CN110612308A - 制备pH依赖性抗体的方法 - Google Patents

制备pH依赖性抗体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110612308A
CN110612308A CN201880030586.2A CN201880030586A CN110612308A CN 110612308 A CN110612308 A CN 110612308A CN 201880030586 A CN201880030586 A CN 201880030586A CN 110612308 A CN110612308 A CN 110612308A
Authority
CN
China
Prior art keywords
histidine
amino acid
antibody
engineered
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880030586.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110612308B (zh
Inventor
克里斯托弗·布朗什托
埃里克·霍夫曼
乔纳斯·德哈德
雅各布斯·科内利斯·拉塞尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alkings Co Ltd
Original Assignee
Alkings Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alkings Co Ltd filed Critical Alkings Co Ltd
Publication of CN110612308A publication Critical patent/CN110612308A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110612308B publication Critical patent/CN110612308B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

公开了用于制备表现出改善的pH依赖性抗原结合的工程化抗体的方法。所述方法基于在抗体CDR内的限定的氨基酸位置的子集处引入组氨酸残基。用于组氨酸替换的所选氨基酸位置的组来源于来自天然抗体库之功能性抗体的CDR内的组氨酸存在的热图。所述方法提供了鉴定pH依赖性抗体变体的更简单且耗时更少的方法。

Description

制备pH依赖性抗体的方法
技术领域
本公开内容涉及抗体工程化的领域，并且具体地涉及用于对表现出与靶抗原pH依赖性结合的抗体变体进行工程化的方法，以及通过该方法制备的抗体。
背景技术
对表现出与靶抗原pH依赖性结合的抗体的工程化存在日益增长的兴趣。特别地，令人感兴趣的是鉴定与中性pH相比在酸性pH下表现出降低的抗原结合的抗体。
并入pH敏感型抗原结合可导致体内工程化抗体的功能改善。抗体可以是经工程化的以在中性pH(例如pH 7.4)下保持高亲和力抗原结合并且在酸性pH(例如pH 4.5至6.0)下显示出降低的结合。当进入内体途径时，pH依赖性抗原结合允许抗体-抗原复合物在酸化的内体(约pH 6.0)中解离和FcRn介导的游离抗体的再循环，进而促进增强的抗原清除，这可使得能够进行更低频率地或更低地抗体给药。
通常，pH依赖性抗体-抗原结合依赖于可电离的组氨酸残基的存在，所述组氨酸残基介导相互作用的抗体的结合或折叠中的结构转变。在较低的pH值下的组氨酸质子化之后诱导的静电相互作用的改变可导致结合亲和力降低。
已经描述了多种蛋白质工程化方法，其目的是通过使用不同的组氨酸替换策略将pH敏感性并入到蛋白质中。例如，由粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，GCSF)受体相互作用位点的结构建模指导的合理设计能够鉴定在组氨酸替换之后导致pH敏感型变体的突变位点(Sarkar等，Nat Biotechnol，Vol.20，pp908-13，2002)。然而，评估可介导蛋白质中的pH敏感性的组氨酸替换的单独位置是耗时且不可预测的。
作为一种替代方法，用合适的高通量技术(例如，酵母表面展示(yeast surfacedisplay，YSD)或噬菌体展示)筛选组合文库已经应用于多种不同蛋白质骨架中的pH敏感型结合的工程化。等，mAbs，vol.7(1)，138-151，2015描述了针对可逆的pH敏感型抗原结合，对抗体重链和轻链可变结构域进行工程化的通用策略。这种方法依赖于重链和轻链组合的组氨酸替换文库的产生和筛选。在这种方法中，将组氨酸突变随机引入到VH和VL区的互补决定区(complementary-determining region，CDR)中。组氨酸突变可被引入至VH结构域和VL结构域的CDR中的任何氨基酸位置处。调整组氨酸突变的速率以实现每个文库变体的平均三个随机突变。因此，完整的文库理论上包含含有CDR中三个随机组氨酸替换的所有可能组合的变体。
这种组合文库方法确实能够成功地鉴定表现出与TNF pH依赖性结合的阿达木单抗(adalimumab)的工程化变体。然而，由于针对可能的组氨酸替换对VH和VL结构域的CDR内的所有氨基酸位置进行采样所需的文库规模大，因此该策略是相对耗时的。此外，没有考虑通过在不利位置处引入组氨酸残基的总体抗体结构和稳定性。
发明概述
需要用于制备表现出与靶抗原pH依赖性结合的工程化抗体变体的替代方法，其比现有技术的方法执行起来更简单且耗时更少。此外，还需要能够鉴定表现出pH依赖性抗原结合的工程化抗体而不会不适当地影响中性pH下的抗原结合能力的方法。
为了满足这些需求，申请人已经对功能性(即抗原结合)抗体可变结构域的大库的互补决定区(CDR)内组氨酸残基的天然存在进行了系统分析。该分析的结果使得申请人能够得到天然抗体内的天然组氨酸存在的“热图(heat-map)”。“热图”不仅提供了CDR内的“热点(hot-spot)”氨基酸残基(在此处组氨酸可天然存在于抗体库内)的列表，还提供了CDR中的“冷点(cold-spot)”氨基酸残基(在此处组氨酸通常不天然存在)的列表。“热点”和“冷点”列表可例如以合理的设计或组合的方法应用于pH依赖性抗体变体的工程化。
在第一方面中，本发明提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括通过用组氨酸残基替换亲本抗体的至少一个氨基酸残基来制备所述工程化抗体，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65
VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33
VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56
VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
其中所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合。
由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，工程化抗体表现出改善的pH依赖性结合(即更大的pH依赖性)。
本发明还提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)提供与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65
VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33
VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56
VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，步骤(c)中鉴定的工程化抗体表现出改善的pH依赖性结合(即更大的pH依赖性)。
本发明还提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65
VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33
VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56
VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
(c)针对与所述靶抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予与所述抗原的pH依赖性结合；
(d)制备所述亲本抗体的一种或更多种另外的工程化变体，其中每种所述变体在步骤(c)中鉴定的两个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸；以及
(e)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述另外的工程化变体；并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，步骤(e)中鉴定的工程化抗体表现出改善的pH依赖性结合(即更大的pH依赖性)。
在第二方面中，本发明提供了工程化抗体，其表现出与其抗原的pH依赖性结合，其中所述工程化抗体的CDR中的至少一个氨基酸是组氨酸残基，其特征在于选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基是组氨酸残基：
并且选自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基不是组氨酸残基：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65
VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33
VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56
VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
。
发明详述
本公开内容提供了制备表现出与靶抗原pH依赖性结合的工程化抗体的方法，所述方法基于用组氨酸残基替换亲本抗体的可变结构域中(并且优选在其CDR内)的所选氨基酸。本领域中通常已知的是，将可电离的组氨酸残基引入到抗体分子的VH和/或VL结构域中可改变抗原结合的pH依赖性。但是，迄今为止，用于pH依赖性抗原结合的工程化的可用方法在很大程度上依赖于筛选随机的组合文库，其中针对可能被替代为组氨酸对CDR中的所有氨基酸残基进行采样。
本发明的方法与现有技术中的方法的不同之处在于，通过以下来指导用于用组氨酸进行替换的特定氨基酸残基的选择：功能性抗体分子的VH和VL结构域内(并且更特别地在其CDR内)的特定氨基酸位置处的组氨酸残基的天然存在；和另外地在CDR中的其他氨基酸位置处的组氨酸残基的天然不存在。因此，本文中公开的方法基于在选自可变结构域(并且特别地CDR)内氨基酸位置的预选子集的氨基酸位置处的组氨酸替换，而CDR中的其他残基被预选为优选不被组氨酸替换。
被预选为用组氨酸进行替换的候选的氨基酸残基在本文中被称为“热点”残基(表A)。这些是CDR中的氨基酸位置，或CDR附近的框架位置，在这些位置处已观察到组氨酸天然存在于功能性抗体库内。
表A(热点残基位置)
被预选为优选不被组氨酸替换的氨基酸残基在本文中被称为“冷点”残基(表B)。这些是CDR中的氨基酸位置，或CDR附近的框架位置，在这些位置处未观察到组氨酸在功能性抗体库内。
表B(冷点残基位置)
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65
VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33
VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56
VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
本公开内容提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括通过用组氨酸残基(其在本文中可缩写为HIS)替换亲本抗体的至少一个氨基酸残基来制备所述工程化抗体。由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，工程化抗体表现出改善的pH依赖性结合(即更大的pH依赖性)。“亲本抗体”可以是能够与目的抗原结合的任何抗体。亲本抗体通常是常规的四链免疫球蛋白，其中成对的VH和VL结构域赋予抗原结合特异性。但是，所述方法也适用于以下的pH依赖性结合的工程化：其他亲本抗体，和抗原结合片段，例如Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、微型抗体(minibody)等，以及包含由成对的VH和VL结构域提供的抗原结合位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白构型。在某些实施方案中，亲本抗体或其可变结构域或CDR可来源于骆驼科物种，包括但不限于：大羊驼(llama)、骆驼(camel)、单峰驼(dromedary)、阿尔帕卡羊驼(alpaca)、小羊驼或原驼(guanaco)。骆驼科单克隆抗体的制备在WO2010/001251中详细描述，其内容通过引用并入本文。亲本抗体和来源于其的工程化抗体的其他优选特征在本文中其他地方描述。亲本抗体所结合的抗原的性质没有特别地限制。
通过将亲本抗体的一个或更多个所选氨基酸残基替换为组氨酸来制备工程化抗体。与亲本抗体相比，工程化抗体可包含总共1、2、3、4、5个或更多个组氨酸替换。被替换为组氨酸的所选氨基酸残基通常位于抗体可变结构域的CDR内、或在CDR附近的框架位置处。在抗体分子包含成对的VH和VL结构域的情况下，用于用组氨酸进行替换的所选残基可位于VH结构域的CDR中，或位于VL结构域的CDR中，或位于VH结构域和VL结构域二者的CDR中。
如本文中所述，被替换为组氨酸的氨基酸位置中的至少一个必须选自“热点”列表(表A)。在某些实施方案中，被替换为组氨酸的氨基酸位置中的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个选自“热点”列表。在某些实施方案中，工程化抗体中的所有组氨酸替换是在选自热点列表(表A)的氨基酸位置处进行的，即，仅热点列表中的残基可被选择用于用组氨酸进行替换。但是，在另一些实施方案中，可在一个或更多个不在热点列表上的位置处包含组氨酸替换，前提是至少一个组氨酸替换是在选自热点列表(表A)中的位置处进行的。例如，如以下所讨论的，在某些实施方案中，可在VH CDR3和/或VL CDR3内的“冷点”位置处包含一个或更多个组氨酸替换。
如本文中所述，在亲本抗体中存在某些氨基酸位置，其优选不被选择用于用组氨酸进行替换。这些氨基酸位置是“冷点”列表(表B)上示出的那些。根据本文中所述的方法制备的工程化抗体必须包含冷点列表(表B)上的至少一个未被替换为组氨酸的氨基酸位置。在某些实施方案中，冷点列表(表B)上的氨基酸位置的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个未被替换为组氨酸。在另一些实施方案中，冷点列表(表B)上的氨基酸位置均未被替换为组氨酸。
在VH CDR3和VL CDR3的情况下，也允许(并且在某些实施方案中可以是有益的)在表B中列出的一个或更多个冷点氨基酸残基位置处引入组氨酸替换，并且测试所得抗体变体的pH依赖性结合。考虑到VH CDR3和VL CDR3的高度可变的性质，在这些CDR中的冷点位置(除了热点位置之外或作为热点位置的替代)处引入组氨酸残基可比在CDR1和CDR2中的冷点位置处引入组氨酸残基更容易地在抗体结构内被耐受，并且可对pH依赖性抗原结合做出重要贡献。因此，在VH CDR3和VL CDR3中列出的冷点位置处的组氨酸替换在本发明的所有方面中均是允许的。
在一个具体的实施方案中，被替换为组氨酸的所有氨基酸残基均选自热点列表(表A)，前提是一个或更多个以下残基还可被替换为组氨酸：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。
pH依赖性结合
已根据本文中所述的方法将一个或更多个组氨酸替换引入至其中的工程化抗体可表现出与靶抗原的pH依赖性结合。
本文中关于抗体-抗原结合相互作用使用的术语“pH依赖性结合”意指酸性pH下抗体的抗原结合活性不同于中性pH下抗体的抗原结合活性。
抗原结合活性的多种量度可用作在酸性pH相对于中性pH下抗原结合活性的差异的指标。
在一个实施方案中，抗体对其抗原的“亲和力”可用作抗原结合活性的指标。在一些优选的实施方案中，如果在酸性pH下工程化抗体对其抗原的亲和力低于在中性pH下该工程化抗体对其抗原的亲和力，则该工程化抗体表现出“pH依赖性结合”。
在一个实施方案中，抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)(也称为抗体解离速率(antibody off-rate，koff)可用作抗原结合活性的指标。在一个优选的实施方案中，如果在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于在中性pH下该工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)，则该工程化抗体表现出“pH依赖性结合”。
在其中解离速率常数(kd)用作pH依赖性结合的指标的一些实施方案中，在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)与在中性pH下该工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)的比值可以为至少1.5、或至少2、或至少5、或至少10。
在另一些实施方案中，在酸性pH(例如pH 5.5)下工程化抗体的解离速率常数(kd)高于在同一酸性pH下亲本抗体的解离速率常数(kd)。在这样的实施方案中，由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，在酸性pH(例如pH 5.5)下的kd提高。在某些实施方案中，在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)与在同一酸性pH下亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)的比值可以为至少1.5、或至少2、或至少5、或至少10。考虑到体内抗体再循环途径，在酸性pH(例如pH 5.5)下的解离速率(kd)是pH依赖性结合的特别相关的量度。在酸性pH(pH 5.5至6.0)下抗体-抗原复合物的更快解离能够使抗原在酸化的内体内释放。
在一个实施方案中，平衡解离常数(KD)可用作抗原结合活性的指标。在一些优选的实施方案中，如果在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于在中性pH下该工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)，则该工程化抗体表现出“pH依赖性结合”。
在其中平衡解离常数(KD)用作pH依赖性结合的指标的一些实施方案中，在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)与在中性pH下该工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)的比值可大于1.5、或大于2、或大于5、或大于10。在一些特别优选的实施方案中，工程化抗体在中性pH下可表现出相对于酸性pH下的抗原结合强20至40倍的抗原结合。
在其中平衡解离常数(KD)用作抗原结合活性的指标的一些非限制性实施方案中，在酸性pH(例如pH 5.5)下工程化抗体可表现出10至20nM的对其抗原的平衡解离常数(KD)；而在中性pH(例如pH 7.4)下工程化抗体对其抗原的KD可为约0.5nM或更小。
可用于指示pH依赖性结合的抗原结合活性的其他量度可包括亲和常数或结合速率常数(ka)或结合速率(on-rate)(kon)。
对于拮抗性抗体，抗原结合活性的量度可以是阻断效力，即在合适的测定中的IC50。
在一个优选的实施方案中，与亲本抗体相比，包含一个或更多个组氨酸替换的工程化抗体表现出与其抗原结合的更大的pH依赖性。“结合的更大的pH依赖性”意指对于工程化抗体而言酸性pH下的抗原结合活性与中性pH下的抗原结合活性之间的差异比对于亲本抗体(工程化抗体来源于其)而言显著更大。
在一些实施方案中，亲本抗体可不表现出与其靶抗原结合的显著pH依赖性，并且由于一个或更多个组氨酸替换，pH依赖性可被引入到工程化变体中。在另一些实施方案中，亲本抗体可表现出可测量的pH依赖性，由于一个或更多个组氨酸替换，pH依赖性在工程化变体中显著提高。
在某些实施方案中，可以将pH依赖性引入到工程化抗体中，而不会显著损害中性pH下抗原-抗体结合的强度。在这样的实施方案中，与亲本抗体(工程化抗体来源于其)相比，工程化抗体可表现出在酸性pH下显著更低的抗原结合活性，而在中性pH下该工程化抗体的抗原结合活性可与亲本抗体(工程化抗体来源于其)的抗原结合活性相当(即无显著差异)。
本文中所述方法(其中根据功能性抗体库中天然组氨酸存在的“热图”选择的用于组氨酸替换的候选氨基酸)的一个优点是，组氨酸残基通常仅引入至“热点”氨基酸位置处(在所述“热点”氨基酸位置处组氨酸残基可天然存在于抗体库内)，并且因此在抗体结构内被耐受。已经观察到，在热点位置处的组氨酸替换可赋予抗原结合的pH依赖性，而不显著影响中性pH下的抗原结合活性的强度。
在一个实施方案中，与亲本抗体相比，工程化抗体表现出与其抗原结合的更大的pH依赖性，同时保留在中性pH下亲本抗体的抗原结合活性的至少80％。在另一些实施方案中，工程化抗体可保留在中性pH下亲本抗体的抗原结合活性的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％，同时仍表现出pH依赖性结合。
在一个优选的实施方案中，与亲本抗体相比，工程化抗体表现出与其抗原结合的更大的pH依赖性，同时保留在中性pH下亲本抗体对所述抗原的亲和力的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。
在其中平衡解离常数(KD)用作抗原结合活性的指标的一些实施方案中，在中性pH下工程化抗体对靶抗原的平衡解离常数(KD)可以比在中性pH下亲本抗体对靶抗原的KD大不超过20％、或不超过15％、或不超过10％、或不超过5％。在另一些实施方案中，在中性pH下工程化抗体对靶抗原的平衡解离常数(KD)可以基本上等于在中性pH下亲本抗体对靶抗原的KD。
在另一些实施方案中，pH依赖性的引入可导致在中性pH下工程化抗体对其抗原的亲和力降低。但是，取决于靶抗原的性质、抗体的预期用途以及亲本抗体的性质，在中性pH下亲和力的降低可以是可接受的，前提是期望的结合的pH依赖性得以实现。例如，如果在中性pH下亲本抗体表现出对其抗原的特别高的亲和力，那么在中性pH下工程化抗体对其抗原的亲和力的降低可以被忍受，条件是这伴随着pH依赖性的显著提高(即，前提是中性pH下的结合与酸性pH下的结合之间期望的“倍数差异”得以实现)。在某些实施方案中，在中性pH下工程化抗体对其靶抗原的亲和力可比在中性pH下亲本抗体对该抗原的亲和力低多至10倍、或甚至20倍，前提是期望的结合的pH依赖性也得以实现。
在每个前述实施方案中，“酸性pH”是指pH为pH 4.0至pH 6.5，优选pH 4.5至pH6.0，更优选pH 5.5至pH 6.0，并且更优选pH 5.5至pH 5.8。
在每个前述实施方案中，“中性pH”是指pH为pH 6.7至pH 10.0，优选pH 7.0至pH8.0，更优选pH 7.4。
在一些具体的实施方案中，可通过比较在酸性pH 5.5下抗体的抗原结合活性与在中性pH 7.4下同一抗体的抗原结合活性来评价pH依赖性结合。
在另一些实施方案中，可通过比较在酸性pH 6.0下抗体的抗原结合活性与在中性pH 7.4下同一抗体的抗原结合活性来评价pH依赖性结合。
用于确定在限定的pH下抗体的抗原结合活性的合适方法和条件是本领域中通常已知的。例如，可通过(GE Healthcare)(如在所附实验例中所述的)、通过ELISA或使用MSD平台来测量在限定的pH下抗体的抗原结合活性。
组氨酸存在的热图
如本文中所述，可基于天然抗体库内功能性抗体的CDR内某些氨基酸位置处的组氨酸残基存在的“热图”，选择用于被替代为组氨酸或不被替代为组氨酸的亲本抗体的氨基酸残基。“热图”不仅提供了CDR内的“热点”氨基酸残基位置和CDR附近的框架位置(在所述位置处组氨酸可天然存在于抗体库内)的列表，还提供了CDR中的“冷点”氨基酸残基位置和CDR附近的框架位置(在所述位置处组氨酸通常不天然存在)的列表。
“抗体库”意指显示出抗原结合活性的抗体群。“天然抗体库”通常是通过用靶抗原免疫宿主而产生的抗体群。所述库可包含针对多于一种靶抗原的抗体。在本公开内容中，组氨酸存在的“热图”来源于大羊驼抗体的多样性库，其本身是通过用多种不同的靶抗原免疫宿主动物而得到的。从这些免疫中分离的抗体还通过特定的噬菌体展示选择进行了筛选，从而允许富集表现出pH依赖性抗原结合的抗体。
用于替代的残基的选择
对于任何给定的亲本抗体，通过组氨酸存在的热图指导用于被替代为组氨酸的候选氨基酸残基的选择。
氨基酸残基的术语“替换”或“替代”在本文中可互换使用。在作为亲本抗体的工程化变体的工程化抗体的情况下，“替换”要求将亲本抗体中限定的氨基酸位置处的氨基酸残基替代为不同的氨基酸残基，即组氨酸残基，其在亲本抗体中的该位置处不天然存在。
本文中所述的组氨酸存在的“热图”提供了热点氨基酸位置的列表，在所述热点氨基酸位置处已观察到组氨酸天然存在。目的亲本抗体(工程化抗体将来源于其)可在热点列表上的一个或更多个氨基酸位置处天然地包含组氨酸残基。在这些情况下，天然组氨酸残基通常会保留在工程化抗体内，因为其可促进pH依赖性抗原结合。然而，出于本文中所述方法的目的，该天然存在的组氨酸将不被视为组氨酸替换。因此，本文中所述的方法要求工程化抗体与亲本抗体(工程化抗体来源于其)相比必须在一个或更多个热点氨基酸位置处包含至少一个另外的组氨酸残基。将一个或更多个另外的组氨酸残基引入到工程化抗体中可改善工程化抗体的pH依赖性结合(即，导致与靶抗原结合的更大的pH依赖性)，甚至对于已经包含热点组氨酸残基的亲本抗体也如此。
从“热点”列表(表A)中选择用于被组氨酸替代的候选氨基酸残基，在该列表中VH和VL结构域的CDR中的氨基酸位置以及CDR附近的框架位置根据KABAT编号系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))进行确认。工程化抗体必须在选自表A的氨基位置处包含至少一个组氨酸替换。
可使用多种方法来选择最合适的组氨酸替换，以在目的亲本抗体中赋予pH依赖性抗原结合。如果可获得亲本抗体与其靶抗原的结合相互作用的结构信息，则采用“合理的设计”方法从用于组氨酸替代的热点列表中选择候选氨基酸可以是合适的。可基于这样的结构信息来选择直接参与抗原-抗体结合相互作用或可能影响亲本抗体的抗原结合界面整体结构的热点残基。然后可例如使用本文中所述的筛选方法合成其中一个或更多个所选热点残基或其不同组合被替换为组氨酸的亲本抗体的工程化变体，并针对pH依赖性抗原结合对其进行筛选。
还可基于亲本抗体的可变结构域家族或亚型来选择用于组氨酸替换的候选残基。本文中描述了热点残基的多种亚型特异性列表，其也来源于抗体库内的组氨酸存在的热图。在其中已知亲本抗体的VH和/或VL结构域的可变结构域家族或亚型的某些实施方案中，用于组氨酸替换的候选残基可选自以下的亚型特异性或家族特异性热点列表。这些列表不旨在是限制性的，而仅提供对于特定可变结构域家族或亚型的组氨酸替代可以是最适合的氨基酸位置的指导。对于任何给定的可变结构域，可从完整的热点列表(表A)中选择可能被替代为组氨酸的氨基酸位置，而与可变结构域家族或亚型无关。
对于VH3家族的重链可变结构域：
表VH3A(VH3家族热点残基)
表VH3B(VH3家族冷点残基)
CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H63，H64，H65
CDR3 H100g，H100h，H100i，H100k，H100I，H100m，H100n
对于VH1家族的重链可变结构域：
表VH1A(VH1家族热点残基)
CDR1 H35
CDR2 H52
CDR3 H100h，H102
表VH1B(VH1家族冷点残基)
对于VH4家族的重链可变结构域：
表VH4A(VH4家族热点残基)
CDR1
CDR2 H50，H52，H63
CDR3 H95，H100f，H100i，H100l
表VH4B(VH4家族冷点残基)
对于λ型的轻链可变结构域：
表VλA(Vλ热点残基)
CDR1 L30，L31，L32，L34，
CDR2 L51，L52，L53，L55，
CDR3 L89，L91，L92，L93，L95a，L95b，L95c，L96
表VλB(Vλ冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L33
CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L54，L56
CDR3 L90，L94，L95，L95d，L95e，L95f，L97
对于Vλ1家族的轻链可变结构域：
表Vλ1A(Vλ1家族热点残基)
CDR1 L31，L32
CDR2
CDR3 L91，L93，L95a，L95b，L96
表Vλ1B(Vλ1家族冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L30，L33，L34
CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L53，L54，L55，L56
CDR3 L89，L90，L92，L94，L95，L95c，L95d，L95e，L95f，L97
对于Vλ2家族的轻链可变结构域：
表Vλ2A(Vλ2家族热点残基)
CDR1
CDR2
CDR3 L95a，L96
FR L87
表Vλ2B(Vλ2家族冷点残基)
对于Vλ3家族的轻链可变结构域：
表Vλ3A(Vλ3家族热点残基)
CDR1 L31，L32，L34
CDR2 L51，L52
CDR3 L89，L91
FR L49，L87
表Vλ3B(Vλ3家族冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L30，L33
CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L53，L54，L55，L56
CDR3 L90，L92，L93，L94，L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L96，L97
对于Vλ5家族的轻链可变结构域：
表Vλ5A(Vλ5家族热点残基)
CDR1 L30，L31，L32
CDR2 L53
CDR3 L92，L95c，L96
FR L49，L87
表Vλ5B(Vλ5家族冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L33，L34
CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L54，L55，L56
CDR3 L89，L90，L91，L93，L94，L95，L95a，L95b，L95d，L95e，L95f，L97
对于Vλ8家族的轻链可变结构域：
表Vλ8A(Vλ8家族热点残基)
CDR1 L31
CDR2 L55
CDR3 L89，L91，L95b
表Vλ8B(Vλ8家族冷点残基)
对于κ型的轻链可变结构域：
表VKA(VK热点残基)
CDR1 L27，L27d，L29，L31，L32
CDR2 L53，L54，L55
CDR3 L89，L90，L91，L92，L93，L94，L96
表VKB(VK冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27A，L27b，L27c，L27e，127f，L28，L30，L33，L34
CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L56
CDR3 L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L97
对于VK1家族的轻链可变结构域：
表VK1A(VK1家族热点残基)
CDR1 L31，L32
CDR2
CDR3 L89，L90，L91，L93
表VK1B(VK1家族冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L30，L33，L34
CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L53，L54，L55，L56
CDR3 L92，L94，L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L96，L97
对于VK2家族的轻链可变结构域：
表VK2A(VK2家族热点残基)
CDR1 L27，L27d，L32
CDR2 L53，L54，L55
CDR3 L91，L93，L94，L96
表VK2B(VK2家族冷点残基)
对于VK4家族的轻链可变结构域：
表VK4A(VK4家族热点残基)
CDR1 L27，L29
CDR2 L54
CDR3 L90，L91，L92
表VK4B(VK4家族冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L30，L31，L32，L33，L34
CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L53，L55，L56
CDR3 L89，L93，L94，L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L96，L97
筛选变体的组
本发明方法的一些具体实施方案可基于构建亲本抗体的工程化变体的组，然后对其进行筛选以鉴定表现出期望的pH依赖性结合的一种或更多种工程化变体。变体的组的构建允许对由热图限定的氨基酸位置处的大量可能的组氨酸替代进行系统的突变分析。该方法与现有技术组合方法的不同之处在于变体的组的构建是通过组氨酸存在的热图来指导的，因此无需或不期望对作为组氨酸替代的候选的CDR中所有可能的氨基酸位置及其组合进行采样。
本文中所述的系统的突变分析方法通常包括以下步骤：
(a)提供与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自热点列表(表A)的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸，并且选自冷点列表(表B)的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸；
(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
该方法需要制备目的亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种工程化变体与亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸被替换为组氨酸。用于用组氨酸进行替代的氨基酸位置的选择也基于组氨酸存在的热图。所述组中的每种工程化变体必须在选自热点列表(表A)的氨基酸位置处包含至少一个组氨酸替换，而在选自冷点列表(表B)的至少一个氨基酸残基处未被替换为组氨酸。优选地，所述组中的每种工程化变体将包含组氨酸替换的不同模式，以允许平行地分析不同组氨酸替换对pH依赖性抗原结合的影响。
在所述方法的一个实施方案中，所述组中的每种工程化变体可在所列的热点氨基酸位置(表A)之一处包含单组氨酸替换。优选地，所述组中的每种工程化变体在所列的热点氨基酸位置(表A)之一处包含不同的组氨酸替换。这样的组允许分析在单独热点氨基酸位置处的组氨酸替换对pH依赖性结合的影响。工程化变体的组可代表整个热点列表，即可包含在表A中列出的每个氨基酸位置处具有单组氨酸替换的变体；或者可代表热点列表的所选子集，例如与一个或更多个特异性可变结构域家族或亚型相关的替换的子集。此外，所述组还可包含在VH CDR3或VL CDR3内的一个或更多个“冷点”位置处包含组氨酸替换的变体。
在另一些实施方案中，在步骤(b)中制备的组可包含工程化变体，所述变体包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或者五个或更多个组氨酸替换的不同组合，前提是至少一个所述替换必须在选自表A的热点氨基酸位置处，而来自表B的至少一个氨基酸未被替换为组氨酸。优选地，所有所述组氨酸替换均在选自表A的热点氨基酸位置处进行。该组允许筛选赋予pH依赖性结合的组氨酸替换的组合(并且特别是热点组氨酸替换的组合)。此外，所述组还可包含变体，所述变体包含在VH CDR3或VL CDR3内的一个或更多个“冷点”位置处的组氨酸替换，其任选地与在一个或更多个热点氨基酸位置处的组氨酸替换组合。
在某些实施方案中，如上所述，可对包含单组氨酸替换的工程化变体的组进行初始筛选以鉴定单氨基酸位置，在所述单氨基酸位置处组氨酸替换可赋予pH依赖性结合。基于该初始筛选的结果，可构建一种或更多种另外的工程化变体，其中组合了先前被鉴定为赋予pH依赖性结合的组氨酸替换。这样的方法可包括以下步骤：
(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自热点列表(表A)的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸，并且选自冷点列表(表B)的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸(优选地其中每种所述工程化变体包含组氨酸替换的不同模式)；
(c)针对与所述靶抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予与所述抗原的pH依赖性结合；
(d)制备所述亲本抗体的一种或更多种另外的工程化变体，其中每种所述变体在步骤(c)中鉴定的两个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸；以及
(e)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述另外的工程化变体；并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
在所述方法的一些具体实施方案中，可分别分析VH结构域和VL结构域中的组氨酸替换对pH依赖性结合的影响。因此，在一个实施方案中，步骤(b)包括制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VH结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自重链热点列表(表HA)的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸，并且选自重链冷点列表(表HB)的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸。此外，所述组还可包含在VHCDR3内的“冷点”位置处包含组氨酸替换的变体。
通常，工程化变体将包含与亲本抗体的VL结构域配对的突变体VH结构域，其包含一个或更多个组氨酸替换。这样的文库允许筛选VH结构域中的赋予pH依赖性结合的组氨酸替换。
表HA(VH热点残基位置)
表HB(VH冷点残基位置)
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c
VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65
VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
在另一个实施方案中，步骤(b)包括制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VL结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自轻链热点列表(表LA)的至少氨基酸残基被替换为组氨酸，并且选自轻链热点列表(表LB)的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸。此外，所述组还可包含在VL CDR3内的“冷点”位置处包含组氨酸替换的变体。
通常，工程化变体将包含与亲本抗体的VH结构域配对的突变体VL结构域，其包含一个或更多个组氨酸替换。这样的文库允许筛选VL结构域中的赋予pH依赖性结合的组氨酸替换。
表LA(VL热点残基位置)
表LB(VL冷点残基位置)
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33
VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56
VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
对于λ类的轻链变体，“热点”和“冷点”残基位置可选自以下列表：
表VλA(Vλ热点残基)
CDR1 L30，L31，L32，L34，
CDR2 L51，L52，L53，L55，
CDR3 L89，L91，L92，L93，L95a，L95b，L95c，L96
表VλB(Vλ冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L33
CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L54，L56
CDR3 L90，L94，L95，L95d，L95e，L95f，L97
对于κ类的轻链变体，“热点”和“冷点”残基位置可选自以下列表：
表VKA(VK热点残基)
CDR1 L27，L27d，L29，L31，L32
CDR2 L53，L54，L55
CDR3 L89，L90，L91，L92，L93，L94，L96
表VKB(VK冷点残基)
CDR1 L24，L25，L26，L27A，L27b，L27c，L27e，127f，L28，L30，L33，L34
CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L56
CDR3 L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L97
在某些实施方案中，通过单独的初始VH和VL结构域筛选鉴定的VH和VL结构域组氨酸替换可在单一工程化变体中组合。然后可进行另外的筛选以鉴定表现出pH依赖性结合的VH和VL组合。这样的方法可包括以下步骤：
(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的第一工程化变体组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VH结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自重链热点列表(表HA)的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸，并且选自重链冷点列表(表HB)的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸；
(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述第一工程化变体组；并且由此鉴定VH结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予pH依赖性结合；
(d)制备所述亲本抗体的第二工程化变体组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VL结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自轻链热点列表(表LA)的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸，并且选自轻链热点列表(表LB)的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸；
(e)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述第二工程化变体组；并且由此鉴定VL结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予pH依赖性结合；
(f)制备所述亲本抗体的一种或更多种另外的工程化变体，其中每种所述变体与所述亲本抗体的不同之处在于在步骤(c)中鉴定的VH结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置处的氨基酸被替换为组氨酸，并且在步骤(e)中鉴定的VL结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置处的氨基酸被替换为组氨酸；以及
(g)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述另外的工程化变体；并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
这种方法能够使得在初始的(单独的)VH和VL结构域筛选中鉴定的组氨酸突变之间鉴定协同作用。例如，可将表现最佳的VH突变(即赋予最大程度的pH依赖性的那些)与许多不同的VL突变组合，或将表现最佳的VL突变与不同的VH突变组合，以鉴定VH和VL结构域突变的不同组合之间的协同作用。在该实施方案中，还可在VH CDR3或VL CDR3内的“冷点”位置处包含组氨酸替换及其组合。
筛选方法
多种筛选方法可用于鉴定表现出与靶抗原pH依赖性结合的工程化抗体。这样的筛选方法可包括以下步骤：
(a)确定在酸性pH下工程化抗体的抗原结合活性；
(b)确定在中性pH下工程化抗体的抗原结合活性；
(c)选择酸性pH下的抗原结合活性不同于中性pH下的抗原结合活性的工程化抗体。
用于确定在限定的pH下的抗原结合活性的合适的方法和条件是本领域中通常已知的。例如，如在所附实验例中所述的，可通过(GE Healthcare)来确定在限定的pH下抗体的抗原结合活性。其他合适的技术(包括ELISA或MSD)可用于确定在不同pH条件(例如pH 7.4和pH 5.5)下在特定抗体浓度(例如EC50)下的抗原结合。
本文中所述的方法可包括以下步骤：在中性pH下和在酸性pH下测量工程化抗体的抗原结合活性，并比较在中性pH和/或酸性pH下的一个或更多个结合参数，以确定表现出pH依赖性结合的工程化抗体。
在某些实施方案中，如在所附实施例中所述的，可通过双pH ELISA来测量工程化抗体的抗原结合活性。在这种设置中，在中性pH(例如pH7.4)下评估抗体与抗原的初始结合，随后在酸性pH(例如pH 5.5)下进行洗涤步骤。这允许区分pH对抗体结合、解离或二者的影响，并且对于如下的体内情况可更具有代表性：在该情况下抗体与靶抗原结合在中性pH下发生，而抗原的释放在酸性内体pH下发生。
通常，所选的工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。在初始的筛选中，酸性pH下的亲和力相对于中性pH下的亲和力的任何显著差异均可指示pH依赖性结合。
在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)(即解离速率)可高于在中性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。在初始的筛选中，酸性pH下的(kd)相对于中性pH下的(kd)的任何显著差异均可指示pH依赖性结合。在另一些实施方案中，在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)与在中性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)的比值可以为至少1.5、或至少2、或至少5、或至少10。当多个组氨酸突变组合时，pH依赖性的整体程度可提高。
在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)可高于在中性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。在初始的筛选中，酸性pH下的KD相对于中性pH下的KD的任何显著差异都可指示pH依赖性结合。在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)与在中性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)的比值可大于1.5、或大于2、或大于5、或大于10。
当多个组氨酸突变组合时，pH依赖性的整体程度可提高。在一些特别优选的实施方案中，组合组氨酸突变在中性pH下可实现相对于酸性pH下的抗原结合强约20至40倍的抗原结合。
如本文中其他地方所解释的，可实现pH依赖性结合的改善，而对在中性pH下对靶抗原的亲和力有或没有显著影响。
在其中平衡解离常数(KD)用作抗原结合活性的指标的一些非限制性实施方案中，在酸性pH(例如pH 5.5)下工程化抗体可表现出10至20nM的对其抗原的平衡解离常数(KD)；而在中性pH(例如7.4)下工程化抗体对其抗原的KD可为约0.5nM或更小。
在每个前述实施方案中，“酸性pH”是指pH为pH 4.0至pH 6.5，优选pH 4.5至pH6.0，更优选pH 5.5至pH 6.0，并且更优选pH 5.5至pH 5.8。
在每个前述实施方案中，“中性pH”是指pH为pH 6.7至pH 10.0，优选pH 7.0至pH8.0，更优选pH 7.4。
在一些具体的实施方案中，可通过比较在酸性pH 5.5下抗体的抗原结合活性与在中性pH 7.4下同一抗体的抗原结合活性来评价pH依赖性结合。
在另一些实施方案中，可通过比较在酸性pH 6.0下抗体的抗原结合活性与在中性pH 7.4下同一抗体的抗原结合活性来评价pH依赖性结合。
另外地或作为替选地，本文中所述的方法可包括以下步骤：测量在酸性pH下和/或在中性pH下亲本抗体的抗原结合活性，并将该结合相互作用的参数与工程化抗体-抗原相互作用的相应结合参数进行比较。
在酸性pH(例如pH 5.5)下工程化抗体的解离速率常数(kd)可高于在同一酸性pH下亲本抗体的解离速率常数(kd)。在这样的实施方案中，由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，在酸性pH(例如pH 5.5)下的kd提高。在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)与在同一酸性pH下亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)的比值可以为至少1.5、或至少2、或至少5、或至少10。
工程化抗体
本文中还提供了工程化抗体，其表现出与其抗原的pH依赖性结合，其中所述工程化抗体的CDR中的至少一个氨基酸是组氨酸残基，其特征在于选自热点列表(表A)的至少一个氨基酸残基是组氨酸残基，并且来自冷点列表(表B)的至少一个氨基酸残基不是组氨酸残基。
“工程化抗体”意指其氨基酸序列已在体外被刻意改变或突变的抗体。在本公开内容中，“工程化抗体”是其中抗体的CDR的氨基酸序列已被刻意改变或突变以引入一个或更多个另外的组氨酸残基的抗体变体。
抗体VL和VH结构域的CDR通常可被定义为包含以下氨基酸：轻链可变结构域中的第24至34位(CDRL1)、第50至56位(CDRL2)和第89至97位(CDRL3)残基，以及重链可变结构域中的第31至35或者31至35c位(CDRH1)、第50至65位(CDRH2)和第95至102位(CDRH3)残基(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。
工程化抗体可在VH结构域、或VL结构域、或VH结构域和VL结构域二者的CDR中包含总共1、2、3、4、5或更多个组氨酸残基。
工程化抗体的CDR中的至少一个组氨酸残基必须在选自“热点”列表(表A)的氨基酸位置处存在。在某些实施方案中，至少两个、至少三个、至少四个或至少五个组氨酸残基必须在选自“热点”列表的氨基酸位置处存在。在某些实施方案中，工程化抗体中的所有组氨酸残基均在选自热点列表(表A)的氨基酸位置处存在。如本文中所述，工程化抗体的CDR中存在某些氨基酸位置，其优选不被组氨酸残基占据。这些氨基酸位置是“冷点”列表(表B)上示出的那些。工程化抗体必须包含冷点列表(表B)上的至少一个未被组氨酸残基占据的氨基酸位置。在某些实施方案中，冷点列表(表B)上的氨基酸位置的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个不是组氨酸。在另一些实施方案中，冷点列表(表B)上的氨基酸位置均不是组氨酸。除此之外，在某些实施方案中，还允许在VH CDR3或VL CDR3内的“冷点”位置处包含组氨酸替换及其组合。
工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，这意味着酸性pH下的所述抗体的抗原结合活性不同于中性pH下的所述抗体的抗原结合活性。
在一个实施方案中，工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。
在一个实施方案中，在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于在中性pH下工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
在一个实施方案中，在酸性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于在中性pH下工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。
在一些特别优选的实施方案中，工程化抗体在中性pH下可表现出相对于酸性pH下的抗原结合强20至40倍的抗原结合。
在其中平衡解离常数(KD)用作抗原结合活性的指标的一些非限制性实施方案中，在酸性pH(例如pH 5.5)下工程化抗体可表现出10至20nM的对其抗原的平衡解离常数(KD)；而在中性pH(例如7.4)下工程化抗体对其抗原的KD可为约0.5nM或更小。
工程化抗体的结构
本文中所述的工程化抗体通常是常规类型的四链免疫球蛋白，其中通过成对的VH和VL结构域提供抗原结合特异性，从而向抗原结合位点贡献六个CDR。但是，术语“工程化抗体”还涵盖常规免疫球蛋白的抗原结合片段和工程化的抗原结合构建体，其包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、双抗体、三抗体、微型抗体等，以及包含由成对的VH和VL结构域提供的抗原结合位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白构型。
工程化抗体可包含恒定区，其包含CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域中的一个或更多个或全部。特别地，工程化抗体可包含Fc区(由CH2和CH3结构域构成)，其可赋予一种或更多种抗体效应物功能。工程化抗体的Fc区本身可通过经工程化或经修饰以赋予有用的功能特性。
工程化抗体可以是任何抗体类别，包括：IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些优选的实施方案中，工程化抗体是IgG。工程化抗体可以是任何亚类(同种型)的IgG，包括：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一个优选的实施方案中，工程化抗体可包含能够与新生儿Fc受体(FcRn)结合的Fc区。特别地，可期望Fc区在中性pH下表现出对FcRn的强结合亲和力。工程化抗体的Fc区可以是经修饰的以增强与新生儿Fc受体FcRn的结合。赋予与FcRn之提高的结合的Fc修饰的一些实例包括在Fc区的CH2和/或CH3结构域中的一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸替换。
合适的Fc突变包括Vaccaro等，Nature Biotechnology，Vol.23，1283-1288(2005)描述的AbdegTM突变。AbdegTM突变体是人IgG(包括但不限于人IgG1)的工程化变体，其包含Met252、Ser254、Thr256、His 433和Asn434至Tyr252、Thr254、Glu256、Lys433和Phe434(EU编号)的突变。携带AbdegTM突变的工程化抗体(例如工程化的人IgG1)相对于它们的野生型的对应物(counterpart)表现出对于与FcRn结合的增强的亲和力，并且在胞外事件(exocytic event)期间在细胞表面处更稳定地与FcRn结合。优选的工程化抗体将如本文中所限定的可变结构域的CDR中的一个或更多个组氨酸替换与Fc区中的Abdeg突变结合。
另一些合适的Fc突变包括US 8,163,881中描述的NHanceTM突变。NHanceTM突变是人IgG(包括但不限于人IgG1)的工程化变体，其包含His 433和Asn434至Lys433和Phe434(EU编号)的突变。携带NHanceTM突变的工程化抗体(例如工程化的人IgG1)相对于它们的野生型的对应体表现出对于与FcRn结合的增强的亲和力。优选的工程化抗体将如本文中所限定的可变结构域的CDR中的一个或更多个组氨酸替换与Fc区中的NHanceTM突变结合。
在一个优选的实施方案中，工程化抗体可包含可变结构域(VH和VL)，所述可变结构域是骆驼科来源的抗体(例如大羊驼抗体)的可变结构域的工程化变体，其包含CDR中的一个或更多个组氨酸替换，以及人IgG(例如人IgG1)的Fc区，所述Fc区包含AbdegTM突变Tyr252、Thr254、Glu256、Lys433和Phe434(EU编号)。
在另一个优选的实施方案中，工程化抗体可包含可变结构域(VH和VL)，所述可变结构域是骆驼科来源的抗体(例如大羊驼抗体)的可变结构域的工程化变体，其包含CDR中的一个或更多个组氨酸替换，以及人IgG(例如人IgG1)的Fc区，所述Fc区包含NHanceTM突变Lys433和Phe434(EU编号)。
表现出pH依赖性抗原结合加对于FcRn的提高的结合亲和力的双重特性的工程化抗体可发挥主动抗原去除(active antigen removal)作用，并且可用于在体内从血浆中消除可溶性抗原。“主动抗原去除”的概念利用工程化抗体来模仿细胞表面胞吞受体的作用，从而能够从血浆中选择性消除靶抗原。简而言之，工程化抗体与血浆中存在的相应抗原(在中性pH下)结合以形成抗原-抗体复合物。该复合物被随机吸收到内体中(通常通过胞饮作用)，在那里当pH变为酸性时，抗体Fc部分将与FcRn结合。由于工程化抗体的pH依赖性抗原结合特性，结合的抗原将在酸性内体中被释放，并且被靶向以通过溶酶体途径降解。然后，游离的抗体(仍与FcRn结合，但不再与其抗原结合)将再循环回到细胞表面，在那里其可参与其他轮的抗原结合和内化作用。有利于在酸性pH下与FcRn结合而基本上不影响在pH 7.4下的结合的Fc突变能够增强这种“主动抗原去除”过程。
除了上面列出的特定Fc突变之外，工程化抗体还可包含：改善内体中抗体摄取的任何其他突变或修饰，包括例如pI的变化、电荷的变化、在pH 7.4和/或pH 6.0下FcRn亲和力的变化；促进与任何其他“高再循环的”Fc受体(例如如Fcγ受体，特别是FcγRIIb)的结合提高的任何突变体或修饰；或提高免疫复合物形成(例如补体结合位点)的任何突变。
工程化抗体可以是来自人、鼠、大鼠、兔、骆驼科或其他哺乳动物物种的亲本抗体或嵌合抗体的工程化变体。在一些具体的实施方案中，工程化抗体可以是从骆驼科物种(例如大羊驼、骆驼、单峰驼、原驼、小羊驼等)分离的骆驼科抗体的工程化变体，或骆驼科-人嵌合抗体(例如大羊驼-人嵌合体)的工程化变体，其中可变结构域(或其CDR)来源于骆驼科物种(例如大羊驼)，而恒定结构域是人的。WO 2010/001251中描述了用于产生骆驼科抗体和骆驼科-人嵌合抗体的技术，其内容通过引用并入本文。
工程化抗体的抗原结合特异性，即其结合的靶抗原的性质没有特别限制。申请人已经证明，本文中提供的方法适用于具有不同抗原结合特性的许多不同亲本抗体的pH依赖性变体的工程化。因此，所描述的用于pH依赖性抗原结合的工程化的技术代表了普遍应用的原则，其不限于结合一种特异性靶抗原的抗体。
例证
通过以下实施例对本发明进行进一步举例说明，所述实施例不应被理解为进行进一步限制。在本申请中通篇引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容均通过引用明确地并入本文。
附图简述
图1：举例说明了如使用功能测定所测量的亲本抗体18E2的工程化变体中的pH依赖性抗原结合。在pH 7.4和pH 5.5二者下针对亲本抗体18E2以及含有一个或两个确定的组氨酸突变的18E2的工程化变体测量了抑制配体：受体相互作用的IC50。
图2、3和4：举例说明了如使用MSD技术所测量的亲本抗体5D1的组氨酸突变体的pH依赖性结合。
实施例1：热图的构建
为了鉴定V结构域中的氨基酸残基位置(在该位置处允许组氨酸残基天然地位于大抗体库中)，合并并分析了来自数个靶抗原项目的大量功能性(抗原结合)抗体或相应的Fab片段的VH、Vλ和Vκ结构域的序列。
每个靶抗原项目包括用经纯化的抗原或表达靶标的DNA进行的主动大羊驼免疫(DNA疫苗接种)、Fab或scFv噬菌体展示文库构建以及针对特定结合物的噬菌体展示选择和筛选。根据标准程序完成噬菌体展示，通常使用胰蛋白酶作为洗脱剂进行多至三轮选择，随后在周质提取物中表达Fab(或scFv)，并通过ELISA、MSD或SPR(Biacore)鉴定Fab(或scFv)结合物。除了胰蛋白酶洗脱之外，并且为了进一步富集具有pH依赖性结合的抗体，随后进行了平行噬菌体展示过程，其中TBS中的洗脱剂(50mM Tris pH 5.5和150mM NaCl)(pH 5.5)用于多至3轮的选择。然后将所有的序列合并，以类型(VH、Vλ或Vκ)和亚家族(例如VH1、VH2和VH3)细分。除去任何精确的复制序列，并且仅使用独特的序列对V结构域的每个位置处的组氨酸残基数进行计数。这导致了“热图”的创建，该图示出了在哪些氨基酸位置处组氨酸在经免疫的大羊驼来源的抗体的V结构域中是可接受的。
另外，该数据集可进一步使用通过高通量测序鉴定的序列进行补充，所述测序使用来自经免疫的大羊驼的RNA。
实施例2：使用热图以提高pH依赖性
使用热图选择在高亲和力、功能性(例如阻断配体：受体相互作用)和优选一些pH依赖性方面具有所需特征的亲本抗体或Fab片段用于组氨酸工程化。
最初，在单个亲本抗体上测试了少数组氨酸突变。抗体18E2在位置H35处的VH结构域中和在位置L34处的VL结构域中突变。由于该抗体的靶抗原由于构象表位的存在而不适合于因此测量了pH依赖性对抗体阻断配体：受体相互作用的能力的影响。当所有蛋白质在pH 7.4或pH 5.5下孵育时，测量IC50，并且结果示于在表1和图1中。数据表明，当引入单突变时，对于该抗体，观察到pH依赖性提高了4倍。有趣的是，突变的VH与突变的Vλ的组合进一步改善了pH依赖性，而在pH 7.4时没有太大影响。
表：1
IC50(μg/ml) 倍数差异
18E2 pH7.4 0.7
18E2 pH5.5 0.4 0.6(*)
18E2_S35H(VH)pH7.4 0.9
18E2_S35H(VH)pH5.5 3.6 4.2
18E2_Y34H(VL)pH7.4 1，2
18E2_Y34H(VL)pH5.5 5.2 4.4
18E2_S35H(VH)_Y34H(VL)pH7.4 1.7
18E2_S35H(VH)_Y34H(VL)pH5.5 14.5 8.8
这些数据证实了在由热图限定的位置处用组氨酸替代氨基酸是有效的，即可增强pH依赖性。由于可预期在其他位置处的组氨酸突变可产生更好(或更差)的效果，因此进行了系统的突变分析。
实施例：3使用热图进行完整的突变分析以提高pH依赖性
使用热图引入针对第二抗原靶标的抗体5D1的pH依赖性。根据热图，5D1的VH中的18个位置和5D1的Vλ中的12个位置适合于组氨酸替代(参见表2)。注意，组氨酸残基天然存在于VL的位置55和91处，进一步减少了待测试的突变体的数目。因为VL的最近种系是VL8，所以FR2中的位置L49在初始的筛选中未被突变为组氨酸。但是，基于CDR2环的结构保守性，该位置也可根据热图已经进行突变。
表2
对于每个突变，均订购了合成基因(Geneart，Thermo Scientific)。将冻干的DNA在H2O中稀释，并使用标准DNA重克隆方法(限制性酶和T4连接酶)在包含人恒定结构域(对于VH为CH1-CH2-CH3，或对于Vλ为Cλ，或对于Vκ为Cκ)的哺乳动物表达载体中进行重克隆。对产生的构建体进行序列验证，并将其用于在混悬液中瞬时转染10ml HEK293细胞以产生工程化变体抗体的组，每个均包含单HIS替换。
每个单VH 5D1突变体用野生型轻链单独转染，而每个单VL 5D1突变体用野生型重链单独转染。使HEK293细胞在37℃，5％CO2下在Freestyle 293表达培养基(Gibco)中生长，并以0.5至0.8×106个细胞/mL的最佳密度下进行转染。转染混合物包含每mL HEK293培养物中的40μL OPTI-MEM(Gibco)、1.5μg聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)(Polysciences)和0.5μg DNA。应用于重链和轻链的比值为1∶3。
转染细胞之后4小时，添加总培养物体积10％的9％Primatone HS/UF(KerryBioScience/Sheffield)。将培养物在100rpm下震荡孵育6天，然后通过以1,000×g离心10分钟进行收获。向每mL细胞培养物的上清液添加10μL蛋白质A-琼脂糖凝胶珠(GEHealthcare)在1×PBS中的50％的浆液。将包含珠的上清液在25rpm，4℃下在转子上孵育至少2小时。通过在降低的减速速度下以610×g离心2分钟来使珠沉淀。将带有结合的功能性mAB的珠转移到96孔0.45μm滤板(PALL)，并用1×PBS、含有0.5M NaCl(ChemLab)的1×PBS和含有0.15M NaCl(ChemLab)的0.5×PBS依次洗涤，每一次在洗涤步骤之间施加真空。在pH 3下使用含有0.3M NaCl(ChemLab)的50mM柠檬酸钠(Sigma-Aldrich)洗脱结合的mAB。将洗脱的级分用1M KHPO4/KH2PO4(VWR)(pH 8)中和，并在NanoDrop 2000(Thermo Scientific)中测量蛋白质浓度。筛选是通过Biacore或使用MSD平台完成的。
对于通过Biacore进行的筛选，可使用数种设置。在“直接”设置中，在25℃下在pH7.4的HBSEP缓冲液(pH 7.4的0.01M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、0.15M NaCl(ChemLab)、3mM EDTA、0.005％(v/v)表面活性剂P20)中，或使用相同的缓冲液但通过添加1M HCl将其调节至pH 5.5，根据制造商的说明，在pH 7.4或pH 5.5下测量经纯化的抗体与CM5芯片(GE Healthcare)上包被的抗原的结合。在不同的“捕获”设置中，将突变的抗体捕获在芯片上，所述芯片在所有通道中用多克隆抗人IgG包被。将mAB注射至HBSEP中以达到150至300的RU，随后将配体(分析物)以不同的浓度注射至pH 7.4的或经调节pH 5.5的HBSEP缓冲液中。在各个循环之后，通过在pH 1.5下注射10mM甘氨酸10秒来完成芯片表面的再生。所有动力学分析均使用GE Healthcare提供的适当软件完成。
对于使用MSD平台测试抗体，将板(MSD)在4℃下用1×PBS中的靶标O/N包被。然后将板用200μL 1×PBS洗涤3次，用150μL含有1％(m/v)酪蛋白(Sigma-Aldrich)的1×PBS在室温下在600rpm的震荡下封闭1至2小时。然后将板用200μL含有0.05％(m/v)吐温(Merck)的1×PBS(pH 7.4)或含有0.05％(m/v)吐温(Merck)的柠檬酸盐缓冲液(0.05M柠檬酸(Sigma-Aldrich)、0.14M柠檬酸钠(Sigma-Aldrich)、0.15M NaCl(ChemLab))(pH 5.5)洗涤3次。为了计算剂量响应曲线，在pH 7.4或pH 5.5下将25μL不同浓度的mAB添加至孔中的1×PBST(含有0.05％(m/v)吐温的PBS)(pH 7.4)或含有0.05％(m/v)吐温(Merck)的柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中。在室温下孵育1小时之后，以600rpm震荡。在pH 7.4或pH 5.5下将孔用1×PBST洗涤4次。对于最后的洗涤步骤，在600rpm的震荡下，在室温下用pH 7.4的PBST或pH5.5的柠檬酸盐缓冲液进行另外的孵育5至10分钟。最后，在600rpm的震荡下，将所有孔均用1×PBS(pH 7.4)洗涤，并在室温下添加0.1％酪蛋白(Sigma-Aldrich)-1×PBS(pH 7.4)中的25μL 1：2000山羊抗人Fc磺基(MSD)，持续1小时。在用200μL 1×PBST(pH 7.4)进行的洗涤步骤之后，将150μL MSD读取缓冲液(MSD)添加至每个孔，并在QuickPlex SQ 120机器(MSD)中读取板。
除了单一pH设置(抗体结合和洗涤在7.4或5.5的相同pH下进行)之外，我们还测试了双pH ELISA，其中抗体结合在pH 7.4下完成，但洗涤在pH 5.5的柠檬酸盐缓冲液中完成。该设置允许区分pH对结合或解离或二者的影响，并且对于如下的体内情况更具有代表性：在该情况下结合在pH 7.4下发生并且抗原的释放必须在pH 5.5至6.0下在内体中发生。
在筛选了表2中指定的所有单突变体之后，数个单突变体表现出对pH依赖性结合有影响(表3)。与5D1M相比，例如5D1VLm3、5D1VHm6、5D1VHm14具有显著的pH依赖性结合。此外，5D1VHm13具有一些改善的pH依赖性以及有利的动力学。
表：3
还使用MSD技术观察到了pH依赖性，如图2和3以及表4中所示。这些突变的作用在图2中所示的曲线上是可见的，其中在洗涤期间(最大结合降低)以及在结合和洗涤二者时(对于突变体5D1VLm3和5D1VHm6丢失大部分的结合)应用了pH 5.5，而在pH 7.4下测得的EC50仍与野生型亲本抗体相似。
表：4
这些数据表明，尽管已经引入了pH依赖性，但对结合阶段的影响比对解离的影响更显著。因此，引入另外的组氨酸突变以增强pH依赖性可以是有益的。
实施例：4组合组氨酸突变以进一步提高pH依赖性
因为VLm3、VHm6和VHm13均对pH依赖性有影响，所以在同一抗体内组合这些突变。通过在HEK293细胞的转染期间将编码每条链的质粒组合在一起来简单地制备双HIS突变体VLm3/VHm6和VLm3/VHm13。在MSD中测试所得抗体的pH依赖性(参见图4)。
如表5中所示，突变的组合对pH依赖性具有非常积极的影响。双突变体在pH 5.5下显示出非常差的结合(pH 5.5-pH 5.5设置)。相较之下，在pH 7.4下结合的大多数抗体在pH5.5洗涤期间释放(pH 7.4-pH 5.5设置)。
表：5
EC50(nM) pH7.4-7.4 pH7.4-5.5 pH5.5-5.5
5D1 0.16 0.11 0，19
5D1 VLm3/VHm6 0.31 11.12 nd
5D1 VLm3/VHm13 0.26 nd nd
nd：由于低结合而使EC50不可测量
实施例：5使用热图进行完整的突变分析以提高抗体3D6的pH依赖性
使用热图引入抗体3D6针对第二抗原靶标的pH依赖性。根据热图和CDR长度，3D6的VH中的25个位置和3D6的Vκ中的16个位置适合于组氨酸替代(参见表6)。这25个位置中的21个在初始筛选中测试。
表：6
对于每个突变，均订购了合成基因(Geneart，Thermo Scientific)，将其克隆至合适的表达载体中，并产生抗体，如实施例3中所示。
在捕获设置中测试了抗体的pH依赖性，其中用大量抗人Fc抗体(8000RU)包被Biacore T200芯片。然后，将3D6抗体野生型或突变体注射至pH 7.4的HBS-EP中(2μg/m1)，以优选达到100至200RU。在信号稳定之后，以2.5或10nM注射靶标，并在pH 7.4或5.5下使用HBS-EP缓冲液进行洗涤。使用T200软件测量pH 7.4下的平衡解离常数KD(M)。由于结合在pH7.4下进行，因此在pH 5.5下仅从拟合中提取解离常数(kd1/s)。结果列于表7和8中。
表：7
表：8
这些数据表明pH依赖性已被引入到3D6中，其中在pH 7.4下结合损失最小。组合单组氨酸突变以增强pH依赖性可以是有益的。
实施例：6组合组氨酸突变以讲一步提高抗体3D6中的pH依赖件
基于表7和表8中的结果，在同一结构域中组合引入显著pH依赖性和/或在pH 7.4下改善结合的突变，从而生成新的突变体VHm23、VHm24、VHm25、VHm26、VKm16、VKm17、VKm18和VKm19(表9)。例如，3D6VHm23具有突变VHm9和VHm13，3D6VHm24具有突变VHm0和VHm16，等。
表：9
通过在HEK293细胞的转染期间将编码每条链的质粒组合在一起来简单地将新的VH和VK突变体进一步彼此组合。例如，通过VHm23突变体DNA与突变体VKm11 DNA共转染来完成抗体3D6VHm23/VKm11。在纯化之后，如实施例5中所述，使用测试所得抗体的pH依赖性。进一步表征具有良好pH依赖性和在pH 7.4下具有良好亲和力的抗体，唯一的区别是添加更高浓度的靶标(0.04nM；0.1nM；0.37nM；1.1nM；3.3nM和10nM)。使用T200软件测量在pH 7.4下的KD(M)。在pH 5.5下仅从拟合中提取解离常数(kd s-1)。表10中指示了前5的抗体。
表：10
来自Biacore的结果清楚地表明，这里呈现的方法允许快速鉴定具有大的pH依赖性并且在pH 7.4下结合损失最小的抗体。

Claims (55)

1.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括通过用组氨酸残基替换亲本抗体的至少一个氨基酸残基来制备所述工程化抗体，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65 VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33 VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56 VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
其中所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合。
2.权利要求1所述的方法，其中所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。
3.权利要求1所述的方法，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
4.权利要求1所述的方法，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于酸性pH下的亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
5.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自所述热点列表的至少两个氨基酸残基被替换为组氨酸。
7.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自所述热点列表的至少三个氨基酸残基被替换为组氨酸。
8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自所述热点列表的至少四个氨基酸残基被替换为组氨酸。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中以下残基中的一个或更多个也被替换为组氨酸：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自所述冷点列表的至少两个氨基酸残基未被替换为组氨酸。
11.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自所述冷点列表的至少三个氨基酸残基未被替换为组氨酸。
12.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自所述冷点列表的VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1和VLCDR2的氨基酸残基均未被替换为组氨酸。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述亲本抗体或其CDR来源于骆驼科物种。
14.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)提供与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65 VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33 VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56 VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
；
(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
15.权利要求14所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。
16.权利要求14所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
17.权利要求14所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于酸性pH下的亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
18.权利要求14或权利要求15所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。
19.权利要求14至18中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VH结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65 VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
。
20.权利要求14至18中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VL结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且选自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33 VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56 VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
。
21.权利要求20所述的方法，其中所述亲本抗体的所述VL结构域属于λ类，并且其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
CDR1 L30，L31，L32，L34， CDR2 L51，L52，L53，L55， CDR3 L89，L91，L92，L93，L95a，L95b，L95c，L96
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L33 CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L54，L56 CDR3 L90，L94，L95，L95d，L95e，L95f，L97
。
22.权利要求20所述的方法，其中所述亲本抗体的所述VL结构域属于κ类，并且其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
CDR1 L27，L27d，L29，L31，L32 CDR2 L53，L54，L55 CDR3 L89，L90，L91，L92，L93，L94，L96
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
CDR1 L24，L25，L26，L27A，L27b，L27c，L27e，127f，L28，L30，L33，L34 CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L56 CDR3 L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L97
。
23.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c VH CDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65 VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33 VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56 VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
；
(c)针对与所述靶抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予与所述抗原的pH依赖性结合；
(d)制备所述亲本抗体的一种或更多种另外的工程化变体，其中每种所述变体在步骤(c)中鉴定的两个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸；以及
(e)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述另外的工程化变体；并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
24.权利要求23所述的方法，其中在部分(e)中鉴定的所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。
25.权利要求23所述的方法，其中在部分(e)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
26.权利要求23所述的方法，其中在部分(e)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于酸性pH下的亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
27.权利要求23或权利要求24所述的方法，其中在部分(e)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。
28.权利要求23至27中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述组中的每种所述工程化变体在选自所述热点列表的氨基酸位置处包含单组氨酸替换。
29.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述另外的工程化变体在步骤(c)中鉴定的三个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸残基。
30.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述另外的工程化变体在步骤(c)中鉴定的四个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸残基。
31.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述另外的工程化变体还在一个或更多个以下氨基酸位置处包含组氨酸残基：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。
32.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的第一工程化变体组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VH结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VH CDR1 H34，H35a，H35b，H35c VHCDR2 H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65 VH CDR3 H100g，H100k，H100m，H100n
；
(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述第一工程化变体组；并且由此鉴定所述VH结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予pH依赖性结合；
(d)制备所述亲本抗体的第二工程化变体组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VL结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
并且选自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
VL CDR1 L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33 VL CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56 VL CDR3 L95，L95d，L95e，L95f，L97
；
(e)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述第二工程化变体组；并且由此鉴定所述VL结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予pH依赖性结合；
(f)制备所述亲本抗体的一种或更多种另外的工程化变体，其中每种所述变体与所述亲本抗体的不同之处在于在步骤(c)中鉴定的所述VH结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置处的氨基酸被替换为组氨酸，并且在步骤(e)中鉴定的所述VL结构域中的一个或更多个所选氨基酸位置处的氨基酸被替换为组氨酸；以及
(g)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述另外的工程化变体，由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。
33.权利要求32所述的方法，其中所述亲本抗体的所述VL结构域属于λ类，并且其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
CDR1 L30，L31，L32，L34， CDR2 L51，L52，L53，L55， CDR3 L89，L91，L92，L93，L95a，L95b，L95c，L96
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
CDR1 L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L33 CDR2 L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L54，L56 CDR3 L90，L94，L95，L95d，L95e，L95f，L97
。
34.权利要求32所述的方法，其中所述亲本抗体的所述VL结构域属于κ类，并且其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：
CDR1 L27，L27d，L29，L31，L32 CDR2 L53，L54，L55 CDR3 L89，L90，L91，L92，L93，L94，L96
并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：
CDR1 L24，L25，L26，L27A，L27b，L27c，L27e，I27f，L28，L30，L33，L34 CDR2 L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L56 CDR3 L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L97
。
35.权利要求32至34中任一项所述的方法，其中在部分(g)中鉴定的所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。
36.权利要求32至34中任一项所述的方法，其中在部分(g)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
37.权利要求32至34中任一项所述的方法，其中在部分(g)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于酸性pH下的亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
38.权利要求32至37中任一项所述的方法，其中在部分(g)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。
39.权利要求32至38中任一项所述的方法，其中步骤(f)的所述另外的工程化变体在步骤(c)和(e)中鉴定的总共三个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸。
40.权利要求32至38中任一项所述的方法，其中步骤(f)的所述另外的工程化变体在步骤(c)和(e)中鉴定的总共四个或更多个所选氨基酸位置处包含组氨酸。
41.权利要求32至38中任一项所述的方法，其中步骤(f)的所述另外的工程化变体还在一个或更多个以下氨基酸位置处包含组氨酸残基：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。
42.根据权利要求14至41中任一项所述的方法，其中所述亲本抗体或其CDR来源于骆驼科物种。
43.工程化抗体，其表现出与其抗原的pH依赖性结合，其中所述工程化抗体的CDR中的至少一个氨基酸是组氨酸残基，其特征在于选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基是组氨酸残基：
并且选自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基不是组氨酸残基：
44.权利要求43所述的工程化抗体，其中所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。
45.权利要求43所述的工程化抗体，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。
46.权利要求43或权利要求44所述的工程化抗体，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。
47.权利要求43至46中任一项所述的工程化抗体，其中选自所述热点列表的至少两个氨基酸残基是组氨酸。
48.权利要求43至46中任一项所述的工程化抗体，其中选自所述热点列表的至少三个氨基酸残基是组氨酸。
49.权利要求43至46中任一项所述的工程化抗体，其中选自所述热点列表的至少四个氨基酸残基是组氨酸。
50.权利要求43至49中任一项所述的工程化抗体，其还在一个或更多个以下氨基酸位置处包含组氨酸残基：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。
51.权利要求43至50中任一项所述的工程化抗体，其中在表B中列出的位置处的至少两个氨基酸残基不是组氨酸。
52.权利要求43至50中任一项所述的工程化抗体，其中在选自所述冷点列表的位置处的至少三个氨基酸残基不是组氨酸。
53.权利要求43至50中任一项所述的工程化抗体，其中所述冷点列表上的位置处的氨基酸残基均不是组氨酸，前提是组氨酸可以被包含在一个或更多个以下氨基酸位置处：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。
54.权利要求43至53中任一项所述的工程化抗体，其是骆驼科抗体的工程化变体。
55.权利要求43至54中任一项所述的工程化抗体，其包含Fc区，其中所述抗体与新生儿Fc受体(FcRn)结合。
CN201880030586.2A 2017-05-10 2018-05-10 制备pH依赖性抗体的方法 Active CN110612308B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1707484.0A GB201707484D0 (en) 2017-05-10 2017-05-10 Method of preparing ph-dependent antibodies
GB1707484.0 2017-05-10
PCT/EP2018/062179 WO2018206748A1 (en) 2017-05-10 2018-05-10 Method of preparing ph-dependent antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110612308A true CN110612308A (zh) 2019-12-24
CN110612308B CN110612308B (zh) 2024-04-16

Family

ID=59065692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880030586.2A Active CN110612308B (zh) 2017-05-10 2018-05-10 制备pH依赖性抗体的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US12060413B2 (zh)
EP (1) EP3625249A1 (zh)
JP (2) JP2020519598A (zh)
CN (1) CN110612308B (zh)
AU (1) AU2018265466B2 (zh)
CA (1) CA3061430A1 (zh)
GB (1) GB201707484D0 (zh)
IL (1) IL270554B1 (zh)
WO (1) WO2018206748A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA45602A (fr) 2016-07-08 2019-05-15 Staten Biotechnology B V Anticorps anti-apoc3 et leurs méthodes d'utilisation
MA50958A (fr) 2017-04-21 2020-10-14 Staten Biotechnology B V Anticorps anti-apoc3 et leurs méthodes d'utilisation
MA50516A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Staten Biotechnology B V Anticorps anti-apoc3 et leurs procédés d'utilisation
US10538583B2 (en) 2017-10-31 2020-01-21 Staten Biotechnology B.V. Anti-APOC3 antibodies and compositions thereof
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
GB2589049C (en) 2019-04-11 2024-02-21 argenx BV Anti-IgE antibodies
KR20220012338A (ko) * 2019-05-23 2022-02-03 시아먼 유니버시티 신규한 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus) 항체 및 그의 용도
CN110669778A (zh) * 2019-09-19 2020-01-10 上海药明生物技术有限公司 一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法
GB202016814D0 (en) 2020-10-22 2020-12-09 Cambridge Mechatronics Ltd An actuator assembly
MX2024006275A (es) 2022-01-18 2024-06-11 argenx BV Anticuerpos para galectina-10.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102056946A (zh) * 2008-04-11 2011-05-11 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
CN104540852A (zh) * 2012-08-13 2015-04-22 瑞泽恩制药公司 具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体
WO2016000813A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Merck Patent Gmbh Anti-tnfa antibodies with ph-dependent antigen binding

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT2825036T (lt) * 2012-03-16 2018-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidino pakeitimus lengvoje grandinėje turintys antikūnai ir genetiškai modifikuoti graužikai, išvesti ju gamybai

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102056946A (zh) * 2008-04-11 2011-05-11 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
CN104540852A (zh) * 2012-08-13 2015-04-22 瑞泽恩制药公司 具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体
WO2016000813A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Merck Patent Gmbh Anti-tnfa antibodies with ph-dependent antigen binding
CN106459192A (zh) * 2014-06-30 2017-02-22 默克专利股份公司 具有pH依赖性抗原结合的抗TNFa抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEGAN L. MURTAUGH ET AL: "A Combinatorial Histidine Scanning Library Approach to Engineer Highly pH-Dependent Protein Switches", 《PROTEIN SCIENCE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023113686A (ja) 2023-08-16
US12060413B2 (en) 2024-08-13
US20220177555A1 (en) 2022-06-09
IL270554A (en) 2019-12-31
EP3625249A1 (en) 2020-03-25
CN110612308B (zh) 2024-04-16
IL270554B1 (en) 2024-08-01
AU2018265466B2 (en) 2024-09-05
AU2018265466A1 (en) 2019-11-14
JP2020519598A (ja) 2020-07-02
WO2018206748A1 (en) 2018-11-15
CA3061430A1 (en) 2018-11-15
GB201707484D0 (en) 2017-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110612308B (zh) 制备pH依赖性抗体的方法
JP7001474B2 (ja) 非免疫原性単一ドメイン抗体
JP2022031790A (ja) 免疫グロブリン単一可変ドメインを伴うアッセイにおける非特異的タンパク質干渉を予測、検出及び低減するための技術
US20180016351A1 (en) Antibodies comprising sequences from camelidae to highly conserved targets
US20200400657A1 (en) Antibody screening methods
EP4036116A1 (en) Anti-vhh domain antibodies and use thereof
Karadag et al. Physicochemical determinants of antibody-protein interactions
JP6785372B2 (ja) 多重特異性分子の機能分析のためのｓｐｒに基づく二重結合アッセイ
CN107531795A (zh) Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US20230102101A1 (en) Human-like heavy chain antibody variable domain (vhh) display libraries
US20230365667A1 (en) Binding proteins and antigen binding fragments thereof that bind abeta
CN110407942B (zh) 针对kn044的单域抗体
WO2024169928A1 (zh) 包含共同轻链的抗体库、其制备方法及其用途
KR20190137294A (ko) 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법
WO2024050439A2 (en) Biepitopic tetravalent antibody targeting egfr
CN117986364A (zh) 特异性结合cd39的纳米抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TG01 Patent term adjustment
TG01 Patent term adjustment