JP2017526379A - シャガシンに基づく足場組成物、方法及び使用 - Google Patents

シャガシンに基づく足場組成物、方法及び使用 Download PDF

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Abstract

シャガシン又はシャガシン様プロテアーゼ阻害剤タンパク質に由来する新規の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供される。天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のライブラリーと、このようなライブラリーを使用して、標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を作製する方法も提供される。本発明は、診断及び治療組成物及び方法を含む、標的リガンドに結合する天然に存在しないシャガシンタンパク質足場を使用する方法をさらに提供する。本発明は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する新規の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する新規の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質も提供する。【選択図】図１

Description

関連出願とのクロスリファレンス
本願は、その全内容が本明細書に参照により援用される２０１４年６月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／０１５２９６号の優先権利益を主張するものである。
代替タンパク質足場からの新規タンパク質の設計及び操作は、構造生物学及びイメージングツールからクリニックで現在検査されている治療用試薬に及ぶ広範な用途を有する、過去１０年間における新興分野であった（HK Binz等、Nat Biotechnol 23, 1257-1268, 2005；HK Binz及びA Pluckthun, Curr Opin Biotechnol 16, 459-469, 2005；SS Sidhu及びS Koide, Curr Opin Struct Biol 17, 481-487, 2007；A Skerra, Curr Opin Biotechnol 18, 295-304, 2007；C Gronwall及びS Stahl, J Biotechnol 140, 254-269, 2009；T Wurch等、Trends Biotechnol 30, 575-582, 2012；S Banta等、Annu Rev Biomed Eng 15, 93-113, 2013）。
潜在的な代替足場分子の望ましい物理的特性は、高い熱安定性並びに熱によるフォールディング及びアンフォールディングの可逆性を含む。高度に類似した熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、安定化ジスルフィド架橋の設計、α−ヘリックス傾向を増加させるための突然変異、塩橋の操作、タンパク質の表面電荷の改変、定向進化及びコンセンサス配列の組成を含むいくつかの方法が、タンパク質及び酵素の見かけ上の熱安定性を増加させるために適用された（Lehmann及びWyss, Curr Opin Biotechnol 12, 371-375, 2001）。
シャガシンは、シャガス病の原因となる病原体である、寄生虫クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）に由来する内因性のタンパク質である（ACS Monteiro等、J Cell Sci 114, 3933-3942, 2001）。シャガシンは、システインプロテアーゼ阻害剤のＩ４２ファミリーのシグネチャーメンバーであり、本来は、原生動物の寄生虫において発見された；シャガシンと相同なタンパク質は、原核生物と同様に真核生物に広く分布していることが判明した（DJ Rigden等、FEBS Lett 504, 41-44, 2001；SJ Sanderson等、FEBS Lett 542, 12-16, 2003）。シャガシンは、寄生虫が哺乳動物宿主細胞へと侵入及び繁殖するのに必須な、主要リソソームシステインプロテアーゼ、クルジパインに結合する熱安定性タンパク質として単離された。クルジパインに加えて、シャガシンは、ファルシパイン２、ファルシパイン３、カテプシンＢ、Ｌ、Ｋ及びＨ等、他のシステインプロテアーゼも阻害する（SX Wang等、Structure 15, 535-543, 2007）。現在までに、シャガシンの数種類のホモログについて記載されている（D Salmon等、J Mol Biol 357, 1511-1521, 2006；BO Smith等、J Biol Chem 281, 5821-5828, 2006；G Hansen等、Structure 19, 919-929, 2011）。単独での、並びにシステインプロテアーゼのパパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ及びファルシパイン２と複合体形成した、シャガシンの結晶構造は、β−サンドイッチタンパク質足場から突出する３個のループ（それぞれＬ２、Ｌ４及びＬ６又はＢＣ、ＤＥ及びＦＧと命名）が、酵素活性を阻害するための、これらのプロテアーゼの活性部位中裂への結合に必須であることを示した（AA Figueiredo da Silva等、J Struct Biol 157, 416-423, 2007；A Ljunggren等、J Mol Biol 371, 137-153, 2007；SX Wang等、Structure 15, 535-543, 2007；I Redzynia等、J Biol Chem 283, 22815-22825, 2008；I Redzynia等、FEBS J 276, 793-806, 2009）。シャガシンは、ヒトＣＤ８αと相同性を有する特有の免疫グロブリン様フォールドを有する（DJ Rigden等、FEBS Lett 504, 41-44, 2001；SX Wang等、Structure 15, 535-543, 2007）。
よって、種々の治療及び診断適用のために、小型の安定した人工の抗体様分子を開発する必要がある。本発明は、上述及び他の必要を満たす。
野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）及び／又はループ６（Ｌ６）に少なくとも１個のアミノ酸改変を含む天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。ある特定の実施態様では、野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤は、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）（Ｄｍ２８ｃクローン）、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）、ブルセイトリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）、メキシコリーシュマニア（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）、赤痢アメーバ（Ｅ．ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ）又は緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する。ある特定の実施態様では、野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤は、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）又はヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する。ある特定の実施態様では、野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するクルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）である。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列Ｘ５−８−ＧＦ（配列番号１５１）を含み、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＸ３−６−ＧＦ（配列番号１５２）を含み、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す。ある特定の実施態様では、Ｌ４は、アミノ酸配列Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ（配列番号１５３）を含み、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す。ある特定の実施態様では、Ｌ６は、アミノ酸配列Ｘ３−１２（配列番号１５４）を含み、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す。ある特定の実施態様では、Ｌ６は、アミノ酸配列Ｘ１０（配列番号１０６）を含み、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す。ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れかの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標的リガンドに特異的に結合する。ある特定の実施態様では、標的リガンドは、タンパク質、核酸、多糖、リポ多糖、脂質又はリン脂質である。ある特定の実施態様では、標的リガンドは、タンパク質である。ある特定の実施態様では、タンパク質は、細胞表面タンパク質、可溶型タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、眼性疾患に関連するタンパク質、がんに関連するタンパク質、骨疾患に関連するタンパク質、炎症に関連するタンパク質又は治療用タンパク質である。ある特定の実施態様では、タンパク質は、ＬＲＰ６である。ある特定の実施態様では、タンパク質は、ＶＥＧＦである。
ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れか１種の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、治療剤にコンジュゲートされている。ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れか１種の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標識にコンジュゲートされている。ある特定の実施態様では、標識は、放射性同位体、蛍光性色素及び酵素からなる群から選択される。
上述の実施態様の何れか１種における天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする単離された核酸も、本明細書に提供される。上述の実施態様の何れか１種における核酸分子をコードする発現ベクターも、本明細書に提供される。上述の実施態様の何れか１種における発現ベクターを含む細胞が、さらに本明細書に提供される。
上述の実施態様の何れか１種における天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法が、本明細書に提供される。本方法は、上述の実施態様の何れか１種における発現ベクターを含む細胞を培養することと、細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することを含むことができる。上述の実施態様の何れか１種における天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法も提供される。本方法は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を化学合成することを含むことができる。
上述の実施態様の何れか１種における天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する組成物も、本明細書に提供される。
ポリペプチドディスプレイライブラリーも、本明細書に包含される。ディスプレイライブラリーは、上述の実施態様の何れか１種における複数の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むことができる。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌又は酵母細胞の表面上にディスプレイされる。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、バクテリオファージ上にディスプレイされる。ある特定の実施態様では、バクテリオファージは、繊維状バクテリオファージである。ある特定の実施態様では、繊維状バクテリオファージは、Ｍ１３ファージである。ある特定の実施態様では、ポリペプチドライブラリーは、約１０８から約１０１４の間の配列多様性を有する。上述の実施態様の何れか１種におけるポリペプチドディスプレイライブラリーをコードする核酸分子も、本明細書に提供される。上述の実施態様の何れか１種における核酸分子に動作可能に連結された発現ベクターも、本明細書に提供される。
標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得る方法も、本明細書に包含される。本方法は、（ａ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を可能にする条件下で、上述の実施態様の何れか１種におけるライブラリーと標的リガンドとを接触させることと、（ｂ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を検出することと、（ｃ）複合体から、標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得ることとを含むことができる。ある特定の実施態様では、本方法は、工程（ｃ）において得られる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６をランダム化して、さらにランダム化された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を作製することと、前記さらにランダム化された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して工程（ａ）及び（ｂ）を反復することとをさらに含むことができる。
一部の実施態様では、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する抗体であって、ヒトＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む抗体も、本明細書に提供される。
本発明は、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を提供する。
上述の実施態様の何れかの（又はこれに適用される）ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む。
一部の実施態様では、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する抗体であって、ヒトＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む抗体も、本明細書に提供される。
本発明は、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を提供する。
上述の実施態様の何れかの（又はこれに適用される）ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合し、配列番号２を参照して、配列番号３−５、７８−８０及び１４６の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号７−９、７７及び８１−８３の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号１１−１３、８４−８６及び１４７の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。
ある特定の実施態様では、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合し、配列番号２を参照して、配列番号３−５の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号７−９の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号１１−１３の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＰＱＴ（配列番号３）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＳＮＫＶＫＧＶＰＧＦ（配列番号７）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＧＰＷＴＧＡＳＱＥＰ（配列番号１１）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＳＮＫＩＫＧＩＰＧＦ（配列番号８）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＲＰＳＴＧＰＳＤＤＳ（配列番号１２）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＶＤ（配列番号５）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＰＲＶＫＧＡＹＬＶＭ（配列番号１３）を含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＹＮＮＩＲＧＬＰＧＦ（配列番号８１）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ（配列番号８４）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＳＣ（配列番号７９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号８２）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＳＰＹＹＧＰＴＫＶＥ（配列番号８５）を含むＬ６を含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＡＤ（配列番号８０）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＹＴＫＨ（配列番号８３）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＰＲＥＫＧＳＳＬＶＭ（配列番号８６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＡＤ（配列番号１４６）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＲＲＥＫＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４７）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１４９に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れかにおける天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、５００ｎＭから１ｐＭの間のＫｄでヒトＬＲＰ６に結合する。ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れかにおける天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＬＲＰ６に特異的に結合し、Ｗｎｔ１シグナル伝達を阻害する。
別の実施態様では、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する抗体であって、ヒトＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む抗体も、本明細書に包含される。
別の実施態様では、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書に提供される。
上述の実施態様の何れかの（又はこれに適用される）ある特定の実施態様では、ＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む。上述の実施態様の何れかの（又はこれに適用される）ある特定の実施態様では、ＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１８−２２の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号２４−２８の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号３０−３４の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＬＲＳＭ（配列番号１８）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＡＧＰＳＡＶＰＬ（配列番号２４）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＲＧＰＡＮＶＩ（配列番号３０）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＮＤＰＧＳＲＬＳ（配列番号２５）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号３１）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＬＱＮＡ（配列番号２０）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＬＳＬＹＡＳＥＴ（配列番号２６）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＮＰＮＷＧＰＤＹＷＩ（配列番号３２）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＬＱＤＳ（配列番号２１）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＳＧＴＴＧＫＳＮ（配列番号２７）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＦＫＳＲＧＬＭＶＰＬ（配列番号３３）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＲＤＳ（配列番号２２）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＶＲＡＧＱＡＮＥ（配列番号２８）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＳＰＶＬＧＰＲＦＷＬ（配列番号３４）を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む天然に存在しないシャガシン足場タンパク質も、本明細書に提供される。ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する抗体であって、ヒトＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む抗体も、本明細書に包含される。
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質も、本明細書に包含される。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１９及び４２−４８の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号５０−５７の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号５９−６６の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＤＤＰＧＳＧＬＷ（配列番号５０）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＹＬ（配列番号５９）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＥ（配列番号４２）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＮＧＰＧＬＧＶＹ（配列番号５１）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＱＧＰＳＲＥＬ（配列番号６０）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＮＶＮＧＳＨＡＷ（配列番号５２）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＦＬ（配列番号６１）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＣＤ（配列番号４４）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＮＹＰＧＳＧＶＬ（配列番号５３）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＦＧＰＳＲＶＬ（配列番号６２）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＮＤ（配列番号４５）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＧＳＳＹＷＧ（配列番号５４）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＡＧＰＳＲＶＬ（配列番号６３）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＳＧＳＹＭＳＹＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＤＬ（配列番号６４）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＦＲＥ（配列番号４７）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＨＶＱＷＧＷ（配列番号５６）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＡＰＷＶＧＰＳＲＥＬ（配列番号６５）を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号６９に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７１に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む。
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質も、本明細書に提供される。ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質も、本明細書に提供される。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、配列番号２を参照して、Ｌ２は、配列番号４８及び１１０の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ４は、配列番号５７及び１１１−１１３の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ６は、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、配列番号２を参照して、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＹＫＤ（配列番号１１０）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む。ある特定の実施態様では、配列番号２を参照して、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＨＹＱＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１１）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む。ある特定の実施態様では、配列番号２を参照して、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＨＹＳＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１２）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む。ある特定の実施態様では、配列番号２を参照して、Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４は、アミノ酸配列ＨＹＴＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１３）を含み、Ｌ６は、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れかにおける天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、５００ｎＭから１ｐＭの間のＫｄでヒトＶＥＧＦに結合する。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ホモダイマーを形成する。
ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れか１種におけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び／又は上述の実施態様の何れか１種におけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、治療剤にコンジュゲートされている。ある特定の実施態様では、上述の実施態様の何れか１種におけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び／又は上述の実施態様の何れか１種におけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標識にコンジュゲートされている。ある特定の実施態様では、標識は、放射性同位体、蛍光性色素及び酵素からなる群から選択される。
本発明は、上述の実施態様の何れか１種におけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は上述の実施態様の何れか１種におけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。本発明は、上述の実施態様の何れかにおける核酸分子をコードする発現ベクターも提供する。上述の実施態様の何れかにおける発現ベクターを含む細胞も、本明細書に提供される。
本発明は、上述の実施態様の何れか１種におけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び／又は上述の実施態様の何れか１種におけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、上述の実施態様の何れかにおける細胞を培養することと、細胞培養物から上述の実施態様の何れか１種におけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は上述の実施態様の何れか１種におけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することとを含む方法を提供する。本発明は、上述の実施態様の何れか１種におけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は上述の実施態様の何れか１種におけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、ＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又はＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を化学合成することを含む方法も提供する。
本発明は、上述の実施態様の何れかにおけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を患者由来の試料に接触させ、ＬＲＰ６タンパク質に結合された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を検出することにより、患者由来の試料におけるＬＲＰ６タンパク質を検出する方法を提供する。本発明は、上述の実施態様の何れかにおけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を患者由来の試料に接触させ、ＶＥＧＦタンパク質に結合された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を検出することにより、患者由来の試料におけるＶＥＧＦタンパク質を検出する方法も提供する。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される。
本発明により、上述の実施態様の何れかにおけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。対象におけるがん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患を治療する方法であって、前記組成物の有効量を対象に投与することを含む方法も提供される。がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患の治療における使用のための、上述の実施態様の何れかにおけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物も提供される。がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、上述の実施態様の何れかにおけるＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の使用も提供される。
本発明により、上述の実施態様の何れかにおけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供される。本発明は、対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出を抑制する方法であって、前記組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患を治療する方法であって、前記組成物の有効量を対象に投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施態様では、疾患は、がん、眼性疾患又は炎症性疾患である。本発明は、対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患の治療における使用のための、上述の実施態様の何れかにおけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物を提供する。本発明は、対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患を治療するための医薬の製造における、上述の実施態様の何れかにおけるＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の使用も提供する。
異なる生物体に由来するシャガシン様プロテアーゼ阻害剤の配列アラインメントを示す図である。 ファージディスプレイにかけられたシャガシンの、パパインへの結合を測定するのに実施されたＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 ファージディスプレイにかけられたシャガシンの、シャガシンのＮ末端へと融合させたｇＤエピトープタグに特異的な抗体への結合を測定するのに実施されたＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 Ｄｋｋ１ペプチドである、Ａｃ−ＮＳＮＡＩＫＮ−ＮＨ２（配列番号１０９）と複合させた、ＬＲＰ６−Ｅ１の結晶構造を示す図である。 図４Ａは、そのアミノ酸配列が、配列番号８７に記載されている、ＬＲＰ６結合剤Ｈの結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 図４Ｂは、そのアミノ酸配列が、配列番号８８に記載されている、ＬＲＰ６結合剤Ｐの結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 そのアミノ酸配列が、配列番号８９に記載されている、ＬＲＰ６結合剤Ｓの結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 そのアミノ酸配列が、配列番号１５に記載されている、ＬＲＰ６結合剤Ｈ２の結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 そのアミノ酸配列が、配列番号１６に記載されている、ＬＲＰ６結合剤Ｈ１５の結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 そのアミノ酸配列が、配列番号１７に記載されている、ＬＲＰ６結合剤Ｓ１１の結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 ＬＲＰ６結合剤Ｈ２、Ｈ１５、及びＳ１１が、Ｗｎｔ依存性細胞内シグナル伝達を阻害することが可能であるかどうかを決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 シャガシンＶＥＧＦ変異体である、５−４４−Ｄ８（配列番号３６）、４−６６−Ｆ６（配列番号３７）、２−４０−Ｄ４（配列番号３８）、１−９０−Ｈ６（配列番号３９）、及び３−６５−Ｆ５（配列番号４０）の、ＥＬＩＳＡプレートへとコーティングされたＶＥＧＦ（３８４ Ｍａｘｉｓｏｒｐ上にコーティングされた５μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）に対するファージ結合滴定を示す図である。 競合結合ＥＬＩＳＡにおいて、ＧＳＴへと融合させたシャガシンＶＥＧＦ変異体である、１−９０−Ｈ６（配列番号３９）、２−４０−Ｄ４（配列番号３８）、３−６５−Ｆ５（配列番号４０）、４−６６−Ｆ６（配列番号３７）、及び５−４４−Ｄ８（配列番号３６）が、ＶＥＧＦの、ＶＥＧＦＲ１−ＥＣＤ Ｆｃ融合体への結合をブロックする能力を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 競合結合ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＥＧＦ変異体４−６６−Ｆ６（配列番号３７）単独、及びＧＳＴへと融合させた４−６６−Ｆ６（配列番号３７）が、ＶＥＧＦの、ＶＥＧＦＲ１−ＥＣＤ Ｆｃ融合体への結合をブロックする能力を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 図１０Ａは、細胞ベースのアッセイにおける、ＧＳＴへと融合させたシャガシンＶＥＧＦ変異体の、ヒトＶＥＧＦに対する阻害活性（変異体３のアミノ酸配列は、配列番号４０に記載されており；変異体４のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載されており；ＷＴのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている）を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 図１０Ｂは、細胞ベースのアッセイにおける、ＧＳＴへと融合させたシャガシンＶＥＧＦ変異体の、マウスＶＥＧＦに対する阻害活性（変異体３のアミノ酸配列は、配列番号４０に記載されており；変異体４のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載されており；ＷＴのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている）を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 細胞ベースのアッセイにおける、ＧＳＴへと融合させたシャガシンＶＥＧＦ変異体の、ラットＶＥＧＦに対する阻害活性（変異体３のアミノ酸配列は、配列番号４０に記載されており；変異体４のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載されており；ＷＴのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている）を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 細胞ベースのアッセイにおける、ＧＳＴ−シャガシンＶＥＧＦ変異体４、変異体４（配列番号３７）、及び抗ＶＥＧＦ抗体の、ヒトＶＥＧＦに対する阻害活性を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 ファージスポットＥＬＩＳＡにより決定される、ＶＥＧＦに対する標的親和性及び標的特異性が大きな、３３個のファージクローンの部分配列を示す図である。 細胞ベースのアッセイにおける、親和性成熟させたシャガシンＶＥＧＦ変異体の、ヒトＶＥＧＦに対する阻害活性（ＷＴのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されており；結合剤４のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載されており；Ｅ４Ｂ−５のアミノ酸配列は、配列番号７０に記載されており；Ｅ４Ｂ−７のアミノ酸配列は、配列番号７１に記載されており；Ｅ４Ｂ−１０のアミノ酸配列は、配列番号６９に記載されており；Ｌ４Ｘ６−３のアミノ酸配列は、配列番号７３に記載されており；Ｌ４Ｘ６−７のアミノ酸配列は、配列番号７５に記載されており；Ｌ４Ｘ６−９のアミノ酸配列は、配列番号７４に記載されている）を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 溶液中のモノマーのシャガシンＶＥＧＦ変異体Ｌ４Ｘ６−７（そのアミノ酸配列は、配列番号７５に記載の）の、ビオチニル化されたＶＥＧＦ１０９に対する結合反応速度を決定するのに実施される実験の結果を示す図である。 シャガシンＶＥＧＦ変異体３７（すなわち、配列番号７２）及びシャガシンＶＥＧＦ変異体６６（配列番号７６）についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及び結合反応速度を示す図である。
本発明は、シャガシン又はシャガシン様プロテアーゼ阻害剤タンパク質に由来する新規の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を提供する。本明細書に提供されるシャガシン足場タンパク質は、高度に熱安定性であり、この性質は、得られる組換えタンパク質の収量を増加させ、精製された分子の溶解度を改善し、細胞内足場の活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小化することができる。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の全体的なフォールドは、相対的な配向性において抗体ＣＤＲと類似の様式で、そのループのうち３個（Ｌ２、Ｌ４及びＬ６）をディスプレイすることを可能にする。この構造により、本発明の足場は、抗体と性質及び親和性が同様の抗原結合特性を保有する。したがって、抗体が、抗原のエピトープに結合するのに酷似して、本明細書に提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標的リガンドにおけるエピトープ（すなわち、決定基）に結合する。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のライブラリーと、このようなライブラリーを使用して、標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を作製する方法が、本明細書に提供される。本明細書に開示されている通り、標的リガンドに結合する天然に存在しないシャガシンタンパク質足場を使用する方法も提供される。このような方法として、診断及び治療方法を挙げることができるがこれらに限定されない。診断及び治療組成物も、本明細書に包含される。
関連する態様では、本発明は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する新規の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する新規の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を提供する。
本明細書に記載されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むキメラ分子及びコンジュゲート、本明細書に記載されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸、並びに組成物（薬学的組成物等）も提供される。本発明は、本明細書に記載されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、試料（インビボ又はエクスビボ試料等）におけるＬＲＰ６若しくはＶＥＧＦ又は別の標的を検出する方法、異常ＬＲＰ６活性若しくは発現又は異常ＶＥＧＦ活性若しくは発現に起因する疾患及び障害の治療における使用のための、本明細書に記載されているこのような天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物、並びにがんの治療のための医薬の製造におけるこのような天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の使用も提供する。
本開示の実施は、別途指示がない限り、細胞生物学、毒性学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組換えＤＮＡの分野及び関連分野における標準方法及び従来技法を当業者の技能範囲内で用いる。このような技法は、文献に記載されており、これにより、当業者に利用可能である。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００８；Ｖｏｅｔ，Ｄ．等、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｌｉｆｅ ａｔ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ」３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２００８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．等、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７及び定期改訂；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ 、ＮＪ 、２０００；並びにシリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．を参照されたい。
定義
本明細書において、「天然に存在しない」は、自然には見出されないポリペプチド又は核酸を意味する。天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（又はこれをコードする核酸）は、遺伝子操作方法又は化学合成方法によって産生することができる。よって、本明細書に記載されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、組換えであり得、すなわち、異種核酸の導入若しくはネイティブ核酸の改変によって当該細胞にとってネイティブではない形態へと修飾された細胞若しくは核酸若しくはベクターによって産生することができ、又は細胞は、このように修飾された細胞に由来する。あるいは、本明細書に記載されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、化学的ペプチド合成により産生することができる。
本明細書において、「アミノ酸改変」は、天然に存在するタンパク質配列（天然に存在するシャガシンタンパク質配列又はシャガシン様プロテアーゼ阻害剤タンパク質配列等）における対応する配列からの少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失又は置換を指す。
「単離された」天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は組成物は、同定された並びにその自然環境の成分から分離及び／又は回収されたタンパク質又は組成物である。その自然環境の夾雑物成分は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のための診断又は治療的使用に干渉する材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含むことができる。好まれる実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は組成物は、（１）ローリー法によって決定される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の９５重量％超まで、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を使用した還元若しくは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一性を得るまで精製される。単離された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、シャガシン足場タンパク質の自然環境の少なくとも１種の成分が存在しないため、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕにおけるシャガシン足場タンパク質を含む。通常、しかし、単離された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、少なくとも１回の精製工程により調製される。
本明細書において同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「相同性」は、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しつつ配列をアラインさせた後に、比較されているポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技能範囲内の様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等、公開コンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大のアラインメントの達成に必要とされる何れかのアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書における目的のため、しかし、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、そのソースコードは、米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９においてユーザードキュメンテーションと共に出願されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７において登録された。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サウスサンフランシスコにより公開されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄにおける使用のためにコンパイルするべきである。あらゆる配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は組成物の「有効量」は、特に表明された目的を達成するのに十分な量である。「有効量」は、経験的に、また、表明された目的に関する公知の方法によって決定することができる。
用語「治療的有効量」は、哺乳動物（別名、患者）における疾患又は障害の「治療」に有効な、本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は組成物の量を指す。がんの場合、本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は組成物の治療的有効量は、がん細胞の数を低下させる；腫瘍サイズ若しくは重量を低下させる；末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで遅くし、好ましくは停止する）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで遅くし、好ましくは停止する）；腫瘍増殖をある程度まで阻害する；及び／又はがんに関連する症候のうち１種若しくは複数をある程度まで軽減することができる。本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は組成物が、現存しているがん細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができる程度まで、これは、細胞分裂停止性及び／又は細胞傷害性であり得る。一実施態様では、治療的有効量は、成長阻害量である。別の実施態様では、治療的有効量は、患者の生存を延長する量である。別の実施態様では、治療的有効量は、患者の無進行生存を改善する量である。
本明細書において、「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための手法である。本発明の目的のため、有益な又は所望の臨床結果として、次のうち１種又は複数が挙げられるがこれらに限定されない：疾患に起因する１種若しくは複数の症候の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止又は遅延）、疾患の拡散（例えば、転移）の防止若しくは遅延、疾患の再発の防止若しくは遅延、疾患の進行の遅延若しくは遅くすること、病状の緩解、疾患の寛解（部分的又は完全）の提供、疾患の治療に必要とされる１種若しくは複数の他の薬剤負荷の用量の減少、疾患の進行の遅延、クオリティオブライフの増加若しくは改善、体重増の増加、及び／又は生存の延長。「治療」によって、がんの病理学的帰結（例えば、腫瘍体積等）の低下も包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうち何れか１種又は複数を企図する。
「障害」は、本明細書に記載されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質による治療から利益を得る何れかの状態である。例えば、哺乳動物は、異常ＬＲＰ６発現若しくは活性又は異常ＶＥＧＦ発現若しくは活性を患う又はその予防を必要とする。これは、哺乳動物を問題の障害に罹り易くする病態を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。本明細書において治療しようとするＬＲＰ６関連障害の非限定例として、本明細書の他の箇所に記載されている通り、がん及び転移性疾患、骨粗鬆症及び他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ及び他の炎症性疾患が挙げられる。本明細書において治療しようとするＶＥＧＦ関連障害の非限定例として、本明細書の他の箇所に記載されている通り、がん、眼性疾患、炎症性疾患が挙げられる。
本明細書において、「薬学的に許容される」又は「薬理的に適合性」とは、生物学的に又は他の意味で望ましくないところがない材料を意味し、例えば、このような材料は、いかなる有意な望ましくない生物学的効果を引き起こすこともなく、又はこれが含有される組成物の他の成分の何れかと有害な様式で相互作用することもなく、患者に投与される薬学的組成物に取り込むことができる。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、好ましくは、毒性学及び製造検査の要求される標準を満たした、及び／又は米国食品医薬品局によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれる。
用語「検出する」は、物質の存在若しくは非存在の決定又は物質（標的リガンド等）の量の定量化を含むことを目的とする。よって、この用語は、定性的及び定量的決定のための、本発明の材料、組成物及び方法の使用を指す。一般に、検出に使用される特定の技法は、本発明の実施に重大な意味を持たない。
例えば、本発明における「検出する」は、次のものを含むことができる：標的リガンド（ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）ポリペプチド又はヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない）の存在若しくは非存在の観察；標的リガンドのレベルの変化；及び／又は標的リガンドの生物学的機能／活性の変化。ある特定の実施態様では、「検出する」は、標的リガンド（例えば、ヒトＬＲＰ６又はヒトＶＥＧＦのポリペプチドレベル）のレベルの検出を含むことができる。検出は、コントロールと比較して、１０％から９０％の間の何れかの値又は３０％から６０％の間若しくは１００％超の何れかの値の変化（増加又は減少）の定量化を含むことができる。検出は、２倍から１０倍の間の何れかの値の包括的な又はそれ以上、例えば、１００倍の変化の定量化を含むことができる。
単語「標識」は、本明細書において使用される場合、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質に直接的又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識それ自体が、単独で検出可能であり得（例えば、放射性標識又は蛍光性標識）、又は酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学変成を触媒することができる。
標的リガンドへの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合に関して、用語「特異的結合」又は特定の標的リガンド「に特異的に結合する」若しくは「に特異的」であるとは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を持たない同様の構造の分子であるコントロール分子の結合と比較した分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非標識標的と同様であるコントロール分子との競合により決定することができる。この場合、プローブへの標識された標的の結合が、過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害されるのであれば、特異的結合が示される。ある特定の実施態様では、「非標的」リガンドへの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合の程度は、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定される、その標的リガンドへの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合の約１０％未満となる。ある特定の実施態様では、本開示の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、約４℃、２５℃、３７℃又は４５℃の温度で測定される、１００ｎＭ以下の、任意選択的に１０ｎＭよりも低い、任意選択的に１ｎＭよりも低い、任意選択的に０．５ｎＭよりも低い、任意選択的に０．１ｎＭよりも低い、任意選択的に０．０１ｎＭよりも低い又は任意選択的に０．００５ｎＭよりも低い解離定数（Ｋｄ）で、標的リガンド（ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられるがこれらに限定されない）に特異的に結合する。
本明細書における「約」値又はパラメータの参照は、本技術分野の当業者であれば容易に分かるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値又はパラメータの参照は、該値又はパラメータそれ自体を対象とする態様を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」を指す記述は、「Ｘ」の記述を含む。
本明細書に記載されている本発明の態様及び実施態様が、態様及び実施態様「を含む」、「からなる」及び「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
特許出願及び刊行物を含む本明細書に引用されているあらゆる参考文献は、これによりそれらの全内容が本明細書に参照により援用される。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質
シャガシンとは、システインペプチダーゼ（ＣＰ）のＣＡクラン、Ｃ１ファミリーの天然阻害剤であって、ヒトシャーガス病の病原体の原虫である、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）において同定された天然阻害剤である（Monteiro等(2001)、J. Cell、Sci.、114:3933-3942; Marin-Neto等(2007)、Circulation.、115:1101-1108）。シャガシンは、ＣＰ阻害剤の他の公知の群との配列類似性を伴わない、１１０残基の単一のポリペプチド鎖であり、１：１の緊密な結合複合体の形成を介して、パパイン様酵素を強力に不活化させる。他の原虫内及び細菌内に存在するシャガシン様阻害剤は、ＩＣＰ（システインペプチダーゼ阻害剤）と名指され、シャガシンファミリー（ＪＬクランのＩ４２ファミリー）を併せて含む（Rigden等(2002)、Protein Sci.、11、1971-1977; Sanderson等(2003)、FEBS Lett.、542:12-16; MEROPSデータベース（インターネット：merops.sanger.ac.uk/））。
シャガシンホモログは、１１０−１３０アミノ酸長であり、さらなるドメインを含有しないことが典型的である。保存的コア構造は、さらに１つ又は２つの潜在的なβストランドが隣接する、７つの予測されるβストランド（図１）を含む。既存のフォールド認識及びモデル化実験では、説得力のある形で、他のβサンドイッチ構造より、Ｉｇ型ドメインが支持された。さらに、シャガシン配列の、抗体軽鎖可変ドメインのコンセンサス配列との比較は、不変トリプトファン及びいくつかの近傍残基を含む、鍵となる残基の保存であって、遠隔の進化関係を示唆する保存を明らかにした。
ＮＭＲにより決定される、シャガシンＩＣＰ及びメキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ）ＩＣＰについての溶液構造は、分子が、Ｉｇ様フォールドと、３つの露出されたループ領域（すなわち、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及びループ６（Ｌ６））であって、分子の一方の端部に位置する、進化的に保存された残基を持つ領域とを有することを示した（Salmon D等(2006)、J. Mol. Biol.、357:1511-1521; Smith等(2006)、J. Biol. Chem.、281:5821-5828）。これらの３つの鍵となるループである、Ｌ２（残基２８−３４）、Ｌ４（残基５９−６９）、及びＬ６（残基９１−１００）は、それぞれ、（ｉ）ＮＰＴＴＧモチーフ；（ｉｉ）その後にＧＸＧＧが続く、２つの疎水性残基を持つ保存的領域；及び（ｉｉｉ）ＲＰＷ／Ｆモチーフ（Salmon D等(2006)、J. Mol. Biol.、357:1511-1521）を含有する。シャガシンの、クルジペインとの接触時における化学シフト摂動についての研究により、Ｌ２内、Ｌ４内、及びＬ６内の残基が、酵素標的シャガシンの結合部位を含む候補残基として同定された（Salmon D等(2006)、J. Mol. Biol.、357:1511-1521）。この仮説は、シャガシンの高分解能結晶構造を、クルゼイン（クルジペインの組換え切断型）の高分解能構造へとドッキングすることにより補強された（Figueiredo da Silva等(2006)、J. Struct. Biol.、157:416-423）。
異なる病原性細菌及び病原性原虫に由来するシャガシン様プロテアーゼ阻害剤の配列アラインメントを、図１に示す。残基番号は、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）シャガシンを指す。クルーズトリパノソーマシャガシンのＮＭＲ構造内で見出される、βストランド及び３１０ヘリックスを、それぞれ、矢印及び円筒により表示し、βストランドに関する配列を枠囲いする。ループ内で最もよく保存されている残基位置を、太字で強調し、保存的な疎水性（芳香族及び脂肪族）残基を、黄色で着色する。クルーズトリパノソーマの非保存的残基は、青色で強調する。ＣＤ８内の相補性決定領域（ＣＤＲ１−３）を指し示す。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号は、以下：クルーズトリパノソーマに由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｄｍ２８ｃクローン：Ｑ９６６Ｘ９；ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１：Ｑ４ＤＨ３２；ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２：Ｑ４ＤＹ７１）；ブルセイトリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｑ８６８Ｈ０）、メキシコリーシュマニア（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｑ８６８Ｈ１）、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｑ８６８Ｇ９）、赤痢アメーバ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｑ６ＫＣＡ４）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｑ９Ｉ５Ｇ０）、及びヒト構造的ホモログタンパク質である、ＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｐ０１７３２）、ＩＬ−１ Ｒ１：インターロイキン１ １型受容体に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｐ１４７７８）、Ｖｃａｍ−１：血管細胞接着分子１に由来するシャガシン様ＩＣＰ（Ｐ１９３２０）の通りである（出典：D Salmon等、J Mol Biol、357、1511-1521、2006）。
このような配列アラインメントにより、ループ２を構成する残基については、高度の保存が明らかになる一方で、プロテアーゼ活性部位のクレフトに結合しようとするループ４及びループ６は、部分的に保存されているに過ぎない（A Ljunggren等、J Mol Biol、371、137-153、2007; SX Wang等、Structure、15、535-543、2007; I Redzynia等、J Biol Chem、283、22815-22825、2008; I Redzynia等、FEBS J、276、793-806、2009）。ループ４は、異なる生物体の間で、長さが、１０から２１残基まで変動する可能性があり、ＮＭＲ解析に基づくと、極めて可撓性であることが見出される（D Salmon等、J Mol Biol、357、1511-1521、2006; BO Smith等、J Biol Chem、281、5821-5828、2006）。
一態様では、本発明は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、野生型シャガシン又は野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む足場タンパク質を提供する。「足場」という用語は、タンパク質ライブラリーの構築における、保存的な共通配列として使用される、最小限のポリペプチド「フレームワーク」又は「配列モチーフ」を指す。足場の固定的又は保存的な残基／位置の間には、可変位置及び超可変位置、例えば、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が存在する。標的リガンドへの特異的結合をもたらすように、固定的な足場残基の間では、可変領域内のアミノ酸に大きな多様性が備わっている。足場は、配列が類縁のタンパク質のファミリーのアラインメントにおいて観察される、保存的残基により規定されることが典型的である。固定的残基は、とりわけ、アラインさせたタンパク質の機能が異なる場合に、フォールティング又は構造に要求される場合がある。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（Ｄｍ２８ｃクローン）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（Ｄｍ２８ｃクローン）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的リガンドとは異なる標的リガンドに結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的リガンドとは異なる標的リガンドに結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的リガンドとは異なる標的リガンドに結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ブルセイトリパノソーマに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ブルセイトリパノソーマに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的リガンドとは異なる標的リガンドに結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、メキシコリーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、メキシコリーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的リガンドとは異なる標的リガンドに結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、森林型熱帯リーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、森林型熱帯リーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、赤痢アメーバに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、赤痢アメーバに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、緑膿菌に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、緑膿菌に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、野生型ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、野生型ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、アミノ酸改変（付加、欠失、又は置換など）を、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のベータストランドのうちの１又は複数へと導入して、標的リガンドへの結合を改善するか、Ｌ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合させるか、又はＬ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する標的リガンドと異なる標的リガンドに結合させる（例えば、Diem等(2014)、Prot Engineer Des & Sel、27、419-429を参照されたい）。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＴＴＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＰ ＤＳＫＬＬＧＡＧＧＴ ＥＨＦＨＶＴＶＫＡＡ ＧＴＨＡＶＮＬＴＹＭ ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ ＥＲＦＴＶＹＬＫＡＮ（配列番号１）
に記載されているアミノ酸配列を有する、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有する、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ１は、配列番号１のアミノ酸１７−２０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ２は、配列番号１のアミノ酸２８−３４に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ３は、配列番号１のアミノ酸３９−５０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ４は、配列番号１のアミノ酸５９−６９に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ５は、配列番号１のアミノ酸７７−８０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ６は、配列番号１のアミノ酸９１−１００に対応する。
ある特定の実施態様では、例えば、標的リガンドへの結合を改善するか、Ｌ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合させるか、又はＬ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する標的リガンドと異なる標的リガンドに結合させるために、アミノ酸改変（付加、欠失、又は置換など）を、配列番号１のベータストランド１−８のうちの１又は複数へと導入する（例えば、Diem等(2014)、Prot Engineer Des & Sel、27、419-429を参照されたい）。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド１は、配列番号１のアミノ酸３−６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド２は、配列番号１のアミノ酸１３−１６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド３は、配列番号１のアミノ酸２１−２６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド４は、配列番号１のアミノ酸３４−３８に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド５は、配列番号１のアミノ酸５１−５８に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド６は、配列番号１のアミノ酸７０−７６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド７は、配列番号１のアミノ酸８１−９０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド８は、配列番号１のアミノ酸１０１−１０９に対応する。
ある特定の実施態様では、配列番号１のループ２（Ｌ２）は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、又は少なくとも１４アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ２は、アミノ酸配列Ｘ５−８−ＧＦ（配列番号１５１）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ２は、アミノ酸配列ＳＮＸ３−６−ＧＦ（配列番号１５２）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ４（Ｌ４）は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ４は、アミノ酸配列Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ（配列番号１５３）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ６（Ｌ６）は、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ６（Ｌ６）は、アミノ酸配列Ｘ３−１２（配列番号１５４）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ６（Ｌ６）は、アミノ酸配列Ｘ１０（配列番号１０６）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰ−Ｘ５−８−ＧＦ ＡＷＹＦＥＧＧＴＫＥ ＳＰＮＥＳＭＦＴＶＥ ＮＫＹＦＰ−Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ ＴＥＨＦＨＶＴＶＫＡ ＡＧＴＨＡＶＮＬＴＹ ＭＸ１０ＥＲＦＴＶＹＬＫ ＡＮ（配列番号２）
に記載されているアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標的リガンドに特異的に結合する。ある特定の実施態様では、標的リガンドは、タンパク質、核酸、多糖、リポ多糖、脂質、リン脂質である。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、細胞表面タンパク質、可溶型タンパク質、哺乳動物タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、眼性疾患に関連するタンパク質、がんに関連するタンパク質、炎症に関連するタンパク質、骨疾患に関連するタンパク質、神経変性疾患に関連するタンパク質、又は治療用タンパク質に結合する。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＬＲＰ６などの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦなどの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する。ある特定の実施態様では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａである。
本明細書の別の個所で記載される通り、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、遺伝子操作を介して作製することができる。したがって、本発明は、本明細書で記載される野生型シャガシン又は野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤のうちの何れか１個を遺伝子操作することにより得られる、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を提供する。代替的に、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書の別の個所で記載される通り、化学的ペプチド合成を介して作製することができる。したがって、ある特定の実施態様では、本発明は、例えば、固体相ペプチド合成、液体相ペプチド合成などの合成を介して得られる、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を提供する。
ある特定の実施態様では、本発明は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は他の何れかの形態など、ＲＮＡ形態の場合もあり、クローニングにより得られるか、又は合成により産生される、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの形態の場合もあり、これらの何れかの組合せの場合もある。ＤＮＡは、三本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、一本鎖の場合もあり、これらの何れかの組合せの場合もある。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つの鎖のうちの何れかの部分は、センス鎖としてもまた公知の、コード鎖の場合もあり、アンチセンス鎖ともまた称する、非コード鎖の場合もある。
本発明の単離された核酸分子は、シャガシン足場タンパク質又はその断片をコードする核酸分子を含み得るがこれらに限定されない。一部の実施態様では、単離された核酸は、転写されるが翻訳されない配列であって、転写、スプライシングを含むｍＲＮＡのプロセシング、及びポリアデニル化シグナル（例えば、リボソームの結合及びｍＲＮＡの安定性）において役割を果たす配列など、非コード５’配列及び非コード３’配列を含むがこれらに限定されない、さらなる非コード配列を含む。一部の実施態様では、単離された核酸は、さらなる機能性をもたらすアミノ酸など、さらなるアミノ酸をコードする、さらなるコード配列を含む。したがって、タンパク質足場をコードする配列を、融合させたシャガシン足場タンパク質の精製を容易とするペプチドをコードする配列などのマーカー配列、細胞への移入を容易とするペプチド（すなわち、細胞透過性ペプチド）、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の細胞からの分泌を容易とするペプチド、及び／又は天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の、例えば、小胞体、ゴルジ装置、エンドソームへの局在化を容易とするペプチドをコードする配列などへと融合させることができる。
ある特定の実施態様では、本明細書で提示される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸を、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の発現、及び天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の、細胞内の標的リガンドへの結合を可能とする条件下で、細胞内に一過性にトランスフェクトする。
ある特定の実施態様では、本明細書で記載される、単離された核酸を含む発現ベクターが提供される。ある特定の実施態様では、本明細書で記載される、単離された核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、宿主細胞を、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が結合する細胞内標的リガンドを同定するために、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を発現させる。
本明細書で提示される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、モノマー形態にある単一特異性タンパク質として使用することもでき、マルチマー形態にある二重特異性タンパク質又は多重特異性タンパク質（異なる標的リガンド又は同じ標的リガンド上の異なるエピトープに対する）として使用することもできる。結合は、共有結合の場合もあり、非共有結合の場合もある。ある特定の実施態様では、ダイマーで、二重特異性の、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、第１の標的リガンド又はエピトープに対する特異性を伴う１つのサブユニットと、第２の標的リガンド又はエピトープに対する特異性を伴う第２のサブユニットとを有する。天然に存在しないシャガシン足場タンパク質サブユニットは、標的リガンドへの結合の価数であり、したがって、標的リガンドへの結合のアビディティーを増大させ得る、様々なコンフォメーションで接合させることができる。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリー
本明細書では、複数の、本明細書で提示される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むポリペプチドディスプレイライブラリーがディスプレイされる。このようなポリペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、治療適用、予防適用、獣医科適用、診断適用、試薬適用、又は材料適用を含むがこれらに限定されない、多種多様な活用に所望の特性を伴う結合性タンパク質を選択し、且つ／又は進化させることができる。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリー内の、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書で記載される、天然に存在するシャガシン又はシャガシン様プロテアーゼ阻害剤の配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％のアミノ酸相同性を有する。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、欠失、置換、又は付加により、天然に存在するシャガシン又はシャガシン様プロテアーゼ阻害剤における対応するループ配列から、少なくとも１個のアミノ酸だけ変動する、ランダム化された、Ｌ２領域配列、Ｌ４領域配列、及び／又はＬ６ループ領域配列を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、野生型シャガシン又は野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、野生型シャガシン又は野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、クルーズトリパノソーマ（Ｄｍ２８ｃクローン）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（Ｄｍ２８ｃクローン）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、ブルセイトリパノソーマに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ブルセイトリパノソーマに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、メキシコリーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、メキシコリーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、森林型熱帯リーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、森林型熱帯リーシュマニアに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、赤痢アメーバに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、赤痢アメーバに由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、緑膿菌に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、緑膿菌に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、野生型ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、野生型ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、ヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する野生型シャガシン様阻害剤を参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。
ある特定の実施態様では、アミノ酸改変（付加、欠失、又は置換など）を、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のベータストランドのうちの１又は複数へと導入して、例えば、標的リガンドへの結合を改善するか、Ｌ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合させるか、又はＬ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する標的リガンドと異なる標的リガンドに結合させる（例えば、Diem等(2014)、Prot Engineer Des & Sel、27、419-429を参照されたい）。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、配列番号１：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＴＴＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＰ ＤＳＫＬＬＧＡＧＧＴ ＥＨＦＨＶＴＶＫＡＡ ＧＴＨＡＶＮＬＴＹＭ ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ ＥＲＦＴＶＹＬＫＡＮ（配列番号１）
に記載されているアミノ酸配列を有する、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）、及び／又はループ６（Ｌ６）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。
代替的に、又は加えて、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有する、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）に由来する野生型シャガシンを参照して、ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、及び／又はループ５（Ｌ５）の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個を超える（例えば、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個の）アミノ酸改変を含む。ある特定の実施態様では、アミノ酸改変を、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５へと導入して、例えば、二重特異性分子を創出するか、又はリンカーを付加する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作する。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３、及び／又はＬ５を、Ｌ２、Ｌ４、及び／又はＬ６が結合する標的とは異なる標的に結合するように操作する。
ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ１は、配列番号１のアミノ酸１７−２０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ２は、配列番号１のアミノ酸２８−３４に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ３は、配列番号１のアミノ酸３９−５０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ４は、配列番号１のアミノ酸５９−６９に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ５は、配列番号１のアミノ酸７７−８０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ６は、配列番号１のアミノ酸９１−１００に対応する。
ある特定の実施態様では、例えば、標的リガンドへの結合を改善するか、Ｌ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する、同じ標的リガンド上の異なるエピトープに結合させるか、又はＬ２、Ｌ４、及び／若しくはＬ６が結合する標的リガンドと異なる標的リガンドに結合させるために、アミノ酸改変（付加、欠失、又は置換など）を、配列番号１のベータストランド１−８のうちの１又は複数へと導入する（例えば、Diem等(2014)、Prot Engineer Des & Sel、27、419-429を参照されたい）。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド１は、配列番号１のアミノ酸３−６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド２は、配列番号１のアミノ酸１３−１６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド３は、配列番号１のアミノ酸２１−２６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド４は、配列番号１のアミノ酸３４−３８に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド５は、配列番号１のアミノ酸５１−５８に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド６は、配列番号１のアミノ酸７０−７６に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド７は、配列番号１のアミノ酸８１−９０に対応する。ある特定の実施態様では、配列番号１のベータストランド８は、配列番号１のアミノ酸１０１−１０９に対応する。
ある特定の実施態様では、配列番号１のループ２（Ｌ２）は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、又は少なくとも１４アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ２は、アミノ酸配列Ｘ５−８−ＧＦ（配列番号１５１）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ４（Ｌ４）は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様では、配列番号１のＬ４は、アミノ酸配列Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ（配列番号１５３）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ６（Ｌ６）は、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０アミノ酸の長さである。ある特定の実施態様では、配列番号１のループ６（Ｌ６）は、アミノ酸配列Ｘ１０（配列番号１０６）［配列中、Ｘは、何れかのアミノ酸を表す］を含む。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、各々が、配列番号２：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰ−Ｘ５−８−ＧＦ ＡＷＹＦＥＧＧＴＫＥ ＳＰＮＥＳＭＦＴＶＥ ＮＫＹＦＰ−Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ ＴＥＨＦＨＶＴＶＫＡ ＡＧＴＨＡＶＮＬＴＹ ＭＸ１０ＥＲＦＴＶＹＬＫ ＡＮ（配列番号２）
に記載されているアミノ酸配列を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。
一実施態様では、本明細書では、これらの値の間の何れかの範囲を含む、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、３０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、２５００個、５０００個、７５００個、１００００個、２５０００個、５００００個、７５０００個、１０００００個、２５００００個、５０００００個、７５００００個、１００００００個、２５０００００個、５００００００個、７５０００００個、１０００００００個、又は１０００００００個を超えるシャガシン足場タンパク質であって、固有のアミノ酸配列を伴うシャガシン足場タンパク質を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーがディスプレイされる。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場ライブラリーは、これらの値の間の何れかの範囲を含む、約２、約５、約１０、約５０、約１００、約２５０、約５００、約７５０、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、又は約１０１４を超える（約１０１５又は約１０１６など）配列多様性を有する。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーを、遺伝子操作を介して作製する。突然変異誘発及びその後のライブラリー構築のための様々な方法については、既に記載されている（スクリーニング又は選択のための適切な方法と共に）。このような突然変異誘発法は、例えば、エラープローンＰＣＲ、ループシャッフリング、若しくはオリゴヌクレオチド指定突然変異、ランダムヌクレオチド挿入又は組換えの前の他の方法を含むがこれらに限定されない。これらの方法に関するさらなる詳細については、例えば、Ａｂｏｕ−Ｎａｄｌｅｒ等（２０１０）、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ、１、３３７−３４０；Ｆｉｒｔｈ等（２００５）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１、３３１４−３３１５；Ｃｉｒｉｎｏ等（２００３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２３１、３−９；Ｐｉｒａｋｉｔｉｋｕｌｒ（２０１０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ、１９、２３３６−２３４６；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等（２００７）、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｃｈ、１８、１４７−１４９；その他において記載されている。したがって、ある特定の実施態様では、遺伝子操作法を介して作製された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーが提供される。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーを、インビトロにおける翻訳を介して作製する。略述すると、インビトロにおける翻訳は、タンパク質をコードする配列（複数可）を、プロモーターを含有するベクターへとクローニングすることと、クローニングされた配列（複数可）を、ＲＮＡポリメラーゼにより転写することを介して、ｍＲＮＡを産生することと、例えば、無細胞抽出物を使用する、このｍＲＮＡのインビトロにおける翻訳により、タンパク質を合成することとを伴う。所望の突然変異体タンパク質は、単にクローニングされたタンパク質コード配列を改変することにより作製することができる。多くのｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物中、又はウサギ網状赤血球溶解物中で効率的に翻訳され得る。インビトロにおける翻訳に関するさらなる詳細については、例えば、Ｈｏｐｅ等（１９８５）、Ｃｅｌｌ、４３、１７７−１８８；Ｈｏｐｅ等（１９８６）、Ｃｅｌｌ、４６、８８５−８９４；Ｈｏｐｅ等（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．６、２７８１−２７８４；Ｈｏｐｅ等（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３３、６３５−６４０；及びＭｅｌｔｏｎ等（１９８４）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２、７０５７−７０７０において記載されている。
したがって、本明細書で記載されるポリペプチドディスプレイライブラリーをコードする複数の核酸分子が提供される。本発明ではまた、複数の核酸分子に動作可能に連結された発現ベクターも提供される。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーを、化学合成を介して作製する。ある特定の実施態様では、シャガシンフレームワークへと化学的に合成されたＬ２ペプチド、Ｌ４ペプチド、及び／又はＬ６ペプチドを使用して、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーを作製する。当該技術分野では、固体相ペプチド合成及び液体相ペプチド合成の方法が周知であり、例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３５、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ及びＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９４；Ｗｅｌｓｃｈ等（２０１０）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、１４、１−１５；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、２８９、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７；「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ、及びＥ．Ｇｉｒａｌｔ編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９７；「Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００；「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」（Ｓ．Ｆ．Ｋａｔｅｓ、Ｆ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、２０００；Ｐ．Ｓｅｎｅｃｉ、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」（Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ編集主幹、Ａ．Ｆｅｌｉｘ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ、Ｃ．Ｔｍｉｏｌｏ編）、Ｔｈｉｅｍｅ、２００２；Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００５；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２９８、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｊ．Ｈｏｗｌ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００５；並びに「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｖｏｌｕｍｅ ３、「Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ、Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ａｎｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ａ．Ｂ．Ｈｕｇｈｓ編）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２０１１において記載されている。したがって、ある特定の実施態様では、化学合成法を介して作製された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーが提供される。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーは、ディスプレイライブラリーを含む。ある特定の実施態様では、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、ファージミドディスプレイライブラリー、ウイルスディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、λｇｔ１１ライブラリー、ＣＩＳディスプレイライブラリー、及びインビトロコンパートメント化ライブラリー、又はリボソームディスプレイライブラリーである。このようなディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングする方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｋ等（２０１１）、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１６、８５７−８８７；Ｂｏｄｅｒ等（１９９７）、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５、５５３−５５７；Ｓｃｏｔｔ等（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、３８６−３９０；Ｂｒｉｓｅｔｔｅ等（２００７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８３、２０３−２１３；Ｋｅｎｒｉｃｋ等（２０１０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ、２３、９−１７；Ｆｒｅｕｄｌ等（１９８６）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１８８、４９１−４９４；Ｇｅｔｚ等（２０１２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、５０３、７５−９７；Ｓｍｉｔｈ等（２０１４）、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ、１１、４８−５５；Ｈａｎｅｓ等（１９９７）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、４９３７−４９４２；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ等（２００４）、Ｊ Ｉｍｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９０、５１−６７；Ｕｌｌｍａｎ等（２０１１）、Ｂｒｉｅｆ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１０、１２５−１３４；Ｏｄｅｇｒｉｐ等（２００４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１、２８０６−２８１０；及びＭｉｌｌｅｒ等（２００６）、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３、５６１−５７０において記載されている。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーは、例えば、Ｓｚｏｓｔａｋ等、ＵＳ６２５８５５８、ＵＳ６２６１８０４、ＵＳ５６４３７６８、及びＵＳ５６５８７５４において記載されている技法により作製される、ＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリーを含む。ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質ライブラリーは、例えば、ＵＳ６４１６９５０において記載されている、ＤＮＡ−タンパク質ライブラリーを含む。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の定向進化
本明細書ではまた、標的リガンド（ポリペプチド、核酸、多糖、脂質、リン脂質、リポ多糖、低分子、又は、抗体が結合し得る、何れかの標的リガンドなど）に特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得る方法も提示される。ある特定の実施態様では、方法は、（ａ）標的リガンドを、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のライブラリー（本明細書で記載されるライブラリーなど）と、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を可能とする条件下で接触させることと、（ｂ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を検出することと、（ｃ）複合体から、標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得ることとを含む。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と標的リガンドとを含む複合体（すなわち、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体）が提供される。ある特定の実施態様では、標的リガンドに結合することが可能な、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供される。ある特定の実施態様では、方法は、（ｄ）標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の核酸配列を決定することをさらに含む。
ある特定の実施態様では、標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、親和性成熟にかける。このプロセスでは、特異的結合性タンパク質を、特異的な標的に対する親和性の増大について選択するスキームにかける（Wu等(1998)、Proc Natl Acad Sci USA.、95、6037-42を参照されたい）。ある特定の実施態様では、標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、ライブラリースクリーニングによる同定の後で、さらにランダム化する。例えば、ある特定の実施態様では、標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得る方法は、（ｅ）既に同定された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体から得られる、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＬ２、Ｌ４、及び／又はＬ６をランダム化して、さらにランダム化された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を作製することと、（ｆ）標的リガンドを、さらにランダム化された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と接触させることと、（ｇ）さらにランダム化された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を検出することと、（ｈ）複合体から、さらにランダム化された、標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得ることとをさらに含む。ある特定の実施態様では、方法は、（ｉ）標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の核酸配列を決定することをさらに含む。
ある特定の実施態様では、さらにランダム化された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、第１のライブラリー内ではいまだランダム化されていなかった、少なくとも１つ又は少なくとも２つの、ランダム化されたループを含む。標的リガンドに対する十分な親和性を有する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（複数可）を得るまで、複数回のラウンドにわたる、ランダム化、スクリーニング、及び選択を実施することができる。したがって、ある特定の実施態様では、標的リガンドに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を同定するために、工程（ｅ）−（ｈ）又は工程（ｅ）−（ｉ）を、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又は１０回を超えて繰り返す。
ある特定の実施態様では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０ラウンド、又は１０を超えるラウンドにわたる、ランダム化、スクリーニング、及び選択を経た、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標的リガンドに、少なくとも、１ラウンドのランダム化、スクリーニング、及び選択を経た、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の親和性と同程度に大きな親和性で結合する。ある特定の実施態様では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０ラウンド、又は１０を超えるラウンドにわたる、ランダム化、スクリーニング、及び選択を経た、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、標的リガンドに、１ラウンドのランダム化、スクリーニング、及び選択を経た、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の親和性より大きな親和性で結合する。
本明細書で提示される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のライブラリーは、新たな結合性タンパク質又は改善された結合性タンパク質であって、標的リガンドに特異的に結合する結合性タンパク質を進化させるための、当該技術分野で公知の何れかの技法によりスクリーニングすることができる。ある特定の実施態様では、標的リガンドを、固体支持体（カラム樹脂又はマイクロタイタープレートウェルなど）上に固定化し、標的リガンドを、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の候補のライブラリー（本明細書で記載される何れかのライブラリーなど）と接触させる。選択法は、例えば、ファージディスプレイ（Smith (1985)、Science、228、1315-1317）、ｍＲＮＡディスプレイ（Wilson等(2001)、Proc Natl Acad Sci USA、98: 3750-3755）、細菌ディスプレイ（Georgiou等(1997)、Nat Biotechnol、15:29-34）、酵母ディスプレイ（Boder及びWittrup(1997)、Nat. Biotechnol.、15:553-5577）、又はリボソームディスプレイ（Hanes及びPluckthun (1997)、Proc Natl Acad Sci U S A、94:4937-4942；並びに国際特許公開第２００８／０６８６３７号）であり得る。
ある特定の実施態様では、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。ある特定の実施態様では、本明細書で提示される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をディスプレイするファージ粒子が提供される。ある特定の実施態様では、本明細書で提示される、標的リガンドに結合することが可能な、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をディスプレイするファージ粒子が提供される。
ファージディスプレイとは、複数の、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質変異体を、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質との融合タンパク質としてディスプレイする技法である（Smith, G. P. (1985)、Science、228:1315-7；Scott, J. K.及びSmith, G. P.(1990)、Science、249: 386；Sergeeva, A.等(2006)、Adv. Drug Deliv. Rev.、58:1622-54）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムにクローニングされたｃＤＮＡ）の大規模なライブラリーにより、標的リガンドに高親和性で結合する配列を、迅速且つ効率的に分取し得るという事実にある。
ファージ上のペプチドライブラリー（Cwirla, S. E.等(1990)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6378）又はタンパク質ライブラリー（Lowman, H. B.等(1991)、Biochemistry、30:10832；Clackson, T.等(1991)、Nature、352:624；Marks, J.D.等(1991)、J. Mol. Biol.、222:581；Kang, A. S.等(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:8363）のディスプレイが、数百万個に及ぶポリペプチド又はオリゴペプチドを、特異的結合特性を伴うポリペプチド又はオリゴペプチドについてスクリーニングするために使用されている（Smith, G. P. (1991)、Current Opin. Biotechnol.、2:668；Wu等(1998)、Proc Natl Acad Sci USA.、95年5月、6037-42）。繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩとの融合を介して、小型のランダムペプチド及び小型のタンパク質をディスプレイするために、多価ファージディスプレイ法が使用されている（Wells及びLowman、Curr. Opin. Struct. Biol.、3:355-362 (1992)；並びにその中で引用されている参考文献）。一価のファージディスプレイでは、タンパク質ライブラリー又はペプチドライブラリーを、遺伝子ＩＩＩ又はその部分へと融合させ、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で、ファージ粒子が、融合タンパク質の１個のコピーをディスプレイするか、又は融合タンパク質のコピーをディスプレイしないように、低レベルで発現させる。分取が、固有のリガンド親和性に基づくように、アビディティー効果を、多価ファージと比べて低減し、ＤＮＡの取扱いを単純化するファージミドベクターを使用する（Lowman及びWells、「Methods: A companion to Methods in Enzymology」、3:205-0216 (1991)）。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のファージライブラリーの分取は、多数の変異体の構築及び繁殖、標的リガンドを使用する、親和性精製のための手順、並びに結合エンリッチメントの結果を査定する手段を伴う（例えば、ＵＳ５２２３４０９、ＵＳ５４０３４８４、ＵＳ５５７１６８９、及びＵＳ５６６３１４３を参照されたい）。
大半のファージディスプレイ法では、繊維状ファージ（Ｍ１３ファージなど）を使用する。また、ラムダファージディスプレイ系（国際特許公開第１９９５／３４６８３号、ＵＳ５６２７０２４を参照されたい）、Ｔ４ファージディスプレイ系（Ren等(1998)、Gene、215:439；Zhu等(1998)、Cancer Research、58:3209-3214；Jiang等(1997)、Infection & Immunity、65:4770-4777；Ren等(1997)、Gene、195:303-311；Ren(1996)、Protein Sci.、5:1833；Efimov等(1995)、Virus Genes、10:173）、及びＴ７ファージディスプレイ系（Smith及びScott(1993)、Methods in Enzymology、217:228-257；ＵＳ．５７６６９０５）も公知である。
基本的なファージディスプレイ概念の、他の多くの改善及び変更が展開されている。これらの改善は、選択された標的リガンドへの結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、これらのタンパク質を、所望の特性についてスクリーニングする潜在的可能性を伴って、機能的なタンパク質をディスプレイするディスプレイ系の能力を増強する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発されており（国際公開第１９９８／１４２７７号）、ファージディスプレイライブラリーが、二分子間相互作用（国際公開第１９９８／２０１６９号；国際公開第１９９８／２０１５９号）及びヘリックス状拘束ペプチドの特性（国際公開第１９９８／２００３６号）について解析し、これを制御するのに使用されている。国際公開第１９９７／３５１９６号は、親和性リガンドを単離する方法であって、ファージディスプレイライブラリーを、リガンドが標的リガンドに結合する１つの溶液、及び親和性リガンドが標的リガンドに結合しない第２の溶液と接触させて、結合性リガンドを選択的に単離する方法について記載している。国際公開第１９９７／４６２５１号は、ランダムファージディスプレイライブラリーを、親和性精製された抗体でバイオパニングし、次いで、結合性ファージを単離するのに続いて、マイクロプレートウェルを使用するマイクロパニングプロセスにかけて、高親和性結合性ファージを単離する方法について記載している。このような方法は、本明細書で開示される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質に適用することができる。また、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡの、親和性タグとしての使用についても報告されている（Li等(1998)、Mol Biotech.、9:187）。国際公開第１９９７／４７３１４号は、ファージディスプレイライブラリーであり得る、コンビナトリアルライブラリーを使用して、酵素特異性を識別する、基質サブトラクションライブラリーの使用について記載している。特異的結合性タンパク質を選択するさらなる方法については、ＵＳ５４９８５３８、ＵＳ５４３２０１８、及び国際公開第１９９８／１５８３３号において記載されている。ペプチドライブラリーを作製し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法はまた、ＵＳ５７２３２８６、ＵＳ５４３２０１８、ＵＳ５５８０７１７、ＵＳ５４２７９０８、ＵＳ５４９８５３０、ＵＳ５７７０４３４、ＵＳ５７３４０１８、ＵＳ５６９８４２６、ＵＳ５７６３１９２、及びＵＳ５７２３３２３においても開示されている。
ある特定の実施態様では、定向進化を介して産生される、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、疾患を引き起こす標的（標的タンパク質など）又は主要な治療用候補物質の同定及び／又は確証において使用することができる。例えば、目的の標的リガンドに結合するように操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、例えば、標的リガンドの生理的役割の特徴を明らかにするか、若しくは確認するか、又は、例えば、標的リガンドの疾患との関連及び治療可能性を、探索及び／若しくは確証し得るように、インビトロ（細胞培養物など）又はインビボ（動物モデルなど）における標的の発現を阻害することができる。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、ヒト標的リガンドへの結合についてスクリーニングする。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、マウス標的リガンドとの交差反応性についてスクリーニングする。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、インビトロにおける機能（例えば、リガンド／受容体の結合に対する阻害）に対する効果についてスクリーニングする。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の機能及び結合を、細胞ベースのアッセイにおいて探索する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合親和性を決定する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が結合する、標的リガンドのエピトープをマッピングする。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、体内の標的リガンドの分布を決定する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、標的リガンドの細胞内局在化を決定する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、疾患性組織内及び非疾患性組織内の標的リガンドの発現についてプロファイリングし、且つ／又は疾患性組織内の標的リガンドの発現を検証する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、前臨床有効性研究を実施する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、毒性研究を実施する。ある特定の実施態様では、操作された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、薬物動態的研究及び／又は薬力学的研究を実施する。標的の確証に関するさらなる詳細については、例えば、Carter等(2004)、Endocr Relat Cancer、11、659-687；van Beijnum等(2002)、Int J Cancer、101、118-127；Verheesen等(2006)、Biochim et Biophys Acta、1764、1307-1319；Shih(2012)、「Development of Antibody-Based Therapeutics」、Springer、p. 9-32；及びWise等(2002)、Drug Disc Today、235-246において記載されている。
ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ）関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質
ＬＤＬ受容体は、リポタンパク質及びタンパク質リガンドの受容体媒介性エンドサイトーシスに関与する膜貫通細胞表面タンパク質である。ヒトＬＤＬ受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）（寄託番号ＮＭ＿００２３３６（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿００２３２７（タンパク質）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ７５５８１）は、受容体として機能し、又はＦｒｉｚｚｌｅｄと共に、Ｗｎｔの共受容体として機能し、それによって、カノニカルＷｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達カスケードを伝達する（Katoh等(2007) Clin Cancer Res 13:4042-4045）。Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達カスケードとのその相互作用を介して、ＬＲＰ６は、細胞の分化、増殖及び遊走の調節、並びに多くのがん型の進行において、役割を果たす（Li等(2004) Oncogene 23:9129-9135; Tung等(2012) PLoS ONE 7(5): e36565. doi:10.1371/journal.pone.0036565; Liu等(2010) Proc Natl Acad Sci USA 107:5136-5141）。
Ｗｎｔシグナル伝達は、多くの生物学的経路に関与する。疾患に関して、これは、がん及び転移性疾患、骨粗鬆症並びに他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ及び他の炎症性疾患と関連する。ＬＲＰ６のブロックによるＷｎｔシグナル伝達のこの阻害は、広範な治療有用性を有し得る。骨喪失は、閉経後骨粗鬆症の間だけでなく、関節リウマチにおいても、重大な医学的問題である。骨は、多発性骨髄腫及び骨転移において分解される。したがって、骨の強化、骨折予防又は損傷した骨の回復を目的とした治療戦略には、非常に高い関心がよせられる（Kawai等(2011) Nat. Rev. Drug Discov. 10, 141-156; Mason及びWilliams (2010) J. Osteoporosis, vol. 2010, Article ID 460120, p9; doi:10.4061/2010/460120）。Ｗｎｔ経路阻害剤ＤＫＫ１及びＳＯＳＴは、新たな骨形成を抑制することにおけるそれらの役割に起因して、高度に有望な治療標的とみなされる；ＳＯＳＴの機能を中和する抗体は、顕著な前臨床活性を示し（Ominsky等(2010) J. Bone Miner. Res. 25, 948-959）、現在ヒト臨床治験中である（Padhi等(2011) J. Bone Miner. Res. 26, 19-26）。
誤調節されたＷｎｔシグナル伝達は、骨粗鬆症からがんまでの範囲の疾患に関与している（Clevers (2006) Cell 127:469-80; MacDonald等 2009. Dev Cell 17: 9-26; Nusse (2008) Cell Res 18:523-7; Polakis (2007) Curr Opin Genet Dev 17:45-51）。このリストは、代謝障害（Mani等(2007) Science 315:1278-82）及び神経変性（Caricasole等(2004) J Neurosci 24:6021-7; De Ferrari等(2007) Proc Natl Acad Sci USA 104: 9434-9）を含むように拡大している。特に明らかな結びつきは、β−カテニンレベルの有効な調節を防止するタンパク質大腸腺腫症（ＡＰＣ）の突然変異と結腸直腸がんとの間に存在する（Polakis (2007) Curr Opin Genet Dev 17:45-51）。ＬＲＰ５と骨ホメオスタシスとの間の強い遺伝的関連性もまた、特に注目される。ＬＲＰ５における機能喪失型突然変異は、低い骨質量、眼球欠損及び骨折の素因によって特徴が明らかにされる常染色体劣性障害、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）を引き起こす（Gong等(2001) Cell 107: 513-23）。
ヒトＬＲＰ６に特異的な本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、十分な親和性及び特異性で、ヒトＬＲＰ６に結合する。好ましくは、このような天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＬＲＰ６活性が関与する疾患又は状態を標的化する及びそれらに干渉することにおいて治療剤として使用され得る。ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、通常、他のＬＲＰタンパク質、例えば、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ３、ＬＲＰ４、ＬＲＰ５、ＬＲＰ８、ＬＲＰ１０、ＬＲＰ１１及びＬＲＰ１２には結合しない。
一部の実施態様では、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、本明細書で提供され、このヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む。ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する抗体もまた本明細書で提供され、このヒトＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む。
ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供され、この天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、結合に関して、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、このヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む。
上述の実施態様の何れかの（又はこれに適用される）ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質によって結合される、ヒトＬＲＰ６の同じエピトープに結合する。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＬＲＰ６への競合分子の結合を競合的に阻害する。ある特定の実施態様では、この競合分子は抗ＬＲＰ６抗体である。ある特定の実施態様では、この競合分子は、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質である。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＬＲＰ６への第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害し、この第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合し、ヒトＬＲＰ６への第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列Ｓ−Ｎ／Ｓ−Ｐ／Ｎ−Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ａ−Ｔ／Ｄ／Ｃ−ＧＦ（配列番号６）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｐ−Ｓ／Ｙ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｖ／Ｉ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−ＰＧＦＧＡＧＧ（配列番号１０）、ＰＳＮ−Ｓ／Ｙ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ−ＧＡＧＧ（配列番号９０）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｐ／Ｓ−Ｓ／Ｙ／Ｔ−Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｈ／Ｋ−Ｅ／Ｄ／Ｖ−Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｅ（配列番号１４）を含むＬ６とを含む。
標的上の重複する又は類似のエリアへの結合によって特徴が明らかにされる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、競合的阻害／結合アッセイによって同定され得る。このようなアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓ．Ｊ．Ｍａｔｈｅｒ（編）１９９６．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１６９−１７９、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｚｅｔｔｎｅｒ（１９７３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９、６９９−７０５；Ｇａｏ（２０１２）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４、３７１８−３７２３に記載されている。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的な天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書に開示されるヒトＬＲＰ６に特異的な天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の何れか１つの、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６を含む。ある特定の実施態様では、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が本明細書で提供され、これは、配列番号２を参照して、配列番号３−５、７８−８０及び１４６の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号７−９、７７及び８１−８３の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号１１−１３、８４−８６及び１４７の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ６とを含む。上記Ｌ２、Ｌ４及びＬ６のアミノ酸配列は、以下の表１に提供される：
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＱＴ（配列番号３）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＫＶＫＧＶＰＧＦ（配列番号７）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＴＧＡＳＱＥＰ（配列番号１１）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＫＩＫＧＩＰＧＦ（配列番号８）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＲＰＳＴＧＰＳＤＤＳ（配列番号１２）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＶＤ（配列番号５）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＰＲＶＫＧＡＹＬＶＭ（配列番号１３）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＹＮＮＩＲＧＬＰＧＦ（配列番号８１）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ（配列番号８４）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＳＣ（配列番号７９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号８２）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＳＰＹＹＧＰＴＫＶＥ（配列番号８５）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰＡＤ（配列番号８０）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＹＴＫＨ（配列番号８３）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＰＲＥＫＧＳＳＬＶＭ（配列番号８６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＡＤ（配列番号１４６）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＲＲＥＫＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４７）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１７に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号８７に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号８８に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号８９に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１４９に記載されているアミノ酸配列を含む。配列番号１５−１７、８７−８９及び１４９は以下に提供される。
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＱＴＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＳ ＮＫＶＫＧＶＰＧＦＧ ＡＧＧＴＥＨＦＨＶＴ ＶＫＡＡＧＴＨＡＶＮ ＬＴＹＭＧＰＷＴＧＡ ＳＱＥＰＥＲＦＴＶＹ ＬＫＡＮ（配列番号１５）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＴＴＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＳ ＮＫＩＫＧＩＰＧＦＧ ＡＧＧＴＥＨＦＨＶＴ ＶＫＡＡＧＴＨＡＶＮ ＬＴＹＭＲＰＳＴＧＰ ＳＤＤＳＥＲＦＴＶＹ ＬＫＡＮ（配列番号１６）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＶ ＤＧＦＡＷＹＦＥＧＧ ＴＫＥＳＰＮＥＳＭＦ ＴＶＥＮＫＹＦＰＳＮ ＳＴＫＲＧＡＧＧＴＥ ＨＦＨＶＴＶＫＡＡＧ ＴＨＡＶＮＬＴＹＭＰ ＲＶＫＧＡＹＬＶＭＥ ＲＦＴＶＹＬＫＡＮ（配列番号１７）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＴＴＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＹ ＮＮＩＲＧＬＰＧＦＧ ＡＧＧＴＥＨＦＨＶＴ ＶＫＡＡＧＴＨＡＶＮ ＬＴＹＭＲＰＷＴＧＰ ＳＨＤＳＥＲＦＴＶＹ ＬＫＡＮ（配列番号８７）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＳＣＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＤ ＳＮＥＩＷＹＣＧＡＧ ＧＴＥＨＦＨＶＴＶＫ ＡＡＧＴＨＡＶＮＬＴ ＹＭＳＰＹＹＧＰＴＫ ＶＥＥＲＦＴＶＹＬＫ ＡＮ（配列番号８８）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＰ ＡＤＧＦＡＷＹＦＥＧ ＧＴＫＥＳＰＮＥＳＭ ＦＴＶＥＮＫＹＦＰＳ ＮＹＴＫＨＧＡＧＧＴ ＥＨＦＨＶＴＶＫＡＡ ＧＴＨＡＶＮＬＴＹＭ ＰＲＥＫＧＳＳＬＶＭ ＥＲＦＴＶＹＬＫＡＮ（配列番号８９）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＡ ＤＧＦＡＷＹＦＥＧＧ ＴＫＥＳＰＮＥＳＭＦ ＴＶＥＮＫＹＦＰＳＮ ＳＴＫＲＧＡＧＧＴＥ ＨＦＨＶＴＶＫＡＡＧ ＴＨＡＶＮＬＴＹＭＲ ＲＥＫＧＳＴＬＶＶＥ ＲＦＴＶＹＬＫＡＮ（配列番号１４９）
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の何れか１つの変異体である。ある特定の実施態様では、このような変異体シャガシン足場タンパク質は、配列番号３、４、５、７、８、９、１１、１２及び／又は１３のうち１又は複数中に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０のアミノ酸置換を含む。ある特定の実施態様では、このアミノ酸置換（複数可）は、保存的アミノ酸置換（複数可）である。ある特定の実施態様では、これらのアミノ酸置換は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質がヒトＬＲＰ６に特異的に結合する能力を実質的に低減させない。例えば、ＬＲＰ６結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が行われ得る。ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する変異体シャガシン足場タンパク質の結合親和性は、以下の実施例に記載される方法を使用して評価され得る。
保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下に表２に示される。より実質的な変化は、「例示的置換」の見出しの下に表２に提供され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して、下にさらに記載される。アミノ酸置換は、変異体シャガシン足場タンパク質中に導入され得、産物は、所望の活性、例えば、保持／改善されたＬＲＰ６結合についてスクリーニングされ得る。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを、別のクラスに交換することを伴う。例示的置換変異体は、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便には生成され得る、ＬＲＰ６に特異的に結合する親和性成熟されたシャガシン足場タンパク質である。簡潔に述べると、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６中の１又は複数の残基が改変され（すなわち、付加、欠失又は置換され）、変異体シャガシン足場タンパク質がファージ上にディスプレイされ、ＬＲＰ６結合親和性についてスクリーニングされる。親和性成熟のある特定の実施態様では、多様性は、種々の方法（例えば、エラー−プローンＰＣＲ、ループシャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）の何れかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが創出される。次いで、このライブラリーは、ＬＲＰ６に対する所望の親和性を有する任意のシャガシン足場タンパク質変異体を同定するためにスクリーニングされる。ある特定の実施態様では、多様性を導入することは、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６中のいくつかの残基（例えば、一度に４−６残基）がランダム化される、ループ指向型の手法を含む。標的リガンドに結合することに関与するＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６の残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して、特異的に同定され得る。
ある特定の実施態様では、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＬＲＰタンパク質又はＬＲＰ６ホモログ、例えば、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ３、ＬＲＰ４、ＬＲＰ５、ＬＲＰ８、ＬＲＰ１０、ＬＲＰ１１及びＬＲＰ１２に対してそれが有する結合親和性よりも、ＬＲＰ６に対する強い結合親和性を有する。
通常、ヒトＬＲＰ６「に特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＬＲＰ６に対するその結合親和性よりも、少なくとも約５０分の１又は少なくとも約５００分の１又は少なくとも約１０００分の１弱い、別のＬＲＰタンパク質に対する結合親和性を有する。
ある特定の実施態様では、非標的リガンド（例えば、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ３、ＬＲＰ４、ＬＲＰ５、ＬＲＰ８、ＬＲＰ１０、ＬＲＰ１１及びＬＲＰ１２）への、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合の程度は、当該技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されるように、ヒトＬＲＰ６への天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合の約１０％未満である。特異的結合は、例えば、一般には結合活性を有さない類似の構造の分子であるコントロール分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と類似したコントロール分子、例えば過剰な非標識標的との競合によって、決定され得る。この場合、プローブへの標識された標的の結合が、過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が示される。本明細書で使用する場合、用語「特異的結合」又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」若しくは「に特異的」であるとは、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ又はそれ超の、標的に対するＫｄを有する分子によって示され得る。一実施態様では、用語「特異的結合」とは、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなしに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに分子が結合する場合の結合を指す。
ある特定の実施態様では、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、約１ｐＭから約５００ｎＭの間のＫｄで、ヒトＬＲＰ６に結合する。ある特定の実施態様では、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、約１ｐＭから約５０ｐＭの間、約５０ｐＭから約２５０ｐＭの間、約２５０ｐＭから約５００ｐＭの間、約５００ｐＭから７５０ｐＭの間、約７５０ｐＭから約１ｎＭの間、約１ｎＭから約２５ｎＭの間、約２５ｎＭから約５０ｎＭの間、５０ｎＭから約１００ｎＭの間、約１００ｎＭから約２５０ｎＭの間、又は約２５０ｎＭから約５００ｎＭの間のＫｄで、ヒトＬＲＰ６に結合する。
ある特定の実施態様では、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、例えば、以下の実施例に記載される方法を使用して決定されるように、Ｗｎｔ１シグナル伝達を阻害する。
ＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸分子、ＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクター、及びこれらの核酸分子を含む細胞もまた、企図される。このような細胞を培養することと、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を発現させることと、細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することとによる、ＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法もまた、本明細書で提供される。
ある特定の実施態様では、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書の他の場所に記載されるように、インビトロ翻訳を介して産生され得る。
本明細書の他の場所に記載されるように、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、例えば、化学合成されたＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６ペプチドをシャガシンフレームワーク上に移植することによって、化学ペプチド合成を介しても生成され得る。
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＡ）は、血管内皮細胞に対して高度に特異的なマイトジェンである。ＶＥＧＦの発現は、低酸素に応答して、活性化された癌遺伝子によって、及び種々のサイトカインによって、強化される。ＶＥＧＦは、内皮細胞増殖を誘導し、細胞遊走を促進し、アポトーシスを阻害する。インビボＶＥＧＦは、血管新生並びに血管の透過化を誘導し、脈管形成の調節において中心的な役割を果たす。ＶＥＧＦは、種々の受容体に結合し得る複数のアイソフォームを有する。例えば、ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）並びにニューロピリン（ＮＲＰ−１）に結合し得る（Ferarra等(2003) Nat Medicine 9, 669-676; Goel等 Nat Rev Cancer (2013) 12, 871-882）。
調節解除されたＶＥＧＦ発現は、腫瘍血管新生を促進することによって、固形腫瘍の進行に寄与し、異常な血管新生によって特徴が明らかにされるいくつかのさらなる疾患、例えば、例えば、糖尿病性失明、網膜症、主に糖尿病性網膜症又は加齢性黄斑変性、脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病（von Rippel-Lindau disease）、眼のヒストプラスマ症、網膜静脈閉塞（分岐網膜静脈閉塞（ＢＲＶＯ）及び中心網膜静脈閉塞（ＣＲＶＯ）の両方）、角膜新血管新生、網膜新血管新生及びルベオーシスが含まれるがこれらに限定されない、眼性新血管新生によって引き起こされる疾患；乾癬、乾癬性関節炎、血管芽細胞腫、例えば、血管腫；炎症性腎性疾患、例えば、糸球体腎炎、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症又は高血圧性腎硬化症の病因に寄与する。調節解除されたＶＥＧＦ発現によって特徴が明らかにされる他の疾患には、種々の炎症性疾患、例えば、関節炎、特に関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬（psorsasis）、サルコイドーシス、動脈の動脈硬化及び移植後に発生する疾患、子宮内膜症又は慢性喘息が含まれる。過剰な、不適切な又は制御されていない血管新生は、例えば、がん、特に血管形成された固形腫瘍及び転移性腫瘍（結腸、肺がん（特に小細胞肺がん）又は前立腺がんを含む）において、病状の悪化又は病状の原因に寄与する新たな血管増殖が存在する場合にも生じる。新たな血管は、罹患組織に供給し得、正常組織を破壊し得、がんの場合には、新たな血管は、腫瘍細胞が循環中に逃げ、他の臓器中に留まる（腫瘍転移）のを可能にし得る。結果として、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害は、広範な種々の腫瘍の進行を無効にする。
ヒトＶＥＧＦに特異的な本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、十分な親和性及び特異性で、ヒトＶＥＧＦに結合する。ある特定の実施態様では、このＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａである。好ましくは、このような天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患又は状態を標的化する及びそれらに干渉することにおいて治療剤として使用され得る。ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、通常、他のＶＥＧＦホモログ、例えば、ＶＥＧＦ−Ｂ若しくはＶＥＧＦ−Ｃ、又は他の増殖因子、例えば、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦ若しくはｂＦＧＦには結合しない。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質によって結合される、ヒトＶＥＧＦのエピトープに結合する。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質によって結合される、ヒトＶＥＧＦのエピトープに結合する。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦへの競合分子の結合を競合的に阻害する。ある特定の実施態様では、この競合分子は抗ＶＥＧＦ抗体である。ある特定の実施態様では、この競合分子は、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質である。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦへの第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害し、この第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、ヒトＶＥＧＦへの第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦへの第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害し、この第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む。
本明細書の他の場所で留意されるように、標的上の重複する又は類似のエリアへの結合によって特徴が明らかにされる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、競合的阻害／結合アッセイによって同定され得る。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的な天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書に開示されるヒトＶＥＧＦに特異的な天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の何れか１つの、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６を含む。したがって、ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、配列番号１８−２２及び４１−４８の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号２４−２８及び５０−５７の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号３０−３４及び５９−６６の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ６とを含む。
上記Ｌ２、Ｌ４及びＬ６のアミノ酸配列は、以下の表３に提供される：
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＬＲＳＭ（配列番号１８）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＡＧＰＳＡＶＰＬ（配列番号２４）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＲＧＰＡＮＶＩ（配列番号３０）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＮＤＰＧＳＲＬＳ（配列番号２５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号３１）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＬＱＮＡ（配列番号２０）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＬＳＬＹＡＳＥＴ（配列番号２６）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＮＰＮＷＧＰＤＹＷＩ（配列番号３２）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＬＱＤＳ（配列番号２１）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＧＴＴＧＫＳＮ（配列番号２７）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＦＫＳＲＧＬＭＶＰＬ（配列番号３３）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＲＤＳ（配列番号２２）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＶＲＡＧＱＡＮＥ（配列番号２８）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＳＰＶＬＧＰＲＦＷＬ（配列番号３４）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＤＤＰＧＳＧＬＷ（配列番号５０）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＹＬ（配列番号５９）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＥ（配列番号４２）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＮＧＰＧＬＧＶＹ（配列番号５１）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＱＧＰＳＲＥＬ（配列番号６０）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＮＶＮＧＳＨＡＷ（配列番号５２）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＦＬ（配列番号６１）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＣＤ（配列番号４４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＮＹＰＧＳＧＶＬ（配列番号５３）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＦＧＰＳＲＶＬ（配列番号６２）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＣＤ（配列番号４４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＮＹＰＧＳＧＶＬ（配列番号５３）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＦＧＰＳＲＶＬ（配列番号６２）を含むＬ６とを含む、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ホモダイマーを形成する。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＮＤ（配列番号４５）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＧＳＳＹＷＧ（配列番号５４）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＡＧＰＳＲＶＬ（配列番号６３）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＳＧＳＹＭＳＹＳ（配列番号５５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＤＬ（配列番号６４）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＦＲＥ（配列番号４７）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＶＱＷＧＷ（配列番号５６）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＡＰＷＶＧＰＳＲＥＬ（配列番号６５）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３６に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３７に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３８に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３９に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号４０に記載されているアミノ酸配列を含む。配列番号３６−４０の配列は、以下に提供される：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＬ ＲＳＭＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＡＧＰＳＡＶＰＬＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＲＧＰＡ ＮＶＩＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号３６）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＮＤＰＧＳＲＬＳＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＬＧＰＳ ＲＶＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号３７）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＬ ＱＮＡＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＬＳＬＹＡＳＥＴＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＮＰＮＷＧＰＤ ＹＷＩＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号３８）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＬ ＱＤＳＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＳＧＴＴＧＫＳＮＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＦＫＳＲＧＬＭ ＶＰＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号３９）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＲＤＳＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＶＲＡＧＱＡＮＥＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＳＰＶＬＧＰＲ ＦＷＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号４０）
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号６９に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７０に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７１に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７２に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７３に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７４に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７５に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７６に記載されているアミノ酸配列を含む。配列番号６９−７６の配列は、以下に提供される：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＤＤＰＧＳＧＬＷＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＳＧＰＳ ＲＹＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号６９）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＹＥＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＮＧＰＧＬＧＶＹＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＱＧＰＳ ＲＥＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号７０）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＹＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＮＶＮＧＳＨＡＷＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＳＧＰＳ ＲＦＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号７１）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＣＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＮＹＰＧＳＧＶＬＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＦＧＰＳ ＲＶＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号７２）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＮＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＧＳＳＹＷＧＧＡＧＧ ＴＥＨＦＨＶＴＶＫＡ ＡＧＴＨＡＶＮＬＴＹ ＭＡＰＷＡＧＰＳＲＶ ＬＥＲＦＴＶＹＬＫＡ Ｎ（配列番号７３）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＳＧＳＹＭＳＹＳＧＡ ＧＧＴＥＨＦＨＶＴＶ ＫＡＡＧＴＨＡＶＮＬ ＴＹＭＡＰＷＬＧＰＳ ＲＤＬＥＲＦＴＶＹＬ ＫＡＮ（配列番号７４）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＦＲＥＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＨＶＱＷＧＷＧＡＧＧ ＴＥＨＦＨＶＴＶＫＡ ＡＧＴＨＡＶＮＬＴＹ ＭＡＰＷＶＧＰＳＲＥ ＬＥＲＦＴＶＹＬＫＡ Ｎ（配列番号７５）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＹＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ ＧＡＧＧＴＥＨＦＨＶ ＴＶＫＡＡＧＴＨＡＶ ＮＬＴＹＭＧＰＷＬＧ ＰＳＲＶＬＥＲＦＴＶ ＹＬＫＡＮ（配列番号７６）
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦへの第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害し、この第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、ヒトＶＥＧＦへの第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦへの第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合を競合的に阻害し、この第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
本明細書の他の場所で留意されるように、標的上の重複する又は類似のエリアへの結合によって特徴が明らかにされる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、競合的阻害／結合アッセイによって同定され得る。
ある特定の実施態様では、このヒトＶＥＧＦに特異的な天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書に開示されるヒトＶＥＧＦに特異的な天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の何れか１つの、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６を含む。したがって、ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、配列番号４８及び１１０の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ２と、配列番号５７及び１１１−１１３の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含むＬ４と、配列番号６６に記載されているアミノ酸配列を含むＬ６とを含む。
上記Ｌ２、Ｌ４及びＬ６のアミノ酸配列は、以下の表４に提供される：
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹＫＤ（配列番号１１０）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＱＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１１）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＳＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１２）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＴＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１３）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１６に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１７に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１８に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号１１９に記載されているアミノ酸配列を含む。配列番号１１６−１１９の配列は、以下に提供される：
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＹＫＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ ＧＡＧＧＴＥＨＦＨＶ ＴＶＫＡＡＧＴＨＡＶ ＮＬＴＹＭＧＰＷＬＧ ＰＳＲＶＬＥＲＦＴＶ ＹＬＫＡＮ（配列番号１１６）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＹＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＨＹＱＮＬＧＧＲＹＴ ＧＡＧＧＴＥＨＦＨＶ ＴＶＫＡＡＧＴＨＡＶ ＮＬＴＹＭＧＰＷＬＧ ＰＳＲＶＬＥＲＦＴＶ ＹＬＫＡＮ（配列番号１１７）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＹＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＨＹＳＮＬＧＧＲＹＴ ＧＧＡＧＴＥＨＦＨＶ ＴＶＫＡＡＧＴＨＡＶ ＮＬＴＹＭＧＰＷＬＧ ＰＳＲＶＬＥＲＦＴＶ ＹＬＫＡＮ（配列番号１１８）
ＭＳＨＫＶＴＫＡＨＮ ＧＡＴＬＴＶＡＶＧＥ ＬＶＥＩＱＬＰＳＮＹ ＹＹＤＧＦＡＷＹＦＥ ＧＧＴＫＥＳＰＮＥＳ ＭＦＴＶＥＮＫＹＦＰ ＨＹＴＮＬＧＧＲＹＴ ＧＧＡＧＴＥＨＦＨＶ ＴＶＫＡＡＧＴＨＡＶ ＮＬＴＹＭＧＰＷＬＧ ＰＳＲＶＬＥＲＦＴＶ ＹＬＫＡＮ（配列番号１１９）
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の何れか１つの変異体である。ある特定の実施態様では、このような変異体シャガシン足場タンパク質は、配列番号３、４、５、７、８、９、１１、１２、１３、１９、２５、３１、４８、５７及び／又は６６のうち１又は複数中に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０のアミノ酸置換を含む。ある特定の実施態様では、このアミノ酸置換（複数可）は、保存的アミノ酸置換（複数可）である。ある特定の実施態様では、これらのアミノ酸置換は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質がヒトＶＥＧＦに特異的に結合する能力を実質的に低減させない。例えば、ＶＥＧＦ結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が行われ得る。ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する変異体シャガシン足場タンパク質の結合親和性は、以下の実施例に記載される方法を使用して評価され得る。
本明細書の他の場所で留意されるように、保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下に表２に示される。より実質的な変化は、「例示的置換」の見出しの下に表２に提供され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して、下にさらに記載される。アミノ酸置換は、変異体シャガシン足場タンパク質中に導入され得、産物は、所望の活性、例えば、保持／改善されたＶＥＧＦ結合についてスクリーニングされ得る。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを、別のクラスに交換することを伴う。例示的置換変異体は、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便には生成され得る、ＶＥＧＦに特異的に結合する親和性成熟されたシャガシン足場タンパク質である。簡潔に述べると、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６中の１又は複数の残基が改変され（すなわち、付加、欠失又は置換され）、変異体シャガシン足場タンパク質がファージ上にディスプレイされ、ＶＥＧＦ結合親和性についてスクリーニングされる。親和性成熟のある特定の実施態様では、多様性は、種々の方法（例えば、エラー−プローンＰＣＲ、ループシャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）の何れかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが創出される。次いで、このライブラリーは、ＶＥＧＦに対する所望の親和性を有する任意のシャガシン足場タンパク質変異体を同定するためにスクリーニングされる。ある特定の実施態様では、多様性を導入することは、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６中のいくつかの残基（例えば、一度に４−６残基）がランダム化される、ループ指向型の手法を含む。標的リガンドに結合することに関与するＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６の残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して、特異的に同定され得る。ある特定の実施態様では、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６中の１又は複数の残基が、ＶＥＧＦに特異的に結合する親和性成熟されたシャガシン足場タンパク質を生成することを目的として改変される、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号３７に記載されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施態様では、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６中の１又は複数の残基が、ＶＥＧＦに特異的に結合する親和性成熟されたシャガシン足場タンパク質を生成することを目的として改変される、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、配列番号７６に記載されているアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＶＥＧＦのホモログ、例えば、ＶＥＧＦ−Ｂ若しくはＶＥＧＦ−Ｃ、又は他の増殖因子、例えば、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦ若しくはｂＦＧＦに対してそれが有する結合親和性よりも、ＶＥＧＦに対する強い結合親和性を有する。通常、ヒトＶＥＧＦ「に特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、ＶＥＧＦに対するその結合親和性よりも、少なくとも約５０分の１又は少なくとも約５００分の１又は少なくとも約１０００分の１弱い、そのＶＥＧＦ又は他の増殖因子のホモログに対する結合親和性を有する。
ある特定の実施態様では、非標的リガンド（例えば、ＶＥＧＦ−Ｂ若しくはＶＥＧＦ−Ｃ、又は他の増殖因子、例えば、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦ若しくはｂＦＧＦ）への、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合の程度は、当該技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されるように、ヒトＶＥＧＦへの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の結合の約１０％未満である。特異的結合は、例えば、一般には結合活性を有さない類似の構造の分子であるコントロール分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と類似したコントロール分子、例えば過剰な非標識標的との競合によって、決定され得る。この場合、プローブへの標識された標的の結合が、過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が示される。本明細書で使用する場合、用語「特異的結合」又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」若しくは「に特異的」であるとは、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ又はそれ超の、標的に対するＫｄを有する分子によって示され得る。一実施態様では、用語「特異的結合」とは、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなしに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに分子が結合する場合の結合を指す。
ある特定の実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、約１ｐＭから約５００ｎＭの間のＫｄで、ヒトＶＥＧＦに結合する。ある特定の実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、約１ｐＭから約５０ｐＭの間、約５０ｐＭから約２５０ｐＭの間、約２５０ｐＭから約５００ｐＭの間、約５００ｐＭから７５０ｐＭの間、約７５０ｐＭから約１ｎＭの間、約１ｎＭから約２５ｎＭの間、約２５ｎＭから約５０ｎＭの間、５０ｎＭから約１００ｎＭの間、約１００ｎＭから約２５０ｎＭの間、又は約２５０ｎＭから約５００ｎＭの間のＫｄで、ヒトＶＥＧＦに結合する。
ＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸分子、ＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクター、及びこれらの核酸分子を含む細胞もまた、企図される。このような細胞を培養することと、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を発現させることと、細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することとによる、ＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法もまた、本明細書で提供される。
ある特定の実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、本明細書の他の場所に記載されるように、インビトロ翻訳を介して産生され得る。
本明細書の他の場所に記載されるように、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、例えば、化学合成されたＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６ペプチドをシャガシンフレームワーク上に移植することによって、化学ペプチド合成を介しても生成され得る。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むキメラ分子
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）は、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合された（例えば、組換え融合された）シャガシン足場タンパク質を含むキメラ分子を形成するための方法において有利な場合には、修飾もまたされ得る。ある特定の実施態様では、このようなキメラ分子は、例えば、二価分子又は二重特異性分子を形成するための抗体と、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質との融合物を含む。ある特定の実施態様では、このようなキメラ分子は、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（Schwarze等, 1999, Science 285:1569-72）を使用した、種々の組織への、より特には脳血液関門を横切った送達のためにポリペプチドを標的化するタンパク質形質導入ドメインと、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質との融合物を含む。
ある特定の実施態様では、キメラ分子は、サイトゾル、核又は他の細胞区画中への天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の送達を促進するための細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質との融合物を含む。ＣＰＰ（タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、膜転位（membrane translocating）配列（ＭＴＳ）又はＴｒｏｊａｎペプチドとも呼ばれる）は、比較的非毒性の様式で細胞の原形質膜を横切って、他の方法では不浸透性な種々の高分子を運搬する能力を有するペプチドのクラスである。ＣＰＰペプチドは、典型的には、カチオン性、両親媒性又は疎水性の性質を有する、５から約３０アミノ酸（ａａ）長の間である。本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質に融合され得る細胞透過性ペプチドの著しい例には、例えば、ＨＩＶ−１由来のＴａｔ、ペネトラチン及びトランスポータンが含まれる（Fawell, S.等 Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, pp 664-668; Theodore, L.等 J. Neurosci. 1995, pp 7158-7167; Pooga, M.等 FASEB J. 1998, pp 67-77）。ＣＰＰの他の例には、例えば、アンテナペディア、ポリ−カチオン性ペプチドなど、又は例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２、１−６、２０１１に記載されるような、このようなペプチドの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施態様では、ＣＰＰは、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＮ末端に組換え融合される。ある特定の実施態様では、ＣＰＰは、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＣ末端に組換え融合される。
ある特定の実施態様では、キメラ分子は、例えば、小胞体、ゴルジ体、エンドソームなどへの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の局在化を促進するためのシグナル配列と、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質との融合物を含む。ある特定の実施態様では、キメラ分子は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の分泌を促進するためのシグナル配列と、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質との融合物を含む。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、多量体形態で、（異なる標的リガンド又は同じ標的リガンド上の異なるエピトープに対して）二重又は多重特異性として使用され得る。例えば、ダイマーの二重特異性の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、第１の標的リガンド又はエピトープに対する特異性を有する１つのサブユニット及び第２の標的リガンド又はエピトープに対する特異性を有する第２のサブユニットを有する。天然に存在しないシャガシン足場タンパク質サブユニットは、結合価を増加させ得、したがって、標的リガンドへの結合の結合力を増加させ得る種々のコンフォメーションで、連結され得る。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供されるキメラ分子は、２以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０を超える）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む。ある特定の実施態様では、核酸は、単一の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の２以上のコピーをコードするように操作され得、これらのコピーは、同一の足場サブユニットの共有結合的に連結された多量体を産生するために、タンデムで転写及び翻訳される。ある特定の実施態様では、この核酸は、２以上の異なる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードするように操作され得、これらのコピーは、例えば、単一の標的リガンドの異なるエピトープ、又は例えば、異なる標的リガンドに結合する異なる足場サブユニットの共有結合的に連結された多量体を産生するために、タンデムで転写及び翻訳される。別の実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドと、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）との融合物を含む。このエピトープタグは、シャガシン足場タンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に一般に配置される。天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のこのようなエピトープ−タグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供は、エピトープタグに結合する抗タグ抗体又は別の型のアフィニティーマトリックスを使用するアフィニティー精製によって、シャガシン足場タンパク質が容易に精製されるのを可能にする。種々のタグポリペプチド及びそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野で公知である。例には、ポリ−ヒスチジン（ポリ−Ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Field等(1988) Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165）；ｃ−ｍｙｃタグ並びにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evan等(1985) Mol. Cell. Biol. 5, 3610-3616］；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Paborsky等(1990) Protein Eng., 3, 547-553）が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド（Hopp等(1988) BioTechnology, 6,1204-1210）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin等(1992) Science, 255, 192-194］；α−チューブリンエピトープペプチド（Skinner等(1991) J. Biol. Chem. 266, 15163-15166）；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Lutz-Freyermuth等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397］が含まれる。
ある特定の実施態様では、このキメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）の融合物を含み得る。二価形態のキメラ分子（例えば、「イムノアドヘシン」）について、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域へであり得る。本明細書で提供されるＩｇ融合物には、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ヒトのおよそ残基９４−２４３、残基３３−５３若しくは残基３３−５２又はこれらの残基のみを含むポリペプチドが含まれる。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合物の産生については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許５４２８１３０号もまた参照のこと。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）は、ＩｇＧの定常領域（Ｆｃ）に、例えば、Ｎ末端又はＣ末端において融合される。ある特定の実施態様では、シャガシン足場タンパク質／Ｆｃ融合分子は、免疫応答の補体成分を活性化する。ある特定の実施態様では、シャガシン足場タンパク質／Ｆｃ融合タンパク質は、シャガシン足場タンパク質の治療的価値を増加させる。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）は、補体タンパク質、例えばＣｌｑに、例えば、Ｎ末端又はＣ末端において融合（例えば、組換え融合）される。ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを分子中に導入すること（国際公開第１９９７／４３３１６号、米国特許５８６９０４６号、米国特許５７４７０３５号、国際公開第１９９６／３２４７８号、国際公開第１９９１／１４４３８号）、又は天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、そのＦｃＲｎ結合親和性が保存されるが、他のＦｃ受容体に対する親和性は大いに低減されている抗体と融合させ（国際公開第１９９９／４３７１３号）若しくは抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合させること（国際公開第２０００／０９５６０号、米国特許４７０３０３９号）の何れかによってその半減期が修飾された、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得るための方法を、種々の刊行物が記載している。生理学的に活性な分子（例えば、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質）の半減期を増加させる特定の技術及び方法もまた、米国特許７０８３７８４号において見出され得る。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）は、アミノ酸残基突然変異（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによって番号付けされる）：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ又はＨ４３３ＫＪＮ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈを含むＩｇＧ由来のＦｃ領域に融合される。
ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するもの及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの）は、インビボ又は血清半減期を増加又は延長する分子と融合される。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質）は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、免疫グロブリン分子（ＩｇＧ）、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質又は血流中でのその半減期及び／若しくはその組織透過を増加させる他の因子と、融合される。
シャガシン足場タンパク質を含むさらなるキメラ分子は、遺伝子−シャッフリング、モチーフ−シャッフリング、エクソン−シャッフリング及び／又はコドン−シャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術を介して生成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、本明細書で提供される足場（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する足場）の活性を改変するために使用され得る。一般には、米国特許５６０５７９３号、米国特許５８１１２３８号、米国特許５８３０７２１号、米国特許５８３４２５２号、米国特許５８３７４５８号、Ｐａｔｔｅｎ等（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８、７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ等（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７、２６５−７６；並びにＬｏｒｅｎｚｏ及びＢｌａｓｃｏ、（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４、３０８−３１３を参照のこと。
ある特定の実施態様では、本明細書に包含される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、組換え前に、エラー−プローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム突然変異誘発に供されることによって改変される。特異的標的に結合する足場をコードするポリヌクレオチドの１又は複数の部分は、１又は複数の異種分子の１又は複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組換えられ得る。
これらの融合物のうち何れかは、例えば、公に入手可能な遺伝子配列を使用して構築された組換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現によって、標準的な技術によって生成され得る。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むコンジュゲート
細胞傷害性剤、例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートしている本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）を含むイムノコンジュゲートもまた、本明細書で提供される。
使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン及びトリコテセン（tricothecene）が含まれる。他の毒素には、メイタンシン及びメイタンシノイド、カリケアマイシン並びに他の細胞傷害性剤が含まれる。種々の放射性核種が、放射性コンジュゲート化シャガシン足場タンパク質の産生のために利用可能である。例には、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）と、例えば細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質−カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアネート（tolyene 2,6-diisocyanate））、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシンイムノトキシンが、Ｖｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。
別の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）は、腫瘍の事前標的化における利用のために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートされ得、この天然に存在しないシャガシン足場タンパク質−受容体コンジュゲートは、患者に投与され、その後、洗浄剤を使用して循環から未結合のコンジュゲートが除去され、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性核種）にコンジュゲートしている「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、多量体形態で、（異なる標的リガンド又は同じ標的リガンド上の異なるエピトープに対して）二重又は多重特異性として使用され得る。結合は、共有結合又は非共有結合であり得る。例えば、ダイマーの二重特異性の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、第１の標的リガンド又はエピトープに対する特異性を有する１つのサブユニット及び第２の標的リガンド又はエピトープに対する特異性を有する第２のサブユニットを有する。天然に存在しないシャガシン足場タンパク質サブユニットは、結合価を増加させ得、したがって、標的リガンドへの結合の結合力を増加させ得る種々のコンフォメーションで、又は複数の標的リガンドに結合するように、例えばコンジュゲーションを介して、連結され得る。例えば、アミノ酸改変（例えば、付加、欠失及び／又は置換）が、例えば、二重特異性分子を創出するため又はリンカーを付加するために、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＬ１、Ｌ３及び／又はＬ５中に導入され得る。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３及び／又はＬ５は、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６によって結合される同じ標的上の異なるエピトープに結合するように操作される。ある特定の実施態様では、Ｌ１、Ｌ３及び／又はＬ５は、Ｌ２、Ｌ４及び／又はＬ６によって結合される標的リガンドとは異なる標的リガンドに結合するように操作される。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、コンジュゲーションのための反応性基を提供するように操作される。ある特定の実施態様では、Ｎ末端及び／又はＣ末端もまた、コンジュゲーションのための反応性基を提供するように機能し得る。ある特定の実施態様では、Ｎ末端は、１つの部分（例えばＰＥＧであるがこれに限定されない）にコンジュゲートしており、Ｃ末端は別の部分（例えばビオチンであるがこれに限定されない）にコンジュゲートしており、又は逆もまた然りである。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子及び有機分子が含まれるがこれらに限定されない１又は複数の部分にコンジュゲートしている本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）の使用が、本明細書で提供される。異種タンパク質又はポリペプチド（又は少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０若しくは少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドまでの、それらの断片）に化学コンジュゲートしている（共有結合及び非共有結合の両方のコンジュゲーションを含む）本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）の使用もまた、本明細書で提供される。この融合は、直接的である必要は必ずしもないが、本明細書に記載のリンカー配列を介して生じ得る。
ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）、又はそのアナログ若しくは誘導体は、診断剤又は検出可能な薬剤にコンジュゲートされ得る。このようなシャガシン足場タンパク質は、例えば、特定の治療の有効性を決定する臨床試験手順の一部として、疾患の進行（development）又は進行（progression）をモニタリング又は予後判定するために有用であり得る。このような診断及び検出は、種々の酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼであるがこれらに限定されない；補欠分子族、例えば、ストレプトアビジンビオチン（streptavidinlbiotin）及びアビジン／ビオチンであるがこれらに限定されない；蛍光性材料、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocynate）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンであるがこれらに限定されない；発光材料、例えば、ルミノールであるがこれに限定されない；生物発光材料、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンであるがこれらに限定されない；放射性材料、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、）及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｎであるがこれらに限定されない；種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオン、及び放射標識された又は特異的放射性同位体にコンジュゲートされた分子、が含まれるがこれらに限定されない検出可能な物質に足場をカップリングさせることによって達成され得る。
さらに、治療部分にコンジュゲートしている本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）の使用が、本明細書で提供される。ある特定の実施態様では、シャガシン足場タンパク質は、治療部分、例えば、細胞毒、例えば、細胞増殖停止性若しくは細胞破壊的剤、治療剤又は放射性金属イオン、例えば、アルファ−放射体にコンジュゲートされ得る。細胞毒又は細胞傷害性剤には、細胞にとって有害な任意の薬剤が含まれる。
ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）は、治療部分、例えば、放射性金属イオン、例えば、アルファ−放射体、例えば、２１３Ｂｉ、又は１３１Ｉｎ、１３１Ｌｕ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍが含まれるがこれらに限定されない放射性金属イオンをポリペプチドにコンジュゲートするために有用な大環状キレート剤にコンジュゲートしている。ある特定の実施態様では、この大環状キレート剤は、リンカー分子を介してシャガシン足場タンパク質に結合され得る１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は、当該技術分野で一般に公知であり、例えば、Ｄｅｎａｒｄｏ等（１９９８）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４、２４８３−９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０、５５３−５５７；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ等（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６、９４３−５０に記載されている。
治療部分を抗体にコンジュゲートするための技術は、周知であり、本明細書に開示される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質に適用され得る、例えば、Ａｍｏｎ等、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ等（編）、ｐｐ．２４３−５６．（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等（編）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ等（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏ ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ等（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）及びＴｈｏｒｐｅ等、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８を参照のこと。類似の手法は、本発明のシャガシン足場タンパク質との使用のために適応され得る。
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）にコンジュゲートしている治療部分又は薬物は、対象における特定の障害に対して所望の予防的又は治療的効果（複数可）を達成するために選択されるべきである。臨床医又は他の医療関係者は、どの治療部分又は薬物を足場にコンジュゲートするかについて決定する際に、以下を考慮すべきである：疾患の性質、疾患の重症度、及び対象の状態。
ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）はまた、標的リガンドのイムノアッセイ又は精製のために特に有用な固体支持体に結合され得る。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが含まれるがこれらに限定されない。
共有結合修飾
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン足場タンパク質）の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の１つの型は、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の標的化されたアミノ酸残基を、シャガシン足場タンパク質の選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性薬剤による誘導体化は、例えば、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、標的リガンドを精製するための方法における使用のための非水溶性支持体マトリックス又は表面に架橋するために有用であり、逆もまた然りである。一般に使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオナート）を含むホモ二官能性イミドエステル、二官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が含まれる。
他の修飾には、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
シャガシン足場タンパク質の別の型の共有結合修飾は、米国特許４６４０８３５号、米国特許４４９６６８９号、米国特許４３０１１４４号、米国特許４６７０４１７号、米国特許４７９１１９２号又は米国特許４１７９３３７号に表記されている様式で、シャガシン足場タンパク質を、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンのうちの１つに連結することを含む。
用語「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、カップリング剤、カップリング又は活性化部分（例えば、チオール、トリフラート、トレシレート（tresylate）、アジリジン（azirdine）、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はマレイミド部分を有する）を有する又は有さない、ポリエチレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。用語「ＰＥＧ」は、そのアナログを含む、５００Ｄａから１５０，０００Ｄａの間の分子量のポリエチレングリコールを示す目的であり、このとき、例えば、末端ＯＲ−基は、メトキシ基によって置き換えられている（ｍＰＥＧと呼ばれる）。
ある特定の実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するもの及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化される。ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド反復単位の直線状の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトンから約４０，０００ダルトンまでの範囲の、それらの分子量によって分類される。本発明で好ましい実施態様では、使用されるＰＥＧは、５，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンまでの範囲の分子量を有する。本明細書で提供される足場にカップリングされるＰＥＧは、分岐鎖又は非分岐鎖の何れかであり得る（例えば、Monfardini, C.等 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69）。ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及び他の会社から市販されている。このようなＰＥＧには、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が含まれるがこれらに限定されない。
ある特定の実施態様では、使用される親水性ポリマー、例えばＰＥＧは、非反応性基例えば、メトキシ又はエトキシ基によって、一方の末端でキャップされる。その後、このポリマーは、適切な活性化剤、例えば、シアヌル酸ハライド（例えば、シアヌル酸クロリド、ブロミド又はフルオリド）、ジイミダゾール（diimadozle）、無水物試薬（例えば、無水ジハロコハク酸、例えば、無水ジブロモコハク酸）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンジルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などとの反応によって、他方の末端において活性化される。次いで、活性化されたポリマーは、ポリマーで誘導体化されたシャガシン足場タンパク質を産生するために、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合するもの及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの）と反応させられる。あるいは、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質中の官能基は、ポリマーとの反応のために活性化され得、又は２つの基が、公知のカップリング方法を使用して、調和したカップリング反応で連結され得る。本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、当業者に公知であり当業者によって使用される無数の他の反応スキームを使用して、ＰＥＧで誘導体化され得ることが、容易に理解される。
免疫リポソーム
また、本明細書で開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合するもの、又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの等）もまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。本明細書に記述の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；並びに米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号に記載のもの等、当該技術分野で公知の方法により調製される。循環時間を延長したリポソームが、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物との逆相蒸発法により生成することができる。リポソームを、細孔径が規定されているフィルタで押し出して、所望の直径を有するリポソームを産出する。また、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、又は化学療法剤（ドキソルビシン等）が、リポソーム内に任意選択的に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ等、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照されたい。
治療法
ＬＲＰ６に関連する疾患及び障害
ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び／又はこのようなシャガシン足場タンパク質を含む本明細書で提供されている組成物は、例えば、本明細書の他所に記載されているような、がん及び転移性疾患、骨粗鬆症、並びに他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ、並びに他の炎症性疾患を含む、異常なＬＲＰ６活性を伴う疾患及び障害を治療するために、対象（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与することができる。ある実施態様では、対象のがん及び転移性疾患、骨粗鬆症、並びに他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ、並びに他の炎症性疾患を治療するために使用される医薬の製造に使用するための、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供される。ある実施態様では、対象のがん及び転移性疾患、骨粗鬆症、並びに他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ、並びに他の炎症性疾患の治療に使用するための、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供される。ある実施態様では、治療される対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等）である。ある実施態様では、対象は、ヒトである。ある実施態様では、対象は、臨床患者、臨床治験ボランティア、実験動物等である。ある実施態様では、対象は、がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、若しくは他の炎症性疾患を有する疑いがあるか若しくはリスクがあるか、又はがん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、若しくは他の炎症性疾患、異常なＬＲＰ６発現若しくは活性を有する任意の他の疾患であると診断されている。
ＶＥＧＦに関連する疾患及び障害
ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はこのようなシャガシン足場タンパク質を含む本明細書で提供されている組成物は、例えば、異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性を伴う疾患及び障害を含む、異常なＶＥＧＦ活性を伴う疾患及び障害を治療するために、対象（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与することができる。以下のもの等の、疾患状態又は疾患状態の原因の悪化に寄与する新たな血管増殖が存在する場合、過剰であるか、不適切であるか、又は制御されない血管新生が生じる：がん、特に血管新生化固形腫瘍及び転移性腫瘍（結腸、肺がん（特に、小細胞肺がん）又は前立腺がんを含む）、眼性新血管新生により引き起こされる疾患、特に、糖尿病性失明、網膜症、主に糖尿病性網膜症、又は加齢性黄斑変性、脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォンヒッペルリンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜静脈閉塞（分岐網膜静脈閉塞（ＢＲＶＯ）及び網膜中心静脈閉塞（ＣＲＶＯ）の両方）、角膜新血管新生、網膜新血管新生、及びルベオーシス；乾癬、乾癬性関節炎、血管腫等の血管芽細胞腫；糸球体腎炎等の炎症性腎疾患、特に、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症、又は高血圧性腎硬化症；関節炎等の種々の炎症性疾患、特に、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、動脈の動脈硬化、移植後に生じる疾患、子宮内膜症、又は慢性喘息。新しい血管は、疾患組織に栄養を供給し、正常組織を破壊する場合があり、がんの場合には、新しい血管は、腫瘍細胞が、循環へと漏出し、他の器官に定着することを可能にする場合がある（腫瘍転移）。望ましくない血管透過性は、例えば、脳腫瘍に関連する浮腫、悪性疾患に関連する腹水症、メイグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、心筋梗塞及び脳卒中等後の状態等の心血管疾患に関連する透過性に関連する。
ある実施態様では、対象の異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性によって特徴が明らかにされる疾患又は障害を治療するための医薬の製造に使用するための、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供される。ある実施態様では、対象の異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性によって特徴が明らかにされる疾患又は障害の治療に使用するための、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が提供される。ある実施態様では、治療される対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等）である。ある実施態様では、対象は、ヒトである。ある実施態様では、対象は、臨床患者、臨床治験ボランティア、実験動物等である。ある実施態様では、対象は、異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性に関連する疾患又は障害（本明細書に記載のもの等）を有する疑いがあるか又はリスクがあるか、あるいは異常な血管新生及び／若しくは異常な血管透過性に関連する疾患若しくは障害（本明細書に記載のもの等）、又は異常なＶＥＧＦ発現若しくは活性を有する任意の他の疾患を有すると診断されている。
投与及び用量
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）、又はこのようなシャガシン足場タンパク質を含む組成物の投与は、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下を含む、任意の好適な経路によるものであってもよい。ある実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）、及び／又は本明細書で提供されている組成物は、例えば、異常なＬＲＰ６活性又は異常なＶＥＧＦ活性を伴う疾患又は障害を治療するために、第２、第３、又は第４の作用剤（例えば、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、細胞障害性剤、又は化学療法剤を含む）と組み合わせて投与される。異常なＬＲＰ６活性を伴う疾患の場合、このような作用剤としては、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１００５６２号及び米国特許出願公開第２０１１／０２５６１２７号に記載されているものが挙げられる。ある実施態様では、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場は、更なる作用剤とコンジュゲートされていてもよい。異常なＶＥＧＦ活性を伴う疾患の場合、このような作用剤としては、例えば、化学療法剤又は他の抗血管新生分子が挙げられる。ある実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場は、更なる作用剤とコンジュゲートされていてもよい。
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）、及び／又は本明細書で提供されている組成物は、限定ではないが、以下の経路を含む任意の経路で個体に投与することができる：静脈内（例えば、点滴ポンプにより）、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所、吸入（例えば、噴霧ミスト等）、粘膜（鼻腔粘膜による等）、皮下、経皮、胃腸、関節内、嚢内、脳室内、直腸（つまり、坐薬により）、膣（つまり、ペッサリーにより）、頭蓋内、尿道内、肝臓内、及び腫瘍内。幾つかの実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）は、全身的に投与される（例えば、静脈内注射により）。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されているシャガシン足場タンパク質又は組成物は、局所的に投与される（例えば、動脈内注射又は眼内注射により）。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）、及び／又は本明細書に記載の組成物は、眼又は眼組織に直接投与される。幾つかの実施態様では、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）、及び／又は本明細書に記載の組成物は、例えば点眼剤で、眼に局所投与される。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されているシャガシン足場タンパク質は、注射により、眼に（眼内注射）又は眼に関連する組織に投与される。本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）、及び／又は本明細書に記載の組成物は、例えば、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、結膜下注射、テノン下注射、球後注射、眼球周囲注射、又は後強膜近傍送達により投与することができる。こうした方法は、当該技術分野で公知である。例えば、網膜薬物送達用の例示的な眼周囲経路の説明は、Ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｒａｇｈａｖａ等（２００４）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．１（１）：９９−１１４を参照されたい。本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）及び／又は本明細書に記載の組成物は、例えば、硝子体、眼房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間の領域、網膜脈絡膜組織、網膜黄斑、又は個体の眼の又は近傍の他の領域に投与することができる。また、組成物は、移植片として個体に投与することができる。好ましい移植片は、ある期間にわたって化合物を徐々に放出する生体適合性及び／又は生分解性の持続放出製剤である。薬物送達用の眼移植片は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５５０１８５６号、第５４７６５１１号、及び第６３３１３１３号を参照されたい。また、組成物は、これらに限定されないが、米国特許第４４５４１５１号及び米国特許出願公開第２００３／０１８１５３１号、及び米国特許出願公開第２００４／００５８３１３号に記載のイオン泳動法を含むイオン泳動法を使用して、個体に投与することができる。
治療しようとする適応症、及びその分野の医師であれば詳しく知っている用量に関連する要因に応じて、本明細書に提供される、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）は、毒性及び副作用を最小限に抑えつつ、その適応症の治療に効果的な用量で投与されるだろう。典型的な用量は、例えば、０．００１から１０００μｇの範囲であってもよいが、この例示的な範囲未満の用量又はこの例示的な範囲を超える用量は、本発明の範囲内にある。１日用量は、全体重１Ｋｇ当たり約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、又は前述の値の任意の２つにより規定される範囲）、好ましくは、全体重１Ｋｇ当たり約０．３μｇ／Ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで（例えば、約０．５μｇ／Ｋｇ、約１μｇ／Ｋｇ、約５０μｇ／Ｋｇ、約１５０μｇ／Ｋｇ、約３００μｇ／Ｋｇ、約７５０μｇ／Ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、又は前述の値の任意の２つにより規定される範囲）、より好ましくは、全体重１Ｋｇ当たり約１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇまで（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、又は前述の値の任意の２つにより規定される範囲）、及び更により好ましくは、１日当たり体重１Ｋｇ当たり約０．５μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は前述の値の任意の２つにより規定される範囲）であってもよい。上述のように、治療有効性又は予防有効性は、治療した患者を定期的に評価することによりモニターすることができる。数日又はより長期にわたって反復投与する場合、状態に応じて、病徴の所望の抑制が生じるまで治療が繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有用である場合があり、それらも本発明の範囲内にある。所望の用量は、組成物の単一のボーラス投与により、組成物の複数ボーラス投与により、又は組成物の持続的注入投与により送達することができる。
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）を含む薬学的組成物は、１日１回、２回、３回、又は４回投与することができる。また、組成物は、１日１回よりも少ない頻度で、例えば、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月１回、２か月毎に１回、３か月毎に１回、又は６か月に１回の頻度で投与することができる。また、組成物は、ある期間にわたって使用するために組成物を徐々に放出し、投与しようとする組成物を、月１回、２−６か月毎に１回、年１回、又は更に単回投与等のより低頻度で投与することを可能にする移植片等の、持続放出製剤で投与することができる。持続放出デバイス（ペレット、ナノ粒子、微小粒子、ナノスフェア、及びミクロスフェア等）は、注射により投与してもよい。
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）は、単一の１日用量で投与してもよく、全１日用量を、１日２回、３回、又は４回の分割用量で投与してもよい。また、組成物は、１日１回よりも少ない頻度で、例えば、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月１回、２か月毎に１回、３か月毎に１回、又は６か月に１回の頻度で投与することができる。また、組成物は、ある期間にわたって使用するために組成物を徐々に放出し、投与しようとする組成物を、月１回、２−６か月毎に１回、年１回、又は更に単回投与等のより低頻度で投与することを可能にする移植片等の、持続放出製剤で投与することができる。持続放出デバイス（ペレット、ナノ粒子、微小粒子、ナノスフェア、及びミクロスフェア等）は、注射により投与してもよく、又は種々の位置に外科的に移植してもよい。
医薬的製剤
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合するもの、又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの等）は、それらが投与に好適となるように、好適な担体又は賦形剤で製剤化することができる。本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の好適な製剤は、所望の純度を有する本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.編 (1980)）と混合することにより得られる。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに毒性がなく、以下のものが挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤。本明細書で提供されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質に応用することができる例示的な抗体製剤は、国際公開第９８／５６４１８号に記載されており、この文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。皮下投与用に構成されている凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。このような凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成してもよく、再構成した製剤は、本明細書で治療しようとする哺乳動物に皮下投与してもよい。
また、本明細書中の製剤は、治療中の特定の適応症に必要な１を超える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含有していてもよい。例えば、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、細胞傷害性剤、又は化学療法剤を更に提供することが望ましい場合がある。このような分子は、意図されている目的に効果的な量の組合せで適切に存在している。このような他の作用剤の有効量は、製剤に存在する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質の量、疾患又は障害又は治療のタイプ、及び上記で考察されている他の要因に依存する。このような他の作用剤は、一般的に、本明細書に記載のものと同じ用量及び投与経路で、又は前述の使用用量の約１から９９％までの用量で使用される。また、活性成分は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンでは、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、それぞれ封入されていてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。上記マトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌグルタメートの共重合体、非分解性エチレン−ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
リポフェクチン又はリポソームを使用して、本明細書に開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合するもの、又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの等）又は本明細書で提供されている組成物を細胞に送達することができる。
また、活性成分は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンでは、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセルに、それぞれ封入されていてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（上記）に開示されている。
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例としては、本明細書で開示されている天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。上記マトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌグルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日間を超える期間にわたって分子を放出することが可能であり、あるヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。封入されたシャガシン足場タンパク質が、長期間にわたって体内に留まる場合、３７℃で水分と接触する結果として変性又は凝集する場合があり、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機序に応じて安定化の合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集機序が、チオジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが判明した場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、濾過滅菌膜による濾過により、容易に達成することができる。
天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用した診断及びイメージング
本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ＬＲＰ６に特異的に結合するもの及び／又はＶＥＧＦに特異的に結合するもの等）は、例えば、患者試料中の（例えば、ＦＡＣＳ、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡアッセイにより）又は患者中のＬＲＰ６タンパク質又はＶＥＧＦタンパク質を検出するために使用することができる。標識された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（ヒトＬＲＰ６に特異的に結合するもの又はヒトＶＥＧＦに特異的に結合するもの等）は、標的リガンド（ＬＲＰ６又はＶＥＧＦ等）の発現、異常発現、及び／又は活性に関連する疾患及び／又は障害を検出、診断、又はモニターするための診断目的に使用することができる。例えば、本明細書で提供される天然に存在しないシャガシン足場タンパク質は、インサイチュ、インビボ、エクスビボ、及びインビトロ診断アッセイ又はイメージングアッセイに使用することができる。
ヒトＬＲＰ６の発現を検出するための方法であって、（ａ）ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する１つ又は複数の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、個体の細胞（例えば、組織）又は体液中のポリペプチドの発現をアッセイすること、及び（ｂ）ＬＲＰ６発現レベルを、基準ＬＲＰ６発現レベルと比較することを含み、アッセイしたＬＲＰ６発現レベルが、基準発現レベルと比較して増加又は減少することが、異常発現であることを示す方法が提供される。また、ヒトＶＥＧＦの発現を検出するための方法であって、（ａ）ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する１つ又は複数の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して、個体の細胞（例えば、組織）又は体液中のポリペプチドの発現をアッセイすること、及び（ｂ）ＶＥＧＦ発現レベルを、基準ＶＥＧＦ発現レベルと比較することを含み、アッセイしたＶＥＧＦ発現レベルが、基準発現レベルと比較して増加又は減少することが、異常発現であることを示す方法が提供されている。
更なる実施態様としては、動物（例えば、ヒト等の哺乳動物）の、ＬＲＰ６の発現又は異常発現に関連する疾患又は障害を診断するための方法が挙げられる。上記方法は、哺乳動物のＬＲＰ６分子を検出することを含む。ある実施態様では、診断は、（ａ）ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する有効量の標識された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を哺乳動物に投与すること、（ｂ）投与後にある期間待機して、ＬＲＰ６分子が発現される対象の部位に、標識されたシャガシン足場タンパク質が、優先的に濃縮すること（及び未結合の標識化分子が、バックグラウンドレベルまで除去されること）を可能にすること、（ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること、及び（ｄ）対象中の標識化分子を検出することを含み、バックグラウンドレベルを超える標識化分子の検出は、対象が、ＬＲＰ６の発現又は異常発現と関連する特定の疾患又は障害を有することを示す。ある実施態様では、診断は、（ａ）ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する有効量の標識された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を哺乳動物に投与すること、（ｂ）投与後にある期間待機して、ＶＥＧＦ分子が発現される対象の部位に、標識されたシャガシン足場タンパク質が優先的に濃縮すること（及び未結合の標識化分子が、バックグラウンドレベルまで除去されること）を可能にすること、（ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること、及び（ｄ）対象中の標識化分子を検出することを含み、バックグラウンドレベルを超える標識化分子の検出は、対象が、ＶＥＧＦの発現又は異常発現と関連する特定の疾患又は障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、検出された標識化分子の量を、特定の系で以前に決定された基準値と比較することを含む、種々の方法により決定することができる。
本明細書に記載の標識されたシャガシン足場タンパク質（ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する標識されたシャガシン足場タンパク質又は本明細書に記載のヒトＶＥＧＦに特異的に結合する標識されたシャガシン足場タンパク質等）は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して、生体試料中のタンパク質レベルをアッセイするために使用することができる（例えば、Jalkanen等, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985)；Jalkanen等, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照）。タンパク質発現の検出に有用な他の方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイが挙げられる。好適なタンパク質アッセイ標識は、当該技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ等の放射性同位元素；ルミノール；並びにフルオレセイン及びローダミン等の蛍光性標識及びビオチンが挙げられる。
当該技術分野で公知の技術を、本明細書で提供されている標識された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質（例えば、ヒトＬＲＰ６に特異的に結合する標識された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又はヒトＶＥＧＦに特異的に結合する標識された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質等）に適用することができる。このような技術としては、限定ではないが、二官能性コンジュゲート剤の使用が挙げられる（例えば、米国特許第５７５６０６５号、第５７１４６３１号、第５６９６２３９号、第５６５２３６１号、第５５０５９３１号、第５４８９４２５号、第５４３５９９０号、第５４２８１３９号、第５３４２６０４号、第５２７４１１９号、第４９９４５６０号、及び第５８０８００３号を参照）。また、例えば標識されたシャガシン足場に基づくアッセイを使用して、血清等の生体液中の離脱抗原を測定することによりＬＲＰ６又はＶＥＧＦの過剰発現を研究することができる（例えば、１９９０年６月１２日に交付された米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開された国際公開第９１／０５２６４号；１９９５年３月２８日に交付された米国特許第５４０１６３８号；及びSias等, J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)も参照）。熟練の施術者であれば、上記のアッセイに加えて、種々のインビボ及びエクスビボアッセイが使用可能である。例えば、哺乳動物の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば放射性同位体で任意選択的に標識されたシャガシン足場タンパク質と接触させ、例えば放射能を外部走査することにより、又は以前にシャガシン足場タンパク質と接触したことのある哺乳動物から採取された試料（例えば、生検又は他の生体試料）を分析することにより、シャガシン足場タンパク質と標的リガンド（例えば、ＬＲＰ６又はＶＥＧＦ）との結合を評価することができる。
製造品及びキット
ある実施態様では、ＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び例えば、がん及び転移性疾患、骨粗鬆症、並びに他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ、並びに他の炎症性疾患の治療に有用な物質を含む製造品が、本明細書で提供される。ある実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、及び異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性によって特徴が明らかにされる疾患及び障害、又は異常なＶＥＧＦ活性若しくは発現によって特徴が明らかにされる任意の他の疾患（本明細書の他所に記載されているもの等）の治療に有用な物質を含む製造品が、本明細書で提供される。
製造品は、容器、及び容器上にあるか又は容器に添付されているラベル又は添付文書を含んでいてもよい。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器等を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等の、様々な材料で形成することができる。一般的に、容器は、状態の治療に有効な組成物を保持しており、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈用溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、ＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、又はＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質である。ラベル又は添付文書には、組成物が、特定の状態を治療するために使用されることが示されている。ラベル又は添付文書は、シャガシン足場組成物を患者に投与するための説明書を更に含ことになる。本明細書に記載のコンビナトリアル療法を含む製造品及びキットも企図される。
添付文書は、このような治療製品の使用に関する適応症、使用法、用量、投与法、禁忌、及び／又は警告に関する情報を含む治療製品の市販パッケージに慣例的に含まれる説明書を指す。ある実施態様では、添付文書には、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないチャガシン足場タンパク質を含む組成物が、がん及び転移性疾患、骨粗鬆症並びに他の骨代謝疾患、ニューロン性及び神経変性疾患、関節リウマチ、並びに他の炎症性疾患の治療に使用されることが示されている。ある実施態様では、添付文書には、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物が、異常な血管新生及び／又は異常な血管透過性によって特徴が明らかにされる疾患及び障害、又は異常なＶＥＧＦ活性若しくは発現によって特徴が明らかにされる任意の他の疾患（本明細書の他所に記載されているもの等）の治療に使用されることが示されている。加えて、製造品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液等の、薬学的に許容されるバッファーを含む第２の容器を更に含んでいてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及び注射器を含む、商業的に及びユーザの観点から望ましい他の物質を更に含んでいてもよい。
また、種々の目的に、例えば、患者のＬＲＰ６又はＶＥＧＦを単離又は検出するために有用なキットが、任意選択的に製造品と組み合わせて提供される。ＬＲＰ６を単離及び精製する場合、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合された、本明細書に記載されている、ＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含んでいてもよい。ＶＥＧＦを単離及び精製する場合、キットは、ビーズに結合された、本明細書に記載されている、ＶＥＧＦに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含んでいてもよい。インビトロで、例えばＥＬＩＳＡ又はブロットでＬＲＰ６又はＶＥＧＦを検出及び定量するための、本明細書に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むキットを提供することができる。製造品と同様に、キットは、容器、及び容器上にあるか又は容器に添付されているラベル又は添付文書を含む。例えば、容器は、ＬＲＰ６に特異的に結合する本明細書に記載の少なくとも１つの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質、又はＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載の少なくとも１つの天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及びバッファー、コントロール抗体等を含む更なる容器が含まれていてもよい。ラベル又は添付文書には、組成物の説明、並びに目的のインビトロ使用又は診断使用の説明書が提供されていてもよい。
実施例１： 材料及び方法
シャガシンのクローニング及びファージミドコンストラクトのデザイン
以下の配列：
ＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＧＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＧＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＡＧＴＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＴＣＧＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧＡＧＣＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＣ（配列番号９１）
により、コドン使用を最適化したシャガシン遺伝子を合成した。
シャガシン遺伝子を、Ｎ末端のエピトープタグ（ｇＤタグ）である、ＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＧＳＬＥ（配列番号９２）（NJ Skelton等、J Biol Chem、278、7645-7654、2003）を伴うＰＣＲにより増幅し、ファージミドベクター（SS Sidhu等、Methods Enzymol、328、333-363、2000；R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）の、ＭａｌＥシグナルペプチドと、コートタンパク質の前に（ＧＧＳ）３リンカーを含む、ファージコートタンパク質であるｇ３又はｇ８との間へとクローニングした。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発法（R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）を使用して、シャガシンの３つのループ領域を、２個の終止コドンで置きかえることにより、シャガシンを含有するファージミドベクターを修飾した。代替的に、一部のライブラリーには、シャガシン遺伝子の後にＴＡＧアンバー終止コドンを導入して、ディスプレイレベルを低減した。これらのコンストラクトを、ＮＮＫコドンにより、又はランダム化のために選択した位置におけるトリヌクレオチドから合成されたオリゴヌクレオチドを使用する、ライブラリー産生のためのＫｕｎｋｅｌテンプレートとして使用した（R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）。
ファージ上のシャガシンディスプレイの決定
ｇＤタグづけされたシャガシンであって、コートタンパク質であるｐ３又はｐ８へと融合させたシャガシンをディスプレイするファージを、記載される（SS Sidhu等、Methods Enzymol、328、333-363、2000；R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）通りに産生した。抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）又はパパインに対する、精製されたファージの結合を、１ｍｌ当たりのファージ２．５×１０１２個で出発する、ファージ溶液の２倍の希釈系列を伴うファージＥＬＩＳＡにより測定し、抗Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲート抗体（ＮＥＢ）を使用して検出した。
シャガシンループのアラニンスキャニング
各々が、２つのランダム化されたループを同時に（Ｌ２及びＬ４、Ｌ２及びＬ６、Ｌ４及びＬ６）含有する、３つのアラニンスキャニングライブラリーを、解析のために作製した。アラニンショットガンスキャニングコドン（GA Weiss等、Proc Natl Acad Sci USA、97、8950-8954、2000）を使用して、ループ２、ループ４、及びループ６における以下の位置（それぞれ、Ｓｅｒ２８からＰｈｅ３４、Ｐｒｏ５９からＧｌｙ６９、及びＡｒｇ９１からＳｅｒ１００）をランダム化した。抗ｇＤ抗体でコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）を使用して、２ラウンドにわたる親和性選択を実施し、選択されたファージクローンを、ファージスポットＥＬＩＳＡ、及び既に記載された（R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）方法を使用するＤＮＡ配列決定により解析した。
ナイーブシャガシンファージライブラリーのデザイン
シャガシンライブラリーは、本質的に、記載されている（R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）方法を使用して作製した。Ｌ２、Ｌ４、及びＬ６における残基位置（それぞれ、２８−３４、５９−６９、及び９１−１００）をコードするＤＮＡを、２個の終止コドンで置きかえた、シャガシンファージミドコンストラクトを、Ｋｕｎｋｅｌテンプレートとして用いた。
太字のアミノ酸残基位置は、アラニンスキャニングの結果（実施例２）と、Ｌ２における追加の残基挿入（実施例３）とに基づき、シャガシンループである、Ｌ２、Ｌ４、及びＬ６におけるランダム化のために選び出した。下線を付した位置は、保存的ライブラリー内で固定した。上記の表５に示した、ランダム化のために選択された位置（Ｘ）に基づき、ＮＮＫコドンを使用して、７つのオリゴヌクレオチド：
Ｌ２−Ｘ２：ＧＧＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＣＣ ＧＮＮ ＫＮＮ ＫＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＧＧ（配列番号９６）
Ｌ２−Ｘ４：ＧＧＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＮＮ ＫＮＮ ＫＮＮ ＫＮＮ ＫＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＧＧ（配列番号９７）
Ｌ４−Ｘ６：ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＴ ＡＡＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＣＣＧ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＴＧ（配列番号９８）
Ｌ４−Ｘ８：ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＴ ＡＡＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＣＣＧ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＴＧ（配列番号９９）
Ｌ４−Ｘ１０：ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＴ ＡＡＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＣＣＧ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＴＧ（配列番号１００）
Ｌ６−Ｘ４ＧＸ５：ＧＴＡ ＡＡＴ ＣＴＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＴＧ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＧＴ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＡＧ ＣＧＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＴＡ ＴＡＴ Ｃ（配列番号１０１）
Ｌ６−ＸＰＸ２ＧＰＸ４：ＧＴＡ ＡＡＴ ＣＴＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＴＧ ＮＮＫ ＣＣＡ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＧＴ ＣＣＧ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＧＡＧ ＣＧＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＴＡ ＴＡＴ Ｃ（配列番号１０２）
をデザインした。
合計８つの個別のナイーブライブラリーを、Ｌ４単独、Ｌ４及びＬ２、又は３つのループ全てが、ランダム化された位置を含有した、これらのオリゴヌクレオチドを用いて作製した（下記の表６を参照されたい）。８から２１の間の残基を、同時にランダム化した。
ファージパニング
溶液中又はコーティングされたプレート上のファージパニングは、本質的に、記載されている（R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007；Y Zhang等、J Biol Chem、289、942-955）通りに実行した。４ラウンドにわたるファージパニングを実施して、標的特異的な結合剤についてエンリッチした。ＬＲＰ６についてのライブラリーパニングは、常に溶液中で行ったのに対し、ＶＥＧＦ１０９に対する初期のナイーブライブラリーパニングは、プレート上で行い、次いで、親和性成熟時の溶液分取へと切り替えた。４ラウンド目のパニングの後で、各ライブラリー又はライブラリープールに由来する９６個のクローンを、ファージＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ配列決定により、個別に産生及び解析した。溶液ファージパニングでは、標的タンパク質濃度を、ラウンドごとに調整した（５００ｎＭから０．５ｎＭの範囲で）。
標的特異的シャガシン結合剤の親和性成熟
ＬＲＰ６又はＶＥＧＦ１０９に対する、標的特異的シャガシン結合剤を、ループ内で選択された新たな配列のソフトランダム化により親和性成熟させた。ソフトランダム化ライブラリーは、野生型塩基を過剰量とする、ヌクレオチド塩基の７０−１０−１０−１０混合物により合成された縮重オリゴヌクレオチドを使用して構築した。この結果として、標的とされる位置では、野生型アミノ酸が、約５０％の頻度で出現し、他の全てのアミノ酸についても、約５０％の頻度がもたらされる。これらの新たなライブラリーのファージパニングは、上記で記載した通りに実行し、オンラインソフトウェアであるＷｅｂＬｏｇｏ ３．３を使用して、ＷｅｂＬｏｇｏプロットを生成した。
ＬＲＰ６の発現及び精製
Ｃ末端のＡｖｉタグ及びＨｉｓ６タグを伴うＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２は、既に記載されている（E Bourhis等、J Biol Chem、285、9172-9179、2010）通りに産生した。ビオチニル化は、製造元のプロトコールに従い、キット（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を使用して実行した。
シャガシン変異体の発現及び精製
シャガシン変異体を、ｐＥＴ５２ｂベクターバックボーンへと、ＴＥＶ切断部位により、シャガシン変異体から分離されるＮ末端のＨｉｓ６−ＧＳＴタグと共に、クローニングした。コンストラクトを、ＢＬ２１Ｓｔａｒ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと形質転換し、ＴＢ自己誘導培地中、１６℃、２００ｒｐｍで、７２時間にわたり発現させた。遠心分離により、細胞ペレットを採取し、マイクロフルイダイザーにより、ＰＢＳバッファー中に溶解させた。５０，０００ｇにおける遠心分離の後で、細胞 溶解物を、製造元のプロトコールに従う、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ親和性精製（Ｑｉａｇｅｎ）に続き、Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上、２０ｍＭのトリスｐＨ８及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中、３０ｃｍ／時間の流量による、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ＧＳＴへと融合させたシャガシン変異体を含有する画分を濃縮し、１ｍＭのＤＴＴを補充して、室温で一晩にわたり、ＴＥＶプロテアーゼ（１ｍｇのＧＳＴ−シャガシン当たり２５μｇのＴＥＶ）で切断した。Ｓ７５サイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２０ｍＭのトリスｐＨ８及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中、３０ｃｍ／時間の流量で使用して、切断されたシャガシン変異体を単離し、濃縮した。
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ（ＩＢＡＧｍｂＨ）を伴うシャガシン変異体の、小スケールの発現：本発明者らは、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）をコードするＤＮＡ配列を、シャガシン変異体を含有するファージミド内の、シャガシンのＣ末端に導入した。組み込まれたＳｅｒ−Ａｌａ残基は、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏに対する親和性を改善する。これらのファージミド変異体を含有する、形質転換された大腸菌株３３Ｄ３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を、対数増殖期まで増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃で一晩にわたり増殖させた。１０,０００ｇにおける遠心分離により、細胞を除去したところ、培地上清は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを伴う、分泌されたシャガシン変異体を含有し、次いで、これを、ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４上の結合研究に使用した。
ＥｘｉＰｒｏｇｅｎ（商標）システムを使用する、シャガシン変異体の小スケールの発現
製造元（Ｂｉｏｎｅｅｒ）のプロトコールに従い、ＥｘｉＰｒｏｇｅｎ（商標）ＰｒｏＸｐｒｅｓｓ鋳型キットを使用して、シャガシン変異体をコードするＤＮＡを、Ｃ末端のＨｉｓ６タグ及びＡｖｉタグと共に増幅した。ＥｘｉＰｒｏｇｅｎ（商標）装置（Ｂｉｏｎｅｅｒ）上で、ＢｉｒＡ及びｄ−ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ）を添加して、ＥＣ１タンパク質合成キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用して、タンパク質を産生して、Ｎｉ親和性クロマトグラフィーから、２０−４０μｇの精製されたビオチニル化タンパク質を得た。
Ｗｎｔ１細胞ベースのアッセイ
ＷＮＴ１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｓ細胞内のルシフェラーゼレポーターアッセイを、記載されている（Y Zhang等、Nat Chem Biol、5、217-219、2009；Y Gong等、PLoS One、5、e12682、2010）通りに実施した。精製されたシャガシンＬＲＰ６変異体及び阻害剤を、２倍で系列希釈し、指し示されている通りに添加した。
ＶＥＧＦＲ１−ＶＥＧＦ競合結合ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、既に記載されている（J Bostrom等、Science、323、1610-1614、2009）通りに行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅを、ＰＢＳ中で一晩にわたり、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした。それを、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃをコーティングしたプレートと共に、１５分間にわたりインキュベートする前に、０．４ｎＭのビオチニル化されたＶＥＧＦ１６５（標識付けは、Ｐｉｅｒｃｅによるプロトコールに従い、Ｐｉｅｒｃｅ製のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンにより実施した）を、ＶＥＧＦ結合剤の滴定系列と、１：１で、２時間にわたり混合した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによる洗浄の後で、結合は、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ ａｎｄ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を伴い、４５０ｎｍの分光光度計により検出した。ＶＥＧＦ１０９、ＶＥＧＦ１６５、及びＶＥＧＦＲ１−Ｆｃは、Ｇｅｒｍａｉｎｅ Ｆｕｈ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）により恵与された。
細胞内ＶＥＧＦ受容体阻害アッセイ
細胞上の、ＫＤＲ受容体を介する、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害は、本質的に、記載されている通り（MD Sadick等、J Pharm Biomed Anal、19、883-891、1999；H Gille等、J Biol Chem、276、3222-3230、2001）に測定した。２５又は５０ｎｇ／ｍＬの一定量のヒトＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦ、又はラットＶＥＧＦを、ＫＤＲを発現するＣＨＯ細胞を刺激する前に、多様な濃度のシャガシン変異体又は阻害剤と混合した。
ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４上の結合反応速度測定値
ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、標的であるＬＲＰ６及びＶＥＧＦ１０９に対する、シャガシン変異体の結合親和性を測定した。全ての洗浄、希釈、及び測定は、１０００ｒｐｍでプレート振盪しながら、ＰＢＳベースの反応速度バッファー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で実施した。ストレプトアビジンバイオセンサー（ＳＡ ｔｉｐｓ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、反応速度バッファー中で５分間にわたり平衡化し、次いで、ビオチニル化されたＬＲＰ６−Ｅ１Ｅ２、又はビオチニル化されたＶＥＧＦ１０９（２０μｇ／ｍｌ）を、シグナル差２ｎｍの密度までロードするのに続いて、３分間にわたる洗浄工程にかけた。会合相には、リガンドでコーティングされたＳＡ−ｔｉｐを、シャガシン変異体を含有する溶液（１０００又は２５０ｎＭで出発する、２倍希釈の７つの系列）中に入れた。シャガシン変異体−標的複合体の解離は、反応速度バッファー単独を含有するウェル内で、最長３０分間にわたり測定した。リガンドをロードしたＳＡ ｔｉｐが、会合及び解離の測定の両方において、バッファーだけを含有するウェルを経る場合のセンサーグラムを、バックグラウンド控除のための参照基準として使用した。Ｋｄ、ｋａ、及びｋｄは、グローバルフィッティングによる１：１結合モデルを使用する、Ｏｃｔｅｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ７．０．１．３．を使用して決定した。代替的に、ＡＭＣ−ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ）を、飽和までロードし、その後、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを含有するシャガシン変異体を、飽和まで捕捉するのに使用した。反応速度バッファー中で５分間にわたる洗浄の後で、標識されていないＬＲＰ６−Ｅ１Ｅ２断片に対する結合反応速度を、本質的に、上記で記載した通りに決定した。
実施例２： シャガシンループにおける、ランダム化のためのアミノ酸位置の決定
シャガシンの、ファージとの適合性を検証するために、シャガシン野生型（ｗｔ）遺伝子を、Ｎ末端のエピトープタグ（ｇＤタグ）（NJ Skelton等、J Biol Chem、278、7645-7654、2003）と共に、ファージミドベクター内のｇ３又はｇ８のＮ末端（SS Sidhu等、Methods Enzymol、328、333-363、2000；R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）へと融合させ、パパイン又は抗ｇＤ抗体に対する、そのディスプレイ及び結合について調べた。ｐ３融合ディスプレイモード及びｐ８融合ディスプレイモードの何れにおいても、シャガシンは、ファージ滴定ＥＬＩＳＡにおいて、パパインへの特異的結合を示したが、ＢＳＡへの検出可能な結合を示さなかった（図２を参照されたい）。ファージ濃度は、２６８ｎｍにおけるＯＤにより決定し、抗ｇＤ抗体又はパパインに対して滴定した。何れの結合イベントも、コントロールとしてのＢＳＡへの結合と比較した場合、特異的であった。
次いで、ナイーブシャガシンタンパク質ライブラリーを作製するためにランダム化され得る、ループ２、ループ４、及びループ６における位置を決定した。シャガシンに対するコンフォメーション特異的抗体であって、ディスプレイされたシャガシン変異体を捕捉する特異的抗体は、現行では利用可能でない。したがって、所与の位置の許容性を決定するために、アラニンスキャニングを実施して、野生型残基又はアラニンの存在が許容されるアミノ酸位置（複数可）を同定した。場合によって、遺伝子コードの縮重のために、野生型又はアラニンの代わりに、他の２個のアミノ酸もまた可能であった（GA Weiss等、Proc Natl Acad Sci USA、97、8950-8954、2000）。シャガシン変異体をディスプレイするファージライブラリーは、抗ｇＤ抗体でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｂ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ上で、Ｎ末端のｇＤタグを介して捕捉したが、この場合、適正にフォールドしたシャガシン変異体だけが、捕捉のために良好にディスプレイされる。野生型残基が、安定性に不可欠である場合、この位置では、野生型残基が、アラニンに対して卓越すると予測される一方で、アラニンの出現と野生型残基の出現とが同等である位置は、アラニンに対する許容性を指し示し、他の残基に対する許容性を指し示す可能性が高い。こうして、アラニンの出現と野生型残基の出現とが同等である位置を、ランダム化のための位置として選び出した。
２つのループを対にして同時にスキャンする３つのアラニンスキャニングライブラリー（Ｌ２＋Ｌ４、Ｌ２＋Ｌ６、Ｌ４＋Ｌ６）を作製し、標準的な手順（R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）を使用して、２ラウンドのパニングにかけた。各ライブラリーから個別により抜かれた９６個のクローンのＤＮＡ配列を得、ＷｅｂＬｏｇｏ３．３を使用する、ロゴプロットを使用して、各ランダム化された位置において現れる残基の頻度／確率を解析した。ループ２は、配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含有し、Ｔｈｒ３２の、Ｌ４における変動との何らかの共依存性により、アラニンによる２個のスレオニン（３１位及び３２位）の置換を許容した。２９位では、Ａｓｎ又はＡｓｐが選好されたが、他の全ての位置は、野生型残基に対する大きな優先性を示した。ループ４は、野生型の配列ＰＰＤＳＫＬＬＧＡＧＧ（配列番号１４９）を含有し、Ｐｒｏ５９及びＳｅｒ６２に対するある程度の優先性を示したが、これらの位置をランダム化から除外するほど著明ではなかった。Ｇｌｙ６６及びＧｌｙ６９は、ループ４において、高度に選好される残基であった。ループ６は、配列ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ（配列番号８４）を含有し、位置の何れにおいても、野生型残基に対する強い優先性を示さなかった。
実施例３： ライブラリーデザインのための、Ｌ２ループの延伸についての探索
次に、タンパク質の安定性に著明に影響を及ぼすことなく、ループ２を伸長させ得るかどうかを決定するように、試験を実施した。Ｌ２の、Ａｓｎ３０とＧｌｙ３３との間に、１個、２個、３個、５個、又は７個の、追加のランダム残基を含有する、５つのライブラリーを構築し、それらを、２ラウンドにわたる抗ｇＤ抗体による分取にかけて、ディスプレイされたシャガシン変異体について選択した。ファージスポットＥＬＩＳＡにより、各ライブラリーに由来する合計９６個のファージクローンを、シャガシンディスプレイレベルについて解析した。Ｌ２内の最大で３個の残基の挿入は、抗ｇＤ抗体に対する結合のディスプレイレベルが極めて均一であり、ＢＳＡに対する結合のレベルが低度のクローンを結果としてもたらした。３個を超える残基の挿入は、ＢＳＡへの結合により測定される、非特異的結合を増大させたシャガシン変異体のディスプレイレベルの低減を示した。
実施例４： シャガシンライブラリーのデザイン
各ループのポジショナルアラニンスキャニングのほか、Ｌ２についてのループの長さ選択にも基づき、上記の表４に示した特異的な位置を、ランダム化のために選び出した。８つのナイーブシャガシンタンパク質ライブラリーをデザインし、ファージ上にディスプレイした、すなわち、６つのライブラリーをｇ３上にディスプレイし、２つのライブラリーをｇ８上にディスプレイした（上記の表６）。Ｌ４は、シャガシンホモログ間で、１０−２１残基の間の長さで変動し得る（D Salmon等、J Mol Biol、357、1511-1521、2006）ので、抗ｇＤ抗体に対するパニングライブラリーにより、このループにおける異なる長さ変動を、それらの安定性及び配列組成について調べることはしなかった。
実施例５： 標的タンパク質に結合するシャガシン変異体の作製
シャガシンの、足場としての有用性と、システインプロテアーゼ以外のタンパク質に対して、大きな親和性、特異性、及び活性で結合する変異体をもたらすその能力とについて検証するために、Ｗｎｔシグナル伝達の共受容体であるＬＲＰ６（KI Pinson等、Nature、407、535-538、2000；K Tamai等、Nature、407、530-535、2000）と、増殖因子であるＶＥＧＦ（DW Leung等、Science、246、1306-1309、1989）とを、ファージパニングのための標的タンパク質として選び出した。ＬＲＰ６（VE Ahn等、Dev Cell、21、862-873、2011；E Bourhis等、Structure、19、1433-1442、2011；Z Cheng等、Nat Struct Mol Biol、18、1204-1210、2011）及びＶＥＧＦ（YA Muller等、Proc Natl Acad Sci USA、94、7192-7197、1997；C Wiesmann等、Cell、91、695-704、1997）の何れも、構造的及び機能的に、十分に特徴を明らかにされている。本明細書で使用されるＶＥＧＦとは、多様な形態を有するＶＥＧＦ−Ａを指す（BA Keyt等、J Biol Chem、271、7788-7795、1996）。ＶＥＧＦ１０９とは、残基８−１０９（ＶＥＧＦ１０９；ＶＥＧＦ８−１０９；ＶＥＧＦ８−１０９ともまた称する）を含有するタンパク質を指し、ＶＥＧＦ１６５とは、残基１−１６５（ＶＥＧＦ１６５；ＶＥＧＦ１−１６５；ＶＥＧＦ１−１６５；ＶＥＧＦ１６５ともまた称する）を含有するタンパク質を指す。
ＬＲＰ６に結合するシャガシン変異体の作製
８つのナイーブシャガシンライブラリーをまず個別に、Ｃ末端にＡｖｉタグづけされたＬＲＰ６受容体断片であるＥ１Ｅ２（E Bourhis等、Structure、19、1433-1442、2011）に対する、４ラウンドにわたる溶液ファージパニング（Y Zhang等、J Biol Chem、289、942-955）にかけた。ファージスポットＥＬＩＳＡにより決定される通り、全てのライブラリーにより、ＬＲＰ６−Ｅ１Ｅ２に特異的に結合するシャガシン変異体が作製され、標的への結合についてのファージ力価のエンリッチメントは、最終ラウンドのパニングにおいて、０から１００倍の範囲であった。
ＬＲＰ６の第１のβプロペラドメイン（Ｅ１）内の、機能的なタンパク質間相互作用部位であって、直鎖状のＮＸＩＫペプチドモチーフに選択的に結合する相互作用部位については記載されている（E Bourhis等、Structure、19、1433-1442、2011）。抗ＬＲＰ６阻害性抗体（ＹＷ２１０．０９）、若しくは天然の阻害剤である、Ｄｋｋ１、ＳＯＳＴに由来するペプチド、又はファージディスプレイに由来するペプチドと複合したＬＲＰ６−Ｅ１の結晶構造は、これらの結合パートナーに対する相互作用であって、Ｄｋｋ１ペプチドである、Ａｃ−ＮＳＮＡＩＫＮ−ＮＨ２（配列番号１０９）の、受容体断片との相互作用（図３）により例示される相互作用を明らかにする。
シャガシンＬＲＰ６変異体（ＬＲＰ６に特異的に結合したシャガシン変異体）についての配列解析は、主に、ランダム化されたループＬ４における、ＮＸＩＫ配列モチーフに対する強い優先性を呈示した。ファージスポットＥＬＩＳＡにおいて、強い標的への結合及び特異性を呈示する、２１個の変異体を、Ｌ４だけ、Ｌ２及びＬ４、又は３つのループ全てにおいてランダム化されたライブラリーから選択した。変異体は、小スケールで、大腸菌からの、Ｃ末端のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを伴う分泌タンパク質として発現させた（TG Schmidt及びA Skerra、Nat Protoc、2、1528-1535、2007）。それらの結合反応速度は、ＡＭＣチップに、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ捕捉抗体をロードして、シャガシンＬＲＰ６変異体を固定化し、ＬＲＰ６−Ｅ１Ｅ２受容体断片を溶存させる、ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４上のバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）測定により、プロファイリングし、ランク付けした。３つのＬＲＰ６結合剤である、変異体Ｈ、Ｐ、及びＳは、反応速度のオフ速度が遅く、結合親和性は、ナノモル範囲（それぞれ、Ｋｄ＝６、１５０、７０ｎＭ）にあった（図４）。変異体Ｓは、分子内ジスルフィド結合を形成し得るが、また、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される通り、ホモダイマーも形成する、２個のシステインを含有した。変異体Ｈ及び変異体Ｓは何れも、３つのループ全てを同時にソフトランダム化するライブラリーを作製することにより、親和性成熟にかけた。結果として得られるライブラリーを、最終工程において、３つの異なる標的濃度（０．５、０．１、０．０５ｎＭ）を伴う、３ラウンドにわたる厳密な溶液ファージパニングにかけた。３８４個のファージクローンを個別に発現させ、ファージスポットＥＬＩＳＡにより、特異性及び親和性の改善について解析した。ＢｉｏｎｅｅｒＥｘｉｐｒｏｇｅｎ（商標）システムを使用して、多くの良好な結合剤のうち、ライブラリーＨ及びライブラリーＳから、標的結合特異性が最高である、上位１６個ずつのクローン（すなわち、合計で３２個のクローン）を、Ｃ末端のＡｖｉタグを伴う小スケールの発現により選び出し、ＢＬＩの測定により、ＬＲＰ６−Ｅ１Ｅ２に対する、それらの結合反応速度プロファイルの特徴を明らかにした。結合反応速度プロファイルが最良である（会合速度が速く、オフ速度が遅い）、上位４個のクローンを、大スケールの発現のために、ＧＳＴへと融合させたタンパク質として選び出した（下記の表７を参照されたい）。
クローンＨ２、Ｈ１５、及びＳ１１の何れの発現も良好であり、モノマーのシャガシンＬＲＰ６変異体を結果としてもたらした。クローンＨ２及びＨ１５の、ＬＲＰ６−Ｅ１Ｅ２に対する結合親和性（Ｋｄ）が、それぞれ、４００ｐＭ及び２５０ｐＭであるのに対し、変異体Ｓ１１の結合親和性は、７４ｎＭであった（図５）。
高親和性のシャガシンＬＲＰ６変異体は、Ｗｎｔ依存性細胞内シグナル伝達を阻害する
３個のシャガシンＬＲＰ６変異体全ての特徴を、細胞ベースのアッセイにおいて、Ｗｎｔシグナル伝達をブロックするそれらの能力についてさらに明らかにした（Y Zhang等、Nat Chem Biol、5、217-219、2009；Y Gong等、PLoS One、5、e12682、2010）。異なるＷｎｔリガンドは、ＬＲＰ６受容体の異なる部分に結合する（E Bourhis等、J Biol Chem、285、9172-9179、2010）。Ｗｎｔ３ａが、ＬＲＰ６のＥ３ドメインと相互作用するのに対し、Ｗｎｔ１は、Ｅ１ドメインと、おそらく、阻害性抗体であるＹＷ２１０．０９と、Ｄｋｋ１とが結合する重複部位において、相互作用する（Y Gong等、PLoS One、5、e12682、2010）。モノマーのシャガシンＬＲＰ６変異体である、Ｈ２、Ｈ１５、及びＳ１１は、この細胞ベースのアッセイにおいて、Ｗｎｔ１シグナル伝達に対して、ＩＣ５０値をそれぞれ、３１、２６、及び４００ｎＭとする、用量依存性の阻害を示した（図６）。比較として述べると、二価の阻害性抗体であるＹＷ２１０．０９のＩＣ５０は、２８ｎＭであることから、モノマーの変異体であるＨ２及びＨ１５は、同等に強力な試薬であることが実証された。このアッセイにおいて、全てのシャガシンＬＲＰ６変異体は、飽和濃度で、完全な阻害を結果としてもたらした。野生型シャガシンは、このアッセイにおいて、Ｗｎｔ１シグナル伝達を阻害せず、正常な細胞増殖にも干渉しない。高親和性のシャガシンＬＲＰ６変異体は、ＹＷ２１０．０９の結合エピトープと重複し、ＬＲＰ６.のＥ１上の、同じＮＸＩＫペプチド結合部位を活用する。
ＶＥＧＦに結合するシャガシン変異体の作製
シャガシンＶＥＧＦ変異体（すなわち、ＶＥＧＦに特異的に結合するシャガシン変異体）を作製するために、８つの個別のナイーブシャガシンファージライブラリーを、３つの群（Ａ、Ｂ、Ｃ）［群中、プールＡは、ランダム化されたループＬ４の長さが異なるライブラリーだけを含有し、プールＢは、Ｌ２ループ及びＬ４ループがランダム化されたライブラリーを含有し、プールＣは、３つのループ全てが同時にランダム化されたライブラリーからなった］へとプールした（表６）。これらの３つのライブラリープールを、４ラウンドにわたる従来のプレート分取であって、ＶＥＧＦをＭａｘｉＳｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅへと固定化したプレート分取にかけた（Y Chen等、J Mol Biol、293、865-881、1999；R Tonikian等、Nat Protoc、2、1368-1386、2007）。各ライブラリープールに由来する、合計９６個の個別のファージクローンを増殖させ、ファージスポットＥＬＩＳＡにより、特異的な標的結合について解析した。標的への結合及び特異性が大きな、個別の変異体を結果としてもたらしたのは、ライブラリープールＣだけであり、これは、ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＥＧＦ及びＢＳＡに対するファージ滴定により確認された（図７）。５個の変異体全てを、ＧＳＴ融合タンパク質として産生し、競合結合ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＥＧＦの、ＶＥＧＦＲ１−ＥＣＤ Ｆｃ融合体への結合をブロックするそれらの能力について調べた（図８）（J Bostrom等、Science、323、1610-1614、2009）。ＶＥＧＦの、ＶＥＧＦＲ１−ＥＣＤへの結合をブロックすることが可能なのは、Ｇ６抗ＶＥＧＦ抗体（G Fuh等、J Biol Chem、281、6625-6631、2006；WC Liang等、J Biol Chem、281, 951-961, 2006）と共に、ＧＳＴ融合タンパク質としての変異体４だけであり、ＩＣ５０値は、それぞれ、１３ｎＭ及び０．２５ｎＭであった。変異体３は、高濃度で、かなり弱い阻害を示したが、他の結合剤は何れも、阻害活性を示さなかった。モノマーのシャガシンＶＥＧＦ変異体４は、同じアッセイにおいて、ＶＥＧＦの結合をブロックしなかった（図９）。理論に束縛されることなく述べると、これは、ＧＳＴが、ダイマーを形成し、シャガシン変異体の、ＶＥＧＦへの結合のアビディティーの増大をもたらし、これにより、このアッセイにおける力価を増強し得るという事実に起因する可能性がある。このアッセイでは、シグナルを効果的に消失させるのに、ホモダイマーであるＶＥＧＦの両方の結合部位をブロックすることが必要である。
シャガシンＶＥＧＦ変異体は、ＶＥＧＦ依存性細胞内シグナル伝達を阻害する
本発明者らは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＳＴ融合体としての変異体４のほか、モノマーのシャガシンＶＥＧＦ変異体４についても調べて、それらが、その受容体ＫＤＲを介して、ＶＥＧＦ依存性細胞内シグナル伝達をブロックすることが可能であるかどうかについて検討し、この場合、細胞内受容体リン酸化が読み出しとなった（下記の図１０Ａ−１０Ｃ、及び１１、並びに表７及び８）（H Gille等、J Biol Chem、276、3222-3230、2001）。このアッセイでは、ＧＳＴへと融合させた変異体４及びモノマーの変異体４の何れもが、ＩＣ５０値を、それぞれ、７２及び９０８ｎＭとする阻害活性を有したが、ＧＳＴへと融合させた他のシャガシンＶＥＧＦ変異体は、活性を阻害しなかった。興味深いことに、変異体４は、マウス又はラットのＶＥＧＦ依存性シグナル伝達は阻害しなかったので、ヒトＶＥＧＦに特異的であった。
シャガシンＶＥＧＦ変異体４の親和性成熟
モノマーのＶＥＧＦ変異体４の親和性及び力価を改善するために、本発明者らは、この変異体のＬ２及びＬ６の配列がソフトランダム化され、Ｌ４が、ＹＳＧＸ組成（システインを除く）（FA Fellouse等、J Mol Biol、373、924-940、2007）、又はソフトランダム化された親配列を伴う、６、８、又は１０カ所のランダム化された位置を含有する、４つの新たなライブラリーをデザインした。全てのライブラリーを、４ラウンドにわたる厳密な溶液ファージパニング（Y Zhang等、J Biol Chem、289、942-955）にかけた。各ライブラリーに由来する合計９６個のクローンを、個体クローンとして発現させ、ファージＥＬＩＳＡにより解析した。解析された３８４個のファージクローンから、標的特異性が大きな、３４個の個別のクローンを同定し（図１２）、Ｂｉｏｎｅｅｒ製のＥｘｉＰｒｏｇｅｎ（商標）を使用して、２３個のクローンを、小スケールで発現させた。図１２は、ファージスポットＥＬＩＳＡにより決定される、ＶＥＧＦに対する標的親和性及び標的特異性が大きな、３３個のファージクローンの部分配列を示す。ループ２、４、６においてランダム化された位置は、太字とする。ＥｘｉＰｒｏｇｅｎ（商標）上、小スケールで産生された２３個の変異体は、アステリスクでマークする。細胞ベースのアッセイにおいて調べるために産生された６個の変異体は、図１２の右側において注記される通り、Ｅ４Ｂ−１０、Ｅ４Ｂ−５、Ｅ４Ｂ−７、３７、Ｌ４Ｘ６−３、Ｌ４Ｘ８−９、及びＬ４Ｘ６−７である。システインには、下線を付す。
これらの２３個の変異体の結合反応速度を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４上のＢＬＩによりプロファイリングし、これらのうちの最良の６個を、ＧＳＴ融合体として、より大きなスケールで発現させ、ＴＥＶプロテアーゼによる切断の後で、モノマーのシャガシンＶＥＧＦ変異体として精製した。これらの６個の変異体を、細胞上のＫＤＲ受容体を介するＶＥＧＦ依存性シグナル伝達（H Gille等、J Biol Chem、276、3222-3230、2001）を阻害するそれらの能力について調べた。大半の変異体が示した阻害の改善は比較的小さかったが、変異体Ｌ４Ｘ６−７及びＬ４Ｘ８−９のＩＣ５０値は、それぞれ、６５及び３０１ｎＭであり、これは、親シャガシン変異体４に対する、１３倍及び２倍の改善を表す（下記の図１３及び表９）。Ｌ４Ｘ６−７の、ＶＥＧＦへの結合の親和性は、結合反応速度の測定値に基づき、Ｋｄ＝１５０ｎＭであった（図１４）が、これは、親変異体４に対する２．５倍の改善である。

大きな親和性でＶＥＧＦに結合する、シャガシンホモダイマー変異体の同定
ファージＥＬＩＳＡにより検出される、大きな標的特異性を示した３４個の個別のクローンのうち、９個が、Ｌ２（ＹＦＣＤ）の同じ位置に、単一のシステインを含有した。Ｌ４ループは、親配列を親和性成熟させた後でも、大きな配列可変性を保有し、ループＬ２及びＬ６は、ごく小さな変化しか示さず、大半は親配列を選好したので、Ｌ４は、ＶＥＧＦへの結合にそれほど関与しない可能性が高い。ｇ３上でアンバーストップを伴いディスプレイされ、Ｌ２（ＹＦＣＤ）において単一のシステインを含有する、クローン３７を選択し、ＧＳＴ融合体として発現させた。ＴＥＶ切断によるＧＳＴの除去及びＳ７５サイズ排除クロマトグラフィーの後で、変異体３７は、酸化条件下で、自発的にホモダイマーを形成し始めた（図１５）。図１５は、シャガシンＶＥＧＦ変異体３７及び６６についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及び結合反応速度を示す。シャガシン変異体３７は、酸化条件下では、ダイマーを形成するが、これは、還元条件下では、モノマーへと分離され得る。何れの結合剤の結合反応速度も、ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４上で、ビオチニル化されたＶＥＧＦ１０９をロードしたＳＡセンサーチップで測定した。何れの結合剤も、遅い解離速度を示したが、ダイマーであるシャガシン変異体３７は、二相性であった。
ｇ３上でアンバー終止コドンを伴ってディスプレイされ、ランダム化されたループの何れにおいてもシステインを含有しない、唯一のクローン（クローン６６）が見出された。Ｅｘｉｐｒｏｇｅｎ（商標）を使用して、シャガシン変異体６６を、小スケールで産生し、ＢＬＩにより、ＶＥＧＦへの結合について査定した。このクローンは、２桁のナノモル結合剤を指し示す、結合反応速度曲線を示した（図１５）。
大スケールのタンパク質の発現及び精製の後で、シャガシン変異体６６は、溶解度が限られ、細胞ベースの実験及び親和性の測定に必要とされる濃度で沈殿することが分かった。クローン６６の配列に基づく、各変異体が、ループＬ２及びＬ４において、単一のランダム化された位置だけを同時に含有し、２０アミノ酸のうちの何れかを組み込むことを可能とする（「ＮＮＫウォーク」）、２つの新たなファージライブラリーをデザインした。ライブラリーを、親和性成熟手順において既に記載した通りに、２ラウンドわたりパニングし、最終回の分取に由来する、２００個のランダムクローンを、ＤＮＡの配列決定及び解析のために選択した。配列解析に基づき、Ｌ２及びＬ４における２個チロシン残基を、配列決定されたクローンにおけるそれらの存在度に基づき、第２段階として選び出された、他の残基で個別に置きかえた。４つの新たなクローン（６６−Ｌ２−Ｋ、６６−Ｌ４−Ｑ、６６−Ｌ４−Ｔ、６６−Ｌ４−Ｓ）を、上記で記載した通りに、ＧＳＴ融合体として発現させ、精製し、ＴＥＶ切断により、個別のシャガシン変異体を得た。上記で記載した通りに、ＶＥＧＦ１０９に対するそれらの親和性も、Ｏｃｔｅｔにより測定し、それらの阻害活性も、細胞ベースのアッセイにおいて調べた。これらの変異体の測定されたデータを、下記の表１１に列挙する。
上述の実施例は、例示的な目的のためだけに提示されるものであり、いかなる形であれ、本発明の範囲を限定することを意図とするものではない。前出の記載から、当業者には、本明細書で示され、記載されている変更に加えて、本発明の多様な変更が明らかとなり、これらは、付属の特許請求の範囲内に収まるであろう。
実施態様の一覧
１． 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）及び／又はループ６（Ｌ６）に少なくとも１個のアミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
２． 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤が、クルーズトリパノソーマ（Ｄｍ２８ｃクローン）、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）、クルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）、ブルセイトリパノソーマ、メキシコリーシュマニア、森林型熱帯リーシュマニア、赤痢アメーバ又は緑膿菌に由来する、実施態様１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
３． 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤が、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）又はヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する、実施態様１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４． 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤が、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するクルーズトリパノソーマ（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）である、実施態様２又は３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５． Ｌ２が、アミノ酸配列Ｘ５−８−ＧＦ（配列番号１５１）を含み、Ｘが、何れかのアミノ酸を表す、実施態様４に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＸ３−６−ＧＦ（配列番号１５２）を含み、Ｘが、何れかのアミノ酸を表す、実施態様５に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７． Ｌ４が、アミノ酸配列Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ（配列番号１５３）を含み、Ｘが、何れかのアミノ酸を表す、実施態様４から６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８． Ｌ６が、アミノ酸配列Ｘ３−１２（配列番号１５４）を含み、Ｘが、何れかのアミノ酸を表す、実施態様４から７の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９． Ｌ６が、アミノ酸配列Ｘ１０（配列番号１０６）を含み、Ｘが、何れかのアミノ酸を表す、実施態様８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０． 配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様４から９の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１１． 標的リガンドに特異的に結合する、実施態様１から１０の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１２． 標的リガンドが、タンパク質、核酸、多糖、リポ多糖、脂質又はリン脂質である、実施態様１１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１３． 標的リガンドが、タンパク質である、実施態様１２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１４． タンパク質が、細胞表面タンパク質、可溶型タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、眼性疾患に関連するタンパク質、がんに関連するタンパク質、骨疾患に関連するタンパク質、炎症に関連するタンパク質又は治療用タンパク質である、実施態様１３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１５． タンパク質が、ＬＲＰ６である、実施態様１３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１６． タンパク質が、ＶＥＧＦである、実施態様１３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１７． 治療剤にコンジュゲートされた、実施態様１から１６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１８． 標識にコンジュゲートされた、実施態様１から１６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１９． 標識が、放射性同位体、蛍光性色素及び酵素からなる群から選択される、実施態様１８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
２０． 実施態様１から１６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする、単離された核酸。
２１． 実施態様２０に記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
２２． 実施態様２１に記載の発現ベクターを含む細胞。
２３． 実施態様１から１６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、実施態様２２に記載の細胞を培養することと、細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することとを含む方法。
２４． 実施態様１から１６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を化学的に合成することを含む方法。
２５． 実施態様１から１６の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
２６． 実施態様１から１６の何れか一つに記載の複数の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むポリペプチドディスプレイライブラリー。
２７． 天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌又は酵母細胞の表面上にディスプレイされる、実施態様２６に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
２８． 天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、バクテリオファージ上にディスプレイされる、実施態様２７に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
２９． バクテリオファージが、繊維状バクテリオファージである、実施態様２８に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
３０． 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３ファージである、実施態様２９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
３１． 約１０８から約１０１４の間の配列多様性を有する、実施態様２６から３０の何れか一つに記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
３２． 実施態様２６から３１の何れか一つに記載のポリペプチドディスプレイライブラリーをコードする核酸分子。
３３． 実施態様３２に記載の核酸分子に動作可能に連結された発現ベクター。
３４． 標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得る方法であって、
（ａ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を可能にする条件下で、実施態様２６から３１の何れか一つに記載のライブラリーと標的リガンドとを接触させることと、
（ｂ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を検出することと、
（ｃ）複合体から、標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得ることと
を含む方法。
３５． 工程（ｃ）において得られる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６をランダム化して、さらにランダム化された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を作製することと、前記さらにランダム化された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して工程（ａ）及び（ｂ）を反復することとをさらに含む、実施態様３４に記載の方法。
３６． ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
３７． ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
３８． 配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、実施態様３６又は３７の何れか一つに記載のヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
３９． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、配列番号３−５、７８−８０及び１４６の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号７−９、７７及び８１−８３の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号１１−１３、８４−８６及び１４７の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４０． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＱＴ（配列番号３）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＫＶＫＧＶＰＧＦ（配列番号７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＴＧＡＳＱＥＰ（配列番号１１）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４１． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＫＩＫＧＩＰＧＦ（配列番号８）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＲＰＳＴＧＰＳＤＤＳ（配列番号１２）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４２． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＶＤ（配列番号５）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＰＲＶＫＧＡＹＬＶＭ（配列番号１３）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４３． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＹＮＮＩＲＧＬＰＧＦ（配列番号８１）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ（配列番号８４）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４４． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＳＣ（配列番号７９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号８２）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＳＰＹＹＧＰＴＫＶＥ（配列番号８５）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４５． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＡＤ（配列番号８０）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＹＴＫＨ（配列番号８３）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＰＲＥＫＧＳＳＬＶＭ（配列番号８６）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４６． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＡＤ（配列番号１４６）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＲＲＥＫＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４７）を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４７． 配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４８． 配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
４９． 配列番号１７に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５０． 配列番号８７に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５１． 配列番号８８に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５２． 配列番号８９に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５３． 配列番号１４９に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５４． ５００ｎＭから１ｐＭの間のＫｄでヒトＬＲＰ６に結合する、実施態様３６から５３の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５５． ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン由来タンパク質が、Ｗｎｔ１シグナル伝達を阻害する、実施態様３６から５４の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５６． ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５７． ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５８． アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、実施態様５６又は５７に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
５９． Ｌ２が、配列番号１８−２２の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号２４−２８の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号３０−３４の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６０． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＬＲＳＭ（配列番号１８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＡＧＰＳＡＶＰＬ（配列番号２４）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＲＧＰＡＮＶＩ（配列番号３０）を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６１． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＤＰＧＳＲＬＳ（配列番号２５）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号３１）を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６２． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＬＱＮＡ（配列番号２０）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＬＳＬＹＡＳＥＴ（配列番号２６）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＮＰＮＷＧＰＤＹＷＩ（配列番号３２）を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６３． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＬＱＤＳ（配列番号２１）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＧＴＴＧＫＳＮ（配列番号２７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＦＫＳＲＧＬＭＶＰＬ（配列番号３３）を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６４． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＲＤＳ（配列番号２２）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＶＲＡＧＱＡＮＥ（配列番号２８）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＳＰＶＬＧＰＲＦＷＬ（配列番号３４）を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６５． 配列番号３６に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６６． 配列番号３７に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６７． 配列番号３８に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６８． 配列番号３９に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
６９． 配列番号４０に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７０． ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７１． ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７２． 配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、実施態様７０又は７１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７３． Ｌ２が、配列番号１９及び４２−４８の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号５０−５７の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号５９−６６の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７４． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＤＤＰＧＳＧＬＷ（配列番号５０）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＹＬ（配列番号５９）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７５． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＥ（配列番号４２）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＧＰＧＬＧＶＹ（配列番号５１）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＱＧＰＳＲＥＬ（配列番号６０）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７６． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＶＮＧＳＨＡＷ（配列番号５２）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＦＬ（配列番号６１）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７７． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＣＤ（配列番号４４）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＹＰＧＳＧＶＬ（配列番号５３）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＦＧＰＳＲＶＬ（配列番号６２）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７８． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＮＤ（配列番号４５）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＧＳＳＹＷＧ（配列番号５４）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＡＧＰＳＲＶＬ（配列番号６３）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
７９． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＧＳＹＭＳＹＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＤＬ（配列番号６４）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８０． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＲＥ（配列番号４７）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＶＱＷＧＷ（配列番号５６）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＶＧＰＳＲＥＬ（配列番号６５）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８１． Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８２． 配列番号６９に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８３． 配列番号７０に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８４． 配列番号７１に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８５． 配列番号７２に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８６． 配列番号７３に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８７． 配列番号７４に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８８． 配列番号７５に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
８９． 配列番号７６に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９０． ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９１． ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９２． 配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、実施態様９０又は９１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９３． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、配列番号４８及び１１０の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号５７及び１１１−１１３の何れか１つに記載されているアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号６６に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９４． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＫＤ（配列番号１１０）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９５． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＱＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１１）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９６． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＳＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１２）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９７． 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＴＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１３）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９８． 配列番号１１６に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
９９． 配列番号１１７に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１００． 配列番号１１８に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０１． 配列番号１１９に記載されているアミノ酸配列を含む、実施態様９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０２． ５００ｎＭから１ｐＭの間のＫｄでヒトＶＥＧＦに結合する、実施態様５６から１０１の何れか一つに記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０３． ホモダイマーを形成する、実施態様７７又は８５に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０４． 治療剤にコンジュゲートされた、実施態様３６から５５の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様５６から１０３の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０５． 標識にコンジュゲートされた、実施態様３６から５５の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様５６から１０３の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０６． 標識が、放射性同位体、蛍光性色素及び酵素からなる群から選択される、実施態様１０５に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又はＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
１０７． 実施態様３６から５５の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様５６から１０３の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
１０８． 実施態様１０７に記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
１０９． 実施態様１０８に記載の発現ベクターを含む細胞。
１１０． 実施態様３６から５５の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様５６から１０３の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、実施態様１０９に記載の細胞を培養することと、細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することとを含む方法。
１１１． 実施態様３６から５５の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様５６から１０３の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、ＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又はＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を化学的に合成することを含む方法。
１１２． 実施態様３６から５５、１０５及び１０６の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を患者由来の試料に接触させ、ＬＲＰ６タンパク質に結合された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を検出することにより、患者由来の試料におけるＬＲＰ６タンパク質を検出する方法。
１１３． 実施態様５６から９５、１０５及び１０５の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を患者由来の試料に接触させ、ＶＥＧＦタンパク質に結合された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を検出することにより、患者由来の試料におけるＶＥＧＦタンパク質を検出する方法。
１１４． 天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される、実施態様１１２又は１１３に記載の方法。
１１５． 実施態様３６から５５及び１０４の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
１１６． 実施態様５６から９５及び１０４の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
１１７． 対象におけるがん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患を治療する方法であって、実施態様３６から５５及び１０４の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様１１５に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
１１８． がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患の治療における使用のための、実施態様３６から５５及び１０４の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物。
１１９． がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患の治療における使用のための、実施態様１１５に記載の組成物。
１２０． がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、実施態様３６から５５及び１０４の何れか一つに記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様１１５に記載の組成物の使用。
１２１． 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出を抑制する方法であって、実施態様５６から９５及び１１６の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様１０８に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
１２２． 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患を治療する方法であって、実施態様５６から９５及び１０４の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様１１６に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
１２３． 疾患が、がん、眼性疾患又は炎症性疾患である、実施態様１２２に記載の方法。
１２４． 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患の治療における使用のための、実施態様５６から９５及び１０４の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物。
１２５． 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患の治療における使用のための、実施態様１１６に記載の組成物。
１２６． 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患を治療するための医薬の製造における、実施態様５６から９５及び１０４の何れか一つに記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は実施態様１１６に記載の組成物の使用。

Claims (126)

  1. 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤を参照して、ループ２（Ｌ２）、ループ４（Ｌ４）及び／又はループ６（Ｌ６）に少なくとも１個のアミノ酸改変を含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  2. 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤が、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）（Ｄｍ２８ｃクローン）、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム２）、ブルセイトリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）、メキシコリーシュマニア（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）、赤痢アメーバ（Ｅ．ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ）又は緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する、請求項１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  3. 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤が、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞表面糖タンパク質、ヒトインターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１ Ｒ１）又はヒト血管細胞接着分子−１（Ｖｃａｍ−１）に由来する、請求項１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  4. 野生型シャガシン様システインプロテアーゼ阻害剤が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するクルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）（ＣＬ Ｂｒｅｎｎｅｒ株、アイソフォーム１）である、請求項２又は３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  5. Ｌ２が、アミノ酸配列Ｘ５−８−ＧＦ（配列番号１５１）を含み、Ｘが何れかのアミノ酸を表す、請求項４に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  6. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＸ３−６−ＧＦ（配列番号１５２）を含み、Ｘが何れかのアミノ酸を表す、請求項５に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  7. Ｌ４が、アミノ酸配列Ｘ７−１５−ＧＡＧＧ（配列番号１５３）を含み、Ｘが何れかのアミノ酸を表す、請求項４から６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  8. Ｌ６が、アミノ酸配列Ｘ３−１２（配列番号１５４）を含み、Ｘが何れかのアミノ酸を表す、請求項４から７の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  9. Ｌ６が、アミノ酸配列Ｘ１０（配列番号１０６）を含み、Ｘが何れかのアミノ酸を表す、請求項８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  10. 配列番号２に表記されているアミノ酸配列を含む、請求項４から９の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  11. 標的リガンドに特異的に結合する、請求項１から１０の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  12. 標的リガンドが、タンパク質、核酸、多糖、リポ多糖、脂質又はリン脂質である、請求項１１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  13. 標的リガンドがタンパク質である、請求項１２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  14. タンパク質が、細胞表面タンパク質、可溶型タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、眼性疾患に関連するタンパク質、がんに関連するタンパク質、骨疾患に関連するタンパク質、炎症に関連するタンパク質又は治療用タンパク質である、請求項１３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  15. タンパク質がＬＲＰ６である、請求項１３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  16. タンパク質がＶＥＧＦである、請求項１３に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  17. 治療剤にコンジュゲートされた、請求項１から１６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  18. 標識にコンジュゲートされた、請求項１から１６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  19. 標識が、放射性同位体、蛍光性色素及び酵素からなる群から選択される、請求項１８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  20. 請求項１から１６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする、単離された核酸。
  21. 請求項２０に記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
  22. 請求項２１に記載の発現ベクターを含む細胞。
  23. 請求項１から１６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、請求項２２に記載の細胞を培養すること、及び細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することを含む、方法。
  24. 請求項１から１６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を化学的に合成することを含む、方法。
  25. 請求項１から１６の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
  26. 請求項１から１６の何れか一項に記載の複数の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含むポリペプチドディスプレイライブラリー。
  27. 天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌又は酵母細胞の表面上にディスプレイされる、請求項２６に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
  28. 天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、バクテリオファージ上にディスプレイされる、請求項２７に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
  29. バクテリオファージが、繊維状バクテリオファージである、請求項２８に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
  30. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３ファージである、請求項２９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
  31. 約１０８から約１０１４の間の配列多様性を有する、請求項２６から３０の何れか一項に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
  32. 請求項２６から３１の何れか一項に記載のポリペプチドディスプレイライブラリーをコードする核酸分子。
  33. 請求項３２に記載の核酸分子に動作可能に連結された発現ベクター。
  34. 標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得る方法であって、
    （ａ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を可能にする条件下で、請求項２６から３１の何れか一項に記載のライブラリーと標的リガンドとを接触させること、
    （ｂ）天然に存在しないシャガシン足場タンパク質：標的リガンド複合体の形成を検出すること、及び
    （ｃ）複合体から、標的リガンドに特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を得ること
    を含む方法。
  35. 工程（ｃ）において得られる天然に存在しないシャガシン足場タンパク質のＬ２、Ｌ４及び／又はＬ６をランダム化して、さらにランダム化された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を作製することと、前記さらにランダム化された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を使用して工程（ａ）及び（ｂ）を反復することとをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  37. ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＬＲＰ６に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  38. 配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＰ−Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｑ−Ｔ／Ｃ／Ｄ（配列番号１５０）又はＳＮ−Ｖ／Ａ−Ｄ（１５５）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ｙ／Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｋ−Ｉ／Ｖ−Ｒ／Ｋ−Ｇ−Ｌ／Ｖ／Ｉ−ＰＧＦ（配列番号１５６）又はＳＮ−Ｙ／Ｓ−ＴＫ−Ｈ／Ｒ（配列番号１５７）又はＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号７７）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｇ−Ｐ／Ｒ−Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｓ／Ｖ−Ｔ／Ｙ／Ｋ／Ｔ−Ｇ−Ｐ／Ｓ／Ａ−Ｓ／Ｔ／Ｙ−Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｄ−Ｄ／Ｖ／Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｖ（配列番号１４８）を含むＬ６とを含む、請求項３６又は３７の何れか一項に記載のヒトＬＲＰ６に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  39. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、配列番号３−５、７８−８０及び１４６の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号７−９、７７及び８１−８３の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号１１−１３、８４−８６及び１４７の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  40. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＱＴ（配列番号３）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＫＶＫＧＶＰＧＦ（配列番号７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＴＧＡＳＱＥＰ（配列番号１１）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  41. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＫＩＫＧＩＰＧＦ（配列番号８）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＲＰＳＴＧＰＳＤＤＳ（配列番号１２）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  42. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＶＤ（配列番号５）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＰＲＶＫＧＡＹＬＶＭ（配列番号１３）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  43. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＴＴ（配列番号４）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＹＮＮＩＲＧＬＰＧＦ（配列番号８１）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＲＰＷＴＧＰＳＨＤＳ（配列番号８４）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  44. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＳＣ（配列番号７９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＤＳＮＥＩＷＹＣ（配列番号８２）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＳＰＹＹＧＰＴＫＶＥ（配列番号８５）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  45. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＰＡＤ（配列番号８０）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＹＴＫＨ（配列番号８３）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＰＲＥＫＧＳＳＬＶＭ（配列番号８６）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  46. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＡＤ（配列番号１４６）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＮＳＴＫＲ（配列番号９）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＲＲＥＫＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４７）を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  47. 配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  48. 配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  49. 配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  50. 配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  51. 配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  52. 配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  53. 配列番号１４９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  54. ５００ｎＭから１ｐＭの間のＫｄでヒトＬＲＰ６に結合する、請求項３６から５３の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  55. ＬＲＰ６に特異的に結合するシャガシン由来タンパク質が、Ｗｎｔ１シグナル伝達を阻害する、請求項３６から５４の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  56. ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  57. ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  58. アミノ酸配列ＳＮ−Ｌ／Ｙ−Ｒ／Ｆ／Ｑ−Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｄ−Ｍ／Ｄ／Ａ／Ｓ（配列番号２３）を含むＬ２と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｌ／Ｓ／Ｖ−Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｒ−Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｑ−Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ａ−Ｐ／Ｌ／Ｅ／Ｓ／Ｎ−Ｌ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ（配列番号２９）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｎ／Ｆ／Ｓ−Ｐ／Ｋ−Ｗ／Ｎ／Ｓ／Ｖ−Ｒ／Ｌ／Ｗ−Ｇ−Ｐ／Ｌ−Ａ／Ｓ／Ｄ／Ｍ／Ｒ−Ｎ／Ｒ／Ｙ／Ｖ／Ｆ−Ｖ／Ｗ／Ｐ−Ｉ／Ｌ（配列番号３５）を含むＬ６とを含む、請求項５６又は５７に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  59. Ｌ２が、配列番号１８−２２の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号２４−２８の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号３０−３４の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  60. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＬＲＳＭ（配列番号１８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＡＧＰＳＡＶＰＬ（配列番号２４）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＲＧＰＡＮＶＩ（配列番号３０）を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  61. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＤＰＧＳＲＬＳ（配列番号２５）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号３１）を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  62. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＬＱＮＡ（配列番号２０）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＬＳＬＹＡＳＥＴ（配列番号２６）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＮＰＮＷＧＰＤＹＷＩ（配列番号３２）を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  63. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＬＱＤＳ（配列番号２１）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＧＴＴＧＫＳＮ（配列番号２７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＦＫＳＲＧＬＭＶＰＬ（配列番号３３）を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  64. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＲＤＳ（配列番号２２）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＶＲＡＧＱＡＮＥ（配列番号２８）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＳＰＶＬＧＰＲＦＷＬ（配列番号３４）を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  65. 配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  66. 配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  67. 配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  68. 配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  69. 配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  70. ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  71. ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  72. 配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹ−Ｆ／Ｙ−Ｙ／Ｃ／Ｎ／Ｒ−Ｄ／Ｅ（配列番号４９）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）、Ｄ／Ｎ／Ｓ−Ｄ／Ｇ／Ｖ／Ｙ−Ｐ／Ｎ／Ｓ−Ｇ／Ｙ−Ｓ／Ｌ／Ｍ−Ｇ／Ｈ／Ｓ−Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｙ−Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｓ（配列番号５８）又はＧ／Ｈ−Ｓ／Ｖ−Ｓ／Ｑ−Ｙ／Ｗ−Ｗ／Ｇ−Ｇ／Ｗ（配列番号６８）を含むＬ４と、アミノ酸配列Ａ／Ｇ−ＰＷ−Ｓ／Ｑ／Ｆ／Ａ／Ｌ／Ｖ−ＧＰＳＲ−Ｙ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｄ−Ｌ（配列番号６７）を含むＬ６とを含む、請求項７０又は７１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  73. Ｌ２が、配列番号１９及び４２−４８の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号５０−５７の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号５９−６６の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  74. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＤＤＰＧＳＧＬＷ（配列番号５０）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＹＬ（配列番号５９）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  75. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＥ（配列番号４２）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＧＰＧＬＧＶＹ（配列番号５１）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＱＧＰＳＲＥＬ（配列番号６０）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  76. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＶＮＧＳＨＡＷ（配列番号５２）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＳＧＰＳＲＦＬ（配列番号６１）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  77. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＣＤ（配列番号４４）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＮＹＰＧＳＧＶＬ（配列番号５３）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＦＧＰＳＲＶＬ（配列番号６２）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  78. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＮＤ（配列番号４５）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＧＳＳＹＷＧ（配列番号５４）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＡＧＰＳＲＶＬ（配列番号６３）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  79. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＹＤ（配列番号１９）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＳＧＳＹＭＳＹＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＬＧＰＳＲＤＬ（配列番号６４）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  80. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＦＲＥ（配列番号４７）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＶＱＷＧＷ（配列番号５６）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＡＰＷＶＧＰＳＲＥＬ（配列番号６５）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  81. Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  82. 配列番号６９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  83. 配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  84. 配列番号７１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  85. 配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  86. 配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  87. 配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  88. 配列番号７５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  89. 配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  90. ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  91. ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質であって、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、結合に関して、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と競合し、ヒトＶＥＧＦに結合する第２の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  92. 配列番号２を参照して、アミノ酸配列ＳＮＹＹ−Ｙ／Ｋ−Ｄ（配列番号１１４）を含むＬ２と、アミノ酸配列ＨＹ−Ｙ／Ｑ／Ｓ／Ｔ−ＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１５）を含むＬ４と、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含むＬ６とを含む、請求項９０又は９１に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  93. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、配列番号４８及び１１０の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ４が、配列番号５７及び１１１−１１３の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ６が、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  94. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＫＤ（配列番号１１０）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＹＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号５７）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  95. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＱＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１１）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  96. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＳＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１２）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  97. 配列番号２を参照して、Ｌ２が、アミノ酸配列ＳＮＹＹＹＤ（配列番号４８）を含み、Ｌ４が、アミノ酸配列ＨＹＴＮＬＧＧＲＹＴ（配列番号１１３）を含み、Ｌ６が、アミノ酸配列ＧＰＷＬＧＰＳＲＶＬ（配列番号６６）を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  98. 配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  99. 配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  100. 配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  101. 配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  102. ５００ｎＭから１ｐＭの間のＫｄでヒトＶＥＧＦに結合する、請求項５６から１０１の何れか一項に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  103. ホモダイマーを形成する、請求項７７又は８５に記載の天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  104. 治療剤にコンジュゲートされた、請求項３６から５５の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項５６から１０３の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  105. 標識にコンジュゲートされた、請求項３６から５５の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項５６から１０３の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  106. 標識が、放射性同位体、蛍光性色素及び酵素からなる群から選択される、請求項１０５に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又はＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質。
  107. 請求項３６から５５の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項５６から１０３の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
  108. 請求項１０７に記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
  109. 請求項１０８に記載の発現ベクターを含む細胞。
  110. 請求項３６から５５の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項５６から１０３の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、請求項１０９に記載の細胞を培養することと、細胞培養物から天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を回収することとを含む方法。
  111. 請求項３６から５５の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項５６から１０３の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を産生する方法であって、ＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又はＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を化学的に合成することを含む方法。
  112. 請求項３６から５５、１０５及び１０６の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を患者由来の試料に接触させ、ＬＲＰ６タンパク質に結合された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を検出することにより、患者由来の試料におけるＬＲＰ６タンパク質を検出する方法。
  113. 請求項５６から９５、１０５及び１０５の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を患者由来の試料に接触させ、ＶＥＧＦタンパク質に結合された天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を検出することにより、患者由来の試料におけるＶＥＧＦタンパク質を検出する方法。
  114. 天然に存在しないシャガシン足場タンパク質が、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される、請求項１１２又は１１３に記載の方法。
  115. 請求項３６から５５及び１０４の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  116. 請求項５６から９５及び１０４の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  117. 対象におけるがん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患を治療する方法であって、請求項３６から５５及び１０４の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項１１５に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
  118. がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患の治療における使用のための、請求項３６から５５及び１０４の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物。
  119. がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患の治療における使用のための、請求項１１５に記載の組成物。
  120. がん、転移性疾患、骨粗鬆症、骨代謝疾患、ニューロン性疾患、神経変性疾患、関節リウマチ又は他の炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項３６から５５及び１０４の何れか一項に記載のＬＲＰ６に結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項１１５に記載の組成物の使用。
  121. 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出を抑制する方法であって、請求項５６から９５及び１１６の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項１０８に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
  122. 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患を治療する方法であって、請求項５６から９５及び１０４の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項１１６に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
  123. 疾患が、がん、眼性疾患又は炎症性疾患である、請求項１２２に記載の方法。
  124. 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患の治療における使用のための、請求項５６から９５及び１０４の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質を含む組成物。
  125. 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患の治療における使用のための、請求項１１６に記載の組成物。
  126. 対象における血管新生及び／又は血管透過性若しくは漏出によって特徴が明らかにされる疾患を治療するための医薬の製造における、請求項５６から９５及び１０４の何れか一項に記載のＶＥＧＦに結合する天然に存在しないシャガシン足場タンパク質又は請求項１１６に記載の組成物の使用。
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