JP2017533712A - マンナナーゼ、セルラーゼおよびペクチナーゼが欠乏している、ベータ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を発現する組換え宿主細胞 - Google Patents
マンナナーゼ、セルラーゼおよびペクチナーゼが欠乏している、ベータ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を発現する組換え宿主細胞 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a.配列番号1との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で980個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
b.配列番号2との少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で975個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
c.配列番号3との少なくとも96.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で1300個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
d.i)配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれる核酸配列またはii)i)の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
e.配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
f.配列番号1、2、3、4または5の1個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
a.配列番号1との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で980個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
b.配列番号2との少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で975個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
c.配列番号3との少なくとも96.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で1300個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
d.i)配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれる核酸配列またはii)i)の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
e.配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
f.配列番号1、2、3、4または5の1個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
配列番号1(本明細書では(BIF_917)とも称する)は、配列番号22の887アミノ酸切断断片である。
配列番号2(本明細書では(BIF_995)とも称する)は、配列番号22の965アミノ酸切断断片である。
配列番号3(本明細書では(BIF_1068)とも称する)は、配列番号22の1038アミノ酸切断断片である。
配列番号4(本明細書では(BIF_1172)とも称する)は、配列番号22の1142アミノ酸切断断片である。
配列番号5(本明細書では(BIF_1241)とも称する)は、配列番号22の1211アミノ酸切断断片である。
配列番号6(本明細書では(BIF_1326)とも称する)は、配列番号22の1296アミノ酸切断断片である。
配列番号7は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)グリコシドヒドロラーゼ触媒コアである。
配列番号8は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)DSM20215由来の細胞外ラクターゼをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号9は、BIF_917をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号10は、BIF_995をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号11は、BIF_1068をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号12は、BIF_1172をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号13は、BIF_1241をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号14は、BIF_1326をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号15は、上記のBIF変異体を生成するためのフォワードプライマーである。
配列番号16は、BIF917のためのリバースプライマーである。
配列番号17は、BIF995のためのリバースプライマーである。
配列番号18は、BIF1068のためのリバースプライマーである。
配列番号19は、BIF1241のためのリバースプライマーである。
配列番号20は、BIF1326のためのリバースプライマーである。
配列番号21は、BIF1478のためのリバースプライマーである。
配列番号22は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)DSM20215由来の細胞外ラクターゼである。
配列番号23は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)DSM20215由来の細胞外ラクターゼのシグナル配列である。
本発明の詳細な説明にしたがって、下記の略語および用語の定義が適用される。本明細書で使用する単数形「1つの」および「その」は、状況が明白に他のことを指示していない限り、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば「1つのポリペプチド」との言及には複数のそのようなポリペプチドが含まれ、「調製物」との言及には1つ以上の調製物および当業者には知られているそれらの同等物などが含まれる。
一態様では、本発明は、セルラーゼ活性を有しないまたは実質的に有しない組成物に関する。別の態様では、本発明は、セルラーゼをコードする遺伝子が不活性化されている新規の細菌を提供する。そのような組成物は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含む。本発明に係る宿主細胞は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる。そのようなトランスガラクトシル化活性は、製品中のラクトースからGOSが生成され得る(即ち好ましくはポリペプチドが組成物中に存在する)レベルで存在すべきである、または宿主細胞が、組成物もしくは宿主細胞が添加されている乳製品中に存在するラクトースからGOSの形態の食物繊維が生成され得るレベルでポリペプチドを発現することができるレベルで存在すべきである。
マンナナーゼは、マンナンとして知られている化合物を分解する酵素である。この多糖は単糖マンノースで構成されており、自然界において広く見出される。多くの植物(および例えばこれらの植物の種子)では、マンナンは炭水化物貯蔵所としての機能を果たす。一態様では、この酵素はマンナナーゼの群から選択され、具体的には、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼから選択される。一実施形態によれば、不活性化されているマンナナーゼ遺伝子はgmuGマンナナーゼである。
ペクチナーゼは、植物の細胞壁中で見出される多糖であるペクチンを分解する酵素である。一般にペクチン酵素と呼ばれているが、このペクチン酵素として、ペクトリアーゼ、ペクトザイムおよびポリガラクツロナーゼが挙げられる。最も研究されているおよび広く使用されている市販のペクチナーゼの1つはポリガラクツロナーゼである。一実施形態によれば、不活性化されているペクチナーゼ遺伝子はpelペクチン酸リアーゼである。
アミラーゼは、デンプンの糖への加水分解を触媒する酵素である。アミラーゼはヒトおよびいくつかのその他の哺乳動物の唾液中に存在し、消化の化学プロセスを開始する。脾臓および唾液腺は、アミラーゼ(アルファアミラーゼ)を生成して食事のデンプンを二糖および三糖へと加水分解し、これら二糖および三糖はその他の酵素によりグルコースへと変換され、身体にエネルギーが供給される。植物およびいくつかの細菌もアミラーゼを産生する。特定のアミラーゼタンパク質はギリシャ文字で表される。全てのアミラーゼはグリコシド加水分解酵素であり、α−1,4−グリコシド結合に作用する。好ましくは、本発明は(EC3.2.1.1)(CAS#9014−71−5)(別名:1,4−α−D−グルカングルカノヒドロラーゼ;グリコゲナーゼ)の不活性化を更に含む。一実施形態によれば、不活性化されているアミラーゼ遺伝子はamyEアルファ−アミラーゼである。
2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメーター「同一性」によって記載される。
i)gapが挿入された時間毎のpenaltyスコアの指定(gap penaltyスコア)、
ii)既存のgapが割増位置を伴って伸長する各時間のpenaltyスコアの指定(extension penaltyスコア)、
iii)同一アミノ酸がアライメントされた時点の高スコアの指定、および
iv)非同一アミノ酸がアラインメントされた時点の可変スコアの指定、が含まれる。
Gap opening penalty:10
Gap extension penalty:0.05
Gap separation penalty range:8
1つの実施形態では、本明細書に開示した発明は、3重量/重量%の初期ラクトース濃度以上の濃度で、少なくとも0.5、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも2.5、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11もしくは少なくとも12のトランスガラクトシル化活性:β−ガラクトシダーゼ活性の比率を有するポリペプチドを使用する。1つの態様では、本明細書に開示した発明は、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアが配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用する。
1つの態様では、本明細書に開示した発明は、Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)および/またはGlyco_hydro 2C(PF02836)ドメインを含有するポリペプチドを使用する。
g.配列番号1との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大980個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
h.配列番号2との少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大975個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
i.配列番号3との少なくとも96.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大1,300個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
j.i)配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13からなる核酸配列、またはii)i)の相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、
k.配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
l.配列番号1、2、3、4または5の1個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
a.配列番号3との少なくとも96.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で1300個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
b.配列番号1との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で980個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
c.i)配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれる核酸配列またはii)i)の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
d.配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
e.配列番号1、2、3、4または5の1個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを用いる。
a)15、30もしくは180分間、例えば180分間の反応後に、37℃および5重量/重量%のラクトースでのミルクベースのアッセイにおいて100ppmの濃度で測定して、少なくとも1、少なくとも2.5、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11または少なくとも12のトランスガラクトシル化活性:β−ガラクトシダーゼ活性の比率を有する、および/または
b)15、30もしくは180分間、例えば180分間の反応後に、37℃および5重量/重量%のラクトースでのミルクベースアッセイにおいて100ppmの濃度で測定して、初期ラクトースの20%超、30%超、40%超および50%までがトランスガラクトシル化されているようなトランスガラクトシル化活性を有する、の内の1つ以上を有する。
1つの態様では、配列番号1、2、3、4もしくは5に比較して、例えば改良されたトランスガラクトシル化などの変化した特性を実行する1つ以上の位置で置換を有する配列番号1、2、3、4もしくは5の変異体が使用される。そのような変異ポリペプチドは、本文献においては便宜的に、「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」または「変異体」とも呼ばれる。1つの態様では、本明細書に定義したポリペプチドは、配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドに比較して改良されたトランスガラクトシル化活性を有する。また別の態様では、本明細書に定義したポリペプチドは、配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドに比較して改良された反応速度を有する。
1つの態様では、本発明は、超低ストリンジェンシー条件下、好ましくは低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件下、いっそうより好ましくは高ストリンジェンシー条件下、および最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下で、i)配列番号1、2、3、4もしくは5の成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれる核酸配列;ii)i)のcDNA配列、またはiii)i)もしくはii)の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる上述したトランスガラクトシル化活性を有する単離ポリペプチドを使用する(J.Sambrook,E.F.Fritsch,およびT.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。配列番号9、10、11、12もしくは13の部分配列は、少なくとも100個の連続ヌクレオチドまたは好ましくは少なくとも200個の連続ヌクレオチドを含有する。さらに、部分配列は、ラクターゼ活性を有するポリペプチド断片をコードする可能性がある。
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htmを参照されたい)
配列番号10のG+C含量は42%であり、配列番号11のG+C含量は44%である。中ストリンジェンシーに対しては、ホルムアミドは35%であり、5×のSSPEに対するNa+濃度は0.75Mである。
相同性率(%)=100−[(有効Tm−ハイブリダイゼーション温度)/1.4]
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htmを参照されたい)
1つの態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを使用する。1つの態様では、細菌細胞がそのベクターを含む。一部の実施形態では、変異体をコードする核酸を含むDNA構築物は、コーディング配列と機能的に連結した調節配列を含む発現ベクター内の宿主細胞に移される。ベクターは、真菌宿主細胞ゲノム内に統合して、宿主細胞内に導入されると複製できる任意のベクターであってよい。ミズーリ大学のFGSC菌株カタログは、好適なベクターを列挙している。好適な発現ベクターおよび/または組込み型ベクターの追加の例は、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUUAL,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(2001);Bennett et al.,MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI,Academic Press,San Diego(1991),pp.396−428;および米国特許第5,874,276号明細書に提供されている。典型的なベクターには、pFB6、pBR322、PUC18、pUC100およびpENTR/D、pDONTM201、pDONRTM221、pENTRTM、pGEM(登録商標)3ZおよびpGEM(登録商標)4Zが含まれる。細菌細胞中で使用するための典型には、大腸菌(E.coli)内での複製を許容するpBR322およびpUC19ならびに例えばバチルス(Bacillus)属における複製を許容するpE194が含まれる。
また別の態様では、本明細書に記載したプラスミドまたは本明細書に記載した発現ベクターを含む、好ましくはそれらを用いて形質転換された宿主細胞が使用される。
セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している宿主細胞またはこれらの酵素が本質的に不活性である宿主細胞を、組換え遺伝子操作技術を使用する遺伝子工学により、この宿主を変異誘発にかけることにより、または両方により得ることができる。本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼをコードする遺伝子の改変または不活性化は、親細胞を変異誘発にかけ、この親細胞と比べてこれらの酵素を発現する能力が低い変異細胞を選択することにより起こり得る。特異的であってもよいしランダムであってもよい変異誘発を、例えば、適切な物理的なもしくは化学的な変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、またはDNA配列をPCR生成変異誘発(PCR−generated mutagenesis)にかけることにより実施することができる。更に、この変異誘発を、これらの変異誘発剤の任意の組合せの使用により実施することができる。
あるいは、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性および任意選択でアミラーゼ活性の量が低減している宿主細胞またはこれらの酵素が本質的に不活性である宿主細胞を、組換えDNA技術を使用して構築してもよい。例えば一段階遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、RNA干渉、アンチセンスRNA等の遺伝子不活性化用のまたは遺伝子破壊用のいくつかの技術が当分野で説明されており、これら全てを使用して、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性が低下している工業的製造株を得るために、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性の合成を低減させる、阻害するまたは妨げることができる。また、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼの遺伝子の発現を指示する制御配列の改変によるセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼの不活性化も本発明の一部である。この一例は、遺伝子破壊によるプロモーター活性の低下である。好ましくはセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性をコードする遺伝子を妨げることにより、より好ましくは酵素活性をコードする遺伝子にマーカー遺伝子を挿入することにより、最も好ましくは、酵素コード領域の一部または全てをゲノムから除去することにより、現代の遺伝子改変技術を使用して、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している組換え株を得ることができる。そのような遺伝子不活性を実施する方法が多くの異なる微生物に関して説明されており、当業者に知られている(即ち欧州特許第357127号明細書を参照されたい)。これにより、変異細胞中でのセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼの発現を低減させることができる、または消失させることができる。これらの技術を使用して改変される宿主株によるが、この手順を数回繰り返して、セルラーゼコード配列、マンナナーゼコード配列およびペクチナーゼコード配列ならびに任意選択でアミラーゼコード配列の全てまたは大部分を除去することができる。
更に別の実施形態によれば、本発明は、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性、ペクチナーゼ活性および/またはアミラーゼ活性が欠乏している宿主細胞中でヌクレオチド配列を転写する方法であって、転写される配列が、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードし、この方法が、
(a)(i)プロモーター、(iv)このポリペプチドコードする下流ヌクレオチド配列、(iii)翻訳停止シグナルおよび(iv)転写停止シグナルを含む本発明の宿主細胞を培養培地中で培養すること、
(b)この宿主細胞中でこのポリペプチドを発現させること、ならびに
(c)任意選択で、この培養培地またはこの宿主細胞からこのポリペプチドを回収すること
を含む、方法に関する。
更なる態様では、本明細書で説明するポリペプチドを発現させる方法は、本明細書で説明する宿主細胞または細胞を得ること、およびこの細胞または宿主細胞からトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現させること、ならびに任意選択で、このポリペプチドを精製することを含む。そのようなポリペプチドを本発明で使用することができる。
DNA構築物またはベクターの宿主細胞中への導入として、形質転換;電気穿孔;核微量注入;形質導入;形質移入、例えばリポフェクション媒介性のおよびDEAE−デキストリン媒介性の形質移入;リン酸カルシウムDNA沈殿物とのインキュベーション;DNA被覆マイクロプロジェクタイル(DNA−coated microprojectile)による高速衝撃(high velocity bombardment);ならびにプロトプラスト融合等の技術が挙げられる。一般的な形質転換技術が当分野で知られている。例えば、Ausubel et al.(1987),上記参照,chapter 9、Sambrook et al.(2001),上記参照およびCampbell et al.,Curr.Genet.16:53−56(1989)を参照されたい。
当分野で既知の方法に従ってポリペプチド組成物を調製することができ、このポリペプチド組成物は液体組成物の形態であってもよいし乾燥組成物の形態であってもよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒状の形態であってもよいし微顆粒状の形態であってもよい。この組成物に含めるポリペプチドを、当分野で既知の方法に従って安定化させることができる。
下記に、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド組成物の好ましい使用の例を示す。
この実施例の宿主細胞はB.スブチリス(B.subtilis)に由来する。
酵素活性は、市販で入手できる基質2−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG)(Sigma N1127)を使用して測定した。
ONPG(水なし)アクセプター
100mMのKPO4(pH6.0)
12.3mMのONPG
アクセプターが補給されたONPG
100mMのKPO4(pH6.0)
20mMのセロビオース
12.3mMのONPG
停止液
10%のNa2CO3
吸光度が0.5〜1.0の間にあった希釈液に対して、トランスガラクトシル化活性の比率=(Abs420+セロビオース/Abs420−セロビオース)*100。
原理:
本アッセイ法の原理は、ラクターゼが37℃で2−o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG)を2−o−ニトロフェノール(ONP)およびガラクトースに加水分解することにある。反応は炭酸ナトリウムを用いて停止させ、遊離したONPを420nmで分光光度計または比色計で測定する。
MESバッファー(pH6.4)(100mMのMES(pH6.4)、10mMのCaCl2):19.52gのMES水和物(Mw:195.2g/モル、Sigma−aldrich、製品番号M8250−250G)および1.470gのCaCl2二水和物(Mw:147.01g/モル、Sigma−aldrich)を1,000mLのddH2O中に溶解させ、10MのNaOHによってpHを6.4に調整する。この溶液を0.2μmフィルターに通して濾過し、1カ月間まで4℃で貯蔵する。ONPG基質(pH6.4)(12.28mMのONPG、100mMのMES(pH6.4)、10mMのCaCl2):0.370gの2−o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG、Mw:301.55g/モル、Sigma−aldrich、製品番号N1127)を100mLのMESバッファー(pH6.4)中に溶解させ、4℃の暗所で7日間まで貯蔵する。停止試薬(10%のNa2CO3):20.0gのNa2CO3を200mLのddH2O中に溶解させ、この溶液を0.2μmのフィルターに通して濾過し、室温で1カ月間まで貯蔵する。
酵素サンプルの希釈系列をMESバッファー(pH6.4)中で作成し、10μLの各サンプル希釈液を、90μLのONPG基質(pH6.4)を含有するマイクロタイタープレート(96ウエルフォーマット)に移した。サンプルを混合し、5分間にわたり37℃でサーモミキサー(Comfort Thermomixer、Eppendorf)を使用してインキュベートし、引き続いて100μLの停止液を各ウエルに加えて反応を終了させた。酵素サンプルの代わりにMESバッファー(pH6.4)を使用してブランクを構築した。420nmでのブランクに比較した吸光度の増加をELISAリーダー(SpectraMaxプレートリーダー、Molecular Device)で測定した。
MESバッファー(pH6.4)中の2−o−ニトロフェノール(Sigma−aldrich、製品番号33444−25G)のモル吸光係数を決定した(0.5998×10−6M−1×cm−1)。1単位(U)のラクターゼ活性(LAU)は、1分当たり1モルのONPGの加水分解に対応すると定義された。200μLの全反応体積を備えるマイクロタイタープレート(0.52cmの光路)を使用すると、酵素サンプル1mL当たりのラクターゼ活性は、下記の方程式を使用して計算することができる:
BIF917濃度の決定:
標的酵素(BIF917)および切断生成物の定量は、Criterion Stain free SDS−PAGEシステム(BioRad)を使用して決定した。任意のkDのStain freeプレキャストゲル、4〜20%のTris−HCl、18ウエル(Comb、製品345−0418)をServa Tris−グリシン/SDSバッファー(BioRad、製品番号42529)とともに使用した。ゲルは、以下のパラメーターを用いてランした:200V、120mA、25W、50分間。BSA(1.43mg/ml)(Sigma−Aldrich、製品番号500−0007)をタンパク質標準物質として使用し、トリプトファン含量の相関を伴うバンド強度を用いた定量のためにはStain Free Imager(BioRad)をImage Labソフトウエア(BioRad)とともに使用した。BIF917の特異的LAU活性は、2つの独立発酵の(方法1に記載したように)粗発酵素(限外濾過濃縮液)から5つの異なる希釈液を使用して決定した(表1を参照されたい)。
試験:1
アッセイ:P−マンナナーゼ活性、還元糖(MU)
この試験方法を使用して、マンナナーゼ活性をMU(マンナナーゼ単位)単位で決定することができる。
目的 このアッセイはマンナナーゼ活性のQA/QCモニタリングに適している。
原理 このアッセイは、ローカストビーンガム(LBG)基質へのエンド−1,4−P−Dマンナナーゼの作用による還元糖の放出を測定する。ジニトロサリチル酸反応を使用して、添加する酵素活性に比例する還元糖含有量の増加を測定する。
1.材料および機器
1.1 遠心分離機、3500rpmが可能
1.2 40℃に設定した水浴
1.3 60℃に設定した水浴
1.4 沸騰水浴
1.5 ポジティブディスプレイスメントピペットおよびチップ(Ranin Inc.)
1.6 ボルテックス
1.7 16×100mmガラス試験管(キャップ付)
1.8 タイマー
1.9 メスフラスコ、メスシリンダー、ビーカー
1.10 磁気撹拌子および撹拌/ホットプレート
1.11 焼結ガラスろ過用漏斗
1.12 pHメーター
1.13 分析用天秤
1.14 調製用天秤
1.15 温度計
1.16 氷水浴
1.17 分光光度計、540nmの読み取りが可能
1.18 使い捨てチップを有する可変ピペット装置(1ml)
1.20 ガラス器具用のオーブンまたはオートクレーブ
2.1 水酸化アンモニウム、濃縮(28〜30%)
2.2 Tris−ヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)−塩酸塩
2.3 水酸化ナトリウムペレット
2.4 3,5−ジニトロサリチル酸、98%、(DNS)、Sigma−Aldrich Cat.#128848
2.5 ローカストビーンガム、Sigma Chemical #G0753
2.6 酒石酸カリウムナトリウム、四水和物、Sigma−Aldrich Cat.#217255
2.7 脱イオン水
2.8 1−プロパノール
3.1 水酸化アンモニウム1.5%
3.1.1 脱イオン水を使用して、メスフラスコ中で30%水酸化アンモニウム5mlを100mlに希釈する。
3.2 Tris−塩酸緩衝液
3.2.1 Tris−塩酸塩15.67gmを脱イオン水、約1900mlに溶解させる。水酸化アンモニウム(1.5%)でpHを7.5±0.05に調整し、脱イオン水で2000mlに希釈する。この溶液を室温で少なくとも2週間にわたり保持することができる。
3.3 水酸化ナトリウム10.67%
3.3.1 水酸化ナトリウムペレット32.0gmを脱イオン水200mlに添加する。溶解するまで撹拌して冷却する。脱イオン水で300mlにする。
(a)2Lビーカー中でDNS20gmを脱イオン水1000mlに懸濁させる。10.67%水酸化ナトリウム溶液300mlを添加する。
(b)溶液が透明になるまで、加熱した撹拌プレート上で懸濁液を温める。この温度は50℃を超えるべきではない。
(c)継続的に混合しつつ、この溶液に酒石酸カリウムナトリウム四水和物600gmを徐々に添加する。溶液を室温にする。
(d)この溶液を脱イオン水で2000mlに希釈し、必要な場合には、粗い焼結ガラスフィルタ(course sintered glass filter)に通してろ過する。室温にて暗い琥珀色のボトル中で保存する。この溶液は少なくとも2ヶ月にわたり良好である。
3.5.1 基質が接触する全てのガラス器具が非常に清潔でマンナナーゼ汚染の可能性がないことを確認する。1−プロパノール洗浄または120℃でのベーキングが推奨される。
5.1.1 Tris−塩酸緩衝液500mlを1000mlビーカーに入れる。このビーカーを沸騰水浴中に入れてまたは加熱した撹拌プレートに置いて、ビーカー中の温度を80℃にする。ローカストビーンガム1.4gmを非常に緩やかに添加しつつ、この溶液を迅速に撹拌する。混合を減速し、この溶液を60分にわたり水浴中において60℃で保持する。室温まで冷却する。脱イオン水で500mlに調整する。10分にわたり3,500rpmで遠心分離する。基質として透明な上清を使用する。
3.6.1 あるロットのマンナナーゼ最終製品を標準物質として選択する。この最終製品を、このロットの分析証明書で報告されているMU値と等しく設定する。この物質を使用して、MU/リットルで既知の濃度の試料を使用する3点標準曲線を作成する。この標準物質の正味の吸光度が試薬ブランクの減算後にアッセイの線形範囲内に入るように、Tris−塩酸緩衝液を使用してこの標準物質を適宜希釈する。このアッセイの線形範囲は0.17および0.52AAである。標準曲線および0.050〜0.140MU/リットルの試料濃度は概して、このアッセイの線形範囲内に入る。
3.7.1 第4節で概説するアッセイ反応が540nmで0.17〜0.52AAに入るように各試料(重量/体積)をTris−塩酸緩衝液で希釈する。
3.7.2 希釈した酵素溶液を氷上で保存する。最良の結果のために、希釈した酵素溶液を1時間以内にアッセイすべきである。
4.1 酵素試料−酵素試料は2重でアッセイすべきである。
4.1.1 20分にわたり16×100ガラス試験管中で40℃にてLGB基質2mlを平衡化する。
4.1.2 酵素試料希釈液0.5mlを添加し、混合し、正確に10分にわたりインキュベートする。
4.1.3 DNS溶液3.0mlを添加して混合することにより、反応を停止させる。
4.1.4 各試験管の上部をキャップで覆って蒸発を防止しつつ、沸騰水浴中で15分にわたり試料を沸騰させる。50分にわたり氷水浴中で冷却する。10分にわたり試料を室温に平衡化する。
5.1.1 脱イオン水ブランクに対する540nmでの吸光度を読み取る。試薬ブランクの減算後の吸光度は0.17〜0.52AAであるべきである。
4.2.1 ブランクを単独で実行することができる。この反応コントロールは、LBG基質中にまたは酵素試料中に存在する還元糖に関するものである。
5.1.1 20分にわたり16×100ガラス試験管中で40℃にてLBG基質2mlを平衡化する。
5.1.2 更に10分にわたりインキュベートする。
5.1.3 DNS溶液3.0mlを添加して混合する。酵素希釈液0.5mlを添加して再度混合する。
5.1.4 試験管の上部をキャップで覆って蒸発を防止しつつ、沸騰水浴中で15分にわたり沸騰させる。5分にわたり氷水浴中で冷却する。10分にわたり試料を室温に平衡化する。
5.1.5 脱イオンブランクに対する540nmでの吸光度を読み取る。
5.1 正味の吸光度を決定するために、全ての標準物質および試料の吸光度測定値から平均試薬/酵素ブランクを減算する。
5.2 正味の吸光度がy軸上であり濃度(MU/リットル)がx軸上である線形回帰を使用して、標準曲線を作成する。
5.3 相関係数は>0.998でなければならない。
5.4 線形回帰から各試料の濃度を決定する。
5.5 液体の場合:マンナナーゼMU/試料kg=曲線(MU/リットル)*試料希釈係数(全体積(リットル)/試料重量(kg))からの値
試験2:エンドグルカナーゼ活性、カルボキシメチルセルロース(CMC)活性
目的 この試験方法を使用して、セルラーゼのエンドヌクレアーゼ活性をCMC単位で決定することができる。注記:IU/gまたはIU/ml(国際単位)で報告されているセルラーゼはそれぞれ、CMC/gまたはCMC/mlと等しい。
原理 このアッセイは、CMC基質へのセルラーゼの作用による還元糖の放出を測定する。3,5ジニトロサリチル酸(DNS)との反応によって測定する場合、還元糖の放出速度は酵素活性に比例する。1CMC単位は、このアッセイの条件下で1分当たりグルコース還元糖当量1^.molを生成するのに必要とされる酵素の量と定義される。この方法では、活性を、割り当てたCMC単位を有する酵素標準物質と比較して測定する。
1.0 材料および機器
1.18 18×150mm試験管
1.19 大理石
1.20 キュベット
1.21 ポジティブディスプレイスメントピペットおよびチップ、Ranin Inc.
1.22 pHメーター
1.23 50℃に設定した水浴
1.24 氷浴
1.25 沸騰水浴
1.26 分光光度計
1.27 マグネチックスターラ
1.28 ストップウォッチ
1.29 粗いガラスフィルタ(著作権)、VWR KT93700−47
1.30 暗い琥珀色のボトル
1.31 ポジティブディスプレイスメントピペット
1.32 ボルテックサー(Vortexer)
1.33 試験管立て
2.0 試薬:下記の試薬または等価物を使用する。
2.9 カルボキシメチルセルロースナトリウム塩Fluka 21900 置換度は0.70〜0.85でなければならない
2.10 3,5−ジニトロサリチル酸、ナトリウム塩(DNS)、Merck 10846
2.11 酒石酸カリウムナトリウム、四水和物、Merck 8087
2.12 水酸化ナトリウム、試薬等級
2.13 氷酢酸、試薬等級
3.0 試薬の調製
3.1 0.05M酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.8
3.1.1 蒸留水900mLに氷酢酸2.85mLを添加する。磁気撹拌子で撹拌しつつ、50%水酸化ナトリウムでpHを4.8に調整する。総体積を蒸留水で1リットルにする。
3.4 10.67%(重量/体積)水酸化ナトリウム溶液
3.2.1 水酸化ナトリウムペレット32.0gを蒸留水200mLに添加する。溶解するまで撹拌して冷却する。蒸留水で300mLにする。
3.5 1%CMC基質溶液
3.3.1 酢酸ナトリウム緩衝液99mLにCMC1.00gを添加する。完全に混ざり合うまで撹拌し、使用前に少なくとも1時間にわたり4℃で保持する。この溶液は4℃で3日にわたり安定である。
3.6 1%の3,5−ジニトロサリチル酸(DNS)
(e)DNS20.0gを蒸留水1000mLに懸濁させ、混合しつつ10.67%水酸化ナトリウム溶液300mLを徐々に添加する。
(f)溶液が透明になるまで、50℃(122゜F)に設定した水浴中で懸濁液を温める。この水浴の温度は50℃を超えるべきではない。
3.4.3 継続的に混合しつつ、この溶液に酒石酸カリウムナトリウム四水和物600gmを徐々に添加する。
3.4.4 この溶液を蒸留水で2000mLに希釈し、粗いガラスフィルタに通してろ過する。室温にて暗い琥珀色のボトル中で保存する。この溶液は2ヶ月にわたり安定である。この溶液は使用前には透明でなければならない。
3.7.2 第4.5節で概説するアッセイ反応から得られる正味の吸光度が0.4〜0.5に入るように、顆粒試料を酢酸緩衝液に溶解させる。約0.2CMC/mLでの調製物は概して、所望の吸光度を得ることができる。
3.7.3 試料を調製する際に、顆粒を少なくとも100mg秤量する。磁気撹拌を使用して4.1.1により酢酸緩衝液で適宜溶解させる。5.1での算出のために、顆粒濃度をmg/mLで記録する。少なくとも20分にわたり中速で混合する。希釈試料を氷上で保存する。少なくとも2時間にわたり安定。
3.7.4 一部の試料は混合時間後に微細なスラリーを形成するであろうことに留置されたい。代表的なスラリー試料を採取して4.5でのアッセイを実施すべきである。
4.1.1 各顆粒試料の調製を3重で実施する。
4.2 液体試料の調製
4.1.3 第4.5節で概説するアッセイ反応から得られる正味の吸光度が0.4〜0.5に入るように、各試料を酢酸緩衝液で希釈する。約0.2CMC/mLでの調製物は概して、所望の吸光度を得ることができる。
4.1.4 試料を調製する際に、ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して液体試料を少なくとも0.10mLで等分する。希釈試料を氷上で保存する。少なくとも2時間にわたり安定。
4.1.5 各液体試料の調製を3重で実施する。
4.3 ワーキング標準物質の調製
4.4
4.3.1 あるロットのセルラーゼ最終製品(液体または顆粒のいずれか)を標準物質として選択する。この最終製品を、このロットの分析証明書で報告されているMU値と等しく設定する。この物質を使用して、4.1または4.2により既知のCMC/mLのワーキング標準物質を調製する。第4.5節で概説するアッセイ反応から得られる正味の吸光度が0.4〜0.5に入るように、酢酸緩衝液を使用してこの標準物質を希釈する。約0.2CMC/mLでの標準物質溶液の調製物は概して、所望の吸光度を得ることができる。
4.3.2 ワーキング標準物質の活性をCMC/mLで記録する。この活性を、第5.1節および第5.2節での算出で使用する。
4.3.3 この標準物質を3重で調製する。
4.4 ブランク溶液
4.4.1 第4.5節でのブランク酵素溶液として酢酸緩衝液を使用する。各ブランク酵素溶液を2重で実行する。
4.5 酵素アッセイ反応
4.5.1 10〜15分にわたり18×150mmガラス試験管中で50℃にてCMC基質1.00mLをインキュベートし、試験管立てに立てる。
4.5.2 20秒の間隔で、このCMC基質に、ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して酵素希釈液およびブランク1.00mLを添加する。10分にわたり50℃(122゜F)で各反応物を混合してインキュベートする。
4.5.3 4.5.2と同じ時間間隔で、DNS溶液3.0mLを添加して混合する。
4.5.4 試験管および試験管立てを沸騰水浴中に置いて、正確に5分にわたり全ての反応混合物+DNSを沸騰させる。試験管の上部を大理石で覆って沸騰中の蒸発を予防する。全ての試料、標準物質およびブランクを一緒に沸騰させるべきである。沸騰後、試験管を氷浴中で冷却する。
4.5.5 ゼロ吸光度としての蒸留水に対する540nmでの酵素試料およびブランクの吸光度を測定する。
4.5.6 平均試料吸光度および平均標準物質吸光度から平均ブランク吸光度を減算する。この正味の吸光度は0.4〜0.5であるべきである。そうでない場合、このアッセイを繰り返すべきである。
4.5.7 このアッセイでは、各酵素試料を3重で実行する。
5.1 顆粒試料での活性を下記のように算出する:
CMC/g(またはIU/g)=(試料の正味の吸光度)(ワーキング標準物質のCMC/mL)(1000mg/g)(ワーキング標準物質の正味の吸光度)(顆粒mg/酢酸緩衝液mL)
5.2 液体試料での活性を下記のように算出する:
CMC/mL(またはIU/ml)=(試料の正味の吸光度)(ワーキング標準物質のCMC/mL)(試料の希釈度)(ワーキング標準物質の正味の吸光度)
注記:IU/gまたはIU/ml(国際単位)で報告されているセルラーゼはそれぞれ、CMC/gまたはCMC/mlと等しい。
試験3
Viscomanをベースとする粘度法(Viscoman−based viscosity method)を使用する。この方法は、非常に低いレベルのマンナナーゼ活性、アミラーゼ活性、CMCアーゼ活性およびペクチナーゼ活性の検出に現在使用され得る。(有用な粘度法は、参照により援用される米国特許出願公開第2013/0045498号明細書にも開示されている)。親水コロイドは酵素により切断され、それにより親水コロイド溶液の粘度が低下する。粘度の低下は、H2Oを添加した親水コロイド試料の粘度に対する酵素添加親水コロイド試料の粘度から算出した相対粘度値として示される。従って、この値は常に1〜0であり、1は試料の粘度の低下がないことを意味する。
Mcllvaineのクエン酸リン酸塩:
A)0.1Mクエン酸塩、C6H8O7 21.0g、H2O/脱塩水1L
B)0.2Mリン酸水素二ナトリウム、Na2HPO4 35.6g、2H2O/脱塩水1L。有効期間:3ヶ月
緩衝液pH4.0=A 71.50ml+B 28.50ml(メスシリンダー中)
緩衝液pH6.7=A 25.00ml+B 75.00ml
特定の基質に使用する緩衝液を水で5倍に希釈し、磁石付きホットプレート上でブルーキャップボトル中にて加熱する。親水コロイドを秤量し、緩衝液が泡立つ場合には、希釈されるまで(約30分)激しく撹拌しつつ粉末を振りかける。デンプンの場合、基質の追加時に加熱を止めてボトルの蓋を外し、基質が吹きこぼれるのを避けることが推奨され、全ては塊の形成等を防止するためである。デンプン溶液を除いて、親水コロイド溶液を40℃まで冷却する。デンプンは、レトログラデーションを防止するために、使用するまで50℃で保存しなければならない。
ブランクを含む各試料用の基質5mlをWheatonガラスに移す。この基質溶液5mlに酵素試料または試料の希釈液(水で作製した)100μlを添加して混合する。同体積がブランク試料に適用される限り、試料を最大で500μL添加することができる。試料を20時間にわたり40℃でインキュベートし、次いで試料を氷上に置くことにより反応を停止させる。次いで、Brookfieldを使用する粘度測定のために、試料を10℃で調節する。
酵素副活性スクリーニング
比較するために、試料1と市販のGODO YNL2ラクターゼとでスクリーニングを行なった。試料1は、セルロース、マンナナーゼおよびペクチナーゼが不活性化されていないB.スブチリス(B.subtilis)宿主細胞により産生されたトランスガラクトシル化活性を有する酵素を含むポリペプチド組成物である。このアッセイおよび結果を表2に列挙する。試料1はGODO YNL2ラクターゼと比較してマンナナーゼ活性およびCMCアーゼ活性のレベルが有意に高いことを観測した。
粘度変化をほとんど観測することができなくなるまで試料を希釈することにより、試料1中に存在するセルラーゼおよびマンナナーゼのレベルを評価した。軟化酵素(macerating enzyme)を試験して、発酵中にダイズ培地中で使用する場合に、この軟化酵素が、最終生成物中に存在するマンナナーゼおよびセルラーゼのレベルに影響を及ぼすかどうかを決定した。この軟化酵素は既知のセルラーゼであり、従って、セルラーゼ活性が期待されるであろうことから、この軟化酵素をマンナナーゼ活性に関してのみ試験した。希釈度(表3を参照されたい)は、この軟化酵素でのマンナナーゼ活性の高レベルならびに試料でのマンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の両方の高レベルを示す。軟化酵素中に存在するマンナナーゼ活性のレベルのみで、存在するマンナナーゼレベルを説明することができなかった。なぜならば、軟化酵素のF10.000希釈では相対粘度が1付近であったのに対して、試料1では相対粘度を1付近にするためにはF100.000を超えて希釈する必要があったからである。
B.スブチリス(B.subtilis)宿主株(試料2)からペクチナーゼ、セルラーゼおよびマンナナーゼをノックアウトし、次いで、副活性の存在に関して再試験することを決定した。新たな株を使用した最初の3K発酵(3K fermentation)の試料を分析用に受け取った。3K試料からの結果と試料1を使用した結果とを比較すると、試料2を使用するとペクチナーゼ、セルラーゼおよびマンナナーゼに対する副活性レベルが低いことが明らかであった(表4を参照されたい)。
ヨーグルト用途でのマンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の閾値を決定するために、粘度低下に基づくマンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の定量化用のアッセイを使用した。このアッセイの場合、Biolab A/SのViscomanピペットマンを使用して、各試料の粘度を測定した。
相対粘度に基づいて定量的マンナナーゼアッセイを設定するために、発明者らは、比色マンナナーゼアッセイからの確立されたコントロールおよび標準物質450MU/Kgを使用した。試料1、試料2および軟化酵素のマンナナーゼ活性を測定した。直線を外挿することにより、検出限界は粉末(10mL中で最大1g)の場合には約0.003MU/Kgであり液体の場合には0.0003MU/Kgであることが分かる。
コントロール2222CMCU/gおよび標準物質2306CMCU/gを使用して、相対粘度に基づいて定量的セルラーゼアッセイを設定した。標準物質の相対粘度値をLN(CMCU/g)に対してプロットし、0.242〜0.885の相対粘度内で線形であることを確認した(図4を参照されたい)。直線を外挿することにより、このアッセイの検出限界は液体の場合には約0.002CMCU/gであり粉末の場合には0.02CMCU/gであることが分かる。
ヨーグルト用途のためのセルラーゼ閾値を確立するために、飲用ヨーグルトを、粘度アッセイに使用したセルラーゼコントロールで処理した。飲用ヨーグルト(MILRAM、Kefir Drink、Erdbeere;BB14−02−14)を、各試料に関して2重にしたWheatonグラス中で5mLに等分した。(1000mL中に0.081mL)のストック希釈液を更に4種の新たな試料に10倍に希釈した。各試料100μLおよびブランク試料用のddH2O 100μLを各ヨーグルト5mLに添加した。次いで、試料を4℃または40℃のいずれかで貯蔵した。様々な時点で、速度2でViscomanを使用して粘度を測定した。
ペクチナーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子およびマンナナーゼ遺伝子は宿主株から効率的にノックアウトされている。
GCGCTTAATTAATTATGTTTTTTCTGTGCTTGTTC
>配列番号17 BIF995のためのリバースプライマー
GCGCTTAATTAATTACAGTGCGCCAATTTCATCAATCA
>配列番号18 BIF1068のためのリバースプライマー
GCGCTTAATTAATTATTGAACTCTAATTGTCGCTG
>配列番号19 BIF1241のためのリバースプライマー
GCGCTTAATTAATTATGTCGCTGTTTTCAGTTCAAT
>配列番号20 BIF1326のためのリバースプライマー
GCGCTTAATTAATTAAAATTCTTGTTCTGTGCCCA
>配列番号21 BIF1478のためのリバースプライマー
GCGCTTAATTAATTATCTCAGTCTAATTTCGCTTGCGC
Vrskklwisllfalaliftmafgstssaqa
Claims (44)
- β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている宿主細胞。
- トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている宿主細胞。
- 前記宿主細胞はアミラーゼが欠乏するように改変されている、請求項1または2に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が変異誘発により改変されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が遺伝子操作により改変されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、宿主細胞。
- トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、宿主細胞。
- 更に、アミラーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、請求項6または7に記載の宿主細胞。
- 前記本質的に不活性なセルラーゼポリペプチド、マンナナーゼポリペプチドおよびペクチナーゼポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼポリペプチドが酵素活性に関して機能的に不活性である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドが変異誘発により本質的に不活性にされている、請求項6〜9のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドが遺伝子操作により本質的に不活性にされている、請求項6〜9のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記変異誘発が化学的なまたは物理的な変異誘発である、請求項4もしくは10またはこれらに従属する請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記遺伝子操作が、一段階遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、RNA干渉またはアンチセンスRNAである、請求項5もしくは11またはこれらに従属する請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が細菌である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が乳酸菌である、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がB.スブチリス(B.subtilis)である、請求項14または15に記載の宿主細胞。
- 前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが、
a.配列番号1との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で980個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
b.配列番号2との少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で975個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
c.配列番号3との少なくとも96.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で1300個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
d.i)配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれる核酸配列またはii)i)の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
e.配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
f.配列番号1、2、3、4または5の1個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の宿主細胞。 - 前記宿主細胞が、前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含み、望ましくないセルロース酵素副活性、マンナナーゼ酵素副活性およびペクチナーゼ酵素副活性の量が低減しているポリペプチド組成物を生成する方法であって、前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドならびにペクチナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞を準備すること、ならびに前記セルロース活性、前記マンナナーゼ活性および前記ペクチナーゼ活性を不活性化させることを含む方法。
- アミラーゼ活性を有するポリペプチドを不活性化させることを更に含む請求項20に記載の方法。
- 前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドを変異誘発により本質的に不活性にする、請求項20または21に記載の方法。
- 前記変異誘発が化学的なまたは物理的な変異誘発である、請求項22に記載の方法。
- 前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドを遺伝子操作により本質的に不活性にする、請求項20または21に記載の方法。
- 前記遺伝子操作が、一段階遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、RNA干渉またはアンチセンスRNAである、請求項24に記載の方法。
- 前記宿主細胞が細菌である、請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が乳酸菌である、請求項26に記載の方法。
- 前記宿主細胞がB.スブチリス(B.subtilis)である、請求項25または26に記載の方法。
- 前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが、
a.配列番号1との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で980個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
b.配列番号2との少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で975個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
c.配列番号3との少なくとも96.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で1300個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
d.i)配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれる核酸配列またはii)i)の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
e.配列番号1、2、3、4もしくは5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号9、10、11、12もしくは13に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
f.配列番号1、2、3、4または5の1個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項20〜28のいずれか一項に記載の方法。 - 前記宿主細胞が、β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項20〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞を、β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換する、請求項20〜30のいずれか一項に記載の方法。
- β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現するのに適した条件下にて培養培地中で請求項1〜19のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、ならびに任意選択で、前記培養培地または前記宿主細胞から、前記β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを回収することを含む方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項32に記載の方法を使用して製造されている、β−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド。
- セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しないまたは実質的に有しない請求項33に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド。
- 請求項33または34に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドであって、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下が、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較した請求項1〜19のいずれか一項で定義するβ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有する酵素を添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも0.85もしくは少なくとも0.9またはより低い、ポリペプチド。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項20〜32のいずれか一項に記載の方法を使用して製造されているβ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド組成物。
- セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しないまたは実質的に有しない請求項36に記載のポリペプチド組成物。
- 請求項36または37に記載のポリペプチド組成物であって、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下が、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較した請求項1〜17のいずれか一項で定義するβ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有する酵素を添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも0.85もしくは少なくとも0.9またはより低い、ポリペプチド組成物。
- 請求項33〜35のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物を含む乳製品。
- 乳製品を製造する方法であって、請求項33〜35のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法。
- GOSを含む乳製品を製造する方法であって、請求項33〜35のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項に記載の組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法。
- 乳製品を調製するための、請求項33〜35のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- GOSを含む乳製品を調製するための、請求項33〜35のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および/もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼを発現する宿主細胞から調製されるβ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドの使用と比較した乳製品の粘度および/またはテクスチャの低下を防止するための、請求項42または43に記載の使用。
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