JP2017534628A - 癌幹細胞治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
癌幹細胞(cancer stem cell)を調製するために、乳癌細胞株のMDA−MB−231とMCF−7細胞株のそれぞれの親細胞(parental cell)であるp−MDA−MB−231とp−MCF−7を長期間栄養欠乏状態を誘導して栄養欠乏状態で細胞死滅を回避し生存した細胞(s−MDA−MB−231およびs−MCF−7)を選別して、通常の癌幹細胞特異的生物学的特性の分析により検証後、癌幹細胞を作製した。癌幹細胞の機序究明および癌幹細胞を抑制できる治療剤の開発のために、s−MDA−MB−231とs−MCF−7細胞にそれぞれshPGC−1αpGFP−V−RSベクター(Origene)を形質注入(transfection)して、shPGC−1αを安定的に発現する幹細胞(stem cell)であるsshPGC−1α−MDA−MB−231とs−shPGC−1α−MCF−7をそれぞれ作製して実験に使用した。それぞれの細胞株は、10%のウシ胎児血清(fetal bovine serum、FBS)が含まれたRPMI−1640培地で培養した。
グルコース欠乏状態(glucose deprivation)で癌細胞と癌幹細胞の生存率を比較するために、実施例1と同様の方法で用意したp−MDA−MB−231、p−MCF−7、s−MDA−MB−231、およびs−MCF−7細胞株を、96ウェルプレートに5X103/100uLの濃度となるようにそれぞれ添加し、培養容器面積の70%程度になるまで培養した後に、グルコースが欠乏している10%FBSが添加されたRPMI−1640培地に交換して、3日間追加培養した。そして、それぞれ0、12、24、36、48、60、および72時間に細胞の生存率を確認した。細胞の生存率は、クリスタルバイオレット染色(crystal violet staining)およびMTT(3−(4,5−dimethylthiazol−2−yl)−2,5−diphenyltetrazolium bromide)assayにより確認した。クリスタルバイオレット染色結果は図1に示し、ΜTΤ assay結果は図2に示した。
(3.1.TUNEL assay)
癌幹細胞が栄養欠乏状態で高い生存率を示す原因が細胞死滅(apoptosis)に対する抵抗性によるかを確認するために、実施例2と同様の方法により、グルコース欠乏状態で40時間培養したp−MDA−MB−231、p−MCF−7、s−MDA−MB−231、およびs−MCF−7細胞株をそれぞれ回収して、TUNEL assayを実施した。TUNEL assayは、回収された細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液(paraformaldehyde solution)を用いて48時間固定させた後に、Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick end Labeling(TUNEL)kitを用いてプロトコルに従って染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察しながら、Zeiss LSM Image Browser software programを用いて蛍光イメージを分析した。その結果は図3に示した。
癌幹細胞が栄養欠乏状態で高い生存率を示す原因である細胞死滅(apoptosis)に対する抵抗性に細胞死滅関連の蛋白質が関与するかを確認するために、実施例2と同様の方法により、グルコース欠乏状態で40時間培養したp−MDA−MB−231、p−MCF−7、s−MDA−MB−231、およびs−MCF−7細胞株をそれぞれ回収して、免疫学的分析を実施した。回収された細胞は、冷たいPBS(phosphate buffered saline)緩衝溶液を用いて2回洗浄し、RIPA緩衝溶液を用いて細胞を溶解させて蛋白質を分離し、分離された蛋白質は、後の実験のためにBCA assayにより蛋白質の量を測定した。そして、それぞれの細胞株から獲得した蛋白質20ugを8−10%SDS−ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)を用いて分離し、電気を利用してPVDF膜(membrane)に移動させた。蛋白質の移動したPVDP膜は、5%脱脂粉乳を用いて室温で1時間処理した後に、caspase−3、caspase−7、Bcl−2、およびbeta−actin(対照群、control)に対するそれぞれの一次抗体(primary antibody)とともに4℃で16時間反応させた。抗体と反応させたPVDP膜は、TBST溶液を用いて3回洗浄して結合していない一次抗体を除去し、HPRの結合されている二次抗体(secondary antibody)と室温で1時間追加反応させた。反応が完了した後に、TBST溶液を用いて洗浄して二次抗体をすべて除去し、ECL溶液を処理し、3分間反応させた後に、Kodak X−OMAT AR Filmで現像した。その結果は図4に示した。
癌幹細胞の、栄養欠乏状態における細胞死滅(apoptosis)が誘発されるかを確認するために、実施例2と同様の方法により、グルコース欠乏状態で12時間(初期、early phase)および40時間(後期、late phase)培養したp−MDA−MB−231、p−MCF−7、s−MDA−MB−231、およびs−MCF−7細胞株をそれぞれ回収して、細胞周期分析を実施した。回収された細胞は、70%エタノール(ethanol)を用いて固定させた後に、40ug/mL propidium iodide(PI)と100ug/mLのRNaseとが混合されているPBS緩衝溶液で30分間反応させてtotal DNAをすべて染色し、染色した細胞の細胞周期分析は、FACS Calibur Flow Cytometerを用いて観察した。G0/G1期、S期、およびG2/M期にある細胞の割合(proportion)は、FACSおよびDNA software program(FlowJo)を用いて測定した。その結果は図5に示した。
(4.1.細胞内部のCa2+量の確認)
細胞死滅が起こる多くの細胞の場合、小胞体(endoplasmic reticulum)から細胞質(cytosol)にCa2+が分泌したり、原形質膜(plasma membrane)を通して細胞の内部にCa2+が流入する現象が生じて細胞内部のカルシウム濃度が維持されないことから、癌幹細胞でもCa2+の移動現象が生じるかを確認するために、実施例3と同様の方法により、栄養欠乏状態の細胞株を用意した後に、カルシウム染色剤のfura−2−AMを用いて細胞内部のCa2+量を確認した。その結果は図6に示した。
癌幹細胞の細胞内部のCa2+量が一般的な癌細胞と比較して高い理由を確認するために、CaMK−2αの発現量をウェスタンブロッティング(western blotting)を利用して確認した。ウェスタンブロッティングは、実施例3.2と同様の方法で実施した。その結果は図7に示した。
癌幹細胞のCaMK−2αの発現を抑制する場合の効果を確認するために、それぞれの細胞株にバイオニアから購入したCaMK−2α siRNAを形質注入(transfection)して、CaMK−2αの発現が抑制された癌幹細胞株を作製した。そして、実施例4.1および4.2と同様の方法でCaMK−2αの発現量および細胞内部のCa2+量を測定した。その結果は図8に示した。
従来栄養欠乏状態で発現が調節されると知られているPGC−1αがCa2+関連細胞死滅に対する抵抗性と関係があるかを確認するために、s−MDA−MB−231細胞株にsh−PGC−1αベクター(Origene)を形質注入(transfection)して、PGC−1αの発現を抑制させた癌幹細胞株を作製し、実施例3.2と同様の方法で免疫学的分析を実施した。その結果は図12に示した。
(5.1.PGC−1αとPMCA1との結合関係の確認)
PGC−1αとPMCA1との関連関係を確認するために、EMSA kitを用いてプロトコルに従ってEMSA assayを実施した。結合配列(probe)としては、PMCA1のプロモーター(promoter)の結合部位配列である「TTGACCTTTGGCCCA」を使用した。その結果は図14に示した。
図14に示されているように、後期段階の癌幹細胞では、HNF4α、PGC−1α、およびDNA(probe)との結合が増加するのに対し、一般的な癌細胞や、PGC−1αの発現が抑制された癌幹細胞では結合が減少することを確認した。前記結果を通して、栄養欠乏状態でPGC−1αがHNF4αと結合してPMCA1のプロモーター部位に結合してPMCA1の発現を調節することを確認できた。
PGC−1αとPMCA2との関連関係を確認するために、EMSA kitを用いてプロトコルに従ってEMSA assayを実施した。結合配列(probe)としては、PMCA2のプロモーター(promoter)の結合部位配列である「CTGGAAATACCCC」を使用した。その結果は図15に示した。
栄養欠乏状態でPMCAの発現量の変化を確認するために、実施例2と同様の方法により、栄養欠乏状態でそれぞれの細胞株を培養し、培養時間に応じてqRT−PCRを実施した。それぞれの時間に回収した細胞は、RNeasy Mini Kitを用いてプロトコルに従ってRNAを抽出し、抽出されたRNA1ugを用いて、one step RT−PCR kitを用いてqRT−PCRを実施した。使用したプライマー配列を表1に記載した。その結果は図16に示した。また、CaMK−2αの発現を抑制させた細胞株を用いて同様の実験を実施した結果は図17に示した。
栄養欠乏状態でPMCAを抑制した時、癌幹細胞のカルシウム濃度調節能力が変化するかを確認するために、原形質膜でCa2+−ATPアーゼ(calcium ATPase)として作用するPMCAの抑制剤でカルシウムポンプ抑制剤(calcium pump inhibitor)であるカロキシン(caloxin)を使用し、小胞体でCa2+−ATPアーゼ(calcium ATPase)として作用するSERCA(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+−ATPase)の抑制剤であるタプシガルギン(thapsigargin)を用いてPMCAまたはSERCAの活性を抑制させた後に、癌幹細胞における細胞外Ca2+量の変化を測定した。その結果は図18に示した。
(6.1.動物モデルの作製)
癌幹細胞に効果的な治療方法を確認するために、乳癌動物モデルを作製した。乳癌動物モデルの作製のために、乳癌細胞であるp−MDA−MB−231とp−MCF−7細胞株と、乳癌幹細胞であるs−MDA−MB−231とs−MCF−7細胞株をin vitroでそれぞれ培養した後に、1.0X107 cells/mouseとなるように5−6週目BALB/c nude miceのupper left flank部位に注入し、7日間水と飼料を提供し、22℃で12時間の周期で光を調節して、乳癌動物モデルを作製した。
実施例6.1と同様の方法で作製した乳癌動物モデルにおいてPMCA1、PMCA2、PGC−1α、およびCaMK−2αの発現が増加するかを確認するために、免疫化学染色法を利用して確認した。Standard surgical pathology protocolsに従ってマウスの癌組織を回収して、10%neutral buffered formalinを用いて固定化させ、再びパラフィンに固定させて5umの間隔で組織を切った後、パラフィンを除去した。そして、pH6のクエン酸塩緩衝溶液(citrate buffer)中で抗原復旧(antigen retrieval)を実施し、3%過酸化水素(hydrogen peroxide)を5分間処理した後に、PMCA1、PMCA2、PGC−1α、およびCaMK−2αに対する1:100の濃度で希釈したそれぞれの一次単クローン抗体(primary monoclonal antibody)を処理した。そして、ヘマトキシリン(haematoxylin)を用いて逆染色した後に、乾燥させて観察した。染色された部位は、MetaMorph4.6softwareを用いて定量した。その結果は図19に示した。
実施例6.1と同様の方法で作製した乳癌動物モデルを9匹ずつ1つの実験群に分類し、グルコース吸収抑制剤(glucose uptake inhibitor)の2−脱酸ブドウ糖(2−deoxyglucose、2DG)を500mg/kg、ビグアナイド(biguanide)系薬物のメトホルミン(metformin)を250mg/kg、そしてカルシウムポンプ抑制剤のカロキシン2al(caloxin2al)を200mg/kgとなるように薬物を組み合わせて、45日間、1日1回腹腔注射(intraperitoneal injection)し、毎日、カリパス(calipers)を用いて癌の横(a)および縦(b)の直径を測定し、「4/3XπX(acmXbcm)3X1/2」式を用いて癌の大きさ(volume)を測定した。その結果は表2および図20に示した。
(7.1.癌細胞と癌幹細胞との遺伝子発現の差の確認)
癌幹細胞の生存機序を確認するために、実施例2と同様の方法により、グルコース欠乏状態で40時間培養したp−MDA−MB−231、p−MCF−7、s−MDA−MB−231、およびs−MCF−7細胞株をそれぞれ回収し、実施例5.3と同様の方法でRNAを抽出してマイクロアレイ(microarray)を実施した。その結果は図21に示した。
栄養欠乏状態で時間に応じたCaMK−2α信号伝達機序の変化を確認するために、実施例3.2と同様の方法でウェスタンブロッティングを実施し、pNF−kBを用いて実施例5.1と同様の方法でEMSA assayを実施した。その結果は図24および図25に示した。
CaMK−2α信号伝達を抑制した時の効果を確認するために、CaMK−2αの抑制剤としてよく知られているKN62(1−[Ν,O−bis(5−isoquinolinesulphonyl)−N−methyl−L−tyrosyl]−4−phenylpiperazine)を癌幹細胞に10uMの濃度で処理した後、実施例3.1と同様の方法でTUNEL assayを実施して細胞死滅およびDNA断片化を確認し、実施例3.2と同様の方法でウェスタンブロッティングを実施して遺伝子の発現を確認し、実施例2と同様の方法で細胞の生存率を確認した。その結果は図26〜図28に示した。
実施例6と同様の方法で作製した動物モデルの特徴を確認するために、生成された乳癌組織を抽出して癌の大きさを測定した。その結果は図29に示した。また、乳癌組織の蛋白質の発現程度をウェスタンブロッティングと免疫化学染色法を実施して確認した。ウェスタンブロッティングは、実施例3.2と同様の方法で実施し、免疫化学染色法は、実施例6.2と同様の方法で実施した。その結果は図30および図31に示した。
Claims (17)
- グルコース吸収抑制剤(glucose uptake inhibitor)およびカルシウムポンプ抑制剤(calcium pump inhibitor)を有効成分として含む、癌幹細胞成長抑制用組成物。
- 前記グルコース吸収抑制剤は、2−脱酸ブドウ糖(2−deoxyglucose、2DG)であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、原形質膜カルシウム−ATPアーゼ(plasma membrane Ca2+ ATPase、PMCA)の抑制剤であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、カロキシン(caloxin)またはニフェジピン(nifedipine)であることを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、CaMK−2α(Ca2+/calmodulin−dependent kinase−2alpha)の抑制剤であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、KN62(1−[N,O−bis(5−isoquinolinesulphonyl)−N−methyl−L−tyrosyl]−4−phenylpiperazine)またはCaMK−2αに特異的に結合するsiRNAであることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
- 前記組成物は、ビグアナイド(biguanide)系化合物を追加的に含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記ビグアナイド系化合物は、メトホルミン(metformin)、フェンホルミン(phenformin)、およびブホルミン(buformine)からなる群より選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項7に記載の組成物。
- グルコース吸収抑制剤(glucose uptake inhibitor)およびカルシウムポンプ抑制剤(calcium pump inhibitor)を有効成分として含む、癌幹細胞治療用薬学組成物。
- 前記グルコース吸収抑制剤は、2−脱酸ブドウ糖(2−deoxyglucose、2DG)であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、原形質膜カルシウム−ATPアーゼ(plasma membrane Ca2+ ATPase、PMCA)の抑制剤であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、カロキシン(caloxin)またはニフェジピン(nifedipine)であることを特徴とする、請求項11に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、CaMK−2α(Ca2+/calmodulin−dependent kinase−2alpha)の抑制剤であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 前記カルシウムポンプ抑制剤は、KN62(1−[N,O−bis(5−isoquinolinesulphonyl)−N−methyl−L−tyrosyl]−4−phenylpiperazine)またはCaMK−2αに特異的に結合するsiRNAであることを特徴とする、請求項13に記載の組成物。
- 前記組成物は、ビグアナイド(biguanide)系化合物を追加的に含むことを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 前記ビグアナイド系化合物は、メトホルミン(metformin)、フェンホルミン(phenformin)、およびブホルミン(buformine)からなる群より選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項15に記載の組成物。
- 前記癌は、乳癌、子宮癌、胃癌、脳癌、直膓癌、大膓癌、肺癌、皮膚癌、血液癌、および肝臓癌からなる群より選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項7に記載の組成物。
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