JP2017525380A - アセチルＣｏＡからアルケンを生成する組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
ＣＯおよび／またはＣＯ２をアセチル−ＣｏＡに変換する内因性酵素を含む組換え微生物が開示される。この組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡの、１〜５個の炭素原子の主鎖を有するアルケンへの変換を可能にする１つまたは複数の酵素をコードする異種核酸配列を含有する。異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列；またはアセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列；またはアセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列を含む。それぞれのコード配列は、転写プロモーターに作動可能に連結されている。
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本出願は、ＵＳＰＴＯに２０１４年９月３日に出願され、米国特許出願第６２／０４５，０８３号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子をアルケンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ ａｌｋｅｎｅｓ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。本出願はまた、ＵＳＰＴＯに２０１４年９月９日に出願され、米国特許出願第６２／０４７，８２７号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子を１，３−ブタジエンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ １，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。本出願はまた、欧州特許庁に２０１４年９月２６日に出願され、欧州特許出願第１４１８６５７４号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子を２−メチル−１，３−ブタジエンと１，３−ブタジエンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ ２−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ａｎｄ １，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。本出願はまた、欧州特許庁に２０１４年９月２６日に出願され、欧州特許出願第１４１８６６９０号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子をアルケンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ ａｌｋｅｎｅ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。前記出願である米国特許出願第６２／０４５，０８３号、米国特許出願第６２／０４７，８２７号、欧州特許出願第１４１８６５７４号、および欧州特許出願第１４１８６６９０号の内容は、全ての表、図面、および特許請求の範囲を含め、ならびにそこに含まれず、ＰＣＴのＲｕｌｅ ４．１８に準拠するＰＣＴのＲｕｌｅ ２０．５（ａ）において言及される説明、特許請求の範囲または図面の任意の要素または一部の組み込みを含め、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＵＳＰＴＯに２０１４年９月３日に出願され、米国特許出願第６２／０４５，０８３号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子をアルケンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ ａｌｋｅｎｅｓ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。本出願はまた、ＵＳＰＴＯに２０１４年９月９日に出願され、米国特許出願第６２／０４７，８２７号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子を１，３−ブタジエンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ １，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。本出願はまた、欧州特許庁に２０１４年９月２６日に出願され、欧州特許出願第１４１８６５７４号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子を２−メチル−１，３−ブタジエンと１，３−ブタジエンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ ２−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ａｎｄ １，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。本出願はまた、欧州特許庁に２０１４年９月２６日に出願され、欧州特許出願第１４１８６６９０号を正式に割り当てられた「気体性Ｃ１炭素源および／または気体性Ｃ１炭素源と電子をアルケンに変換するための遺伝子操作された微生物および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ Ｃ１−ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ ｉｎｔｏ ａｌｋｅｎｅ）に関する出願の利益およびそれに対する優先権を主張する。前記出願である米国特許出願第６２／０４５，０８３号、米国特許出願第６２／０４７，８２７号、欧州特許出願第１４１８６５７４号、および欧州特許出願第１４１８６６９０号の内容は、全ての表、図面、および特許請求の範囲を含め、ならびにそこに含まれず、ＰＣＴのＲｕｌｅ ４．１８に準拠するＰＣＴのＲｕｌｅ ２０．５（ａ）において言及される説明、特許請求の範囲または図面の任意の要素または一部の組み込みを含め、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は配列表を含む。
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発明の分野
組換え微生物が提供される。また、組換え微生物を用いる方法が提供される。この方法は、Ｃ１炭素源を、１〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンに変換する方法である。
組換え微生物が提供される。また、組換え微生物を用いる方法が提供される。この方法は、Ｃ１炭素源を、１〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンに変換する方法である。
以下の背景の考察は、単に、読者が以下に開示される微生物、方法および使用を理解するのを助けるために提供されるものであり、先行技術を説明または構成することを承諾するものではない。
グローバル経済によるエネルギーおよびバルクケミカルに対する需要の増大は、炭化水素の費用に対して高い圧力をかけてきた。化学工業およびプラスチック工業などの多くの工業は、その製品のための原料として利用可能である化石炭化水素源に依存するところが大きい。アルカンは、ガソリン、ディーゼル、およびジェット燃料の主要な構成物質である。アルケンは、原油に見出されるアルカンをクラッキングすることによって一般的に生成される。化石燃料の急速な枯渇は、アルカンの生成のための代替源を同定するための原動力であった。多くの長鎖アルカンは、多様な種によって天然に生成される。しかしながら、約１０個未満の原子の鎖長を有するアルカンおよびアルケンについては、天然の生合成経路はメタンについて知られているに過ぎない。そのような短鎖アルカンおよびアルケンは、燃料として使用されるだけでなく、バルクケミカルの生成においても重要である。それらは、例えば、プラスチック、ポリエステル、溶媒、燃料、接着剤、または塗料の構成要素として役立つ。例えば、プロペン（プロピレン）は、ポリエチレン、ポリプロピレン、アルファオレフィン、スチレン、ポリエステル、アクリル、エチレングリコール不凍剤、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、プロピレンオキシド、ケトアルコール、およびイソプロパノールを製造するために用いられる末端オレフィンである。プロペンは、伝統的には、クラッキングおよび他の精製プロセスから得られる炭化水素混合物に由来する分留から得られる。エチレンもまた、出発材料として、例えば、ポリウレタン、ゴム製品、実験用化学物質、工業用流体、および凍結防止化合物のためのモノマーとして役立つ。それはまた、燃料および燃料添加物を生成するために用いられる。
１，３−ブタジエンは、−４．５℃で液体に凝結する無色の気体である。抽出蒸留プロセスを用いて、ブタジエンは、エチレンおよびプロピレン生成のクラッカー副産物の１つである、未精製のＣ４流から得られる。ブタジエンの最大の単独使用は、スチレン−ブタジエンゴム（ＳＢＲ）の生成におけるものであり、これは次いで、主に自動車用タイヤの製造において用いられる。ＳＢＲはまた、接着剤、シーラント、コーティングおよび靴底のようなゴム商品において用いられる。また、ポリブタジエンもタイヤにおいて用いられ、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）の生成における中間体として用いることができる。ＡＢＳは、電話、コンピュータケースおよび他の電化製品などの商品において広く用いられている。ブタジエンから作られる他のポリマーとしては、例えば、カーペット裏地および接着剤において用いられるスチレン−ブタジエンラテックス；ホース、燃料経路、ガスケットシール、手袋および履き物において用いられるニトリルゴム；ならびにアスファルト改良剤（道路および屋根の建築用途）から接着剤、履き物および玩具までの多くの最終用途において用いられるスチレン−ブタジエンブロックコポリマーが挙げられる。ブタジエンから作られる化学的中間体としては、アジポニトリルおよびクロロプレンが挙げられ、それぞれ、ナイロンおよびネオプレンの製造において用いられる。約１０００万トンのブタジエンが、現在毎年製造されている。１，３−ブタジエンの販売は世界で１００億米ドルを超える価格である。代替原料および／または再生可能原料からブタジエンを製造することができると、より持続可能な化学物質生成プロセスを達成するための大きな進歩となる。
２−メチル−１，３−ブタジエンまたはイソプレンは、多くの植物、動物および細菌によって天然に生成される無色の揮発性液体である。２−メチル−１，３−ブタジエンは、様々な合成ポリマー、特に、合成エラストマーの合成のための重要な出発材料として役立つ。今日利用可能であり、合成エラストマーの生成に必要とされる２−メチル−１，３−ブタジエンの大半は、石油または油の熱分解によって生成される。エラストマー、またはゴムは、タイヤの製造において必要であるだけでなく、ゴム工業においても必要であり、それらは医療用手袋、フィッティング、ゴムバンド、靴、運動用品などの様々な消費者製品のために用いられている。合成ゴムは、主に、エチレンおよびプロピレンの生成から副産物として得られるブタジエンポリマーに基づくものである。２−メチル−１，３−ブタジエンは石油を分画することによって取得することができるが、石油の精製は高価かつ時間消費的であり、必要とされる努力と比較した場合に得られる２−メチル−１，３−ブタジエンの収率が低い。天然ゴムの入手可能性が厳しくなり、その価格が上昇するにつれて、２−メチル−１，３−ブタジエンの供給はさらに不安定となる。また、環境に深く配慮するようになったため、オレフィンのクラッキングからの粗製Ｃ５供給流の許容性は下落している。かくして、最近では、２−メチル−１，３−ブタジエンを生成するためのより経済的な方法、特に、生物に基づくプロセスが試みられている。２−メチル−１，３−ブタジエンのための生物資源、すなわち、ある特定の植物がそのようなものとして利用可能であるが、経済的かつ実用的に実現可能である、植物から２−メチル−１，３−ブタジエンを生成し、回収するための商業的プロセスはこれまでのところ開発されていない。細菌ガスを用いる合成からのイソプレン生成の試みが行われている（米国特許出願公開第２０１４／０２３４９２６号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０３２３８２０号明細書、国際公開第２０１４／０６５２７１号パンフレット、国際公開第２０１３／１８０５８４号パンフレット、国際公開第２０１３／１８１６４７号パンフレット）が、用いられる株は収率、純度および安定性の点で工業生産の要件を満たしていない。
液体燃料または化学物質への合成ガス変換のための利用可能な技術としては、Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈプロセスなどの化学触媒プロセスならびにメタノールまたは他の混合アルコールの合成のためのプロセス、および生物学的ガス発酵プロセスが挙げられる。Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈプロセスは、ほぼ１００年来使用されており、合成ガスのより長い鎖の炭化水素への変換を金属に基づく無機触媒に依拠している。
天然の生化学的代謝プロセスによって炭素を固定する生物系は公知である。藻類系は、光合成反応、ならびに光合成に間接的に依存する糖により供給される従属栄養反応によって炭化水素を生成するために開発されている。細菌細胞は、従属栄養発酵系において糖原料を有用な炭化水素に加工するように遺伝子操作されている。
例えば、アルケンを直接的または間接的に生成するための生物学的経路が開示されている（米国特許出願公開第２０１１／０２６９２０４号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００９１９５２号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２６９２０４号明細書、国際公開第２０１２／０５８６０６号パンフレット、米国特許出願公開第２０１２／０３２９１１９号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２２４８０８号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０３１６４２５号明細書、国際公開第２０１３／１４８３４８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／００３９１４３号明細書、国際公開第２０１４／０４７２０９号パンフレット）。しかしながら、これらの開示の方法は、特に、それらを大規模工業生産にとって不十分であるか、または不適当にする制限を有する。いくつかの刊行物（Lee, C. C, et al., Science (2010) 329, 5992, 642；Yang, Z.-Y, et al., Journal of Biological Chemistry (2011) 286, 22, 19417-19421）は、精製バナジウムならびにモリブデンニトロゲナーゼはＣＯまたはＣＯ２またはＣＮの変換を触媒して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで炭化水素を形成することができることを示している。
組換え微生物が提供される。組換え微生物は、典型的には、Ｃ１炭素化合物、特に、一酸化炭素および／または二酸化炭素から、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンを生成することができる。組換え微生物はまた、一酸化炭素、二酸化炭素および／またはシアン化物などのＣ１炭素から、１〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成することもできる。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、一酸化炭素または二酸化炭素から、２または３個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成することができる。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、一酸化炭素または二酸化炭素から、４または５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成することができる。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、光合成を実行することができない。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、組換え微生物にＣＯ、ＣＯ２および／またはシアン化物からのアセチル−ＣｏＡの生合成を実施させる内因性酵素を有する。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、組換え微生物にＣＯ、ＣＯ２および／またはシアン化物からのアセチル−ＣｏＡの生合成を実施させる同種酵素を有する。
本明細書に記載の細胞は、アルカンおよび／またはアルケンの生合成のための人工的かつ効率的な経路を含有する。ある特定の実施形態においては、それぞれの生合成遺伝子は、宿主染色体中に安定に組み込まれる。また、ロバストな商業プロセスの需要を満たすのに十分な高い収率および純度で２つのアルカンおよび／またはアルケンを生成することができる手段によるプロセスも提供される。これらのプロセスは、非常に清潔かつ効率的であり（費用および時間節約の点で）、目的のアルカンおよび／またはアルケンを生成する工業的に実現可能な方法である。
第１の態様によれば、組換え微生物が提供される。組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡの、１〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする異種核酸配列を含有する。異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡの、１〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素をコードするコード配列またはコード配列の組合せを含む。それぞれのコード配列は、転写プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡの、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンへの変換を可能にする１つまたは複数の酵素をコードする異種核酸配列を含有する。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、Ｃ１炭素源をアセチル−ＣｏＡに変換する１つまたは複数の内因性酵素をさらに含有する。Ｃ１炭素源は、いくつかの実施形態においては、一酸化炭素、二酸化炭素およびシアン化物のうちの少なくとも１つである。
いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡの、１〜８個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする少なくとも１つのコード配列またはコード配列の組合せを含まない。組換え微生物がアセチル−ＣｏＡの、１〜８個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする２つ以上のコード配列または２つ以上のコード配列の組合せを含む実施形態においては、組換え微生物は少なくとも１つのそれぞれのコード配列を含まなくてもよい。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、ニトロゲナーゼ酵素ＥＣ１．１８．６．１またはＥＣ１．１９．６．１をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒し、アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）を含む。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）；およびグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）を含む。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）；および３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）を含む。また、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）を含んでもよい。アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、いくつかの実施形態においては、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）；および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）を含む。いくつかの実施形態においては、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）；および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）を含む。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）を含む。アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）を含んでもよい。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）および／またはピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）を含む。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）を含む。いくつかの実施形態においては、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。いくつかの実施形態においては、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）を含む。いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリル−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）；およびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）を含む。いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；および酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）を含む。いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；および酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ(ＥＣ４．２．１．１２７)でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）；２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼを含む。
いくつかの実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−および／またはＥＣ１．２．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）、および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）、および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、および／またはゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、および／またはヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、および／またはゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、および／またはヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、および／またはゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、および／またはヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、および／またはゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、および／またはヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−またはＥＣ１．２．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−またはＥＣ１．２．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、および／またはゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）および／またはヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、および／またはゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）および／またはヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）および／またはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）；ならびに２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）および／またはメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；ＩｃｄＡＢ酵素；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；ＩｃｄＡＢ酵素；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；ＩｃｄＡＢ酵素；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；ＩｃｄＡＢ酵素；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（マロン酸セミアルデヒド形成性）（ＥＣ１．２．１．７５）；３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は、アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．５）；リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）；ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）；およびメチルブテノールシンターゼ酵素をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される微生物は、嫌気性である。微生物は、嫌気性細胞であってもよい。第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、一酸化炭素および二酸化炭素の一方または両方をアセチル−ＣｏＡに変換する内因性酵素は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素である。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全酵素の内因性酵素をコードする配列を含む。組換え微生物は、一酸化炭素および二酸化炭素の一方または両方の、アセチル−ＣｏＡへの変換を触媒するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の内因性酵素を発現してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全酵素の内因性酵素をコードする配列を含む。組換え微生物は、一酸化炭素および二酸化炭素の一方または両方の、アセチル−ＣｏＡへの変換を触媒するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の内因性酵素を発現してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全酵素の内因性酵素をコードする配列を含む。組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全酵素を発現してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、カロキシオトロップである。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、酢酸生成菌（acetogen）である。
第１の態様による組換え微生物のいくつかの実施形態によれば、全てのコード配列は、同じ共通の転写プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態によれば、異種遺伝子配列は、異種核酸分子または微生物の染色体中に含まれる。いくつかの実施形態によれば、微生物は、クロストリジウム（Clostridium）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）であってもよい。微生物はまた、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、クロストリジウム・ホルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・マグナム（Clostridium magnum）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・コッコイデス（Clostridium coccoides）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・ホルミカセチカム（Clostridium formicaceticum）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、クロストリジウム・フェルビダス（Clostridium fervidus）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）であってもよい。
いくつかの実施形態によれば、第１の態様による組換え微生物は、ムーレラ（Moorella）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、ムーレラ・サーマトトロフィカ（Moorella thermautotrophica）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、ムーレラ・ムルデリ（Moorella mulderi）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、ムーレラ・スタムシ（Moorella stamsii）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、ムーレラ・グリセリニ（Moorella glycerini）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム（Acetobacterium）属のものである。微生物は、いくつかの実施形態においては、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム・バキイ（Acetobacterium bakii）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム・カルビノリカム（Acetobacterium carbinolicum）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、アセトバクテリウム・デハロゲナンス（Acetobacterium dehalogenans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム・マリカム（Acetobacterium malicum）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、アセトバクテリウム・パルドサム（Acetobacterium paludosum）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム・フィメタリウム（Acetobacterium fimetarium）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、アセトバクテリウム・ツンドラエ（Acetobacterium tundrae）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム・ウィエリンガエ（Acetobacterium wieringae）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、アセトバクテリウム・プサモリチカム（Acetobacterium psammolithicum）であってもよい。
いくつかの実施形態によれば、第１の態様による微生物は、スポロミュサ（Sporomusa）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、スポロミュサ・オバタ（Sporomusa ovata）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、スポロミュサ・シルバセチカ（Sporomusa silvacetica）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、スポロミュサ・スフェロイデス（Sporomusa sphaeroides）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、スポロミュサ・テルミチダ（Sporomusa termitida）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、スポロミュサ・アシドボランス（Sporomusa acidovorans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、スポロミュサ・アエリボランス（Sporomusa aerivorans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、スポロミュサ・パウシボランス・アシドボランス（Sporomusa paucivorans acidovorans）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、ブラウティア（Blautia）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、ブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、ブラウティア・ウェクスレラエ（Blautia wexlerae）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、ブラウティア・ヒドロゲノトロフィカ（Blautia hydrogenotrophica）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、ブラウティア・ハンセニ（Blautia hansenii）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、カルボキシドセラ（Carboxydocella）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドセラ・スポロプロデューセンス（Carboxydocella sporoproducens）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドセラ・フェリレデューセンス（Carboxydocella ferrireducens）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、カルボキシドセラ・サーマウトトロフィカ（Carboxydocella thermautotrophica）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、カルボキシドセラ（Carboxydocella）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドセラ・スポロプロデューセンス（Carboxydocella sporoproducens）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、カルボキシドサームス（Carboxydothermus）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドサームス・ヒドロゲノフォーマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドサームス・フェリレデューセンス（Carboxydothermus ferrireducens）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、カルボキシドサームス・パーチナックス（Carboxydothermus pertinax）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドサームス・アイランディクス（Carboxydothermus islandicus）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、カルボキシドサームス・シデロフィルス（Carboxydothermus siderophilus）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルホトマクルム・カルボキシジボランス（Desulfotomaculum carboxydivorans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルホトマクルム・ギブソニアエ（Desulfotomaculum gibsoniae）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、デスルホトマクルム・クズネトソビ（Desulfotomaculum kuznetsovii）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルホトマクルム・サーモベンゾイクム亜種サーモシントロフィクム（Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルホトマクルム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、デスルホトマクルム・アルコーリボラックス（Desulfotomaculum alcoholivorax）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルホトマクルム・カルボキシジボランス（Desulfotomaculum carboxydivorans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルホトマクルム・サポマンデンス（Desulfotomaculum sapomandens）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、デスルホトマクルム・サーモシステルナム（Desulfotomaculum thermocisternum）であってもよい。
いくつかの実施形態によれば、第１の態様による微生物は、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルフォビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルフォビブリオ・アラスケンシス（Desulfovibrio alaskensis）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、デスルフォビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、デスルフォビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、マイコバクテリウム・ゴルドナ（Mycobacterium gordonae）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）であってもよい。いくつかの実施形態によれば、微生物は、ルミノコッカス（Ruminococcus）属のものである。いくつかの実施形態においては、微生物は、ルミノコッカス・ヒドロゲノトロフィクス（Ruminococcus hydrogenotrophicus）であってもよい。微生物は、いくつかの実施形態においては、ルミノコッカス・シンキイ（Ruminococcus schinkii）であってもよい。いくつかの実施形態においては、微生物は、ルミノコッカス・プロダクタス（Ruminococcus productus）であってもよい。
いくつかの実施形態によれば、第１の態様による組換え微生物は、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アルカリバクルム・
バッキ（Alkalibaculum bacchii）、アセトアリエロビウム・リオテラ（Aecetoariaerobium riotera）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、デスルフィトバクテリウム・ハフィエリス（Desulfitbacterium hafhierise）、ペプトストレプトコッカス・プロダクタス（Peptostreptococcus productus）、ロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）、サーモアナエロバクター・キウビ（Thermoanaerobacter kiuvi）、オキソバクター・プフェニギ（Oxobacter pfennigii）、アセトハロビウム・アラバチカム（Acetohalobium arabaticum）、カルボフィルス・カルボキシダス（Carbophilus carboxidus）、クロアシバチルス・エブリエンシス（Cloacibacillus evryensis）、ヒドロゲノファガ・シュードフラバ（Hydrogenophaga pseudoflava）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、シュードモナス・ガゾトロファ（Pseudomonas gazotropha）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、カルデリハビタンス・マリチムス（Calderihabitans maritimus）、カロリバクテリウム・システルナエ（Caloribacterium cisternae）、カルボキシドブラキウム・パシフィカム（Carboxydobrachium pacificum）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Desulfurispora thermophila）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Dictyoglomus thermophilum）、ヒドロゲノフィルス・アイランディクス（Hydrogenophilus islandicus）、サーミンコラ・カルボキシジフィラ（Thermincola carboxydiphila）、サーミンコラ・フェリアセチカ（Thermincola ferriacetica）、サーミンコラ・ポテンス（Thermincola potens）、サーモアセトゲニウム・ファエウム（Thermoacetogenium phaeum）、サーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリクス亜種カルボキシドボランス（Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus subsp. carboxydovorans）、サーモシヌス・カルボキシジボランス（Thermosinus carboxydivorans）、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）、デスルフォスポロシヌス・メリジエイ（Desulfosporosinus meridiei）、デハロコッコイデス・マッカルチ（Dehalococcoides mccartyi）、デスルファチバシルム・アリファチシボランス（Desulfatibacillum aliphaticivorans）、デスルフォバクテリウム・オートトロフィカム（Desulfobacterium autotrophicum）、デスルフォバクラ・トルオリカ（Desulfobacula toluolica）、デスルフォスピラ・ジョエルゲンセニ（Desulfospira joergensenii）、デスルフォスポロシヌス・オリエンチス（Desulfosporosinus orientis）、デスルフォスポロシヌス・ヤンギアエ（Desulfosporosinus youngiae）、デスルフォベルミクルス・ハロフィルス（Desulfovermiculus halophilus）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Desulfurispora thermophila）、ホロファガ・フォエチダ（Holophaga foetida）、メタノブレビバクター・アルボリフィルス（Methanobrevibacter arboriphilus）、オレニア・サリナリア（Orenia salinaria）、ペニバシルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、チンダリア・カリフォニエンシスTindallia californiensis）、アノキシバチルス・フラビサームス（Anoxybacillus flavithermus）、デスルフォビルグラ・サーモクニクリ（Desulfovirgula thermocuniculi）、サーモセジミニバクター・オセアニ（Thermosediminibacter oceani）、カンジダタス・スカリンデュア・ブロダエ（Candidatus Scalindua brodae）、アセトアナエロビウム・ノテラエ（Acetoanaerobium noterae）、アンモニフェックス・デゲンシ（Ammonifex degensii）、アセチトマクルム・ルミニス（Acetitomaculum ruminis）、アセトアナエロビウム・ロマシュコビル（Acetoanaerobium romashkovil）、アセトネマ・ロンガム（Acetonema longum）、ブリアネラ・フォルマテキシゲンス（Bryanella formatexigens）、カロラマトル・フェルビダス（Caloramator fervidus）、ナトロニエラ・アセチゲナ（Natroniella acetigena）、ナトロニンコラ・ヒスチノボランス（Natronincola histinovorans）、シントロフォコッカス・スクロムタンス（Syntrophococcus sucromutans）、トレポネマ・プリミチア（Treponema primitia）、シュードモナス・カルボキシドヒロゲナ（Pseudomonas carboxydohyrogena）、シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Pseudomonas thermocarboxydovorans）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、ストレプトミセス・サーモオートトロフィクス（Streptomyces thermoautotrophicus）、バチルス・シュレゲリ（Bacillus schlegelii）、カルダナエロバクター・スブテラネウス（Caldanaerobacter subterraneus）、サーモリトバクター・カルボキシジボランス（Thermolithobacter carboxydivorans）、サーモコッカス・オヌリネウス（Thermococcus onnurineus）、サーモフィルム・カルボキシジトロフス（Thermofilum carboxyditrophus）、アルケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、デスルフォモニル・チエジェイ（Desulfomonile tiedjei）、サーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）またはルブリビバックス・ゲラチノーサ（Rubrivivax gelatinosa）の種である。
バッキ（Alkalibaculum bacchii）、アセトアリエロビウム・リオテラ（Aecetoariaerobium riotera）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、デスルフィトバクテリウム・ハフィエリス（Desulfitbacterium hafhierise）、ペプトストレプトコッカス・プロダクタス（Peptostreptococcus productus）、ロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）、サーモアナエロバクター・キウビ（Thermoanaerobacter kiuvi）、オキソバクター・プフェニギ（Oxobacter pfennigii）、アセトハロビウム・アラバチカム（Acetohalobium arabaticum）、カルボフィルス・カルボキシダス（Carbophilus carboxidus）、クロアシバチルス・エブリエンシス（Cloacibacillus evryensis）、ヒドロゲノファガ・シュードフラバ（Hydrogenophaga pseudoflava）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、シュードモナス・ガゾトロファ（Pseudomonas gazotropha）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、カルデリハビタンス・マリチムス（Calderihabitans maritimus）、カロリバクテリウム・システルナエ（Caloribacterium cisternae）、カルボキシドブラキウム・パシフィカム（Carboxydobrachium pacificum）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Desulfurispora thermophila）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Dictyoglomus thermophilum）、ヒドロゲノフィルス・アイランディクス（Hydrogenophilus islandicus）、サーミンコラ・カルボキシジフィラ（Thermincola carboxydiphila）、サーミンコラ・フェリアセチカ（Thermincola ferriacetica）、サーミンコラ・ポテンス（Thermincola potens）、サーモアセトゲニウム・ファエウム（Thermoacetogenium phaeum）、サーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリクス亜種カルボキシドボランス（Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus subsp. carboxydovorans）、サーモシヌス・カルボキシジボランス（Thermosinus carboxydivorans）、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）、デスルフォスポロシヌス・メリジエイ（Desulfosporosinus meridiei）、デハロコッコイデス・マッカルチ（Dehalococcoides mccartyi）、デスルファチバシルム・アリファチシボランス（Desulfatibacillum aliphaticivorans）、デスルフォバクテリウム・オートトロフィカム（Desulfobacterium autotrophicum）、デスルフォバクラ・トルオリカ（Desulfobacula toluolica）、デスルフォスピラ・ジョエルゲンセニ（Desulfospira joergensenii）、デスルフォスポロシヌス・オリエンチス（Desulfosporosinus orientis）、デスルフォスポロシヌス・ヤンギアエ（Desulfosporosinus youngiae）、デスルフォベルミクルス・ハロフィルス（Desulfovermiculus halophilus）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Desulfurispora thermophila）、ホロファガ・フォエチダ（Holophaga foetida）、メタノブレビバクター・アルボリフィルス（Methanobrevibacter arboriphilus）、オレニア・サリナリア（Orenia salinaria）、ペニバシルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、チンダリア・カリフォニエンシスTindallia californiensis）、アノキシバチルス・フラビサームス（Anoxybacillus flavithermus）、デスルフォビルグラ・サーモクニクリ（Desulfovirgula thermocuniculi）、サーモセジミニバクター・オセアニ（Thermosediminibacter oceani）、カンジダタス・スカリンデュア・ブロダエ（Candidatus Scalindua brodae）、アセトアナエロビウム・ノテラエ（Acetoanaerobium noterae）、アンモニフェックス・デゲンシ（Ammonifex degensii）、アセチトマクルム・ルミニス（Acetitomaculum ruminis）、アセトアナエロビウム・ロマシュコビル（Acetoanaerobium romashkovil）、アセトネマ・ロンガム（Acetonema longum）、ブリアネラ・フォルマテキシゲンス（Bryanella formatexigens）、カロラマトル・フェルビダス（Caloramator fervidus）、ナトロニエラ・アセチゲナ（Natroniella acetigena）、ナトロニンコラ・ヒスチノボランス（Natronincola histinovorans）、シントロフォコッカス・スクロムタンス（Syntrophococcus sucromutans）、トレポネマ・プリミチア（Treponema primitia）、シュードモナス・カルボキシドヒロゲナ（Pseudomonas carboxydohyrogena）、シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Pseudomonas thermocarboxydovorans）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、ストレプトミセス・サーモオートトロフィクス（Streptomyces thermoautotrophicus）、バチルス・シュレゲリ（Bacillus schlegelii）、カルダナエロバクター・スブテラネウス（Caldanaerobacter subterraneus）、サーモリトバクター・カルボキシジボランス（Thermolithobacter carboxydivorans）、サーモコッカス・オヌリネウス（Thermococcus onnurineus）、サーモフィルム・カルボキシジトロフス（Thermofilum carboxyditrophus）、アルケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、デスルフォモニル・チエジェイ（Desulfomonile tiedjei）、サーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）またはルブリビバックス・ゲラチノーサ（Rubrivivax gelatinosa）の種である。
第２の態様によれば、組換え核酸分子が提供される。組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡの、２〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を可能にする１つまたは複数の酵素をコードする核酸配列を含有する。組換え核酸分子がアセチル−ＣｏＡの、２〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする２つ以上のコード配列または２つ以上のコード配列の組合せを含む実施形態においては、組換え核酸分子は少なくとも１つのそれぞれのコード配列を含まなくてもよい。いくつかの実施形態においては、組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡの、２〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする少なくとも１つのコード配列またはコード配列の組合せを含まない。
いくつかの実施形態においては、組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡの、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンへの変換を可能にする１つまたは複数の酵素をコードする核酸配列を含有する。組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含んでもよい。組換え核酸分子はまた、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含んでもよい。組換え核酸分子はまた、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を含んでもよい。組換え核酸分子中に含まれるそれぞれのコード配列は、転写プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、ニトロゲナーゼ酵素ＥＣ１．１８．６．１またはＥＣ１．１９．６．１をコードするコード配列を含有する。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）；およびグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）；および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）；および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）；およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）および／またはピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）および（ｂ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態においては、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）の１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）の組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）の組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）の組合せ；（ｍ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）の組合せ；（ｍ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）；ならびにアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；および（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）の組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）の組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）の組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）を含む。いくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）の組合せ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）またはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）またはメチルブテノールシンターゼのうちの１つまたは複数との組合せを含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）との組合せ；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。いくつかの実施形態において、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）と３−ヒドロキシ−ブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）との組合せ；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
第２の態様による組換え核酸分子のいくつかの実施形態において、アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。いくつかの実施形態において、アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する１つまたは複数の酵素は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）およびアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）、および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．４）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）、および／または（ｉ）ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）もしくはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つもしくは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）もしくはメチルブテノールシンターゼ酵素のうちの１つもしくは複数との組合せをコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；ならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）、および／または（ｉ）ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）もしくはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つもしくは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）もしくはメチルブテノールシンターゼ酵素のうちの１つもしくは複数との組合せをコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）の組合せ；ならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ならびにリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）でもあるゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）、および／または（ｉ）ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）もしくはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つもしくは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）もしくはメチルブテノールシンターゼ酵素のうちの１つもしくは複数との組合せをコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、（ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）の組合せ；（ｉｉ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびに（ｉｉｉ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、（ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）およびアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；および３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素の組合せ；（ｉｉ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびに（ｉｉｉ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；およびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）；酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）；およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ−デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ酵素（ＥＣ５．４．９９．２）；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．４１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；（ｖｉ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ酵素（ＥＣ５．４．９９．２）；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．４１）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）；ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；（ｉ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）、グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）および／または（ｉｉ）４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）およびグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）の組合せ；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の態様による組換え核酸分子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（マロン酸セミアルデヒド形成性）（ＥＣ１．２．１．７５）；３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）；３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）；ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、（ｉ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）および／または（ｉｉ）乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）の組合せ；リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびにフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列を含む。
第３の態様によれば、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンを生成する方法が提供される。この方法は、第２の態様による組換え微生物と、一酸化炭素および／または二酸化炭素とを接触させることを含む。
第３の態様による方法は、エチレンを生成する方法であってもよい。この方法はまた、１−プロペンを生成する方法であってもよい。いくつかの実施形態においては、方法は、１−ブテンを生成する方法であってもよい。いくつかの実施形態においては、方法は、２−メチルプロペンを生成する方法であってもよい。いくつかの実施形態においては、方法は、１，３−ブタジエンを生成する方法であってもよい。いくつかの実施形態においては、方法は、１−ペンテンを生成する方法であってもよい。方法は、いくつかの実施形態においては、２−メチル−１，３−ブタジエンを生成する方法であってもよい。
さらなる利点は以下の説明中に部分的に記載され、部分的には説明および図面から明らかであるか、または本明細書に開示される方法もしくは微生物の実施によって学習することができる。それぞれの方法および微生物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素および組合せを用いて実現および達成されるであろう。前記の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的および説明的なものに過ぎず、特許請求されるように本発明を限定するものではないことを理解されるべきである。
図面を通して、以下の参照番号を適用する：
２０−トランスポザーゼ（例えば、ｈｉｍａｒ１）
２２−トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
２４−抗生物質耐性マーカー（ｍＩｓＲ）
２６−目的の遺伝子（カーゴ）
２８−トランスポザーゼ認識部位（３’ＩＴＲ逆方向末端反復）
３０−複製起点
３１−アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝ＡtoＢ
３２−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｈｂｄ
３４−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）＝ｃｒｔ
３６−アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ＹｃｉＡ、ＹｄｉＩ
３８−フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）＝ＰＡＤ１、ＰＡＤＣ
４０−ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ５．４．４．４およびＥＣ４．２．１．１２７）＝ＧＩＭ、ＧＩＴ
４２−アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）＝ＡｃｃＡＢＣＤ
４４−アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）＝ｎｐｈＴ７
４６−アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｐｈａＢ１
４８−（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）＝ｐｈａＪ
５０−４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）＝ｇａｂＴ
５２−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）＝ｇｄｈ
５４−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）＝ｙｇａＦ
５６−グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）＝ｇｃｔＡ
５８−２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）＝ｈｄｇＡＢ
６０−グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）＝ｇｃｄＡＢＣＤ
６２−４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）とも呼ばれる＝４ｈｂＤ
６４−４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ａｂｆＴ
６６−ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）＝ａｂｆＤ
６８−４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）＝ａｂｆＤ
７０−アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝Ｂｋｔｂ
７２−２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、２−ケトグルタル酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）とも呼ばれる＝ＫｏｒＡＢ
７４−ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、ピルビン酸／ケトイソ吉草酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）＝ＰＦＯＲ
７６−メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）＝ｓｃｐＡ
７８−メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）＝ｓｃｐＢ
８０−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）＝ｍｖａＳ
８２−３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）＝ｌｉｕＣ
８４−３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）＝ｌｉｕＢＤ
８６−ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｔｅｒ
８８−アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝Ｂｋｔｂ
９０−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｐＡＡＨ１
９２−アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ｍＢＡＣＨ
９４−リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＝ｐｔｂ
９６−酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）＝ｂｕｋ
１００−乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ｐｃｔ
１０２−ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）＝ｌｃｄＡＢ
１０４−マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）＝ｍｃｒ
１０６−マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）＝ｍｃｒ
１０８−プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）＝ｐｃｒ
１１０−プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）＝ｐｃｒ、ｍｓｅｄ１２
１１２−プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）＝ｐｃｒ
１３２−リプレッサー（例えば、ｌａｃＩ）
１３４−オペレーター部位（例えば、ｌａｃオペレーター）
１３６−トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
１３８−抗生物質耐性遺伝子（ｍＩｓＲ）
１４０−抗生物質耐性タンパク質（ｍＩｓＲ）
１４２−陽性選択特徴を有するプラスミド
１４４−ＤＮＡカセットが無作為に組み込まれた染色体
ｐＭＢ１＝複製起点（大腸菌（E.coli））
ｒｅｐＨ＝複製起点（クロストリジウム（Clostridium））
ｃａｔｐ＝クロラムフェニコール／チアンフェニコール耐性マーカー
ｌａｃＩ＝ｌａｃリプレッサー
ｔｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサー
ｘｙｌＲ＝キシロースリプレッサー
ｈｉｍａｒ＝トランスポザーゼ
２０−トランスポザーゼ（例えば、ｈｉｍａｒ１）
２２−トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
２４−抗生物質耐性マーカー（ｍＩｓＲ）
２６−目的の遺伝子（カーゴ）
２８−トランスポザーゼ認識部位（３’ＩＴＲ逆方向末端反復）
３０−複製起点
３１−アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝ＡtoＢ
３２−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｈｂｄ
３４−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）＝ｃｒｔ
３６−アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ＹｃｉＡ、ＹｄｉＩ
３８−フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）＝ＰＡＤ１、ＰＡＤＣ
４０−ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ５．４．４．４およびＥＣ４．２．１．１２７）＝ＧＩＭ、ＧＩＴ
４２−アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）＝ＡｃｃＡＢＣＤ
４４−アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）＝ｎｐｈＴ７
４６−アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｐｈａＢ１
４８−（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）＝ｐｈａＪ
５０−４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）＝ｇａｂＴ
５２−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）＝ｇｄｈ
５４−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）＝ｙｇａＦ
５６−グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）＝ｇｃｔＡ
５８−２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）＝ｈｄｇＡＢ
６０−グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）＝ｇｃｄＡＢＣＤ
６２−４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）とも呼ばれる＝４ｈｂＤ
６４−４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ａｂｆＴ
６６−ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）＝ａｂｆＤ
６８−４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）＝ａｂｆＤ
７０−アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝Ｂｋｔｂ
７２−２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、２−ケトグルタル酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）とも呼ばれる＝ＫｏｒＡＢ
７４−ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、ピルビン酸／ケトイソ吉草酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）＝ＰＦＯＲ
７６−メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）＝ｓｃｐＡ
７８−メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）＝ｓｃｐＢ
８０−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）＝ｍｖａＳ
８２−３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）＝ｌｉｕＣ
８４−３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）＝ｌｉｕＢＤ
８６−ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｔｅｒ
８８−アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝Ｂｋｔｂ
９０−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｐＡＡＨ１
９２−アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ｍＢＡＣＨ
９４−リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＝ｐｔｂ
９６−酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）＝ｂｕｋ
１００−乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ｐｃｔ
１０２−ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）＝ｌｃｄＡＢ
１０４−マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）＝ｍｃｒ
１０６−マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）＝ｍｃｒ
１０８−プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）＝ｐｃｒ
１１０−プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）＝ｐｃｒ、ｍｓｅｄ１２
１１２−プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）＝ｐｃｒ
１３２−リプレッサー（例えば、ｌａｃＩ）
１３４−オペレーター部位（例えば、ｌａｃオペレーター）
１３６−トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
１３８−抗生物質耐性遺伝子（ｍＩｓＲ）
１４０−抗生物質耐性タンパク質（ｍＩｓＲ）
１４２−陽性選択特徴を有するプラスミド
１４４−ＤＮＡカセットが無作為に組み込まれた染色体
ｐＭＢ１＝複製起点（大腸菌（E.coli））
ｒｅｐＨ＝複製起点（クロストリジウム（Clostridium））
ｃａｔｐ＝クロラムフェニコール／チアンフェニコール耐性マーカー
ｌａｃＩ＝ｌａｃリプレッサー
ｔｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサー
ｘｙｌＲ＝キシロースリプレッサー
ｈｉｍａｒ＝トランスポザーゼ
本発明の微生物、組成物、核酸分子、ベクター、宿主細胞、および／または方法を開示および説明する前に、それらが、別途特定されない限り、特定の合成方法、または別途特定されない限り、特定の試薬に限定されず、そのようなものとして、自然に変化してもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書に記載のものと類似する、または等価である任意の方法および材料を用いることができるが、例示的な方法および材料をここで説明する。
本明細書で提供される微生物の使用は、６個以下の炭素原子の鎖長を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを取得する新規方法を可能にする。方法は、気体性Ｃ１炭素源と電子を含む、気体性Ｃ１炭素源を用いる。
特に、一酸化炭素および／または二酸化炭素から１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成する方法が本明細書に開示される。この方法は、１つまたは複数の非天然微生物の使用に基づくものである。それぞれの微生物もまた本明細書に開示される。本明細書に開示される微生物は、アルケン生合成の能力を有してもよい。また、微生物は、アルカン生合成の能力を有してもよい。いくつかの実施形態においては、微生物はまた、アルカン生合成およびアルケン生合成の能力を有してもよい。本明細書に開示される微生物は、異種核酸配列を含有する組換え微生物である。異種核酸配列は、１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の配列を含有する。それぞれの酵素は、一酸化炭素および／または二酸化炭素を変換して、１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成する能力を有する組換え微生物を提供する。
本明細書に開示される方法にしたがって生成されるアルケンは、いくつかの実施形態においては、以下の式：
この式において、Ｒ１は１個の二重結合を含有してもよい脂肪族炭素鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１は二重結合を含有しない。典型的には、Ｒ１は非分枝状である。いくつかの実施形態において、Ｒ１は４個の炭素原子を含有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１は２または３個の炭素原子を含有してもよい。Ｒ１は、いくつかの実施形態においては、１個の炭素原子を含有してもよい。Ｒ２は、二重結合を含有しない非分枝脂肪族炭素鎖であってもよい。一般に、Ｒ２は、１または２個の炭素原子を含有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ２はメチル基である。Ｒ２は水素原子であってもよい。
一般に、微生物は、１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成するように操作されている。微生物は、いくつかの実施形態においては、一酸化炭素および／または二酸化炭素から１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンを生成するように操作されている。本明細書に開示される微生物は、アルケン生合成の能力を欠く天然微生物に基づいて操作されていてもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される微生物は、一酸化炭素および／または二酸化炭素からのアルケン生合成の能力を欠く天然微生物に基づいて操作されていてもよい。本明細書に開示される微生物はまた、アルカン生合成の能力を欠く天然微生物に基づいて操作されていてもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される微生物は、一酸化炭素および／または二酸化炭素からのアルカン生合成の能力を欠く天然微生物に基づいて操作されていてもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される微生物は、アルカン生合成とアルケン生合成との両方の能力を欠く天然微生物に基づいて操作されていてもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される微生物は、一酸化炭素および／または二酸化炭素からのアルカン生合成とアルケン生合成との両方の能力を欠く天然微生物に基づいて操作されていてもよい。アルカンおよび／またはアルケン生合成の能力を有する微生物の設計および生成を含む、一酸化炭素および／または二酸化炭素からの１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンの生成のためにそのような生物を作製および使用する方法も開示される。
定義
別途記述しない限り、説明および特許請求の範囲を含む本文献中で用いられる以下の用語は、下記に与えられる定義を有する。
別途記述しない限り、説明および特許請求の範囲を含む本文献中で用いられる以下の用語は、下記に与えられる定義を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に区別しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書で用いられる単語「または」は、特定の一覧の任意の１つのメンバーを意味し、また、その一覧のメンバーの任意の組合せを含む。
本明細書で用いられる単語「約」は、当業者によって決定される特定の値に関して許容可能な誤差範囲内にある値を指し、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に一部依存する。例えば、「約」は、当業界における実務について、１または１より大きい標準偏差内を意味してもよい。用語「約」はまた、問題の量または値が指定された値またはほぼ同じであるいくつかの他の値であってもよいことを示すために用いられる。この語句は、類似する値が記載される等価な結果または効果を促進することを伝えることが意図される。この文脈において、「約」は１０％までの上および／または下の範囲を指してもよい。単語「約」とは、いくつかの実施形態においては、その値の上または下２％まで、１％まで、または０．５％までなどの、５％までである、ある特定の値の上および下の範囲を指す。一実施形態においては、「約」とは、所与の値の０．１％まで上および下の範囲を指す。
用語「対立遺伝子変異体」は、本明細書では、同じ染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを示す。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、集団内の多型をもたらしてもよい。遺伝子突然変異はサイレント（コードされるポリペプチドに変化がない）であってもよいか、またはアミノ酸配列が変化したポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
用語「アルカン」は、別途記述しない限り、飽和脂肪族分子を意味する。それぞれの脂肪族分子は、ヘテロ原子を含んでもよい、直鎖状または分枝状炭化水素鎖を有する。本明細書に開示される方法において、アルカンは、一般的には、ヘテロ原子を含有しない。炭化水素鎖の分枝は、直鎖を含んでもよい。一般に、本明細書に開示される方法において形成されるアルカンは、環状要素を含有しない。炭化水素鎖は、別途記述しない限り、任意の長さのものであってよく、任意数の分枝を含有してもよい。分枝は、メチル、エチルまたはプロピル基などのアルキル基によって定義されてもよい。典型的には、本明細書に記載の方法において形成されるアルカンの炭化水素（主）鎖は、２〜６個などの１〜８個の炭素原子を含む。
用語「アルケン」は、別途記述しない限り、１つまたは複数の二重結合を含有する、不飽和脂肪族分子を意味する。それぞれの脂肪族分子は、一不飽和または多不飽和であってもよく、ヘテロ原子を含んでもよい、直鎖状または分枝状炭化水素鎖を有する。本明細書に開示される方法において、アルケンは一般に、ヘテロ原子を含有しない。炭化水素鎖中の分枝の存在は、上記で既に述べられている。一般に、本明細書に記載の方法において形成されるアルケンは、環状要素を含有しない。典型的には、本明細書に記載の方法において形成されるアルケンの炭化水素（主）鎖は、２〜６個などの１〜８個の炭素原子を含む。
「嫌気性生物」は、増殖のために酸素を必要としない生物である。嫌気性生物は、偏性嫌気性菌、通性嫌気性菌、または酸素耐性嫌気性菌であってもよい。「偏性嫌気性菌」は、大気中濃度の酸素が致死的であり得る嫌気性生物である。偏性嫌気性菌の例としては、限定されるものではないが、クロストリジウム（Clostridium）、ユーロバクテリウム（Eurobacterium）、バクテロイデス（Bacteroides）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ブチリバクテリウム（Butyribacterium）、ベイロネラ（Veillonella）、およびアクチノミセス（Actinomyces）が挙げられる。「通性嫌気性菌」は、酸素の存在下で好気的呼吸を実行することができ、酸素制限または無酸素条件下で嫌気的発酵を実行することができる嫌気性生物である。通性嫌気性菌の例としては、限定されるものではないが、大腸菌（Escherichia）、パントエア（Pantoea）およびストレプトミセス（Streptomyces）が挙げられる。
用語「一酸化炭素資化生物」および「一酸化炭素資化」とは、高濃度の一酸化炭素を許容し、一般に、代謝のために一酸化炭素を用いることができる生物を指す。一酸化炭素資化微生物は、ＣＯの酸化からエネルギーおよび炭素をさらに取得することができる。そのような一酸化炭素資化微生物は、ＣＯを二酸化炭素に酸化することができる好気性細菌であってもよい。一酸化炭素資化微生物はまた、二酸化炭素をＣＯに還元する、および／またはＣＯを二酸化炭素と水素に変換することができる、偏性嫌気性菌であってもよい。偏性嫌気性菌であるいくつかの一酸化炭素資化微生物は、酢酸生成細菌、例えば、モレラ・サーモアセチカ（Morella thermoacetica）であり、ＣＯおよび／またはＣＯ２から酢酸塩を形成することができる。
本明細書で用いられる場合、用語「コード配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定する、ヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は一般に、通常はＡＴＧ開始コドンまたはＧＴＧおよびＴＴＧなどの代替開始コドンから始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡなどの停止コドンで終わる、オープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換えヌクレオチド配列であってもよい。
本明細書で用いられる場合、用語「保存的改変」および「保存的置換」とは、対応する参照に関して、物理的、生物学的、化学的または機能的にその特性を維持する、改変および置換をそれぞれ指す。例えば、保存的置換を有する配列を含む分子は、共有もしくは水素結合を形成する同等の能力および／または同等の極性などの、類似するサイズ、形状、電荷、化学的特性を有する。そのような保存的改変としては、限定されるものではないが、１つまたは複数の核酸塩基およびアミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。
例えば、保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものが挙げられる。例えば、抗原への結合に関して非必須であるアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置き換えることができ、例えば、セリンをトレオニンに置換してもよい。アミノ酸残基は通常、共通の類似する側鎖特性に基づくファミリー、例えば、
１．非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、
２．非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン）、
３．塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、
４．酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
５．ベータ−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
６．芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）
に分けられる。この分類を、さらに分割することができる。さらなる位置付けとして、以下の８群はそれぞれ、通常、互いに対する保存的置換を定義すると考えられるアミノ酸：
１）アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
２）アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
３）アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
４）アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）；
５）イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
７）セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；および
８）システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）
を含有する。保存的置換を、上記６群のうちの１群内の最初のアミノ酸の、６群のうちの同じ群内のさらなるアミノ酸による置換であると考えることができる。保存的置換は一般に、突然変異されるアミノ酸と、それぞれに続く１つまたは複数の、保存的であると考えることができる置換にしたがって列挙してある、以下の置換：Ａｌａ→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ；Ａｒｇ→Ｌｙｓ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ→Ａｓｎ；Ｇｌｕ→Ａｓｐ；Ｇｌｙ→Ａｌａ；Ｈｉｓ→Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ→Ｌｅｕ、Ｖａｌ；Ｌｅｕ→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｍｅｔ→Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ；Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ；Ｖａｌ→Ｉｌｅ、Ｌｅｕである。他の置換もまた許容され、経験的に、または他の既知の保存的もしくは非保存的置換にしたがって決定することができる。保存的置換はまた、非天然アミノ酸の使用を含んでもよい。
１．非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、
２．非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン）、
３．塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、
４．酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
５．ベータ−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
６．芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）
に分けられる。この分類を、さらに分割することができる。さらなる位置付けとして、以下の８群はそれぞれ、通常、互いに対する保存的置換を定義すると考えられるアミノ酸：
１）アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
２）アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
３）アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
４）アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）；
５）イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
７）セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；および
８）システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）
を含有する。保存的置換を、上記６群のうちの１群内の最初のアミノ酸の、６群のうちの同じ群内のさらなるアミノ酸による置換であると考えることができる。保存的置換は一般に、突然変異されるアミノ酸と、それぞれに続く１つまたは複数の、保存的であると考えることができる置換にしたがって列挙してある、以下の置換：Ａｌａ→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ；Ａｒｇ→Ｌｙｓ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ→Ａｓｎ；Ｇｌｕ→Ａｓｐ；Ｇｌｙ→Ａｌａ；Ｈｉｓ→Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ→Ｌｅｕ、Ｖａｌ；Ｌｅｕ→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｍｅｔ→Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ；Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ；Ｖａｌ→Ｉｌｅ、Ｌｅｕである。他の置換もまた許容され、経験的に、または他の既知の保存的もしくは非保存的置換にしたがって決定することができる。保存的置換はまた、非天然アミノ酸の使用を含んでもよい。
非保存的置換、すなわち、あるファミリーのメンバーを、別のファミリーのメンバーに対して交換することは、例えば、電荷、双極子モーメント、サイズ、親水性、疎水性または結合メンバーのコンフォメーションに関して実質的な変化をもたらし、特に、標的分子への結合にとって必須であるアミノ酸が影響される場合、結合活性の有意な低下をもたらし得る。非保存的置換はまた、非天然アミノ酸の使用を含んでもよい。
保存的および非保存的改変を、コンビナトリアル化学、部位特異的ＤＮＡ突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性および／またはカセット突然変異誘発、ペプチド／タンパク質化学合成、親結合メンバー中の反応基を特異的に改変する化学反応などの、当業界で公知の様々な標準的な技術により、親結合メンバー中に導入することができる。変異体を、その化学的、生物学的、生物物理学的および／または生化学的特性について日常的な方法によって試験することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、親配列の機能的特徴、および一般的には、構造的特徴をも実質的に変化させない。したがって、保存的置換を含む結合メンバーの結合特徴は、少なくとも本質的に変化しない。さらに、保存的アミノ酸置換は、一般に、親配列の二次構造を実質的に改変または破壊しない。
本明細書で用いられる用語「内因性」とは、宿主中に自然に存在する参照の分子を指す。したがって、微生物の文脈において本明細書で用いられる「内因性」酵素は、それぞれの種の遺伝子などの、自然では同じ微生物の一部である核酸配列から生成または合成される酵素である。
本明細書で用いられる用語「外因性」とは、参照の分子、配列または活性が、宿主微生物中に導入されるか、または導入されたことを意味することが意図される。かくして、外因性核酸分子または配列とは、自然に見出されるその特定の生物を起源としない任意の核酸分子または配列を指す。かくして、非天然核酸分子または配列は、一度、生物中に導入されたら、細胞にとって外因性であると考えられる。例えば、宿主染色体中への組み込み、またはプラスミドなどの非染色体遺伝子材料としてなど、宿主遺伝子材料中へのコード核酸分子の導入によって、その分子または配列を導入することができる。したがって、コード核酸の発現を参照して用いられる場合のこの用語は、微生物中への発現可能な形態でのコード核酸の導入を指す。生合成活性を参照して用いられる場合、この用語は、宿主参照生物中に導入される活性を指す。供給源は、例えば、宿主微生物中への導入後に参照の活性を発現する同種または異種コード核酸であってもよい。
非天然核酸分子または配列は、該核酸が全体として自然に存在しないという条件で、自然に見出される核酸配列または核酸配列の断片を含有してもよいことに留意することが重要である。例えば、発現ベクター内にゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は、非天然核酸分子であり、かくして、その核酸分子は全体として（ゲノムＤＮＡ＋ベクターＤＮＡ）は自然に存在しないため、一度、細胞中に導入されたら、細胞にとって外因性である。かくして、全体として自然には存在しない任意のベクター、自己複製プラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）は、非天然核酸であると考えられる。ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるゲノムＤＮＡ断片ならびにｃＤＮＡは、それらが自然には見出されない別々の分子として存在するため、非天然核酸であると考えられるということになる。また、自然には見出されない配置でプロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有する任意の核酸は非天然核酸であるということになる。天然に存在する核酸は、特定の生物にとって外因性であってもよい。例えば、生物Ｘの細胞から単離される全染色体は、一度、その染色体が生物の細胞中に導入されたら、生物Ｙの細胞に関して外因性核酸である。
タンパク質を参照する用語「発現すること」および「発現」は、核酸分子中に含まれ、ペプチド／タンパク質をコードする配列がそのペプチド／タンパク質産物に変換されることと定義する。核酸がＤＮＡである場合、酵素などのタンパク質は、核酸のｍＲＮＡへの転写、次いで、ポリペプチドへの翻訳を介して細胞により発現され、折り畳まれ、おそらくはさらにプロセシングされる。核酸がＲＮＡである場合、発現はこのＲＮＡのさらなるＲＮＡコピーへの複製および／またはＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、場合により、このＤＮＡのさらなるＲＮＡ分子への転写を含んでもよい。いずれの場合も、ＲＮＡの発現は、提供される／生成される任意のＲＮＡ種のタンパク質への翻訳を含む。したがって、細胞がタンパク質を発現しているという記述は、そのタンパク質がそれぞれの細胞の発現機構によって合成されたことを意味する。それぞれの生物学的プロセス自体に関して、用語「発現」、「遺伝子発現」または「発現すること」とは、遺伝子の核酸配列中にコードされる情報を、最初にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に、次いで、タンパク質に変換する調節経路の全体を指す。したがって、遺伝子の発現は、一次ｈｎＲＮＡへのその転写、このｈｎＲＮＡの成熟ＲＮＡへのプロセシングおよびｍＲＮＡ配列の、タンパク質の対応するアミノ酸配列への翻訳を含む。この文脈において、用語「遺伝子産物」は、例えば、その遺伝子によってコードされる最終タンパク質（そのスプライス変異体を含む）および適用可能な場合、それぞれの前駆体タンパク質を含むタンパク質だけでなく、遺伝子発現の経過中に「第１の遺伝子産物」と見なすことができる、それぞれのｍＲＮＡも指すことに留意されたい。タンパク質またはペプチドの発現を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を用いて実行することができる。そのような発現系は、典型的には、細菌、ウサギ網状赤血球または小麦胚芽に由来する細胞抽出物を含んでもよい。多くの好適な系が市販されている。用いられるアミノ酸の混合物は、必要に応じて、ライブラリー中で生成される可能な数または種のタンパク質を増加させるために、合成アミノ酸を含んでもよい。これを、ｔＲＮＡに人工アミノ酸をチャージし、選択されるタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳のためにこれらのｔＲＮＡを用いることによって達成することができる。発現目的での好適な実施形態は、ベクター、特に、発現ベクターの使用である。
本明細書で用いられる用語「発現カセット」とは、適切な宿主細胞中での特定のヌクレオチド配列の発現を指令することができる核酸分子を指す。発現カセットは、１つまたは複数の終結シグナルに作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。また、それは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳にとって必要とされる配列を含んでもよい。コード領域は、目的のポリペプチドをコードしてもよく、また、限定されるものではないが、アンチセンスＲＮＡまたはセンスもしくはアンチセンス方向の非翻訳ＲＮＡなどの、目的の機能的ＲＮＡをコードしてもよい。目的のヌクレオチド配列を含有する発現カセットは、キメラであってもよく、これは、その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現にとって有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかしながら、いくつかの実施形態においては、発現カセットは、宿主に関して異種である；すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞中に天然に存在せず、形質転換事象によって宿主細胞または宿主細胞の先祖に導入されたものである。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーター、または宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝露された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。植物または動物などの多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、臓器、または発生の段階に特異的であってもよい。
文脈が別途必要としない限り、本明細書で用いられる場合の語句「発酵すること」、「発酵プロセス」および「発酵反応」とは、化合物の酵素的変換を指す。それぞれの化合物は一般に、有機化合物であり、一酸化炭素および二酸化炭素などの気体性炭素化合物を含む。反応物の生成化合物への酵素的変換は、典型的には、酵素的変換にとって必要とされる酵素を包含する、および／または生成する細胞を含む。発酵プロセスは、その段階、密度および／または増殖条件に関係なく、細胞の培養を含む。例えば、プロセスの増殖期と生成物生合成期との両方が包含されることが意図される。これに関して、いくつかの実施形態においては、バイオリアクターは、第１の増殖リアクターと第２の発酵リアクターとを含有してもよい。そのようなものとして、発酵反応への金属または組成物の添加は、これらのリアクターのいずれかまたは両方への添加を含むことが理解されるべきである。
本明細書で用いられる「発酵ブロス」は、栄養培地と細菌細胞とを含む培養培地である。
「遺伝子」とは、染色体上の特定の遺伝子座を占有し、生物学的機能と関連する核酸のセグメントである遺伝的形質の単位を意味する。遺伝子は、転写および／または翻訳調節配列ならびにコード領域を包含する。コード配列の他に、遺伝子は、プロモーター領域、ｃｉｓ調節配列、調節タンパク質のための特異的認識配列である非発現ＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現ＤＮＡセグメント、所望のパラメータを有するように設計されたＤＮＡセグメント、またはその組合せを含んでもよい。生物学的試料からのクローニング、既知の、または予測される配列情報に基づく合成、および存在する配列の組換え誘導などの、様々な方法によって、遺伝子を取得することができる。
微生物の文脈において本明細書で用いられる場合、「同種」酵素は、自然では同じ種の微生物の一部である核酸配列から生成または合成される酵素である。同種酵素は、かくして、微生物の遺伝子によってコードされる酵素と同一である酵素であってもよいが、それは遺伝子操作によって微生物中に導入されたものであってもよい。それぞれの酵素は、そのような場合、微生物自身のそれぞれの酵素と区別することができない。いくつかの酵素は、同じ種内で異なるアイソフォームの形態で存在する。したがって、そのような場合、同じ種のいくつかのメンバーは第１のアイソフォームを有するが、その種の他のメンバーは第２のアイソフォームを有する。同種酵素は、いずれかのアイソフォームであってもよい。換言すれば、同種酵素は、特定の微生物の遺伝子によってコードされる酵素とは異なる酵素のアイソフォームであってもよいが、それは同じ種のいくつかの他のメンバーに見出される酵素のアイソフォームであってもよい。
本明細書で用いられる用語「同種配列」とは、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子の間、または２つのポリペプチド分子の間の配列類似性を指す。所与の配列に関するｔｆａｓｔｙ検索がさらなる配列に関して０．００１未満の予測値スコア（Ｅ値）をもたらす場合、２つの配列は同種と呼ぶことができる。
本明細書で用いられる用語「異種」とは、参照の種以外の起源から得られる分子または活性を指すが、「同種」とは、宿主微生物から得られる分子または活性を指す。したがって、本明細書に記載のコード核酸の外因性発現は、異種または同種コード核酸のいずれかまたは両方を用いることができる。微生物の文脈において本明細書で用いられる「異種」酵素は、それぞれの微生物の種とは異なる種に天然に存在する核酸配列から生成または合成される酵素である。
アミノ酸配列または核酸配列の文脈における用語「同一性」または「配列同一性」とは、２つのタンパク質または核酸の間の配列一致を指す。この用語は、かくして、その類似性または関係を測定する配列の特性を定義する。比較しようとするタンパク質または核酸配列を整列させて、最大の同一性を得る。比較のために配列を整列させるための方法は、当業界で周知である。実例は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｘと共に用いることができる、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）などの、いくつかの供給源から利用可能な、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al., J.Mol.Biol.(1990) 215, 403-410）である。ＢＬＡＳＴ（商標）は、インターネット上のＮＣＢＩのウェブサイトでアクセスすることができる。さらなる例は、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅツール（ペアワイズアラインメント；ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで利用可能）である。比較しようとする配列中の同じ位置が同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占有される場合、それぞれの分子はまさにその位置で同一である。「配列同一性」または「同一性」は、特定のポリペプチドの配列と、参照配列との（相同性）アラインメント後に、これらの２つの配列のうちの長い方における残基数に関して、ペアワイズに同一の残基のパーセンテージを定義すると考えることができる。同一性は、同一の残基数を、残基の総数で除算し、その結果に１００を掛けることによって測定される。例えば、１０個の配列位置のうちの６個が同一である場合、同一性は６０％である。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントを、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１０の「ギャップオープンペナルティ」、０．５の「ギャップ伸長ペナルティ」、偽「エンドギャップペナルティ」、１０の「エンドギャップオープンペナルティ」および０．５の「エンドギャップ伸長ペナルティ」を用いる、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（NEEDLEMAN, S.B. and Wunsch, CD., JMB (1970,) 48, 443-453）を用いて決定することができる。同じ一次アミノ酸または核酸配列を有する２つの分子は、化学的および／または生物学的改変と関係なく同一である。例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するが、グリコシル化パターンが異なる２つの酵素は、この定義によれば同一である。核酸の場合、例えば、同じ配列を有するが、リン酸の代わりにチオリン酸などの異なる結合成分を有する２つの分子は、この定義によれば同一である。
配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、例えば、ＢＬＡＳＴＰプログラム、例えば、ｂｌａｓｔｐバージョン２．２．５（２００２年１１月１６日；Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402を参照）を用いて決定することができる。この実施形態において、相同性のパーセンテージは、ペアワイズ比較における参照として既知の天然タンパク質を用いた、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメント（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：１１．１；１０−３に設定されたカットオフ値）に基づくものであってよい。それは、アラインメントのためにプログラムにより選択されるアミノ酸の総数で除算した、ＢＬＡＳＴＰプログラムのアウトプットにおける結果として示された「陽性」（相同アミノ酸）の数のパーセンテージとして算出される。これに関連して、選択されるアミノ酸のこの総数は既知の天然タンパク質の長さと異なっていてもよいことに留意されたい。
核酸またはポリペプチドを参照した用語「突然変異した」または「突然変異体」とは、天然に存在する核酸分子またはポリペプチドと比較して、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。それぞれの突然変異体は、例えば、対応する天然アミノ酸配列または核酸配列と比較して１つまたは複数の置換を含んでもよい。
本明細書で用いられる用語「突然変異誘発」は、選択されたタンパク質の所与の配列位置に天然に存在するアミノ酸を、それぞれの天然ポリペプチド配列中のこの特定の位置に存在しない少なくとも１つのアミノ酸によって置換することができるように、実験条件が選択されることを意味する。既に上述された通り、用語「突然変異誘発」はまた、１つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（さらなる）改変を含む。かくして、例えば、選択される配列位置にある１つのアミノ酸は、３つの無作為突然変異のストレッチによって置き換えられて、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して２つのアミノ酸残基の挿入をもたらしてもよい。そのような欠失の挿入を、突然変異誘発にかけることができる任意のペプチドセグメントにおいて互いに独立に導入することができる。用語「無作為突然変異誘発」は、所定の単一アミノ酸（突然変異）がある特定の配列位置に存在しないが、少なくとも２つのアミノ酸を、突然変異誘発中に規定の配列位置にある特定の確率で組み込むことができることを意味する。
選択されるタンパク質のコード配列を、突然変異誘発のための出発点として用いることができる。選択されるアミノ酸位置の突然変異誘発のために、当業者であれば、意のままに部位特異的突然変異誘発のための様々な確立された標準的な方法を使うことができる。一般的に用いられる技術は、所望の配列位置に縮重塩基組成を担持する、合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異の導入である。例えば、コドンＮＮＫまたはＮＮＳ（ここで、Ｎ＝アデニン、グアニンまたはシトシンまたはチミン；Ｋ＝グアニンまたはチミン；Ｓ＝アデニンまたはシトシンである）の使用は、突然変異誘発中に２０種全部のアミノ酸とアンバー停止コドンの組み込みを可能にするが、コドンＶＶＳは、アミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌがポリペプチド配列の選択される位置に組み込まれないため、組み込まれる可能性のあるアミノ酸の数を１２に制限する；コドンＮＭＳ（ここで、Ｍ＝アデニンまたはシトシンである）の使用は、例えば、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌが選択される配列位置に組み込まれないため、選択される配列位置での可能なアミノ酸の数を１１に限定する。これに関して、セレノシステインまたはピロリシンなどの正常な２０種の天然アミノ酸とは異なるアミノ酸のためのコドンを、核酸中に組み込むこともできることに留意されたい。また、Wang, L., et al. Science (2001) 292, 498-500またはWang, L., and Schultz, P.G. Chem. Comm. (2002) 1, 1-11により記載されたように、他の通常ではないアミノ酸、例えば、ｏ−メチル−Ｌ−チロシンまたはｐ−アミノフェニルアラニンを挿入するために通常は停止コドンとして認識されるＵＡＧなどの「人工」コドンを用いることもできる。塩基対特異性が低下したヌクレオチド構成要素、例えば、イノシン、８−オキソ−２’デオキシグアノシンまたは６（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミンド−１，２−オキサジン−７−オン（Zaccolo et al. J. Mol. Biol. (1996) 255, 589-603）の使用は、選択される配列セグメントへの突然変異の導入のための別の選択肢である。さらなる可能性は、いわゆるトリプレット突然変異誘発である。この方法は、それぞれ、コード配列への組み込みのための１つのアミノ酸をコードする異なるヌクレオチドトリプレットの混合物を使用するものである（Virnekas et al., Nucleic Acids Res (1994) 22, 5600-5607）。
微生物の文脈において本明細書で用いられる場合、用語「非天然」は、その微生物が参照種の野生型株を含む、参照種の天然株には通常は見出されない１つまたは複数の遺伝子変化を有することを意味することが意図される。遺伝子変化としては、例えば、代謝ポリペプチド、特に、１つまたは複数の酵素をコードする発現可能な核酸配列を導入する改変が挙げられる。それぞれの発現可能な核酸配列を、微生物のゲノム中に含有させるか、またはそれを微生物のゲノムとは異なる核酸分子中に含有させてもよい。遺伝子変化はまた、微生物の遺伝子材料の他の核酸付加、核酸欠失および／または他の機能的破壊を含んでもよい。そのような改変としては、例えば、参照種にとって異種、同種または異種と同種との両方のポリペプチドのためのコード領域およびその機能的断片が挙げられる。さらなる改変としては、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が挙げられる。例示的な代謝ポリペプチドとしては、アルケン生合成経路内の酵素またはタンパク質が挙げられる。
代謝的改変とは、その天然の状態から変化する生化学反応を指す。したがって、非天然微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝子改変を有してもよい。
本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖またはその組合せなどの、任意の可能な構成にある任意の核酸を指す。核酸の例としては、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体を用いて、または核酸化学を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ロックド核酸分子（ＬＮＡ）、タンパク質核酸分子（ＰＮＡ）、アルキルホスホネートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子およびｔｅｃｔｏ−ＲＮＡ分子（例えば、Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077）が挙げられる。ＬＮＡは、Ｃ４’とＯ２’との間にメチレン架橋を有する改変されたＲＮＡ骨格を有し、より高い二本鎖安定性およびヌクレアーゼ耐性を有するそれぞれの分子を提供する。アルキルホスホネートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子は、核酸骨格中のリン酸基のＰ−ＯＨ基を、それぞれ、アルキル基およびアルコキシ基に交換することによって核酸骨格のリン酸基が中和されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子と見ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノムまたは合成起源のものであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。そのような核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであってもよい。それぞれの核酸は、非天然ヌクレオチド類似体をさらに含有するか、および／または親和性タグもしくは標識に連結することができる。
多くのヌクレオチド類似体が公知であり、本明細書に記載の方法において用いられる核酸中で用いることができる。ヌクレオチド類似体は、例えば、塩基、糖、またはリン酸部分に改変を含有するヌクレオチドである。実例として、ｓｉＲＮＡの２’−ＯＨ残基の、２’Ｆ、２’Ｏ−Ｍｅまたは２’Ｈ残基との置換は、それぞれのＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を改善することが知られている。塩基部分での改変は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然または合成改変、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イルなどの異なるプリンまたはピリミジン塩基、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基であってもよい。他のヌクレオチド類似体は、ユニバーサル塩基として働く。ユニバーサル塩基の例としては、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基改変を、例えば、二本鎖安定性の増大などのユニークな特性を達成するために、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの、例えば、糖改変と組み合わせることができることが多い。
本明細書で用いられる用語「核酸構築物」とは、天然に存在する遺伝子から単離されたか、またはそうでなければ自然には存在しない様式で核酸のセグメントを含有するように改変された、または合成のものである、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が特定のコード配列の発現にとって必要とされる制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。
用語「作動可能に連結される」とは、ある核酸配列と、別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結される核酸配列の例である。例えば、ＤＮＡの転写制御エレメントへの作動可能な連結は、ＤＮＡの転写が、該ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、これを転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的かつ機能的な関係を指す。
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、ある特定の最小長の生成物に限定されない。両用語が同時に用いられる場合、この二重の命名は当業界で一緒に両用語の使用を説明する。
本明細書を通して用いられる用語「プロモーター」とは、遺伝子配列の発現にとって必要とされる核酸配列を指す。プロモーター領域は、生物間で変化するが、様々な生物について当業者に周知である。例えば、原核生物においては、プロモーター領域は、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指令する）ならびにＲＮＡに転写された場合に、合成開始のシグナルを発するＤＮＡ配列の両方を含有する。そのような領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含む。構成性と誘導性プロモーターの両方を、本明細書に開示される方法の文脈において用いることができる。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。選択されるプロモーターを、制限酵素消化を介して起源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を選択されたベクターに挿入することにより、本明細書に記載のポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの両方を用いて、選択される核酸配列の増幅および／または発現を指令することができる。
単語「組換え」は、その起源、操作、またはその両方の理由で、それが自然において関係する核酸分子の全部または一部と関係しない核酸分子を記載するために本明細書で用いられる。一般に、組換え核酸分子は、それぞれの野生型生物または細胞中には天然には存在しない配列を含む。典型的には、組換え核酸分子は、遺伝子操作によって得られ、通常は細胞の外部で構築される。一般に、組換え核酸分子は、天然に存在する対応する核酸分子の少なくとも一部と実質的に同一である、および／または実質的に相補的である。組換え核酸分子は、ゲノム、ｃＤＮＡ、哺乳動物、細菌、ウイルス、半合成または合成起源などの、任意の起源のものであってもよい。タンパク質／ポリペプチドに関して用いられる用語「組換え」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。
「類似」タンパク質配列は、整列された場合、比較しようとする配列の同じ位置において、類似するアミノ酸残基、最も頻繁には、義務的ではないが、同一のアミノ酸残基を有するものである。類似アミノ酸残基は、側鎖の化学的特性によってファミリーにグループ化される。これらのファミリーは、「保存的アミノ酸置換」について以下に記載される。配列間の「類似性パーセント」は、比較しようとする配列の同じ配列位置において同一であるか、または類似する残基を含有する位置の数を比較される位置の総数で除算し、１００％を乗算したものである。例えば、１０個の配列位置のうちの６個が同一のアミノ酸残基を有し、１０個の位置のうちの２個が類似する残基を含有する場合、配列は８０％の類似性を有する。２つの配列間の類似性は、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いて決定することができる。
用語「ストリンジェントな条件」とは、核酸分子をハイブリダイズさせる技術を指す。核酸ハイブリダイゼーション反応を、様々なストリンジェンシーの条件下で実施することができる。「ストリンジェントな条件」は、当業界で広く公知であり、公開されている。典型的には、ハイブリダイゼーション反応中に、ＳＳＣが７．０のｐＨを有する０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸バッファーであるＳＳＣに基づくバッファーを用いることができる。バッファー濃度の増大および変性剤の存在は、ハイブリダイゼーションステップのストリンジェンシーを増大させる。例えば、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、（ｉ）４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランと、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄；（ｉｉ）４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５と、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、または（ｉｉｉ）５５℃の１０％硫酸デキストラン、２ｘＳＳＣ、および５０％ホルムアミドの使用、次いで、５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄を含んでもよい。さらに、または代わりに、低イオン強度および高温の洗浄溶液を用いる１、２回以上の洗浄ステップを、例えば、５０℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いるハイブリダイゼーションプロトコールに含むことができる。
用語「合成ガス」とは、一酸化炭素、二酸化炭素および水素の混合物を指す。
本明細書で用いられる用語「トランスポゾン」または「転位性因子」とは、ドナーポリヌクレオチド、例えば、ベクターから切り出すか、またはコピーし、標的部位、例えば、細胞のゲノムまたは染色体外ＤＮＡ中に組み込むことができるヌクレオチド配列を指すことを意味する。ある核酸分子から規定のＤＮＡセグメントを切り出すか、またはコピーし、同じか、または異なる核酸分子中の別の部位にそれを移動させるプロセスは、転位と呼ばれる。トランスポゾンは、「ＤＮＡトランスポゾン」とも呼ばれる、「クラス２」エレメントであってもよい。クラス２エレメントは、ドナーポリヌクレオチドから切り出され、標的核酸分子中に挿入される。このプロセスは、機能的トランスポザーゼタンパク質によって触媒される。トランスポザーゼタンパク質は、いくつかの場合、トランスポゾンによってコードされる。そのようなトランスポゾンはまた、自律的トランスポゾンとも呼ばれる。トランスポゾンは、トランスポゾンの末端上のｃｉｓ作用性ヌクレオチド配列に隣接する核酸配列を含有する。核酸配列は、少なくとも１つのｃｉｓ作用性ヌクレオチド配列が核酸配列の５’側に位置する場合、および少なくとも１つのｃｉｓ作用性ヌクレオチド配列が核酸配列の３’側に位置する場合、ｃｉｓ作用性ヌクレオチド配列に「隣接する」。クラス２エレメントについて、ｃｉｓ作用性ヌクレオチド配列は、トランスポザーゼが結合する、トランスポゾンのそれぞれの末端に、少なくとも１つの逆方向反復（本明細書では、逆方向末端反復、またはＩＴＲとも呼ばれる）を含む。また、トランスポゾンは、「レトロトランスポゾン」とも呼ばれる、「クラス１」エレメントであってもよい。クラス１エレメントは、トランスポザーゼ酵素をコードしない；むしろ、それはＲＮＡ転写物を生成し、次いで、逆転写酵素に依拠して、ＲＮＡ配列をＤＮＡに逆転写した後、標的部位に挿入される。クラス１エレメントは、ドナーポリヌクレオチドからコピーされる、すなわち、それは元のコピーを残し、標的部位に挿入される第２のコピーを作成する。クラス１エレメントは、それらがレトロ転位にとって必要とされるタンパク質をコードする配列を包含するか、またはしないかに応じて、自律的クラスと非自律的クラスとに分割される。トランスポゾンがドナーポリヌクレオチドから切り出すか、またはコピーし、標的部位に組み込む能力を、例えば、メチル化および／または低分子干渉ＲＮＡによって沈黙させることができる。
「変異体」とは、本明細書に開示される親配列の少なくとも１つの所望の活性を保持しながら、１つまたは複数のアミノ酸残基または核酸塩基の付加（挿入を含む）、欠失および／または置換の理由で親配列と異なるアミノ酸または核酸配列を指す。酵素の場合、そのような所望の活性は、特異的基質結合を含んでもよい。同様に、変異体核酸配列は、１つまたは複数の核酸塩基の付加、欠失および／または置換の理由で親配列と比較した場合に改変されていてもよいが、コードされるタンパク質、例えば、酵素は、上記のように所望の活性を保持する。変異体は、対立遺伝子変異体もしくはスプライス変異体などの天然のものであるか、または人工的に構築されたものであってもよい。
用語「ベクター」は、遺伝子送達系または遺伝子導入ビヒクルと呼ばれることもあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏに関わらず、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む大分子または分子の複合体に関する。典型的には、ベクターは、核酸配列の細胞中への導入を可能にする、または容易にする一本鎖または二本鎖環状核酸分子である。一般的には、ベクターを細胞中にトランスフェクトし、細胞ゲノム内で、または細胞ゲノムとは無関係に複製させることができる。制限酵素を用いる処理の際に、環状二本鎖核酸分子を切断し、それによって、線状化することができる。核酸ベクター、制限酵素の仕分け、および制限酵素により切断されるヌクレオチド配列の知識は、当業者には容易に利用可能である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３２５１３２０．１のアミノ酸配列をコードする配列もしくはそのホモログ、および／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３２４３１９０．１のアミノ酸配列をコードする配列もしくはそのホモログなどの、ペプチドをコードする核酸分子を、ベクターを制限酵素で切断し、２つの小片を一緒にライゲーションすることによってベクター中に挿入することができる。ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスに基づくベクターまたはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。ベクターはまた、原核生物ベクターの典型例でもあるプラスミドベクターであってもよい。それぞれのプラスミドは、いくつかの実施形態においては、例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４またはπＶＸなどの、大腸菌（E.coli）中で複製することができるプラスミドであってもよい。バチルス（Bacillus）プラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１またはｐＴ１２７が挙げられる。好適なストレプトミセス（Streptomyces）プラスミドとしては、ｐ１９１０１、およびφＣ３１などのストレプトミセス（Streptomyces）バクテリオファージが挙げられる。ベクターはまた、エピソームベクターとも呼ばれる、リポソームに基づく染色体外ベクターであってもよい。エピソームベクターの２つの実例は、ｏｒｉＰ系ベクターおよびＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターである。リンパ球指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球中で複製し、その自然の生活環の一部としてプラスミドになるヘルペスウイルスである。ベクターはまた、有機改変ケイ酸に基づくものであってもよい。いくつかの実施形態においては、ベクターは、上記で説明されたように、トランスポゾンに基づく系であってもよい。
用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）、「有する（having）」などは、拡張的に、または変更可能に、そして、限定なしに読まれるべきである。「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」などの単数形は、文脈が別途明確に指摘しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、「ベクター」に対する参照は、単一のベクターならびに同じ、例えば、同じオペロンか、または異なる、複数のベクターを含む。同様に、「細胞」に対する参照は、単一の細胞ならびに複数の細胞を含む。別途指摘しない限り、一連の要素の前の用語「少なくとも」は、その一連中の全ての要素を指すことが理解されるべきである。用語「少なくとも１つ」および「少なくとも１つの」は、例えば、１、２、３、４、または５つ以上の要素を含む。記述される範囲の上および下のわずかな変化を用いて、その範囲内の値と実質的に同じ結果を達成することができることがさらに理解される。また、別途指摘しない限り、範囲の開示は、最小値と最大値との間の全ての値を含む連続する範囲と意図される。
用語の任意の使用の範囲および意味は、その用語が用いられる特定の文脈から明らかであろう。本明細書を通して用いられる選択された用語に関するある特定のさらなる定義は、適用可能な場合、詳細な説明の適切な文脈において与えられる。別途定義しない限り、説明、図面および特許請求の範囲において用いられる全ての他の科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される通り、その通常の意味を有する。
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。様々な実施形態、優先および範囲を随意に組み合わせることができることが理解される。さらに、特定の実施形態に応じて、選択される定義、実施形態または範囲を適用しなくてもよい。
酵素および経路
本明細書に記載の組換え微生物は、一般に、生合成経路を提供する、完成させる、または増強する１つまたは複数の異種核酸配列を含有する。本明細書に記載の組換え微生物は一般に、アルカンおよび／またはアルケンの形成をもたらす生合成経路を一緒に定義するいくつかの酵素を発現することができる。生合成経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされる。典型的には、生合成経路の酵素は、アルカンおよび／またはアルケンの生成を可能にするのに十分な量で発現される。それにより、組換え微生物は、一酸化炭素および／または二酸化炭素を、アルカンおよび／またはアルケンに変換することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、メタンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組換え微生物は、エタンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。
本明細書に記載の組換え微生物は、一般に、生合成経路を提供する、完成させる、または増強する１つまたは複数の異種核酸配列を含有する。本明細書に記載の組換え微生物は一般に、アルカンおよび／またはアルケンの形成をもたらす生合成経路を一緒に定義するいくつかの酵素を発現することができる。生合成経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされる。典型的には、生合成経路の酵素は、アルカンおよび／またはアルケンの生成を可能にするのに十分な量で発現される。それにより、組換え微生物は、一酸化炭素および／または二酸化炭素を、アルカンおよび／またはアルケンに変換することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、メタンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組換え微生物は、エタンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。
本明細書に記載の組換え微生物は、エテンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。１つまたは複数のこれらの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、エタンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、エタンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、エテンを生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、エタンを生成することができる。本明細書に開示される組換え微生物は、エタンを生成することができない。本明細書に開示される組換え微生物は、プロパンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。１つまたは複数のこれらの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、プロパンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、プロパンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、プロパンを生成することができる。
本明細書に記載の組換え微生物は、プロペンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。１つまたは複数のこれらの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、２つまたは３つのこれらの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。上記のように、それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、プロペンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、プロペンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。本明細書に記載の組換え微生物は、いくつかの実施形態においては、プロペンを生成することができる。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組換え微生物は、プロペンを生成することができない。本明細書に開示される組換え微生物は、ｎ−ブタンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ｎ−ブタンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ｎ−ブタンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、プロパンを生成することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、１−ブテンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、この経路の２つまたは３つのこれらの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。上記のように、それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、１−ブテンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、１−ブテンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、１−ブテンを生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、１−ブテンを生成することができない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、イソブテンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、イソブテンの形成をもたらす経路の少なくとも２つまたは３つの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、イソブテンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、イソブテンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、イソブテンを生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、イソブテンを生成することができない。本明細書に開示される組換え微生物はまた、１，３−ブタジエンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、この経路の少なくとも２つまたは３つの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。上記に示されたように、それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、１，３−ブタジエンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、１，３−ブタジエンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。本明細書に記載の組換え微生物は、いくつかの実施形態において、１，３−ブタジエンを生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、１，３−ブタジエンを生成することができない。
本明細書に記載の組換え微生物は、ｎ−ペンタンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ｎ−ペンタンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ｎ−ペンタンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、ｎ−ペンタンを生成することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、１−ペンテンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、この経路の少なくとも２つまたは３つの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、１−ペンテンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、１−ペンテンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、１−ペンテンを生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、１−ペンテンを生成することができない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、ｎ−ヘキサンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ｎ−ヘキサンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ｎ−ヘキサンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、ｎ−ヘキサンを生成することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、１−ヘキセンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。この経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、この経路の少なくとも２つまたは３つの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、１−ヘキセンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、１−ヘキセンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、１−ヘキセンを生成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、２−メチル−１，３−ブタジエンとも呼ばれる、イソプレンの形成をもたらす経路の酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。イソプレンの形成をもたらす経路の１つまたは複数の酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態においては、２−メチル−１，３−ブタジエンの形成をもたらす経路の少なくとも２つまたは３つの酵素は、異種核酸配列によってコードされていてもよい。それぞれの異種核酸配列は、異種核酸分子を起源とするものであってもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、２−メチル−１，３−ブタジエンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有してもよい。組換え微生物は、いくつかの実施形態において、１−ヘキセンの形成をもたらす経路の全酵素をコードする核酸配列を含有しない。本明細書に記載の組換え微生物は、いくつかの実施形態において、２−メチル−１，３−ブタジエンを生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え微生物は、２−メチル−１，３−ブタジエンを生成することができない。
異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡの、２〜６個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルカンおよび／またはアルケンへの酵素的変換を可能にする１つまたは複数の酵素をコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸配列は、アセチル−ＣｏＡの、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンへの酵素的変換を可能にする２つ以上の酵素をコードする。アセチル−ＣｏＡまたはアセチルコエンザイムＡは、酢酸と、コエンザイムＡのβ−メルカプトエチルアミン部分とのチオエステルである。それは、代謝における普遍的成分として働き、アセチル基の活性化担体と見なすことができる。アセチル−ＣｏＡは、特に、脂肪酸ならびに炭水化物の分解によって生成され、様々な生合成経路における出発物質として働く。アセチル−ＣｏＡは容易に膜を通過しないため、細胞内に残存し、反応物質として機能することができる。
本明細書に開示される方法、核酸配列およびベクターを用いて確立する、完成させる、または増強することができる生合成経路の実例は、図面に記載される。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素をさらに発現する。結果として、組換え微生物は、一酸化炭素および／または二酸化炭素からアセチル−ＣｏＡを合成することができる。微生物が発現するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素を、いくつかの実施形態においては、内因性核酸配列によりコードさせ、それから発現させることができる。
本明細書に記載の組換え微生物は、以下に記載される酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。コードされるタンパク質は、それぞれの酵素の任意の対立遺伝子変異体であってもよい。それぞれの異種核酸配列は、いくつかの実施形態においては、配列データベース中に見出されるヌクレオチド配列であってもよい。組換え微生物中に含まれる異種核酸配列は、以下に記載される酵素をコードする核酸のホモログであってもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物中に含まれる異種核酸配列は、ペプチド／タンパク質の酵素的活性を本質的に維持する保存的改変を含有してもよい。同じ実施形態において、それぞれの保存的改変は、ペプチド／タンパク質の酵素活性を本質的に未変化のままにする。組換え微生物中に含まれる異種核酸配列は、コドン最適化されていてもよい、すなわち、それは、１つもしくは複数、例えば、２つもしくは３つ、または有意数のコドンを、所与の生物の遺伝子中でより頻繁に用いられる１つまたは複数のコドンで置き換えることによって、その生物の細胞中での発現のために適合させたものであってもよい。コドン最適化は、当業界で周知である。一般に、生物中で高度に発現される遺伝子は、その生物において最も豊富なｔＲＮＡ種によって認識されるコドンに向かって偏る。この偏りの１つの尺度は、特定の遺伝子中のそれぞれのアミノ酸をコードするために用いられるコドンが、ある生物に由来する高度に発現される遺伝子の参照セットにおいて最も多く存在するものである程度を測定する、「コドン適合指数」または「ＣＡＩ」である。多くの生物は、成長するペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用のための偏りを示す。コドンの選択性またはコドンの偏り、生物間でのコドン使用の差異は、遺伝子コードの縮重性によって得られ、多くの生物間で十分に裏付けられている。コドンの偏りは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、次いで、特に、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞中での選択されたｔＲＮＡの優先性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に用いられるコドンを反映する。
組換え微生物中に含まれる異種核酸配列は、いくつかの実施形態においては、以下に記載されるペプチド／タンパク質のデータベースエントリーの配列と比較した場合、９０％以上の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物中の異種核酸配列は、以下に記載されるペプチド／タンパク質のデータベースエントリーの配列と比較した場合、９５％以上、例えば、９７％以上の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態においては、組換え微生物中の異種核酸配列は、以下に記載されるペプチド／タンパク質のデータベースエントリーの配列と比較した場合、９９％以上の配列同一性を有してもよい。組換え微生物中の異種核酸配列は、いくつかの実施形態においては、二本鎖核酸分子中に含まれる。異種核酸配列のコード鎖、すなわち、センス鎖に対する相補鎖は、いくつかの実施形態においては、ストリンジェントな条件下で、以下に記載のペプチド／タンパク質の配列をコードする鎖に結合することができる。
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組換え微生物は、それぞれのアルカンおよび／またはアルケンを合成する酵素的能力を既に含有する宿主から生成される。そのような実施形態においては、例えば、アルケン生成に向かうアルカン／アルケン経路反応を誘導する、経路の１つまたは複数の中間生成物の合成または蓄積を増加させることが有用であり得る。合成または蓄積の増加を、例えば、１つまたは複数の上記酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列の過剰発現によって達成することができる。アルカンまたはアルケン経路の酵素もしくは複数の酵素および／またはタンパク質もしくは複数のタンパク質の過剰発現は、例えば、内因性遺伝子もしくは複数の内因性遺伝子の外因性発現により、または異種遺伝子もしくは複数の異種遺伝子の外因性発現により生じてもよい。したがって、天然の微生物を、例えば、それぞれのアルカン／アルケン経路の酵素をコードする１つまたは複数の、例えば、全ての核酸配列の過剰発現により、アルカンおよび／またはアルケンを生成する、非天然の微生物であるように容易に生成することができる。いくつかの実施形態においては、組換え微生物を、アルカン／アルケン生合成経路における酵素の活性の増加をもたらす内因性遺伝子の突然変異誘発によって生成することができる。
いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡのエテンへの変換を可能にする酵素をコードする異種核酸配列を含有する。いくつかの実施形態においては、微生物は、乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）をコードする１つまたは複数の異種核酸配列を含有する。ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｇ３ＫＩＭ４（ＬＣＤＡ＿ＣＬＯＰＲ）、２０１４年１１月２６日のバージョン１３（配列のバージョン１）のアルファサブユニットおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｌ３Ｆ８（Ｑ９Ｌ３Ｆ８＿ＣＬＯＰＲ）、２０１４年１０月２９日のバージョン２０（配列のバージョン１）のベータサブユニットを有するクロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）に由来する酵素である。乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）は、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば、酵素ＥＣ２．８．３．１であってもよい。好適な例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｌ３Ｆ７（Ｑ９Ｌ３Ｆ７＿ＣＬＯＰＲ）、２０１５年４月１日のバージョン３８（配列のバージョン１）を有する、最大約４個の炭素原子を有する脂肪酸に対する広い基質特異性を有する、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）に由来する酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼＹｄｉＦである。
いくつかの実施形態においては、微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有する。それぞれの酵素の例は、ヨケネラ種（Yokenella sp.）に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＩ８７８７２．１を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ６ＣＸ２６のＷＺＹ００２、２０１５年４月１日のバージョン１０（配列のバージョン１）である。図６６を参照されたい。
いくつかの実施形態においては、微生物は、ＮＡＤＰ依存的マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）をコードする異種核酸配列を含有する。それぞれの酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ４ＹＥＮ２、２０１５年５月２５日のバージョン５６（配列のバージョン１）のメタロスフェラ・セデュラ（Mettalosphaera sedula）に由来するマロニルＣｏＡリダクターゼである。さらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９６ＹＫ１、２０１５年５月２７日のバージョン７９（配列のバージョン１）を有するスルホロブス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）に由来するマロニルＣｏＡリダクターゼである。
いくつかの実施形態においては、微生物は、マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）をコードする異種核酸配列を含有する。そのような酵素の一例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３９８３１、２０１５年７月２２日のバージョン１１４（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来するＮＡＤＰ依存的３−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼリダクターゼである。そのような酵素のさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ７ＭＦＸ７、２０１５年７月２２日のバージョン４７（配列のバージョン１）のクロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）に由来するマロン酸セミアルデヒドリダクターゼＲｕｔＥである。別の好適な酵素は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｊ７Ｒ１３３、２０１５年７月２２日のバージョン２２（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来する３−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ酵素である。
いくつかの実施形態においては、微生物は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）をコードする異種核酸配列を含有する。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ４Ａ７Ｖ６、２０１５年６月２４日のバージョン５３（配列のバージョン１）のコングレギバクター・リトラリス（Congregibacter litoralis）に由来する酵素である。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ４ＹＧＲ１、２０１５年７月２２日のバージョン４９（配列のバージョン１）のメタロスフェラ・セデュラ（Mettalosphaera sedula）に由来する酵素である。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９７３Ｗ５、２０１５年７月２２日のバージョン７５（配列のバージョン１）のスルホロブス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態においては、微生物は、３−ヒドロキシプロピオニル−コエンザイムＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）をコードする異種核酸配列を含有する。３−ヒドロキシプロピオニル−コエンザイムＡデヒドラターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｆ９ＶＮＧ３、２０１５年７月２２日のバージョン１１（配列のバージョン１）のスルホロブス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）に由来する酵素である。３−ヒドロキシプロピオニル−コエンザイムＡデヒドラターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ４ＹＩ８９、２０１５年７月２２日のバージョン５２（配列のバージョン１）のメタロスフェラ・セデュラ（Mettalosphaera sedula）に由来する酵素である。３−ヒドロキシプロピオニル−コエンザイムＡデヒドラターゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０９０ＩＷＩ４、２０１５年４月２９日のバージョン４（配列のバージョン１）のバチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態においては、微生物は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）をコードする異種核酸配列を含有する。この酵素は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０００６３７９８２．１（図６６を参照されたい）と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ７７７８１、２０１５年７月２２日のバージョン１２１（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来するＥ．Ｃ．３．１．２．２８の１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ酵素であってもよい。この酵素は、様々なアシル−ＣｏＡチオエステルに対する活性を有する。Ｅ．Ｃ．３．１．２．２８の１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ２ＢＮＷ８、２０１５年７月２２日のバージョン５３（配列のバージョン１）のプロクロロコッカス・マリヌス（Prochlorococcus marinus）に由来する酵素である。さらなる例として、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＧＧ２、２０１５年７月２２日のバージョン８２（配列のバージョン２）の大腸菌（E.coli）に由来するＥ．Ｃ．３．１．２．２のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２酵素であってもよい。ＥＣ３．１．２．−のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素のさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０Ａ８Ｚ３、２０１５年７月２２日のバージョン８７（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＹｂｇＣである。ＥＣ３．１．２．−のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素の別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ９４８４２、２０１５年７月２２日のバージョン１０１（配列のバージョン２）のヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＹｂｇＣ（ＥＣ３．１．２．−）である。ＥＣ３．１．２．−のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素のさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ４５０６１、２０１５年６月２４日のバージョン８１（配列のバージョン２）のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＹｎｅＰである。ＥＣ３．１．２．−のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素のさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ９ＢＮＨ２、２０１５年７月２２日のバージョン１５（配列のバージョン１）のクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼｔｅｓＢ（ＥＣ３．１．２．−）である。
いくつかの実施形態において、微生物は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）をコードする異種核酸配列を含有する。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ４ＹＩ８９、２０１５年７月２２日のバージョン５２（配列のバージョン１）のメタロスフェラ・セデュラ（Mettalosphaera sedula）に由来する酵素である。ＥＣ４．２．１．１１６の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０９０ＩＷＩ４、２０１５年４月２９日のバージョン４（配列のバージョン１）のバチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＹｂｇＣである。
いくつかの実施形態において、微生物は、アシル−ＣｏＡチオエステルヒドロラーゼとも呼ばれる、ＥＣ３．１．２（ＥＣ３．１．２．−）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有する。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ４５０６１、２０１５年６月２４日のバージョン８１（配列のバージョン２）のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素ＹｎｅＰ(ＥＣ３．１．２．−）である。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼのさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００５６５２４４１．１（図６６を参照されたい）と同一の配列を有するＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｅ３ＪＨ２１、２０１５年７月２２日のバージョン２（配列のバージョン１）のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素ＴｅｓＢ（ＥＣ３．１．２．−）である。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｖ５Ｖ９Ｌ９、２０１５年７月２２日のバージョン１７（配列のバージョン１）のアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素ＴｅｓＢ（ＥＣ３．１．２．−）である。好適なアシル−ＣｏＡチオエステラーゼのさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０００６３７９８２．１（図６６を参照されたい）と同一の配列を有するＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ８Ｕ９Ｑ５、２０１５年７月２２日のバージョン３５（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．２８）である。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｇ７ＥＮ０７、２０１５年５月２７日のバージョン１０（配列のバージョン１）のシュードアルテロモナス種（Pseudoalteromonas sp.）ＢＳｉ２０３１１に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素ＴｅｓＢ（ＥＣ３．１．２．−）である。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＧＧ２、２０１５年７月２２日のバージョン８２（配列のバージョン２）の大腸菌（E.coli）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素ＴｅｓＢ（ＥＣ３．１．２．−）である。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＤＡ１、２０１５年７月２２日のバージョン８３（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素ＴｅｓＡ（ＥＣ３．１．２．−）である。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼのさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０００１０８１６０．１（図６６を参照されたい）と同一の配列を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｅ１ＬＷＳ５、２０１５年７月２２日のバージョン３（配列のバージョン１）の酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。リン酸ブチリルトランスフェラーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１０９６６３５７．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５８２５５、２０１５年７月２２日のバージョン７８（配列のバージョン１）のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来するリン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素である。リン酸ブチリルトランスフェラーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５４５３０、２０１３年１０月１６日のバージョン８５（配列のバージョン２）のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するそれぞれの酵素（ＥＣ２．３．１．１９）である。さらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｆ２ＮＰＥ１、２０１５年７月２２日のバージョン２２（配列のバージョン１）のマリニサームス・ヒドロサーマリス（Marinithermus hydrothermalis）に由来するリン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）である。
いくつかの実施形態において、微生物は、酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。酪酸キナーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ８１３３７、２０１５年１月７日のバージョン５１（配列のバージョン１）のクロストリジウム・パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）に由来する酵素である。酪酸キナーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０５６１９、２０１５年７月２２日のバージョン８８（配列のバージョン１）のクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）に由来する酵素である。別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０５６１９、２０１５年７月２２日のバージョン３１（配列のバージョン１）のサーモセジミニバクター・オセアニ（Thermosediminibacter oceani）に由来する酪酸キナーゼ酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、フェノール酸デカルボキシラーゼとしても作用し得る、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードする異種核酸配列を含有する。フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼの実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０１０８２７．３（図６６を参照されたい）と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３３７５１、２０１４年２月１９日のバージョン１１３（配列のバージョン２）のサッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）に由来するミトコンドリア酵素である。フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｇ７ＸＶＡ３、２０１５年７月２２日のバージョン２４（配列のバージョン１）のアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）に由来する酵素である。フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｕ１ＬＰ５４、２０１５年５月２７日のバージョン５（配列のバージョン１）のシュードアルテロモナス・ルブラ（Pseudoalteromonas rubra）に由来する酵素である。フェノール酸デカルボキシラーゼと現在命名されている、それぞれの酵素のさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３２４３１９０．１（図６６を参照されたい）と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｏ０７００６、２０１５年６月２４日のバージョン９３（配列のバージョン１）のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）に由来する酵素である。
図１Ｂは、上記に示された酵素のいくつか、または全部が存在してもよい、エテンの合成をもたらす例示的経路を示す。
いくつかの実施形態において、微生物は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２２２５６、２０１４年５月１４日のバージョン１３２（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来するそれぞれの酵素である。４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｅ６ＳＬＧ７、２０１５年７月２２日のバージョン２８（配列のバージョン１）のサーモエアロバクター・マリアネンシス（Thermaerobacter marianensis）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）をコードする異種核酸配列を含有する。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３９６３３、２０１５年７月２２日のバージョン１１１（配列のバージョン３）のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）に由来する酵素である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２７３４６、２０１５年７月２２日のバージョン７２（配列のバージョン１）のペプトクロストリジウム・ディフィシレ（Peptoclostridium difficile）（クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile））に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）をコードする異種核酸配列を含有する。２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｎ４Ｚ０、２０１５年７月２２日のバージョン８４（配列のバージョン２）のカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）に由来するミトコンドリア酵素である。２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｇ８Ｑ８８８、２０１５年７月２２日のバージョン２２（配列のバージョン１）のシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）をコードする異種核酸配列を含有する。それぞれの酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｅ３ＰＷＪ５、２０１５年７月２２日のバージョン２１（配列のバージョン１）のクロストリジウム・スティックランディ（Clostridium sticklandii）に由来するグルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼである。グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５９１１１、２０１５年４月１日のバージョン９５（配列のバージョン３）のアシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）に由来するサブユニットＡと、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５９１１２、２０１５年７月２２日のバージョン９５（配列のバージョン３）のアシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）に由来するサブユニットＢとを有する酵素である。さらに別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１１５５４２６７．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１Ｄ４Ｉ４、２０１５年７月２２日のバージョン５０（配列のバージョン１）のミクソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）に由来する酵素のサブユニットＡである。この酵素は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１１５５４２６８．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１Ｄ４Ｉ３、２０１５年７月２２日のバージョン４６（配列のバージョン１）のサブユニットＢを有する。
微生物は、いくつかの実施形態において、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）をコードする異種核酸配列を含有する。２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１１５６９、２０１５年７月２２日のバージョン８３（配列のバージョン３）のアシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）に由来するサブユニットアルファと、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１１５７０、２０１５年７月２２日のバージョン８３（配列のバージョン３）のアシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）に由来するサブユニットベータとを有する酵素である。２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｄ８ＧＴ１８、２０１５年７月２２日のバージョン１９（配列のバージョン１）のクロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）をコードする異種核酸配列を含有する。それぞれの酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０６７００、２０１５年４月１日のバージョン８２（配列のバージョン１）のサブユニットアルファ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＺＡＡ６、２０１５年７月２２日のバージョン８１（配列のバージョン１）のサブユニットベータ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＺＡＡ７、２０１４年１１月２６日のバージョン８２（配列のバージョン１）のサブユニットガンマ、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＺＡＡ８、２０１５年７月２２日のバージョン７８（配列のバージョン１）のサブユニットデルタを有するアシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）に由来する酵素である。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＺＡＡ８のサブユニットデルタは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１２９３９１７３．１（図６６を参照されたい）を有する。グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ２ＲＮ２８、２０１５年５月２７日のバージョン５０（配列のバージョン１）のロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）に由来する酵素である。グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ９ＫＬＱ１、２０１５年７月２２日のバージョン４０（配列のバージョン１）のクロストリジウム・フィトファーメンタンス（Clostridium phytofermentans）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）とも呼ばれる、ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３８９４５、２０１５年７月２２日のバージョン７２（配列のバージョン１）のクロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）に由来する酵素である。ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｈ６ＬＨＹ２、２０１５年７月２２日のバージョン１６（配列のバージョン１）のアセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。そのような酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ８Ｘ５Ｘ６、２０１５年７月２２日のバージョン８１（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来する酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼＹｄｉＦである。この酵素は、短鎖脂肪酸に対する広い基質特異性を有し、プロピオン酸、アセト酢酸、酪酸、イソ酪酸、および４−ヒドロキシ酪酸の反応を触媒する。４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｅ８ＸＫ９７、２０１５年７月２２日のバージョン２（配列のバージョン１）のイェルシニア・シュードツベルクロシス（Yersinia pseudotuberculosis）に由来する酵素である。４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＲＭ８６、２０１５年６月２４日のバージョン４８（配列のバージョン２）のクロストリジウム・アミノブチリカム（Clostridium aminobutyricum）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、多くの実施形態において、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）でもある、ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。両活性を有するそのような酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５５７９２、２０１５年４月１日のバージョン７９（配列のバージョン３）のクロストリジウム・アミノブチリカム（Clostridium aminobutyricum）に由来する酵素である。ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０１１ＰＣＫ９、２０１５年１月７日のバージョン３（配列のバージョン１）のカンジダタス・アクムリバクター種（Candidatus Accumulibacter sp.）ＳＫ−１１に由来する酵素である。ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ６ＮＥＳ０、２０１５年６月２４日のバージョン８（配列のバージョン１）のクロストリジウム・チロブチリカム（Clostridium tyrobutyricum）に由来する酵素である。ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ活性（ＥＣ５．３．３．３）および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．２．１．−）を有する好適な酵素の別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ３ＡＣＩ６、２０１５年７月２２日のバージョン６７（配列のバージョン１）のカルボキシドサームス・ヒドロゲノフォーマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）に由来する酵素である。ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ活性（ＥＣ５．３．３．３）および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．２．１．−）を有する好適な酵素の別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１２１０３３６３．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｂ９Ｅ５Ｅ４、２０１５年７月２２日のバージョン３９（配列のバージョン１）のクロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）に由来する酵素である。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼとしてＥＣ４．２．１．１２０に該当することが唯一公知である酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｋ０ＩＰ１９、２０１５年７月２２日のバージョン１４（配列のバージョン１）のニトロソスフェラ・ガージェンシス（Nitrososphaera gargensis）に由来する酵素である。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有することが唯一公知である酵素のさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｇ４ＲＪＫ０、２０１５年７月２２日のバージョン２０（配列のバージョン１）のサーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ酵素またはアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。それぞれの酵素の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４５３６２、２０１５年１月７日のバージョン７４（配列のバージョン２）のペプトクロストリジウム・ディフィシレ（Peptoclostridium difficile）（クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile））に由来する酵素である。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの２つのさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫＲ２９８９６．１およびＷＰ＿０００７８６５４７．１（図６６を参照されたい）の配列を含む、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０２４ＬＢ５５、２０１５年７月２２日のバージョン１２（配列のバージョン１）、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｈ９ＵＵＧ８、２０１５年７月２２日のバージョン１７（配列のバージョン１）の、大腸菌（E.coli）に由来する酵素である。。好適なアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１１６１５０８９．１（図６６を参照されたい）の配列と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０ＫＢＰ１、２０１５年７月２２日のバージョン６２（配列のバージョン１）のクプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）に由来するベータ−ケトチオラーゼ酵素ＢｋｔＢである。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｄ０Ｆ６Ｖ４、２０１５年７月２２日のバージョン４（配列のバージョン１）のバチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５２０４１、２０１５年５月２７日のバージョン１０１（配列のバージョン２）のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する酵素である。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｂ５ＸＲＪ５、２０１５年７月２２日のバージョン５２（配列のバージョン１）のクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae）に由来する酵素である。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｂ７Ｌ６Ｂ５、２０１５年７月２２日のバージョン４５（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ５ＡＺ７４、２０１４年１０月２９日のバージョン３４（配列のバージョン１）のメチロバクテリウム・エクストルケンス（Methylobacterium extorquens）に由来する酵素である。さらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１８９Ｚ６、２０１５年７月２２日のバージョン６０（配列のバージョン１）のペプトクロストリジウム・ディフィシレ（Peptoclostridium difficile）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。この酵素は、典型的には、酵素複合体である。例示的サブユニットは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＥ０８０６８．１（図６６を参照されたい）に対応する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ８ＺＬＬ８、２０１５年７月２２日のバージョン１３（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来するベータサブユニットである。
いくつかの実施形態において、微生物は、ビオチンカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．３．４．１４）をコードする異種核酸配列を含んでもよい。好適なビオチンカルボキシラーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＡ６７３７９．１（図６６を参照されたい）に対応する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ａ７Ａ００３、２０１５年７月２２日のバージョン５（配列のバージョン１）のシゲラ・ディセンテリア（Shigella dysenteriae）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ７ＵＲＶ０．１（図６６を参照されたい）と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｄ７ＵＲＶ０、２０１５年７月２２日のバージョン２３（配列のバージョン１）のストレプトミセス種（Streptomyces sp.）（ＣＬ１９０株）に由来する酵素である。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｂ０Ｉ６Ｓ７、２０１５年７月２２日のバージョン５（配列のバージョン１）のペニバチルス種（Paenibacillus sp.）Ｐ１ＸＰ２に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５０２０３、２０１５年１月７日のバージョン７０（配列のバージョン１）のアシネトバクター種（Acinetobacter sp.）（ＲＡ３８４９株）に由来する酵素である。アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ５ＡＺＮ８、２０１５年７月２２日のバージョン４１（配列のバージョン１）のメチロバクテリウム・エクストルケンス（Methylobacterium extorquens）に由来する酵素である。アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ０Ａ０９２、２０１５年７月２２日のバージョン７（配列のバージョン１）のアエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）などのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする異種核酸配列を含有してもよい。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素の実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３２５１３２０．１（図６６を参照されたい）の酵素と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ８８ＦＭ３、２０１５年７月２２日のバージョン７０（配列のバージョン１）のシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に由来する酵素である。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素の別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０２５３２７１１０．１（図６６を参照されたい）の酵素と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ０Ａ１Ｘ１、２０１５年７月２２日のバージョン９（配列のバージョン１）のアエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来する酵素である。（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ２ＲＱ３６、２０１５年６月２４日のバージョン５９（配列のバージョン１）のロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）に由来する酵素である。（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）のさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０２２０７、２０１５年５月２７日のバージョン１２３（配列のバージョン１）のサッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）に由来するペルオキシソーム酵素である。（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）のさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｘ７ＹＩ３８、２０１５年６月２４日のバージョン７（配列のバージョン１）のマイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）に由来するペルオキシソーム酵素である。
図１Ｃは、１つまたは複数の上記に示された酵素が存在してもよい、プロペンの合成をもたらす例示的経路を示す。
いくつかの実施形態において、微生物は、プロピオニル−ＣｏＡシンターゼとも呼ばれる、アクリロイル−コエンザイムＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。アクリロイル−コエンザイムＡリダクターゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９７５Ｃ８、２０１５年７月２２日のバージョン９６（配列のバージョン１）のスルホロブス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）に由来する酵素である。アクリロイル−コエンザイムＡリダクターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ３Ｊ６Ｋ９、２０１５年４月２９日のバージョン６５（配列のバージョン１）のロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ酵素（ＥＣ５．４．９９．２）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。メチルマロニル−ＣｏＡムターゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２７２５３、２０１５年７月２２日のバージョン１２４（配列のバージョン２）の大腸菌（E.coli）に由来する酵素である。メチルマロニル−ＣｏＡムターゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０５０６５、２０１５年６月２４日のバージョン７７（配列のバージョン１）のストレプトミセス・シナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）に由来する酵素である。メチルマロニル−ＣｏＡムターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ３Ｎ１５９、２０１５年６月２４日のバージョン２９（配列のバージョン１）のスルホロブス・アイランディクス（Sulfolobus islandicus）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．４１）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５２０４５、２０１５年７月２２日のバージョン１０８（配列のバージョン１）の大腸菌（E.coli）に由来する酵素である。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｃ６ＦＷＧ２、２０１５年７月２２日のバージョン４（配列のバージョン１）のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。そのような酵素は、典型的には、アルコールデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．１）を含み、および、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．２．１．１０）を含んでもよい。アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼの実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１０８９０７２０．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ７ＤＦＮ２、２０１５年５月２７日のバージョン２４（配列のバージョン１）のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する酵素である。
図１Ｄは、１つまたは複数の上記に示された酵素が存在してもよい、ｎ−ブテンの合成をもたらす例示的経路を示す。
いくつかの実施形態において、微生物は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｄ４ＧＷＲ６、２０１５年７月２２日のバージョン３７（配列のバージョン１）のハロフェラックス・ボルカニ（Haloferax volcanii）に由来する酵素である。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼのさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０００１７２１９０．１と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｅ１ＸＢ８３、２０１５年７月２２日のバージョン３（配列のバージョン１）の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する酵素である。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号１２Ｃ５Ｅ４、２０１５年７月２２日のバージョン１８（配列のバージョン１）のバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｙ２に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）とも呼ばれる、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする異種核酸配列を含んでもよい。メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５４ＨＧ７、２０１５年７月２２日のバージョン６７（配列のバージョン１）のジクチオステリウム・ディスコイデウム（Dictyostelium discoideum）に由来するミトコンドリア酵素である。メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０６８Ｎ７Ｔ５、２０１５年７月２２日のバージョン５（配列のバージョン１）のバチルス・セレウス（Bacillus cereus）に由来する酵素である。メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する好適な酵素のさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｂ８ＦＣ６２、２０１５年７月２２日のバージョン３６（配列のバージョン１）のデスルファチバシルム・アルケニボランス（Desulfatibacillum alkenivorans）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態において、３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）とも呼ばれる、メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５４ＫＥ６、２０１３年５月２９日のバージョン８０（配列のバージョン１）のアルファサブユニットと、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ８Ｔ２Ｊ９、２０１５年６月２４日のバージョン７６（配列のバージョン２）のベータサブユニットとを有するジクチオステリウム・ディスコイデウム（Dictyostelium discoideum）に由来するミトコンドリア酵素である。メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｍ９ＲＳＷ８、２０１５年７月２２日のバージョン１４（配列のバージョン１）のアルファサブユニットと、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｍ９ＲＬ６２、２０１５年４月２９日のバージョン１５（配列のバージョン１）のベータサブユニットとを有するオクタデカバクター・アルティクス（Octadecabacter arcticus）に由来する酵素である。メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼのさらに別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３１１３５０６．１（図６６を参照されたい）の酵素と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｉ２９９、２０１５年６月２４日のバージョン９１（配列のバージョン１）のシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来する酵素である。メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼの別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３１００３８７．１（図６６を参照されたい）の酵素と同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｗ１ＭＪＫ９、２０１５年７月２２日のバージョン８（配列のバージョン１）のシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来する酵素である。
図１Ｅは、１つまたは複数の上記に示された酵素が存在してもよい、イソブテンの合成をもたらす例示的経路を示す。
いくつかの実施形態において、微生物は、ピルビン酸／ケトイソ吉草酸オキシドリダクターゼまたはピルビン酸シンターゼ（ＥＣ１．２．７．１）とも呼ばれる、ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素をコードする異種核酸配列を含んでもよい。２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ８０５２１、２０１５年７月２２日のバージョン８３（配列のバージョン２）のサブユニットＰｏｒＡ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ８０５２２、２０１５年７月２２日のバージョン８１（配列のバージョン３）のサブユニットＰｏｒＢ、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ８０５２３、２０１５年７月２２日のバージョン８４（配列のバージョン２）のサブユニットＰｏｒＣを有するメタノサルシナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）に由来するピルビン酸シンターゼ酵素である。ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ８４８１９、２０１４年１０月１日のバージョン２１（配列のバージョン１）のピロコッカス・エンデボリ（Pyrococcus endeavori）に由来するピルビン酸／ケトイソ吉草酸オキシドリダクターゼ共通サブユニットガンマ（ＰｏｒＧ）と呼ばれる酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、２−ケトグルタル酸オキシドリダクターゼまたは２−オキソグルタル酸シンターゼ（ＥＣ１．２．７．３）とも呼ばれる、２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素をコードする異種核酸配列を含んでもよい。２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５７７２４、２０１５年６月２４日のバージョン８８（配列のバージョン１）のサブユニットＫｏｒＡ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５７９５７、２０１５年７月２２日のバージョン８３（配列のバージョン１）のサブユニットＫｏｒＢ、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５７９５６、２０１５年６月２４日のバージョン８５（配列のバージョン１）のサブユニットＫｏｒＣを有するメタノカルドコッカス・ジャナシ（Methanocaldococcus jannaschii）に由来するピルビン酸シンターゼ酵素である。２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ６Ａ４Ｈ７、２０１５年５月２７日のバージョン３２（配列のバージョン１）のサブユニットアルファ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ６Ａ４Ｈ６、２０１５年５月２７日のバージョン３２（配列のバージョン１）のサブユニットベータ、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｃ６Ａ４Ｈ５、２０１５年５月２７日のバージョン３１（配列のバージョン１）のサブユニットガンマを有するサーモコッカス・シビリクス（Thermococcus sibiricus）に由来する２−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＫＧＯＲ）酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．５）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼの実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１３２３８６６５．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｕ５ＲＰ０２、２０１５年７月２２日のバージョン１０（配列のバージョン１）のクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）に由来する酵素である。この酵素はまた、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｕ５ＲＰ０２のアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ中に完全に含まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１０９６６３５６．１（図６６を参照されたい）を有するクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する酪酸キナーゼであってもよい。
いくつかの実施形態において、微生物は、ゲラニオールヒドロキシムターゼとも呼ばれる、ゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。この酵素は、二官能性であり、リナロールデヒドラターゼイソメラーゼとも呼ばれる、リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）としても作用する。ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｅ１ＸＵＪ２、２０１５年４月１日のバージョン１２（配列のバージョン１）のカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）に由来する酵素である。ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｌ２ＦＲＨ３、２０１５年３月４日のバージョン１１（配列のバージョン１）のコレトトリクム・グロエオスポリオイデス（Colletotrichum gloeosporioides）に由来する酵素である。ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０２４ＪＱＲ５、２０１５年６月２４日のバージョン５（配列のバージョン１）のマイコバクテリウム・トリプレックス（Mycobacterium triplex）に由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態においては、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）とも呼ばれる、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ５０２０４、２０１５年６月２４日のバージョン７６（配列のバージョン１）のパラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）に由来する酵素である。アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｅ３ＨＷＩ９、２０１５年７月２２日のバージョン３１（配列のバージョン１）のアクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。酪酸キナーゼの例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ４５８２９、２０１５年３月２７日のバージョン９０（配列のバージョン２）のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する酪酸キナーゼ１酵素である。酪酸キナーゼの別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９７ＩＩ１、２０１５年７月２２日のバージョン８０（配列のバージョン１）のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する酪酸キナーゼ２酵素である。酪酸キナーゼのさらに別の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｇ４ＦＧＥ０、２０１５年７月２２日のバージョン３４（配列のバージョン１）のサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、イソプレンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。イソプレンシンターゼの実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ６ＥＪ９７．１（図６６を参照されたい）も有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ６ＥＪ９７、２０１５年４月１日のバージョン４２（配列のバージョン１）のプエラリア・モンタナ・バル・ロバテ（Pueraria montana var. lobate）に由来する酵素である。イソプレンシンターゼのさらなる例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ５０Ｌ３６、２０１５年５月２７日のバージョン３８（配列のバージョン１）のポプラス・アルバ（Populus alba）に由来する酵素である。
いくつかの実施形態において、微生物は、ジアシルグリセロールキナーゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。ジアシルグリセロールキナーゼの実例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２６８６７、２０１０年６月２３日の登録のバージョン５（配列のバージョン２）（図６６を参照されたい）のＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０５８８８、２０１５年６月２４日のバージョン１０６（配列のバージョン２）のストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＧＳ−５に由来する酵素である。この酵素は、例えば、ジアシルグリセロールキナーゼ活性を有する、ウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）であってもよい。それぞれのウンデカプレノールキナーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２６８６７．１のジアシルグリセロールキナーゼと９８％同一である、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ０５８８８、２０１５年６月２４日のバージョン１０６（配列のバージョン２）のストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）血清型ｃに由来する酵素である。
微生物は、いくつかの実施形態においては、２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼ酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼの実例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｉ３ＱＤＴ７、２０１５年４月１日のバージョン１４（配列のバージョン１）のピヌス・ムリカタ（Pinus muricata）に由来する酵素である。２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼの別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＪ７３５７５．１（図６６を参照されたい）を有する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｉ３ＱＤＶ８、２０１５年４月１日のバージョン１４（配列のバージョン１）のピヌス・ラジアタ（Pinus radiata）に由来する酵素である。
図１Ｆは、１つまたは複数の上記に示された酵素が存在してもよい、ブタジエンの合成をもたらす例示的経路を示す。図１Ｇは、１つまたは複数の上記に示された酵素が存在してもよい、２−メチル−１，３−ブタジエンの合成をもたらす例示的経路を示す。図１Ｈは、１つまたは複数の上記に示された酵素が存在してもよい、１−ペンテンの合成をもたらす例示的経路を示す。
図６６は、以下に記載されるプラスミドによってコードされる例示的酵素を示す。この図面に示される酵素はいずれも、組換え生物に含まれ、それによって発現される異種核酸配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、図６６に示される２つ以上の酵素を発現する１つまたは複数の異種核酸配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態においては、コード核酸配列の外因性発現が用いられる。外因性発現は、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成するために、宿主および適用に対して、発現および／または調節エレメントを特注にしたがって変更する能力を付与する。いくつかの実施形態においては、内因性発現は、例えば、負の調節エフェクターの除去、または誘導性プロモーターもしくは他の調節エレメントに連結された場合、遺伝子のプロモーターの誘導によって用いられる。天然の誘導性プロモーターを有する内因性遺伝子を、適切な誘導剤を提供することによって上方調節するか、または内因性遺伝子の調節領域を操作して、誘導性調節エレメントを組み込み、それによって、所望の時点で内因性遺伝子の発現増加の調節を可能にすることができる。同様に、誘導性プロモーターを、天然の微生物中に導入される外因性遺伝子のための調節エレメントとして含むことができる。
１つの特定の活性を有することが公知のいくつかの酵素について、その酵素は全く異なる機能も触媒することが報告されている。例として、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｍ９ＲＳＷ８のオクタデカバクター・アルクチクス（Octadecabacter arcticus）に由来するメチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性と、ビオチンカルボキシラーゼ活性の両方を有する。２つのさらなる例として、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｂ８ＦＣ６２のデスルファチバシルム・アルケニボランス（Desulfatibacillum alkenivorans）に由来するメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼは、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と、エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ活性の両方を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｃ６ＦＷＧ２のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）に由来するメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ活性およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する。他方、指向性進化を用いて酵素を改変して、非天然基質に対するその特異性を広げることもできる。あるいは、酵素の基質選択性を、指向性進化を用いて変化させることもできる。それにより、所与の酵素を、効率的な機能、天然の基質上では、例えば、改善された効率、または非天然基質上では、例えば、増大した効率のために操作することができる。これに関して、非天然および非生物学的基質、４−ヒドロキシ−４−（６−メトキシ−２−ナフチル）−２−ブタノンにおける炭素間結合切断を触媒するために用いることができるレトロ−アルドラーゼを設計するためのアルゴリズムを用いた（Jiang, L., et al., Science (2008) 319, 1387-1391）。これらのアルゴリズムは、４つの異なる触媒モチーフの異なる組合せを用いて、新しい酵素を設計した。実験的特徴付けのための２０の選択された設計は、非触媒反応と比較して４倍改善された速度を有していた（Jiang et al., 2008, supra）。このように、酵素が用いることができる潜在的な基質のアレイを変化させることができるだけでなく、酵素の設計および構築を実施することもできる。例として、ＤＮＡシャッフリングの方法（一過性鋳型上でのランダムキメラ生成またはＲＡＣＨＩＴＴ）は、複合基質上での脱硫速度を改善し、ならびに非天然基質を２０倍速く変換する操作されたモノオキシゲナーゼをもたらすことが報告された（Coco, WM, et al., Nat. Biotechnol. (2001) 19, 4, 354-359）。同様に、反応が遅い突然変異体トリオースリン酸イソメラーゼ酵素の比活性は、１．３倍から最大で１９倍改善された（Hermes, JD, et al., Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. (1990) 87, 2, 696-700）。比活性のこの増強は、タンパク質の全長上での無作為突然変異誘発を用いることによって達成され、その改善を６個のアミノ酸残基における突然変異まで追跡することができた。
上記のように、組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の内因性酵素を含有してもよい。組換え微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の機能的内因性酵素を既に含んでいた宿主として天然に存在する微生物に基づいて操作されたものであってもよい。還元的アセチル−ＣｏＡ経路とも呼ばれる、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯおよび／またはＣＯ２のアセチル−ＣｏＡへの変換を可能にする酵素反応である。この経路は、図１Ｂ〜図１Ｆの全てに示される。ＣＯ２が反応物質として用いられる場合、あるＣＯ２分子は、一酸化炭素（ＣＯ）デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素によってＣＯに還元される。別のＣＯ２分子は還元されて、カルボニル基を生成する。組換え微生物は、酢酸生成菌、すなわち、偏性嫌気性細菌であってもよく、還元的アセチル−ＣｏＡまたはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路はエネルギー保存のための細菌の主な機能として役立つ。酢酸生成細菌中で、基質としてＣＯ２を用いる場合、アセチル−ＣｏＡの形成のためには、典型的には、水素分子が必要である。かくして、それぞれの微生物は、ＣＯおよび合成ガスを用いることができ、ならびに、一般的にはＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を用いることもできる。
組換え微生物の取得
いくつかの原核生物は、グラム陰性細菌などの本明細書に記載の組換え微生物を取得する際の使用にとって好適である。いくつかの実施形態において、用いられる微生物は、一酸化炭素または二酸化炭素などの１つの炭素反応物質を発酵することができる細菌である。好適な種は、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、アセトハロビウム（Acetohalobium）、アセトアナエロビウム（Acetoanaerobium）、アセチトマクルム（Acetitomaculum）、アセトネマ（Acetonema）、アルカリバクルム（Alkalibaculum）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、アモニフェックス（Ammonifex）、アーケオグロブス（Archaeoglobus）、バチルス（Bacillus）、ブラウティア（Blautia）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブリアネラ（Bryanella）、ブチリバクテリウム（Butyribacterium）、カロラマトル（Caloramator）、カルデリハビタンス（Calderihabitans）、カロリバクテリウム（Caloribacterium）、カルダナエロバクター（Caldanaerobacter）、カンジダタス（Candidatus）、カルボフィルス（Carbophilus）、カルボキシドブラキウム（Carboxydobrachium）、カルボキシドセラ（Carboxydocella）、カルボキシドサームス（Carboxydothermus）、クロアシバチルス（Cloacibacillus）、クロストリジウム（Clostridium）、デスルホモニル（Desulfomonile）、デスルホビルグラ（Desulfovirgula）、ホロファガ（Holophaga）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitbacterium）、デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）、デスルフリスポラ（Desulfurispora）、デスルホスポロシヌス（Desulfosporosinus）、デハロコッコイデス（Dehalococcoides）、デスルファチバシルム（Desulfatibacillum）、デスルホバクテリウム（Desulfobacterium）、デスルホバクラ（Desulfobacula）、デスルホスピラ（Desulfospira）、デスルホベルミクルス（Desulfovermiculus）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、ディクチオグロムス（Dictyoglomus）、ヒドロゲノフィルス（Hydrogenophilus）、ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）、ムーレラ（Moorella）、メタノブレビバクター（Methanobrevibacter）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ナトロニエラ（Natroniella）、ナトロニンコラ（Natronincola）、オリゴトロファ（Oligotropha）、オキソバクター（Oxobacter）、オレニア（Orenia）、ペニバチルス（Paenibacillus）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラルストニア（Ralstonia）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ルブリビバックス（Rubrivivax）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、スカリンデュア（Scalindua）、シントロホコッカス（Syntrophococcus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、スポロミュサ（Sporomusa）、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、サーミンコラ（Thermincola）、サーモアセトゲニウム（Thermoacetogenium）、サーモシヌス（Thermosinus）、チンダリア（Tindallia）、サーモセジミニバクター（Thermosediminibacter）、トレポネマ（Treponema）、サーモリトバクター（Thermolithobacter）、サーモコッカス（Thermococcus）、サーモフィルム（Thermofilum）またはサーモプロテウス（Thermoproteus）の属にあってもよい。典型的には、アルカン／アルケン産生株としての開発のために選択される株を第１に分析して、どのアルケン産生遺伝子がその株にとって内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定する。内因性対応物が株中に存在しない遺伝子を、１つまたは複数の構築物中で集合させた後、株中に形質転換して、失われている機能を供給する。内因性対応物が株中に存在する遺伝子を、必要に応じて、１つまたは複数の組換え遺伝子を用いて改変または添加して、例えば、特定の経路または特定のステップを介する流動を増強することができる。
いくつかの原核生物は、グラム陰性細菌などの本明細書に記載の組換え微生物を取得する際の使用にとって好適である。いくつかの実施形態において、用いられる微生物は、一酸化炭素または二酸化炭素などの１つの炭素反応物質を発酵することができる細菌である。好適な種は、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、アセトハロビウム（Acetohalobium）、アセトアナエロビウム（Acetoanaerobium）、アセチトマクルム（Acetitomaculum）、アセトネマ（Acetonema）、アルカリバクルム（Alkalibaculum）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、アモニフェックス（Ammonifex）、アーケオグロブス（Archaeoglobus）、バチルス（Bacillus）、ブラウティア（Blautia）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブリアネラ（Bryanella）、ブチリバクテリウム（Butyribacterium）、カロラマトル（Caloramator）、カルデリハビタンス（Calderihabitans）、カロリバクテリウム（Caloribacterium）、カルダナエロバクター（Caldanaerobacter）、カンジダタス（Candidatus）、カルボフィルス（Carbophilus）、カルボキシドブラキウム（Carboxydobrachium）、カルボキシドセラ（Carboxydocella）、カルボキシドサームス（Carboxydothermus）、クロアシバチルス（Cloacibacillus）、クロストリジウム（Clostridium）、デスルホモニル（Desulfomonile）、デスルホビルグラ（Desulfovirgula）、ホロファガ（Holophaga）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitbacterium）、デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）、デスルフリスポラ（Desulfurispora）、デスルホスポロシヌス（Desulfosporosinus）、デハロコッコイデス（Dehalococcoides）、デスルファチバシルム（Desulfatibacillum）、デスルホバクテリウム（Desulfobacterium）、デスルホバクラ（Desulfobacula）、デスルホスピラ（Desulfospira）、デスルホベルミクルス（Desulfovermiculus）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、ディクチオグロムス（Dictyoglomus）、ヒドロゲノフィルス（Hydrogenophilus）、ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）、ムーレラ（Moorella）、メタノブレビバクター（Methanobrevibacter）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ナトロニエラ（Natroniella）、ナトロニンコラ（Natronincola）、オリゴトロファ（Oligotropha）、オキソバクター（Oxobacter）、オレニア（Orenia）、ペニバチルス（Paenibacillus）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラルストニア（Ralstonia）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ルブリビバックス（Rubrivivax）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、スカリンデュア（Scalindua）、シントロホコッカス（Syntrophococcus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、スポロミュサ（Sporomusa）、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、サーミンコラ（Thermincola）、サーモアセトゲニウム（Thermoacetogenium）、サーモシヌス（Thermosinus）、チンダリア（Tindallia）、サーモセジミニバクター（Thermosediminibacter）、トレポネマ（Treponema）、サーモリトバクター（Thermolithobacter）、サーモコッカス（Thermococcus）、サーモフィルム（Thermofilum）またはサーモプロテウス（Thermoproteus）の属にあってもよい。典型的には、アルカン／アルケン産生株としての開発のために選択される株を第１に分析して、どのアルケン産生遺伝子がその株にとって内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定する。内因性対応物が株中に存在しない遺伝子を、１つまたは複数の構築物中で集合させた後、株中に形質転換して、失われている機能を供給する。内因性対応物が株中に存在する遺伝子を、必要に応じて、１つまたは複数の組換え遺伝子を用いて改変または添加して、例えば、特定の経路または特定のステップを介する流動を増強することができる。
いくつかの実施形態においては、組換え微生物は、天然に存在する一酸化炭素資化細胞に由来する細胞である。それぞれの宿主細胞は、かくして、一酸化炭素資化性であってもよい。いくつかの実施形態においては、組換え細胞は、天然に存在する耐熱性宿主細胞に由来する。それぞれの宿主細胞は、かくして、耐熱性であってもよい。耐熱性宿主細胞は、比較的高温で増殖する能力のため、バイオテクノロジーにおけるプロセス適用において有用である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、好熱性、すなわち、約４５℃以上の温度で繁殖する細胞であってもよい。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、中等温度好性、すなわち、約２０〜約４５℃の範囲で繁殖する細胞であってもよい。
遺伝子操作の多数のよく確立された技術が当業界で利用可能であり、これを用いて、本明細書に開示される微生物を取得することができる。そのような技術は、異種遺伝子発現、ゲノム挿入もしくは欠失、遺伝子発現の変化、遺伝子の不活化、または酵素操作方法などの分子的方法を含む。
本明細書に開示される方法において、当業界で利用可能な細胞の形質転換のための核酸送達の任意の好適な技術により、核酸分子を宿主細胞中に導入することができる。好適な技術の例としては、限定されるものではないが、例えば、トランスフェクション、マイクロインジェクションを含む注入、エレクトロポレーションによるＤＮＡの直接送達、ＤＥＡＥ−デキストラン、次いで、ポリエチレングリコールを用いることによるリン酸カルシウム沈降、直接音波負荷、リポソーム媒介性トランスフェクション、受容体媒介性トランスフェクション、微粒子ボンバードメント、炭化ケイ素繊維を用いる撹拌、アグロバクテリウム媒介性トランスフェクション、乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ取込み、またはその任意の組合せが挙げられる。
外因性核酸分子を、裸の核酸分子として微生物に送達するか、またはそれを１つもしくは複数の薬剤と共に製剤化して、形質転換プロセスを容易にすることができる。実例として、リポソーム結合核酸を提供することができる。本明細書に記載の微生物を、１つまたは複数の外因性核酸を微生物中に導入することによって取得することができる。核酸分子を細胞中に導入する様々な技術が当業界で利用可能である。例えば、形質導入またはトランスフェクションを含む形質転換を、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、化学的または天然コンピテンス、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘導またはコンジュゲーションにより達成することができる。
エレクトロポレーションは、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（Kopke et al., Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107, 13087-13092；国際公開第２０１２／０５３９０５号パンフレット；Leang et al., Appl Environ Microbiol. (2013) 79, 4, 1102-1109）、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）（国際公開第２０１２／０５３９０５号パンフレット）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）（Straetz et al., Appl. Environ. Microbiol. (1994) 60, 1033-37）またはムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）（Kita et al., J Biosci Bioeng. (2013) 115, 4, 347-352）などのいくつかの一酸化炭素資化酢酸生成菌について記載されており、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）（Mermelstein et al., Biotechnology (1992) 10, 190-195）、Ｃ．セルロリティカム（C. cellulolyticum）（Jennert et al., 2000, Microbiology, 146, 3071-3080）またはＣ．サーモセルム（C. thermocellum）（Tyurin et al., Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 883-890）などの多くのクロストリジウムにおいて用いられる標準的な方法である。コンジュゲーションは、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）（Herbert et al., FEMS Microbiol. Lett. (2003) 229, 103-110）またはＣ．アセトブチリカム（C. acetobuylicum）（Williams et al., J. Gen. Microbiol. (1990) 136, 819-826）を含む多くのクロストリジウムについて選択される方法として記載されており、一酸化炭素資化酢酸生成菌のために類似する様式で用いることができる。
ある特定の実施形態においては、形質転換される微生物において活性である制限系のため、微生物中に導入しようとする核酸をメチル化することが必要である。これを、当業界で公知の様々な技術を用いて行うことができる。
ベクターと遺伝子の組み込み
本明細書に記載の微生物は、いくつかの実施形態においては、細菌であってもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の細菌は、細菌染色体とさらなる核酸分子とを含有してもよい。さらなる核酸分子は、上記のように導入されたものであってもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の細菌は、細菌染色体を含有し、さらなる核酸分子を含有しない。細菌染色体は、いくつかの実施形態においては、改変されており、本明細書に記載の外因性核酸配列を含有してもよい。外因性核酸配列は、異種核酸配列であってもよい。一実施形態において、細菌染色体は、本明細書に記載の異種性を含む外因性の核酸配列を含有し、さらなる核酸分子を含有しない。
本明細書に記載の微生物は、いくつかの実施形態においては、細菌であってもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の細菌は、細菌染色体とさらなる核酸分子とを含有してもよい。さらなる核酸分子は、上記のように導入されたものであってもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の細菌は、細菌染色体を含有し、さらなる核酸分子を含有しない。細菌染色体は、いくつかの実施形態においては、改変されており、本明細書に記載の外因性核酸配列を含有してもよい。外因性核酸配列は、異種核酸配列であってもよい。一実施形態において、細菌染色体は、本明細書に記載の異種性を含む外因性の核酸配列を含有し、さらなる核酸分子を含有しない。
本明細書に記載の微生物は、いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の酵素をコードする２つ以上の異種核酸配列を含有してもよい。本明細書に記載の微生物は、いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の酵素をコードする３つ以上の異種核酸配列を含有してもよい。本明細書に記載の微生物はまた、いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の２つ以上の酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。本明細書に記載の微生物はまた、いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の３つ以上の酵素をコードする異種核酸配列を含有してもよい。
いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される核酸分子は、酵素の発現を誘導する、および／または調節することができる発現カセットを含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される核酸分子は、それぞれの宿主細胞（内因性または外因性起源のものであるかには関係ない）中での転写を開始させるのに有効なプロモーターを含有するベクターによって包含される。
微生物中での酵素の発現は、それぞれの酵素をコードする配列を含む構築物を有するベクターの生成を含んでもよい。用いることができる多数の好適なベクターが公知である。一度、構築物を含有するベクターまたは核酸分子が発現のために調製されたら、核酸構築物を、任意の様々な好適な手段、すなわち、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクションなどによって選択された好適な宿主細胞中に導入することができる。いくつかの実施形態においては、ベクターは、選択マーカーを含有する。選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、もしくはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に対して栄養的利益などの代謝的利益を付与する核酸が挙げられる。そのような実施形態においては、ベクターの導入後、レシピエント細胞を、ベクターを含有する微生物の増殖について選択する選択培地中で増殖させることができる。クローニングされた遺伝子の発現は、それぞれの酵素の生成をもたらす。これは、形質転換された細胞中でそのまま行うか、またはこれらの細胞の分化を誘導した後に行うことができる。様々なインキュベーション条件を用いて、本明細書に開示されるペプチドを形成させることができる。いくつかの実施形態においては、生理学的条件を模倣する条件を用いることが望ましい。
本明細書に記載される微生物の生成は、クローニングベクター、発現ベクターまたは合成オペロンなどの様々な組換え核酸構築物の使用を含んでもよい。クローニングベクターと発現ベクターは両方とも、１つまたは複数の好適な組換え微生物中でのベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列を含有する。クローニングベクターにおいては、この配列は一般に、組換え微生物の染色体とは無関係にベクターの複製を可能にするものであり、また、複製起点または自律的に複製する配列のいずれかを含む。様々な細菌およびウイルスの複製起点が当業界で使用されている。一般的には、組換え微生物中でポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを維持する、増殖させる、または発現させるのに好適な任意のベクターを、これに関する発現のために用いることができる。ほんの数例を挙げれば、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、バキュロウイルス、パポウイルス、例えば、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、ならびにコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するものなどの、その組合せに由来するベクターが、当業界で用いられる。
適切なＤＮＡ配列を、任意の様々な周知および日常的な技術によってそれぞれのベクター中に挿入する。一般に、発現のためのＤＮＡ配列および発現ベクターを、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで切断した後、例えば、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に制限断片を連結することによって、ＤＮＡ配列を発現ベクターに連結する。連結は、ＳＯＥ ＰＣＲ、ＤＮＡ合成、平滑末端ライゲーション、または制限酵素部位でのライゲーションなどの従来の技術によって達成される。好適な制限部位が利用可能ではない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いることができる。Ｇｉｂｓｏｎら（Gibson, D. G., et al. Nature Methods (2009) 6, 5, 343-345；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により記載されたように、多数の遺伝子を含む複数の配列の単一の核酸分子への集合を、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ固定化ＤＮＡポリメラーゼの組合せを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えによって達成することができる。
構成的、誘導性、発生調節性、および環境調節性プロモーターなどの、いくつかのプロモーターが、細菌細胞中で機能的であり、文献中に記載されている。特に興味深いのは、適切な組換え微生物中で機能的であるプロモーター（転写開始領域とも呼ばれる）の使用である。例えば、組換え微生物として大腸菌（E.coli）を用いる場合、用いることができる例示的プロモーターとしては、限定されるものではないが、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（E.coli）のｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターまたはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが挙げられる。
本明細書に記載の１つまたは複数の酵素をコードするポリヌクレオチド配列はまた、プロモーター、本明細書に開示される酵素をコードする１つまたは複数の核酸、および組換え微生物において機能的である転写終結シグナル配列を最小でも含む発現カセットの一部であってもよい。プロモーターは、必要に応じて任意の型のプロモーターであってもよい。例えば、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターおよび発現カセットは、作動可能に連結された標的化配列または生成されるタンパク質の輸送を指令することができる輸送もしくは分泌ペプチドコード領域をさらに含んでもよい。発現カセットはまた、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態においては、２つ以上の異なる宿主種において増殖することができるシャトルベクターが用いられる。例示的なシャトルベクターは、大腸菌（E.coli）および／またはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）中で、ならびにクロストリジウム（Clostridium）などの偏性嫌気性菌中で複製することができる。シャトルベクター中への酵素の挿入の際に、シャトルベクターを、ベクターの増幅および選択のための大腸菌（E.coli）宿主細胞中に導入することができる。そのようなシャトルベクター、例えば、酵素をコードする１つまたは複数の配列を含有するシャトルベクターを、メチル化されたベクターを取得する目的でメチルトランスフェラーゼを含有する宿主細胞（例えば、メチルトランスフェラーゼを発現する大腸菌（E.coli）宿主細胞）中に導入することもできる。
次いで、ベクターを単離し、１つまたは複数の酵素の発現のための選択された微生物中に導入することができる。本開示の以下に記載される任意のシャトルプラスミドなどの、任意の好適なシャトルベクターまたはプラスミドを用いることができる。
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の任意の細胞に、酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列を担持する、単一のベクター、例えば、シャトルプラスミドＤＮＡ分子を導入する。二重プラスミド系を用いることもできる。酵素をコードする１つまたは複数の配列を担持する２つの異なるプラスミドを用いることができる。２つの異なるプラスミドのそれぞれは、異なる選択マーカーを担持してもよい。いくつかの実施形態において、プラスミドを、嫌気性細胞中に安定に形質転換する。
アルカンおよび／またはアルケンの生成のために、異種核酸配列が安定に維持される組換え微生物を用いることが望ましい。これに関して、複製可能プラスミドを用いることができる。これは、宿主によって認識され、細胞分裂中に娘細胞に分配される安定な自律性の染色体外エレメントとしてのプラスミドの複製を可能にする複製起点を有する。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の配列が、選択された微生物のゲノム中に組み込まれる。組み込みを、発現カセットと一緒に実施することができる。いくつかの実施形態においては、宿主ゲノム中への組み込みは、安定な組み込みである。ゲノム中への核酸の組み込みを、トランスポザーゼ酵素を用いて実行することができる。それぞれの宿主ゲノムは、細菌染色体であってもよい。
酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列が宿主ゲノム中に組み込まれる実施形態においては、１つまたは複数の輸送可能エレメントを、この目的のために用いることができる。例として、トランスポザーゼをコードしてもよいクラス２輸送可能エレメントは、ベクター中に含まれ、本明細書に開示される１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のコード配列を包含してもよい。細菌からヒトまでの様々な生物に由来するトランスポザーゼが公知である。ヒトトランスポザーゼの例は、ＴＨＡＰ型亜鉛フィンガーを含有する、ＴＨＡＰ９トランスポザーゼである。ほとんどのトランスポザーゼは、ＥＣ番号ＥＣ２．７．７の下に分類される。
頻繁に用いられ、よく検査されているトランスポザーゼは、大腸菌（E.coli）などの細菌中に見出される、トランスポゾンＴｎ１０のトランスポザーゼである。このトランスポゾンは、トランスポザーゼと、抗生物質テトラサイクリンに対する耐性を付与する２つのタンパク質とを含む、５つの遺伝子を含有する。Ｔｎ１０のトランスポザーゼは、例えば、プラスミドｐＷＨ１（Ａ３１Ｖ）−ｍＲＦＰまたはプラスミドｐＸＴ１０７に含まれる。好適なトランスポザーゼのさらなる例は、大腸菌（E.coli）およびシェワネラ（Shewanella）中に見出される、細菌トランスポゾンＴｎ５（ＥＣ３．１．−．−）のトランスポザーゼである。このトランスポゾンは、２つのタンパク質、トランスポザーゼＴｎ５と、転移阻害因子とをコードする。トランスポザーゼＴｎ５は、レトロウイルスインテグラーゼを含むタンパク質のＲＮａｓｅスーパーファミリーのメンバーである。トランスポゾンは、カナマイシンおよび他のアミノグリコシド抗生物質に対する抗生物質耐性をコードする。トランスポザーゼＴｎ５は、例えば、プラスミドｐＯ８６Ａ１中に含まれる。さらに別の例は、原核生物中に見出される、Ｔｎ３トランスポゾンのＴｎ３トランスポザーゼである。このトランスポゾンは、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を付与する酵素であるβ−ラクタマーゼ、Ｔｎ３トランスポザーゼおよびＴｎ３レゾルバーゼをコードする。用いることができるトランスポザーゼの別の例は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系などのＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼである。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、正確に規定されたＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体中に導入するように設計された合成ＤＮＡトランスポゾンである。それは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼを含有する。多数のＳＢトランスポゾンが、非ウイルスベクターとして、特に、脊椎動物のゲノム中への遺伝子の導入のために開発されている。用いることができる２つのさらなるトランスポゾンに基づく系は、例えば、国際公開第２００３／１０００７０号パンフレットに記載されたＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン／トランスポザーゼ系、またはＴＴＡＡ特異的トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃ系である。さらに別の例は、大腸菌（E.coli）に由来するトランスポゾンＴｎｉＡのトランスポザーゼである。ＴｎｉＡのトランスポザーゼは、プラスミドｐＥＣ２７９、ｐＥＣ５４およびｐｅＨ４Ｈに含まれる。さらなる例として、大腸菌（E.coli）中に見出される、「トランスポゾンガンマ−デルタ」とも呼ばれる、トランスポゾンＴｎ１０００トランスポザーゼは、例えば、大腸菌（E.coli）Ｆプラスミド中に含まれる。さらなる例として、大腸菌（E.coli）に由来するＩＳ１８６Ａトランスポザーゼ、ＲＥＰ関連チロシントランスポザーゼまたはＩｎｓＨトランスポザーゼが役立ち得る。
宿主ゲノム中への組み込みを、生物中に導入されるＤＮＡによりコードされる特定の機能の存在または非存在に応じて、陽性選択と組み合わせて、例えば、組換え宿主、例えば、細菌の生存にとって必要な特定の特性または機能をコードする核酸分子を提供することによって実施することができる。それぞれの特性または機能は、特定の抗生物質に対する耐性に属するものであってもよい。上記も参照されたい。実例として、耐性マーカーは発現され、かくして、宿主ゲノム、例えば、染色体ＤＮＡ中に組み込まれた場合に活性であってもよく、「インテグランド」とも呼ばれる、組み込まれた核酸を担持する宿主細胞についての陽性選択を実行することができる。いくつかの実施形態においては、それぞれの耐性マーカーは、発現されず、かくして、ベクターによって包含された場合、かくして、ゲノム中にまだ組み込まれていない場合に活性であってもよい。それぞれのベクター、例えば、プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子のプロモーターに近接して結合することができるリプレッサーを含んでもよい。結果として、ベクター中に含まれるが、耐性マーカーは不活性である。一度、例えば、転位によって細菌ゲノム中に挿入されたら、リプレッサーが結合することができるオペレーター配列は存在しない。耐性マーカーは、したがって、宿主ゲノム中で機能的である。
酵素の発現の決定
必要に応じて、核酸もしくはタンパク質の量を検出することにより、または、酵素の場合、酵素活性を検出することにより、タンパク質の発現を検証することができる。任意の利用可能な方法を用いて、本明細書に開示される方法の文脈において核酸またはタンパク質の存在を検出することができる。そのような方法は、当業界で周知の確立された標準的な手順を含んでもよい。そのような技術の例としては、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡａｓｅ保護アッセイ、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイまたは蛍光滴定アッセイが挙げられる。酵素について、酵素活性を用いて、その存在を評価し、存在するタンパク質の量を見積もることができる。それぞれの活性試験を、細胞中に導入することができる入手可能な色素を用いて細胞中、ｉｎ ｖｉｖｏで実行することができる。
必要に応じて、核酸もしくはタンパク質の量を検出することにより、または、酵素の場合、酵素活性を検出することにより、タンパク質の発現を検証することができる。任意の利用可能な方法を用いて、本明細書に開示される方法の文脈において核酸またはタンパク質の存在を検出することができる。そのような方法は、当業界で周知の確立された標準的な手順を含んでもよい。そのような技術の例としては、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡａｓｅ保護アッセイ、ノーザン分析、ウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイまたは蛍光滴定アッセイが挙げられる。酵素について、酵素活性を用いて、その存在を評価し、存在するタンパク質の量を見積もることができる。それぞれの活性試験を、細胞中に導入することができる入手可能な色素を用いて細胞中、ｉｎ ｖｉｖｏで実行することができる。
それぞれの色素の検出を、蛍光比顕微鏡を含む蛍光顕微鏡を用いて実行することができる。生物学的調製物から最終データまでアッセイ全体を処理することができる統合型光学画像化システムが市販されている。様々な生理的に重要な特性の感受性蛍光指標が利用可能であり、タンパク質、ヌクレオチド、イオン、および脂質の細胞内分布を高感度に、かつ特異的に特徴付けるために蛍光試薬を用いることができる。蛍光比顕微鏡においては、２つの蛍光画像を収集し、目的のパラメータを、一方の画像における蛍光の他方の画像における蛍光との比として定量する。２つの波長の光で試料を連続的に励起し、２つの異なる画像を連続的に収集することにより、単一の波長の光で試料を励起し、２つの異なる放出波長の光から形成される画像を収集することにより、または２つの波長で試料を励起し、２つの波長の放出を収集することにより、蛍光比画像を収集することができる。
細胞中のタンパク質の量の評価は、それぞれのタンパク質をコードする細胞中の、核酸、例えば、ＲＮＡの量を評価することを含んでもよい。本明細書に開示される方法は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００３１１３５０６．１の配列もしくはそのホモログおよび／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０１０８２７．３の配列もしくはそのホモログをコードする配列の発現を測定することをさらに含んでもよい。これは、例えば、選択されたプロモーターの制御下にあるコード核酸分子から転写されるＲＮＡ分子の数を決定することによって達成することができる。当業界で一般的に用いられる方法は、逆転写酵素を用いたＲＮＡからｃＤＮＡへのその後のコピーおよびｃＤＮＡ分子の蛍光色素へのカップリングである。分析を、例えば、ＤＮＡマイクロアレイの形態で実施することができる。いくつかのそれぞれのサービスおよびキットが商業的に利用可能であり、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイがある。転写因子の遺伝子発現を決定する他の手段としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチドアレイ、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
核酸プローブを用いて、タンパク質の核酸分子の量を検出するための任意の一般的なハイブリダイゼーション法によって試料を精査することができる。核酸プローブを取得するために、化学合成を実行することができる。合成された核酸プローブを、それぞれのプローブを取得するために、認識されるＰＣＲ技術にしたがって、本質的には適切な鋳型を用いる標準的なＰＣＲプロトコールにしたがって実行されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして最初に用いることができる。当業者であれば、バイオマーカーにとって利用可能な配列に基づいて、そのようなプローブを容易に設計することができる。放射標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光またはナノ粒子などの標準的な標識技術により、ハイブリダイゼーションプローブを標識することができる。ハイブリダイゼーション後、プローブを、標準的な技術を用いて可視化することができる。
核酸の濃度を決定するために最も頻繁に用いられる方法としては、オートラジオグラフィー、蛍光、化学発光または生物発光ならびに電気化学的および電気的技術による検出が挙げられる。さらに好適な技術は、国際公開第２００９／０４１９１７号パンフレットおよび国際公開第２００８／０９７１９０号パンフレット（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示された標的核酸分子の電気的検出である。矛盾する場合、定義を含む、本明細書が優先するものとする。当業界でよく確立された選択された核酸の特異的検出のための技術は、核酸結合パートナーと標的核酸とのハイブリダイゼーションに基づくものである。典型的には、それぞれの核酸結合パートナーを固相支持体上に固定した後、上記の検出方法のうちの１つを用いる。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子の発現レベルの決定は、ｍＲＮＡへの転写レベルを決定することを含む。目的のタンパク質をコードするＲＮＡを、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲおよび難増幅性突然変異特異的（ＡＲＭＳ）ＰＣＲ（対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）とも呼ばれる）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢレプリカーゼ連鎖反応、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）ならびにゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）、多鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）、および遺伝子特異的鎖置換増幅（ＧＳ−ＭＳＤＡ）などの鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの任意の利用可能な増幅技術を用いて増幅することができる。得られる増幅産物の検出を、当業界で公知のいくつかの方法で実施することができる。例としては、限定されるものではないが、臭化エチジウム染色などの染色と組み合わせたアガロースゲル電気泳動などの電気泳動法が挙げられる。他の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、リアルタイムＰＣＲなどのリアルタイム検出を伴う。これらの実施形態においては、増幅プロセスの時間経過をモニタリングする。当業界で一般的に用いられるリアルタイム検出の手段は、増幅プロセス前の色素の添加を含む。そのような色素の例は、二本鎖核酸に結合された場合にのみ蛍光シグナルを放出する、蛍光色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎである。
実例として、リアルタイムＰＣＲを用いて、酵素などの目的のタンパク質をコードするＲＮＡのレベルを決定することができる。そのようなＰＣＲ手順をリアルタイム検出の下で実行して、増幅プロセスの時間経過をモニタリングする。ＰＣＲは、標的配列の対数増幅を特徴とする。ＲＮＡの増幅のためには、逆転写酵素ＰＣＲを用いる。タンパク質の発現を検出するのに必要とされるプライマーおよびプローブの設計は、当業者の技術の範囲内にある。いくつかの実施形態においては、ＲＮＡｓｅを含まない条件下で試料からＲＮＡを単離した後、逆転写酵素の使用によりＤＮＡに変換する。逆転写を、ＲＴ−ＰＣＲ分析の前に、または同時に、単一の反応容器内で実施することができる。ＲＴ−ＰＣＲプローブは、５’末端に結合した、リポーター色素とも呼ばれる蛍光部分と、３’末端にカップリングされたクエンチャー部分（またはその逆）を有するオリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、典型的には、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイズしていない状態では、蛍光部分とクエンチ部分が近いと、プローブからの蛍光シグナルの検出が阻まれる。ＰＣＲ増幅中、ポリメラーゼがＲＴ−ＰＣＲプローブが結合する鋳型を複製する時に、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性はプローブを切断する。それにより、蛍光部分とクエンチ部分が脱カップリングされる。次いで、蛍光は、プローブ切断の量に比例する様式で、各サイクル中で増加する。反応物から放出される蛍光シグナルを、日常的かつ従来の技術を用いて商業的に利用可能である装備を用いて経時的に測定するか、または追跡することができる。評価される試料中のバイオマーカーＲＮＡの定量を、増幅シグナルと、既知量のＲＮＡが同様の様式で評価された１つまたは複数の標準曲線のものとの比較により実施することができる。いくつかの実施形態においては、バイオマーカー発現の差異を、閾値蛍光、または「ｄＣＴ」に達するまでのＰＣＲサイクル時間における差異として測定する。
組換え微生物を用いたアルケンの生成
本明細書に記載の組換え微生物を用いて、１つまたは複数のアルケンおよび／またはアルカン生成物を生成することができる。１つまたは複数のアルケンおよび／またはアルカンの生成は、それぞれの微生物によってアセチル−ＣｏＡに変換することができる基質を提供することを含んでもよい。上記で説明された通り、アセチル−ＣｏＡは、中心的な代謝構成要素（building stone）である。用いられる微生物に応じて、様々な基質が潜在的に好適であってもよい。いくつかの実施形態においては、生成物は、ＣＯを含む基質を提供することを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ＣＯ２を含む基質を提供することができる。基質は、気体性であってもよく、ある特定の量のＣＯおよび／またはＣＯ２を含有してもよい。例えば、２５％（ｖ／ｖ）以上の一酸化炭素を含有する基質を提供することができる。また、２５％（ｖ／ｖ）以上の二酸化炭素を含有する基質を提供することもできる。いくつかの実施形態においては、３５％（ｖ／ｖ）以上の一酸化炭素を含有する基質を提供することができる。いくつかの実施形態においては、３５％（ｖ／ｖ）以上の二酸化炭素を含有する基質を提供することができる。ＣＯは、水素と一酸化炭素とから本質的になる気体混合物である、合成気体とも呼ばれる、合成ガスに含まれる成分であってもよい。いくつかの実施形態においては、ＣＯとＣＯ２の両方が合成ガス中に含まれていてもよい。
本明細書に記載の組換え微生物を用いて、１つまたは複数のアルケンおよび／またはアルカン生成物を生成することができる。１つまたは複数のアルケンおよび／またはアルカンの生成は、それぞれの微生物によってアセチル−ＣｏＡに変換することができる基質を提供することを含んでもよい。上記で説明された通り、アセチル−ＣｏＡは、中心的な代謝構成要素（building stone）である。用いられる微生物に応じて、様々な基質が潜在的に好適であってもよい。いくつかの実施形態においては、生成物は、ＣＯを含む基質を提供することを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ＣＯ２を含む基質を提供することができる。基質は、気体性であってもよく、ある特定の量のＣＯおよび／またはＣＯ２を含有してもよい。例えば、２５％（ｖ／ｖ）以上の一酸化炭素を含有する基質を提供することができる。また、２５％（ｖ／ｖ）以上の二酸化炭素を含有する基質を提供することもできる。いくつかの実施形態においては、３５％（ｖ／ｖ）以上の一酸化炭素を含有する基質を提供することができる。いくつかの実施形態においては、３５％（ｖ／ｖ）以上の二酸化炭素を含有する基質を提供することができる。ＣＯは、水素と一酸化炭素とから本質的になる気体混合物である、合成気体とも呼ばれる、合成ガスに含まれる成分であってもよい。いくつかの実施形態においては、ＣＯとＣＯ２の両方が合成ガス中に含まれていてもよい。
本明細書に開示されるアルカンおよび／またはアルケンを生成する方法は、一般に、ＣＯおよび／またはＣＯ２の存在下、例えば、ＣＯおよびＣＯ２を含有する雰囲気下、好適な培地中、好適な条件下で非天然微生物を培養することを含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の非天然微生物の培養を、実質的に嫌気的培養条件で実行することができる。培養培地は、用いられる微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミンおよびミネラルを含有してもよい。ＣＯを用いる発酵にとって好適な嫌気的培地は、当業界で公知である。
１つまたは複数のアルケンおよび／またはアルカンの生成は、発酵プロセスを含んでもよい。発酵プロセスを、水性培養培地、例えば、バイオリアクター中で実行することができる。培養培地を用いるバイオリアクター中での培養は、当業界でよく確立された技術である。一酸化炭素および／または二酸化炭素を含有する基質を含む一酸化炭素および／または二酸化炭素、ならびに培地を、連続、バッチまたはフェドバッチ様式でそれぞれのバイオリアクターに供給することができる。
生成されたアルカンまたはアルケンは、組換え微生物によって周囲の培地中に分泌されてもよい。かくして、アルカンまたはアルケンを、発酵ブロスから回収することができる。アルカンまたはアルケンが気体性である実施形態においては、アルカンまたはアルケンの一部は、培養培地中に溶解してもよい。例として、ブタジエンは、約７．４ｇ／Ｌの水への溶解度を有する。ブテンは、約２．２／Ｌの水への溶解度を有するが、プロペンは約０．６ｇ／Ｌの水への溶解度を有する。アルカンまたはアルケンが気体性である場合、典型的には、それぞれの生成物は、培養培地の上の気体相から収集される。
生成されたアルカンまたはアルケンを、当業界で公知の任意の好適な分離および／または精製技術を用いて、単離および富化、例えば、精製することができる。いくつかの実施形態においては、ｎ−ブテンまたは１，３−ブタジエンなどの生成されたアルカンまたはアルケンは、気体性である。いくつかの実施形態においては、イソプレンなどの生成されたアルカンまたはアルケンは液体である。気体生成物の場合、アルカンまたはアルケンは、フィルター、気体分離膜および／または吸着カラムなどの気体精製剤を通過した後、１つまたは複数のシリンダー中に保存することができる。いくつかの実施形態においては、蒸留を用いて、生成された気体を精製することができる。いくつかの実施形態においては、気体−液体抽出（ストリッピング）を用いてもよい。液体生成物の場合、アルカンまたはアルケンの単離は、遠心分離を含んでもよい。また、有機相を用いる抽出によって生成物を富化することもできる。アルカンおよび／またはアルケンを含有するそれぞれの有機相を、脱乳化剤および／または核形成剤を発酵液体に添加することにより、発酵液体から分離することができる。脱乳化剤の実例は、凝集剤および凝固剤を含む。核形成剤の実例は、アセチル−ＣｏＡ由来化合物自体ならびにドデカン、ミリスチン酸イソプロピル、およびオレイン酸メチルなどの有機溶媒の液滴を含む。いくつかの実施形態においては、アセチル−ＣｏＡ由来化合物を含む有機相は、発酵物から自発的に分離する。得られるアルカンまたはアルケンを精製する方法は、限外濾過などの他の標準的な技術、および１つまたは複数のクロマトグラフィー技術を含んでもよい。
本明細書における以前に公開された文献の列挙または考察は、必ずしも文献が技術水準の一部であるか、または共通一般知識であるとの承認と理解されるべきではない。
本明細書に例示的に記載される発明は、本明細書に具体的に開示されない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の非存在下でも好適に実行することができる。さらに、本明細書で用いられる用語および表現は、制限の用語ではなく、説明の用語として用いられており、示され、説明される特徴の任意の均等物またはその一部を排除することをそのような用語および表現の使用において意図するものではなく、様々な改変が特許請求される発明の範囲内で可能であることが認識される。かくして、本発明は例示的な実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されてきたが、当業者であれば、本明細書に開示され、その中で具体化される本発明の改変および変更を用いることができ、そのような改変および変更が本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
本発明は、本明細書において広く、かつ一般的に記載されてきた。一般的な開示の範囲内にあるより狭い種および亜属群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これは、切り出される材料が本明細書に具体的に記載されるかどうかに関係なく、属から任意の主題を除去する条件付きで、または消極的な限定と共に本発明の一般的な説明を含む。
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の中にある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の形式で記載される場合、当業者であれば、それにより本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることを認識できる。
本発明を容易に理解し、効果的に実施するために、ここで、特定の実施形態を、以下の非限定例によって記載する。
実施例は、本明細書に開示される方法および上記の組換え微生物の取得において用いることができる技術を例示する。
メタン、エタン、エテン、プロパン、プロペン、ｎ−ブタン、１−ブテン、２−メチルプロペン、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、ｎ−ヘキサンおよび１−ヘキセンの生成
発現プラスミドＳＧ３２３（および本明細書に記載される他の全てのプラスミド）の構築を、アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）ＣＡに由来する遺伝子を用いる標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術によって実施した。図４Ｄは、操作されたモリブデンニトロゲナーゼ経路を含有するプラスミドＳＧ３２３（配列番号４）を示す。このプラスミドを、以下のプロトコールによってクロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）細胞中にエレクトロポレーションした。
発現プラスミドＳＧ３２３（および本明細書に記載される他の全てのプラスミド）の構築を、アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）ＣＡに由来する遺伝子を用いる標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術によって実施した。図４Ｄは、操作されたモリブデンニトロゲナーゼ経路を含有するプラスミドＳＧ３２３（配列番号４）を示す。このプラスミドを、以下のプロトコールによってクロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）細胞中にエレクトロポレーションした。
クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）細胞の遺伝子形質転換
エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製：Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）エレクトロコンピテント細胞を作製するための手順を、以前に報告されたプロトコール（Kopke, M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107, 29, 13087-13092）から改変した。遠心分離以外の全ての操作を、嫌気性チャンバ中、氷上で実行した。全てのバッファーおよび遠心分離チューブを、使用前に氷冷し、無酸素状態にした。全てのプラスチックを、使用前に少なくとも２４ｈ、嫌気性チャンバに入れて、残留酸素を全て除去した。コンピテント細胞を、使用まで−８０℃で１０％ＤＭＳＯを含むＳＭＰバッファー（２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６）中で維持した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞を、凍結ストックから新鮮に接種した培養物から調製した後、ＹＴＦ液体培地中に２回移した。コンピテント細胞の調製の約１５〜１６ｈ前に、中期から後期対数期の培養物を、４０ｍＭ ＤＬ−トレオニンを添加した１００ｍＬの新鮮なＹＴＦ培地（６００ｎｍでの最終光密度［ＯＤ５００］＝０．００４］を含有する２つの血清ボトル中に移した。３７℃で一晩増殖させた後、初期対数期の細胞（ＯＤ６００＝０．２〜０．３；２００ｍＬ）を、４℃で１０ｍｉｎ、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離により集めた。細胞を２００ｍｌのＳＭＰ洗浄バッファーで２回洗浄し、１０１０〜１０１１細胞／ｍＬの最終濃度で同じバッファー中に再懸濁した。凍結防止バッファー（６０％ＤＭＳＯ−４０％ＳＭＰ、ｐＨ６）を、最終再懸濁容量の１／５でコンピテント細胞に添加して、１０％ＤＭＳＯの最終濃度を達成した。得られたコンピテント細胞（２５μＬ／チューブ）を、将来の使用のために−８０℃で保存した。これらの凍結コンピテント細胞の能力は、約１カ月にわたって安定なままであった。
エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製：Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）エレクトロコンピテント細胞を作製するための手順を、以前に報告されたプロトコール（Kopke, M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107, 29, 13087-13092）から改変した。遠心分離以外の全ての操作を、嫌気性チャンバ中、氷上で実行した。全てのバッファーおよび遠心分離チューブを、使用前に氷冷し、無酸素状態にした。全てのプラスチックを、使用前に少なくとも２４ｈ、嫌気性チャンバに入れて、残留酸素を全て除去した。コンピテント細胞を、使用まで−８０℃で１０％ＤＭＳＯを含むＳＭＰバッファー（２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６）中で維持した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞を、凍結ストックから新鮮に接種した培養物から調製した後、ＹＴＦ液体培地中に２回移した。コンピテント細胞の調製の約１５〜１６ｈ前に、中期から後期対数期の培養物を、４０ｍＭ ＤＬ−トレオニンを添加した１００ｍＬの新鮮なＹＴＦ培地（６００ｎｍでの最終光密度［ＯＤ５００］＝０．００４］を含有する２つの血清ボトル中に移した。３７℃で一晩増殖させた後、初期対数期の細胞（ＯＤ６００＝０．２〜０．３；２００ｍＬ）を、４℃で１０ｍｉｎ、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離により集めた。細胞を２００ｍｌのＳＭＰ洗浄バッファーで２回洗浄し、１０１０〜１０１１細胞／ｍＬの最終濃度で同じバッファー中に再懸濁した。凍結防止バッファー（６０％ＤＭＳＯ−４０％ＳＭＰ、ｐＨ６）を、最終再懸濁容量の１／５でコンピテント細胞に添加して、１０％ＤＭＳＯの最終濃度を達成した。得られたコンピテント細胞（２５μＬ／チューブ）を、将来の使用のために−８０℃で保存した。これらの凍結コンピテント細胞の能力は、約１カ月にわたって安定なままであった。
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）の電気的形質転換手順：全ての手順を、嫌気性チャンバ中で実行した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞（２５μｌ）を、−８０℃の冷凍庫から嫌気性チャンバに、迅速に氷上で移した。氷上で解凍した後（約１ｍｉｎ）、細胞を１〜５μｇのＤＮＡと混合し、予め冷却した、０．１ｃｍギャップのキュベットに移した。微生物エレクトロポレーションシステムを用いて、６００Ｏｈｍの抵抗および２５μＦの電気容量で０．６２５ｋＶを細胞にパルスした。パルスの直後、０．５ｍＬの新鮮なＹＴＦ培地を用いて細胞を回収し、５ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７）を添加した１０ｍＬのＹＴＦ培地を含有する圧力チューブに移し、３７℃でインキュベートした。エレクトロポレーションされた細胞を、その細胞密度がエレクトロポレーションの直後よりも高くなるまで（約９〜１２ｈ）、３７℃で回復させた。５ミリリットル容量の派生培養物または適切に希釈された培養物を、適切な抗生物質を含有する２０ｍＬのＹＴＦ融解寒天（１．５％）と混合し、ペトリ皿に注いだ。寒天混合物を固化させた後、プレートを、下を上にしてインキュベートした。２〜３日後、コロニーが見えるようになり、液体培養物中に接種することができた。
ＹＴＦ培地：
１０ｇ／Ｌ酵母抽出物
１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン
４ｇ／Ｌ塩化ナトリウム
５ｇ／Ｌフルクトース
２ｍＭ Ｌ−システインを添加
最終ｐＨは６．０である。
１０ｇ／Ｌ酵母抽出物
１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン
４ｇ／Ｌ塩化ナトリウム
５ｇ／Ｌフルクトース
２ｍＭ Ｌ−システインを添加
最終ｐＨは６．０である。
電極による電子供給を用いるガス発酵による、合成ガス（ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２の混合物）および電子からのメタン、エタン、エテン、プロパン、プロペン、ｎ−ブタン、１−ブテン、２−メチルプロペン、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、ｎ−ヘキサンおよび１−ヘキセンの生成を、プラスミドＳＧ３２３を担持する前記遺伝子操作されたＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞を用いて実施した。用いた材料および方法を、以下に記載する。
ガスを用いた増殖のための用いた培地：
ＮＨ４Ｃｌ： １．０ｇ
ＫＣｌ： ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＮａＣｌ ０．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
微量元素（以下を参照） １０．０ｍＬ
Ｗｏｌｆｅのビタミン溶液（以下を参照） １０．０ｍＬ
還元剤（以下を参照） １０．０ｍＬ
蒸留水 ９８０．０ｍＬ
最終ｐＨは６．０である。
ＮＨ４Ｃｌ： １．０ｇ
ＫＣｌ： ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＮａＣｌ ０．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
微量元素（以下を参照） １０．０ｍＬ
Ｗｏｌｆｅのビタミン溶液（以下を参照） １０．０ｍＬ
還元剤（以下を参照） １０．０ｍＬ
蒸留水 ９８０．０ｍＬ
最終ｐＨは６．０である。
微量元素：
ニトリロ三酢酸 ２．０ｇ
ＭｎＳＯ４ｘＨ２Ｏ １．０ｇ
Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２ｘ６Ｈ２Ｏ ０．８ｇ
ＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ
ＣｕＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
ＮｉＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４ ２０．０ｍｇ
Ｎａ２ＷＯ４ ２０．０ｍｇ
蒸留水 １．０Ｌ
ニトリロ三酢酸を水に添加し、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整する。残りの成分を添加する。
ニトリロ三酢酸 ２．０ｇ
ＭｎＳＯ４ｘＨ２Ｏ １．０ｇ
Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２ｘ６Ｈ２Ｏ ０．８ｇ
ＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ
ＣｕＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
ＮｉＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ ２０．０ｍｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４ ２０．０ｍｇ
Ｎａ２ＷＯ４ ２０．０ｍｇ
蒸留水 １．０Ｌ
ニトリロ三酢酸を水に添加し、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整する。残りの成分を添加する。
Ｗｏｌｆｅのビタミン溶液：
ビオチン ２．０ｍｇ
葉酸 ２．０ｍｇ
塩酸ピリドキシン １０．０ｍｇ
チアミンｘＨＣｌ ５．０ｍｇ
リボフラビン ５．０ｍｇ
ニコチン酸 ５．０ｍｇ
Ｄ−（＋）−パントテン酸カルシウム ５．０ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．１ｍｇ
ｐ−アミノ安息香酸 ５．０ｍｇ
チオクト酸 ５．０ｍｇ
蒸留水 １．０Ｌ。
ビオチン ２．０ｍｇ
葉酸 ２．０ｍｇ
塩酸ピリドキシン １０．０ｍｇ
チアミンｘＨＣｌ ５．０ｍｇ
リボフラビン ５．０ｍｇ
ニコチン酸 ５．０ｍｇ
Ｄ−（＋）−パントテン酸カルシウム ５．０ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．１ｍｇ
ｐ−アミノ安息香酸 ５．０ｍｇ
チオクト酸 ５．０ｍｇ
蒸留水 １．０Ｌ。
還元剤：
Ｌ−システイン（遊離塩基） ４．０ｇ
蒸留水 １００．０ｍＬ。
Ｌ−システイン（遊離塩基） ４．０ｇ
蒸留水 １００．０ｍＬ。
用いたガス：６０％ＣＯ、１０％ＣＯ２、３０％Ｈ２。
形質転換された細胞を、１バールの圧力で合成ガス（６０％ＣＯ、１０％ＣＯ２、３０％Ｈ２）および電気供給のための電源を備えた電極を提供したＣＳＴＲバイオリアクター中、３７℃で１０μｇ／ｍＬのチアンフェニコール（抗生物質）を添加した上記培地中で培養した。０．３ＯＤ６００の細胞密度に達した時、１０ｍＭ ＩＰＴＧにより遺伝子発現を誘導した。生成物分析を、ＧＣ−ＭＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−ＭＳ ＱＰ５０５０Ａ）により実施した。５００ｉＩＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ気密シリンジを用いて、頭部空間ガスサンプリングを行った。メタン、エタン、エテン、プロパン、プロペン、ｎ−ブタン、１−ブテン、２−メチルプロペン、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、ｎ−ヘキサンおよび１−ヘキセンの生成を、ＧＣ−ＭＳにより検出することができた。
代替的な実施形態：
また、プラスミドＳＧ１９３（図４Ａおよび配列番号１）、プラスミドＳＧ２１１（図４Ｂおよび配列番号２）およびプラスミドＳＧ２７８（図４Ｃおよび配列番号３）を用いて、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）細胞を操作して、メタン、エタン、エテン、プロパン、プロペン、ｎ−ブタン、１−ブテン、２−メチルプロペン、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、ｎ−ヘキサンを生成した。好ましい実施形態に記載されたものと同じ基本プロトコールおよびプロセスを実施した。以下に列挙されるような様々な基質を用いた。
また、プラスミドＳＧ１９３（図４Ａおよび配列番号１）、プラスミドＳＧ２１１（図４Ｂおよび配列番号２）およびプラスミドＳＧ２７８（図４Ｃおよび配列番号３）を用いて、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）細胞を操作して、メタン、エタン、エテン、プロパン、プロペン、ｎ−ブタン、１−ブテン、２−メチルプロペン、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、ｎ−ヘキサンを生成した。好ましい実施形態に記載されたものと同じ基本プロトコールおよびプロセスを実施した。以下に列挙されるような様々な基質を用いた。
全ての基質について、その後の実施例のものも用いた：
６０％ＣＯ、１０％ＣＯ２、３０％Ｈ２
１００％ＣＯ
３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２
６０％ＣＯ、１０％ＣＯ２、３０％Ｈ２および電子
１００％ＣＯおよび電子
１００％ＣＯ２および電子
３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２および電子。
６０％ＣＯ、１０％ＣＯ２、３０％Ｈ２
１００％ＣＯ
３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２
６０％ＣＯ、１０％ＣＯ２、３０％Ｈ２および電子
１００％ＣＯおよび電子
１００％ＣＯ２および電子
３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２および電子。
トランスポザーゼによるクロストリジウム中での染色体組み込みおよび多コピー染色体組み込みの陽性選択
以下の実施例は、所与の宿主または筐体微生物中に異種ＤＮＡ（代謝遺伝子クラスターまたは他の任意の機能的もしくは非機能的核酸配列）を組み込む方法を例示する。突然変異細菌の陽性選択（または直接的遺伝子選択）は、組換え細菌の生存が生物中に導入されるＤＮＡによりコードされる特定の機能の存在または非存在に依存する場合はいつでも可能である。スクリーニング法に勝る選択方法の利点は、部位特異的突然変異を有する細菌の増殖がその特異的突然変異を欠く細菌よりも非常に好ましく、かくして、好ましい突然変異体の同定を容易にするということである。転位のために認識される塩基配列に隣接するトランスポザーゼおよび組み込みカセットなどの、転位にとって必要とされる全ての機能はプラスミド上に導入されるため、組み込みカセットの一部としての抗生物質選択マーカーによる直接陽性選択は不可能である。耐性マーカーはプラスミド上で機能的であり、したがって（多くのプラスミドも高コピー数を有する）、増殖における優位性は組み込み事象からは生じない。しかしながら、マーカーが染色体ＤＮＡ中に組み込まれた場合にのみ発現され、かくして、活性である場合、インテグランドに関する陽性選択が可能である。
以下の実施例は、所与の宿主または筐体微生物中に異種ＤＮＡ（代謝遺伝子クラスターまたは他の任意の機能的もしくは非機能的核酸配列）を組み込む方法を例示する。突然変異細菌の陽性選択（または直接的遺伝子選択）は、組換え細菌の生存が生物中に導入されるＤＮＡによりコードされる特定の機能の存在または非存在に依存する場合はいつでも可能である。スクリーニング法に勝る選択方法の利点は、部位特異的突然変異を有する細菌の増殖がその特異的突然変異を欠く細菌よりも非常に好ましく、かくして、好ましい突然変異体の同定を容易にするということである。転位のために認識される塩基配列に隣接するトランスポザーゼおよび組み込みカセットなどの、転位にとって必要とされる全ての機能はプラスミド上に導入されるため、組み込みカセットの一部としての抗生物質選択マーカーによる直接陽性選択は不可能である。耐性マーカーはプラスミド上で機能的であり、したがって（多くのプラスミドも高コピー数を有する）、増殖における優位性は組み込み事象からは生じない。しかしながら、マーカーが染色体ＤＮＡ中に組み込まれた場合にのみ発現され、かくして、活性である場合、インテグランドに関する陽性選択が可能である。
図２Ａは、カットアンドペーストトランスポザーゼ２０による細菌染色体への核酸配列の組み込みのための基本系の概説を提供する。必要な全ての機能は、単一のプラスミド上に位置する。主鎖は、形質転換細菌細胞中でのベクターの増殖のための抗生物質耐性マーカー３２および複製起点３０を有する。組み込みカセットは、トランスポザーゼ認識部位２２および２８に隣接する；組み込みカセットはまた、第２の抗生物質耐性遺伝子を含む。トランスポザーゼ２０は、２つの認識部位でＤＮＡを切断し、この核酸を細菌染色体中に組み込む。
耐性マーカーの発現は、抗生物質遺伝子のプロモーターの近くでのリプレッサーの結合によってプラスミド上に位置する場合に脱活性化される。転位後、リプレッサーが結合するオペレーター配列は失われ、耐性が付与される。この原理は、図２Ｂにより詳細に示される。
図３Ａは、図２Ａの最小系の上部に実装された陽性選択系を記載する。ここで、さらなるリプレッサー３２は、オペレーター部位３４に結合し、抗生物質耐性遺伝子３８の発現を遮断する。対応する抗生物質耐性タンパク質は発現されず、耐性は付与されない。図３Ｂは、カセットがトランスポザーゼの作用によって細菌染色体４４に組み込まれた状況を例示する。オペレーター部位３４は最早存在せず、抗生物質耐性遺伝子３８の発現は抗生物質耐性をもたらす。かくして、挿入染色体突然変異体を選択することが可能である。
５’ＩＴＲ（トランスポザーゼにより認識、切断される逆方向末端反復）およびｌｏｘ６６部位は、エリスロマイシン／クラリスロマイシン抗生物質耐性マーカーｍＩｓＲのためのプロモーターでもある（図２Ｂを参照されたい）。リプレッサー（ｌａｃＩ）は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、転写を遮断する（これはＩＰＴＧの添加によって反転させることもできる）。転位後、ｌａｃオペレーター配列は失われ、ｍＩｓＲが発現され、（ＲＢＳ＝リボソーム結合部位）について選択することができる。驚くべきことに、それぞれのプロセスはまた、多コピー組み込みの生成および高カーゴの転位も容易にする。インテグランドの陽性選択と、転位事象が起こるための長い時間枠との両方を達成することができる。
トランスポザーゼによるクロストリジウム中での無作為染色体組み込みのための初期系
転位にとって必要な全てのもの（抗生物質耐性マーカーおよびＢｓＦｂＦＰに隣接した、逆方向末端反復とも呼ばれる転位のために認識される塩基配列およびキシロース誘導プロモーターの制御下にあるトランスポザーゼを含む組み込みカセット）を担持する４つの異なる大腸菌（E.coli）−クロストリジウムシャトルプラスミドと、さらなる機能を有さない大腸菌（E.coli）−クロストリジウムシャトルプラスミドのみからなる陰性対照とを試験することによって、嫌気性蛍光タンパク質（ＢｓＦｂＦＰ）の染色体組み込みを確立した。野生型トランスポザーゼｈｉｍａｒ１およびまた過活動変異体ｈｉｍａｒ１Ｃ９を試験した。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の遺伝子形質転換のために、プラスミドｐＡＮＴによってｉｎ ｖｉｖｏでプラスミドをメチル化した。用いたベクターは、配列番号９〜１４のものである。そのベクターマップを、図９〜図１４から取ることができる。
転位にとって必要な全てのもの（抗生物質耐性マーカーおよびＢｓＦｂＦＰに隣接した、逆方向末端反復とも呼ばれる転位のために認識される塩基配列およびキシロース誘導プロモーターの制御下にあるトランスポザーゼを含む組み込みカセット）を担持する４つの異なる大腸菌（E.coli）−クロストリジウムシャトルプラスミドと、さらなる機能を有さない大腸菌（E.coli）−クロストリジウムシャトルプラスミドのみからなる陰性対照とを試験することによって、嫌気性蛍光タンパク質（ＢｓＦｂＦＰ）の染色体組み込みを確立した。野生型トランスポザーゼｈｉｍａｒ１およびまた過活動変異体ｈｉｍａｒ１Ｃ９を試験した。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の遺伝子形質転換のために、プラスミドｐＡＮＴによってｉｎ ｖｉｖｏでプラスミドをメチル化した。用いたベクターは、配列番号９〜１４のものである。そのベクターマップを、図９〜図１４から取ることができる。
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の形質転換を、以下のプロトコールにしたがって実施した。
１．プラスミドＤＮＡのメチル化
プラスミドｐＡＮＴ（φ３Ｔメチルトランスフェラーゼ）と共に大腸菌（E.coli）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲ中でのプラスミドの形質転換
抗生物質：アンピシリン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンの播種
中間調製（ＤＮＡの濃度は低すぎるべきではない）。
プラスミドｐＡＮＴ（φ３Ｔメチルトランスフェラーゼ）と共に大腸菌（E.coli）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲ中でのプラスミドの形質転換
抗生物質：アンピシリン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンの播種
中間調製（ＤＮＡの濃度は低すぎるべきではない）。
２．２ｘＹＴＧ培地を用いてＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）の５ｍｌの液体培養を開始する。
夕方、５０ｍｌの２ｘＹＴＧ培地を５０〜２００ｌの予備培養液に接種し、３６℃で一晩培養する。
・ＯＤ６００＝０．８〜１で細胞を集める
・２２００ｇで１０ｍｉｎ（４℃）、細胞を遠心分離する
・４０ｍｌの氷冷ＨＥＢ＋バッファーで細胞を洗浄する
・２２００ｘｇで１０ｍｉｎ（４℃）遠心分離する
・ＨＥＢ＋バッファーで３回、細胞を洗浄する
・２ｍｌのＨＥＢバッファー中に懸濁し、６００μＬにアリコートする（１回の形質転換）
・冷却した４ｍｍのエレクトロポレーションキュベットおよび最大４μＬのプラスミド（６００μＬの細胞）を用いる
・氷上で２ｍｉｎインキュベートする
・２５００Ｖでエレクトロポレーションする
・１．４ｍＬの２ｘＹＴＧ培地を添加し、３６℃で４時間インキュベートする
・適切な抗生物質、例えば、クラリスロマイシン（Ｃｌａ）またはチアンフェニコール（Ｔｍ）を選択プレート上に播種する
・３６℃で３日間インキュベートする
・コロニーを観察し、液体培養に接種する。
・ＯＤ６００＝０．８〜１で細胞を集める
・２２００ｇで１０ｍｉｎ（４℃）、細胞を遠心分離する
・４０ｍｌの氷冷ＨＥＢ＋バッファーで細胞を洗浄する
・２２００ｘｇで１０ｍｉｎ（４℃）遠心分離する
・ＨＥＢ＋バッファーで３回、細胞を洗浄する
・２ｍｌのＨＥＢバッファー中に懸濁し、６００μＬにアリコートする（１回の形質転換）
・冷却した４ｍｍのエレクトロポレーションキュベットおよび最大４μＬのプラスミド（６００μＬの細胞）を用いる
・氷上で２ｍｉｎインキュベートする
・２５００Ｖでエレクトロポレーションする
・１．４ｍＬの２ｘＹＴＧ培地を添加し、３６℃で４時間インキュベートする
・適切な抗生物質、例えば、クラリスロマイシン（Ｃｌａ）またはチアンフェニコール（Ｔｍ）を選択プレート上に播種する
・３６℃で３日間インキュベートする
・コロニーを観察し、液体培養に接種する。
３．培地：
２ｘＹＴＧ：５ｇ／Ｌグルコース
１６ｇ／Ｌトリプトン
１０ｇ／Ｌ酵母抽出物
５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
ｐＨ７．０
ＨＥＢ＋バッファー：
７ｍＭ ＨＥＰＥＳ
２７２ｍＭスクロース
５ｍＭ ＭｇＣｌ２
ｐＨ７．４
ＨＥＢバッファーは、ＭｇＣｌ２を含有しない。
用いたメチル化プラスミドの濃度：
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３２：３５０ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３３：３００ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３４：２８０ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３５：３８５ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３６：５００ｎｇ／μＬ。
２ｘＹＴＧ：５ｇ／Ｌグルコース
１６ｇ／Ｌトリプトン
１０ｇ／Ｌ酵母抽出物
５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
ｐＨ７．０
ＨＥＢ＋バッファー：
７ｍＭ ＨＥＰＥＳ
２７２ｍＭスクロース
５ｍＭ ＭｇＣｌ２
ｐＨ７．４
ＨＥＢバッファーは、ＭｇＣｌ２を含有しない。
用いたメチル化プラスミドの濃度：
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３２：３５０ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３３：３００ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３４：２８０ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３５：３８５ｎｇ／μＬ
ｐＡＮＴメチル化プラスミドＢＧ００１３６：５００ｎｇ／μＬ。
全ての構築物のエレクトロポレーションが成功し、各プレート上に１０〜５０個のコロニーが観察された。
組み込みを、以下のように実施した。
それぞれの形質転換（１、２、３、４、５）の４個のコロニーを、以下のように新鮮な培地（５ｍＬ）中に接種した：
培地１＝２ｘＹＴＧ ５ｇ／Ｌグルコース
培地２＝２ｘＹＴＧ ５ｇ／Ｌグルコース＋２．５ｇ／Ｌキシロース
培地３＝２ｘＹＴＧ ５ｇ／Ｌグルコース＋１０ｇ／Ｌキシロース。
培地１＝２ｘＹＴＧ ５ｇ／Ｌグルコース
培地２＝２ｘＹＴＧ ５ｇ／Ｌグルコース＋２．５ｇ／Ｌキシロース
培地３＝２ｘＹＴＧ ５ｇ／Ｌグルコース＋１０ｇ／Ｌキシロース。
観察：プラスミドＢＧ１３２、ＢＧ１３４、ＢＧ１３５との予備培養物は他のものよりも早く増殖した。
２μＬのそれぞれの予備培養物を、
−５ｇ／Ｌグルコース
−５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロース〜１０ｇ／Ｌキシロース
を含有する２ｘＹＴプレート上に播種した。
２μＬのそれぞれの予備培養物を、
−５ｇ／Ｌグルコース
−５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロース〜１０ｇ／Ｌキシロース
を含有する２ｘＹＴプレート上に播種した。
２２個の異なるコロニーを、以下のプレート上に打った（第１ラウンド）：
１．２ｘＹＴＧプレート
２．５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＧＸ
３．１０ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＸ。
１．２ｘＹＴＧプレート
２．５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＧＸ
３．１０ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＸ。
２２個のコロニーを、以下のように打った（第２ラウンド）：
１．２ｘＹＴＧプレート
２．５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＧＸ
３．１０ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＸ。
１．２ｘＹＴＧプレート
２．５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＧＸ
３．１０ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＸ。
プレートから取った２２個のコロニーを、以下のように打った（第３ラウンド）：
１．２ｘＹＴＧプレート
２．５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＧＸ
３．１０ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＸ。
１．２ｘＹＴＧプレート
２．５ｇ／Ｌグルコースおよび２．５ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＧＸ
３．１０ｇ／Ｌキシロースを含む２ｘＹＴＸ。
プレートから取った２２個のコロニーを、以下のように打った（第４ラウンド）：
１．抗生物質を含まない２ｘＹＴＧプレート
２．１０μｇ／Ｌクラリスロマイシン（Ｃｌａ）を含む２ｘＹＴＧプレート
３．２０μｇ／Ｌチアンフェニコール（Ｔｍ）を含む２ｘＹＴＧプレート。
１．抗生物質を含まない２ｘＹＴＧプレート
２．１０μｇ／Ｌクラリスロマイシン（Ｃｌａ）を含む２ｘＹＴＧプレート
３．２０μｇ／Ｌチアンフェニコール（Ｔｍ）を含む２ｘＹＴＧプレート。
第４ラウンドのプレートを検査した：
概要：インテグランドを単離することができ、対照は全て陰性であったが、多数の試験したクローンと比較してインテグランドは非常に少なかった。いくつかのクローンは未だプラスミドを失っていなかった。
組み込みの遺伝子座の決定を、以下のように実施した：
Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いるクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）組み込み株（表を参照）のゲノムＤＮＡの調製。約２０ｍＬの液体培養物を用いた。ｇＤＮＡの濃度を、ナノドロップによって決定した。
インテグランド１＝４７０ｎｇ／μＬ
インテグランド２＝４６０ｎｇ／μＬ
インテグランド３＝５２０ｎｇ／μＬ
インテグランド４＝７１０ｎｇ／μＬ
インテグランド５＝３８０ｎｇ／μＬ
インテグランド６＝４６０ｎｇ／μＬ
インテグランド７＝４４０ｎｇ／μＬ
インテグランド８＝４５０ｎｇ／μＬ
インテグランド９＝４２０ｎｇ／μＬ
インテグランド１０＝４００ｎｇ／μＬ
インテグランド１１＝５７０ｎｇ／μＬ
インテグランド１２＝３７０ｎｇ／μＬ。
Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いるクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）組み込み株（表を参照）のゲノムＤＮＡの調製。約２０ｍＬの液体培養物を用いた。ｇＤＮＡの濃度を、ナノドロップによって決定した。
インテグランド１＝４７０ｎｇ／μＬ
インテグランド２＝４６０ｎｇ／μＬ
インテグランド３＝５２０ｎｇ／μＬ
インテグランド４＝７１０ｎｇ／μＬ
インテグランド５＝３８０ｎｇ／μＬ
インテグランド６＝４６０ｎｇ／μＬ
インテグランド７＝４４０ｎｇ／μＬ
インテグランド８＝４５０ｎｇ／μＬ
インテグランド９＝４２０ｎｇ／μＬ
インテグランド１０＝４００ｎｇ／μＬ
インテグランド１１＝５７０ｎｇ／μＬ
インテグランド１２＝３７０ｎｇ／μＬ。
試料を、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送って、遺伝子座決定のためのＰＣＲウォーキングを実施した。
さらなるＰＣＲを実施して、インテグランドを検証した：
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）組み込みチェック。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）組み込みチェック。
ＰＣＲ１：蛍光タンパク質ＢｓＦＢＦＰの存在を試験する
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７２フォワード：ＧＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＡＴ（配列番号５８）
プライマーＢＧ２７３リバース：ＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＡＡＡ（配列番号５９）。
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７２フォワード：ＧＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＡＴ（配列番号５８）
プライマーＢＧ２７３リバース：ＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＡＡＡ（配列番号５９）。
ＰＣＲ２：組み込みマーカーをチェックする
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７４フォワード：ＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣ（配列番号６０）
ＢＧ２７５リバース：ＧＣＡＴＴＴＡＡＧＣＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧ（配列番号６１）。
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７４フォワード：ＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣ（配列番号６０）
ＢＧ２７５リバース：ＧＣＡＴＴＴＡＡＧＣＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧ（配列番号６１）。
ＰＣＲ３：組み込みマーカー２をチェックする
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７６フォワード：ＴＴＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＧＧＧＴＴＴＧ（配列番号６２）
プライマーＢＧ２７７リバース：ＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＡＣＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＧ（配列番号６３）。
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７６フォワード：ＴＴＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＧＧＧＴＴＴＧ（配列番号６２）
プライマーＢＧ２７７リバース：ＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＡＣＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＧ（配列番号６３）。
ＰＣＲ４：主鎖をチェックする
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７８フォワード：ＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡ（配列番号６４）
プライマーＢＧ２７９リバース：ＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡ（配列番号６５）。
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２７８フォワード：ＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡ（配列番号６４）
プライマーＢＧ２７９リバース：ＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡ（配列番号６５）。
ＰＣＲ５：主鎖２をチェックする
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２８０フォワード：ＡＴＴＧＴＡＡＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧ（配列番号６６）
プライマーＢＧ２８１リバース：ＡＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号６７）。
鋳型：インテグランド（クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum））のゲノムＤＮＡおよび野生型ｇＤＮＡ、陽性対照ベクターＢＧ１３２
プライマーＢＧ２８０フォワード：ＡＴＴＧＴＡＡＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧ（配列番号６６）
プライマーＢＧ２８１リバース：ＡＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号６７）。
ＰＣＲ１〜５を、３０サイクル、１ｍｉｎの伸長、５５℃のアニーリング温度、５０μＬの全サイズ、ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて実施した。次いで、ＰＣＲ産物を、０．８％分析的ＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって検査した。その結果を、図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。
ゲル１、図１５Ａ：それぞれ１０μＬのローディング；割り当て；名称；結果は以下の通りであった：
レーン１：Ｒｏｔｈ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ ＆ ＣＯ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した３μＬラダー１ｋＢ
レーン２〜６：インテグランド１ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン７〜１１：インテグランド２ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１２：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１００ｂｐ
レーン１３〜１７：インテグランド３ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１８〜２２：インテグランド４ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン２３〜２７：インテグランド５ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン２８：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ。
レーン１：Ｒｏｔｈ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ ＆ ＣＯ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した３μＬラダー１ｋＢ
レーン２〜６：インテグランド１ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン７〜１１：インテグランド２ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１２：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１００ｂｐ
レーン１３〜１７：インテグランド３ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１８〜２２：インテグランド４ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン２３〜２７：インテグランド５ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン２８：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ。
ゲル２、図１５Ｂ：それぞれ１０μＬのローディング；割り当て；名称；結果は以下の通りであった：
レーン１：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ
レーン２〜６：インテグランド６ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン７〜１１：インテグランド７ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１２〜１６：インテグランド８ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１７：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１００ｂｐ
レーン１８〜２２：野生型 ＰＣＲ１〜５；全て陰性
レーン２３〜２７：インテグランド５ ＰＣＲ１〜５；１、３、４、５陽性、２陰性
レーン２８：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ。
レーン１：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ
レーン２〜６：インテグランド６ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン７〜１１：インテグランド７ ＰＣＲ１〜５；結果：１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１２〜１６：インテグランド８ ＰＣＲ１〜５；１および３陽性、２、４、５陰性
レーン１７：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１００ｂｐ
レーン１８〜２２：野生型 ＰＣＲ１〜５；全て陰性
レーン２３〜２７：インテグランド５ ＰＣＲ１〜５；１、３、４、５陽性、２陰性
レーン２８：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ。
ゲノムウォーキング−ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからの最初の結果。読取り値（最初の数はインテグランドに対応する、上記参照）を、配列番号６８〜７８から取ることができる。
初期の分析に関する表：
初期の分析に関する表：
結果：ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより実施されたＰＣＲゲノムウォーキングは成功したが、全ての遺伝子座を決定することはできなかった。ＬＧＣは最適化された設定で２回目を実行した。
インテグランドの蛍光顕微鏡観察
インテグランドを、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡上で分析した。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）インテグランド１の画像を、図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃに示す。倍率は１０００ｘである。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）インテグランド２の画像を、図１６Ｄに示す。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）インテグランド１０の画像を、図１６Ｅ、図１６Ｆおよび図１６Ｇに示す。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）野生型対照の画像を、図１６Ｈに示す。全ての検査したインテグランドが、蛍光を示す。野生型対照は陰性である。
インテグランドを、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡上で分析した。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）インテグランド１の画像を、図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃに示す。倍率は１０００ｘである。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）インテグランド２の画像を、図１６Ｄに示す。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）インテグランド１０の画像を、図１６Ｅ、図１６Ｆおよび図１６Ｇに示す。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）野生型対照の画像を、図１６Ｈに示す。全ての検査したインテグランドが、蛍光を示す。野生型対照は陰性である。
ゲノムウォーキング−ＬＧＣ ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＰＣＲゲノムウォーキングの第２ラウンドにより、配列番号７９〜８５から取ることができる読取り値が得られた。
トランスポザーゼによるクロストリジウムにおける無作為染色体組み込みおよび無作為多コピー染色体組み込みのための陽性選択系の開発
初期の、面倒な染色体組み込み系をさらに改善するために、組み込みマーカーの転写を遮断するリプレッサーを含む新しいプラスミドを構築した。続いて、新しい系を試験するために、以下の大腸菌（E.coli）−クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）シャトルベクターを、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）中に形質転換した。このプラスミドをクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）中に形質転換するために、最初は上記のプラスミドｐＡＮＴの助けを借りてｉｎ ｖｉｖｏでメチル化した。これを達成するために、プラスミドを、大腸菌（E.coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換した（上記参照）。実施例２に由来する最高性能のベクター（上記参照）である、ベクターＢＧ１３３（「Ｎ」と省略される）は、配列番号１１の配列を有していた。ベクターＢＧ１６８（「Ｉ」と省略される、図１７を参照）は、配列番号１５の配列を有していた。温度感受性プラスミドＢＧ１８２（図１８を参照）は、配列番号１６の配列を有していた。プラスミド調製後、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）を、例えば、上記のプロトコールによりプラスミドＢＧ１６８で遺伝的に形質転換することができる。Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）を、０．６〜０．８の光密度に達するまで、２ｘＹＴＧ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌグルコース）中で嫌気的に培養した。以下のステップも全て嫌気的に行った。細胞を２０００ｇ（４℃）で１０ｍｉｎ遠心分離した後、エレクトロポレーションバッファー（７ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２７０ｍＭスクロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で洗浄した。これを、さらに２回繰り返した。次いで、冷却したエレクトロポレーションキュベットを、５ｋｇのプラスミドＤＮＡ、５００μＬのコンピテント細胞と共に調製し、３ｍｓを超えて２５００Ｖでエレクトロポレーションした。新鮮な２ｘＹＴＧ培地を用いて２時間再生した後、好適な抗生物質を添加した２ｘＹＴＧ寒天プレート上に細胞を播種した。２日後、遺伝的に形質転換されたコロニーが見えるようになった。陽性選択系により染色体インテグランドを単離した：トランスポザーゼ誘導のためにキシロースを添加して、および、第２の抗生物質を添加して、細胞を培養した。２回の連続導入後、細胞を再播種し、次いで、個々の試験のために拾った。第２の（組み込み）マーカーであるクラリスロマイシンについて耐性のままにしながら、チアンフェニコールである第１の（主鎖）マーカーについての耐性の喪失によってインテグランドを同定した。１００を超えるインテグランドを単離することができた。唯一の画分をさらに分析した。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）組み込み株のゲノムＤＮＡの調製を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いて実施した；約２０ｍＬの液体培養を用いた。
初期の、面倒な染色体組み込み系をさらに改善するために、組み込みマーカーの転写を遮断するリプレッサーを含む新しいプラスミドを構築した。続いて、新しい系を試験するために、以下の大腸菌（E.coli）−クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）シャトルベクターを、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）中に形質転換した。このプラスミドをクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）中に形質転換するために、最初は上記のプラスミドｐＡＮＴの助けを借りてｉｎ ｖｉｖｏでメチル化した。これを達成するために、プラスミドを、大腸菌（E.coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換した（上記参照）。実施例２に由来する最高性能のベクター（上記参照）である、ベクターＢＧ１３３（「Ｎ」と省略される）は、配列番号１１の配列を有していた。ベクターＢＧ１６８（「Ｉ」と省略される、図１７を参照）は、配列番号１５の配列を有していた。温度感受性プラスミドＢＧ１８２（図１８を参照）は、配列番号１６の配列を有していた。プラスミド調製後、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）を、例えば、上記のプロトコールによりプラスミドＢＧ１６８で遺伝的に形質転換することができる。Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）を、０．６〜０．８の光密度に達するまで、２ｘＹＴＧ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌグルコース）中で嫌気的に培養した。以下のステップも全て嫌気的に行った。細胞を２０００ｇ（４℃）で１０ｍｉｎ遠心分離した後、エレクトロポレーションバッファー（７ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２７０ｍＭスクロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で洗浄した。これを、さらに２回繰り返した。次いで、冷却したエレクトロポレーションキュベットを、５ｋｇのプラスミドＤＮＡ、５００μＬのコンピテント細胞と共に調製し、３ｍｓを超えて２５００Ｖでエレクトロポレーションした。新鮮な２ｘＹＴＧ培地を用いて２時間再生した後、好適な抗生物質を添加した２ｘＹＴＧ寒天プレート上に細胞を播種した。２日後、遺伝的に形質転換されたコロニーが見えるようになった。陽性選択系により染色体インテグランドを単離した：トランスポザーゼ誘導のためにキシロースを添加して、および、第２の抗生物質を添加して、細胞を培養した。２回の連続導入後、細胞を再播種し、次いで、個々の試験のために拾った。第２の（組み込み）マーカーであるクラリスロマイシンについて耐性のままにしながら、チアンフェニコールである第１の（主鎖）マーカーについての耐性の喪失によってインテグランドを同定した。１００を超えるインテグランドを単離することができた。唯一の画分をさらに分析した。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）組み込み株のゲノムＤＮＡの調製を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いて実施した；約２０ｍＬの液体培養を用いた。
連続導入（陽性選択）による染色体組み込みの比較
凡例：
Ｎ＝プラスミドＮ（上記参照）
Ｉ＝プラスミドＩ（上記参照）
Ｖ＝液体培養（複製物）７ｍＬのサイズ
Ｕ＝連続導入の回数
＃＝番号
Ｃｌａ＝クラリスロマイシン。
Ｎ＝プラスミドＮ（上記参照）
Ｉ＝プラスミドＩ（上記参照）
Ｖ＝液体培養（複製物）７ｍＬのサイズ
Ｕ＝連続導入の回数
＃＝番号
Ｃｌａ＝クラリスロマイシン。
液体培養中での連続導入後、それぞれの複製物５μＬを２ｘＹＴＧ上に播種した。次いで、２８個のコロニーを以下のプレート上に打った：
１．抗生物質を含まない２ｘＹＴＧ
２．５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含む２ｘＹＴＧ
３．２０μｇ／ｍＬチアンフェニコールを含む２ｘＹＴＧ。
１．抗生物質を含まない２ｘＹＴＧ
２．５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含む２ｘＹＴＧ
３．２０μｇ／ｍＬチアンフェニコールを含む２ｘＹＴＧ。
プレートを比較した場合、「Ｎ」シリーズからの全てのクローンはチアンフェニコール耐性（主鎖マーカー）を示したが、これは、プラスミドが依然としてそこにあることを意味している。しかしながら、「Ｉ」シリーズからの全てのクローンはチアンフェニコール耐性（主鎖マーカー）ではなく、クラリスロマイシン耐性（組み込みマーカー）のみであったが、これは、それらが全て染色体インテグランドであることを意味している。
結果を、図６２に示される表にまとめる。
続いて、ｇＤＮＡを、図６３に示すように調製した（プロトコールは上記参照）。
遺伝子座の決定：
ＬＧＣ ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＰＣＲゲノムウォーキングの第１ラウンドは、以下の結果を提供した。
ＬＧＣ ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＰＣＲゲノムウォーキングの第１ラウンドは、以下の結果を提供した。
決定不可能：６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３５。
ｇｕｅｎｔ０１：４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸リダクターゼ／Ｓ１ ＲＮＡ結合ドメインタンパク質：１、２、３、４、５。
ｇｕｅｎｔ０７：ｐｐｌｏｏｐ−ａｔｐａｓｅ：７、９。
ｇｕｅｎｔ１６：保存された膜タンパク質、推定輸送因子、ＹＰＡＡ バチルス・サブチリス（B.subtilis）オーソログ：１６
ｇｕｅｎｔ１９：未特性評価タンパク質、ＤｅｇＶファミリー：１９。
ｇｕｅｎｔ３０：フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質：３０、３１。
ｇｕｅｎｔ３４：黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus）ＳＴ２２８プラスミドｐＩ５Ｓ５：３４。
得られた読取り値は以下の通りであった：＞ｇｕｅｎｔ＿０７＿ｇｗ２ ｂｋ＿２６１１１２．０．１０は、配列番号８６の配列を有していた；＞ｇｕｅｎｔ０１．ｇｗ２ ｂｋ＿２６１１１２．０．２は、配列番号８７の配列を有していた；＞ｇｕｅｎｔ＿１９＿ｇｗ２ ｂｋ＿２６１１１２．０．１５は、配列番号８８の配列を有していた；＞ｇｕｅｎｔ＿３０＿ｇｗ２ ｂｋ＿２６１１１２．０．１８は、配列番号８９の配列を有していた；＞ｇｕｅｎｔ＿３４＿ｇｗ２ ｂｋ＿２６１１１２．０．２１は、配列番号９０の配列を有していた；＞ｇｕｅｎｔ＿１６＿ｇｗ２ ｂｋ＿２６１１１２．０．１４は、配列番号９１の配列を有していた。
遺伝子座決定の第２ラウンドは、図６４に示す結果を提供した。ほぼ全ての遺伝子座が決定された。この結果も非常に一貫していた。最も高い選択圧で生成された４個のクローンのうちの１個は、多コピー組み込みを示す。
クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）におけるトランスポザーゼによる無作為染色体組み込みおよび無作為多コピー染色体組み込みのための陽性選択系の適用
実施例２に記載されたものと同じ陽性選択系を含む以下のプラスミド（上記参照）を、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）と共に用いた：配列番号１７の配列を有するベクターＢＧ２８２（図１９）；配列番号１８の配列を有するベクターＢＧ２８１（図２０）；配列番号１９の配列を有するベクターＢＧ２８７（図２１）；配列番号２０の配列を有するベクターＢＧ２８８（図２２）；配列番号２１の配列を有するベクターＢＧ２８９（図２３）；配列番号２２の配列を有するベクターＢＧ２９０（図２４）；配列番号２３の配列を有するベクターＢＧ２９１（図２５）；配列番号２４の配列を有するベクターＢＧ２９２（図２６）；配列番号２５の配列を有するベクターＢＧ１７８（図２７）。例えば、プラスミドＢＧ２８１を用いて、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）の染色体中に大きなメバロン酸生合成遺伝子クラスターを組み込んだ。別の例として、プラスミドＢＧ２８２を用いて、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）の染色体中にわずかに異なるＭＶＡ経路を組み込んだ。
実施例２に記載されたものと同じ陽性選択系を含む以下のプラスミド（上記参照）を、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）と共に用いた：配列番号１７の配列を有するベクターＢＧ２８２（図１９）；配列番号１８の配列を有するベクターＢＧ２８１（図２０）；配列番号１９の配列を有するベクターＢＧ２８７（図２１）；配列番号２０の配列を有するベクターＢＧ２８８（図２２）；配列番号２１の配列を有するベクターＢＧ２８９（図２３）；配列番号２２の配列を有するベクターＢＧ２９０（図２４）；配列番号２３の配列を有するベクターＢＧ２９１（図２５）；配列番号２４の配列を有するベクターＢＧ２９２（図２６）；配列番号２５の配列を有するベクターＢＧ１７８（図２７）。例えば、プラスミドＢＧ２８１を用いて、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）の染色体中に大きなメバロン酸生合成遺伝子クラスターを組み込んだ。別の例として、プラスミドＢＧ２８２を用いて、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）の染色体中にわずかに異なるＭＶＡ経路を組み込んだ。
クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）の遺伝子形質転換
形質転換を、Leang, L., et al., Appl Environ Microbiol. (2013) 79, 4, 1102-1109にしたがって実施した。ＮＥＢ発現細胞の代わりに大腸菌（E.coli）ＢＬ２１、およびＰＥＴＣ培地の代わりにＹＴＦ培地を用いた。プロトコールは以下の通りであった：
形質転換を、Leang, L., et al., Appl Environ Microbiol. (2013) 79, 4, 1102-1109にしたがって実施した。ＮＥＢ発現細胞の代わりに大腸菌（E.coli）ＢＬ２１、およびＰＥＴＣ培地の代わりにＹＴＦ培地を用いた。プロトコールは以下の通りであった：
エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製
遠心分離以外の全ての操作を、嫌気性チャンバ中、氷上で実行した。全てのバッファーおよび遠心分離チューブを、使用前に氷冷し、無酸素状態にした。全てのプラスチックを、使用前に少なくとも２４ｈ、嫌気性チャンバに入れて、残留酸素を全て除去した。コンピテント細胞を、使用まで−８０℃で１０％ＤＭＳＯを含むＳＭＰバッファー（２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６）中で維持した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞を、凍結ストックから新鮮に接種した後、ＰＥＴＣ液体培地中に２回移した培養物から調製した。ＰＥＴＣ培地を、形質転換効率を有意に喪失することなく、ＹＴＦ培地と交換することができる。コンピテント細胞の調製の約１５〜１６ｈ前に、中期から後期対数期の培養物を、４０ｍＭ ＤＬ−トレオニンを添加した１００ｍｌの新鮮なＰＥＴＣ培地を含有する２つの血清ボトルに移した（６００ｎｍでの最終光密度［ＯＤ６００］＝０．００４）。３７℃で一晩増殖させた後、初期対数期の細胞（ＯＤ６０００．２〜０．３；２００ｍｌ）を、４℃で１０ｍｉｎの１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって集めた。細胞を２００ｍｌのＳＭＰ洗浄バッファーで２回洗浄し、１０１０〜１０１１細胞／ｍｌの最終濃度で同じバッファー中に再懸濁した。凍結防止バッファー（６０％ＤＭＳＯ−４０％ＳＭＰ、ｐＨ６）を、最終再懸濁容量の１／５でコンピテント細胞に添加して、１０％ＤＭＳＯの最終濃度を達成した。得られたコンピテント細胞（２５μｌ／チューブ）を、将来の使用のために−８０℃で保存した。これらの凍結されたコンピテント細胞の能力は、約１カ月にわたって安定なままであった。
遠心分離以外の全ての操作を、嫌気性チャンバ中、氷上で実行した。全てのバッファーおよび遠心分離チューブを、使用前に氷冷し、無酸素状態にした。全てのプラスチックを、使用前に少なくとも２４ｈ、嫌気性チャンバに入れて、残留酸素を全て除去した。コンピテント細胞を、使用まで−８０℃で１０％ＤＭＳＯを含むＳＭＰバッファー（２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６）中で維持した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞を、凍結ストックから新鮮に接種した後、ＰＥＴＣ液体培地中に２回移した培養物から調製した。ＰＥＴＣ培地を、形質転換効率を有意に喪失することなく、ＹＴＦ培地と交換することができる。コンピテント細胞の調製の約１５〜１６ｈ前に、中期から後期対数期の培養物を、４０ｍＭ ＤＬ−トレオニンを添加した１００ｍｌの新鮮なＰＥＴＣ培地を含有する２つの血清ボトルに移した（６００ｎｍでの最終光密度［ＯＤ６００］＝０．００４）。３７℃で一晩増殖させた後、初期対数期の細胞（ＯＤ６０００．２〜０．３；２００ｍｌ）を、４℃で１０ｍｉｎの１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって集めた。細胞を２００ｍｌのＳＭＰ洗浄バッファーで２回洗浄し、１０１０〜１０１１細胞／ｍｌの最終濃度で同じバッファー中に再懸濁した。凍結防止バッファー（６０％ＤＭＳＯ−４０％ＳＭＰ、ｐＨ６）を、最終再懸濁容量の１／５でコンピテント細胞に添加して、１０％ＤＭＳＯの最終濃度を達成した。得られたコンピテント細胞（２５μｌ／チューブ）を、将来の使用のために−８０℃で保存した。これらの凍結されたコンピテント細胞の能力は、約１カ月にわたって安定なままであった。
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）のための電気的形質転換手順
全ての手順を、嫌気性チャンバ中で実行した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞（２５μＬ）を、−８０℃の冷凍庫から嫌気性チャンバに氷上で迅速に移した。氷上で解凍した後（約１ｍｉｎ）、細胞を１〜５μｇのＤＮＡと混合し、予め冷却した０．１ｃｍギャップのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌｍｉｃｒｏｂｉａｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いることにより、６００Ｏｈｍの抵抗および２５μＦの電気容量で０．６２５ｋＶを細胞にパルスした。パルスの直後、細胞を０．５ｍｌの新鮮なＰＥＴＣ培地を用いて回収し、５ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７）を添加した１０ｍｌのＰＥＴＣ培地を含有する圧力チューブに移し、３７℃でインキュベートした。エレクトロポレーションされた細胞を、その細胞密度がエレクトロポレーションの直後よりも高くなるまで（約９〜１２ｈ）、３７℃で回復させた。５ミリリットル容量の派生培養物または適切に希釈された培養物を、適切な抗生物質を含有する２０ｍＬのＲＣＭ融解寒天（１．５％）と混合し、ペトリ皿に注いだ。寒天混合物を固化させた後、プレートを、下を上にしてインキュベートした。
全ての手順を、嫌気性チャンバ中で実行した。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞（２５μＬ）を、−８０℃の冷凍庫から嫌気性チャンバに氷上で迅速に移した。氷上で解凍した後（約１ｍｉｎ）、細胞を１〜５μｇのＤＮＡと混合し、予め冷却した０．１ｃｍギャップのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌｍｉｃｒｏｂｉａｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いることにより、６００Ｏｈｍの抵抗および２５μＦの電気容量で０．６２５ｋＶを細胞にパルスした。パルスの直後、細胞を０．５ｍｌの新鮮なＰＥＴＣ培地を用いて回収し、５ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７）を添加した１０ｍｌのＰＥＴＣ培地を含有する圧力チューブに移し、３７℃でインキュベートした。エレクトロポレーションされた細胞を、その細胞密度がエレクトロポレーションの直後よりも高くなるまで（約９〜１２ｈ）、３７℃で回復させた。５ミリリットル容量の派生培養物または適切に希釈された培養物を、適切な抗生物質を含有する２０ｍＬのＲＣＭ融解寒天（１．５％）と混合し、ペトリ皿に注いだ。寒天混合物を固化させた後、プレートを、下を上にしてインキュベートした。
ＢＧ１７８（９）以外の全てのプラスミドを、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）中に形質転換することができた。
クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）における染色体組み込み
形質転換体を、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＸ（５ｇ／Ｌキシロース）を用いて液体中で３回培養した。新鮮な培地（５ｇ／Ｌキシロースおよび５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するＹＴＸ）を用いる連続導入を３回実施した。その後、５μＬを、抗生物質を含まないＹＴＧプレート上にスポットした。それぞれのプレートの４個のコロニーを拾い、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＧプレート、５μｇ／ｍＬチアンフェニコールを含むＹＴＧプレートおよび抗生物質を含まないプレート上に同時に打った。
形質転換体を、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＸ（５ｇ／Ｌキシロース）を用いて液体中で３回培養した。新鮮な培地（５ｇ／Ｌキシロースおよび５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するＹＴＸ）を用いる連続導入を３回実施した。その後、５μＬを、抗生物質を含まないＹＴＧプレート上にスポットした。それぞれのプレートの４個のコロニーを拾い、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＧプレート、５μｇ／ｍＬチアンフェニコールを含むＹＴＧプレートおよび抗生物質を含まないプレート上に同時に打った。
インテグランド（クラリスロマイシン耐性であったが、チアンフェニコール耐性ではなかったもの）を、ゲノムＤＮＡの調製のために培養した。クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）組み込み株のゲノムＤＮＡの調製を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いて実施した。約１０ｍＬの液体培養を用いた。ｇＤＮＡの濃度を、ナノドロップにより決定した。結果を、図６５の表中に記載する。
インテグランドのＰＣＲ検証
推定インテグランドのｇＤＮＡ上でのＰＣＲを、以下のプライマー（組み込みカセットを増幅する）：
プライマーフォワード：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＧＧＴＣ（配列番号９２）、
プライマーリバース：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＧＧＴＣ（配列番号９３）
を用いて、アニーリング温度５５℃、伸長時間５ｍｉｎおよび３０サイクルで実施した。
推定インテグランドのｇＤＮＡ上でのＰＣＲを、以下のプライマー（組み込みカセットを増幅する）：
プライマーフォワード：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＧＧＴＣ（配列番号９２）、
プライマーリバース：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＧＧＴＣ（配列番号９３）
を用いて、アニーリング温度５５℃、伸長時間５ｍｉｎおよび３０サイクルで実施した。
次いで、ＰＣＲ産物を、０．８％分析的ＤＮＡアガロースゲル電気泳動により検査した。結果を、図２８から取ることができる。レーン１：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ；レーン２〜９：インテグランドＬＢＩ １０５〜１１１ ＰＣＲ；結果：４、５、６、７、８陽性、１、２、３陰性；レーン１０：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ；レーン１１〜１８：インテグランドＬＢＩ １１２〜１２０ ＰＣＲ；結果：１、２、５、７、８陽性、３、４、６陰性；レーン１９：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ；レーン２４〜２５：陽性対照ＰＣＲ；結果：１、２陽性；レーン２６〜２７：陰性対照ｇＤＮＡ Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ｇＤＮＡ ＰＣＲ；陰性；レーン２８〜２９：陰性対照ｇＤＮＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ｇＤＮＡ ＰＣＲ；陰性；レーン３０：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ。
分析：少なくともいくつかのインテグランドの組み込みカセットを、ＰＣＲによって増幅することができる。これは、陽性選択系の助けを借り、この場合、１０ｋｂまでのカーゴを組み込むことができることを示している。
クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）における染色体組み込み
単一の構築物、ＢＧ２８９を、組み込みのために選択した。ＢＧ２８９の形質転換体を、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＸ（５ｇ／Ｌキシロース）中で培養した。新鮮な培地（５ｇ／Ｌキシロースおよび５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するＹＴＸ）を用いる連続導入を３回実施した。その後、抗生物質を含まないＹＴＧプレート上に５μＬをスポットした。１０個のコロニーを拾い、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＧプレート、５μｇ／ｍＬチアンフェニコールを含むＹＴＧプレートおよび抗生物質を含まないプレート上に同時に打った。これにより、４個のインテグランドが得られた。インテグランド（クラリスロマイシン耐性であったが、チアンフェニコール耐性ではなかったもの）を、ゲノムＤＮＡの調製のために培養した。クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）インテグランドのゲノムＤＮＡの調製を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いて実施した。約１０ｍＬの液体培養を用いた。ｇＤＮＡの濃度を、ナノドロップにより決定した。
単一の構築物、ＢＧ２８９を、組み込みのために選択した。ＢＧ２８９の形質転換体を、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＸ（５ｇ／Ｌキシロース）中で培養した。新鮮な培地（５ｇ／Ｌキシロースおよび５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するＹＴＸ）を用いる連続導入を３回実施した。その後、抗生物質を含まないＹＴＧプレート上に５μＬをスポットした。１０個のコロニーを拾い、５μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含むＹＴＧプレート、５μｇ／ｍＬチアンフェニコールを含むＹＴＧプレートおよび抗生物質を含まないプレート上に同時に打った。これにより、４個のインテグランドが得られた。インテグランド（クラリスロマイシン耐性であったが、チアンフェニコール耐性ではなかったもの）を、ゲノムＤＮＡの調製のために培養した。クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）インテグランドのゲノムＤＮＡの調製を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからのキット（溶解が難しい細菌のための特殊なプロトコール）を用いて実施した。約１０ｍＬの液体培養を用いた。ｇＤＮＡの濃度を、ナノドロップにより決定した。
インテグランドのＰＣＲ検証
推定インテグランドのｇＤＮＡ上でのＰＣＲを、以下のプライマー（組み込みカセット中の酵素に結合する）：
プライマーフォワード：ＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＧ（配列番号９４）
プライマーリバース：ＧＣＡＧＴＡＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＡＡＴＣ（配列番号９５）
を用いて、アニーリング温度５５℃、伸長時間６０ｓｅｃおよび３０サイクルを用いて実施した。
推定インテグランドのｇＤＮＡ上でのＰＣＲを、以下のプライマー（組み込みカセット中の酵素に結合する）：
プライマーフォワード：ＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＧ（配列番号９４）
プライマーリバース：ＧＣＡＧＴＡＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＡＡＴＣ（配列番号９５）
を用いて、アニーリング温度５５℃、伸長時間６０ｓｅｃおよび３０サイクルを用いて実施した。
次いで、ＰＣＲ産物を、０．８％分析的ＤＮＡアガロースゲル電気泳動により検査した。その結果を、図２９に示す。レーン１：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ；レーン２〜５：インテグランドＡ１〜Ａ４ ＰＣＲ；結果：３陽性、１、２、４陰性；レーン６〜７：陽性対照ＰＣＲ；結果：１、２陽性；レーン８〜９：陰性対照ｇＤＮＡ Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ｇＤＮＡ ＰＣＲ；陰性；レーン１０〜１１：陰性対照ｇＤＮＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ｇＤＮＡ ＰＣＲ；陰性；レーン１２：Ｒｏｔｈから購入した３μＬラダー１ｋＢ。
分析：組み込まれた酵素を、ｇＤＮＡ試料Ａ３から増幅することができる。これは、システムがクロストリジウム（Clostridium）属内の広範な宿主域で機能することを示している。
２−メチル−１，３−ブタジエンの合成
図４８および図４９は、それぞれが２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ７２６（配列番号４４）およびＳＧ７０５（配列番号４５）をそれぞれ示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。図４９は、操作された２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７０５（配列番号４５）を示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。２−メチル−１，３−ブタジエン生成を、実施例１に記載のように実施した。２−メチル−１，３−ブタジエン形成を、上記のようにＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
図４８および図４９は、それぞれが２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ７２６（配列番号４４）およびＳＧ７０５（配列番号４５）をそれぞれ示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。図４９は、操作された２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７０５（配列番号４５）を示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。２−メチル−１，３−ブタジエン生成を、実施例１に記載のように実施した。２−メチル−１，３−ブタジエン形成を、上記のようにＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、２つのプラスミドを用いて、２−メチル−１，３−ブタジエンを生成するようにクロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）細胞を、染色体について操作した。実施例１に記載のプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
２−メチル−１，３−ブタジエンの合成
図６および図５Ａは、それぞれが２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ１５６（配列番号７）およびＳＧ１２３（配列番号５）をそれぞれ示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。図５Ｂおよび図７Ｂは、それぞれがさらに操作された２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ１２４（配列番号６）およびＳＧ１５７（配列番号８）をそれぞれ示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。２−メチル−１，３−ブタジエン生成を、１００％ＣＯ２を用いて実施例１に記載のように実施した。図８Ａおよび図８Ｂは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−ＭＳ ＱＰ５０５０Ａを用いるＧＣ−ＭＳによる生成物分析を示す。試料を、５００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジにより採取した。５００μＬの頭部空間を収集し、−１のスプリットを用いて、ＲＸＩ−５ｍｓカラム３０ｍ、０．２５ｍｍ ＩＤおよび０．２５μｍ ＤＦ（Ｒｅｓｔｅｋ）上にロードした。分離を、イソクラチックに３０℃で実行した（注入温度６０℃；ＳＩＭはｍ／ｚ＝６７で記録）。スペクトルは、２−メチル−１，３−ブタジエンとの完全な一致を示す。
図６および図５Ａは、それぞれが２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ１５６（配列番号７）およびＳＧ１２３（配列番号５）をそれぞれ示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。図５Ｂおよび図７Ｂは、それぞれがさらに操作された２−メチル−１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ１２４（配列番号６）およびＳＧ１５７（配列番号８）をそれぞれ示す（遺伝子については、参照符号も参照されたい）。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。２−メチル−１，３−ブタジエン生成を、１００％ＣＯ２を用いて実施例１に記載のように実施した。図８Ａおよび図８Ｂは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−ＭＳ ＱＰ５０５０Ａを用いるＧＣ−ＭＳによる生成物分析を示す。試料を、５００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジにより採取した。５００μＬの頭部空間を収集し、−１のスプリットを用いて、ＲＸＩ−５ｍｓカラム３０ｍ、０．２５ｍｍ ＩＤおよび０．２５μｍ ＤＦ（Ｒｅｓｔｅｋ）上にロードした。分離を、イソクラチックに３０℃で実行した（注入温度６０℃；ＳＩＭはｍ／ｚ＝６７で記録）。スペクトルは、２−メチル−１，３−ブタジエンとの完全な一致を示す。
また、４つのプラスミドを用いて、２−メチル−１，３−ブタジエンを生成するように、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）細胞を、染色体について操作した。実施例１に記載のプロトコールおよびプロセスを実施した。１００％ＣＯ２、および５０％ＣＯ２と５０％ＣＯとの混合物のいずれも基質としての使用に成功した。
１，３−ブタジエンの合成
図５０は、操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７１４（配列番号４６）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５１は、第２の操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７３９（配列番号４７）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。１，３−ブタジエン生成を、実施例１に記載のように実施した。１，３−ブタジエン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
図５０は、操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７１４（配列番号４６）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５１は、第２の操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７３９（配列番号４７）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。１，３−ブタジエン生成を、実施例１に記載のように実施した。１，３−ブタジエン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、２つのプラスミドを用いて、１，３−ブタジエンを生成するように、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）細胞を、染色体について操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
１，３−ブタジエンの合成
図３４は、操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ３８７（配列番号３０）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図３５は、第２の操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ４１１（配列番号３１）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。
図３４は、操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ３８７（配列番号３０）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図３５は、第２の操作された１，３−ブタジエン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ４１１（配列番号３１）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。
発現プラスミドの構築を、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、大腸菌（Echerichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６、アエロモナス・カビエ（Aeromonas caviae）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）Ｍ６２／１、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）ＢＫＴ０１５９２５、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）ＤＳＭ５５５、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）ＤＳＭ２０７３１、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロロフレクサス・オーランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）Ｊ−１０−ｆｌ、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒ２８６６、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５、タウエラ・リナローレンティス（Thauera linaloolentis）およびマイコバクテリウム（Mycobcaterium）ＪＤＭ６０１に由来する遺伝子を用いて、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって実施した。
エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。プラスミドＳＧ７１４について、１，３−ブタジエン生成を、１００％ＣＯ２を用いて実施例１に記載のように実施した。プラスミドＳＧ７３９については、１，３−ブタジエン生成を、３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２を用いて実施例１に記載のように実施した。両方の場合に、１，３−ブタジエン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、２つのプラスミドを用いて、１，３−ブタジエンを生成するように、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）細胞を、染色体について操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
プロペンの合成
図３６は、操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ４５５（配列番号３２）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５２は、さらに操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７５５（配列番号４８）を示す。図５３は、別の操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７７９（配列番号４９）を示す。図３７は、さらに別の操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ４７９（配列番号３３）を示す。
図３６は、操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ４５５（配列番号３２）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５２は、さらに操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７５５（配列番号４８）を示す。図５３は、別の操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ７７９（配列番号４９）を示す。図３７は、さらに別の操作されたプロペン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ４７９（配列番号３３）を示す。
発現プラスミドの構築を、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、大腸菌（Echerichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６、アエロモナス・カビエ（Aeromonas caviae）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）Ｍ６２／１、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）ＢＫＴ０１５９２５、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）ＤＳＭ５５５、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）ＤＳＭ２０７３１、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロロフレクサス・オーランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）Ｊ−１０−ｆｌ、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒ２８６６、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５、ハツカネズミ（Mus musculus）、メタロスフェラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）ＤＳＭ５３４８および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する遺伝子を用いて、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって実施した。
エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した。プロペン生成を、実施例１に記載のように実施した。プロペン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、３つのプラスミドを用いて、プロペンを生成するように、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１およびクロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）細胞を操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
１−ブテンの合成
図３８は、操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ５３９（配列番号３４）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図３９は、別の操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ５２３（配列番号３５）を示す。図５４は、別の操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ８３９（配列番号５０）を示す。図５５は、さらに別の操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ８２３（配列番号５１）を示す。
図３８は、操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ５３９（配列番号３４）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図３９は、別の操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ５２３（配列番号３５）を示す。図５４は、別の操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ８３９（配列番号５０）を示す。図５５は、さらに別の操作された１−ブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ８２３（配列番号５１）を示す。
発現プラスミドの構築を、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、大腸菌（Echerichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６、アエロモナス・カビエ（Aeromonas caviae）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）Ｍ６２／１、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）ＢＫＴ０１５９２５、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）ＤＳＭ５５５、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）ＤＳＭ２０７３１、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロロフレクサス・オーランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）Ｊ−１０−ｆｌ、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒ２８６６、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５、ハツカネズミ（Mus musculus）、メタロスフェラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）ＤＳＭ５３４８および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する遺伝子を用いて、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって実施した。
エレクトロコンピテントなＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。１−ブテン生成を、実施例１に記載のように実施した。１−ブテン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、３つのプラスミドを用いて、１−ブテンを生成するように、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８およびクロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）細胞を操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
イソブテン（２−メチルプロペン）の合成
図４１は、操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ６０１（配列番号３７）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図４０は、さらに操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ５８２（配列番号３６）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５６は、さらに別の操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ８８２（配列番号５２）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５７は、さらに別の操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ９０１（配列番号５３）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。
図４１は、操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ６０１（配列番号３７）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図４０は、さらに操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ５８２（配列番号３６）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５６は、さらに別の操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ８８２（配列番号５２）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５７は、さらに別の操作されたイソブテン経路の酵素をコードする配列を含有するプラスミドＳＧ９０１（配列番号５３）を示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。
発現プラスミドの構築を、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、大腸菌（Echerichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６、アエロモナス・カビエ（Aeromonas caviae）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）Ｍ６２／１、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）ＢＫＴ０１５９２５、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）ＤＳＭ５５５、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）ＤＳＭ２０７３１、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロロフレクサス・オーランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）Ｊ−１０−ｆｌ、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒ２８６６、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５、ハツカネズミ（Mus musculus）、メタロスフェラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）ＤＳＭ５３４８および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する遺伝子を用いて、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって実施した。
エレクトロコンピテントなＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した（実施例３も参照されたい）。イソブテン生成を、３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２を用いて実施例１に記載のように実施した。イソブテン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。図６７は、Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７７Ｅ ＧＣＭＳＤ上で測定された、ＧＣ−ＭＳによる得られた生成物の分析を示す。用いたカラムは、Ｒｅｓｔｅｋ Ｒｔ−Ａｌｕｍｉｎａ ＢＯＮＤ／ＭＡＰＤ、３０ｍｘ０．３２ｍｍ；ｄｆ５μｍであった。担体ガス：ヘリウム。ＳＩＭ ５６ｍ／ｚ。ＧＥＲＳＴＥＬ−ＭｕｌｔｉＰｕｒｐｏｓｅＳａｍｐｌｅｒ ２ＸＬ−ＸＴを用いる５００μＬ頭部空間注入。スペクトルは、イソブテン（２−メチルプロペン）との完全な一致を示す。
また、２つのプラスミドを用いて、エテンを生成するように、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１およびクロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）細胞を操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
１−ペンテンの合成
図４２および図４３は、それぞれが操作された１−ペンテン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ４９８（配列番号３８）およびＳＧ５１３（配列番号３９）をそれぞれ示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５８および図５９は、それぞれが別の操作された１−ペンテン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ７９８（配列番号５４）およびＳＧ８１３（配列番号５５）をそれぞれ示す。
図４２および図４３は、それぞれが操作された１−ペンテン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ４９８（配列番号３８）およびＳＧ５１３（配列番号３９）をそれぞれ示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。図５８および図５９は、それぞれが別の操作された１−ペンテン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ７９８（配列番号５４）およびＳＧ８１３（配列番号５５）をそれぞれ示す。
発現プラスミドの構築を、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、大腸菌（Echerichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６、アエロモナス・カビエ（Aeromonas caviae）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）Ｍ６２／１、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）ＢＫＴ０１５９２５、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）ＤＳＭ５５５、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）ＤＳＭ２０７３１、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロロフレクサス・オーランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）Ｊ−１０−ｆｌ、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒ２８６６、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５、ハツカネズミ（Mus musculus）、メタロスフェラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）ＤＳＭ５３４８および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する遺伝子を用いて、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって実施した。
エレクトロコンピテントなクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した。１−ペンテン生成を、１００％ＣＯ２を用いて実施例１に記載のように実施した。１−ペンテン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、２つのプラスミドを用いて、１−ペンテンを生成するように、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８およびクロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）細胞を操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
エテンの合成
図４４、図４５、図６０および図６１は、それぞれが操作されたエテン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ５５７（配列番号４０）、ＳＧ５９８（配列番号４１）、ＳＧ８５７（配列番号５６）、およびＳＧ８９８（配列番号５７）をそれぞれ示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。
図４４、図４５、図６０および図６１は、それぞれが操作されたエテン経路の酵素をコードする配列を含有する、プラスミドＳＧ５５７（配列番号４０）、ＳＧ５９８（配列番号４１）、ＳＧ８５７（配列番号５６）、およびＳＧ８９８（配列番号５７）をそれぞれ示す（遺伝子については参照符号も参照されたい）。
発現プラスミドの構築を、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、大腸菌（Echerichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６、アエロモナス・カビエ（Aeromonas caviae）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）Ｍ６２／１、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）ＢＫＴ０１５９２５、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）ＤＳＭ５５５、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）ＤＳＭ２０７３１、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロロフレクサス・オーランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）Ｊ−１０−ｆｌ、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒ２８６６、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５、ハツカネズミ（Mus musculus）、メタロスフェラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）ＤＳＭ５３４８および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する遺伝子を用いて、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって実施した。
エレクトロコンピテントなクロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８細胞の調製および電気的形質転換を、実施例１に記載のように実行した。エテン生成を、３０％ＣＯ２および６０％Ｈ２を用いて実施例１に記載のように実施した。エテン生成を、上記のようなＧＣ−ＭＳによって検出することができた。
また、２つのプラスミドを用いて、エテンを生成するように、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１およびクロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）細胞を操作した。実施例１に記載のものと同じプロトコールおよびプロセスを実施した。さらに、ＣＯ、およびＣＯ２とＣＯとの混合物、ならびにＣＯと電子および／またはＣＯ２と電子の基質としての使用に成功した。
本明細書に記載される全ての刊行物は、あたかも、特許出願を含む、それぞれ個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれたかのように、その刊行物がそれらとの関連で引用される方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日以前のその開示についてのみ提供される。本発明は、先行する発明という理由でそのような刊行物に先行する資格を与えられるものではないという承諾と解釈されるべき記載は、本明細書には一切ない。さらに、本明細書に提供される刊行物の日付は、独立した確認を要し得る、実際の刊行日とは異なることがある。
別途明確に記述しない限り、本明細書に記載の任意の方法または態様は、そのステップが特定の順序で実施されることを必要とすると解釈されることを意図しない。したがって、特許請求される方法について、ステップが特定の順序に限定されることが特許請求の範囲または説明に具体的に記述されない場合、いかなる点でも、順序が暗示されることを意図しない。これは、ステップもしくは操作の流れの配置、文法構成もしくは句読点から得られる明白な意味、または本明細書に記載される態様の数もしくは種類に関する論理を含む、解釈のための任意の可能な非表現的基礎にも当てはまる。
２０ トランスポザーゼ（例えば、ｈｉｍａｒ１）
２２ トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
２４ 抗生物質耐性マーカー（ｍＩｓＲ）
２６ 目的の遺伝子（カーゴ）
２８ トランスポザーゼ認識部位（３’ＩＴＲ逆方向末端反復）
３０ 複製起点
３１ アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝ＡｔｏＢ
３２ ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｈｂｄ
３４ ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）＝ｃｒｔ
３６ アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ＹｃｉＡ、ＹｄｉＩ
３８ フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）＝ＰＡＤ１、ＰＡＤＣ
４０ ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ５．４．４．４およびＥＣ４．２．１．１２７）＝ＧＩＭ、ＧＩＴ
４２ アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）＝ＡｃｃＡＢＣＤ
４４ アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）＝ｎｐｈＴ７
４６ アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｐｈａＢ１
４８ （Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）＝ｐｈａＪ
５０ ４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）＝ｇａｂＴ
５２ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）＝ｇｄｈ
５４ ２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）＝ｙｇａＦ
５６ グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）＝ｇｃｔＡ
５８ ２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）＝ｈｄｇＡＢ
６０ グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）＝ｇｃｄＡＢＣＤ
６２ ４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）とも呼ばれる＝４ｈｂＤ
６４ ４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ａｂｆＴ
６６ ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）＝ａｂｆＤ
６８ ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）＝ａｂｆＤ
７０ アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝Ｂｋｔｂ
７２ ２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、２−ケトグルタル酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）とも呼ばれる＝ＫｏｒＡＢ
７４ ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、ピルビン酸／ケトイソ吉草酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）＝ＰＦＯＲ
７６ メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）＝ｓｃｐＡ
７８ メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）＝ｓｃｐＢ
８０ ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）＝ｍｖａＳ
８２ ３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）＝ｌｉｕＣ
８４ ３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）＝ｌｉｕＢＤ
８６ ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｔｅｒ
８８ アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝Ｂｋｔｂ
９０ ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｐＡＡＨ１
９２ アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ｍＢＡＣＨ
９４ リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＝ｐｔｂ
９６ 酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）＝ｂｕｋ
１００ 乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ｐｃｔ
１０２ ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）＝ｌｃｄＡＢ
１０４ マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）＝ｍｃｒ
１０６ マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）＝ｍｃｒ
１０８ プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）＝ｐｃｒ
１１０ プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）＝ｐｃｒ、ｍｓｅｄ１２
１１２ プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）＝ｐｃｒ
１３２ リプレッサー（例えば、ｌａｃＩ）
１３４ オペレーター部位（例えば、ｌａｃオペレーター）
１３６ トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
１３８ 抗生物質耐性遺伝子（ｍＩｓＲ）
１４０ 抗生物質耐性タンパク質（ｍＩｓＲ）
１４２ 陽性選択特徴を有するプラスミド
１４４ ＤＮＡカセットが無作為に組み込まれた染色体
２２ トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
２４ 抗生物質耐性マーカー（ｍＩｓＲ）
２６ 目的の遺伝子（カーゴ）
２８ トランスポザーゼ認識部位（３’ＩＴＲ逆方向末端反復）
３０ 複製起点
３１ アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝ＡｔｏＢ
３２ ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｈｂｄ
３４ ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）＝ｃｒｔ
３６ アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ＹｃｉＡ、ＹｄｉＩ
３８ フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）＝ＰＡＤ１、ＰＡＤＣ
４０ ゲラニオールイソメラーゼ／リナロールデヒドラターゼ（ＥＣ５．４．４．４およびＥＣ４．２．１．１２７）＝ＧＩＭ、ＧＩＴ
４２ アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）＝ＡｃｃＡＢＣＤ
４４ アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）＝ｎｐｈＴ７
４６ アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｐｈａＢ１
４８ （Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）＝ｐｈａＪ
５０ ４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）＝ｇａｂＴ
５２ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）＝ｇｄｈ
５４ ２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）＝ｙｇａＦ
５６ グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）＝ｇｃｔＡ
５８ ２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）＝ｈｄｇＡＢ
６０ グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）＝ｇｃｄＡＢＣＤ
６２ ４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）とも呼ばれる＝４ｈｂＤ
６４ ４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ａｂｆＴ
６６ ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）＝ａｂｆＤ
６８ ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）＝ａｂｆＤ
７０ アセトアセチル−コエンザイムＡシンターゼチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）＝Ｂｋｔｂ
７２ ２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、２−ケトグルタル酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）とも呼ばれる＝ＫｏｒＡＢ
７４ ピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ、ピルビン酸／ケトイソ吉草酸オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）＝ＰＦＯＲ
７６ メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）＝ｓｃｐＡ
７８ メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）＝ｓｃｐＢ
８０ ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）＝ｍｖａＳ
８２ ３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）＝ｌｉｕＣ
８４ ３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）＝ｌｉｕＢＤ
８６ ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）＝ｔｅｒ
８８ アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝Ｂｋｔｂ
９０ ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）＝ｐＡＡＨ１
９２ アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）＝ｍＢＡＣＨ
９４ リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＝ｐｔｂ
９６ 酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）＝ｂｕｋ
１００ 乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）＝ｐｃｔ
１０２ ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）＝ｌｃｄＡＢ
１０４ マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）＝ｍｃｒ
１０６ マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）＝ｍｃｒ
１０８ プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）＝ｐｃｒ
１１０ プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）＝ｐｃｒ、ｍｓｅｄ１２
１１２ プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）＝ｐｃｒ
１３２ リプレッサー（例えば、ｌａｃＩ）
１３４ オペレーター部位（例えば、ｌａｃオペレーター）
１３６ トランスポザーゼ認識部位（５’ＩＴＲ逆方向末端反復）
１３８ 抗生物質耐性遺伝子（ｍＩｓＲ）
１４０ 抗生物質耐性タンパク質（ｍＩｓＲ）
１４２ 陽性選択特徴を有するプラスミド
１４４ ＤＮＡカセットが無作為に組み込まれた染色体
Claims (10)
- アセチル−ＣｏＡの、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンへの変換を可能にする１つまたは複数の酵素をコードする異種核酸配列を含む組換え微生物であって、前記異種核酸配列が、
（ａ）アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列；または
（ｂ）アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列；または
（ｃ）アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列；または
（ｄ）アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒し、アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換をさらに触媒する１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のコード配列
を含み、それぞれのコード配列が転写プロモーターに作動可能に連結されている、組換え微生物。 - 一酸化炭素と二酸化炭素の一方または両方を、アセチル−ＣｏＡに変換する内因性酵素をさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物。
- （ｉ）アセチル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、
− アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）；アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）；または
− アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；または
− ４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）；およびグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７０）；または
− ４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）；および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ５．３．３．３）
を含み；
（ｉｉ）アセチル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、（ａ）（Ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、および（ＩＩ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）とアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）との組合せの一方または両方；（ｂ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）；（ｃ）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）ならびに（ｄ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）
を含み；
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、
− アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）；または
− アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１）；または
− ２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）および／もしくはピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．１）；または
− 乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ１．３．１．８４）
を含み；
（ｉｖ）アセチル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、
− アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）；マロニルＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９８）；プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３６）；およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）；または
− 乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）；およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）
を含む、請求項１または２に記載の組換え微生物。 - （ｉ）クロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、
− （ａ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）および（ｂ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）；あるいは
− （ｃ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）；（ｄ）酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、および（ｅ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）；あるいは
− （ｆ）ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）；（ｇ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；（ｈ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）；（ｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；（ｊ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；および（ｋ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）；あるいは
− （ｌ）（ｉ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）または（ｉｉ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）との組合せ、または（ｉｉｉ）アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；または（ｉｖ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）の組合せ、または（ｖ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）の組合せ；（ｍ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｎ）ゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）もしくはリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）、または（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）もしくはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つもしくは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）もしくはメチルブテノールシンターゼのうちの１つもしくは複数との組合せ
を含み；
（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、
− （ａ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）；および（ｂ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；あるいは
− （ｃ）（ｉ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）または（ｉｉ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）との組合せ、または（ｉｉｉ）アルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）とアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）との組合せ；または（ｉｖ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）の組合せ、または（ｖ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）およびアルデヒドフェレドキシンオキシドリダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）の組合せ；（ｍ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに（ｎ）ゲラニオールイソメラーゼ（ＥＣ５．４．４．４）もしくはリナロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２７）、または（ｉ）ファルネソールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）もしくはウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つもしくは複数と、（ｉｉ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２７）もしくはメチルブテノールシンターゼのうちの１つもしくは複数との組合せ
を含み；
（ｉｉｉ）プロピオニル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、（ａ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）；（ｂ）（Ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ＩＩ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；（ｃ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；ならびに（ｄ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）
を含み；
（ｉｖ）アクリロイル−ＣｏＡのアルケンへの変換を触媒する前記１つまたは複数の酵素が、（ａ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、および／またはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）と酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）との組合せ；ならびに（ｂ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え微生物。 - 前記異種遺伝子配列が異種核酸分子または微生物の染色体中に含まれる、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 一酸化炭素と二酸化炭素の一方または両方をアセチル−ＣｏＡに変換する前記内因性酵素がＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素である、請求項２から５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・ホルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）、クロストリジウム・マグナム（Clostridium magnum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクルム・バッキ（Alkalibaculum bacchii）、アセトアリエロビウム・リオテラ（Aecetoariaerobium riotera）、ブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、デスルフィトバクテリウム・ハフィエリス（Desulfitbacterium hafhierise）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ペプトストレプトコッカス・プロダクタス（Peptostreptococcus productus）、ロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）、スポロミュサ・オバタ（Sporomusa ovata）、スポロミュサ・シルバセチカ（Sporomusa silvacetica）、スポロミュサ・スフェロイデス（Sporomusa sphaeroides）、サーモアナエロバクター・キウビ（Thermoanaerobacter kiuvi）、オキソバクター・プフェニギ（Oxobacter pfennigii）、アセトバクテリウム・フィメタリウム（Acetobacterium fimetarium）、アセトハロビウム・アラバチカム（Acetohalobium arabaticum）、ブラウティア・ウェクスレラエ（Blautia wexlerae）、カルボフィルス・カルボキシダス（Carbophilus carboxidus）、クロアシバチルス・エブリエンシス（Cloacibacillus evryensis）、ヒドロゲノファガ・シュードフラバ（Hydrogenophaga pseudoflava）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、シュードモナス・ガゾトロファ（Pseudomonas gazotropha）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、カルデリハビタンス・マリチムス（Calderihabitans maritimus）、カロリバクテリウム・システルナエ（Caloribacterium cisternae）、カルボキシドブラキウム・パシフィカム（Carboxydobrachium pacificum）、カルボキシドセラ・フェリレデューセンス（Carboxydocella ferrireducens）、カルボキシドセラ・スポロプロデューセンス（Carboxydocella sporoproducens）、カルボキシドセラ・サーマウトトロフィカ（Carboxydocella thermautotrophica）、カルボキシドサームス・フェリレデューセンス（Carboxydothermus ferrireducens）、カルボキシドサームス・ヒドロゲノフォーマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）、カルボキシドサームス・アイランディクス（Carboxydothermus islandicus）、カルボキシドサームス・パーチナックス（Carboxydothermus pertinax）、カルボキシドサームス・シデロフィルス（Carboxydothermus siderophilus）、クロストリジウム・フェルビダス（Clostridium fervidus）、クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）、デスルホトマクルム・カルボキシジボランス（Desulfotomaculum carboxydivorans）、デスルホトマクルム・クズネトソビ（Desulfotomaculum kuznetsovii）、デスルホトマクルム・サーモベンゾイクム亜種サーモシントロフィクム（Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum）、デスルホトマクルム・サーモシステルナム（Desulfotomaculum thermocisternum）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Desulfurispora thermophila）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Dictyoglomus thermophilum）、ヒドロゲノフィルス・アイランディクス（Hydrogenophilus islandicus）、ムーレラ・ムルデリ（Moorella mulderi）、ムーレラ・スタムシ（Moorella stamsii）、サーミンコラ・カルボキシジフィラ（Thermincola carboxydiphila）、サーミンコラ・フェリアセチカ（Thermincola ferriacetica）、サーミンコラ・ポテンス（Thermincola potens）、サーモアセトゲニウム・ファエウム（Thermoacetogenium phaeum）、サーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリクス亜種カルボキシドボランス（Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus subsp. carboxydovorans）、サーモシヌス・カルボキシジボランス（Thermosinus carboxydivorans）、スポロミュサ・テルミチダ（Sporomusa termitida）、クロストリジウム・ホルミカセチカム（Clostridium formicaceticum）、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）、デスルホトマクルム・ギブソニアエ（Desulfotomaculum gibsoniae）、デスルフォスポロシヌス・メリジエイ（Desulfosporosinus meridiei）、ブラウティア・ヒドロゲノトロフィカ（Blautia hydrogenotrophica）、デハロコッコイデス・マッカルチ（Dehalococcoides mccartyi）、デスルファチバシルム・アリファチシボランス（Desulfatibacillum aliphaticivorans）、デスルフォバクテリウム・オートトロフィカム（Desulfobacterium autotrophicum）、デスルフォバクラ・トルオリカ（Desulfobacula toluolica）、デスルフォスピラ・ジョエルゲンセニ（Desulfospira joergensenii）、デスルフォスポロシヌス・オリエンチス（Desulfosporosinus orientis）、デスルフォスポロシヌス・ヤンギアエ（Desulfosporosinus youngiae）、デスルホトマクルム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）、デスルホトマクルム・アルコーリボラックス（Desulfotomaculum alcoholivorax）、デスルホトマクルム・カルボキシジボランス（Desulfotomaculum carboxydivorans）、デスルホトマクルム・サポマンデンス（Desulfotomaculum sapomandens）、デスルホトマクルム・サーモシステルナム（Desulfotomaculum thermocisternum）、デスルフォベルミクルス・ハロフィルス（Desulfovermiculus halophilus）、デスルフォビブリオ・アラスケンシス（Desulfovibrio alaskensis）、デスルホビブリオ・フリギダス（Desulfovibrio frigidus）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Desulfurispora thermophila）、ホロファガ・フォエチダ（Holophaga foetida）、メタノブレビバクター・アルボリフィルス（Methanobrevibacter arboriphilus）、オレニア・サリナリア（Orenia salinaria）、ペニバシルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、チンダリア・カリフォニエンシス（Tindallia californiensis）、アノキシバチルス・フラビサームス（Anoxybacillus flavithermus）、デスルフォビルグラ・サーモクニクリ（Desulfovirgula thermocuniculi）、サーモセジミニバクター・オセアニ（Thermosediminibacter oceani）、アセトバクテリウム・バキイ（Acetobacterium bakii）、アセトバクテリウム・カルビノリカム（Acetobacterium carbinolicum）、アセトバクテリウム・デハロゲナンス（Acetobacterium dehalogenans）、アセトバクテリウム・マリカム（Acetobacterium malicum）、アセトバクテリウム・パルドサム（Acetobacterium paludosum）、アセトバクテリウム・ツンドラエ（Acetobacterium tundrae）、アセトバクテリウム・ウィエリンガエ（Acetobacterium wieringae）、カンジダタス・スカリンデュア・ブロダエ（Candidatus Scalindua brodae）、アセトアナエロビウム・ノテラエ（Acetoanaerobium noterae）、ブラウティア・ハンセニ（Blautia hansenii）、アンモニフェックス・デゲンシ（Ammonifex degensii）、アセチトマクルム・ルミニス（Acetitomaculum ruminis）、アセトアナエロビウム・ロマシュコビル（Acetoanaerobium romashkovil）、アセトバクテリウム・プサモリチカム（Acetobacterium psammolithicum）、アセトネマ・ロンガム（Acetonema longum）、ブリアネラ・フォルマテキシゲンス（Bryanella formatexigens）、カロラマトル・フェルビダス（Caloramator fervidus）、クロストリジウム・コッコイデス（Clostridium coccoides）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ムーレラ・グリセリニ（Moorella glycerini）、ナトロニエラ・アセチゲナ（Natroniella acetigena）、ナトロニンコラ・ヒスチノボランス（Natronincola histinovorans）、ルミノコッカス・ヒドロゲノトロフィクス（Ruminococcus hydrogenotrophicus）、ルミノコッカス・プロダクタス（Ruminococcus productus）、ルミノコッカス・シンキイ（Ruminococcus schinkii）、スポロミュサ・アシドボランス（Sporomusa acidovorans）、スポロミュサ・アエリボランス（Sporomusa aerivorans）、スポロミュサ・マロニカ（Sporomusa malonica）、スポロミュサ・パウシボランス（Sporomusa paucivorans）、シントロフォコッカス・スクロムタンス（Syntrophococcus sucromutans）、トレポネマ・プリミチア（Treponema primitia）、シュードモナス・カルボキシドヒロゲナ（Pseudomonas carboxydohyrogena）、シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Pseudomonas thermocarboxydovorans）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、ストレプトミセス・サーモオートトロフィクス（Streptomyces thermoautotrophicus）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）、マイコバクテリウム・ゴルドナ（Mycobacterium gordonae）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、バチルス・シュレゲリ（Bacillus schlegelii）、カルダナエロバクター・スブテラネウス（Caldanaerobacter subterraneus）、サーモリトバクター・カルボキシジボランス（Thermolithobacter carboxydivorans）、サーモコッカス・オヌリネウス（Thermococcus onnurineus）、サーモフィルム・カルボキシジトロフス（Thermofilum carboxyditrophus）、アルケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、デスルフォモニル・チエジェイ（Desulfomonile tiedjei）、デスルフォビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）、サーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）またはルブリビバックス・ゲラチノーサ（Rubrivivax gelatinosa）のうちの１つの種である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記異種核酸配列が、
（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；（ｉｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；（ｉｖ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；（ｖ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；および（ｖｉ）ゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）またはリナロールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２７）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｂ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；（ｖ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；（ｖｉ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；および（ｖｉｉ）ゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）またはリナロールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２７）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｃ）４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）；２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）；グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）；２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）；グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）またはリナロールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２７）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｄ）４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）；ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；およびゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）またはリナロールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２７）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｅ）（ｉ）（Ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）および／もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）、および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．４）、または（ＩＩ）（ｉ）（Ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）および／もしくは（ＩＩ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）；ならびに
（ｉｉ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．−）またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．−）；ならびに
（ｉｉｉ）ゲラニオールイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．４．４．４）および／もしくはリナロールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２７）、および／または（Ｉ）ファルネソールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．−）、ゲラニルゲラニオールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．Ｂ１９）、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．５０）もしくはウンデカプレノールキナーゼ酵素（ＥＣ２．７．１．６６）のうちの１つもしくは複数と、（ＩＩ）２−メチル−１，３−ブタジエンシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．３．２７）もしくはメチルブテノールシンターゼ酵素、
のうちの１つもしくは複数との組合せをコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｆ）（ｉ）（Ｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ、および／もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）の組合せ、または（ＩＩ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）および／もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）およびアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．３．１０）；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１８）；および３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の組合せ；ならびに
（ｉｉ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；および（ｉｉｉ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）
をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｇ）（ｉ）乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、（ｉｉ）ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）、（ｉｉｉ）（Ｉ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）または（ＩＩ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）の組合せのうちの一方または両方；ならびに（ｉｖ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｈ）（ｉ）（Ｉ）４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）、および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）の組合せ、または（ＩＩ）４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）、グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）、およびグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）；ならびに
（ｉｉ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびに
（ｉｉｉ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）
をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｉ）（ｉ）（Ｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）および／または（ＩＩ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９４）、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）の組合せ；（ｉｉ）ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉｖ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；（ｖ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；（ｖｉ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびに（ｖｉｉ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｊ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）；（ｉｉ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ酵素（ＥＣ５．４．９９．２）；（ｉｉｉ）メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．４１）；（ｉｖ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｖ）（Ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ＩＩ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；（ｖｉ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；（ｖｉｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｉｉｘ）（Ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ＩＩ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；（ｉｘ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびに（ｘ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｋ）（ｉ）（Ｉ）２−オキソグルタル酸／酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．３）、およびピルビン酸／２−オキソ酪酸フェレドキシンオキシドリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．７．１）の組合せ；（ＩＩ）乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）、およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）の組合せ；または（ＩＩＩ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．２．１．７５）、マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）、プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）、プロピオニル−ＣｏＡシンターゼ／アクリロイル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）、およびプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ１．３．１．８４）の組合せ；ならびに（ｉｉ）ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）；ならびに（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；ならびに（ｉｖ）（Ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２酵素（ＥＣ４．２．１．１１９）および／または（ＩＩ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の組合せ；（ｉｖ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、および／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）の組合せ；ならびに（ｖ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）
をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｌ）（ｉ）４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．６．１．１９）；（ｉｉ）（Ｉ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．４．１．２）、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．９９．２）、グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．１２）、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．−）および／または（ＩＩ）４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６１）；４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、ビニルアセチル−ＣｏＡ−デルタ−イソメラーゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１２０）およびグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．７０）の組合せ；（ｉｉｉ）４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ５．３．３．３）；（ｉｖ）ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡリダクターゼ酵素（ＥＣ１．１．１．３６）；（ｖ）アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．９）；（ｖｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．１５７）；（ｖｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５５）；（ｉｉｘ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；ならびに（ｘ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）をコードするコード配列の組合せ；あるいは
（ｍ）（ｉ）（Ｉ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、マロニルＣｏＡリダクターゼ酵素（マロン酸セミアルデヒド形成）（ＥＣ１．２．１．７５）、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．２９８）、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンターゼ酵素（ＥＣ６．２．１．３６）、およびヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）の組合せ、または（ＩＩ）（α）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ６．４．１．２）、乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）、およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）および／もしくは（β）乳酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．８．３．−）およびラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．５４）の組合せ；
（ｉｉ）（Ｉ）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）の組合せ、および／または（ＩＩ）アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＥＣ３．１．２．−）；ならびに
（ｉｉｉ）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ４．１．１．−）
をコードするコード配列の組合せ
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え微生物。 - 請求項１から８のいずれか一項に記載の組換え微生物と、一酸化炭素または二酸化炭素の一方または両方とを接触させることを含む、２〜５個の炭素原子の主鎖を有する１つまたは複数のアルケンを生成する方法。
- エチレン、１−プロペン、１−ブテン、２−メチルプロペン、１，３−ブタジエン、１−ペンテン、または２−メチル−１，３−ブタジエンのうちの１つまたは複数を生成する方法である、請求項９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462045083P | 2014-09-03 | 2014-09-03 | |
| US62/045,083 | 2014-09-03 | ||
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