JP2017519494A - Ｏｘ４０ｌ融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

Ｏｘ４０ｌ融合タンパク質およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、およびＯＸ４０リガンドの受容体結合ドメインを含む、ＯＸ４０Ｌ ｈｕＩｇＧ４融合ポリペプチドサブユニットを提供し、ここで、融合ポリペプチドサブユニットは、六量体タンパク質に自己組織化することができる。また、融合ポリペプチドサブユニットおよび六量体タンパク質を調製する方法、ならびに使用方法、例えば、癌の治療方法も提供される。【選択図】図１

Description

本開示は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、およびＯＸ４０リガンドの受容体結合ドメインを含む、ＯＸ４０Ｌ ｈｕＩｇＧ４融合ポリペプチドサブユニットを提供し、ここで、融合ポリペプチドサブユニットは、六量体タンパク質に自己組織化することができる。また、融合ポリペプチドサブユニットおよび六量体タンパク質を調製する方法、ならびに使用方法、例えば、癌の治療方法も提供される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにて電子書式で提出された配列表を含み、これは、参照により全体として本明細書に組み込むものとする。２０１５年５月２１日作成の上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＯＸ４０Ｆ−１０１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは３１，４９６バイトである。
ＯＸ４０（ＣＤ１３４；ＴＮＦＲＳＦ４）は、主として活性化ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に見出される腫瘍壊死因子受容体である（Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１）。ＯＸ４０は、１つの既知の内在性リガンド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１５２；ＴＮＦＳＦ４）を有するが、これは、三量体形態で存在し、ＯＸ４０をクラスター化して、Ｔ細胞内に強力な細胞シグナル伝達イベントを起こすことができる（Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１）。活性化ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞上のＯＸ４０を介したシグナル伝達は、サイトカイン産生の増強、グランザイムおよびパーフォリン放出ならびにエフェクターおよびメモリーＴ細胞プールの拡大を引き起こす（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４−３２）。さらに、Ｔｒｅｇ細胞でのＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔｒｅｇの拡大を阻害し、Ｔｒｅｇの誘導を停止し、Ｔｒｅｇ抑制機能をブロックする（Ｖｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：３６４１−５０；Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０：２５０１−１０）。
免疫組織化学研究および初期フローサイトメトリー分析によって、ＯＸ４０が、非常に多様なヒト癌に浸潤するＴ細胞に発現されることが判明した（Ｂａｒｕａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１７：６６８−６７５；Ｃｕｒｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８；Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１−３０；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２−８ Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ，２０００，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７９：４００−６；Ｓａｒｆｆ ｅｔ ａｌ，２００８，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１９５：６２１−５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ６２５；Ｖｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７４：２５８−６５）。腫瘍浸潤リンパ球上でのＯＸ４０発現は、いくつかのヒト癌での、より長い生存と相関し、これは、ＯＸ４０シグナルが、抗腫瘍免疫応答を確立する上で重要な役割を果たし得ることを示唆している（Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１−３０；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２−８）。
様々な非臨床マウス腫瘍モデルでは、ＯＸ４０のアゴニスト（抗体およびＯＸ４０リガンド融合タンパク質を含む）の使用に成功し、有望な結果が得られている（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５５１４−２１；Ｎｄｈｌｏｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２９９１−９；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０−９）。ＯＸ４０を介したＴ細胞の共刺激によって、抗腫瘍活性が促進され、いくつかの事例では、抗腫瘍活性は永持続性であり、後の腫瘍攻撃からの長続きする防御をもたらした（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０−９）。Ｔｒｅｇ細胞阻害およびエフェクターＴ細胞の共刺激は、ＯＸ４０アゴニストの腫瘍成長阻害のために必要であることが判明した（Ｐｉｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：８２５−３９）。ワクチン、化学療法、放射線療法、および免疫療法との組み合わせによって、ＯＸ４０アゴニスト療法の抗腫瘍効果を増強するために、多くの戦略および技術が探究されてきた（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４−３２；Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：９９７−１００８）。
本開示は、ポリペプチドサブユニットに関し、各々は、融合ポリペプチドとして、ＯＸリガンド（ＯＸ４０Ｌ）の受容体結合ドメイン、三量体化ドメインおよびヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、これらは、安定した多量体、例えば、六量体タンパク質を形成することができる。癌免疫療法に有用な組成物および方法が提供される。
本開示は、以下：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン；機能性三量体化ドメイン；およびＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドサブユニットを提供する。いくつかの態様では、提供されるポリペプチドサブユニットは、三量体または六量体タンパク質に自己組織化することができる。いくつかの態様では、ポリペプチドサブユニットは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、次に三量体化ドメイン、続いてＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインを含む。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインのカルボキシ末端は、三量体化ドメインのアミノ末端に直接融合させることができ、三量体化ドメインのカルボキシ末端は、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインのアミノ末端に直接融合させることができる。
本開示によって提供されるポリペプチドサブユニットの別の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ヒンジ領域を含み、これは、完全な重鎖間ジスルフィド結合形成を賦与する突然変異、例えば、ＥＵ番号付与に従い、２２８位でのセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ）を含有することができる。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、配列番号４のアミノ酸１〜１２を含む。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域をさらに含み得る。いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号４のアミノ酸１〜２２９を含む。
本開示により提供される三量体化ドメインは、αヘリックスコイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、またはこれらの組み合わせを含み得る。例えば、三量体化ドメインは、ＴＲＡＦ２；トロンボスポンジン１；マトリリン−４；ＣＭＰ（マトリリン−１）；ＨＳＦ１；またはクビリンから得ることができる。いくつかの態様では、三量体化ドメインは、ヒトＴＲＡＦ２三量体化ドメインを含む。いくつかの態様では、ＴＲＡＦ２三量体化ドメインは、ヒトＴＲＡＦ２（配列番号２）のアミノ酸３１０〜３４９を含む。
本開示により提供されるポリペプチドサブユニットの別の態様では、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインは、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号１）のアミノ酸５１〜１８３を含み得る。いくつかの態様では、本開示により提供されるポリペプチドサブユニットは、六量体融合タンパク質に自己組織化することができ、これは、ヒトＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、ポリペプチドサブユニットは、アミノ酸配列：配列番号４を含む。
本明細書に記載するポリペプチドサブユニットは、結合した異種薬剤をさらに含んでもよい。本明細書に記載する異種薬剤は、ペプチド結合を介してポリペプチドサブユニットに融合した異種ポリペプチドであってよい。異種ポリペプチドは、例えば、ＩｇＧ４−ＦｃドメインのＮ末端、ＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインのＣ末端、ＩｇＧ４−ＦｃドメインのＣ末端および三量体化ドメインのＮ末端、または三量体化ドメインのＣ末端およびＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインのＮ末端に、融合させることができる。いくつかの態様では、異種薬剤は、ポリペプチドサブユニットに化学的にコンジュゲートすることができ、これは、例えば、細胞傷害性分子、安定剤、免疫応答改質剤、または検出可能な薬剤であってよい。
いくつかの態様では、本開示は、対照として用いることができるポリペプチドサブユニットを提供する。例えば、本開示は、１８０位でのフェニルアラニンからアラニンへの単一置換（Ｆ１８０Ａ）以外は、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインが、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号１）のアミノ酸５１〜１８３を含むポリペプチドサブユニットを提供する。このポリペプチドサブユニットから自己組織化する六量体融合タンパク質は、ヒトＯＸ４０に結合することができない。いくつかの態様では、この対照ポリペプチドサブユニットは、アミノ酸配列：配列番号６を含む。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載する３つのポリペプチドサブユニットを含む三量体タンパク質を提供する。
本開示は、前述した６つのポリペプチドサブユニットを含む六量体タンパク質を提供する。いくつかの態様では、６つのポリペプチドサブユニットは、各々、アミノ酸配列：配列番号４を含む。例示的な六量体融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質である。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、ヒト、カニクイザル、および／もしくはアカゲザル由来の活性化ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞に発現されるＯＸ４０に特異的に結合することができる。例えば、六量体タンパク質は、ヒト、カニクイザル、および／またはアカゲザル由来の一次活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０の結合親和性は、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約８．０ｐＭ、例えば、約３．６ｐＭである。いくつかの態様では、六量体タンパク質は、約０．５ｐＭ〜約３．０ｐＭ、例えば、約１．８ｐＭで、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に２０％受容体占有率（ＥＣ20）を、約３．０ｐＭ〜約１０ｐＭ、例えば、約６．６ｐＭで、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に５０％受容体占有率（ＥＣ50）を、ならびに約３５ｐＭ〜約７０ｐＭ、例えば、約５３ｐＭで、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に９０％受容体占有率（ＥＣ90）を達成することができる。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現されたヒトＯＸ４０に対する結合親和性：フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約２４ｐＭ、例えば、約１２ｐＭの結合親和性を有する。いくつかの態様では、六量体タンパク質は、約１．０〜約１５ｐＭ、例えば、約７．２ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上にＥＣ20を、約１．０〜約４０ｐＭ、例えば、約１６ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上にＥＣ50を、ならびに約１０〜約１００ｐＭ、例えば、約５７ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上にＥＣ90を達成することができる（全て、フローサイトメトリーにより測定）。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるカニクイザルＯＸ４０に対する結合親和性を有し、これは、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約５０ｐＭ、例えば、約２４ｐＭである。いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるアカゲザルＯＸ４０に対する結合親和性を有し、これは、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約５０ｐＭ、例えば、約２１ｐＭである。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、プレートアッセイにおいて、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の用量依存性増殖および活性化ＣＤ４+Ｔ細胞からの用量依存性サイトカイン放出を誘導することができる。いくつかの態様では、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞において、約１．０ｐＭ〜約１５ｐＭ、例えば、約８．０ｐＭの六量体タンパク質濃度で、２０％最大増殖応答（ＥＣ20）を達成することができ、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞において、約５．０ｐＭ〜約２５ｐＭ、例えば、約１４ｐＭの六量体タンパク質濃度で、５０％最大増殖応答（ＥＣ50）を達成することができ、ならびに、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞において、約５０ｐＭ〜約６５ｐＭ、例えば、約５７ｐＭの六量体タンパク質濃度で、９０％最大増殖応答（ＥＣ90）を達成することができる（全て、フローサイトメトリーにより測定）。いくつかの態様では、六量体タンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、および／またはＩＬ−１βの用量依存的放出を誘導することができる。いくつかの態様では、放出されるサイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、および／またはＩＬ−１０を含む。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞および一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞において、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖およびサイトカイン放出を達成することができる。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、ＦｃγＲ発現細胞の存在下で、ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＮＦκＢ経路を活性化することができる。例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞であってよい。これらの細胞により発現されるＯＸ４０は、例えば、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＯＸ４０またはアカゲザルＯＸ４０であってよい。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、癌治療が必要な対象に有効量として投与されると、例えば、Ｔ細胞の存在下で、対象における腫瘍成長を阻害することができる。いくつかの態様では、腫瘍成長は、アイソタイプが一致する対照の投与と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％阻害することができる。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、ＯＸ４０との結合を介して、活性化したＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を誘導することができるが、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的にトリガーしない。例えば、いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、Ｃｌｑに結合することも、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性をトリガーすることもない。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、ワクチン抗原と一緒に対象に共投与されると、ＣＤ４＋セントラルメモリー（ｃＭ）Ｔ細胞増殖、エフェクターメモリー（ｅＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、ＮＫ細胞増殖、および／またはＢ細胞増殖を増大することができる。いくつかの態様では、ＣＤ４＋ｃＭＴ細胞増殖、ＣＤ８＋ｅＭＴ細胞増殖、ＮＫ細胞増殖、Ｂ細胞増殖、またはこれらの任意の組み合わせは、末梢血単核細胞における細胞内Ｋｉ６７発現として測定される。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、限定されるものではないが、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）由来の抗原を含むワクチン抗原と一緒に対象に共投与されると、抗原特異的Ｔ細胞応答を増大することができ、これは、例えば、増大したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）発現として測定することができる。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、ワクチン抗原と一緒に対象に共投与されると、抗原特異的ＩｇＧ力価を高めることができる。いくつかの態様では、抗原は、ＲＳウイルスの可溶性Ｆ糖タンパク質（ＲＳＶ ｓＦ）であってよく、六量体タンパク質およびＲＳＶ抗原を対象に共投与することによって、ＲＳＶ中和抗体の力価を高めることができる。
いくつかの態様では、六量体タンパク質およびワクチン抗原が共投与される対象は、非ヒト霊長類である。
いくつかの態様では、本開示により提供される六量体タンパク質は、例えば、プレートアッセイにおいて、エフェクターＴ細胞増殖の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介性抑制を阻害することができる。いくつかの態様では、エフェクターＴ細胞は、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、エフェクター細胞とＴｒｅｇ細胞の比は、約１：０．５〜約１：３、例えば、１：１または約１：２であってよい。
本開示は、本明細書に記載する六量体タンパク質および担体を含む組成物をさらに提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載するポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、核酸配列：配列番号３を含み得る。
本開示はさらに、記載のポリヌクレオチドを組み込んだベクターおよび記載のポリヌクレオチドまたはベクターを組み込んだ宿主細胞も提供する。関連する態様では、本開示は、本明細書に記載するポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する六量体タンパク質を生成する方法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質が発現される条件下で、記載の宿主細胞を培養するステップと、ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質を回収するステップを含む。
さらなる態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞の生存または増殖を促進する方法を提供し、この方法は、活性化Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、これによって、六量体タンパク質が、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができるようにする。本開示は、活性化Ｔ細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法をさらに提供し、この方法は、活性化Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、これによって、六量体タンパク質が、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができるようにする。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、および／またはＩＬ−１β、例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、および／またはＩＬ−１０であってよい。いくつかの態様では、活性化Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞および／または活性化ＣＤ８+Ｔ細胞である。例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞、および／またはアカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞であってよい。
さらなる態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞増殖の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介性抑制を低減する方法を提供し、この方法は、活性化Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞の混合物を請求項２６〜７０のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、六量体タンパク質は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。
また別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性化を促進する方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、これによって、六量体タンパク質が、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができるようにする。いくつかの態様では、この方法はさらに、ＩｇＧ４−Ｆｃドメインと、ＦｃγＲを発現する細胞との相互作用による六量体タンパク質の架橋も含む。ＦｃγＲを発現する細胞は、例えば、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄もしくは形質細胞様樹状細胞、濾胞性樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞、好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、原発性ヒト腫瘍または腫瘍流入領域もしくは非流入領域リンパ節由来のＣＤ４５+細胞、および／またはその他の二次元もしくは三次元リンパ系構造由来のＣＤ４５＋細胞であってよい。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激によって測定することができ、いくつかの態様では、活性化Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞および／または活性化ＣＤ８+Ｔ細胞、例えば、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞、および／またはアカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、前述した方法は、治療が必要な対象に、本開示により提供される六量体タンパク質または組成物を有効量で投与するステップを含む。関連する態様では、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、この方法は、治療が必要な対象に、本明細書に記載する六量体タンパク質を有効量で投与するステップを含む。いくつかの態様では、癌は、固形腫瘍である。いくつかの態様では、六量体タンパク質または組成物の投与によって、腫瘍成長を阻害することができ、腫瘍縮小を促進することができるか、あるいは、その両方が可能である。いくつかの態様では、腫瘍成長阻害は、Ｔ細胞の存在下で達成される。
また別の態様では、本開示は、対象における免疫応答を増大する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、本開示により提供される六量体タンパク質、または本開示により提供される組成物を治療に有効な量で投与するステップを含む。本開示で提供される治療方法のいずれかについて、対象は、ヒト対象であり得る。
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞上でのＩＣＯＳの発現を誘導する方法を提供し、Ｔ細胞を本開示により提供される六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、六量体タンパク質は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞上でのＰＤ−１の発現を誘導する方法を提供し、Ｔ細胞を本開示により提供される六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、六量体タンパク質は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。
例示的な多量体タンパク質、すなわちＯＸ４０Ｌ融合タンパク質を概略図的に示す。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のアミノ酸配列（ＮからＣ末端、配列番号４）を示す。アミノ酸配列ｈｕＩｇＧ４ ＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａが配列番号１２として開示される。 図２−１の続き。 一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞の表面に発現されたＯＸ４０に結合するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質を示す。データは、２０％、５０％および９０％の受容体占有率（ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値）を達成するための見掛け親和性（Ｋd）ならびに見掛け濃度の決定のために使用した。 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に発現されたヒトＯＸ４０に結合するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質を示す。データは、２０％、５０％および９０％の受容体占有率（ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値）を達成するための見掛け親和性（Ｋd）ならびに見掛け濃度の決定のために使用した。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化マウスＣＤ４+Ｔ細胞に発現されたＯＸ４０に対する結合が欠如している。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。ｎＭ＝ナノモル。エラーバー＝ＳＥＭ。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ラットＣＤ４+Ｔ細胞に発現されたＯＸ４０に対する結合が欠如している。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。ｎＭ＝ナノモル。エラーバー＝ＳＥＭ。 一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されたＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合を示す。２つの独立したアッセイから平均した単一ウェルデータを、見掛け親和性（Ｋd）値の決定のために使用した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。ｎＭ＝ナノモル。 一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されたＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合を示す。２つの独立したアッセイから平均したデータを、見掛け親和性（Ｋｄ）値の決定のために使用した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。ｎＭ＝ナノモル。エラーバー＝ＳＥＭ ＴＮＦＲＳＦ発現ＨＥＫ２９３およびＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔに対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞において、ヒストグラムの左側に示すＴＮＦＲＳＦメンバーの一過性発現、ならびにヒストグラムの上方に示すＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂまたはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質に対する結合。グレイのヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂについての蛍光色素結合アイソタイプ対照抗体結合、またはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質についてのヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体結合対照；オープンヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂまたはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合。 図５Ａ−１の続き。 ＴＮＦＲＳＦ発現ＨＥＫ２９３およびＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔに対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞において、ヒストグラムの左側に示すＴＮＦＲＳＦメンバーの一過性発現、ならびにヒストグラムの上方に示すＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂまたはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質に対する結合。グレイのヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂについての蛍光色素結合アイソタイプ対照抗体結合、またはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質についてのヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体結合対照；オープンヒストグラム、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂまたはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合。 図５Ｂ−１の続き。 ＴＮＦＲＳＦ発現ＨＥＫ２９３およびＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔに対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合。（Ｃ）正の対照としてＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔに対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合。グレイのヒストグラム、ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体結合対照；オープンヒストグラム、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質プレート結合バイオアッセイの概略図を示す。Ｑ、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質。Ｙ、抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、プレート生物活性アッセイにおいて、一次ＣＤ４Ｔ細胞を共刺激して、サイトカインを増殖および放出する。（Ａ）ＣＤ４Ｔ細胞増殖について示されるドナー４の代表的なデータ；同様の結果が、ドナー１、２および３について認められた。符号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、プレート生物活性アッセイにおいて、一次ＣＤ４Ｔ細胞を共刺激して、サイトカインを増殖および放出する。（Ｂ）ＩＦＮγの放出について示されるドナー４の代表的なデータ；同様の結果が、ドナー１、２および３について認められた。符号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、プレート生物活性アッセイにおいて、一次ＣＤ４Ｔ細胞を共刺激して、サイトカインを増殖および放出する。（Ｃ）ＴＮＦαの放出について示されるドナー４の代表的なデータ；同様の結果が、ドナー１、２および３について認められた。符号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、プレート生物活性アッセイにおいて、一次ＣＤ４Ｔ細胞を共刺激して、サイトカインを増殖および放出する。（Ｄ）ＩＬ−１０の放出について示されるドナー４の代表的なデータ；同様の結果が、ドナー１、２および３について認められた。符号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、プレート生物活性アッセイにおいて、一次ＣＤ４Ｔ細胞を共刺激して、サイトカインを増殖および放出する。（Ｅ）ＩＬ−１３の放出について示されるドナー４の代表的なデータ；同様の結果が、ドナー１、２および３について認められた。符号、平均値；エラーバー、平均値の標準偏差。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性を測定するために使用した細胞系を示す。ＦｃγＲ発現細胞によるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質架橋は、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼクローン６４リポータ細胞株でのＯＸ４０のクラスター形成を媒介し、これによって、ルシフェラーゼのＮＦκＢ依存性生成が起こり、これを、ＮＦκＢ活性およびＴ細胞活性化の代理として測定することができる。 ＦｃγＲにより架橋された、または架橋されていない場合の、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の生物活性を示す。（Ａ）ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３によるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の架橋後のリポータ活性。（Ｂ）ＦｃγＲ発現のないＨＥＫ２９３親細胞の存在下でのリポータ活性。（Ｃ）薬物を含み、且つＨＥＫ２９３細胞なしのリポータ活性。ＲＬＵ、相対発光単位。 ラージ（Ｒａｊｉ）、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、またはＦｃγＲ媒介薬物架橋のために原発性ヒト腫瘍から単離されたＣＤ４５＋細胞、および生物活性読み取りのためのＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢルシフェラーゼクローン６４受容体細胞を用いたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性の実施例を示す。（Ａ）ラージＢ細胞によりクラスター形成されたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質活性。ＲＬＵ＝相対発光単位。Ｍ＝モル濃度。 ラージ（Ｒａｊｉ）、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、またはＦｃγＲ媒介薬物架橋のために原発性ヒト腫瘍から単離されたＣＤ４５＋細胞、および生物活性読み取りのためのＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢルシフェラーゼクローン６４受容体細胞を用いたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性の実施例を示す。（Ｂ）ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３。ＲＬＵ＝相対発光単位。Ｍ＝モル濃度。 ラージ（Ｒａｊｉ）、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、またはＦｃγＲ媒介薬物架橋のために原発性ヒト腫瘍から単離されたＣＤ４５＋細胞、および生物活性読み取りのためのＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢルシフェラーゼクローン６４受容体細胞を用いたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性の実施例を示す。（Ｃ）ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３。ＲＬＵ＝相対発光単位。Ｍ＝モル濃度。 ラージ（Ｒａｊｉ）、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、またはＦｃγＲ媒介薬物架橋のために原発性ヒト腫瘍から単離されたＣＤ４５＋細胞、および生物活性読み取りのためのＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢルシフェラーゼクローン６４受容体細胞を用いたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性の実施例を示す。（Ｄ）原発性ヒト腫瘍から単離されたＣＤ４５＋細胞。ＲＬＵ＝相対発光単位。Ｍ＝モル濃度。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、Ｃｙｎｏ／Ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼクローンＢ２およびＬＣＬ８６６４Ｒｈｅｓｕｓ Ｂ細胞生物活性アッセイにおいて活性である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞株の細胞表面に発現されたｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０を介してシグナル伝達を誘導する、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の濃度依存性活性（ＲＬＵ）。データポイント毎に４回の反復。エラーバー＝ＳＥＭ。ＲＬＵ、相対発光単位；ｎ＝２アッセイ；ｎＭ＝ナノモル ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、Ｃｙｎｏ／Ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼおよびＦｃγ受容体発現Ｒｈｅｓｕｓ免疫細胞生物活性アッセイにおいて活性である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞株の細胞表面に発現されたｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０を介してシグナル伝達を誘導する、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の濃度依存性活性（ＲＬＵ）。データポイント毎に２回の反復。エラーバー＝ＳＥＭ。ＲＬＵ、相対発光単位；ｎＭ＝ナノモル。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を引き起こす。一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を細胞周期および分裂に誘導する、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の濃度依存性活性。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の特異的活性は、分裂ＣＤ４パーセント値から抗ＣＤ３抗体のみによる刺激細胞の平均値を減じることにより、計算した。データは、３つの同じウェルを用いた２回の独立したアッセイについて示す。ｎＭ＝ナノモル。エラーバー＝ＳＥＭ。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質および抗ＣＤ２０抗体のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性の評価、実験＃１を示す。一次活性化ＮＫ細胞によるＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の特異的殺傷は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１により媒介されるが、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＦ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ４Ｐ対照によっては媒介されない：（Ａ）活性化ＣＤ４+Ｔ細胞と一緒にインキュベートしたドナー１ＮＫ細胞。実験反復は３回実施した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質および抗ＣＤ２０抗体のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性の評価、実験＃１を示す。一次活性化ＮＫ細胞によるＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の特異的殺傷は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１により媒介されるが、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＦ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ４Ｐ対照によっては媒介されない：（Ｂ）トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）Ｂ細胞と一緒にインキュベートしたドナー１ＮＫ細胞。実験反復は３回実施した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質および抗ＣＤ２０抗体のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性の評価、実験＃１を示す。一次活性化ＮＫ細胞によるＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の特異的殺傷は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１により媒介されるが、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＦ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ４Ｐ対照によっては媒介されない：（Ｃ）活性化ＣＤ４+Ｔ細胞と一緒にインキュベートしたドナー２ＮＫ細胞。ＡＤＣＣアッセイで用いた一次活性化ＮＫ細胞は、リツキシマブに結合したトレドＢ細胞の効率的な溶解を媒介することができた。実験反復は３回実施した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質および抗ＣＤ２０抗体のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性の評価、実験＃１を示す。一次活性化ＮＫ細胞によるＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の特異的殺傷は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１により媒介されるが、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＦ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ４Ｐ対照によっては媒介されない：（Ｄ）トレドＢ細胞と組み合わせたドナー２ＮＫ細胞。実験反復は３回実施した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質およびＯＸ４０リガンド融合タンパク質ＩｇＧ１のナチュラルキラー細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性の評価、実験＃２を示す。一次活性化ＮＫ細胞によるＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の特異的殺傷は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１により媒介されるが、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＦ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ４Ｐ対照によっては媒介されない。実験反復は３回実施した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。 精製Ｃｌｑタンパク質に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合の評価を示す。（Ａ）表示した濃度の精製ヒトＣｌｑタンパク質をバイオセンサーチップに注射した。ブランクは、ＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０ビヒクル単独の注射を示す。（Ｂ）同じ実験において、対照ヒトＩｇＧ１は、精製ヒトＣｌｑタンパク質に結合した。 マウス異種移植片モデルにおけるＡ３７５細胞の成長に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の作用を示す。各グループ６匹ずつのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、１：６のＥ：Ｔ比でアロ反応性ヒトＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞株と混合したＡ３７５細胞を第１日にＳＣ移植した。試験物質（アイソタイプ対照またはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質）を第４、７、９および１２日にＩＰ投与した。腫瘍体積の平均値を示す。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質処置およびアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）順位和検定により統計的有意性について分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。*：ＴＧＩ＞５０％、アイソタイプ対照グループと比較してＰ≦０．０５。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ＝非肥満糖尿病／重症複合免疫不全；ＳＣ＝皮下；Ｅ：Ｔ＝エフェクター：標的比；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害 マウス異種移植片モデルにおけるＡ３７５細胞の成長に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の作用を示す。各グループ６匹ずつのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、Ａ３７５細胞を単独で（Ｔ細胞なし）、または１：６のＥ：Ｔ比でアロ反応性ヒトＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞株と混合して（２：１の比）、第１日にＳＣ移植した。試験物質（アイソタイプ対照またはＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質）を第３、６、８および１０日にＩＰ投与した。腫瘍体積の平均値を示す。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質処置およびアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）順位和検定により統計的有意性について分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。*：ＴＧＩ＞５０％、アイソタイプ対照グループと比較してＰ≦０．０５。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ＝非肥満糖尿病／重症複合免疫不全；ＳＣ＝皮下；Ｅ：Ｔ＝エフェクター：標的比；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおけるレンカ（Ｒｅｎｃａ）細胞株の成長に対するマウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質の作用を示す。各グループ１０匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスにレンカ細胞を第１日にＳＣ接種した。対照物質（アイソタイプ対照）および試験物質（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）を第４および７日にＩＰ投与した。腫瘍体積の平均（パネルＡ）および個々の（パネルＢ）値を示す。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ処置およびアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを用いたセクション６．８に記載の方法により統計的有意性について分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。*：ＴＧＩ＞５０％、第２６日のアイソタイプ対照グループと比較してＰ≦０．０００１。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおけるＣＴ２６細胞株の成長に対するマウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質の作用を示す。各グループ１０匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６細胞を第１日にＳＣ接種した。対照物質（アイソタイプ対照）および試験物質（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）を第４および６日にＩＰで投与した。腫瘍体積の平均（パネルＡ）および個々の（パネルＢ）値を示す。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ処理およびアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを用いたセクション６．８に記載の方法により統計的有意性について分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。*：ＴＧＩ＞５０％、第２２日のアイソタイプ対照グループと比較してＰ≦０．０００１。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおける４Ｔ１細胞株の成長に対するマウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質の作用を示す。各グループ１２匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスに４Ｔ１細胞を第１日にＳＣ接種した。対照物質（アイソタイプ対照）および試験物質（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）を第４および７日にＩＰで投与した。腫瘍体積の平均（パネルＡ）および個々の（パネルＢ）値を示す。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ処置およびアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを用いたセクション６．８に記載の方法により統計的有意性について分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。*：ＴＧＩ＞５０％、第２５日のアイソタイプ対照グループと比較してＰ≦０．０００６。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 マウス同系モデルにおけるＭＣＡ２０５細胞株の成長に対するマウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質の作用を示す。各グループ１４匹ずつのＣ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５細胞を第１日にＳＣ接種した。対照物質（アイソタイプ対照）および試験物質（ＯＸ４０Ｌ ＦＰ）を第１１および１４日にＩＰ投与した。腫瘍体積の平均（パネルＡ）および個々の（パネルＢ）値を示す。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ処置およびアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを用いたセクション６．８に記載の方法により統計的有意性について分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。*：ＴＧＩ＞５０％、第２２日のアイソタイプ対照グループと比較してＰ≦０．０２８。ＳＣ＝皮下；ＩＰ＝腹腔内；ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。 ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞抑制を克服する。エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞をカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識してから、表示した比の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と一緒に、またはなしで、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および試験もしくは対照物質の存在下、４日間培養した。アッセイの終了時に、分裂エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより評価した。エラーバーは、２回反復アッセイウェルからの平均値の標準偏差を表す。有意性は、スチューデントＴ検定（*Ｐ＝０．００４２；**Ｐ＝０．０００２、***Ｐ＜０．０００１）を用いて計算した。 エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞抑制に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の作用は、濃度依存性である。エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞をカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識してから、表示した１：１比の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と一緒に、またはなしで、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および試験もしくは対照物質の存在下、４日間培養した。アッセイの終了時に、分裂エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより評価した。エラーバーは、２つの同じアッセイウェルからの平均値の標準偏差を表す。有意性は、スチューデントＴ検定（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）を用いて計算した。 アカゲザルに対して静脈内経路で投与したＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの薬力学をモニターするための試験設計を示す。 全ＣＤ４メモリーＴ細胞（Ａ）、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞（Ｂ）、全メモリーＣＤ８Ｔ細胞（Ｃ）、およびナイーブＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）の薬力学（Ｋｉ−６７発現により測定）を示す。 全ＣＤ４メモリーＴ細胞（Ａ）、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞（Ｂ）、全メモリーＣＤ８Ｔ細胞（Ｃ）、およびナイーブＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）の薬力学（ＩＣＯＳ発現により測定）を示す。 全ＣＤ４メモリーＴ細胞（Ａ）、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞（Ｂ）、全メモリーＣＤ８Ｔ細胞（Ｃ）、およびナイーブＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）の薬力学（ＰＤ−１発現により測定）を示す。 Ｌｉｎ−ＣＤ２０＋Ｂ細胞の増殖としての薬力学（Ｋｉ−６７発現により測定）を示す。
抗原による初回免疫中、またはその直後、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞とのＯＸ４０の会合は、抗原に対するＴ細胞、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞の応答増大をもたらす。本開示に関連して、用語「会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）」は、ＯＸ４０受容体により媒介される少なくとも１つの活性との結合およびその刺激を指す。例えば、抗原特異的Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞上でのＯＸ４０受容体の会合は、抗原単独に対する応答と比較して、増大したＴ細胞増殖、および増大したサイトカイン産生をもたらす。抗原に対する応答の増加は、ＯＸ４０受容体会合の非存在下よりも実質的に長い期間にわたって維持することができる。このように、ＯＸ４０受容体を介した刺激は、Ｔ細胞認識、例えば、腫瘍抗原のＴ細胞認識を促進することによって抗原特異的免疫応答を増強する。
抗原によるＴ細胞の初回感作中、またはその直後にＯＸ４０アゴニストは、対象（例えば、ヒト対象）に投与すると、対象における抗原特異的免疫応答を増強することができる。ＯＸ４０アゴニストは、可溶性ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質および抗ＯＸ４０抗体またはその断片などのＯＸ４０リガンド（「ＯＸ４０Ｌ」）を含む。具体的例は、ＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメイン、三量体化ドメイン、例えば、ＴＲＡＦ２からのイソロイシンジッパードメイン、およびヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドサブユニットであり、ポリペプチドサブユニットは、多量体（例えば、三量体もしくは六量体）融合タンパク質に自己組織化する。こうした融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も記載される。本開示はまた、多量体ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドを用いて、対象における抗原特異的免疫応答を増強する方法も提供する。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に関して本明細書に開示される組成物および方法は、より一般的に、多量体（例えば、三量体および六量体）受容体結合融合タンパク質の生成および使用に適用することができる。
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「ポリペプチドサブユニット」は、１つまたは複数のポリペプチドサブユニットを表すと理解される。従って、用語「１つの（ａ）」（もしくは「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および符号は、国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）承認の形態で表記する。数値の範囲は、範囲を定める数もふくむ。別に記載のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で、左から右に向かって記載する。本明細書に記載する見出しは、本開示の様々な態様または態様の限定ではなく、全体として本明細書の参照により援用され得る。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書への参照により、その全体がより詳細に定義される。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」および複数形「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖状に結合しているモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、規定の長さの生成物を指さない。したがって、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、それらの用語のいずれにも代えて、またはそれらの用語と互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾、例として、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、または非標準アミノ酸による修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然生物学的資源に由来し得、または組換え技術により産生することができるが、指定される核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、任意の様式、例として化学合成により生成することができる。
本明細書において使用される「タンパク質」は、単一ポリペプチド、すなわち、上に定義した通りの単一のアミノ酸鎖を指し得るが、例えば、ジスルフィド結合、水素結合、または疎水性相互作用により、結合して、多量体タンパク質を生成する２つ以上のポリペプチドを指す場合もある。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドサブユニット」は、同一または異なる他のポリペプチドサブユニットと相互作用して、多量体タンパク質、例えば、本明細書に記載する六量体タンパク質を形成することができるアミノ酸からなるポリペプチド鎖を指す。
本明細書に開示のポリペプチドは、約３アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、７５アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、５００アミノ酸以上、１０００アミノ酸以上、または２０００アミノ酸以上のサイズであり得る。ポリペプチドは、定義された３次元構造を有し得るが、それらは、そのような構造を必ずしも有さない。定義された３次元構造を有するポリペプチドは、フォールドと称され、定義された３次元構造を有さないが、多数の異なる立体構造を採り得るポリペプチドは、アンフォールドと称される。
「単離」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は要求されない。例えば、単離ポリペプチドは、そのネイティブまたは天然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書に開示の単離とみなされ、任意の好適な技術により分離、分別、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドと同様である。
本明細書に開示する他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、およびこれらの任意の組み合わせである。本明細書に開示するポリペプチドサブユニットまたは多量体タンパク質に関して、用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、完全なポリペプチドまたはタンパク質の活性の少なくとも一部を保持するが、構造的に異なる任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含し得る。ポリペプチドの断片として、例えば、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が挙げられる。バリアントとしては、前述した断片、さらには、アミノ酸置換、欠失、または挿入により改変したアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。バリアントは、自然に発生したものであってもよいし、または意図的に構築したものでもよい。意図的に構築したバリアントは、当分野で公知の突然変異誘発技術を用いて生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存または非保存アミノ酸置換、欠失もしくは付加を含んでもよい。誘導体は、天然ポリペプチドに見出されない追加的特徴を呈示するように改変されたポリペプチドである。例として、融合タンパク質がある。バリアントポリペプチドはまた、本明細書において、「ポリペプチド類似体」と呼ぶこともできる。本明細書で使用される「誘導体」は、官能側基の反応により化学的に誘導体化した１つまたは複数のアミノ酸を有する対象のポリペプチドを指す。また、「誘導体」として、２０個の標準アミノ酸からなる１つまたは複数の標準もしくは合成アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換することができ；５−ヒドロキシリシンでリシンを置換することができ；３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換することができ；ホモセリンで、セリンを置換することができ；オルニチンでリシンを置換することができる。
「保存アミノ酸置換」は、１アミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸により置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当分野において定義されており、これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。例えば、フェニルアラニンによるチロシンの置換は、保存置換である。タンパク質活性を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存置換を同定する方法は、当分野ではよく知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１ １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２−４１７（１９９７））。
本明細書において使用される場合、用語「抗体」（またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、抗原、Ｂ細胞により産生される典型的抗体の場合には、重鎖（ＶＨ）の可変ドメインおよび軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインに結合することができる抗体の少なくとも最小部分を指す。脊椎動物系における基本的な抗体構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）参照。
抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体として、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片が挙げられる。ｓｃＦｖ分子は、当分野において公知であり、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。本開示により包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸および複数形の核酸を包含するものとし、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用のホスホジエステル結合または非慣用結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示の単離とみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに合成により産生されたそのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得、またはそれらを含み得る。
本明細書において使用される「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含む核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それは、コード領域の一部とみなすことができるが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部でない。２つ以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば、単一ベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一コード領域を含有し得、または２つ以上のコード領域を含み得、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードし得る。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、ポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する融合タンパク質をコードする核酸に融合されておりまたは融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されるものではないが、特殊化エレメントまたはモチーフ、例えば分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つまたは複数のコード領域と作動可能に会合しているプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に配置するように１つまたは複数の調節配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと会合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指向する発現調節配列の能力もＤＮＡテンプレートの転写される能力も妨害しない場合、「作動可能に会合している」または「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらし得る場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合している。プロモーターは、所定の細胞中でのみＤＮＡの実質的な転写を指向する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加え、他の転写制御エレメントは、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが細胞特異的転写を指向するためにポリヌクレオチドと作動可能に会合していてよい。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示される。
種々の転写制御領域は、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、脊椎動物において機能する転写制御領域、例えば、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（イントロンＡと連携する前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御し得る他の配列が含まれる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が含まれる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントは、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が含まれる。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態であり得る。
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載するポリペプチドサブユニットをコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指向する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合していてよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を越える成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から開裂されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態を産生するために完全または「全長」ポリペプチドから開裂されるポリペプチドのＮ末端に融合しているシグナルペプチドを有することに精通している。ある実施形態において、ネイティブシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、または作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指向する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置換することができる。
「ベクター」は、核酸分子であり、宿主細胞に導入されると、形質転換宿主細胞が生成される。ベクターは、これが宿主細胞で複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターはさらに、１つまたは複数の選択マーカ遺伝子および当分野で公知の他の遺伝エレメントを含んでもよい。
「形質転換」細胞、または「宿主」細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で用いられるように、形質転換という用語は、核酸分子をこうした細胞に導入することができるあらゆる技術、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、およびパーティクル・ガン加速によるネイキッドＤＮＡの導入などが挙げられる。形質転換細胞または宿主細胞は、細菌細胞または真核細胞であってよい。
「特異的に結合する」とは、一般に、分子、例えば、ＯＸ４０Ｌまたはその受容体結合断片が、その受容体結合ドメインを介して別の分子、例えば、ＯＸ４０に結合すること、ならびに、結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間にある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、リガンドは、それがその受容体結合ドメインを介して、ランダムの無関連な分子に結合するよりも容易に受容体に結合する場合、その受容体に「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書において、あるリガンドがある受容体に結合する相対親和性を特定するために使用される。例えば、リガンド「Ａ」は、所与の受容体についてリガンド「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、またはリガンド「Ａ」は、それが関連受容体「Ｄ」について有するよりも高い特異性で受容体「Ｃ」に結合すると言うことができる。
「受容体結合ドメイン」とは、リガンド、例えば、本明細書に開示するＯＸ４０Ｌに含まれる結合ドメインを意味する。
リガンド、例えば、本明細書に開示するＯＸ４０Ｌ−ＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチドサブユニットまたは多量体融合タンパク質は、５×１０-2秒-1、１０-2秒-1、５×ｌ０-3秒-1または１０-3秒-1以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で受容体、例えば、ＯＸ４０に結合することができる。リガンド、例えば、本明細書に開示するＯＸ４０Ｌ−ＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチドサブユニットまたは多量体融合タンパク質は、５×１０-4秒-1、１０-4秒-1、５×１０-5秒-1、または１０-5秒-1５×１０-6秒-1、１０-6秒-1、５×１０-7秒-1または１０-7秒-1以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で受容体、例えば、ＯＸ４０に結合することができる。
用語「阻害する」、「ブロックする」および「抑制する」は、本明細書において互換的に用いられ、完全な活性のブロックを含む、あらゆる統計的に有意な生物活性の減少を指す。例えば、「阻害」は、生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少を指し得る。
本明細書において使用される用語「親和性」は、リガンドとそのコグネイト受容体との結合の強さの尺度を指す。本明細書において使用される用語「アビディティー」は、リガンドの集団と受容体との複合体の総合安定性、すなわち、リガンドと受容体の組み合わせ、例えば、六量体ＯＸ４０Ｌ−ＩｇＧ４融合タンパク質と細胞表面ＯＸ４０の相互作用の機能的組み合わせ強度を指す。アビディティーは、集団における個々の受容体結合ドメインと規定の受容体との親和性、ならびにまたリガンドと受容体の価数の両方に関する。
リガンド、例えば、本明細書に開示するＯＸ４０Ｌ−ＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチドサブユニットまたは多量体融合タンパク質は、リガンドに対するそれらの結合親和性に関して記載または規定することもできる。例えば、リガンドは、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、または１０-15Ｍ以下の解離定数またはＫDで受容体に結合し得る。
リガンド、例えば、本明細書に開示するＯＸ４０Ｌ−ＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチドサブユニットまたは多量体融合タンパク質は、受容体、例えば、ＯＸ４０に、１０3Ｍ-1秒-1、５×１０3Ｍ-1秒-1、１０4Ｍ-1秒-1または５×１０4Ｍ-1秒-1以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で結合することができる。リガンド、例えば、本明細書に開示するＯＸ４０Ｌ−ＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチドサブユニットまたは多量体融合タンパク質は、受容体、例えば、ＯＸ４０に、１０5Ｍ-1秒-1、５×１０5Ｍ-1秒-1、１０6Ｍ-1秒-1、または５×１０6Ｍ-1秒-1または１０7Ｍ-1秒-1以上のオン速度（ｏｎ ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｎ））で結合し得る。
ＯＸ４０、または「ＯＸ４０受容体」は、活性化Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞、ならびにＦｏｘｐ３+ＣＤ４+調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の表面に発現されるタンパク質（また、ＣＤ１３４、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４、およびＡＣＴ−３５など、様々に称される）である。ネイティブＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞は、ＯＸ４０を発現しない（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．，（２０１０）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：５７−７８）。
「ＯＸ４０リガンド」（「ＯＸ４０Ｌ」）（また、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４、ｇｐ３４、ＴＡＸ転写活性化糖タンパク質−１、およびＣＤ２５２など、様々に称される）は、主として、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見出され、活性化Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、形質細胞様ＤＣ、およびマクロファージ上で誘導することができる（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．，（２０１０）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：５７−７８）。活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マスト細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞などのその他の細胞は、炎症性サイトカインに応答してＯＸ４０Ｌを発現することができる（同上）。ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０受容体に特異的に結合する。ヒトタンパク質は、国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されている。マウスＯＸ４０Ｌは、米国特許第５，４５７，０３５号明細書に記載されている。ＯＸ４０Ｌは、細胞の表面に発現され、細胞内、膜貫通および細胞外受容体−結合ドメインを含む。ＯＸ４０Ｌの機能的に活性の可溶性形態は、例えば、米国特許第５，４５７，０３５号明細書および米国特許第６，３１２，７００号明細書、ならびに国際公開第９５／２１９１５号パンフレット（これらの開示内容は、あらゆる目的のために、本明細書に組み込む）に記載されているように、細胞内および膜貫通ドメインを欠失させることにより、生成することができる。ＯＸ４０Ｌの機能的に活性の形態は、ＯＸ４０に特異的に結合する能力を保持する、すなわち、ＯＸ４０「受容体結合ドメイン」を有する形態である。一例として、配列番号１のアミノ酸５１〜１８３、すなわちヒトＯＸ４０Ｌがある。ＯＸ４０Ｌ分子または誘導体が、ＯＸ４０に特異的に結合する能力を決定する方法は、以下に詳述する。ＯＸ４０Ｌおよびその誘導体（例えば、ＯＸ４０結合ドメインを含む誘導体）を作製および使用する方法は、国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されており、この文献は、ヒト免疫グロブリン（「Ｉｇ」）Ｆｃ領域などの他のペプチドに結合したＯＸ４０Ｌの可溶性形態を含むタンパク質も記載し、これを生成して、培養細胞からのＯＸ４０リガンドの精製を容易にする、または哺乳動物へのインビボ投与後の分子の安定性を高めることができる（さらに、米国特許第５，４５７，０３５号明細書および国際公開第２００６／１２１８１０号パンフレットも参照のこと；これらのいずれも、参照により全体として本明細書に組み込む）。
本明細書において使用される用語「ＯＸ４０Ｌ」は、全ＯＸ４０リガンド、可溶性ＯＸ４０リガンド、およびＯＸ４０リガンドの機能的に活性の部分を包含する。また、ＯＸ４０Ｌの定義には、天然に存在するＯＸ４０リガンド分子とはアミノ酸配列が異なるが、ＯＸ４０受容体に特異的に結合する能力を保持するＯＸ４０リガンドバリアントも含まれる。こうしたバリアントは、米国特許第５，４５７，０３５号明細書および国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されている。関連する実施形態では、本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する能力、例えば、配列番号１のアミノ酸５１〜１８３を失ったＯＸ４０Ｌの突然変異体があり、ここで、ヒトＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインの１８０位のフェニルアラニンは、アラニンで置換されている（Ｆ１８０Ａ）。
「三量体化ドメイン」は、三量体へのポリペプチドの組織化を促進するポリペプチド内のアミノ酸配列である。例えば、三量体化は、他の（同じまたは異なるアミノ酸配列を有する別のポリペプチドの）三量体化ドメインとの結合を介して三量体への組織化を促進する。この用語はまた、ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すためにも用いられる。
用語「Ｆｃ」ドメインは、抗体定常領域の一部を指す。伝統的に、Ｆｃドメインという用語は、抗体の対合ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含む、プロテアーゼ（例えば、パパイン）切断生成物を指す。本開示に関連して、ＦｃドメインまたはＦｃという用語は、生成の手段とは関係なく、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の全部または一部を含む、任意のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを指す。
本明細書において使用される用語「ＣＨ２ドメイン」には、例えば、慣用の番号付与スキームを使用して、抗体の概ねアミノ酸２４４からアミノ酸３６０に及ぶ重鎖分子のＦｃドメインの部分が含まれる（アミノ酸２４４から３６０、Ｋａｂａｔ番号付与系；およびアミノ酸２３１〜３４０、ＥＵ番号付与系）。また、ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端に及んで、約１０８アミノ酸を含むことも十分に立証されている。
本明細書において使用される用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結させる重鎖分子のＦｃドメインの部分が含まれる。このヒンジ領域は、約２５アミノ酸を含み、フレキシブルであり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能とする。ヒンジ領域は、３つの区別されるドメイン：上部、中央部、および下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））に下位分類することができる。
本明細書において使用される用語「ジスルフィド結合」には、２つの硫黄原子間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、第２のチオール基とのジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。本明細書に記載するいくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、２つのヒンジ領域の間にジスルフィド結合形成を、具体的には、２２８位（ＥＵ番号付与に従う）でのセリンからプロリンへの突然変異を確実にするように、ヒンジ領域で突然変異させることができる。Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、本明細書において「ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン」と呼ばれる。
本明細書において使用される用語「結合している」、「融合している」または「融合」は、互換的に使用され得る。これらの用語は、あらゆる手段、例として化学コンジュゲーションまたは組換え手段によるさらに２つのエレメントまたは構成成分の連結を指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持する様式で連続するより長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の連結を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦ（セグメントが通常、天然では連結されていない）によりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質であり、例えば、本明細書に記載するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質である。リーディングフレームはこうして融合セグメント全体にわたり連続的とされるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的または空間的に分離することができる。
ポリペプチドに関して、「直鎖配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接するアミノ酸がポリペプチドの１次活性化構造中で連続する、アミノからカルボキシ末端方向におけるポリペプチド中のアミノ酸の順序である。
本明細書において使用される用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスには、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕在化、例として、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現および安定的発現の両方が含まれる。それには、限定されるものではないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終所望産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆体の作出が含まれる。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用される遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生される核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれでもよい。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解開裂などを有するポリペプチドがさらに含まれる。
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療」または「〜の治療」（例えば、「癌患者を治療する」段階において）は、例えば、対象が、より長期の生存率を有するか、またはその不快が軽減される程度までの、疾患病状の強度の低減、疾患の症状の発生の低下を指す。例えば、治療は、療法が、対象に投与されたとき、疾患症状、兆候、または原因を軽減する能力を指す。治療はまた、少なくとも１つの臨床症状の緩和もしくは軽減および／または病状の進行の阻害もしくは遅延および／または疾患もしくは疾病の発症の予防もしくは遅延も指す。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜動物、農場動物、競技動物、および動物園動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、クマなどが含まれる。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物活性を有効にするような形態を採り、しかも、組成物が投与される対象に対して、許容されないほど毒性の追加成分を含有しない製剤を指す。このような組成物は、無菌であってよい。
本明細書に開示する抗体の「有効量」は、具体的に記載される目的を実施するのに十分な量である。「有効な量」は、記載される目的に関して、実験により、常用的方法で決定することができる。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４融合ポリペプチドサブユニット
本開示は、ヒトＴ細胞を刺激する能力が増大した六量体タンパク質に組織化することができるＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットに関する。本明細書に記載するポリペプチドサブユニットは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、例えば、ＴＲＡＦ−２イソロイシンジッパー三量体化ドメイン、およびヒトＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインを含む。例示的な実施形態を図１に概略的に図示する。典型的に、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、三量体化ドメインおよびＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向に配置されている。例示的なＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットは、配列番号４により表される。
例示的な実施形態では、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインは、ヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインである。このような１ドメインの配列は、配列番号１のアミノ酸５１〜１８３によって表される。
＞ｓｐ｜Ｐ２３５１０｜ＴＮＦＬ４＿ＨＵＭＡＮ 腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４ ＯＳ＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） ＧＮ＝ＴＮＦＳＦ４ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
Figure 2017519494
ＯＸ４０受容体に結合する所望の特性を保持するいずれのＯＸ４０Ｌポリペプチド配列も、本明細書に記載の融合ポリペプチドおよび方法で好適である。
ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインに隣接しているのが、三量体化ドメインである。用語「隣接している」は、例えば、〜と隣接しているか、またはリンカーもしくは異種薬剤を介して結合していることを含む。三量体化ドメインは、三量体タンパク質への個別のＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチド分子の自己組織化を促進する上で役立つ。従って、三量体化ドメインを有するＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドは、三量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に自己組織化する。一実施形態では、三量体化ドメインは、ロイシンジッパードメインである。例示的なロイシンジッパードメインは、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−１４０７（その開示内容は、あらゆる目的のために本明細書に組み込む）により記載されている、エンジニアリングされた酵母ＧＣＮ４ロイシンバリアントである。例示的な三量体化ドメインとして、以下のものが挙げられる：ＴＮＦ受容体結合因子２（ＴＲＡＦ２）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｑ１２９３３［ｇｉ：２３５０３１０３］；アミノ酸３１０〜３４９）；トランボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）１（アクセッション番号ＰＯ７９９６［ｇｉ：１３５７１７］；アミノ酸２９１〜３１４)；マトリリン（Ｍａｔｒｉｌｉｎ）−４（アクセッション番号Ｏ９５４６０［ｇｉ：１４５４８１１７］；アミノ酸５９４〜６１８；軟骨基質タンパク質（マトリリン−１）（アクセッション番号ＮＰ００２３７０［ｇｉ：４５０５１１１］；アミノ酸４６３〜４９６；熱ショック転写因子（ＨＳＦ）（アクセッション番号ＡＡＸ４２２１１［ｇｉ：６１３６２３８６］；アミノ酸１６５〜１９１；およびクビリン（Ｃｕｂｉｌｉｎ）（アクセッション番号ＮＰ００１０７２［ｇｉ：４５５７５０３］；アミノ酸１０４〜１３８。いくつかの態様では、三量体化ドメインは、ヒトＴＲＡＦ２のアミノ酸３１０〜３４９（配列番号２）を含む。
＞ｓｐ｜Ｑ１２９３３｜ＴＲＡＦ２＿ＨＵＭＡＮ ＴＮＦ受容体結合因子２ ＯＳ＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） ＧＮ＝ＴＲＡＦ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
Figure 2017519494
ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインおよび三量体化ドメイン以外に、融合ポリペプチドは、定常領域または「Ｆｃ」ドメインなどの免疫グロブリンドメインを含む。本開示は、少なくともヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを提供する。いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、さらにＣＨ２ドメインを含む。いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、さらにＣＨ３ドメインを含む。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、完全な重鎖内ジスルフィド結合形成を付与する、２２８位（ＥＵ番号付与に従い）でのセリンからプロリンへの突然変異を含む。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、配列番号４のアミノ酸１〜１２を含む。いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号４のアミノ酸１〜２２９を含む。
３つのＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインを一緒にする三量体化ドメインと組み合わせて、２つのＩｇＧ４ Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合形成は、六量体タンパク質の形成をもたらす（図１）。従って、免疫グロブリンドメインは、非対合免疫グロブリンドメイン同士の相互作用を介して、２つの三量体融合ポリペプチド同士を安定した六量体（６つのＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットを含有する多量体である）に組織化するのを促進する二量体化ドメインとして役立つ。いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性などのエフェクター機能を促進することなく、六量体タンパク質に安定性を賦与する。
いくつかの態様では、本開示は、自己組織化して、ＯＸ４０に特異的に結合することができる六量体タンパク質を形成する単鎖ポリペプチドサブユニットを提供する。例示的なポリペプチドサブユニットは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、機能性三量体化ドメイン、およびＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインを含む。具体的な態様では、ポリペプチドサブユニットは、三量体または六量体タンパク質に自己組織化することができる。いくつかの態様では、ポリペプチドサブユニットは、以下のように、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって配置される：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、次に三量体化ドメイン、続いてＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメイン。３つのドメインは、直接隣接していてもよい。例えば、いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインのカルボキシ末端は、三量体化ドメインのアミノ末端に直接融合し、且つ、三量体化ドメインのカルボキシ末端は、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインのアミノ末端に直接融合している。あるいは、３つのドメインは、１つまたは複数のリンカー、スペーサ、またはその他の異種ポリペプチドによって隔てることもできる。
いくつかの態様では、本明細書に記載するＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットは、ヒトＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載するＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットは、非ヒト霊長類ＯＸ４０、例えば、カニクイザルＯＸ４０またはアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載するＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットは、マウスＯＸ４０またはラットＯＸ４０に結合しない。
本明細書に記載するＯＸ４０Ｌサブユニットポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸変化、例えば、最大１０の保存的変化（例えば、２つの置換されたアミノ酸、３つの置換されたアミノ酸、４つの置換されたアミノ酸、または５つの置換されたアミノ酸など）を含有し得るが、ただし、これらの変化は、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質の生化学的機能を変えることなく、ポリペプチドに達成できるものとする。
例えば、１つまたは複数の保存的変化は、ＯＸ４０に結合するその能力を変えることなく、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインに実施することができる。同様に、１つまたは複数の保存的変化は、三量体化するその能力を改変することなく、三量体化ドメインに実施することができる。
さらに、ポリペプチドドメインの一部は、その機能の全てを損傷または排除することなく、欠失させることもできる。同様に、以下に記載するように、その機能を損傷または排除することなく、ポリペプチド鎖に挿入または付加を実施することができる。ポリペプチドの１つまたは複数の機能を実質的に損傷することなく実施することができる他の修飾として、例えば、特異アミノ酸を組み込むインビボまたはインビトロ化学および生化学修飾が挙げられる。こうした修飾として、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、例えば、放射性核種による標識、ならびに酵素修飾が挙げられ、これらは、当業者には容易に認識されよう。ポリペプチドの様々な標識方法、こうした目的に有用な標識は、当分野においてよく知られており、放射性同位体、例えば、32Ｐ、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および抗リガンドが挙げられる。
融合ポリペプチドサブユニットは、異種薬剤、例えば、安定剤、免疫応答改質剤、または検出可能な薬剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、異種薬剤は、ペプチド結合を介して、ポリペプチドサブユニットに融合した１つまたは複数の追加のポリペプチド配列、例えば、シグナル配列（例えば、分泌シグナル配列）、リンカー配列、アミノ酸タグもしくは標識、または精製を容易にするペプチドもしくはポリペプチド配列を含む。いくつかの態様では、異種ポリペプチドは、ＩｇＧ４−ＦｃドメインのＮ末端に融合させることができ、異種ポリペプチドは、ＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインのＣ末端に融合することができ、異種ポリペプチドは、ＩｇＧ４−ＦｃドメインのＣ末端および三量体化ドメインのＮ末端に融合させることができ、または異種ポリペプチドは、三量体化ドメインのＣ末端およびＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインのＮ末端に融合させることができる。あるいは、異種ポリペプチドは、ドメインの機能的特徴が維持される限りにおいて、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、またはＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインのいずれかの内部に融合させることもできる。
いくつかの態様では、異種薬剤は、ポリペプチドサブユニットに化学的にコンジュゲートすることができる。ポリペプチドサブユニットにコンジュゲートすることができる例示的な異種薬剤として、限定されるものではないが、リンカー、薬物、毒素、造影剤、放射性化合物、有機および無機ポリマー、ならびにポリペプチドサブユニット自体によって賦与されない所望の活性を提供し得るいずれか他の組成物が挙げられる。具体的な薬剤として、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害性薬剤、放射性核種、造影剤、ビオチンが挙げられる。
いくつかの態様では、本開示は、対照または研究ツールとして用いるための特定のＯＸ４０Ｌ関連ポリペプチドサブユニットを提供する。例えば、本開示は、前述したＯＸ４０Ｌ関連サブユニットポリペプチドサブユニットを提供し、ここで、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインは、１８０位でのフェニルアラニンからアラニンへの単一置換（Ｆ１８０Ａ）以外は、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号１）のアミノ酸５１〜１８３を含む。配列番号６を含むこのＯＸ４０Ｌ関連ポリペプチドサブユニットは、ヒトＯＸ４０に結合することができない。別の例では、本開示は、前述した六量体タンパク質を形成することができるＯＸ４０Ｌポリペプチドサブユニットを提供するが、ここで、ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインは、マウスまたはラットＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインであり、Ｆｃドメインは、マウスＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、三量体化ドメインは、マウスＴＲＡＦ２三量体化ドメインである。このマウス由来構築物を用いて、げっ歯類でのインビボ実験を実施することができる。
多量体ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質
前述したＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットは、三量体または六量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に自己組織化することができる。従って、本開示は、前述した６つのポリペプチドサブユニットを含む六量体タンパク質を提供する。実施例に記載する例示的なポリペプチドサブユニットは、本明細書で「ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質」と称される六量体タンパク質に自己組織化する。特に注記のない限り、本明細書で使用される用語「ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質」は、ヒトＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を指す。六量体タンパク質ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質に自己組織化するポリペプチドサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されている。それでもなお、当業者は、多数の他の配列も、六量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質について本明細書に記載した基準を満たすことを認識するであろう。
いくつかの態様では、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットはまた、３つのポリペプチドサブユニットを含む三量体タンパク質に自己組織化することもできる。これは、例えば、Ｆｃドメインが、完全な二量体化を呈示しない場合に起こり得る。
本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化Ｔ細胞、例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、またはこれらの任意の組み合わせからの一次活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、フローサイトメトリーにより測定して、約０．０１ｐＭ〜約１ｐＭ、例えば、約０．１ｐＭ〜約１００ｐＭ、例えば、約１ｐＭ〜約１０ｐＭ、例えば、約１．０ｐＭ〜約８．０ｐＭの結合親和性で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができる。例えば、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に、約０．１ｐＭ、約０．５ｐＭ、約１ｐＭ、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約６ｐＭ、約７ｐＭ、約８ｐＭ、約９ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５００ｐＭ、または約１ｎＭの結合親和性（全て、フローサイトメトリーにより測定）で結合することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に、約３．６ｐＭの結合親和性で結合することができる。結合親和性は、いくつかの異なる方法および／または計器により測定することができ、当業者には十分理解されるように、相対結合親和性は、方法または計器によって変動し得る。
本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、その多価特性を考慮すると、細胞、例えば、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０分子の一部または全部を占有して、それらと架橋することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができ、フローサイトメトリーにより測定して、約０．０１ｐＭ〜約１ｎＭ、例えば、約０．１ｐＭ〜約１００ｐＭ、例えば、約０．５ｐＭ〜約１０ｐＭ、例えば、または約０．５ｐＭ〜約３．０ｐＭ、例えば、約０．５ｐＭ、約０．６ｐＭ、約０．７ｐＭ、約０．８ｐＭ、約０．９ｐＭ、約２ｐＭ、約２ｐＭ、または約３ｐＭの濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に２０％の受容体占有率（ＥＣ20）を達成することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができ、フローサイトメトリーにより測定して、約０．０１ｐＭ〜約１ｎＭ、例えば、約０．１ｐＭ〜約１００ｐＭ、例えば、約０．５ｐＭ〜約１０ｐＭ、例えば、または約３．０ｐＭ〜約１０ｐＭ、例えば、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約６ｐＭ、約７ｐＭ、約８ｐＭ、約９ｐＭ、もしくは約１０ｐＭの濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に５０％の受容体占有率（ＥＣ50）を達成することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができ、フローサイトメトリーにより測定して、約０．１ｐＭ〜約１０ｎＭ、例えば、約１ｐＭ〜約１ｎＭ、例えば、約１０ｐＭ〜約１００ｐＭ、例えば、または約３５ｐＭ〜約７０ｐＭ、例えば、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、もしくは約７０ｐＭの濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に９０％の受容体占有率（ＥＣ90）を達成することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができ、全てフローサイトメトリーにより測定して、約１．８ｐＭの濃度でＥＣ20、約６．６ｐＭの濃度でＥＣ50、ならびに約５３ｐＭの濃度でＥＣ90を達成することができる。
例えば、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約２４ｐＭ、例えば、約１２ｐＭの結合親和性で、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に結合することができ、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０〜約１５ｐＭの濃度でＥＣ20、約１．０〜約４０ｐＭの濃度でＥＣ50、ならびに約１０〜約１００ｐＭの濃度でＥＣ90を達成することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現したヒトＯＸ４０に結合することができ、フローサイトメトリーにより測定して、約７．２ｐＭの濃度でＥＣ20、約１６ｐＭの濃度でＥＣ50、ならびに約５７ｐＭの濃度でＥＣ90を達成することができる。
別の例では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約５０ｐＭ、例えば、約２４ｐＭの結合親和性で、一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるカニクイザルＯＸ４０に結合することができる。別の例では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約５０ｐＭ、例えば、約２１ｐＭの結合親和性で、一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるアカゲザルＯＸ４０に結合することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、プレートアッセイにおいて、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の用量依存的増殖を含み得る。例えば、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を用いたインビトロアッセイにおいて、約１．０ｐＭ〜約１５ｐＭ、例えば、約８．０ｐＭの六量体タンパク質濃度の一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞では、２０％最大増殖応答（ＥＣ20）を達成することができ、約５．０ｐＭ〜約２５ｐＭ、例えば、約１４ｐＭの六量体タンパク質濃度の一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞では、５０％最大増殖応答（ＥＣ50）を達成することができ、また、約５０ｐＭ〜約６５ｐＭ、例えば、約５７ｐＭの六量体タンパク質濃度の一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞では、９０％最大増殖応答（ＥＣ90）を達成することができる（全て、フローサイトメトリーにより測定）。
いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞、例えば、ヒト一次活性化ＣＤ４+Ｔ細胞からの用量依存的サイトカイン放出を誘導することができる。いくつかの態様では、放出されるサイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはこれらの任意の組み合わせを含む。同様に、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞および一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞において、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖およびサイトカイン放出を達成することができる。
別の態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＦｃγＲ発現細胞の存在下でＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＮＦκＢ経路を活性化することができる。例えば、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞において、ＮＦκＢ経路を活性化することができる。あるいは、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＯＸ４０またはアカゲザルＯＸ４０を発現する細胞において、ＮＦκＢ経路を活性化することができる。
また別の態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、癌治療が必要な対象に有効量として投与されると、例えば、腫瘍成長を遅延させる、腫瘍成長を遅滞させる、または存在する腫瘍のサイズを縮小することによって、癌治療を促進することができる。いくつかの態様では、癌治療の促進は、Ｔ細胞の存在下で達成することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、癌治療が必要な対象に有効量として投与されると、アイソタイプが一致する対照分子の投与と比較して、腫瘍成長を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、および少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％阻害することができる。
さらにまた別の態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＯＸ４０との結合を介して、活性化したＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を誘導することができるが、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的にトリガーしない。さらに、いくつかの態様では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＯＸ４０との結合を介して、活性化したＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を誘導することができるが、Ｃｌｑに結合しないか、または活性化ＣＤ４+Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性をトリガーしない。
ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本開示は、さらに、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドも提供する。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号３に表される。いくつかの態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、三量体化ドメインおよびＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインをコードする核酸配列は、５’から３’方向に結合され、例えば、５’から３’方向に隣接して連結される。別の態様では、提供されるポリヌクレオチドは、例えば、分泌シグナルペプチドまたは膜局在化配列をコードするシグナル配列をさらに含んでもよい。サブユニットを含むあらゆるＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体、例えば、六量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドが本開示により提供される。
いくつかの態様では、本開示は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、核酸配列は、配列番号３を含む。本明細書に記載する制御タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、本開示は、ＨｕＩｇＧ−４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５を含む。
ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）もしくはリボデオキシヌクレオチド（ＲＮＡ）配列、またはいずれかのヌクレオチドの修飾形態を含む。この用語は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの単鎖および二本鎖形態を含む。
さらに、１つまたは少数の欠失、付加および／または置換を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。こうした変化は、連続的であってもよいし、または核酸内で異なる位置に分布させてもよい。実質的に同一の核酸配列、例えば、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上のヌクレオチド欠失、付加および／または置換を含有することができる。いくつかの態様では、１つまたは複数の欠失、付加および／または置換は、ポリヌクレオチド配列によりコードされるリーディングフレームを改変しないため、修飾されている（「突然変異体」）が、実質的に同一のポリペプチドが、核酸の発現時に生成される。
アミノ酸（および／または核酸）配列同士の類似性は、配列同士の類似性（あるいは、配列同一性とも呼ばれる）として表現される。配列同一性は、同一性（または類似性）パーセンテージとして測定されることが多く；パーセンテージが高いほど、２つの配列の一次活性化構造も類似している。「同一性パーセント（％）」は、本明細書において、配列をアラインメントし、必要であれば、最大配列同一性パーセントを達成するために、候補および／または選択した配列にギャップを導入した後、保存的アミノ酸置換を配列同一性としてみなさずに、選択した配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
このように、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、配列番号４またはその少なくとも１つのサブ配列に対して、少なくとも約９５％、または少なくとも９６％、多くの場合、少なくとも９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。相同性パーセント（すなわち、配列類似性）または同一性パーセントの決定を目的とするアラインメントは、例えば、公知または専有のアルゴリズムを用いて、当業者の技能範囲内の様々な方法で達成することができる。例えば、配列類似性は、ペアワイズ・アラインメント法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、もしくはＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣｌｕｓｔａｌＷもしくはＴ−Ｃｏｆｆｅｅソフトウェアなどの複数の配列アラインメント法を用いて、決定することができる。当業者は、適切なスコア関数、例えば、ギャップペナルティまたはアラインメントを測定するためのスコアマトリックスを決定することができ、これには、比較する配列の全長にわたって最適なアラインメントクォリティを達成する上で必要なあらゆるアルゴリズムが含まれる。さらに、配列アラインメントは、構造アラインメント法（例えば、二次元もしくは三次元構造情報を用いて、２つ以上の配列をアラインメントする方法）、または配列、構造、および分子系統情報を組み合わせて、候補タンパク質配列を同定し、最適にアラインメントするハイブリッド法を用いて、達成することができる。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）などの複数のソースから、およびインターネットで入手可能である。このプログラムを用いて、配列同一性を決定する方法についての記載は、インターネットのＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。
このように、配列番号４と実質的に同一か、または実質的に類似した核酸配列は、本開示に包含される。配列が、あるヌクレオチドについてヌクレオチド基準により、参照配列（例えば、配列番号４）の少なくともサブ配列と同一であれば、その配列は、配列番号４と実質的に同一である。こうした核酸は、例えば、配列番号４に対して、挿入、欠失、および置換を含み得る。例えば、こうした核酸は、参照核酸配列と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または参照ポリペプチド配列、例えば、配列番号４と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。
さらに、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、核酸の発現または複製を促進するポリヌクレオチド配列、例えば、発現調節配列および／またはベクター配列を含んでもよい。同様に、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドに機能的属性を付与する追加のコード配列を含んでもよい。こうした配列は、分泌シグナル配列および膜局在化シグナルを含む。
ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、慣用の技術により、真核細胞発現ベクターなどのベクターに導入することができる。従って、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。発現ベクターは、ｃＤＮＡの転写を開始および増強すると共に、その適正なスプライシングおよびポリアデニル化を確実にする調節配列を賦与することによって、細胞中のＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写を可能にするように設計される。多数の発現ベクターが当業者には周知であり、市販されているか、または慣用の分子生物学手順に従い個々の成分から組織化することができる。
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択に左右される。多様な発現宿主／ベクター組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとして、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、周知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびこれらの誘導体を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、より広宿主域のプラスミド、例えば、Ｍ１３および繊維状単鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の発現に好適な宿主細胞としては、適切なプロモータの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫または高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌が挙げられる。高等真核生物細胞としては、以下に記載する哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。また、無細胞翻訳系を使用してもよい。抗体生成を含むタンパク質生成方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書および米国特許第６，６６０，５０１号明細書、ならびに国際公開第２００４／００９８２３号パンフレットに記載されており、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む。
また、本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も提供される。有利には、ポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する六量体タンパク質を発現するために、様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系を使用することができる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、こうしたタンパク質が、概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、しかも完全に機能性であることから、実施することができる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＨＥＫ−２９３およびＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）により記載されるサル腎臓細胞のＣＯＳ−７株、ならびに例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株などの他の細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結した好適なプロモータおよびエンハンサー、ならびに他の５’もしくは３’フランキング非転写配列、および５’もしくは３’フランキング非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、およびアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでもよい。昆虫細胞における異種タンパク質の生成のためのバキュロウイルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）により論じられている。
ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のようなタンパク質の発現および精製は、標準的実験技術を用いて実施することができる。こうした方法の例は、論じられているか、または本明細書で参照される。発現の後、精製されたタンパク質は、例えば、機能分析、抗体生成、および診断学、ならびに後述する予防および治療用途を含む多くの用途を有する。例えば、ポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する六量体タンパク質を用いて、予防および／または治療投与に好適なワクチン組成物を含む医薬組成物を生成することができる。
形質転換宿主によって産生されたＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のようなタンパク質は、任意の好適な方法に従い精製することができる。こうした標準的方法として、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のためのいずれか他の標準的技術が挙げられる。適切なアフィニティカラムの通過による容易な精製を可能にするために、ヘキサヒスチジン（配列番号１１）、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティタグをタンパク質に結合することができる。単離したタンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ線結晶学などの技術を用いて物理的に特性決定することもできる。
例えば、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ超濾過ユニットを用いて、培地中に組換えタンパク質を分泌する系からの上清を最初に濃縮することができる。濃縮ステップの後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般に使用されるその他のタイプであってよい。あるいは、カチオン交換ステップを使用することもできる。好適なカチオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、インフルエンザＢ／ヤマガタ（Ｙａｍａｇａｔａ）ウイルス結合分子をさらに精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ担体、例えば、ペンダントメチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用した１つまたは複数の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを使用することができる。均質な組換えタンパク質を提供するために、前述した精製ステップの一部または全部を様々な組み合わせで使用することもできる。
ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、細菌培養で産生されたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、例えば、細胞ペレットからの初回抽出ステップ、続いて、１回または複数回の濃縮ステップ、塩析ステップ、水性イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製ステップのために、使用することができる。組換えタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクルの繰り返し、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用など、任意の慣用の方法により破砕することができる。
医薬組成物および投与方法
例えば、癌患者における免疫応答を増強するために、例えば、腫瘍成長を阻害または縮小するために、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、本明細書に記載のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を調製する方法、ならびにこれを治療が必要な対象に投与する方法は、当業者にはよく知られており、当業者によって容易に決定することができる。本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入または局所であってよい。本明細書で使用される非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。これらの投与形態は全て、好適な形態として明らかに考慮されるが、別の投与形態の例として、特に、静脈内もしくは動脈内注射または滴注がある。通常、好適な医薬組成物は、限定されるものではないが、バッファー（例えば、酢酸、リン酸もしくはクエン酸バッファー）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。本明細書の教示内容に適合可能な別の方法では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、本明細書に記載のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、有害な細胞集団の部位に直接送達され、これによって治療薬に対する患部組織の曝露を増大することができる。
本明細書に記載する特定の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液などの許容される剤形で経口投与することができる。また、特定の医薬組成物は、鼻内エアゾールまたは吸入によって投与することもできる。こうした組成物は、ベンジルアルコールまたはその他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、および／またはその他の慣用の可溶化もしくは分散剤を使用して、食塩溶液として調製することができる。
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の量は、治療する対象および具体的な投与方法に応じて変動し得る。組成物は、単回用量、複数回用量として、または既定期間にわたる注入で投与することができる。また、最適な所望の応答（例えば、治療または予防応答）をもたらすように、投与レジメンを調節することもできる。
「治療に有効な用量もしくは量」または「有効量」とは、治療しようとする疾患または状態を有する患者の治療に関して、投与されると、プラスの治療応答をもたらす本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の量を意味する。
キット
本開示は、さらに、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を含み、本明細書に記載する方法を実施するために用いることができるキットも提供する。いくつかの態様では、キットは、少なくとも１種の本明細書に記載する精製六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を１つまたは複数の容器内に含む。当業者は、本明細書で提供される開示した六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、当分野でよく知られている既定のキットフォーマットの１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識されよう。
免疫アッセイ
本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、当分野で公知の任意の方法により、特異的および／または選択的結合についてアッセイすることができる。用いることができる免疫アッセイとして、いくつか挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、蛍光フォーカスアッセイ（ＦＦＡ）、マイクロ中和アッセイ、血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降反応、免疫核酸アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定、蛍光免疫アッセイなどの技法を用いる競合または非競合アッセイシステムがあるが、これらに限定されるものではない。こうしたアッセイは、当分野ではよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）Ｖｏｌ．１を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ＦＦＡ、マイクロ中和アッセイ、およびＨＡＩは、以下の実施例に詳述する。
本明細書に記載する六量体タンパク質の結合特性の決定に好適な方法および試薬は、当分野では公知であり、および／または市販されている。こうした速度論的分析のために設計された装置およびソフトウェアは市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
免疫増強および治療の方法
抗原活性化中またはその後に、ＯＸ４０を活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に会合させることによる、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）における抗原特異的免疫応答の増強は、非常に多様な方法を用いて達成することができる。選択の方法は、主として、免疫応答を増強することが望まれる抗原の種類に左右され、利用可能な様々な方法については以下に述べる。どのような方法を選択しようと、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、対象、例えば、ヒト患者に投与して、抗原によるＴ細胞の初回感作中またはその直後に、上記タンパク質が対象のＴ細胞に提示されるようにすることができる。本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を用いて、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答を活性化する例示的な方法は、国際公開第２００６／１２１８１０号パンフレットに記載されており、これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の生存または増殖を促進する方法であって、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と、六量体タンパク質が、Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。いくつかの態様では、接触ステップは、インビトロで行う。いくつかの態様では、接触ステップは、インビボで、例えば、治療が必要な対象に対する有効量の六量体タンパク質の投与を介して行う。いくつかの態様では、接触ステップは、Ｔ細胞活性化、例えば、抗原活性化と同時に実施することができ、いくつかの態様では、接触ステップは、Ｔ細胞活性化後に行うことができる。
別の態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供し、ここで、六量体タンパク質は、Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、接触ステップは、インビトロで行う。いくつかの態様では、接触ステップは、インビボで、例えば、治療が必要な対象に対する有効量の六量体タンパク質の投与を介して行う。いくつかの態様では、接触ステップは、Ｔ細胞活性化、例えば、抗原活性化と同時に実施することができ、いくつかの態様では、接触ステップは、Ｔ細胞活性化後に行うことができる。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。
いくつかの態様では、活性化Ｔ細胞、例えば、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示は、Ｔ細胞活性化を促進する方法であって、Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供し、ここで、六量体タンパク質は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。いくつかの態様では、接触ステップは、抗原、例えば、腫瘍抗原の存在下で行う。いくつかの態様では、上記方法はさらに、ＩｇＧ４−Ｆｃドメインと、ＦｃγＲを発現する細胞、例えば、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄もしくは形質細胞様樹状細胞、濾胞性樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞、好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、原発性ヒト腫瘍または腫瘍流入領域もしくは非流入領域リンパ節由来のＣＤ４５+細胞、その他の二次元もしくは三次元リンパ系構造由来のＣＤ４５+細胞、またはこれらの組み合わせとの相互作用を介した六量体タンパク質の架橋ステップも含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激によって測定することができる。いくつかの態様では、接触ステップは、インビトロで行う。いくつかの態様では、接触ステップは、インビボで、例えば、治療が必要な対象に対する有効量の六量体タンパク質の投与を介して行う。
本開示はさらに、Ｔ細胞でのＩＣＯＳまたはプログラム細胞死タンパク質（ＰＤ−１）の発現を誘導する方法であって、Ｔ細胞を本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と接触させるステップを含む方法も提供し、ここで、六量体タンパク質は、Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる。
本開示はさらに、対象における癌を治療する方法であって、治療が必要な対象に、有効量の本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、または六量体タンパク質を含有する組成物もしくは製剤を投与するステップを含む方法も提供する。いくつかの態様では、癌は、固形腫瘍である。この方法によれば、六量体タンパク質または組成物の投与によって、腫瘍成長を阻害することができ；腫瘍縮小を促進することができるか、またはその両方が可能である。いくつかの態様では、腫瘍成長の阻害は、Ｔ細胞の存在下で達成される。
「癌」、「腫瘍」、「癌性」、および「悪性」という用語は、典型的に、制御されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそのような状態を表す。癌の例として、限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、および白血病などの癌腫が挙げられる。こうした癌のより具体的な例として、以下：扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌およびヘパトームなどの腎臓癌、膀胱癌、乳癌（ホルモン依存性乳癌を含む；例えば、Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４：１０５７−１０６５を参照のこと）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、様々な種類の頭頸部癌（限定されるものではないが、扁平上皮癌など）、ならびに粘液性癌、例えば、粘液性卵巣癌、胆管癌（肝臓）および乳頭型腎癌が挙げられる。
一部の実施形態は、治療が必要な対象における癌を予防または治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、六量体タンパク質、または本明細書に記載のようなポリヌクレオチド、ベクター、若しくは宿主細胞を含有する組成物もしくは製剤を対象に投与するステップを含む方法に関する。
癌の治療のための組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例として、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物か、投与される他の医薬品、および治療が防止的か療法的かに応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治療投与量を当業者に公知の定型方法を使用して力価測定して安全性および効力を最適化することができる。
本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻腔、バッカル、経膣または植込リザーバーを介して投与することができる。本明細書において使用される用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。
本開示はさらに、対象における免疫応答を増強する方法であって、治療が必要な対象に、治療に有効な量の本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、または六量体タンパク質を含有する組成物もしくは製剤を投与するステップを含む方法も提供する。
治療しようとする対象は、治療を必要とするいずれかの動物、例えば、哺乳動物であってよく、いくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。
その最も単純な形態では、対象に投与しようとする調製物は、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質であり、これは、慣用の剤形で、また、一部の態様では、本明細書の他所に記載する製剤用賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて、投与される。
本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、本明細書の他所に記載する任意の好適な方法によって、例えば、ＩＶ注入を介して投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、腫瘍中に、または腫瘍細胞の近傍に導入することができる。
あらゆる種類の腫瘍が、このアプローチによる治療を受ける可能性を有し、こうした腫瘍として、限定されるものではないが、乳房、肺、膵臓、卵巣、腎臓、結腸および膀胱の癌腫、ならびに黒色腫、肉腫およびリンパ腫が挙げられる。
本開示は、別に記載のない限り、当業者の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用の技術を使用する。こうした技術は、文献に十分に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）。
抗体改変の一般原理は、以下：Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。タンパク質改変の一般原理は、以下：Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は、以下の文献に記載されている：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；およびＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）。さらに、当分野において公知であり、詳細に記載していない免疫学の標準的方法は、概して、以下の文献に記載のように実施する：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）ならびにＭｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）。
免疫学の一般原理を記載する標準的参照文献には、以下のものが含まれる：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４ｔｈ ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ ＆ Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。
上に引用した参照文献の全て、ならびに本明細書で引用する全ての参照文献は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
以下の実施例は、例示として提供されるのであって、限定を意図するものではない。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
Figure 2017519494
＜実施例１：ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のエンジニアリング＞
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、３つの異なるドメイン（図１）：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、ＴＲＡＦ２のイソロイシンジッパー、およびヒトＯＸ４０の受容体結合ドメインから構成される、遺伝子エンジニアリングされたヒトＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）六量体タンパク質である。Ｎ末端Ｆｃは、ヒンジ領域（ＨＣ）と、ヒト免疫グロブリンドメインＧ４（ＩｇＧ４）のγ重鎖定常ドメイン２および３（ＣＨ２、ＣＨ３）から構成される。コアヒンジ領域は、２２８位（ＥＵ番号付与に従う）にセリンからプロリンへの突然変異を含有し、これは、完全な重鎖内ジスルフィド結合形成を付与する。ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ヒト腫瘍壊死因子２（ＴＲＡＦ２）のアミノ酸残基３１０〜３４９から得られるイソロイシンジッパー三量体化ドメインに直接融合している。ＴＲＡＦ２のｃ末端には、ヒトＯＸ４０Ｌ（遺伝子名：ＴＮＦＳＦ４）の細胞外受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が融合している。ＴＲＡＦ２ドメインは、ＯＸ４０Ｌ ＲＢＤのホモ三量体構造を安定化して、ＯＸ４０結合および活性化を可能にするのに対し、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、血清安定性、ＯＸ４０Ｌ三量体の二量体化を付与して、六量体タンパク質のＦｃγ受容体クラスター形成を促進する。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、２つの個別のＤＮＡ断片を融合した後、融合ＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、これにより、ｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌと呼ばれる完全な融合タンパク質をコードする単一の遺伝子を作製することによって、遺伝子エンジニアリングした。部位指定突然変異誘発によりＩｇＧ４ ＤＮＡ配列に事前に導入しておいたＳ２２８Ｐ ＩｇＧ４Ｐ突然変異を含有する所内プラスミドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で鋳型として使用することにより、ＩｇＧ４Ｐ Ｆｃ ＤＮＡ断片を作製した。ＴＲＡＦ２およびＯＸ４０Ｌ ＲＢＤの融合物をコードするＤＮＡ配列を含有する個別の所内プラスミドをＰＣＲ鋳型として使用して、第２ＤＮＡ断片を作製した。後者の断片をオーバーラップ・エクステンションＰＣＲによってＩｇＧ４Ｐ Ｆｃ断片で組み換えることによって、完全長融合タンパク質をコードする単一ＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、５’ＢｓｓＨＩＩ制限部位および３’ＮｈｅＩ制限部位を導入して、完全長断片を所内ｐＯＥプラスミド発現ベクターに消化、結合、およびクローニングするように設計した。挿入片のヌクレオチド配列は、下記のヌクレオチド配列（配列番号３）を含み、この構築物からの発現産物（ｈｕＩｇＧＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌとも呼ばれる）は、次のアミノ酸配列（配列番号４）を含む：
配列番号３：ｈｕＩｇＧ４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０ＬのＤＮＡ配列（５’から３’方向のオープンリーディングフレーム）
Figure 2017519494
 配列番号４：ｈｕＩｇＧ４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列（ＮからＣ末端）
Figure 2017519494
ＩｇＧ４−Ｆｃドメインは、下線で示すＳ２２８Ｐ突然変異と一緒に通常の書体で示し、ＴＲＡＦ２三量体化ドメインは、下線で示し、ＯＸ４０ＬのＲＢＤは、太字で表示する。
この構築物に加えて、ＯＸ４０Ｌの１８０位に対応するアミノ酸で、フェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）への突然変異をコードするバリアント（Ｆ１８０Ａ）も生成した。この突然変異は、ＯＸ４０Ｌタンパク質のＯＸ４０受容体結合活性を除去するため、こうして得られる分子は、融合タンパク質の特異的活性を確認するための実験対照として役立つ。このバリアントは、１８０位のアラニンをコードするプライマーと、鋳型として融合タンパク質をコードするプラスミドを用いた部位指定突然変異誘発により作製した。挿入片のヌクレオチド配列は、下記ヌクレオチド配列（配列番号５）を含み、この構築物からの発現産物（ｈｕＩｇＧＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａとも呼ばれる）は、次のアミノ酸配列（配列番号６）を含む：
ｈｕＩｇＧ４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０ＡのＤＮＡ配列（５’から３’方向のオープンリーディングフレーム）
Figure 2017519494
 ｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａのアミノ酸配列（ＮからＣ末端方向）
Figure 2017519494
ＩｇＧ４−Ｆｃドメインは、下線で示すＳ２２８Ｐ突然変異と一緒に通常の書体で示し、ＴＲＡＦ２三量体化ドメインは、下線で示し、ＯＸ４０ＬのＲＢＤは、太字で表示し、Ｆ１８０Ａ突然変異は、二重下線で示す。
ｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０ＬおよびｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａ構築物は、図２にグラフを用いて表す。
ＩｇＧ４Ｐ ＦｃドメインをヒトＩｇＧ１ドメインで置換した第３バリアント、ｈｕＩｇＧ１ＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌも構築した。オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを使用するのではなく、この構築物は、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で設計して、遺伝子合成により調製した（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。前述したように、合成遺伝子断片は、消化および連結のためのＢｓｓＨＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位をｐＯＥプラスミド発現ベクターに導入するためのＰＣＲ鋳型として使用した。挿入片のヌクレオチド配列は、下記ヌクレオチド配列（配列番号７）を含み、この構築物からの発現産物（ｈｕＩｇＧＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａとも呼ばれる）は、次のアミノ酸配列（配列番号８）を含む：
配列番号７：ｈｕＩｇＧ１ＴＦ２ＯＸ４０ＬのＤＮＡ配列（５’から３’方向のオープンリーディングフレーム）
Figure 2017519494
 配列番号８：ｈｕＩｇＧ１ＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列（ＮからＣ末端）
Figure 2017519494
ＩｇＧ１−Ｆｃドメインは、通常の書体で示し、ＴＲＡＦ２三量体化ドメインは、下線で示し、ＯＸ４０ＬのＲＢＤは、太字で表示する。
融合タンパク質をコードする、作製したｐＯＥプラスミドを、一過性発現のためにＨＥＫ−２３９細胞にトランスフェクトした後、プロテインＡクロマトグラフィーおよびゲル濾過により、可溶性融合タンパク質を培地から精製した。精製した融合タンパク質は、均質時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）エピトープ競合アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ，カタログ番号６２Ｃ１６ＰＡＥ）を用いた生化学特性決定に付した。ＨＴＲＦ競合アッセイを実施して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する、Ｖ１５８抗親和性バリアントに対するｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌの結合活性を評価した。このアッセイでは、ＦｃγＲＩＩＩａおよびγ鎖をＨＥＫ−２３９細胞で共発現させて、ＳＮＡＰ−テブリウムドナー色素で標識した。０．１〜１μＭの濃度のｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌタンパク質の調製物を標識細胞に添加した後、アクセプター色素標識ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ−ｄ２）を添加した。ＩｇＧ−ｄ２は、標識ＦｃγＲＩＩＩａに結合して、測定可能なＦＲＥＴシグナルをトリガーした。ｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０ＬによるＩｇＧ−ｄ２結合の競合は、ＦＲＥＴを阻害し、この負のシグナルは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する融合タンパク質の結合親和性に反比例する。ｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌは、５００ｎＭの半数最大応答（ＥＣ５０）で、ＦｃγＲＩＩＩａに結合した。比較して、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体は、２２０ｎＭのＥＣ５０で結合し、これは、融合タンパク質が、典型的なＩｇＧ１抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対し、約２．３倍低下した親和性を有することを示している。また、ｈｕＩｇＧ１ＦｃＴＦ２ＯＸ４０ＬバリアントもＨＴＲＦアッセイで試験したところ、これは、４ｎＭのＥＣ５０、すなわち、ＩｇＧ１抗体と比して約５５倍高い親和性で、ＦｃγＲＩＩＩａに結合した。
＜実施例２：活性化ヒト、非ヒト霊長類、ラットおよびマウスＴ細胞の表面に発現されるネイティブＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合親和性および受容体占有率＞
この実施例では、細胞を用いた平衡結合アッセイを実施して、ヒト、非ヒト霊長類、ラットおよびマウスＴ細胞の細胞表面に発現されるＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合の見掛け親和性を測定した。さらに、平衡結合アッセイを実施して、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のどの濃度が、２０％、５０％、または９０％ヒトＯＸ４０受容体占有率を達成したか（ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90）を決定した。
一次活性化ヒトＣＤ４ + Ｔ細胞およびＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合
ヒトＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合についての平衡結合定数（Ｋd）と、平衡状態で２０％、５０％、もしくは９０％のヒトＯＸ４０受容体に結合する濃度（ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90）を、ＯＸ４０発現活性化一次ヒトＣＤ４+Ｔ細胞またはＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合曲線から計算した。
活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に対する結合について、次のプロトコルに従い、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍより、健常なドナーから取得したナトリウムヘパリン抗凝固全血からＣＤ４+Ｔ細胞を最初に単離した：
１．１ｍＬのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４+Ｔ細胞単離キット抗体ミックスを全血２０ｍＬ毎に添加して、混合した後、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。
２．無菌の室温ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％熱不活性化新生仔ウシ血清、ｐＨ７．２）で血液を１：１希釈してから、ＤＭ−Ｌ培地上に重ねた後、卓上型遠心機において３８０ｇ（１２００ｒｐｍ）で断続的に２０分間遠心分離した。
３．遠心分離後、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を含有するバフィーコートを１０ｍＬピペットで取り出し、細胞をＲＴ ＦＡＣＳバッファーで１回、続いてＲＴ完全ＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。
４．細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターで計数して、細胞数および生存率を決定した後、ＣＤ４+Ｔ細胞をｍｌ当たり１．０×１０6の濃度で完全ＲＰＭＩ培地に懸濁させた。
一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞（完全ＲＰＭＩ培地中、ｍｌ当たり１．０×１０6）を、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌおよび２０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬの存在下、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ中で培養して、Ｔ細胞を活性化すると共に、ＯＸ４０を上方制御した。次に、これらの細胞をＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合実験に使用した。以下の表および図面に記載するドナーは全て、個別の個体を示すものであり；すなわち、ＣＤ４+Ｔ細胞は、反復結合実験について同じドナーから単離したものではなかった。
結合実験の前に、しかし、活性化なしで、ヒトＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼクローン６４細胞を培養した。
続いて、結合実験のための細胞を遠心分離（ＲＴ、３８０ｇで５分）により収集し、ＦＡＣＳバッファー中で懸濁させた後、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＶｉＣｅｌｌカウンターで計数して、細胞生存率を決定した。次いで、＞９５％生存率と判定された細胞を、ＦＡＣＳバッファー中ｍＬ当たり１．０×１０6細胞まで希釈した後、結合アッセイのために使用した。次に、結合アッセイのために、１００μＬの生存細胞（１００，０００）を非ＴＣ処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加した。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を細胞に結合させるために、薬物を４℃のＦＡＣＳバッファー中１μｇ／ｍＬに希釈してから、１５ポイント希釈系列にわたって３倍希釈した。希釈後、９６ウェルプレートに添加した細胞を３８０ｇでスピンすることにより、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳバッファーを除去した。次に、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーを細胞に添加してから、４℃で１時間インキュベートした。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のインキュベーション後、４℃のＦＡＣＳバッファーで、洗浄毎に２００μＬを用いて、細胞を３回洗浄した。次に、２５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ヤギ抗ヒト二次抗体および１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーと一緒に、細胞を４℃で３０分暗所にてインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を４℃のＦＡＣＳバッファー（洗浄毎に２００μＬ）で２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータでのフローサイトメトリー分析のために１００μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁させた。補正のために、１０μｇ／ｍＬの抗体に結合したＯＸ４０発現細胞（ＰＩなし）、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識Ａｂ試薬だけに結合した細胞、または０．１％サポニンで透過処理し、且つ１μｇ／ｍＬのＰＩで処理した細胞を含有するウェルを単一染色補正対照として調製した。バックグラウンド除去のために、一次抗体の非存在下で、二次抗体を含有する細胞も前述したように調製した。Ｆ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧＰ対照を初期実験のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と同じ濃度で使用して、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合が、活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合により特異的に媒介されることを立証した。この突然変異対照タンパク質は、ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻止するが、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の全体的構造には影響を与えない、１８０位の単一アミノ酸突然変異（ＦからＡへのアミノ酸変化）を有するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を代表するものであり；これは、ネイティブＯＸ４０には結合しないことから、活性化Ｔ細胞上の受容体占有が、ＯＸ４０Ｌ：ＯＸ４０相互作用により特異的に媒介されることを明らかにする。
細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質の結合の分析のために、Ｆｌｏｗ Ｊｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用した。補正マトリックスを規定するための補正制御を用いた蛍光補正の後、生存（ＰＩ陰性）細胞をゲーティングして、二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合のＭＦＩをタンパク質濃度（Ｍ）に対してプロットすることにより、結合曲線を決定した後、見掛け平衡解離結合定数（Ｋd）ならびに２０、５０および９０％の受容体占有率を示す濃度（それぞれ、ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90）を、それぞれ、単一部位（双曲線）非線形回帰方程式を用いたＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ、およびＳ字状用量−応答曲線（可変勾配）用いたＥＣｆ計算によって決定した。一次ヒトＣＤ４Ｔ細胞を用いて得られた見掛けＫｄならびにＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値と、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて得られたものを比較する両側スチューデントＴ検定から決定したＰ値（もしあれば）を要約表に示す。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、３．６±４．３ｐＭの平均Ｋd、ならびにそれぞれ１．８±１．１、６．６±２．８、および５３±１７ｐＭの受容体占有率値のＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90で、活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に結合した（表２−１および図３Ａ）。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、１２±１２ｐＭの平均Ｋd、ならびにそれぞれ７．２±８．８、１６±１６、および５７±４６ｐＭの受容体占有率値のＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90で、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に結合した（表２−２および図３Ｂ）。表２−３に示すように、ＯＸ４０発現活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞とＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ細胞との間には、結合親和性または受容体占有率値の統計学差は計算されなかった。
Figure 2017519494
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マウスＣＤ４ + Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合
ＯＸ４０発現活性化一次活性化マウスＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、マウスＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合を調べた。マウスＣＤ４+Ｔ細胞は、採取された正常Ｂａｌｂ／Ｃマウス脾臓から、次のプロトコルに従い単離した：
１．滅菌３ｍＬシリンジの後部を備えた７０μＭナイロンフィルタを介して脾臓をすりつぶすことにより、脾細胞を放出させた後、フィルタを１ｍＬの完全培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％抗生物質／抗真菌溶液、および５５μＭβメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有するＲＰＭＩ １６４０）ですすいだ。
２．脾細胞を卓上型遠心分離機により３３０×ｇ（１２００ｒｐｍ）で１０分間室温にて遠心分離することにより、細胞をペレット化した。
３．上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬの１×赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファーで処理した後、ＲＴで５分間インキュベートすることにより、ＲＢＣを溶解させた。インキュベーション時間の終了時の浸透圧を回復するために、４５ｍＬの完全培地を混合物に添加した。
４．細胞を３３０×ｇで１０分間遠心分離機によりペレット化した後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ｐＨ７．２＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））で２回洗浄した。
５．上清を廃棄し、細胞ペレットを低温ＭＡＣＳバッファーに懸濁させてから、ＶｉＣｅｌｌカウンターで計数することにより、細胞数および生存率を決定した。
６．マウスＣＤ４+Ｔ細胞単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉプロセスキットを用いて、製造者の指示に従い実施した。次に、ＣＤ４+陽性Ｔ細胞を完全培地に１．５×１０6で懸濁させた。
マウスＣＤ４+Ｔ細胞（１００μＬの完全培地中ウェル当たり１５０，０００）を、２μｇ／ｍＬのハムスター抗マウスＣＤ３およびハムスター抗マウスＣＤ２８抗体でコーティングした９６ウェル中で培養することにより、Ｔ細胞を活性化し、ＯＸ４０発現を誘導してから、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ中で一晩インキュベートした。活性化ＣＤ４+Ｔ細胞をインキュベーションプレートから除去した後、１００，０００個の細胞を、結合アッセイのために非組織培養処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに移し、細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ ｐＨ７．２）で１回洗浄した。結合は、１０ポイントデータ曲線のためにＦＡＣＳバッファーで連続的に３倍希釈した１μｇ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質およびラット抗マウスクローンＯＸ８６（正の対照）抗体で実施し、１μｇ／ｍＬのＦ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐ（負の対照）は、３ポイントデータ曲線のために、ディープウェルポリプロピレンプレート中で６倍希釈した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質または抗体を含有する５０μＬのＦＡＣＳバッファーを細胞に２回反復で添加して、４℃で４５分間インキュベートした。一次活性化インキュベーション後、洗浄毎に２００μＬの低温（４℃）ＦＡＣＳバッファーで、細胞を２回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒト二次抗体またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ラット二次抗体および５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する５０μＬのＦＡＣＳバッファーと一緒に、細胞を４℃で３０分間暗所にてインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を４℃のＦＡＣＳバッファー（洗浄毎に２００μＬ）で２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータでのフローサイトメトリー分析のために１００μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁させた。ＯＸ４０発現細胞（ＰＩなし）、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体試薬だけに結合した細胞、または０．１％サポニンで透過処理し、且つ１０μｇ／ｍＬのＰＩで処理した細胞を含有するウェルを単一染色補正対照として調製した。
細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質の結合を決定するために、Ｆｌｏｗ Ｊｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用した。補正制御を用いて、補正マトリックスを規定した後、生存（ＰＩ陰性）細胞をゲーティングして、二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合のＭＦＩをタンパク質濃度（ｎＭ）に対してプロットすることにより、結合曲線を決定した後、見掛け平衡解離結合定数（Ｋd）を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用し、また、単一部位（双曲線）非線形回帰方程式を用いて決定した。
活性化マウスＣＤ４+Ｔ細胞についての結合アッセイ結果を図４Ａに示す。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、活性化マウスＣＤ４+Ｔ細胞に結合しない。
ラットＣＤ４ + Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合
ＯＸ４０発現活性化一次活性化ラットＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、ラットＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合を調べた。ラットＣＤ４+細胞は、採取された正常スプラーグ・ドーリィ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット脾臓から、次のプロトコルに従い単離した：
１．滅菌３ｍＬシリンジの後部を備えた７０μＭナイロンフィルタを介して脾臓をすりつぶすことにより、脾細胞を放出させた後、フィルタを完全培地（１０％ＦＢＳ、１％抗生物質／抗真菌溶液、および５５μＭ ＢＭＥを含有するＲＰＭＩ １６４０）ですすいだ。
２．脾細胞を卓上型遠心分離機により３３０×ｇ（１２００ｒｐｍ）で１０分間ＲＴにて遠心分離することにより、細胞をペレット化した。
３．上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬの１×ＲＢＣ溶解バッファーで処理した後、ＲＴで５分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に溶解を停止させるために、４５ｍＬの完全培地を混合物に添加した。
４．細胞を３３０×ｇで１０分間遠心分離機によりペレット化した後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ｐＨ７．２＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。
５．上清を廃棄し、細胞ペレットを低温ＭＡＣＳバッファーに懸濁させてから、ＶｉＣｅｌｌカウンターで計数することにより、細胞数および生存率を決定した。
６．ラットＣＤ４+Ｔ細胞単離は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｇｃｅｌｅｃｔキットを用いて、製造者の指示に従い実施した。次に、ＣＤ４+陽性Ｔ細胞を完全培地に１．５×１０6で懸濁させた。
ラットＣＤ４+Ｔ細胞（完全培地ｍＬ当たり１×１０6）を、１μｇ／ｍＬのコンコナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）および５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴ７５細胞培養フラスコ中で培養することにより、Ｔ細胞を活性化し、ＯＸ４０発現を誘導してから、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ中で一晩インキュベートした。活性化ＣＤ４+Ｔ細胞をフラスコから除去した後、１００，０００個の細胞を、結合アッセイのために非組織培養処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに移し、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。結合は、１０ポイントデータ曲線のためにＦＡＣＳバッファーで連続的に３倍希釈した１０μｇ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質およびマウス抗ラットクローンＯＸ４０（正の対照）と、３ポイントデータ曲線のためにディープウェルポリプロピレンプレート中で連続的に６倍希釈した１０μｇ／ｍＬのＦ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐ（負の対照）を用いて実施した。１００μＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、対照タンパク質、または抗体を細胞に２回反復で添加して、４℃で１時間インキュベートした。一次活性化インキュベーション後、洗浄毎に２００μＬの低温（４℃）ＦＡＣＳバッファーで、細胞を２回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒトまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ラット二次抗体および５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーと一緒に、細胞を４℃で３０分間暗所にてインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を４℃のＦＡＣＳバッファー（洗浄毎に２００μＬ）で２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータでのフローサイトメトリー分析のために１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。ＯＸ４０発現細胞（ＰＩなし）、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体試薬だけに結合した細胞、または０．１％サポニンで透過処理し、且つ１０μｇ／ｍＬのＰＩで処理した細胞を含有するウェルを単一染色補正制御のために調製した。
細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質の結合を決定するために、Ｆｌｏｗ Ｊｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用した。補正制御を用いて、補正マトリックスを規定した後、生存（ＰＩ陰性）細胞をゲーティングして、二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合のＭＦＩをタンパク質濃度（ｎＭ）に対してプロットすることにより、結合曲線を決定した後、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、また、単一部位（双曲線）非線形回帰方程式を用いて、見掛け平衡解離結合定数（Ｋd）を決定した。
活性化ラットＣＤ４+Ｔ細胞についての結合アッセイ結果を図４Ｂに示す。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、活性化ラットＣＤ４+Ｔ細胞に結合しない。
カニクイザルＣＤ４ + Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合
カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合についての平衡結合定数（Ｋd）を、ＯＸ４０発現活性化一次活性化ｃｙｎｏ ＣＤ４+Ｔ細胞を用いて決定した。ｃｙｎｏ ＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｍｉａｍ，ＦＬ）からの健常なｃｙｎｏドナー（Ｎ＝２）から取得したナトリウムヘパリン抗凝固全血から、次のプロトコルに従い単離した：
１．（アッセイ１）５２．８ ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ、１．２ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、６ｍＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．２および４０ｍＬの１×ＰＢＳ ｐＨ ７．２を組み合わせることによって、６０％Ｐｅｒｃｏｌｌを調製した後、１０ｍＬの全血を５０ｍｌ遠心分離用コニカルチューブ中の３０ｍＬの６０％Ｐｅｒｃｏｌｌ上に重ねた。（アッセイ２）１５ｍＬのＰＢＳを８５ｍＬのＬＳＭにＲＴで添加することにより、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）を８５％に希釈した後、２０ｍＬの全血を１５ｍＬの８５％ＬＳＭ上に重ねた。
２．（アッセイ１）ブレーキなしの卓上型遠心分離機により４００×ｇで３０分間ＲＴにて血液を遠心分離した。（アッセイ２）ブレーキなしの卓上型遠心分離機により１１００×ｇで２０分間ＲＴにて血液を遠心分離した。
３．中間期で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集してから、１２００ＲＰＭで１０分間、低温（４℃）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
４．上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬの１×ＲＢＣ溶解バッファーで処理した後、ＲＴで５分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に溶解プロセスを停止させるために、４５ｍＬの完全培地（１０％ＦＢＳと１％抗生物質／抗菌剤を含むＲＰＭＩ）をペレットに添加した。
５．次に、細胞を３３０×ｇで１０分間遠心分離機によりペレット化した後、２０ｍＬの低温（４℃）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
６．上清を廃棄し、細胞ペレットを低温（４℃）ＭＡＣＳバッファーに懸濁させてから、ＶｉＣｅｌｌカウンターで計数することにより、細胞数および生存率を決定した。
７．Ｃｙｎｏ ＣＤ４+Ｔ細胞単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ非ヒト霊長類キットを用いて、製造者の指示に従い実施し、次に、ＣＤ４+陽性Ｔ細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターで計数した後、前述した完全培地にｍＬ当たり１×１０6で懸濁させた。
ｃｙｎｏ ＣＤ４+Ｔ細胞（完全培地中ｍＬ当たり１×１０6）を、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌおよび２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴ７５細胞培養フラスコ中で培養することにより、Ｔ細胞を活性化し、ＯＸ４０発現を誘導してから、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ中で４８時間攪拌した。活性化ＣＤ４+Ｔ細胞をフラスコから除去した後、１００，０００個の細胞を、結合アッセイのために非組織培養処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに移し、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。結合は、１０ポイントデータ曲線のためにＦＡＣＳバッファーで連続的に３倍希釈した１μｇ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と、３ポイントデータ曲線のためにディープウェルポリプロピレンプレート中で連続的に８倍希釈した１μｇ／ｍＬのＦ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐ（負の対照）を用いて実施した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質または対照タンパク質を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーを細胞に２回反復で添加して、４℃で１時間インキュベートした。一次活性化インキュベーション後、細胞を洗浄毎に２００μＬの低温（４℃）ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒト二次抗体および５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーと一緒に、細胞を４℃で３０分間暗所にてインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を４℃のＦＡＣＳバッファー（洗浄毎に２００μＬ）で２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータでのフローサイトメトリー分析のために１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。ＯＸ４０発現細胞（ＰＩなし）、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体試薬だけに結合した細胞、または０．１％サポニンで透過処理し、且つ１０μｇ／ｍＬのＰＩで処理した細胞を含有するウェルを単一染色補正対照として調製した。
細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質の結合を決定するために、Ｆｌｏｗ Ｊｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用した。補正制御を用いて、補正マトリックスを規定した後、生存（ＰＩ陰性）細胞をゲーティングして、二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合のＭＦＩをタンパク質濃度（ｎＭ）に対してプロットすることにより、結合曲線を決定した後、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、また、単一部位（双曲線）非線形回帰方程式を用いて、見掛け平衡解離結合定数（Ｋd）を決定した。
ＯＸ４０発現活性化一次活性化ｃｙｎｏ ＣＤ４+Ｔ細胞を用いた結合アッセイ（Ｎ＝２）の結果を表２−４および図４Ｃに示す。平衡解離定数（Ｋd）の計算から、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、活性化ｃｙｎｏ ＣＤ４+Ｔ細胞に、２４．２±３１．４ｐＭの平均Ｋdで結合することが判明した。ｃｙｎｏＫdおよびヒトＫd測定値間の比は７倍である、
Figure 2017519494
アカゲザルＣＤ４ + Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合
アカゲザルＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合についての平衡結合定数（Ｋd）を、ＯＸ４０発現活性化一次活性化アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＣＤ４+Ｔ細胞を用いて決定した。アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｍｉａｍ，ＦＬ）からの健常なアカゲザルドナー（Ｎ＝２）から取得したナトリウムヘパリン抗凝固全血から、次のプロトコルに従い単離した：
１．５ｍＬのＰＢＳを９５ｍＬのＬＳＭにＲＴで添加することにより、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）を９５％に希釈した。
２．ヘパリン処理したｒｈｅｓｕｓ血液をＲＴにてＰＢＳで１：１に希釈した後、２０ｍＬの希釈全血を５０ｍｌ遠心分離用コニカルチューブ中の１５ｍｌの９５％ＬＳＭ上に重ねた。
３．ブレーキなしの卓上型遠心分離機により４００×ｇで３０分間ＲＴにて血液を遠心分離した。
４．中間期で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集してから、１２００ＲＰＭで１０分間、低温Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
５．上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬの１×ＲＢＣ溶解バッファーで処理した後、ＲＴで５分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に溶解プロセスを停止させるために、４５ｍＬの完全培地（１０％ＦＢＳと１％抗生物質／抗菌剤を含むＲＰＭＩ）をペレットに添加した。
６．次に、細胞を３３０×ｇで１０分間遠心分離機によりペレット化した後、２０ｍＬの低温Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
７．上清を廃棄し、細胞ペレットを低温（４℃）ＭＡＣＳバッファーに懸濁させてから、ＶｉＣｅｌｌカウンターで計数することにより、細胞数および生存率を決定した。
８．アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ非ヒト霊長類キットを用いて、製造者の指示に従い実施し、次に、ＣＤ４+陽性Ｔ細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターで計数した後、前述した完全培地中にｍＬ当たり１×１０6で再懸濁させた。
アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞（完全培地中ｍＬ当たり１×１０6）を、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌおよび２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴ７５細胞培養フラスコ中で培養することにより、Ｔ細胞を活性化し、ＯＸ４０発現を誘導してから、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ中で４８時間攪拌した。活性化ＣＤ４+Ｔ細胞をフラスコから除去した後、１００，０００個の細胞を、結合アッセイのために非組織培養処理９６ウェル丸底プレートの各ウェルに移し、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。結合は、１０ポイント（アッセイ１）または１２ポイントデータ曲線（アッセイ２）のために、ディープウェルポリプロピレンプレートにおいて、ＦＡＣＳバッファーで連続的に３倍希釈した１μｇ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を用いて実施し、１μｇ／ｍＬのＦ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐ（負の対照）は、２データポイントのために６倍希釈した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質または対照タンパク質を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーを細胞に２回反復で添加して、４℃で１時間インキュベートした。一次活性化インキュベーション後、洗浄毎に２００μＬの低温（４℃）ＦＡＣＳバッファーで、細胞を２回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗ヒトまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体および５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーと一緒に、細胞を４℃で３０分間暗所にてインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、４℃のＦＡＣＳバッファー（洗浄毎に２００μＬ）で細胞を２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータでのフローサイトメトリー分析のために１００μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁させた。ＯＸ４０発現細胞（ＰＩなし）、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識Ａｂ試薬だけに結合した細胞、または０．１％サポニンで透過処理し、且つ１０μｇ／ｍＬのＰＩで処理した細胞を含有するウェルを、単一染色補正対照として調製した。
細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質および対照タンパク質の結合を決定するために、Ｆｌｏｗ Ｊｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用した。補正制御を用いて、補正マトリックスを規定した後、生存（ＰＩ陰性）細胞をゲーティングして、二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合のＭＦＩをタンパク質濃度（ｎＭ）に対してプロットすることにより、結合曲線を決定した後、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、また、単一部位（双曲線）非線形回帰方程式を用いて、見掛け平衡解離結合定数（Ｋd）を決定した。
ＯＸ４０発現活性化一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞（Ｎ＝２）を用いた結合アッセイの結果を表２−５および図４Ｄに示す。平衡解離定数（Ｋd）の計算から、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞に、２０．６５±２２．５６ｐＭで結合することが判明した。ｃｙｎｏＫdおよびヒトＫd測定値間の比は６倍である。
Figure 2017519494
統計的方法
ヒト、マウス、ラット、カニクイザル、アカゲザルＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質結合の見掛け解離平衡結合定数（Ｋd）を決定するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍを用いて、１つの部位結合（双曲線）について非線形回帰（曲線当てはめ）方程式を使用した。
２０％、５０％、および９０％のＯＸ４０受容体が抗体によって占有される濃度を決定するために、まず、方程式Ｘ＝ｌｏｇ［Ｘ］を用いて、濃度値（Ｍ）を変換した後、ＥＣ Ａｎｙｔｈｉｎｇ（ＥＣｆ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いたＳ字状用量−応答（変動勾配濃度−ＭＦＩ）結合曲線から、ｆ＝２０、ｆ＝５０およびｆ＝９０について決定した。ＥＣｆは、最小値から最大値までの間の応答ｆパーセントを与えるアゴニストの濃度であり、この場合、それぞれ２０、５０、または９０に設定されたとき、２０、５０、および９０％受容体占有率を表し、ここで、計算された曲線の最大値は、１００％受容体占有率を示す。
一次活性化ヒトＴ細胞またはＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔからの結合アッセイから決定された見掛けＫd値または見掛けＥＣ20、ＥＣ50もしくはＥＣ90値の間の統計的有意性を決定するために、９５％信頼レベルを有する両側独立スチューデント検定、ならびに様々な標準偏差を有するデータセット計算に入れるウェルチの補正をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで使用した。
データセットから得られた有意なｐ値（もしあれば）は、要約表および図面において、記述的統計学（すなわち、平均値および標準偏差）に隣接して表示する。
この試験で使用した材料を表２−６に掲載する。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
結論
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞表面に発現されたＯＸ４０に、ヒトの場合、３．６ｐＭ、カニクイザルの場合、２４ｐＭ、またアカゲザルの場合には、２１ｐＭの見掛けＫdで結合した。ヒト一次活性化Ｔ細胞と比較したカニクイザル、およびヒト一次活性化Ｔ細胞と比較したアカゲザルの細胞表面のＯＸ４０に結合したＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質について得られた平均Ｋd値の比は、それぞれ、７および６と算出された。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ラットまたはマウスＴ細胞の細胞表面に発現されたＯＸ４０に結合しなかった。さらに、平衡状態で２０％、５０％、または９０％ヒトＯＸ４０受容体占有率（ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90）を達成するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質濃度は、それぞれ１．８ｐＭ、６．６ｐＭおよび５３ｐＭであると算出された。
＜実施例３：細胞の表面に発現された関連ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーと比較したＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のＯＸ４０に対する結合特異性の決定＞
この実施例では、ＯＸ４０に対して高い配列同一性を有するＴＮＦＲスーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーの発現を指令するｃＤＮＡ構築物で一時的にトランスフェクトしたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を用いたフローサイトメトリーによる細胞結合アッセイで、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の特異性を決定した。
方法
ヒトＯＸ４０に対して高度配列相同性を有するタンパク質の検索
ヒトＯＸ４０に対して高度アミノ酸配列同一性を有するヒトタンパク質を同定するために、ＯＸ４０のタンパク質配列を用いて、配列同一性検索を実施した。ＵｎｉＰｒｏｔウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を検索に用いて、ヒトＯＸ４０と、同定されたヒトタンパク質との間のアミノ酸同一性のパーセンテージを決定した（表３−１）。
Figure 2017519494
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合特異性
哺乳動物細胞にトランスフェクトされると、個々のＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を指令することができるｃＤＮＡ構造を、Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。これらのｃＤＮＡ構築物は、一過性トランスフェクションで使用するために、メリーランド州ゲイザーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）にあるＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｇｒｏｕｐによって、増幅および精製された。ＴＮＦＲＳＦメンバーの各々の発現のために、ＴＮＦＲＳＦメンバーの１つをコードする発現ベクターの２．５μｇのＤＮＡと組み合わせたリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて、ＨＥＫ２９３細胞を個別にトランスフェクトした；その後、製造者により推奨されるリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００のためのプロトコルを続けた。トランスフェクションから４８時間後、細胞をトリプシン処理により組織培養プレートから取り出して、血清含有完全培地の添加によりトリプシン中和した後、細胞をペレット化し、完全培地で洗浄した。次に、低温ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）に細胞を懸濁させてから、ＴＮＦＲＳＦ特異的ｍＡｂおよびＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質との結合試験のために、９６ウェル非ＴＣ処理プレートにプレーティングした。
抗体への結合のために、セルをペレット化し、ＦＡＣＳバッファーを除去した後、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と、製造者により推奨される量の、トランスフェクトＴＮＦＲＳＦメンバーに特異的な蛍光色素標識ｍＡｂか、または濃度１μｇ／ｍｌのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のいずれかを含有するＦＡＣＳバッファーに細胞を懸濁させた。結合対照として、蛍光色素標識アイソタイプ対照抗体と一緒に細胞を個別にインキュベートした。抗体と一緒に細胞を４℃で１時間暗所にてインキュベートした。その後、蛍光色素標識モノクローナル抗体と一緒にインキュベートした細胞を低温ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄してから、ＬＳＲＩＩフローサイトメータを用いて、フローサイトメトリーによりイベントを分析した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と一緒にインキュベートした細胞を低温ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄してから、２５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体に懸濁させた後、４℃の暗所にてさらに３０分間インキュベートした。結合対照のために、いくつかの細胞は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の非存在下で、しかし、蛍光色素標識二次抗体単独の存在下でインキュベートした。その後、細胞を低温ＦＡＣＳバッファーでさらに２回洗浄してから、ＬＳＲＩＩフローサイトメータでの分析のために、低温ＦＡＣＳバッファーに懸濁させた。
フローサイトメトリー分析のために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、フローサイトメトリー標準（ＦＣＳ）データを調べた。ｍＡｂ結合を分析するために、生存（ＰＩ陰性）細胞について細胞をゲーティングした後、ＭＦＩをイベントの数に対してプロットすることにより、結合ヒストグラムを作成した。また、バックグラウンド（アイソタイプ対照または二次抗体単独）に対する倍率ＭＦＩを決定することができるように、生存細胞の幾何平均強度を各々の結合について決定した。
この試験に使用した材料を表３−２に掲載する。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
ＯＸ４０に関する配列相同性ＢＬＡＳＴ検索によって、ＯＸ４０と１０％以上のアミノ酸配列同一性を共有する１２のヒトＴＮＦＲＳＦタンパク質を同定した。これらのタンパク質および配列同一性のパーセンテージを表３−１に掲載する。
ヒトＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合の特異性を確認するために、ヒトＯＸ４０を発現するようにエンジニアリングされたＪｕｒｋａｔ細胞株、またはヒトＮＧＦＲ、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７もしくはＨＶＥＭを発現した一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合をフローサイトメトリーにより評価した。ＯＸ４０を発現したＪｕｒｋａｔ細胞株に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合は、ＭＦＩにより決定して、二次抗体単独のＭＦＩより１７倍高かった（図５Ａ〜Ｂ）。ヒトＮＧＦＲ、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７およびＨＶＥＭの細胞表面発現は、各々のヒトＴＮＦＲＳＦタンパク質に特異的な市販の抗体を用いて確認し；各ＴＮＦＲＳＦタンパク質についてアイソタイプ対照抗体と比較したＭＦＩの倍率増加を表１２−２に示す。ヒトＮＧＦＲ、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７およびＨＶＥＭを発現したＨＥＫ２９３に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合は、同じ細胞に対する二次抗体単独の結合について認められたものを超えなかった（表３−３、図５Ｃ）。
Figure 2017519494
結論
ヒトＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合は特異的である。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦの高度関連抗体と交差反応性ではない。
＜実施例４：ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のインビトロ生物活性：一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を用いたプレートバイオアッセイ＞
この実施例では、プレートアッセイで一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の生物活性を決定した。ＯＸ４０受容体媒介性共刺激のためのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の用量漸増と共に、ＴＣＲ刺激のためのプレート捕捉準最適抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）モノクローナル抗体上に、活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞をプレーティングした。ＣＤ４+Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン放出を決定して、ＯＸ４０生物活性を測定した。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、ＴＣＲ（共刺激）による活性化と同時に、Ｔ細胞の活性化を増強する能力を決定するために、プレート生物活性アッセイを実施し、Ｔ細胞活性化を評価した。Ｔ細胞共刺激の測定は、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン放出の決定を含んだ。共刺激にＯＸ４０会合が必要であることを証明するために、ＯＸ４０と結合することができないＯＸ４０Ｌ ＥＣＤを含有するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の突然変異形態（Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐ）をＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の代わりに使用した。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のバイオアベイラビリティは、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン放出を活性読み取り値として、プレート薬物捕捉アッセイにおいて、活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を用いて決定した（図６）。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性を測定するために、以下のプロトコルを使用した：
第０日：
・ロイコパック（ｌｅｕｋｏ ｐａｋ）の形態のヒト免疫細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓから入手した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ４+Ｔ細胞濃縮キットを用いて、製造者のプロトコルに従い、ＣＤ４+Ｔ細胞を精製した。
・ＣＤ４+Ｔ細胞を完全ＲＰＭＩ培地に懸濁させてから、細胞濃度をｍｌ当たり１．０×１０6に調節した。ＰＨＡ−Ｌおよび組み換えヒトＩＬ−２を含有する培地をそれぞれ２μｇ／ｍＬおよび２０ＩＵ／ｍＬの最終濃度まで添加し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿組織培養インキュベータにおいて、２日間細胞を培養することにより、Ｔ細胞を活性化させた。
第１日：
・非ＴＣ処理丸底９６ウェルアッセイプレートを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）および２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト（Ｆｃγ特異的）１００μＬでコーティングする
・４℃で一晩インキュベートする
第２日：
・２００μＬのＰＢＳでプレートを洗浄する
・ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）でプレートを３７℃で９０分間ブロックする
・ＰＢＳでプレートを３回洗浄する
・１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で再構成した２ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３を３７℃で９０分かけて添加する
・ＰＢＳでプレートを３回洗浄する
・（１μｇ／ｍＬ（ウェル当たり１００μＬ；３ｎＭ）から出発し、３倍希釈系列にわたって継続する）１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質または対照Ｆ１８０Ａ突然変異ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐを添加する。３７℃で９０分間インキュベートする
・その間、活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を収集し、室温（ＲＴ）完全ＲＰＭＩ中で、濃度を１．０×１０6生存細胞／ｍＬに調節する
・３７℃で１０分のインキュベーションに伴い、推奨される５μＭではなく、１．２５μＭ ＣＦＳＥを使用する以外は、製造者の指示に従いＣＦＳＥで細胞を標識する。標識後、完全ＲＰＭＩに細胞を懸濁させてから、濃度をｍｌ当たり０．５×１０6に調節する
・ＰＢＳでプレートを３回洗浄する
・ウェル当たり２００μＬの細胞（１００，０００）を添加する。卓上型遠心分離機で１００×ｇの遠心分離により細胞を穏やかにペレット化する。３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ内に３日間配置する
第３日
・翌日（２４時間のインキュベーション時間）、サイトカイン放出測定のために４０μＬの細胞培養上清を取り出す
第５日
・７２時間のインキュベーション時間後、サイトカイン放出測定のために４０μＬの細胞培養上清を取り出す
・ＣＤ４+Ｔ細胞を３８０ｇでペレット化し、２％ＦＢＳを含有する４℃のＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で１回洗浄する
・ＣＤ４+Ｔ細胞の標識のための抗体と、生存／非生存細胞識別のためのヨウ化プロピジウムを含有する結合ミックスに細胞を懸濁させる。３０分間インキュベートした後、４℃のＦＡＣＳバッファーで２回洗浄する。４℃のＦＡＣＳバッファーに再懸濁させてから、ＬＳＲＩＩフローサイトメータおよびＦＣＳフローサイトメトリーデータの分析用のＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、イベントを分析する。
サイトカイン放出の分析のために、ＭＳＤ製の１０プレックスＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン分析キットを用いて、製造者のプロトコルに従い、７２時間の培養後に得られた細胞培養上清をサイトカイン含有率について分析した。このキットは、電気化学検出法を使用して、次のサイトカイン：ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＩＬ−１βを定量測定する。以前の実験では、７２時間の時点が、より早い時点でサイトカイン放出を定性的に表すことが判明しており、そのため、これらの条件下では、特定のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの検出がプラスまたはマイナスのいずれにも偏らない。
細胞増殖の分析のために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、生存（ＰＩ陰性）イベントをゲーティングし、ＣＦＳＥの希釈を示すＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージを増殖中の細胞のパーセンテージの尺度として決定した。増殖またはサイトカイン放出に関して半数最大応答をもたらすＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の濃度（ＥＣ50）、ならびに２０％および９０％の半数最大応答の濃度（ＥＣ20およびＥＣ90）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１による非線形回帰分析を用いて決定した。
本試験で使用する材料を表４−１に掲載する。
Figure 2017519494
濃縮ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０について、増殖の誘導およびサイトカイン放出に関して、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質に対する用量依存性応答を示し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、およびＩＬ−１βについては弱い曲線が形成された。４人のドナーのうちの１人について用量−応答を賦与した結果の例を図７Ａ〜Ｅに示す。ドナーについてのデータの概要を表４−２にまとめる。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、およびＩＬ−１βサイトカイン放出については弱い用量−応答曲線の形成が観察されたため、これらの測定値については力価の値が取得できなかった。
ＣＤ４+Ｔ細胞増殖に関して４人のドナーの平均ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値は、８．０±７．６、１４±１１、および５７±５．８ｐＭであった。サイトカイン放出の平均ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値は、次の通りであった：ＩＮＦγ、４５±３９、６５±４１、および１４０±４５ｐＭ；ＴＮＦα、２２±１７、４８±２６、および２３０±１３２ｐＭ；ＩＬ−１０、３２±２０、５３±３４、および１３７±７０ｐＭ；ＩＬ−５、４３±２８、５９±４０、および１３４±５７ｐＭ。このように、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖は、このフォーマットでのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質効力の最も感度の高い尺度であった。
Figure 2017519494
＜実施例５：ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のインビトロ活性：Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼ受容体Ｔ細胞を用いた２−細胞バイオアベイラビリティ＞
この実施例では、２−細胞活性アッセイにおいて、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼ受容体細胞株を用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の生物活性を決定した。具体的には、ＯＸ４０Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼ受容体細胞を、ＮＦｋＢシグナル伝達のＯＸ４０受容体媒介性活性化のためのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の用量漸増と共に、ＦｃγＲ−発現ＨＥＫ２９３細胞、腫瘍細胞株と一緒に、または原発性ヒト腫瘍から単離したＣＤ４+Ｔ細胞と一緒にプレーティングした。ＮＦｋＢシグナル伝達は、ＯＸ４０シグナル伝達において周知の下流イベントであり、増殖およびサイトカイン放出などのＴ細胞活性化の他の尺度と定性的に相関する。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、Ｔ細胞の活性化を増強する能力を決定するために、１セットの２−細胞リポータ生物活性アッセイを実施して、Ｔ細胞活性化を評価した。Ｔ細胞活性化の測定は、一次活性化ヒトＴ細胞活性化の典型的な結果であるＮＦｋＢシグナル伝達経路の刺激（図８）に応答して、ルシフェラーゼを産生するＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼＴ細胞リポータ株を使用することによって達成した。ルシフェラーゼの量、従ってＴ細胞活性化は、ルシフェラーゼ基質を細胞溶解物に添加し、ルミノメータを用いて反応産物により発光される光を測定することによって、測定することができる。Ｔ細胞活性化は、ＦｃγＲの様々な補体を発現する細胞を用いて、可溶性ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質ならびにＦｃγＲ架橋ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質について測定した。同様に、ＯＸ４０会合の作用の特異性を証明するために、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の代わりに、ＯＸ４０Ｌ ＥＣＤに、ＦからＡへの単一アミノ酸置換（Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＩｇＧ４Ｐ）（ＥＣＤがＯＸ４０に結合できないようにする）を含有するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の突然変異形態を使用した。
アッセイ１
２細胞バイオアベイラビリティアッセイを用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をバイオアベイラビリティについて試験したが、このアッセイでは、ＯＸ４０アゴニズム（ＮＦｋＢ活性）の読み取りのためのヒトＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼリポータクローン６４（ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔリポータ）と、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔリポータ細胞上にＯＸ４０をクラスター形成させるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質架橋を媒介する第２ＦｃγＲ発現細胞株を使用した（図８）。薬物架橋のために用いたＦｃγＲ発現細胞株は、ラージ（Ｒａｊｉ）Ｂ細胞腫瘍株、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３もしくはＣＤ４５+免疫細胞（原発性ヒト腫瘍または正常な隣接組織から単離した）を含んだ。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の可溶活性を決定するために、ＦｃγＲ発現細胞株の代わりに親ＨＥＫ２９３細胞（ＦｃγＲヌル）を使用して、または第２架橋細胞株の完全な非存在下で、生物活性アッセイを実施した。リポータに対するＯＸ４０会合の必要性を証明するために、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の代わりに、ＯＸ４０結合が低減した突然変異ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐまたは突然変異ＯＸ４０Ｌ融合ＩｇＧ１を使用した。
使用前に、加湿組織培養インキュベータにおいて３７℃および５％ＣＯ2の完全ＲＰＭＩ培地中で、ｍｌ当たり０．５〜１．５ｅ６の密度でＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔリポータ細胞を培養した。細胞は、バイオアッセイの前日にｍｌ当たり１ｅ６の密度に継代した。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のバイオアッセイは、次のプロトコルを用いてセットアップした：
第０日
・ＯＸ４０Ｊｕｒｋａｔリポータ細胞およびＦｃγＲ発現細胞株、またはＨＥＫ親細胞を５０ｍＬ遠心分離管に収集してから、３８０ｇ（１２００ｒｐｍ）でペレット化する。原発性活性化ヒト腫瘍および正常な隣接組織から単離されるＣＤ４５+細胞のために、組織を解離して、ＣＤ４５+細胞を単離した後、後述する生物活性アッセイで使用するために、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。
・完全ＲＰＭＩに各細胞型を再懸濁させて、抗体を希釈する間、取り除けて置く。
・μｇ／ｍＬ範囲から出発し、ｎｇ／ｍＬ未満の濃度まで完全ＲＰＭＩ培地で３倍希釈して、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の連続希釈物を調製する。対照として、Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質を完全ＲＰＭＩ培地で希釈する。
・９６ウェルプレートにＯＸ４０リポータ細胞とＦｃγＲ発現細胞株またはＨＥＫ親細胞（各々ウェル当たり１００，０００細胞）を導入する。
・完全ＲＰＭＩ培地中の細胞に、前述のように１μｇ／ｍＬから出発して３倍希釈する最終濃度まで、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を添加する。対照として、Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質を完全ＲＰＭＩ培地で最終濃度１μｇ／ｍＬに希釈する。
第１日
・翌日（１６〜２４時間のインキュベーション時間）、Ｐｒｏｍｅｇａからの１００μＬのＲＴ再構成ＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ溶液を各ウェルに添加し、ウェルを混合して、細胞を溶解させる。
・ＲＴで５分間インキュベートすることによりルシフェラーゼシグナルを平衡させてから、リバースピペッティング法を用いて（気泡を防止するために）、各ウェルから検出用の９６ウェルホワイトウォールアッセイプレートに、１５０μＬのｓｔｅａｄｙ ｇｌｏｗ／サンプル溶解物を移した後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎルミネッセンスリーダを用いて、ルミネッセンスシグナルを読み取る。
・ルミネッセンスのＲＬＵ（ｙ軸）に対してＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の濃度（ｘ軸、モル濃度のｌｏｇ１０）をプロットすることにより、データを解析する。ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１ソフトウェアを用いた非線形回帰分析により、ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値を決定した。
ヒト腫瘍および正常な隣接組織から一次ヒトＣＤ４５+細胞を単離するために、次のプロトコルを用いた：
・輸送培地から腫瘍または正常な隣接組織サンプルを取り出して、滅菌ペトリ皿に配置する。ハンクスバッファー塩溶液を添加して、腫瘍細胞から肉眼で認められる壊死組織またはあらゆる正常組織を解剖する。
・鉗子とはさみを用いて、組織を小さな切片（約１ｍｍ）に刻み、５０ｍＬコニカルチューブ中に導入してから、１０〜２０ｍｌのコラゲナーゼＩＩＩ酵素ミックス（２５０ＩＵ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩＩ、３ｍＭ ＣａＣｌ2、３１５μｇ／ｍＬのＤＮＡａｓｅ Ｉ）を添加する。十分に混合した後、約１／２時間にわたって３０℃のインキュベータでインキュベートする。
・７０ミクロンフィルタを通して、消化サンプルを濾過する。１ｍＬシリンジプランジャーの後部を用いて、材料をフィルタに穏やかに押し付け、ＭＡＣＳバッファーを用いて、頻繁にフィルタを洗浄することにより、細胞を洗い流すのを補助する。
・解離した細胞を９００ｒｐｍ（１９０ｇ ＲＣＦ）で１５分間４℃にてペレット化する。
・Ｖｉ ｃｅｌｌカウンターを用いて、細胞数および生存率を決定する。
・各々１千万個の細胞について、８０μＬのＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ｐＨ７．２と０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁させてから、２０μＬのＣＤ４５マイクロビーズを添加した。
・氷上で１５分間４℃にてインキュベートする。
・１千万個の細胞毎に２ｍＬの低温ＭＡＣＳバッファーで細胞を洗浄する。
・５００μＬの低温ＭＡＣＳバッファーに再懸濁させる
・各選択腫瘍および正常組織サンプルにつき１本のＬＳカラムを３ｍＬの低温ＭＡＣＳバッファーで予湿する
・５００μＬのビーズ結合細胞懸濁液をカラムに適用してから、３×３ｍＬの低温ＭＡＣＳバッファー（計９ｍＬ）を添加することにより、カラムを介して非結合細胞を洗浄する。
・カラムを磁石から取り出して、５ｍＬのＭＡＣＳバッファーを添加することにより、ビーズに結合したＣＤ４５+細胞を溶離させる。プランジャーを用いて、ＭＡＣＳバッファーを細胞と一緒に穏やかに押してカラムを通過させる。ＣＤ４５+細胞をペレット化した後、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、前述したような生物活性アッセイで使用する。
本試験で使用する材料を表５−１に掲載する。
Figure 2017519494
２−細胞生物活性アッセイの結果
第２細胞型の非存在下、または内在的に発現されたＦｃγＲが欠失したＨＥＫ２９３細胞の存在下で、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞とＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の生物活性を可溶性タンパク質として試験した。これらの条件下で、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、リポータ活性をほとんど示さなかった。しかし、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３細胞などのＦｃＲ発現細胞株の存在下では、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＮＦｋＢ経路刺激により測定されるように、強力なＴ細胞刺激活性を示す（図９）。
ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫの存在下と同様に、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ラージＢ細胞、ＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３細胞、ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３、またはＣＤ４５＋細胞（薬物架橋のために原発性ヒト腫瘍から単離した）を用いた２−細胞アッセイにおいて強力な生物活性を示す（図１０）。
２−細胞バイオアッセイについての効力値（ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90）を表５−２にまとめる。アッセイの平均±標準偏差ＥＣ20、ＥＣ50、およびＥＣ90値は、それぞれ、３５±２９ｐＭ、５０±４７、および１４１±１１４ｐＭであった。
Figure 2017519494
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞におけるＮＦｋＢ経路の活性化を通して測定されるように、ヒトＴ細胞の活性化を媒介する。この生物活性は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のＦｃドメインを介して薬物を架橋することができるＦｃＲを発現する細胞の非存在下では低い。薬物架橋のためのＦｃＲ発現細胞（ラージ、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ発現ＨＥＫ２９３）と、Ｔ細胞活性化の読み取りのためのＪｕｒｋａｔ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼリポータ株を用いた２−細胞系において、ＭＥＤＩは、６０±５２ｐＭの平均ＥＣ50値で、強力なＴ細胞活性化を媒介した。
＜実施例６：ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質とカニクイザルおよびアカゲザルＴ細胞を用いたインビトロ比較可能性試験＞
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の安全性および薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モデル化のために、カニクイザル（ｃｙｎｏ）およびアカゲザルが使用されているが、これらの種は、同一のＯＸ４０配列を有する。この実施例では、２−細胞活性アッセイにおいてｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓＯＸ４０を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞株を用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の生物活性を決定した。ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞を、Ｆｃγ受容体発現アカゲザルＢ細胞株、または抗原提示細胞を含有する単離したアカゲザル細胞と一緒にプレーティングし、ＮＦκＢシグナル伝達のＯＸ４０リポータ媒介性活性化のためにＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の用量漸増によって処理した。ＮＦκＢシグナル伝達は、ＯＸ４０シグナル伝達において周知の下流イベントであり、増殖およびサイトカイン放出などのＴ細胞活性化の他の尺度と相関し得る。
さらに、プレート増殖アッセイにおいて、一次活性化アカゲザルＣＤ４５+Ｔ細胞を用いてＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の生物活性を決定した。一次活性化アカゲザルＣＤ４５+Ｔ細胞を、ＯＸ４０受容体媒介共刺激のためのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の用量漸増と共に、ＴＣＲ刺激のためのプレート捕捉準最適抗ＣＤ３モノクローナル抗体上にプレーティングした。ＯＸ４０生物活性を測定するために、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を決定した。
ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ２−細胞生物活性アッセイ
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の架橋、その結果、Ｊｕｒｋａｔリポータ細胞上でのＯＸ４０クラスター形成を媒介するために使用されるＦｃγ受容体発現細胞と共に２−細胞アッセイを用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を試験した。カニクイザル（ｃｙｎｏ）およびアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）は、同一のＯＸ４０を有することから、第１細胞型は、ＯＸ４０アゴニズム（ＮＦκＢ活性）の読み取りに用いられるｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞株（クローンＢ２）である。第２細胞型は、正常なアカゲザルの全血に由来するＦｃγ受容体発現細胞株、アカゲザルＢ細胞株ＬＣＬ８６６４、またはＦｃγ受容体発現免疫細胞である。可溶性ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の活性を決定するために、第２架橋細胞株（「標的のみ」）の非存在下で対照を実施した。バックグラウンド生物活性は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の添加なしで評価した（「標的＋エフェクター」）。リポータ細胞に対するＯＸ４０Ｌの会合の必要性を証明するために、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の代わりに、ＯＸ４０結合が低減した突然変異Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐを使用した。ＬＣＬ８６６４を用いたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質２−細胞生物活性アッセイを次のプロトコルに従い実施した：
アッセイの前日：
１．アッセイにおいて良好な細胞生存率を促進するために、それぞれ、ｍＬ当たり約５００，０００および４００，０００細胞の細胞密度を達成するように、ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータクローンＢ２およびアカゲザルＢ細胞株ＬＣＬ８６６４に、完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）を添加した。
第０日：
１．ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータクローンＢおよびアカゲザルＢ細胞株ＬＣＬ８６６４を個別の５０ｍＬ遠心分離用コニカルチューブ中に収集し、３３０×ｇでペレット化した後、上清を廃棄した。次に、細胞を１０ｍＬの完全培地に懸濁させ、ＶｉＣｅｌｌカウンターを用いて、細胞懸濁液を計数し、細胞濃度を前述した完全培地中で２．５×１０6に調節した。
２．ディープウェルポリプロピレンプレート中で、１０μｇ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、１１ポイントデータ曲線のために３倍インクリメントで連続的に希釈した。１０μｇ／ｍＬのＦ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質およびＩｇＧ４Ｐ抗体（負のアイソタイプ対照）も、５ポイントデータ曲線のために６倍インクリメントで同様に希釈した。
３．ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータクローンＢ２とアカゲザルＢ細胞株ＬＣＬ８６６４を、ｍＬ当たり各細胞１．２５×１０6の最終濃度に等量で混合した後、８０μＬの混合細胞懸濁液を９６ウェル底非組織培養処理プレートの各ウェルに配分した。
４．２０μＬのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＦ１８０Ａ突然変異体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４Ｐを各ウェルに添加して、プレートを加湿５％ＣＯ2雰囲気の３７℃インキュベータに移した。
第１日：
１．１６時間のインキュベーション後、プレートを室温に３０分間順応させた後、１００μＬの再構成室温ＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加して、細胞を溶解させた。
２．プレートをロータリーシェーカでＲＴにて５分間インキュベートして、ルシフェラーゼシグナルを平衡させた。各ウェルからの１５０μＬのＳｔｅａｄｙｇｌｏ／サンプル溶解物を９６ウェルホワイトウォールアッセイプレートの各ウェルに移してから、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎルミネッセンスリーダを用いて、各ウェルのルミネッセンスシグナルを決定した。
健常なインド生まれのアカゲザルドナー（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｍｉａｍ，ＦＬ）から取得したナトリウムヘパリン抗凝固全血からＦｃγ受容体を発現する免疫細胞を単離するために、次のプロトコルを使用した：
１．５ｍＬの新鮮な全血を５０ｍＬコニカルチューブに添加し、４５ｍＬの塩化アンモニウム溶液を添加した。細胞混合物を氷上で１０分間インキュベートした。
２．細胞混合物を３００×ｇで１０分間遠心分離した後；上清を廃棄した。
３．細胞ペレットを前述のように４０ｍＬの完全細胞培地で２回洗浄してから、２−細胞生物活性アッセイで使用するために細胞を準備した。
ｒｈｅｓｕｓ溶解全血を用いた２−細胞生物活性アッセイを、ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ４Ｐを負の対照抗体として濃度１０μｇ／ｍＬでのみ使用した以外は、前述と同様に、ＬＣＬ８６６４アカゲザルＢ細胞株と一緒に実施した。
アカゲザルＣＤ４５ + Ｔ細胞増殖アッセイ
プレート薬物捕捉アッセイにおいて、活性化一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性を決定し、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を測定した。Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｍｉａｍ，ＦＬ）からの健常なアカゲザルドナー（Ｎ＝２）から取得したナトリウムヘパリン抗凝固全血から単離したアカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、次のプロトコルに従い、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質生物活性を評価した：
第１日：
１．ＲＴで９５ｍＬのＬＳＭに５ｍＬのＰＢＳを添加することにより、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）を９５％に希釈した。
２．ＲＴにて新鮮なヘパリン添加ｒｈｅｓｕｓ血液をＰＢＳで１：１希釈した後、２０ｍＬの希釈全血を５０ｍＬ遠心分離用コニカルチューブ内の１５ｍＬの９５％ＬＳＭに重ねた。
３．ブレーキなしの卓上型遠心分離機により４００×ｇで３０分間ＲＴにて血液を遠心分離した。
４．中間期で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集してから、１２００ＲＰＭにて１０分間、低温Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
５．上清を廃棄し、細胞ペレットを５ｍＬのＲＴ １×ＲＢＣ溶解バッファーで処理した後、ＲＴで５分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に溶解プロセスを停止させるために、４５ｍＬの完全培地（１０％ＦＢＳと１％抗生物質／抗菌剤を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ）をペレットに添加した。
６．次に、ＰＢＭＣ細胞を３３０×ｇで１０分間遠心分離機によりペレット化した後、２０ｍＬの低温Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
７．上清を廃棄し、細胞ペレットを低温ＭＡＣＳバッファーに懸濁させてから、ＶｉＣｅｌｌカウンターで計数することにより、細胞数および生存率を決定した。
８．アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞の単離を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ非ヒト霊長類キットを用いて、製造者の指示に従い実施し、次に、ＣＤ４+Ｔ細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターで計数した後、前述した完全培地中にｍＬ当たり１×１０6で懸濁させた。
９．Ｔ細胞を活性化すると共にＯＸ４０発現を誘導するために、５μｇ／ｍＬのコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ）Ａと１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴ７５細胞培養フラスコ中で、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータにおいてアカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞（完全培地中ｍＬ当たり１×１０6）を４８時間培養した。
第２日：
１．非組織培養処理丸底９６ウェルアッセイプレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）および２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）１００μＬでコーティングした後、４℃で一晩インキュベートした。
第３日：
１．抗体でコーティングしたプレートを２００μＬのＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）でプレートを３７℃にて９０分間ブロックした。
２．プレートを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後；１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中２ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３クローンＳＰ３４−２をウェル毎に１００μＬずつ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。
３．プレートを２００μＬのＰＢＳ、次に１０ポイントデータ曲線のために１％ＢＳＡ／ＰＢＳで連続的に希釈した０．５μｇ／ｍＬもしくは１μｇ／ｍＬの（アッセイ２）ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質または１μｇ／ｍＬの対照ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ４Ｐアイソタイプをウェル毎に１００μＬずつ添加した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。
４．活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を前述したＲＴ完全培地中で１×１０6生存細胞／ｍＬに調節した。
５．推奨される５μＭではなく、１．２５μＭ ＣＦＳＥを用いる以外は製造者の指示に従い、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）でアカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を標識した後、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞標識の後、前述した完全培地に細胞を懸濁させ、濃度をｍｌ当たり１．５×１０6に調節した。
６．１００μＬの活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞（１５０，０００）をウェル毎に添加した後、プレートを３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ内に３日間静置した。
第５日：
１．アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を３３０×ｇの遠心分離機でペレット化した後、２％ＦＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）を含む２００μＬの４℃ＰＢＳで１回洗浄した。
２．アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞の標識のための２．５μＬのＣＤ４−Ｖ４５０抗体と、生存／非生存細胞識別のための０．５μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する４℃結合ミックスに細胞を懸濁させた。
３．細胞プレートを４℃で３０分間インキュベートした後、ウェル毎に２００μＬの４℃ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。ウェル毎に１００μＬの４℃バッファーに細胞を懸濁させ、ＬＳＲＩＩフローサイトメータおよびＦＣＳフローサイトメトリーデータの解析用のＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ；Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、フローサイトメトリーにより解析した。
アッセイは、表６−３に示すように、一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞を用いた２つの独立したアッセイにおいて反復した。
細胞増殖の解析のために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、生存（ＰＩ陰性）イベントをゲーティングし、ＣＦＳＥの希釈を示すＣＤ４−ゲーティング細胞のパーセンテージを増殖中の細胞のパーセンテージの尺度として決定した。
生物活性および増殖に関して半数最大応答（ＥＣ50）をもたらすＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、非線形回帰分析（対数用量応答、４−パラメータ当てはめ曲線）を用いて決定した。個々の実験およびドナー同士の偏差の尺度として標準偏差を決定した。
本試験で使用する材料を表６−１に掲載する。
Figure 2017519494
結果
Ｃｙｎｏ／Ｒｈｅｓｕｓ２−細胞生物活性アッセイの結果
ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ２−細胞生物活性アッセイの結果を表６−２および６−３ならびに図１１および１２に示す。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、アカゲザルＢ細胞株、ＬＣＬ８６６４の存在下、４９．９±４．６０ｐＭの平均ＥＣ50（Ｎ＝２アッセイ）で、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化する能力を明らかにした。表６−５に示すように、ラージＢ細胞株を用いたヒト２−細胞アッセイと比較して、ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ２−細胞アッセイにおけるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質活性のＥＣ50値は、３．６倍高い。さらに、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、Ｆｃγ受容体を発現する全ｒｈｅｓｕｓ免疫細胞の存在下、５０．８（９５％ＣＩ４５．７、５６．４）ｐＭのＥＣ50（Ｎ＝１アッセイ）で、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化した。
Figure 2017519494
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アカゲザル一次活性化Ｔ細胞増殖アッセイの結果
アカゲザル一次活性化Ｔ細胞増殖アッセイ（Ｎ＝２）の結果を表６−４および図１３に示す。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、１３４±１４４ｐＭの平均ＥＣ50（Ｎ＝２アッセイ）で、一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を誘導した。表６−６に示すように、アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質活性のＥＣ50値は、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞増殖と比較して、９．６倍高い。
Figure 2017519494
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ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、溶解全血由来のＦｃγ受容体を発現するアカゲザルＢ細胞またはアカゲザル免疫細胞の存在下で、ｃｙｎｏ／ｒｈｅｓｕｓ ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化した。さらに、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、一次活性化ｒｈｅｓｕｓ ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を誘導した。
＜実施例７：ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質がエフェクター機能をトリガーする能力の決定＞
この実施例では、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、Ｃｌｑに結合して、高レベルのＯＸ４０を発現する一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に対して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をトリガーする能力を評価する。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＩｇＧ１）を担持するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の形態を作製して、既知であり、且つ、ＡＤＣＣをトリガーするか、またはＣｌｑに結合することができるＦｃドメインの寄与を評価した。ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインに点突然変異（Ｆ１８０Ａ）を担持するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質およびＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＩｇＧ１の形態は、ＯＸ４０の結合能力が低下しているため、これを生成して、ＯＸ４０を発現する細胞に対してＡＤＣＣをトリガーするＯＸ４０結合ドメインの寄与を評価した。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、ＣＤ２０を発現するＢ細胞に結合するため、ＡＤＣＣ実験の正の対照として使用した。一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞は、ＣＤ２０を発現しないことから、ＡＤＣＣアッセイ系が有効であることを確認するために、ＣＤ２０を発現しないトレド（Ｔｏｌａｄｏ）Ｂ細胞株を用いた個別のアッセイを実施した。ヒトＩｇＧ１対照抗体は、Ｃｌｑの結合アッセイの正の対照として使用した。
抗体依存性細胞傷害性
濃縮一次活性化ヒトＮＫ細胞をエフェクターとして、また、ＯＸ４０発現一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を標的として用いて、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびリツキシマブのそれに対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のＡＤＣＣ活性を試験した。一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞の単離のために、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍにより、健常なドナーから取得したヘパリン抗凝固全血を入手し、次のプロトコルに従い処理した：
１．全血２０ｍＬ当たり１ｍＬのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４+Ｔ細胞単離キット抗体ミックスを添加し、混合した後、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。
２．血液は、滅菌室温ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２％熱不活性化新生仔ウシ血清、ｐＨ７．２）で１：１希釈してから、ＤＭ−Ｌ培地に重ねた後、卓上型遠心分離機による３８０ｇ（１２００ｒｐｍ）での遠心分離を２０分間中断せずに行った。
３．遠心分離後、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を含有するバフィーコートを１０ｍＬピペットで取り出し、ＲＴ ＦＡＣＳバッファーで１回、ＲＴ完全ＲＰＭＩ培地で１回細胞を洗浄した。
４．細胞をＶｉＣｅｌｌカウンターで計数して、細胞数および生存率を決定した後、ＣＤ４+Ｔ細胞をｍｌ当たり１．０×１０6の濃度で完全ＲＰＭＩ培地に懸濁させた。
一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞（完全ＲＰＭＩ培地中ｍｌ当たり１．０×１０6）を、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌおよび２０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬの存在下、３７℃および５％ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ中で４８時間培養して、Ｔ細胞を活性化すると共に、ＯＸ４０を上方制御した後、これらの細胞をＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質ＡＤＣＣアッセイに使用した。以下の表および図面に記載するドナーは全て、個別の個体を示す；すなわち、ＣＤ４+Ｔ細胞は、反復ＡＤＣＣ実験の場合、同じドナーから単離したものではなかった。
一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞の活性化後、１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４+Ｔ細胞単離キット抗体ミックスの代わりに、１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＮＫ細胞単離キット抗体ミックスを使用した以外は、ＣＤ４+Ｔ細胞に関して前述と同じプロトコルを用いて、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍからのナトリウムヘパリン抗凝固血液からエフェクターＮＫ細胞を単離した。単離した一次活性化ヒトＮＫ細胞を温かい完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１６４０と１０％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、ｍｌ当たり２．６７×１０6の濃度で完全ＲＰＭＩに懸濁させた。同様に、活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞も、温かい完全ＲＰＭＩで２回洗浄した後、ｍｌ当たり２．６７×１０5の濃度で懸濁させた。その後、７５μＬの活性化一次活性化ヒトＮＫ細胞（２００，０００）および７５μＬの一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞（２０，０００）を、１０：１のエフェクター：標的比で、滅菌非ＴＣ処理丸底９６ウェルプレートのウェルに添加した。プレート内の細胞に、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質またはＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１の希釈系列を含有する５０μＬの完全ＲＰＭＩを添加した。活性化一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞の代わりに、ＣＤ２０発現ラージＢ細胞を含有するウェルでは、１０μｇ／ｍＬのリツキシマブ対照抗体を正の対照として使用した。ＡＤＣＣアッセイの細胞を遠心分離（ＲＴにて、１００ｇで２分）により穏やかにペレット化した後、加湿組織培養インキュベータにおいて、３７℃および５％ＣＯ2で２４時間培養した。
インキュベーション時間の終了時に、細胞を３８０ｇの遠心分離によりペレット化した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータでのフローサイトメトリー分析による非生存細胞識別のための１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁させた。補正のために、１０μｇ／ｍＬのＡｂ（ＰＩなし）に結合したＯＸ４０発現細胞を含有するウェル、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識Ａｂ試薬だけに結合した細胞、または０．１％サポニンで透過処理し、且つ１０μｇ／ｍＬのＰＩで処理した細胞を単一染色補正対照として調製した。バックグラウンド除去のために、一次活性化抗体の非存在下で、二次抗体を含有する細胞も前述したように調製した。
Ｃｌｑに対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の結合
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６計器を使用して、ヒト血清のプールから精製されたヒト補体タンパク質ＣｌｑのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質に対する結合パラメータを決定した。標準的アミンカップリング法を用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をＧＬＣバイオセンサーチップの表面に固定化した。２６ｎＭ〜１．６ｎＭまでの範囲の５つの濃度のＰＢＳ／０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４にヒトＣｌｑを懸濁させた。サンプルを３０μＬ／分で２００秒間注射した後、解離相を６００秒にわたって継続する。１：１フィッティングを用いたＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ２．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、センサグラムデータを処理した。
この試験で使用する材料を表７−１に掲載する。
Figure 2017519494
治療用抗体は、エフェクター機能を誘発するその能力に基づいて、おおまかに３つのカテゴリーに分類することができる（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１１）。クラスＩおよびクラスＩＩ抗体は、細胞結合抗原に結合し、クラスＩＩＩ抗体は、可溶性抗原に結合して、それを中和する。一般に、クラスＩ抗体の作用機構は、ＣＤＣおよびＡＤＣＣのようなＦｃエフェクター機能を必要とする。これに対し、Ｆｃエフェクター機能は、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩ抗体の作用機構に参加するとは考えられていない。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ＯＸ４０に特異的に結合するヒトＯＸ４０リガンドＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質、すなわち、細胞表面結合タンパク質である。ＩｇＧ４Ｐ含有分子は、Ｆｃγ受容体との比較的低い親和性相互作用を明らかにしており、エフェクター機能が欠如している（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１１）。従って、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、クラスＩＩ抗体として分類され、測定可能なエフェクター機能をトリガーすると考えられていない。この試験の一部として、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のエフェクター機能の欠如を、ＡＤＣＣアッセイおよびＣｌｑ結合アッセイで確認した。
濃縮一次活性化ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞として、また高レベルのＯＸ４０を発現する活性化ヒトＣＤ４+細胞を標的細胞として使用して、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣの能力を評価した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質およびＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を評価した：抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）を正の対照抗体として使用した。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１は、濃度依存性ＡＤＣＣ活性を示した（図１４ＡおよびＣ：図１５）。対照的に、また、ＩｇＧ４Ｐ Ｆｃドメインに基づいて予想されるように、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質には、検出可能なＡＤＣＣが全く認められなかった（図１４ＡおよびＣ：図１５）。さらに、各ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ４ＰのＦ１８０Ａ突然変異形態にも、検出可能なＡＤＣＣ活性が全く認められず（図１４ＡおよびＣ：図１５）、これによって、ＡＤＣＣ活性が、標的細胞へのＯＸ４０の融合タンパク質会合に依存的であることを確認した。また、ヒトＣＤ２０に対する正の対照抗体も、ＡＤＣＣを示し（図１４ＢおよびＤ）；これは、本アッセイの有効性を支持するものである。総合して、これらの実験の結果から、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、高レベルのＯＸ４０を発現する標的細胞に対してＡＤＣＣをトリガーしないことを確認した。
表面プラズマ共鳴アッセイを用いて、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、ヒト補体成分Ｃｌｑに結合する能力を評価した。このアッセイでは、補体依存性細胞傷害性アッセイの代理としてＣｌｑへの結合を用いた（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，Ｋ．Ｅ．Ｃｏｏｋ，Ｍ．Ｍ．Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｗｏｏｄｓ ａｎｄ Ｈ Ｗｕ．２００６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７：１１２９−１１３８．）。
ヒトＩｇＧ１抗体を正の対照抗体として使用した。対照ヒトＩｇＧ１は、予想通り、精製したヒトＣｌｑタンパク質に結合する濃度依存性能力を示した（図１６）。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質には、Ｃｌｑタンパク質に対する検出可能な結合が全く認められなかった（図１６）。
結論
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、Ｃｌｑに結合しないか、または高レベルのＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に対してＡＤＣＣをトリガーしない。
＜実施例８：ヒト癌のマウスモデルにおけるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の活性＞
この実施例では、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、癌の治療のための単剤療法として有効となり得るか否か、ならびにＴ細胞が、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のインビボ抗癌活性に寄与するか否かを試験する。この試験は、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病／重症複合免疫不全、表８−１）マウスにおけるヒト癌の異種移植片モデルで実施した。
試験動物
Figure 2017519494
収容
動物は、人道的に取り扱い、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）承認のプロトコルに従い、実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）および米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）認可施設であるＭｅｄＩｍｍｕｎｅの実験動物質源（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）施設に収容した。動物は、滅菌マイクロアイソレータユニット内で飼育し、滅菌寝藁および餌、ならびに酸性化飲料水を無制限に供給した。環境条件は標準化した（室温：２０±１℃；相対湿度：５０％±１０％；１２時間明暗周期）。動物は、有害な臨床徴候について毎日、体重について毎週モニターした。体重は、Ｔ細胞の存在下および非存在下で、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の活性を試験する実験のために毎週収集した。後肢の麻痺、呼吸困難、２０％の減量、または２０００ｍｍ3を超える腫瘍体積が認められた場合には、直ちにＣＯ2を用いた窒息により人道的に動物を死なせた。
移植片の定着
試験で使用するヒト細胞株
Figure 2017519494
移植用の細胞の調製
細胞培養物からヒト癌Ａ３７５細胞を採取し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、再懸濁した。続いて、Ａ３７５細胞を、Ａ３７５腫瘍細胞株に対してアロ反応性のＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞株と混合した後、動物に移植した。
ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞株を作製するために、健常なドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞について、全血２０ｍＬ当たり１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｔ細胞濃縮製剤の添加により濃縮した。このステップの後、２０分間のインキュベーション、続いて、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＤＭ−Ｌ密度培地を用いて、密度勾配遠心分離による単離を実施した。遠心分離の後、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＰＢＳで細胞を３回洗浄してから、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させた。濃縮したＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を、組換えヒトインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２）を補充した培地中で７〜１０日間個別に培養し、各々マイトマイシンＣ処理Ａ３７５細胞と合わせた。Ｔ細胞を収集し、ｒｈＩＬ−２を補充した培地中で７〜１０日間個別に再度培養し、マイトマイシンＣ処理Ａ３７５細胞と合わせた。ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を収集し、２：１比で合わせた。
ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞について濃縮したＡ３７５細胞およびＰＢＭＣは、移植の直前に６Ａ３７５細胞：１Ｔ細胞の比で混合した。
異種移植片の移植
異種移植片は、動物の右わき腹への３．５×１０6細胞（１：６のエフェクター：標的［Ｅ：Ｔ］比でヒトＴ細胞と混合し、２００μＬのＰＢＳに懸濁させたＡ３７５細胞）の皮下（ＳＣ）注射により定着させた。
ランダム化、グループ指定および用量レベル
細胞のＳＣ注射の前に、６匹の動物をランダムに各実験グループに割り当てた。動物の取り替えは行わなかった。各実験のグループ指定および用量レベルを表８−３および表８−４に掲載する。試験および対照物質は、２００μＬの総量で腹腔内（ＩＰ）投与した。癌／エフェクターＴ細胞の移植後第３または４日に、第１用量の試験および対照物質を投与した。動物は、図１７および１８の図の説明に表示する日に、最大３回の追加用量の試験および対照物質を受けた。腫瘍の形成は、各動物において週に１〜２回観察された。この試験の一次活性化エンドポイントは、２０００ｍｍ3の腫瘍体積または大きな腫瘍壊死のいずれかであった。
腫瘍測定
腫瘍をカリパスで測定し、次の式を用いて、腫瘍体積（Ｖ）を測定した：
腫瘍体積＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）2］／２
各グループについて、結果を算術平均として記録する。
抗癌作用は、腫瘍成長阻害パーセント（％ＴＧＩ）として表し、これは、次のように計算した：
％ＴＧＩ＝（１−［治療グループの平均腫瘍Ｖ］÷［対照グループの平均腫瘍Ｖ］）×１００。
統計的手法
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質処置動物とアイソタイプ対照処置動物同士の比較を実施して、グループ間の差をマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）順位和検定により統計的有意性について分析した。
マン・ホイットニー順位和検定から得られた有意なｐ値は、要約表および図面において、算術平均および平均値の標準偏差に隣接して表示する。
この試験で使用する材料、およびその供給元を表８−５に掲載する。
Figure 2017519494
ヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍の成長に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の活性をこの試験で調べた。免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌動物に、アロ反応性ヒトＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞株と混合したヒト癌細胞株を移植した。ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞は、健全なヒトドナーから単離したＰＢＭＣに由来する。動物は、異種移植片の移植から３または４日後に第１用量の試験および対照物質を受けてから、表示の通りに追加用量の試験および対照物質を投与された。
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、アイソタイプ対照グループと比較してＡ３７５細胞の成長を最大７４％有意に阻害した（表８−３、表８−４、図１７および図１８）。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の抗腫瘍活性は、アロ反応性ヒトＴ細胞の添加に依存的である（表８−４および図１８）。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ヒトＴ細胞の存在下ではＡ３７５細胞の成長を阻害したが、Ｔ細胞が存在しない場合には阻害しなかった。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ヒト癌のマウスモデルにおいて強力な抗癌活性を示した。これらの結果は、１）ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、癌患者の治療のための単剤療法として有効となり得ること、２）従って、Ｔ細胞が、インビボでＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の抗癌活性に寄与するというエビデンスを提供するものである。
＜実施例９：マウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質は、同系モデルにおけるマウス癌細胞株の成長を阻害する＞
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、マウス（ｍ）ＯＸ４０に対して反応しない（実施例２を参照）ことから；免疫応答性マウスモデルにおいてその活性を試験することはできない。ＯＸ４０アゴニズムの作用をさらに詳しく調べるために、マウスＯＸ４０受容体に特異的に結合して、それによるシグナル伝達をトリガーするマウスＯＸ４０リガンドマウスＩｇＧ１融合タンパク質（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）を生成した。ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列９および配列１０として表示される。
ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰをＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の代用マウスＯＸ４０ ＦＰとして選択した。この非ＧＬＰ試験は、癌の４つのマウスモデルにおけるｍＯＸ４０Ｌ ＦＰの単剤活性を評価するために実施した。
配列番号９：マウス構築物ｍＩｇＧ１ｍＴＦ２ｍＯＸ４０ＬのＤＮＡ配列（５’から３’方向のオープンリーディングフレーム）
Figure 2017519494
配列番号１０：マウス構築物ｍＩｇＧ１ＦｃｍＴＦ２ｍＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列（ＮからＣ末端）
Figure 2017519494
試験動物を表９−１および９−２に記載する。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
収容
動物は、人道的に取り扱い、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）承認のプロトコルに従い、実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）および米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）認可施設であるＭｅｄＩｍｍｕｎｅの実験動物質源（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）施設に収容した。動物は、滅菌マイクロアイソレータユニット内で飼育し、滅菌寝藁および餌、ならびに酸性化飲料水を無制限に供給した。環境条件は標準化した（室温：２０±１℃；相対湿度：５０％±１０％；１２時間明暗周期）。動物は、有害な臨床徴候について毎日、体重について毎週モニターした。後肢の麻痺、呼吸困難、２０％の減量、または２０００ｍｍ3を超える腫瘍体積が認められた場合には、ＣＯ2を用いた窒息により、直ちに動物を人道的に死なせた。
同系腫瘍の定着
同系腫瘍モデルで使用する細胞株を表９−３〜９−６に記載する。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
Figure 2017519494
Figure 2017519494
同系腫瘍の移植
０．１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁させた５．０×１０5個のＲｅｎｃａ細胞、５．０×１０5個のＣＴ２６細胞または１．０×１０5個の４Ｔ１細胞を試験群にランダムに分布させた７〜９週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの右わき腹に皮下（ＳＣ）注射することにより、同種移植片を定着させ、また、０．１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁させた２．５×１０6個のＭＣＡ２０５細胞を７〜９週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に注射した。
ランダム化、グループ指定および用量レベル
この試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウス（計１５０）およびＣ５７ＢＬ／６（計７０）雌マウスを使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに処置グループに割り当てた後、レンカおよびＣＴ２６腫瘍細胞株を注射した。４Ｔ１腫瘍細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスを、移植から３日後に体重によりランダム化した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、腫瘍が、コホート毎に９５ｍｍ3の平均体積まで成長した後、すなわち移植から１１日後、ランダムに割り当てた。グループ指定、動物の数、用量レベルおよび投与スケジュールを表９−７、表９−８、表９−９および表９−１０に表示する。
処置は全て、表９−７、表９−８、表９−９および表９−１０に表示するように、適切な試験日に腹腔内（ＩＰ）投与した。動物の取り替えはなかった。
各グループからの動物は、腫瘍体積が約２０００ｍｍ3に達したら、死なせた。
Figure 2017519494
Figure 2017519494
Figure 2017519494
Figure 2017519494
腫瘍測定
腫瘍をカリパスで測定し、次の式を用いて、腫瘍体積を測定した：
腫瘍体積＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）2］／２
ここで、長さは、長い方の辺として、また幅は、長さに対して垂直の、短い方の辺としてそれぞれ定義した。
各グループの抗腫瘍作用は、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）として表し、これは、次のように計算した：
パーセントＴＧＩ＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００
ここで、Ｔ＝最終用量後の処置グループからの最終腫瘍体積であり、Ｃ＝最後の用量後の対照グループからの最終腫瘍体積である。
腫瘍成長応答は、測定可能な腫瘍がなければ、完全奏効（ＣＲ）として分類した。
統計的手法
一元配置分散分析を用いて、平均腫瘍体積の差を決定した。有意なＦ検定のイベントでは、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）またはシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を使用した（適切であれば）。適用可能な場合、不均一分散を計算に入れるために、ｌｏｇ１０変換を腫瘍体積に適用した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
この試験で使用する材料、およびその供給元を表９−１１に掲載する。
Figure 2017519494
マウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質ＩｇＧ１（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）でのマウスの処置によって、アイソタイプ対照と比較して、レンカ（Ｒｅｎｃａ）、ＣＴ２６、４Ｔ１およびＭＣＡ２０５腫瘍細胞の増殖の有意な低減が起こった（表９−７、表９−８、表９−９および表９−１０、図１９、図２０、図２１および図２２）。
同系モデルには混合型応答が往々にして認められる。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰによる処置の応答は、個々の動物腫瘍グラフから、よりはっきりとしている（図１９のパネルＢ、図２０、図１２−３および図２１）。非処置およびアイソタイプ対照処置動物は、大きな腫瘍サイズのために、第２５日（図１９、図２１）、第４２日（図２２）または第４３日（図２０）までに安楽死させた。用量応答は、腫瘍成長阻害（表９−１２、図１９）または完全奏効を有する動物の数（表９−１３、表９−１４および表９−１５）に基づいて、ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰで処置したマウスに観察された。
Figure 2017519494
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結論
ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰによる腫瘍担持マウスの単剤処置は、非処置およびアイソタイプ対照処置グループと比較して、４つの異なる腫瘍の成長を有意に低減する用量依存性抗腫瘍活性をもたらした。
＜実施例１０：非ヒト霊長類ワクチン接種モデルにおけるＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパクに対する応答＞
この実施例では、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ワクチン接種モデルにおいて、ＯＸ４０アゴニストのインビボ活性を評価した。この試験に用いた抗原は、ＲＳウイルス可溶性Ｆ糖タンパク質（ＲＳＶ ｓＦ）抗原であり、これは、カニクイザルにおいてＴ細胞応答および抗体応答の両方を誘導することができる（データは示していない）。
クローンＬ１０６と呼ばれる抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体は、サル免疫不全ウイルス糖タンパク質１３０（ＳＩＶ ｇｐ１３４０）ワクチン接種の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおいて、ＴおよびＢ細胞応答の両方を増強することが判明している（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＡＤ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２９：５７５−５８５（２００６））。癌患者の第１相ヒト臨床試験において、ＭＥＤＩ６４６９、すなわちクローン９Ｂ１２としても知られるマウス抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体は、共投与された抗原に対するＴ細胞増殖応答（破傷風トキソイドに対するリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答と、スカシガイヘモシアニンに対するデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）応答の両方）を刺激することがわかっており、一部の患者では腫瘍退縮が起こった（Ｃｕｒｔｉ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１８９−９８（２０１３））。
材料および方法
表１０−１には、グループ指定と投与レジメンを記載する。２匹の雌および２匹の雄の実験的にナイーブな中国カニクイザルをこの試験で使用した。動物をランダム化し、グループに割り当てた。動物は、投与時に、約２．３〜５．５歳であり、体重は、２．５〜３．５ｋｇであった。動物は、試験中に社会化（ｓｏｃｉａｌｉｚｅｄ）した。
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全血からのカニクイザル末梢血単核細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配にわたって単離した。手短には、全血（約１５ｍＬ）を、５０ｍＬコニカルチューブ中の３０ｍＬの６０％パーコール希釈標準溶液に重ねた後、１１００×ｇで、室温（ＲＴ）にて２０分間遠心分離した。パーコール界面からＰＢＭＣを採取し、新しいコニカルチューブに移してから、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ペレット化した後、２ｍＬの塩化アンモニウム−カリウム溶解バッファーにＲＴで再懸濁させて、赤血球を溶解した。ＰＢＭＣは、１×ＰＢＳで洗浄してから、ペレット化し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ−ＨＴ計器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）による計数のために２５ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁させた。ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬での１：２０希釈を用いて、総生存ＰＢＭＣ計数を取得した。アッセイタイプは、各々異なる細胞濃度を必要とするため、遠心分離の前に、各動物からのＰＢＭＣサンプルを２つのチューブ：１つは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ用で、もう１つは、Ｋｉ６７アッセイ用に分割した。遠心分離の後、ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＢＭＣは、ＣＴＬ試験培地（Ｌ−グルタミンを含む）中に２×１０6ＰＭＢＣ／ｍＬで再懸濁させ、Ｋｉ６７ ＰＢＭＣは、培地中に５×１０6ＰＭＢＣ／ｍＬで再懸濁させた。
細胞内Ｋｉ６７染色アッセイ
Ｋｉ６７は、全血または精製ＰＭＢＣ中の複数の免疫サブセットにおける細胞増幅の同時評価を可能にする増殖の細胞内（核）マーカである。Ｋｉ６７増殖は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞におけるＯＸ４０アゴニストのインビボ活性を測定する上での確立された薬力学マーカである（Ｃｕｒｔｉ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８（２０１３））。
全てのサルは、第７、４２および５６日には精製ＰＢＭＣを用いて、また第２８、３５、および３８日には全血を用いて、セントラルメモリー（ｃＭ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリー（ｅＴ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞中のＫｉ６７レベルについて評価した。全血またはＰＢＭＣ（１０6細胞／ウェル）の１００μＬのアリコートを９６ウェルｖ字底プレートの複数のウェルに、免疫表現型検査パネル（すなわち、１つはメモリーＴ細胞、１つはＮＫ細胞、および１つはＢ細胞）毎に１ウェルずつ、ピペットで添加した。ＣＤ４＋ｃＭサブセット（ＣＤ９５＋、ＣＣＲ５−）は、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の大部分を占めるのに対して、ＣＤ８＋ｅＭ（ＣＤ９５＋、ＣＣＲ５＋）サブセットは、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の大部分を占める。これらのサブセットに焦点を絞ることによって、アッセイの解析能力を高めた。
表１０−２に掲載する抗体を用いて、ＮＨＰメモリーＴ細胞およびＮＫ細胞のための免疫表現型検査抗体カクテルを調製した。免疫表現型検査抗体カクテルを１００μＬの全血またはＰＢＭＣと一緒に細胞ペレットをＲＴで２０分間インキュベートした。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）染色バッファー（ＦＳＢ）でウェルを２回洗浄した後、ＦＡＣＳ（商標）Ｌｙｓｅと一緒にＲＴで１０分間再懸濁した。次に、細胞ペレットをＦＳＢで洗浄してから、ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍを用いて、ＲＴで１０分間透過処理した（２回）。細胞ペレットをＦＳＢでもう１回洗浄した後、暗所にて１０μＬのＫｉ６７フルオレセインイソチオシアネート抗体を各ウェルにＲＴで４５分かけて添加した。細胞ペレットを２００μＬのＦＳＢで２回洗浄した後、２００μＬのＦＳＢに再懸濁させた。サンプル当たり１０万回のイベントをフローサイトメータで取得した後、ＦＡＣＳ ＤｉｖａおよびＦｌｏｗＪｏ １０．６ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ；Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてデータを解析した。
ＮＨＰ ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔは、ＩＦＮγサイトカインを分泌する個々の細胞に対応する個々のメンブレンスポットを捕捉および定量することにより、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を検出するために用いられる９６ウェルアッセイである。このアッセイは、抗原特異的Ｔ細胞を検出する上で、当分野で最も感度の高いアッセイである。
抗体プレコートプレートを含む抗サルＩＦＮγキットおよび検出抗体は、Ｍａｂｔｅｃｈ（Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ，ＯＨ）から購入し、製造者の指示に従い使用した。プレートをＣＴＬ−Ｔｅｓｔ培地でブロックした。ウェル当たり２００，０００ＰＢＭＣのサンプルをモック（ＣＴＬ−Ｔｅｓｔとジメチルスルホキシド）またはＲＳＶ Ｆペプチドプール（２μｇ／ｍＬ）で３回反復して刺激したのに対し、ウェル当たり２０，０００ＰＢＭＣのサンプルは、正の対照としてのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（１μｇ／ｍＬ）で３回反復して刺激した。プレートを２２±２時間にわたって３７℃でインキュベートした後、ＰＢＳで１０分間洗浄した。ＩＦＮγスポットの検出は、検出抗体（７−Ｂ６−１−ビオチン、１：１０００）とＲＴで２時間のインキュベーション、その後もう１回の洗浄、続いて、二次検出抗体（ストレプトアビジン−ＡＬＰ、１：１０００）とのＲＴで１時間のインキュベーションによって達成した。次に、４分間にわたるＢＣＩＰ／ＮＢＴと基質の添加によって、スポットを視覚化し、プレートを水で入念に洗浄してスポットの成長を停止した後、暗所にてＲＴで一晩乾燥させた。翌日、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレートリーダおよびＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ５．１ソフトウェア（ＣＴＬ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて、各ウェルのスポットを計数した。結果は、ジメチルスルホキシドウェル（バックグラウンド）の除去後、Ｆ特異的スポット形成計数（ＳＦＣ）／１０6ＰＢＭＣとして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて計数した。
ＲＳＶ−Ｆ特異的血清ＩｇＧ検出アッセイ
ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のために、ハイバインド９６ウェル平底プレートを０．１μｇ／ｍＬのＲＳＶ ｓＦタンパク質で、４℃にて一晩コーティングした。血清サンプルを希釈バッファー（１０％スーパーブロックを補充したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０［ＰＢＳＴ］）中に手で１：１００希釈した後、ＢｒａｖｏリキッドハンドラーＳＲＴを用いて、９６ウェルサンプル−希釈ブロック（０．５ｍＬ）中に７回、連続的に１：３希釈した。各サンプル−希釈ブロックはまた、正の対照としてのヒト血清と、アッセイバックグラウンドを測定するための抗血清なしの負の対照の両方を含んだ。アッセイプレートをＰＢＳＴで３回洗浄してから、スーパーブロックでＲＴにて１時間ブロックした後、９６ウェルサンプル−希釈ブロック中の血清希釈物を９６ウェルアッセイプレートに移し、一定の振盪下、ＲＴで１時間さらにインキュベートした。インキュベーションの終了時に、アッセイプレートをＰＢＳＴで３回洗浄してから、一定の振盪下、ＲＴで１時間セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗サルＩｇＧ（１：８０，０００）と一緒にインキュベートした。アッセイプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）中で８〜１５分間発色させた。１Ｎ ＨＣｌで発色を停止した後、ウェルをプレートリーダ上の光学密度（ＯＤ）450で読み取った。血清力価は、各アッセイプレートの平均バックグラウンドの４倍のＯＤ450をもたらした逆数倍（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ−ｆｏｌｄ）血清希釈度として定量した。ＲＳＶ−Ｆ抗原特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価をｌｏｇ2変換し、プロットした。このアッセイについての検出限界（ＬＯＤ）は、血清サンプルで実施した最初の血清希釈の逆数であると決定された。すなわち、１：１００希釈は、ＬＯＤが、１００またはｌｏｇ2６．６であることを意味し、＜１００であるサンプルの帰属ＬＯＤ値は、ＬＯＤの半分であり、これは、本実施例の場合、５０またはｌｏｇ2５．６である。
ＲＳＶ Ａ２マイクロ中和アッセイ
血清ＲＳＶ中和力価は、ＲＳＶ Ａ２−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マイクロ中和アッセイにより決定した。対照および試験サンプル血清を５６℃で１時間熱不活性化することにより、補体を不活性化した。熱不活性化血清対照および試験サンプルは、Ｂｒａｖｏ ＳＲＴリキッドハンドラー（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、１：５または１：１０から出発し、８つの希釈物について連続的に３倍希釈した。ＧＦＰ（ＲＳＶ−ＧＦＰ）を発現するようにエンジニアリングされたＲＳＶ Ａ２を、各血清希釈物、およびウェル当たり約５００蛍光輝点を達成する希釈度のウイルス単独対照ウェルに添加した。その間、９５％〜１００％コンフルエント単層を達成するように９６ウェルプレートにプレーティングしたベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を調製した。血清−ウイルス混合物を中和のためにＲＴで１時間インキュベートした後、Ｂｒａｖｏ ＳＲＴリキッドハンドラーを用いて、２つの同じ２回洗浄済みベロ（Ｖｅｒｏ）細胞プレートに添加した。感染させた細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２２〜２４時間インキュベートした。プレートのデータをＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により取得した後、非中和ＲＳＶ−ＧＦＰによって生成された蛍光輝点を数えた。輝点数を自動化データ解析ワークシートに記録して、各プレート上のウイルス対照に正規化したデータから、２点補間を用いて、ｌｏｇ2５０％阻害濃度力価を決定した。２点補間は、ウイルスの５０％中和付近の２点の線形回帰から計算した。このアッセイの場合、ＬＯＤは、サンプルについて実施した最初の希釈の逆数であると決定された。すなわち、１：１０希釈は、ＬＯＤが、１０またはｌｏｇ2３．３であることを意味し、＜１０であるサンプルの帰属ＬＯＤ値は、ＬＯＤの半分であり、これは、この実施例のケースでは、５またはｌｏｇ2２．３である。
統計的手法
混合効果モデル（Ｂｒｏｗｎ Ｈ ａｎｄ Ｐｒｅｓｃｏｔｔ Ｒ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｘｅｄ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）を用いて、有意なｐ値を取得した。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。有意性に近い値、すなわち０．０５〜０．１のｐ値も、分析および評価の目的のために記録し、特定した。統計的有意性の分析を実施することにより、特定の時点の特定のグループ内の４つの個別動物アッセイ値から計算したＧｅｏＭｅａｎを用いて、グループ間および日間で比較した。
この試験で使用する材料を表１０−２に掲載する。
Figure 2017519494
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結果
細胞内Ｋｉ６７レベル
ＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞中のＫｉ６７
表１０−３に、ＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞増殖結果（Ｋｉ６７誘導パーセンテージ）をまとめる。ＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞増殖を評価するための最適な時点（ピークＫｉ６７レベルに基づく）は、通常、第３５日〜４２日である。
第２９、３１、および３３日（グループ１０）に３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を投与したサルは、第４２日にＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞増殖の最も強力な増強を示し、これは、他の全てのグループより有意に高かった。Ｋｉ６７刺激パーセンテージの増加は、第２８日のベースライン（ｐ＝０．０００３）と比較して非常に有意であり、第３５および４２日には７０％を超えるＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞増殖を誘発した。第５６日までには、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質によって誘発されたＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞増殖は、ほぼベースラインに戻った。グループ４の動物には、５ｍｇ／ｋｇのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を３用量投与したが、グループ５の動物には、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を単一の１ｍｇ／ｋｇ用量で投与した。１用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質によって誘発された応答は、３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンによって誘発された応答と同等であり、ＰＢＳまたはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照グループのそれより有意に強力であったが、これは、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が、単一用量投与後に、カニクイザルにおいて有意なＯＸ４０アゴニズムを達成し得ることを示している。
ＭＥＤＩ６４６９は、ＰＢＳ対照グループと比較して、ＣＤ４＋ｃＭ Ｔ細胞増殖アッセイで有意な活性を示さなかった（表１０−３を参照のこと）。
Figure 2017519494
ＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞中のＫｉ６７
表１０−４に、ＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖結果（Ｋｉ６７誘導パーセンテージ）をまとめる。ＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖は、第４２日で最適であった。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ベースライン（ｐ＝０．００９５）と比較して、第４２日で最も強力なＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖応答を示した。また、ＭＥＤＩ６４６９も、ベースライン（ｐ＝０．００７）およびアイソタイプ対照、ｍＩｇＧ１（ｐ＝０．０１５）と比較して、第４２日までに強力なＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖を誘導した。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質（３用量）について観察されたＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖応答のピーク値は、５０％を上回った（ＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞中の％Ｋｉ６７＋細胞）。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質およびＭＥＤＩ６４６９は、その活性が、ＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖中のＰＢＳおよびｍＩｇＧ１アイソタイプ対照グループと比較して、有意性に達した唯一のＯＸ４０アゴニストであった。
Figure 2017519494
ＮＫ細胞中のＫｉ６７
表１０−５に、ＮＫ細胞増殖結果（Ｋｉ６７＋ＮＫ細胞のパーセンテージ）をまとめる。ＯＸ４０は、低レベルでＮＫ細胞に発現されることが報告されている（Ｃｒｏｆｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３_９１（２００９））ことから、ＮＫ細胞は、ＯＸ４０アゴニズムの直接の標的になり得るか、またはＴ細胞との相互作用により影響され得る。ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、試験した全グループで第４２日に最も高いＮＫ細胞増殖応答を誘発し；応答は、ＰＢＳ対照（ｐ＝０．０２０）およびｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｐ＝０．０３２）と比較して有意であり、ＭＥＤＩ６４６９と類似していた（ｐ＝０．７４）。単一の１ｍｇ／ｋｇ用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、３用量（５ｍｇ／ｋｇ）レジメンと類似していた（ｐ＝０．４８）。ＭＥＤＩ６４６９は、第４２日までにＮＫ細胞増殖を増強し、これは、ＰＢＳ対照（ｐ＝０．００８３）およびｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｐ＝０．０４２）グループより有意に高かった。
Figure 2017519494
Ｂ細胞中のＫｉ６７
表１０−６に、Ｂ細胞増殖結果（Ｋｉ６７＋Ｂ細胞のパーセンテージ）をまとめる。Ｂ細胞は、ＯＸ４０を発現しないことがわかっているが、Ｂ細胞は、活性化Ｔ細胞との相互作用に影響され得る。有意なＢ細胞増殖が、３用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンおよび１用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンで、ベースライン（ｐ＜０．０５）と比較して第４２日までに観察された。３用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンでは、ベースラインとの差が認められたが、これは、恐らく、２匹の動物のベースライン値がなくなったことと、サンプルのサイズが小さいために、結果は統計的に有意ではなかった。ＰＢＳ対照グループもまた、Ｂ細胞増殖の増加を示し、これは、ベースラインと有意に相違した（ｐ＝０．０００７）。そのため、ＰＢＳ対照グループより有意に高いＢ細胞増殖を有する唯一のグループは、１用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループであった（ｐ＝０．０３１６）。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照グループに対して有意なＢ細胞増殖を示す唯一のグループは、１用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンであった。１用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンは、３用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンと同等であった。
Figure 2017519494
ＲＳＶ−Ｆ ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ
表１０−７に、ＥＬＩＳｐｏｔにより測定したＲＳＶ−Ｆ特異的ＩＦＮγ応答をまとめる。ＲＳＶ ｓＦ初回−追加ワクチン接種レジメンに対する最適なＴ細胞応答は、追加抗原の投与から１４〜２８日後に観察することができ、これは、この試験において第４２〜５６日に相当する。動物は、それが、ベースライン（ワクチン接種前）レベルの４倍の応答レベルとおよび≧５０スポット／百万ＰＢＭＣを有した場合、応答動物とみなした。
３用量ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質レジメンは、ＲＳＶ−Ｆ特異的Ｔ細胞応答の最も強力な誘導を示し、これは、第４２および５６日に検出され、各時点で、４／４サルが陽性応答を有した。応答は、第４２日（ｐ＝０．０１２）および第５６日（ｐ＝０．０１０）でベースラインに対して有意であり、ＰＢＳ対照（ｐ＝０．００２３）およびｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｐ＝０．００２４）グループとは有意に相違した。１用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を投与された動物の応答は、第４２日（ｐ＝０．４７）および第５６日（ｐ＝０．３８）で、３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を投与された動物の応答と類似していた。
Figure 2017519494
第４２日では、ＭＥＤＩ６４６９は、２５％応答率を誘発したが、これは、ＰＢＳ対照（ｐ＝０．０９３）またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｐ＝０．０６６）グループとは有意に相違しなかった。第５６日までに、ＭＥＤＩ６４６９は、５０％応答率を有し、これは、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照グループ（ｐ＝０．０３９）と有意に相違した。この応答は、抗原追加後に遅延なく投与されたＭＥＤＩ６４６９と有意に相違しなかった。
抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ力価
表１０−８に、抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ力価をまとめる。Ｂ細胞は、活性化Ｔ細胞との相互作用に影響されて、共有する抗原標的に対してより多くの、またはより高い親和性の抗体を産生することができる。表１０−６のＫｉ６７データからわかるように、Ｂ細胞は、いくつかのＯＸ４０アゴニストレジメンにより誘導されて増殖した。抗原特異的抗体力価を評価することにより、この増殖が、機能性効果に変換されたかどうかを決定した。ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧレベルは、第０日の最初の免疫前にほとんど（または全て）の動物で、アッセイ検出限界に満たなかった。低レベルの抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ抗体が、ＰＢＳ対照グループを除く全ＲＳＶ ｓＦ免疫グループで第１４日に検出された。ＯＸ４０アゴニスト投与から１４日後の第４２日に、ピーク抗体応答が観察された。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照グループは、初回免疫（第１４および２８日）後にＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ力価の増加（ベースラインから約１：２５６力価または８ｌｏｇ2まで）を示したが、これは、ＲＳＶ−Ｆ抗原単独追加後の第４２および５６日までに約８倍さらに増加した（約１：２０４８力価または１１ｌｏｇ2）。ＭＥＤＩ６４６９によるＯＸ４０アゴニズムは、ベースラインから３００倍の増加で、第４２日までにｍＩｇＧ１アイソタイプ対照グループ（ｐ＝０．０５０）と比較して、抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ抗体を有意に増強した（約１：１６，４００力価または１４ｌｏｇ2）。３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループは、第４２日までに抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ抗体の強力な誘導を示し、これは、ＭＥＤＩ６４６９と類似していた（それぞれ、ｐ＝０．３３およびｐ＝０．４４）。第５６日の応答は、これら２グループについて大きさ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）および有意性が第４２日の応答と同等であった。また、１用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループは、抗ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧ抗体の誘導で、３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループと同等であった（ｐ＝０．２３）。
Figure 2017519494
ＲＳＶ中和抗体力価
表１０−９に、動物の血清中に観察された平均（グループ毎）ＲＳＶ中和力価をまとめる。このアッセイは、ＲＳＶウイルスを中和することができる抗体しか評価しないため、ＲＳＶ−Ｆ ＩｇＧアッセイより感度が低い。正の中和応答は、ベースラインに対して中和抗体力価の４倍の上昇として定義する。最大ＲＳＶ中和抗体は、第４２および５６日に観察された。このアッセイにおける最大応答は、３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループで観察され、１００％応答率（４／４動物）を達成した。１用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループは、第５６日には、そのベースラインより有意に高い大きさで、７５％応答率に達し、３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の第４２日（ｐ＝０．２１）および第５６日（ｐ＝０．４５）と類似していた。１用量および３用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質グループは、第５６日でＰＢＳ対照グループに対して統計的有意性（両グループ共に、ｐ＝０．０２９）を示した唯一のグループであった。
Figure 2017519494
結論
ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、Ｋｉ６７増殖レベルおよびＲＳＶ−Ｆ抗原特異的応答の両方に関して強力な応答を誘導した。ＭＥＤＩ６４６９は活性であり、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質と類似のＣＤ８＋ｅＭ Ｔ細胞増殖を誘発すると共に、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質より弱いＲＳＶ−Ｆ特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答を誘発した。全体的に、１用量のＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質（１ｍｇ／ｋｇ）は、評価したほとんどのアッセイで、３用量（５ｍｇ／ｋｇ）と類似の応答を誘導したが、３用量レジメンは、Ｋｉ６７増殖およびＲＳＶ中和抗体の誘発において優れていた。ＲＳＶ ｓＦと一緒に投与されたＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ベースラインと比較して、有意なＦ特異的ＩＦＮγ応答をもたらした。ＮＨＰ試験の結果は、ＮＨＰに対するＯＸ４０アゴニストの投与が、明確な抗原特異的免疫応答を駆動することができるというエビデンスを提供する。
＜実施例１１：ヒトＣＤ４＋エフェクターＴ細胞のＴｒｅｇ媒介性抑制に対するヒトＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパクの作用＞
この実施例では、ヒト調節Ｔ細胞の抑制作用に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパクの作用を調べた。
材料および方法
エフェクターおよび調節Ｔ細胞の分離
非特定化ヒト白血球錐体細胞（ｃｏｎｅｓ）は、英国の国立保健サービス輸血サービス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ）（ＮＨＳＢＴ）により供給された。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓに血液を重ねた後、製造者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）の指示に従い遠心分離することによって、白血球錐体細胞から単離した。ヒトＣＤ４＋エフェクターおよび調節Ｔ細胞は、ヒトＴ調節細胞単離キットを用いて、製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）の指示に従い、ＰＢＭＣから単離した。手短には、この方法は、非ＣＤ４＋細胞の抗体標識および磁気ビーズによる枯渇を用いたそれらの除去による全ＣＤ４＋細胞の負の選択を含む。次に、抗ＣＤ２５で標識した後、磁気ビーズ（後に、単離した細胞から除去される）を用いた正の選択によって、調節Ｔ細胞をエフェクターＣＤ４＋細胞から分離する。
２つの連続したステップで、丸底９６ウェル組織培養プレートを抗ＣＤ３抗体および試験物質でコーティングした。第１ステップでは、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体を各ウェルに添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで洗浄してから、１００μＬの試験または対照物質を関連ウェルに適切な濃度で添加した後、プレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを次の抑制アッセイで使用する前に、ＰＢＳで再度洗浄した。
ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＳＦＥ細胞増殖キットを用いて、製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）の指示に従い、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ）でエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を標識した。
エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞および調節Ｔ細胞を抗ＣＤ３コーティングプレート中に１：１または１：２で共培養した。培地は、１％ｖ／ｖペニシリンおよびストレプトマイシン、５％ｖ／ｖヒトＡＢ血清および１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を含有するＲＰＭＩ−１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉであった。培養条件は、３７℃の温度および５％ＣＯ2の雰囲気であった。
４日の培養後、細胞を培養プレートから除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０で、製造者（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＵＫ）の指示に従い染色した。染色後、細胞をＦＡＣＳバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄してから、１００μＬのＣｅｌｌＦｉｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で固定した後、室温で１５分間のインキュベーションを行った。
固定した細胞をＦＡＣＳバッファーに懸濁させた後、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータを用いて分析した。分裂したエフェクターＴ細胞（ＣＦＳＥ低）のパーセンテージを蛍光競合の後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョンｖＸ．０．７）を用いて評価した。非生存（ｅＦｌｕｏｒ陽性）細胞および調節Ｔ細胞（ＣＦＳＥ陰性）を識別した後、分析から排除した。
平均値および平均値の標準誤差の決定を含む、データのグラフ表示をＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０を用いて作成した。
この実施例で使用する材料を表１１−１に掲載する。
Figure 2017519494
結果
ヒトＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質は、ヒトエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の調節Ｔ細胞媒介性抑制を克服する
ヒトエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、刺激の非存在下では分裂しなかった。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の添加により、３３％までの分裂細胞のパーセンテージの増加が起こった。濃度４０ｎＭまたは１０ｎＭのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質の添加によって、分裂細胞のパーセンテージがそれぞれ４１％および６１％まで増加した（図２３）。濃度４０ｎＭまたは１０ｎＭの対照構築物（Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＩｇＧ１；このフェニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）への突然変異は、ＯＸ４０Ｌタンパク質のＯＸ４０受容体結合活性を除去する；実施例１を参照されたい）の添加では、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８単独に対して、分裂細胞の％を有意に増加しなかった（図２３「アイソタイプ対照」（Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＩｇＧ１））。
エフェクター対Ｔｒｅｇ比１：１の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の添加により、分裂細胞のパーセンテージが１５％まで減少した。１：２のエフェクター対Ｔｒｅｇ比の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の添加では、分裂細胞のパーセンテージがさらに１２％まで減少した。４０ｎＭまたは１０ｎＭの対照構築物（Ｆ１８０Ａ ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＩｇＧ１）の添加は、１：１または１：２のいずれのエフェクター対Ｔｒｅｇ比で存在する場合も、ＴｒｅｇによるエフェクターＴ細胞分裂の抑制に有意に影響しなかった。対照的に、４０ｎＭまたは１０ｎＭのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質の添加では、エフェクター対Ｔｒｅｇ比１：１のＴｒｅｇの存在下で培養すると、分裂エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをそれぞれ５２％および６７％まで、有意に増加した。４０ｎＭおよび１０ｎＭのＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ１融合タンパク質の添加では、エフェクター対Ｔｒｅｇ比１：２のＴｒｅｇの存在下で培養すると、分裂エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをそれぞれ５３％および６６％まで、有意に増加した（図２３）。
エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の調節Ｔ細胞媒介性抑制に対するＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の作用は、濃度依存性である
続くアッセイにおいて、前述したＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質媒介の作用の濃度依存性を評価した。このアッセイでは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の添加により、３．４％の分裂ＣＤ４＋エフェクター細胞が得られた。これは、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質の添加によって増加したが、これらの増加は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質が分裂エフェクター細胞のパーセンテージを１７％に増加した２．５ｎＭを除いて、統計的有意性に達しなかった（図２４）。
１：１比でのＴｒｅｇの添加によって、分裂エフェクターＴ細胞のパーセンテージは２．５％に減少した。４０ｎＭおよび２．５ｎＭのＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰａｔの添加は、分裂エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをそれぞれ６．７％および２４％まで、有意に増加したが、１０ｎＭおよび０．６２ｎＭはそうではなかった（図２４）。
濃度４０ｎＭの対照物質（ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ４Ｐ（表１−１を参照））の添加は、単独またはＴｒｅｇの存在下のいずれで培養した場合も、分裂ＣＤ４＋エフェクター細胞の％を有意に増加しなかった（図２４）。
結論
ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質は、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖に対するＴｒｅｇ細胞の抑制作用を克服することができる。Ｔｒｅｇ細胞媒介性抑制に対するＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の作用は、濃度依存性であり、少なくとも２．５ｎＭのＯＸ４０Ｌ融合タンパク質を必要とする。
＜実施例１２：アカゲザルにおけるＯＸ４０アゴニストの薬力学＞
アカゲザルへの静脈内投与後に、ＯＸ４０アゴニストの薬力学を決定した。値は、ＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２抗体）またはＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰを投与後に、末梢血Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞の増殖（免疫細胞に関しては細胞表面免疫調節タンパク質および細胞内Ｋｉ−６７の変化として）に基づくものであった。細胞増殖のマーカとしての発現Ｋｉ−６７、ならびにＰＤ−１およびＩＣＯＳなどの免疫調節タンパク質をこれらの細胞集団について調べた。さらに別のグループは、対照として食塩水を受けた。
本試験は、以下のように実施した（図２５も参照のこと）。
Figure 2017519494
生存単細胞をフローサイトメトリーにより分析して、薬力学マーカの変化を決定した。全メモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、それぞれ、ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ９５+ＣＤ２０-およびＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ９５+ＣＤ２０-として定義した。セントラルメモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、それぞれ、ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ２８+ＣＤ９５+ＣＣＲ５-ＣＣＲ７+ＣＤ２０-およびＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２８+ＣＤ９５+ＣＣＲ５-ＣＣＲ７+ＣＤ２０-として定義した。エフェクターメモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、それぞれ、ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ２８-ＣＤ９５+ＣＣＲ７-ＣＤ２０−およびＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２８-ＣＤ９５+ＣＣＲ７-ＣＤ２０−として定義した。Ｂ細胞は、ＣＤ３-ＣＤ２０+の細胞として定義した（以下の表１２−２を参照のこと）。
Figure 2017519494
ＭＥＤＩ６４６９およびＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰについての結果はいずれも、ＰＢＳ対照グループと比較したピーク生物効果で、定量的および定性的の両方で異なっていた。ＭＥＤＩ６４６９は、ＰＢＳ処置グループに対して、全メモリーＣＤ４Ｔ細胞増殖に３．５倍の平均増加を示した（７．６％に比して３０％）。これは、セントラルメモリーＣＤ４の３．０倍の増加（７．７％に比して２３％）およびエフェクターメモリーＣＤ４Ｔ細胞の３．２倍増加（６．８％に比して２２％）に表された。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰは、全メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に７倍の増加（７．６％に比して５２％）を誘導した。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰ誘導によるエフェクターメモリーＣＤ４Ｔ細胞増殖のピーク増加（第１４日）は、全およびセントラルメモリーＣＤ４Ｔ細胞増殖について観察されたもの（第１０日）に対して遅延した。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰに応答したＣＤ８＋全メモリーＴ細胞の増殖の増加（７．６％に比して１９％；２．５倍）は、ＭＥＤＩ６４６９（９．２％に比して１７％；１．８倍）について観察されたものと類似していた。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの場合、全メモリーＣＤ８Ｔ細胞の増加は、セントラルメモリーＣＤ８Ｔ細胞の３．３倍の変化（８．９％に比して２９％）、およびエフェクターメモリーＣＤ８Ｔ細胞の１．９倍の変化（１１％に比して２１％）に表された。ＣＤ４Ｔ細胞について観察されたものと同様に、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰ処置後のエフェクターメモリーＣＤ８Ｔ細胞増殖のピーク（第１４日）は、全およびセントラルメモリーＣＤ８Ｔ細胞増殖について観察されたもの（第１０日）に対して遅延した。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰまたはＭＥＤＩ６４６９のいずれについても、ナイーブＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞増殖の実質的変化は観察されなかった（図２６）。
全メモリーＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＣＯＳ＋細胞の増加は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの全メモリーＣＤ４Ｔ細胞のＯＸ４０媒介性増殖と定性的に対応しており、平均陽性細胞％の６．４倍増加を示した（ＰＢＳグループの２．３％に対して１５％）が、細胞に関してはより低い全体的総誘導パーセンテージを示した。ＩＣＯＳ＋メモリーＣＤ８Ｔ細胞の６．０倍増加も観察され（０．６４％に対して３．８）、これは、ＣＤ８メモリーＴ細胞増殖の相対増加（Ｋｉ６７；２．５倍）より高かったが、全体的総誘導率％は低かった。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰとは対照的に、ＭＥＤＩ６４６９は、ＩＣＯＳ誘導について、より低い２．４倍増加を誘導し、これは、全メモリーＣＤ４Ｔ細胞上での３．５倍の増殖誘導（Ｋｉ６７）と類似していた。全メモリーＣＤ８Ｔ細胞のＭＥＤＩ６４６９処置後に、ＩＣＯＳ誘導は一切観察されなかったため、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの結果とは相違した。ナイーブＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのＩＣＯＳの発現の変化は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰまたはＭＥＤＩ６４６９について観察されなかった（図２７）。
ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの投与後に全メモリーＣＤ４Ｔ細胞上のＰＤ−１発現は、３．１倍増加し（１．１％ＰＢＳグループに対して３．３％）、また、ＭＥＤＩ６４６９の投与では、増加は約５．１倍（１．１から５．４％）であったが、総パーセンテージ基準での誘導は低かった（それぞれ、２．０％および４．０％）。全メモリーＣＤ８Ｔ細胞については、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰおよびＭＥＤＩ６４６９は、ＰＤ−１発現細胞の２．７倍（０．９２％に比して２．５％）および５．０倍（０．５４％に比して２．６％）のピーク増加を誘導したが、各々の総パーセンテージ基準での増加は、かなり低かった（それぞれ、１．６％および２．１％）。全メモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上でのＭＥＤＩ６４６９によるＰＤ−１の優れた誘導は、ＩＣＯＳについて観察されたものとは定性的に異なっており、その場合、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰ誘導の変化の方が高かった。ナイーブＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのＰＤ−１の発現の変化は、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰまたはＭＥＤＩ６４６９について観察されなかった（図２８）。
ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰおよびＭＥＤＩ６４６９は、ＣＤ２０＋Ｂ細胞の増殖を誘導した。ピークでは、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰは、Ｂ細胞でのＫｉ６７発現を２．８倍（８．５％に比して２４％）増加し、ＭＥＤＩ６４６９は、２．５倍（６．７％に比して１７％）であった（図２９）。
結果
ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰは、全、セントラル、およびエフェクターメモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導した。効果の大きさは、ＣＤ８Ｔ細胞集団よりＣＤ４の方が大きかった。エフェクターメモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞増殖の誘導は、全およびセントラルメモリーＴ細胞に対して遅く、これは、エフェクターＴ細胞増殖に対する間接的生物効果または遅延生物効果のいずれかを示している。ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰは、ＭＥＤＩ６４６９よりも高いレベルの全メモリーＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導したが、全メモリーＣＤ８Ｔ細胞増殖の誘導は、薬物の上記用量およびスケジュールで類似していた。
ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰは、全メモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞でのＩＣＯＳおよびＰＤ−１発現を誘導し、全メモリーＣＤ８Ｔ細胞と比較して、全メモリーＣＤ４で観察された各々の総パーセンテージ誘導の方が高かった。ＭＥＤＩ６４６９よりも、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの方が、全メモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上に多くのＩＣＯＳ誘導が観察された。しかし、全メモリーＣＤ４Ｔ細胞上では、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰよりも、ＭＥＤＩ６４６９によるＰＤ−１の誘導の方が高く、これは、これらの細胞上で、アゴニストｍＡｂＭＥＤＩ６４６９に対して、ＰＤ−１Ｔ細胞阻害タンパク質を誘導するＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質ＩｇＧ４−ＦＰの能力の生物学的相違の可能性を示している。
本開示の広がりおよび範囲は、上に記載した例示的実施形態のいずれにも制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの同等物によってのみ、限定されるべきである。

Claims (90)

  1. ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン；機能性三量体化ドメイン；およびＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドサブユニットであって、前記ポリペプチドサブユニットが、三量体または六量体タンパク質に自己組織化することができる、ポリペプチドサブユニット。
  2. アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、次に前記三量体化ドメイン、続いて前記ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチドサブユニット。
  3. 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインのカルボキシ末端が、前記三量体化ドメインのアミノ末端に直接融合され、且つ、前記三量体化ドメインのカルボキシ末端が、前記ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインのアミノ末端に直接融合されている、請求項２に記載のポリペプチドサブユニット。
  4. 前記ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項の記載のポリペプチドサブユニット。
  5. 前記ヒンジ領域が、完全な重鎖間ジスルフィド結合形成を賦与する突然変異を含む、請求項４に記載のポリペプチドサブユニット。
  6. 前記突然変異が、ＥＵ番号付与に従い、２２８位でのセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ）を含む、請求項５に記載のポリペプチドサブユニット。
  7. 前記ヒンジ領域が、配列番号４のアミノ酸１〜１２を含む、請求項５または請求項６に記載のポリペプチドサブユニット。
  8. 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、ＣＨ２領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  9. 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、ＣＨ３領域をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  10. 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、配列番号４のアミノ酸１〜２２９を含む、請求項９に記載のポリペプチドサブユニット。
  11. 前記三量体化ドメインが、αヘリックスコイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  12. 前記三量体化ドメインが、ＴＲＡＦ２；トロンボスポンジン１；マトリリン−４；ＣＭＰ（マトリリン−１）；ＨＳＦ１；またはクビリンから得ることができる、請求項１１に記載のポリペプチドサブユニット。
  13. 前記三量体化ドメインが、ヒトＴＲＡＦ２（配列番号２）のアミノ酸３１０〜３４９を含む、請求項１２に記載のポリペプチドサブユニット。
  14. 前記ＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインが、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号１）のアミノ酸５１〜１８３を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  15. 前記ポリペプチドサブユニットの６つから組織化された六量体タンパク質が、ヒトＯＸ４０に特異的に結合することができる、請求項１４に記載のポリペプチドサブユニット。
  16. アミノ酸配列：配列番号４を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  17. 結合した異種薬剤をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  18. 前記異種薬剤が、異種ポリペプチドであり、ペプチド結合を介して前記ポリペプチドサブユニットに融合されている、請求項１７に記載のポリペプチドサブユニット。
  19. 前記異種ポリペプチドが、前記ＩｇＧ４−ＦｃドメインのＮ末端に融合され、ＯＸ４０Ｌの前記受容体結合ドメインのＣ末端に融合され、前記ＩｇＧ４−ＦｃドメインのＣ末端および前記三量体化ドメインのＮ末端に融合されるか、または前記三量体化ドメインのＣ末端およびＯＸ４０Ｌの前記受容体結合ドメインのＮ末端に融合されている、請求項１８に記載のポリペプチドサブユニット。
  20. 前記異種薬剤が、前記ポリペプチドサブユニットに化学的にコンジュゲートされている、請求項１７に記載のポリペプチドサブユニット。
  21. 前記異種薬剤が、細胞傷害性分子、安定剤、免疫応答改質剤、または検出可能な薬剤を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット。
  22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の３つのポリペプチドサブユニットを含む、三量体タンパク質。
  23. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の６つのポリペプチドサブユニットを含む、六量体タンパク質。
  24. 前記６つのポリペプチドサブユニットが、各々アミノ酸配列：配列番号４を含む、請求項２３に記載の六量体タンパク質。
  25. ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を含む、請求項２４に記載の六量体タンパク質。
  26. ヒト、カニクイザル、アカゲザル、もしくはこれらの任意の組み合わせに由来する活性化ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞に発現されるＯＸ４０に特異的に結合する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  27. ヒト、カニクイザル、アカゲザル、またはこれらの任意の組み合わせ由来の一次活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるＯＸ４０に特異的に結合することができる、請求項２６に記載の六量体タンパク質。
  28. 一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるヒトＯＸ４０に対する前記結合親和性が、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約８．０ｐＭである、請求項２６または請求項２７に記載の六量体タンパク質。
  29. 前記結合親和性が、約３．６ｐＭである、請求項２８に記載の六量体タンパク質。
  30. フローサイトメトリーにより測定して、約０．５〜約３．０ｐＭで、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に２０％受容体占有率（ＥＣ20）を、約３．０〜約１０ｐＭで、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に５０％受容体占有率（ＥＣ50）を、ならびに約３５ｐＭ〜約７０ｐＭで、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞上に９０％受容体占有率（ＥＣ90）を達成することができる、請求項２６または請求項２７に記載の六量体タンパク質。
  31. ＥＣ20が、約１．８ｐＭで、ＥＣ50が、約６．６ｐＭで、ＥＣ90が、約５３ｐＭである、請求項３０に記載の六量体タンパク質。
  32. ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現されたヒトＯＸ４０に対する前記結合親和性が、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約２４ｐＭである、請求項２６に記載の六量体タンパク質。
  33. 前記結合親和性が、約１２ｐＭである、請求項３２に記載の六量体タンパク質。
  34. フローサイトメトリーにより測定して、約１．０〜約１５ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上でＥＣ20を、約１．０〜約４０ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上でＥＣ50を、ならびに約１０〜約１００ｐＭで、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上でＥＣ90を達成することができる、請求項２６に記載の六量体タンパク質。
  35. ＥＣ20が約７．２ｐＭであり、ＥＣ50が約１６ｐＭであり、ＥＣ90が約５７ｐＭである、請求項３４に記載の六量体タンパク質。
  36. 一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるカニクイザルＯＸ４０に対する前記結合親和性が、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約５０ｐＭである、請求項２６または請求項２７に記載の六量体タンパク質。
  37. 前記結合親和性が、約２４ｐＭである、請求項３６に記載の六量体タンパク質。
  38. 一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞に発現されるアカゲザルＯＸ４０に対する前記結合親和性が、フローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約５０ｐＭである、請求項２６または請求項２７に記載の六量体タンパク質。
  39. 前記結合親和性が、約２１ｐＭである、請求項３８に記載の六量体タンパク質。
  40. プレートアッセイにおいて、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の用量依存性増殖および活性化ＣＤ４+Ｔ細胞からの用量依存性サイトカイン放出を誘導する、請求項２３〜３９のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  41. 全てフローサイトメトリーにより測定して、約１．０ｐＭ〜約１５ｐＭの六量体タンパク質濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞において２０％最大増殖応答（ＥＣ20）を達成することができ、約５．０ｐＭ〜約２５ｐＭの六量体タンパク質濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞において５０％最大増殖応答（ＥＣ50）を達成することができ、ならびに、約５０ｐＭ〜約６５ｐＭの六量体タンパク質濃度で、一次活性化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞において９０％最大増殖応答（ＥＣ90）を達成することができる、請求項４０に記載の六量体タンパク質。
  42. ＥＣ20が、約８．０ｐＭで、ＥＣ50が、約１４ｐＭで、ＥＣ90が、約５７ｐＭである、請求項４１に記載の六量体タンパク質。
  43. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４０に記載の六量体タンパク質。
  44. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４３に記載の六量体タンパク質。
  45. 一次活性化カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞および一次活性化アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞において、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖およびサイトカイン放出を達成することができる、請求項２３〜３９のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  46. ＦｃγＲ発現細胞の存在下で、ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＮＦκＢ経路を活性化することができる、請求項２３〜３９のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  47. 前記ＯＸ４０発現Ｔ細胞が、前記ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼリポータ細胞である、請求項４６に記載の六量体タンパク質。
  48. 前記細胞が、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＯＸ４０またはアカゲザルＯＸ４０を発現する、請求項４６または４７に記載の六量体タンパク質。
  49. 癌治療が必要な対象に対する有効量の投与によって、前記対象における腫瘍成長を阻害することができる、請求項２３〜４８のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  50. 前記腫瘍成長阻害が、Ｔ細胞の存在下で達成される、請求項４９に記載の六量体タンパク質。
  51. 前記腫瘍成長が、アイソタイプが一致する対照の投与と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％阻害される、請求項４８または請求項４９に記載の六量体タンパク質。
  52. ＯＸ４０との結合を介して、活性化したＯＸ４０発現ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を誘導することができるが、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的にトリガーしない、請求項２３〜５１のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  53. Ｃｌｑに結合しないか、または活性化ＣＤ４+Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞傷害性をトリガーしない、請求項２３〜５２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  54. 対象に対する前記六量体タンパク質およびワクチン抗原の共投与によって、ＣＤ４＋セントラルメモリー（ｃＭ）Ｔ細胞増殖を増大することができる、請求項２３〜５３のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  55. 対象に対する前記六量体タンパク質およびワクチン抗原の共投与によって、エフェクターメモリー（ｅＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増大することができる、請求項２３〜５３のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  56. 対象に対する前記六量体タンパク質およびワクチン抗原の共投与によって、ＮＫ細胞増殖を増大することができる、請求項２３〜５３のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  57. 対象に対する前記六量体タンパク質およびワクチン抗原の共投与によって、Ｂ細胞増殖を増大することができる、請求項２３〜５３のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  58. ＣＤ４＋ｃＭＴ細胞増殖、ＣＤ８＋ｅＭＴ細胞増殖、ＮＫ細胞増殖、Ｂ細胞増殖、またはこれらの任意の組み合わせが、末梢血単核細胞における細胞内Ｋｉ６７発現として測定される、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  59. 対象に対する前記六量体タンパク質およびワクチン抗原の共投与によって、抗原特異的Ｔ細胞応答を増大することができる、請求項２３〜５８のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  60. 前記抗原特異的Ｔ細胞応答が、増大したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）発現として測定される、請求項５９に記載の六量体タンパク質。
  61. 対象に対する前記六量体タンパク質およびワクチン抗原の共投与によって、抗原特異的ＩｇＧ力価を高めることができる、請求項２３〜６０のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
  62. 前記抗原が、呼吸器合胞体ウイルスの可溶性Ｆ糖タンパク質（ＲＳＶ ｓＦ）であり、六量体タンパク質およびＲＳＶ抗原を対象に共投与することによって、ＲＳＶ中和抗体の力価を高めることができる、請求項６１に記載の六量体タンパク質。
  63. 請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質、および担体を含む、組成物。
  64. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット、または請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド。
  65. 配列番号３を含む、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
  66. 請求項６４または６５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  67. 請求項６４または６５に記載のポリヌクレオチド、または請求項６６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  68. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチドサブユニット、または請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質を生成する方法であって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質が発現される条件下で、請求項６７に記載の宿主細胞を培養するステップ、および前記ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質を回収するステップを含む方法。
  69. 活性化Ｔ細胞の生存または増殖を促進する方法であって、活性化Ｔ細胞を請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、前記六量体タンパク質が、前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる方法。
  70. 活性化Ｔ細胞増殖の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介性抑制を低減する方法であって、活性化Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞の混合物を請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、前記六量体タンパク質が、前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる方法。
  71. 活性化Ｔ細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、活性化Ｔ細胞を請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、前記六量体タンパク質が、前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる方法。
  72. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記活性化Ｔ細胞が、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞、活性化ＣＤ８+Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項６９〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記活性化ＣＤ４+Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項７４に記載の方法。
  76. Ｔ細胞活性化を促進する方法であって、Ｔ細胞を請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、前記六量体タンパク質が、前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる方法。
  77. 前記ＩｇＧ４−Ｆｃドメインと、ＦｃγＲを発現する細胞との相互作用による前記六量体タンパク質の架橋をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  78. ＦｃγＲを発現する前記細胞が、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄もしくは形質細胞様樹状細胞、濾胞性樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞、好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、原発性ヒト腫瘍または腫瘍流入領域もしくは非流入領域リンパ節由来のＣＤ４５+細胞、その他の二次元もしくは三次元リンパ系構造由来のＣＤ４５+細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項７７に記載の方法。
  79. Ｔ細胞活性化をＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激によって測定することができる、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記活性化Ｔ細胞が、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞、活性化ＣＤ８+Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記活性化ＣＤ４+Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４+Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４+Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記接触ステップが、有効量の前記六量体タンパク質を対象に投与するステップを含む、請求項６９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 治療が必要な対象に、請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質または請求項６３に記載の組成物を有効量で投与するステップを含む、対象における癌の治療方法。
  84. 前記癌が、固形腫瘍である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記六量体タンパク質または組成物の投与によって、腫瘍成長を阻害することができ、腫瘍縮小を促進することができるか、あるいは、その両方が可能である、請求項８３または請求項８４に記載の方法。
  86. 腫瘍成長阻害が、Ｔ細胞の存在下で達成される、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 対象における免疫応答を増大する方法であって、それを必要とする対象に、請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質または請求項６３に記載の組成物を治療に有効な量で投与するステップを含む方法。
  88. 前記対象が、ヒト対象である、請求項８３〜８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. Ｔ細胞上でのＩＣＯＳの発現を誘導する方法であって、Ｔ細胞を請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、前記六量体タンパク質が、前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる方法。
  90. Ｔ細胞上でのＰＤ−１の発現を誘導する方法であって、Ｔ細胞を請求項２３〜６２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質と接触させるステップを含み、ここで、前記六量体タンパク質が、前記Ｔ細胞の表面上のＯＸ４０に特異的に結合することができる方法。
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