CN103270045A - 用于调控wnt途径的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于调控Wnt信号传导途径的方法和组合物，特别是通过干扰Dkk1或SOST与LRP5和/或LRP6的结合来进行。

Description

用于调控WNT途径的方法和组合物

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年10月20日提交的美国临时申请No.61/394,840的权益，通过述及将其公开内容完整收入本文。

技术领域

一般而言，本发明涉及Wnt途径调节领域。更具体地说，本发明关注Wnt信号传导途径的调控剂及所述调控剂的用途。

背景

Wnt/β-联蛋白(catenin)信号传导途径从胚胎发育到成体器官稳态都是至关重要的，而且如果失调，能诱导范围从骨质疏松到癌症的疾病（1-4）。最初命名为int-1（5）的第一种Wnt基因是在1982年发现的，后来在果蝇中发现它的同系物Wg后重新归类为Wnt基因家族的基础成员（6，7）。在最近三十年内，已经鉴定了构成Wnt/β-联蛋白信号传导核心的蛋白质，它们规定这种途径的开关状态。在Wnt配体缺失下，细胞内β-联蛋白是由轴蛋白，APC，GSK3和CK1形成的复合物的一部分，该复合物磷酸化β-联蛋白并在由β-Trcp遍在蛋白化后将β-联蛋白靶向由蛋白酶体进行的降解（2）。Wnt/β-联蛋白信号传导由分泌的Wnt结合其共受体Frizzled（Fz）（8）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6（9，10）来启动。Wnt介导的Fz对LRP的结合诱导在细胞表面形成三元复合物（10，11），这导致蛋白质Dishevelled（Dvl）与Fz胞内域的联合及蛋白质激酶GSK3和CK1对LRP6C端PPPSPxS基序的磷酸化，将轴蛋白募集至质膜必需的两种事件（12-15）。Wnt介导的对轴蛋白的置换诱导β-联蛋白细胞质池的稳定，且容许其移位至细胞核，在那里它作为共转录因子与TCF/LEF联合起作用，激活Wnt靶基因的表达（2）。

Wnt/β-联蛋白途径与代谢病症（16），神经变性（17，18），和众多类型的癌症（1，2，4）已经联系起来。阻止完整β-联蛋白调节的APC蛋白突变和结肠直肠癌之间存在更加确定的联系（4，19，20）。特别注意LRP5和骨稳态之间的遗传关系。LRP5中的功能丧失突变引起常染色体隐性病症骨质疏松-假胶质瘤综合征（OPPG），其特征为低骨量，眼缺陷和骨折倾向（21）。相反，别的LRP5遗传表征揭示转变为高骨量密度表型的突变（22-24）。

在细胞表面，Wnt/β-联蛋白信号传导受到两组分泌性蛋白质的调节，作用模式截然不同。第一，可溶性Frizzled相关蛋白或FRP（25）具有与Frizzled受体的富含半胱氨酸域（CRD）相似的折叠（26）且通过直接结合Wnt蛋白来抑制Wnt/β-联蛋白途径。然而，第二种类型的Wnt结合抑制剂，Wnt抑制性因子（WIF）由一个WIF域和五个EGF域构成（27），这指示Wnt蛋白能与结构不同的抑制剂相互作用。第二类Wnt抑制剂由Dickkopf（Dkk）（28，29）和WISE/Sclerostin（30-32）蛋白质家族构成。这些蛋白质通过与Wnt直接竞争对其共受体LRP5和LRP6的结合来抑制Wnt/β-联蛋白信号传导途径（29，33）。Dkk1和Sclerostin（SOST）都显示出通过LRP5直接涉及骨生长调节。特别地，Sclerostin功能丧失对硬化性骨化病和Van Buchem病负有责任（34，35）；在这些状况中观察到的罕见致密且坚固的骨与由LRP5功能获取突变引起的hBMD表型相似。尚未发现引起相当效应的Dkk1突变，尽管Dkk1在鼠骨发育中的功能与Sclerostin相当（36）。

当前，甲状旁腺素（PTH）代表唯一得到FDA批准、市场上可得的骨形成产品，但是PTH已经与安全性问题诸如高钙血症和骨肉瘤联系起来（37）。其它治疗诸如双膦酸盐和靶向核因子-_KB的受体激活剂（RANKL）的抗体靶向具有降低骨再吸收效应的破骨细胞亚型（38）。或者，Wnt/β-联蛋白信号传导途径刺激成骨细胞发生（39），因此，对Wnt信号传导的刺激能诱导骨形成（40）。对于倾向于骨折，骨质疏松和类风湿性关节炎的老年人群，需要安全且治疗有效的骨同化药。

概述

本发明提供调控Wnt途径的化合物和使用该化合物的方法。本发明的一个发明提供提供一种抑制Dkk1和/或SOST对LRP6和/或LRP5的结合的化合物。在一个实施方案中，该化合物不抑制Wnt对LRP6和/或LRP6的结合。在一个实施方案中，该化合物不抑制Wnt9B对LRP6和/或LRP5的结合。

本发明的一个发明提供一种分离的肽，其包含氨基酸序列X₀X₁X₂X₃，其中X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；和X₃为K，R或H。在一个实施方案中，该肽包含氨基酸序列X₁X₀X₁X₂X₃X₄，其中X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，该肽包含选自下组的氨基酸序列：NX₁IK，NX₁VK，NX₁IR，NX₁VR，NX₁IH和NX₁VH，其中X₁为A，S，F，T，Y。在一个实施方案中，该肽选自家族1（图1）的肽。在一个实施方案中，该肽的至少一个氨基酸用氨基酸类似物替代。在一个实施方案中，该肽包含氨基酸类似物。在一个实施方案中，该肽抑制Dkk1对LRP6的结合但不抑制Wnt9B对LRP6的结合。在一个实施方案中，该肽结合LRP6的E1β-螺旋桨。在一个实施方案中，该肽与LRP6的E1β-螺旋桨的氨基酸残基R28，E51，D52，V70，S71，E73，L95，S96，D98，E115，R141和N185中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个或全部相互作用。

本发明的一个方面提供一种分离的环肽，其包含氨基酸序列：X₀X₁X₂X₃，其中X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；且X₃为K，R或H。在一个实施方案中，该环肽包含氨基酸序列X_-1X₀X₁X₂X₃X₄，其中X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，该环肽包含选自下组的氨基酸序列：NX₁IK，NX₁VK，NX₁IR，NX₁VR，NX₁IH和NX₁VH，其中X₁为F，Y，L，A，R或S。在一个实施方案中，该环肽选自家族2（图2）的肽。在一个实施方案中，该环肽的至少一个氨基酸用氨基酸类似物替代。在一个实施方案中，该环肽包含氨基酸类似物。在一个实施方案中，该环肽抑制Dkk1对LRP6的结合但不抑制Wnt9B对LRP6的结合。在一个实施方案中，该环肽结合LRP6的E1β-螺旋桨。在一个实施方案中，该环肽与LRP6的E1β-螺旋桨的氨基酸残基R28，E51，D52，V70，S71，E73，L95，S96，D98，E115，R141和N185中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个或全部相互作用。

本发明的一个方面提供一种分离的肽，其包含氨基酸序列：X_-1X₀X₁X₂，其中X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；且X₂为M。在一个实施方案中，该肽包含氨基酸序列：X_-2X_-1X₀X₁X₂X₃，其中X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，该肽选自家族3（图3）的肽。

本发明的一个方面提供一种分离的肽，其选自家族4（图4）的肽。

本发明的一个方面提供一种用于筛选抑制Dkk1和LRP6的相互作用的化合物的方法，其包括使测试化合物与LRP6或其功能性等同物接触，并在抑制Dkk1与LRP6相互作用的肽配体存在和缺失下测定该测试化合物对该LRP6或其功能性等同物的结合水平，其中在该肽配体存在或缺失下结合水平的变化指示该测试化合物抑制Dkk1与LRP6相互作用，且其中该肽配体包含选自下组的氨基酸序列：a）家族1（图1）的氨基酸序列；b）家族2（图2）的氨基酸序列；c）家族3（图3）的氨基酸序列；和d）家族4（图4）的氨基酸序列。在一个实施方案中，该肽配体用可检测标记物标记。

本发明的一个方面提供一种用于筛选抑制Dkk1和LRP5的相互作用的化合物的方法，其包括使测试化合物与LRP5或其功能性等同物接触，并在抑制Dkk1与LRP5相互作用的肽配体存在和缺失下测定该测试化合物对该LRP5或其功能性等同物的结合水平，其中在该肽配体存在或缺失下结合水平的变化指示该测试化合物抑制Dkk1与LRP5相互作用，且其中该肽配体包含选自下组的氨基酸序列：a）家族1（图1）的氨基酸序列；b）家族2（图2）的氨基酸序列；c）家族3（图3）的氨基酸序列；和d）家族4（图4）的氨基酸序列。在一个实施方案中，该肽配体用可检测标记物标记。

附图简述

图1。家族1的例示性肽。

图2。家族2的例示性肽。

图3。家族3的例示性肽。

图4A-C。家族4的例示性肽。

图5。CDR H3与LRP6沟的残基的相互作用的详细视图，显示了由NAVK序列进行的相互作用的网络。

图6。由H3以外的抗体CDR进行的相互作用的详情。

图7。（A）来自Dkk1，Dkk2，Dkk4，Sclerostin和Wise的一级序列的比对。（B）基于具有“NXI”基序的蛋白质的肽的实例。

图8。Dkk1和其它Wnt途径抑制剂之间的竞争结合。将所示LRP6构建物预加载到生物传感器尖端上。将Dkk1（100nM）（或缓冲液对照）和测试配体（100nM）序贯加载到LRP6尖端上。（A）Dkk2与Dkk1的竞争。（B）Sclerostin与Dkk1的竞争。相对于缓冲液对照显示了在Dkk1存在下的百分比结合。

图9。Wnt抑制剂Dkk1和sclerostin中的结合决定子。（A）“NXI”基序的保守Asn和Ile残基对于Dkk1和sclerostin结合LRP6E1E2是重要的。（B）Dkk1具有两个独立的结合区，一个识别LRP6E1E2，一个识别LRP6E3E4。“NXI”基序中的替代（N40A，I42E）影响对LRP6E1E2的结合，但不影响对E3E4的结合，而C端富含半胱氨酸域中的替代（H204E，K211E）影响对LRP6E3E4的结合，但不影响对E1E2的结合。在每一种情况中，突变蛋白保留对LRP6E1E4的结合。

图10。描绘通过SEC-MALS研究的不同Dkk1-LRP6E1E4复合物和可能的相互作用模型的卡通图。显示了各个分子或复合物的预测分子量，下面显示了实验观察重量。观察分子量与LRP6E1E4和每种Dkk1变体之间的1:1复合物形成一致。数据与模型3（显示2:1化学计量）不一致。数据改为与模型4（其中一个Dkk1分子能桥接两个LRP6结合位点）或模型5/6（其中结合的Dkk1只能接近一个或另一个位点）一致。

图11。在Dkk1或sclerostin存在或缺失下Wnt对LRP6E1E4的结合。Dkk1（125nM）抑制Wnt3A和Wnt9B二者的结合（各为125nM），而sclerostin（125nM）只抑制Wnt9B的结合。

图12。在野生型和突变型抑制剂存在或缺失下对Wnt/β-联蛋白报告物的诱导。用Wnt1（结合LRP6E1E2）转染细胞。以所示剂量使用Dkk1和sclerostin变体或对照抑制剂Fz8CRD。

图13。将LRP5BMD替代引入LRP6E1E2中降低对Wnt抑制剂的亲和力。在y轴上标示了表征的五处替代。关于Wnt9b，Dkk1，和sclerostin对每一种LRP6变体的结合进行了稳态亲和力测量。对Wnt9b的结合的差异是微小的（与野生型相比变化≤5倍），而对Dkk1和sclerostin的结合受到更加显著的影响（与野生型相比亲和力损失10-250倍）。

图14。自线性和环肽文库针对LRP6E1E2选择的噬菌体克隆中存在的保守基序。（A）例示性家族1的线性肽。（B）例示性家族2的环肽。

图15。自线性和环肽文库针对LRP5E1选择的噬菌体克隆中存在的保守基序。（A）例示性家族3的线性肽。（B）例示性家族4的环肽。

图16。LRP6E1和自噬菌体展示文库发现的肽的共晶体结构。（A）肽Ac-SNSIKFYA-am，来自例示性家族1。（B）肽Ac-GSLCSNRIKPDTHCSS-am（二硫化物），例示性家族2的CX9C类成员。（C）肽Ac-CNSIKLC-am（二硫化物），例示性家族2的CX₅C类成员。（D）肽Ac-CNSIKCL-am（二硫化物），例示性家族2的CX₄C类成员。

图17。Dkk17聚物肽的结构-活性研究。通过标准Fmoc规程合成所示肽，并如实施例1所述测定IC50值。（A）C端和N端截短。（B）“NXI”基序的位置“X”处的替代。

图18A和B。Dkk17聚物肽的结构-活性研究，显示了N，S，I，和K残基的替代的影响。通过标准Fmoc规程合成所示肽，并如实施例1所述测定IC50值。

图19。来自例示性家族1的线性肽的结构-活性研究。“NXI”基序的Ile位置中进行替代。通过标准Fmoc规程合成所示肽，并如实施例1所述测定IC50值。

图20。将“NXI”表位转移至结构化肽支架。（A）结构化模拟物的设计。来自抗体复合物结构的残基N100-V100b覆盖在Bowmain-Birk抑制性（BBI）环肽的一种代表性结构（PDB代码1GM2）（42）上。除分支疏水残基前面的酰胺键旋转之外，肽的构象是相似的。三残基基序的侧链β-碳的位置重合。显示了BBI环模板和含“NXI”BBI模拟物的序列。（B）BBI模拟物结合LRP6E1，而缺少保守Asn的对照肽不结合。

图21。Dkk17聚物肽的酰胺环化变体的设计。（A）顶部显示取自与LRP6E1的复合物的Dkk1肽的结构。Ser2的侧链指向Asn7的侧链，之间有短间隙。下面是Ser2被Lys且Asn7被Asp替代的模型。侧链通过通过Lysε-胺和Asp羧酸根之间的酰胺键连接。（B）竞争结合数据指示环化肽结合LRP6E1。

图22。LRP6E1结合肽抑制Wnt抑制剂结合LRP6E1E2，但不抑制Wnt9B结合LRP6E1E2。通过生物层干扰测量来评估结合，如实施例1所述。将固定化LRP6E1E2暴露于以比E1E2的测量解离常数高三倍的浓度存在于溶液中的蛋白质配体（Wnt9b，Dkk1或sclerostin）。以饱和水平（比测量IC50值高20倍）添加竞争肽。肽A：Ac-NSNAIKN-am；肽B：Ac-CNSIKFCG-am（二硫化物）；肽C：Ac-GSLCSNRIKPDTHCSS-am（二硫化物）

发明详述

通用技术

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分阐述了这些技术，诸如“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,第二版(Sambrook et al.,1989);“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait,编,1984);“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,编,1987);“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.);“Current Protocols inMolecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,编,1987,及定期更新);“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,编,1994);“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)。

定义

本发明范围内的术语“氨基酸”以其最广义使用，而且意图包括天然称作L-氨基酸或残基。本文中使用天然存在氨基酸的常用单字母或三字母缩写(Lehninger,Biochemistry,2d ed.,pp.71-92,(Worth Publishers:New York,1975))。该术语包括D-氨基酸以及化学修饰氨基酸诸如氨基酸类似物、通常不掺入蛋白质中的天然存在氨基酸诸如正亮氨酸、和具有本领域知道是氨基酸特征性的特性的化学合成化合物。例如，氨基酸的定义内包括苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物，其容许与天然Phe或Pro相同的肽化合物构象限制。此类类似物和模拟物在本文中称作氨基酸的“功能性等同物”。Robertsand Vellaccio,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Eds.Gross andMeiehofer,Vol.5,p.341(Academic Press,Inc.:N.Y.1983)列出了氨基酸的其它例子。

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的化合物变体，诸如肽变体。保守替代在表1中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。

表1

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸, Met, Ala, Val, Leu, Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；

(3)酸性的：Asp, Glu；

(4)碱性的：His, Lys, Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly, Pro；

(6)芳香族的：Trp, Tyr, Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

合成肽（例如通过标准固相合成技术合成的）不限于由基因编码的氨基酸，且因此容许给定氨基酸的极其多种替代。不是由遗传密码编码的氨基酸在本文中称作“氨基酸类似物”，而且包括例如WO 90/01940中及下文表（表2）中记载的那些，以及例如用于Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad)；用于Glu和Asp的2-氨基庚二酸(Apm)；用于Met，Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基丁酸(Abu)；用于Met，Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基庚酸(Ahe)；用于Gly的2-氨基异丁酸(Aib)；用于Val、Leu和Ile的环己基丙氨酸(Cha)；用于Arg和Lys的高精氨酸(Har)；用于Lys，Arg和His的2,3-二氨基丙酸(Dap)；用于Gly，Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；用于Gly，Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；用于Asn和Gln的N-乙基天冬酰胺(EtAsn)；用于Lys的羟赖氨酸(Hyl)；用于Lys的别羟赖氨酸(AHyl)；用于Pro，Ser和Thr的3-(和4-)羟基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)；用于Ile，Leu和Val的别异亮氨酸(AIle)；用于Arg的4-脒基苯丙氨酸；用于Gly，Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)；用于Ile的N-甲基异亮氨酸(MeIle)；用于Met和其它脂肪族氨基酸的正缬氨酸(Nva)；用于Met和其它脂肪族氨基酸的正亮氨酸(Nle)；用于Lys，Arg和His的鸟氨酸(Orn)；用于Thr，Asn和Gln的瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSO)；和用于Phe的N-甲基苯丙氨酸(MePhe)，三甲基苯丙氨酸，卤代(F-，Cl-，Br-，或I-)苯丙氨酸，或三氟苯丙氨酸(triflourylphenylalanine)。

表2

可掺入本发明肽中的疏水性氨基酸类似物的例子 ¹

¹对应于实施例13中使用的非遗传编码的氨基酸。此列表并非穷尽式列举的，而是可以涵盖其它替代。

关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可经由Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。

除非另有具体说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

“分离的”化合物指已经与其天然环境的成分分开的化合物。在一些实施方案中，化合物（诸如肽）纯化至纯度大于95%或99%，如通过例如电泳（例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳）或层析（例如离子交换或反相HPLC）测定的。用于评估纯度的方法的综述参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染色体外形式存在的或在染色体上的定位不同于它其天然染色体定位。

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“重组载体”）。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖的糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR₂（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂（“甲缩醛”(formacetal)）替代，其中R或R'各自独立为H或者取代或未取代的烷基（1-20个C），任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。

如本文中使用的，术语“LRP6”指来自任何脊椎动物来源的任何天然LRP6，包括哺乳动物诸如灵长类动物（例如人）和啮齿类动物（例如小鼠和大鼠），除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工的LRP6以及源自细胞中加工的任何形式LRP6。该术语还涵盖LRP6的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。NCBI登录号AAI43726提供了一种例示性人LRP6的氨基酸序列，Strausberg,R.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903(2002)(He,X,et al.,Development,131:1663-1677(2004);Chen,M.,et al.,J.Biol.Chem.,284:35040-35048(2009))。

如本文中使用的，术语“LRP5”指来自任何脊椎动物来源的任何天然LRP5，包括哺乳动物诸如灵长类动物（例如人）和啮齿类动物（例如小鼠和大鼠），除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工的LRP5以及源自细胞中加工的任何形式LRP5。该术语还涵盖LRP5的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。NCBI登录号O75197提供了一种例示性人LRP5的氨基酸序列，Hey,P.J.,et al,Gene216(1),103-111(1998)。

在用于本文时，“治疗”（及其语法变化形式，诸如“处理”或“处置”）指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的化合物用于延迟疾病的发生/发展，或用于减缓疾病的进展。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（例如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性），而且还可以包括某些抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。

非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani andHamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

“病症”指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括通过Wnt信号传导来激活或抑制的过程的病症。此类过程包括例如细胞增殖、细胞命运规约、和不同癌症类型中的干细胞自我更新、和发育过程。本发明的化合物可用于例如治疗Wnt介导的骨或骨骼系统病症。可使用本发明的化合物来治疗的骨骼或骨病症的例子包括骨质疏松、骨关节炎、骨折、和骨损害和各种形式的骨退化。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

化合物和方法

Dickkopf（Dkk）和WISE/Sclerostin（SOST）蛋白质家族通过与Wnt直接竞争对其LRP5和LRP6共受体的结合来抑制Wnt/β-联蛋白信号传导途径。本文中提供调控Dkk1与LRP5和/或LRP6的相互作用的化合物和调控SOST与LRP5和/或LRP6的相互作用的化合物。在一些实施方案中，化合物调控Dkk1和SOST二者与LRP5和/或LRP6的相互作用。

在一个实施方案中，该化合物抑制Dkk1与LRP5和/或LRP6的相互作用。在一个实施方案中，该化合物抑制SOST与LRP5和/或LRP6的相互作用。在一个实施方案中，该化合物抑制Dkk1和SOST二者与LRP5和/或LRP6的相互作用。

在一个实施方案中，该化合物与Dkk1竞争对LRP6的结合。在一个实施方案中，该化合物与SOST竞争对LRP6的结合。在一个实施方案中，该化合物与Dkk1竞争对LRP5的结合。在一个实施方案中，该化合物与SOST竞争对LRP5的结合。在一个实施方案中，该化合物结合LRP6上的Dkk1结合位点。在一个实施方案中，该化合物结合LRP6上的SOST结合位点。在一个实施方案中，该化合物结合LRP5上的Dkk1结合位点。在一个实施方案中，该化合物结合LRP5上的SOST结合位点。在一个实施方案中，该化合物结合LRP6的E1β-螺旋桨。在一个实施方案中，该化合物结合LRP5的E1β-螺旋桨。在一个实施方案中，该化合物与LRP6的E1β-螺旋桨的氨基酸残基R28，E51，D52，V70，S71，E73，L95，S96，D98，E115，R141和N185中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个或全部相互作用。在一个实施方案中，该化合物与LRP5的E1β-螺旋桨的氨基酸残基R28，E63，D64，V82，S83，E85，V108，S109，D111，E128，R154和N198中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个或全部相互作用。通过直接结合Dkk1或SOST结合位点，该化合物提供一种调控与Dkk1和SOST结合有关的Wnt途径信号传导的靶向办法。在一个实施方案中，该化合物调控与Dkk1结合LRP5或LRP6有关的Wnt途径信号传导。在一个实施方案中，该化合物调控与SOST结合LRP5或LRP6有关的Wnt途径信号传导。在一个实施方案中，该化合物调控与Dkk1和/或SOST结合LRP5或LRP6有关的Wnt途径信号传导，不调控血清素途径。

在一些实施方案中，该化合物抑制Dkk1与LRP5和/或LRP6的相互作用且不抑制Wnt与LRP5或LRP6的相互作用。在一些实施方案中，该化合物抑制SOST与LRP5和/或LRP6的相互作用且不抑制Wnt与LRP5或LRP6的相互作用。在一个实施方案中，该Wnt为Wnt3a。在一个实施方案中，该Wnt为Wnt9b。这种选择性抑制用来防止抑制剂Dkk1或SOST对Wnt信号传导途径的抑制同时容许Wnt分子刺激该途径。结果是，该化合物用来促进与Wnt途径有关的骨生长和修复。在一些实施方案中，该化合物可用于治疗各种能受益于促进骨生长的骨骼病症（例如骨质疏松，类风湿性关节炎，骨降解降解或退化，其可以因许多状况（包括例如癌症，诸如多发性骨髓瘤）而发生），及治疗骨折或其它与低骨密度或低骨强度有关的骨缺陷。

在本发明的一个方面中，该化合物为肽。在一个实施方案中，该化合物为线性肽。在一个实施方案中，该线性肽长3到100，3到50，3到30，3到20，3到10，3到9，3到8，3到7，3到6，3到5或3到4个氨基酸。在一个实施方案中，该线性肽长4到10，5到8，6到7个氨基酸。在一个实施方案中，该线性肽长3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物为环肽。在一个实施方案中，该环肽长5到100，5到50，5到30，5到20，5到10，7到20，7到17，7到16，7到17，7到18，7到19或7到20个氨基酸。在一个实施方案中，该环肽长5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个氨基酸。

在又一个实施方案中，该肽为结构化肽或在没有结合靶物的情况中采取明确定义的构象的肽（过继性（adoptive）肽）。该肽采取的这种构象与该肽的结合状态结构的构象相似。在一些实施方案中，与未结构化肽相比，结构化肽或过继性肽具有增强的治疗功效。在一个实施方案中，与未结构化肽相比，结构化肽或过继性肽具有增强的靶物结合，增强的稳定性，和增强的生物利用度中的一项或多项特征。

在一个方面中，本发明提供家族1的线性肽，其包含氨基酸序列：X₀X₁X₂X₃，其中X₀为天冬酰胺（N）残基。家族1的肽结合LRP6的E1β-螺旋桨。在一些实施方案中，家族1的肽还结合LRP5。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；且X₃为K，R或H。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I；且X₃为K，R或H。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；且X₃为K。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为V；且X₃为K，R或H。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I；且X₃为K。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I；且X₃为R。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为V；且X₃为K。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为V；且X₃为R或H。

在其它实施方案中，家族1的线性肽进一步在X₀X₁X₂X₃的任一侧包含额外的氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明提供家族1的肽，其包含氨基酸序列：X_-1X₀X₁X₂X₃X₄，其中X₀为N。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；X₃为K；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，本发明提供家族1的肽，其包含氨基酸序列：X_-1X₀X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₀为N。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；X₃为K，R或H；X₄为F，T，Y，L或V；且X₅为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I；X₃为K，R或H；X₄为F，T，Y，L或V；且X₅为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；X₃为K；X₄为F，T，Y，L或V；且X₅为F，T，Y，L或V。

在一个实施方案中，家族1的肽包含选自下组的肽：NX₁IK，NX₁VK，NX₁IR，NX₁VR，NX₁IH和NX₁VH，其中X₁为A，S，F，T，Y，R或K。图1中显示了家族1的例示性肽。

在另一个方面中，本发明提供家族2的环肽，其包含氨基酸序列：X₀X₁X₂X₃，其中X₀为N。家族2的肽结合LRP6的E1β-螺旋桨。在一些实施方案中，家族2的肽还结合LRP5。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；且X₃为K，R或H。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I；且X₃为K，R或H。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；且X₃为K；X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I；且X₃为K。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I；且X₃为R。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为V；且X₃为K。在一个实施方案中，X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为V；且X₃为R。

在其它实施方案中，家族2的环肽进一步在X₀X₁X₂X₃的任一侧包含额外的氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明提供家族2的环肽，其包含氨基酸序列：X_-1X₀X₁X₂X₃X₄，其中X₀为N。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；X₃为K；且X₄为F，T，Y，L或V。在另一个实施方案中，本发明提供家族1的肽，其包含氨基酸序列：X₁X₀X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₀为N。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；X₃为K，R或H；X₄为F，T，Y，L或V；且X₅为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I；X₃为K，R或H；X₄为F，T，Y，L或V；且X₅为F，T，Y，L或V。在一个实施方案中，X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；X₃为K；X₄为F，T，Y，L或V；且X₅为F，T，Y，L或V。

在一个实施方案中，家族2的肽包含选自下组的肽：NX₁IK，NX₁VK，NX₁IR，NX₁VR，NX₁IH和NX₁VH，其中X₁为F，Y，L，A，R或S。

图2中显示了家族2的例示性肽。

在另一个方面中，本发明提供家族3的线性肽，其包含氨基酸序列：X_-1X₀X₁X₂，其中X₀为D或E且X₂为M。家族3的肽结合LRP5的E1β-螺旋桨。在一些实施方案中，X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；且X₂为M。在一个实施方案中，X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D；X₁为F，W，I，S或Y；且X₂为M。在一个实施方案中，X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-1为F；X₀为E；X₁为I；X₂为M；且X₃为W。

在其它实施方案中，家族3的线性肽进一步在X_-1X₀X₁X₂的任一侧包含额外的氨基酸残基。在一个实施方案中，家族3的线性肽包含氨基酸序列：X_-2X_-1X₀X₁X₂X₃，其中X₀为D或E且X₂为M。在一个实施方案中，X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-2为V；X_-1为F；X₀为E；X₁为I；X₂为M；且X₃为W。在另一个实施方案中，本发明提供家族3的线性肽，其包含氨基酸序列：X_-3X_-2X_-1X₀X₁X₂X₃，其中X₀为D或E且X₂为M。在一个实施方案中，X_-3为H，F，N或Q；X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-3为H，F，N或Q；X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-3为H，F，N或Q；X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。在一个实施方案中，X_-3为H；X_-2为V；X_-1为F；X₀为E；X₁为I；X₂为M；且X₃为W。

图3中显示了家族3的例示性肽。

在另一个方面中，本发明提供家族4的环肽。家族4的肽结合LRP5的E1β-螺旋桨。在一些实施方案中，本发明提供图4中显示的家族4的肽。

在一些实施方案中，本发明的肽以小于100uM，小于50uM，小于20uM，小于10uM，小于5uM，小于1uM，小于0.5uM，小于0.1uM或小于0.01uM的Kd结合它们的靶物。在一些实施方案中，本发明的肽以小于100uM，小于50uM，小于20uM，小于10uM，小于5uM，小于1uM，小于0.5uM，小于0.1uM或小于0.01uM的IC50结合它们的靶物。

在一些实施方案中，本发明的肽包含氨基酸类似物。在一些实施方案中，本发明的肽包含家族1，家族2，家族3和/或家族4的肽，其中该肽的至少一个氨基酸用氨基酸类似物替代。氨基酸类似物替代的具体例子包括但不限于2-氨基己二酸（Aad）用于Glu和Asp；2-氨基庚二酸（Apm）用于Glu和Asp；2-氨基丁酸（Abu）用于Met，Leu，和其它脂肪族氨基酸；2-氨基庚酸（Ahe）用于Met，Leu，和其它脂肪族氨基酸；2-氨基异丁酸（Aib）用于Gly；环己基丙氨酸（Cha）用于Val，Leu和Ile；高精氨酸（Har）用于Arg和Lys；2,3-二氨基丙酸（Dap）用于Lys，Arg，和His；N-乙基甘氨酸（EtGly）用于Gly，Pro，和Ala；N-乙基甘氨酸（EtGly）用于Gly，Pro，和Ala；N-乙基天冬酰胺（EtAsn）用于Asn，和Gln；羟基赖氨酸（Hyl）用于Lys；别羟基赖氨酸（AHyl）用于Lys；3-（和4-）羟基脯氨酸（3Hyp，4Hyp）用于Pro，Ser，和Thr；别异亮氨酸（AIle）用于Ile，Leu，和Val；4-脒基苯丙氨酸用于Arg；N-甲基甘氨酸（MeGly，肌氨酸）用于Gly，Pro，和Ala；N-甲基异亮氨酸（MeIle）用于Ile；正缬氨酸（Nva）用于Met和其它脂肪族氨基酸；正亮氨酸（Nle）用于Met和其它脂肪族氨基酸；鸟氨酸（Orn）用于Lys，Arg和His；瓜氨酸（Cit）和甲硫氨酸亚砜（MSO）用于Thr，Asn，和Gln；和N-甲基苯丙氨酸（MePhe），三甲基苯丙氨酸，卤代（F-，Cl-，Br-或I-）苯丙氨酸或三氟苯丙氨酸用于Phe。

本发明的化合物的更具体例子包括寡核苷酸（其可以是适体），抗体（包括但不限于多克隆和单克隆抗体和抗体片段，单链抗体，抗独特型抗体，和嵌合或人源化型式的此类抗体或片段，以及人抗体和抗体片段）。或者，该化合物可以是密切相关蛋白，例如突变形式的Dkk1或SOST，其识别LRP5或LRP6但不给予额外效应，由此竞争性抑制野生型Dkk1或SOST的作用。如上所述，在一些实施方案中，该化合物抑制Dkk1或SOST的作用但不抑制Wnt分子与LRP5或LPR6的相互作用。

本发明的别的化合物包括干扰Dkk1与LRP5和/或LRP6的相互作用或SOST与LRP5和/或LRP6的相互作用的小分子。小分子的例子包括但不限于肽样分子和合成非肽基有机或无机化合物。

这些小分子可通过任何一种或多种本文中讨论的筛选测定法和/或通过本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术来鉴定。

如本文中描述的，本发明的化合物可以是肽。获得此类肽的方法是本领域公知的，而且包括对肽文库筛选针对合适靶抗原的结合物。在一个实施方案中，合适的靶抗原会包含LRP5或LRP6（或其包含Dkk1或SOST结合位点的部分），这在本文中有详细描述。例如，一种合适的靶抗原为LRP6或LRP5的E1β-螺旋桨。肽的文库是本领域公知的，而且还可以依照现有方法来制备。参见例如Clark等人的美国专利No.6,121,416。与异源蛋白质成分（诸如噬菌体外壳蛋白）融合的肽的文库是本领域公知的，例如记载于Clark等人，见上文。可以通过筛选肽的突变体以获得感兴趣特征（例如增强的靶物结合亲和力，增强的药动学，降低的毒性，改进的治疗指数，等）来生成第一种肽结合物的变体。诱变技术是本领域公知的。而且，扫描诱变技术（诸如那些基于丙氨酸扫描的）尤其能帮助评估肽内各个氨基酸残基的结构和/或功能重要性。

载体构建

也可使用标准的重组技术获得编码本文所述肽的多核苷酸序列。期望的多核苷酸序列可分离并测序自合适的源细胞。抗体源细胞应包括抗体产生细胞，诸如杂交瘤细胞。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码免疫球蛋白的序列插入能在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。许多本领域可获得且已知的载体可用于本发明的目的中。合适载体的选择主要取决于要被插入到该载体中的核酸的大小以及要用该载体转化的特定宿主细胞。每种载体取决于其功能（异源多核苷酸的扩增或表达，或两者）以及其与所驻留的特定宿主细胞的相容性，都包含多种元件。载体元件通常包括但不限于：复制起点（特别是当载体插入原核细胞时）、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段及转录终止序列。

一般而言，包含衍生自与宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主联合使用。载体通常携带复制位点以及能在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用pBR322（一种来源于大肠杆菌物种的质粒）转化大肠杆菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因并因此提供了鉴定转化细胞的方便手段。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体还可包含或被修饰以包含能被微生物机体用于内源蛋白表达的启动子。

另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用作为这些宿主的转化载体。例如，在制备可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体中可利用噬菌体诸如λGEM.TM.-11。

根据本领域技术人员能确定的具体情况需要，组成型或诱导型启动子可用于本发明中。熟知为多种可能宿主细胞所识别的诸多启动子。通过经限制酶消化从源DNA上切下启动子并将分离的启动子序列插入所选的载体中，所选择的启动子能可操作地连接编码本文所述多肽的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。然而，优选异源启动子，因为同天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更多转录以及更高产量。

适合于原核宿主使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶(galactamase)和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，其他在细菌中有功能的启动子（例如其他已知的细菌或噬菌体启动子）同样适用。它们的核苷酸序列已公开，由此使得本领域技术人员得以使用接头或衔接头以提供任何需要的限制性位点可操作地将它们连接至编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等(1980)Cell20:269)。

在有些实施方案中，重组载体中的每一顺反子都包含指导所表达多肽穿膜易位的分泌信号序列元件。一般而言，该信号序列可以是载体的元件，或其可作为插入到载体中的靶多肽DNA的一部分。为了本发明的目的所选择的信号序列应当是一种为宿主细胞所识别并加工（即为信号肽酶所切割）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽自有信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列替换该信号序列。

适合于表达多肽的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的例子包括埃希氏菌属(Escherichia)（例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)）、芽孢杆菌属(Bacilli)（例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)）、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种（例如铜绿假单胞菌((P.aeruginosa)）、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏杆菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。优选地，使用革兰氏阴性细胞。优选地，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且期望额外的蛋白酶抑制剂可掺入细胞培养物中。

多肽生产

用上述表达载体转化或转染宿主细胞并在被改良适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。

转染指宿主细胞吸纳表达载体而无论任何编码序列是否事实上表达。本领域技术人员知道多种转染方法，例如CaPO₄沉淀和电穿孔。当任何该载体运转的指示出现在宿主细胞中时，通常认为是成功的转染。

转化意味着将DNA导入原核宿主中，使得该DNA或作为染色体外元件或整合入染色体从而可复制。取决于所使用的宿主细胞，使用适合于所述细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理通常用于包含坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法使用了聚乙二醇/DMSO。又一种被使用的技术是电穿孔。

用于产生本发明多肽的原核细胞在本领域已知且适合于所选择的宿主细胞培养的培养基中培养。合适的培养基的例子包括添加必需营养补充物的Luria培养基(LB)。在优选的实施方案中，该培养基还含有选择剂，基于表达载体的构建进行选择以选择性容许含该表达载体的原核细胞生长。例如，添加氨苄青霉素到培养基用于表达氨苄青霉素抗性基因细胞的生长。

还可包括以适当的浓度单独或作为与另一种补充物或培养基的混合物诸如复合氮源引入的在碳源、氮源和无机磷酸盐源之外的任何必需补充物。任选地，培养基可含有一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基醋酸酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的还原剂。

在合适的温度下培养原核宿主细胞。例如，对于大肠杆菌生长，优选的温度范围在约20°C-约39°C，更优选在约25°C-约37°C，甚至更优选在约30°C。培养基的pH可以是约5-约9范围内的任意pH，主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8-约7.4，更优选约7.0。

如果诱导型启动子用于表达载体中，则在适合于该启动子激活的条件下蛋白表达被诱导。例如，如果PhoA启动子用于控制转录，则可在磷酸盐限制培养基中培养转化的宿主细胞用于诱导。如本领域所知的，根据所使用的载体构建物，可使用多种其它诱导物。

在微生物中表达的本文所述多肽可分泌入并回收自宿主细胞周质。蛋白回收通常涉及破裂微生物，一般通过诸如渗压休克、超声处理或裂解的手段。一旦细胞被破坏，就可通过离心或过滤除去细胞碎片或整个细胞。蛋白可被进一步纯化，例如通过亲和树脂层析。或者，蛋白可转运至培养基中并从其中分离。可从培养物中除去细胞并过滤和浓缩培养物上清液用于所产生蛋白的进一步纯化。可使用普遍知道的方法分离并鉴定所表达的多肽，诸如在免疫亲和或离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；疏水亲和树脂；使用固定在基质上的合适抗原的配体亲和；及Western印迹测定法。

在原核宿主细胞之外，在本领域中还很好地建立了真核宿主细胞系统。合适的宿主包括哺乳动物细胞系诸如CHO及昆虫细胞诸如下文所述昆虫细胞。

多肽纯化

可纯化所产生的多肽以获得用于进一步检验和应用的基本上均一的制备物。可使用本领域中已知的标准的蛋白纯化方法。下列规程是合适的纯化规程的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE上层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

本发明的候选物质/分子化合物抑制Dkk1与LRP5和/或LRP6及SOST与LRP5和/或LRP6的结合的能力的测定可通过在体外或体内测定法测试该化合物的调控能力来实施，这在实施例部分中有描述。

药物组合物和施用模式

可以采用各种化合物（包括肽等）作为治疗剂。一个实施方案提供含有本发明化合物和治疗惰性载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本发明化合物制备此类组合物和药物的方法。在一个例子中，通过于环境温度于适宜的pH及以期望的纯度与生理学可接受载体（即在采用剂量和浓度对接受者无毒的载体）混合，可以将化合物配制成盖伦施用形式(galeincaladministration form)。配制剂的pH主要取决于化合物的具体用途和浓度，但是优选范围为约3到约8。在一个例子中，在pH5的乙酸盐缓冲液中配制化合物。在另一个实施方案中，该化合物是无菌的。可以例如作为固体或无定形组合物，作为冻干配制剂或作为水溶液保存该化合物。

以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用组合物。在此上下文中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体患者、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施用的方法、施用的日程表、和医学从业人员知道的其它因素。

根据用于施用药物的方法，可以以多种方式包装应用的药物组合物（或配制剂）。一般地，销售的商品包括具有其中存放的合适形式的药物配制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员公知的，并且包括材料诸如瓶（塑胶和玻璃）、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒(cylinder)、等等。所述容器还可以包含防干扰组件(assemblage)以阻止不慎接近包装的内容物。另外，所述容器具有在其上存放的标签，其描述容器的内容物。标签还可以包含合适的警告。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有化合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)）、聚交酯、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

在一个例子中，每剂胃肠外施用的本发明化合物的药学有效量会在每天约0.01-100mg/kg，或者约0.1至20mg/kg患者体重的范围中，所使用的化合物的典型的初始范围是0.3至15mg/kg/天。在另一个实施方案中，优选地，口服单位剂量形式，诸如片剂和胶囊含有约5-100mg本发明的化合物。

可以通过任何合适的手段，包括口服、表面（包括含服和舌下）、直肠、阴道、经皮、胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、皮内、鞘内和硬膜外和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明化合物。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。

可以以任何方便的施用形式，例如，片剂、粉末、胶囊、溶液、分散体、悬浮液、糖浆剂、喷雾、栓剂、凝胶、乳剂、贴片等施用本发明化合物。此类组合物可以含有药用制剂中常规的组分，例如，稀释剂、载体、pH改性剂、增甜剂、填充剂、和别的活性剂。

通过混合本发明的化合物和载体或赋形剂制备典型的配制剂。合适的载体和赋形剂是本领域技术人员公知的，并且详细记载于例如，Ansel,HowardC.,等,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems.Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2004;Gennaro,Alfonso R.等Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2000;及Rowe,Raymond C.Handbook of PharmaceuticalExcipients.Chicago,Pharmaceutical Press,2005。配制剂还可以包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、造影剂(opaquing agent)、助流剂、加工助剂、着色剂、增甜剂、发香剂(perfuming agent)、芳香剂、稀释剂和其它已知的添加剂以提供药物（即，本发明的化合物或其药物组合物）的优雅呈现或帮助制造药物产品（即，药物）。

合适的口服剂量形式的例子是含有与约90-30mg无水乳糖、约5-40mg交联羧甲基纤维素钠、约5-30mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30、和约1-10mg硬脂酸镁混合的约25mg、50mg、100mg、250mg或500mg本发明的化合物的片剂。首先，将粉状成分混合在一起，然后与PVP的溶液混合。可以将所得的组合物干燥、粒化、与硬脂酸镁混合，并使用常规设备压缩成片剂形式。可以通过将本发明的化合物（例如5-400mg）在合适的缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液中溶解，若想要的话，添加张力调节剂(tonicifier)，例如盐诸如氯化钠来制备气雾剂配制剂的例子。可以例如使用0.2微米滤器来过滤溶液，以除去杂质和污染物。

因此，一个实施方案包括包含化合物、或其立体异构体或药学可接受盐的药物组合物。在又一个实施方案中包括包含化合物、或其立体异构体或药学可接受盐，以及药学可接受载体或赋形剂的药物组合物。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。或者/另外，所述组合物可包含增强其功能的药剂，诸如例如细胞毒剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂或生长增强剂。合适的是，此类分子适于以对于预定目的有效的量组合存在。

筛选方法

在另一个方面中，本发明提供筛选抑制Dkk1和/或SOST与LRP5和/或LRP6的相互作用的化合物的方法。该方法包括筛选结合（优选但非必须特异性）LRP5和/或LRP6且抑制Dkk1和/或SOST对这些受体的特异性结合的化合物。

本发明包括筛选候选或测试化合物以鉴定那些抑制Dkk1与LRP5和/或LRP6的相互作用的化合物和抑制Sclerostin与LRP5和/或LRP6的相互作用的化合物的方法。在一个实施方案中，该化合物不抑制Wnt信号传导。筛选测定法设计成鉴定与LRP5和/或LRP6结合或复合或以其它方式干扰LRP5和/或LRP6与Dkk1和/或SOST的相互作用的化合物。这样的筛选测定法会包括可顺应于化学文库高通量筛选的测定法，使得它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。

测定法可以多种形式进行，包括在本领域中均有充分描述的蛋白-蛋白结合测定法、生化筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。

在一个实施方案中，测定法需要在足以容许下述两种组分起相互作用的条件及时间下，使候选化合物与LRP5或LRP6（或其等同物）接触。在一个实施方案中，使候选化合物与LRP6的E1的β-螺旋桨域接触。在一个实施方案中，使候选化合物与LRP5的E1的β-螺旋桨域接触。在结合测定法中，相互作用是结合，而且可在反应混合物中分离或检测所形成的复合物。在一个具体的实施方案中，通过共价或非共价附着将候选化合物固定在固相例如微量滴定板上。通常通过用物质/分子的溶液包被固体表面并干燥来实现非共价附着。或者，固定化的亲和分子诸如抗体例如特异于要固定化的物质/分子的单克隆抗体可用于将其锚定在固体表面上。通过添加可通过可检测标记物而被标记的非固定化组分到固定化组分例如含有所述锚定组分的经包被表面上进行该测定。当反应完成时，例如通过洗涤除去不反应的组分，并检测锚定在固体表面上的复合物。当最初非固定化的组分携带可检测标记物时，检测到固定化在表面上的标记物指示发生了复合。在最初非固定化的组分没有携带标记物的情况中，可例如通过使用经标记的特异性结合固定化复合物的抗体来检测复合。

在其它实施方案中，候选化合物和LRP5或LRP6或其功能等同部分诸如LRP6的E1的β-螺旋桨域或LRP5的E1的β-螺旋桨域之间的相互作用可通过众所周知用于检测蛋白-蛋白相互作用的方法测定其与所述多肽的相互作用。这样的测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共沉淀、和通过梯度或层析柱的共纯化。此外，如Chevray和Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5789-5793(1991)所披露的，可通过使用Fields和同事(Fields和Song,Nature (London),340:245-246(1989);Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578-9582(1991))所描述的基于酵母的遗传系统监测蛋白-蛋白相互作用。许多转录激活物（诸如酵母GAL4）由两个物理上离散的模块域组成，其中一个模块域起DNA结合域的作用，另一个模块域起转录激活域的功能。前述出版物中描述的酵母表达系统（一般称为“双杂交系统”）利用了该特性，并使用了两种杂合蛋白，在一种杂合蛋白中靶蛋白融合至GAL4的DNA结合域，在另一种杂合蛋白中候选激活蛋白融合至激活域。在GAL4激活的启动子控制下的GAL1-lacZ报道基因表达依赖于经蛋白-蛋白相互作用的GAL4活性重建。使用β-半乳糖苷酶生色底物检测含有相互作用多肽的菌落。使用双杂交技术用于鉴定两种特定蛋白之间蛋白-蛋白相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKER^TM)可购自Clontech。该系统还可扩展来对涉及特定蛋白相互作用的蛋白结构域作图以及用于精确定位对于这些相互作用至关紧要的氨基酸残基。

本发明的另一个方面提供一种测定法，其涉及使用本文所述肽对测试化合物筛选其抑制Dkk1或SOST对LRP5或LRP6靶分子的相互作用的能力。LRP5或LRP6靶分子包括全长LRP5或LRP6分子及其功能多肽部分诸如LRP6的E1的β-螺旋桨域或LRP5的E1的β-螺旋桨域。在一个实施方案中，该测定法包括在选自本发明肽的肽（例如来自家族1，家族2，家族3或家族4的肽）存在或缺失下使测试化合物与LRP5或LRP6靶分子接触。此肽在测定法的上下文中称作肽配体。如果该测试化合物与肽配体竞争结合或自LRP5或LPR6靶分子置换肽配体，那么选择该测试化合物作为抑制Dkk1或SOST与靶分子的相互作用的化合物。使用本领域公知的或本文中描述的测定法，选定的测试化合物可以进一步评估特定期望特征，诸如促进骨生长的能力，以及其对Wnt配体结合LRP5或LPR6靶分子的影响。

测试化合物抑制肽配体结合LPR5或LRP6靶分子的能力可以通过本领域公知的技术来评估。可以用可检测标记物标记靶分子，肽配体或测试化合物任一以便于监测测定法相互作用。此类标记物包括放射性同位素，荧光标记物，化学发光标记物，磷光标记物，磁性颗粒，染料，金属颗粒，酶，等。此类标记物的例子包括但不限于生物素，荧光素，德克萨斯红，萤光黄，和罗丹明。其它标记方法包括酶示踪剂，诸如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，和葡萄糖氧化酶。

此类筛选测定法会包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。所设想的小分子包括合成的有机或无机化合物。可以多种形式实施测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质结合测定法，生物化学筛选测定法，免疫测定法和基于细胞的测定法。

测试化合物可以是任何类型的分子，包括例如肽，肽模拟物，拟肽诸如插烯拟肽，多核苷酸或有机小分子。

以下是本发明方法和组合物的实施例。应当理解为在上文提供的一般描述下，可实施各种其它实施方案。

通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）。

实施例

实施例1：材料和方法

材料。作为无载体蛋白质自R&D Systems（Minneapolis，MN）获得高度纯的Wnt3a，Wnt9b，Dkk2，Dkk3和Dkk4用于结合和细胞测定法。将编码Dkk1，Sclerostin和LRP6蛋白的基因克隆入改良pAcGP67杆状病毒DNA转移载体（BD Pharmingen）中用于Tni昆虫细胞（Expression Systems，LLC，Woodland CA.）中的杆状病毒生成和胞外表达，如先前描述的（11）。

蛋白质表达和纯化。依照先前描述的方案（11）表达和纯化用于此研究的LRP6，Dkk1和sclerostin蛋白。然后可以将纯的蛋白质浓缩至10μM储液并保存于-80℃。通过将经过转化的大肠杆菌34B8（Stratagene）在低磷酸盐AP5培养基中于30℃培养24小时来表达抗LRP6E1YW210.09Fab（43），并在蛋白G亲和柱（GE Healthcare）上纯化（44）。通过流过SP-Sepharose柱（GEHealthcare）来进一步纯化含有Fab的级分。通过280nm处的吸光度来测定蛋白质浓度。

蛋白质复合物结晶。经过纯化的LRP6E1E2与YW210.09Fab一起温育过夜以形成稳定的复合物，接着在Superdex S200凝胶过滤柱（GE Healthcare）上纯化复合物。合并含有复合物的级分并浓缩至8mg/mL，然后在含有10mMTris pH8，300mM NaCl和2.5%甘油的缓冲液中透析。自0.2M甲酸铵和20%PEG3350（w/v）的溶液获得了晶体。因为只有LRP6E1在解析的结构中可见，所以通过质谱术来分析晶体，揭示了LRP6E2在Arg335之后降解。经过纯化的LRP6E1和Dkk1肽的复合物自0.1M硫氰酸钾和30%（w/v）PEG MME2000或自0.2M NaCl，0.1M Tris pH8，25%（w/v）PEG3,350结晶。通过在过量的感兴趣肽（1-2mM终浓度）和LRP6E1存在下微量接种初始共晶体（含有Dkk1肽）实现了别的与LRP6E1复合的肽的结晶。接种的晶体在2或3天中从两种初始Dkk1肽结晶条件之一（或二者）生长出来，并发现含有感兴趣的肽。

数据收集和结构测定。使用Advanced Light Source（ALS）束线5.0.2处的单色X射线束（12398.1eV）收集衍射数据。X射线检测装置为距晶体350mm放置的ADSC量子-210CCD检测仪。或者，在Stanford Synchrotron RadiationLaboratory（SSRL71），Advanced Photon Souce（APS211DF）或内部使用与Rigaku CCD照相机（007HF/Saturn944+）偶联的Rigaku X射线发生器007HF型收集数据。在数据收集之前，将晶体转移入含有25%甘油的防冻溶液中，接着在液氮中闪冻。将旋转法应用于单一晶体以收集完整数据集，1°摆动每帧，总楔大小180°。然后使用程序HKL2000（45）对数据编索引，整合，和定标。使用程序Phaser（CCP4，Daresbury，England）通过分子置换（MR）方法对LRP6E1/Fab结构定相。Matthews系数计算结果指示每个不对称单元由一个Fab/E1复合物和54%溶剂构成。因此，MR计算致力于搜索一组三个亚基，包括Fab的N端域，Fab的C端域，和E1的β-螺旋桨域。N和C端域分开搜索，考虑Fab肘角作为变量。Fab亚基的搜索模型衍生自HGFA/Fab复合物的晶体结构（46）。β-螺旋桨域的搜索模型是一种经由ESyPred3D网络服务器产生的同源性模型（47）；LDL受体的胞外域的结构（48）用作同源性建模模板。使用MR解决方案计算的差异电子密度图揭示了EGF域结构。使用来自Fab复合物的LRP6E1域作为搜索模型，通过分子置换确定了LRP6-肽复合物结构。将肽手工构建入电子密度中。用程序COOT（49）进行手工重构建。使用最大似然目标函数，各向异性各B-因子(anisotropic individual B-factor)细化，用程序REFMAC5（50）和PHENIX（51）进行结构细化（仅肽复合物）。

结合测定法。如先前所述（11）使用Octet Red仪器（ForteBio）通过生物层干扰测量来测量结合动力学。给链霉亲合素（SA）生物传感器加载50mMTris，pH8，300mM NaCl，5%（v/v）甘油，和0.05%（w/v）Triton X-100中的生物素化hLRP6。在相同缓冲液中清洗加载后的生物传感器，之后进行指定时间的结合和解离测量。经由Octet Red软件v6.3使用稳态分析测定每种相互作用的K_d。每个报告值代表不同浓度的三次或更多次实验的平均，拟合实验曲线的相关系数平方（R2）在0.96以上。

或者，通过荧光偏振（FP）来测定亲和力。以适合于特定靶-探针组合的亲和力（大约K_d）的浓度将荧光素修饰的肽探针（30nM）与LRP5或LRP6E1域混合。然后添加竞争性测试剂（蛋白质或肽）并监测FP作为测试剂的浓度的函数。通过使用程序KaleidaGraph（Synergy Software）将所得曲线拟合标准方程来获得抑制常数。

还通过与展示结合肽的噬菌体的竞争（竞争噬菌体ELISA）来测定肽亲和力。将测试肽的连续稀释液与适宜（非饱和）浓度的噬菌体混合，之后将混合物暴露于靶并容许其达到平衡。清洗以除去未结合材料后，通过与抗M13抗体-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物一起温育并暴露于合适的比色HRP底物来检测结合的噬菌体。

最后，还通过竞争ELISA来测定肽亲和力。用链霉亲合素或中性亲合素（5μg/mL，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中；4°C过夜）包被Maxi-Sorb板（Nunc），然后用PBS中的0.2%牛血清清蛋白（BSA）封闭（1小时，室温）。将生物素化E1结合肽Ac-GSLCSNRIKPDTHCSSK（生物素）-am（二硫化物）的溶液（500nM，在PBS中）添加至每个孔达30分钟，然后将孔用含有0.05%Tween-20的PBS清洗3次以除去过量的肽。将带His标签的E1域或带FLAG标签的E1E2蛋白（5-10nM终浓度）与连续稀释的测试肽一起预温育15分钟，之后将混合物添加至测定板的孔达30分钟。清洗孔，然后通过添加Qiagen五His-HRP偶联物或Sigma抗FLAG M2HRP偶联物（1:2000稀释，在PBS，0.2%BSA，0.05%Tween-20中）达30分钟来探查结合的LRP6。清洗后，添加TMB底物（Kirkegaard and Perry Laboratories）。将孔用1M H₃PO₄淬灭并于读板。通过使用程序KaleidaGraph（Synergy Software）将所得曲线拟合标准四参数方程来获得抑制常数。

光散射实验。如先前（11）所述通过SEC-MALS（Dawn Helios2及QELSHPLC，其偶联至Optilab Rex，Wyatt Technologies）分析平衡过夜的110μl蛋白质或蛋白质复合物等分试样。

噬菌体展示。如（41）所述构建噬菌体展示肽文库（大约2x10¹⁰个独特成员）并进行四轮针对LRP6E1E2，E1或E3E4或针对LRP5E1的溶液结合选择。对在噬菌体ELISA中结合LRP6的各个噬菌体克隆进行DNA序列分析。

细胞β-联蛋白测定法。在小鼠成纤维细胞L细胞中或在HEK293s细胞中评估Wnt信号传导。如（52）所述实施293细胞中的萤光素酶报告物测定法。基本上如（53）所述进行小鼠成纤维细胞L细胞成像测定法。如所示用Wnt3a，Fz8CRD（（美国专利公开文本20080299136；（54），LRP6或Dkk1或这些蛋白质的组合处理细胞，并于37℃/5%CO₂再过6小时后加工。

颅盖骨模型。如先前所述（52，55）收获并培养颅盖。颅盖在组织培养板中在补充有0.1%牛血清清蛋白和各100U/ml青霉素和链霉素的BGJb培养基中培养1天，之后用适宜浓度的肽或蛋白质处理7天。在5%CO₂增湿气氛中于37℃培养骨。用μCT40（SCANCO Medical，Basserdorf，Switzerland）x射线micro-CT系统对小鼠颅盖成像。用Analyze（AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS，USA）分析micro-CT扫描。或者，将颅盖组织学染色以查看钙化区域。所有使用小鼠的实验依照Genentech科研动物护理和使用委员会指导方针实施。

实施例2：LRP6E1-YW210.09Fab复合物的结构。

通过分子置换测定与Fab形式的抗LRP6抗体YW210.09（WO2011119661）复合的LRP6的第一个β-螺旋桨和EGF域（E1域）的晶体结构，并细化至1.9

分辨率，R和Rfree分别为0.175和0.220。结晶学不对称单元由一个LRP6E1域和一个YW210.09Fab构成。可解释的电子密度容许描绘E1域的残基Ala20到Lys324。除Fab重链残基Ser127到Thr131外，能描绘Fab轻链残基Asp1到Glu213和重链Glu1到Lys214（全文使用Kabat编号方式（56））。

LRP6E1域以包含β-螺旋桨模块和表皮生长因子（EGF）样模块的模块化体系装配。β-螺旋桨由六个桨片组成，桨片由四股反平行β-片层形成，放射状排列，N端边缘面向中央通道而YWTD基序位于每个桨片的第二条链。LRP6E1β-螺旋桨结构密切类似LDLr的结构（57），当在245个Cα原子上重叠时rmsd为0.83

，尽管序列同一性只有36%。大多数保守残基集中在YWTD核心基序附近，形成对于β-螺旋桨结构完整性至关重要的β-片层。相反，表面残基是高度多样的，正如根据这些受体的功能多样性可能预期的。LRP6利用其EGF样域来锁定(lock down)螺旋桨的第一个和第六个桨片（以维持其机械强度）。EGF样模块经一个十残基接头自β-螺旋桨C端延伸出来，然后折叠回到β-螺旋桨的底侧上，停靠至第三个和第四个桨片之间的表面。EGF样域和β-螺旋桨直接的相互作用是广泛的，表现为

的大总掩埋表面积和0.74的形状互补性得分（58）。EGF模块的第一条β链中的三个残基（即Leu296，Leu298和Met299）构成一个疏水核，其堆叠入β-螺旋桨的一个互补腔中；疏水核被一些直接或水介导的极性相互作用所包围。在LDLr结构中也观察到这些特征（48，57）。

YW210.09Fab识别β-螺旋桨顶部中央的一个区域，即频繁发现涉及蛋白质-蛋白质相互作用的一个区域（59）。互补位由来自五个CDR的残基构成，包括三个重链CDR（H1，H2，H3）和两个轻链CDR（L1和L3）。抗体结合β-螺旋桨掩埋的总面积，形状互补性得分为0.76。一个酸性斑占据β-螺旋桨此侧大约三分之一的总面积但与YW210表位几乎不交叠。抗体重链和轻链识别离散区域。由重链CDR形成的直接接触占掩埋表面积的80%，单单CDR H3占超过50%。此区段由17个残基构成，其中残基His98至Lys100c与β-螺旋桨形成直接接触。重要的是，抗体的Asn100与LRP6的Asn185生成一对氢键，形成“握手”相互作用（图5）。另外，穿过Val100b和Lys100c的罕见主链构象将一个与LRP6的Arg28相互作用的羰基置于“背部”，并将两个经由两个水分子（Wat1和Wat2）与酸性斑相互作用的NH基置于“前部”（图5）。Lys100c侧链还通过与LRP6的Val70和Ser96主链羰基形成氢键，部分中和酸性斑。LRP6的Arg141锚定在中部且与桥接水Wat2，LRP6的Asn185，和YW210.09的Ala100a相互作用。Arg141看来整合两个氢键网络。另外，Val100b侧链停靠入β-螺旋桨中央通道中的疏水腔中。因此，短的、连续的YW210.09H3序列NAVK展现出程度异常显著的与LRP6的β-螺旋桨E1的相互作用。其它CDR与沿着β-螺旋桨顶部周界的残基相互作用。H1和H2接触第五个和第六个桨片，而L1和L3接触第六个，第一个，和第二个桨片（图6）。晶体堆叠相互作用不直接涉及YW210.09接触LRP6表位的区域，指示晶体结构应当反映两种分子在溶液中如何相互作用。

实施例3：YW210.09H3环序列呈现在Dkks，sclerostin和wise间保守的“NXI”基序。

独特CDR H3NAVKN基序和LRP6E1β-螺旋桨之间的相互作用与层粘连蛋白和巢蛋白(nidogen)之间报告的相互作用高度相似（60）。在这两种情况中，经由上文所述Asn握手和一个进入β-螺旋桨中央通道顶部形成的疏水腔的分支疏水性残基发生显著接触。与LDLr不同，巢蛋白和LRP6E1通道的中央通过由一个附近苯丙氨酸侧链或“Phe快门”恰当定位的一个色氨酸残基对溶剂关闭（60）。有人提出此特征预示能结合低分子量配体的YWTD螺旋桨域（60）。人Dkk1的一段短序列（NAIKN；氨基酸40至44）与在YW210.09的CDR H3环中找到的基序几乎相同（图7）。此基序在来自不同物种的多个Dkk家族成员间严格保守，Dkk3除外。强保守提示Dkk1，2，和4的此区段具有重要功能。发现保守基序在Dkk1的N末端附近，即一个预测无秩序且先前尚未鉴定为在功能方面重要的区域（61）。另外，此基序出现于另外两种经与LRP5/6的相互作用调节Wnt信号传导的蛋白质，即sclerostin（32）和wise（30）（图7A）。sclerostin和wise属于半胱氨酸-节蛋白(cystine-knot protein)超家族（62），而且在明确定义的折叠的延伸环2，也称作“踵”中展示基序（63，64）。在sclerostin的情况中，“踵”已经定位为一种中和性抗体的结合表位（63），提示该区域在功能上可能是重要的。尚未报告sclerostin或wise与LRP5或LRP6的相互作用的详情。

实施例4：来自Dkk1和sclerostin的肽结合LRP6β-螺旋桨的顶部。

通过标准Fmoc规程合成了来自Dkk1和Sost的七残基肽。图7B。这些肽包括上文所述“NXI”基序。通过竞争噬菌体ELISA（41）测定了肽对LRP6E1E2的亲和力。Dkk1肽以相对较高的亲和力结合，而sclerostin肽的结合弱约10倍（分别为IC504μM和45μM）。这些值与层粘连蛋白肽对巢蛋白β-螺旋桨的亲和力（65）相当。为了了解肽与LRP6的详细相互作用，我们测定了肽结合LRP6E1β-螺旋桨的高分辨率共晶体结构。通过分子置换测定结构并对Dkk1和Sost肽分别细化至1.9和1.5

分辨率（图8）。引入注目地，肽显示出与抗体环相比非常相似的结合状态构象，在每种情况中关键天冬酰胺侧链置于恰当位置进行上文所述“握手”相互作用。肽异亮氨酸残基占据疏水袋，在那里抗体环的缬氨酸侧链相互作用。抗体环和Dkk1肽的总体比较尤其惊人；抗体残基Val99至Lys100c（主链Cα至Cα，还包括Lysβ-碳和Asn100，Ala100a，和Val100b的整个侧链）与Dkk1肽的等效原子的比对显示了构象本质上相同（26个原子上RMSD为0.14

）。在核心“NXI”基序之外，每种肽中的碱性侧链与LRP6上的酸性斑相互作用，尽管它们在序列中的相对位置不同。对于Dkk1肽，赖氨酸就在异亮氨酸残基后面；赖氨酸的ε-氨基以与来自抗体环的类似赖氨酸的相互作用非常相似的方式占据一个酸性小裂缝。在Sost肽的情况中，异亮氨酸后面，碱性精氨酸残基之前是一个居间甘氨酸。这使肽主链重定向并将精氨酸侧链置于LRP6的酸性斑上的一个更加外围的位置。这些肽结构证明了对LRP6E1的结合由极其明确的核心基序（Asn和Ile侧链的相互作用）及由与能够实现一定范围支持性接触的周围表面的相互作用二者驱动。这后一组相互作用很可能不仅负责额外的亲和力，而且负责特异性。例如，一种来自层粘连蛋白的相关肽对巢蛋白的高亲和力结合要求Asn和Val残基（65），而且这些形成与LRP6复合物结构中的“NXI”基序看到的接触（60）非常相似的接触。然而，与巢蛋白的高亲和力相互作用要求额外的来自位于核心基序的Asn前面两个残基处的Asp的接触（60，65）。此Asp与巢蛋白中存在的但LRP5或LRP6中不存在的一个表面Arg形成盐桥。总之，Dkk1和sclerostin肽的结合特性与下述想法一致，即在多种Wnt途径抑制剂中观察到的“NXI”基序（图7）对于这些蛋白质对LRP5和LRP6的结合及因此对于它们的抑制活性是重要的。

实施例5：Wnt途径抑制剂和LRP6的各个β-螺旋桨之间的相互作用的定位。

使用生物层干扰测量测定法（11）测量不同Dkk和sclerostin与LRP6的不同域的相互作用。经过纯化的受体含有单个β-螺旋桨-EGF样单元（E1，E2或E4），两个β-螺旋桨（E1E2或E3E4）或四个β-螺旋桨（E1E4）--如下：

人LRP6：构建物E1E4-LPR6的氨基酸A20-Q1253；构建物E1E2-LPR6的氨基酸A20-E631；构建物E3E4-LPR6的氨基酸E631-Q1253；构建物E1-LPR6的氨基酸A20-D325；构建物E2-LPR6的氨基酸D235-E631；构建物E4-T933-Q1253。单个LRP6β-螺旋桨E3不能表达。

人LRP5：构建物E1-LRP5的氨基酸P33-R348

Dkk1能结合LRP6的E1E2和E3E4区二者（11）。通过显示Dkk1和Dkk2都以高亲和力（分别为22和53nM）结合LRP6E1E2，此研究扩展了该发现。而且，Dkk1和Dkk2还结合E3E4（分别为51和38nM）。相反，对Dkk3和Dkk4没有观察到高亲和力相互作用。Dkk3未能结合任何测试的LRP6构建物，符合一份最近的报告（66）。Dkk4显示出很弱的对LRP6E1E4和E3E4的结合的一些证据，但是，有趣的是，不结合E1E2。对Dkk1和Dkk2结合各个β-螺旋桨的进一步分析指示它们每一个只以高亲和力结合E1。检测不到对E4的结合，指示观察到的与E3E4的相互作用很可能是由与E3的高亲和力相互作用驱动的。只在很高的Dkk浓度检测得到对E2的部分结合，与很弱的结合或与非特异性的效应一致。以类似的方式定位sclerostin的结合。sclerostin只结合E1E4，E1E2，和E1，对E2只有很弱的或非特异性的结合。

为了评估Dkk1，Dkk2，和sclerostin是否可能结合LRP6E1上的相同位点，在预加载的Dkk1（100nM）存在下测量Dkk2或sclerostin结合。Dkk2结合只受到轻微抑制（图8A），提示Dkk1和Dkk2的结合位点没有显著交叠。相反，sclerostin结合在Dkk1存在下受到很强抑制（图8B），提示这两种抑制剂的结合位点交叠。此结论与上文肽相互作用研究（其显示Dkk1和sclerostin的“NXI”基序以相似方式与LRP6E1相互作用）一致。

实施例6：“NXI”基序对于Dkk1和sclerostin结合LRP6E1是重要的。

基于肽和域定位研究的组合结果，假设Dkk1和sclerostin对LRP6E1的结合主要由每种蛋白质中存在的“NXI”基序介导。为了检验这个想法，用预测破坏相互作用的氨基酸替代该基序中的关键接触残基（Asn变成Ala；或Ile变成Glu）。值得注意的是，层粘连蛋白中类似残基的替代显著影响对巢蛋白的结合，亲和力损失3000到50,000倍（67）。Dkk1中的Asn40Ala替代导致对LRP6E1E2的亲和力损失75倍，而Ile42Glu替代大大消除结合（>364倍影响）（图9A）。替代对sclerostin结合的影响是清楚可见的但不强，Asn117Ala和Ile119Glu替代的亲和力损失分别为14和19倍（图9A）。这些数据与“NXI”基序的重要作用（尤其对于Dkk1）一致。

实施例7：Dkk1的CRD2中的氨基酸替代破坏对LRP6E3E4的结合。

提出了Dkk蛋白的C端区的一项重要作用；例如，已经显示了编码缺少第一个富含半胱氨酸域（CRD1）的人Dkk1或Dkk2的mRNA在注射入爪蟾胚胎中时能抑制xWnt8信号传导（61）。然而，迄今为止，没有任何Dkk家族成员的完整结构，也没有任何与相互作用配偶的复合物。通过计算将来自小鼠Dkk2的CRD2的一种实验结构停靠到LRP5E3的同源性模型上（68）。基于这种复合物模型，用Glu替代小鼠Dkk1残基His210，Lys217或Arg242（分别对应于人Dkk1残基204，211，和236）预测干扰结合（68），而且在每种情况中，发现破坏对经LRP6转染的细胞的结合和Dkk1抑制Wnt3a信号传导的能力二者（69）。如实施例5中所述，Dkk1能结合LRP6的E1和大概E3域二者。因此，我们怀疑在CRD2中掺有报告的氨基酸替代的人Dkk1对LRP6E3的亲和力可能低得多，而且对E1的结合会不受影响。用Dkk1突变体H204E和K211E检验了这种假说，结果显示于图9B。确实，这些突变干扰对LRP6E3E4的结合，但不干扰对E1E2的结合。与上文描述的结果一致，相反的情况对“NXI”基序替代成立。有趣的是，CRD2或“NXI”基序替代对Dkk1结合E1E4都只有轻微影响。综上所述，这提示Dkk1独立结合E1E4上的两个不同位点（2:1复合物；图10中的卡通图3），或者，Dkk1能结合互相排斥的两个位点（即，择一1:1复合物；图10中的卡通图5和6）。第三种可能是一个Dkk1分子同时结合E1和E3上的位点（图10中的卡通图4）；然而，与两类突变体相比，野生型Dkk1的任何实质性“亲合效应”的缺失似乎会使得这更加不大可能。另外，没有观察到E1E2，Dkk1，和E3E4的三元复合物的形成（11）。为了区分2:1和1:1结合模型，通过与光散射检测偶联的大小排阻层析来分析Dkk1变体与E1E4的复合物。这些数据显示Dkk1E1E4与LRP6E1E4的复合物都展现1:1化学计量（图10）。总之，亲和力测量和光散射数据提示Dkk1和LRP6之间存在两种独立的但互相排斥的结合模式。

实施例8：sclerostin只调节Wnt的一个子集而Dkk1作为该途径的广谱抑制剂起作用。

如上文（实施例5）所述，sclerostin结合LRP6E1且不与LRP6的E3E4区相互作用。Wnt9b也结合E1E2区但不结合E3E4区（11）。因而，sclerostin抑制Wnt9b结合LRP6E1E4（图11）。相反，sclerostin不能抑制Wnt3a对LRP6E1E4的结合（图11），符合先前的观察结果，即Wnt3a不结合E1E2但改为结合LRP6的E3E4区（11）。与Dkk1的情况更为复杂，因为Dkk1能以高亲和力结合LRP6的E1E2和E3E4片段二者（11），显然经由两种不同相互作用模式（实施例5-7）。因而，Dkk1抑制Wnt3a和Wnt9b二者对LRP6E1E4的结合（图11）。

为了测试观察到的对经过纯化的蛋白质之间的结合的影响对细胞信号传导是否是有关的，进一步在Wnt依赖性TOPbrite萤光素酶报告物测定法中测试Dkk1和sclerostin活性（52）。用Wnt1瞬时转染经报告物稳定转染的细胞。用经过纯化的Dkk1或sclerostin变体处理经Wnt转染的细胞，并测量对报告物诱导的影响（图12）。对于野生型Dkk1和sclerostin，观察到对Wnt1依赖性信号传导的强抑制。这与更早的观察结果一致，即Wnt1属于一类经由LRP5/6的E1E2部分的Wnts信号传导（11，52）。Dkk1和sclerostin突变体显示出与它们对LRP6的结合一致的活性（图12）。sclerostin Ile119Glu（“NXI”基序）相对于野生型在其抑制Wnt1驱动的信号传导的能力方面受损，正如Dkk1Ile42Glu。相反，Dkk1Lys211Glu（CRD2）有效抑制Wnt1信号传导，与此突变体保留结合E1E2的能力一致（图9B）。

总之，结合数据和细胞测定法中对Wnt信号传导的影响确认了保守的“NXI”基序对Dkk1和sclerostin经由结合E1E2抑制那些Wnts信号传导在功能上有关，而且Dkk1CRD2与E3E4的相互作用只对抑制Wnt配体的一个不同子集是重要的。另外，数据显示了Dkk1广泛抑制Wnt信号传导（经由两种不同结合模式），而sclerostin更具选择性。

实施例9：人骨矿物质密度（BMD）突变破坏Dkk1和sclerostin结合LRP6E1E2，不影响Wnt9b结合。

对Dkk1和sclerostin与LRP6的第一个β-螺旋桨的相互作用的理解照亮了LRP5功能获取突变的机制。LRP5E1中的这些单一氨基酸替代导致受影响个体中骨强度和厚度的显著增加（22-24）。在最近八年里，记载了总共九处LRP5功能获取突变（七个位置处）（23）。这些七个氨基酸中每一个在LRP5和LRP6之间严格保守。总之，LRP5和LRP6的E1β-螺旋桨高度保守（68%相同），而且，重要的是，它们的顶部相互作用表面几乎完全相同。从结构的观点看，最惊人的BMD突变是Asn198用Ser替代（24）；Asn198对应于LRP6Asn185，其参与同Dkk1和sclerostin中找到的“NXI”基序的“握手”相互作用（实施例2和4）。在LRP6E1/Dkk1肽复合物的表面上定位BMD突变位点揭示了在Asn185之外，LRP6残基Asp98，Arg141，和Ala201或是与所述肽直接接触或是紧挨着结合袋。因而，可以预测这些突变破坏Dkk1和sclerostin结合LRP6E1。

其它三个突变位点离结合的肽更远，但是预期替代对肽结合袋的完整性可能有间接影响。LRP6残基Gly158存在于一个表面环上，而且预期可能影响Trp157的构象。Trp157的吲哚环挨着BMD突变位点Arg141，在那里它可对溶剂屏蔽Arg侧链和肽Asn羰基之间的氢键。Trp157的吲哚还构成围绕Asn-Asn“握手”的袋的一堵墙。Gly158环附近有第二个吲哚侧链，是Trp183的；此吲哚形成Asn-Asn袋的第二堵墙。Ala201（另一个BMD突变位点）在相对于Gly158而言，Trp183另一侧的一个表面环上。Trp157或Trp183侧链的不正确指向预期会破坏对“NXI”肽的结合。BMD位点Thr240和Ala229远离蛋白质邻近β-链末端附近的表面。Thr240位于此类螺旋桨蛋白质中存在的特征性“YWTD”重复之一中。Thr240羟基与Ala229主链酰胺形成氢键；替代任一残基预期可能引起蛋白质去稳定化。另外，Ala229就在认为对于将配体结合位点的底部对溶剂关闭重要的“Phe快门”（见实施例3）的紧下面（60）。

经携带BMD突变的LRP5变体转染的细胞显示出降低的对sclerostin的结合，而且对sclerostin抑制Wnt10b或Wnt6信号传导不太敏感（70）。为了进一步测试BMD替代的影响，我们将它们中的数个引入LRP6E1E2，结果显示于图13。LRP6E1E2Gly158Val不能在昆虫细胞中表达。此观察结果符合相应LRP5突变体在哺乳动物细胞中观察到的极低表达水平（70），提示此残基的替代在结构上是去稳定化的。我们测试的其它LRP6突变都破坏Dkk1和sclerostin二者结合LRP6E1E2。Asn185突变成Ser显著破坏结合，Dkk1和sclerostin的亲和力分别损失183和59倍。类似地，Arg141Met诱导Dkk1和sclerostin的亲和力分别损失29和31倍。重要的是，对Wnt9b结合LRP6变体没有影响或影响很小。这些结果支持下述想法，即源自BMD突变的功能获取并非源自对Wnt配体的亲和力的获得，而是源自对Wnt抑制剂的亲和力的选择性损失。重要的是，不仅对sclerostin的结合受到影响（70），而且Dkk1对其E1相互作用位点的结合也受损。

实施例10：LRP5和LRP6E1β-螺旋桨是高度特异性的肽识别模块。

使用噬菌体展示对LPR6β-螺旋桨探查肽结合特异性。使用线性或环肽的天然库针对LRP6E1E2或E3E4或LRP5E1进行溶液结合实验（41）。使用每一种靶物实施四轮结合选择。观察到结合特定靶物相对于结合BSA的显著富集，LRP6E1E2和E3E4分别富集1000和6000倍。针对LRP5E1域的选择观察到类似的强富集。对各个噬菌体克隆筛选对感兴趣靶物的结合，还有对其它LRP6β-螺旋桨构建物的结合。针对LRP6E1E2或E3E4构建物选择的噬菌体是显著特异性的：分离的克隆都只结合初始靶物，对其它LRP6构建物没有交叉结合。另外，对E1E2特异性的噬菌体只结合E1域，而针对E3E4选择的噬菌体看来是对E3特异性的。通过对感兴趣的噬菌体克隆测序，获得了肽的序列。使用特别有希望的克隆来设计次级文库进行亲和力成熟；对这些文库进行额外轮次的选择和筛选。

LRP6E1肽序列基序（图14）与在Dkk1，sclerostin和wise中找到的“NXI”基序显著一致。对于线性和环肽文库二者，存在一个严格保守的Asn（第0位）。第+2位总是一个分支疏水性残基，绝大多数情况中存在Ile。特异性结合噬菌体中这些残基的强选择确认了“NXI”基序中这两个残基的重要性。对于自线性文库衍生的肽，第-1位存在能够产生转角的残基，诸如Pro，Ser，Cys或Gly是优选的。第+1位最优选Ser，接着是疏水性残基诸如Phe，Trp，Tyr和Leu。正如在Dkk1序列中观察到的，Lys是第+3位最优选的残基，Arg和His是第二和第三最常见的残基。最后，第+4和+5位优选疏水性残基。包括两个半胱氨酸之间的广泛环长度范围的环状文库在结合选择后只产生四种类型的环肽。它们在环长度方面和在“NXI”基序相对于Cys残基的位置方面是不同的。另外，保守Asn和Ile残基侧翼位置的残基偏爱对于不同环类型是不同的。例如，第+3位对Lys的偏爱对“CNXIXC”型的环而言相当放松。在其它情况中，例如“CXNXIKX₄C”型的环，标有下划线的Lys几乎不变。这些结果不仅与“NXI”基序的强特异性，而且与不同类型的环肽的独特构象偏爱（和潜在结合接触）一致。

以与上文关于LRP6E1E2所述相同的方式获得了结合LRP5E1的肽。像LRP6，LRP5产生独特的线性和环肽基序（图15）。然而，这些基序与结合LRP6E1的基序相当不同。特别地，这些肽不含有“NXI”基序。所述线性肽显示保守的酸性位置（第0位），第+2，+3和-1位为疏水性氨基酸（分别为Met，Trp，和Phe）。经过成熟的克隆显示出很强的第-3位对His和第-5位对Arg的偏爱。三个环肽家族中的两个还具有保守的酸性残基，但是它们的序列样式在其它方面与线性家族的序列样式不同。

实施例11：自噬菌体文库选择鉴定的肽的合成确认它们结合LRP6E1。

化学合成了数种来自例示性家族1和2的肽以评估它们是否结合在噬菌体颗粒上的展示背景以外的靶物（LRP6E1）。一般而言，这些合成肽能够结合靶物。例示性家族1的线性肽的亲和力与Dkk17聚物肽在相同范围中（低微摩尔），而来自例示性家族2的环肽具有低微摩尔至中纳摩尔的亲和力。为了了解这些噬菌体衍生肽如何识别LRP6E1，测定了数种共晶体结构（图16）。显示的结构中的四种肽都含有“NXI”基序；因此，四种肽都与Dkk1和sclerostin肽结合相同位点，而且每种肽的Asn和Ile残基占据上文关于其它结构所述的相同位点。另外，肽结构显示了一些独特特征。B部分中显示的“CX9C”环肽将N-末端乙酰基置入LRP6表面上的第三浅袋中（顶部中央）。Dkk1肽不占据此袋。有趣的是，此肽的数个残基（显示朝向底部左边的Lys之后的那些）在电子密度中看不见，提示它们动态处于结合状态。C和D部分中显示的结构中的肽在序列上密切相关，区别仅在于最后两个残基颠倒。此残基颠倒对环大小从“CX₅C”缩小至“CX₄C”具有叠加效应。可见两种肽与蛋白质的接触略有不同；特别地，Lys侧链相互作用不同，并因此，肽亲和力受到影响。

实施例12：Dkk1肽的最小结合序列的确定和最小化类似物中个别残基的替代。

为了确定Dkk1肽的七个残基是否都是结合LRP6E1所必需的，合成了数种更短的肽。这些肽缺少一个或多个取自N端或C端的残基。自任一端消除三个残基完全消除结合。这些删除足以消除“NXI”基序的保守Ile或保守Asn。这确认了这两个残基对结合LRP6位点的重要性。更少的删除一般保留结合，对亲和力的影响不超过3倍。图17（A和B）。

来自一项替代研究的结果显示于图18。替代肽Ac-NSIKGY-am中的Asn残基确认了此残基在结合LRP6E1域中的重要性。特别地，通常保守的替代Gln导致可检测结合的完全丧失。S，I，和K残基的替代一般得到更多耐受。用Ala或用碱性残基Lys，Arg，His或ε,ε-二甲基Lys替换Ser略微改进了亲和力，尽管具有更短侧链的碱性残基（诸如Orn，Dab，和Dap）随着侧链长度缩短显示出更低的亲和力。Ile的许多疏水性替代得到耐受，尽管具有更大侧链的氨基酸（诸如Phe）不然。相对较长的侧链（诸如Leu或Met的）引起亲和力的显著损失。Ile的β-甲基看来具有最小重要性，因为Nva以与含Ile亲本相似的亲和力结合，而且还对Val和Abu类似物观察到相似的样式。然而，用带电荷的残基（Glu）替代Ile残基消除结合。最后，可以用多种碱性氨基酸替换Lys残基。其中，Orn和Arg肽保留与Lys亲本的亲和力接近的亲和力，而具有更短侧链的氨基酸（Dap和Dab）降低肽亲和力。测试的任何位置（S，I或K）处的Nα-甲基氨基酸的替代引起亲和力的实质性损失（未检测到结合）。

实施例13：对疏水性口袋的进一步探索。

在来自例示性家族1的肽（亲本肽与图16A所示肽相同）的背景中探索“NXI”基序Ile位置处的侧链偏爱。另合成了十种肽，每种用一个不同疏水性氨基酸替换Ile残基（表2；图19）。除环己基甘氨酸（Chg）替代外，每种肽均结合LRP6。掺有非遗传编码氨基酸正缬氨酸（Nva）的肽与亲本Ile肽等效。另外，携带三个β-甲基的Tle肽与Val肽（携带两个此类甲基）等效。根据这两项比较，可以推断LRP6E1能在肽侧链上容纳一个额外的β-甲基（或损失一个此类甲基），对亲和力没有有害影响。

实施例14：将“NXI”基序转移至结构化肽支架。

具有进行特定接触所需侧链和溶液中明确（且适宜）的构象二者的肽预期可能展现对靶蛋白的更高亲和力。想着这个想法，将结合至LRP6的配体的结构与已发表的肽结构进行比较。“NXI”基序的Asn周围的罕见主链构象表现为匹配一类植物蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk抑制剂；BBI）。较短二硫键抑制肽可取自较大天然抑制剂，并测定了这些肽中的一些的结构（42）。比较几个残基，“NXI”基序的主链构象与BBI肽结构密切重叠（图20A）。唯一的显著序列差异为与结合LRP6所需的Asn相比，一个BBI环Lys（胰蛋白酶抑制的P1决定子）。具有此单一氨基酸改变的一种BBI相关肽的合成产生了对LRP6有亲和力的肽（22μM；图20B）。值得注意的是，此BBI模拟物没有Dkk1中与LRP6的酸性片相互作用的Lys残基的等同物。这显示了“NXI”基序足以结合LRP6E1。

实施例15：二硫键以外的肽环化策略。

如前一个实施例中描述的，肽的环化能提高对靶蛋白的亲和力。另外，在有些情况中，环化可增强在生物学背景下的稳定性或以其它方式改进肽的特性以用于调控生物学效应。因此，对为给定肽限定多种环化方法发生兴趣。结合至LRP6的Dkk1肽的结构提示这样一种策略（图21A）。结合的肽以使得第二个（Ser）和第七个（Asn）残基的侧链指向彼此的方式弯曲。距离使得它可通过Lys侧链（替换Ser）和Asp侧链（替换Asn）之间的酰胺键形成而连接。合成靶环肽并发现其以与亲本Dkk1肽等同的亲和力结合LRP6（图21B）。

实施例16：“NXI”基序肽抑制Wnt抑制剂对LRP6的结合但不抑制Wnt结合。

如果能在不干扰由Wnt配体进行的积极信号传导的情况下消除抑制剂的作用，那么致力于刺激或恢复由Wnt刺激的骨生长的一种治疗策略可能是最有效的。用LRP6的BMD突变体类似物进行的实验（实施例9）提示抑制剂结合和Wnt结合可能可分开（由于LRP5/6上不同的表位）的可能性。为了支持来自蛋白质诱变的结论，对肽测定针对各种配体结合LRP6的抑制活性。三种不同肽抑制抑制剂Dkk1和sclerostin对LRP6E1E2的结合，不影响Wnt9B的结合（图22）。这显示了低分子量配体能再现BMD突变的影响。

实施例17：可以在离体骨生长测定法中测试化合物。

为了评估肽或其它药剂是否对骨生长具有有用影响，使用离体骨生长测定法。此测定法跟踪培养中的小鼠胚胎头骨（颅盖）的发育。发育中的骨产生多种有关细胞类型，例如成骨细胞，而且解剖的颅盖足够复杂从而以指示潜在体内响应的方式响应治疗。另外，颅盖测定法比动物处理更方便。一般而言，收获颅盖并分成两半，如先前所述进行测定（见实施例1）（52，55）。以靶测定浓度50倍在水中溶解肽，然后每天在测定培养基中新鲜稀释。7天里每天更换培养基。在此生长期结束时，如（52，55）所述加工样品进行分析。组织学染色（茜素红/阿辛蓝）以红色揭示了骨化区域。

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Claims (26)

1.一种分离的肽，其包含氨基酸序列X₀X₁X₂X₃，其中X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；且X₃为K，R或H。

2.权利要求1的肽，其中该肽包含氨基酸序列X₁X₀X₁X₂X₃X₄，其中X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为A，S，F，T，Y，L，K或R；X₂为I或V；X₃为K，R或H；且X₄为F，T，Y，L或V。

3.权利要求1的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列：NX₁IK，NX₁VK，NX₁IR，NX₁VR，NX₁IH和NX₁VH，其中X₁为A，S，F，T，Y。

4.权利要求1的肽，其中该肽为选自家族1（图1）的肽。

5.权利要求4的肽，其中该肽的至少一个氨基酸用氨基酸类似物替代。

6.权利要求1的肽，其中该肽包含氨基酸类似物。

7.权利要求1的肽，其中该肽抑制Dkk1对LRP6的结合但不抑制Wnt9B对LRP6的结合。

8.权利要求1的肽，其中该肽结合LRP6的E1β-螺旋桨。

9.权利要求8的肽，其中该肽与LRP6的E1β-螺旋桨的氨基酸残基R28，E51，D52，V70，S71，E73，L95，S96，D98，E115，R141和N185中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个或全部的相互作用。

10.一种分离的环肽，其包含氨基酸序列：X₀X₁X₂X₃，其中X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；且X₃为K，R或H。

11.权利要求10的环肽，其中该环肽包含氨基酸序列X_-1X₀X₁X₂X₃X₄，其中X_-1为P，S，C或G；X₀为N；X₁为F，Y，L，A，R或S；X₂为I或V；X₃为K，R或H；和X₄为F，T，Y，L或V。

12.权利要求10的环肽，其中该环肽包含选自下组的氨基酸序列：NX₁IK，NX₁VK，NX₁IR，NX₁VR，NX₁IH和NX₁VH，其中X₁为F，Y，L，A，R或S。

13.权利要求10的环肽，其中该肽选自家族2（图2）的肽。

14.权利要求13的环肽，其中该肽的至少一个氨基酸用氨基酸类似物替代。

15.权利要求10的环肽，其中该肽包含氨基酸类似物。

16.权利要求10的环肽，其中该肽抑制Dkk1对LRP6的结合但不抑制Wnt9B对LRP6的结合。

17.权利要求10的环肽，其中该肽结合LRP6的E1β-螺旋桨。

18.权利要求10的环肽，其中该肽与LRP6的E1β-螺旋桨的氨基酸残基R28，E51，D52，V70，S71，E73，L95，S96，D98，E115，R141和N185中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个或全部的相互作用。

19.一种分离的肽，其包含氨基酸序列：X_-1X₀X₁X₂，其中X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；且X₂为M。

20.权利要求19的肽，其中该肽包含氨基酸序列：X_-2X_-1X₀X₁X₂X₃，其中X_-2为V，I，L或F；X_-1为W，L，Y，F或I；X₀为D或E；X₁为F，W，I，S或Y；X₂为M；且X₃为W，M，A或G。

21.权利要求19的肽，其中该肽选自家族3（图3）的肽。

22.一种分离的肽，其选自家族4（图4）的肽。

23.一种用于筛选抑制Dkk1和LRP6的相互作用的化合物的方法，其包括使测试化合物与LRP6或其功能性等同物接触，并

在抑制Dkk1与LRP6相互作用的肽配体存在和缺失下测定该测试化合物对该LRP6或其功能性等同物的结合水平，

其中在该肽配体存在或缺失下结合水平的变化指示该测试化合物抑制Dkk1与LRP6相互作用，

且其中该肽配体包含选自下组的氨基酸序列：

a）家族1（图1）的氨基酸序列；

b）家族2（图2）的氨基酸序列；

c）家族3（图3）的氨基酸序列；和

d）家族4（图4）的氨基酸序列。

24.权利要求23的方法，其中该肽配体用可检测标记物标记。

25.一种用于筛选抑制Dkk1和LRP5的相互作用的化合物的方法，包括使测试化合物与LRP5或其功能性等同物接触，并

在抑制Dkk1与LRP5相互作用的肽配体存在和缺失下测定该测试化合物对该LRP5或其功能性等同物的结合水平，

其中在该肽配体存在或缺失下结合水平的变化指示该测试化合物抑制Dkk1与LRP5相互作用，

且其中该肽配体包含选自下组的氨基酸序列：

a）家族1（图1）的氨基酸序列；

b）家族2（图2）的氨基酸序列；

c）家族3（图3）的氨基酸序列；和

d）家族4（图4）的氨基酸序列。

26.权利要求25的方法，其中该肽配体用可检测标记物标记。

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