQ1或其功能变体或片段的效应子部分。

20.一种表达阻遏物，其包含：

包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分。

21.一种表达阻遏物，其包含：

包含CRISPR/Cas结构域(例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白)的靶向部分，该靶向部分结合包含MYC基因的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列；以及

包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分。

22.一种表达阻遏物，其包含：

包含锌指结构域的靶向部分，该靶向部分结合可操作地连接至MYC基因的转录调节元件(例如启动子、增强子或转录起始位点(TSS))，或所述转录调节元件近侧的序列；以及

包含MQ1或其功能变体或片段的效应子部分。

23.一种表达阻遏物，其包含：

包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分。

24.一种表达阻遏物，其包含：

结合小鼠基因组基因座的靶向部分，该靶向部分包含SEQ ID NO:190-192中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，以及

任选地，效应子部分，

其中该表达阻遏物能够降低MYC的表达。

25.如权利要求24所述的表达阻遏物，其中该效应子部分包含DNA甲基转移酶，例如MQ1或其片段或变体。

26.如实施例24或25所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含TAL效应子结构域、CRISPR/Cas结构域、锌指结构域、tetR结构域、大核酸酶结构域或寡核苷酸。

27.如实施例24-26中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含锌指结构域或TAL效应子结构域。

28.如实施例24-27中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物包含选自SEQID NO:160-165中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

29.如实施例24-28中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物由选自SEQ IDNO:166-168中任一个的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

30.如实施例24-29中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含根据SEQ IDNO:154-156中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

31.如实施例24-30中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含根据SEQ IDNO:157-159中任一个的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

32.如实施例24-31中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分是持久效应子部分。

33.如实施例24-32中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分是瞬时效应子部分。

34.如实施例24-33中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物是融合分子。

35.如实施例24-34中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含锌指结构域，并且该效应子部分包含表观遗传修饰部分，例如DNA甲基转移酶，例如MQ1或其片段或变体。

36.如实施例18-20、22或23中任一项所述的表达阻遏物，其中该调节元件是调节元件簇的一部分。

37.如实施例18-20、22或23中任一项所述的表达阻遏物，其中该调节元件位于非编码区。

38.如实施例18-20、22或23中任一项所述的表达阻遏物，其中该调节元件是远端增强子，例如位于距靶基因(例如，MYC)启动子至少1,000nt处。

39.如实施例18-20、22、23或36-38中任一项所述的表达阻遏物，其中该调节元件增加靶基因(例如，MYC)的表达。

40.如实施例18-20、22、23或36-39中任一项所述的表达阻遏物，其中该调节元件包含一个或多个突变。

41.如实施例18-20、22、23或36-40中任一项所述的表达阻遏物，其中该调节元件包含至少一个疾病相关单核苷酸多态性(SNP)。

42.如实施例18-20、22、23或36-41中任一项所述的表达阻遏物，其中该转录调节元件通过增强子对接位点与靶基因(例如，MYC)的启动子相互作用。

43.如实施例42所述的表达阻遏物，其中该增强子对接位点包含根据SEQ ID NO:71-74中任一个的核苷酸序列。

44.一种表达阻遏物，其包含：

包含锌指结构域的靶向部分，该靶向部分结合包含MYC基因的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合锚序列近侧的序列；以及

包含KRAB或其功能变体或片段的效应子部分。

45.如实施例1-23或36-43中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物包含选自SEQ ID NO:22-37、129、133、134、139-149或177-186中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

46.如实施例1-23或36-45中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物由选自SEQ ID NO:55-70、130、189或193-197中任一个的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

47.如实施例1-23或36-46中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含根据SEQ ID NO:5-16或169-172中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

48.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分包含根据SEQID NO:18、19或87的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列

49.如实施例1-12、17-19、22、36-42或44-47中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分是持久效应子部分。

50.如实施例1-23或36-48中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分是瞬时效应子部分。

51.如实施例1-12、17-19、22、36-42或44-48中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分包含DNA甲基转移酶，例如MQ1或其片段或变体。

52.如实施例1-23、36-47或49中任一项所述的表达阻遏物，其中该效应子部分包含转录阻遏物，例如包含KRAB或其片段或变体。

53.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含TAL效应子结构域、CRISPR/Cas结构域、锌指结构域、tetR结构域、大核酸酶结构域或寡核苷酸。

54.如实施例53所述的表达阻遏物，其中该CRISPR/Cas结构域结合gRNA，例如，与包含SEQ ID NO:1-4中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座结合的gRNA，例如，其中该gRNA包含的序列包含SEQ ID NO:1-4中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

55.如实施例53所述的表达阻遏物，其中该CRISPR/Cas结构域结合gRNA，例如，与包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座结合的gRNA，例如，其中该gRNA包含的序列包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

56.如实施例53-55中任一项所述的表达阻遏物，其中该CRISPR/Cas结构域包含选自表1的Cas蛋白或Cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)。

57.如实施例53-56中任一项所述的表达阻遏物，其中该CRISPR/Cas结构域包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白，例如dCas9。

58.如实施例53所述的表达阻遏物，其中该锌指结构域结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座，例如，其中该gRNA包含的序列包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

59.如实施例17、22、26-53或57中任一项所述的表达阻遏物，其中该锌指结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个锌指(并且任选地不超过11、10、9、8、7、6或5个锌指)。

60.如实施例17、22、26-53、57或58中任一项所述的表达阻遏物，其中该锌指结构域包含1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10个锌指。

61.如实施例17、22、26-53或57-59中任一项所述的表达阻遏物，其中该锌指结构域包含3个或9个锌指。

62.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其包含融合分子。

63.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其包含位于该靶向结构域和该效应子结构域之间的接头，任选地其中该接头包含根据SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列。

64.如实施例1-17、20、21、23、44-48、50或52-57中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含无催化活性的CRISPR/Cas结构域(例如，dCas9)并且该效应子部分包含转录阻遏物，例如KRAB或其片段或变体。

65.如实施例1-17、20、21、23、44-48、50、52或53-64中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含锌指结构域，并且该效应子部分包含转录阻遏物，例如KRAB或其片段或变体。

66.如实施例17、36-43、45-47、53或58-63中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含锌指结构域，并且该表达阻遏物不包含效应子部分。

67.如实施例1-12、18-19、22、36-43、45-49、51或53-57中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含无催化活性的CRISPR/Cas结构域(例如，dCas9)并且该效应子部分包含表观遗传修饰部分，例如DNA甲基转移酶，例如MQ1或其片段或变体。

68.如实施例1-12、17-19、22、36-43、45-49、51、53或58-63中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分包含锌指结构域，并且该效应子部分包含表观遗传修饰部分，例如DNA甲基转移酶，例如MQ1或其片段或变体。

69.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，该表达阻遏物包含SEQ ID NO:22-37、129、133、134、139-149或177-186中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。

70.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其：(i)包含一个或多个核定位信号序列(NLS)，或(ii)不包含NLS。

71.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其在N末端包含第一NLS，例如，其中该第一NLS具有SEQ ID NO:88的序列。

72.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其在C末端包含NLS，例如第二NLS，例如具有SEQ ID NO:89的序列。

73.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一和该第二NLS具有相同序列。

74.如实施例71-73中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一和该第二NLS具有不同序列。

75.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其包含表位标签。

76.如实施例75所述的表达阻遏物，其中该表位标签是HA标签。

77.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列包含SEQ ID NO:71或72的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

78.如实施例1-77中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列包含根据SEQ IDNO:73或74的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

79.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列与该MYC基因位于同一染色体上。

80.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列在该MYC基因的上游(例如，TSS上游或启动子上游)。

81.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列距离该MYC基因(例如，距离MYC基因的TSS或启动子)至少1、5、10、50、100或1000千碱基。

82.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列距离该MYC基因(例如，距离MYC基因的TSS或启动子)0.1-0.5、0.1-1、0.1-5、0.1-10、0.1-50、0.1-100、0.1-500、0.1-1000、0.5-1、0.5-5、0.5-10、0.5-50、0.5-100、0.5-500、0.5-1000、1-5、1-10、1-50、1-100、1-500、1-1000、5-10、5-50、5-100、5-500、5-1000、10-50、10-100、10-500、10-1000、50-100、50-500、50-1000、100-500、100-1000、或500-1000千碱基。

83.如实施例1-79或81-82中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶序列位于该MYC基因的下游(例如，该TSS的下游或该启动子的下游)。

84.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合染色体坐标128746342-128746364、128746321-128746343、128746525-128746547、128748014-128748036、129188878-129188900、129188958-129188980、129188960-129188982、129189067-129189089、129189457-129189479、129189554-129189576、129189679-129189701、129209511-129209533、129209643-129209665、129209658-129209680、129209856-129209878、129189452-129189474、129189190-129189212、129189274-129189296、129189421-129189443、128746405-128746425、128748069-128748089、129188825-129188845、或129188822-129188842处的序列或其近侧的序列。

85.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中与不存在该表达阻遏物的情况下的甲基化相比，该表达阻遏物与该靶基因基因座(例如，MYC)的结合使该靶基因基因座(例如，MYC)中的位点处的甲基化增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过ELISA所测量的或如实例7或28中任一项所述，其中任选地测定甲基化的位点是根据hg19参考基因组的chr8:129188693-129189048，例如，包含根据SEQ IDNO:123的序列。

86.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物与该靶基因基因座(例如MYC)的结合使该靶基因基因座(例如MYC)中位点处的甲基化增加持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂的时间段，例如，如实例28中所述。

87.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中与不存在该表达阻遏物时的表达相比，该表达阻遏物与该MYC基因座的结合使细胞中MYC的表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如通过ELISA测量或如实例2-7或9中任一项所述。

88.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物与该MYC基因座的结合使MYC的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂的时间段，例如通过ELISA测量或如实例2-7或9中任一个所述。

89.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物与该MYC基因座的结合使MYC的表达在转染后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80或96小时明显降低。

90.如实施例1-23或36-89中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合人基因组基因座。

91.如实施例24-43、49、51，53、56-57、59-62、66-68、70-89中任一项所述的表达阻遏物，其中该靶向部分结合小鼠基因组基因座。

92.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物与该MYC基因座的结合降低包含MYC基因座的细胞(例如，癌细胞)的活力。

93.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中使多个细胞与该表达阻遏物或编码该表达阻遏物的核酸接触降低该多个细胞的活力。

94.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中与不存在该第一表达阻遏物时的活力相比，活力降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如通过CellTiter Glo测量或如实例2-7中任一项所述。

95.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物的施用导致至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％的靶细胞(例如，癌细胞)凋亡。

96.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该多个细胞包含多个癌细胞和多个非癌细胞和/或多个感染细胞和多个未感染细胞。

97.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中使该多个细胞与该表达阻遏物或编码该表达阻遏物的核酸接触对该多个癌细胞的活力的降低大于其对该多个非癌细胞的活力的降低。

98.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中使该多个细胞与该表达阻遏物或编码该表达阻遏物的核酸接触对该多个癌细胞的活力的降低比其对该多个非癌细胞的活力的降低大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x。

99.如实施例92-97中任一项所述的表达阻遏物，其中这些癌细胞是肺癌细胞、胃癌细胞、胃肠癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞或肝癌细胞。

100.如实施例92-99中任一项所述的表达阻遏物，其中该癌症是肝细胞癌(HCC)、纤维板层肝细胞癌(FHCC)、胆管癌、血管肉瘤、继发性肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、大细胞(未分化)癌、三阴性乳腺癌、胃腺癌、子宫内膜癌或胰腺癌。

101.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，当与多个感染细胞和多个未感染细胞接触时，其对该多个感染细胞的活力的降低大于其对该多个未感染细胞的活力的降低。

102.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该感染是病毒感染。

103.如实施例102的表达阻遏物，其中该病毒感染是肝炎，例如乙型肝炎。

104.如实施例92-103中任一项所述的表达阻遏物，其中该感染细胞是人肝细胞。

105.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，当在使用编码该表达阻遏物的mRNA的LNP递送的癌细胞(例如，HCC细胞)活力测定中(例如在根据实例12的测定中)进行测试时，该表达阻遏物具有0.04-0.4、0.04-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、或0.3-0.4μg/mL的EC50。

106.如实施例1-104中任一项所述的表达阻遏物，当在使用编码该表达阻遏物的mRNA的LNP递送的癌细胞(例如，肺癌细胞)活力测定中(例如，在根据实例18的测定中)进行测试时，该表达阻遏物具有0.1-2.5、0.5-2.2、1.0-1.5、1.2-2μg/mL的EC50。

107.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，当在使用编码该表达阻遏物的mRNA的LNP递送用于降低癌细胞(例如HCC细胞)MYC mRNA水平的测定中(例如在根据实例12的测定中)进行测试时，该表达阻遏物具有0.004-0.08、0.004-0.01、0.01-0.02、0.02-0.04、或0.04-0.08μg/mL的EC50。

108.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，当在使用编码该表达阻遏物的mRNA的LNP递送用于降低癌细胞(例如肺癌细胞)MYC mRNA水平的测定中(例如在根据实例18的测定中)进行测试时，该表达阻遏物具有0.04-0.1、0.04-0.09、0.05-0.09、或0.06-0.8μg/mL的EC50。

109.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其使细胞中靶基因(例如，MYC)编码的蛋白质水平与未处理细胞中的蛋白质水平相比降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

110.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其能够减小例如人受试者或哺乳动物模型中的肿瘤体积。

111.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物能够将肿瘤体积减小的程度与化疗剂相比相似或更大，例如在哺乳动物模型中，例如当在开始治疗后第20天测量时，例如，其中该表达阻遏物每5天以3mg/kg的剂量施用。

112.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物能够与PBS对照相比减小肿瘤体积，例如，在哺乳动物模型中，例如当在开始治疗后第20天测量时，例如，其中该表达阻遏物以1mg/kg、1.5mg/kg或3mg/kg每5天一次，施用4个剂量，然后每3天一次，施用3个剂量。

113.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中与用PBS治疗的对照相比，例如在治疗开始后第20天，肿瘤体积减小至少约10％、20％、30％或40％。

114.如实施例111-113中任一项所述的表达阻遏物，其中该化疗剂是索拉非尼或顺铂。

115.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该系统能够将肿瘤体积减小至与小分子MYC抑制剂相似或更大的程度。

116.如实施例115所述的表达阻遏物，其中该小分子MYC抑制剂是MYCi975，其中任选地，与用MYCi975治疗的对照相比，例如在治疗开始后第20天，肿瘤体积减小至少约10％、20％、30％或40％。

117.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其与治疗开始时相比不引起体重下降，或引起小于3％、2％或1％的体重下降。

118.一种系统，其包含：

如前述实施例中任一项所述的第一表达阻遏物，以及

第二表达阻遏物，例如本文所述的第二表达阻遏物，例如任何前述实施例所述的第二表达阻遏物。

119.一种系统，其包含：

包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分的第一表达阻遏物，其中该第一表达阻遏物结合可操作地连接至MYC基因的转录调节元件(例如，启动子、增强子或转录起始位点(TSS))或该转录调节元件近侧的序列，以及

包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中该第二表达阻遏物结合包含MYC基因的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合该锚序列近侧的序列。

120.如实施例118或119所述的系统，

其中该转录调节元件包含启动子，并且

其中该锚序列包含CTCF结合基序。

121.如实施例118-120中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物结合邻近该CTCF结合基序的下游区域。

122.如实施例118-120中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物结合邻近该CTCF结合基序的上游区域。

123.如实施例118-122中任一项所述的系统，其中

该第一表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:2、3、4、71-86或200-206的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分；以及

该第二表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:2、3、4、71-86或200-206的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分。

124.如实施例118-123中任一项所述的系统，其中

该第一表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分。

125.如实施例118-124中任一项所述的系统，其中，

该第一表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:83的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分；以及

该第二表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:77的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分。

126.一种系统，其包含：

包含第一靶向部分和任选的第一效应子部分的第一表达阻遏物，其中该第一表达阻遏物结合可操作地连接至MYC基因的启动子或该启动子近侧的序列，和

包含第二靶向部分和任选的第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中该第二表达阻遏物结合MYC基因的增强子(例如，超级增强子)。

127.如实施例126所述的系统，其中，

该第一表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:204的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分，并且

该第二表达阻遏物结合包含SEQ ID NO:199或201中任一个的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分。

128.一种用于降低MYC表达的系统，该系统包含：

a)第一表达阻遏物，其包含：

i)第一靶向部分，该第一靶向部分具有根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

ii)第一效应子部分，该第一效应子部分具有根据SEQ ID NO:19或87的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

b)第二表达阻遏物，其包含：

i)第二靶向部分，该第二靶向部分具有根据SEQ ID NO:7 169或171的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

ii)第二效应子部分，该第二效应子部分具有根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

129.如实施例128所述的系统，其中该第一表达阻遏物进一步包含第一核定位信号，例如SV40 NLS，例如根据SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如,位于该第一靶向部分的N末端。

130.如实施例128或129所述的系统，其中该第一表达阻遏物进一步包含第二核定位信号，例如核蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如位于该第一效应子部分的C末端。

131.如实施例128-130中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物进一步包含第一核定位信号，例如SV40 NLS，例如根据SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如,位于该第二靶向部分的N末端。

132.如实施例128-131中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物进一步包含第二核定位信号，例如核质蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如,位于该第二靶向部分的C末端。

133.如实施例128-132中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物进一步包含位于该第一靶向部分和该第一效应子部分之间的第一接头，其中任选地该第一接头具有根据SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

134.如实施例128-133中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物进一步包含位于该第二靶向部分和该第二效应子部分之间的第二接头，其中任选地该第二接头具有根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

135.如实施例128-134中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物进一步包含该第一效应子部分的C末端的氨基酸序列，例如多达30、25、20或18个氨基酸的序列，例如根据SEQ ID NO:126的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

136.如实施例128-132中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物进一步包含该第二靶向部分的N末端的氨基酸序列，例如多达30、25、20或18个氨基酸的序列，例如，根据SEQ ID NO:128的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

137.如实施例128-136中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物具有根据SEQID NO:30或129的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

138.如实施例128-137中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物具有根据SEQID NO:24的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

139.如实施例128-137中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分包含根据SEQID NO:169的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

140.如实施例128-137中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分包含根据SEQID NO:171的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

141.如实施例128-140中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物具有根据SEQID NO:177或183的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

142.如实施例128-140中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物具有根据SEQID NO:179、185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

143.一种核酸，其编码如实施例128-142中任一项所述的系统的第一表达阻遏物和第二阻遏物。

144.一种核酸，其编码用于降低MYC表达的系统，该核酸包含：

a)编码第一表达阻遏物的第一区域，该第一表达阻遏物包含：

b)编码第二表达阻遏物的第二区域，该第二表达阻遏物包含：

i)第二靶向部分，该第二靶向部分具有根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

145.如实施例144所述的核酸，其中该第一区域在该第二区域的5’。

146.如实施例144所述的核酸，其中该第一区域在该第二区域的3’。

147.如实施例145或146所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码第一核定位信号的核苷酸序列，该第一核定位信号是例如SV40 NLS，例如根据SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如位于该第一靶向部分的N末端。

148.如实施例145-147中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码第二核定位信号的核苷酸序列，该第二核定位信号是例如核质蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如，位于该第一效应子部分的C末端。

149.如实施例145-148中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码第一核定位信号的核苷酸序列，该第一核定位信号是例如SV40NLS，例如根据SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如位于该第二靶向部分的N末端。

150.如实施例145-149中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码第二核定位信号的核苷酸序列，该第二核定位信号是例如核质蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如，位于该第二效应子部分的C末端。

151.如实施例145-150中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码位于该第一靶向部分和该第一效应子部分之间的第一接头的核苷酸序列，其中任选地该第一接头具有根据SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

152.如实施例145-151中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码位于该第二靶向部分和该第二效应子部分之间的第二接头的核苷酸序列，其中任选地该第二接头具有根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

153.如实施例145-152中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码该第一效应子部分的C末端的氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列是例如多达30、25、20或18个氨基酸的序列，例如根据SEQ ID NO:126的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

154.如实施例145-153中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码该第二靶向部分的N末端的氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列是例如多达30、25、20或18个氨基酸的序列，例如根据SEQ ID NO:128的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

155.如实施例145-154中任一项所述的核酸，其中该第一表达阻遏物具有根据SEQID NO:30或129的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

156.如实施例145-155中任一项所述的核酸，其中该第二表达阻遏物具有根据SEQID NO:24的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

157.如实施例145-156中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一靶向部分的核苷酸序列，其中编码该第一靶向部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:46或131的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

158.如实施例145-157中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第一效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:52或132的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

159.如实施例145-158中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含编码该第二靶向部分的核苷酸序列，其中编码该第二靶向部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:40的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

160.如实施例145-159中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第一效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:51的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

161.如实施例145-160中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含根据SEQ IDNO:63或130的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

162.如实施例145-161中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:57的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

163.一种核酸，其编码用于降低MYC表达的系统，该核酸包含：

i)第二靶向部分，该第二靶向部分具有根据SEQ ID NO:169的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

164.一种核酸，其编码用于降低MYC表达的系统，该核酸包含：

i)第二靶向部分，该第二靶向部分具有根据SEQ ID NO:171的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

165.如实施例163或164所述的核酸，其中该第一区域在该第二区域的5’。

166.如实施例163或164所述的核酸，其中该第一区域在该第二区域的3’。

167.如实施例163-166中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码第一核定位信号的核苷酸序列，该第一核定位信号是例如SV40NLS，例如根据SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如位于该第一靶向部分的N末端。

168.如实施例163-167中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码第二核定位信号的核苷酸序列，该第二核定位信号是例如核质蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如，位于该第一效应子部分的C末端。

169.如实施例163-168中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码第一核定位信号的核苷酸序列，该第一核定位信号是例如SV40NLS，例如根据SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如位于该第二靶向部分的N末端。

170.如实施例163-169中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码第二核定位信号的核苷酸序列，该第二核定位信号是例如核质蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，例如，位于该第二效应子部分的C末端。

171.如实施例163-170中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码位于该第一靶向部分和该第一效应子部分之间的第一接头的核苷酸序列，其中任选地该第一接头具有根据SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

172.如实施例163-171中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码位于该第二靶向部分和该第二效应子部分之间的第二接头的核苷酸序列，其中任选地该第二接头具有根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

173.如实施例163-171中任一项所述的核酸，其中该第一区域进一步包含编码该第一效应子部分的C末端的氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列是例如多达30、25、20或18个氨基酸的序列，例如根据SEQ ID NO:126的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

174.如实施例163-173中任一项所述的核酸，其中该第二区域进一步包含编码该第二靶向部分的N末端的氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列是例如多达30、25、20或18个氨基酸的序列，例如根据SEQ ID NO:128的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

175.如实施例163-174中任一项所述的核酸，其中该第一表达阻遏物具有根据SEQID NO:30或129的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

176.如实施例144-175中任一项所述的核酸，其中该第二表达阻遏物具有根据SEQID NO:177或183的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

177.如实施例144-176中任一项所述的核酸，其中该第二表达阻遏物具有根据SEQID NO:179或185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

178.如实施例144-177中任一项所述的核酸，其中该第一表达阻遏物包含根据SEQID NO:30或129的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，并且该第二表达阻遏物具有根据SEQ ID NO:24、141、177、179、183或185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

179.如实施例144-178中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一靶向部分的核苷酸序列，其中编码该第一靶向部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:46或131的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

180.如实施例144-179中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第一效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:52或132的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

181.如实施例144-180中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:173的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

182.如实施例144-181中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:175的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

183.如实施例144-182中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含编码该第二效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第二效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:51的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

184.如实施例144-183中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含根据SEQ IDNO:63或130的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

185.如实施例144-184中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:189的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

186.如实施例144-185中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:194的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的

187.如实施例144-186中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第一效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:52或132的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

188.如实施例144-187中任一项所述的核酸，其中该第一区域包含编码该第一靶向部分的核苷酸序列，其中编码该第一靶向部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:46或131的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

189.如实施例144-188中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含编码该第二效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第二效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:51的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

190.如实施例144-189中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:189的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

191.如实施例144-190中任一项所述的核酸，其中该第二区域包含根据SEQ IDNO:194的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

192.如实施例144-191中任一项所述的核酸，该核酸具有根据SEQ ID NO:93、112的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

193.如实施例144-192中任一项所述的核酸，该核酸具有根据SEQ ID NO:196或197的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

194.如实施例118-193中任一项所述的系统或核酸，其中该第一表达阻遏物包含该第一效应子部分。

195.如实施例118-194中任一项所述的系统或核酸，其中该第二表达阻遏物包含该第二效应子部分。

196.如实施例118-195中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分具有与该第二效应子部分不同的氨基酸序列。

197.如实施例118-196中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分是持久效应子部分。

198.如实施例118-125或144-197中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分是瞬时效应子部分。

199.如实施例118-198中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分是表观遗传修饰部分。

200.如实施例118-143、163-197或199中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含组蛋白甲基转移酶。

201.如实施例200所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2或其任一项的功能变体或片段，例如其任一项的SET结构域。

202.如实施例118-143、163-197或199中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含组蛋白去甲基化酶(例如，赖氨酸去甲基化酶)。

203.如实施例202所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66(或其任一项的功能变体或片段)。

204.如实施例118-143、163-197或199中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶。

205.如实施例204所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9，或其任一项的功能变体或片段。

206.如实施例118-197或200中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含DNA甲基转移酶。

207.如实施例206所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L，或其任一项的功能变体或片段。

208.如实施例118-143、160-196或198中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分是转录阻遏物部分，例如包含转录阻遏物。

209.如实施例198或199所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任一项的功能变体或片段。

210.如实施例118-209中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分促进转录调节元件或其近侧的序列的表观遗传修饰。

211.如实施例118-210中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分催化转录调节元件或其近侧的序列的表观遗传修饰。

212.如实施例118-125、194或197-211中任一项所述的系统或核酸，其中该第二表达阻遏物不包含效应子部分。

213.如实施例118-212中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分是瞬时效应子部分。

214.如实施例118-125或194-211中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分是持久效应子部分。

215.如实施例118-211或214中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分是表观遗传修饰部分。

216.如实施例118-125、194-211或214-215中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含组蛋白甲基转移酶。

217.如实施例216所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含选自以下的蛋白质：SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2或其任一项的功能变体或片段，例如其任一项的SET结构域。

218.如实施例118-125、194-211或214-215中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含组蛋白去甲基化酶(例如，赖氨酸去甲基化酶)。

219.如实施例218所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含选自以下的蛋白质：KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66(或其任一项的功能变体或片段)。

220.如实施例118-125、194-211或214-215中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶。

221.如实施例220所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含选自以下的蛋白质：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9，或其任一项的功能变体或片段。

222.如实施例118-125、194-211或214-215中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含DNA甲基转移酶。

223.如实施例222所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含选自以下的蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L，或其任一项的功能变体或片段。

224.如实施例118-211或213中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分是转录阻遏物部分。

225.如实施例224所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分促进锚序列或其近侧的序列的表观遗传修饰。

226.如实施例223或224所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分结合一种或多种内源表观遗传修饰蛋白或一种或多种内源转录修饰蛋白。

227.如实施例223-226中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任一项的功能变体或片段。

228.如实施例118-197、199-207、210-211、213或224-227中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一效应子部分是持久效应子部分，并且

该第二效应子部分是瞬时效应子部分。

229.如实施例228所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分是表观遗传修饰部分。

230.如实施例227或228中所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分是转录阻遏物部分。

231.如实施例227-230中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一效应子部分包含组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白脱乙酰酶、DNA甲基转移酶、其任一项的功能变体或片段、或其任何组合，并且

该第二效应子部分包含转录阻遏物或其任一项的功能变体或片段。

232.如实施例118-125、194、197、199-207、210-212、或190中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第二表达阻遏物不包含第二效应子部分。

233.如实施例118-125、199-207、210-211、213、214或224-231中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一效应子部分包含SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、其任一项的功能变体或片段、或其任何组合，并且

该第二效应子部分包含KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12、其任一项的功能变体或片段、或其任何组合。

234.如实施例118-197、199、206-207、210-211、213、215、224-231或233中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一效应子部分包含DNA甲基转移酶，并且

该第二效应子部分包含转录阻遏物。

235.如实施例118-125、194、197、200、206-207、210-212或232中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一效应子部分包含DNA甲基转移酶，并且

该第二表达阻遏物不包含第二效应子部分。

236.如实施例118-125、200、206-207、210-235中任一项所述的系统或核酸，其中该第一效应子部分包含MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、或其任一项的功能变体或片段。

237.如实施例118-211、214、224-234或236中任一项所述的系统或核酸，其中该第二效应子部分包含KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任一项的功能变体或片段。

238.如实施例118-211、199、206-207、210-211、213、224-234或236-237中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一效应子部分包含MQ1或其任一项的功能变体或片段，并且

该第二效应子包含KRAB或其任一项的功能变体或片段。

239.如实施例118-125、194、197、199-207、或210-212、229、232、235、或236中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第二表达阻遏物不包含第二效应子部分。

240.如实施例118-200中任一项所述的系统或核酸，其中该第一表达阻遏物包含选自SEQ ID NO:22-37、129、133、134、139-149、177-180或183-186中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

241.如实施例118-198、200、206-211、213-216、222-223、236-237或240中任一项所述的系统或核酸，其中该第二表达阻遏物包含选自SEQ ID NO:22-37、129、133、134、139-149、177-180或183-186中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

242.如实施例118-198、200、206-211、213-216、222、-223、236-237或240-241中任一项所述的系统或核酸，其中：其中该第一表达阻遏物包含SEQ ID NO:30、129、133的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第二表达阻遏物包含SEQ ID NO:24、134、141、177、179、183或185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

243.如实施例118-198、200、206-211、213-216、222、-223、236-237或240-242中任一项所述的系统或核酸，其中该第一表达阻遏物由SEQ ID NO:63或130的第一核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码，并且该第二表达阻遏物由SEQ ID NO:57、189或194的第二核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

244.如实施例118-198、200、206-211、213-216、222-223、236-237或240-243中任一项所述的系统或核酸，其中该第一阻遏物和第二阻遏物由SEQ ID NO:93、94、112、113、196或197的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

245.如实施例244所述的系统或核酸，该系统或核酸包含SEQ ID NO:91、92、121、122、181、182、187或188的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

246.如实施例118-197、199、206-207、210-211、213、215、224-231、233-234、236-237或240-244中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一表达阻遏物从N末端到C末端包含：

(i)第一核定位信号，例如SV40 NLS；例如，根据SEQ ID NO:135的序列；

(ii)第一靶向部分，例如锌指结合结构域，例如ZF9；例如，根据SEQ ID NO:13的序列；

(iii)第一效应子部分，例如DNA甲基转移酶，例如MQ1；例如，根据SEQ ID NO:19或87的序列；

(iv)第二核定位信号，例如核质蛋白NLS；例如，根据SEQ ID NO:136的序列；

并且该第二表达阻遏物从N末端到C末端包含：

(v)第三核定位信号，例如SV40NLS；例如，根据SEQ ID NO:135的序列；

(vi)第二靶向部分，例如锌指结合结构域，例如ZF3；例如，根据SEQ ID NO:7的序列；

(vii)第二效应子部分，例如KRAB，例如根据SEQ ID NO:18的序列；以及

(viii)第四核定位信号，例如核质蛋白NLS，例如根据SEQ ID NO:136的序列。

247.如实施例118-197、199、206-207、210-211、213、215、224-231、233-234、236-237或240-244中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一表达阻遏物从N末端到C末端包含：

并且该第二表达阻遏物从N末端到C末端包含：

(vi)第二靶向部分，例如锌指结合结构域，例如ZF54；例如，根据SEQ ID NO:169的序列；

248.如实施例118-197、199、206-207、210-211、213、215、224-231、233-234、236-237或240-244中任一项所述的系统或核酸，其中：

该第一表达阻遏物从N末端到C末端包含：

并且该第二表达阻遏物从N末端到C末端包含：

(vi)第二靶向部分，例如锌指结合结构域，例如ZF67；例如，根据SEQ ID NO:171的序列；

249.如实施例118-248中任一项所述的系统，其中与单独的第一表达阻遏物或单独的第二表达阻遏物相比，该系统能够更大程度地降低MYC的表达。

250.如实施例128-194或242-249中任一项所述的系统，其中与SEQ ID:22、23、25-29、31-37的任何表达阻遏物单独或组合相比，该系统能够更大程度地降低MYC的表达。

251.如实施例118-250中任一项所述的系统，其能够减小例如人受试者或哺乳动物模型中的肿瘤体积。

252.如实施例128-193或242-209中任一项所述的系统，其中该系统能够将肿瘤体积减小的程度与化疗剂相比相似或更大，例如在哺乳动物模型中，例如当在开始治疗后第20天测量时，例如，其中该表达阻遏物每5天以3mg/kg的剂量施用，例如，在如实例15中所述的模型系统中。

253.如实施例128-193或242-252中任一项所述的系统，其中该系统能够将肿瘤体积减小的程度与化疗剂相比相似，例如在哺乳动物模型中，例如当在开始治疗后第15天测量时，例如，其中该表达阻遏物每5天以6mg/kg的剂量施用，例如，在如实例14中所述的模型系统中。

254.如实施例128-193或242-253中任一项所述的系统，其中与用PBS治疗的对照相比，例如在治疗开始后第20天，肿瘤体积减小至少约10％、20％、30％、40％、50％或60％。

255.如实施方式254所述的系统，其中该化疗剂是索拉非尼或顺铂。

256.如实施例128-193或242-253中任一项所述的系统，其中该系统能够将肿瘤体积减小至与小分子MYC抑制剂相似或更大的程度。

257.如实施例256所述的系统，其中该小分子MYC抑制剂是MYCi975，其中任选地，与用MYCi975治疗的对照相比，例如在治疗开始后第20天，肿瘤体积减小至少约10％、20％、30％或40％。

258.如实施例118-257中任一项所述的系统，其与治疗开始时相比不引起体重下降，或引起小于3％、2％或1％的体重下降。

259.如实施例118-258中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分选自TAL效应结构域、CRISPR/Cas结构域、锌指结构域、tetR结构域、大范围核酸酶或寡核苷酸。

260.如实施例118-260中任一项所述的系统或核酸，其中该第二靶向部分选自TAL效应结构域、CRISPR/Cas结构域、锌指结构域、tetR结构域、大范围核酸酶或寡核苷酸。

261.如实施例118-260中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分包含CRISPR/Cas结构域(例如，第一CRISPR/Cas结构域)。

262.如实施例118-261中任一项所述的系统或核酸，其中该第二靶向部分包含第二CRISPR/Cas结构域(例如，第二CRISPR/Cas结构域)。

263.如实施例262所述的系统或核酸，其中：i)该第一CRISPR/Cas结构域结合第一指导RNA，ii)该第二CRISPR/Cas结构域结合第二指导RNA，或iii)(i)和(ii)两者。

264.如实施例262或263所述的系统或核酸，其中该第一CRISPR/Cas结构域不结合该第二指导RNA或以至少10、20、50、100、1000或10,000nM的K_D结合，并且该第二CRISPR/Cas结构域不结合该第一指导RNA或以至少10、20、50、100、1000或10,000nM的K_D结合。

265.如实施例260-264中任一项所述的系统或核酸，其中该第一CRISPR/Cas结构域包含与该第二CRISPR/Cas结构域不同的氨基酸序列。

266.如实施例260-265中任一项所述的系统或核酸，其中该第一或第二CRISPR/Cas结构域包含选自表1的Cas蛋白或Cpf1蛋白或其任一项的变体(例如突变体)的氨基酸序列。

267.如实施例260-266中任一项所述的系统或核酸，其中该第一CRISPR/Cas结构域包含选自表1的Cas蛋白或Cpf1蛋白或其任一项的变体(例如突变体)的氨基酸序列，并且该第二CRISPR/Cas结构域包含选自表1的不同Cas蛋白或Cpf1蛋白或其任一项的变体(例如突变体)的氨基酸序列。

268.如实施例118-260中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分包含锌指结构域(例如，第一锌指结构域)。

269.如实施例118-260或268中任一项所述的系统或核酸，其中该第二靶向部分包含锌指结构域(例如，第二锌指结构域)。

270.如实施例118-261或268-269中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分包含第一锌指结构域并且该第二靶向部分包含第二锌指结构域。

271.如实施例268-270中任一项所述的系统或核酸，其中该第一锌指结构域和该第二锌指结构域结合相同的基因组基因座，例如具有相同的氨基酸序列。

272.如实施例268-271中任一项所述的系统或核酸，其中该第一锌指结构域和该第二锌指结构域具有不同的氨基酸序列或结合不同的基因组基因座。

273.如实施例118-261或267-272中任一项所述的系统或核酸，其中该第一锌指分子包含至少1、2、3、4、5、7、8、9或10个锌指(并且任选地不超过11、10、9、8、7、6或5个锌指)。

274.如实施例267-273中任一项所述的系统或核酸，其中该第一锌指分子包含1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10个锌指。

275.如实施例268-274中任一项所述的系统或核酸，其中该第一锌指结构域包含3或9个锌指。

276.如实施例268-275中任一项所述的系统或核酸，其中该第二锌指结构域包含至少1、2、3、4、5、7、8、9或10个锌指(并且任选地不超过11、10、9、8、7、6或5个锌指)。

277.如实施例268-276中任一项所述的系统或核酸，其中该第二锌指结构域包含1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10个锌指。

278.如实施例268-277中任一项所述的系统或核酸，其中该第二锌指结构域包含3或9个锌指。

279.如实施例118-278中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分包含TAL效应子结构域(例如，第一TAL效应子结构域)。

280.如实施例118-260或279中任一项所述的系统或核酸，其中该第二靶向部分包含TAL效应子结构域(例如，第二TAL效应子结构域)。

281.如实施例279或280中任一项所述的系统或核酸，其中该第一TAL效应子结构域包含至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40个中心重复(并且任选地，不超过45、40、35、30、25、20、15或10个中心重复)。

282.如实施例279-281中任一项所述的系统或核酸，其中该第一TAL效应子结构域包含2-40、5-40、10-40、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、2-35、5-35、10-35、15-35、20-35、25-35、30-35、2-30、5-30、10-30、15-30、20-30、25-30、2-25、5-25、10-25、15-25、20-25、2-20、5-20、10-20、15-20、2-15、5-15、10-15、2-10、5-10、或2-5个中心重复。

283.如实施例279-282中任一项所述的系统或核酸，其中该第二TAL效应子结构域包含至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40个中心重复(并且任选地，不超过45、40、35、30、25、20、15或10个中心重复)。

284.如实施例279-283中任一项所述的系统或核酸，其中该第二TAL效应子结构域包含2-40、5-40、10-40、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、2-35、5-35、10-35、15-35、20-35、25-35、30-35、2-30、5-30、10-30、15-30、20-30、25-30、2-25、5-25、10-25、15-25、20-25、2-20、5-20、10-20、15-20、2-15、5-15、10-15、2-10、5-10或2-5个中心重复。

285.如实施例118-284中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分包含核酸(例如，第一核酸)。

286.如实施例129-285中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分包含核酸(例如，第二核酸)。

287.如实施例129-286中任一项所述的系统或核酸，其中该第一靶向部分包含多肽(例如，第一多肽)。

288.如实施例129-287中任一项所述的系统或核酸，其中该第二靶向部分包含多肽(例如，第二多肽)。

289.如实施例287或288所述的系统，其中该核酸共价连接至多肽。

290.如实施例288或289所述的系统，其中该核酸与该多肽非共价结合。

291.如实施例275-290中任一项所述的系统或核酸，其中该核酸包含与该转录调节元件或其近侧的序列互补的序列，或相对于该转录调节元件或与其近侧的序列包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个错配。

292.如实施例275-291中任一项所述的系统或核酸，其中该核酸包含与锚序列或其近侧的序列互补的序列，或相对于锚序列或其近侧的序列包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个错配。

293.如实施例275-292中任一项所述的系统，其中该核酸包含DNA、肽核酸(PNA)、肽-寡核苷酸缀合物、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、聚酰胺、形成三链体的寡核苷酸、反义寡核苷酸、tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子。

294.如实施例-275-293中任一项所述的系统，其中该核酸包含gRNA。

295.如实施例275-294中任一项所述的系统，其中该核酸包含与SEQ ID NO:1-4中任一个具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置的序列。

296.如实施例275-295中任一项所述的系统，其中该第一核酸包含与SEQ ID NO:1-4中任一个具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，或者与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置的差异，并且该第二核酸包含与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，或者与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置的差异。

297.如实施例275-295中任一项所述的系统，其中该第一核酸包含与SEQ ID NO:96-110中任一个具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，或者与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置的差异，并且该第二核酸包含与SEQ ID NO:96-110中的任一个具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，或者与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置的差异。

298.如实施例118-297中任一项所述的系统，其中该转录调节元件包含启动子。

299.如实施例118-298中任一项所述的系统，其中该转录调节元件包含增强子；例如，超级增强剂。

300.如实施例118-299中任一项所述的系统，其中该锚序列包含CTCF结合基序。

301.如实施例118-300中任一项所述的系统，其中该锚序列包含YY1结合基序。

302.如实施例118-301中任一项所述的系统，其中该锚序列包含SEQ ID NO:71或72的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

303.如实施例118-302中任一项所述的系统，其中该锚序列包含根据SEQ ID NO:73或74的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

304.如实施例118-303中任一项所述的系统，其中该锚序列与该MYC基因位于同一染色体上。

305.如实施例118-304中任一项所述的系统，其中该锚序列在该MYC基因的上游(例如，TSS上游或启动子上游)。

306.如实施例118-305中任一项所述的系统，其中该锚序列距离该MYC基因(例如，距离MYC基因的TSS或启动子)至少1、5、10、50、100或1000千碱基。

307.如实施例118-306中任一项所述的系统，其中该锚序列距离该MYC基因(例如，距离MYC基因的TSS或启动子)0.1-0.5、0.1-1、0.1-5、0.1-10、0.1-50、0.1-100、0.1-500、0.1-1000、0.5-1、0.5-5、0.5-10、0.5-50、0.5-100、0.5-500、0.5-1000、1-5、1-10、1-50、1-100、1-500、1-1000、5-10、5-50、5-100、5-500、5-1000、10-50、10-100、10-500、10-1000、50-100、50-500、50-1000、100-500、100-1000、或500-1000千碱基。

308.如实施例118-303或305-307中任一项所述的系统，其中该锚序列与该MYC基因在不同染色体上。

309.如实施例118-308中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分以足以与内源多肽(例如，CTCF或YY1)竞争结合的亲和力结合该锚序列或该锚序列近侧的序列。

310.如实施例118-309中任一项所述的系统，其中该第一靶向部分结合染色体坐标128746342-128746364、128746321-128746343或128746525-128746547处的序列或其近侧的序列。

311.如实施例118-309中任一项所述的系统，其中该第一靶向部分结合染色体坐标128746405-128746425、128748069-128748089、129188825-129188845或129188822-129188842处的序列或其近侧的序列。

312.如实施例118-311中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分结合染色体坐标128748014-128748036处的序列或其近侧的序列。

313.如实施例118-311中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分结合染色体坐标128746405-128746425、128748069-128748089、129188825-129188845或129188822-129188842处的序列或其近侧的序列。

314.如实施例118-314中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物是融合分子。

315.如实施例118-314中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物是融合分子。

316.如实施例118-315中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物包含接头。

317.如实施例118-316中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物包含接头。

318.如实施例118-267或285-317中任一项所述的系统，其中：

该第一表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含第一CRISPR/Cas分子，例如包含第一无催化活性的CRISPR/Cas蛋白，该效应子部分包含表观遗传修饰部分；以及

该第二表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含第二CRISPR/Cas分子，例如包含第二无催化活性的CRISPR/Cas蛋白，该效应子部分任选地包含转录阻遏物。

319.如实施例118-260、268-278或285-317中任一项所述的系统，其中：

该第一表达阻遏物包含含有第一锌指结构域的靶向部分和含有表观遗传修饰部分的效应子部分；以及

该第二表达阻遏物包含含有第二锌指结构域的靶向部分和含有转录阻遏物的任选的效应子部分。

320.如实施例118-120、262、268或275-318中任一项所述的系统，其中：

该第一表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含CRISPR/Cas分子，例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白，该效应子部分包含表观遗传修饰部分；以及

该第二表达阻遏物包含含有锌指结构域的靶向部分和含有转录阻遏物的任选的效应子部分。

321.如实施例118-260、268或275-318中任一项所述的系统，其中：

该第一表达阻遏物包含含有锌指结构域的靶向部分和含有表观遗传修饰部分的效应子部分；以及

该第二表达阻遏物包含靶向部分和任选的效应子部分，该靶向部分包含CRISPR/Cas结构域，例如包含无催化活性的CRISPR/Cas蛋白，该效应子部分包含转录阻遏物。

322.如实施例260、268-278、或275-318中任一项所述的系统，其中该锌指结构域(例如，第一或第二锌指结构域)包含1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10个锌指，例如3或9个锌指。

323.如实施例322中任一项所述的系统，其中该表观遗传修饰部分包含DNA甲基转移酶。

324.如实施例118-323中任一项所述的系统，其中该表观遗传修饰部分包含MQ1或其功能变体或片段。

325.如实施例118-324中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物包含效应子部分，该效应子部分包含转录阻遏物。

326.如实施例118-323中任一项所述的系统，其中该转录阻遏物包含KRAB或其功能变体或片段。

327.如实施例118-326中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物包含SEQ IDNO:28-33或35-37、145-149、151、152中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

328.如实施例118-327中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物包含SEQ IDNO:22-27、34、139-144、150、177-180、183-186中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

329.如实施例118-328中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧的序列的结合降低细胞中MYC的表达。

330.如实施例327的系统，其中与不存在该第一表达阻遏物的情况下的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过QPCR或ELISA测量。

331.如实施例326或327所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件的结合使MYC的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂的时间段，例如，如通过QPCR或ELISA测量。

332.如实施例329-331中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件的结合使MYC的表达在转染后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80或96小时明显降低。

333.如实施例328-332中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧的序列的结合降低细胞中MYC的表达。

334.如实施例333的系统，其中与不存在该第二表达阻遏物的情况下的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过QPCR或ELISA测量。

335.如实施例333或334所述的系统，其中该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合使MYC的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂的时间段，例如，如通过QPCR或ELISA测量。

336.如实施例334-335中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物与锚序列或其近侧的序列的结合使MYC的表达在转染后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80或96小时明显降低。

337.如实施例329-336中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧的序列的结合以及该第二表达阻遏物与锚序列或其近侧的序列的结合降低细胞中MYC的表达。

338.如实施例329-337中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧的序列的结合以及该第二表达阻遏物与锚序列或其近侧的序列的结合使MYC的表达在转染后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80或96小时明显降低。

339.如实施例337或338中任一项所述的系统，其中与不存在该第一和第二表达阻遏物的情况下的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过QPCR或ELISA测量。

340.如实施例329-339中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合使MYC的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂的时间段，例如，如通过QPCR或ELISA所测量的。

341.如实施例329-340中任一项所述的系统，其中与由该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合单独引起的表达降低相比，由该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合引起的表达降低更大。

342.如实施例341所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合对表达的降低比该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合任一者对表达的降低大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过QPCR或ELISA所测量的。

343.如实施例329-342中任一项所述的系统，其中与由该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合单独引起的表达降低相比，由该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合引起的表达降低持续更长的时间(例如，更多的小时、天数或细胞分裂)。

344.如实施例343所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合对表达的降低比该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合任一者对表达的降低长(例如以小时、天或细胞分裂来测量)1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过QPCR或ELISA所测量的。

345.如实施例329-344中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合使MYC的表达明显降低至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂的时间段，例如，如通过QPCR或ELISA所测量的。

346.如实施例329-345中任一项所述的系统，其中与由该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合单独引起的表达降低相比，由该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合以及该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合引起的表达降低更大。

347.如实施例346所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合对表达的降低比该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合任一者对表达的降低大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过QPCR或ELISA所测量的。

348.如实施例329-347中任一项所述的系统，其中与由该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合单独引起的表达降低相比，由该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合引起的表达降低持续更长的时间(例如，更多的小时、天数或细胞分裂)。

349.如实施例348所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合对表达的降低比该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合任一者对表达的降低长(例如以小时、天或细胞分裂来测量)1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过QPCR或ELISA所测量的。

350.如实施例329-349中任一项所述的系统，其中表达明显地无限定地降低(例如，持续比可通过实验测量的时间更长的时间段)。

351.如实施例329-350中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧的序列的结合降低包含该转录调节元件或其近侧的序列的细胞的活力。

352.如实施例329-351中任一项所述的系统，其中使多个细胞与该第一表达阻遏物或编码该第一表达阻遏物的核酸接触降低该多个细胞的活力，任选地其中该多个细胞包括癌性和非癌性细胞和/或感染细胞和未感染细胞。

353.如实施例352所述的系统，其中与不存在该第一表达阻遏物时活力相比，活力降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如通过CellTiter Glo测量。

354.如实施例329-353中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物的施用导致至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％的靶细胞(例如，癌细胞)凋亡。

355.如实施例329-354中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧的序列的结合降低包含该锚序列或其近侧的序列的细胞的活力。

356.如实施例329-355中任一项所述的系统，其中使多个细胞与该第二表达阻遏物或编码该第二表达阻遏物的核酸接触降低该多个细胞的活力。

357.如实施例329-356中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧的序列的结合降低包含该转录调节元件或其近侧的序列的细胞的活力。

358.如实施例329-357中任一项所述的系统，其中使多个细胞与该第二表达阻遏物或编码该第一表达阻遏物的核酸接触降低该多个细胞的活力，任选地其中该多个细胞包括癌性和非癌性细胞和/或感染细胞和未感染细胞。

359.如实施例358所述的系统，其中与不存在该第二表达阻遏物时活力相比，活力降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如通过CellTiter Glo测量。

360.如实施例329-359中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物的施用导致至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％的靶细胞(例如，癌细胞)凋亡。

361.如实施例329-360中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧的序列的结合以及该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧的序列的结合降低包含该锚序列或其近侧的序列的细胞的活力。

362.如实施例329-361中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧的序列的结合以及该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧的序列的结合降低了细胞的活力

363.如实施例329-362中任一项所述的系统，其中使多个细胞与该系统或编码该系统的核酸接触降低了该多个细胞的活力。

364.如实施例329-363所述的系统，其中与不存在该系统时活力相比，活力降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如通过CellTiter Glo测量。

365.如实施例329-364中任一项所述的系统，其中与由该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合单独引起的活力降低相比，由该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合引起的活力降低更大。

366.如实施例329-365中任一项所述的系统，其中与由该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合单独引起的活力降低相比，由该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合以及该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合引起的活力降低更大。

367.如实施例366所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合对活力的降低比该第一表达阻遏物与该转录调节元件或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该锚序列或其近侧序列的结合任一者对活力的降低大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过CellTiter Glo所测量的。

368.如实施例366或367所述的系统，其中该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合和该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合对活力的降低比该第一表达阻遏物与该启动子或其近侧序列的结合或该第二表达阻遏物与该超级增强子或其近侧序列的结合任一者对活力的降低大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过CellTiter Glo所测量的。

369.如实施例329-368中任一项所述的系统，其中该第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的施用导致至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％的靶细胞(例如，癌细胞)凋亡。

370.如实施例329-369所述的系统，其中该多个细胞包括多个癌细胞和多个非癌细胞。

371.如实施例370所述的系统，其中使该多个细胞与该系统或编码该系统的核酸接触对该多个癌细胞的活力的降低大于其对该多个非癌细胞的活力的降低。

372.如实施例370或371所述的系统，其中使该多个细胞与该系统或编码该系统的核酸接触对该多个癌细胞的活力的降低比其对该多个非癌细胞的活力的降低大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x、或100x。

373.如任何前述实施例所述的表达阻遏物或系统，其不使非癌细胞(例如，原代肝细胞)的活力降低超过5％、10％、15％或20％，例如，当根据实例29测定时。

374.如实施例320所述的表达阻遏物或系统，其中在这些细胞与该表达阻遏物或系统接触后72小时测定活力。

375.如实施例374所述的表达阻遏物或系统，其中该测定包括使这些非癌细胞与2.5、2、1.25、1、0.6或0.5μg/ml的该表达阻遏物或系统接触。

376.如实施例352-375中任一项的系统，当与多个感染细胞和多个未感染细胞接触时，该系统对该多个感染细胞的活力的降低多于对该多个未感染细胞的活力的降低，和/或对该多个癌性细胞活力的降低多于对该多个非癌性细胞活力的降低。

377.如实施例352-376中任一项所述的系统，其中该癌症是肝细胞癌(HCC)、纤维板层肝细胞癌(FHCC)、胆管癌、血管肉瘤、继发性肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、大细胞(未分化)癌、三阴性乳腺癌、胃腺癌、子宫内膜癌或胰腺癌。

378.如实施例352-377中任一项所述的系统，其中这些癌细胞是肺癌细胞、胃癌细胞、胃肠癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞或肝癌细胞。

379.如实施例352-378中任一项所述的系统，其中这些细胞是人肺上皮细胞或人肺成纤维细胞

380.如实施例352-379中任一项所述的系统，其中该感染是病毒感染。

381.如实施例380的表达阻遏物，其中该病毒感染是肝炎，例如乙型肝炎。

382.如实施例378-381中任一项所述的系统，其中这些感染细胞是人肝细胞。

383.如实施例352-382中任一项所述的系统，其中该病毒感染是慢性感染。

384.一种融合蛋白，其包含：

第一氨基酸区域，其包含编码如实施例118-383中任一项所述的系统的第一表达阻遏物的序列；以及

第二氨基酸区域，其包含编码如实施例118-383中任一项所述的系统的第二表达阻遏物的序列。

385.如实施例384所述的融合蛋白，其包含第三氨基酸区域，其中该第三氨基酸区域位于该第一氨基酸区域和该第二氨基酸区域之间。

386.如实施例385所述的融合蛋白，其中该第三氨基酸区包含蛋白酶切割肽序列，例如自切割肽序列，例如T2A自切割肽序列，例如根据SEQ ID NO:120的序列。

387.如实施例386所述的融合蛋白，其中该第三氨基酸区包含蛋白酶切割肽序列，例如自切割肽序列，例如串联2A肽序列，例如tPT2A序列，例如根据SEQ ID NO:124的序列。

388.如实施例385所述的融合蛋白，其中该肽序列包含T2A肽序列和P2A肽序列。

389.如实施例384-388中任一项所述的融合蛋白，其中：

该第一表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:30或129的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列；以及

该第二表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:24或142的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

390.如实施例384-388中任一项所述的融合蛋白，其中：

该第二表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:177或183的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

391.如实施例384-388中任一项所述的融合蛋白，其中：

该第二表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:179或185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

392.如实施例384-391中任一项所述的融合蛋白，该融合蛋白包含SEQ ID NO:91、92、121或122的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

393.如实施例384-392中任一项所述的融合蛋白，该融合蛋白包含SEQ ID NO:181、182、187或188的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

394.一种核酸，其编码如实施例118-393中任一项所述的系统的序列。

395.一种核酸，其编码如实施例394所述的系统的序列。

396.如实施例394或395所述的核酸，其包含：

第一区域，其包含编码如实施例118-393中任一项所述的系统的第一表达阻遏物的序列；以及

第二区域，其包含编码如实施例118-393中任一项所述的系统的第二表达阻遏物的序列。

397.如实施例394-396中任一项所述的核酸，其包含第三区域，其中该第三区域位于该第一区域和该第二区域之间。

398.如实施例394-397中任一项所述的核酸，其中该第三区域编码核糖体跳跃序列。

399.如实施例397或398所述的核酸，其中该第三区域编码tPT2A肽序列，例如根据SEQ ID NO:124的序列。

400.如实施例397-399中任一项所述的核酸，其中该第三区域编码蛋白酶切割肽序列，例如，自切割肽序列，例如，T2A自切割肽序列，例如，根据SEQ ID NO:95的序列。

401.如实施例397-400中任一项所述的核酸，其中该第三区域编码蛋白酶切割肽序列，例如，自切割肽序列，例如，串联2A肽序列，例如，tPT2A肽序列，例如，根据SEQ ID NO:124的序列。

402.如实施例394-401中任一项所述的核酸，其中

该第一表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:30、129的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列；以及

该第二表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:24、142的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

403.如实施例394-401中任一项所述的核酸，其中

该第二表达阻遏物包含根据SEQ ID NO:177、179、183或185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

404.如实施例394-403中任一项所述的核酸，其编码SEQ ID NO:91、92、121、122的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

405.如实施例394-404中任一项所述的核酸，其编码SEQ ID NO:181、182、187、188的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

406.如实施例394-405中任一项所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO:93、94、112或113的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

407.如实施例394-406中任一项所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO:196、197的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

408.一种核酸，其包含编码如实施例1-407中任一项所述的表达阻遏物或表达阻遏物系统的序列。

409.如实施例394-408中任一项所述的核酸，其是RNA，例如mRNA。

410.如实施例394-409中任一项所述的核酸，其包含N7-甲基化鸟苷，例如通过反向5′至5′三磷酸键连接至RNA的5′末端的N7-甲基化鸟苷。

411.如实施例394-410中任一项所述的核酸，其包含5’UTR。

412.如实施例394-411中任一项所述的核酸，其包含科扎克序列，例如，在该5’UTR和编码该表达阻遏物的序列之间。

413.一种系统，其包含：

第一核酸，其包含编码如实施例118-393中任一项所述的系统的第一表达阻遏物的序列；以及

第二核酸，其包含编码第二表达阻遏物的序列，例如如实施例118-393中任一项所述的系统的第二表达阻遏物。

414.如实施例413所述的系统，其中该第一核酸具有SEQ ID NO:63、130的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个位置的序列，并且该第二核酸具有SEQ ID NO:57的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个位置的序列。

415.如实施例414所述的系统，其中该第一核酸具有SEQ ID NO:63、130的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个位置的序列，并且该第二核酸具有SEQ ID NO:189或194的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个位置的序列。

416.如实施例415所述的系统，其中该第一核酸具有SEQ ID NO:189、194的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个位置的序列，并且该第二核酸具有SEQ ID NO:63、130的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其差异不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个位置的序列。

417.如实施例394-416中任一项所述的核酸或系统，其中该核酸包含mRNA。

418.一种载体，其包含编码如前述实施例中任一项所述的系统或表达阻遏物的核酸。

419.一种脂质纳米颗粒，其包含如前述实施例中任一项所述的系统、核酸、mRNA或载体。

420.如实施例419所述的脂质纳米颗粒，其包含可电离脂质，例如阳离子脂质，例如MC3、SSOP。

421.如实施例419或420所述的脂质纳米颗粒，其进一步包含一种或多种中性脂质、可电离的含胺脂质、可生物降解的炔烃脂质、类固醇、磷脂、多不饱和脂质、结构脂质(例如甾醇)、PEG、胆固醇或聚合物缀合脂质。

422.一种反应混合物，其包含如前述实施例中任一项所述的系统、核酸、载体或脂质纳米颗粒。

423.如实施例422所述的反应混合物，其进一步包含细胞。

424.一种药物组合物，其包含如任何前述实施例所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或反应混合物。

425.一种降低细胞中MYC基因表达的方法，该方法包括：

使该细胞(例如，癌细胞)与如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、编码所述系统或表达阻遏物的一种或多种核酸、载体、脂质纳米颗粒、或药物组合物接触，

从而降低该细胞中该MYC基因的表达。

426.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：

向该受试者施用如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物，

从而治疗该受试者的该癌症。

427.一种减少有需要的受试者的肿瘤生长的方法，该方法包括：

从而减小该受试者中的肿瘤尺寸。

428.如实施例427所述的方法，其中肿瘤生长的减少包括与治疗开始时的肿瘤体积相比肿瘤体积的减小。

429.如实施例428的方法，其中与未治疗的受试者相比，该受试者中肿瘤生长的减少更大。

430.一种增加或恢复癌症对激酶抑制剂例如索拉非尼的敏感性的方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用本文所述的表达阻遏物或系统。

431.如实施例430所述的方法，其中该表达阻遏物或系统的施用使激酶抑制剂的IC₅₀降低10％、20％、30％或40％，例如在癌细胞活力测定中，例如根据实例38的测定。

432.如实施例430或431的方法，其中该激酶抑制剂抑制VEGFR、PDGFR或RAF激酶中的一种或多种(例如全部)。

433.一种增加或恢复癌症对布罗莫结构域抑制剂例如BET抑制剂例如JQ1的敏感性的方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用本文描述的(例如实施例1-423中任一项所述的)表达阻遏物、系统或核酸，其中任选地该表达阻遏物或系统的施用使该布罗莫结构域抑制剂的IC₅₀降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如在癌细胞活力测定中，例如根据实例39的测定。

434.如实施例433的方法，其中该布罗莫结构域抑制剂是或包含JQ1、BET672或比拉瑞塞(birabresib)。

435.一种增加或恢复癌症对MEK抑制剂(例如，曲美替尼)的敏感性的方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用本文描述的(例如实施例1-423中任一项所述的)表达阻遏物、系统或核酸，其中任选地该表达阻遏物或系统的施用使MEK抑制剂的IC₅₀降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如在癌细胞活力测定中，例如根据实例51的测定。

436.如实施例427-435中任一项所述的方法，其中该受试者中肿瘤生长的减少大于或类似于当用化疗剂或小分子MYC抑制剂治疗受试者时的肿瘤尺寸减小。

437.如实施例436所述的方法，其中该化疗剂是索拉非尼或顺铂。

438.如实施例437所述的方法，其中该小分子MYC抑制剂是MYCi975。

439.一种减小有需要的受试者的肿瘤尺寸的方法，该方法包括：

向该受试者施用1-424所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物，其中肿瘤尺寸的减小大于或类似于当用化疗剂治疗该受试者时的肿瘤尺寸减小。

440.如439所述的方法，其中该化疗剂是索拉非尼或顺铂。

441.前述实施例中任一项所述的方法，其中与用化疗剂或小分子MYC抑制剂治疗时相比，该受试者没有经历任何显著的副作用。

442.如实施例436-441中任一项所述的方法，其中该化疗剂是索拉非尼或顺铂。

443.如实施例442所述的方法，其中该小分子MYC抑制剂是MYCi975。

444.如实施例426-443中任一项所述的方法，其中该癌症是I期、II期、III期或IV期癌症。

445.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该受试者的体重在治疗前和治疗后保持大致相同。

446.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该受试者未经历体重下降，或其中与治疗开始时相比，该受试者经历小于3％、2％或1％的体重下降。

447.如前述实施例中任一项所述的方法，其中与治疗前该受试者的体重相比，该受试者治疗后体重没有减少或增加。

448.一种用于治疗有需要的受试者的肝病的方法，该方法包括：

向该受试者施用表达阻遏物，其中该表达阻遏物包含结合MYC基因座(例如，MYC的转录区、MYC启动子、或包含MYC基因的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列或该锚序列近侧的序列)的靶向部分，和任选的效应子部分，例如本文所述的效应子部分；

从而治疗该受试者的该肝病。

449.如实施例447所述的方法，其进一步包括向该受试者施用第二表达阻遏物，该第二表达阻遏物包含结合包含靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列的靶向部分，和任选的第二效应子部分，例如本文所述的效应子部分；例如，KRAB；

从而治疗该受试者的该肝病。

450.一种用于治疗有需要的受试者的肝病的方法，该方法包括：

从而治疗该受试者的该肝病。

451.如实施例450所述的方法，其中该肝病是慢性肝病。

452.如实施例450或451所述的方法，其中该肝病是病毒或酒精相关的。

453.如实施例450-452中任一项所述的方法，其中该肝病是肝炎或肝细胞癌。

454.如实施例453所述的方法，其中该肝细胞癌选自HCC亚型S1、HCC亚型S2或HCC亚型S3。

455.如实施例453或454所述的方法，其中该肝细胞癌是HCC S1。

456.如实施例453或454所述的方法，其中该肝细胞癌是HCC S2。

457.如实施例450-456中任一项所述的方法，其中该肝病由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒引起。

458.一种用于治疗有需要的受试者的肺病的方法，该方法包括：

从而治疗该受试者的该肺病。

459.如实施例458所述的方法，其进一步包括向该受试者施用第二表达阻遏物，该第二表达阻遏物包含结合位于该靶基因(例如MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座的靶向部分，和任选的第二效应子部分，例如本文所述的效应子部分；例如，KRAB；

从而治疗该受试者的该肺病

460.一种用于治疗有需要的受试者的肺病的方法，该方法包括：

从而治疗该受试者的该肺病。

461.如实施例459或460所述的方法，其中该肺病是癌症，例如肺癌，例如肺肿瘤，例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌。

462.如实施例425-461中任一项所述的方法，其中接触或施用包括对受试者静脉内施用。

463.如实施例425-462中任一项所述的方法，其中接触或施用包括肿瘤内递送(例如，注射)。

464.如实施例425-463中任一项所述的方法，其中该癌症的特征在于相对于参考水平(例如，相对于参考细胞的MYC表达，例如该受试者的在其他方面类似的非癌性细胞)增加的MYC表达。

465.如实施例426-464中任一项所述的方法，其中该癌症的特征在于MYC基因的一部分或全部的重复。

466.如实施例426-465中任一项所述的方法，其中该癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、AML、前列腺癌、神经母细胞瘤、肺癌、子宫内膜癌、肝癌、淋巴瘤(例如，伯基特淋巴瘤)、子宫颈癌或胃癌。

467.如实施例426-466中任一项所述的方法，其中该癌症是分泌人绒毛膜促性腺激素(hCG)的癌症。

468.如实施例426-467中任一项所述的方法，其中该癌症是肝癌。

469.如实施例426-468中任一项所述的方法，其中该癌症是无应答性癌症，例如无应答性肝癌。

470.如实施例426-469中任一项所述的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。

471.如实施例426-470中任一项所述的方法，其中该癌症过表达甲胎蛋白(AFP)(例如，相对于参考细胞的AFP表达，例如，该受试者的在其他方面相似的非癌性细胞)。

472.如实施例431-471中任一项所述的方法，其中该癌症的细胞的特征在于存在超级增强子，该超级增强子例如包含该MYC基因或包含含有该MYC基因的锚序列介导的接合，其中任选地，该癌症选自肝癌、结直肠癌、乳腺癌、AML、前列腺癌、神经母细胞瘤、肺癌或子宫内膜癌。

472.如实施例471所述的方法，其中该表达阻遏物(例如，第二表达阻遏物)结合包含MYC基因的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，或结合该锚序列近侧的序列。

473.如实施例426-472中任一项所述的方法，其中该癌症的细胞的特征在于不存在超级增强子，该超级增强子包含该MYC基因或包含含有该MYC基因的锚序列介导的接合。

474.如实施例473所述的方法，其中该表达阻遏物(例如，第一表达阻遏物)结合该MYC启动子。

475.如实施例426-474中任一项所述的方法，其中该癌症包含含有超级增强子的细胞，该超级增强子包含该MYC基因或包含含有该MYC基因的锚序列介导的接合，以及包含不含有超级增强子的细胞，该超级增强子包含该MYC基因或包含含有该MYC基因的锚序列介导的接合。

476.如实施例426-475中任一项所述的方法，其中该癌症包含特征在于相对于参考水平(例如，相对于参考细胞的MYC表达，例如该受试者的在其他方面类似的非癌性细胞)的MYC表达增加的细胞，以及特征不在于相对于参考水平(例如，相对于参考细胞的MYC表达，例如该受试者的在其他方面类似的非癌性细胞)的MYC表达增加的细胞，例如，具有正常MYC表达的细胞。

477.如实施例426-476中任一项所述的方法，其中该表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物以单一疗法施用。

478.如实施例426-477中任一项所述的方法，其包括向该受试者施用多个剂量，例如至少2、3、4、5或6个剂量的该表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物。

479.如实施例426-479中任一项所述的方法，其包括以5天的间隔向该受试者施用多个剂量的该表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物。

480.如实施例426-479中任一项所述的方法，其包括：

a)首先，向该受试者施用本文所述的(例如，实施例1-424中任一项所述的)表达阻遏物或系统的第一多个剂量，其中任选地，该第一多个剂量中的每个后续剂量在该第一多个剂量中的在先剂量之后5天施用；

b)第二，停止该表达阻遏物或系统一段时间(“药物假期”)，例如约2周，以及

c)第三，向该受试者施用该表达阻遏物或系统的第二多个剂量，其中任选地该第二多个剂量中的后续剂量在该第二多个剂量中的在先剂量之后5天施用。

481.如实施例480所述的方法，其中该第一多个剂量包括4个剂量。

482.如实施例479或480所述的方法，其中该第二多个剂量包括2个剂量。

483.如实施例480-482中任一项所述的方法，其中该受试者在该药物假期期间根本不接受治疗。

484.如实施例480-483中任一项所述的方法，其中该受试者在该药物假期期间接受第二治疗剂。

485.如实施例480-484中任一项所述的方法，其中该药物假期是该第一多个剂量中的剂量施用之间的时间的至少两倍长。

486.如实施例480-486中任一项所述的方法，其中该药物假期是该第二多个剂量中的剂量施用之间的时间的至少两倍长。

487.如实施例426-486中任一项所述的方法，其中在用该表达阻遏物或系统治疗后，该肿瘤的体积下降至不可检测的水平。

488.如实施例426-487中任一项所述的方法，在停止用该表达阻遏物或系统治疗后，肿瘤体积下降(例如，至不可检测的水平)。

489.如实施例425-488中任一项所述的方法，其中该癌症不会对该表达阻遏物或系统产生抗性，或者在10、20、30、40、50或60天的时间内不会对该表达阻遏物或系统产生抗性。

490.如实施例425-489中任一项所述的方法，其中这些癌细胞具有功能性凋亡途径。

491.如实施例425-490中任一项所述的方法，其中这些癌细胞具有功能性胱天蛋白酶3。

492.如实施例491的方法，其中在向该受试者施用该表达阻遏物或系统后，癌细胞中胱天蛋白酶3上调。

493.如实施例425-492中任一项所述的方法，其中在向该受试者施用该表达阻遏物或系统后，癌细胞中的Ki67下调。

494.如实施例425-493中任一项所述的方法，其中在向该受试者施用该表达阻遏物或系统后癌细胞增殖下降。

495.如权利要求425-494中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括

a.将该细胞与第二治疗剂接触或

b.向该受试者施用第二治疗剂。

496.如实施例495所述的方法，其中该第二治疗剂不是与MYC启动子结合的表达阻遏物。

497.如实施例495或496所述的方法，其中该第二治疗剂不是如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、融合蛋白、核酸、载体、反应混合物、药物组合物或脂质纳米颗粒。

498.如实施例494-496中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、融合蛋白、核酸、载体、反应混合物、药物组合物或脂质纳米颗粒。

499.如实施例495-497中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是免疫疗法、免疫检查点和抗血管内皮生长因子疗法之一或两者、全身化疗、酪氨酸激酶抑制剂例如索拉非尼、丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂(MEK抑制剂)例如曲美替尼、或布罗莫结构域抑制剂例如BET抑制剂例如JQ1或比拉瑞塞。

500.如实施例495-499中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂，例如索拉非尼。

501.如实施例495-499中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是布罗莫结构域抑制剂，例如BET抑制剂，例如JQ1、比拉瑞塞或BET 672。

502.如实施例495-499中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂(MEK抑制剂)，例如曲美替尼。

503.如实施例495-502中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括对该受试者实施另外的疗法。

504.如实施例504所述的方法，其中该另外的疗法包括手术切除原位肝移植、射频消融、光动力疗法(PDT)、激光疗法、近距离放射疗法、辐射疗法、经导管动脉化疗或放射栓塞、或立体定向放射疗法。

505.如实施例495-504中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂选自检查点抑制剂或小分子。

506.如实施例495-505中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是化疗剂，例如激酶抑制剂或布罗莫结构域抑制剂，例如BET抑制剂。

507.如实施例505或506的方法，其中该第二治疗剂选自索拉非尼、JQ1、BET672、比拉瑞塞或曲美替尼。

508.如实施例495-506中任一项所述的方法，其中该表达阻遏物、系统或核酸和该第二治疗剂同时施用。

509.如实施例495-508中任一项所述的方法，其中该表达阻遏物、系统或核酸和该第二治疗剂顺序施用。

509.如实施例503-509中任一项所述的方法，其中同时施用该另外的疗法。

511.如实施例503-510中任一项所述的方法，其中顺序施用该另外的疗法。

512.如实施例495-511中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂与如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒、药物组合物或反应混合物同时施用。

513.如实施例495-512中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂与如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、核酸、载体、脂质纳米颗粒、药物组合物或反应混合物连续施用。

514.如实施例495-513中任一项所述的方法，其中静脉内施用该表达阻遏物、系统或核酸，并且口服施用该第二疗法。

515.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该癌症是抗性或难治性癌症。

516.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该癌症对激酶抑制剂有抗性或难治性，该激酶抑制剂是例如抑制VEGFR、PDGFR或RAF激酶中的一种或多种的激酶抑制剂，例如索拉非尼。

517.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该受试者在MYC超级增强子中具有扩增。

518.一种试剂盒，其包含容器以及一套说明书，该容器包含组合物，该组合物包含如实施例1-424中任一项所述的表达阻遏物、系统、编码所述系统或表达阻遏物的一种或多种核酸、载体、脂质纳米颗粒、反应混合物或药物组合物，该说明书包含至少一种用所述组合物调节例如降低细胞内MYC基因表达的方法。

定义

一个/一种(a/an)、该(这些)：如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“该(这些)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

试剂：如本文所用，术语“试剂”可以用于指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖、脂质、小分子、金属、或其组合或复合物。本领域技术人员从上下文中将清楚的是，在一些实施例中，该术语可以用于指是或包含细胞或生物体、或其级分、提取物或组分的实体。可替代地或另外地，如本领域技术人员根据上下文将理解的，在一些实施例中，该术语可以用于指天然产品，因为其在自然界中发现和/或从自然界获得。在一些实施例中，同样如本领域技术人员根据上下文将理解的，该术语可以用于指一种或多种人造的实体，因为其是通过人手的动作设计、工程化和/或生产的和/或不是在自然界中发现的。在一些实施例中，试剂可以以分离的或纯的形式使用；在一些实施例中，试剂可以以粗制形式使用。在一些实施例中，潜在的试剂可以作为集合或文库提供，例如可以对其进行筛选以鉴定或表征其中的活性剂。在一些实施例中，术语“试剂”可以指是或包含聚合物的化合物或实体；在一些实施例中，该术语可以指包含一个或多个聚合部分的化合物或实体。在一些实施例中，术语“试剂”可以指不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物和/或一个或多个特定聚合部分的化合物或实体。在一些实施例中，该术语可以指缺乏或基本上不含任何聚合部分的化合物或实体。

锚序列：如本文所用的术语“锚序列”是指被成核剂识别的核酸序列，其充分结合以形成锚序列介导的接合，例如复合物。在一些实施例中，锚序列包含一个或多个CTCF结合基序。在一些实施例中，锚序列不位于基因编码区内。在一些实施例中，锚序列位于基因间区域内。在一些实施例中，锚序列不位于增强子或启动子内。在一些实施例中，锚序列位于距离任何转录起始位点至少400bp、至少450bp、至少500bp、至少550bp、至少600bp、至少650bp、至少700bp、至少750bp、至少800bp、至少850bp、至少900bp、至少950bp、或至少1kb处。在一些实施例中，锚序列位于与基因组印记、单等位基因表达和/或单等位基因表观遗传标记物无关的区域内。在一些实施例中，锚序列具有一种或多种选自以下的功能：结合内源性成核多肽(例如，CTCF)、与第二种锚序列相互作用以形成锚序列介导的接合，或与锚序列介导的接合之外的增强子隔离。在本披露的一些实施例中，提供了可以特异性靶向一个或多个特定锚序列，而不靶向其他锚序列(例如，在不同上下文中可能含有成核剂(例如，CTCF)结合基序的序列)的技术；此类靶向的锚序列可以被称为“靶锚序列”。在一些实施例中，靶锚序列的序列和/或活性受到调节，而可能存在于与靶向的锚序列相同的系统中(例如，在相同的细胞中和/或在一些实施例中在相同的核酸分子(例如，相同的染色体)上)的一个或多个其他锚序列的序列和/或活性不受调节。在一些实施例中，锚序列包含或者是成核多肽结合基序。在一些实施例中，锚序列邻近成核多肽结合基序。

锚序列介导的接合：如本文所用的术语“锚序列介导的接合”是指一种DNA结构，在一些情况下是一种复合物，其经由通过一种或多种多肽(如成核多肽)或者一种或多种蛋白质和/或核酸实体(如RNA或DNA)(其结合锚序列以实现锚序列之间的空间接近和功能性连接)与DNA中至少两个锚序列的物理相互作用或结合而产生和/或维持(参见，例如图1)。

相关联：如果一个事件或实体的存在、水平、形式和/或功能与另一个事件或实体相关联，则两个事件或实体彼此“相关”,如该术语在本文中所使用的。例如，在一些实施例中，如果特定实体(例如，多肽、遗传特征、代谢物、微生物等)的存在、水平、形式和/或功能与疾病、障碍或病症的发病率和/或易感性相关(例如，在相关群体中)，则其被认为与特定疾病、障碍或病症相关联。在一些实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使得它们在物理上彼此接近和/或保持在物理上彼此接近，则它们在物理上彼此“相关联”。在一些实施例中，在物理上彼此相关联的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施例中，在物理上彼此相关联的两个或更多个实体不是彼此共价连接，而是非共价结合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性、及其组合。在一些实施例中，当核酸至少部分位于靶基因组或转录复合物内，并且DNA序列中基因的表达受到靶基因组或转录复合物的形成或破坏的影响时，DNA序列与靶基因组或转录复合物“相关联”。

结构域：如本文所用，术语“结构域”是指实体的区段或部分。在一些实施例中，“结构域”与实体的特定结构和/或功能特征相关联，使得当该结构域与其父实体的其余部分物理分离时，它基本上或完全保留该特定结构和/或功能特征。可替代地或另外地，在一些实施例中，结构域可以是或包括实体的一部分，该实体在与该(父)实体分离并与不同的(接收)实体连接时，基本上保留和/或赋予接收实体一个或多个在父实体中表征它的结构和/或功能特征。在一些实施例中，结构域是或包含分子(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸、多肽等)的区段或部分。在一些实施例中，结构域是或包含多肽的区段。在一些此类实施例中，结构域的特征在于特定的结构元件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特征、β-折叠特征、螺旋卷曲特征、随机卷曲特征等)，和/或特定的功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号活性等)。

效应子部分：如本文所用，术语“效应子部分”是指当定位于细胞核中的适当位点时，能够改变靶基因表达的结构域。在一些实施例中，效应子部分募集转录机制的组分。在一些实施例中，效应子部分抑制转录因子或表达抑制因子的组分的募集。在一些实施例中，效应子部分包含表观遗传修饰部分(例如，表观遗传修饰靶DNA序列)。

表观遗传修饰部分：如本文所用，“表观遗传修饰部分”是指改变以下的结构域：i)染色质的结构，例如二维结构；和/或ii)表观遗传标志物(例如，DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白苏素化(sumoylation)、组蛋白磷酸化和RNA相关沉默中的一种或多种)，此时表观遗传修饰部分被适当地定位于核酸(例如，通过靶向部分)。在一些实施例中，表观遗传修饰部分包含影响一种或多种表观遗传标志物(例如，增加或降低其水平)的酶或其功能片段或变体。在一些实施例中，表观遗传修饰部分包含DNA甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、CREB结合蛋白(CBP)、或其任一项的功能片段。

表达控制序列：如本文所用的术语“表达控制序列”是指增加或减少基因转录的核酸序列，并且包括(但不限于)启动子和增强子。“增强序列”是指表达控制序列的一个亚型，并且增加了基因转录的可能性。“沉默或阻遏序列”是指表达控制序列的一个亚型，并且降低了基因转录的可能性。

表达阻遏物：如本文所用，术语“表达阻遏物”是指具有一种或多种功能性的药剂或实体，其降低细胞中靶基因的表达并特异性结合DNA序列(例如，与靶基因相关的DNA序列，或可操作地连接至靶基因的转录控制元件)。表达阻遏物包含至少一个靶向部分和任选的一个效应子部分。

表达阻遏系统：如本文所用，术语“表达阻遏系统”指降低细胞中靶基因表达的多个表达阻遏物。在一些实施例中，表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物和第二表达阻遏物(或编码第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的核酸)一起存在于单一组合物中，混合物或药物组合物中。在一些实施例中，表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物和第二表达阻遏物(或编码第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的核酸)存在于分开的组合物或药物组合物中。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物同时存在于同一细胞中。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物不同时存在于同一细胞中，例如，它们顺序地存在。例如，第一表达阻遏物可以在细胞中存在第一时间段，然后第二表达阻遏物可以在细胞中存在第二时间段，其中第一和第二时间段可以重叠或不重叠。

融合分子：如本文所用，术语“融合分子”是指包含共价连接的两个或更多个部分(例如，靶向部分和效应子部分)的化合物。融合分子及其部分可以包含多肽、核酸、聚糖、小分子或本文所述的其他组分的任何组合(例如，靶向部分可以包含核酸并且效应子部分可以包含多肽)。在一些实施例中，融合分子是融合蛋白，例如，包含一个或多个经由肽键共价连接的多肽结构域。在一些实施例中，融合分子是包含通过共价键而非肽键或磷酸二酯键连接的靶向部分和效应子部分(例如，包含核酸的靶向部分和包含通过共价键而非肽键或磷酸二酯键连接的多肽的效应子部分)的缀合分子。在一些实施例中，表达阻遏物是或包含融合分子。

基因组复合物：如本文所用，术语“基因组复合物”是经由多个蛋白质和/或其他组分(可能包括基因组序列元件)之间和其中的相互作用，将在一条或多条染色体上彼此隔开的两个基因组序列元件聚集在一起的复合物。在一些实施例中，基因组序列元件是锚序列，复合物的一种或多种蛋白质组分与之结合。在一些实施例中，基因组复合物可以包含锚序列介导的接合。在一些实施例中，基因组序列元件可以是或包含CTCF结合基序、启动子和/或增强子。在一些实施例中，基因组序列元件包括启动子和/或调节位点(例如，增强子)中的至少一者或二者。在一些实施例中，复合物形成在一个或多个基因组序列元件处成核和/或通过一种或多种蛋白质组分与一个或多个基因组序列元件的结合而成核。如本领域技术人员将理解的，在一些实施例中，经由形成复合物进行的基因组位点的共定位(例如，结合)改变了一个或多个基因组序列元件处或附近(在一些实施例中，包括它们之间)的DNA拓扑结构。在一些实施例中，基因组复合物包含锚序列介导的接合，其包含一个或多个环。在一些实施例中，如本文所述的基因组复合物由成核多肽(例如像CTCF和/或黏连蛋白)成核。在一些实施例中，如本文所述的基因组复合物可以包含例如CTCF、黏连蛋白(Cohesin)、非编码RNA(例如，eRNA)、转录机器蛋白(例如，RNA聚合酶、一个或多个转录因子，例如选自由TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH等组成的组)、转录调节因子(例如，中介体(Mediator)、P300、增强子结合蛋白、阻遏物结合蛋白、组蛋白修饰剂等)等。在一些实施例中，如本文所述的基因组复合物包含一个或多个多肽组分和/或一个或多个核酸组分(例如，一个或多个RNA组分)，在一些实施例中，它们可以彼此相互作用和/或与一个或多个基因组序列元件(例如，锚序列、启动子序列、调节序列(例如，增强子序列))相互作用，以便将一段基因组DNA限制到拓扑结构(例如，环)中，当复合物没有形成时，不会采用这种拓扑结构。

部分：如本文所用，术语“部分”是指具有特定结构和/或活性的定义的化学基团或实体，如本文所述。

调节剂：如本文所用，术语“调节剂”是指包含一个或多个靶向部分和一个或多个效应子部分的试剂，这些效应子部分能够改变(例如，增加或减少)靶基因(例如，MYC)的表达。

MYC：如本文所用，术语“MYC基因座”指编码MYC多肽(例如，NCBI登录号NP002458.2中披露的多肽或其突变体)、可操作地连接至MYC的启动子(“MYC启动子”)以及形成包含MYC基因的ASMC的锚序列的人基因组部分。在一些实施例中，MYC基因座编码具有NCBI登录号NM_002467的核酸。在一些实施例中，MYC基因是原癌基因，并且在一些实施例中，MYC基因是癌基因。在某些情况下，MYC基因位于8号染色体8q24.21上。在某些情况下，MYC基因在距pter的128,816,862bp处开始并且在距pter的128,822,856bp处结束。在某些情况下，MYC基因约为6kb。在某些情况下，MYC基因编码至少八个独立的mRNA序列—5个选择性剪接变体和3个非剪接变体。

核酸：如本文所用，在其最广义上，术语“核酸”是指被并入或可并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键被掺入或可以被掺入寡核苷酸链的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施例中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基或由其组成。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种核酸类似物或由其组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种“肽核酸”或由其组成，这些肽核酸是本领域已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本披露的范围内。可替代地或另外地，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由其组成。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基、及其组合)或由其组成。在一些实施例中，与天然核酸中的相比，核酸包含一种或多种修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能基因产物(如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，通过从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合的酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制以及化学合成中的一种或多种来制备核酸。在一些实施例中，核酸长度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中，核酸部分或全部是单链的；在一些实施例中，核酸部分或全部是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个编码多肽的元件或者是编码多肽的序列的互补序列的核苷酸序列。在一个实施例中，核酸具有酶活性。

成核多肽：如本文所用，如本文所用的术语“成核多肽”或“结合成核多肽”是指直接或间接与锚序列相关联的蛋白质，并且可以与一种或多种结合成核多肽(其可以与锚序列或其他核酸相互作用)相互作用，以形成由两种或更多种这样的结合成核多肽(其可以彼此相同或不同)组成的二聚体(或更高级结构)。当与不同锚序列相关联的结合成核多肽相互关联，使得不同锚序列保持彼此物理接近时，由此产生的结构是锚序列介导的结合。也就是说，成核多肽-锚序列与另一个成核多肽-锚序列相互作用的紧密物理接近产生锚序列介导的结合(例如，在一些情况下，DNA环)，其在锚序列处开始和结束。如阅读本说明书的本领域技术人员将立即理解的，术语如“成核多肽”、“成核分子”、“成核蛋白质”、“结合成核蛋白质”，有时可以用于指结合成核多肽。如阅读本说明书的本领域技术人员同样将立即理解的，两种或更多种结合成核多肽的组装集合(在一些实施例中，其可以包括相同试剂的多个拷贝和/或在一些实施例中，多种不同试剂中的一种或多种)可以被称为“复合物”、“二聚体”、“多聚体”等。

可操作地连接：如本文所用，短语“可操作地连接”是指一种并列关系，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与功能元件(例如，基因)“可操作地连接”的转录控制元件以这样的方式关联：在与转录控制元件相容的条件下实现功能元件(例如，基因)的表达和/或活性。在一些实施例中，“可操作地连接的”转录控制元件与感兴趣的编码元件(例如，基因)是连续的(例如，共价连接)；在一些实施例中，可操作地连接的转录控制元件反式作用于感兴趣的功能元件(例如，基因)或以其他方式在距其一定距离处起作用。在一些实施例中，可操作地连接意味着两个核酸序列包含在同一核酸分子上。在另一个实施例中，可操作地连接可以进一步意指两个核酸序列在同一核酸分子上彼此接近，例如，彼此在1000、500、100、50或10个碱基对内或彼此直接邻近。

肽、多肽、蛋白质：如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指由通过肽键或通过除了肽键之外的方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含两个或更多个通过肽键或通过除了肽键之外的方式相互连接的氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链和长链二者，该短链在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体，并且该长链在本领域中通常称为蛋白质，这些蛋白质具有许多类型。

药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性剂(例如调节剂，例如破坏剂)。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当施用至相关群体时，该治疗方案显示出实现预定治疗效果的统计学显著概率。在一些实施例中，药物组合物可以特别配制成以固体或液体形式施用，包括适用于以下情况的那些：口服施用，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂，例如用于口腔、舌下和全身吸收的那些片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、用于舌头的糊剂；胃肠外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液，或持续释放配制品；局部施用，例如，作为乳膏、软膏或控释贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓、乳膏或泡沫；舌下含服；眼部；透皮；或鼻、肺和/或至其他粘膜表面。

近侧：如本文所用，“近侧”是指两个位点(例如，核酸位点)的接近，使得表达阻遏物在第一位点处的结合和/或表达阻遏物对第一位点的修饰将产生与另一个位点的结合和/或修饰相同或基本上相同的效果。例如，靶向部分可以与增强子(第二位点)近侧的第一位点结合，并且与所述靶向部分相关联的效应子部分可以表观遗传修饰第一位点，使得增强子对靶基因表达的影响被修饰，基本上与第二位点(增强子序列)被结合和/或修饰的情况相同。在一些实施例中，靶基因(例如，靶基因内的外显子、内含子或剪接位点)近侧、与靶基因可操作地连接的转录控制元件近侧、或锚序列近侧的位点距靶基因(例如，靶基因内的外显子、内含子或剪接位点)、转录控制元件、或锚序列少于5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50或25个碱基对(并且任选地，距靶基因(例如，靶基因内的外显子、内含子或剪接位点)、转录控制元件、或锚序列至少20、25、50、100、200或300个碱基对)。

特异性：如本文所用，术语“特异性”是指具有活性的试剂，被本领域技术人员理解为意指该试剂区分潜在的靶实体或状态。例如，在一些实施例中，如果在一种或多种竞争性替代靶标存在下，试剂优先与其靶标结合，则该试剂被称为与该靶标“特异性”结合。在一些实施例中，特异性相互作用取决于靶实体(例如，表位、裂缝、结合位点)的特定结构特征的存在。应理解，特异性不必是绝对的。在一些实施例中，可以相对于结合剂对一个或多个其他潜在靶实体(例如，竞争者)的特异性来评估特异性。在一些实施例中，相对于参考特异性结合剂的特异性来评估特异性。在一些实施例中，相对于参考非特异性结合剂的特异性来评估特异性。在一些实施例中，在与其靶实体结合的条件下，试剂或实体不可检测地与竞争性替代靶标结合。在一些实施例中，与一个或多个竞争性替代靶标相比，结合剂以更高的开启速率、更低的解离速率、增加的亲和力、减少的解离和/或增加的稳定性与其靶实体结合。

特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”是指在结合发生的环境中区分可能的结合配偶体的能力。在一些实施例中，当其他潜在靶标存在时与一个特定靶标相互作用的结合剂被称为“特异性结合”至与其相互作用的靶标。在一些实施例中，特异性结合通过检测或确定结合剂与其配偶体之间的结合程度来评估；在一些实施例中，特异性结合通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估。在一些实施例中，特异性结合通过检测或确定结合剂与其配偶体和另一实体之间的选择性相互作用竞争的能力来评估。在一些实施例中，特异性结合是通过在一定浓度范围内进行此类检测或确定来评估的。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行到完全或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”可以用于本文的一些实施例中，以捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在不完整性。

症状减轻：如本文所用，当特定疾病、障碍或病症的一种或多种症状的程度(例如，强度、严重性等)和/或频率降低时，可以使用短语“症状减轻”。在一些实施例中，延迟特定症状的发作被认为是降低该症状频率的一种形式。

靶标：根据本披露，如果一种试剂或实体在它们彼此接触的条件下与靶向的试剂或实体特异性结合，则认为该试剂或实体“靶向”另一种试剂或实体。例如，在一些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)靶向其同源表位或抗原。在一些实施例中，具有特定序列的核酸靶向基本上互补序列的核酸。

靶基因：如本文所用，术语“靶基因”意指被靶向用于调节例如表达的基因。在一些实施例中，靶基因是靶向的基因组复合物的一部分(例如，其基因组序列的至少一部分作为靶基因组复合物的一部分的基因，例如在锚序列介导的结合内)，该基因组复合物被一种或多种如本文所述的调节剂靶向。在一些实施例中，调节包括抑制靶基因的表达。在一些实施例中，通过将靶基因或可操作地连接至靶基因上的转录控制元件与本文所述的表达阻遏系统(例如表达阻遏物)接触来调节靶基因。在一些实施例中，靶基因在细胞(例如，受试者(例如，患者)中的细胞)中异常表达(例如，过表达)。

靶向部分：如本文所用，术语“靶向部分”意指特异性靶向(例如，结合)基因组序列元件(例如，表达控制序列或锚序列)的试剂或实体。在一些实施例中，基因组序列元件邻近和/或可操作地连接至靶基因(例如，MYC)。

治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用至受试者时，具有治疗效果和/或引起所期望的生物学和/或药理学效果的试剂。在一些实施例中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的任何物质。在一些实施例中，治疗剂包含本文所述的表达阻遏系统，例如表达阻遏物。在一些实施例中，治疗剂包含编码本文所述的表达阻遏系统例如表达阻遏物的核酸。在一些实施例中，治疗剂包含本文所述的药物组合物。

治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时，引起所期望生物应答的物质(例如，治疗剂、组合物和/或配制品)的量。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当施用至患有或易患疾病、障碍和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防疾病、障碍和/或病症和/或延迟其发作的量。如本领域的普通技术人员将理解，物质的有效量可取决于以下这类因素变化：如一个或多个所希望的生物学终点、待递送的物质、一个或多个靶细胞或一个或多个组织等。例如，在一些实施例中，用于治疗疾病、障碍和/或病症的配制品中化合物的有效量是缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发病率的量。在一些实施例中，治疗有效量以单个剂量施用；在一些实施例中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。

附图说明

当结合附图阅读时，将会更好地理解以下对本披露实施例的详细描述。出于图解说明本披露的目的，在附图中显示了目前示例的实施例。然而，应理解，本披露不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。

图1A描绘了基于使用与DNA甲基转移酶融合的DBD对MYC启动子进行持久阻断以及使用DBD或与短期效应子融合的DBD对CTCF/TF位点进行瞬时(48/72小时)阻断的双靶标方法的示意图。

图1B描绘了MYC基因的靶位点(CTCF和启动子)的指导RNA定位和染色质背景。从上到下，图代表HepG2细胞中MYC基因座的H3K4me3(组蛋白H3 Ky三甲基化)水平；H3K9me3(组蛋白H3 K9三甲基化)水平(重复1)；H3K9me3(组蛋白H3 K9三甲基化)水平(重复2)；H3K27me3(组蛋白H3 K27三甲基化)水平；H3K27ac(组蛋白H3 K27乙酰化)水平；GROseq_fwdStrand水平(转录活性RNA pol II在正向链上的结合)；GROseq_revStrand水平(转录活性RNA pol II在反向链上的结合)；RNAseq_rep2水平(使用RNAseq测量的MYC转录物水平，重复2)；通过WGBS(全基因组亚硫酸氢盐测序)测量的DNA甲基化水平和CTCF结合水平。四个gRNA的位置用箭头表示。gRNA GD-28859、gRNA GD-28616、gRNA GD-28862靶向MYC上游锚定位点或其附近，gRNA GD-28617靶向MYC启动子。在本披露中，GD-28859也称为GD-59；GD-28616也称为GD-16；GD-28862也称为GD-62；GD-28617也称为GD-17。

图1C显示示例性双顺反子构建体的示意图。该构建体的5'末端具有由通过反向5'至5'三磷酸键连接到mRNA的第一个核苷酸的N7-甲基化鸟苷定义的帽结构。在一些实施例中，帽结构促进蛋白质翻译和稳定性。帽结构的下游是非翻译区(5’UTR)，旨在促进高水平的蛋白质翻译，随后是核糖体识别的规范“科扎克”序列以开始蛋白质翻译。“科扎克”序列之后是CDS，其是单个连续序列，包含由tPT2A“核糖体跳跃”序列(接头)分隔的第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一靶向部分和第一效应子部分，该第二表达阻遏物包含第二靶向部分和第二效应子部分。不希望受理论束缚，当核糖体到达tPT2A接头时，它开始将接头翻译成氨基酸。从P2A接头产生的前18个氨基酸保留在第一表达阻遏物(例如，包含ZF DBD和MQ1)的C末端，然后核糖体将其释放。然后核糖体继续前进，直到到达T2A接头，T2A接头的前17个残基被翻译并释放。接下来，翻译第二多肽，其包含单个氨基酸，然后是第二表达阻遏物的开始部分(例如，包含第二ZF DBD和KRAB)。CDS之后是3’UTR，旨在帮助高水平翻译并稳定mRNA。最后，mRNA的3’末端是聚A尾。在一些实施例中，聚A尾促进蛋白质翻译和mRNA稳定性。

图2A显示CTCF基序的Cas9核酸酶编辑导致MYC表达下调。使用Cas9(与GD-28616组合)破坏CTCF基序导致所有三个HCC细胞系(HepG2、Hep3B和SKHEP1)中MYC表达下调32％-39％。CTCF基序(GD-28859)邻近区域的破坏将三个细胞系中的两个(HepG2和Hep3B)中的MYC表达调节35％-45％。

图2B显示通过AmpSeq评估的编辑效率证实了所有细胞系的77％-100％编辑。

图3显示dCas9-KRAB在针对启动子或相关CTCF基序时下调MYC表达。LNP介导的dCas9-KRAB/GD-28616转染在Hep3B和SKHEP1中的48/72小时时间点将MYC表达下调11％-34％。在所有3个HCC模型中，LNP介导的dCas9-KRAB/GD-28859转染在48/72小时时间点将MYC表达下调18％-44％。在所有3个HCC模型中，通过dCas9-KRAB/GD-28617将dCas9-KRAB引导至MYC启动子，在48/72小时时间点将MYC表达下调24％-58％。

图4A描绘了与CTCF基序相关联的启动子处的sgRNA定位和锌指设计。该图披露了SEQ ID NO:208。

图4B显示针对与CTCF相关联的启动子的ZF-KRAB构建体在Hep3B中影响MYC下调。在Hep3B细胞中，ZF2-KRAB、ZF3-KRAB和ZF4-KRAB下调MYC的程度与dCas9-KRAB/GD-28859相当或更大，其中ZF3-KRAB的下调作用最强。

图4C显示ZF3-No效应子和ZF3-KRAB在多种人HCC模型(HepG2、Hep3B和SKHEP1)中下调MYC表达。在其他两种HCC模型HepG2和SKHEP1中，ZF3-KRAB也显示出下调MYC的程度与ZF3-无效应子和ZF5-无效应子相当或更大。

图4D显示ZF3-No效应子和ZF3-KRAB在不同时间点(24小时、72小时和120小时)对Hep3B细胞中的MYC表达和活力表现出相当的效果。

图5显示，在多种HCC模型(HepG2、Hep3B和SKHEP1)中，dCas9-MQ1在针对MYC启动子时下调MYC表达。

图6A描绘了MYC启动子处的sgRNA定位和锌指设计。该图披露了SEQ ID NO:209。

图6B描绘了针对MYC启动子的6个ZF-MQ1构建体，其被筛选以检测对Hep3B中MYC下调的影响。ZF8-MQ1、ZF9-MQ1和ZF11-MQ1在Hep3B细胞中最大程度地下调MYC，其中ZF9-KRABMQ1的下调作用最强。

图7A显示，与ZF12-MQ1相比，ZF9-MQ1显著下调MYC表达并降低Hep3B中的活力。

图7B显示，与ZF12-MQ1相比，ZF9-MQ1显著下调MYC表达并降低HepG2中的活力。

图7C显示，与ZF12-MQ1相比，ZF9-MQ1显著下调MYC表达并降低SKHEP1中的活力。

图7D显示，与ZF8-MQ1相比，ZF9-MQ1在下调Hep3B中的MYC表达和降低活力方面更有效。

图7E显示，与ZF8-MQ1相比，ZF9-MQ1在下调HepG2中的MYC表达和降低活力方面更有效。

图7F显示，与ZF8-MQ1相比，ZF9-MQ1在下调SKHEP1中的MYC表达和降低活力方面更有效。

图7G显示，与dCas9-MQ1/GD17相比，ZF9-MQ1显著下调MYC表达并降低Hep3B中的活力。

图7H显示，与dCas9-MQ1/GD17相比，ZF9-MQ1显著下调MYC表达并降低HepG2中的活力。

图7I显示，与dCas9-MQ1/GD17相比，ZF9-MQ1显著下调MYC表达并降低SKHEP1中的活力。

图8A显示dCas9-MQ1使三个细胞系(Hep3B、HepG2和SKHEP1)的mRNA在72小时减少50％-90％。

图8B显示MYC下调在72小时和168小时显著降低HepG2和Hep3B的活力，尽管SK-HEP-1活力受MYC下调的影响最小。

图8C显示在第7天和第11天，MYC mRNA分别减少约70％和约55％。直到第15天，转录物仍维持约40％的下调。

图8D显示，用dCas9-MQ1/GD-28617处理将从头甲基化引导至目标区域，并且这些转录变化与目标区域中CpG甲基化的百分比紧密相关，并证实甲基化持续直至第15天。

图9显示用dCas9-MQ1/GD-17治疗抑制体内肿瘤生长。

图10显示dCas9-MQ1/GD-17在人肝细胞中乙型肝炎感染的情况下下调MYC。

图11显示，将与锌指结构域融合的KRAB效应子(或无效应子或NE)靶向与CTCF基序直接相邻的上游区域(ZF3-NE或ZF3-KRAB)，并将与锌指结构域融合的MQ1效应子靶向MYC启动子(ZF9-MQ1)下调MYC1mRNA表达。

图12显示ZF3-KRAB加ZF9-MQ1比单独的ZF9-MQ1或ZF3-NE加ZF9-MQ1组合更大程度地下调MYC。

图13A显示设计用于结合并靶向MYC启动子的ZF9-MQ1以多个浓度给药于五个HCC细胞系Hep3B、HepG2、SKHEP1、SNU-182和SNU-449中。

图13B-F显示，ZF9-MQ1在所有测试的五种HCC细胞系中下调MYC表达并降低活力，并且在HepG2细胞系中ZF9-MQ1下调MYC表达的中值EC50为0.028ug/ml LNP/mRNA，对体外72小时活力的影响的中值EC50(0.13ug/ml)高约10倍。

图14显示，与PBS对照治疗的小鼠相比，ZF9-MQ1能够显著减少肿瘤生长(从第6天开始)，并且ZF9-MQ1比小分子比较物(MYCi975)更多地减少肿瘤生长(A)。与PBS或MYCi975相比，ZF9-MQ1对动物总体重量的影响最小(B)。

图15A显示，以1.5mg/kg每5天一次进行2个剂量、以3mg/kg每5天一次进行3个剂量、以3mg/kg每3天一次进行1个剂量的ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的组合以与索拉非尼相当的水平减少肿瘤生长。

图15B显示，与用索拉非尼治疗时对动物总体重量的影响相比，用ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的组合治疗对动物总体重量的影响最小。

图16A显示，与阴性对照治疗的小鼠相比，1mg/kg的ZF9-MQ1(从第13天开始)以及ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的共配制品(从第6天开始)能够显著减少肿瘤生长。

图16B显示，与阴性对照治疗的小鼠相比，单独的ZF9-MQ1以及3mg/kg的ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的共配制品能够减少肿瘤生长。

图16C显示，在1mg/kg和3mg/kg剂量下，ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的共配制品能够以与顺铂或小分子比较物(MYCi975)相似或更高的水平减少肿瘤生长。

图16D显示，与用顺铂或MYCi975治疗时对动物总体重量的影响相比，用1mg/kg和3mg/kg剂量的ZF9-MQ1和ZF3-KRAB共配制品的治疗对动物总体重量的影响最小。

图17A显示ZF9-MQ1在处理后120小时将A549细胞系中的MYC mRNA水平降低超过80％。

图17B显示ZF9-MQ1在处理后120小时将NCI-H2009细胞系中的MYC mRNA水平降低超过80％。

图17C显示ZF9-MQ1在处理后120小时将NCI-H358细胞系中的MYC mRNA水平降低超过80％。

图17D显示ZF9-MQ1在处理后72小时将HCC95细胞系中的MYC mRNA水平降低超过80％。

图17E显示ZF9-MQ1在处理后120小时引起A549细胞系中细胞活力的丧失。

图17F显示ZF9-MQ1在处理后120小时引起NCI-H2009细胞系中细胞活力的丧失。

图17G显示ZF9-MQ1在处理后120小时引起NCI-H358细胞系中细胞活力的丧失。

图17H显示ZF9-MQ1在处理后72小时引起HCC95细胞系中细胞活力的丧失。

图18A显示处理后96小时，未处理的细胞群中约17.5％的细胞凋亡。

图18B显示处理后96小时，用ZF9-NE处理的细胞群中约18％的细胞凋亡。

图18C显示处理后96小时，用ZF9-MQ1处理的细胞群中约38.9％的细胞凋亡。

图18D显示，处理后96小时，用ZF9-MQ1处理的细胞群中约38.9％的细胞凋亡，相比之下未处理的细胞和ZF9-NE处理的细胞群中约18％的细胞凋亡，这表明ZF9-MQ1能够诱导肺癌细胞的细胞凋亡。

图19A和B显示在这些A549(图19A)和HCC95(图19B)细胞系中，在体外在72小时，ZF9-MQ1下调的MYC，具有0.08ug/ml LNP/mRNA的EC50，对活力(2ug/ml)的EC50效应高约25倍。

图20A和B显示ZF9-MQ1处理在肺癌细胞系中在处理后96小时使MYC蛋白水平降低超过80％。

图21显示，与PBS对照处理的小鼠相比，ZF9-MQ1能够显著减少肿瘤生长(从第8天开始)。还观察到ZF9-MQ1对动物总体重量的影响最小。

图22显示，当使用利用具有SSOP的LNP递送与dCAS9-KRAB效应子mRNA一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以有效地下调MYC mRNA水平，突出了使用该远端调节元件减少致癌MYC的能力。

图23显示，当使用具有MC3的LNP递送与dCAS9-KRAB效应子mRNA一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以有效地下调MYC mRNA水平，突出了使用该远端调节元件减少致癌MYC的能力。

图24A显示，在A549细胞系中当与所有3种效应蛋白(EZH2、EZH2-KRAB和MQ1)一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以有效下调MYC mRNA水平。

图24B显示，在NCI-H2009细胞系中当与所有3种效应蛋白(EZH2、EZH2-KRAB和MQ1)一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以有效下调MYC mRNA水平。

图25A显示与KRAB或MQ1一起递送的指导RNA GD-29833和29914可以在处理后120小时显著下调A549细胞系中的MYC mRNA水平。

图25B显示与KRAB或MQ1一起递送的指导RNA GD-29833和29914可以在处理后120小时显著下调NCI-H2009细胞系中的MYC mRNA水平，并且该下调与ZF9-MQ1处理后观察到的下调相当。

图26A显示dCas9-MQ1将NSCLC中的靶位点甲基化增加至约60％。

图26B显示dCas9-MQ1将甲基化引导至远端启动子区域(增加至约50％)。

图27A-B显示，在NCI-H2009肺癌细胞系中，引导指导物至MYC肺超级增强子连同转录阻遏物在96小时时降低MYC蛋白水平。

图28A显示用ZF9-MQ1处理Hep3B细胞后，全细胞裂解物中ZF9-MQ1蛋白的存在逐渐减少。

图28B显示用ZF9-MQ1处理Hep3B细胞后全细胞裂解物中的MYC蛋白表达逐渐下调。

图28C显示全细胞裂解物中ZF9-MQ1蛋白的存在与用ZF9-MQ1处理Hep3B细胞后MYC蛋白的下调相关。

图29A显示了在用ZF9-MQ1处理后SK-HEP细胞系中直至第15天的几个时间点上mRNA表达的下调，其中MYC转录物下调45％。

图29B显示直至第15天MYC转录变化与甲基化百分比相关。

图30A显示，与单独的GFP、ZF-NE或ZF3-KRAB相比，用浓度为0.6μg/ml、1.25μg/ml和2.5μg/ml的ZF9-MQ1、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB或双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理的原代肝细胞显示出MYC mRNA表达的下降。

图30B显示用浓度0.6μg/ml、1.25μg/ml和2.5μg/ml的ZF9-MQ1、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB或双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理对原代肝细胞的活力具有最小影响，证明与HCC细胞系相比，MYC表达的降低对正常细胞影响较小。

图30C显示，与单独的GFP、ZF-NE或ZF3-KRAB相比，用浓度为0.5μg/ml、1.0μg/ml和2.0μg/ml的ZF9-MQ1、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB或双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理的原代肝细胞显示出MYC mRNA表达的下降。

图30D显示用浓度0.5μg/ml、1.0μg/ml和2.0μg/ml的ZF9-MQ1、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB或双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理对原代肝细胞的活力具有最小影响，证明与HCC细胞系相比，MYC表达的降低对正常细胞影响较小。

图31A显示，用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理显示在三次施用后肿瘤尺寸统计上显著减小，导致第25天时肿瘤体积与对照相比降低63％，并且ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理与用顺铂处理对肿瘤体积的等效效果相关。

图31B显示用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB治疗的小鼠没有经历体重的显著下降。

图32A显示，用1.5mg/kg的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB治疗与两次施用后肿瘤尺寸统计上显著的减小相关，导致与阴性对照相比，到第23天肿瘤生长被抑制63％。3mg/kg的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB与两次施用后肿瘤尺寸的统计学上显著的减小相关联，与阴性对照相比，导致到第23天肿瘤生长抑制54％，并且用6mg/kg剂量的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理与两次施用后肿瘤尺寸的统计学上显著的减小相关联，与阴性对照相比，导致第23天时肿瘤体积减小了63％。

图32B显示用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB治疗的小鼠没有经历体重的显著下降。用索拉非尼治疗的小鼠最初体重下降，随后总体体重增加，可能是由于肿瘤质量的增加。

图33A显示双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在Hep 3B细胞中以0.6μg/ml和2.0μg/ml的浓度比单独的单一构建体(ZF3-KRAB或ZF9-MQ1)更大程度地下调MYC mRNA表达。双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在0.6μg/ml和2μg/ml浓度下在48小时将总MYC mRNA水平降低了99％。

图33B显示双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB比单独的单一构建体(ZF3-KRAB或ZF9-MQ1)更大程度地下调Hep 3B细胞中的细胞活力。双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在0.6μg/ml和2μg/ml浓度下分别使Hep3B细胞的活力降低约80％和27％。

图34A显示双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB以剂量依赖性方式下调Hep3B细胞中的MYC mRNA和细胞活力。

图34B显示双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB以剂量依赖性方式下调HepG2细胞中的MYC mRNA和细胞活力。

图34C显示双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB以剂量依赖性方式下调SKHEP1细胞中的MYC mRNA和细胞活力。

图34D显示双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对于HCC S1和S2亚型均有效。

图35显示在用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理48小时时，在Hep3B和Hep G2细胞系中检测到>75％的凋亡细胞，并且在SK-HEP-1细胞系中检测到约15％的凋亡细胞。与未处理的细胞相比(5-20％背景凋亡)，细胞不受非编码mRNA对照的影响。

图36显示，在SKHEP1细胞中，用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB构建体处理1次后，MYCmRNA水平在第一天降低，并且在处理后保持抑制直至十五天。

图37显示，与Hep3B和SKHEP1细胞系中的短非编码mRNA或未处理的细胞相比，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理在6小时时降低了MYC mRNA和蛋白质表达，其在96小时后仍保持降低。

图38显示在转染后6小时和24小时时间点，由双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB mRNA编码的OEC ZF3-KRAB和ZF9-MQ1蛋白均通过HA标签在蛋白质印迹上可视化。

图39A显示当索拉非尼与0.6μg/ml双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB组合施用时，索拉非尼在SKHEP1中的IC₅₀从12.3μM降低至10.7μM。当索拉非尼与0.1μg/ml双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB组合施用时，索拉非尼在SKHEP1细胞中的IC₅₀没有显著变化。

图39B显示当索拉非尼与0.6μg/ml双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB组合施用时，索拉非尼在Hep 3B中的IC₅₀从4.4μM降低至2.9μM。当索拉非尼与0.1μg/ml双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB组合施用时，索拉非尼在Hep3B细胞中的IC₅₀没有显著变化。

图40A显示，当分别用浓度0.6μg/ml和0.1μg/ml的双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理时，SKHEP1细胞中JQ1的IC₅₀降低。

图40B显示，当分别用浓度0.6μg/ml和0.1μg/ml的双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理时，Hep 3B细胞中JQ1的IC₅₀降低。

图41A显示与未处理的细胞相比，ZF17-MQ1在0.6和1.2μg/ml浓度下均能够下调Hepa1-6细胞中的小鼠MYC mRNA表达。

图41B显示与未处理的细胞相比，ZF17-MQ1在0.6和1.2μg/ml浓度下均能够降低小鼠Hepa1-6细胞中的细胞活力。

图42A显示小鼠HCC细胞Hepa1-6中的ZF17-MQ1处理在24和48小时显示MYC蛋白的显著下调。

图42B显示小鼠HCC细胞Hepa1-6中的ZF17-MQ1处理在24和48小时显示MYC蛋白的显著下调。

图42C显示小鼠HCC细胞Hepa1-6中的ZF17-MQ1处理在96小时显示MYC mRNA的显著下调。

图42D显示小鼠HCC细胞Hepa1-6中的ZF17-MQ1处理在96小时时显示细胞活力的显著丧失。

图43显示ZF17-MQ1在4个剂量后显著降低动物肿瘤负荷，并且在两周的药物假期后，用ZF17-MQ1重新治疗小鼠导致约4周后肿瘤完全消除。

图44A显示与未处理或GFP处理的细胞相比，ZF17-MQ1处理的细胞显示出LL2细胞中降低的MYC蛋白水平。

图44B显示与在未处理的细胞中观察到的水平相比，ZF17-MQ1和ZF16-MQ1在LL2细胞中分别使MYC mRNA水平降低>99.9％或74％。

图44C显示所有三种构建体ZF15-MQ1、ZF16-MQ1和ZF17-MQ1能够比未处理的细胞和GFP处理的细胞更大程度地降低LL2细胞中的细胞活力。

图45A显示ZF17-MQ1在1.25μg/mL和2.5μg/mL浓度下降低MYC mRNA水平。与未处理细胞中观察到的水平相比，2.5μg/mL ZF17-MQ1使LL2和CT26细胞中的MYC mRNA水平分别降低93％和85％。

图45B显示ZF17-MQ1在两种浓度下均降低细胞活力。与未处理的细胞相比，在这些条件下，ZF17-MQ1使LL2和CT26细胞的细胞活力分别降低87％和93％。

图46显示ZF17-MQ1比未处理的细胞和GFP处理的细胞(阴性对照)更大的程度地在CMT167和LL2细胞中下调MYC mRNA并降低细胞活力。与未处理细胞中观察到的水平相比，ZF17-MQ1使CMT167和LL2细胞中的MYC mRNA水平分别降低62％和73％。此外，与未处理的细胞相比，在这些条件下，ZF17-MQ1使CMT167和LL2细胞的细胞活力分别降低54％和57％。

图47显示在原代小气道上皮细胞、原代肺叶上皮细胞和原代肺成纤维细胞中与未处理的细胞相比，ZF9-MQ1分别将MYC mRNA水平下调94％、96％、96％水平。然而，与对照细胞相比，活力仅降低了16％、9％和22％。

图48A显示ZF9-MQ1和JQ1各自单独抑制A549细胞的细胞活力。

图48B显示ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和JQ1(浓度高达6.25uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图48C显示ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和JQ1(浓度高达6.25uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图49A显示ZF9-MQ1和BET762各自单独抑制A549细胞的细胞活力。

图49B显示ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和BET762(浓度高达1.25uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图49C显示ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和BET762(浓度高达0.625uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图50A显示ZF9-MQ1和比拉瑞塞各自单独抑制A549细胞的细胞活力。

图50B显示ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和比拉瑞塞(浓度高达0.625uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图50C显示ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和比拉瑞塞(浓度高达0.313uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图51A显示ZF9-MQ1和曲美替尼各自单独抑制A549细胞的细胞活力。

图51B显示ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和曲美替尼(浓度高达0.05uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图51C显示ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和曲美替尼(浓度高达0.05uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应。

图52A显示与未处理的细胞相比，所有构建体ZF9-MQ1、ZF54-KRAB、ZF67-KRAB和ZF68-KRAB能够在处理后72小时将H2009细胞中的MYC mRNA水平下调至少42％。

图52B显示与未处理的细胞相比，构建体ZF9-MQ1、ZF67-KRAB和ZF68-KRAB能够在处理后72小时将H226细胞中的MYC mRNA水平下调至少27％。

图52C显示与未处理的细胞相比，构建体ZF9-MQ1和ZF54-KRAB都能够在处理后72小时将H226细胞中的MYC mRNA水平下调至少27％。

图52D显示与未处理的细胞相比，构建体ZF9-MQ1、ZF61-KRAB、ZF67-KRAB和ZF68-KRAB能够在处理后72小时将H460细胞中的MYC mRNA水平下调至少26％。

图53显示在测试的最高浓度下，相对于未处理的对照细胞，ZF9-MQ1和ZF54-KRAB各自分别将H2009细胞中的MYC mRNA分别下调99％或62％。当低于0.313μg/mL的ZF9-MQ1与1或2μg/mL ZF54-KRAB组合时，MYC mRNA下调的程度比单独使用任一治疗观察到的程度更大。

图54显示48小时时ZF9-MQ1相对于未处理的对照细胞将H1299细胞中的MYC mRNA下调95％，并在144小时时维持在对照水平的90％的下调。ZF9-MQ1加ZF54-KRAB的组合在48小时时将MYC mRNA水平降低至98％，并在144小时时维持下调至对照水平的93％(图54)。此外，数据显示ZF9-MQ1和ZF9-MQ1与ZF54-KRAB组合下调H1299细胞中的MYC mRNA水平至少6天。

图55显示引入H2009细胞后24小时，与未处理的细胞相比，ZF9-MQ1和ZF54-KRAB分别将MYC mRNA水平下调高达83％和55％。处理后48小时，ZF9-MQ1处理的细胞中MYC mRNA水平进一步降低另外13％，达到未处理对照的96％，而ZF54-KRAB不会进一步下调MYC水平。处理后24小时，用ZF9-MQ1_ZF54-KRAB和ZF54-KRAB_ZF9-MQ1处理的细胞中的MYC mRNA水平分别降低至对照细胞的95％和96％。数据表明，这些对照能够比ZF9-MQ1更早降低MYC mRNA水平，导致H2009细胞中24小时时与ZF9-MQ1处理的细胞相比，处理的细胞中MYC下调水平更高。

图56显示与索拉非尼诱导的肿瘤生长抑制相比，ZF9-MQ1治疗以相似或更高的水平抑制H460皮下肿瘤模型中的肿瘤生长。

具体实施方式

本披露提供了通过使用本文所述的表达阻遏物或系统来调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)在细胞中(例如，在受试者或患者中)的表达的技术。

许多不同的疾病和综合症，包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病和肥胖症，都可能是由基因表达的错误调节引起的。特别是，人们早已知道转录因子的过表达会导致肿瘤发生，最近的研究表明，过表达的致癌转录因子可以改变细胞的核心自动调节回路。

MYC是一种转录因子和主细胞调节因子，在超过50％的人癌症中经常失调，并且在致瘤过程的几乎每个方面都发挥着核心作用。除了早期应答基因外，MYC通常上调基因表达。MYC是最常扩增的癌基因，其基因产物的表达升高与肿瘤侵袭和不良临床结果相关。c-MYC水平升高可促进多种组织的肿瘤发生。大多数肿瘤细胞的生长和增殖依赖于转录因子c-MYC。MYC过表达还与慢性肝病有关，例如病毒和酒精相关的肝病。MYC过表达水平在特定癌症亚型中存在差异。不希望受理论的束缚，认为调节例如降低患有MYC错误调节障碍的受试者(例如，整体或一个或多个特定靶组织)的MYC水平可以减轻或消除MYC错误调节障碍的症状。

本披露部分地提供了表达阻遏物，其包含与靶基因启动子(例如MYC启动子)或可操作连接至靶基因(例如MYC基因)的启动子结合的靶向部分，以及当被靶向部分定位时能够调节(例如降低)靶基因(例如MYC)表达的效应子部分。在一些实施例中，本文披露的表达阻遏物特异性通过靶向部分结合与靶基因(例如，MYC)可操作地连接的表达控制元件(例如，启动子或增强子、阻遏物或沉默子)，并且效应子部分调节靶基因(例如，MYC)的表达。在一些实施例中，本文披露的表达阻遏物通过靶向部分特异性结合包含靶基因(例如，MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列或该锚序列近侧的序列，并且效应子部分调节靶基因(例如，MYC)的表达。在一些实施例中，本文披露的表达阻遏物特异性结合位于靶基因(例如，MYC)的超级增强子区域中的基因组基因座，并且效应子部分调节靶基因(例如，MYC)的表达。

本披露还部分地提供了包含两个或更多个表达阻遏物的表达阻遏系统，每个表达阻遏物包含靶向部分和任选的效应子部分。在一些实施例中，靶向部分靶向两个或更多个不同的序列(例如，每个表达阻遏物可靶向不同的序列)。在一些实施例中，第一表达阻遏物结合与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录调节元件(例如启动子或转录起始位点(TSS))，第二表达阻遏物结合包含靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列。在一些实施例中，第一表达阻遏物结合至可操作地连接至靶基因(例如，MYC)的转录调节元件(例如，启动子或转录起始位点(TSS))，并且第二表达阻遏物结合至可操作地连接至靶基因(例如，MYC)的表达控制元件(例如，增强子、超级增强子、阻遏物或沉默子)。在一些实施例中，第一表达阻遏物结合至包含靶基因(例如，MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，并且第二表达阻遏物结合至可操作地连接至靶基因的表达控制元件(例如，增强子、超级增强子、阻遏物或沉默子)。通常，表达阻遏系统对靶基因(例如，MYC)表达的调节涉及第一表达阻遏物和第二表达阻遏物分别与第一和第二DNA序列的结合。第一和第二DNA序列的结合将第一和第二效应子部分的功能定位到那些位点。在不希望受理论约束的情况下，在一些实施例中，采用第一和第二阻遏物部分两者的功能稳定地阻遏与第一和/或第二DNA序列相关联或包含第一和/或第二DNA序列的靶基因的表达，例如，其中该第一和/或第二DNA序列是或包含该靶基因或一个或多个可操作地连接的转录控制元件的序列。在一些实施例中，表达阻遏物系统由双顺反子核酸序列编码。

本披露进一步提供编码所述表达阻遏物和/或表达阻遏物系统的核酸、包含表达阻遏物和/或表达阻遏物系统的组合物、以及用于递送所述核酸的方法。进一步提供了使用本文所述的表达阻遏物或表达阻遏物系统增加细胞中靶基因表达例如MYC基因表达的方法。

表达阻遏物

如本文所述，本披露部分地提供了用于调节例如降低靶基因例如MYC的表达的表达阻遏物。在一些实施例中，表达阻遏物可以包含结合靶基因启动子(例如MYC启动子)的靶向部分和任选的效应子部分。在一些实施例中，靶向部分特异性结合靶DNA序列，例如MYCDNA序列，从而将表达阻遏物的功能定位于DNA序列。在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和一个效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和多个效应子部分(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个效应子结构域(并且任选地，少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个效应子结构域))。

表达阻遏物可以包含多个效应子部分，其中每个效应子部分包含与其他效应子部分不同的功能。例如，表达阻遏物可以包含两个效应子部分，其中第一效应子部分包含DNA甲基化酶功能，第二效应子部分包含转录阻遏物功能。在一些实施例中，表达阻遏物包含效应子部分，其功能在降低靶基因(例如MYC)的表达方面彼此互补，其中所述功能一起使得能够抑制表达，且任选地当单独存在时不抑制或可忽略地抑制表达。在一些实施例中，表达阻遏物包含多个效应子部分，其中每个效应子部分与其他效应子部分互补，每个效应子部分降低靶基因(例如MYC)的表达。

在一些实施例中，表达阻遏物包含效应子部分的组合，这些效应子部分的功能在降低靶基因(例如MYC)的表达方面相互协同。不希望被理论所束缚，在一些实施例中，据认为对基因组基因座的表观遗传修饰是累积的，因为多个转录激活表观遗传标志物(例如，多种不同类型的表观遗传标志物和/或给定类型的更广泛标志物)单独地一起比单独的单个修饰更有效地抑制表达(例如，产生更大的表达降低和/或更持久的表达降低)。在一些实施例中，表达阻遏物包含多个效应子部分，其中每个效应子部分与每个其他效应子部分协同，例如，每个效应子部分降低靶基因(例如，MYC)的表达。在一些实施例中，表达阻遏物(包含多个相互协同的效应子部分)在抑制靶基因(例如，MYC)表达方面比包含单个效应子部分的表达阻遏物更有效。在一些实施例中，包含所述多个效应子部分的表达阻遏物在降低靶基因(例如，MYC)表达方面比包含单个效应子部分的表达阻遏物更有效至少1.05x(即1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.55x、1.6x、1.65x、1.7x、1.75x、1.8x、1.85x、1.9x、1.95x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x或100x。

在一些实施例中，表达阻遏物包含一个或多个靶向部分，例如Cas结构域、TAL效应子结构域或Zn指结构域。在实施例中，当表达阻遏物系统包含两个或更多个相同类型的靶向部分时，例如两个或更多个Cas结构域，靶向部分特异性结合两个或更多个不同的序列。例如，在包括两个或更多个Cas结构域的表达阻遏物系统中，可以选择或改变所述两个或更多个Cas结构域，使得它们仅明显地结合对应于它们的靶序列的gRNA(例如，而不会明显地结合对应于另一个Cas结构域的靶标的gRNA)。

在一些实施例中，表达阻遏物包含例如通过肽键共价连接的靶向部分和效应子部分。在一些实施例中，靶向部分和效应子部分位于同一多肽链上，例如，通过一个或多个肽键和/或接头连接。在一些实施例中，表达阻遏物是或包含融合分子，例如，该融合分子包含通过肽键和/或接头连接的靶向部分和效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物包含布置在同一多肽链上的效应子部分的N末端的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏物包含布置在同一多肽链上的效应子部分的C末端的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏物包含通过非肽键共价连接的靶向部分和效应子部分。在一些实施例中，靶向部分通过非肽键缀合至效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和多个效应子部分，其中靶向部分和多个效应子部分共价连接，例如，通过肽键(例如，靶向部分和多个效应子部分都是通过一系列共价键连接，尽管每个单独的部分可能不会与每个其他效应子部分共享共价键)。

在其他实施例中，表达阻遏物包含未共价连接的靶向部分和效应子部分，例如，它们彼此非共价地相关联。在一些实施例中，表达阻遏物包含非共价结合至效应子部分的靶向部分或反之亦然。在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和多个效应子部分，其中靶向部分和至少一个效应子部分不共价连接，例如彼此非共价地相关联，并且其中靶向部分和至少一个其他效应子部分共价连接，例如通过肽键。

通常，本文所述的表达阻遏物结合(例如，通过靶向部分)靶基因(例如MYC)近侧的和/或可操作连接至靶基因(例如MYC)的基因组序列元件。在一些实施例中，表达阻遏物与基因组序列元件的结合调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。例如，包含募集转录机器组分或抑制其募集的效应子部分的表达阻遏物与基因组序列元件的结合可以调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。作为进一步的实例，包含具有酶活性的效应子部分(例如表观遗传修饰部分)的表达阻遏物的结合可以通过效应子部分的局部酶活性来调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。作为进一步的实例，表达阻遏物与基因组序列元件的结合和表达阻遏物的局部酶活性都有助于最终调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。

在一些实施例中，表达阻遏物包含效应子部分，其中效应子部分包含选自以下的蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、KRAB(例如，KRAB结构域)、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其功能变体或片段。

在一些实施例中，表达阻遏物包含第一效应子部分和第二效应子部分，其中第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、KRAB(例如，KRAB结构域)、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其功能变体或片段，并且第二效应子部分包含选自以下的不同蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、KRAB(例如，KRAB结构域)、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其功能变体或片段。

在一些实施例中，本披露提供了编码如本文所述的表达阻遏物、表达阻遏物系统、靶向部分和/或效应部分的核酸序列。技术人员知道RNA的核酸序列与相应的DNA序列相同，除了胸腺嘧啶(T)通常被尿嘧啶(U)替代。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(例如，包括A、T、G、C)表示时，本披露还提供对应的RNA序列(例如，包括A、U、G、C)，其中“U”代替“T”。本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。

本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，可以产生编码包括如本文所述的靶向部分和/或效应子部分的表达阻遏物的大量核苷酸序列，其中一些与本文披露的核酸序列具有相似性，例如，90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU都编码氨基酸精氨酸。因此，在本发明的核酸分子中精氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可以改变为上述任何相应的密码子而不改变编码的多肽。

在一些实施例中，编码包含靶向部分和效应子部分的表达阻遏物的核酸序列可以是密码子优化编码区的一部分或全部，根据哺乳动物例如人的密码子使用进行优化。在一些实施例中，编码靶向部分和效应子部分的核酸序列是密码子优化的以增加蛋白质表达和/或增加蛋白质表达的持续时间。在一些实施例中，由密码子优化的核酸序列产生的蛋白质与由非密码子优化的核酸序列编码时的蛋白质水平相比高至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。

表达阻遏系统

本披露的表达阻遏系统可包含两个或更多个表达阻遏物。在一些实施例中，表达阻遏系统包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达阻遏物(并且任选地不超过15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个)。在一些实施例中，表达阻遏系统靶向两个或更多个不同的序列(例如第1和第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12和/或其他DNA序列，并且任选地不超过第20、第19、第18、第17、第16、第15、第14、第13、第12、第11、第10、第9、第8、第6、第5、第4、第3或第2个序列)。在一些实施例中，表达阻遏系统包含多个表达阻遏物，其中多个表达阻遏物的每个成员不会可检测地结合，例如，不结合多个表达阻遏物的另一个成员。在一些实施例中，表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物不会可检测地结合，例如，不结合第二表达阻遏物。

在一些实施例中，本披露的表达阻遏系统包含两个或更多个表达阻遏物，其中表达阻遏物一起存在于组合物、药物组合物或混合物中。在一些实施例中，本披露的表达阻遏系统包含两个或更多个表达阻遏物，其中一个或多个表达阻遏物不与至少一个其他表达阻遏物混合。例如，表达阻遏系统可包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物在细胞核中的存在与第二表达阻遏物在相同细胞的细胞核中的存在不重叠，其中表达阻遏系统通过第一和第二表达阻遏物的非重叠存在实现MYC基因表达的降低。在一些实施例中，与单独通过第一或第二表达阻遏物实现的MYC基因表达的降低相比，表达阻遏系统实现了MYC基因表达的更大降低。

在一些实施例中，表达阻遏物系统的表达阻遏物各自包含不同的靶向部分(例如，第一、第二、第三或另外的表达阻遏物各自包含彼此不同的靶向部分)。例如，表达阻遏系统可包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含第一靶向部分(例如Cas9结构域、TAL效应子结构域或Zn指结构域)，并且第二表达阻遏物包含不同于第一靶向部分的第二靶向部分(例如，Cas9结构域、TAL效应子结构域或Zn指结构域)。在一些实施例中，不同可以指包含不同类型的靶向部分，例如，第一靶向部分包含Cas9结构域，第二DNA靶向部分包含Zn指结构域。在其他实施例中，不同可以指包括同一类型的靶向部分的不同变体，例如，第一靶向部分包括第一Cas9结构域(例如，来自第一物种)并且第二靶向部分包括第二Cas9结构域(例如，来自第二物种)。在实施例中，当表达阻遏物系统包含两个或更多个相同类型的靶向部分时，例如两个或更多个Cas9或ZF结构域，靶向部分特异性结合两个或更多个不同的序列。例如，在包括两个或更多个Cas9结构域的表达阻遏物系统中，可以选择或改变所述两个或更多个Cas9结构域，使得它们仅明显地结合对应于它们的靶序列的gRNA(例如，而不会明显地结合对应于另一个Cas9结构域的靶标的gRNA)。在另一个实例中，在包含两个或更多个效应子部分的表达阻遏物系统中，可以选择或改变两个或更多个效应子部分，使得它们仅明显结合它们的靶序列(例如，不明显结合另一个效应子部分的靶序列)。

在一些实施例中，表达阻遏物系统包含三个或更多个表达阻遏物并且两个或更多个表达阻遏物包含相同的靶向部分。例如，表达阻遏物系统可包含三个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均包含第一靶向部分并且第三表达阻遏物包含第二不同的靶向部分。又如，表达阻遏物系统可包含四个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均包含第一靶向部分，而第三和第四表达阻遏物包含第二不同的靶向部分。又如，表达阻遏物系统可包含五个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均包含第一靶向部分，第三和第四表达阻遏物均包含第二不同的靶向部分，并且第五表达阻遏物包含第三不同的靶向部分。如上所述，不同可以指包含不同类型的靶向部分或包含相同类型的靶向部分的不同变体。

在一些实施例中，表达阻遏物系统的表达阻遏物各自结合不同的DNA序列(例如，第一、第二、第三或另外的表达阻遏物各自结合彼此不同的DNA序列)。例如，表达阻遏系统可包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物结合第一DNA序列，第二表达阻遏物结合第二DNA序列。在一些实施例中，不同可以指：在一个表达阻遏物所结合的DNA序列和另一个表达阻遏物所结合的DNA序列之间至少有一个位置不相同，或者在一个表达阻遏物所结合的DNA序列中存在至少一个位置，该位置不存在于另一个表达阻遏物所结合的DNA序列中。

在一些实施例中，第一DNA序列可位于第一基因组DNA链上且第二DNA序列可位于第二基因组DNA链上。在一些实施例中，第一DNA序列可位于与第二DNA序列相同的基因组DNA链上。

在一些实施例中，表达阻遏物系统包含三个或更多个表达阻遏物并且两个或更多个表达阻遏物结合相同的DNA序列。例如，表达阻遏物系统可包含三个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均结合第一DNA序列，并且第三表达阻遏物结合第二不同DNA序列。又如，表达阻遏物系统可包含四个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均结合第一DNA序列，而第三和第四表达阻遏物均结合第二DNA序列。又如，表达阻遏物系统可包含五个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均结合第一DNA序列，第三和第四表达阻遏物均结合第二DNA序列，第五表达阻遏物结合第三DNA序列。如上所述，不同可以指在一个表达阻遏物所结合的DNA序列和另一个表达阻遏物所结合的DNA序列之间至少有一个位置不相同，或者在一个表达阻遏物所结合的DNA序列中存在至少一个位置，该位置不存在于另一个表达阻遏物所结合的DNA序列中。

在一些实施例中，表达阻遏系统包含两个或更多个(例如两个)表达阻遏物并且多个(例如两个)表达阻遏物包含结合不同DNA序列的靶向部分。在这样的实施例中，第一靶向部分可以结合第一DNA序列并且第二DNA靶向部分可以结合第二DNA序列，其中第一和第二DNA序列不同并且不重叠。在一些此类实施例中，第一DNA序列与第二DNA序列相隔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个碱基对(任选地，不超过500、400、300、200、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基对)。在一些此类实施例中，第一DNA序列与第二DNA序列的间隔不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个碱基对(任选地，没有碱基对，例如，第一和第二序列彼此直接相邻)。

在一些实施例中，表达阻遏物系统的表达阻遏物各自包含不同的效应子部分(例如，第一、第二、第三或另外的表达阻遏物各自包含彼此不同的效应子部分)。例如，表达阻遏系统可包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含第一效应子部分(例如，包含DNA甲基转移酶或其功能片段)，并且第二表达阻遏物包含不同于第一效应子部分的第二效应子部分(例如，包含转录阻遏物(例如，KRAB)或其功能片段)。在一些实施例中，不同可以意指包含不同类型的效应子部分。在其他实施例中，不同可以指包含相同类型的效应子部分的不同变体，例如，第一效应子部分包含第一DNA甲基转移酶(例如，具有第一位点特异性或氨基酸序列)，第二效应子部分包含第二DNA甲基转移酶(例如，具有第二位点特异性或氨基酸序列)。

在一些实施例中，表达阻遏物系统包含含有第一效应子部分的第一表达阻遏物和含有第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中第一效应子部分包含选自以下的蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其功能变体或片段，并且第二效应子部分包含选自以下的不同蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其功能变体或片段。

在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性(例如，MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L或其任何功能变体或片段)，且另一效应子部分包含转录阻遏物活性(例如，KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任何功能变体或片段)，第一或第二效应子部分包含组蛋白甲基转移酶活性，且另一个效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性(例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9或其任何功能变体或片段)。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白甲基转移酶活性，且另一个效应子部分包含DNA甲基转移酶活性(例如，MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L或其任何功能变体或片段)。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白甲基转移酶活性，且另一个效应子部分包含转录阻遏物活性(例如，KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12，或其任一项的功能变体或片段)。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含转录阻遏物活性并且另一个效应子部分包含不同的转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含相同的DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含DNA去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含不同的组蛋白去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含相同的组蛋白去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性并且另一个效应子部分包含DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性并且另一个效应子部分包含DNA去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性并且另一个效应子部分包含转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性并且另一个效应子部分包含不同的组蛋白脱乙酰酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含组蛋白脱乙酰酶活性并且另一个效应子部分包含相同的组蛋白脱乙酰酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含DNA去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含不同的DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA甲基转移酶活性并且另一个效应子部分包含相同的DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含不同的DNA去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含DNA去甲基化酶活性并且另一个效应子部分包含相同的DNA去甲基化酶活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含转录阻遏物活性并且另一个效应子部分包含不同的转录阻遏物活性。在一些实施例中，第一或第二效应子部分包含转录阻遏物活性并且另一个效应子部分包含相同的转录阻遏物活性。

在一些实施例中，表达阻遏物系统包含三个或更多个表达阻遏物并且两个或更多个表达阻遏物包含相同的DNA靶向部分。例如，表达阻遏物系统可包含三个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均包含第一效应子部分并且第三表达阻遏物包含第二不同的效应子部分。又如，表达阻遏物系统可包含四个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均包含第一效应子部分，而第三和第四表达阻遏物包含第二不同的效应子部分。又如，表达阻遏物系统可包含五个表达阻遏物，其中第一和第二表达阻遏物均包含第一效应子部分，第三和第四表达阻遏物均包含第二不同的效应子部分，并且第五表达阻遏物包含第三不同的效应子部分。如上所述，不同可以指包含不同类型的效应子部分或包含相同类型的效应子部分的不同变体。

在一些实施例中，表达阻遏物系统的两个或更多个(例如，所有)表达阻遏物彼此不共价地相关联，例如，每个表达阻遏物不与任何其他表达阻遏物共价地相关联。在另一个实施例中，表达阻遏物系统的两个或更多个表达阻遏物彼此共价地相关联。在一个实施例中，表达阻遏系统包含布置在同一多肽上的第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，例如作为融合分子，例如通过肽键和任选的接头连接。在一些实施例中，肽是自切割肽，例如T2A自切割肽。在一个实施例中，表达阻遏系统包含通过非肽键连接，例如彼此缀合的第一表达阻遏物和第二表达阻遏物。

接头

如本文所披露的表达阻遏物或表达阻遏物系统可包含一个或多个接头。接头可将靶向部分连接至效应子部分，将效应子部分连接至另一效应子部分，或将靶向部分连接至另一靶向部分。接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，接头是共价的。在一些实施例中，接头是非共价的。在一些实施例中，接头是肽接头。这种接头的长度可以在2-30、5-30、10-30、15-30、20-30、25-30、2-25、5-25、10-25、15-25、20-25、2-20、5-20、10-20、15-20、2-15、5-15、10-15、2-10、5-10、或2-5个氨基酸之间，或者长度大于或等于2、5、10、15、20、25或30个氨基酸(并且任选地，长度高达50、40、30、25、20、15、10或5个氨基酸)。在一些实施例中，接头可用于将第一结构域或部分与第二结构域或部分隔开，例如将DNA靶向部分与效应子部分隔开。在一些实施例中，例如，接头可以位于DNA靶向部分和效应子部分之间，例如，以提供二级和三级结构的分子柔性。接头可以包括本文所述的柔性的、刚性的和/或可切割的接头。在一些实施例中，接头包括至少一个甘氨酸、丙氨酸、和丝氨酸氨基酸以提供柔性。在一些实施例中，接头是疏水接头，例如包括带负电荷的磺酸盐基团、聚乙二醇(PEG)基团或焦磷酸二酯基团。在一些实施例中，接头是可切割的以选择性地从调节剂释放部分(例如多肽)，但足够稳定以防止过早切割。

在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物的一个或多个部分和/或结构域与一个或多个接头连接。在一些实施例中，表达阻遏可以包含位于靶向部分和效应子部分之间的接头。在一些实施例中，接头可以具有ASGSGGGSGGARD(SEQ ID NO:137)或ASGSGGGSGG(SEQID NO:138)的序列。在一些实施例中，包含第一和第二阻遏物的系统可以包含位于第一靶向部分和第一效应子部分之间的第一接头，和位于第二靶向部分和第二效应子部分之间的第二接头。在一些实施例中，第一和第二接头可以相同。在一些实施例中，第一和第二接头可以不同。在一些实施例中，第一接头可包含根据SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，并且第二接头可包含根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。

如本领域技术人员所知，最常用的柔性接头具有的序列主要由Gly和Ser残基(“GS”接头)段组成。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域/部分，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。Ser或Thr的掺入还可通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，且因此减少了接头与部分/结构域之间的不利相互作用。在一些实施例中，接头是GS接头或其变体，例如G4S(SEQID NO:207)。

刚性接头有用于保持结构域/部分之间的固定距离并维持它们的独立功能。当结构域的空间分离对于保持融合中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。刚性接头可以具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro-richsequence)、(XP)_n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。

可切割接头可以在体内释放游离的功能结构域。在一些实施例中，接头可以在特异性条件下(例如在还原剂或蛋白酶的存在下)切割。体内可切割接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。此类接头是已知的，并且例如在Chen等人,2013.融合蛋白接头：特性、设计和功能。Adv Drug Deliv Rev.[先进药物输送评论]65(10):1357-1369中描述。融合蛋白中接头的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶在某些条件下在体内、在特定细胞或组织中、或在受限的某些细胞区室内表达。许多蛋白酶的特异性在受限的区室中提供了对接头的缓慢切割。在一些实施例中，可切割接头可以是自切割接头，例如T2A肽接头。在一些实施例中，接头可包含“核糖体跳跃”序列，例如tPT2A接头。

适用于本文所述接头的分子的实例包括带负电荷的磺酸基；脂质，例如聚(--CH₂--)烃链，例如聚乙二醇(PEG)基团、其不饱和变体、其羟基化变体、其酰胺化或其他含N的变体；非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或能够共价连接表达阻遏物的两个或更多个组分的其他分子。也可包含非共价接头(例如多肽与之连接的疏水性脂质小球)，例如通过多肽的疏水区或多肽的疏水延伸，例如富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或者也可能是丙氨酸、苯丙氨酸或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的一系列残基或其他疏水残基。表达阻遏物的组分可以使用基于电荷的化学被连接，使得表达阻遏物的正电荷组分与另一组分的负电荷连接。

靶向部分

本披露提供了例如包含靶向部分的表达阻遏物，该靶向部分特异性靶向例如结合靶基因中的、靶基因近侧的和/或可操作地连接至靶基因的基因组序列元件(例如启动子、TSS或锚序列)。靶向部分可以特异性结合DNA序列，例如与靶基因(例如MYC)相关联的DNA序列。特异性结合DNA序列的任何分子或化合物均可用作靶向部分。

在一些实施例中，靶向部分靶向(例如，结合)基因组复合物(例如，ASMC)的组分。在一些实施例中，靶向部分靶向(例如，结合)与靶基因可操作地连接的表达控制序列(例如，启动子或增强子)。在一些实施例中，靶向部分靶向(例如，结合)靶基因或靶基因的一部分。靶向部分的靶标可以被称为其靶向的组分。靶向的组分可以是与靶基因可操作地连接的任何基因组序列元件或靶基因本身，包括但不限于启动子、增强子、锚序列、外显子、内含子、UTR编码序列、剪接位点或转录起始位点。在一些实施例中，靶向部分特异性结合一个或多个靶锚序列(例如，在细胞内)并且不结合非靶向的锚序列(例如，在同一细胞内)。

在一些实施例中，靶向部分可以是或包含CRISPR/Cas结构域、TAL效应子结构域、Zn指结构域、肽核酸(PNA)或核酸分子。在一些实施例中，表达阻遏物包含一个效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物包含多个靶向部分，其中每个靶向部分不可检测地结合(例如，不结合)另一个靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包含多个表达阻遏物，其中多个表达阻遏物的每个成员包含靶向部分，其中每个靶向部分不会可检测地结合，例如不结合另一个靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包含含有第一靶向部分的第一表达阻遏物和含有第二靶向部分的第二表达阻遏物，其中第一靶向部分不会可检测地结合，例如，不结合第二靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包含含有第一靶向部分的第一表达阻遏物和含有第二靶向部分的第二表达阻遏物，其中第一靶向部分不会可检测地结合，例如，不结合另一个第一靶向部分，并且第二靶向部分不会可检测地结合，例如不结合另一个第二靶向部分。在一些实施例中，用于本文所述的组合物和方法的靶向部分在单体状态(例如非二聚体状态)下是有功能的(例如，结合DNA序列)。

在一些实施例中，靶向部分与靶向的组分的结合降低了靶向的组分对另一种转录因子、基因组复合物组分或基因组序列元件的结合亲和力。在一些实施例中，靶向部分以小于或等于500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.002或0.001nM的K_D(并且任选地，至少50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.002或0.001nM的K_D)与其靶序列结合。在一些实施例中，靶向部分以0.001nM至500nM，例如0.1nM至5nM，例如约0.5nM的K_D与其靶序列结合。在一些实施例中，靶向部分以至少500、600、700、800、900、1000、2000、5000、10,000或100,000nM的K_D结合非靶序列(并且任选地，不会明显地结合非靶序列)。在一些实施例中，靶向部分不结合非靶序列。

在一些实施例中，靶向部分包含与被靶向的组分(例如靶基因(例如MYC)的调节元件(例如启动子或增强子))互补的核酸序列。在一些实施例中，靶向部分包含与靶向的组分至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％互补的核酸序列。

在一些实施例中，靶向部分可以是或包含CRISPR/Cas结构域、TAL效应结构域、Zn指结构域或核酸分子。

在一些实施例中，表达阻遏物的靶向部分包含不超过100、90、80、70、60、50、40、30或20个核苷酸(并且任选至少10、20、30、40、50、60、70、80或90个核苷酸)。在一些实施例中，融合分子的表达阻遏物或效应子部分包含不超过2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、或100个氨基酸(并且任选至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、或1900个氨基酸)。在一些实施例中，融合分子的表达阻遏物或效应子部分包含100-2000、100-1900、100-1800、100-1700、100-1600、100-1500、100-1400、100-1300、100-1200、100-1100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-2000、200-1900、200-1800、200-1700、200-1600、200-1500、200-1400、200-1300、200-1200、200-1100、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、300-2000、300-1900、300-1800、300-1700、300-1600、300-1500、300-1400、300-1300、300-1200、300-1100、300-1000、300-900、300-800、300-700、300-600、300-500、300-400、400-2000、400-1900、400-1800、400-1700、400-1600、400-1500、400-1400、400-1300、400-1200、400-1100、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、500-2000、500-1900、500-1800、500-1700、500-1600、500-1500、500-1400、500-1300、500-1200、500-1100、500-1000、500-900、500-800、500-700、500-600、600-2000、600-1900、600-1800、600-1700、600-1600、600-1500、600-1400、600-1300、600-1200、600-1100、600-1000、600-900、600-800、600-700、700-2000、700-1900、700-1800、700-1700、700-1600、700-1500、700-1400、700-1300、700-1200、700-1100、700-1000、700-900、700-800、800-2000、800-1900、800-1800、800-1700、800-1600、800-1500、800-1400、800-1300、800-1200、800-1100、800-1000、800-900、900-2000、900-1900、900-1800、900-1700、900-1600、900-1500、900-1400、900-1300、900-1200、900-1100、900-1000、1000-2000、1000-1900、1000-1800、1000-1700、1000-1600、1000-1500、1000-1400、1000-1300、1000-1200、1000-1100、1100-2000、1100-1900、1100-1800、1100-1700、1100-1600、1100-1500、1100-1400、1100-1300、1100-1200、1200-2000、1200-1900、1200-1800、1200-1700、1200-1600、1200-1500、1200-1400、1200-1300、1300-2000、1300-1900、1300-1800、1300-1700、1300-1600、1300-1500、1300-1400、1400-2000、1400-1900、1400-1800、1400-1700、1400-1600、1400-1500、1500-2000、1500-1900、1500-1800、1500-1700、1500-1600、1600-2000、1600-1900、1600-1800、1600-1700、1700-2000、1700-1900、1700-1800、1800-2000、1800-1900、或1900-2000个氨基酸。

本文披露的表达阻遏物或包含表达物的系统可以包含核酸，例如一个或多个核酸。术语“核酸”是指掺入或可以掺入寡核苷酸链的任何化合物。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键被掺入或可以被掺入寡核苷酸链的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施例中，核酸是或包含超过50％的核糖核苷酸，并且在本文中被称为核糖核酸(RNA)。在一些实施例中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基或由其组成。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种核酸类似物或由其组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种“肽核酸”或由其组成，这些肽核酸是本领域已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。可替代地或另外地，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由其组成。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基、及其组合)或由其组成。在一些实施例中，与天然核酸中的相比，核酸包含一种或多种修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能基因产物(如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，通过从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合的酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制以及化学合成中的一种或多种来制备核酸。如本文所用，“重组的”在用于描述核酸时是指非天然存在的任何核酸。在一些实施例中，核酸长度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中，核酸的长度可以是约2nt至约5000nt、约10nt至约100nt、约50nt至约150nt、约100nt至约200nt、约150nt至约250nt、约200nt至约300nt、约250nt至约350nt、约300nt至约500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt、或其间的任何范围。在一些实施例中，核酸部分或全部是单链的；在一些实施例中，核酸部分或全部是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个编码多肽的元件或者是编码多肽的序列的互补序列的核苷酸序列。在一个实施例中，核酸具有酶活性。

在一些实施例中，靶向部分包含或者是核酸序列、蛋白质、蛋白质融合物或膜转位多肽。在一些实施例中，靶向部分选自外源接合成核分子、编码接合成核分子的核酸、或序列靶向多肽与接合成核分子的融合物。接合成核分子可以是，例如CTCF、黏连蛋白、USF1、YY1、TATA-盒结合蛋白相关因子3(TAF3)、ZNF143结合基序。在一些实施例中，靶向部分包含或者是聚合物或聚合物部分，例如，核苷酸聚合物(例如寡核苷酸)、肽核酸、肽-核酸混合体、肽或多肽、聚酰胺、碳水化合物等。

在一些实施例中，靶向部分包含或者是核酸。在一些实施例中，效应子部分包含或者是核酸。在一些实施例中，可以包含在部分中的核酸可以是或包含DNA、RNA和/或人工或合成的核酸或核酸类似物或模拟物。例如，在一些实施例中，核酸可以是或包含以下中的一个或多个：基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、肽核酸(PNA)、肽-核酸混合体、肽-寡核苷酸缀合物、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、聚酰胺、形成三链体的寡核苷酸、反义寡核苷酸、tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子(例如，靶向本文所述的非编码RNA和/或靶向与本文所述的靶基因组复合物相关联的特定基因的表达产物)等。适用于调节剂的核酸序列可以包括修饰的寡核苷酸(例如，化学修饰，如改变主链连接、糖分子和/或核酸碱基的修饰)和/或人工核酸。在一些实施例中，核酸序列包括但不限于基因组DNA、cDNA、肽核酸(PNA)或肽寡核苷酸缀合物、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、聚酰胺、形成三链体的寡核苷酸、修饰的DNA、反义DNA寡核苷酸、tRNA、mRNA、rRNA、修饰的RNA、miRNA、gRNA和siRNA或其他RNA或DNA分子。在一些实施例中，核酸可以包括一个或多个不是天然存在的DNA或RNA残基的残基，可以包括一个或多个不是磷酸二酯键的连接(例如，可以是例如硫代磷酸酯键等)，和/或可以包括一个或多个修饰，例如像2'O修饰，如2'-OmeP。可用于制备合成核酸的多种核酸结构是本领域已知的(参见例如，WO 2017/062862l和WO 2014/012081)，本领域技术人员将理解，可以根据本披露利用这些核酸结构。

核酸的一些实例包括但不限于与靶基因(例如，MYC)杂交的核酸(例如，如本文其他地方所述的gRNA或反义ssDNA)、与外源核酸(如病毒DNA或RNA)杂交的核酸、与RNA杂交的核酸、干扰基因转录的核酸、干扰RNA翻译的核酸、稳定RNA或去稳定RNA的核酸(如通过靶向降解)、通过干扰DNA或RNA结合因子的表达或功能而对其进行干扰的核酸、与细胞内蛋白质或蛋白质复合物连接并调节其功能的核酸等。

在一些实施例中，表达阻遏物包含一种或多种核苷类似物。在一些实施例中，除了一种或多种天然核苷(例如，嘌呤或嘧啶，例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)之外或作为其替代物，核酸序列可以包括一种或多种核苷类似物。在一些实施例中，核酸序列包括一种或多种核苷类似物。核苷类似物可以包括但不限于，核苷类似物，如5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、4-甲基苯并咪唑、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、二氢尿苷、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤、3-硝基吡咯、肌苷、硫尿核苷、辫苷(queuosine)、怀俄苷、二氨基嘌呤、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、二氨基嘧啶、2,4-二氟甲苯、异喹啉、吡咯并[2,3-β]吡啶、以及可以与嘌呤或嘧啶侧链碱基配对的任何其他物质。

CRISPR/Cas结构域

在一些实施例中，靶向部分是或包含CRISPR/Cas结构域。CRISPR/Cas蛋白可包含CRISPR/Cas效应子和任选的一个或多个其他结构域。CRISPR/Cas结构域通常与参与成簇调节间隔短回文重复(CRISPR)系统的蛋白质(例如Cas蛋白)具有结构和/或功能相似性。CRISPR/Cas结构域任选地包含指导RNA，例如，单指导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，CRISPR/Cas结构域包含的gRNA与CRISPR/Cas结构域非共价结合。

CRISPR系统是最初在细菌和古细菌中发现的自适应防御系统。CRISPR系统使用称为CRISPR相关或“Cas”核酸内切酶的RNA引导性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)来切割外来DNA。例如，在典型的CRISPR/Cas系统中，核酸内切酶通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性的非编码“指导RNA”定向到靶核苷酸序列(例如，基因组中待序列编辑的位点)。已经鉴定了三类(I-III)CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单个Cas核酸内切酶(而不是多个Cas蛋白)。一种II类CRISPR系统包括II型Cas核酸内切酶，例如Cas9、CRISPR RNA(“crRNA”)和反式激活crRNA(“tracrRNA”)。crRNA含有“指导RNA”，即通常对应于靶DNA序列的约20个核苷酸的RNA序列。crRNA还包含与tracrRNA结合的区域，以形成被RNA酶III切割的部分双链结构，产生crRNA/tracrRNA杂交体。然后，crRNA/tracrRNA杂交体指导Cas9核酸内切酶识别并切割靶DNA序列。靶DNA序列必须总体上邻近针对给定Cas核酸内切酶来说是特异性的“原间隔子邻近基序”(“PAM”)；然而，PAM序列似乎遍布整个给定基因组。从不同原核物种鉴定的CRISPR核酸内切酶具有独特的PAM序列要求；PAM序列的实例包括5’-NGG(化脓性链球菌)、5’-NNAGAA(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseria meningiditis))。一些核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)与富含G的PAM位点(例如5'-NGG)相关联，并在距PAM位点上游(5')3个核苷酸处对靶DNA进行钝端切割。另一个II类CRISPR系统包括V型核酸内切酶Cpf1，它比Cas9小；实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺旋菌属物种(Lachnospiraceae sp.))。Cpf1相关CRISPR阵列被处理成成熟crRNA，而不需要tracrRNA；换言之，Cpf1系统仅需要Cpf1核酸酶和crRNA来切割靶DNA序列。Cpf1核酸内切酶与富含T的PAM位点例如5'-TTN相关。Cpf1也可以识别5'-CTA PAM基序。Cpf1通过引入具有4或5个核苷酸的5'突出端的错位或交错的双链断裂来切割靶DNA，例如切割如下靶DNA，该靶DNA中的5个核苷酸的错位或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(3')18个核苷酸的位置处和距离互补链上的PAM位点下游23个核苷酸的位置处；由这样的错位切割产生的5个核苷酸突出端使得通过同源重组的DNA插入比在平末端切割的DNA的插入更精确地进行基因组编辑。参见例如，Zetsche等人(2015)Cell[细胞],163:759-771。

多种CRISPR相关(Cas)基因或蛋白可以用于本披露提供的技术中，并且Cas蛋白的选择将取决于该方法的具体条件。Cas蛋白的具体实例包括II类系统，包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3。在一些实施例中，Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)可以来自多种原核物种中的任一种。在一些实施例中，特定Cas蛋白(例如，特定Cas9蛋白)被选择以识别特定的原间隔子邻近基序(PAM)序列。在一些实施例中，DNA靶向部分包括序列靶向多肽，如Cas蛋白，例如Cas9。在某些实施例中，Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)可以从细菌或古细菌中获得或使用已知方法合成。在某些实施例中，Cas蛋白可以来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在某些实施例中，Cas蛋白可以来自链球菌(例如，酿脓链球菌或嗜热链球菌)、弗朗西斯菌(例如，新凶手弗朗西斯菌)、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)、氨基酸球菌(例如，氨基酸球菌属物种BV3L6)、奈瑟氏球菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)、隐球菌、棒状杆菌、嗜血杆菌、真细菌、巴斯德氏菌、普氏菌、韦荣球菌或海洋杆菌。

在一些实施例中，Cas蛋白需要原间隔子邻近基序(PAM)存在于靶DNA序列中或邻近靶DNA序列，以便Cas蛋白结合和/或发挥功能。在一些实施例中，PAM是或包含从5'至3'的NGG、YG、NNGRRT、NNNRRT、NGA、TYCV、TATV、NTTN或NNNGATT，其中N代表任何核苷酸，Y代表C或T，R代表A或G，并且V代表A或C或G。在一些实施例中，Cas蛋白是表1中列出的蛋白。在一些实施例中，Cas蛋白包含一个或多个改变其PAM的突变。在一些实施例中，Cas蛋白包含E1369R、E1449H和R1556A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，Cas蛋白包含E782K、N968K和R1015H突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，Cas蛋白包含D1135V、R1335Q和T1337R突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，Cas蛋白包含S542R和K607R突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，Cas蛋白包含S542R、K548V和N552R突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

表1

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在一些实施例中，Cas蛋白被修饰以使核酸酶失活，例如核酸酶缺陷型Cas。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白。而在由gRNA靶向的特异性DNA序列上，野生型Cas9产生双链断裂(DSB)，具有修饰的功能性的许多CRISPR核酸内切酶是可得的，例如：Cas9的“切口酶”版本仅产生单链断裂；无催化活性的Cas9(“dCas9”)不会切割靶DNA。在一些实施例中，dCas与DNA序列的结合可以通过空间位阻干扰该位点处的转录。在一些实施例中，DNA靶向部分是或包含无催化活性的Cas，例如dCas。许多无催化活性的Cas蛋白是本领域已知的。在一些实施例中，dCas9包含Cas蛋白的每个核酸内切酶结构域中的突变，例如D10A和H840A突变。

在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D11A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含H969A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含N995A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D11A、H969A和N995A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D10A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含H557A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D10A和H557A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D839A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含H840A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含N863A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D10A、D839A、H840A和N863A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含E993A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D917A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含E1006A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D1255A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D917A、E1006A和D1255A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D16A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D587A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含H588A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含N611A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。在一些实施例中，无催化活性的Cas9蛋白例如dCas9包含D16A、D587A、H588A和N611A突变或对应于所述位置的氨基酸的类似取代。

在另一方面，本披露涉及包含一个或多个(例如，一个)靶向部分和一个或多个效应子部分的表达阻遏物或多肽，其中该一个或多个靶向部分是或包含CRISPR/Cas结构域，该分子包含Cas蛋白，例如无催化活性的Cas9蛋白，例如dCas9，或其功能变体或片段。在一些实施例中，dCas9包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列：

在一些实施例中，dCas9由SEQ ID NO:50的核酸序列编码：

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在一些实施例中，靶向部分可以包含含有或连接(例如，共价连接)gRNA的Cas结构域。gRNA是一种短的合成RNA，由Cas蛋白结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列组成。在实践中，通常将指导RNA序列设计为具有17-24个核苷酸(例如，19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制gRNA生成器和算法可通过商业途径获得，用于设计有效的指导RNA。使用嵌合性“单指导RNA”(“sgRNA”)也可以实现基因编辑，这是一种工程化(合成)的单一RNA分子，模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物，并同时含有tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶引导至被靶向序列进行编辑)。化学修饰的sgRNA也已经被证明有效地与Cas蛋白一起使用；参见，例如，Hendel等人(2015)Nature Biotechnol.[自然-生物技术],985-991。示例性指导RNA序列披露于表2和表13中。

在一些实施例中，gRNA包含与靶基因相关联的DNA序列互补的核酸序列。在一些实施例中，DNA序列是、包含或重叠与靶基因可操作地连接的表达控制元件。在一些实施例中，gRNA包括与靶基因相关联的DNA序列至少90％、95％、99％或100％互补的核酸序列。在一些实施例中，与包含Cas分子的DNA靶向部分一起使用的gRNA是sgRNA。

在一些实施例中，与CRISPR/Cas结构域一起使用的gRNA特异性结合与CTCF相关联的靶序列。在一些实施例中，与CRISPR/Cas结构域一起使用的gRNA特异性结合与启动子相关联的靶序列。在一些实施例中，gRNA结合表2和表13中列出的靶序列。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物结合表2或表13中列出的靶序列。

表2：示例性gRNA序列

表13示例性gRNA序列

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在一些实施例中，表达阻遏物系统包含含有第一DNA靶向部分的第一表达阻遏物和含有第二DNA靶向部分的第二表达阻遏物，其中第一DNA靶向部分包含或者是第一CRISPR/Cas结构域，并且第二DNA靶向部分包含或者是第二CRISPR/Cas结构域。在一些实施例中，第一CRISPR/Cas结构域包含第一CRISPR/Cas蛋白和第一指导RNA，并且第二CRISPR/Cas分子包含第二CRISPR/Cas结构域和第二指导RNA。在一些实施例中，第一CRISPR/Cas蛋白不明显结合(例如，不结合)第二指导RNA，例如，以至少10、20、50、100、1000或10,000nM的K_D结合，并且第二CRISPR/Cas蛋白不明显结合(例如，不结合)第一指导RNA，例如，以至少10、20、50、100、1000或10,000nM的K_D结合。

TAL效应子结构域

在一些实施例中，DNA靶向部分是或包含TAL效应子结构域。TAL效应子结构域，例如特异性结合DNA序列的TAL效应子结构域，包含多个TAL效应子重复或其片段，以及任选地一个或多个天然存在的TAL效应子重复的另外部分(例如多个TAL效应子结构域的N末端和/或C末端)，其中每个TAL效应子重复识别核苷酸。TAL效应子蛋白可包含TAL效应子和任选的一个或多个其他结构域。许多TAL效应子结构域是本领域技术人员已知的并且是可商购的，例如从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)商购。

TALE是由多种细菌病原体(包括植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas))分泌的天然效应蛋白，其调节宿主植物中的基因表达并促进细菌定植和存活。TAL效应子的特异性结合基于串联排列的几乎相同的典型33或34个氨基酸重复序列的中心重复结构域(重复可变二残基，RVD结构域)。

TAL效应子家族的成员主要在其重复序列的数量和顺序上不同。重复序列的数量范围为1.5至33.5个重复，并且C末端重复通常长度较短(例如，约20个氨基酸)，并且通常被称为“半重复”。TAL效应子的每个重复具有一个重复对一个碱基对的相关性，其中不同的重复类型表现出不同的碱基对特异性(一个重复识别靶基因序列上的一个碱基对)。通常，重复序列数量越少，蛋白质-DNA相互作用越弱。已证明6.5个重复序列的数量足以激活报告基因的转录(Scholze等人,2010)。

重复至重复的变异主要发生在氨基酸位置12和13处，因此它们被称为“高变的”，并负责与靶DNA启动子序列相互作用的特异性，如表3所示，其列出了示例性重复可变双残基(RVD)及其与核酸碱基靶标的对应关系。

表3-RVD和核酸碱基特异性

因此，有可能修饰TAL效应子的重复序列以靶向特定的DNA序列。进一步的研究表明，RVD NK可以靶向G。TAL效应子的靶位点也倾向于包括在被第一重复序列靶向的5'碱基侧翼的T，但这种识别的确切机制尚不清楚。迄今已知超过113种TAL效应子序列。来自黄单胞菌的TAL效应子的非限制性实例包括Hax2、Hax3、Hax4、AvrXa7、AvrXa10和AvrBs3。

相应地，本披露的TAL效应子结构域的TAL效应子重复可以源自来自任何细菌物种(例如黄单胞菌属(Xanthomonas)物种，例如米糠黄单胞菌(Xanthomonas oryzaepv.Oryzae)的非洲菌株(Yu等人2011)、野油菜黄单胞菌萝卜致病变种(Xanthomonascampestris pv.raphani)菌株756C和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.Oryzicola)菌株BLS256(Bogdanove等人2011))的TAL效应子。如本文所用，根据本披露的TAL效应子结构域包含RVD结构域，以及也来自天然存在的TAL效应子的一个或多个侧翼序列(RVD结构域的N末端和/或C末端侧上的序列)。它可以包含比天然存在的TAL效应子结构域的RVD更多或更少的重复序列。本披露的TAL效应子结构域被设计成基于上述编码和本领域已知的其他编码来靶向给定的DNA序列。TAL效应子重复(例如单体或模块)的数量及其特定序列是基于所期望的DNA靶序列来选择的。例如，为了适应特定的靶序列，可以去除或添加TAL效应子重复。在实施例中，本发明的TAL效应子结构域包含6.5至33.5个TAL效应子重复。在实施例中，本发明的TAL效应子结构域包含8至33.5个TAL效应子重复，例如10至25个TAL效应子重复，例如10至14个TAL效应子重复。

在一些实施例中，TAL效应子结构域包含对应于与DNA靶序列完全匹配的TAL效应子重复。在一些实施例中，DNA靶序列上重复和靶碱基对之间的错配是允许的，只要它允许表达阻遏系统(例如，包含TAL效应子结构域的表达阻遏物)的功能。通常，TALE结合与错配数量呈负相关。在一些实施例中，本披露的表达阻遏物的TAL效应子结构域与靶DNA序列包含不超过7个错配、6个错配、5个错配、4个错配、3个错配、2个错配或1个错配，并且任选地没有错配。不希望被理论所束缚，一般来说，TAL效应子结构域中TAL效应子重复的数量越少，将被容许的错配数量就越少，并且仍然允许表达阻遏系统(例如，包含TAL效应子结构域的表达阻遏物)的功能。结合亲和力被认为取决于匹配的重复-DNA组合的总和。例如，具有25个或更多个TAL效应子重复的TAL效应子结构域可能能够耐受多达7个错配。

除了TAL效应子重复之外，本披露的TAL效应子结构域还可以包含来源于天然存在的TAL效应子的另外序列。包含在TAL效应子结构域的TAL效应子重复部分每一侧上的一个或多个C末端和/或N末端序列的长度可以变化，并且由本领域技术人员选择，例如基于Zhang等人(2011)的研究。Zhang等人已经表征了Hax3来源的基于TAL效应子的蛋白质中的许多C末端和N末端截短突变体，并且已经鉴定了有助于与靶序列最佳结合并因此激活转录的关键元件。通常，发现转录活性与N末端的长度呈负相关。关于C末端，鉴定了Hax 3序列前68个氨基酸内DNA结合残基的重要元件。因此，在一些实施例中，天然存在的TAL效应子的TAL效应子重复的C末端侧上的前68个氨基酸包含在本披露表达阻遏物的TAL效应子结构域中。因此，在实施例中，本披露的TAL效应子结构域包含1)一个或多个来源于天然存在的TAL效应子的TAL效应子重复；2)至少70、80、90、100、110、120、130、140、150、170、180、190、200、220、230、240、250、260、270、280个或更多个来自TAL效应子重复N末端侧上的天然存在的TAL效应子的氨基酸；和/或3)至少68、80、90、100、110、120、130、140、150、170、180、190、200、220、230、240、250、260个或更多个来自TAL效应子重复C末端侧上的天然存在的TAL效应子的氨基酸。

在一些实施例中，调节剂包含靶向部分，该靶向部分包含工程改造的DNA结合结构域(DBD)，例如，TAL效应子，其包含与靶序列(例如可操作地连接至靶基因(例如，MYC)的启动子或转录起始位点(TSS)序列，例如转录调节元件近侧的序列，例如，包含靶基因(例如，MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，例如锚序列近侧的序列)结合的TAL效应子重复。在一些实施例中，TAL效应子结构域可被工程化以将表观遗传效应子部分携带至靶位点。

Zn指结构域

在一些实施例中，DNA靶向部分是或包含Zn指结构域。Zn指结构域包含Zn指，例如天然存在的Zn指或工程化的Zn指、或其片段。许多Zn指是本领域技术人员已知的并且是可商购的，例如从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)商购。一般而言，Zn指结构域包含多个Zn指，其中每个Zn指识别三个核苷酸。Zn指蛋白可包含Zn指结构域和任选的一个或多个其他结构域。

在一些实施例中，Zn指分子包含非天然存在的Zn指蛋白，其被工程化以与选择的靶DNA序列结合。例如，参见Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.[自然生物技术]20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.[生物化学年度综述]70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前观点]12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.[分子生物学杂志]10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；以及美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，均通过引用以其整体并入本文。

与天然存在的Zn指相比，工程化的Zn指可能具有新的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括，例如，使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个Zn指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的Zn指的一个或多个氨基酸序列相关联。参见例如，美国专利号6,453,242和6,534,261，通过引用以其整体并入本文。

示例性选择方法(包括噬菌体展示和双杂交系统)披露于以下中：美国专利号5,789,538、5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及国际专利公开号WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；以及WO 01/88197和GB2,338,237。另外，增强锌指蛋白的结合特异性已经例如，在国际专利公开号WO 02/077227中描述。

另外，如这些和其他参考文献中所披露的，锌指和/或多指锌指结构域可以使用任何合适的接头序列(包括例如，长度为5个或更多个氨基酸的接头)连接在一起。另参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949的示例性接头序列长度为6个或更多个氨基酸。本文所述的蛋白质可以包括蛋白质的单个锌指之间的合适接头的任何组合。另外，增强锌指结合结构域的结合特异性已经例如，在共同拥有的国际专利公开号WO 02/077227中描述。

Zn指和用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的，并在以下中详细描述：美国专利号6,140,0815；789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；和6,200,759；国际专利公开号WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536；和WO 03/016496。

在某些实施例中，DNA靶向部分包含Zn指结构域，其包含与靶DNA序列结合(以序列特异性方式)的工程化锌指。在一些实施例中，Zn指结构域包含一个Zn指或其片段。在一些实施例中，Zn指结构域包含多个Zn指(或其片段)，例如2、3、4、5、6或更多个Zn指(并且任选地，不超过12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个Zn指)。在一些实施例中，Zn指结构域包含至少三个Zn指。在一些实施例中，Zn指结构域包含四个、五个或六个Zn指。在一些实施例中，Zn指结构域包含8、9、10、11或12个Zn指。在一些实施例中，包含三个Zn指的Zn指结构域识别包含9或10个核苷酸的靶DNA序列。在一些实施例中，包含四个Zn指的Zn指结构域识别包含12至14个核苷酸的靶DNA序列。在一些实施例中，包含六个Zn指的Zn指结构域识别包含18至21个核苷酸的靶DNA序列。

在一些实施例中，靶向结构域包含双手Zn指蛋白。双手锌指蛋白是这样的蛋白质，其中两簇锌指被插入的氨基酸分开，使得两个锌指结构域与两个不连续的靶DNA序列结合。双手型锌指结合蛋白的实例是SIP1，其中四个锌指的簇位于蛋白质的氨基末端处，并且三个Zn指的簇位于羧基末端处(参见Remade等人(1999)EMBO Journal[欧洲分子生物学杂志]18(18):5073-5084)。这些结构域中的每一簇锌指均能够与独特的靶序列结合，并且这两个靶序列之间的间隔可以包含许多核苷酸。

在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分，该靶向部分包含工程改造的DNA结合结构域(DBD)，例如，Zn指结构域，其包含与靶序列(例如可操作地连接至靶基因(例如，MYC)的启动子或转录起始位点(TSS)序列，例如转录调节元件近侧的序列，例如，包含靶基因(例如，MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，例如锚序列近侧的序列)结合的Zn指(ZFN)。在一些实施例中，ZFN可被工程改造以将表观遗传效应分子携带至靶位点。在一些实施例中，靶向部分包含含有2、3、4、5、6、7或8个锌指的Zn指结构域。本文披露的示例性靶向部分的氨基酸序列列于表4中。编码本文披露的示例性靶向部分的核苷酸序列列于表5中。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物或系统包含具有表4中列出的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列的靶向部分。在一些实施例中，本文描述的核酸包含表5中列出的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。

表4：示例性靶向部分的氨基酸序列

表5：示例性靶向部分的核苷酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分，该靶向部分包含工程改造的DNA结合结构域(DBD)，例如，Zn指结构域，其包含与小鼠基因组中的靶序列(例如可操作地连接至靶基因(例如，MYC)的启动子或转录起始位点(TSS)序列，例如转录调节元件近侧的序列，例如，包含靶基因(例如，MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)的锚序列，例如锚序列近侧的序列)结合的Zn指(ZFN)。在一些实施例中，ZFN可被工程改造以将表观遗传效应分子携带至靶位点。在一些实施例中，靶向部分包含含有2、3、4、5、6、7或8个锌指的Zn指结构域。本文披露的示例性靶向部分的氨基酸序列列于表14中。编码本文披露的示例性靶向部分的核苷酸序列列于表15中。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物或系统包含具有表14中列出的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列的靶向部分。在一些实施例中，本文描述的核酸包含表15中列出的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。

表14：示例性小鼠特异性靶向部分的氨基酸序列

表15：示例性小鼠特异性靶向部分的核苷酸序列

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核酸分子

在一些实施例中，靶向部分是或包含来自核酸酶的DNA结合结构域。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列(如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII)是已知的。还参见美国专利号5,420,032；6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res[核酸研究].25:3379-3388；Dujon等人(1989)Gene[基因]82:115-118；Perler等人(1994)NucleicAcids Res[核酸研究].22:1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet[遗传学趋势].12:224-228；Gimble等人(1996)；J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]263:163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol[分子生物学杂志].280:345-353和新英格兰生物实验室目录。另外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可以被工程化以结合非天然靶位点。参见例如，Chevalier等人(2002)Molec.Cell[分子细胞]10:895-905；Epinat等人(2003)NucleicAcids Res[核酸研究].31:2952-2962；Ashworth等人(2006)Nature[自然]441:656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy[目前的基因疗法]7:49-66；美国专利公开号2007/0117128。

在一些实施例中，DNA靶向部分包含或者是核酸。在一些实施例中，可以包含在DNA靶向部分中的核酸可以是或包含DNA、RNA和/或人工或合成的核酸或核酸类似物或模拟物。例如，在一些实施例中，核酸可以是或包含以下中的一个或多个：基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、肽核酸(PNA)、肽-寡核苷酸缀合物、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、聚酰胺、形成三链体的寡核苷酸、反义寡核苷酸、tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子(例如，靶向本文所述的非编码RNA和/或靶向与本文所述的靶基因组复合物相关联的特定基因的表达产物)等。在一些实施例中，核酸可以包含一个或多个作为并非天然存在的DNA或RNA残基的残基、可以包含一个或多个是/不是磷酸二酯键的连接(例如，可以是例如硫代磷酸酯键等)和/或可以包含一个或多个修饰，诸如，例如2'O修饰，诸如2'-OmeP。可用于制备合成核酸的多种核酸结构是本领域已知的(参见例如，WO 2017/062862l和WO 2014/012081)，本领域技术人员将理解，可以根据本披露利用这些核酸结构。

适用于表达阻遏物中，例如DNA靶向部分中的核酸可以包括但不限于DNA、RNA、经修饰的寡核苷酸(例如，化学修饰，如改变主链连接、糖分子和/或核酸碱基的修饰)和人工核酸。在一些实施例中，核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、肽核酸(PNA)或肽寡核苷酸缀合物、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、聚酰胺、形成三链体的寡核苷酸、修饰的DNA、反义DNA寡核苷酸、tRNA、mRNA、rRNA、修饰的RNA、miRNA、gRNA和siRNA或其他RNA或DNA分子。

在一些实施例中，DNA靶向部分包含的核酸的长度是约15-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、110-200、120-200、130-200、140-200、150-200、160-200、170-200、180-200、190-200、215-190、20-190、30-190、40-190、50-190、60-190、70-190、80-190、90-190、100-190、110-190、120-190、130-190、140-190、150-190、160-190、170-190、180-190、15-180、20-180、30-180、40-180、50-180、60-180、70-180、80-180、90-180、100-180、110-180、120-180、130-180、140-180、150-180、160-180、170-180、15-170、20-170、30-170、40-170、50-170、60-170、70-170、80-170、90-170、100-170、110-170、120-170、130-170、140-170、150-170、160-170、15-160、20-160、30-160、40-160、50-160、60-160、70-160、80-160、90-160、100-160、110-160、120-160、130-160、140-160、150-160、215-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、70-150、80-150、90-150、100-150、110-150、120-150、130-150、140-150、15-140、20-140、30-140、40-140、50-140、60-140、70-140、80-140、90-140、100-140、110-140、120-140、130-140、15-130、20-130、30-130、40-130、50-130、60-130、70-130、80-130、90-130、100-130、110-130、120-130、215-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、90-120、100-120、110-120、15-110、20-110、30-110、40-110、50-110、60-110、70-110、80-110、90-110、100-110、15-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100、15-90、20-90、30-90、40-90、50-90、60-90、70-90、80-90、15-80、20-80、30-80、40-80、50-80、60-80、70-80、15-70、20-70、30-70、40-70、50-70、60-70、15-60、20-60、30-60、40-60、50-60、15-50、20-50、30-50、40-50、15-40、20-40、30-40、15-30、20-30、或15-20个核苷酸、或其间的任何范围。

效应子部分

在一些实施例中，本披露的表达阻遏物包含一个或多个效应子部分。在一些实施例中，当用作本文所述的表达物阻遏物或表达阻遏系统的一部分时，效应子部分降低细胞中靶基因的表达。

在一些实施例中，效应子部分具有与靶向部分的结合不相关的功能。例如，效应子部分可以靶向(例如，结合)被靶向部分靶向的基因组序列元件近侧的基因组序列元件或基因组复合物组分，或者募集转录因子。作为进一步的实例，效应子部分可以包含酶活性，例如遗传修饰功能。

在一些实施例中，效应子部分包含表观遗传修饰部分。在一些实施例中，效应子部分包含DNA修饰功能，例如DNA甲基转移酶。在一些实施例中，效应子部分是或包含选自以下的蛋白质：MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L或其任一项的功能变体或片段。

在一些实施例中，效应子部分包含转录阻遏物。在一些实施例中，转录阻遏物阻断刺激或促进转录(例如靶基因的转录)的因子的募集。在一些实施例中，转录阻遏物募集抑制例如转录(例如靶基因的转录)的因子。在一些实施例中，效应子部分，例如转录阻遏物，是或包含选自以下的蛋白质：KRAB、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任一项的功能变体或片段。

在一些实施例中，效应子部分例如直接或间接地促进表观遗传修饰。例如，效应子部分可以通过募集表观遗传修饰染色质的内源性蛋白质来间接促进表观遗传修饰。效应子部分可以通过催化表观遗传修饰直接促进表观遗传修饰，其中效应子部分具有酶活性并直接在染色质上放置表观遗传标志物。

在一些实施例中，效应子部分包含组蛋白修饰功能，例如组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或组蛋白脱乙酰酶活性。在一些实施例中，效应子部分是或包含选自以下的蛋白质：KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66或其任一项的功能变体或片段。在一些实施例中，效应子部分是或包含选自以下的蛋白质：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9，或其任一项的功能变体或片段。

在一些实施例中，效应子部分包含具有本文所述功能的蛋白质。在一些实施例中，效应子部分是或包含选自以下的蛋白质：KRAB(例如，根据NP_056209.2或NM_015394.5编码的蛋白质)；SET结构域(例如，以下的SET结构域：SETDB1(例如，根据NP_001353347.1或NM_001366418.1编码的蛋白质)；EZH2(例如，根据NP-004447.2或由NM_004456.5编码的蛋白质)；G9A(例如，根据NP_001350618.1或由NM_001363689.1编码的蛋白质)；或SUV39H1(例如，根据NP_003164.1或由NM_003173.4编码的蛋白质))；组蛋白去甲基化酶LSD1(例如，根据NP_055828.2或由NM_015013.4编码的蛋白质)；FOG1(例如，FOG1的N末端残基)(例如，根据NP_722520.2或由NM_153813.3编码的蛋白质)；或KAP1(例如，根据NP_005753.1或NM_005762.3编码的蛋白质)；其任一项的功能片段或变体，或具有与任何上述序列具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序列的多肽。

在一些实施例中，效应子部分是或包含选自以下的蛋白质：DNMT3A(例如，人DNMT3A)(例如，根据NP_072046.2或由NM_022552.4编码的蛋白质)；DNMT3B(例如，根据NP_008823.1或由NM_006892.4编码的蛋白质)；DNMT3L(例如，根据NP_787063.1或由NM_175867.3编码的蛋白质)；DNMT3A/3L复合物，细菌MQ1(例如，根据CAA35058.1或P15840.3)；其任一项的功能片段，或具有与任何上述序列具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序列的多肽。

在另一方面，本披露涉及包含一个或多个(例如，一个)靶向部分和一个或多个效应子部分的表达阻遏物或多肽，其中一个或多个效应子部分是或包含Krueppel相关盒(KRAB)，例如，如根据NP_056209.2，或NM_015394.5编码的蛋白质或其功能变体或片段。在一些实施例中，KRAB是合成的KRAB构建体。在一些实施例中，KRAB包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列：

在一些实施例中，KRAB效应子部分由SEQ ID NO:51的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核苷酸序列包含SEQ ID NO:51的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

在一些实施例中，用于本文所述的多肽或表达阻遏物的KRAB是变体，例如，相对于SEQ ID NO:18的KRAB序列包含一个或多个突变。在一些实施例中，KRAB变体包含相对于SEQID NO:18的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。

在一些实施例中，多肽或表达阻遏物是包含作为或包含KRAB的效应子部分和DNA靶向部分的融合蛋白。在一些实施例中，靶向部分是或包含锌指结构域、TAL结构域或CRISPR/Cas结构域，例如包含CRISPR/Cas蛋白，例如dCas9蛋白。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物包含本文所述的另外部分。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物降低靶基因(例如MYC)的表达。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物可用于调节(例如，降低)基因表达的方法、治疗病症的方法或对本文所述的靶基因(例如MYC)或转录控制元件进行表观遗传修饰(例如，代替表达阻遏系统)的方法。在一些实施例中，表达阻遏系统包含两个或更多个(例如，两个、三个或四个)表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含效应子部分，该阻遏物结构域包含SEQ ID NO:18的KRAB序列，或其功能变体或片段。

在另一方面，本披露涉及包含一个或多个(例如一个)靶向部分和一个或多个效应子部分的表达阻遏物或多肽，其中一个或多个效应子部分是或包含MQ1，例如细菌MQ1，或其功能变体或片段。在一些实施例中，MQ1是软体螺原体(Mollicutes spiroplasma)MQ1。在一些实施例中，MQ1是单比亚螺原体(Spiroplasma monobiae)MQ1。在一些实施例中，MQ1是来自菌株ATCC 33825和/或对应于Uniprot ID P15840的MQ1。在一些实施例中，MQ1包含SEQID NO:19的氨基酸序列。在一些实施例中，MQ1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的效应子结构域包含SEQ ID NO:19或87或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

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在一些实施例中，MQ1由SEQ ID NO:52或132的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:52、132的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

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在一些实施例中，用于本文所述的多肽或表达阻遏物的MQ1是变体，例如，相对于野生型MQ1(SEQ ID NO:19)包含一个或多个突变。在一些实施例中，MQ1变体包含相对于野生型MQ1，例如SEQ ID NO:19的MQ1的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施例中，MQ1变体包含K297P取代。在一些实施例中，MQ1变体包含N299C取代。在一些实施例中，MQ1变体包含E301Y取代。在一些实施例中，MQ1变体包含Q147L取代(例如，并且相对于野生型MQ1具有降低的DNA甲基转移酶活性)。在一些实施例中，MQ1变体包含K297P、N299C和E301Y取代(例如，并且相对于野生型MQ1具有降低的DNA结合亲和力)。在一些实施例中，MQ1变体包含Q147L、K297P、N299C和E301Y取代(例如，并且相对于野生型MQ1具有降低的DNA甲基转移酶活性和DNA结合亲和力)。

在一些实施例中，多肽或表达阻遏物是融合蛋白，其包含效应子部分(其是或包含MQ1)和靶向部分(其是或包含锌指结构域、TAL结构域或CRISPR/Cas结构域、dCas9结构域)。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物包含本文所述的另外部分。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物降低靶基因(例如MYC)的表达。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物可用于调节(例如，降低)基因表达的方法、治疗病症的方法或对本文所述的靶基因(例如MYC)或转录控制元件进行表观遗传修饰(例如，代替表达阻遏系统)的方法。在一些实施例中，表达阻遏系统包含两个或更多个(例如，两个、三个或四个)表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含效应子结构域，该效应子结构域包含MQ1，例如细菌MQ1，或其功能变体或片段。

在另一方面，本披露涉及包含一个或多个(例如一个)靶向部分和一个或多个效应子部分的表达阻遏物或多肽，其中一个或多个效应子部分是或包含DNMT1，例如人DNMT1，或其功能变体或片段。在一些实施例中，DNMT1是人DNMT1，例如对应于基因ID 1786，例如对应于UniProt ID P26358.2。在一些实施例中，DNMT1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的效应子结构域包含根据SEQ ID NO:20的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列：

在一些实施例中，DNMT1由SEQ ID NO:53的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:53的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列

在一些实施例中，用于本文所述的多肽或表达阻遏物的DNMT1是变体，例如，相对于SEQ ID NO:20的DNMT序列包含一个或多个突变。在一些实施例中，效应子结构域包含相对于野生型DNMT1的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施例中，多肽是包含作为或含有DNMT1的阻遏物结构域和靶向部分的融合蛋白。在一些实施例中，靶向部分是或包含锌指结构域、TAL结构域或CRISPR/Cas结构域，例如dCas9结构域。在一些实施例中，表达阻遏系统包含两个或更多个(例如，两个、三个或四个)表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含效应子部分，该效应子部分包含DNMT1，或其功能变体或片段。

在另一方面，本披露涉及包含一个或多个(例如一个)靶向部分和一个或多个效应子部分的表达阻遏物或多肽，其中一个或多个效应子部分是或包含DNMT3a/3L复合物，或其功能变体或片段。在一些实施例中，DNMT3a/3L复合物是融合构建体。在一些实施例中，DNMT3a/3L复合物包含DNMT3A(例如人DNMT3A)(例如根据NP_072046.2或由NM_022552.4编码的蛋白质)。在一些实施例中，DNMT3a/3L复合物包含DNMT3L(例如根据NP_787063.1或由NM_175867.3编码的蛋白质)。在一些实施例中，DNMT3a/3L包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的效应子结构域包含SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:114或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

在一些实施例中，DNMT3a/3L由SEQ ID NO:54的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:54的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

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在一些实施例中，用于本文所述的多肽或表达阻遏物的DNMT3a/3L是变体，例如，相对于SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:114的DNMT3a/3L包含一个或多个突变。在一些实施例中，DNMT3a/3L变体包含相对于SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:114的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施例中，多肽或表达阻遏物是包含作为或含有DNMT3a/3L的效应子部分和靶向部分的融合蛋白。在一些实施例中，靶向部分是或包含锌指结构域、TAL结构域或CRISPR/Cas结构域，例如dCas9结构域。在一些实施例中，表达阻遏系统包含两个或更多个(例如，两个、三个或四个)表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含效应子部分，该效应子部分包含DNMT3a/3L，或其功能变体或片段。

在一些实施例中，效应子部分是或包含多肽。在一些实施例中，效应子部分是或包含核酸。在一些实施例中，效应子部分是化学品，例如，调节胞嘧啶I或腺嘌呤(A)的化学品(例如，亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵)。在一些实施例中，效应子部分具有酶活性(例如，甲基转移酶、去甲基化酶、核酸酶(例如，Cas9)或脱氨酶活性)。效应子部分可以是或包含以下中的一种或多种：分子、肽、核酸、纳米颗粒、适体或具有差PK/PD的药物剂。

在一些实施例中，效应子部分可以包含肽配体、全长蛋白质、蛋白质片段、抗体、抗体片段和/或靶向适体。在一些实施例中，蛋白质可以结合受体，如细胞外受体、神经肽、激素肽、肽药物、毒性肽、病毒或微生物肽、合成肽、或激动剂或拮抗剂肽。

在一些实施例中，效应子部分可以包含抗原、抗体、抗体片段例如像单结构域抗体、配体或受体例如像胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-2受体2、胆囊收缩素B(CCKB)或生长抑素受体、肽治疗剂例如像与特定细胞表面受体如G蛋白偶联受体(GPCR)或离子通道结合的那些、天然生物活性肽的合成或类似物肽、抗微生物肽、成孔肽、肿瘤靶向或细胞毒性肽、或降解或自毁肽如凋亡诱导肽信号或光敏肽。

用于如本文所述效应子部分的肽或蛋白质部分还可以包括小抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如像单链抗体、纳米抗体(参见例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[作为治疗剂的纳米抗体：小分子抗体的巨大机会]Drug Discov Today[当代药物发现]:21(7):1076-113)。这样的小抗原结合肽可以结合例如细胞质抗原、核抗原、细胞器内抗原。

在一些实施例中，效应子部分包含显性负性组分(例如，显性负性部分)，例如蛋白质，该蛋白质识别并结合序列(例如，锚序列，例如，CTCF结合基序)，但具有无活性(例如，突变的)二聚化结构域，例如，无法形成功能性锚序列介导的接合的二聚化结构域，或与基因组复合体的组分(例如，转录因子亚基等)结合从而阻止形成功能性转录因子的二聚化结构域，等。例如，可以改变CTCF的锌指结构域以使其结合特定的锚序列(通过添加识别侧翼核酸的锌指)，同时改变同二聚化结构域，以防止工程改造的CTCF与内源形式的CTCF之间的相互作用。在一些实施例中，显性负组分包含对靶锚序列介导的接合内的锚序列具有选定结合亲和力的合成成核多肽。在一些实施例中，结合亲和力可以比与靶锚序列相关联的内源成核多肽(例如，CTCF)的结合亲和力高或低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。合成成核多肽可以与对应的内源成核多肽具有30％-90％、30％-85％、30％-80％、30％-70％、50％-80％、50％-90％的氨基酸序列同一性。成核多肽可以调节(例如，破坏)，如通过竞争性结合，例如与内源成核多肽与其锚序列的结合竞争。

在一些实施例中，效应子部分包含抗体或其片段。在一些实施例中，经由使用效应子部分来改变靶基因(例如，MYC)表达，这些效应子部分是或包含一种或多种抗体或其片段。在一些实施例中，经由使用效应子部分来改变基因表达，这些效应子部分是或包含一种或多种抗体(或其片段)和dCas9。

在一些实施例中，用于效应子部分的抗体或其片段可以是单克隆的。抗体可以是融合物、嵌合抗体、非人源化抗体、部分或完全人源化抗体等。如本领域技术人员将理解的，所使用的一种或多种抗体的形式可以相同或不同，这取决于给定的靶标。

在一些实施例中，效应子部分包含结合成核分子、编码结合成核分子的核酸、或其组合。结合成核分子可以是，例如，CTCF、黏连蛋白、USF1、YY1、TATA-盒结合蛋白相关因子3(TAF3)、ZNF143结合基序，或促进锚序列介导的结合形成的另一种多肽。结合成核分子可以是内源多肽或其他蛋白质，如转录因子，例如自身免疫调节因子(AIRE)，另一种因子，例如X失活特异性转录物(XIST)，或被工程化以识别感兴趣的特定DNA序列的工程多肽，例如具有用于序列识别的锌指、亮氨酸拉链或bHLH结构域。结合成核分子可以调节锚序列介导的结合内或周围的DNA相互作用(例如，与由靶向部分靶向的基因组序列元件相关联或包含该元件)。例如，结合成核分子可以向锚序列募集其他因子，改变锚序列介导的结合形成或破坏。

结合成核分子还可以具有用于同源或异源二聚化的二聚化结构域。(例如，内源和工程化的)一种或多种结合成核分子可以相互作用，以形成锚序列介导的结合。在一些实施例中，结合成核分子被工程化以进一步包括稳定化结构域，例如内聚相互作用结构域，以稳定锚序列介导的结合。在一些实施例中，结合成核分子被工程化以结合靶序列，例如，靶序列结合亲和力被调节。在一些实施例中，结合成核分子被选择或工程化为对锚序列介导的结合内的锚序列具有选定的结合亲和力。

结合成核分子和它们相应的锚序列可以通过使用在CTCF中含有失活突变的细胞和染色体构象捕获或基于3C的方法(例如，Hi-C或高通量测序)来鉴定，以检查拓扑相关的结构域，例如在不存在CTCF的情况下远端DNA区域或基因座之间的拓扑相互作用。还可以鉴定长程DNA相互作用。另外的分析可以包括ChIA-PET分析，其使用诱饵，如黏连蛋白、YY1或USF1、ZNF143结合基序和MS来鉴定与诱饵相关联的复合物。

在一些实施例中，效应子部分包含蛋白质的DNA结合结构域。在一些实施例中，效应子部分的DNA结合结构域增强或改变调节剂的靶向，但不能单独实现调节剂的完全靶向(例如，仍需要靶向部分来实现调节剂的靶向)。在一些实施例中，DNA结合结构域增强调节剂的靶向。在一些实施例中，DNA结合结构域增强调节剂的功效。本领域技术人员已知，DNA结合蛋白具有独特的结构基序，例如其在结合DNA方面起关键作用。在一些实施例中，DNA结合结构域包含螺旋-转角-螺旋(HTH)基序，这是阻遏蛋白中常见的DNA识别基序。这种基序包含两个螺旋，其中一个识别DNA(又名识别螺旋)，其侧链提供结合特异性。此类基序通常用于调节参与发育过程的蛋白质。有时多于一种蛋白质竞争相同的序列或识别相同的DNA片段。不同的蛋白质对同一序列或DNA构象的亲和力可能不同，分别通过H键、盐桥和范德华相互作用。

在一些实施例中，DNA结合结构域包含螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序。具有HhH结构基序的DNA结合蛋白可能参与非序列特异性DNA结合，这种结合经由蛋白主链氮和DNA磷酸基团之间的氢键形成而发生。

在一些实施例中，DNA结合结构域包含螺旋-环-螺旋(HLH)基序。具有HLH结构基序的DNA结合蛋白是转录调节蛋白，并且主要与多种发育过程相关。就残基而言，HLH结构基序比HTH或HhH基序更长。许多这些蛋白质相互作用，以形成同源和异源二聚体。一个结构基序由两个长螺旋区域构成，其中N末端螺旋与DNA结合，而复合物区域允许蛋白质二聚化。

在一些实施例中，DNA结合结构域包含亮氨酸拉链基序。在一些转录因子中，具有DNA的二聚体结合位点形成亮氨酸拉链。该基序包括两个两亲性螺旋，每个亚基一个，相互作用产生左旋螺旋卷曲超级二级结构。亮氨酸拉链是一个螺旋中规则间隔的亮氨酸残基与来自相邻螺旋的亮氨酸的交错接合。大多数情况下，亮氨酸拉链中涉及的螺旋表现出七残基序列(abcdefg)，其中残基a和d是疏水的，其他残基是亲水的。亮氨酸拉链基序可以介导同源或异源二聚体的形成。

在一些实施例中，DNA结合结构域包含Zn指结构域，其中Zn⁺⁺离子由2个Cys和2个His残基配位。这种转录因子包括化学计量为ββ‘α的三聚体。Zn⁺⁺配位的一个明显效果是稳定小的复合物结构，而不是疏水的核心残基。每个锌指以构象相同的方式与双螺旋大沟中连续的三碱基对片段相互作用。蛋白质-DNA相互作用由两个因素决定：(i)α-螺旋和DNA片段之间的H键相互作用，主要在Arg残基和鸟嘌呤碱基之间。(ii)与DNA磷酸主链的H键相互作用，主要是与Arg和His的相互作用。可替代的锌指基序使Zn⁺⁺与6个Cys螯合。

在一些实施例中，DNA结合结构域包含TATA盒结合蛋白(TBP)。TBP首先被鉴定为II类起始因子TFIID的组分。这些结合蛋白参与所有三种核RNA聚合酶的转录，在每种聚合酶中充当亚基。TBP的结构显示了具有89-90个氨基酸的两个α/β结构域。TBP的C末端或核心区域以高亲和力与TATA共有序列(TATAa/tAa/t，SEQ ID NO:210)结合，识别小沟决定簇并促进DNA弯曲。TBP像一个分子马鞍(molecular saddle)。结合侧衬有10股反平行β-折叠的中心8股。上表面包含四个α-螺旋并与转录机制的各种组分结合。

在一些实施例中，DNA结合结构域是或包含转录因子。转录因子(TF)可以是模块化蛋白质，包含负责特异性识别碱基序列的DNA结合结构域和一个或多个可以激活或抑制转录的效应子结构域。TF与染色质相互作用，并且募集蛋白质复合物作为共激活子或共阻遏物。

在一些实施例中，效应子部分包含一种或多种RNA(例如gRNA)和dCas9。在一些实施例中，一种或多种RNA经由dCas9和靶特异性指导RNA靶向基因组序列元件。如本领域技术人员将理解的，用于靶向的RNA可以相同或不同，这取决于给定的靶标。效应子部分可以包含适体，如寡核苷酸适体或肽适体。适体部分是寡核苷酸适体或肽适体。

效应子部分可以包含寡核苷酸适体。寡核苷酸适体是单链DNA或RNA(ssDNA或ssRNA)分子，其可以以高亲和力和特异性结合预先选择的靶标(包括蛋白质和肽)。

寡核苷酸适体是可以通过重复多轮的体外选择或等效地SELEX(通过指数富集的配体系统进化)而工程化以结合到各种分子靶标(例如小分子、蛋白质、核酸甚至细胞、组织和生物体)的核酸种类。适体提供有分辨能力的分子识别，并且可以通过化学合成来产生。另外，适体具有期望的储存特性，并且在治疗应用中几乎没有引起免疫原性。

DNA和RNA适体二者均显示出对各种靶标的稳健结合亲和力。例如，已经选择了DNA和RNA适体用于溶菌酶、凝血酶、人类免疫缺陷病毒反式反应响应元件(HIV TAR)、氯化血红素、干扰素γ、血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺特异性抗原(PSA)、多巴胺和非经典癌基因、热休克因子1(HSF1)。

基于适体的血浆蛋白质谱的诊断技术包括适体血浆蛋白质组学。这项技术将使未来的多生物标记蛋白质测量成为可能，可以有助于疾病相比于健康状态的诊断区分。

效应子部分可以包含肽适体部分。肽适体具有一个(或多个)短可变肽结构域，包括具有低分子量12kDa-14kDa的肽。可以将肽适体设计为特异性结合并干扰细胞内部的蛋白质-蛋白质相互作用。

肽适体是经选择或经工程化以结合特定靶分子的人工蛋白质。这些蛋白质包括可变序列的一种或多种肽复合物。它们通常是从组合文库中分离出来的，并且常常随后通过定向突变或多轮的可变区诱变和选择而得到改进。在体内，肽适体可以结合细胞蛋白靶标并发挥生物学作用，包括干扰其靶向的分子与其他蛋白的正常蛋白相互作用。特别地，针对附着于转录因子激活结构域的靶蛋白筛选附着于转录因子结合结构域的可变肽适体复合物。将肽适体经由该选择策略与其靶标的体内结合检测为下游酵母标记基因的表达。此类实验鉴定了与适体结合的特定蛋白质，以及适体破坏的蛋白质相互作用以引起给定表型。另外，用适当的官能部分衍生的肽适体可引起其靶蛋白的特异性翻译后修饰，或改变靶标的亚细胞定位。肽适体还可以在体外识别靶标。已发现它们可代替生物传感器中的抗体，并用于从包含无活性和活性蛋白形式的群体中检测活性蛋白同工型。其中肽适体“头部”与独特的序列双链DNA“尾部”共价连接的称为蝌蚪的衍生物可通过其DNA尾部的PCR(例如，使用定量实时聚合酶链反应)定量混合物中的稀缺靶分子。

可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最多的是酵母双杂交系统。肽适体还可以选自通过噬菌体展示和其他表面展示技术(例如mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示)构建的组合肽文库。这些实验程序也称为生物淘选。在从生物淘选获得的肽中，模拟表位可被认为是一种肽适体。从组合肽文库淘选的肽已存储在名为MimoDB的特殊数据库中。

示例性效应子部分可以包括但不限于：泛素、作为泛素连接酶抑制剂的双环肽、转录因子、DNA和蛋白质修饰酶如拓扑异构酶、拓扑异构酶抑制剂如拓扑替康、DNA甲基转移酶如DNMT家族(例如，DNMT3A、DNMT3B、DNMT3a/3L、MQ1)、蛋白质甲基转移酶(例如，病毒赖氨酸甲基转移酶(vSET)、蛋白质-赖氨酸N-甲基转移酶(SMYD2)、脱氨酶(例如，APOBEC、UG1)、组蛋白甲基转移酶如zeste增强子同源物2(EZH2)、PRMT1、组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶(Setdb1)、组蛋白甲基转移酶(SET2)、常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2(G9a)、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(SUV39H1)和G9a)、组蛋白脱乙酰酶(例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3)、在DNA去甲基化中起作用的酶(例如，TET家族酶催化5-甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶和更高级的氧化衍生物)、蛋白质去甲基化酶如KDM1A和赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)、解旋酶如DHX9、脱乙酰酶(例如，瑟土因1、2、3、4、5、6或7)、激酶、磷酸酶、DNA嵌入剂如溴化乙锭、SYBR green和原黄素、外排泵抑制剂如肽模拟物如苯丙氨酸精氨酸基β-萘酰胺或喹啉衍生物、核受体激活剂和抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂如参与溶酶体贮积病的那些、蛋白质合成抑制剂、核酸酶(例如，Cpf1、Cas9、锌指核酸酶)、蛋白质的特定结构域(例如KRAB结构域)及其一个或多个的融合物(例如，dCas9-DNMT、dCas9-MQ1、dCas9-KRAB)。

在一些实施例中，可以通过本领域技术人员已知的方法确定候选结构域适合用作效应子部分。例如，候选效应子部分可以通过以下方式进行测试：测定当候选效应子部分存在于细胞核中并适当定位(例如，定位至靶基因或与所述靶基因可操作地连接的转录控制元件，例如，通过靶向部分)时，候选效应子部分是否降低细胞中靶基因的表达，例如，降低靶基因编码的RNA转录物的水平(例如，通过RNASeq或RNA印迹测量)或降低靶基因编码的蛋白质的水平(例如，通过ELISA测量)。

在一些实施例中，表达阻遏物包含多个效应子部分，其中每个效应子部分不可检测地结合(例如，不结合)另一个效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包含含有第一效应子部分的第一表达阻遏物和含有第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中第一效应子部分不会可检测地结合，例如，不结合第二效应子部分。

在一些实施例中，表达阻遏系统包含多个表达阻遏物，其中多个表达阻遏物的每个成员包含应子部分，其中每个应子部分不会可检测地结合，例如不结合另一个应子部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包含含有第一效应子部分的第一表达阻遏物和含有第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中第一效应子部分不会可检测地结合，例如，不结合第二效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包含含有第一效应子部分的第一表达阻遏物和含有第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中第一效应子部分不会可检测地结合，例如，不结合另一个第一效应子部分，并且第二效应子部分不会可检测地结合，例如不结合另一个第二效应子部分。在一些实施例中，用于本文所述的组合物和方法中的效应子部分以单体(例如，非二聚体)状态起作用。

在一些实施例中，效应子部分是或包含例如调节染色质的二维结构的表观遗传修饰部分(即，以改变其二维表达的方式调节染色质的结构)。

可用于本披露的方法和组合物中的表观遗传修饰部分包括影响表观遗传标志物的药剂，例如，DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白糖基化、组蛋白磷酸化和RNA相关沉默。可以靶向如本文所述基因组序列元件的示例性表观遗传酶包括DNA甲基化酶(例如，DNMT3a、DNMT3b、DNMT3a/3L、MQ1)、DNA去甲基化(例如，TET家族)、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶(例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3)、瑟土因1、2、3、4、5、6或7、赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)、组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶(Setdb1)、常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2(G9a)、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(SUV39H1)、zeste增强子同源物2(EZH2)、病毒赖氨酸甲基转移酶(vSET)、组蛋白甲基转移酶(SET2)和蛋白质-赖氨酸N-甲基转移酶(SMYD2)。此类表观遗传修饰剂的实例例如，在de Groote等人Nuc.Acids Res.[核酸研究](2012):1-18中描述。

在一些实施例中，在本文中有用的表达阻遏物(例如，包括表观遗传修饰部分)包括或是以下文献中描述的构建体：Koferle等人Genome Medicine[基因组医学]7.59(2015):1-3，该文献通过引用并入本文。例如，在一些实施例中，表达阻遏物包含或是Koferle等人的表1中发现的构建体，例如，表1中描述的组蛋白脱乙酰酶、组蛋白甲基转移酶、DNA去甲基化、或H3K4和/或H3K9组蛋白去甲基化酶(例如dCas9-p300、TALE-TET1、ZF-DNMT3A或TALE-LSD1)。

在一些实施例中，效应子部分包含基因编辑系统的组分，例如CRISPR/Cas结构域，例如Zn指结构域，例如TAL效应子结构域。在一些实施例中，表观遗传修饰部分可以包含与gRNA和靶向的核酸酶(例如Cas9，例如野生型Cas9、切口酶Cas9(例如，Cas9 D10A)、无催化活性的Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1、或C2C3，或编码这样的核酸酶的核酸)连接的多肽(例如肽或蛋白质部分)。

如本文所用，“效应子结构域的生物活性部分”是维持效应子结构域(例如，“最小”或“核心”结构域)的功能(例如，完全、部分、最小)的部分。在一些实施例中，dCas9与表观遗传修饰剂(如DNA甲基化酶或在DNA去甲基化中起作用的酶，例如DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L、DNMT抑制剂、其组合、TET家族酶、蛋白质乙酰转移酶或脱乙酰酶、dCas9-DNMT3a/3L、dCas9-DNMT3a/3L/KRAB、dCas9/VP64)的一个或多个效应子结构域的全部或部分融合，产生了与多肽连接的嵌合蛋白，并可用于本文所述的方法。包含这种嵌合蛋白的效应子部分被称为遗传修饰部分(因为其使用了基因编辑系统组分Cas9)或表观遗传修饰部分(因为其使用了表观遗传修饰剂的效应子结构域)。

在一些实施例中，所提供的技术被描述为包含特异性靶向靶基因的gRNA。在一些实施例中，靶基因是癌基因、肿瘤抑制基因或MYC错配障碍相关基因。在一些实施例中，靶基因是MYC。

在一些实施例中，本文提供的技术包括通过将本文所述的一个或多个遗传修饰部分(例如，CRISPR系统组分)连接至靶向部分作为融合分子的一部分，将这样的部分递送至受试者(例如，递送至受试者的细胞核或组织)的方法。在一些实施例中，本文提供的技术包括通过将一种或多种遗传修饰部分(例如，CRISPR系统组分)包封在脂质纳米粒子中，将本文所述的一种或多种遗传修饰部分(例如，CRISPR系统组分)递送至受试者，例如受试者的细胞核或组织的方法。

另外的部分

表达阻遏物可进一步包含一个或多个另外的部分(例如，除了一个或多个靶向部分和一个或多个效应子部分之外)。在一些实施例中，另外的部分选自标记部分或监测部分、可切割部分(例如，位于DNA靶向部分和效应子部分之间或位于多肽的N末端或C末端处的可切割部分)、小分子、膜易位多肽、或药物剂部分。

示例性表达阻遏物

以下示例性表达阻遏物仅出于说明目的而呈现，并不旨在进行限制。

在一些实施例中，表达阻遏物包含含有dCas9(例如金黄色葡萄球菌dCas9)的靶向部分，和含有MQ1(例如细菌MQ1)的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ ID NO:68(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))的核酸序列编码。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ ID NO:119的核酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:68、119的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-MQ1核苷酸序列：

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在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:35或151的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:35、151的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-MQ1蛋白序列：

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在一些实施例中，表达阻遏物包含含有dCas9(例如化脓性链球菌dCas9)的靶向部分，和含有KRAB(例如KRAB结构域)的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ IDNO:67(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))的核酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:67的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-KRAB核苷酸序列：

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在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:34或150的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:34、150的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-KRAB蛋白序列：

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在一些实施例中，表达阻遏物包含含有dCas9(例如金黄色葡萄球菌dCas9)的DNA靶向部分，和含有DNMT1(例如人DNMT1)的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQID NO:69(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))的核酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:69的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-DNMT1核苷酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:36或152的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:36、152的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-DNMT1蛋白序列：

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在一些实施例中，表达阻遏物包含含有dCas9(例如金黄色葡萄球菌dCas9)的DNA靶向部分，和含有DNMT13a/3L的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ ID NO:70(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))的核酸序列编码。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:70的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-DNMT3a/3L核苷酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:37或153的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

dCas9-DNMT3a/3L蛋白序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含含有Zn指结构域的靶向部分和含有KRAB(例如KRAB结构域)的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ ID NO:55、56、57、58、59、60、189、194、195和196中任一个的核酸序列(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))编码。这些示例性表达阻遏物的核酸序列披露于表6中。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:55-60、189、194-196中任一个的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。在一些实施例中，核酸序列包含聚A序列，而在其他实施例中，核酸缺乏聚A序列。

表6：示例性ZF-KRAB效应子的核苷酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含Zn指结构域(例如，具有根据SEQ ID NO:5-10或169-172中任一个的氨基酸序列)，该效应子部分包含KRAB(例如，氨基酸序列SEQ ID NO:18)，例如KRAB结构域。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:22、23、24、25、26、27、139-144、177-180或183-186中任一个的氨基酸序列。这些示例性表达阻遏物的蛋白质序列披露于表7中。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:22-27、139-144、177-180、183-186中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

表7：示例性锌指-KRAB效应子的氨基酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含含有Zn指结构域的靶向部分(例如，由SEQ IDNO:44-49或115中任一个的核苷酸序列编码的结构域)和包含MQ1，例如细菌MQ1(例如，由SEQ ID NO:52的核苷酸序列编码)的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ IDNO:61、62、63、64、65、66、116、117、118或130的核酸序列编码。这些示例性表达阻遏物的核酸序列披露于表8中。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:61-66、116-118、130中任一个的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。在一些实施例中，核酸序列包含聚A序列，而在其他实施例中，核酸缺乏聚A序列。例如，在一些实施例中，本文描述的核酸包含序列，该序列根据SEQ ID NO:61-66、116-118或130中任一个(或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列)但是缺少3’聚A序列或者包含较短长度的3’聚A序列。

表8：示例性ZF-MQ1效应子的核苷酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含Zn指结构域(例如，包含SEQ ID NO:11-14中任一个的氨基酸序列)，该效应子部分包含MQ1，例如细菌MQ1(例如，SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32、33、129和145-149中任一个的氨基酸序列。这些示例性表达阻遏物的蛋白质序列披露于表9中。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:28-33、129中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

表9示例性ZF-MQ1效应子的氨基酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含Zn指结构域(例如，具有SEQ ID NO:11-14中任一个的氨基酸序列)，该效应子部分包含MQ1，例如细菌MQ1(例如，SEQ ID NO:87)。

在一些实施例中，表达阻遏物包含含有Zn指结构域的靶向部分(例如，由SEQ IDNO:166-168中任一个的核苷酸序列编码的结构域)和包含MQ1，例如细菌MQ1(例如，由SEQID NO:52的核苷酸序列编码)的效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物由SEQ ID NO:157、158或159的核酸序列编码。这些示例性表达阻遏物的核酸序列披露于表16中。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:166-168中任一个的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。在一些实施例中，核酸序列包含聚A序列，而在其他实施例中，核酸缺乏聚A序列。例如，在一些实施例中，本文描述的核酸包含序列，该序列根据SEQ ID NO:166-168中任一个(或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列)但是缺少3’聚A序列或者包含较短长度的3’聚A序列。

表16：示例性小鼠特异性ZF-MQ1效应子的核苷酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含Zn指结构域(例如，包含SEQ ID NO:154-156中任一个的氨基酸序列)，该效应子部分包含MQ1，例如细菌MQ1(例如，SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:160-165中任一个的氨基酸序列。这些示例性表达阻遏物的蛋白质序列披露于表17中。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含SEQ ID NO:160-165中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

表17：示例性ZF-MQ1效应子的氨基酸序列

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在一些实施例中，本披露提供了表达阻遏物系统，其包含含有第一ZF的第一靶向部分、含有DNA甲基转移酶例如MQ1或其功能片段的第一效应子部分、含有第二ZF的第二靶向部分和含有KRAB例如KRAB结构域的第二效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏物系统由编码第一靶向部分和第一效应子部分的第一核酸(其中表达由第一启动子或IRES驱动)以及编码第二靶向部分和第二效应子部分的第二核酸(其中表达由第二启动子或IRES驱动)编码。在一些实施例中，使用单顺反子序列。在一些实施例中，编码表达阻遏物系统的核酸是多顺反子序列。在一些实施例中，多顺反子序列是双顺反子序列。在一些实施例中，多顺反子序列包含编码第一表达阻遏物的序列和编码第二表达阻遏物的序列。在一些实施例中，多顺反子序列编码可自切割的肽序列，例如2A肽序列，例如T2A肽序列、P2A序列。在一些实施例中，多顺反子序列编码T2A肽序列和P2A肽序列。在一些实施例中，多顺反子序列编码串联2A序列，例如tPT2A序列。在一些实施例中，多顺反子构建体从5’至3’编码(i)第一核定位信号，例如，SV40 NLS，(ii)第一靶向部分，例如，DNA结合结构域，例如，锌指结合结构域，例如，ZF-9，(iii)第一效应子部分，例如，DNA甲基转移酶，例如，MQ1，(iv)第二核定位信号，例如，核质蛋白NLS，(v)接头，例如，tPT2A接头，(vi)第三核定位信号，例如，SV40NLS，(vii)第二靶向部分，例如，DNA结合结构域，例如，锌指结合结构域，例如，ZF-3，(viii)第二效应子部分，例如，转录阻遏物部分，例如，KRAB，和(ix)第四核定位信号，例如，核质蛋白NLS。在一些实施例中，双顺反子构建体进一步包含聚A尾。在一些实施例中，在双顺反子基因构建体转录后，产生编码第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的单个mRNA转录物，其在翻译后例如在2A肽内的甘氨酸残基之后被切割，以产生作为两个独立的蛋白质的第一表达阻遏物和第二表达阻遏物。在一些实施例中，第一和第二表达阻遏物通过“核糖体跳跃”分开。在一些实施例中，第一表达阻遏物和/或第二表达阻遏物在核糖体跳跃后保留2A肽的片段。在一些实施例中，第一和第二表达阻遏物的表达水平相等。在一些实施例中，第一和第二表达阻遏物的表达水平不同。在一些实施例中，第一表达阻遏物的蛋白质水平在第二表达阻遏物的蛋白质水平的(大于或小于)1％、2％、5％或10％以内。

在一些实施例中，与其中第一和第二表达阻遏物由单顺反子核酸编码的其他类似系统相比，由双顺反子核酸编码的系统将细胞中靶基因(例如，MYC)的表达降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％。

在一些实施例中，双顺反子序列编码SEQ ID NO:91、92、121、122、181、182、187、188的氨基酸，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。在一些实施例中，表达阻遏物系统包含靶向部分和效应子部分，该靶向部分包含Zn指结构域(例如，包含SEQ ID NO:7或13中任一个的氨基酸序列)，该效应子部分包含MQ1，例如细菌MQ1(例如，SEQ ID NO:19)或KRAB，例如KRAB结构域(例如，SEQ ID NO:18)。在一些实施例中，表达阻遏物包含SEQ ID NO:91、92、121、122、181、182、187和188中任一个的氨基酸序列。这些示例性表达阻遏物系统的蛋白质序列披露于表10中。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物相同包含SEQ ID NO:91-92、121-122、181、182、187、188中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

在一些实施例中，双顺反子序列包含SEQ ID NO:93或112(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))或SEQ ID NO:94或113(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))的核酸序列。在一些实施例中，双顺反子序列包含SEQ ID NO:196(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))或SEQ ID NO:197(例如，编码表达阻遏物的核酸(例如，cDNA))的核酸序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包含SEQ ID NO:93、94、112、113、196或197的核酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。编码这些示例性表达阻遏物系统的核酸序列披露于表10中。在一些实施例中，核酸序列包含聚A序列，而在其他实施例中，核酸缺乏聚A序列。

表10示例性表达阻遏物系统的氨基酸序列和编码核酸序列

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在一些实施例中，表达阻遏物包含核定位序列(NLS)。在一些实施例中，表达阻遏物包含NLS，例如，在N末端的SV40 NLS。在一些实施例中，表达阻遏物包含NLS，例如C末端的核质蛋白NLS。在一些实施例中，表达阻遏物包含在N末端的第一NLS和在C末端的第二NLS。在一些实施例中，第一和第二NLS具有相同的序列。在一些实施例中，第一和第二NLS具有不同的序列。在一些实施例中，表达阻遏阻遏物包含SV40 NLS，例如，表达阻遏物包含根据PKKKRK(SEQ ID NO:135)的序列。在一些实施例中，N末端序列包含NLS和间隔子，例如具有根据以下的序列：MAPKKKRKVGIHGVPAAGSSGS(SEQ ID NO:88)。在一些实施例中，表达阻遏物包含C末端序列，其包含以下的一项或多项，例如以下的任意两项或全部三项：间隔子、核质蛋白核定位序列和HA标签：例如，SGGKRPAATKKAGQAKKKGSYPYDVPDYA(SEQ ID NO:89)。在一些实施例中，表达阻遏物包含表位标签，例如HA标签：YPYDVPDYA(SEQ ID NO:90)。例如，表达阻遏物可包含表位标签的两个拷贝。

虽然表位标签在许多研究环境中很有用，但有时希望在治疗环境中省略表位标签。因此，在一些实施例中，表达阻遏物缺少表位标签。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物包含本文提供的序列(或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列)，但缺少SEQ ID NO:90的HA标签。在一些实施例中，本文所述的核酸包含本文提供的序列(或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列)，但缺少编码SEQ IDNO:90的HA标签的区域。在一些实施例中，表达阻遏物包含核质蛋白NLS，例如，表达阻遏物包含序列KRPAATKKAGQAKKK(SEQ ID NO:136)。在一些实施例中，表达阻遏物不包含NLS。在一些实施例中，表达阻遏物不包含表位标签。在一些实施例中，表达阻遏物不包含HA标签。在一些实施例中，表达阻遏物不包含根据SEQ ID NO:90的HA标签序列。

在一些实施例中，本披露提供了包含自切割肽的表达阻遏物系统。自切割肽首先在小核糖核酸病毒中发现，是长度在19至22个氨基酸之间的肽，通常在小核糖核酸病毒家族某些成员中存在于两个蛋白质之间。利用自切割蛋白，小核糖核酸病毒能够从同一mRNA产生等摩尔水平的多个基因。已知此类自切割蛋白存在于其他病毒物种中，并且如果需要，本领域技术人员基于本文提供的信息将能够容易地确定本文披露的自切割蛋白的合适取代。在一些实施例中，表达阻遏物系统包含自切割肽，例如2A自切割肽。在一些实施例中，2A肽包含单个切割位点，例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A或F2A肽。在一些实施例中，自切割肽例如2A肽包含两个切割位点，例如pPT2A或P2A-T2A-E2A。在一些实施例中，表达阻遏物系统包含含有多个切割位点的自切割肽，例如T2A自切割肽和P2A自切割肽。在一些实施例中，2A肽在翻译后被切割。在一些实施例中，自切割肽在切割后产生两个或更多个片段。在一些实施例中，2A肽片段包含SEQ ID NO:126-128的序列。在一些实施例中，2A自切割肽包含SEQ IDNO:120、124、125或其衍生物的序列。在一些实施例中，SEQ ID NO:95包含自切割肽的序列。

当然应当理解，虽然2A序列例如tPT2A序列(例如根据SEQ ID NO:124)可以在科学文献中和本文中被称为自切割肽，但是这是根据非限制性理论。根据另一个非限制性理论，在一些实施例中，2A序列通过核糖体跳跃起作用。例如，编码2A序列的mRNA可以诱导核糖体跳跃，其中核糖体在翻译2A区域时无法形成肽键，导致翻译产物的第一部分的释放。然后核糖体产生翻译产物的第二部分。总体而言，已充分确定置于第一序列和第二序列之间的2A序列将导致产生包含第一序列的第一蛋白质和包含第二序列的单独的第二蛋白质。本披露不受关于实现这一点的分子机制的任何特定理论的约束。

功能特征

本披露的表达阻遏物或系统可用于降低细胞中靶基因(例如MYC)的表达。一般而言，本文所述的表达阻遏物或系统结合(例如，通过靶向部分)靶基因(例如MYC)近侧的和/或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的基因组序列元件。在一些实施例中，表达阻遏物或系统与基因组序列元件的结合调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。例如，表达阻遏物或包含抑制转录机器组分募集的效应子部分的系统与基因组序列元件的结合可以调节(例如，降低)靶基因(例如，MYC)的表达。作为进一步的实例，表达阻遏物或包含具有酶活性的效应子部分(例如表观遗传修饰部分)的系统的结合可以通过效应子部分的局部酶活性来调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。作为进一步的实例，表达阻遏物或系统与基因组序列元件的结合和表达阻遏物或系统的局部酶活性都有助于最终调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。

在一些实施例中，降低表达包括降低由靶基因(例如MYC)编码的RNA例如mRNA的水平。在一些实施例中，降低表达包括降低靶基因(例如MYC)编码的蛋白的水平。在一些实施例中，降低表达包括降低由靶基因(例如MYC)编码的mRNA和蛋白质二者的水平。在一些实施例中，靶基因在与本文披露的表达阻遏物或表达阻遏系统接触或包含本文披露的表达阻遏物或表达阻遏系统的细胞中的表达比靶基因在未与本文披露的表达阻遏物或表达阻遏系统接触或包含本文披露的表达阻遏物或表达阻遏系统的细胞中的表达水平低至少1.05x(即1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.55x、1.6x、1.65x、1.7x、1.75x、1.8x、1.85x、1.9x、1.95x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x或100x。靶基因(例如MYC)的表达可以通过本领域技术人员已知的方法测定，包括RT-PCR、ELISA、蛋白质印迹和实例2-9的方法。靶基因(例如，MYC)在受试者(例如，患者，例如，患有MYC错误调节障碍的患者，例如，患有肝病的患者、患有肿瘤形成和/或病毒性或酒精性肝病的患者，例如，患有肝癌的患者，例如，患有肝癌亚型S1或肝癌亚型S2的患者)中的表达水平可以通过评价靶基因(例如，MYC)的血液(例如，全血)水平来评估，例如，通过以下文献中的方法：Oglesbee等人.Clin Chem.[临床化学]2013年10月；59(10):1461-9。Doi:10.1373/clinchem.2013.207472或Deutsch等人J Neurol Neurosurg Psychiatry.[神经病学、神经外科学与精神病学杂志]2014年9月；85(9):994-1002。Doi:10.1136/jnnp-2013-306788，其内容通过引用以其整体并入本文。

本披露的表达阻遏物或系统可用于在一段时间内降低细胞中靶基因(例如MYC)的表达。在一些实施例中，靶基因(例如MYC)在与表达阻遏物或系统接触或包含表达阻遏物或系统的细胞中的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或至少1、2、3、4、5、6、7、10、14或15天，或至少1、2、3、4或5周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少1、2、3、4或5年(例如，无限期地)。任选地，靶基因(例如MYC)在与表达阻遏物或系统接触或包含表达阻遏物或系统的细胞中的表达明显降低持续不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1年。在一些实施例中，靶基因(例如MYC)在与表达阻遏物或系统接触或包含表达阻遏物或系统的细胞中的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂。本披露的表达阻遏物或系统可用于甲基化靶启动子(例如MYC启动子)中的CpG核苷酸。在一些实施例中，MYC表达的转录变化与CpG甲基化的百分比相关。在一些实施例中，甲基化在用本文披露的表达阻遏物或系统处理后持续至少1天、至少2天、至少5天、至少7天、至少10天、至少15天或至少20天。

本披露的表达阻遏物或系统可用于降低包含靶基因基因座例如MYC基因座的细胞的活力。在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低包含靶基因基因座例如MYC基因座的多个细胞的活力。在一些实施例中，与未接触或不包含表达阻遏物或系统的对照细胞群中的活细胞数量相比，接触或包含表达阻遏物或系统的活细胞数量明显减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低包括癌细胞和非癌细胞的多个细胞的活力。在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低多个癌细胞的活力，其程度大于其降低多个非癌细胞的活力。在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低所述多个癌细胞的活力，降低的程度比其对多个非癌细胞的活力的降低程度大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x。

在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低包括感染细胞和未感染细胞的多个细胞的活力。在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低多个感染细胞的活力，其程度大于其降低多个未感染细胞的活力。在一些实施例中，本披露的表达阻遏物或系统可用于降低所述多个感染细胞的活力，降低的程度比其对多个未感染细胞的活力的降低程度大1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x。

表达阻遏系统可包含多个表达阻遏物，其中每个表达阻遏物包含与另一个表达阻遏物的效应子部分具有不同功能的效应子部分。例如，表达阻遏系统可包含两个表达阻遏物，其中第一表达阻遏物包含第一效应子部分，该第一效应子部分包含表观遗传修饰部分，例如DNA甲基转移酶，例如MQ1，并且第二表达阻遏物包含第二效应子部分，该第二效应子部分包含转录阻遏物，例如KRAB。在一些实施例中，第二表达阻遏物不包含第二效应子部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包括表达阻遏物，所述表达阻遏物包括效应子部分的组合，这些效应子部分的功能在抑制靶基因(例如MYC)表达方面彼此互补，例如，其中这些功能一起能够抑制表达，并且任选地，当单独存在时不抑制或可忽略地抑制表达。在一些实施例中，表达阻遏系统包含多个表达阻遏物，其中每个表达阻遏物包含与每个其他表达阻遏物的效应子部分互补的效应子部分，例如，每个效应子部分降低靶基因(例如MYC)的表达。

在一些实施例中，表达阻遏系统包含表达阻遏物，所述表达阻遏物包含效应子部分的组合，这些效应子部分的功能在抑制靶基因(例如MYC)表达方面相互协同。不希望被理论所束缚，对基因组基因座的表观遗传修饰是累积的，因为多个阻遏表观遗传标志物(例如，多种不同类型的表观遗传标志物和/或给定类型的更广泛标志物)单独地一起比单独的单个修饰更有效地降低表达(例如，产生更大的表达减少和/或更持久的表达减少)。在一些实施例中，表达阻遏系统包含多个表达阻遏物，其中每个表达阻遏物包含与每个其他表达阻遏物的效应子部分协同作用的效应子部分，例如，每个效应子部分降低靶基因(例如MYC)的表达。

在一些实施例中，表达阻遏物或系统通过改变与靶基因(例如MYC)或其可操作地连接的表达控制序列相关联的一种或多种表观遗传标志物来调节(例如降低)靶基因(例如MYC)的表达。在一些实施例中，改变包括降低与靶基因(例如MYC)或其可操作地连接的表达控制序列相关联的表观遗传标志物的水平。表观遗传标志物包括但不限于DNA甲基化、组蛋白甲基化和组蛋白脱乙酰化。

在一些实施例中，改变表观遗传标志物的水平使与靶基因(例如MYC)或其可操作地连接的表达控制序列相关联的表观遗传标志物的水平降低至低于未被调节剂接触或不包含表达阻遏物或系统的细胞中与靶基因(例如MYC)或与其可操作地连接的表达控制序列相关联的表观遗传标志物水平至少1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.55x、1.6x、1.65x、1.7x、1.75x、1.8x、1.85x、1.9x、1.95x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x或100x。表观遗传标志物的水平可以通过本领域技术人员已知的方法来测定，包括全基因组亚硫酸氢盐测序、简并代表性亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐扩增子测序、甲基化阵列、焦磷酸测序、ChIP-seq或ChIP-qPCR。在一些实施例中，表观遗传标志物例如DNA甲基化的变化(例如增加或减少)可以使用亚硫酸氢盐基因组测序在根据hg19参考基因组的精确基因组坐标处(例如根据hg19参考基因组在chr8:129188693-129189048之间)进行测定。在一些实施例中，表观遗传标志物例如DNA甲基化的变化(例如增加或减少)可以使用亚硫酸氢盐基因组测序在根据SEQ IDNO:123的基因组位置处进行测定。

本披露的表达阻遏物或系统可以用于在一段时间内改变细胞中与靶基因(例如MYC)或其可操作地连接的表达控制序列相关联的表观遗传标志物的水平。在一些实施例中，与表达阻遏物或系统接触或包含表达阻遏物或系统的细胞中与靶基因或其可操作地连接的表达控制序列相关联的表观遗传标志物的水平明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或至少1、2、3、4、5、6、7、10或14天，或至少1、2、3、4或5周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少1、2、3、4或5年(例如，无限期地)。任选地，与表达阻遏物或系统接触或包含表达阻遏物或系统的细胞中与靶基因(例如MYC)或其可操作地连接的表达控制序列相关联的表观遗传标志物的水平明显降低持续不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1年。

阻遏物的组合

在一些实施例中，表达阻遏系统包含含有第一效应子部分的第一表达阻遏物和含有第二效应子部分的第二表达阻遏物，其中第一效应子部分和第二效应子部分彼此不同。在一些实施例中，第一效应子部分是或包括第一表观遗传修饰部分(例如，其增加或减少第一表观遗传标志物)或其功能片段，并且第二效应子部分是或包括第二表观遗传修饰部分(例如，其增加或减少第二表观遗传标志物)或其功能片段。在一些实施例中，第一效应子部分是或包含DNA甲基转移酶或其功能片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能片段。在一些实施例中，第一效应子部分是或包含组蛋白脱乙酰酶或其功能片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能片段。在一些实施例中，第一效应子部分是或包含组蛋白甲基转移酶或其功能片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能片段。在一些实施例中，第一效应子部分是或包含组蛋白去甲基化酶或其功能片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2或其任一项的功能片段，并且第二效应子部分是或包含KRAB(例如，KRAB结构域)、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任一项的功能片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含KRAB(例如，KRAB结构域)、MeCP2、HP1、RBBP4、REST、FOG1、SUZ12或其任一项的功能片段，并且第二效应子部分是或包含MQ1、DNMT1、DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B 4、DNMT3B5、DNMT3B6、DNMT3L、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、SIRT8、SIRT9、KDM1A(即LSD1)、KDM1B(即LSD2)、KDM2A、KDM2B、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM4B、NO66、SETDB1、SETDB2、EHMT2(即G9A)、EHMT1(即GLP)、SUV39H1、EZH2、EZH1、SUV39H2、SETD8、SUV420H1、SUV420H2或其任一项的功能片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含细菌MQ1或其功能变体或片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能变体或片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含DNMT3A或其功能变体或片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能变体或片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含DNMT3B或其功能变体或片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能变体或片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含DNMT3L或其功能变体或片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能变体或片段。

在一些实施例中，第一效应子部分是或包含DNMT3a/3L复合物或其功能变体或片段，第二效应子部分是或包含KRAB或其功能变体或片段。

靶位点

本文披露的表达阻遏物或系统可用于调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)在细胞中(例如，在受试者或患者中)的表达。靶基因(例如MYC)可以是本领域技术人员已知的任何基因。在一些实施例中，靶基因(例如MYC)与受试者(例如哺乳动物，例如人、牛、马、羊、鸡、大鼠、小鼠、猫或狗)的疾病或病症相关。靶基因可包括编码序列，例如外显子，和/或非编码序列，例如内含子、3’UTR或5’UTR。在一些实施例中，靶基因可操作地连接至转录控制元件。

适用于本文所述的表达阻遏物或系统的表达阻遏物的靶向部分可以结合(例如，特异性结合)靶基因(例如MYC)内的任何位点、可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录控制元件、或锚序列(例如，靶基因近侧的锚序列或与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合相关联的锚序列(例如，如果缀合的中断改变了靶基因(例如MYC)的表达，则锚序列介导的接合可操作地连接至靶基因))、或位于超级增强子区域中的调节元件(例如，位于MYC的超级增强子区域中的调节元件)。

在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物在位点处或该位点近侧的位置处结合。例如，靶向部分可以与阻遏物(第二位点)近侧的第一位点结合，并且与所述靶向部分相关联的效应子部分可以表观遗传修饰第一位点，使得增强子对靶基因表达的影响被修饰，基本上与第二位点(增强子序列)被结合和/或修饰的情况相同。在一些实施例中，靶基因(例如，靶基因内的外显子、内含子或剪接位点)近侧、与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件近侧、或锚序列近侧的位点距靶基因(例如MYC)(例如，靶基因(例如MYC)内的外显子、内含子或剪接位点)、转录控制元件、或锚序列少于5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50或25个碱基对(并且任选地，距靶基因(例如MYC)(例如，靶基因内的外显子、内含子或剪接位点)、转录控制元件、或锚序列至少20、25、50、100、200或300个碱基对)。

在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC)。在一些实施例中，DNA靶向部分结合靶基因(例如MYC)外显子内的位点。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC)内含子内的位点。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC)的外显子和内含子边界处的位点，例如剪接位点。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC)的5’UTR内的位点。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC)的3’UTR内的位点。靶基因包括但不限于编码MYC的基因。

在一些实施例中，靶向部分结合可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录控制元件，例如启动子或增强子。在一些实施例中，靶向部分结合可操作地连接至靶基因(例如MYC)的启动子的一部分或可操作地连接至靶基因的启动子内的位点。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC)的转录起始位点。在一些实施例中，靶向部分结合可操作地连接至靶基因(例如MYC)的增强子的一部分或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的增强子内的位点。在一些实施例中，基因组复合物(例如，ASMC)共定位两个或更多个基因组序列元件，其中这两个或更多个基因组序列元件包括启动子。启动子通常是启动相关基因转录的序列元件。启动子典型地位于基因的5'端附近，离其转录起始位点不远。如本领域普通技术人员所知，真核细胞中蛋白质编码基因的转录典型地通过以下来启动：将一般转录因子(例如，TFIID、TFIIE、TFIIH、FUSE、CT元件等)和介体与核心启动子序列结合，作为将RNA聚合酶II引导至转录起始位点的起始前复合物，并且在许多情况下，甚至在RNA聚合酶逃逸和初级转录物延伸启动之后仍保持与核心启动子序列的结合。在一些实施例中，启动子包括如TATA、Inr、DPE或BRE的序列元件，但本领域技术人员很清楚此类序列不是定义启动子所必需的。本领域技术人员熟悉各种与基因相关联的正(例如增强子)或负(例如阻遏物或沉默子)转录控制元件。在一些实施例中，转录控制元件是转录因子结合位点。典型地，当同源调节蛋白与这种转录控制元件结合时，从一个或多个相关基因的转录被改变(例如，增加或减少)。在一些实施例中，靶向部分结合位于基因组坐标GRCh37:chr8:129162465-129212140内的基因组序列。

在一些实施例中，靶向部分与基因组序列元件包含或部分包含的靶序列结合。在一些实施例中，基因组序列元件是或包含表达控制序列。在一些实施例中，基因组序列元件是或包含靶基因(例如，MYC)或靶基因(例如，MYC)的一部分。在一些实施例中，靶向部分与长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基(并且任选地，长度不超过40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个碱基)的靶序列结合。在一些实施例中，靶向部分与长度为10-30、15-30、15-25、18-24、19-23、20-23、21-23或22-23个碱基的靶序列结合。在一些实施例中，靶序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基。在一些实施例中，基因组序列元件是或包含锚序列。

每个ASMC包含一个或多个锚序列，例如多个。在一些实施例中，可以操纵或改变锚序列以调节(例如，破坏)天然存在的基因组复合物(例如，ASMC)或形成新的基因组复合物(例如，ASMC)(例如，形成具有外源或改变的锚序列的非天然存在的基因组复合物(例如，ASMC))。在一些实施例中，可以破坏锚序列介导的接合以改变，例如抑制，例如降低靶基因的表达。这种破坏可以通过例如改变DNA的拓扑结构来调节基因表达，例如通过调节靶基因与转录控制元件相互作用的能力(例如，增强和沉默/阻遏序列)。

在一些实施例中，靶向部分结合锚序列，例如，靶基因(例如MYC)近侧的锚序列或与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)相关联的锚序列(例如，如果连接的中断改变了靶基因(例如MYC)的表达，则锚序列介导的接合可操作地连接至靶基因(例如MYC))。通常，锚序列是基因组复合物组分(例如，成核多肽)特异性结合的基因组序列元件。在一些实施例中，基因组复合物组分与锚序列的结合使复合物形成成核，例如，ASMC形成。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC基因座)。基因座通常定义为涵盖包含靶基因(例如，MYC)的ASMC的转录区、启动子和锚定位点。在一些实施例中，靶向部分结合包含SEQ ID NO:75-86或199-206中任一个的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:75-86中任一个的序列，并且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:75-86中任一个的序列，其中第一和第二靶向部分结合相同的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:75-86中任一个的序列，并且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:75-86中任一个的序列，其中第一第二靶向部分结合不同的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:83、203或206中任一个的序列，且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:77的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:77的序列并且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:83、203或206中任一个的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:83、203或206中任一个的序列，且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:199、204或205中任一个的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:199、204或205中任一个的序列，且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:83、203或206中任一个的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:83、203或206中任一个的序列，且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:201的序列。在一些实施例中，编码第一和第二表达阻遏物的核酸包含编码第一表达阻遏物的第一区域，其中该第一区域位于编码第二表达阻遏物的第二区域的上游。在一些实施例中，编码第一和第二表达阻遏物的核酸包含编码第一表达阻遏物的第一区域，其中该第一区域位于编码第二表达阻遏物的第二区域的下游。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:75-86或199-206中任一个的序列，并且第二靶向部分(例如，包含gRNA的CRISPR/Cas结构域)结合包含SEQ ID NO:1-4中任一个的序列。在一些实施例中，靶向部分结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列，并且第二靶向部分结合包含SEQID NO:96-110中任一个的序列，其中第一和第二靶向部分结合相同的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列，并且第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列，其中第一第二靶向部分结合不同的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含SEQ ID NO:96-110中任一个的序列，并且第二靶向部分(例如，包含gRNA的CRISPR/Cas结构域)结合包含SEQ ID NO:1-4中任一个的序列。在一些实施例中，第一靶向部分结合包含表2、12或13中披露的SEQ ID No.中任一个的序列，并且第二靶向部分(例如，包含gRNA的CRISPR/Cas结构域)结合包含表2、12或13中披露的SEQ ID No.中任一个的序列。

示例性靶序列披露于表12中。

表12：示例性靶序列

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在一些实施例中，表达阻遏物结合具有本文所列序列的基因组基因座，例如，SEQID NOS:1-4、75-86、96-110或199-206中的任一个。应当理解，在许多情况下，被结合的基因组基因座包含双链DNA，并且可以通过给出其有义链或反义链的序列来描述该基因座。因此，具有给定间隔子序列的gRNA可能导致表达阻遏物与特定基因组基因座结合，其中基因组基因座的一条链具有与间隔子序列相似或相同的序列，并且基因组基因座的另一条链具有互补序列。通常，gRNA与基因组基因座的结合将涉及基因组基因座的一些解旋以及gRNA间隔子和跟间隔子互补的链的配对。

在一些实施例中，靶向部分结合小鼠基因组中的锚序列，例如，靶基因(例如MYC)近侧的锚序列或与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合(ASMC)相关联的锚序列(例如，如果连接的中断改变了靶基因(例如MYC)的表达，则锚序列介导的接合可操作地连接至靶基因(例如MYC))。通常，锚序列是基因组复合物组分(例如，成核多肽)特异性结合的基因组序列元件。在一些实施例中，基因组复合物组分与锚序列的结合使复合物形成成核，例如，ASMC形成。在一些实施例中，靶向部分结合靶基因(例如MYC基因座)。基因座通常定义为涵盖包含靶基因(例如，MYC)的ASMC的转录区、启动子和锚定位点。在一些实施例中，靶向部分结合包含SEQ ID NO:190-192中任一个的序列。在一些实施例中，靶向部分结合包含表18中披露的SEQ ID NO.中任一个的序列。小鼠基因组中的示例性靶序列披露于表18中。

表18：小鼠基因组中的示例性靶序列

在一些实施例中，表达阻遏物结合具有本文所列序列的基因组基因座，例如，SEQID NO:190-192中的任一个。应当理解，在许多情况下，被结合的基因组基因座包含双链DNA，并且可以通过给出其有义链或反义链的序列来描述该基因座。

在一个实施例中，锚序列介导的接合包含环，例如染色体内环。在某些实施例中，锚序列介导的接合具有多个环。一个或多个环可包括第一锚序列、核酸序列、转录控制序列和第二锚序列。在另一个实施例中，至少一个环依次包括第一锚序列、转录控制序列和第二锚序列，或者第一锚序列、核酸序列和第二锚序列。在又一个实施例中，核酸序列和转录控制序列之一或两者位于环内或环外。在又一个实施例中，一个或多个环包含转录控制序列。

在一些实施例中，锚序列介导的接合包括TATA盒、CAAT盒、GC盒或CAP位点。在一些实施例中，锚序列介导的接合包含多个环，并且其中锚序列介导的接合在这些环中的一个或多个中包含锚序列、核酸序列和转录控制序列中的至少一种。

在一些实施例中，通过在锚序列内取代、添加或缺失一个或多个核苷酸来修饰染色质结构。在一些实施例中，通过在锚序列介导的结合的锚序列内取代、添加或缺失一个或多个核苷酸来修饰染色质结构。在一些实施例中，通过包含激活环或排除阻遏环来抑制转录。在一个这样的实施例中，锚序列介导的接合不包括降低核酸序列转录的转录控制序列。在一些实施例中，通过包含阻遏环或排除激活环来阻遏转录。在一个这样的实施例中，锚序列介导的接合包括降低核酸序列转录的转录控制序列。

锚序列可以彼此不连续。在具有不连续锚序列的实施例中，第一锚序列可以与第二锚序列分开约500bp至约500Mb、约750bp至约200Mb、约1kb至约100Mb、约25kb至约50Mb、约50kb至约1Mb、约100kb至约750kb、约150kb至约15 500kb或约175kb至约500kb。在一些实施例中，第一锚序列可以与第二锚序列分开约500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb、5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、55kb、60kb、65kb、70kb、75kb、80kb、85kb、90kb、95kb、100kb、125kb、150kb、175kb、200kb、225kb、250kb、275kb、300kb、350kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb、10Mb、15Mb、20Mb、25Mb、50Mb、75Mb、20 100Mb、200Mb、300Mb、400Mb、500Mb、或其间的任何大小。

在一些另外的实施例中，靶向部分引入以下至少之一：至少一个外源锚序列；至少一个接合成核分子结合位点的改变，例如通过改变对接合成核分子的结合亲和力；至少一个共同核苷酸序列(例如CTCF结合基序、YY1结合基序、ZNF143结合基序、或本文提到的其他结合基序)的取向的改变；以及至少一个锚序列(例如CTCF结合基序、YY1结合基序、ZNF143结合基序或本文提到的其他结合基序)的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，锚序列包含成核多肽结合基序，例如CTCF结合基序：N(T/C/G)N(G/A/T)CC(A/T/G)(C/G)(C/T/A)AG(G/A)(G/T)GG(C/A/T)(G/A)(C/G)(C/T/A)(G/A/C)(SEQID NO:71)，其中N是任何核苷酸。

CTCF结合基序也可处于相反取向，例如(G/A/C)(C/T/A)(C/G)(G/A)(C/A/T)GG(G/T)(G/A)GA(C/T/A)(C/G)(A/T/G)CC(G/A/T)N(T/C/G)N(SEQ ID NO:72)。其中N是任何核苷酸

在一些实施例中，锚序列包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72或者与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。

在一些实施例中，锚序列包含成核多肽结合基序，例如YY1结合基序：CCGCCATNTT(SEQ ID NO:73)，其中N是任何核苷酸。

YY1结合基序也可以处于相反方向，例如AANATGGCGG(SEQ ID NO:74)，其中N是任何核苷酸。

在一些实施例中，锚序列介导的结合至少包含第一锚序列和第二锚序列。例如，在一些实施例中，第一锚序列和第二锚序列可以各自包含成核多肽结合基序，例如，各自包含CTCF结合基序。

在一些实施例中，第一锚序列和第二锚序列包含不同的序列，例如，第一锚序列包含CTCF结合基序，并且第二锚序列包含除了CTCF结合基序之外的锚序列。在一些实施例中，每个锚序列包含成核多肽结合基序和在成核多肽结合基序一侧或两侧上的一个或多个侧翼核苷酸。

可以形成ASMC的两个CTCF结合基序(例如，连续或非连续的CTCF结合基序)可以以任何方向存在于基因组中，例如，以相同方向(串联)5'-3'(左侧串联，例如，包含SEQ IDNO:71的两个CTCF结合基序)或3'-5'(右侧串联，例如，两个CTCF结合基序包含SEQ ID NO:72)，或者以会聚方向，其中一个CTCF结合基序包含SEQ ID NO:71，并且另一个包含SEQ IDNO:72。

在一些实施例中，锚序列包含与靶基因(例如MYC)相关联的CTCF结合基序，其中靶基因与疾病、障碍和/或病症(例如MYC错误调节障碍，例如肝病(例如肝癌)或肺癌)相关。

在一些实施例中，本披露的方法包括调节(例如，破坏)基因组复合物(例如，ASMC)，例如通过修饰染色质结构，通过取代、添加或缺失锚序列(例如，成核多肽结合基序)内的一个或多个核苷酸。一个或多个核苷酸可以被特异性靶向，例如靶向的改变，用于锚序列(例如，成核多肽结合基序)内的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，可以通过改变至少一个成核多肽结合基序的方向来改变基因组复合物(例如，ASMC)。在一些实施例中，锚序列包含成核多肽结合基序(例如，CTCF结合基序)，并且靶向部分在至少一个成核多肽结合基序中引入改变，例如改变对成核多肽的结合亲和力。

在一些实施例中，在施用本文所述的表达阻遏物或系统之前，靶基因例如MYC具有确定的表达状态，例如处于患病状态。例如，靶基因例如MYC可以在疾病细胞中具有高水平的表达。通过破坏锚序列介导的接合，可以降低靶基因例如MYC的表达。

适用于本文所述表达阻遏系统的表达阻遏物中的靶向部分可结合，例如特异性结合包含至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或碱基对(并且任选地不超过50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸或碱基对)的位点。在一些实施例中，DNA靶向部分结合包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或碱基对的位点。

本披露的表达阻遏系统可包含两个或更多个表达阻遏物。在一些实施例中，表达阻遏物系统的表达阻遏物各自包含不同的靶向部分。

在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括结合靶基因(例如，外显子、内含子或外显子内含子边界(例如，剪接位点))的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括结合靶基因(例如，外显子、内含子或外显子内含子边界(例如，剪接位点))的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括结合靶基因(例如，外显子、内含子或外显子内含子边界(例如，剪接位点))的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录控制元件(例如，启动子或增强子)结合的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括与可操作地连接至靶基因的转录控制元件(例如，启动子或增强子)结合的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括与可操作地连接至靶基因的转录控制元件(例如，启动子或增强子)结合的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括与靶基因(例如MYC)近侧的锚序列或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合相关联的锚序列结合的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录控制元件(例如，启动子或增强子)结合的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括与靶基因(例如MYC)近侧的锚序列或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合相关联的锚序列结合的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括与靶基因(例如MYC)，例如外显子、内含子或外显子内含子边界(例如剪接位点)结合的靶向部分。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括与靶基因(例如MYC)近侧的锚序列或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合相关联的锚序列结合的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括与靶基因(例如MYC)近侧的锚序列或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合相关联的锚序列结合的靶向部分。

在一些实施例中，表达阻遏系统包括：第一表达阻遏物，其包括结合至例如可操作地连接至靶基因(例如MYC)的启动子中的第一位点的靶向部分；和第二表达阻遏物，其包括结合至例如可操作地连接至靶基因(例如MYC)的启动子中的第二位点的靶向部分。第一位点和第二位点可以是不同的且不重叠的位点，例如，第一位点和第二位点不共享任何共同的序列。第一位点和第二位点可以是不同但重叠的位点，例如，第一位点和第二位点包含不同的序列但共享一些共同的序列。

在一些实施例中，靶基因是MYC。在一些实施例中，MYC位于人8号染色体上。在一些实施例中，本文所述的表达阻遏物或表达阻遏物系统结合至MYC的转录起始位点(TSS)。

其他组合物

核酸和载体

本披露进一步部分地涉及编码本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统的核酸。在一些实施例中，可以通过包含编码表达阻遏物的核酸的组合物来提供表达阻遏物，其中该核酸与足够的其他序列相关联，以在目的系统中(例如，在特定细胞、组织、生物体等中)实现表达阻遏物的表达。在一些实施例中，可以通过包含编码表达阻遏系统(例如表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)的核酸的组合物提供表达阻遏系统，其中核酸与足够的其他序列相关联以实现在目的系统中(例如，在特定细胞、组织、生物体等中)表达所述表达阻遏系统(例如表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)。

在一些特定的实施例中，本披露提供了编码表达阻遏物或其多肽部分的核酸的组合物。在一些此类实施例中，所提供的核酸可以是或包括DNA、RNA或如本文所述的任何其他核酸部分或实体，并且可以通过本文所述的任何技术或本领域中可获得的其他技术来制备(例如，合成、克隆、扩增、体外或体内转录等)。在一些实施例中，所提供的编码表达阻遏物或其多肽部分的核酸可以与一种或多种复制、整合和/或表达信号可操作地相关联，该一种或多种复制、整合和/或表达信号适于和/或足以实现所提供核酸在感兴趣的系统(例如，在特定细胞、组织、生物体等)中的整合、复制和/或表达。

在一些实施例中，用于递送本文所述表达阻遏物的组合物是或包含载体，例如病毒载体，其包含编码本文所述表达阻遏物或表达阻遏物的一种或多种组分的一种或多种核酸。

在一些特定的实施例中，本披露提供了编码表达阻遏系统、一个或多个表达阻遏物或其多肽部分的核酸组合物。在一些此类实施例中，所提供的核酸可以是或包括DNA、RNA或如本文所述的任何其他核酸部分或实体，并且可以通过本文所述的任何技术或本领域中可获得的其他技术来制备(例如，合成、克隆、扩增、体外或体内转录等)。在一些实施例中，提供了编码表达阻遏系统、一个或多个表达阻遏物或其多肽部分的核酸可以与一种或多种复制、整合和/或表达信号可操作地相关联，该一种或多种复制、整合和/或表达信号适于和/或足以实现所提供核酸在感兴趣的系统(例如，在特定细胞、组织、生物体等)中的整合、复制和/或表达。

在一些实施例中，用于递送本文所述的表达阻遏系统的组合物是或包括载体，例如，病毒载体，其包括编码表达阻遏系统的一个或多个组分(例如，如本文所述的表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)的一个或多个核酸。

在一些实施例中，用于递送本文所述表达阻遏物的组合物是或包含RNA，例如mRNA，其包含编码本文所述表达阻遏物或表达阻遏物的一种或多种组分的一种或多种核酸。

在一些实施例中，用于递送本文所述的表达阻遏系统的组合物是或包含RNA，例如mRNA，其包括编码表达阻遏系统的一个或多个组分(例如，如本文所述的表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)的一个或多个核酸。

可以将本文所述的核酸或编码本文所述的蛋白质的核酸掺入载体中。包括来源于逆转录病毒如慢病毒的那些载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。载体的实例包括表达载体、复制载体、探针产生载体、和测序载体。可以按病毒载体的形式，将表达载体提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于多种病理学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点、和一种或多种选择性标志物。

天然的或合成的核酸的表达典型地通过以下实现：将编码感兴趣基因的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体并入表达载体。载体可以适用于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和启动子，可用于所期望核酸序列的表达。

另外的启动子元件，例如增强序列，可以调节转录起始的频率。典型地，这些序列位于转录起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近已显示多种启动子也含有转录起始位点下游的功能元件。

在一些实施例中，本文描述的表达阻遏物或系统作用于增强序列。在一些实施例中，增强序列是增强子、伸长增强子、阴影增强子、基因座控制区(LCR)或超级增强子。在一些实施例中，超级增强子包含增强子簇和其他调节元件。在一些实施例中，这些序列位于转录起始位点上游或下游.2-2Mb的区域中。在一些实施例中，该区域是非编码区。在一些实施例中，该区域含有至少一个与较高的患癌症风险相关的SNP。在一些实施例中，该区域与靶基因例如MYC的远程调节相关。在一些实施例中，这些区域是细胞类型特异性的。在一些实施例中，超级增强子通过募集靶基因启动子(例如，MYC启动子)来修饰(例如，增加或减少)靶基因表达(例如，MYC表达)。在一些实施例中，超级增强子通过增强子对接位点与靶基因启动子(例如MYC启动子)相互作用。在一些实施例中，增强子对接位点是锚序列。在一些实施例中，增强子对接位点距离靶基因启动子(例如，MYC启动子)至少100bp、200bp、500bp、1000bp、1500bp、2000bp或3000bp。在一些实施例中，超级增强子区的长度为至少100bp、至少200bp、至少300bp、至少500bp、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb或至少25kb。

启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当反转元件或使元件相对彼此移动时能够保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以共同地或独立地发挥功能，以激活转录。

合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这一启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的一些实施例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、连同人类基因启动子(如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、以及肌酸激酶启动子)。

本披露不应解释为限于使用任何特定启动子或启动子种类(例如组成型启动子)。例如，在一些实施例中，诱导型启动子被认为是本披露的一部分。在一些实施例中，诱导型启动子的使用提供了能够开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的分子开关(当期望这样的表达时)。在一些实施例中，诱导型启动子的使用提供了能够关闭表达的分子开关(当不期望表达时)。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。

在一些实施例中，待引入的表达载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或二者，从而便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞的群体中，鉴定和选择表达性细胞。在一些方面，选择性标志物可以在一段单独的DNA上进行，并且用于共转染程序。选择性标志物和报告基因的侧翼均可以是适当的转录控制序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标志物可以包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。

在一些实施例中，可以将报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和/或用于评估转录控制序列的功能。通常，报告基因是不存在于(报告基因的)受者来源中或不由受者来源表达，并且编码其表达由一些易于检测特性(例如酶活性或可视荧光)所证明的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因，并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。

细胞

本披露进一步部分地涉及包含本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统的细胞。本领域技术人员已知的任何细胞，例如细胞系，例如适合表达重组多肽的细胞系，都适合包含本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统。在一些实施例中，细胞，例如细胞系，可用于表达本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统，例如一个或多个表达阻遏物。在一些实施例中，细胞例如细胞系可用于表达或扩增编码本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统(例如一个或多个表达阻遏物)的核酸，例如载体。在一些实施例中，细胞包含编码本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统(例如一个或多个表达阻遏物)的核酸。

在一些实施例中，细胞包含编码表达阻遏系统的第一组分(例如第一表达阻遏物)的第一核酸，和编码表达阻遏系统的第二组分(例如第二表达阻遏物)的第二核酸。在一些实施例中，其中细胞包含编码包含两个或更多个表达阻遏物的表达阻遏系统的核酸，编码每个表达阻遏物的序列布置在不同的核酸分子上，例如不同的载体上，例如编码第一表达阻遏物的第一载体和编码第二表达阻遏物的第二载体。在一些实施例中，编码每个表达阻遏物的序列布置在相同的核酸分子上，例如，相同的载体上。在一些实施例中，编码表达阻遏系统的一些或所有核酸被整合到细胞的基因组DNA中。在一些实施例中，编码表达阻遏系统的第一表达阻遏物的核酸被整合到细胞的基因组DNA中，并且编码表达阻遏系统的第二表达阻遏物的核酸不被整合到细胞的基因组DNA中(例如，位于载体上)。在一些实施例中，编码表达阻遏系统的第一和第二表达阻遏物的一个或多个核酸被整合到细胞的基因组DNA中，例如，在基因组DNA中的相同(例如，相邻或共定位)或不同位点。

可包含和/或表达本文所述的表达阻遏系统或表达阻遏物的细胞的实例包括但不限于肝细胞、神经元细胞、内皮细胞、肌细胞和淋巴细胞。

本披露进一步部分地涉及通过本文所述的方法或工艺制造的细胞。在一些实施例中，本披露提供了通过以下产生的细胞：提供本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统，提供细胞，并使细胞与表达阻遏物(或编码表达阻遏物的核酸，或包含所述表达阻遏物或核酸的组合物)或表达阻遏系统(或编码表达阻遏系统的核酸，或包含所述表达阻遏系统或核酸的组合物)接触。在一些实施例中，使细胞与表达阻遏物接触包括在允许细胞产生表达阻遏物的条件下使细胞与编码表达阻遏物的核酸接触。在一些实施例中，使细胞与表达阻遏物接触包括使包含细胞的生物体与表达阻遏物或编码表达阻遏物的核酸在允许细胞产生表达阻遏物的条件下接触。

不希望被理论束缚，与本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统接触的细胞可表现出：与未与表达阻遏物或表达阻遏系统接触过的相似细胞相比，靶基因(例如MYC)表达的减少和/或与靶基因(例如MYC)相关联的表观遗传标志物的修饰、可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录控制元件的修饰、或靶基因近侧的锚序列或与可操作地连接至靶基因(例如MYC)的锚序列介导的接合相关联的锚序列的修饰。在一些实施例中，表现出所述靶基因(例如MYC)表达降低和/或表观遗传标志物修饰的细胞不包含表达阻遏物或表达阻遏系统。在与表达阻遏物或表达阻遏系统接触后，表达降低和/或表观遗传标志物修饰可持续例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或至少1、2、3、4、5、6、7、10或14天，或至少1、2、3、4或5周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少1、2、3、4或5年(例如，无限期地)。

在一些实施例中，先前与表达阻遏物或表达阻遏系统接触过的细胞在表达阻遏物或表达阻遏系统不再存在于该细胞中后保持表达的减少和/或表观遗传标志物的修饰，例如，在表达阻遏物或表达阻遏系统不再存在于该细胞中后持续至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时，或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天或14天，或至少1周、2周、3周、4周或5周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月，或至少1年、2年、3年、4年或5年(例如，无限期地)。

制造表达阻遏系统和/或表达阻遏物的方法

在一些实施例中，表达阻遏物包含蛋白质或者是蛋白质，因此可以通过制备蛋白质的方法产生。在一些实施例中，表达阻遏系统，例如表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物，包含一个或多个蛋白质并且因此可以通过制备蛋白质的方法来产生。如技术人员将理解的，制备蛋白质或多肽(其可以包含在如本文所述的调节剂中)的方法是本领域的常规方法。通常，参见Smales和James(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),HumanaPress[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。

本披露组合物的蛋白质或多肽可以通过采用标准固相技术来生化合成。这类方法包括排阻固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。这些方法可以当肽相对较短(例如，10kDa)和/或当它不能通过重组技术来产生(即，未由核酸序列来编码)并且因此涉及不同化学时使用。

固相合成程序是本领域众所周知的，并且进一步由以下描述：John MorrowStewart和Janis Dillaha Young,Solid Phase Peptide Syntheses[固相肽合成],第2版，Pierce Chemical Company[皮尔斯化学公司],1984；和Coin,I.等人,Nature Protocols[自然实验手册],2:3247-3256,2007。

对于较长肽，可以使用重组的方法。制备重组治疗性多肽的方法在本领域是常规的。通常，参见Smales和James(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),HumanaPress[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。

产生治疗性药物蛋白质或多肽的示例性方法涉及在哺乳动物细胞中表达，尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、或其他细胞，在适当的启动子控制下，产生重组蛋白。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，如复制起点、合适的启动子、以及其他5'或3’侧翼非转录序列；以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册](第四版),Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。

在期望大量蛋白质或多肽的情况下，其可以使用例如由以下文献描述的技术来产生：Brian Bray,Nature Reviews Drug Discovery[自然综述：药物发现],2:587-593,2003；以及Weissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press[植物分子生物学方法],Academic Press[学术出版社],纽约,第VIII节,第421-463页。

各种哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于生产蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：Zhou和Kantardjieff(编辑),Mammalian Cell Culturesfor Biologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。本文所述的组合物可包括载体，例如编码重组蛋白的病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施例中，载体，例如病毒载体，可以包含编码重组蛋白的核酸。本文所述的组合物可包括包封编码重组蛋白的载体(例如病毒载体，例如慢病毒载体)的脂质纳米颗粒。在一些实施例中，包封载体(例如病毒载体)的脂质纳米颗粒可包含编码重组蛋白的核酸。

在以下文献中描述了蛋白治疗剂的纯化：Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,Protein PurificationProtocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),HumanaPress[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches to formulation in theLaboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。

蛋白质包含一种或多种氨基酸。氨基酸包括可以例如通过形成一个或多个肽键掺入多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通式结构H₂N-C(H)I-COOH。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论它是合成制备的还是从天然来源获得的。在一些实施例中，与上述一般结构相比，多肽中的氨基酸，包括羧基和/或氨基末端氨基酸，可以包含结构修饰。例如，在一些实施例中，与一般结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如氨基、羧酸基、一个或多个质子、和/或羟基)来修饰。在一些实施例中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，这种修饰可以例如，改变含有修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施例中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，这种修饰不会显著改变含有修饰的氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以清楚地看出，在一些实施例中，术语“氨基酸”可以用来指游离氨基酸；在一些实施例中，它可以用来指多肽的氨基酸残基。

药物组合物、配制品、递送和施用

本披露进一步部分地涉及包括本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统(例如，一个或多个表达阻遏物)的药物组合物、涉及包括编码本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统(例如，一个或多个表达阻遏物)的核酸的药物组合物和/或涉及将本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统(例如，一个或多个表达阻遏物)递送至细胞、组织、器官和/或受试者的组合物。

如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载剂(例如，本领域技术人员已知的药学上可接受的载剂)一起配制的活性剂(例如，表达阻遏物或表达受体的核酸，例如，表达阻遏系统，例如，表达阻遏物系统的一个或多个表达阻遏物，或编码其的核酸)。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当施用至相关群体时，该治疗方案显示出实现预定治疗效果的统计学显著概率。在一些实施例中，包含本披露的表达阻遏物的药物组合物包含表达阻遏物或一个或多个编码其的核酸。在一些实施例中，包括本披露的表达阻遏系统的药物组合物包括表达阻遏系统的表达阻遏物中的每一个或编码所述表达阻遏物的一个或多个核酸(例如，如果表达阻遏系统包括第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，则药物组合物包括第一和第二表达阻遏物)。在一些实施例中，药物组合物包含少于包含多个表达阻遏物的表达阻遏系统的所有表达阻遏物。例如，表达阻遏系统可以包括第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，并且第一药物组合物可以包括第一表达阻遏物或编码所述第一表达阻遏物的核酸，并且第二药物组合物可以包括第二表达阻遏物或编码所述第二表达阻遏物的核酸。在一些实施例中，药物组合物可包含一个或多个表达阻遏物或编码其的一个或多个核酸的共配制品。

在一些实施例中，药物组合物可以特别配制成以固体或液体形式施用，包括适用于以下情况的那些：口服施用，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂，例如用于口腔、舌下和全身吸收的那些片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、用于舌头的糊剂；胃肠外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液，或持续释放配制品；局部施用，例如，作为乳膏、软膏或控释贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓、乳膏或泡沫；舌下含服；眼部；透皮；或鼻、肺和/或至其他粘膜表面。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型，其适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏应答、或其他问题或并发症，与适当的益处/风险比相称。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其参与将主题化合物从身体的一个器官或部分运送或转运至身体的另一个器官或部分。每种载剂在与配制品的其他成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且对患者无害。例如，在一些实施例中，可以用作药学上可接受的载剂的材料包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在药物配制品中采用的其他无毒相容物质。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指适合用于药物环境的此类化合物的盐，即在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏应答等，并且与适当的益处/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志],66:1-19(1977)中详细描述了药学上可接受的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于无毒的酸加成盐，其是与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)形成，或与有机酸(如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成，或通过使用本领域中使用的其他方法(如离子交换)形成的氨基盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。在一些实施例中，药学上可接受的盐适当地包括使用平衡离子(诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有从1至6个碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。

在各种实施例中，本披露提供了本文所述的药物组合物，其具有药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂包括可用于制备通常安全，无毒和所期望的药物组合物的赋形剂，并且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气雾剂组合物的情况下是气体。

药物制剂可以按照常规制药技术来制备，包括研磨、混合、制粒，必要时压制成片剂；或者针对硬明胶胶囊形式进行研磨、混合和填充。当使用液体载剂时，制剂可以是糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水性溶液或悬浮液的形式。这种液体配制品可以直接口服施用。

在一些实施例中，药物组合物可以配制成经由任何施用途径递送至细胞和/或受试者。对受试者的施用方式可以包括注射、输注、吸入、鼻内、眼内、局部递送、环间递送或摄入。注射包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，施用包括气雾剂吸入，例如使用雾化。在一些实施例中，施用是全身性的(例如，口服、直肠、鼻内、舌下、口腔或胃肠外)、经肠的(例如，系统范围的作用，但通过胃肠道递送)，或局部的(例如，皮肤上的局部应用、玻璃体内注射)。在一些实施例中，全身性施用一种或多种组合物。在一些实施例中，施用是非胃肠外施用，并且治疗剂是胃肠外治疗剂。在一些实施例中，施用可以是支气管(例如，通过支气管滴注)、口腔、皮肤(其可以是或包括例如真皮局部、皮内、皮肤内、经皮等中的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如肝内)、粘膜、鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(例如，通过气管内滴注)、阴道、玻璃体等施用。在一些实施例中，施用可以是单剂量。在一些实施例中，施用可以包括间歇给药(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或周期性(例如，由公共时间段分开的单个剂量)给药。在一些实施例中，施用可以包括持续给药(例如，灌注)至少一段选定的时间。在一些实施例中，作为治疗方案，在一次治疗期间或一段时间内可以向受试者给予六次、八次、十次、12次、15次或20次或更多次施用。

在一些实施例中，可以根据需要给予施用，例如，只要与疾病、障碍或病症相关的症状持续存在。在一些实施例中，可以指示在受试者的余生中重复施用。治疗期可以变化并且可以是例如一天、两天、三天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月、一年或更长。

剂量

施用的药剂或组合物的剂量可以根据例如所治疗的病症、疾病的严重程度、受试者的个体参数(包含年龄、生理状况、体型和体重)、治疗的持续时间、待进行的治疗的类型(如果有的话)、特定的施用途径和类似因素而变化。因此，本文所述药剂的施用剂量可取决于此类各种参数。施用的组合物的剂量也可根据其他因素如受试者的性别、一般医学状况和待治疗障碍的严重程度而变化。可能期望以单次静脉内输注的方式向受试者提供在约1mg/kg至6mg/kg范围内的本文披露的调节剂或调节剂组合的剂量，尽管根据情况指示也可以施用更低或更高的剂量。剂量可根据需要重复，例如，每天一次(例如，持续1-30天)、每3天一次(例如，持续1-30天)、每5天一次(例如，持续1-30天)、每周一次(例如，持续1-6周或持续2-5周)。在一些实施例中，剂量可包括但不限于1.0mg/kg-6mg/kg、1.0mg/kg-5mg/kg、1.0mg/kg-4mg/kg、1.0-3.0mg/kg、1.5mg/kg-3.0mg/kg、1.0mg/kg-1.5mg/kg、1.5mg/kg-3mg/kg、3mg/kg-4mg/kg、4mg/kg-5mg/kg、或5mg/kg-6mg/kg。该剂量可以多次施用，例如每周一次或两次，或每1或2周一次。在一些实施例中，以多次静脉内输注的方式向受试者提供在约1mg/kg至6mg/kg范围内的本文披露的调节剂或调节剂组合的剂量，但是根据情况指示也可以施用更低或更高的剂量。

本文披露的调节剂或调节剂的组合可以每3-5天一个剂量施用，重复总共至少3个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以3mg/kg施用，持续25天。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每3-5天以1.0-5.0mg/kg施用一次，进行1-10个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以1.0-3.0mg/kg施用一次，进行3个剂量，然后每3天施用一次，进行3个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以1.0-3.0mg/kg施用一次，进行4个剂量，然后每3天施用一次，进行3个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以6mg/kg施用一次，进行1-10个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以3mg/kg施用一次，进行1-10个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以1.5mg/kg施用一次进行2个剂量，每5天以3mg/kg施用一次进行3个剂量，每3天以3mg/kg施用一次进行1个剂量。可替代地，本文披露的调节剂或调节剂组合可以每5天以6mg/kg的剂量施用，或者每天一次以1.5mg/kg的剂量施用，持续5天，休息2天。给药方案可以任选地以其他间隔重复，并且剂量可以通过各种胃肠外途径给予，并适当调整剂量和方案。在一些实施例中，调节剂或调节剂组合的给药可以包括1.0mg/kg至6.0mg/kg之间的剂量，任选每周、每周两次或每隔一周给予。普通技术人员将认识到，在选择本文披露的调节剂或调节剂组合的剂量时可以考虑多种因素，例如年龄、性别、体重、待治疗的障碍的严重性，并且在治疗过程中可以增加或减少施用的剂量和/或频率。可以根据需要重复剂量，有证据表明在少至2至8个剂量后观察到肿瘤体积缩小。与顺铂、索拉非尼或小分子比较物相比，本文披露的给药剂量和方案显示对受试者总体体重的影响最小。本方法可以包括使用CT和/或PET/CT或MRI来定期测量肿瘤应答。还可以监测肿瘤标志物的血液水平。剂量和/或施用方案可以根据成像结果和/或标志物血液水平按需调整。

在一些实施例中，本文披露的组合物可以与选自以下的一种或多种治疗剂或方法组合施用：手术切除、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)例如索拉非尼、布罗莫结构域抑制剂(例如BET抑制剂，例如JQ1，例如BET672，例如比拉瑞塞)、MEK抑制剂(例如，曲美替尼)、原位肝移植、射频消融、免疫疗法、免疫检查点加抗血管内皮生长因子组合疗法、光动力疗法(PDT)、激光疗法、近距离放射疗法、辐射疗法、经导管动脉化疗或放射栓塞、立体定向放射疗法、化疗和/或全身化疗，以治疗疾病或障碍。下表21披露了示例性治疗剂。

表21：小分子化合物，例如用于与本文所述的表达阻遏物的组合疗法中。

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根据本披露的药物组合物可以按治疗有效量递送。精确的治疗有效量是将在治疗功效方面在给定受试者中产生最有效结果的组合物的量。该量将根据多种因素而变化，包括但不限于治疗性化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体条件、对给定剂量的应答性和药物类型)、配制品中一种或多种药学上可接受的载剂的性质、和/或施用途径。

在一些方面，本披露提供了递送治疗剂的方法，其包括向受试者施用如本文所述的组合物，其中调节剂是治疗剂和/或其中治疗剂的递送相对于不存在治疗剂时的基因表达引起基因表达的变化。

如在本文各种实施例中所提供的方法可用于本文描述的任何一些方面。在一些实施例中，一种或多种组合物靶向特定细胞或一种或多种特定组织。

例如，在一些实施例中，一种或多种组合物靶向肝、上皮、结缔、肌肉、生殖和/或神经组织或细胞。在一些实施例中，组合物靶向特定器官系统的细胞或组织，例如心血管系统(心脏、脉管系统)；消化系统(食道、胃、肝、胆、胰、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、垂体、松果体或松果腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如，骨骼肌)；神经系统(大脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、膈肌)；骨骼系统(骨骼、软骨)；和/或其组合。

在一些实施例中，本披露的组合物穿过血脑屏障、胎盘膜或血睾屏障。

在一些实施例中，全身性施用如本文所提供的药物组合物。

在一些实施例中，施用是非胃肠外施用，并且治疗剂是胃肠外治疗剂。

本文提供的方法和组合物可以包括通过足以减轻疾病、障碍和/或病症的症状的方案施用的药物组合物。在一些方面，本披露提供了通过施用如本文所述的组合物来递送治疗剂的方法。

本披露的药物用途可以包括如本文所述的组合物(例如调节剂，例如破坏剂)。

在一些实施例中，与单独的活性剂相比，本披露的药物组合物具有改善的PK/PD，例如增加的药代动力学或药效学，如改善的靶向、吸收或转运(例如，至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％的改善或更多)。在一些实施例中，与单独的治疗剂相比，药物组合物具有减少的不良效应，如减少的向非靶位置的扩散、脱靶活性或毒性代谢(例如，与单独的活性剂相比，减少至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多)。在一些实施例中，与单独的活性剂相比，组合物增加了治疗剂的功效和/或降低了治疗剂的毒性(例如，至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多)。

本文所述的药物组合物可以被配制例如包含载剂(如药物载剂和/或聚合物载剂，例如纳米颗粒、脂质体或囊泡)，并通过已知方法递送至有需要的受试者(例如，人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物，磷酸钙)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)和病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)。递送方法也描述于例如Gori等人,Delivery and Specificity ofCRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy[人类基因治疗用CRISPR/Cas9基因组编辑技术的传递和特异性].Human Gene Therapy[人类基因治疗].2015年7月,26(7):443-451.Doi:10.1089/hum.2015.074；和Zuris等人,Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editingin vitro and in vivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内实现高效的基于蛋白质的基因组编辑].Nat Biotechnol[自然－生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。

脂质纳米颗粒

如本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统可以使用任何生物递送系统/配制品递送，包括颗粒，例如纳米颗粒递送系统。纳米颗粒包括尺寸(例如直径)为约1至约1000纳米、约1至约500纳米、约1至约100nm、约30nm至约200nm、约50nm至约300nm、约75nm至约200nm、约100nm至约200nm以及其间任何范围的颗粒。纳米颗粒具有纳米级尺寸的复合结构。在一些实施例中，纳米颗粒通常是球形的，尽管根据纳米颗粒的组成可能有不同的形态。纳米颗粒与纳米颗粒外部环境接触的部分通常被确定为纳米颗粒的表面。在一些实施例中，纳米颗粒具有范围在25nm和200nm之间的最大尺寸。本文所述的纳米颗粒包含可以任何形式提供的递送系统，包括但不限于固体、半固体、乳液或胶体纳米颗粒。纳米颗粒递送系统可包括但不限于基于脂质的系统、脂质体、胶束、微囊泡、外来体或基因枪。在一个实施例中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施例中，LNP是包含多个通过分子间力彼此物理关联的脂质分子的颗粒。

在一些实施例中，LNP可包含多个组分，例如3-4个组分。在一个实施例中，表达阻遏物或包含所述表达阻遏物的药物组合物(或编码其的核酸，或包含所述表达阻遏物核酸的药物组合物)被封装在LNP中。在一个实施例中，表达阻遏系统或包含所述表达阻遏系统的药物组合物(或编码其的核酸，或包含所述表达阻遏系统核酸的药物组合物)被封装在LNP中。在一些实施例中，编码第一表达阻遏物的核酸和编码第二表达阻遏物的核酸存在于同一LNP中。在一些实施例中，编码第一表达阻遏物的核酸和编码第二表达阻遏物的核酸存在于不同的LNP中。可以使用LNP的制备和调节剂封装/和/或改编自Rosin等人,MolecularTherapy[分子疗法],第19卷,第12期,第1286-2200页,2011年12月。在一些实施例中，本文披露的脂质纳米颗粒组合物可用于表达由mRNA编码的蛋白质。在一些实施例中，当核酸存在于脂质纳米颗粒中时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。

在一些实施例中，LNP配制品可包括CCD脂质、中性脂质和/或辅助脂质。在一些实施例中，LNP配制品包含可电离脂质。在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质或可容易质子化的含胺脂质。在一些实施例中，脂质是阳离子脂质，其可以根据pH以带正电或中性形式存在。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。在一些实施例中，脂质颗粒包括与中性脂质、可电离含胺脂质、可生物降解的炔脂质、类固醇、包括多不饱和脂质的磷脂、结构脂质(例如固醇)、PEG、胆固醇和聚合物缀合脂质中的一种或多种配制的阳离子脂质。

在一些实施例中，LNP配制品(例如，MC3和/或SSOP)包括胆固醇、PEG和/或辅助脂质。LNP可以是例如微球体(包括单层和多层囊泡、层状相脂质双层，其在一些实施例中基本上是球形的。

在一些实施例中，LNP可包含水性核心，例如，包含编码本文披露的表达阻遏物或系统的核酸。在本披露的一些实施例中，LNP配制品的货物包括至少一个指导RNA。在一些实施例中，货物，例如编码表达阻遏物的核酸，或如本文所披露的系统，可以吸附到LNP的表面，例如包含阳离子脂质的LNP。在一些实施例中，货物，例如编码表达阻遏物的核酸，或如本文披露的系统可与LNP相关联。在一些实施例中，货物，例如编码表达阻遏物的核酸，或本文披露的系统，可以被封装，例如完全封装和/或部分封装在LNP中。

在一些实施例中，包含货物的LNP可被施用用于全身递送，例如，递送治疗有效剂量的货物，其可导致活性剂在生物体内的广泛暴露。脂质纳米颗粒的全身递送可以通过本领域已知的任何方式进行，包括例如静脉内、动脉内、皮下和腹膜内递送。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的全身递送是通过静脉内递送。在一些实施例中，可以施用包含货物的LNP用于局部递送，例如，将活性剂直接递送至生物体内的靶位点。在一些实施例中，LNP可以被局部递送至疾病部位，例如肿瘤，其他靶部位，例如炎症部位，或递送到靶器官，例如肝、肺、胃、结肠、胰腺、子宫、乳房、淋巴结等。在一些实施例中，本文披露的LNP可被局部递送至特定细胞，例如肝细胞、星状细胞、枯否细胞、内皮细胞、肺泡细胞和/或上皮细胞。在一些实施例中，本文披露的LNP可被局部递送至特定肿瘤部位，例如皮下、原位。

LNP可以配制成乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。在一些实施例中，LNP是可生物降解的。在一些实施例中，LNP在治疗有效剂量下不会累积到细胞毒性水平或在体内引起毒性。在一些实施例中，LNP在以治疗有效剂量重复施用后不会累积到细胞毒性水平或在体内引起毒性。在一些实施例中，LNP在治疗有效剂量下不引起导致显著不利影响的先天免疫反应。

在一些实施例中，使用的LNP包含式(6Z,9Z,28Z,31Z)-七碳六烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯或ssPalmO-苯基-P4C2(ssPalmO-Phe,SS-OP)。在一些实施例中，LNP配制品包括以下式：(6Z,9Z,28Z,31Z)-七碳六烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(MC3)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2k-DMG)，例如，MC3 LNP或ssPalmO-苯基-P4C2(ssPalmO-Phe，SS-OP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2k-DMG)，例如，SSOP-LNP。

脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其装载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.Doi:10.1155/2011/469679)。

囊泡可由几种不同类型的脂质制成；然而，最常使用磷脂生成作为药物载剂的脂质体。囊泡可包括但不限于DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，单独使用或与胆固醇一起产生DOTMA和胆固醇、DOTAP和胆固醇、DOTIM和胆固醇以及DDAB和胆固醇。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的传授内容通过援引并入文中)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤压装置以振荡的形式施加力来加快囊泡的形成(对于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.Doi:10.1155/2011/469679)。可通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，其关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入文中。

用途

本披露进一步涉及本文披露的表达阻遏物或表达阻遏物系统的用途。除其他事项外，在一些实施例中，此类提供的技术可用于实现靶基因(例如MYC)表达的调节，例如阻遏，并且例如能够控制例如细胞中的靶基因(例如MYC)的活性、递送和外显率。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在一些实施例中，细胞是体细胞。在一些实施例中，细胞是原代细胞。例如，在一些实施例中，细胞是哺乳动物体细胞。在一些实施例中，哺乳动物体细胞是原代细胞。在一些实施例中，哺乳动物体细胞是非胚胎细胞。

调节基因表达

本披露进一步部分地涉及一种调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)表达的方法，所述方法包括提供表达阻遏物(或编码所述表达阻遏物的核酸，或包括所述表达阻遏物核酸的药物组合物)或本文所述的表达阻遏系统(或编码所述表达阻遏系统的核酸，或包括所述表达阻遏系统或核酸的药物组合物)，以及使靶基因(例如MYC)和/或可操作地连接的一个或多个转录控制元件与表达阻遏物或表达阻遏系统接触。在一些实施例中，调节，例如降低靶基因(例如MYC)的表达，包括与在不存在表达阻遏物或表达阻遏系统的情况下的参考值，例如靶基因(例如MYC)的转录相比，调节靶基因(例如MYC)的转录。在一些实施例中，调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)表达的方法是离体使用的，例如在来自受试者(例如哺乳动物受试者，例如人受试者)的细胞上。在一些实施例中，调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)表达的方法是在体内使用的，例如在哺乳动物受试者(例如，人受试者)体内。在一些实施例中，调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)表达的方法是体外使用的，例如在本文所述的细胞或细胞系上。

本披露进一步部分地涉及治疗与错误调节(例如受试者中靶基因(例如MYC)的过表达)相关的病症的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的表达阻遏物(或编码其的核酸，或包含所述表达阻遏物核酸的药物组合物)或表达阻遏系统(或编码其的核酸，或包含所述表达阻遏系统或核酸的药物组合物)。与特定基因表达的过表达相关的病症是本领域技术人员已知的。此类病症包括但不限于代谢障碍、癌症(例如实体瘤)和肝炎。

本文提供的方法和组合物可以通过稳定或瞬时改变(例如，减少)靶基因(例如MYC)的转录来治疗与靶基因(例如MYC)的过表达或错误调控相关的病症。在一些实施例中，这种调节持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更长时间或其间的任何时间。在一些实施例中，这种调节持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或至少1、2、3、4、5、6或7天，或至少1、2、3、4或5周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少1、2、3、4或5年(例如，永久地或无限期地)。任选地，这种调节持续不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1年。

在一些实施例中，本文提供的方法或组合物可使细胞中靶基因(例如MYC)的表达相对于靶基因在未接触组合物或未用方法处理的细胞中的表达降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(并且任选地高达100％)。

在一些实施例中，本文提供的方法可以通过破坏与靶基因(例如MYC)相关联的基因组复合物(例如，锚序列介导的接合)来调节(例如，降低)所述靶基因的表达。与锚序列介导的接合相关联的基因可以至少部分地在连接内(即，在序列上位于第一和第二锚序列之间)，或者它可以在连接的外部，因为它在序列上不位于第一和第二锚序列之间，而是位于同一染色体上，并且与至少第一或第二锚序列足够接近，使得它的表达可以通过控制锚序列介导的接合的拓扑结构来调节。本领域普通技术人员将理解，在一些实施例中，两个元件之间(例如，基因和锚序列介导的接合之间)的三维空间距离可能比碱基对方面的距离更相关。在一些实施例中，外部但相关联的基因位于第一或第二锚序列的2Mb内、1.9Mb内、1.8Mb内、1.7Mb内、1.6Mb内、1.5Mb内、1.4Mb内、1.3Mb内、1.3Mb内、1.2Mb内、1.1Mb内、1Mb内、900kb内、800kb内、700kb内、500kb内、400kb内、300kb内、200kb内、100kb内、50kb内、20kb内、10kb内或5kb内。

在一些实施例中，调节基因(例如MYC)的表达包括改变转录控制序列对基因(例如MYC)的可及性。转录控制序列，无论是锚序列介导的接合的内部还是外部，都可以是增强序列或沉默(或抑制)序列。

在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的基因错误调节障碍，例如MYC基因错误调节障碍，例如与MYC基因错误调节相关的症状。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)中的MYC基因错误调节障碍或与MYC基因错误调节障碍相关的症状。在一些实施例中，该障碍与MYC错误调节相关，例如MYC过表达。在一些实施例中，该障碍与AFP错误调节相关，例如AFP过表达。在一些实施例中，此类提供的技术可用于甲基化靶基因(例如MYC)的启动子，以治疗有需要的受试者(例如患者)的基因错误调节障碍，例如MYC基因错误调节障碍，例如与MYC基因错误调节相关的症状。在一些实施例中，此类提供的技术可以选择性地影响异常表达由靶基因(例如，MYC)编码的多肽的细胞的活力。

在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的肝障碍或例如与肝障碍相关的症状的障碍。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的肺障碍或例如与肝障碍相关的症状的障碍。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的瘤形成障碍，例如与瘤形成障碍相关的障碍或症状。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的病毒感染相关障碍，例如与病毒感染相关障碍相关的障碍或症状。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的酒精滥用相关障碍，例如与酒精滥用相关障碍相关的障碍或症状。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗有需要的受试者(例如患者)的与病毒感染或酒精滥用相关的瘤形成障碍，例如与病毒感染或酒精滥用相关的瘤形成障碍相关的障碍或症状。

在一些实施例中，所治疗的病症是瘤形成。在一些实施例中，所治疗的病症是肿瘤发生。在一些实施例中，所治疗的病症是癌症。在一些实施例中，癌症与不良预后相关。在一些实施例中，癌症与MYC错误调节相关，例如MYC过表达。在一些实施例中，癌症与AFP错误调节相关，例如AFP过表达。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、肝癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和/或子宫癌。在一些实施例中，癌症与感染相关，例如病毒感染，例如细菌感染。在一些实施例中，癌症与酒精滥用相关。在一些实施例中，癌症是肝癌。

在一些实施例中，癌细胞是肺癌细胞、胃癌细胞、胃肠道癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞或肝癌细胞。在一些实施例中，癌症是肝细胞癌(HCC)、纤维板层肝细胞癌(FHCC)、胆管癌、血管肉瘤、继发性肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、大细胞(未分化)癌、三阴性乳腺癌、胃腺癌、子宫内膜癌或胰腺癌。

在一些实施例中，所治疗的病症是肝病。在一些实施例中，所治疗的病症与MYC错误调节相关，例如MYC过表达。在一些实施例中，所治疗的病症是慢性病。在一些实施例中，所治疗的病症是慢性肝病。在一些实施例中，所治疗的病症是病毒感染。在一些实施例中，所治疗的病症是酒精滥用相关障碍。

在一些实施例中，所治疗的病症是肺病。在一些实施例中，所治疗的病症与MYC错误调节相关，例如MYC过表达。在一些实施例中，所治疗的病症是慢性病。在一些实施例中，所治疗的病症是慢性肺病。在一些实施例中，此类提供的技术可用于治疗或减少肺癌生长、转移、药物抗性和/或癌症干细胞(CSC)维持。在一些实施例中，所治疗的病症是癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施例中，慢性肺病与烟草滥用相关。

在一些实施例中，癌症是肝癌亚型S1(HCC S1)、肝癌亚型S2(HCC S2)或肝癌亚型S3(HCC S2)。在一些实施例中，HCC亚型与MYC过表达相关。在一些实施例中，癌症是HCC S1或HCC S2。在一些实施例中，癌症亚型与侵袭性肿瘤和不良临床结果相关。

在一些实施例中，本披露提供了可以基于受试者的HCC亚型为受试者设计的治疗方案，例如基于受试者的HCC亚型定制治疗的积极性的个性化方法。在一些实施例中，本披露提供了使用本文披露的表达阻遏物或表达阻遏物系统的治疗方法，该方法包括鉴定患者的HCC亚型并基于HCC亚型鉴定确定所述表达阻遏物和/或表达阻遏物系统的剂量和施用方案。

本文描述了将本文披露的药剂或组合物递送至受试者以治疗病症的方法，使得与化疗治疗相比受试者遭受最小的副作用或全身毒性。在一些实施例中，当用本文描述的药剂和/或组合物治疗时，受试者没有经历通常与化疗相关的任何显著副作用。在一些实施例中，当用本文所述的药剂和/或组合物治疗时受试者未经历显著副作用，包括但不限于脱发、恶心、呕吐、食欲不振、酸痛、嗜中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、头晕、疲劳、便秘、口腔溃疡、皮肤发痒、脱皮、神经和肌肉损伤、听觉变化、体重减轻、腹泻、免疫抑制、瘀伤、心脏损伤、出血、肝损伤、肾损伤、水肿、口腔和咽喉溃疡、不育、纤维化、脱毛、出现湿性脱屑、粘膜干燥、眩晕和脑病。在一些实施例中，当用本文描述的药剂和/或组合物治疗时，受试者没有表现出体重的显著减轻。

本文所述的药剂和组合物可以例如在体内施用于受试者，例如哺乳动物，以治疗或预防本文所述的多种病症。这包括涉及以MYC表达模式改变为特征的细胞的障碍。

表观遗传修饰

本披露进一步部分地涉及一种对靶基因、可操作地连接至靶基因的转录控制元件或锚序列(例如，靶基因近侧的锚序列或与可操作地连接至靶基因的锚序列介导的接合相关联的锚序列)进行表观遗传修饰的方法，所述方法包括提供表达阻遏物(或编码其的核酸)或表达阻遏系统(例如，一个或多个表达阻遏物，或编码所述表达阻遏系统的核酸)或包括所述表达阻遏物(或编码其的核酸)或表达阻遏系统或核酸的药物组合物；以及使靶基因或可操作地连接至靶基因的转录控制元件与表达阻遏物或表达阻遏系统接触，从而对靶基因(例如MYC)或可操作地连接至靶基因(例如MYC)的转录控制元件进行表观遗传修饰。

在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法包括增加或减少靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的DNA甲基化。在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法包括增加或减少与靶基因(例如MYC)或靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件相关联的组蛋白的组蛋白甲基化。在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法包括减少与靶基因(例如MYC)或靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件相关联的组蛋白的组蛋白乙酰化。在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法包括增加或减少与靶基因(例如MYC)或靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件相关联的组蛋白的组蛋白苏素化。在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法包括增加或减少与靶基因(例如MYC)或靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件相关联的组蛋白的组蛋白磷酸化。

在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法可以相对于未被组合物接触或用该方法处理的细胞中该位点处的表观遗传修饰的水平，将表观遗传修饰的水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(并且任选地，高达100％)。在一些实施例中，表观遗传学修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法可以相对于未被组合物接触或用该方法处理的细胞中该位点处的表观遗传修饰的水平，将表观遗传修饰的水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％(并且任选地，高达200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或2000％)。在一些实施例中，靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的表观遗传修饰可以修饰靶基因(例如MYC)的表达水平，例如，如本文所述。

在一些实施例中，通过本文所述方法产生的表观遗传修饰持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更长时间或其间的任何时间。在一些实施例中，这种调节持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或至少1、2、3、4、5、6或7天，或至少1、2、3、4或5周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少1、2、3、4或5年(例如，无限期地)。任选地，这种调节持续不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1年。

在一些实施例中，一种用于表观遗传修饰靶基因(例如MYC)或与靶基因(例如MYC)可操作地连接的转录控制元件的方法中的表达阻遏物或表达阻遏系统包含含有效应子部分的表达阻遏物，该效应部分是或包含表观遗传修饰部分。

例如，效应子部分可以是或包括具有DNA甲基转移酶活性的表观遗传修饰部分，并且内源性或天然存在的靶序列(例如靶基因(例如MYC)或转录控制元件)可以被改变成增加其甲基化(例如，减少转录因子与靶基因(例如MYC)或转录控制元件的一部分的相互作用，减少成核蛋白与锚序列的结合，和/或中断或阻止锚序列介导的接合)，或者被改变成降低其甲基化(例如，增加转录因子与靶基因(例如MYC)或转录控制元件的一部分的相互作用，增加成核蛋白与锚序列的结合，和/或促进或增加锚序列介导的接合)。

试剂盒

本披露进一步部分地涉及包含本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统例如一个或多个表达阻遏物的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含表达阻遏物或表达阻遏系统(例如，表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)和使用所述表达阻遏物或表达阻遏系统的说明书。在一些实施例中，试剂盒包含编码表达阻遏物的核酸或编码表达阻遏系统或其组分的核酸(例如，表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)和使用所述表达阻遏物(和/或所述核酸)和/或所述表达阻遏系统(和/或所述核酸)的说明书。在一些实施例中，试剂盒包含含有编码表达阻遏物的核酸或编码表达阻遏系统或其组分(例如表达阻遏系统的一个或多个表达阻遏物)的核酸的细胞，以及使用所述细胞、核酸和/或所述表达阻遏物或表达阻遏系统的说明书。

在一些实施例中，该试剂盒进一步包括b)一套说明书，其包括至少一种用所述组合物治疗疾病或调节(例如，降低)靶基因(例如MYC)在细胞内的表达的方法。在一些实施例中，试剂盒可以任选地包括用于所述组合物的递送媒剂(例如，脂质纳米颗粒)。试剂可以悬浮在赋形剂和/或递送媒剂中提供，或者可以作为单独的组分提供，该单独的组分随后可以与赋形剂和/或递送媒剂组合。在一些实施例中，试剂盒可以任选地包含另外的治疗剂以与组合物共同以影响期望的靶基因表达，例如MYC基因表达调节。虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。任何能够存储此类说明并将它们传送给最终用户的介质都在考虑之列。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可能包括提供此类说明材料的互联网站点的地址。

在一些实施例中，试剂盒包括单位剂量的本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统(例如，一个或多个表达阻遏物)，或单位剂量的编码本文所述的表达阻遏系统(例如，一个或多个表达阻遏物)的核酸，例如，载体。

提供以下实例以进一步说明本披露的一些实施例，但并非旨在限制本披露的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实例

实例1：CTCF基序的靶向修饰导致MYC下调

本实例描述了使用Cas9对CTCF基序或与CTCF基序相邻的区域进行核酸酶编辑以下调MYC表达。

在本实例中，设计了与外显子1中包含的启动子区域CpG岛互补的四个sgRNA，以识别最佳靶区域，以指导表观遗传效应子介导的MYC基因下调。c-MYC基因包含长的非翻译外显子1(Spencer CA，Groudine M 1991)，外显子2和3包含主要编码区。使用CRISPR-dCas9-KRAB和CRISPR-dCas9-MQ1(来自细菌软体螺原体的DNMT)效应子进行基因组编辑，四个sgRNA靶向MYC启动子CpG岛区域，以识别合适的下调区域。(1)dCas9(无效应子)与sgRNA组合，以及(2)未处理的细胞都用作对照来评估MYC表达的变化。这些用于选择sgRNA的初始筛选是在易于生长和可转染的细胞K562和HEK293中进行的，并确定sgRNA(GD-28617)介导对MYC mRNA下调的最强影响(数据未显示)。

将靶向CTCF基序(GD-28616)或直接邻近CTCF基序(GD-28859)的上游区域(CTCF锚定位点)的Cas9用2.5ug/ml SSOP制剂转染至三种人HCC模型(HepG2、Hep3B和SKHEP1)中(表11和图1A-B)。使用Cas9(与GD-28616组合)破坏CTCF基序导致所有三个HCC细胞系(HepG2、Hep3B和SKHEP1)中MYC表达下调32％-39％。CTCF基序(GD-28859)邻近区域的破坏使三个品系中的两个(HepG2和Hep3B)的MYC表达下调35％-45％(图2A)。AmpSeq评估的编辑效率证实了细胞系的编辑率为77％-100％(图2B)。

表11：指导物

实例2：与dCas9sgRNA融合的KRAB效应子下调MYC1表达

本实例描述了通过将与dCas9sgRNA融合的KRAB效应子靶向CTCF基序(GD-28616)或直接邻近CTCF基序的上游区域(GD-28859)或MYC启动子(GD-28617)来下调MYC1表达。为了靶向HCC中的MYC表达，通过将CRISPR-dCas9系统连接到KRAB来对其进行修饰。

在本实例中，将dCas9-KRAB mRNA递送至人HCC细胞系(HepG2、Hep3B和SKHEP1)，其中单个sgRNA(表1和图1A-B)将其靶向CTCF基序(GD-28616)、CTCF“锚”位点(GD-28859)或MYC启动子(GD-28617)。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA和sgRNA。对于对照，(1)dCas9(无效应子)与sgRNA组合，以及(2)未处理的细胞用于评估变化。将HCC细胞接种在96孔板的生长培养基中(5000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(2-2.5ug/ml)添加到细胞中以转染mRNA和sgRNA。所有处理均一式三份进行生物学处理。评估24-168小时的时间点的MYC表达和细胞活力。按照制造商的方案，使用加96孔试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从四个独立的实验中分离RNA。使用/>超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录为cDNA，并使用MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定

使用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司(Thermo Scientific))通过定量PCR(qPCR)(技术上一式三份)进行分析。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参考基因的表达对MYC表达进行定量。未处理的和dCas9(无效应子)样品用作校准物。

实验数据表明，LNP介导的dCas9-KRAB/GD-28616转染在Hep3B和SKHEP1中的48/72小时时间点将MYC表达下调11％-34％。在所有3个HCC模型中，LNP介导的dCas9-KRAB/GD-28859转染在48/72小时时间点将MYC表达下调18％-44％(图3)。这种效应在两个细胞系(Hep3B和SKHEP1)中到168小时时降低，但MYC表达在HepG2细胞系中在168小时时仍然下降了28％(图3)。在所有3个HCC模型中，通过dCas9-KRAB/GD-28617将dCas9-KRAB引导至MYC启动子，在48/72小时时间点将MYC表达下调24％-58％。这种效应在两个细胞系(Hep3B和SKHEP1)中到168小时时降低，但MYC在HepG2中在168小时时仍然下降了43％(图3)。

实例3：与锌指结构域融合的KRAB效应子下调MYC1表达

本实例描述了通过将与锌指结构域融合的KRAB效应子靶向与CTCF基序直接相邻的上游区域(GD-28859)来下调MYC1表达。在本实例中，锌指指导的KRAB效应子(ZF-KRAB效应子)被设计为结合由GD-28859靶向的DNA区域的锚位点(图4A)。在人HCC模型(HepG2、Hep3B、SKHEP1)中设计并筛选了7种构建体(dCas-KRAB/GD-59、ZF1-KRAB、ZF2-KRAB、ZF3-KRAB、ZF4-KRAB、ZF5-KRAB和ZF6-KRAB)。这些实验的阴性对照包括未处理的细胞，dCas9-KRAB/GD-28859用作阳性对照。从两个独立实验中分离RNA，每个实验以生物学一式三份进行，使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)遵循制造商的方案。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性Taqman引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参考基因的表达对MYC表达进行定量，未处理和dCas9(无效应子)样品用作校准品。使用/>发光细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega)#G9241)通过ATP定量评估细胞活力。将HCC细胞接种在96孔板的生长培养基中(5000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(0.6-2.5ug/ml)添加到细胞中以转染mRNA和sgRNA。所有处理均一式三份进行生物学处理。

这些数据表明，在Hep3B细胞中，ZF2-KRAB、ZF3-KRAB和ZF4-KRAB下调MYC的程度与dCas9-KRAB/GD-28859相当或更大，其中ZF3-KRAB的下调作用最强(表4B)。在其他两种HCC模型HepG2和SKHEP1中，ZF3-KRAB也显示出下调MYC的程度与dCas9-KRAB/GD-28859相当或更大(表4C)。ZF3-无效应子(NE)也被确定对MYC表达具有下调作用，可能是由于调节位点的空间阻断所致。Hep3B中的ZF3-KRAB和ZF3-NE在24、72和120小时的时间过程中均表现出对MYC表达和活力的下调作用(图4D)。

实例4：与dCas9sgRNA融合的MQ1效应子下调MYC1表达

本实例描述了通过将与dCas9sgRNA融合的MQ1效应子靶向CTCF基序(GD-28616)或直接邻近CTCF基序的上游区域(GD-28859)、GD-28862或MYC启动子(GD-28617)来下调MYC1表达。

在本实例中，将dCas9-MQ1 mRNA递送至人HCC细胞系(HepG2、Hep3B和SKHEP1)，其中单个sgRNA(表11和图1A-B)将其靶向CTCF“锚”位点或MYC启动子。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA和sgRNA。对于对照，(1)dCas9(无效应子)与sgRNA组合，以及(2)未处理的细胞用于评估变化。基本上按照实例2中描述的方案进行实验。

结果表明，dCas9-MQ1通过GD-16、GD-59和GD-62靶向CTCF，以细胞系特异性方式导致可变的下调和上调。dCas9-MQ1通过GD-17靶向启动子在所有三种HCC模型中导致72小时时MYC下调50％-90％，并持续直至168小时(图5)。MYC下调在72小时和168小时显著降低HepG2和Hep3B的活力，尽管SK-HEP-1活力受MYC下调的影响最小。与未处理的对照相比，dCas9-sgRNA对照对表达或活力没有影响

实例5：与锌指结构域融合的MQ1效应子下调MYC1表达

本实例描述了通过将与锌指结构域融合的MQ1效应子靶向MYC启动子(GD-28617)来下调MYC1表达。

在本实例中，锌指指导的MQ1效应子(ZF-MQ1效应子)被设计为结合由GD-28617靶向的DNA区域(图4A和图6A)。围绕GD-28617设计6个构建体(ZF7-MQ1、ZF8-MQ1、ZF9-MQ1、ZF10-MQ1、ZF11-MQ1和ZF12-MQ1)以结合实施例4筛选中鉴定的区域并在人HCC模型(HepG2、Hep3B、SKHEP1)中筛选。未处理的细胞和单独转染ZF蛋白的细胞(ZF-无效应子或ZF-NE)用作实验的阴性对照，dCas9-KRAB/GD-28859用作阳性对照。遵循实例3中描述的方案。

结果表明，ZF8-MQ1、ZF9-MQ1和ZF11-MQ1在Hep3B细胞中最大程度地下调MYC，其中ZF9-MQ1的下调作用最强(图6B)。数据进一步表明，成功降低MYC表达的ZF-MQ1分子(ZF8-MQ1、ZF9-MQ1和ZF11-MQ1)的基因组结合位点与不改变MYC表达的ZF-MQ1分子(ZF7-MQ1、ZF10-MQ1和ZF12-MQ1)非常接近。这可能是结合效率、结合的3-D取向、区域甲基化延伸的影响，或者是与MYC启动子中的调节元件相关的特定效应子定位的结果。看来ZF效应子结合位点的轻微改变对MYC基因调控具有显著影响。研究发现，ZF9-MQ1在所有三种HCC模型中都能强烈下调MYC mRNA并降低活力，并且ZF9-MQ1构建体所产生的作用比dCas9-MQ1/GD-28617系统所产生的作用要大得多。

实例6：与其他ZF-MQ1效应子相比，ZF9-MQ1对MYC1表达具有最强的下调作用

本实例描述了与其他测试的ZF-MQ1效应子相比，ZF9-MQ1通过将与锌指结构域融合的MQ1效应子靶向MYC启动子(GD-28617)，对下调MYC1表达具有最强的作用。

在本实例中，将ZF9-MQ1在所有HCC模型(HepG2、Hep3B和SKHEP1)中下调MYC表达的作用分别与ZF12-MQ1、ZF8-MQ1和dCas9-MQ1/GD-28617进行比较。未处理的细胞和单独转染ZF蛋白的细胞(ZF-无效应子或ZF-NE)用作实验的阴性对照，dCas9-KRAB/GD-28859用作阳性对照。遵循实例3中描述的方案。

与ZF12-MQ1相比，ZF9-MQ1在所有三种检查的HCC模型(Hep3B、HepG2和SKHEP1)中均显示出强烈下调MYC并降低活力(图7A-C)。ZF9-MQ1调节的MYC1表达下调比ZF8-MQ1存在时观察到的下调相对更大(图7D-F)，并且用ZF9-MQ1构建体观察到的作用比dCas9-MQ1/GD-28617系统可以指导的作用大得多(图7G-I)。数据进一步显示，虽然ZF9-MQ1最快在24小时内下调MYC表达，但直到72小时或更晚才观察到对活力的影响。相比之下，ZF8-MQ1对MYCmRNA的影响要小得多，但细胞活力的降低要直接得多。

实例7：dCas9-MQ1对MYC表达的作用明显大于人dCas9-DNMT1或dCas9-DNMT-3A-3L

本实例展示dCas9-MQ1对MYC表达的作用明显大于人dCas9-DNMT1或dCas9-DNMT-3A-3L。

在本实例中，通过将CRISPR-dCas9系统与一系列表观遗传阻遏物(包括KRAB、人DNMT1、人DNMT3A-3L融合物、人DNMT3Bm原核DNMT和MQ1)拴系来进行修饰。这些分子通过招募阻遏复合物(KRAB)或甲基化DNA的CpG核苷酸(DNMT1、DNMT3A-3L、DNMT3B和MQ1)来调节转录阻遏。利用一组人HCC细胞系(包括HepG2、Hep3B和SKHEP1)在肝癌模型中进行效应子筛选。将GD-28617sgRNA与dCas9-DNMT mRNA组合，并通过LNP转染共同递送至这些细胞系中。CRISPR-Cas9研究通过测量sgRNA/Cas9的编辑效率来评估LNP递送的功效，证实使用该系统的编辑效率为90％-99％(数据未显示)。转染后，然后在多个时间点通过qPCR分析细胞的MYC mRNA表达，并通过分析细胞的活力。为了通过亚硫酸氢盐测序进行靶向甲基化和整体甲基化分析，使用Lucigen DNA提取试剂盒分离基因组DNA。

这些研究表明，dCas9-MQ1对MYC表达的作用明显大于所检查的任何人dCas9-DNMT或dCas9-KRAB(数据未显示)。dCas9-MQ1在72小时时使这三个品系的mRNA减少了50％-90％(图8A)。MYC下调在72小时和168小时显著降低HepG2和Hep3B的活力，尽管SK-HEP-1活力受MYC下调的影响最小(图8B)。与未处理的对照相比，dCas9-sgRNA对照对表达或活力没有影响。

由于SK-HEP-1模型显示MYC下调后活力变化最小，因此利用该品系来评估对MYC表达下调作用的持久性。第5天，与仅使用dCas9 DBD的对照和未处理的对照相比，MYC mRNA减少了80％。在第7天和第11天，MYC mRNA分别减少约70％和约55％。直到第15天，转录物仍维持约40％的下调(图8C)。使用亚硫酸氢盐基因组测序(一种以单碱基对分辨率测量5-甲基胞嘧啶的定性和定量方法)确定，用dCas9-MQ1/GD-28617处理将从头甲基化引导至目标区域，并且这些转录变化与目标区域中CpG甲基化的百分比紧密相关，并证实甲基化持续直至第15天(图8D)。

实例8：用dCas9-MQ1/GD-17处理抑制体内肿瘤生长

本实例描述了皮下Hep3B异种移植物的dCas9-MQ1/GD-17处理的体内分析，与对照处理(PBS和/或dCas9/GD-安全港)相比，可抑制肿瘤生长。

在本实例中，在第1天和第7天，通过瘤内注射将0.6mg/ml LNP(MC3)配制的效应子(dCas9-MQ1/GD-17)递送至测试组动物的肿瘤部位(20μl/小鼠)。对照组小鼠在肿瘤部位注射PBS或0.6mg/ml LNP(MC3)对照效应子dCas9/GD-安全港(20μl/小鼠)。每个对照组和测试组由6只具有SubQ Hep3B异种移植物(250mm³)的动物组成。每3天测量一次每组肿瘤体积的变化，持续15天。15天结束时，使用配对T检验测量平均肿瘤体积的变化并绘制图表。与对照组相比，用dCas9-MQ1/GD-17处理的小鼠肿瘤体积有所减小(图9)。

实例9：dCas9-MQ1/GD-17在乙型肝炎感染的情况下下调人肝细胞中的MYC

本实例展示dCas9-MQ1/GD-17在人肝细胞感染乙型肝炎的情况下下调MYC。

在本实例中，人肝细胞被HBV感染，并且未感染和感染的肝细胞均被铺板并生长8天。9天结束时，与未感染的细胞相比，HBV感染的人肝细胞显示出更高的MYC表达。未感染和HBV感染的肝细胞均被带有对照效应子(dCas9+安全港sgRNA(GD-SH))或效应子dCas9-MQ1/GD-17的LNP转染，并允许再生长48小时。然后48小时后通过qPCR评估MYC表达(图8)。该研究以生物学一式三份进行。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参照基因的表达来定量MYC表达，并且dCas9+GD-SH样品用作校准品。

48小时后通过qPCR评估并针对未感染的人肝细胞对照归一化的MYC表达表明，dCas9-MQ1/GD-17(启动子)下调未感染和感染细胞中的MYC(图10)。

实例10：锌指结构域与靶向MYC ASMC的转录效应子的组合下调MYC表达

本实例展示了将与锌指结构域融合的KRAB效应子(或无效应子或NE)靶向与CTCF基序直接相邻的上游区域(ZF3-NE或ZF3-KRAB)以及将与锌指结构域融合的MQ1效应子靶向MYC启动子(ZF9-MQ1)可下调MYC mRNA表达。与本实施例中单独或组合测试的其他效应子相比，ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的组合在下调MYC表达方面更有效。

靶向锚CTCF的ZF3-NE或ZF3-KRAB效应子与设计用于结合和靶向HCC细胞系Hep3B中的MYC启动子的ZF9-MQ1组合。dCas-KRAB/GD-28859和dCas9-MQ1/GD-28617用于两个区域的阳性对照。这些实验的阴性对照包括未处理的细胞和用ZF5-NE和绿色荧光蛋白(GFP)转染的细胞。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA。将HCC细胞接种在96孔板的生长培养基中(约5000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(0.6ug/ml)添加到细胞中以转染mRNA，然后孵育不同的时间点。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参考基因的表达对MYC表达进行定量，未处理和dCas9(无效应子)样品用作校准品。

这些数据表明，ZF3-KRAB加ZF9-MQ1比dCas9-KRAB/GD-28859、ZF3-KRAB、ZF3-NE、dCas9-MQ1/GD-28617、ZF9-MQ1单独或ZF3-NE或ZF5-NE加ZF9-MQ1组合更大程度地下调MYC(图11)。单独使用GFP和ZF5-NE对MYC表达的作用可以忽略不计。在测试的时间过程(24、48和72小时)内，数据具有可比性，最大阻遏在24小时后持续到至少72小时。

实例11：ZF9-MQ1和ZF3-KRAB组合可下调三个HCC模型中的MYC表达。

本实例展示，与单独或组合测试的其他效应子相比，ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的组合在其他HCC细胞系(Hep3B、HepG2和SKHEP1)中下调MYC mRNA表达更多。

靶向锚CTCF的ZF3-NE或ZF3-KRAB效应子与设计用于结合并靶向三个HCC细胞系(Hep3B、HepG2和SKHEP1)中的MYC启动子的ZF9-MQ1组合。这些实验的阴性对照包括用ZF5-NE转染的细胞。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA。将HCC细胞接种在96孔板的生长培养基中(约5000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(0.6ug/ml)添加到细胞中以转染mRNA，然后孵育不同的时间点。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参考基因的表达对MYC表达进行定量，未处理和dCas9(无效应子)样品用作校准品。

这些数据表明，ZF3-KRAB加ZF9-MQ1比单独的ZF9-MQ1或ZF3-NE加ZF9-MQ1组合更大程度地下调MYC(图12)。在测试的时间过程(24、48和72小时)内，数据具有可比性。

实例12：另外的HCC模型中ZF9-MQ1的活力和MYC表达的剂量应答曲线。

本实例描述了使用剂量应答曲线通过ZF9-MQ1在五种HCC细胞系中下调Myc表达和细胞活力。

在本实例中，设计用于结合并靶向MYC启动子的ZF9-MQ1以多个浓度给药于五个HCC细胞系Hep3B、HepG2、SKHEP1、SNU-182和SNU-449中(图13A)。未处理的细胞用作阴性对照。使用具有SSOP的LNP递送来递送效应子mRNA。将HCC细胞接种在96孔板的生长培养基中(约5000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(从5或0.6ug/ml开始)分别添加到3个孔中，然后在后续孔中以约1:2稀释，共6至10个剂量，以便转染mRNA，然后孵育72小时。收集不同的重复板以检测活力和RNA。根据制造商的方案，使用普洛麦格公司的Celltiter GLO检测试剂盒测量活力。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参考基因的表达对MYC表达进行定量，未处理和dCas9(无效应子)样品用作校准品。EC50值是根据剂量应答曲线计算的。

这些数据表明，ZF9-MQ1下调MYC表达并降低所有测试的五种HCC细胞系的活力。在这五种HCC细胞系中，ZF9-MQ1下调MYC表达，EC50范围为0.0057-0.065ug/ml LNP/mRNA，对体外72小时时活力的EC50作用范围为0.049-.29ug/ml。(图13B-F)。

实例13：ZF9-MQ1在裸小鼠皮下生长的Hep 3B模型中的体内功效。

本实例展示，ZF9-MQ1处理抑制了雌性裸小鼠中建立的Hep 3B肿瘤的生长。

将Hep 3B肿瘤细胞植入三十只雌性裸小鼠的左胁腹以诱导肿瘤。测量肿瘤体积的变化，并在平均肿瘤体积达到约100-150mm³时开始处理。将小鼠分为处理组和对照组，使得每组的平均肿瘤体积大致相等。对照组注射PBS或MYCi975(一种小分子比较物)。每组小鼠瘤内注射PBS(每5天一次，3个剂量，然后转为静脉内2个剂量)，静脉内ZF9-MQ1(每5天以3mg/kg)或腹腔内注射MYCi975(每天一次，5天/周)。每天对所有动物称重并进行目视评估。每周测量每组肿瘤体积的变化3次。在22天的过程中，使用配对T检验测量体重相对于基线的变化和平均肿瘤体积并绘制成图(图14A-B)。

结果表明，与PBS对照处理的小鼠相比，ZF9-MQ1能够显著减少肿瘤生长(从第6天开始)。ZF9-MQ1比小分子比较物(MYCi975)更能减少肿瘤生长(图14A)。此外，最后一个剂量后48小时的IHC染色显示ZF9-MQ1多肽的表达、MYC表达的减少以及通过Ki67测量的增殖的减少(数据未显示)。ZF9-MQ1对动物总体重量的影响最小(图14B)。

实例14：ZF9-MQ1+ZF3-KRAB在Fox Chase CB17 SCID小鼠中原位生长的Hep 3B模型中的体内功效。

本实例展示了在雌性Fox Chase CB17 SCID小鼠的原位Hep3B-luc模型中，双顺反子ZF9-MQ1+ZF3-KRAB给药后的长期抗肿瘤功效和持久性。

Hep-3B-luc细胞被注射到SCID小鼠的肝左上叶。随机分组时每组的平均腹侧视图全身肿瘤相关生物发光(TABL)约为2.8x109 p/s。在细胞植入后第7天，将小鼠随机分为每组12只小鼠的两组(用PBS和ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理)以及一组6只小鼠(用索拉非尼处理)。处理从肿瘤细胞植入后第8天开始(在图表上标记为给药第1天)。小鼠用以下处理：静脉内PBS(每5天一次，4个剂量，然后每3天一次，2个剂量)，静脉LNP(MC3)ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(每5天以1.5mg/kg，2个剂量，每5天以3mg/kg，3个剂量，每3天以3mg/kg，1个剂量)，口服索拉非尼(每天50mg/kg)。每天对所有动物称重并进行目视评估。每周通过生物发光测量肿瘤尺寸2次。

结果表明，与PBS对照处理的小鼠相比，ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理显著减少了肿瘤生长(从第21天开始)。ZF9-MQ1+ZF3-KRAB减少的肿瘤生长与索拉非尼相当(图15A)。用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理对动物总重量影响最小(图15B)。

实例15：ZF9-MQ1和共同配制的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB在裸小鼠中皮下生长的Hep 3B模型中的体内功效。

本实例展示，ZF9-MQ1和共同配制的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB能够以剂量依赖性方式抑制雌性裸小鼠中Hep 3B肿瘤的生长。

将Hep 3B肿瘤细胞植入七十二只雌性裸小鼠的左胁腹以诱导肿瘤。测量肿瘤体积的变化，并在平均肿瘤体积达到约200mm³时开始处理。将小鼠分为九个处理组(每组8只小鼠)，使得每组的平均肿瘤体积大致相等。向每组中的小鼠静脉内注射PBS(每5天一次，3个剂量，然后每3天一次，3个剂量)、1mg/kg和3mg/kg ZF9-MQ1(每5天一次，3个剂量，然后每3天一次，3个剂量)、1mg/kg和3mg/kg的共配制的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(每5天一次，3个剂量，然后每3天一次，3个剂量)、1mg/kg和3mg/kg阴性对照mRNA(每5天一次，3个剂量，然后每3天一次，3个剂量)、腹膜内注射100mg/kg MYCi975(每天一次，每周5天)或腹膜内注射1mg/kg顺铂(每15天一次)。每天对所有动物称重并进行目视评估。每周测量肿瘤体积的变化3次。

结果显示，与阴性对照处理的小鼠相比，单独的ZF9-MQ1以及ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的以1mg/kg的组合能够减少肿瘤生长(图16A)。此外，与阴性对照处理的小鼠相比，单独的ZF9-MQ1(从第13天开始)和共同配制的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB以3mg/kg的组合(从第6天开始)能够显著减少肿瘤生长(图16B)。共同配制的ZF9-MQ1+/ZF3-KRAB在1mg/kg和3mg/kg剂量下能够以与顺铂或小分子比较物(MYCi975)相似或更高的水平减少肿瘤生长。与1mg/kg和3mg/kg剂量的顺铂和MYCi975相比，共同配制的ZF9-MQ1+/-ZF3-KRAB对总体动物体重的影响最小(图16C-D)。

实例16：锌指结构域与靶向MYC绝缘基因组结构域(IGD)的DNA甲基转移酶的组合在各种肺癌细胞系中下调MYC表达并降低细胞活力

本实例展示，在NSCLC系(A549、NCI-H2009、NCI-H358HCC95)中，通过将与锌指结构域融合的MQ1效应子靶向MYC启动子(ZF9-MQ1)来下调Myc1 mRNA表达会导致多种肺癌细胞系的细胞活力丧失。

设计为结合和靶向肺癌细胞系中MYC启动子的ZF9-MQ1与阴性对照一起递送，阴性对照包括未处理的细胞和用绿色荧光蛋白(GFP)转染的细胞。如上文实例12和14中所述，使用SSOP LNP递送来递送编码ZF9-MQ1或GFP的mRNA。将肺癌细胞接种在96孔板的生长培养基中(约10000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(1μg/ml)添加到细胞中以转染mRNA，然后分别孵育72小时和120小时。收集不同的重复板以确定活力和mRNA表达的变化。

根据制造商的方案，使用普洛麦格公司的检测试剂盒测量活力。使用/>Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参照基因的表达来定量MYC表达，并且未处理的样品用作校准品。

这些数据显示ZF9-MQ1能够在四种肺癌细胞系中使MYC mRNA水平降低>80％，并且这与所有四种细胞系中肺癌细胞活力的显著丧失相一致(图17A-H)。

实例17：ZF9-MQ1诱导NSCLC细胞系NCI-H2009细胞凋亡

本实例展示了ZF9-MQ1对肺癌细胞细胞凋亡的影响。

活力测定例如Cell Titer GLO(实例16中所用)通过基于ATP水平确定孔中剩余细胞的相对数量来测量活力。这些测定无法区分细胞增殖丧失和不同类型的细胞死亡(例如坏死性凋亡与细胞凋亡)。

使用针对膜联蛋白V的经荧光标记的抗体和碘化丙啶(PI)核染色剂对用ZF9-MQ1转染后的凋亡细胞进行定量。除未处理的细胞外，编码不含效应蛋白的ZF9锌指结构域(ZF9-NE)的mRNA也用作阴性对照。将肺细胞系NCI-H2009铺板于12孔板的生长培养基中(每孔50,000个细胞)。然后将含有mRNA的LNP配制品(1ug/ml)添加到细胞中以转染ZF9-MQ1或ZF9-NE mRNA，然后孵育96小时。收获细胞并使用BD膜联蛋白V:FITC细胞凋亡检测试剂盒(BDB556570)染色并通过流式细胞仪进行分析。膜联蛋白V-FITC和PI呈阳性的细胞被归类为凋亡细胞。

这些数据显示96小时后，在阴性对照(用ZF9-NE处理的细胞和未处理的细胞)中，仅18％的细胞凋亡(图18A-B、18D)。相反，在用ZF9-MQ1处理的NCI-H2009培养物中40％的细胞凋亡(图18C-D)。这就说明ZF9-MQ1能够诱导肺癌细胞的细胞凋亡。

实例18：另外的NSCLC细胞系中ZF9-MQ1的活力和MYC表达的剂量应答曲线。

本实例展示ZF9-MQ1以剂量应答方式下调NSCLC细胞系中MYC1表达和细胞活力。

设计用于结合和靶向MYC启动子的ZF9-MQ1在两种NSCLC细胞系A549和HCC95中以多个浓度给药。未处理的细胞用作阴性对照。使用具有SSOP的LNP递送来递送效应子mRNA。将肺癌细胞接种在96孔板的生长培养基中(约10000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(从5ug/ml开始)分别添加到3个孔中，然后在后续孔中以约1:2稀释，共10个剂量，以便转染mRNA，并且孵育72小时。收集不同的重复板以确定活力和mRNA表达的变化。

根据制造商的方案，使用普洛麦格公司的检测试剂盒测量活力。使用/>Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参考基因的表达对MYC表达进行定量，未处理和dCas9(无效应子)样品用作校准品。

数据显示在A549和HCC95(图19A-B)中，在体外在72小时，ZF9-MQ1下调的MYC，具有0.08ug/ml LNP/mRNA的EC50，对活力(2ug/ml)的EC50效应高约25倍。

实例19：ZF9-MQ1将NSCLC细胞系NCI-H2009中的MYC蛋白水平降低超过80％

本实例通过免疫印迹技术演示了应答于ZF9-MQ1的MYC蛋白水平的变化。

设计为结合和靶向肺癌细胞系中MYC启动子的ZF9-MQ1与阴性对照ZF9-NE和未处理的细胞一起递送。将肺细胞系NCI-H2009铺板于12孔板的生长培养基中(每孔50,000个细胞)。然后将的LNP配制品(1ug/ml)添加到细胞中以转染ZF9-MQ1或ZF9-NE mRNA，然后孵育96小时。然后将细胞在RIPA缓冲液中裂解，并使用Pierce BCA蛋白质测定(23225)定量蛋白质水平。每个样品上样等量的蛋白质，并使用NuPAGE^TM小型凝胶系统(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))按大小进行分离。然后使用iBlot^TM2凝胶转移装置(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到PVDF膜上。使用ABCAM抗MYC抗体(ab32072)过夜探测膜。细胞信号传导公司(Cell Signaling)抗肌动蛋白抗体(8H10D10)用作上样对照。然后使用LI-COR成像系统使用MYC和肌动蛋白抗体种类的荧光二抗对信号进行可视化和量化。

数据显示ZF9-MQ1处理使肺癌细胞系中处理后96小时的MYC蛋白水平降低超过80％(图20A-B)，与mRNA表达水平的降低相当(实例17)。

实例20：ZF9-MQ1在裸小鼠中皮下生长的NCI-H2009模型中的体内功效。

本实例展示ZF9-MQ1抑制雌性裸小鼠中建立的NCI-H2009肿瘤的生长。

通过将NCI-H2009肿瘤细胞植入雌性裸小鼠的左胁腹来诱导疾病。当平均肿瘤体积达到约100-150mm³时开始处理。将小鼠分为处理组，使得每组的平均肿瘤体积大致相等。mRNA在MC3 LNP中递送。给小鼠静脉内注射以3mg/kg的ZF9-MQ1或MC3 LNP中的非编码mRNA或PBS(每5天一次，4个剂量，然后每3天一次，3个剂量；小鼠总共接受了7个剂量)。每天对所有动物称重并进行目视评估。每周测量肿瘤尺寸3次。

结果表明，与PBS对照处理的小鼠相比，ZF9-MQ1能够显著减少肿瘤生长(从第8天开始)(图21)。ZF9-MQ1对动物总体重量的影响最小。

实例21：使用SSOP LNP，靶向MYC IGD超级增强子的指导RNA和转录阻遏物(通过dCas9)的组合下调MYC表达

本实例展示，当调节A549细胞系中MYC表达的肺特异性超级增强子被KRAB效应蛋白靶向时，MYC mRNA表达下调。

指导RNA(表13)在肺超级增强子区域进行设计，并与缀合至无酶促活性的CAS9的KRAB阻遏蛋白结合进行测试。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA和指导RNA，并以GFP的mRNA递送作为阴性对照。将NCSLC细胞系A549接种在96孔板的生长培养基中(约10000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(2.5ug/ml)添加到细胞中以转染效应子mRNA/指导RNA，然后孵育72小时。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参照基因的表达来定量MYC表达，并且未处理的样品用作校准品。

表13：指导物

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这些数据表明，当使用与dCAS9-KRAB效应子mRNA一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以下调MYC mRNA水平，突出了使用该远端调节元件减少致癌MYC的能力(图22)。

实例22：使用MC3 LNP，靶向MYC IGD超级增强子的指导RNA和转录阻遏物(dCas9)的组合下调MYC表达

本实例描述了通过利用替代脂质MC3(相对于实例21中的SSOP)将KRAB效应蛋白靶向肺特异性超级增强子(其调节MYC表达)来下调MYC mRNA表达。

指导RNA(表13)在肺超级增强子区域进行设计，并与缀合至无酶促活性的CAS9的KRAB阻遏蛋白结合进行测试。使用具有MC3的LNP递送来共同递送效应子mRNA和指导RNA，并以GFP的mRNA递送作为阴性对照。将NCSLC细胞系A549接种在96孔板的生长培养基中(约10000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(2.5ug/ml)添加到细胞中以转染效应子mRNA/指导RNA，然后孵育72小时。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参照基因的表达来定量MYC表达，并且未处理的样品用作校准品。

这些数据表明，当使用与dCAS9-KRAB效应子mRNA一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以下调MYC mRNA水平，突出了使用该远端调节元件减少致癌MYC的能力(图23)。这种作用在SSOP(实例21)和MC3脂质转染(实例22)中均可见。

实例23：靶向MYC IGD超级增强子的指导RNA与转录阻遏物(dCas9)的组合下调NSCLC中的MYC表达

本实例描述了通过将各种转录效应蛋白(EZH2、EZH2-KRAB或MQ1)靶向调节MYC表达的肺特异性超级增强子来下调MYC mRNA表达。

靶向MYC超级增强子的指导RNA(GD-29833和GD-29914)与阻遏蛋白(包括组蛋白甲基转移酶EZH2(单独或与KRAB缀合)和与无酶促活性的CAS9缀合的DNA甲基转移酶MQ1)组合进行了测试。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA和指导RNA，并以GFP的mRNA递送作为阴性对照。将NCSLC细胞系A549或NCI-H2009接种在96孔板的生长培养基中(约10000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(2.5ug/ml)添加到细胞中以转染效应子mRNA/指导RNA，然后孵育72小时。使用Plus96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参照基因的表达来定量MYC表达，并且未处理的样品用作校准品。

这些数据表明，当在2种不同NSCLC细胞系(A549和NCI-H2009)中与测试的所有3种效应蛋白(EZH2、EZH2-KRAB和MQ1)一起递送时，指导RNA GD-29833和29914可以有效下调MYC mRNA水平(图24A-B)。

实例24：靶向MYC IGD超级增强子的指导RNA与转录阻遏物(dCas9)的组合在120小时时进一步下调NSCLC中的MYC表达

本实例表明，在肺癌细胞系(A549和NCI-H2009)中，靶向超级增强子的指导物连同KRAB或MQ1效应蛋白转染后120小时，观察到MYC mRNA表达量的减少增加。

与KRAB阻遏蛋白或MQ1 DNA甲基转移酶组合地对靶向MYC超级增强子的指导RNA进行了测试。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA和指导RNA，并以GFP的mRNA递送作为阴性对照。将NCSLC细胞系A549或NCI-H2009接种在12孔板的生长培养基中(约50000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(2.5ug/ml)添加到细胞中以转染效应子mRNA/指导RNA，然后孵育120小时。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH参照基因的表达来定量MYC表达，并且未处理的样品用作校准品。

这些数据显示与KRAB或MQ1一起递送的指导RNA GD-29833和29914可以在120小时时显著下调2个NSCLC细胞系(A549和NCI-H2009)中的MYC mRNA水平(图25A-B)。此外，观察到的下调与NCI-H2009中ZF9-MQ1处理观察到的下调相当(图25B)。

实例25：将dCAS9-MQ1导向MYC超级增强子会导致超级增强子靶位点和MYC启动子区域的DNA甲基化增加。

本实例展示dCas9-MQ1可被导向至MYC超级增强子，导致靶位点和MYC启动子区域的甲基化。

通过将CRISPR-dCas9系统与表观遗传阻遏物MQ1拴系来对CRISPR-dCas9系统进行修饰。这些分子调节转录抑制，使DNA的CpG核苷酸甲基化。使用具有SSOP的LNP递送来共同递送效应子mRNA和超级增强子指导RNA(29833和29914)，其中使用GFP或dCAS9无效应子构建体(dCas9-NE)的mRNA递送作为阴性对照。将NCSLC细胞系NCI-H2009接种在6孔板的生长培养基中(约100000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(2.5ug/ml)添加到细胞中以转染效应子mRNA/指导RNA，然后孵育72小时。使用Lucigen QuickExtract^TMDNA提取试剂盒分离DNA，并使用启动子和超级增强子区域的靶向亚硫酸氢盐测序确定甲基化区域。

这些研究表明，dCas9-MQ1使NSCLC中的靶位点甲基化增加60％，并且还将甲基化引导至远端启动子区域(增加至约50％)(图26A-B)。

实例26：靶向MYC IGD超级增强子的指导RNA与转录阻遏蛋白(通过“死”CAS9)的组合降低NSCLC细胞系NCI-H2009中的MYC蛋白水平

本实例展示了通过将指导RNA靶向NSCLC细胞中的MYC超级增强子通过免疫印迹技术测量的MYC蛋白水平改变。

设计用于结合并靶向肺癌细胞系中的MYC超级增强子的GD-29833与dCAS9-KRAB或dCAS9-MQ1效应子mRNA共同递送。将肺细胞系NCI-H2009铺板于12孔板的生长培养基中(每孔50,000个细胞)。然后将LNP配制品(1ug/ml)添加到细胞中以转染指导物和效应子mRNA，然后孵育96小时。使用dCAS9无效应子(dCAS9-NE)构建体作为阴性对照。然后将细胞在RIPA缓冲液中裂解，并使用Pierce BCA蛋白质测定(23225)定量蛋白质水平。每个样品上样等量的蛋白质，并使用NuPAGE^TM小型凝胶系统(赛默飞世尔公司)按大小进行分离。然后使用英杰公司iBlot^TM2凝胶转移装置(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到PVDF膜上。使用ABCAM抗MYC抗体(ab32072)过夜探测膜。细胞信号传导公司(Cell Signaling)抗肌动蛋白抗体(8H10D10)用作上样对照。然后使用LI-COR成像系统使用MYC和肌动蛋白抗体种类的荧光二抗对信号进行可视化和量化。

这些数据显示，在NCI-H2009肺癌细胞系中，引导指导物至MYC肺超级增强子连同转录阻遏物在96小时时将MYC蛋白水平降低高达50％(图27A-B)，与mRNA表达水平的降低相当(实施例16)。

实例27：全细胞裂解物中ZF9-MQ1蛋白的存在与Hep3B细胞系中MYC蛋白的下调相关

本实例描述了用ZF9-MQ1处理后，测定Hep 3B细胞中ZF9-MQ1和MYC蛋白表达水平随时间推移的变化。

ZF9-MQ1处理后6、16和48小时评估ZF9-MQ1和MYC蛋白表达水平(蛋白质印迹)，其中处理开始后24小时除去LNP并更换培养基。使用RIPA缓冲液提取蛋白质，并使用BCA测定(赛默飞世尔公司)定量总蛋白。总蛋白在NuPAGE^TM Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔公司)、MOPS电泳缓冲液上运行，并使用iBlot^TM2凝胶转移装置(赛默飞世尔公司)进行转移。

MYC蛋白质印迹：β-肌动蛋白抗体用经在594nm波长发射的荧光团标记的二抗染色，并且MYC抗体(艾博抗公司(Abcam))用经在488nm波长发射的荧光团标记的二抗染色。将使用近红外(NIR)荧光的CLx成像系统(LI-COR)用于捕获蛋白质图像，然后通过LI-COR软件进行定量。每个MYC和肌动蛋白条带的曲线下面积(AUC)减去背景面积，然后将每个时间点的所有针对阴性对照进行归一化。

ZF9-MQ1(用血凝素[HA]表位标记的对照)蛋白质印迹：β-肌动蛋白抗体用经在594nm波长发射的荧光团标记的二抗染色，HA抗体用经在488nm波长发射的荧光团标记的二抗染色。使用NIR荧光的CLx成像系统(LI-COR)用于捕获蛋白质图像，然后通过LI-COR软件进行定量。每个HA和肌动蛋白条带的AUC减去背景面积，然后将每个时间点的所有针对阴性对照进行归一化。

数据显示用ZF9-MQ1处理细胞后全细胞裂解物中ZF9-MQ1蛋白的存在和MYC蛋白表达水平降低(图28A-B)，并且全细胞裂解物中ZF9-MQ1蛋白的存在与MYC蛋白的下调相关(图28C)。

实例28：MYC表达降低和甲基化状态的持续时间

该实验评估了ZF9-MQ1处理后MYC表达降低的持久性。此外，该实验展示并评估了MYC表达与靶基因座处DNA甲基化增加的相关性。

SKHEP-1细胞系(其表现出最小的活力变化，但MYC下调40％-50％(实例4))用于评估应答的持久性。SK-HEP-1用LNP/ZF9-MQ1或ZF-无效应子(阴性对照)转染，然后在处理24小时后更换为新培养基。在指定时间点收集细胞以提取mRNA和基因组DNA(凯杰公司RNA/DNA试剂盒)。为了评估MYC mRNA，对全细胞RNA进行处理以制备互补DNA(cDNA)(使用聚A引物)，然后使用对人MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。为了评估靶向的基因座处的甲基化状态，使用靶向亚硫酸氢盐基因组测序以单DNA碱基对分辨率测量5-甲基胞嘧啶。

第3天，与阴性对照(ZF-无效应子)和未处理的细胞(未显示)相比，MYC mRNA减少了89％。mRNA表达的下调缓慢增加，并且在第15天维持MYC转录物45％的下调(图29A)。此外，ZF9-MQ1的表达将从头CpG甲基化引导至MYC启动子区域。直至第15天MYC转录变化与甲基化百分比相关(图29B)。

实例29：用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB时原代肝细胞的C-MYC表达和细胞活力

本实例评估双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对原代肝细胞中MYC mRNA和活力的影响。

将冷冻保存的原代人肝细胞(龙沙公司(Lonza))解冻并添加到预热的解冻培养基中，并从24小时开始铺板。将细胞重悬浮于铺板培养基中并计数以在指定浓度制备(106个细胞/mL)。然后将五十(50)uL细胞溶液添加到96孔板中(另外添加50uL铺板培养基)，总体积为100uL，并孵育过夜。将LNP配制的mRNA(GFP、ZF-NE、ZF9-MQ1、ZF3-KRAB、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB或双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB)添加到100μL另外培养基中的细胞中，浓度为0.6μg/ml、1.25μg/ml和2.5μg/ml。将细胞孵育72小时，6小时时开始更换维持培养基，此后每天更换。处理后72小时评估MYC mRNA表达水平(RT-PCR)和细胞活力()。

当与GFP、ZF-NE或ZF3-KRAB相比时，用ZF9-MQ1、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB或双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理的原代肝细胞显示出MYC mRNA表达的降低(图30A)。总体而言，处理显示出对活力的最小影响，证明与HCC细胞系相比，MYC表达的降低对正常细胞的影响较小(图30B)。

在另一项实验中，将冷冻保存的PHH解冻到预热的肝细胞解冻培养基中，并在室温下以100g旋转8分钟。将细胞沉淀重悬浮于肝细胞铺板培养基中。然后对细胞进行计数，并测量它们的基线活力。制备细胞稀释液，并将50,000个细胞铺板到一式两份96孔板中。将细胞孵育过夜。第二天完全除去平板培养基并添加预热的肝细胞培养基。用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB、ZF9-MQ1、ZF3-KRAB、ZF9-NE或对照GFP mRNA以2.0、1.0或0.5μg/mL处理细胞，一式三份，并孵育6小时。然后除去处理培养基并更换为200μL新鲜肝细胞培养基。转染后将细胞再培养66小时(总共72小时)。处理后，用试剂裂解一个板，并使用Glo Max Discovery读板仪对发光进行定量。通过抽吸从第二细胞板中除去培养基，并用RLT Plus裂解缓冲液裂解细胞。根据制造商的说明，使用/>Plus96试剂盒进行mRNA提取。提取后，使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将mRNA转化为cDNA。使用MYC(靶标)和GAPDH(参考)探针通过ΔΔCT qPCR分析cDNA。

与对照相比，用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理的PHH显示出MYC mRNA的减少(图30C)。ZF9-MQ1(所有剂量)和ZF3-KRAB(2μg/mL)也下调MYC mRNA，对细胞活力的影响最小(图30D)。ZF9-NE不影响MYC mRNA或活力(图30C-D)。总体而言，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理显示出对活力的最小影响，证明正常细胞中MYC表达的降低不影响细胞活力(图30A-D)。

实例30：ZF9-MQ1+ZF3-KRAB在裸小鼠中皮下生长的NCI-H2009模型中的体内功效。

本实例展示ZF9-MQ1+ZF3-KRAB抑制雌性裸小鼠中建立的NCI-H2009肿瘤的生长。

通过将NCI-H2009肿瘤细胞植入雌性裸小鼠的左胁腹来诱导疾病。当平均肿瘤体积达到约100-150mm³时开始处理。将小鼠分为处理组，使得每组的平均肿瘤体积大致相等。mRNA在MC3 LNP中递送。每5天给小鼠静脉内注射3mg/kg ZF9-MQ1+ZF3-KRAB，或每5天3mg/kg非编码mRNA(MC3LNP中)，或每15天1mg/kg IP顺铂，或每5天PBS。

结果显示，用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理在三次施用后显示出肿瘤尺寸统计上显著的减小，导致第25天时肿瘤体积与对照相比减小63％(图31A)，而对处理的小鼠的体重没有显著影响(图31B)。在该研究中，ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理与顺铂处理对肿瘤体积的作用相当(图31A)。

实例31：ZF9-MQ1+ZF3-KRAB共配制品在Fox Chase CB17 SCID小鼠中原位生长的Hep 3B模型中的体内功效。

本实例表明了在雌性Fox Chase CB17 SCID小鼠的原位Hep3B-luc模型中，ZF9-MQ1+ZF3-KRAB共配制品给药后的长期抗肿瘤功效和持久性。

Hep-3B-luc细胞被注射到SCID小鼠的肝左上叶。随机分组时每组的平均腹侧视图全身肿瘤相关生物发光(TABL)约为2.8x10⁹p/s。在细胞植入后第7天，将小鼠随机分为每组12只的四组(用以下处理：PBS、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(较高剂量，即6mg/kg)、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(中等剂量，即3mg/kg)、ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(低剂量，即3mg/kg))以及一组6只小鼠(用索拉非尼处理)。处理从肿瘤细胞植入后第8天开始(在图表上标记为给药第1天)。小鼠用以下处理：静脉内PBS(每5天一次，4个剂量，然后每3天一次，2个剂量)、LNP(MC3)ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(1.5mg/kg，每5天一次)、静脉内LNP(MC3)ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(3mg/kg，每5天一次)、静脉内LNP(MC3)ZF9-MQ1+ZF3-KRAB(6mg/kg，每5天一次)和口服索拉非尼(50mg/kg，每天一次)。每天对所有动物称重并进行目视评估。每周通过生物发光测量肿瘤尺寸2次。

结果表明，两次施用后，用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理与肿瘤尺寸的显著抑制相关。与阴性对照相比，用1.5mg/kg剂量处理导致到第23天时肿瘤生长的约63％抑制，与阴性对照相比，用3mg/kg剂量处理导致到第23天时肿瘤生长的约54％抑制(图32A)。类似地，用6mg/kg剂量的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理与两次施用后肿瘤尺寸统计上显著减小相关，导致与阴性对照相比在第23天时肿瘤体积减小63％(图32A)。用3mg/kg的ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理相当于用索拉非尼处理(图32A)。用ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理的小鼠没有经历体重的显著下降(图32B)。用索拉非尼处理的小鼠最初体重下降，随后总体体重增加，可能是由于肿瘤质量的增加(图32B)。这些数据表明，本研究中ZF9-MQ1+ZF3-KRAB处理的耐受性良好。

实例32：编码ZF9-MQ1和ZF3-KRAB的双顺反子mRNA降低MYC表达和细胞活力

本实例比较了双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB与单一构建体ZF3-KRAB和ZF9-MQ1以及ZF3-KRAB和ZF9-MQ1的共配制品的功效。这些构建体通过封装在脂质纳米颗粒(LNP)中的mRNA递送至肝细胞癌细胞。

通过将各自的mRNA封装在LNP中来制备ZF9-MQ1、ZF3-KRAB、双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB以及共配制的ZF9-MQ1和ZF3-KRAB构建体。通过在96孔板中每孔接种10,000个细胞来转染Hep 3B细胞，并用0.6μg/mL和2μg/mL mRNA/LNP进一步处理。

转染后48小时分析MYC mRNA和细胞活力。根据制造商的方案，使用普洛麦格公司的检测试剂盒测量活力。使用/>Plus96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH基因的表达(使用TaqMan^TM引物/探针)对MYC表达进行定量。未处理的细胞用于对MYC表达进行归一化。/>

这些数据显示双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB比单独的单一构建体(ZF3-KRAB或ZF9-MQ1)更大程度地下调Hep 3B细胞中的MYC mRNA和细胞活力(图33A-33B)。双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在0.6μg/ml和2μg/ml浓度下在48小时将总MYC mRNA水平降低了99％(图33A)。双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在2μg/ml和0.6μg/ml浓度下分别使Hep3B细胞的活力降低约80％和27％(图33B)。此外，用双顺反子构建体处理与ZF3-KRAB和ZF9-MQ1构建体的共配制品同样有效。

实例33：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB跨HCC亚型以剂量依赖性方式降低MYC mRNA和HCC细胞活力

本实例评估双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在HCC亚型S1和S2中的效力。用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理HCC S1亚型细胞系SKHEP-1、SNU-449和SNU-182以及S2亚型细胞系Hep 3B和Hep G2。我们在处理72小时后评估了连续稀释浓度的双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的MYC mRNA和细胞活力。

将HCC细胞接种在96孔板的生长培养基中(约10,000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(从2.5μg/ml开始)分别添加到3个孔中，然后在后续孔中以约1:2稀释，共10个剂量点，以便转染mRNA，然后孵育72小时。收集不同的重复板以检测活力和RNA。根据制造商的方案，使用普洛麦格公司的检测试剂盒测量活力。使用/>Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用/>超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH基因的表达(使用TaqMan^TM引物/探针)对MYC表达进行定量。未处理的细胞用于对MYC表达进行归一化。

结果表明双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理跨HCC亚型显示出对细胞活力的作用(图34A-C)。抑制MYC mRNA的EC50值范围为＜1-20ng/mL，S1和S2亚型之间没有趋势(图34D)。同样，与MYC mRNA EC50相比，50％细胞活力的丧失转化为更高范围的值(120-200ng/mL)。S1和S2亚型之间的MYC mRNA表达或细胞活力没有显著差异。三种S1和两种S2亚型HCC肿瘤细胞系的EC50值证明双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对于两种HCC亚型均有效(图34D)。

实例34：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB诱导HCC细胞凋亡

本实例描述了双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对HCC细胞的细胞凋亡的影响。等活力测定仅根据ATP水平评估孔中剩余细胞的相对数量，不区分细胞增殖丧失和细胞死亡。

在本实例中，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB转染后，使用针对膜联蛋白V蛋白(膜联蛋白V FITC)的经荧光标记的抗体和碘化丙啶(PI)对三种HCC细胞系Hep 3B、Hep G2和SK-HEP-1中的凋亡细胞进行定量。除未处理的细胞外，还使用非编码mRNA作为阴性对照。将HCC细胞铺板在12孔板中的生长培养基中(50,000个细胞/孔)。然后将LNP配制品(1μg/ml)添加到细胞中以转染mRNA，并孵育48小时。收获细胞并使用BD膜联蛋白V:FITC细胞凋亡检测试剂盒(BDB556570)染色并通过流式细胞仪进行分析。膜联蛋白V FITC和PI呈阳性的细胞被归类为凋亡细胞。

这些数据显示，在用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理48小时时，在Hep 3B和HepG2细胞系中检测到>75％的凋亡细胞，并且在SK-HEP-1细胞系中检测到15％的凋亡细胞(图35)。与未处理的细胞相比(5-20％背景凋亡)，细胞不受非编码mRNA对照的影响(图35)。表明双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB能够诱导培养的HCC细胞系的细胞凋亡。

实例35：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB以持久的方式降低MYC mRNA水平

在本实例中，在双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB SSOP LNP一次处理后评估了双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对MYC mRNA下调的持久性。双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB通过将甲基化和阻遏组蛋白标志物导向MYC IGD来阻遏MYC。为了确定这些修饰的有效持续时间，使用了SK-HEP-1细胞，因为在用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理后，它们对细胞活力的影响最小。本研究的目的是确定双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的一次处理是否可以维持MYC mRNA阻遏约2周。

将SK-HEP-1细胞以每孔200,000个细胞的密度铺板在6孔板中的2mL生长培养基中。然后用0.6μg/mL的双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB或对照非编码mRNA LNP处理细胞。用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理后第1天，将细胞用胰蛋白酶消化并分成三个样品；1个样品用于RNA提取，1个样品用于基因组DNA(gDNA)提取，1个样品保存用于未来时间点。处理后第3、6、9和12天重复此过程。第15天，将剩余细胞均分用以提取RNA和gDNA。使用Plus 96孔试剂盒(凯杰公司)按照制造商的方案从三个生物重复中分离RNA。使用RT超级混合物试剂盒(NEB)将RNA样品逆转录成cDNA，并使用采用TaqMan^TM快速高级母混合物(赛默科技公司)的MYC特异性TaqMan^TM引物/探针组测定法，通过定量PCR(qPCR)进行分析(以技术性一式三份)。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH基因的表达(使用TaqMan^TM引物/探针)对MYC表达进行定量。未处理的细胞用于对MYC表达进行归一化。

该数据证明了双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB介导的MYC基因表达调节的持久性。在SKHEP1细胞中用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理一次后，MYC mRNA水平在第1天降低，并且在处理后长达15天保持阻遏(图36)。

实例36：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB降低HCC细胞系中MYC mRNA和蛋白表达以及细胞活力

在用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理后6-96小时评估HCC细胞中MYC mRNA和蛋白水平的表达、细胞活力和双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的表达，以了解双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在多种HCC细胞中的药效学。

对于每个时间点，将Hep 3B或SK-HEP-1细胞以每孔10,000个细胞的密度铺板在两个96孔板组的培养基中，并以每孔400,000个细胞的密度铺板在6孔板的培养基中。将96孔板用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB或非编码mRNA以1μg/mL处理三次，用于细胞活力和mRNA分析。将6孔板用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB或非编码mRNA以1μg/mL处理一式两份，用于蛋白质分析。处理后将细胞孵育6、24、48、72或96小时，每个时间点留下一部分细胞作为未处理的阴性对照。在每个时间点，用裂解一个96孔板，并使用/>定量发光。第二96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用/>Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用RT/>将mRNA转化为cDNA。然后使用MYC(靶标)和GAPDH(参考)探针通过ΔΔCT qPCR分析cDNA。在每个时间点使用RIPA缓冲液裂解6孔板的细胞以分离蛋白质。使用Pierce BCA蛋白质测定(23225)对总蛋白质进行定量。每个样品上样等量的蛋白质，并使用NuPAGE^TM小型凝胶系统(赛默飞世尔公司)按大小进行分离。然后使用iBlot^TM2凝胶转移装置(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到PVDF膜上。用抗MYC抗体(艾博抗公司ab32072)探测膜过夜。使用抗β-肌动蛋白抗体(细胞传导公司8H10D10)作为上样对照。然后使用LI-COR成像系统使用MYC和β-肌动蛋白一抗的荧光二抗对信号进行可视化和定量。

在两种细胞系中，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在6小时时降低MYC mRNA和蛋白质表达，与短非编码mRNA或未处理的细胞相比，其在96小时后仍保持降低(图37)。在两种细胞系中，用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理后48小时观察到细胞活力降低(图37)。短非编码阴性对照对细胞活力没有影响。

实例37：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB mRNA表达ZF9-MQ1和ZF3-KRAB，如经HA标记的蛋白可视化

在本实例中，通过蛋白质印迹分析证实了双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB mRNA/LNP编码的蛋白质的表达。在细胞内，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB产生两种ZF蛋白(ZF3-KRAB和ZF9-MQ1)，在本实验中，它们用HA标记，从而可以在HCC细胞转染后对蛋白表达进行定量。

每个时间点将Hep 3B或SK-HEP-1细胞以每孔400,000个细胞铺板在6孔板的培养基中。将6孔板用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB以1μg/mL处理一式两份，用于蛋白质分析。将细胞孵育6或24小时。然后将细胞在RIPA缓冲液中裂解，并使用Pierce BCA蛋白质测定(23225)定量总蛋白质水平。每个样品上样等量的蛋白质，并使用NuPAGE^TM小型凝胶系统(赛默飞世尔公司)按大小进行分离。然后使用iBlot^TM2凝胶转移装置(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到PVDF膜上。使用艾博抗公司HA抗体对膜进行过夜探测。使用抗β-肌动蛋白抗体(细胞传导公司8H10D10)作为上样对照。使用LI-COR成像系统使用MYC和β-肌动蛋白抗体的荧光二抗对信号进行可视化和定量。

在转染后6小时和24小时，由双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB mRNA编码的ZF3-KRAB和ZF9-MQ1蛋白均通过HA标签在蛋白质印迹上可视化(图38)。在两个时间点均观察到ZF3-KRAB和ZF9-MQ1构建体的积累。

实例38：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB增加HCC细胞中的索拉非尼应答

在本实例中，评估了双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对HCC细胞系中小分子索拉非尼(多激酶抑制剂)功效的影响。索拉非尼被用作HCC的标准护理，高MYC水平可以预测索拉非尼抗性。据推测，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB可能通过下调MYC使HCC对索拉非尼重新敏感。利用剂量应答测定来评估双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB处理是否可以降低索拉非尼的IC₅₀。

为了评估双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB和索拉非尼之间的潜在协同作用，将Hep 3B或SK-HEP-1细胞以每孔10,000个细胞铺板在96孔板中。然后用剂量范围为0.1至25μM的索拉非尼(按1:2连续稀释)处理细胞。然后将携带双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的脂质混合物以0.1或0.6μg/mL的剂量添加到一部分孔中。将一组细胞单独用索拉非尼处理作为对照。72小时处理后，使用试剂裂解细胞，并使用Glo Max定量发光。通过将未处理的值进行平均并将每个实验荧光素酶值除以该平均值来计算相对细胞活力。

表19：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对索拉非尼IC₅₀的影响

数据显示，当索拉非尼与0.6μg/ml双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB组合施用时，索拉非尼在SKHEP1中的IC₅₀从12.3降至10.7μM(图39A和表19)，在Hep 3B中的IC₅₀从4.4降至2.9μM(图39B和表19)。当索拉非尼与0.1μg/ml双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB组合施用时，索拉非尼在Hep 3B或SK-HEP-1细胞中的IC₅₀没有显著变化(图39A-39B)。索拉非尼和双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的组合比单独的索拉非尼更有效(图39A-39B)。该数据表明双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB和索拉非尼之间具有协同活性。

实例39：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB增加HCC细胞中的JQ1应答

本实例评估双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB与JQ1(BET抑制剂)组合在多种HCC细胞系中的功效。BET蛋白已被证明对MYC转录很重要。目前正在临床上评估新一代BET抑制剂的血液学适应症；然而，它们的毒性特征限制了它们的使用。可以在降低剂量水平下增加BET抑制剂效力的组合处理可以改善BET抑制剂的耐受性。

为了评估双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB和JQ1之间的潜在协同作用，将Hep 3B或SK-HEP-1细胞以每孔10,000个细胞铺板在96孔板中。然后用剂量范围为0.1至25μM的JQ1(按1:2连续稀释)处理细胞。然后将携带双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的脂质混合物以0.1或0.6μg/mL的剂量添加到一组孔中。将一组细胞单独用JQ1处理作为对照。72小时处理后，使用试剂裂解细胞，并使用Glo Max定量发光。通过将未处理的值进行平均并将每个实验荧光素酶值除以该平均值来计算相对细胞活力。

表20：双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB对JQ1IC50的影响

0.6μg/mL双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB与JQ1的组合使SK-HEP1中JQ1的IC₅₀从>25μM降低至1.1μM(图40A和表20)，并且在Hep 3B中从6.6μM降低至0.2μM(图40B和表20)。0.1μg/mL双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB与JQ1的组合使SK-HEP1中JQ1的IC₅₀从>25μM降低至1.9μM(图40A和表20)，并且在Hep 3B中从6.6μM降低至0.6μM(图40B和表20)。该数据表明双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF3-KRAB和JQ1之间存在协同活性。

实例40：筛选设计以靶向MYC基因组基因座的小鼠替代构建体

本实例使用肝细胞癌小鼠模型Hepa1-6来评估靶向小鼠MYC IGD的构建体。这些构建体(ZF15-MQ1、ZF16-MQ1和ZF17-MQ1)被开发为靶向小鼠基因组的双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的替代物。我们评估了这些构建体下调MYC mRNA表达并降低小鼠HCC细胞活力的能力。

生成一组小鼠替代构建体(ZF15-MQ1、ZF16-MQ1和ZF17-MQ1)，并通过将10,000个细胞/孔接种在一式两份板中进行mRNA提取或细胞活力分析来在Hepa1-6细胞中进行筛选。使用0.6或1.2μg/mL的候选ZF对96孔板进行一式三份处理。将细胞孵育72小时。孵育期结束后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。第二96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用/>Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用RT/>将mRNA转化为cDNA。然后使用MYC(靶标)和GAPDH(参考)探针通过ΔΔCT qPCR分析cDNA。

该筛选表明ZF17-MQ1显示小鼠MYC mRNA的下调(图41A)，对应于活力的降低(图41B)。

实例41：小鼠替代构建体ZF17-MQ1对HCC细胞活力以及MYC mRNA和蛋白表达的影响

在本实例中，使用肝细胞癌小鼠模型Hepa1-6来评估ZF17-MQ1构建体在下调MYCmRNA和蛋白质表达以及小鼠HCC细胞活力方面的影响。

使用ZF17-MQ1或GFP mRNA处理96小时后，对MYC mRNA和细胞活力进行分析。Hepa1-6细胞以每孔10,000个细胞接种在一式两份板中，用于mRNA提取或细胞活力分析。将96孔板用0.6或1.2μg/mL的ZF17-MQ1进行一式三份处理。孵育后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。第二96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用/>96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用RT Lunascript。将mRNA转化为cDNA。然后使用MYC(靶标)和GAPDH(参考)探针通过ΔΔCT qPCR分析cDNA。

通过用ZF17-MQ1或对照GFP mRNA转染12孔板中的100,000个细胞，在处理24和48小时后分析MYC蛋白水平。将细胞在RIPA缓冲液中裂解，并使用Pierce BCA蛋白质测定(23225)定量总蛋白质水平。每个样品上样等量的蛋白质，并使用NuPAGE^TM小型凝胶系统(赛默飞世尔公司)按大小进行分离。然后使用iBlot^TM凝胶转移装置(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到PVDF膜上。用抗MYC抗体(艾博抗公司ab32072)探测膜过夜。使用抗β-肌动蛋白抗体(细胞传导公司8H10D10)作为上样对照。然后使用LI-COR成像系统使用MYC和β-肌动蛋白抗体的荧光二抗对信号进行可视化和定量。

数据显示，ZF17-MQ1能够通过靶向MYC IGD作为双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB的小鼠替代物起作用。小鼠HCC细胞Hepa1-6中的ZF17-MQ1处理在24和48小时显示MYC蛋白的显著下调(图42A)。小鼠HCC细胞Hepa1-6中的ZF17-MQ1处理显示在96小时时MYC mRNA显著下调(图42C)以及在96小时时细胞活力降低(图42D)。

实例42：Hepa1-6皮下同基因模型显示ZF17-MQ1的功效

本实例展示了ZF17-MQ1在免疫健全动物中的功效。具体来说，Hepa1-6被植入同基因接受体C57BL/6正常小鼠中。

通过将Hepa1-6肿瘤细胞植入雌性C57BL/6小鼠的左胁腹来诱导疾病。当平均肿瘤体积达到约150mm³时开始处理。将小鼠分为处理组(对于PBS或ZF17-MQ1而言每组9只小鼠，对于索拉非尼而言每组6只小鼠)，使得每组的平均肿瘤体积大致相等。给小鼠静脉内注射PBS或3mg/kg ZF17-MQ1。每日口服灌胃给予阳性对照标准护理药索拉非尼50mg/kg。ZF17-MQ1每5天给药4个剂量，然后给予2周药物假期，并再重新开始处理两次。每天对所有动物称重并进行目视评估。每周通过卡尺测量肿瘤尺寸3次。

结果显示，ZF17-MQ1在4个剂量后显著降低了动物肿瘤负荷(图43)。药物假期后，对小鼠进行重新处理导致约4周后肿瘤完全消除(图43)。这些数据表明，ZF17-MQ1可以有效减少在免疫健全动物中进行的HCC异种移植物的肿瘤负荷。

实例43：作为HCC的潜在新疗法的MYC癌基因的表观遗传调节

本实例描述了通过测量MYC mRNA和细胞活力来表征HCC细胞系(Hep 3B、Hep G2、SK-HEP-1、SNU-182和SNU-449)中的双顺反子ZF9-MQ1-ZF3-KRAB。

通过测量MYC mRNA和细胞活力，对HCC细胞系(Hep 3B、Hep G2、SK-HEP-1、SNU-182和SNU-449)中的双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB构建体进行了表征。对双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB进行了持久表观遗传(例如DNA/染色质甲基化)和转录组(例如RNA-seq)变化的测试。使用各种蛋白质组学方法测量MYC蛋白水平和通路信号传导的变化。最后，通过评估肿瘤体积、肿瘤相关生物发光(BLI)和免疫组织化学(IHC)，在皮下(subQ)和原位HCC模型中分析双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB的体内活性。

我们鉴定了包括双顺反子ZF9-MQ1_ZF3-KRAB在内的构建体，其靶向MYC IGD上的多个基因座，并且有效降低HCC细胞中的MYC mRNA、蛋白质和细胞活力，同时不影响正常细胞。在HCC细胞中，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB的中值抑制EC50对于MYC mRNA是<0.001ng/mL，对于细胞活力是120ng/mL。重要的是，双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB的作用持续超过2周，提供持久的MYC mRNA阻遏。在无胸腺裸小鼠的Hep 3BsubQ模型中，以3和6mg/kg Q5D的LNP形式静脉内递送双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB，在第23天时与阴性对照相比，显示出统计学上显著的肿瘤生长抑制(TGI)分别为54％和63％。与阴性对照或索拉非尼处理的小鼠相比，用双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB处理的小鼠体重(BW)没有显著下降。双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB和对照处理的肿瘤的IHC显示，MYC和增殖标志物Ki67显著下调，细胞凋亡标志物胱天蛋白酶3上调。在Hep 3B原位模型中，3mg/kg双顺反子ZF9-MQ1_ZF3KRAB Q5D显示出与50mg/kgQD索拉非尼相当的BLI降低，而BW没有降低。

实例44：小鼠替代构建体对LL2细胞中MYC表达和细胞活力的影响

本实例涉及评估小鼠替代构建体(ZF15-MQ1、ZF16-MQ1和ZF17-MQ1)对LL2细胞中MYC表达和细胞活力的影响。

将LL2细胞以每孔5,000个细胞接种在一式两份96孔板中，用于mRNA提取或细胞活力分析。将96孔板用0.625μg/mL(用于mRNA和活力读出)和1.25μg/ml(mRNA和活力读出)的负载了ZF15-MQ1、ZF16-MQ1或ZF17-MQ1的LNP进行一式三份处理，并孵育。将6孔板每孔接种200,000个细胞，并用上述构建体以1.25μg/ml转染(用于蛋白质印迹读出)。将GFP处理的细胞用作阴性对照。孵育后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。第二96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用/>Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对小鼠MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。对于蛋白质印迹，β-肌动蛋白抗体用经在594nm波长发射的荧光团标记的二抗染色，并且MYC抗体(艾博抗公司)用经在488nm波长发射的荧光团标记的二抗检测。使用近红外(NIR)荧光的/>CLx成像系统(LI-COR)用于捕获蛋白质图像。

数据显示，与未处理或GFP处理条件的细胞相比，ZF17-MQ1处理的细胞在LL2细胞中表现出降低的MYC蛋白水平(图44A)。与在未处理的细胞中观察到的水平相比，ZF17-MQ1和ZF16-MQ1在LL2细胞中分别使MYC mRNA水平降低>99.9％或74％(图44B)。此外，所有三种构建体都能够比未处理的细胞和GFP处理的细胞更大程度地降低LL2细胞中的细胞活力(图44C)。与未处理的细胞相比，构建体ZF17-MQ1、ZF16-MQ1和ZF15-MQ1使LL2细胞中的活力分别降低了高达74％、65％和30％。

实例45：ZF17-MQ1处理的LL2和CT26细胞中MYC转录物下调

本实例旨在评估ZF17-MQ1构建体在CT26和LL2细胞中下调MYC mRNA表达并降低细胞活力的功效。

将CT26和LL2细胞以每孔2,500个细胞接种在一式两份板中，用于mRNA提取或细胞活力分析。将96孔板用负载ZF17-MQ1的LNP(1.25μg/mL和2.5μg/ml)进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。第二96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用/>Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对小鼠MYCmRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示，ZF17-MQ1比未处理的细胞和GFP处理的细胞(阴性对照)更大的程度地在LL2和CT26细胞中下调MYC mRNA并降低细胞活力。与未处理细胞中观察到的水平相比，2.5μg/mL ZF17-MQ1使LL2和CT26细胞中的MYC mRNA水平分别降低93％和85％(图45A)。此外，与未处理的细胞相比，在这些条件下，ZF17-MQ1使LL2和CT26细胞的细胞活力分别降低87％和93％(图45B)。

实例46：ZF17-MQ1处理的LL2和CMT167细胞中MYC转录物下调

本实例旨在评估ZF17-MQ1构建体在CMT167和LL2细胞中下调MYC mRNA表达并降低细胞活力的功效。

将CMT167和LL2细胞以每孔5,000个细胞接种在一式两份板中，用于mRNA提取或细胞活力分析。将96孔板用1.0μg/mL的负载GFP、非编码RNA或ZF17-MQ1的LNP进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。第二96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用/>Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对小鼠MYCmRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示，ZF17-MQ1比未处理的细胞和GFP处理的细胞(阴性对照)更大的程度地在CMT167和LL2细胞中下调MYC mRNA并降低细胞活力。与未处理细胞中观察到的水平相比，ZF17-MQ1使CMT167和LL2细胞中的MYC mRNA水平分别降低62％和73％(图46)。此外，与未处理的细胞相比，在这些条件下，ZF17-MQ1使CMT167和LL2细胞的细胞活力分别降低54％和57％(图46)。

实例47：ZF9-MQ1对原代细胞活力几乎没有影响

本实例评估ZF9-MQ1构建体对原代细胞活力的影响。

将原代小气道上皮细胞、原代肺叶上皮细胞和原代肺成纤维细胞以每孔7,500个(原代小气道上皮细胞)或5000个(原代肺叶上皮细胞和原代肺成纤维细胞)细胞接种在一式两份板中，用于细胞活力分析。将96孔板用1.0μg/mL的负载GFP或ZF9-MQ1的LNP进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。第二96孔板用RLTPlus裂解缓冲液裂解，以使用/>Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对人MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示，在原代小气道上皮细胞、原代肺叶上皮细胞和原代肺成纤维细胞中与未处理的细胞相比，ZF9-MQ1分别将MYC mRNA水平下调94％、96％、96％水平(图47)。然而，与对照细胞相比，活力仅降低了16％、9％和22％，这表明与之前在H2009癌细胞中的发现相比，ZF9-MQ1对正常肺上皮细胞或成纤维细胞的细胞活力仅产生适度的影响。

实例48：ZF9-MQ1与JQ1的共处理对A549活力显示出大于加和的影响

本实例评估了ZF9-MQ1构建体与不同浓度的JQ1抑制剂组合使用时对A549细胞活力的影响。

A549细胞以每孔4,000个细胞接种在一式两份板中，用于细胞活力分析。将96孔板用0.5μg/mL或1.0μg/mL的负载GFP或ZF9-MQ1的LNP与渐增浓度的BET抑制剂JQ1(浓度高达6.25uM)组合进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育72小时后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。

数据显示ZF9-MQ1和JQ1各自单独抑制A549细胞的细胞活力(图48A)。当组合时，ZF9-MQ1(0.5或1μg/ml)和JQ1(浓度高达6.25uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应，表明ZF9-MQ1和JQ1组合协同抑制A549细胞中的活力(图48B-48C)。

实例49：ZF9-MQ1与BET762的共处理对A549活力显示出大于加和的影响

本实例评估了ZF9-MQ1构建体与不同浓度的BET762抑制剂组合使用时对A549细胞活力的影响。

A549细胞以每孔4,000个细胞接种在一式两份板中，用于细胞活力分析。将96孔板用0.5μg/mL或1.0μg/mL的负载GFP或ZF9-MQ1的LNP与渐增浓度(浓度高达1.25uM)的BET抑制剂BET762组合进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育72小时后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。

数据显示ZF9-MQ1和BET762各自单独抑制A549细胞的细胞活力(图49A)。当组合时，ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和BET762(对于0.5μg/ml ZF9-MQ1处理的细胞浓度高达1.25uM，对于1.0μg/ml ZF9-MQ1处理的细胞浓度高达0.625uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应(图49B)。当组合时，ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和BET762(浓度高达0.625uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应(图49C)。数据表明ZF9-MQ1和BET762组合协同抑制A549细胞中的活力(图49B-C)。

实例50：ZF9-MQ1与比拉瑞塞的共处理对A549活力显示出大于加和的影响

本实例评估了ZF9-MQ1构建体与不同浓度的BET抑制剂比拉瑞塞组合使用时对A549细胞活力的影响。

A549细胞以每孔4,000个细胞接种在一式两份板中，用于细胞活力分析。将96孔板用0.5μg/mL或1.0μg/mL的负载GFP或ZF9-MQ1的LNP以及渐增浓度(对于0.5μg/ml ZF9-MQ1处理的细胞，浓度高达0.625uM，并且对于1.0μg/ml ZF9-MQ1处理的细胞，浓度高达0.313uM)的BET抑制剂比拉瑞塞进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育72小时后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。

数据显示ZF9-MQ1和比拉瑞塞各自单独抑制A549细胞的细胞活力(图50A)。当组合时，ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和比拉瑞塞(浓度高达0.625uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应(图50B)。当组合时，ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和比拉瑞塞(浓度高达0.313uM)对A549活力的抑制显示出大于其各自活性预测的相加效应(图50C)。数据表明ZF9-MQ1和比拉瑞塞组合协同抑制A549细胞中的活力(图50B-50C)。

实例51：ZF9-MQ1与曲美替尼的共处理对A549活力显示出大于加和的影响

本实例评估了ZF9-MQ1构建体与不同浓度的MEK抑制剂曲美替尼组合使用时对A549细胞活力的影响。

A549细胞以每孔4,000个细胞接种在一式两份板中，用于细胞活力分析。将96孔板用0.5μg/mL或1.0μg/mL的负载GFP或ZF9-MQ1的LNP与渐增浓度(浓度高达0.05uM)的MEK抑制剂曲美替尼组合进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育72小时后，用裂解一个96孔板，并使用/>Discovery读板仪对发光进行定量。

数据显示ZF9-MQ1和曲美替尼各自单独抑制A549细胞的细胞活力(图51A)。当组合时，ZF9-MQ1(0.5μg/ml)和曲美替尼(浓度高达0.05uM)对A549活力的抑制显示出比其各自活性所预测的更大的加和效应(图51B)。当组合时，ZF9-MQ1(1.0μg/ml)和曲美替尼(浓度高达0.05uM)对A549活力的抑制显示出大于其各自活性预测的相加效应(图51C)。数据表明ZF9-MQ1和曲美替尼组合协同抑制A549细胞中的活力(图51B-51C)。

实例52：多个细胞系中靶向超级增强子区域的ZF-KRAB构建体的组下调MYC的研究

本实例评估ZF9-MQ1和一组靶向超级增强子区域的锌指构建体ZF9-MQ1、ZF54-KRAB、ZF61-KRAB、ZF67-KRAB和ZF68-KRAB对H2009、H460和H226细胞中MYC下调的影响。

将H2009和H226细胞以每孔5,000个细胞接种在一式两份板中进行mRNA分析。将96孔板用1.0μg/mL的负载GFP、ZF9-MQ1、ZF54-KRAB、ZF67-KRAB或ZF68-KRAB的LNP进行一式三份处理并孵育。将H226细胞还用1.0μg/mL的负载非编码RNA的LNP进行一式三份处理并孵育。将H460细胞以每孔5,000个细胞接种在一式两份板中进行mRNA分析。将96孔板用1.0μg/mL的负载GFP、ZF9-MQ1、ZF61-KRAB、ZF67-KRAB或ZF68-KRAB的LNP进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育72小时后，用RLT Plus裂解缓冲液裂解细胞，以使用Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对人MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示与未处理的细胞相比，ZF9-MQ1、ZF54-KRAB、ZF67-KRAB和ZF68-KRAB将MYC mRNA水平在H2009细胞中下调至少42％(图52A)并且在H226细胞中下调至少27％(图52B-52C)。此外，与未处理的细胞相比，ZF9-MQ1、ZF61-KRAB、ZF67-KRAB和ZF68-KRAB将H460细胞中的MYC mRNA水平下调至少26％(图52D)。

实例53：与单独ZF9-MQ1相比，ZF54-KRAB和ZF9-MQ1共同处理进一步降低MYC mRNA水平

本实例评估ZF9-MQ1和ZF54-KRAB组合处理对H2009细胞中MYC下调的影响。

将H2009细胞以每孔5,000个细胞接种在96孔板中进行mRNA分析。将板中的孔用1.0μg/mL或2.0μg/mL的负载GFP、ZF9-MQ1的LNP与渐增浓度的负载ZF9-MQ1的LNP的组合进行一式三份处理，并孵育72小时。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。孵育后，用RLTPlus裂解缓冲液裂解细胞，以使用Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对人MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示，在测试的最高浓度下，相对于未处理的对照细胞，ZF9-MQ1和ZF54-KRAB各自分别将H2009细胞中的MYC mRNA分别下调99％或62％。当低于0.313μg/mL的ZF9-MQ1与1或2μg/mL ZF54-KRAB组合时，MYC mRNA下调的程度比单独使用任一处理观察到的程度更大，这表明每种ZF9-MQ1和ZF54-KRAB均有助于体外H2009细胞系中MYC mRNA水平的下调(图53)。

实例54：ZF9-MQ1和ZF54-KRAB的1:1组合可阻遏所有时间点的MYC表达，持续多达至少6天

本实例评估ZF9-MQ1和ZF54-KRAB组合处理对H1299细胞中MYC下调的持久性。

将H1299细胞以每孔10,000个细胞铺板在96孔板中进行mRNA分析。将96孔板中的孔用1.0μg/mL的负载GFP、ZF54-KRAB或ZF9-MQ1+ZF54-KRAB的LNP进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。在转染后6小时、1天、2天、3天或6天进行测量。孵育后，一个96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对人MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDH mRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示，48小时时ZF9-MQ1相对于未处理的对照细胞将H1299细胞中的MYC mRNA下调95％，并在144小时时维持在对照水平的90％的下调。ZF9-MQ1加ZF54-KRAB的组合在48小时时将MYC mRNA水平降低至98％，并在144小时时维持下调至对照水平的93％(图54)。此外，数据显示ZF9-MQ1和ZF9-MQ1与ZF54-KRAB组合下调H1299细胞中的MYC mRNA水平至少6天(图54)。

实例55：双顺反子ZF9-MQ1_ZF54-KRAB比ZF9-MQ1更早抑制MYC水平

本实例评估了双顺反子构建体ZF9-MQ1_ZF54-KRAB和ZF54-KRAB_ZF9-MQ1与单独的ZF9-MQ1和ZF54-KRAB构建体相比的功效。

将H2009细胞以每孔5,000个细胞接种在96孔板中进行mRNA分析。将96孔板的孔用0.5μg/mL或1.0μg/mL的负载GFP、ZF9-MQ1、ZF54-KRAB、ZF9-MQ1_ZF54-KRAB或ZF54-KRAB_ZF9-MQ1的LNP进行一式三份处理并孵育。未处理的细胞和GFP处理的细胞用作对照。转染后24小时和48小时进行测量。孵育后，一个96孔板用RLT Plus裂解缓冲液裂解，以使用Plus 96试剂盒提取mRNA。裂解的样品与RNA柱结合，用缓冲液洗涤并洗脱。然后使用聚A引物和RT Lunascript将mRNA转化为cDNA。然后使用对人MYC mRNA转录物具有特异性的TaqMan^TM探针(赛默飞世尔公司)将cDNA用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。GAPDHmRNA转录物水平用于跨组归一化。

数据显示，引入H2009细胞后24小时，与未处理的细胞相比，ZF9-MQ1和ZF54-KRAB分别将MYC mRNA水平下调高达83％和55％。处理后48小时，ZF9-MQ1处理的细胞中MYC mRNA水平进一步降低另外13％，达到未处理对照的96％，而ZF54-KRAB不会进一步下调MYC水平。处理后24小时，用ZF9-MQ1_ZF54-KRAB和ZF54-KRAB_ZF9-MQ1处理的细胞中的MYC mRNA水平分别降低至对照细胞的95％和96％。数据表明，这些对照能够比ZF9-MQ1更早降低MYC mRNA水平，导致H2009细胞中24小时时与ZF9-MQ1处理的细胞相比，处理的细胞中MYC下调水平更高。(图55)。

实例56：ZF9-MQ1处理对携带H460 SQ肿瘤的小鼠中肿瘤生长的抑制的影响

本实例展示ZF9-MQ1抑制裸小鼠中建立的皮下H460肿瘤的生长。

通过将H460肿瘤细胞皮下植入裸小鼠的左胁腹来诱导疾病。当平均肿瘤体积达到约100-150mm³时开始处理。将小鼠分为处理组，使得每组的平均肿瘤体积大致相等。使用PBS(媒剂)、索拉非尼(标准护理)、MC3 LNP中配制的非编码RNA或MC3 LNP中配制的ZF9-MQ1mRNA处理肿瘤。PBS、非编码RNA(SEQ ID NO:198)LNP和ZF9-MQ1 LNP以每五天施用3mg/kg进行给药。索拉非尼以50mg/kg每日给药。每周两次测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积计算为(宽度²x长度)/2。

结果表明，ZF9-MQ1处理抑制H460皮下肿瘤模型中的肿瘤生长。在PBS处理组、mRNA阴性对照处理组和ZF09-MQ1处理组中，研究结束时的平均肿瘤体积分别为1921mm³、1829mm³和702mm³。索拉非尼处理的小鼠中的平均肿瘤体积(752mm³)与ZF9-MQ1-LNP处理的小鼠没有区别，表明ZF9-MQ1在该模型中表现出与标准护理剂索拉非尼相似或更好的活性。这些结果表明，与阴性对照组相比，负载ZF9-MQ1的LNP在体内H460皮下肿瘤模型中有效抑制肿瘤生长(图56)。

等同形式

应当理解，虽然已经结合其具体实施方式描述了本发明，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来限定。一些方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims

1.一种表达阻遏物，其包含：

结合包含SEQ ID NO:83的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的第一靶向部分，以及

包含DNA甲基转移酶的第一效应子部分。

2.如权利要求1所述的表达阻遏物，其中该第一靶向部分包含锌指结构域。

3.如权利要求1或2所述的表达阻遏物，其中该第一靶向部分包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

4.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一效应子部分包含MQ1或其功能变体或片段。

5.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一效应子部分包含SEQ IDNO:19或87的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

6.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一效应子部分包含SEQ IDNO:30或129的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

7.一种核酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物。

8.如权利要求7所述的核酸，其包含编码该第一靶向部分的核苷酸序列，其中编码该第一靶向部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:46或131的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

9.如权利要求7或8所述的核酸，其包含编码该第一效应子部分的核苷酸序列，其中编码该第一效应子部分的核苷酸序列包含根据SEQ ID NO:52或132的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

10.如权利要求7-9中任一项所述的核酸，该核酸包含根据SEQ ID NO:63或130的核苷酸序列，或与其具有至少80、85、90、95、99或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中聚A序列是任选的。

11.一种系统，其包含：

如权利要求1-6中任一项所述的第一表达阻遏物，以及

第二表达阻遏物。

12.如权利要求11所述的系统，其中该第二表达阻遏物包含：

结合基因组基因座的第二靶向部分，以及

第二效应子部分。

13.如权利要求12所述的系统，其中该第二靶向部分结合包含SEQ ID NO:77 199或201的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

14.如权利要求12或13所述的系统，其中该第二靶向部分包含锌指结构域。

15.如权利要求12-14中任一项所述的系统，其中该第二靶向部分包含根据SEQ ID NO:7 169、171的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

16.如权利要求12-15中任一项所述的系统，其中该第二效应子部分包含KRAB或其功能变体或片段。

17.如权利要求12-16中任一项所述的系统，其中该第二效应子部分包含根据SEQ IDNO:18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

18.如权利要求12-17中任一项所述的系统，其中该第二表达阻遏物包含根据SEQ IDNO:24 177、183、179或185的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

19.一种核酸，其编码如权利要求12-18中任一项所述的系统的第一表达阻遏物和第二阻遏物。

20.如权利要求19所述的核酸，其包含根据SEQ ID NO:113、196或197的核苷酸序列，其中聚A序列是任选的。

21.一种表达阻遏系统，其包含：

a)第一表达阻遏物，其包含：

b)第二表达阻遏物，其包含：

22.一种表达阻遏系统，其包含：

a)第一表达阻遏物，其包含：

b)第二表达阻遏物，其包含：

i)第二靶向部分，该第二靶向部分具有根据SEQ ID NO:169、171的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

23.一种表达阻遏系统，其包含：

a)第一表达阻遏物，其包含：

i)第一靶向部分，该第一靶向部分具有根据SEQ ID NO:169、171的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

ii)第一效应子部分，该第一效应子部分具有根据SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

b)第二表达阻遏物，其包含：

i)第二靶向部分，该第二靶向部分具有根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

ii)第二效应子部分，该第二效应子部分具有根据SEQ ID NO:19或87的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

24.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物或表达阻遏系统，其使MYC的表达明显降低持续以下时间段：至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂，例如，如通过ELISA测量。

25.一种融合蛋白，其包含编码本文所述的第一表达阻遏物的第一氨基酸区和包含本文所述的第二表达阻遏物的第二氨基酸区。

26.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物、融合蛋白或表达阻遏系统，其中该表达阻遏物与该MYC基因座的结合使MYC的表达在用该表达阻遏物或表达阻遏系统转染后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80或96小时明显降低。

27.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物、融合蛋白或表达阻遏系统，其中将多个细胞与该表达阻遏物、表达阻遏物系统、或编码该表达阻遏物或该第一表达阻遏物和该第二表达阻遏物的核酸接触降低了该多个细胞的活力。

28.如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物、融合蛋白或表达阻遏系统，其中，该表达阻遏物或表达阻遏系统的施用导致至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％的靶细胞(例如癌细胞)凋亡。

29.如权利要求17d所述的表达阻遏物、融合蛋白、或表达阻遏系统，其中该多个细胞包括多个癌细胞和多个非癌细胞。

30.如权利要求17e所述的表达阻遏物、融合蛋白、或表达阻遏系统，其中使该多个细胞与该系统或编码该系统的核酸接触对该多个癌细胞的活力的降低大于其对该多个非癌细胞的活力的降低，任选地其中该多个癌细胞的活力比该多个非癌细胞的活力降低1.05x(即，1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x、或100x。

31.一种核酸，其包含编码如权利要求1-30中任一项所述的表达阻遏物、融合蛋白或系统的序列。

32.一种核酸，其编码表达阻遏系统，该核酸包含：

33.一种核酸，其编码表达阻遏系统，该核酸包含：

34.一种核酸，其编码表达阻遏系统，该核酸包含：

35.如权利要求19、21或22中任一项所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO:93、94、112、113、196、197的核苷酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

36.一种表达阻遏物，其包含：

结合包含表12的序列的至少16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分，以及

任选地，效应子部分。

37.一种表达阻遏物，其包含：

靶向部分，该靶向部具有根据表4的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

任选地，效应子部分。

38.如权利要求37所述的表达阻遏物，该表达阻遏物包含根据表7或表9的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

39.一种核酸，该核酸包含根据表5、表6、表8、表16或表10的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

40.一种载体，其包含编码如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白、系统或表达阻遏物的核酸。

41.一种反应混合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物、系统、融合蛋白、核酸或载体。

42.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的表达阻遏物、系统、融合蛋白、核酸、载体或反应混合物。

43.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：

施用如权利要求1-20中任一项所述的表达阻遏物、系统、融合蛋白、或编码该表达阻遏物或该系统的核酸。

44.如权利要求43所述的方法，其中该癌症是肝细胞癌(HCC)、纤维板层肝细胞癌(FHCC)、胆管癌、血管肉瘤、继发性肝癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、大细胞(未分化)癌、三阴性乳腺癌、胃腺癌、子宫内膜癌或胰腺癌。

45.一种用于治疗有需要的受试者的肝炎的方法，该方法包括：

施用如权利要求1-42中任一项所述的表达阻遏物、融合蛋白、系统、或编码该表达阻遏物或该系统的核酸。

46.一种减少有需要的受试者的肿瘤生长的方法，该方法包括：

向该受试者施用如权利要求1-42中任一项所述的表达阻遏物、融合蛋白、系统、核酸、载体或药物组合物，

从而减少该受试者的肿瘤生长。

47.一种增加或恢复癌症对激酶抑制剂例如索拉非尼的敏感性的方法，该方法包括向患有该癌症的受试者施用如权利要求1-42中任一项所述的表达阻遏物或系统，任选地其中该表达阻遏物或系统的施用使该激酶抑制剂的IC₅₀降低10％、20％、30％或40％，例如在癌细胞活力测定中。

48.一种增加或恢复癌症对布罗莫结构域抑制剂，例如BET抑制剂，例如JQ1的敏感性的方法，该方法包括向患有该癌症的受试者施用如权利要求1-42中任一项所述的表达阻遏物或系统，其中任选地，该表达阻遏物或系统的施用使该布罗莫结构域抑制剂的IC₅₀降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如在癌细胞活力测定中。

49.一种增加或恢复癌症对MEK抑制剂例如曲美替尼的敏感性的方法，该方法包括向患有该癌症的受试者施用如权利要求1-42中任一项所述的表达阻遏物或系统，其中任选地，该表达阻遏物或系统的施用使该MEK抑制剂的IC₅₀降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如在癌细胞活力测定中。

50.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中该癌症包含特征在于相对于参考水平(例如，相对于参考细胞的MYC表达，例如该受试者的在其他方面类似的非癌性细胞)的MYC表达增加的细胞，以及特征不在于相对于参考水平(例如，相对于参考细胞的MYC表达，例如该受试者的在其他方面类似的非癌性细胞)的MYC表达增加的细胞，例如，具有正常MYC表达的细胞。

51.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其包括：

a)首先，向该受试者施用权利要求________中任一项所述的表达阻遏物或系统的第一多个剂量，其中任选地，该第一多个剂量中的每个后续剂量在该第一多个剂量中的在先剂量之后5天施用；

52.如权利要求43-51中任一项所述的方法，其中停止用该表达阻遏物、融合蛋白或系统治疗后，肿瘤体积下降(例如，至不可检测的水平)。

53.如权利要求43-52中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括

a.将该细胞与第二治疗剂接触或

b.向该受试者施用第二治疗剂，任选地其中该第二治疗剂不是如权利要求__中任一项所述的表达阻遏物、系统、融合蛋白、核酸、载体、反应混合物或药物组合物。

54.如权利要求43-53中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂是免疫疗法、免疫检查点和抗血管内皮生长因子疗法之一或两者、全身化疗、酪氨酸激酶抑制剂例如索拉非尼、丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂例如曲美替尼、或布罗莫结构域抑制剂例如BET抑制剂，例如JQ1，例如比拉瑞塞。

55.如权利要求43-54中任一项所述的方法，其中该第一治疗剂和该第二治疗剂同时施用。

56.如权利要求43-55中任一项所述的方法，其中该第一治疗剂和该第二治疗剂顺序施用。

57.如权利要求43-56中任一项所述的方法，其中该受试者在至少一些细胞中具有MYC过表达。