JP2017531443A - Vh−vlドメイン間角度に基づく抗体ヒト化の方法 - Google Patents
Vh−vlドメイン間角度に基づく抗体ヒト化の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017531443A JP2017531443A JP2017522101A JP2017522101A JP2017531443A JP 2017531443 A JP2017531443 A JP 2017531443A JP 2017522101 A JP2017522101 A JP 2017522101A JP 2017522101 A JP2017522101 A JP 2017522101A JP 2017531443 A JP2017531443 A JP 2017531443A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- fragment
- orientation
- residues
- fragments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 158
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims abstract description 150
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims abstract description 150
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 45
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000005452 bending Methods 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 238000000547 structure data Methods 0.000 claims description 3
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 41
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 32
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 29
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 17
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 238000012549 training Methods 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 102000057063 human MAPT Human genes 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004989 Hepsin Human genes 0.000 description 1
- 108090001101 Hepsin Proteins 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102220480802 Platelet glycoprotein VI_L95H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 238000002939 conjugate gradient method Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21106—Hepsin (3.4.21.106)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
抗体の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン、すなわちVHとVLとの境界面に形成され、このためVH-VLドメイン配向は、抗体の特異性および親和性に影響を及ぼす要因となる。抗体の操作およびヒト化の過程においてVH-VLドメイン配向を保持することは、ドナー抗体特性を保つ目的に有利であると考えられる。正確なVH-VL配向の予測が、抗体相同性モデリングにおける要因の1つであることは認識されている。
‐親抗体Fvフラグメント由来の1つまたは複数の特異性決定残基をアクセプター抗体Fvフラグメントに移植する/移行させることによって多数の変異抗体Fvフラグメントを作製する段階であって、多数の変異抗体Fvフラグメントの各変異抗体Fvフラグメントが、他の変異抗体Fvフラグメントとは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐親Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体Fvフラグメントの変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VL配向と比較してVH-VL配向において最小の差(smallest difference)を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含み、1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントが親抗体Fvフラグメントと同じ抗原に結合する、方法である。
‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の(構造的)類似性を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階。
‐親抗体Fvフラグメント由来の1つまたは複数の特異性決定残基をアクセプター抗体Fvフラグメントに移植する/移行させることによって多数の変異抗体Fvフラグメントを作製する段階であって、多数の変異抗体Fvフラグメントの各変異抗体Fvフラグメントが、他の変異抗体Fvフラグメントとは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐親Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体Fvフラグメントの変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の(構造的)類似性を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含み、1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントが親抗体Fvフラグメントと同じ抗原に結合する、方法である。
‐抗原と特異的に結合する非ヒト抗体を用意する段階、
‐非ヒト抗体由来の1つまたは複数の特異性決定残基をヒトアクセプター抗体もしくはヒト化アクセプター抗体または生殖細胞系列抗体配列に移植する/移行させることによって多数の変異抗体を作製する段階であって、多数の変異抗体の各変異抗体が、他の変異抗体とは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐非ヒト抗体Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体の変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VL配向と比較してVH-VL配向において最小の差を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、非ヒト由来の1つまたは複数のヒト化抗体を選択する段階
を含み、1つまたは複数のヒト化抗体が非ヒト抗体と同じ抗原に結合する方法である。
‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の(構造的)類似性を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、非ヒト抗体に由来する1つまたは複数のヒト化抗体を選択する段階。
‐抗原と特異的に結合する非ヒト抗体を用意する段階、
‐非ヒト抗体由来の1つまたは複数の特異性決定残基をヒトアクセプター抗体もしくはヒト化アクセプター抗体または生殖細胞系列抗体配列に移植する/移行させることによって多数の変異抗体を作製する段階であって、多数の変異抗体の各変異抗体が、他の変異抗体とは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐非ヒト抗体Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体の変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の(構造的)類似性を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、非ヒト抗体に由来する1つまたは複数のヒト化抗体を選択する段階
を含み、1つまたは複数のヒト化抗体が非ヒト抗体と同じ抗原に結合する方法である。
は、VH-VL予測変数を用いることによって、構造の参照物に対して改善された。VH-VL再配向による
の減少は、特にフレームワーク領域に関しては、より優れたRMSD値に一般に変換される。平均すると、Fv全体に関して、
の顕著な改善、およびカルボニルRMSDの改善が認められた。
‐1つまたは複数の抗体または抗体Fvフラグメントを、本明細書において報告される方法に従って選択する段階、
‐1つまたは複数の抗体または抗体Fvフラグメントから、単一の抗体または抗体Fvフラグメントをその結合特性に基づいて選択する段階、
‐そのVHおよびVLをコードする核酸を、1つまたは複数の発現ベクター中にクローニングする段階、
‐細胞に、前記段階で得られた発現ベクターをトランスフェクトする段階、
‐トランスフェクトされた細胞を培養し、それによって抗体を産生させる段階。
‐1つまたは複数の抗体または抗体Fvフラグメントを選択する段階であって、以下の段階:
‐非ヒト抗体由来の1つまたは複数の特異性決定残基をヒトアクセプター抗体もしくはヒト化アクセプター抗体または生殖細胞系列抗体配列に移植する/移行させることによって多数の変異抗体を作製する段階であって、多数の変異抗体の各変異抗体が、他の変異抗体とは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐VHおよびVLの回転軸の、習慣的に使用されるねじれ角、4つの屈曲角(可変ドメイン当たり2つ)および長さ(HL、HC1、LC1、HC2、LC2、dc)を、抗体Fvフラグメントの残基H33、H35、H37、H39、H43、H44、H45、H46、H47、H50、H55、H56、H58、H60、H61、H62、H89、H91、H95、H96、H98、H99、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94/L95x-1、L95x、L96、L97、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)からなるVH-VL境界面残基のセットに基づくランダムフォレストモデルを用いて計算することによって、非ヒト抗体Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体の変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、VH-VL配向を決定する段階、
‐非ヒト抗体Fvフラグメントおよび変異抗体Fvフラグメントの対応するCα原子のすべての対に関して決定された、最小平均の二乗平均平方根偏差(RMSD)を有する変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含む、段階、
‐1つまたは複数の抗体から、単一の抗体をその結合特性に基づいて選択する段階、
‐そのVHおよびVLをコードする核酸を、1つまたは複数の発現ベクター中にクローニングする段階、
‐細胞に、前記段階で得られた発現ベクターをトランスフェクトする段階、
‐トランスフェクトされた細胞を培養し、それによって抗体を産生させる段階。
Wolfguy番号付けスキーム
Wolfguy番号付けは、CDR領域をKabatおよびChothiaの定義の合併セットとして定義する。その上、この番号付けスキームは、CDRループ先端に対して、CDR位置のインデックスがあるCDR残基が上向きループまたは下向きループの一部であることを指し示すように、CDRの長さに基づいて(かつ一部には配列に基づいて)アノテーションを行う。確立された番号付けスキームとの比較を表1に示す。
アミノ酸をベースとする2つの任意の構造間で比較を行う場合には、一般に、等価な分子の距離に基づく測定基準、例えば二乗平均平方根偏差(RMSD)などが用いられる。
‐各対象物に対する基準系
‐配向パラメーターを測定するための軸
‐これらのパラメーターの記述および定量のための用語。
‐Cの長さ、dc、
‐Cの周りにH1からL1まで測定されるねじれ角、HL、
‐H1とCとの間の屈曲角、HC1、
‐H2とCとの間の屈曲角、HC2、
‐L1とCとの間の屈曲角、LC1、および
‐L2とCとの間の屈曲角、LC2。
‐Cの長さ、dc、
‐Cの周りにH1からL1まで測定されるねじれ角、HL、
‐H1とCとの間の屈曲角、HC1、
‐H2とCとの間の屈曲角、HC2、
‐L1とCとの間の屈曲角、LC1、および
‐L2とCとの間の屈曲角、LC2
によって定義され、ここで参照フレーム平面は、i)VHの8つの位置H36、H37、H38、H39、H89、H90、H91およびH92に対応するCα座標のアライメントを行い、平面をそれらを通るようにフィッティングする段階、ならびにii)VLの8つの位置L35、L36、L37、L38、L85、L86、L87およびL88に対応するCα座標のアライメントを行い、平面をそれらを通るようにフィッティングする段階、iii)各平面に配置されたもの(a placed)を配置する段階であって、各構造が等価なメッシュ点および等価なVH-VLメッシュ点の対を有する段階、ならびにiv)各構造におけるメッシュ点の各対に関してユークリッド距離を測定する段階によって登録され、ここでベクトルCは点の対をそれらの分離距離が最小分散となるようにつなぎ、
ここでH1はVH平面の第1の主成分と平行するベクトルであり、H2はVH平面の第2の主成分と平行するベクトルであり、L1はVL平面の第1の主成分と平行するベクトルであり、L2はVL平面の第2の主成分と平行するベクトルであり、HL角度はこの2つのドメイン間のねじれ角度であり、HC1およびLC1は一方のドメインのもう一方のドメインに対する傾斜様変形物と等価な屈曲角であり、HC2屈曲角およびLC2屈曲角は一方のドメインの他のドメインに対するねじれ様変形物と等価である。
a:Chailyan et al.によって影響性があることが同じく見いだされた位置を表している。
b:Abhinandan and Martinによって影響性があることが同じく見いだされた位置を表している。
(さらに詳細な情報については、参考文献7およびBujotzek, A., et al., Prot. Struct. Funct. Bioinf. 83 (2015) 681-695を参照のこと。これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
「アクセプターヒトフレームワーク」は、本明細書において、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークのことである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはそれがアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの態様において、アミノ酸変化の数は10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8個もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、5個もしくはそれ未満、4個もしくはそれ未満、3個もしくはそれ未満、または2個もしくはそれ未満である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)に存在するCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)に存在する抗原接触部(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)および/または(c)の組み合わせ。
VH-VLドメイン間配向を予測する、迅速な配列ベースの予測変数が、本明細書において報告される。0.67〜0.80の範囲にわたるQ2値が達成される。VH-VL配向は、VH-VL配向の種々の自由度を明確に区別するために、6つの絶対的ABangleパラメーターに関して記載される。VH-VL配向の影響を種々の抗体構造に関して評価した。本明細書において報告する方法を用いると、親(非ヒト)抗体に対する変異(ヒト化)抗体のVH-VL配向の偏差に関して改善を達成しうることが見いだされた。これはアミノ酸骨格のカルボニル原子の平均の二乗平均平方根偏差(RMSD)によって示される。これは、親(非ヒト)抗体と変異(ヒト化)抗体との間のVH-VLドメイン間角度の類似性に関する改善を示している。本明細書において報告される方法(移植手順を含む)は、変異(ヒト化)抗体のより優れた結合特性を与える。抗体の生物物理学的特性を変化させる目的で、フレームワークシャフリングなどの他の操作方法を、ヒトフレームワークを別のものと交換した場合に変異抗体の結合性の改善をもたらす本明細書において報告される方法と組み合わせることができる。これは、親抗体に由来する多数の変異抗体からより優れたヒト化抗体を選択するための方法の提供をもたらす。
(表5)50回の試行を平均した6つのABangleパラメーターの予測に関するQ2値およびRMSE値。ランダムフォレストモデル当たりの決定木の数は、Q2が最大になるように手作業で微調整した。括弧内の値は標準偏差を明記している。
MoFvAbモデル
MoFvAb(抗体に対するFvのモデリング)手順の詳細な説明は、Bujotzek, A., et al.(mAbs 7 (2015) 838-852)によって発表されている。変異体1(コンセンサスVHフレームワークまたはVLフレームワークのいずれかに対してアライメントを行い、その後にコンセンサスFvフレームワーク上にVH-VL再配向が行われた、テンプレート構造から構築されたモデル)のモデル構築に関して得られた結果を、表6に示している。
という本質的に同じABangle配向を共通に有する。AMAII構造に固有のVH-VL配向の大きな多様性が示されている。最大の偏差はパラメーターHLおよびHC2に関して生じ、それは異なる構造間だけではなく、同じ非対称単位由来の配列同一構造についても生じた:4MA3_B_Aおよび4MA3_H_Lに関するパラメーターHLには5.87度の偏差があった。このことは、VH-VL配向は、一方ではある特定の配列特徴によってガイドされるが(図3参照)、方向性のない(undirected)固有の変動性にもさらされることを裏付けている。これは非結合形態にあるタンパク質結合抗体で特に顕著である(7)。
に基づいて選択されたVH-VL配向テンプレートである。VH-VL配向テンプレートの選び出しはフィンガープリント類似性に基づいてではなく、ABangle配向空間における類似性によって行った。
本明細書において報告しているように、ある所与のFv相同性モデルを、VH-VL配向テンプレート上にそれを再配向させることによって改良するアプローチは、現行の最新式モデリングソフトウェアに組み込まれている。元のAMAIIモデルは、http://www.3dabmod.comから入手し、組み込みを容易にするためにその構造にWolfguy番号付けによるアノテーションを行い、表8に列記された通りにモデルをVH-VL配向テンプレート上に再配向させた。すべてのAMAII被験体の各々のモデルで平均した、再配向後の抗体当たりのカルボニルRMSDおよびdistABangleの変化の平均を、図5に示している。
ある抗原の同じエピトープと結合する2つの(ヒト化)抗体変異体の間のVH-VL配向の、その親非ヒト抗体に比しての違いの総和が、抗体の抗原結合能力の各々の違いと相関することが見いだされた。
* ループの長さに応じた番号付け
+ Chothia et al.(13)による定義によるVH-VL境界面の一部
* ループの長さに応じた番号付け
+ Chothia et al.(13)による定義によるVH-VL境界面の一部
行列を、RV係数、またはPROTEST法による相関係数などの他の係数を用いて相関付けることができる。これらの方法は本質的には2つのデータセット間の相関を評価し、ここで本発明者らは各試料に関して1つだけではなくいくつかの測定値を有しており、それ故に標準的な単変量相関係数をある程度拡張している。RV係数を以下では用いている。表23には、HCおよびLCの見込みからの3種類の異なるデータセットについてRV係数およびそのp値を示している。
抗体サブセットの選択のための3通りの方法を、それらの性能に関して以下の通りに分析した。これらの方法は、本明細書において説明するように、下位20%の選択、不良なHC/LCの組み合わせの選択、およびHCまたはLCの全体の選択である。
HC/LC情報を用いる両方の方法については、残りのものよりも成績が不良と予測されるHC/LCを選択する必要がある。図7は、HC(行列の列、左)およびLC(行列の行、右)に関する平均角度距離を描写している。HC 6、7、8、9、12、13および14、ならびにLC 7および9を含む抗体は選択除外している。
以上に概要を述べたものと同じアプローチを、抗体CD81K13のヒト化変異体に対して行った。結果は図10〜12および以下の表26に示されている。
以上に概要を述べたものと同じアプローチを、抗体Rb86のヒト化変異体に対して行った。結果は図13〜15および以下の表27に示されている。
共通の元の親抗体にすべてが由来するヒト化変異体に対してVH-VL配向(VH-VL角)予測を使用した場合に、親抗体の角度パラメーターにより近いという点で優れたヒト化変異体が得られることが見いだされた。最適に満たないVH-VL配向を有する抗体を不合格とするために用いた3種の方法、すなわち、「下位20%」、またはHC/LCの全体のセット、または不良なHC/LCの組み合わせを不合格とする方法により、類似の抗体サブセットがもたらされた。積み上げヒストグラムおよび相関分析により、角度-距離が結合挙動の優れた指標であることが裏付けられた。本明細書において報告される選択方法を用いることによって、そのように選別されたヒト化行列の質が劇的に高まることが見いだされた。
1.親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択するための方法であって、以下の段階:
‐親抗体Fvフラグメント由来の1つまたは複数の特異性決定残基をアクセプター抗体Fvフラグメントに移植する/移行させることによって多数の変異抗体Fvフラグメントを作製する段階であって、多数の変異抗体Fvフラグメントの各変異抗体Fvフラグメントが、他の変異抗体Fvフラグメントとは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐親Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体Fvフラグメントの変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VL配向と比較してVH-VL配向において最小の差を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含み、1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントが親抗体Fvフラグメントと同じ抗原に結合する、方法。
2.非ヒト抗体をヒト化するための方法であって、以下の段階:
‐抗原と特異的に結合する非ヒト抗体を用意する段階、
‐非ヒト抗体由来の1つまたは複数の特異性決定残基をヒトアクセプター抗体もしくはヒト化アクセプター抗体または生殖細胞系列抗体配列に移植する/移行させることによって多数の変異抗体を作製する段階であって、多数の変異抗体の各変異抗体が、他の変異抗体とは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐非ヒト抗体Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体の変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VL配向と比較してVH-VL配向において最小の差を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、非ヒト由来の1つまたは複数のヒト化抗体を選択する段階
を含み、1つまたは複数のヒト化抗体が非ヒト抗体と同じ抗原に結合する方法。
3.以下の段階を含む、態様1記載の方法:
‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の(構造的)類似性を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階。
4.以下の段階を含む、態様2記載の方法:
‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の(構造的)類似性を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、非ヒト抗体に由来する1つまたは複数のヒト化抗体を選択する段階。
5.親抗体Fvフラグメントが非ヒト抗体Fvフラグメントである、態様1および3のいずれか1つに記載の方法。
6.アクセプター抗体Fvフラグメントが、ヒト抗体もしくはヒト化抗体のFvフラグメント、またはヒト抗体Fvフラグメント生殖細胞系列アミノ酸配列である、態様1、3および5のいずれか1つに記載の方法。
7.配列フィンガープリントがVH-VL境界面残基のセットである、態様1〜6のいずれか1つに記載の方法。
8.VH-VL境界面残基が、(重ね合わされたすべてのFv構造の少なくとも90%において)その側鎖原子が4Å未満またはそれと等しい距離で対向鎖の近接原子を有するアミノ酸残基である、態様7記載の方法。
9.VH-VL境界面残基のセットが、残基L44、L46、L87、H45、H62(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8のいずれか1つに記載の方法。
10.VH-VL境界面残基のセットが、残基H35、H37、H39、H45、H47、H50、H58、H60、H61、H91、H95、H96、H98、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L43、L44、L46、L49、L50、L55、L87、L89、L91、L95x-1、L95x、L96(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜9のいずれか1つに記載の方法。
11.VH-VL境界面残基のセットが、残基H33、H35、H43、H44、H46、H50、H55、H56、H58、H61、H62、H89、H99、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94/L95x-1、L95x、L96、L97、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜9のいずれか1つに記載の方法。
12.VH-VL境界面残基のセットが、残基H33、H35、H37、H39、H43、H44、H45、H46、H47、H50、H55、H56、H58、H60、H61、H62、H89、H91、H95、H96、H98、H99、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94/L95x-1、L95x、L96、L97、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜9のいずれか1つに記載の方法。
13.VH-VL境界面残基のセットが、残基H35、H37、H39、H45、H47、H50、H58、H60、H61、H91、H95、H96、H98、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L43、L44、L46、L49、L50、L55、L87、L89、L91、L95x-1、L95x、L96、L98(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜9のいずれか1つに記載の方法。
14.VH-VL境界面残基のセットが、残基H33、H35、H37、H39、H43、H44、H45、H46、H47、H50、H58、H60、H61、H62、H89、H91、H95、H96、H98、H99、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94、L95x-1、L95x、L96、L97、L98、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜9のいずれか1つに記載の方法。
15.VH-VL境界面残基のセットが、残基210、296、610、612、733(Wolfguyインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8のいずれか1つに記載の方法。
16.VH-VL境界面残基のセットが、残基199、202、204、210、212、251、292、294、295、329、351、352、354、395、396、397、398、399、401、403、597、599、602、604、609、610、612、615、651、698、733、751、753、796、797、798(Wolfguyインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8および15のいずれか1つに記載の方法。
17.VH-VL境界面残基のセットが、残基197、199、208、209、211、251、289、290、292、295、296、327、355、599、602、604、607、608、609、610、611、612、615、651、696、698、699、731、733、751、753、755、796、797、798、799、803(Wolfguyインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8および15〜16のいずれか1つに記載の方法。
18.VH-VL境界面残基のセットが、残基197、199、202、204、208、209、210、211、212、251、292、294、295、296、327、329、351、352、354、355、395、396、397、398、399、401、403、597、599、602、604、607、608、609、610、611、612、615、651、696、698、699、731、733、751、753、755、796、796、797、798、799、801、803(Wolfguyインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8および15〜17のいずれか1つに記載の方法。
19.VH-VL境界面残基のセットが、残基199、202、204、210、212、251、292、294、295、329、351、352、354、395、396、397、398、399、401、403、597、599、602、604、609、610、612、615、651、698、733、751、753、796、797、798、801(Wolfguyインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8および15〜18のいずれか1つに記載の方法。
20.VH-VL境界面残基のセットが、残基197、199、202、204、208、209、210、211、212、251、292、294、295、296、327、329、351、352、354、355、395、396、397、398、399、401、403、597、599、602、604、607、608、609、610、611、612、615、651、696、698、699、731、733、751、753、755、796、797、798、799、801、803(Wolfguyインデックスによる番号付け)を含む、態様7〜8および15〜19のいずれか1つに記載の方法。
21.上位20%の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階を含む、態様1〜20のいずれか1つに記載の方法。
22.VH-VL配向が、6つのABangle VH-VL配向パラメーターを計算することによって決定される、態様1〜21のいずれか1つに記載の方法。
23.VH-VL配向が、ランダムフォレスト法を用いてABangle VH-VL配向パラメーターを計算することによって決定される、態様1〜22のいずれか1つに記載の方法。
24.VH-VL配向が、各ABangleに関して1つのランダムフォレスト法を用いてABangle VH-VL配向パラメーターを計算することによって決定される、態様1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25.VH-VL配向が、VHおよびVLの回転軸のねじれ角、4つの屈曲角(可変ドメイン当たり2つ)および長さ(HL、HC1、LC1、HC2、LC2、dc)をランダムフォレストモデルを用いて計算することによって決定される、態様1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26.ランダムフォレストモデルが複合体抗体構造データのみを用いて訓練される、態様25記載の方法。
27.最小の差が最大のQ2値である、態様1〜26のいずれか1つに記載の方法。
28.最大の類似性が最小平均の二乗平均平方根偏差(RMSD)である、態様1〜27のいずれか1つに記載の方法。
29.コンセンサスVHフレームワークまたはVLフレームワークのいずれかに対してアライメントが行われたテンプレート構造から構築され、その後にコンセンサスFvフレームワークに対するVH-VL再配向が行われたモデルが、VH-VL配向を決定するために用いられる、態様1〜28のいずれか1つに記載の方法。
30.完全Fvのβシートコアに対して(VHおよびVLに同時に)アライメントが行われたモデルが、VH-VL配向を決定する段階のために用いられる、態様1〜28のいずれか1つに記載の方法。
31.抗体FvフラグメントがコンセンサスFvフレームワークに対して再配向されたモデルが、VH-VL配向を決定する段階のために用いられる、態様1〜30のいずれか1つに記載の方法。
32.共通のコンセンサスFvフレームワークに対してアライメントが行われたテンプレート構造が用いられ、VH-VL配向を決定するためにいずれの形態においてもVH-VL配向が調整されていないモデルが用いられる、態様1〜28および30のいずれか1つに記載の方法。
33.コンセンサスVHフレームワークまたはVLフレームワークのいずれかに対してアライメントが行われたテンプレート構造から構築され、その後に類似性に基づいて選択されたVH-VL配向テンプレート構造に対するVH-VL再配向が行われたモデルが、VH-VL配向を決定するために用いられる、態様1〜28および30のいずれか1つに記載の方法。
34.以下の段階を含む、抗体を作製するための方法:
‐態様1〜33のいずれか1つに記載の方法によって、1つまたは複数の抗体または抗体Fvフラグメントを選択する段階、
‐1つまたは複数の抗体または抗体Fvフラグメントから、単一の抗体または抗体Fcフラグメントをその結合特性に基づいて選択する段階、
‐そのVHおよびVLをコードする核酸を1つまたは複数の発現ベクター中にクローニングする段階、
‐細胞に、前記段階で得られた発現ベクターをトランスフェクトする段階、
‐トランスフェクトされた細胞を培養し、それによって抗体を産生させる段階。
材料および方法
Roche抗体データベース3D(RAB3D)
抗体構造データベースRAB3Dは、ほとんどは公開されているFv構造を含む。Fv構造は処理され、社内の「Wolfguy」番号付けスキーム(次項を参照されたい)によってアノテーションが行われている。アノテーションが行われたすべてのFv構造が、コンセンサスFvフレームワークに対して、コンセンサスVHフレームワークに対して、およびコンセンサスVLフレームワークに対して重ね合わされている。コンセンサス構造は、PDBからの高分解能構造のサブセットを用いて計算されている。アノテーションが行われ、再配向が行われたFv構造は、相同性モデリングのためのテンプレートリポジトリとしての役を果たす。
Wolfguy番号付けは、CDR領域を、KabatおよびChothiaの定義の合併セットとして定義する。その上、この番号付けスキームは、CDRループ先端に対して、CDR位置のインデックスがあるCDR残基が上向きループまたは下向きループの一部であることを指し示すように、CDRの長さに基づいて(かつ一部には配列に基づいて)アノテーションを行う。確立された番号付けスキームとの比較を表1に示す。
VH-VL配向フィンガープリントの選択
VH-VL配向は、本明細書においては、完全Fv配列からではなく、Fv配列位置の(意味のある)サブセット(「配列フィンガープリント」)から予測される。VH-VL配向はVH-VL境界面の箇所またはその近傍にある残基によって司られるという仮定に基づき、境界面残基のセットが同定されており、ここで残基は、その側鎖原子が、データベース、例えばRAB3Dにおける重ね合わされたすべてのFv構造の少なくとも90%において4Åに等しいかまたはそれ未満の距離にある対向鎖の近接原子であるならばVH-VL境界面の一部であると定められる。結果は表29にまとめられており、これはまた、ある配列位置が、VH-VL配向の決定基であることが統計分析に基づいて以前に結び付けられているかどうかも示している(4、5、7)。
* ループの長さに応じた番号付け
+ Chothia et al.(13)による定義によるVH-VL境界面の一部
* ループの長さに応じた番号付け
+ Chothia et al.(13)による定義によるVH-VL境界面の一部
フィンガープリント1は、表29に示されたVH-VL境界面の一部であることが見いだされているすべての配列位置を含む。位置801(L98)はそれらの配列保存性が高度であることから放棄した。
フィンガープリント2は、ABangle「上位10の重要な入力変数」(7)の中に列記されたすべての配列位置、すなわち、197、199、208、209、211、251、292、295、296、327、355、599、602、604、607、608、609、610、611、612、615、651、696、698、699、731、733、751、753、755、796、797、798、799、803(H33、H35、H43、H44、H46、H50、H58、H61、H62、H89、H99、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94/L95x-1、L95x、L96、L97、L100)、ならびに位置289および290(H55およびH56)を含む。
フィンガープリント3は、フィンガープリント1とフィンガープリント2の合併セットである。
a:フレームワークの辺縁にある最も外側のCDR残基のみを有するもの、および
b:いかなるCDR残基も含まないもの
を作製した。
VH-VL配向予測変数の訓練
2013年10月の時点で公開されている抗体Fv結晶構造を、RCSB PDB(www.rcsb.org)(24)から蓄積し、各構造について、本明細書において説明するように、ABangle VH-VL配向パラメーターを計算した(実施例4参照)。その上、各構造について、VH-VL配向配列フィンガープリントを、上記に説明した通りに作製した(配列中、黒で強調)。配列フィンガープリントは54アミノ酸からなり、VH領域に29アミノ酸、VL領域に25アミノ酸を含む。この配列フィンガープリントはまた、ループの長さによっては所与の抗体配列中に存在しないことのある、超可変領域に属する残基も含む。この場合には、一文字記号による通常のアミノ酸記述の代わりに、非占有の配列フィンガープリント位置を「X」で描写している。両方のABangleパラメーターならびに配列フィンガープリントを計算した後に、データセット(n=2249)を複合体構造(n_複合体=1468)とapo構造(n_apo=781)に分類した。
VH-VL配向調整を伴う抗体相同性モデリングアルゴリズム
抗体のFv領域のモデリングのためのモデリングソフトウェア(MoFvAb)では、テンプレートリポジトリとして、例えば、RAB3Dデータベースからの、アノテーションおよび再配向が行われた構造を用いる。重鎖および軽鎖の所与の対の入力配列に対してWolfguyによりアノテーションを行い、それぞれVHおよびVLに還元した。続いて、VHおよびVLの両方を、7つの機能的セグメント、すなわち、フレームワーク1、CDR 1、フレームワーク2、CDR 2、フレームワーク3、CDR 3、およびフレームワーク4に分けた(表10参照)。他の相同性モデリングアプローチとは対照的に、共通のフレームワークテンプレートをFv毎または鎖毎に選び出すことはせず、ただしあらゆるフラグメントを配列相同性に基づいて独立に探し出し/アライメントを行い/決定した。例えば、単一のMoFvAbモデルを14種の異なるテンプレート構造、さらに場合によってはさらに多くのものから組み立てることが考えられるが、これは異なるテンプレート構造からもCDRループの上向き部分および下向き部分を再構築することが実行可能であるためである。フラグメントテンプレートのヒットは、
1)配列類似性(BLOSUM62行列スコア)、
2)不完全な側鎖の数、
3)テンプレート構造の分解能、および
4)RAB3Dコンセンサスフレームワークに対するテンプレート構造のアライメントのRMSD
によって、後述の順序にランク付けした。
変異体1:鎖毎に、すなわち、それぞれコンセンサスVHフレームワークおよびコンセンサスVLフレームワークに対してアライメントを行ったテンプレート構造からモデルを構築し、モデル処理およびエネルギー最小化の前に、モデルのVH-VL配向をコンセンサスFv構造に対する鎖毎アライメントによって調整した。この変異体では、配列と無関係な一般的で平均的なVH-VL配向を有するモデルが生成される。
変異体2:モデルのVH-VL配向を上記の通りの配列フィンガープリントに基づいて予測し、データベース中でそのABangleパラメーターの点で最も類似しているFvテンプレートを探し出した。続いてモデルのVH-VL配向を、いわゆる配向テンプレートに対する鎖毎アライメントによって調整した。
変異体3:このモデルは、鎖毎のコンセンサス構造の代わりに、共通のコンセンサスFvフレームワーク上へのアライメントを行ったテンプレート構造から構築し、VH-VL配向は調整しなかった。
ABangle距離の計算
ABangle空間における類似性を計算する目的で、ABangleパラメーターのセットを、タプル
として定義した。すると、ABangleパラメーターの2つのセット間のユークリッド距離は
となる。
を伴う予測されるABangleパラメーターのセット
と、測定されたABangleパラメーターθのセットとの間の距離を計算する際には、重み付けされた距離関数
を用いることによって、予測の不確実性を因子として加えた。
は角度尺度(HL、HC1、LC1、HC2、LC2)を直線距離尺度(dc)と混ぜ合わせているため、それらは角度空間における実際の距離と解釈することはできず、理論上の距離尺度のみとしての役を果たす。
相関
Pearson相関係数
Pearson相関係数は、2つの変数XとYとの間の直線的相関を測定する。これは
として計算され、ここでcov(X,Y)はXとYとの間の共分散であり、σは標準偏差である。Rにおける標準的な相関検定(cor.test)法(25)を相関係数を計算するために用い、それがゼロと有意に異なる場合にはp値を評価した。
EscoufierによるRV係数を、正方対称行列間の類似性を測定するために用いた(26)。この定義は矩形行列に対して容易に拡張することができる(27)。2つの行列XおよびYに関して、RV係数は
として計算することができ、ここでS=XXTであり、T=YYTである。
角度距離の大きさは参照物と比較して抗体の結合挙動が不良であることの指標になるという仮定の下で、抗体を不合格とするための多くの異なる方法を考えることができる。
この場合には、抗体のある特定のパーセンテージを、参照物に対するそれらの角度距離に直接的に基づいて不合格とする。一例として、本発明者らは今回、20%を不合格にすることを選んでいる。そのため、このアルゴリズムは以下となる。
1.角度-距離行列をソートし、インデックスを記憶する
2.角度-距離が最も大きい側の20%のインデックスを用いて、最も不良な抗体を不合格とする。
この場合には、HCまたはLCの全体を不合格とし、他のHC/LCの組み合わせを生成する。これを行うために、本発明者らは以下のアルゴリズムを提唱する。
1.各HC/LCについて平均角度-距離を計算する
2.これらの距離を描出し、不合格とするHC/LCのサブセットを選択する
以後の方法の変形物は、単に「不良な」HC/LCの組み合わせを有する抗体を不合格とするためのものである。この方法は、抗体に対する角度-距離の相関が個々の抗体に関してそれほど強くなく、ただしHCおよびLCの全体よりも良好に保たれている場合によい成績を収める。このアルゴリズムは以下である:
1.各HC/LCについて平均角度-距離を計算する
2.これらの距離を描出し、これらの間の可能性のあるすべての組み合わせのみを不合格とするためにHC/LCのサブセットを選択する。
カルボニルRMSD
AMAIIとの整合性を目的として、カルボニルRMSD、およびTeplyakov et al.(2)によるβシートコアおよびCDRループの定義を用いた。所与のフラグメントに関してカルボニルRMSDを決定するために、Accelrys Discovery Studio 3.5(20)に備わっている重ね合わせ方法により、βシートコアのCα原子を用いて、第1のモデルを結晶構造に重ね合わせた。続いてカルボニルRMSDを、結晶構造に対するその所与のセグメントの骨格カルボニル基原子の偏差として計算した。一般的に用いられるCαまたは全骨格のRMSDと比較して、カルボニルRMSDは骨格立体構造における偏差に対してより感度が高い。AMAIIでは、VHまたはVLのいずれかのみのβシートコアの重ね合わせに基づいてすべてのカルボニルRMSD値が計算されたが、この場合にはさらにVHおよびVLのβシートコアの同時の重ね合わせに基づくカルボニルRMSDが計算された。全Fvに対する重ね合わせは、VH-VL配向における不備を因子として加えるため、不良なRMSD値につながる。
ヒト化抗CD81抗体変異体を用いた結合細胞ELISA
結合細胞ELISAアッセイのために、HuH7-Rluc-H3(CD81を発現する陽性細胞株)およびHuH7-Rluc-L1(陰性対照細胞株)を、10% FCSを含むF-12 DMEM培地中で37℃および5% CO2の下で増殖させた。第1日に、およそ90%の集密度にある細胞をトリプシン処理し、細胞4×105個/mLで再懸濁させた。2×104個/ウェルのHuH7-Rluc-H3およびHuH7-Rluc-L1(陰性対照細胞株)を50μLのDMEM培地中にてプレーティングし、96ウェルのポリ-D-リジンプレート(Greiner、カタログ番号655940)に、37℃および5% CO2の下で24時間おいて付着させた。第2日に、被験抗体試料を、別々のポリプロピレン製丸底プレートに所望の濃度の2倍として最終容積120μlとなるように調製した。アッセイ試料はすべて細胞培養用培地で希釈した。各抗体試料の50μL(ウェル2つずつに)を細胞に添加して最終容積を100μL/ウェルとし、4℃で2時間インキュベートした。一次インキュベーション後に試料を吸引によって取り出し、細胞を0.05%グルタルアルデヒドを含むPBS溶液(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号1666789)中で室温で10分間かけて固定した。固定後に、各ウェルを200μLのPBS/0.05% Tweenで3回洗浄した。結合した抗CD81抗体の検出のための二次インキュベーション段階は、往復振盪機上にて室温で2時間行った。ヒト化CD81K抗体について、検出はペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ヒトIgG-γ鎖特異抗体(The Binding Site、カタログ番号AP004)を用いて行い、JS81マウス陽性対照抗体(BD Biosciences、カタログ番号555675)に対してはヤギ抗マウスIgG、(H+L)-HRP結合体(BIORAD、カタログ番号170-6516)を、いずれもPBS 10%ブロッキング緩衝液で1:1000に希釈した上で用いた。非結合抗体を除去するために各ウェルを200μLのPBS/0.05% Tweenで3回洗浄した。HRP活性は50μLの使用準備済みTMB溶液(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号1432559)を用いて検出し、およそ7〜10分後にウェル当たり50μLの1M H2SO4により反応を停止させた。ELISA Tecanリーダーを用い、620nmを参照波長として吸光度を450nmで読み取った。
速度論的スクリーニング
速度論的スクリーニングは、Schraeml et al.(Schraeml, M. and M. Biehl, Methods Mol. Biol. 901 (2012) 171-181)に従い、BIAcore CM5センサーを装着したBIAcore 4000装置にて行った。BIAcore 4000装置はソフトウェアバージョンV1.1の制御下にあった。BIAcore CM5シリーズのSチップを装置内に装着し、製造元の指示に従って流体力学的な取り扱いおよびプレコンディショニングを行った。装置用の緩衝液はHBS-EP緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)とした。抗体捕捉システムをセンサー表面上に用意した。ヒトIgG-Fc特異性を有するポリクローナルヤギ抗ヒト抗体(Jackson Lab.)を、スポット1、2、4および5については、NHS/EDC化学を用いて10,000RUで、装置のフローセル1、2、3および4に、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5)中にて30μg/mlで固定化した。各フローセルにおける抗体をスポット1およびスポット5で捕捉した。スポット2およびスポット4を参照スポットとして用いた。センサーを1Mエタノールアミン溶液によって失活させた。ヒト化抗体誘導体を、1mg/mlのCMD(カルボキシメチルデキストラン)を加えた装置用緩衝液中にて44nM〜70nMの濃度で適用した。抗体を流速30μl/分で2分間かけて注射した。表面提示抗体の捕捉レベル(CL)を相対的反応単位(RU)として測定した。溶液中の分析物であるリン酸化ヒトタウタンパク質、非リン酸化ヒトタウタンパク質およびリン酸化ヒトタウ突然変異型タンパク質T422Sを300nMで流速30μl/分にて3分間注射した。解離については5分間モニターした。捕捉システムは、すべてのフローセルについて、10mMグリシン緩衝液pH 1.7の30μL/分での1分間の注射によって再生させた。2つの報告時点である、分析物注射の終了直前の記録シグナル、すなわち結合後期(BL)と表されるものと、解離時間の終了直前に記録したシグナル、すなわち安定性後期(SL)を用いて、速度論的スクリーニング性能の特性決定を行った。さらに、解離速度定数kd(1/s)をラングミュアモデルに従って計算し、抗体/抗原複合体の半減期を、式ln(2)/(60*kd)を計算した。モル比(MR)は、式MR=(結合後期(RU))/(捕捉レベル(RU))×(MW(抗体)/(MW(抗原))に従って計算した。センサーが適量の抗体リガンド捕捉レベルに構成されている場合には、各抗体は、モル比MR=1.0によって表される、溶液中の少なくとも1つの分析物と機能的に結合する必要がある。その場合、モル比は分析物結合の結合価様式の指標ともなる。最大結合価は2種の分析物と結合する抗体についてはMR=2となり、各Fabの結合価は1である。
Claims (16)
- アミノ酸位置H26〜H32、H33、H35、H37、H39、H43、H44、H45、H46、H47、H50、H53〜H55、H56、H58、H60、H61、H62、H89、H91、H95、H96〜H101、H102、H103、H105、L26〜L32、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50〜L52、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91〜L96、L97、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)にドナー非ヒト抗体由来のアミノ酸残基を含み、かつ軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインにおける残りの位置に、アクセプターヒト抗体もしくはヒト化抗体またはアクセプターヒト生殖細胞系列アミノ酸配列由来の残基を含む、ヒト化抗体。
- 親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択するための方法であって、以下の段階:
‐親抗体Fvフラグメント由来の1つまたは複数の特異性決定残基をアクセプター抗体Fvフラグメントに移植する/移行させることによって多数の変異抗体Fvフラグメントを作製する段階であって、多数の変異抗体Fvフラグメントの各変異抗体Fvフラグメントが、他の変異抗体Fvフラグメントとは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐親Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体Fvフラグメントの変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、抗体Fvフラグメントの配列フィンガープリントに基づきVH-VL配向を決定する段階、
‐親抗体のVH-VL配向と比較してVH-VL配向において最小の差(smallest difference)を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含み、1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントが親抗体Fvフラグメントと同じ抗原に結合する、方法。 - ‐親抗体のVH-VLドメイン間角度と比較してVH-VLドメイン間角度において最大の類似性(highest similarity)を有する変異抗体Fvフラグメントを選択し、それによって、親抗体Fvフラグメントに由来する1つまたは複数の変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含む、請求項2記載の方法。 - 親抗体Fvフラグメントが非ヒト抗体Fvフラグメントである、請求項2〜3のいずれか一項記載の方法。
- アクセプター抗体Fvフラグメントが、ヒト抗体Fvフラグメントもしくはヒト化抗体Fvフラグメントまたはヒト抗体Fvフラグメント生殖細胞系列アミノ酸配列である、請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
- 配列フィンガープリントがVH-VL境界面残基のセットである、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- VH-VL境界面残基のセットが、残基L44、L46、L87、H45、H62(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、請求項6記載の方法。
- VH-VL境界面残基のセットが、残基H33、H35、H37、H39、H43、H44、H45、H46、H47、H50、H55、H56、H58、H60、H61、H62、H89、H91、H95、H96、H98、H99、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94/L95x-1、L95x、L96、L97、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)を含む、請求項6〜7のいずれか一項記載の方法。
- VH-VL配向が、6つのABangle VH-VL配向パラメーターを計算することによって決定される、請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
- VH-VL配向が、各ABangleに関して1つのランダムフォレスト法を用いてABangle VH-VL配向パラメーターを計算することによって決定される、請求項2〜9のいずれか一項記載の方法。
- VH-VL配向が、VHおよびVLの回転軸のねじれ角、4つの屈曲角(可変ドメイン当たり2つ)および長さ(HL、HC1、LC1、HC2、LC2、dc)をランダムフォレストモデルを用いて計算することによって決定される、請求項2〜10のいずれか一項記載の方法。
- ランダムフォレストモデルが複合体抗体構造データのみを用いて訓練される、請求項10〜11のいずれか一項記載の方法。
- 最小の差が最大のQ2値である、請求項2〜12のいずれか一項記載の方法。
- 最大の類似性が最小平均の二乗平均平方根偏差(RMSD)である、請求項2〜13のいずれか一項記載の方法。
- コンセンサスVHフレームワークまたはVLフレームワークのいずれかに対してアライメントが行われたテンプレート構造から構築され、その後に類似性に基づいて選択されたVH-VL配向テンプレート構造に対するVH-VL再配向が行われたモデルが、VH-VL配向を決定するために用いられる、請求項2〜14のいずれか一項記載の方法。
- ‐1つまたは複数の抗体または抗体Fvフラグメントを選択する段階であって、以下の段階:
‐非ヒト抗体由来の1つまたは複数の特異性決定残基をヒトアクセプター抗体もしくはヒト化アクセプター抗体または生殖細胞系列抗体配列に移植する/移行させることによって多数の変異抗体を作製する段階であって、多数の変異抗体の各変異抗体が、他の変異抗体とは少なくとも1つのアミノ酸残基で異なっている段階、
‐VHおよびVLの回転軸の、習慣的に使用されるねじれ角、4つの屈曲角(可変ドメイン当たり2つ)および長さ(HL、HC1、LC1、HC2、LC2、dc)を、抗体Fvフラグメントの残基H33、H35、H37、H39、H43、H44、H45、H46、H47、H50、H55、H56、H58、H60、H61、H62、H89、H91、H95、H96、H98、H99、H100x-2、H100x-1、H100x、H101、H102、H103、H105、L32、L34、L36、L38、L41、L42、L43、L44、L45、L46、L49、L50、L53、L55、L56、L85、L87、L89、L91、L93、L94/L95x-1、L95x、L96、L97、L100(Chothiaインデックスによる番号付け)からなるVH-VL境界面残基のセットに基づくランダムフォレストモデルを用いて計算することによって、非ヒト抗体Fvフラグメントに関して、および多数の変異抗体の変異抗体Fvフラグメントのそれぞれに関して、VH-VL配向を決定する段階、
‐非ヒト抗体Fvフラグメントおよび変異抗体Fvフラグメントの対応するCα原子のすべての対に関して決定された最小の平均二乗平均平方根偏差(RMSD)を有する変異抗体Fvフラグメントを選択する段階
を含む、段階、
‐1つまたは複数の抗体から、単一の抗体をその結合特性に基づいて選択する段階、
‐そのVHおよびVLをコードする核酸を1つまたは複数の発現ベクター中にクローニングする段階、
‐細胞に、前記段階で得られた発現ベクターをトランスフェクトする段階、
‐トランスフェクトされた細胞を培養し、それによって抗体を産生させる段階
を含む、抗体を作製するための方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14190307 | 2014-10-24 | ||
EP14190307.0 | 2014-10-24 | ||
PCT/EP2015/074294 WO2016062734A1 (en) | 2014-10-24 | 2015-10-21 | Vh-vl-interdomain angle based antibody humanization |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017531443A true JP2017531443A (ja) | 2017-10-26 |
JP6829194B2 JP6829194B2 (ja) | 2021-02-10 |
Family
ID=51799006
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017522101A Active JP6829194B2 (ja) | 2014-10-24 | 2015-10-21 | Vh−vlドメイン間角度に基づく抗体ヒト化の方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20170204182A1 (ja) |
EP (1) | EP3209684B1 (ja) |
JP (1) | JP6829194B2 (ja) |
KR (1) | KR20170070070A (ja) |
CN (1) | CN107074933B (ja) |
BR (1) | BR112017005451A2 (ja) |
CA (1) | CA2960445A1 (ja) |
DK (1) | DK3209684T3 (ja) |
ES (1) | ES2857553T3 (ja) |
MX (1) | MX2017004001A (ja) |
RU (1) | RU2017115212A (ja) |
WO (1) | WO2016062734A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW201829463A (zh) | 2016-11-18 | 2018-08-16 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 抗hla-g抗體及其用途 |
RU2766234C2 (ru) | 2017-04-04 | 2022-02-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Новые биспецифические антигенсвязывающие молекулы, обладающие способностью специфически связываться с cd40 и fap |
CN110945023B (zh) | 2017-07-31 | 2023-08-18 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 基于三维结构的人源化方法 |
TWI829667B (zh) | 2018-02-09 | 2024-01-21 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 結合gprc5d之抗體 |
AR115052A1 (es) | 2018-04-18 | 2020-11-25 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos |
AR114789A1 (es) | 2018-04-18 | 2020-10-14 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos |
MX2021003548A (es) | 2018-10-01 | 2021-05-27 | Hoffmann La Roche | Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap. |
CN112654641A (zh) | 2018-10-01 | 2021-04-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 具有与cd40的三价结合的双特异性抗原结合分子 |
EP3990492A1 (en) | 2019-06-27 | 2022-05-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them |
AR119382A1 (es) | 2019-07-12 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso |
CN114174338A (zh) | 2019-07-31 | 2022-03-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 与gprc5d结合的抗体 |
CR20220019A (es) | 2019-07-31 | 2022-02-11 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se fijan a gprc5d |
AR121706A1 (es) | 2020-04-01 | 2022-06-29 | Hoffmann La Roche | Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap |
AR126009A1 (es) | 2021-06-02 | 2023-08-30 | Hoffmann La Roche | Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam |
WO2023078420A1 (en) * | 2021-11-04 | 2023-05-11 | Vibrant Pharma Limited | Methods for antibody optimization |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001027160A1 (en) * | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Methods of optimizing antibody variable region binding affinity |
JP2006516408A (ja) * | 2003-02-01 | 2006-07-06 | タノックス インコーポレーテッド | 高親和性抗体の生成方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
AU2002368077B2 (en) * | 2001-07-12 | 2010-03-04 | Jefferson Foote | Super humanized antibodies |
GB0613209D0 (en) * | 2006-07-03 | 2006-08-09 | Ucb Sa | Methods |
EP2250198B1 (en) * | 2008-01-23 | 2016-03-09 | Department of Biotechnology | A humanized high affinity recombinant antibody against hepatitis b surface antigen |
GB0914691D0 (en) * | 2009-08-21 | 2009-09-30 | Lonza Biologics Plc | Immunoglobulin variants |
CN102740877B (zh) * | 2009-09-06 | 2015-01-14 | 普罗塔布有限公司 | 对源自hsp65的肽-6有特异性的人源化抗体及其方法和用途 |
WO2013039954A1 (en) * | 2011-09-14 | 2013-03-21 | Sanofi | Anti-gitr antibodies |
-
2015
- 2015-10-21 WO PCT/EP2015/074294 patent/WO2016062734A1/en active Application Filing
- 2015-10-21 JP JP2017522101A patent/JP6829194B2/ja active Active
- 2015-10-21 DK DK15784344.2T patent/DK3209684T3/da active
- 2015-10-21 CA CA2960445A patent/CA2960445A1/en not_active Abandoned
- 2015-10-21 CN CN201580056696.2A patent/CN107074933B/zh active Active
- 2015-10-21 RU RU2017115212A patent/RU2017115212A/ru not_active Application Discontinuation
- 2015-10-21 BR BR112017005451A patent/BR112017005451A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-10-21 KR KR1020177010887A patent/KR20170070070A/ko unknown
- 2015-10-21 EP EP15784344.2A patent/EP3209684B1/en active Active
- 2015-10-21 ES ES15784344T patent/ES2857553T3/es active Active
- 2015-10-21 MX MX2017004001A patent/MX2017004001A/es unknown
-
2017
- 2017-03-31 US US15/475,440 patent/US20170204182A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-03-16 US US16/820,094 patent/US20200377590A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001027160A1 (en) * | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Methods of optimizing antibody variable region binding affinity |
JP2006516408A (ja) * | 2003-02-01 | 2006-07-06 | タノックス インコーポレーテッド | 高親和性抗体の生成方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PROTEIN ENG. DES. SEL. (2013) VOL.26, NO.10, P.611-620, JPN6019034999, ISSN: 0004275256 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK3209684T3 (da) | 2021-02-22 |
BR112017005451A2 (pt) | 2018-01-02 |
CA2960445A1 (en) | 2016-04-28 |
WO2016062734A1 (en) | 2016-04-28 |
CN107074933B (zh) | 2021-03-19 |
CN107074933A (zh) | 2017-08-18 |
MX2017004001A (es) | 2017-06-30 |
EP3209684A1 (en) | 2017-08-30 |
ES2857553T3 (es) | 2021-09-29 |
US20200377590A1 (en) | 2020-12-03 |
RU2017115212A (ru) | 2018-11-26 |
US20170204182A1 (en) | 2017-07-20 |
JP6829194B2 (ja) | 2021-02-10 |
KR20170070070A (ko) | 2017-06-21 |
RU2017115212A3 (ja) | 2019-04-24 |
EP3209684B1 (en) | 2020-12-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6829194B2 (ja) | Vh−vlドメイン間角度に基づく抗体ヒト化の方法 | |
JP5457009B2 (ja) | ヒトに適合したモノクローナル抗体における使用法 | |
US20230016112A1 (en) | Engineered cd25 polypeptides and uses thereof | |
CN110612308A (zh) | 制备pH依赖性抗体的方法 | |
JP7217772B2 (ja) | 三次元構造に基づくヒト化方法 | |
Lu et al. | Frontier of therapeutic antibody discovery: The challenges and how to face them | |
JP5323710B2 (ja) | ヒトに適合するモノクローナル抗体に使用するための方法 | |
AU2016301969A1 (en) | Novel anti-human GPVI antibodies and uses thereof | |
JP7412440B2 (ja) | アビド結合多重特異性抗体を作製する方法 | |
Arslan et al. | Conformational changes in a Vernier zone region: Implications for antibody dual specificity | |
JP2023508366A (ja) | 二重特異性fcyriii×cd30抗体構築体の製造方法 | |
WO2024006975A1 (en) | Methods for antibody humanization | |
Almagro et al. | Humanization of antibodies | |
Rebouças et al. | Binding Free Energy to Evaluate Rituximab Single Chain Fragment Variable and CD20 Peptide Interaction by Adaptative Biasing Force Algorithm Through Molecular Dynamics Simulations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181005 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190909 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191205 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200824 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210113 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210121 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6829194 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |