JP2017530110A - シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された新規の化合物（ｋｓ５１３）、その化合物を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療用組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規の（１ａＳ，１ｂＳ，２Ｓ，４Ｓ，５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１ａ−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシ−２−（（（２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）オクタヒドロオキシレノ［２’，３’：４，５］シクロペンタ［１，２−ｃ］ピラン−６−イル ４−ヒドロキシベンゾエート｝（ＫＳ−５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物、これらを有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防又は治療用組成物及びその使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患を予防又は治療する、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum）から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）、該化合物を含む組成物及びその使用に関する。

一般に、炎症応答は、組織又は細胞がその内部において一部の器質的な変化を生じる何らかの侵入を受けた場合の、浮腫、疼痛等を伴う人体の正常な応答である。最近では種々の型のサイトカインが炎症性疾患に関与することがわかっている。

アレルギー応答を、応答の種類による４つのカテゴリー、すなわちＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型に、又はアレルゲンによって生じる再感作から応答の開始時間までの期間の種類による２つのカテゴリー、すなわちＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の即時型アレルギー応答及びＩＶ型等の遅延型アレルギー応答に分類することができる。

これらのうち、Ｉ型アレルギーは、ＩｇＥ抗体に関与し、アナフィラキシー型アレルギーと呼ばれているが、気管支喘息、皮膚炎又は胃腸炎等のアトピー性疾患、花粉症等のアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー等を引き起こす。

喘息は、種々の臨床症状、例えば咳、気道閉塞、急性又は慢性の気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）及び構造的リモデリングにより引き起こされる呼吸困難を特徴とする気道の複合症候群と考えられ、これらの回復の可能性は可逆的又は不可逆的であり得る。喘息のほとんどがアレルギー性疾患であり、慢性気道炎症及び気管支過敏性を特徴とする（非特許文献１）。

喘息を、２つの型、すなわち外因性喘息及び内因性喘息に分類することができる。外因性喘息は抗原に曝露することにより引き起こされ、皮膚検査又は抗原に対する気管支誘発検査において陽性反応を示す。通常、発症する年齢は若年になりつつある。喘息は主に、イエダニのダーマトファゴイデス（Dermatophagoides）及び花粉、動物の上皮組織、真菌等により引き起こされる。内因性喘息は上気道感染、運動、情緒不安定、気候の湿度変化により引き起こされ、成人患者が一般的である。また、外因性喘息のＩｇＥ抗原を血清中のＩｇＥの増加に基づく皮膚検査によって検出することができる。

病態生理学において、喘息はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞誘導性の慢性炎症及び種々の炎症性メディエーター、例えば免疫細胞由来のサイトカイン、ケモカイン、シグナル伝達分子、接着分子及び成長因子により認識され、気道の細胞構造は喘息の種々の病期にわたり関与する（非特許文献２）。喘息に罹患した患者の気管支内の炎症細胞、例えば好酸球、肥満細胞、肺胞マクロファージ等が活性化して、種々の炎症性メディエーター、例えばシステインロイコトリエン、プロスタグランジン等が放出され、強力な気管支収縮に関与する（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。

それに応じて、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等の炎症細胞活性化に関与する種々のサイトカイン及びＩｇＥの再生並びに炎症細胞から放出されるシステインロイコトリエンの再生が炎症、アレルギー応答及び喘息の主な原因であることから、現在までこれらの再生を阻害する物質を開発する研究が多く為されてきた。

一般に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、気道の閉塞を生じる肺の異常炎症性疾患によって引き起こされる肺疾患の１つである。ＣＯＰＤは、気流排出の障害に起因する呼吸困難を生じ、様々な特徴、例えば喘息の一般的な特徴の、気道制限又は気道閉塞の可逆性不良、経時による進行性の発現等を示し、肺気腫及び慢性閉塞性気管支炎に分類されることができる（非特許文献６）。

ＣＯＰＤは、心血管系疾患の罹患率及び死亡率の危険因子の１つとして、並びに２００１年の世界規模での死亡原因の第５位として報告されている。慢性閉塞性肺疾患に対するグローバルイニシアチブ（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease）（ＧＯＬＤ）基準（ＦＥＶ１とＦＶＣとの比が０．７未満）に基づく慢性閉塞性肺疾患の有病率は、４５歳を超える韓国人のうち１７．２％（男性２５．８％、女性９．６％）であった（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。

ほとんどのＣＯＰＤ患者は、３つの病理学的メカニズム（慢性閉塞性気管支炎、気腫及び粘液栓）全てを有し、気腫及び閉塞性気管支炎の割合に違いがあるかもしれないが、その全てが喫煙により誘発される。先進諸国において、タバコによる喫煙は、ＣＯＰＤの圧倒的に最も一般的な原因であるが、大気汚染（特に、燃料燃焼による室内大気汚染）、偏った食事及び職業上の曝露を含む他のいくつかの危険因子がある。ＣＯＰＤは、加齢に認められる肺機能の正常な低下を加速させる特徴がある。ゆっくりと進行する気流制限が身体障害及び早死をまねくが、稀に重症化する可変性気道閉塞及び喘息の症状とは全く異なる。

ＣＯＰＤの病態生理学的作用及び症候群が基本的に喘息のものと異なることが報告されている。ＣＯＰＤ及び喘息はともに、気道の炎症が関与するが、炎症プロセスの性質が著しく異なり、炎症細胞、メディエーター、炎症反応、解剖学的分布及び抗炎症療法に対する反応が異なり、例えば（ａ）炎症細胞において、肥満細胞、好酸球、Ｄ４^＋細胞（Ｔｈ２）、マクロファージ等は主に喘息の発症時に作用するが、好中球、ＣＤ８^＋（Ｔｃ）等は主にＣＯＰＤの発症時に作用する、（ｂ）炎症性メディエーターにおいて、ロイコトリエンＢ、ヒスタミン、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、エオタキシン、ＲＥＮＴＥＳ、酸化ストレス等は主に喘息の発症に関与するが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α等は主にＣＯＰＤの発症に関与する、（ｃ）炎症性症候群において、成人の末梢気道に作用することにより生じ、種々の現象、例えば上皮化生、実質破壊、相対的不可逆性気道閉塞、慢性気管支炎、気腫等を示すＣＯＰＤに比べ、喘息は若年時に肺気道全体に作用することによる様々な炎症性症候群、例えばＡＨＲ（気道過敏性）、上皮細胞の剥落、線維症、実質性病変の非含有、粘液分泌、相対的可逆性気道閉塞、咳、くしゃみ、呼吸困難等を示す（非特許文献１０、非特許文献１１）。

ＣＯＰＤにおける組織病理学的研究では、主に末梢気道（細気管支）及び肺実質に関与し、喘息は気道全ての炎症に関与するが肺実質に関与しないことが示されている。細気管支の閉塞があり、線維症並びにマクロファージ及びＴリンパ球による浸潤を含む。肺実質が破壊され、マクロファージ及びＣＤ８（細胞毒性）Ｔリンパ球数が増加する（非特許文献１２）。重度ＣＯＰＤ患者における気管支生検では、マクロファージ及びＣＤ８細胞の浸潤と好中球数の増加とを伴う同様の変化が示されている（非特許文献１３）。

喘息と対照的に、好酸球は憎悪又は患者が同時に喘息を併発した時を除いて顕著ではなかった（非特許文献１４、非特許文献１５）。

それゆえ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療アプローチは、喘息のものと異なるはずであるが、現在の治療法は、両疾患を非特異的に治療することに集中している。それゆえ、ＣＯＰＤに特に認可された抗炎症治療法はなく、利用可能な抗炎症治療法は元々喘息用に開発されていた。ＣＯＰＤの研究が直面している課題は多面的であり、この疾患の複雑さ及び異種病因を基礎とする機構の解明が求められ、疾患の進行における炎症の役割を確認する必要がある（非特許文献１６、非特許文献１７）。

長時間作用性βアゴニスト、安全なステロイド及び併用療法の形態での喘息の治療に利用可能な現在の治療法の改善が進められ、ＣＯＰＤでは、抗コリン作動薬が症状を緩和させる。憎悪を治療するためにステロイドが利用されているが、未だにＣＯＰＤの肺機能における進行性の低下に対して又は喘息の発症に対して顕著な影響を与える治療は示されていない。

それに応じて、これまでにアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又はＣＯＰＤの治療に成功し、特化する可能性のある新たな薬剤を開発する研究が多く為されている。

本発明者らは、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又はＣＯＰＤに対する強力な治療効果を有する、植物、動物等の天然資源由来の安全かつ有効で強力な治療剤を開発することに注力しており、最終的に、予期せぬ驚くべき結果、例えばシュードリシマキオン・ロンギフォリウム（Pseudolysimachion longifolium：セイヨウトラノオ）の抽出物の強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性及び抗喘息活性（特許文献１及び特許文献２）及びその抽出物から単離された種々の化合物、例えばベルプロシド（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシベンゾイルカタルポール）、ピクロシドＩＩ（６−Ｏ−４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイルカタルポール）、ベルミノシド（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシシンナモイルカタルポール）、６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール（６−Ｏ−３，４−ジメトキシベンゾイルカタルポール）、ミネコシド（６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルカタルポール）、カタルポール等の強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性及び抗喘息活性（特許文献３）；シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物由来のカタルポール派生物等の有効成分を十分に含有する新規の精製抽出物の強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性及び抗喘息活性（ＡＴＣ２：特許文献４、ＡＴＣ１：特許文献５）；これらの抽出物の抗ＣＯＰＤ活性（特許文献６）及びこれらの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ−５３４）の抗ＣＯＰＤ活性を現在までに続けて見出している。

シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムは、韓国、中国、日本、サハリン島、及びロシアに分布する多年生草本である。

シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物の抗炎症活性、抗アレルギー活性及び抗喘息活性におけるこれまでの研究に基づき、本発明者らは、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示す新規の化合物を開発しようとした。

しかし、それらの開示が引用することにより本明細書の一部をなす、上記の引用文献ではシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示す新規の化合物（ＫＳ−５１３）について報告又は開示されていなかった。

それに応じて、本発明者らは、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示す新規の化合物を見出し、この本化合物は、例えば（１）ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いた細胞毒性試験、（２）ＬＰＳによって誘導されるＲＡＷ２６４．７細胞株における、ｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素のｍＲＮＡ発現及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する作用、（３）ＮＯ再生に関与するｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生レベルに対する阻害作用、（４）ＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルに対する阻害作用、（５）ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の産生レベルに対する阻害作用の種々の試験から強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示すことを見出した。

韓国特許第１０−８６００８０号 米国特許出願第２０１２／０１８３６３２号 韓国特許出願第１０−２００６−１２５４９９号 韓国特許第１４７６０４５号 韓国特許第１５０４６５１号 韓国特許第１４７６０９５号

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本発明は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）を提供する。

本発明はまた、有効な量のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又はＣＯＰＤ疾患の治療及び予防用の医薬組成物及び健康食品を提供する。

本発明はまた、炎症性疾患、アレルギー性疾患、喘息又はＣＯＰＤの治療又は予防に使用される医薬の製造のための、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１４）の使用を提供する。

本発明はまた、哺乳動物又はヒトにおける炎症性疾患、アレルギー性疾患、喘息又はＣＯＰＤを治療又は予防する方法であって、上記哺乳動物又はヒトにシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、有効量の新規の化合物（ＫＳ５１４）をその薬学的に許容可能な担体とともに投与することを含む、方法を提供する。

本発明は、以下の化学式（１）：

［化学式１］
で表される（１ａＳ，１ｂＳ，２Ｓ，４Ｓ，５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１ａ−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシ−２−（（（２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）オクタヒドロオキシレノ［２’，３’：４，５］シクロペンタ［１，２−ｃ］ピラン−６−イル ４−ヒドロキシベンゾエート｝（ＫＳ−５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物を提供する。

本発明の新規の化合物を、当該技術分野において既知の従来の方法により薬学的に許容可能な塩及び溶媒和物に変換することができる。その塩において、その薬学的に許容可能な遊離酸により形成されるその酸付加塩は有用であり、従来の方法により調製することができる。例えば、過剰量の酸溶液にこの化合物を溶解させた後、その塩を水混和性の有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルによって析出してその酸付加塩を調製し、更に等量の化合物及び希釈した酸と、水又はグリコールモノメチルエーテル等のアルコールとの混合物を加熱した後、蒸発乾固させるか又は減圧下において濾過し、その乾燥塩形態を得ることができる。

上記方法の遊離酸として、有機酸又は無機酸を使用することができる。例えば、有機酸、例えばメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸等及び無機酸、例えば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸等を本明細書において使用することができる。

さらに、本発明の化合物の薬学的に許容可能な金属塩を、塩基を使用することで調製することができる。そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩を、従来の方法、例えば過剰量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物の溶液に化合物を溶解させた後、不溶性の塩を濾過し、残った濾液を蒸発乾固させ、その金属塩を得ることにより調製することができる。本発明の金属塩として、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩は薬学的に好適であり、対応する銀塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を硝酸銀等の好適な銀塩と反応させることにより調製することができる。

本化合物の薬学的に許容可能な塩は、本明細書において特に明示されない場合、本化合物に存在し得る酸性塩又は塩基性塩を全て含む。例えば、本発明の薬学的に許容可能な塩には、ヒドロキシル基の塩、例えばそのナトリウム塩、カルシウム塩及びカリウム塩、アミノ基の塩、例えば臭化水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、ジヒドロリン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸（メシル酸）塩及びｐ−トルエンスルホン酸（トシル酸）塩等が含まれ、これらを当該技術分野において既知の従来の方法により作製することができる。

本化合物が非対称的な中心を有することから、光学的に異なるジアステレオマーの形態において存在することができ、したがって本発明の化合物は、光学的に活性な異性体、Ｒ型又はＳ型立体異性体及びそれらの混合物を全て含む。本発明はまた、ラセミ混合物、２つ以上の光学的に活性な異性体又はそれらの混合物の使用全て及び当該技術分野において既知のジアステレオマーの調製又は単離の方法全てを含む。

本発明の化合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー又は再結晶方法等の当該技術分野において既知の単離方法若しくは精製方法、例えば特許文献３に開示の方法から単離することができ、又は単なる例示の、本発明を限定しない当該技術分野において既知の方法により化学的に合成することができる。

本発明の新規の化合物（ＫＳ５１３）を以下の手順によりシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから調製することができる。

例えば、新規の化合物（ＫＳ５１３）は、以下のプロセス：第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノール等のＣ１〜Ｃ４低級アルコール又はそれらの混合物、好ましくは水とメタノールとの混合物、より好ましくは１０％（ｗ／ｗ）〜１００％（ｗ／ｗ）メタノール水溶液から選択される少なくとも１つの抽出溶剤を、乾燥させたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加することと；第２の工程において、１０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜７０℃の温度にて、３０分〜７２時間、好ましくは１時間〜４８時間の範囲の期間において熱水抽出、冷水抽出、超音波処理又は従来の抽出、好ましくは冷水抽出を用いた還流抽出、より好ましくは、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の温度にて３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間にて繰り返される冷水抽出の後に、４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度にて３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間にて繰り返される還流抽出から選択された少なくとも１つの抽出方法を行い、第１の抽出物を得ることと；第３の工程にて、濾過、真空濃縮及び乾燥方法を行い、粗製乾燥抽出物を得ることと；（ｉ）逆相分配クロマトグラフィー、（ｉｉ）フラッシュカラムクロマトグラフィー、（ｉｉｉ）ＲＰ Ｃ１８カラムクロマトグラフィー、（ｉｖ）シリカゲルカラムクロマトグラフィー、（ｖ）イオン交換クロマトグラフィー又は（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーから選択される少なくとも１つの精製プロセスを繰り返し行い、本発明の新規の化合物（ＫＳ５１３）を得ることによって調製されることにより特徴付けられる。

本明細書で定義される「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」の用語は、「薬学的添加物」、すなわち、医薬品を製造するのに使用される不活性な原料を含む。薬学的添加物として、色素、香味料、結合剤、軟化剤、充填剤、滑剤、防腐剤、及び他にも多くの分類が挙げられる。一般的な賦形剤として、当該技術分野（食品医薬品局のホームページ：www.fda.gov又は医薬品情報オンラインwww.drugs.comを参照されたい）又は以前の文献（例えば、Rowe, Raymond C et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 7th Edition, 2012）でよく知られている、コーンスターチ、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖、ゼラチン、ステアリン酸カルシウム、二酸化ケイ素、シェラック及びグレーズが挙げられる。

本明細書で開示される「予防」の用語は、本発明の組成物を投与することによって、本明細書で開示される或る特定の疾患又は障害の発症を阻害又は遅延する任意の作用を含み、また、本明細書で開示される「治療」の用語は、本発明の組成物を投与することによって、本明細書で開示される或る特定の疾患又は障害と関連する症状を緩和又は有利に変化させる任意の作用を含む。

本発明者らは、新規の化合物（ＫＳ５１３）を、（１）ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いた細胞毒性試験、（２）ＬＰＳにより誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞株におけるｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する作用、（３）ＮＯ再生に関与するｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生のレベルに対する阻害作用、（４）ＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルに対する阻害作用、（５）ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の産生レベルに対する阻害作用の種々の試験から強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから調製することができることを見出した。

それに応じて、本発明の他の態様によれば、本発明は、有効量のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又はＣＯＰＤ疾患の治療及び予防用の医薬組成物又は健康機能食品を提供する。

本発明は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療又は予防用の医薬組成物又は健康機能食品を提供する。

本発明の別の態様によれば、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療又は予防するために使用される医薬の製造のための、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）の使用も提供する。

本発明の別の態様によれば、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療又は予防するために使用される医薬の製造のための、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離される新規の化合物（ＫＳ５１３）及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の使用も提供される。

本発明の別の態様によれば、哺乳動物におけるアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療又は予防する方法であって、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、治療有効量の新規の化合物（ＫＳ５１３）を、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患した哺乳動物に投与することを含む、方法も提供する。

本発明の別の態様によれば、哺乳動物におけるアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療又は予防する方法であって、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、治療有効量の新規の化合物（ＫＳ５１３）及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む組成物をアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患した哺乳動物に投与することを含む、方法も提供する。

アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療及び予防するための本発明の組成物は、組成物の総重量に対して０．１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％の上記化合物を含むことができる。

本発明による組成物を薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を含有する医薬組成物として提供することができる。上記製剤は、追加的に、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤等を含んでもよい。本発明の組成物は、当該技術分野でよく知られている任意の手順を採用することにより、患者に投与した後の上記有効成分の即時放出、持続放出又は遅延放出を提供するように製剤化されてもよい。

例えば、本発明の組成物を、油、プロピレングリコール又は注射剤を製造するのに通常使用される他の溶媒に溶解することができる。担体の好適な例として、生理学的食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピル等が挙げられるが、それらに限定されない。局所投与に対しては、本発明の抽出物を軟膏及びクリームの形態に製剤化することができる。

本組成物を含有する医薬製剤は、経口剤形（粉末、錠剤、カプセル、軟カプセル、水性薬剤、シロップ、エリキシル、丸剤、粉末、サシェ、粒剤）、又は局所用調製物（クリーム、軟膏、ローション、ジェル、香膏、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアロゾル等）、又は注射用調製物（溶液、懸濁液、エマルション）等の任意の形態で調製することができる。

医薬剤形の本発明の組成物は、それらの薬学的に許容可能な塩の形態で使用されてもよく、さらに、単独で又は他の薬学的活性化合物と適当な関連のもと、また同じく、それらと組合せて使用されてもよい。

本発明の抽出物又は化合物の望ましい用量は、被験体の状態及び体重、重症度、薬剤の形態、投与経路及び期間に応じて変化し、当業者により選択され得る。しかしながら、所望の効果を得るため、一般的には、１日当たり体重１ｋｇ当たり本発明の抽出物を０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与することが推奨される。上記用量は、１日１回投与されてもよく、１日に数回に分けて投与されてもよい。

本発明の医薬組成物を、様々な経路で哺乳動物（ラット、マウス、家畜又はヒト）等の被験動物に投与することができる。全ての投与様式を考慮する。例えば、投与は経口で、経直腸で、又は静脈内、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、硬膜外若しくは脳室内の注射により行うことができる。

本発明はまた、有効量のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された新規の化合物（ＫＳ５１３）を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又はＣＯＰＤ疾患の治療及び予防用の医薬組成物及び健康食品を提供する。

本発明はまた、炎症性疾患、アレルギー性疾患、喘息又はＣＯＰＤを治療又は予防するために使用される医薬の製造のための、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離される新規の化合物（ＫＳ５１３）の使用を提供する。

本発明はまた、哺乳動物又はヒトにおける炎症性疾患、アレルギー性疾患、喘息又はＣＯＰＤを治療又は予防する方法であって、上記哺乳動物又はヒトにシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、有効量の新規の化合物（ＫＳ５１３）をその薬学的に許容可能な担体とともに投与することを含む、方法を提供する。

本発明の抽出物はまた、種々の機能性健康食品及び健康管理食品の作製に主成分又は添加物及び補助剤として使用することができる。

それに応じて、本発明の他の目的は、有効成分として含有するシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、治療有効量の新規の化合物（ＫＳ５１３）を含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防又は軽減用の健康機能食品を提供することである。

「機能性健康食品」の用語は、本明細書では「ヒト又は哺乳動物において目的とする疾患を予防又は改善するため本発明の抽出物を従来の食品に添加することにより物理的機能性又は生理学的機能性等の増強された機能性を有する機能性食品」と定義される。

本発明の他の目的は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、治療有効量の新規の化合物（ＫＳ５１３）を食品学的に許容可能な添加物とともに含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防又は軽減用の健康管理食品を提供することである。

「健康管理食品」の用語は、本明細書では「添加物の形態として少量で、又は粉末、顆粒、カプセル剤、丸剤、錠剤等の形態として全量で、特定の意図した効果を示さないが、全体的な意図した効果を示す本発明の抽出物又は化合物（複数の場合もある）を含有する食品」と定義される。

本明細書で定義される「食品学的に許容可能な添加物」は、「直接又は間接に、任意の食品の成分となる、又はそうでなければ任意の食品の特徴に影響を及ぼす、又は合理的にそれが予想される用途の任意の物質」を含み、その起源に応じて３つの群、すなわち、（１）ケトン、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸等の化学合成添加物；（２）カキ色素、カンゾウ抽出物、結晶セルロース、グアーガム等の天然添加物；（３）Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、防腐剤、タール色素等のそれらとの混合添加物等、又は当該技術分野若しくは以前の文献（GSFA Online：www.codexalimentarius.net/gsfaonline/index.htmlのホームページの"Codex General Standard for Food Additives"（GSFA, Codex STAN 192-1995）を参照されたい）でよく知られている、食品におけるその機能による様々なカテゴリー、例えば、増粘剤、熟成剤、漂白剤、捕捉剤、湿潤剤、固化防止剤、清澄剤、硬化剤、乳化剤、安定剤、増ちょう剤、塩基及び酸、気泡剤、栄養素、着色剤、香味剤、甘味料、保存剤、抗酸化剤等に分類され得る。

或る物質がその食品における特定の目的のために食品に添加される場合、それは直接添加物と呼ばれ、間接食品添加物は、その包装、保存又は他の取り扱いによって微量でその食品の一部となるものである。

本明細書に開示される「健康管理食品又は健康機能性食品」の用語は、食品、健康飲料、栄養補助食品等に含めることができ、目的とする疾患を予防又は改善するために、粉末、顆粒、錠剤、懸濁液、エマルション、シロップ、チューイングタブレット、カプセル、飲料等の薬学的な投与形態；又は食品形態、例えばパン、餅、ドライフルーツ、キャンディー、チョコレート、チューイングガム、アイスクリーム、低脂肪乳等の牛乳、乳糖加水分解済みの牛乳、山羊乳、加工乳、発酵乳、バター、濃縮乳、ミルククリーム、バターオイル、ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、粉ミルク、乳清等の乳製品、ハンバーグ、ハム、ソーセージ、ベーコン等の加工肉製品、加工卵製品、魚粕等の魚肉製品、即席麺、乾麺、生麺（wet noodles）、フライドヌードル、ノンフライ麺、ゼラチン化乾麺、加熱調理済み麺、凍結乾燥麺、パスタ等の麺製品、ティーバッグ、浸出茶等の茶製品、フルーツ飲料、野菜飲料、炭酸清涼飲料水、豆乳飲料、乳酸飲料配合飲料等の健康飲料、醤油、味噌、唐辛子ペースト、チュンジャン（カラメルで色付けした発酵大豆製品の一種）、チョングッチャン（バチルス・サブチリスによる自然発酵大豆）、混合ペースト、酢、ソース、ケチャップ、カレー粉、ドレッシング等の調味料、マーガリン、ショートニング、ピザ等へと配合することができるが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではない。

また、上述の抽出物又は化合物を目的の障害を予防及び改善する食品又は飲料に添加することができる。機能性健康食品又は健康管理食品としての食品又は飲料における上述の抽出物又は化合物（複数の場合もある）の量は、一般的には、機能性健康食品組成物用の食品の総重量の約０．０１ｗ／ｗ％〜約１００ｗ／ｗ％の範囲であってもよい。特に、機能性健康食品、健康管理食品又は特殊な栄養食品における本発明の抽出物の好ましい量は各食品の意図される目的に応じて変化し得るが、一般的に、上記食品組成物１００％に対して麺類等の食品において約０．０１％〜５％、健康管理食品において４０％〜１００％の範囲の割合の量で本発明の抽出物又は化合物（複数の場合もある）を添加物としての用途に使用することが好ましい。

本発明の健康飲料組成物が指定される割合で必須の成分として上記抽出物又は化合物（複数の場合もある）を含有する場合、他の液体成分については特に何ら制限もなく、他の成分は、従来の飲料等の様々な消臭剤（deodorant）又は天然の糖質であってもよい。上述の天然の糖質の例は、ブドウ糖、果糖等の単糖、マルトース、ショ糖等の二糖、デキストリン、シクロデキストリン等の従来の糖、並びにキシリトール及びエリスリトール等の糖アルコール等である。上述のもの以外の消臭剤として、有利には、タウマチン、レバウジオシドＡ、グリチルリチン等のステビア抽出物等の天然の消臭剤、及びサッカリン、アスパルテーム等の合成消臭剤等が有用な場合がある。上述の天然の糖質の量は、一般的には、本発明の飲料組成物１００ｍｌ当たり約１ｇ〜２０ｇ、好ましくは５ｇ〜１２ｇの範囲の割合である。

上述の組成以外の成分は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル、又は電解質、合成香味剤、着色剤、及びチーズ、チョコレート等の場合の品質改良剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド接着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料等に使用される炭化剤である。上述のもの以外の成分は、天然果汁ジュース、果汁飲料、及び野菜飲料を調製するための果汁であってもよく、上記成分は独立して又は組合せて使用され得る。上記成分の比率はさほど重要ではないが、一般的には、本発明の組成物１００ｗ／ｗ％当たり約０ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の範囲である。上記抽出物又は化合物を含む追加可能な食品の例は、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品等である。

本発明の抽出物又は化合物（複数の場合もある）は、毒性及びそれに対する有害作用がなく、安全に使用することができる。

本発明の組成物、使用及び調製物において、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な修飾及び変更を行うことができることが当業者に明らかであろう。

本発明は、以下の実施例によってより具体的に説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないことが理解されるべきである。

本発明に記載のように、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された本発明の新規の化合物（ＫＳ５１３）は、（１）ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いた細胞毒性試験、（２）ＬＰＳにより誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞株におけるｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する作用、（３）ＮＯ再生に関与するｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生のレベルに対する阻害作用、（４）ＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルに対する阻害作用、（５）ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の産生レベルに対する阻害作用の種々の試験から強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示した。

最良の形態
本発明の上記及び他の目的、特徴及び他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明によって更に明確に理解される。

ＲＡＷ２６４．７細胞株における、細胞毒性に対する試験サンプルの作用を示すグラフである。 ＲＡＷ２６４．７細胞株における、ｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する試験サンプルの作用を示すグラフである。 ウェスタンブロットアッセイ及び一酸化窒素アッセイを用いたＮＯ再生に関与するｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生のレベルに対する試験サンプルの阻害作用を示すグラフである（スチューデントのｔ検定によって統計分析を行い、Ｐ値（^＊＊、＜０．０５）が統計的に有意であるとみなされた）。 ウェスタンブロットアッセイ及び酵素免疫（ＥＩＡ）法を用いたＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルに対する試験サンプルの阻害作用を表した図である（スチューデントのｔ検定によって統計分析を行い、Ｐ値（^＊＊、＜０．０１及び^＊＊＊、＜０．００１）が統計的に有意であるとみなされた）。 ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の放出レベルに対する本発明の化合物の作用を表す図である（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって統計分析を行い、Ｐ値（^＊、＜０．０５、（^＊＊、＜０．０１及び^＊＊＊、＜０．００１）が統計的に有意であるとみなされた）。

本発明の組成物、使用及び調製物において、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な修飾及び変更を行うことができることが当業者に明らかであろう。

本発明を、以下の実施例においてより具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないと理解されるべきである。

以下の参照例、実施例及び実験例は、その範囲を限定することなく本発明を更に説明することを意図するものである。

参照例１．分析装置
実験において、融点を融点測定装置（Ｋｏｆｌｅｒ ｍｉｃｒｏｈｏｓｔａｇｅ）により求め、補正は行わず、旋光度をＪａｓｃｏ Ｐ−１０２０旋光計により、ＵＶデータをＵＶ−ＶＩＳ ２４５０分光計により、ＦＴ−ＩＲスペクトルをＪａｓｃｏ ＦＴ／ＩＲ−４２００により、ＮＭＲスペクトルを内部標準としてＴＭＳを用いたＶａｒｉａｎ ＵＮＩＴＹ ４００ＭＨｚ ＦＴ−ＮＭＲ分光計により、ＨＲＥＳＩＭＳをＷａｔｅｒｓ Ｑ−ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ分光計により、及びＨＰＬＣ分析をＵＶ／ＶＩＳ−１５５検出器及びポンプ３０５を用いたＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣにより求めた。

実施例１．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム由来の新規の化合物（ＫＳ５１３）の調製

１−１．粗製抽出物の調製
４．０ｋｇの乾燥シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（韓国、大田、ＫＲＩＢＢの植物抽出物バンクのＧＡＰ、ＫＲＩＢＢ ００２０６９７に従い、韓国、チュンチョンブクド、ウムソングン、ソイミョン２４４にて栽培）を小片に細分し、１０Ｌのメタノールと混合した。混合物を２４時間、室温にて撹拌し、１２時間、７８℃にて還流抽出により抽出し、濾液を２度回収した。抽出物を濾紙により濾過し、残屑を除去した。回収した濾液を、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−２１００、日本）により５５℃〜６５℃にて減圧下において濃縮し、凍結乾燥器を用いて乾燥させ、３９７．４ｇの粗製乾燥抽出物を得た。

１−２．精製抽出物の調製
２００ｇの粗製乾燥抽出物を混合溶媒（２５％ＭｅＯＨ水溶液）に溶解させ、分取逆相クロマトグラフィー（Ｚｅｏｐｒｅｐ Ｃ１８、７５μｍ、２００×２５０ｍｍ、Zeochem、米国、ルイビル）を用いて更に精製した。溶出画分（ｆ１〜ｆ４）を回収し、真空において濃縮した。５．０ｇの画分ｆ２をカラム：ＲＰ Ｃ−１８（Ｚｅｏｐｒｅｐ Ｃ１８、２０×２５０ｍｍ、１０μｍ、Zeochem、米国、ルイビル）及び溶出溶媒（ＭｅＯＨ水溶液＝２：８、３：７、４：６、１０：０）を用いた中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）に充填し、５つの部分画分、すなわちｆ２ａ、ｆ２ｂ、ｆ２ｃ、ｆ２ｄ及びｆ２ｅを得た。

１−３．新規の化合物ＫＳ５１３の調製
２．３ｇの部分画分（ｆ２ｂ）に半分取ＨＰＬＣ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｐｏｌａｒ−ＲＰ、４μｍ、２１．２×２５０ｍｍ、Phenomenex、米国、カリフォルニア州トーランス、Ｈ_２Ｏ中２３％ ＭｅＣＮ）を行い、以下の物理化学特性を示す白色非晶質粉末の新規のイリドイド化合物（１ａＳ，１ｂＳ，２Ｓ，４Ｓ，５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１ａ−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシ−２−（（（２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）オクタヒドロオキシレノ［２’，３’：４，５］シクロペンタ［１，２−ｃ］ピラン−６−イル ４−ヒドロキシベンゾエート｝（ＫＳ−５１３；Ｃ_２３Ｈ_２９ｌＯ_１３）を得た。
［α］^２０ _Ｄ−６４．０°（ｃ ０．２、ＭｅＯＨ）。
ＨＲＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ ５１３．１６０９［Ｍ−Ｈ］⁻を観測）：準分子３：１イオンクラスタ
ＩＲスペクトル：３４１２ｃｍ^−１（ヒドロキシル基）；１６９２ｃｍ^−１。（α，β−不飽和エステルカルボニル）
^１Ｈ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル：表１

実験例１．細胞毒性試験
本発明の化合物の細胞毒性を求めるため、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いた以下の細胞毒性試験を文献（Lee, S. U., et al., 2010, Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NK-kappa B signaling pathway, International Immunopharmacology, 10, pp298-303）に開示の方法により行った。

１−１．ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞毒性の評価
マウスのマクロファージ細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１、ＡＴＣＣ）を５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）補充ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco）培地に１×１０^５細胞／ｍｌの濃度にて懸濁させ、１００μＬの懸濁液を９６ウェルプレートに接種し、細胞をプレートに４時間接着させた。種々の濃度の試験サンプル（ＫＳ５１３化合物）で処理し、２４時間培養した。製造業者のマニュアルキット（Dojindo Co. Ltd）に従い１０μＬのＣＣＫ−８溶液を混合し、３０分〜４時間反応させ、溶液の吸光度を５７０ｎｍにて求めた。細胞生存率を０．２％ ＤＭＳＯで処理した陰性対照群に対する以下の数式１に従い算出し、結果を表２に示した。
［数式１］
細胞生存率（％）＝ＯＤ５７０ｎｍ（試験群）／ＯＤ５７０ｎｍ（陰性対照群）×１００

その結果、図１及び表２に示されるように、８０μＭ未満のＫＳ５１３化合物において、９５％を超える細胞生存率を示したことから、ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞毒性は示されなかったことを確認した。

実験例２．炎症促進を介在する酵素及び炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する阻害
ＬＰＳにより誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞株におけるｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現の阻害作用を求めるため、リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、ｑＰＣＲ）を用いた以下の試験を文献（Livak, K.J., Schimittgen T.D., 2001, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 （-Delta Delta C（T）method, Methods 25, p402-408）に開示の方法に従い行った。

２−１．手法
ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０^６細胞／ウェルの濃度にて６ウェルプレートに接種し、１２時間インキュベーションした。種々の濃度のＫＳ−５１３化合物（２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）で前処理し、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｌ６５２９、Sigma）を添加し、１２時間インキュベーションした。

全ＲＮＡを抽出するため、ＲＮＡを、トリアゾールＢ（invitrogen）を用いて抽出し、定量化の後にｃＤＮＡをＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（２０５１１３、Qiagen GmbH、ドイツ、ヒルデン）を用いて合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型及び表３に示すプライマー（配列番号１〜配列番号１４）と結合させ、ＰＣＲミックス（ＰＣＲマスターミックス、Bioneer、韓国）を用いて９４℃にて５分間変性させ、以下のように反応させた：前変性処理１サイクル；９５℃、３０秒、６０℃、４５秒、７２℃、４５秒、変性３０サイクル；７２℃、１０分、最終伸長１サイクル（図２）。

その結果、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞株において、ｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡの発現レベルがＬＰＳで処理した対照群において増加し、種々の濃度のＫＳ−５１３化合物で前処理した試験群のものは、表４に示すことができるように、ＬＰＳで処理した対照群のもの（１００％）に比べ用量依存的に顕著に低下したことを確認した。

実験例３．ｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生に対する阻害作用
ＮＯ再生に関与するｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生レベルの阻害作用を求めるため、以下の試験が行われた。

ＮＯ合成酵素によるＮＯは、血管拡張、血液凝固、神経伝達、腎機能、炎症、抗腫瘍等の種々の生物学的特性を示すことが知られている。ＮＯは、活性酸素及び高反応性生体起源物質の１つであり、炎症応答を生じる重要な役割を果たし、ＮＯＳ（一酸化窒素合成酵素）によりＬ−アルギニンから再生される。特に、ｉＮＯＳ（誘導型ＮＯＳ）は炎症応答に関与し、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカイン、ＬＰＳ（リポ多糖）等の刺激により発現する（Nathan, C., 1992, Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells, FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Society for Experimental Biology, 6, pp.3051-3064）。

３−１．ｉＮＯＳ発現レベルに対する作用
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳ発現のレベルに対する試験サンプルの作用を求めるため、以下のアッセイを文献（Lee, S. U., et al., Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NF-kappabeta signaling pathway: International immunopharmacology, 10, pp298-303）に開示の方法により行った。

ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳの発現レベルを、ウェスタンブロット分析を用いることによって求めた。ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０^６細胞／ウェルの濃度にて９６ウェルプレートに接種し、１２時間インキュベーションした。種々の濃度のＫＳ−５１３化合物（２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）で前処理し、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｌ６５２９、Sigma）を添加し、１２時間インキュベーションした。

タンパク質を抽出するために、氷冷ＰＢＳで細胞を３回洗浄後、溶解緩衝液（５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Roche、ドイツ、１１６９７４９８００１）を細胞に添加し、４℃にて３０分間反応させ、１２０００ｒｐｍの速度にて１０分間遠心分離し、上清を採取した。

当量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＢＲ１６２−０１４５、Bio-Rad）に移した。膜をブロッキング緩衝液（５％脱脂乳及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ溶液、ＳＨ３０２５８．０１、Ｈｙｃｌｏｎｅ）と１時間反応させ、抗体の非特異的結合を遮断した。タンパク質に対する抗体（抗ｉＮＯＳ）を１時間〜２時間にわたり添加し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳＴ溶液で洗浄し、二次抗体と反応させた。生成物をＥＣＬ系と反応させ、タンパク質量を画像分析装置（ＬＡＳ−４０００、Fujifilm）により求めた。

アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット、Thermo）を用いて５９５ｎｍでの吸光度を求めることによってタンパク質を定量的に測定し、結果を図３Ａに示した。

３−２．ＮＯＳ再生に対する阻害作用
培地中のＮＯ再生の量を求めるため、以下の試験を文献（Ding, A. H., et al., 1988, Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages, Comparison of activating cytokines and evidence for independent production, Journal of Immunology, 141, pp2407-2412）に開示の方法により行った。

ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０^５細胞／ウェルの濃度にて９６ウェルプレートに接種し、１８時間インキュベーションした。種々の濃度のＫＳ−５１３化合物（２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）で前処理し、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｌ６５２９、Sigma）を添加し、２４時間インキュベーションした。培地と当量のＧｒｉｅｓｓ試薬（Ｇ４４１０、Sigma）を添加し、室温にて１０分間反応させ、５４０ｎｍでの吸光度を求めた。培地のＮＯレベルを種々の濃度の亜硝酸ナトリウムに従って表された標準曲線を用いて求め、結果を表５及び図３に示した。

その結果、ＫＳ−５１３で処置した試験群のｉＮＯＳタンパク質の発現レベルは、用量依存的に減少したが、ＬＰＳ処理群のものは増加し（図３Ａ）、試験群におけるＮＯの再生レベルは、ＬＰＳ処理のもの（１００％）に対して用量依存的に減少したことを確認した。

実験例４．ＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルの阻害
ＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルの阻害作用を求めるため、以下の試験を文献（Chen, C, et al., 1999, Involvement of p38 mitogen-activated protein kinase in lipopolysaccharide-induced iNOS and COX-2 expression in J774 macrophage, Immunology, 97, pp124-129）に開示の方法により行った。

ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により誘発されたＲＡＷ２６４．７細胞のＣＯＸ−２の発現レベルを、実験例３に開示の方法に従い、ウェスタンブロット分析を用いて求めた。

ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０^５細胞／ウェルの濃度にて９６ウェルプレートに接種し、１８時間インキュベーションした。種々の濃度のＫＳ−５１３化合物（２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）で前処理し、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｌ６５２９、Sigma）を添加し、２４時間インキュベーションした。細胞のＰＧＥ２レベルを酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ、Amersham Pharmacia）系によって求め、結果を図４Ａ、図ＡＢ及び表６に示した。

その結果、ＫＳ−５１３で処理した試験群のＣＯＸ−２タンパク質の発現レベルは用量依存的に減少したが、ＬＰＳ処理群のものは増加し（図４Ａ）、試験群のＰＧＥ_２の再生比は、ＬＰＳ処理のもの（１００％）に対して用量依存的に減少したことを確認した。

実験例５．炎症促進性サイトカイン産生に対する阻害
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進性サイトカインの産生に対する阻害作用を求めるため、以下の試験を文献（Lee, S. U., et al., Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NF-kappabeta signaling pathway: International immunopharmacology, 10, pp298-303）に開示の方法により行った。

ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインは、炎症時の種々の細胞、例えばリンパ球、マクロファージ等の活性に密接に関与している。

ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０^５細胞／ウェルの濃度にて９６ウェルプレートに接種し、１８時間インキュベーションした。種々の濃度のＫＳ−５１３化合物（２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）で前処理し、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｌ６５２９、Sigma）を添加し、２４時間インキュベーションした。培地中の細胞のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインのレベルをＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１β：５５９６０３、ＩＬ−６：５５５２４０、ＴＮＦ−α：５５５８５３４、BD）によって求め、結果を図５及び表７〜表９に示した。

その結果、ＫＳ−５１３で処理した試験群のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進性サイトカインの産生レベルは用量依存的に減少したが、ＬＰＳ処理群（１μｇ／ｍｌ）のものは増加した（図５）ことを確認した。試験群における炎症促進性サイトカインの再生比は、ＬＰＳ処理のもの（１００％）に対して用量依存的に減少した。

実験例６．ラットにおける経口投与による急性毒性試験
６週齢のＳＰＦ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに本発明の化合物を投与することにより、急性毒性試験を行った。

２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、５０００ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物を、２匹のラットからなる各群に経口投与し、ラットの症状を１４日間にわたり観察した。抽出物又は化合物の投与の後、全ての臨床上の変化、すなわち、死亡率、臨床兆候、体重の変化を観察し、血液学検査及び血液生化学検査等の血液検査を行った。検視により腹部臓器及び胸部臓器の異常な変化を観察した。

いずれの群又はいずれの性別においても、死亡率の変化、臨床兆候、体重変化及び重大な知見を全く示さなかった。さらに、５０００ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物で処理した試験群において何らの毒性も示さなかった。

したがって、本発明で調製した本発明の化合物が経口投与においてＬＤ_５０（５０００ｍｇ／ｋｇ超）を示す強力で安全な物質であったことが確認された。

発明の形態
以下に製剤化方法及び賦形剤の種類を記載するが、本発明はそれらに限定されない。代表的な調製例を以下に記載する。

注射用調製物
ＫＳ５１３ １００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム ３．０ｍｇ
メチルパラベン ０．８ｍｇ
プロピルパラベン ０．１ｍｇ
注射用蒸留水 適量

有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に制御し、その後、全ての成分を２ｍＬアンプルに充填して、従来の注射用調製物の方法により滅菌することにより注射用調製物を調製した。

粉末調製物
ＫＳ５１３ ５００ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ

上記成分を混合し、密封パッケージに充填することにより粉末調製物を調製した。

錠剤調製物
ＫＳ５１３ ２００ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量

上記成分を混合し、打錠することにより錠剤調製物を調製した。

カプセル調製物
ＫＳ５１３ １００ｍｇ
乳糖 ５０ｍｇ
コーンスターチ ５０ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量

上記成分を混合し、従来のゼラチン調製物の方法によりゼラチンカプセルに充填することにより錠剤調製物を調製した。

液体調製物
ＫＳ５１３ １０００ｍｇ
糖 ２０ｇ
多糖類 ２０ｇ
レモンフレバー ２０ｇ

有効成分を溶解した後、全ての成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、従来の液体調製物の方法により滅菌することによって液体調製物を調製した。

健康食品調製物
ＫＳ５１３ １０００ｍｇ
混合ビタミン 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ_１０ １３ｍｇ
ビタミンＢ_２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１ ２０．２ｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
混合ミネラル 適量
硫酸第一鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム １５ｍｇ
リン酸二カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ

上述のビタミン及びミネラルの混合物は、様々に変化し得る。かかる変化は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱するものではないものとする。

健康飲料調製物
ＫＳ５１３ １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
濃縮アンズ ２ｇ
タウリン １ｇ
蒸留水 ９００ｍＬ

有効成分を溶解し、混合し、８５℃で１時間撹拌し、濾過した後、全ての成分を１０００ｍＬのアンプルに充填し、従来の健康飲料調製物の方法により滅菌することによって健康飲料調製物を調製した。

上述の本発明について、該発明が様々に変化し得ることが明らかであろう。かかる変化は本発明の趣旨及び範囲から逸脱するものとされず、当業者に自明であろう全てのかかる修飾が添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。

本発明に記載のように、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物由来の本発明のＫＳ５１３化合物は、例えば（１）ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いた細胞毒性試験、（２）ＬＰＳにより誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞株におけるｉＮＯＳ又はＣＯＸ−２等の炎症促進を介在する酵素及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症促進を介在するサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する作用、（３）ＮＯ再生に関与するｉＮＯＳタンパク質発現及びＮＯ再生のレベルに対する阻害作用、（４）ＣＯＸ−２タンパク質発現及びＰＧＥ２の再生レベルに対する阻害作用、（５）ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の産生レベルに対する阻害作用の種々の試験によって確認された強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗喘息活性及び抗ＣＯＰＤ活性を示した。それゆえ、本発明のＫＳ５１３化合物をアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療及び予防用の治療剤又は機能性健康食品として使用することができる。

Claims (7)

1. 以下の化学式（１）：
   ［化学式１］
   で表される（１ａＳ，１ｂＳ，２Ｓ，４Ｓ，５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１ａ−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシ−２−（（（２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）オクタヒドロオキシレノ［２’，３’：４，５］シクロペンタ［１，２−ｃ］ピラン−６−イル ４−ヒドロキシベンゾエート｝（ＫＳ−５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物。
2. シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された請求項１に記載の前記化合物（ＫＳ５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物を含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療又は予防用医薬組成物。
3. 請求項１に記載のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された前記化合物（ＫＳ５１３）及びその薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療又は予防用医薬組成物。
4. 哺乳動物におけるアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療又は予防する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の前記新規の化合物（ＫＳ５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物をアレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患した前記哺乳類動物に投与することを含む、方法。
5. アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療又は予防するために使用される医薬の製造のための、請求項１に記載の前記化合物（ＫＳ５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物及びその薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む組成物の使用。
6. 治療有効量の請求項１に記載の前記化合物（ＫＳ５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防又は軽減用健康機能食品。
7. 請求項１に記載の治療有効量の前記化合物（ＫＳ５１３）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物を食品学的に許容可能な添加物とともに含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防又は軽減用健康管理食品。