JP2017532983A - 帯状疱疹予防及び治療用ｄｎａワクチン組成物並びにこれを利用したｖｚｖ抗原に対するｔ細胞活性化方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含む少なくとも一種のプラスミド、及び薬剤学的に許容できる別の成分を含む帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物を提供する。前記プラスミドは、相異なる異種の遺伝子挿入部位を含む複数のプラスミドを含む。前記プラスミドは、ＩＥ−６２タンパク質（配列目録１）をコーディングする第１遺伝子の挿入部位を含む第１プラスミド、ＩＥ−６３タンパク質（配列目録２）をコーディングする第２遺伝子の挿入部位を含む第２プラスミド、及びｇＥタンパク質（配列目録３）をコーディングする第３遺伝子の挿入部位を含む第３プラスミドを含む。
Description
本発明は、ワクチン分野の技術に係り、より具体的には、生産性、安定性及びＴ細胞に対する免疫反応性が優秀で、多様な疾患形態に適用可能な帯状疱疹予防及び治療用ワクチンに関する技術である。
一般的に、帯状疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｚｏｓｔｅｒ）は水痘−帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）が神経節（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ）で潜伏していて、免疫が弱くなればＶＺＶの再活性化が誘発されて現われる肌の発疹疾患である。帯状疱疹が発病すれば水疱性病変が現われ、回復しても神経性痛み（ｐｏｓｔｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒａｌｇｉａ）の後遺症が残り、神経性痛みは一度発生すると完治し難くて、患者は激痛を経験することになる。ＶＺＶの再活性化及び帯状疱疹の発病は、Ｔ細胞を中心にした細胞免疫反応の弱化と係り、特に、高齢者や免疫抑制治療を受けるヒトによく表れる疾患である。
帯状疱疹が発生すれば抗ウイルス剤で治療するが、これの目的は、基本的に発疹が始まってから７２時間以内に投与して発疹がそれ以上別の部位へ拡散されないようにし、帯状疱疹後に合併症を減らすか緩和することである。高齢者及び免疫抑制患者が増えることにつれ、国内での帯状疱疹の発病率は急速に増加しているが、根源的な治療法がないため、予防ワクチンの重要性が非常に大きい疾患とされている。
現在、市販される帯状疱疹予防ワクチンは、臨床試験でその効能を認められてはいるが、予防ワクチンの投与による帯状疱疹の発生減少率は５０％にとどまっていて、優れた効能を有する新しい帯状疱疹ワクチンの開発が必要な実情である。そして、現在市販される帯状疱疹予防ワクチンは、弱毒化された生ワクチンであるため、帯状疱疹の発病率が高い免疫抑制患者には使えない逆説的な状況に置かれている。これにより、免疫抑制患者にも安全に投与できる新しい帯状疱疹ワクチンの開発が切実に求められている。
本発明の目的は、前述のような従来技術の問題点を解決し、現実的要求を考慮した発明であって、多様な疾患の患者に適用可能であり、安定性が画期的に改善された帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、前記帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物を体内に効果的に投与して、ＶＺＶ抗原に対するＴ細胞の活性化方法を提供することである。
本発明の一実施例による帯状疱疹予防及び治療用プラスミドＤＮＡは帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含み、電気穿孔方式によって体内に直接投与され、ＶＺＶ抗原に対するＴ細胞の免疫活性を誘導する。
前記電気穿孔のための電気穿孔機としては、イノビオ（ｉｎｏｖｉｏ）社の電気穿孔機（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ＜登録商標＞）を使うことができる。
前記遺伝子は、ＩＥ−６２タンパク質（配列目録１）をコーディングする第１遺伝子、ＩＥ−６３タンパク質（配列目録２）をコーディングする第２遺伝子、及びｇＥタンパク質（配列目録３）をコーディングする第３遺伝子のいずれか一つであってもよい。
前記遺伝子は、ＩＥ−６２タンパク質（配列目録１）をコーディングする第１遺伝子、ＩＥ−６３タンパク質（配列目録２）をコーディングする第２遺伝子、及びｇＥタンパク質（配列目録３）をコーディングする第３遺伝子のいずれか一つであってもよい。
前記プラスミドは、具体的に配列目録４のプラスミドＤＮＡ、配列目録５のプラスミドＤＮＡ及び配列目録６のプラスミドＤＮＡのいずれか一つであってもよい。
本発明の一実施例による帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物は、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含む少なくとも一種のプラスミド、並びに薬剤学的に許容できる別の成分を含んでもよい。前記別の成分としては、例えば食塩水などの水を飲むことができる。
本発明の一実施例による帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物は、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含む少なくとも一種のプラスミド、並びに薬剤学的に許容できる別の成分を含んでもよい。前記別の成分としては、例えば食塩水などの水を飲むことができる。
前記ＤＮＡワクチンをなす前記プラスミドとしては、相異なる異種の遺伝子挿入部位を含む複数のプラスミドを含んでもよい。例えば、前記プラスミドとしてはＶＺＶのタンパク質を符号化する相異なる遺伝子部位を含む複数のプラスミドが使われてもよい。
前記ＤＮＡワクチン組成物に含まれるプラスミドとしては、ＩＥ−６２タンパク質（配列目録１）をコーディングする第１遺伝子の挿入部位を含む第１プラスミド、ＩＥ−６３タンパク質（配列目録２）をコーディングする第２遺伝子の挿入部位を含む第２プラスミド、及びｇＥタンパク質（配列目録３）をコーディングする第３遺伝子の挿入部位を含む第３プラスミドなどの３種のプラスミドが使われる。前記各プラスミドの組成物内の含量は、疾患形態、投与対象者の年齢などを考慮して多様に調節することができる。
本発明の一実施例によるＶＺＶ抗原に対するＴ細胞活性化方法は、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含むプラスミドを準備する段階、及び前記プラスミドを電気穿孔方式によって体内に投与する段階を含む。一方、前記プラスミドは大量生産システムによって量産されてもよい。
本発明による帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンは、プラスミドの直接投与によるワクチンなので、弱毒化された生ワクチンが持つ安全性の問題を起こさない。また、プラスミドの大量生産が容易であり、ワクチンの流通過程における安定性を画期的に改善することができる。前記ＤＮＡワクチンは、電気穿孔方式によって体内に投与されるので、一般的な注射剤と比べて、革新的な体内伝達効率を表す。一方、前記帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンは、予防だけではなく治療目的として使用可能であり、多様な疾患を持つ患者及び多様な年齢帯の患者に対して適切に使うことができる。前記帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンは、プラスミドの遺伝子挿入部位が相異なる複数のプラスミドの多様な組み合わせによって、ヒトに合わせるワクチンを設計することができる長所を持つ。
以下、帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンについて詳しく説明する。
本発明による帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンは、ウイルス基盤の生ワクチンではなく、ＤＮＡ自体を体内に投与するＤＮＡ基盤のワクチンであって、ＶＺＶ抗原に対するＴ細胞免疫活性を誘導するために体内に投与されるプラスミド形態のＤＮＡ自体がワクチンとして機能する。
本発明による帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンは、ウイルス基盤の生ワクチンではなく、ＤＮＡ自体を体内に投与するＤＮＡ基盤のワクチンであって、ＶＺＶ抗原に対するＴ細胞免疫活性を誘導するために体内に投与されるプラスミド形態のＤＮＡ自体がワクチンとして機能する。
前記ＤＮＡワクチンは、ＶＺＶ由来の抗原タンパク質を符号化し、窮極的には体内で抗原タンパク質を形成する役割をする。ＶＺＶ由来のタンパク質は、求められるＤＮＡワクチンの特性を考慮して選定されることが望ましいし、前記タンパク質は単独または複数種の組み合わせによって選定されてもよい。
本発明の一実施例によると、前記タンパク質としては細胞免疫反応を誘導できるタンパク質のＩＥ−６２（配列目録１）、ＩＥ−６３（配列目録２）、糖タンパク質のｇＥ（配列目録３）遺伝子が挙げられ、前記プラスミドはこのようなタンパク質を符号化する遺伝子が挿入されるように設計される。
前記プラスミドＤＮＡは、液状に混合して体内に投与されるが、本発明のプラスミドＤＮＡは電気穿孔方式によって体内に高効率で投入できるように設計され、このような電気穿孔方式によって体内への伝達効率を極大化することができるし、窮極的に治療効能を極大化することができる。電気穿孔方式による体内投与部位は、筋肉部位など特に制限されないが、投与対象者の年齢、疾患タイプ、並行疾患など多様な要素を考慮して決まる。電気穿孔方式を具現する電気穿孔装備としては、例えば、イノビオ（イノビオ）社の電気穿孔機（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ＜登録商標＞）を使うことができる。
それぞれ、前記ＩＥ−６２、ＩＥ−６３及びｇＥタンパク質を符号化して発現させることができる遺伝子の第１遺伝子、第２遺伝子及び第３遺伝子は、通常の方法によりプラスミドに搭載される。但し、効果及び投与効率を極大化するため、本実施例ではそれぞれ配列目録４、配列目録５及び配列目録６のプラスミドを設計することで、ＤＮＡワクチンの効率を極大化することができる。前記それぞれのプラスミドは単独で使われてもよいが、相異なる２種以上のプラスミドの組み合わせの形でＤＮＡワクチンに含まれることが望ましい。例えば、本発明の一実施例では、前記三つのプラスミドを全て含むＤＮＡワクチンを考慮することができる。一方、本実施例で明示していない別の種類のプラスミドを新たに導入することができることは勿論である。
前記プラスミドは、注射剤などを通して体内に投与されることができ、伝達効率及び免疫反応効率のため、前記プラスミドは高濃度及び高純度で用意しなければならない。また、商業的観点で大量生産の容易性を確保しなければならない。本発明の一実施例によるプラスミドは、現在このような高濃度及び高純度の大量生産の基盤を確保した状態である。
本発明の一実施例による帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチンは、前述の少なくとも１種のプラスミドＤＮＡを含む液状、つまり、注射剤のワクチンであって、プラスミドＤＮＡ及び液状成分を含む。前記液状成分は純粋な水であってもよい。本発明の一実施例によるＤＮＡワクチン組成物は、水の他に薬剤学的に許容できる機能性添加剤をさらに含んでもよく、このような添加剤は慣用技術の水準で導入することができる。
前記ＤＮＡワクチンの組成物は、例えば、前述した３種のプラスミドを全て含んでもよい。
以下では、具体的な実験の内容に基づいて本発明の一実施例によるプラスミドＤＮＡの有効性を説明する。
以下では、具体的な実験の内容に基づいて本発明の一実施例によるプラスミドＤＮＡの有効性を説明する。
[実験１] 免疫原性評価
ＤＮＡワクチンに利用するＶＺＶ遺伝子候補選定
ＶＺＶゲノムでタンパク質を符号化する６７種の遺伝子の中で細胞免疫反応を誘導できるタンパク質ＩＥ−６２、ＩＥ−６３及び糖タンパク質のｇＥ遺伝子を候補として選定した。ＶＺＶゲノムの種類は、総５種のクレード（ｃｌａｄｅ）に分けられるし、クレード間のＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥアミノ酸配列にはさほど差がない。以上のＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ遺伝子配列でプラスミドを製造した。前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列目録１ないし３に表示されたものと同じであり、製造されたプラスミドのＤＮＡ配列は、配列目録４ないし６と同じである。本実施例におけるＤＮＡワクチンには、プラスミド及び液状成分としての水以外は別の成分が含まれていない。
ＤＮＡワクチンに利用するＶＺＶ遺伝子候補選定
ＶＺＶゲノムでタンパク質を符号化する６７種の遺伝子の中で細胞免疫反応を誘導できるタンパク質ＩＥ−６２、ＩＥ−６３及び糖タンパク質のｇＥ遺伝子を候補として選定した。ＶＺＶゲノムの種類は、総５種のクレード（ｃｌａｄｅ）に分けられるし、クレード間のＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥアミノ酸配列にはさほど差がない。以上のＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ遺伝子配列でプラスミドを製造した。前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列目録１ないし３に表示されたものと同じであり、製造されたプラスミドのＤＮＡ配列は、配列目録４ないし６と同じである。本実施例におけるＤＮＡワクチンには、プラスミド及び液状成分としての水以外は別の成分が含まれていない。
マウス実験
ＩＥ−６２、ＩＥ−６３及びｇＥ遺伝子をＤＮＡワクチン候補物質として製造し、Ｃ５７ＢＬ/６マウスに投与し、脾臓細胞を分離してＶＺＶ抗原に対するＴ細胞免疫原性を評価した。試験を行った群は総５群で、各群当たり５匹を次のような組み合わせで構成した。
１）Ｎｅｇ：ベクトルで接種した群（ｎ＝５）
２）ＩＥ６２：ＩＥ−６２ＤＮＡワクチンで接種した群（ｎ＝５）
３）ＩＥ６３：ＩＥ−６３ＤＮＡワクチンで接種した群（ｎ＝５）
４）ｇＥ：ｇＥ ＤＮＡワクチンで接種した群（ｎ＝５）
５）ＩＥ６２+ＩＥ６３+ｇＥ：ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ ＤＮＡワクチンを混合して接種した群
電気穿孔機であるＣＥＬＬＥＣＴＲＡ＜登録商標＞（イノビオ社製）を利用して２週間おきに３回接種し、毎接種時のＤＮＡ量は１匹当たり３０μgで、混合した群はＤＮＡ当たり３０μgずつ総９０μgを毎回接種した。接種を完了した１２日後、脾臓細胞を分離して免疫評価を行った。接種スケジュールは図１に図示されたとおりである。図１は本発明の一実施例による接種スケジュールを示すための図面である。
ＩＥ−６２、ＩＥ−６３及びｇＥ遺伝子をＤＮＡワクチン候補物質として製造し、Ｃ５７ＢＬ/６マウスに投与し、脾臓細胞を分離してＶＺＶ抗原に対するＴ細胞免疫原性を評価した。試験を行った群は総５群で、各群当たり５匹を次のような組み合わせで構成した。
１）Ｎｅｇ：ベクトルで接種した群（ｎ＝５）
２）ＩＥ６２：ＩＥ−６２ＤＮＡワクチンで接種した群（ｎ＝５）
３）ＩＥ６３：ＩＥ−６３ＤＮＡワクチンで接種した群（ｎ＝５）
４）ｇＥ：ｇＥ ＤＮＡワクチンで接種した群（ｎ＝５）
５）ＩＥ６２+ＩＥ６３+ｇＥ：ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ ＤＮＡワクチンを混合して接種した群
電気穿孔機であるＣＥＬＬＥＣＴＲＡ＜登録商標＞（イノビオ社製）を利用して２週間おきに３回接種し、毎接種時のＤＮＡ量は１匹当たり３０μgで、混合した群はＤＮＡ当たり３０μgずつ総９０μgを毎回接種した。接種を完了した１２日後、脾臓細胞を分離して免疫評価を行った。接種スケジュールは図１に図示されたとおりである。図１は本発明の一実施例による接種スケジュールを示すための図面である。
試験用抗原の製造
候補遺伝子がコーディングするタンパク質に対する全体免疫反応を体系的に測定するため、重複ペプチド（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＯＬＰｓ）シリーズを考案して製造した。各々の重複ペプチドは１５個のアミノ酸で構成され、隣り合うペプチドと１０アミノ酸が重複するように考案した。ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥタンパク質の全体アミノ酸配列を含むように重複ペプチドを考案した。２６１個のＩＥ−６２重複ペプチド、５４個のＩＥ−６３重複ペプチド、１２４個のｇＥ重複ペプチドを製造した。連続した３７個または３８個のＩＥ−６２重複ペプチドを混合して総７種のペプチド混合物を作って使用した。連続した２７個のＩＥ−６３重複ペプチドを混合して総２種のペプチド混合物を作って使用した。連続した４０個または４１個のｇＥ重複ペプチドを混合して総３種のペプチド混合物を作って使用した。陰性対照群として５％ＤＭＳＯを使用し、陽性対照群としてＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ）イオノマイシンを混合して使用した。重複ペプチドの混合で作ったペプチド混合物を以下の表１に示す。
候補遺伝子がコーディングするタンパク質に対する全体免疫反応を体系的に測定するため、重複ペプチド（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＯＬＰｓ）シリーズを考案して製造した。各々の重複ペプチドは１５個のアミノ酸で構成され、隣り合うペプチドと１０アミノ酸が重複するように考案した。ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥタンパク質の全体アミノ酸配列を含むように重複ペプチドを考案した。２６１個のＩＥ−６２重複ペプチド、５４個のＩＥ−６３重複ペプチド、１２４個のｇＥ重複ペプチドを製造した。連続した３７個または３８個のＩＥ−６２重複ペプチドを混合して総７種のペプチド混合物を作って使用した。連続した２７個のＩＥ−６３重複ペプチドを混合して総２種のペプチド混合物を作って使用した。連続した４０個または４１個のｇＥ重複ペプチドを混合して総３種のペプチド混合物を作って使用した。陰性対照群として５％ＤＭＳＯを使用し、陽性対照群としてＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ）イオノマイシンを混合して使用した。重複ペプチドの混合で作ったペプチド混合物を以下の表１に示す。
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイプロトコール
１ウェル当たり１×１０６個の脾臓細胞を入れてＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。重複ペプチド混合物の刺激時に１ウェル当たり各重複ペプチドの濃度が１μg/mlになるように投与し、ｌｙｓａｔｅ抗原刺激時の１ウェル当たり５０μg/ml濃度になるように投与し、各試験当たり３回繰り返して行った。重複ペプチド抗原刺激で得た検体結果は、Mean of OLP pools specific spot forming cells（SFCs）−Mean of ５％ DMSO specific SFCs値で計算した。Ｌｙｓａｔｅ抗原刺激で得た検体結果は、Mean of ＶＺＶ specific SFCs−Mean of MRC−５ specific SFCs値で計算した。各ウェル当たりＳＦＣの最大値は５００で計算した。
１ウェル当たり１×１０６個の脾臓細胞を入れてＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。重複ペプチド混合物の刺激時に１ウェル当たり各重複ペプチドの濃度が１μg/mlになるように投与し、ｌｙｓａｔｅ抗原刺激時の１ウェル当たり５０μg/ml濃度になるように投与し、各試験当たり３回繰り返して行った。重複ペプチド抗原刺激で得た検体結果は、Mean of OLP pools specific spot forming cells（SFCs）−Mean of ５％ DMSO specific SFCs値で計算した。Ｌｙｓａｔｅ抗原刺激で得た検体結果は、Mean of ＶＺＶ specific SFCs−Mean of MRC−５ specific SFCs値で計算した。各ウェル当たりＳＦＣの最大値は５００で計算した。
免疫原性実験結果
各ワクチンによる抗原評価結果、陰性対照群に使用したＮｅｇ群からは、如何なる重複ペプチド刺激にも免疫反応を見せなかった。ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥＤＮＡワクチンをそれぞれ単独投与したＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ群からは該当タンパク質の重複ペプチドに対してのみ免疫反応を見せた。ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ ＤＮＡワクチンを全て投与したＩＥ６２+ＩＥ６３+ｇＥ群からは三つのタンパク質の重複ペプチドに対して皆免疫反応を表した。候補物質のＤＮＡワクチンを投与する際に、候補物質に特異的な重複ペプチドに対してのみ免疫反応を示した。図２は本発明の一実施例による実験群に対する免疫原性の結果を示すグラフである。
各ワクチンによる抗原評価結果、陰性対照群に使用したＮｅｇ群からは、如何なる重複ペプチド刺激にも免疫反応を見せなかった。ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥＤＮＡワクチンをそれぞれ単独投与したＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ群からは該当タンパク質の重複ペプチドに対してのみ免疫反応を見せた。ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥ ＤＮＡワクチンを全て投与したＩＥ６２+ＩＥ６３+ｇＥ群からは三つのタンパク質の重複ペプチドに対して皆免疫反応を表した。候補物質のＤＮＡワクチンを投与する際に、候補物質に特異的な重複ペプチドに対してのみ免疫反応を示した。図２は本発明の一実施例による実験群に対する免疫原性の結果を示すグラフである。
図３及び図４は、各実験群のタンパク質重複ペプチドの免疫反応を比較した結果を示すグラフである。図３を参照すれば、単一ＤＮＡワクチンを投与した群と三種類のＤＮＡワクチンを投与した群の該当タンパク質の重複ペプチド免疫反応を比べた結果、三種類のＤＮＡワクチンを混合して投与すれば、単一のＤＮＡワクチンを投与したときよりＩＥ−６２に対する免疫反応は４３．３％減少し、ＩＥ−６３に対する免疫反応は差がなかったし、ｇＥに対する免疫反応は９．６％減少した。
抗原選定の妥当性
図４を参照すれば、各実験群にｌｙｓａｔｅ抗原で刺激した結果、Ｎｅｇ群からは免疫反応を見せなかった一方、候補物質のＤＮＡワクチンを投与した群からは強い免疫反応を見せたことを確認した。このような結果は、ＶＺＶに感染された細胞ではＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥなどのタンパク質が発現されているし、本実験で候補物質として選択したＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥに対して免疫反応を誘導すればＶＺＶに感染された細胞に対して免疫反応ができることを確認した。
図４を参照すれば、各実験群にｌｙｓａｔｅ抗原で刺激した結果、Ｎｅｇ群からは免疫反応を見せなかった一方、候補物質のＤＮＡワクチンを投与した群からは強い免疫反応を見せたことを確認した。このような結果は、ＶＺＶに感染された細胞ではＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥなどのタンパク質が発現されているし、本実験で候補物質として選択したＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥに対して免疫反応を誘導すればＶＺＶに感染された細胞に対して免疫反応ができることを確認した。
実験評価
ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥタンパク質をコーディングする遺伝子で製造したＤＮＡワクチンを実験動物モデルから評価及び分析した結果、単一または混合投与する際に十分なＴ細胞免疫原性を示した。ＶＺＶ溶解物の抗原刺激によるＴ細胞免疫原性分析結果、ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥをワクチンの候補物質として選定することが妥当であると判断された。
ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥタンパク質をコーディングする遺伝子で製造したＤＮＡワクチンを実験動物モデルから評価及び分析した結果、単一または混合投与する際に十分なＴ細胞免疫原性を示した。ＶＺＶ溶解物の抗原刺激によるＴ細胞免疫原性分析結果、ＩＥ−６２、ＩＥ−６３、ｇＥをワクチンの候補物質として選定することが妥当であると判断された。
[実験２] インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）タンパク質の発現評価
発現確認条件
−細胞導入（transfection：ＲＤ cells １×１０６cells/Ｔ７５ flask）、３０ ug of pＤＮＡ、Lipofectamine＜登録商標＞２０００、細胞導入から２４時間後にcell harvest
*ＲＤ cell：ヒト横紋筋肉腫細胞（rhabdomyosarcoma）
−細胞溶解（cell lysis）：２×１０６cells/９０ ul RIPA buffer with Protease Inhibitor Cocktail
−SDS PAGE：LDS sample buffer with Reducing agent（DTT）、３０ ul loading lysate １９．５ ul、４−１２％Bis−Tris gel、MES running buffer、１６５Ｖ、３５分
−Protein transfer：NC membrane、Dry blotting、２０Ｖ、１分→２３Ｖ、４分→２５Ｖ、２分
−Protein detection：１）Blocking １時間、２）Antibody reaction（１:１００）１時間３０分（HA−probe HRP（SantaCruz社、Cat．no．sc−８０５HRP）、Goat anti−ＶＺＶ ＩＥ６２ （SantaCruz社、Cat．no．sc−１７５２５）、Donkey anti−goat IgG HRP（SantaCruz社、Cat．no．sc−２０２０、３）HRP chromogenic substrate（Invitrogen社、Cat．No．ＷＰ２０００４）
発現確認評価
図５ないし図７は、それぞれのプラスミド遺伝子によって発現される生成物を確認した電気泳動写真である。
発現確認条件
−細胞導入（transfection：ＲＤ cells １×１０６cells/Ｔ７５ flask）、３０ ug of pＤＮＡ、Lipofectamine＜登録商標＞２０００、細胞導入から２４時間後にcell harvest
*ＲＤ cell：ヒト横紋筋肉腫細胞（rhabdomyosarcoma）
−細胞溶解（cell lysis）：２×１０６cells/９０ ul RIPA buffer with Protease Inhibitor Cocktail
−SDS PAGE：LDS sample buffer with Reducing agent（DTT）、３０ ul loading lysate １９．５ ul、４−１２％Bis−Tris gel、MES running buffer、１６５Ｖ、３５分
−Protein transfer：NC membrane、Dry blotting、２０Ｖ、１分→２３Ｖ、４分→２５Ｖ、２分
−Protein detection：１）Blocking １時間、２）Antibody reaction（１:１００）１時間３０分（HA−probe HRP（SantaCruz社、Cat．no．sc−８０５HRP）、Goat anti−ＶＺＶ ＩＥ６２ （SantaCruz社、Cat．no．sc−１７５２５）、Donkey anti−goat IgG HRP（SantaCruz社、Cat．no．sc−２０２０、３）HRP chromogenic substrate（Invitrogen社、Cat．No．ＷＰ２０００４）
発現確認評価
図５ないし図７は、それぞれのプラスミド遺伝子によって発現される生成物を確認した電気泳動写真である。
図５を参照すれば、Lipofectamine＜登録商標＞２０００を利用してＩＥ−６２遺伝子をコーディングするプラスミドをヒト横紋筋肉腫細胞（rhabdomyosarcoma）から由来し
たＲＤ細胞に導入した後、２４時間後に細胞を溶解してタンパク質を抽出し、発現抗原検出用抗体を利用してWestern Blotを行った。ＩＥ−６２遺伝子をコーディングするプラスミドの発現タンパク質は、anti−ＶＺＶ ＩＥ６２（SantaCruz社、cat．no．SC−２０２０）を利用して検出し、HRP Chromogenic Substrates（Invitrogen Cat．no．ＷＰ２０００４）を使用して可視化した。ＩＥ−６２遺伝子をコーディングハはプラスミドから発現される導入遺伝子の生成物の大きさは予測分子量と一致することが確認されたし、これはＲＤ細胞内に導入された遺伝子の生成物がＶＺＶのＩＥ−６２抗原タンパク質であることを示すことである。
たＲＤ細胞に導入した後、２４時間後に細胞を溶解してタンパク質を抽出し、発現抗原検出用抗体を利用してWestern Blotを行った。ＩＥ−６２遺伝子をコーディングするプラスミドの発現タンパク質は、anti−ＶＺＶ ＩＥ６２（SantaCruz社、cat．no．SC−２０２０）を利用して検出し、HRP Chromogenic Substrates（Invitrogen Cat．no．ＷＰ２０００４）を使用して可視化した。ＩＥ−６２遺伝子をコーディングハはプラスミドから発現される導入遺伝子の生成物の大きさは予測分子量と一致することが確認されたし、これはＲＤ細胞内に導入された遺伝子の生成物がＶＺＶのＩＥ−６２抗原タンパク質であることを示すことである。
図６を参照すれば、Lipofectamine＜登録商標＞２０００を利用してＩＥ−６３遺伝子をコーディングするプラスミドをヒト横紋筋肉腫細胞（rhabdomyosarcoma）から由来したＲＤ細胞に導入し、２４時間後に細胞を溶解してタンパク質を抽出し、発現抗原検出用抗体を利用してWestern Blotを行った。ＩＥ−６３遺伝子をコーディングするプラスミドの発現タンパク質は、HA−probe HRP（SantaCruz社、cat．no．SC−８０５HRP）を利用して検出し、HRP Chromogenic Substrates（Invitrogen Cat．no．ＷＰ２０００４）を使用して可視化した。ＩＥ−６３遺伝子をコーディングするプラスミドから発現される導入遺伝子の生成物の大きさは、予測分子量と一致することが確認されたし、これはＲＤ細胞内に導入された遺伝子の生成物がＶＺＶのＩＥ−６３抗原タンパク質であることを示すことである。
図７を参照すれば、Lipofectamine＜登録商標＞２０００を利用してｇＥ遺伝子をコーディングするプラスミドをヒト横紋筋肉腫細胞（rhabdomyosarcoma）から由来したＲＤ細胞に導入し、２４時間後に細胞を溶解してタンパク質を抽出し、発現抗原検出用抗体を利用してWestern Blotを行った。ｇＥ遺伝子をコーディングするプラスミドの発現タンパク質は、HA−probe HRP（SantaCruz社、cat．no．SC−８０５HRP）を利用して検出し、HRP Chromogenic Substrates（Invitrogen Cat．no．WP２０００４）を使用して可視化した。ｇＥ遺伝子をコーディングするプラスミドから発現される導入遺伝子の生成物の大きさは、予測分子量と一致することが確認されたし、これはＲＤ細胞内に導入された遺伝子の生成物がＶＺＶのｇＥ抗原タンパク質であることを示すことである。
Claims (7)
- 帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含み、
電気穿孔方式によって体内に直接投与され、ＶＺＶ抗原に対するＴ細胞免疫活性を誘導する、帯状疱疹予防及び治療用プラスミドＤＮＡ。 - 前記遺伝子は、ＩＥ−６２タンパク質（配列目録１）をコーディングする第１遺伝子、ＩＥ−６３タンパク質（配列目録２）をコーディングする第２遺伝子、及びｇＥタンパク質（配列目録３）をコーディングする第３遺伝子のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の帯状疱疹予防及び治療用プラスミドＤＮＡ。
- 配列目録４のプラスミドＤＮＡ、配列目録５のプラスミドＤＮＡ及び配列目録６のプラスミドＤＮＡのいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドＤＮＡ。
- 帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含む少なくとも一種のプラスミド、及び薬剤学的に許容できる別の成分を含む、帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物。
- 前記プラスミドは、相異なる異種の遺伝子挿入部位を含む複数のプラスミドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物。
- 前記プラスミドは、ＩＥ−６２タンパク質（配列目録１）をコーディングする第１遺伝子の挿入部位を含む第１プラスミド、ＩＥ−６３タンパク質（配列目録２）をコーディングする第２遺伝子の挿入部位を含む第２プラスミド、及びｇＥタンパク質（配列目録３）をコーディングする第３遺伝子の挿入部位を含む第３プラスミドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の帯状疱疹予防及び治療用ＤＮＡワクチン組成物。
- 帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を符号化するＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含むプラスミドを準備する段階; 及び
前記プラスミドを電気穿孔方式によって体内に投与する段階を含むＶＺＶ抗原に対するＴ細胞活性化方法。
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