JP2017533696A - ナノ構造のアレイを使用するポリマーの効率的光学分析 - Google Patents
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Abstract
Description
過去10年にわたり開発されてきたDNA配列決定技術は、生物科学に変革をもたらし、例えばLernerら、The Auk、127巻:4〜15頁(2010年);Metzker、Nature Review Genetics、11巻:31〜46頁(2010年);Holtら、Genome Research、18巻:839〜846頁(2008年);そして将来医療行為の多くの態様に変革をもたらす潜在性を有している、例えばVoelkerdingら、Clinical Chemistry、55巻:641〜658頁(2009年);Andersonら、Genes、1巻:38〜69頁(2010年);Freemanら、Genome Research、19巻:1817〜1824頁(2009年);Tuckerら、Am.J.Human Genet.、85巻:142〜154頁(2009年)。しかし、そのような潜在性を実現するには、1ラン当たりの配列決定コストの削減、試料調製の単純化、ランタイムの短縮、配列読取り長の増大、およびデータ解析の改善などを含む、対処しなければならない多くの課題が依然として存在し、例えば、Baker、Nature Methods、7巻:495〜498頁(2010年);Kircherら、Bioessays、32巻:524〜536頁(2010年);Turnerら、Annual Review of Genomics and Human Genetics、10巻:263〜284頁(2009年)。ナノポアアレイなどのナノ作製アレイ上での単一分子配列決定は、これらの課題のいくつかに対処することができ、例えば、Maitraら、Electrophoresis、33巻:3418〜3428頁(2012年);Venkatesanら、Nature Nanotechnology、6巻:615〜624頁(2011年);しかしこれらの手法には、それ自体の一連の技術的難題、例えば信頼性あるナノ構造製作、ナノポアを通るDNA移行速度の制御、ヌクレオチド識別、およびナノポアセンサーのラージアレイからの電気シグナルの検出などがある、例えば、Brantonら、Nature Biotechnology、26巻(10号):1146〜1153頁(2008年);Venkatesanら(前掲)。
上記に鑑み、光学に基づくナノポア配列決定および/またはゼロモード導波路配列決定などの、一般的かつその特定の適用例におけるナノポアセンサー技術にとって、検出分解能限界によって課された限界を改善するための方法が利用可能であれば有利と考えられる。
本発明は、ナノポアまたはナノウェルなどのナノ構造の高密度アレイを使用して、ポリヌクレオチドなどのポリマーの効率的な光学検出および分析をするための、デバイスおよび方法を対象とする。
一部の実施形態では、本発明は、アレイ上での並列反応から光学シグナルの配列を検出するための、方法および装置を対象とし、本発明の装置は、以下の要素:(a)それぞれが反応部位を含み、かつそれぞれが光学シグナルの配列を発生させる反応を限定することが可能な、ナノ構造のアレイであって、アレイのナノ構造は、それぞれが所定の数のナノ構造を含むクラスターに配置されており、ナノ構造の異なるクラスターのそれぞれは異なる分解能限界区域内に配置されている、ナノ構造のアレイと;(b)反応から光学シグナルを検出するためにアレイに動作可能に関連付けられた光学システムとを含む。一部の実施形態では、各クラスター内のナノ構造の数は、1よりも大きいか、またはゼロよりも大きい平均値を有するランダムな変数である。先の実施形態のいくつかにおいて、分析されるポリマーはポリヌクレオチドを含み、そのようなポリヌクレオチドは、「シス」チャンバーから「トランス」チャンバーに、電気泳動によってナノポアを通って移行される。
本発明は、様々な修正および代替形態を受け得るが、それらの詳細を図面に例として示しており、これより詳細に記述する。しかし、本発明を、記述される特定の実施形態に限定しようとするものではないことを理解すべきである。それどころか、本発明の精神および範囲内に入る全ての修正例、均等物、および代替例を包含するものである。例えば、本発明の特定のナノポアのタイプおよび数、特定の標識、FRET対、検出スキーム、製作手法は、例示の目的で示される。しかし本開示は、その他のタイプのナノポア、ナノポアのアレイ、およびその他の製作技術を利用して本明細書で論ずるシステムの様々な態様を実現することができるので、この点に限定するものではないことを理解すべきである。本発明の態様に関する指針は、その関連ある部分が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004);Levinson,Principles of Lithography,Second Edition(SPIE Press,2005);Doering and Nishi, Editors,Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology,Second Edition(CRC Press,2007);Sawyer et al,Electrochemistry for Chemists,2nd edition(Wiley Interscience,1995);Bard and Faulkner,Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications,2nd edition(Wiley,2000);Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy,3rd edition(Springer,2006);Hermanson,Bioconjugate Techniques,Second Edition(Academic Press,2008);などを含む、当業者に周知の多くの入手可能な参考文献および論文に見出される。
u=αt/(w+t)
この式は、uが、αもしくはtを増大させることによって、またはwを低減させることによって、増大できることを示唆する。例えば、αは、ナノポアアレイの製造を改善することによって増大させることができ、tは、分析されるポリマーの長さを延ばすことによって増大させることができ、wは、ナノポアアレイを横断するポリマーの流束を増大させることによって、例えば、DNAの場合には、ポリマーの濃度を増加させることによって、かつ/またはポリマー推進力、例えば、アレイを横切る電位を増大させることによって、低減させることができる。上述のように、ナノポアアレイの効率を増大させるこれらの手法は限られており、それはこれらの手法が大量の数または密度の活性ナノポアがもたらし得るとはいえ、2つまたはそれ超のナノポアが分解能限界区域内にあるときにはいつでも、得られるシグナルが有用な情報を提供しないからである。したがって、一態様では、本発明の方法は、分解能の限界によって課された拘束に鑑み、有用な情報を提供するナノポアの数を最大にするuの値を提供する。一態様では、有用な配列情報を提供することが可能なナノポアは、本明細書では「配列決定可能なナノポア」と呼ばれる分解能限界区域内の活性ナノポアのみである。即ち、配列決定可能なナノポアは、同時に同じ分解能限界区域内にその他の活性ナノポアを持たないものである。四角形のアレイとして間隔を空けて配置されたナノポアの場合、配列決定可能なナノポアの数は、下記の通り推定され得る。
ナノポアおよびナノポア配列決定
ナノポアおよび分析物に関する標識
移行速度
本発明は、ポリマー分析物のモノマーを逐次識別するための、ナノポアおよび蛍光消光の使用に関する。ポリマー分析物のそのような分析は、単一のポリマー分析物で、または複数のポリマー分析物で同時に並行して実施されてもよい。一部の実施形態では、モノマーは、標的ポリマーに取着しながら少なくとも3つの状態が可能な蛍光標識で標識される:(i)取着した蛍光標識の蛍光が、すぐ隣りに隣接するモノマー上の蛍光標識によって消光される、消光状態;例えば、本発明によるポリマーに取着された蛍光標識は、標識されたポリマーが水溶液中で遊離したときに消光される。(ii)自由溶液の動き、または取着された蛍光標識のアライメントが崩壊し、または限定されることにより蛍光標識から発生した検出可能なシグナルがほとんどまたは全くないように、標識されたポリマーがナノポアを移行する、立体的に拘束された状態。(iii)ポリマーがナノポアを移行しながら、蛍光標識がナノポアから出て行くときに(「遷移インターバル」の間)、ポリマーに取着された蛍光標識が、立体的に拘束された状態から消光状態へと遷移する遷移状態。一部では、本発明は、遷移インターバル中に、通常は蛍光標識が検出可能な蛍光シグナルを発生することが可能であるという発見の適用である。この発見を裏付けるいかなる理論にも限定するものではないが、遷移インターバルの間に発生した蛍光シグナルは、自由に回転可能な双極子起因すると考えられる。立体的拘束された状態ならびに消光状態では、共に、双極子はその回転自由度が限定され、それによって、放出される光子の数が低減しまたは限定される。一部の実施形態では、ポリマーがポリヌクレオチドであり、通常は一本鎖ポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAであるが、特にDNAである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを移行するときに、取着された蛍光標識が1つずつナノポアから出て行くとき、その蛍光標識により発生したシグナルを記録することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。出る際に、取着された蛍光標識のそれぞれは、ナノポアにおける拘束状態から、自由溶液中のポリヌクレオチドでの消光状態へと、遷移インターバルの間に遷移する。上述のように、この遷移インターバルまたは期間の間に、蛍光標識は、それが取着されるヌクレオチドを示す、検出可能な蛍光シグナルを放出することが可能である。
配列分析のためのゼロモード導波路のアレイ
ゼロモード導波路のアレイは、対応する光学シグナルの配列を発生させる反応のシーケンスをそれぞれが受ける単一分子の集団を、並行して分析するために開発されており、例えば、Leveneら、Science、299巻:682〜686頁(2003年);Korlachら、Proc.Natl.Acad.Sci.、105巻(4号):1176〜1181頁(2008年)がある。この手法は、高スループットDNA配列決定機器を開発するのに適用されており、Eidら、Science、323巻:133〜138頁(2009年)がある。そのような適用例は、参照により本明細書に組み込まれる以下の米国特許:第7,302,146号;第7,476,503号;第7,906,284号;および第8,709,725号などに、さらに開示されている。典型的には、これらの適用例で使用されるゼロモード導波路のアレイでは、導波路は、隣接する導波路からの光学シグナルを光学的に区別することができ、かつ収集されたシグナルの値に実質的に影響を及ぼさないような、十分大きい導波路間距離で、規則的に間隔を空けて配置される。そのような間隔は、通常、光学シグナルを含む光の波長よりも大きく、したがって、ナノポアアレイに関して既に記述されたように、特徴の近接した配置に関するナノ工学技法の全能力は用いられない。したがって、そのような方法の効率は、本発明によるクラスターのアレイを用いることによって改善することができる。
一部の実施形態では、複数の反応試料を用いる多数の化学反応を行うための改善された方法は、以下のステップ:(a)ナノウェルのアレイを提供するステップと;(b)標識された反応物を含む複数の反応試料を、アレイのナノウェル内に配置するステップであって、個別の反応試料はアレイの異なるナノウェル内に配置されるステップと;(c)アレイを、化学反応の生成物の形成に適した条件に供するステップと;(d)生成物に動作可能に関連付けられた光学システムで、生成物の形成を検出するステップとで行ってもよく、アレイのナノウェルは、ナノウェルの異なるクラスターのそれぞれが異なる分解能限界区域内に配置されるようにかつ各クラスターのナノウェルの平均数がゼロよりも大きいように、クラスターに配置されている。一部の実施形態では、アレイのナノウェルはそれぞれ、米国特許第7,302,146号に記載されるように、光閉じ込め部および/またはゼロモード導波路を含む。
一部の実施形態では、複数の標的核酸分子を配列決定する改善された方法は、以下のステップ:(a)ナノウェルのアレイを提供するステップであって、アレイのナノウェルは、ナノウェルの異なるクラスターのそれぞれが異なる分解能限界区域内に配置されるように、かつ各クラスターのナノウェルの平均数がゼロよりも大きいように、クラスターに配置され、各ナノウェルは、個々の分子の観察を可能にする有効観察体積を提供し;光学システムは、ナノウェルに動作可能にカップリングされて、ナノウェルの有効観察体積からシグナルを検出するステップと;(b)ナノウェル内で、複数の標的核酸分子、標的核酸分子に相補的なプライマー、重合酵素、および複数新生ヌクレオチド鎖中に取り込まれるべき1つ以上のタイプのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、混合するステップであって、各鎖がそれぞれの標的核酸分子と相補的であるステップと;(c)ステップ(b)の混合物を、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の鋳型指向性重合により、新生ヌクレオチド鎖の形成に適した条件下で重合反応に供するステップと;(d)ナノウェルを、入射光線で照明するステップと;(e)各新生ヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を識別するステップとによって行ってもよい。上記のように、一部の実施形態では、アレイのナノウェルはそれぞれ、米国特許第7,302,146号に記載されるように、光閉じ込め部および/またはゼロモード導波路を含む。
ナノ構造のアレイに言及する際の「クラスター」は、ナノ構造の複数の群または収集物の分布を意味し、各群はアレイの個別の区域を占有し、群内のナノ構造間距離は、群間のナノ構造間距離よりも非常に小さい。一部の実施形態では、そのような分布は実質的に平面状であり;即ち、ナノ構造が表面に対して間隔を空けて配置される場合、そのような表面の曲率はクラスターの近傍で小さい。一部の実施形態では、ナノ構造のクラスターは、異なるクラスターのナノ構造が異なる分解能限界区域内にあるように、分解能限界区域により包含される。クラスター内のナノ構造の数は、広く様々であってもよい。一部の実施形態では、ナノ構造アレイは、アレイの各クラスター内で、所定の数のナノ構造で製作されてもよい。例えば、アレイのクラスターはそれぞれ、複数のナノ構造を有していてもよく;他の実施形態では、アレイのクラスターはそれぞれ、1から100個のナノ構造を有していてもよく;他の実施形態では、クラスターはそれぞれ、2から50個のナノ構造を有していてもよく;他の実施形態では、クラスターは2から16個のナノ構造を有していてもよい。一部の実施形態では、アレイの各クラスターは、同じ数のナノ構造を有していてもよい。他の実施形態では、クラスター内のナノ構造の数は、平均の、または予測される数およびおそらくはその分散がアレイ内のクラスターを特徴付けるように、ランダムな変数であってもよい。一部の実施形態では、ナノ構造のクラスターはナノポアのクラスターであり;他の実施形態では、ナノ構造のクラスターは、ゼロモード導波路であるナノウェルを含むがこれらに限定されないナノウェルのクラスターである。一部の実施形態では、例えばナノ構造がタンパク質ナノポアを含む場合、クラスター内のナノポアの数を表すランダムな変数は、その平均値が、アパーチャーのアレイを装荷するのに使用される溶液中のタンパク質ナノポアの濃度に依存する、Poissonランダム変数であってもよい。
Claims (20)
- モノマーの配列に取着された光学標識をそれぞれが有するポリマーを分析するためのデバイスであって、
第1のチャンバーおよび第2のチャンバーを分離するナノポアアレイであって、前記ナノポアアレイのナノポアがそれぞれ前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバーを接続し、ナノポアの異なるクラスターのそれぞれが異なる分解能限界区域内に配置されるようにクラスターに配置されている、ナノポアアレイと、
前記ナノポアアレイの前記ナノポアを通して、前記第2のチャンバーに前記第1のチャンバー内でポリマーを移動させるための、ポリマー移行システムと、
光学標識が分解能限界区域内でナノポアから出て行くときにはいつでも、ポリマーに取着された光学標識によって発生した光学シグナルを収集するための、検出システムとを含むデバイス。 - 前記クラスターが、直線的なアレイにまたは六角形のアレイに配置構成される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記クラスターのそれぞれが複数のナノポアを含み、または前記クラスターのそれぞれが、ゼロよりも大きい平均値を有するランダムな変数で所定の数のナノポアを含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記ポリマーがポリヌクレオチドであり、前記検出システムが、前記収集された光学シグナルから前記分解能限界区域のそれぞれの内部の機能的ナノポアの数を決定し、前記ナノポアアレイを横切る電場を変化させて、前記ナノポアアレイによる配列決定速度を最大にする、請求項1に記載のデバイス。
- 光学標識の配列をそれぞれが有するポリマーを分析する方法であって、
各ナノポアが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通を提供することが可能なボアを有する、ナノポアアレイであって、複数のナノポアを含有する少なくとも1つの分解能限界区域を有するナノポアアレイを提供するステップと、
前記ナノポアアレイのナノポアを通ってポリマーを移行させるステップと、
所定の間隔の間に、前記分解能限界区域のそれぞれで、ナノポアを通って移行するポリマーから光学シグナルを収集し積分して、前記分解能限界区域のそれぞれに関する積分シグナルを得るステップと、
前記分解能限界区域のそれぞれの内部で、その積分シグナルの相対レベルによって機能的ナノポアの数を決定するステップとを含む方法。 - 前記ナノポアアレイの配列決定スループットが最大になるように、ポリマー濃度および/またはポリマー流束を選択するステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリヌクレオチドであり、選択する前記ステップが、前記ナノポアアレイを横切る電場強度を変化させることによって配列決定スループットを最大にするように前記ポリマー流束を調節することを含む、請求項6に記載の方法。
- 光学標識の配列をそれぞれが有するポリマーを分析するためのデバイスであって、
第1のチャンバーおよび第2のチャンバーを分離する固相膜であって、前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバーをそれぞれが接続するアパーチャーのアレイを有し、前記アレイの前記アパーチャーは、複数のアパーチャーをそれぞれが有するクラスターに配置されており、異なるクラスターのそれぞれは、異なる分解能限界区域内に配置されている固相膜と、
前記アパーチャーに固定化されたタンパク質ナノポアであって、活性部分の固定化されたタンパク質のそれぞれが、ポリマーを前記第1のチャンバーからボアを通して前記第2のチャンバーに移行させることが可能である前記活性部分を有する固定化されたタンパク質ナノポアと、
光学標識が、分解能限界区域内でタンパク質ナノポアのボアから出て行くときにはいつでも、光学標識により発生した光学シグナルを収集するための検出システムとを含むデバイス。 - 前記ポリマーがポリヌクレオチドを含み、前記検出システムが、前記収集された光学シグナルから、前記分解能限界区域のそれぞれの内部で機能的ナノポアの数を決定し、前記ナノポアアレイを横切る電場を変化させて、前記ナノポアアレイにより光学標識の前記配列を決定する速度を最大にする、請求項8に記載のデバイス。
- 光学標識の配列をそれぞれが有するポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
(a)所定の濃度および流束でナノポアアレイを通って一本鎖ポリヌクレオチドを移行させるステップであって、各一本鎖ポリヌクレオチドの実質的に全てのヌクレオチドは、光学標識が取着されるヌクレオチドを示す光学シグナルを発生させることが可能な光学標識で標識されており、前記ナノポアアレイはナノポアのクラスターを含み、各クラスターは所定の数のナノポアを含み、異なるクラスターのそれぞれは異なる分解能限界区域内に配置され、各クラスター内のナノポアの前記数は、1よりも大きいか、またはゼロよりも大きい平均値を有するランダムな変数であるステップと、
(b)各ヌクレオチドの前記光学標識を、ナノポアから出る際に励起放射線に曝露するステップと、
(c)前記ナノポアアレイ上の各分解能限界領域で、ナノポアから出て行く光学標識により発生した光学シグナルを測定して、そのような光学シグナルが単一光学標識からのものであるときにはいつでも、前記光学標識が取着されるヌクレオチドを識別するステップと、
(d)単一光学標識からの光学シグナルの配列から前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む方法。 - 前記ナノポアアレイを通る前記ポリヌクレオチドの濃度および/または前記ポリヌクレオチドの流束が、前記アレイ内の配列決定可能なナノポアを最大にするように調節される、請求項10に記載の方法。
- 前記一本鎖ポリヌクレオチドの前記流束が、前記ナノポアアレイを横切る電位を制御することによって、前記アレイ内の配列決定可能なナノポアの数を最大にするように制御される、請求項10に記載の方法。
- アレイ上での並列反応から、光学シグナルの配列を検出するための装置であって、
反応部位をそれぞれが含み、かつ光学シグナルの配列を発生させる反応を制限することがそれぞれ可能なナノ構造のアレイであって、前記アレイの前記ナノ構造は、所定の数のナノ構造をそれぞれが含むクラスターに配置され、ナノ構造の異なるクラスターのそれぞれは、異なる分解能限界区域内に配置されている、ナノ構造のアレイと、
前記反応から光学シグナルを検出するために前記アレイに動作可能に関連付けられた光学システムとを含む装置。 - 前記ナノ構造が、ナノポア、ナノウェル、およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項13に記載の装置。
- 前記クラスターのそれぞれでのナノ構造の前記数が、1よりも大きいか、またはゼロよりも大きい平均値を有するランダムな変数である、請求項14に記載の装置。
- 前記ナノ構造がナノポアであり、前記アレイが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとを分離する固相膜であって、前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバーをそれぞれが接続しておりかつクラスター内にそれぞれが配置されている複数のアパーチャーを有する固相膜と、前記アパーチャー内に固定化されたタンパク質ナノポアであって、活性部分の各固定化されたタンパク質が、ポリマーを前記第1のチャンバーからボアを通して前記第2のチャンバーへと移行させることが可能である前記活性部分を有する固定化されたタンパク質ナノポアと、を含む、請求項15に記載の装置。
- 前記タンパク質ナノポアでの前記反応が、FRET対のドナーとアクセプターとの間のFRET相互作用であり、各アクセプターは前記ポリマーのモノマーに取着され、各アクセプターは、前記アクセプターが取着される前記モノマーを示す光学シグナルを発生させることが可能である、請求項16に記載の装置。
- 前記ナノ構造がナノポアであり、前記アレイが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとを分離する固相膜を含み、前記固相膜が、前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバーをそれぞれが接続しており、かつ脂質二重層がそれぞれに跨っている複数のアパーチャーを有し、前記脂質二重層は、各クラスター内のタンパク質ナノポアの前記数が、ゼロよりも大きい前記平均値を有する前記ランダムな変数であるように、その内部にタンパク質ナノポアが配置されて前記クラスターを形成する、請求項15に記載の装置。
- 前記タンパク質ナノポアでの前記反応が、FRET対のドナーとアクセプターとの間のFRET相互作用であり、各ドナーはタンパク質ナノポアに取着され、各アクセプターは前記ポリマーのモノマーに取着され、各アクセプターは、前記アクセプターが取着される前記モノマーを示す光学シグナルを発生させることが可能である、請求項18に記載の装置。
- 前記ナノ構造が、ゼロモード導波路をそれぞれが含むナノウェルである、請求項15に記載の装置。
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