JP2017517485A - 免疫調節方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

外因性抗原を含有する細胞及びその使用が提供される。本発明は、例えば免疫トレランスを誘導する方法であって、自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記自己免疫疾患、障害又は病態を媒介する前記抗原に対して前記対象において免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される、方法を提供する。

Description

本発明の分野は、疾患及び障害を治療するための医薬組成物である。
異常な免疫活性化は、多くのヒト疾患及び病態の顕著な特徴である。自己免疫疾患は、生体の免疫系が自己抗原を非自己として不適切に感知し、生体自体の組織を攻撃するときに生じる。炎症性疾患及びアレルギーは、生体の免疫系が共通の食物由来抗原又は環境抗原によって不適切に惹起されるときに生じ得る。様々なヒト疾患の治療に使用されるポリペプチド及びタンパク質は、多くの場合に、それらが外来抗原であるかのようにそれらに反応する免疫細胞によって破壊されるか、中和されるか、又は他に無効にされる。
不適切な免疫活性化の疾患の現行の治療は、コルチコステロイド類などの化学剤、又は抗ヒスタミン薬、抗体、若しくはサイトカインなどの炎症性メディエーターの阻害薬による免疫抑制を含む。これらの全身性の治療は免疫系を広範に抑制するため、感染症に罹り易くなるなど、高い罹患性を伴う。
ある種の重度のアレルギーについては、時間をかけて徐々に用量を漸増させながら原因タンパク質に曝露することによってアレルゲンに対する「トレランス」を誘導しようとする臨床試験が実施中である。これまでのところ、これらの治療は長期有効性を欠き、重度のアナフィラキシーのリスクを伴う。
これらの疾患を治療するための新規療法が必要とされている。
本発明は、特定の態様において、抗原を発現する単離された除核造血細胞に関する。除核造血細胞は、本明細書では、「ＥＨＣ」（又はその単数形では：「ＥＨＣ」）と称する。一部の実施形態において、除核造血細胞又はＥＨＣは核物質を欠く。例えば、ＥＨＣは赤血球系細胞又は血小板系細胞（ｔｈｒｏｍｂｏｉｄ ｃｅｌｌ）であり得る。一部の実施形態において、核物質を欠くＥＨＣは、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、網赤血球、又は血小板である。一部の実施形態において、除核造血細胞又はＥＨＣは、例えばその核物質を失うように誘導されるか又は機能上除核された状態で複製不能となるように誘導される有核前駆赤血球系細胞又は前駆血小板系細胞である。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは赤血球細胞などの循環細胞である。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、定義付けられた因子を使用して造血前駆体から培養される。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは血小板などの血小板系細胞である。一部の実施形態において、血小板系細胞は、定義付けられた因子を使用して造血前駆体から培養される。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、自己使用又は同種使用のいずれかのために患者から単離された、抗原と接触する初代細胞である。
本発明の特定の態様は、例えば外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物の形態で対象に投与したときに免疫トレランスを誘導する能力を有する外因性抗原発現ＥＨＣに関する。ＥＨＣが発現する外因性抗原は、特定の疾患、障害又は病態に合わせて調整され得る。外因性抗原発現ＥＨＣは、目的の抗原の例えば表面提示、細胞内発現、細胞内負荷、又は表面コンジュゲーションなど、複数の方法で抗原を含むことができる。外因性抗原発現ＥＨＣは、異常な免疫活性化疾患を既存の治療と比べてより有効に及び／又はより少ない副作用で管理し得る。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣは、広範な免疫系生理機能が実質的に摂動を受けることのないまま免疫系を選択的に調節し得る。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、抗原特異的Ｔ及びＢリンパ球の破壊、失活、及び／又はアネルギーを誘導し得る。それに代えて又は加えて、外因性抗原発現ＥＨＣは、抗原特異的調節性Ｔリンパ球の増殖を誘導し得る。
本発明の特定の態様は、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、及び膜性腎炎などで免疫細胞によって認識される外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣに関する。
本発明の特定の態様は、炎症性疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は他の特発性炎症性腸疾患などで免疫細胞によって認識される外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣに関する。
本発明の特定の態様は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合媒介性疾患、例えば、移植片対宿主病又は移植臓器拒絶反応などで免疫細胞によって認識される外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣに関する。
本発明の特定の態様は、アレルギー性疾患、例えば、喘息、ピーナッツアレルギー、甲殻類アレルギー、花粉アレルギー、乳タンパク質アレルギー、虫刺されアレルギー、及びラテックスアレルギーなどで免疫細胞によって認識される外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣに関する。
本発明の特定の態様は、例えば、血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ凝固因子、血友病Ｂにおける第ＩＸ凝固因子、関節リウマチ及び他の炎症性疾患における抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）抗体、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるアスパラギナーゼなどの、その有効性又は効力が免疫細胞によって低減されるか又は損なわれる治療用タンパク質である外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣに関する。
本発明の特定の態様は、ａ）補体調節を媒介するか、ｂ）免疫複合体の結合及び隔絶を媒介するか、ｃ）自己免疫性抗体であるか、又はｄ）病原性粒子であるポリペプチドの完全長、トランケーション、及びキメラ融合物を含む外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣに関する。一部の実施形態において、外因性抗原は、ある小分子基質から別の小分子生成物への変換又は例えばポリペプチド基質の開裂を含めた、あるポリペチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）基質から第２のポリペプチド生成物への変換において酵素的に活性なポリペプチドの完全長、トランケーション、及びキメラ融合物を含む。
本発明はまた、特定の態様において、本明細書に提供される外因性抗原発現ＥＨＣ及びその医薬組成物を使用した疾患の治療方法も提供する。
一部の態様において、本明細書には、免疫トレランスを誘導する方法が開示される。本方法は、自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、自己免疫疾患、障害又は病態を媒介する抗原に対して対象において免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される。
一部の実施形態において、自己免疫疾患は、多発性硬化症、１型糖尿病、及び表Ｆに列挙されるものからなる群から選択される。
一部の実施形態において、本方法は、自己免疫疾患、障害又は病態が治療されるか、又はその症状が低下するように、医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップをさらに含む。
特定の実施形態において、本方法は、自己免疫疾患、障害又は病態が予防されるように、医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップをさらに含む。
他の実施形態において、本方法は、抗原特異的免疫細胞の割合が治療期間中に実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態において、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、免疫細胞はＢ細胞である。
一部の実施形態において、抗原特異的免疫細胞の濃度の低下は、対象から採取された生物学的試料からフローサイトメトリーによって計測される。
一部の実施形態において、生物学的試料は、リンパ節生検、脾臓試料、又は末梢血である。
一部の実施形態において、抗原特異的免疫細胞の濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。
他の実施形態において、抗原特異的免疫細胞の濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、抗原特異的免疫細胞の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
特定の実施形態において、本医薬組成物は、少なくとも治療期間中である期間にわたり抗原特異的免疫細胞の濃度が実質的に低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、循環中の抗原特異的抗体の濃度が治療期間中に実質的に低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、循環中の抗原特異的抗体の濃度はＥＬＩＳＡによって計測される。
一部の実施形態において、抗原特異的循環抗体の濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。
一部の実施形態において、抗原特異的抗体の濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。
特定の実施形態において、本医薬組成物は、抗原特異的循環抗体の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
特定の実施形態において、本医薬組成物は、少なくとも治療期間中である期間にわたり抗原特異的循環抗体の濃度が実質的に低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、抗原特異的調節性Ｔ細胞の割合が治療期間中に実質的に増加するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、抗原特異的免疫細胞の濃度の低下は、対象から採取された生物学的試料からフローサイトメトリーによって計測される。
一部の実施形態において、生物学的試料は、リンパ節生検、脾臓試料、又は末梢血である。
特定の実施形態において、抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超増加する。
特定の実施形態において、抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超増加する。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に増加するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、少なくとも治療期間中である期間にわたり抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度が実質的に増加するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、自己免疫疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防されるか、軽減されるか、又は遅延するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。
一部の実施形態において、治療期間は、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である。
特定の実施形態において、治療期間内における投与間の時間間隔は、投与される医薬組成物中に存在する外因性抗原を発現する除核造血細胞の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満にまで外因性抗原を発現する除核造血細胞の数が減少する期間以下である。
一部の実施形態において、投与頻度は、抗原特異的免疫細胞の濃度を、自己免疫疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。
特定の実施形態において、投与頻度は、抗原特異的循環抗体の濃度を、自己免疫疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。
特定の実施形態において、投与頻度は、抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度を、自己免疫疾患、障害又は病態の症状に関連する閾値レベルより高く有効に増加させるのに十分である。
一部の実施形態において、除核造血細胞は、赤血球系細胞、血小板系細胞、又はそれらの前駆体である。一部の実施形態において、赤血球系細胞は赤血球又は網赤血球である。一部の実施形態において、血小板系細胞は血小板である。
一部の実施形態において、除核造血細胞はドナーから単離される。一部の実施形態において、除核造血細胞は対象から自己細胞によって誘導される。一部の実施形態において、除核造血細胞は同種細胞によって誘導される。一部の実施形態において、除核造血細胞は異種細胞によって誘導される。
一部の実施形態において、有核造血細胞は、有核前駆細胞から、その核の排出を生じさせる培養に基づくプロセスによって誘導される。一部の実施形態において、除核造血細胞は、有核前駆細胞であって、その核を取り除く化学的又は物理的操作を受ける有核前駆細胞から作成される。
一部の実施形態において、除核造血細胞は、有核前駆細胞の核の照射又は化学的破壊によって作成される。一部の実施形態において、化学的破壊はサイトカラシンＢによって行われる。一部の実施形態において、照射は、少なくとも５Ｇｙ、７Ｇｙ、１０Ｇｙ、１５Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、４０Ｇｙ又は少なくとも５０Ｇｙで行われる。
一部の実施形態において、外因性抗原は、外因性核酸によってコードされるポリペプチドである。
一部の実施形態において、外因性抗原は除核造血細胞の細胞膜に会合している。
一部の実施形態において、外因性抗原は融合物又はキメラポリペプチドである。
一部の実施形態において、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含み、ここでＳドメインは除核造血細胞上の表面ドメインであり、Ａドメインは細胞膜内又は細胞膜上のアンカーであり、Ｕドメインは除核造血細胞の細胞内の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。
一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、又は少なくとも５００アミノ酸を含む。一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも５００、７５０、又は少なくとも１，０００アミノ酸を含む。
一部の実施形態において、外因性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、並びに表Ｆ、表６、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される。
一部の実施形態において、除核造血細胞は、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、５００，０００コピー、１，０００，０００コピー、又は２，０００，０００コピーの外因性抗原を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は薬学的に活性な薬剤をさらに含む。
一部の実施形態において、本方法は、薬学的に活性な薬剤を投与するステップをさらに含み、ここで薬学的に活性な薬剤は医薬組成物の前に、その後に、又はそれと同時に投与される。
一部の実施形態において、本医薬組成物は静脈内投与される。
一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される。
一部の実施形態において、本医薬組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
特定の実施形態において、本方法は、血栓性血小板減少性紫斑病、ＣＡＰＳ、ＡＰＳ、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、膜性腎炎、１型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、又は表Ｆ及び表Ｇに列挙されるものからなる群から選択される自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む。
一部の態様において、本明細書には、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物が開示され、ここで医薬組成物の有効量の投与は、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法による投与を受ける、自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象において免疫トレランスを誘導する能力を有する。
一部の実施形態において、本医薬組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、外因性抗原を発現する造血細胞の集団を含む。一部の実施形態において、本医薬組成物は、外因性抗原を発現する少なくとも１×１０３個の造血細胞を含む。
本医薬組成物の特定の実施形態において、外因性抗原を発現する造血細胞は、約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で提供される。本医薬組成物の他の実施形態において、外因性抗原を発現する造血細胞は、約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で提供される。
本医薬組成物の一部の実施形態において、本組成物は長期保存用に製剤化される。本医薬組成物の一部の実施形態において、本組成物は凍結される。一部の実施形態において、本医薬組成物は薬学的に活性な薬剤を含む。
本医薬組成物の特定の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される。
一部の態様において、本明細書には、静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化された本明細書に記載される組成物を含む剤形が開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される医薬組成物を保持する容器と、対象への医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具が開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される医薬組成物と、対象への医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キットが開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される方法のいずれかによって投与される医薬組成物の外因性抗原を発現する造血細胞が開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるとおりの外因性抗原を発現する造血細胞の集団が開示される。
一部の実施形態において、外因性抗原を発現する造血細胞の集団は液体として製剤化される。
一部の実施形態において、外因性抗原を発現する造血細胞の集団は凍結される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される造血細胞集団によって発現される単離抗原が開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される外因性抗原をコードする外因性核酸が開示される。
一部の態様において、本明細書には、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含む外因性抗原を含む除核造血細胞が開示され、ここでＳドメインは細胞外表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、及びＵドメインは細胞内に局在し、除核造血細胞は対象への投与時に免疫トレランスを誘導する能力を有する。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、外因性抗原は融合物又はキメラポリペプチドである。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。
本明細書に開示される除核造血細胞の特定の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、又は少なくとも５００アミノ酸を含む。
本明細書に開示される除核造血細胞の特定の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも５００、７５０、又は少なくとも１，０００アミノ酸を含む。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、外因性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、並びに表Ｆ、表６、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される。
一部の実施形態において、除核造血細胞は、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、５００，０００コピー、１，０００，０００コピー、又は２，０００，０００コピーの外因性抗原を含む。
特定の実施形態において、除核造血細胞は、赤血球系細胞、血小板系細胞、又はそれらの前駆体である。一部の実施形態において、赤血球系細胞は赤血球又は網赤血球である。一部の実施形態において、血小板系細胞は血小板である。
一部の実施形態において、除核造血細胞はドナーから単離される。一部の実施形態において、除核造血細胞は対象から自己細胞によって誘導される。一部の実施形態において、除核造血細胞は同種細胞によって誘導される。一部の実施形態において、除核造血細胞は異種細胞によって誘導される。
特定の実施形態において、除核造血細胞は、有核前駆細胞から、その核の排出を生じさせる培養に基づくプロセスによって誘導される。
特定の実施形態において、除核造血細胞は、有核前駆細胞であって、その核を取り除く化学的又は物理的操作を受ける有核前駆細胞から作成される。
特定の実施形態において、除核造血細胞は、有核前駆細胞の核の照射又は化学的破壊によって作成される。一部の実施形態において、化学的破壊はサイトカラシンＢによって行われる。一部の実施形態において、照射は、少なくとも５Ｇｙ、７Ｇｙ、１０Ｇｙ、１５Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、４０Ｇｙ又は少なくとも５０Ｇｙで行われる。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、外因性抗原は、外因性核酸によってコードされるポリペプチドである。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、細胞はヒト供給源から誘導される。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、細胞は、ブタ、チンパンジー、マカク、非ヒト霊長類、及び非霊長類哺乳動物からなる群から選択される非ヒト供給源から誘導される。
本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、ポリペプチド抗原は細胞内に局在する。本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、ポリペプチド抗原は細胞の表面上において細胞外に局在する。本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、ポリペプチド抗原は内因性細胞タンパク質に融合している。本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、ポリペプチド抗原は内因性膜貫通タンパク質の細胞内領域に融合している。本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、ポリペプチド抗原は内因性膜貫通タンパク質の細胞外領域に融合している。本明細書に開示される除核造血細胞の一部の実施形態において、ポリペプチド抗原はグリコシルホスファチジルイニソトール（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｉｓｏｔｏｌ）（ＧＰＩ）アンカリングタンパク質に融合している。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される除核造血細胞を含む組織培養バッチが開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される除核造血細胞の集団が開示される。
一部の態様において、本明細書には、本明細書に記載される細胞集団を含む医薬組成物が開示される。
一部の態様において、本明細書には、免疫トレランスを誘導する方法が開示され、この方法は、それを必要としている対象に対し、対象において免疫トレランスを誘導するのに十分な量及び／又は頻度で本明細書に記載される医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の態様において、本明細書には、免疫活性化疾患を治療する方法が開示され、この方法は、それを必要としている対象に対し、免疫活性化疾患を治療するのに十分な量及び／又は頻度で本明細書に記載される医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態において、疾患は、自己抗体媒介性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、ＨＬＡ不適合媒介性疾患、及び免疫原性治療用タンパク質によって治療可能な疾患からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、治療用タンパク質治療レジメンに応答した免疫活性化を低減又は軽減する方法が開示され、この方法は、それを必要としている対象に対し、免疫活性化を実質的に低減又は軽減するのに十分な量及び／又は頻度で本明細書に記載される医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態において、治療用タンパク質は、表Ｉ、表Ｊ、及び表７に列挙されるものからなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ、表Ｊ、表６、表７、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリペプチド抗原と融合した内因性赤血球系細胞タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターが開示される。
一部の態様において、本明細書には、表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ、表Ｊ、表６、表７、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリペプチド抗原と融合した内因性赤血球系細胞タンパク質をコードする核酸配列を含むメッセンジャーＲＮＡが開示される。
一部の態様において、本明細書には、免疫トレランスを誘導する方法が開示され、この方法は、アレルゲン媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、対象においてその疾患、障害又は病態を媒介するアレルゲンに対する免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される。
特定の実施形態において、外因性抗原は、Ａｒａ ｈ２、２Ｓアルブミン、ヒアラウロニダーゼ（ｈｙａｌａｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、及び表Ｈに列挙されるものからなる群から選択される。
特定の実施形態において、アレルゲン媒介性疾患、障害又は病態は、ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、昆虫毒アレルギー、及び表Ｈに列挙されるものからなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、免疫トレランスを誘導する方法が開示され、この方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、対象においてその疾患、障害又は病態を媒介するＨＬＡに対する免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される。
一部の態様において、本明細書には、免疫トレランスを誘導する方法が開示され、この方法は、免疫原性治療用分子によって治療され得る疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、対象においてその疾患、障害又は病態の治療に使用される免疫原性治療用分子に対する免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される。
一部の実施形態において、治療用分子は、組換え（第ＶＩＩＩ因子）、ベネフィックス（Ｂｅｎｅｆｉｘ）（第ＩＸ因子）、ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（抗ＴＮＦα）、並びに表Ｉ、表Ｊ、及び表７に列挙されるものからなる群から選択される。
リポソーム内に封入された蛍光標識ＩｇＧと接触させた赤血球の一連のフローサイトメトリープロットである。リポソーム無し（左）、低用量のリポソーム（中央）、及び高用量のリポソーム（左）と共にインキュベートした細胞が示される。下段のヒストグラムには、蛍光を示す細胞の割合が示される。 定量的フローサイトメトリーによって評価した細胞表面発現レベルのプロットである。このプロットは、赤血球系細胞分化の過程における種々の細胞表面受容体−グリコホリンＡ（塗り潰した三角形）、ｃＫＩＴ（破線上の四角形）、トランスフェリン受容体（点線上の菱形）−及び外因性表面トランス遺伝子（白色の丸）を示す。 図３Ａ〜３Ｃ、３Ｆ、３Ｉ〜３Ｍ、３Ｏ〜３Ｚ及びＡＡ〜ＡＵは、３つの細胞型、除核赤血球系細胞、有核赤血球系前駆細胞、及び赤白血病細胞における、表面上での、細胞質における、融合物としての、及びインタクトなタンパク質としての多数の例示的抗原の発現を実証する一連のフローサイトメトリープロット及びウエスタンブロットである。図３Ａ〜３Ｃ、３Ｆ、３Ｉ−３Ｍ及び３Ｏ−３Ｓは、除核培養赤血球系細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３Ａ：共翻訳されるＧＦＰの発現によって評価した、細胞質Ｃ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｂ：抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列と遺伝子本体との間のＮ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｃ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有する約７０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。 抗ＨＡ染色によって評価した、グリコホリンＡに対するＮ末端融合としての抗体ｓｃＦｖの発現。 抗ＨＡ染色によって評価した、７１アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。 図３Ｊ：抗ＨＡ染色によって評価した、７９アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３Ｋ：抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５５の発現。図３Ｌ：抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５９の発現。 図３Ｍ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、３７アミノ酸のＣＤ５５由来断片のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３Ｏ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約４０ｋＤａ。図３Ｐ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約３３ｋＤａ。図３Ｑ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、アデノシンデアミナーゼ及びＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。図３Ｒ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約５５ｋＤａ。図３Ｓ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約５０ｋＤａ。 図３Ｔ−３ＡＯ：有核培養赤血球系前駆細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３Ｔ：共翻訳されるＧＦＰの発現によって評価した、細胞質Ｃ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｕ：抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列と遺伝子本体との間のＮ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｖ：抗ＣＲ１染色によって評価した、補体受容体１の過剰発現。 図３Ｗ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有する約７０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。図３Ｘ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有する約２１０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。図３Ｙ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡのＮ末端に融合した約２３０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。 図３Ｚ：抗ＨＡ染色によって評価した、グリコホリンＡに対するＮ末端融合としての抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＡ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｋｅｌｌの細胞外Ｃ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。予想サイズ約１０８ｋＤａ。図３ＡＢ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｋｅｌｌの細胞外Ｃ末端に融合したＨＡタグの発現。 図３ＡＣ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｃ（細胞外）末端にＨＡタグを有する７１アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片の発現。図３ＡＤ：抗ＨＡ染色によって評価した、Ｃ末端にＨＡタグを有する７９アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片の発現。図３ＡＥ：抗ＨＡ染色によって評価した、７１アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。 図３ＡＦ：抗ＨＡ染色によって評価した、７９アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＧ：抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５５の発現。図３ＡＨ：抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５９の発現。 図３ＡＩ：抗ＨＡ染色によって評価した、３７アミノ酸のＣＤ５５由来断片のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＪ：抗ＨＡ染色によって評価した、ＣＤ５９のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＫ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約４０ｋＤａ。図３ＡＬ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約３３ｋＤａ。 図３ＡＭ：共翻訳されるＧＦＰからの蛍光についてフローサイトメトリーによって評価した、アデノシンデアミナーゼ及びＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。図３ＡＮ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約５５ｋＤａ。図３ＡＯ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約５０ｋＤａ。図３ＡＰ−３ＡＵ：Ｋ５６２赤白血病細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３ＡＰ：抗ＣＲ１染色によって評価した、補体受容体１の過剰発現。 図３ＡＰ−３ＡＵ：Ｋ５６２赤白血病細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３ＡＱ：抗ＨＡ染色によって評価した、グリコホリンＡに対するＮ末端融合としての抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＲ：抗ＨＡ染色によって評価した、３７アミノ酸のＣＤ５５由来断片のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＳ：抗ＨＡ染色によって評価した、ＣＤ５９のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。 図３ＡＴ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約４０ｋＤａ。図３ＡＵ：抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約３３ｋＤａ。 蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした初代血小板における蛍光を計測する一連のフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ａ）非トランスフェクト血小板。（Ｂ）３ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板。（４Ｃ）６．８ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板。 培養下のトランスジェニック赤血球系細胞のタンパク質発現及び酵素活性を示す。（Ａ）は、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたって抗ＨＡ抗体で検出した外因的に発現するアデノシンデアミナーゼのウエスタンブロットである。（Ｂ）は、インタクトなアデノシンデアミナーゼ発現２９３Ｔ細胞によってアデノシンから産生されるイノシンの棒グラフである。（Ｃ）は、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたって種々の時点で抗ＨＡ抗体で検出した外因的に発現するフェニルアラニンヒドロキシラーゼのウエスタンブロットである。（Ｄ）は、培養フェニルアラニンヒドロキシラーゼ発現除核赤血球系細胞のライセートによってフェニルアラニンから産生されるチロシンの棒グラフである。 補体受容体１（ＣＲ１）を過剰発現する培養赤血球系細胞による免疫複合体の捕捉及びマクロファージへのトランスファーを示す。（Ａ）は、ＣＲ１を過剰発現する培養赤血球系細胞による蛍光免疫複合体（白色のヒストグラム）及び補体欠損免疫複合体（網掛けのヒストグラム）の捕捉を示すフローサイトメトリープロットである。（Ｂ）は、マクロファージ（左のセット）又はＣＲ１を過剰発現する培養赤血球系細胞と共にインキュベートしたマクロファージ（右のセット）による蛍光免疫複合体（斜線網掛けのバー）、補体欠損免疫複合体（灰色のバー）、又は免疫複合体無し（黒色のバー）の取込みを評価するフローサイトメトリーデータの棒グラフである。 培養赤血球系細胞の表面上のＢ型肝炎表面抗原を結合する抗体ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）の活性を示す。（Ａ）は、４５０ｎＭ抗原（白色のヒストグラム）又は抗原無し（灰色のヒストグラム）の結合を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｂ）は、様々な抗原濃度についてフローサイトメトリーによって評価した結合シグナルのタイトレーションである。（Ｃ〜Ｄ）は、蛍光抗原及びｓｃＦｖを発現しない（Ｃ）又は発現する（Ｄ）培養赤血球系細胞を注射したマウスからの血液細胞のフローサイトメトリープロットである。ｙ軸は抗原蛍光を表す。ｘ軸は培養細胞の蛍光を表す。 インビボで外因性抗原発現ＥＨＣによって媒介される循環抗体の特異的クリアランスを示す。（Ａ）は、表面上にＨＡエピトープタグを発現しない（上）、或いは発現する（下）レシピエントマウスから単離したＣＦＳＥ標識培養ヒト赤血球系細胞に対する循環Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識マウス抗ＨＡ抗体の結合無し（上）及び結合（下）を示す一組のフローサイトメトリープロットである。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ＨＡ抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０蛍光を表す。（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体（白色の丸、実線）、抗ＨＡ抗体と、続いてＨＡエピトープタグを発現しない培養ヒト赤血球系細胞（破線）、又は抗ＨＡ抗体と、続いてＨＡエピトープタグを発現する培養ヒト赤血球系細胞（点線）を注射したマウスから採取した血漿中の経時的な抗ＨＡ抗体レベルを比較するＨＡエピトープタグ基質ＥＬＩＳＡからのデータである。（Ｃ）は、表面上でビオチンにコンジュゲートしていない（上）、或いはコンジュゲートしている（下）ＣＦＳＥ標識初代ヒト赤血球に対するＤｙｌｉｇｈｔ６５０標識マウス抗ビオチン抗体の結合無し（上）及び結合（下）を示す一組のフローサイトメトリープロットである。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ビオチン抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０蛍光を表す。（Ｄ）は、抗ビオチン抗体（白色の丸、実線）、抗ビオチン抗体と、続いてビオチンにコンジュゲートしていない培養ヒト赤血球系細胞（破線）、又は抗ビオチン抗体と、続いてビオチンにコンジュゲートしている培養ヒト赤血球系細胞（点線）を注射したマウスから採取した血漿中の経時的な抗ビオチン抗体レベルを比較するビオチン基質ＥＬＩＳＡからのデータである。 インビボで外因性抗原発現ＥＨＣによって媒介される循環抗体の特異的クリアランスを示す。（Ａ）は、表面上にＨＡエピトープタグを発現しない（上）、或いは発現する（下）レシピエントマウスから単離したＣＦＳＥ標識培養ヒト赤血球系細胞に対する循環Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識マウス抗ＨＡ抗体の結合無し（上）及び結合（下）を示す一組のフローサイトメトリープロットである。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ＨＡ抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０蛍光を表す。（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体（白色の丸、実線）、抗ＨＡ抗体と、続いてＨＡエピトープタグを発現しない培養ヒト赤血球系細胞（破線）、又は抗ＨＡ抗体と、続いてＨＡエピトープタグを発現する培養ヒト赤血球系細胞（点線）を注射したマウスから採取した血漿中の経時的な抗ＨＡ抗体レベルを比較するＨＡエピトープタグ基質ＥＬＩＳＡからのデータである。（Ｃ）は、表面上でビオチンにコンジュゲートしていない（上）、或いはコンジュゲートしている（下）ＣＦＳＥ標識初代ヒト赤血球に対するＤｙｌｉｇｈｔ６５０標識マウス抗ビオチン抗体の結合無し（上）及び結合（下）を示す一組のフローサイトメトリープロットである。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ビオチン抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０蛍光を表す。（Ｄ）は、抗ビオチン抗体（白色の丸、実線）、抗ビオチン抗体と、続いてビオチンにコンジュゲートしていない培養ヒト赤血球系細胞（破線）、又は抗ビオチン抗体と、続いてビオチンにコンジュゲートしている培養ヒト赤血球系細胞（点線）を注射したマウスから採取した血漿中の経時的な抗ビオチン抗体レベルを比較するビオチン基質ＥＬＩＳＡからのデータである。 マウスにおける培養ヒト赤血球系細胞のクリアランス速度を示す。（Ａ）は、ヒトグリコホリンＡ（ｙ軸）及びＣＦＳＥ（ｘ軸）について染色した採取血液の代表的なフローサイトメトリードットプロットであり、ここではヒト培養細胞がダブルポジティブである。（Ｂ）は、ＮＳＧマウスにヒト赤血球（塗り潰しの丸）、培養除核赤血球系細胞（破線上の菱形）、細胞内外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（点線上の四角形）及び表面外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（白色の三角形）を注射した後に残るダブルポジティブ細胞の割合としての経時的なクリアランス速度のプロットである。 培養ヒト赤血球系細胞をマウスに注射した後の有害事象の評価である。（Ａ〜Ｂ）は、（１）ヒト赤血球、（２）培養ヒト赤血球系細胞、（３）外因性細胞質タンパク質を発現する培養ヒト赤血球系細胞、（４）外因性表面トランス遺伝子を発現する培養ヒト赤血球系細胞、又は（５）組換えタンパク質の注射後２０分（黒色）、６時間（灰色）、及び４８時間（白色）にマウスから採取した血漿中のＥＬＩＳＡによって評価した（Ａ）フィブリノペプチドＡ及び（Ｂ）フィブリノペプチドＢのレベルを示す。（Ｃ〜Ｄ）は、（Ｃ）培養ヒト赤血球系細胞及び（Ｄ）組換えタンパク質を注射したマウスに関する脾臓の組織染色切片の顕微鏡像を示す。 循環中の培養赤血球系細胞上での外因性タンパク質の発現を追跡する。（Ａ）は、外因性表面タンパク質を発現する培養ヒト赤血球系細胞を注射したマウスから採取した血液のフローサイトメトリーデータであり、経時的なＨＡ陽性の培養ヒト赤血球系細胞のパーセントを示す。（Ｂ）は、２匹のマウスから採取した血液のウエスタンブロットであり、ここで一方のマウスには外因性細胞質タンパク質を発現する培養ヒト赤血球系細胞を注射し、他方のマウスには細胞の非存在下で精製組換え産生外因性タンパク質を注射しており、経時的な血中ＨＡ含有タンパク質レベルを示す。 培養ヒト赤血球系細胞の拡大及び分化の評価である。（Ａ）は、トランス遺伝子を含有するインビトロ分化赤血球系細胞（破線及び点線）及びトランス遺伝子を含有しない細胞（実線）の個別的な培養物に関する拡大速度のプロットである。（Ｂ）は、トランス遺伝子を含有しない（左）又は含有する（右）培養ヒト赤血球系細胞の個別的な培養物に関する細胞表面マーカーＧＰＡ及びＣＫＩＴのフローサイトメトリープロットである。（Ｃ）は、トランス遺伝子を含有しない（左）又は含有する（右）培養ヒト赤血球系細胞のフローサイトメトリープロットであり、ここで細胞はＤＮＡ染色剤ＤＲＡＱ５（ｙ軸）及び抗グリコホリンＡ（ｘ軸）で染色し、これによって（１）除核細胞、（２）有核細胞、及び（３）核の個別的な集団が同定される。 図１３Ａは、抗原が外因性抗原発現ＥＨＣに局在し得る３つの方法の概略図である。図１３Ｂは、外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上に局在する抗原が循環中の標的に作用し得る３つの方法の概略図である。図１３Ｃは、ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ機構を利用した抗原に対する内因性ポリペプチドアンカーの自己触媒融合の概略図である。
本発明は、特定の態様において、目的の外因性抗原を含有するように操作又は修飾された単離細胞を提供する。特定の態様において、本発明の単離ＥＨＣは、ポリペプチドを含むか又はそれからなる１つ以上の抗原を含む。一部の実施形態において、抗原は完全長タンパク質である。一部の実施形態において、抗原は、約７アミノ酸より大きい任意の長さの、完全長タンパク質内に含まれる１つ以上のポリペプチドを含む。抗原を含むポリペプチドは、立体エピトープであってもよく、又は線状エピトープであってもよい１つ以上の免疫学的エピトープを含み得る。抗原は、１つ以上の異なるタンパク質由来の１つ以上のポリペプチドを含み得る。特定の態様において、本発明のＥＨＣは、炭水化物を含むか又はそれからなる１つ以上の抗原を含む。特定の態様において、本発明のＥＨＣは、脂質を含むか又はそれからなる１つ以上の抗原を含む。特定の態様において、本発明のＥＨＣは、１つ以上のポリペプチド、脂質、及び／又は炭水化物、及びそれらの任意の組み合わせを含むか又はそれからなる１つ以上の抗原を含む。細胞はＥＨＣなどの循環細胞であり得る。ＥＨＣは、例えば幹細胞因子、ＩＬ−３及びＩＬ−６などのサイトカイン、インスリン、トランスフェリン、エリスロポエチン、ヒドロコルチゾン、及びエストロゲンなどの定義付けられた因子を使用して造血前駆体から培養することができる。
本発明の態様は、目的の外因性抗原を含むようにＥＨＣを培養する方法に関する。目的の外因性抗原は、例えば、細胞内発現、細胞表面発現、内因性タンパク質との融合、化学的又は酵素的手段による細胞表面タンパク質とのコンジュゲーション、又は細胞内空間への物理的負荷など、幾つもの方法によって導入することができる。本発明の抗原を含む細胞は治療剤として使用し得る。
本発明の態様は、末梢性トレランスの誘導による免疫活性化疾患の治療におけるこれらの抗原を含む細胞の使用に関する。一部の態様において、末梢性トレランスの誘導とは、例えばＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＤ８ Ｔ細胞）、ＣＤ４ Ｔリンパ球（ＣＤ４ Ｔ細胞）、ＣＤ４ Ｔ調節性リンパ球（Ｔｒｅｇ）、又はＢリンパ球（Ｂ細胞）などの抗原特異的免疫細胞の消失又は不活性化を意味する。免疫活性化疾患には、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、及び膜性腎炎などが含まれる。免疫活性化疾患にはまた、炎症性疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は他の特発性炎症性腸疾患なども含まれる。免疫活性化疾患にはまた、アレルギー性疾患、例えば、喘息、ピーナッツアレルギー、甲殻類アレルギー、花粉アレルギー、乳タンパク質アレルギー、虫刺されアレルギー、及びラテックスアレルギーなども含まれる。免疫活性化疾患にはまた、例えば、血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ凝固因子、血友病Ｂにおける第ＩＸ凝固因子、関節リウマチ及び他の炎症性疾患における抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）抗体、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるアスパラギナーゼなどの治療用タンパク質の有効性を低下させる、原発病態の治療のために投与される治療用タンパク質に応答した免疫活性化も含まれる。
免疫トレランスの生物学
身体においては、異常な免疫活性化及び自己免疫疾患を防ぐための精巧な機構が進化しており、こうした機構はまとめて免疫トレランスと称される。中枢性トレランスは、一次リンパ器官、例えば胸腺及び骨髄で発生する間の自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原特異的な消失を指す。末梢性トレランスは、一次リンパ器官外での成熟Ｔ及びＢリンパ球の消失又は不活性化を指す。末梢性トレランスには、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）による自己反応性リンパ球の抑制又は共刺激「危険」シグナルの非存在下で低用量の抗原に連続的に曝露することによる抗原特異的エフェクターリンパ球におけるアネルギー又は非反応性の誘導が含まれる。Ｔｒｅｇ活性化及びリンパ球アネルギーは両方とも、阻害因子、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、及びＩＬ−４などの分泌によって誘導され得る。
抗原に応答した免疫活性化は、多くの場合に、病原性微生物又はウイルスに由来することの多いＴｏｌｌ様受容体リガンドなどの二次的「危険」シグナルを必要とする（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏ １９９４）。かかる危険シグナルには、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、リポ多糖、細菌性リポタンパク質、フラジェリン、ザイモサンなどが含まれる。抗原及び危険シグナルの両方を受け取る抗原提示細胞は、その表面上に、抗原ペプチドに加えてＣＤ８０及びＣＤ８６などの共刺激分子を提示する。抗原ペプチド及び共刺激分子の両方を認識するＴ細胞が活性化する。抗原ペプチドシグナルのみを受け取るものはアネルギーとなる。
多くの食物アレルギーの実験的治療のため、危険シグナルが存在しない場合の抗原提示を利用して免疫トレランスを誘導する治療戦略が開発されている。これらの研究は、トレランスの誘導を意図した漸増用量のアレルゲンに対する長期曝露の形態をとる。２００７年以降、１３件の研究において、ピーナッツ、牛乳、及び卵などの種々の一般的な食物アレルゲンがこのフォーマットで試験されている。患者の５０〜１００％が感作され、即ち、アナフィラキシーを起こすことなく食物による攻撃誘発を耐え抜くことができている。しかしながら、長期トレランスは奏効率が低く、１ヵ月の無治療の後に抗原に耐えることができる患者は僅か２５〜５０％である。例えば、Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２を参照されたい。
アレルギーはＩｇＥ媒介性であり、肥満細胞及び好塩基球の活性化を伴うと考えられている。持続補給など、低用量のアレルゲンの経口投与は、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞による抗原提示並びにＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、及びＩＬ−４の分泌を介してＴｒｅｇを誘導する。高用量の経口投与は、形質細胞性樹状細胞を介した抗原特異的Ｔ細胞の消失及びアネルギーを誘導する。ヒト研究では、アレルゲンの経口投与が、ＩｇＥ、肥満細胞、及び好塩基球の減少、ＩｇＧ４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０の増加、及び治療開始時のＴｒｅｇの一時的な上昇をもたらしている。例えば、Ｈｅｒｚｏｇ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０１３を参照されたい。
いかなる特定の機構に限定されることも望まないが、末梢性免疫トレランスはアポトーシス細胞からの自己抗原によって誘導され得ると考えられる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ａｎｄ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９）。分子の観点から正確な機構は完全には分かっていないが、ＨＳＰ９０などの自己タンパク質及び他の損傷関連分子パターンが樹状細胞による取り込みを促進する。ＣＤ２０５などの樹状細胞受容体がこれらのシグナルを認識し、抗原を交差提示し、及び寛容原性サイトカインを誘導して共刺激タンパク質発現を抑制する（Ｂｏｎｉｆａｚ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００２）。
アポトーシス細胞の潜在的な寛容原性能力を利用して末梢性免疫トレランスを誘導する治療戦略の調査が進められている。こうした戦略には、典型的には細胞の表面に対する目的の抗原の化学的カップリングが関わる。マウス、ラット、及びモルモットにおける研究では、種々のタンパク質抗原が脾細胞及び白血球の表面に化学的に取り付けられている。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７９；Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８０；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００８；Ｓｍａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１１を参照されたい。
最近のヒトにおける第Ｉ相臨床研究において、多発性硬化症に関連するペプチド抗原のカクテルが自己末梢血単核細胞と化学的にカップリングされ、患者に再注入された（Ｌｕｔｔｅｒｏｔｔｉ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ２０１３）。これらの細胞は良好に忍容され、抗原特異的Ｔ細胞応答の低下のエビデンスがあった。
ＥＨＣは、顕著な瀕死細胞源である。毎日、エリプトーシスと呼ばれるアポトーシス様プログラム細胞死の後に多数の赤血球が除去される（ヒトでは１日１％超、約１×１０１１細胞）。赤血球クリアランスの正確なトリガーは未だ不明であるものの、エリプトーシス赤血球は、アポトーシス有核細胞に類似して、ホスファチジルセリン非対称性、膜不均一性、及びアネキシン−Ｖ結合によって特徴付けられる。
ＥＨＣはまた、体内での持続性もある。成人ヒトにおいて赤血球は最長１２０日間循環する。そのため、目的の抗原を含むＥＨＣは、抗原を宿主に持続的に曝露させることが可能であり得る。上記に記載したとおり、正確な分子機構は完全には分かっていないものの、抗原に対する持続的な曝露は共刺激シグナルの非存在下における抗原提示によって末梢性トレランスを誘導し、調節性Ｔ細胞の拡大、エフェクターＴ及びＢ細胞の消失及びアネルギー、並びに抗炎症及び寛容原性促進サイトカインの分泌につながり得ると考えられる。
赤血球を利用することによる末梢性トレランスの誘導は、また実験的にも調査されている。予備研究では、モデル抗原オボアルブミンが、赤血球に非共有結合的に結合させたとき（Ｋｏｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３）又は赤血球に浸透圧的に負荷したとき（Ｃｒｅｍｅｌ ａｎｄ Ｇｏｄｆｒｉｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０１３）、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の消失及び抗原特異的Ｔｒｅｇ誘導を誘導することが示されている。
目的の外因性抗原を含む本発明の培養ＥＨＣは、赤血球に例えばポリペプチド結合ドメインを介して非共有結合的に結合させた抗原に優る特徴的な利点を有し得る。１つの利点は、目的の外因性抗原を含むＥＨＣの体内分布が、標的ドメインを有する抗原のポリペプチド組成物と比べてより定義付けられていることであり得る。目的の外因性抗原を含むＥＨＣは、血管系及び赤血球が典型的に存在する場所、例えば脾臓に限られることになる。目的の外因性抗原を含むＥＨＣは、ポリペプチド抗原組成物を投与したときに生じ得る問題である、腎臓でろ過によって取り除かれたり、又は末梢組織中に抜け出たりすることがない。ＥＨＣ当たりの外因性抗原の用量は、目的の外因性抗原を含む細胞を培養する場合には、ポリペプチド抗原を血流中に直接注入して血流内の約１０兆個の赤血球にわたり分布させる場合と比べて大幅に高くなり得る。場合によっては、目的の外因性抗原をＥＨＣの細胞内コンパートメント内に限局させる方が好ましいこともある。例えば、抗原が免疫原性である場合、免疫系から免疫原性抗原が隠され、従って免疫活性化が防止又は低減されるため、細胞内局在が有利となり得る。この構成は、ポリペプチド抗原組成物では不可能である。
目的の外因性抗原を発現する培養ＥＨＣは、ＥＨＣに浸透圧的に負荷された抗原に優る特徴的な利点を有し得る。目的の外因性抗原を含む培養ＥＨＣは、大きい孔によって細胞膜及び細胞骨格の完全性が破壊される浸透圧負荷手順の生成物とは対照的に、実質的に改変されていない細胞膜及び細胞骨格を有し得る。ＥＨＣの形態及び生物物理学的特徴は、細胞の体内分布、循環、並びに血管系及び免疫細胞との相互作用の重要な決定要因であり（例えば、Ｐｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．１９９６）、ひいては細胞完全性の維持は有効性の保持に重要であり得る。例えば内因性細胞質タンパク質との直接の融合又は内因性膜貫通タンパク質との融合によって培養ＥＨＣに物理的に結合した外因性抗原は、ＥＨＣが消費されるまでは、細胞から漏出して免疫系に曝露されることがない。漏出の問題は、細胞膜が損傷を受け得る浸透圧負荷手順を使用して細胞を抗原と接触させる場合に生じ得る。
目的の抗原を発現する培養ＥＨＣは、その抗原を必要としている対象に直接投与することができる。生成物製造中の抗原の分離及び精製は不要である。これは、抗原を別途合成して精製し、次に細胞と組み合わせなければならない浸透圧負荷生成物とは対照的であり、生成物の製造において顕著なコスト及び時間上の利点をもたらし得る。目的の抗原を発現する培養ＥＨＣは、培養下での増殖によってスケールアップすることができる。大型の工業規模の細胞バッチを作製して、多くの対象を広く治療するために使用し得る所与の抗原に関して実質的に均一なＥＨＣ医薬組成物を作成し得る。対照的に、浸透圧負荷は概して１ドナー対１対象のスケールに限られている。
細胞の入手
本発明の外因性抗原発現除核造血細胞は、本明細書に記載される任意の方法によって作成することができる。一部の実施形態において、これらのステップには、造血幹細胞から誘導された単離され、任意選択で培養された細胞を抗原と接触させるステップが含まれる。造血幹細胞は、骨髄系統（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）及びリンパ系統（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含め、哺乳類の血中に見られるあらゆる血液細胞型を生じる。造血幹細胞は、例えば大腿骨、寛骨、肋骨、又は胸骨を含めた成人骨の骨髄から単離し得る。細胞は、例えば針及びシリンジによる吸引を用いて骨髄から細胞を抜き取ることにより、股関節部から直接得てもよい。或いは、造血幹細胞は、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などのサイトカインによる前治療の後に正常末梢血から単離してもよい。Ｇ−ＣＳＦは骨髄コンパートメントから末梢循環への細胞の遊離を動員する。他の造血幹細胞源としては、臍帯血及び胎盤が挙げられる。
単離造血幹細胞を培養し、拡大し、及びエキソビボで分化させて種々の供給源材料を提供することにより、外因性抗原発現ＥＨＣを作成し得る。例えば、骨髄、サイトカイン刺激末梢血又は臍帯血から単離した造血幹細胞を拡大してエキソビボで成熟赤血球に分化させ得る（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９−７４（２００５）；米国特許出願公開第２００７／０２１８５５２号明細書）。このように、例えば磁気マイクロビーズ選択法及びＭｉｎｉ−ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＣＤ３４＋細胞を骨髄又は末梢血若しくは臍帯血から単離する。一例では、続いて細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１２０μｇ／ｍｌ鉄飽和ヒトトランスフェリン、９００ｎｇ／ｍｌ硫酸第一鉄、９０ｎｇ／ｍｌ硝酸第二鉄及び１０μｇ／ｍｌインスリンを補充した改変無血清培地で培養し、３７℃、５％二酸化炭素の空気中に維持する。細胞培養物の拡大及び分化は多段階で行い得る。例えば、単離後の最初の成長段階で、本明細書に記載される培地において、例えばヒドロコルチゾン、幹細胞因子、ＩＬ−３、及びエリスロポエチンを含めた複数の成長因子の存在下で細胞を拡大し得る。第２段階では、任意選択で、例えば付着間質細胞層上でエリスロポエチンの存在下で細胞を共培養し得る。第３段階では、外的因子の非存在下で培養培地中の付着間質細胞層上で細胞を培養し得る。付着間質細胞層は、例えばマウスＭＳ−５間質細胞であってもよい。或いは、付着間質細胞層は、成人骨髄に由来する間葉間質細胞であってもよい。付着間質細胞は、例えば１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ中に維持し得る。一部の実施形態において、赤血球系前駆細胞及びそれから得られる細胞集団は、非ＥＨＣ、例えば付着間質細胞層と共培養されず、即ち非ＥＨＣの非存在下で培養される。一部の実施形態では、ＥＨＣの１０％超、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％超が除核され、且つ除核細胞を選択するための濃縮ステップ、例えば重力分離、磁気又は蛍光選別、照射、有核細胞の中毒化などを用いることなく除核細胞の集団が得られるように、抗原を含むＥＨＣは非ＥＨＣの非存在下で培養し、分化させる。
場合によっては、インビトロでＣＤ３４＋造血幹細胞を拡大して部分的に分化させて、インビボで成熟赤血球への最終分化を生じさせることが望ましいこともある（例えば、Ｎｅｉｌｄｅｚ−Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４６７−４７２（２００２）を参照）。単離ＣＤ３４＋造血幹細胞はインビトロで、例えばＦｌｔ３リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、及びインスリン成長因子を含めた種々の因子を含有する培地において付着間質細胞層の非存在下で拡大し得る。得られる赤血球系前駆細胞はＣＤ３６及びＧＰＡの表面発現によって特徴付けることができ、対象に輸注して、そこで成熟赤血球への最終分化を生じさせ得る。
一部の実施形態において、ＥＨＣ集団は、除核中に保持される抗原ポリペプチドを含む複数の除核ＥＨＣを含む。これにより得られる、抗原ポリペプチドを含む単離除核ＥＨＣは、対応する単離非修飾非培養ＥＨＣと実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。
一部の実施形態において、ＥＨＣ集団は、実質的に同じ分化段階及び／又は細胞周期段階にある複数の赤血球前駆細胞を含み、ここで前駆細胞は、抗原をコードする組換え核酸を含む。抗原をコードする組換え核酸を含む赤血球前駆細胞の大多数は、組換え核酸を保持せずに抗原を保持する成熟赤血球に分化する能力を有する。
一部の実施形態において、初代細胞は、静脈穿刺、毛細血管穿刺、又は動脈穿刺によって採取し得る。次に、採取した全血から、血漿枯渇、密度勾配、ヘタスターチ、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ−ＣＢ、及び遠心を含む技法の１つ、又は組み合わせを用いて赤血球、血小板又は他の細胞を単離し得る。
同種／及び自己供給源
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの作成には、対象にとって自己及び／又は同種の、単離され、任意選択で培養された細胞を抗原と接触させるステップが含まれる。例えば、対象にとって同種の赤血球には、血液型特異的赤血球の１つ以上又は１つ以上の万能ドナー赤血球が含まれる。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、赤血球の融合、例えば、対象にとって自己の赤血球と１つ以上の同種赤血球、リポソーム、及び／又は人工小胞との間の融合によって作成し得る。
特定の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの自己輸血には、対象から赤血球、網赤血球又は造血幹細胞を単離すること、本明細書に記載される方法によってその細胞を抗原と接触させて好適な外因性抗原発現ＥＨＣを作成すること、及びその外因性抗原発現ＥＨＣを（例えば、輸液によって）同じ対象に投与することが含まれる。
特定の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの同種輸血には、ドナーから赤血球、網赤血球又は造血幹細胞を単離すること、本明細書に記載される方法によってその細胞を抗原と接触させて好適な外因性抗原発現ＥＨＣを作成すること、及びその外因性抗原発現ＥＨＣを（例えば、輸液によって）ドナーとは異なる対象に投与することが含まれる。輸血に同種細胞が使用される場合、適合性ＡＢＯ血液型を使用して、補体活性化及び不適合赤血球の溶解によって特徴付けられる急性血管内溶血性輸血反応を防ぐように注意を払う必要がある。ＡＢＯ血液型は、血液型抗原Ａ及びＢが存在するか否か、赤血球の表面上の糖タンパク質類及び糖脂質類に関連するオリゴ糖鎖の末端に見られる単糖糖鎖構造に基づき定義される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７）にレビューされる）。Ｏ型赤血球はこれらの抗原性単糖構造のいずれをも欠いている。Ａ型赤血球の対象は、Ｂ型赤血球に対する天然に存在する抗体を有し、一方、Ｂ型赤血球の対象は、Ａ型赤血球に対する抗体を有する。血液型ＡＢの対象はいずれの抗体も有さず、及び血液型Ｏの個体は両方を有する。抗Ａ抗体及び／又は抗Ｂ抗体のいずれかを有する対象は、対応する抗原を含有する血液の輸血を受けることができない。Ｏ型赤血球はＡ抗原もＢ抗原も含まないため、いずれのＡＢＯ血液型のレシピエントにも、例えば、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、又はＯ型レシピエントに安全に輸血することができる。Ｏ型赤血球は万能と考えられ、あらゆる輸血に使用し得る。対照的に、Ａ型赤血球はＡ型及びＡＢ型レシピエントに提供することができ、Ｂ型赤血球はＢ型及びＡＢ型レシピエントに提供することができ、及びＡＢ型赤血球はＡＢ型レシピエントにのみ提供することができる。赤血球又はその前駆体を抗原と接触させることによって外因性抗原発現ＥＨＣが作成される実施形態において、供給源となる赤血球又はその前駆体は、レシピエントと適合するようにマッチングされる。
場合によっては、非Ｏ型赤血球を含む外因性抗原発現ＥＨＣを万能血液型に変換することが有益であり得る。Ａ型及びＢ型赤血球の表面上にある免疫優性単糖類の酵素的除去を用いて、Ｏ型様外因性抗原発現ＥＨＣの集団を作成し得る（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７）を参照）。Ｂ型外因性抗原発現ＥＨＣは、生コーヒー豆に由来するα−ガラクトシダーゼを使用して変換し得る。それに代えて又は加えて、Ｅ．メニンゴセプチカム菌（Ｅ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）に由来するα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ及びα−ガラクトシダーゼ酵素活性を使用して、それぞれ免疫優性Ａ抗原及びＢ抗原を（外因性抗原発現ＥＨＣ上に存在する場合には）除去し得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７））。一例では、本明細書に記載するとおり単離した濃厚赤血球をα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ及びα−ガラクトシダーゼ（約３００μｇ／ｍｌ濃厚赤血球）のいずれかの存在下で２００ｍＭグリシン（ｐＨ６．８）及び３ｍＭ ＮａＣｌ中、２６℃で６０分間インキュベートする。処理後、赤血球を生理食塩水中で遠心して３〜４回リンスすることによって洗浄し、標準的な血液バンキング技術によってＡＢＯ型を決定する。
具体的な実施形態において、本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣは以下の方法で作成し得る。初めに、赤血球系前駆細胞を単離する。これらの細胞は、或いは患者の自己細胞であっても、又は実質的に万能なドナー血液由来であってもよい。例えば、細胞は、ＡＢＯ式Ｏ型、リーサス因子Ｒｈ ｒ／ｒ、ダッフィ−／−、及び大型ケル抗原Ｋ１陰性であってもよい。赤血球系前駆細胞からＥＨＣへの分化の過程で、抗原をコードする組換え核酸が導入される。この抗原をコードする組換え核酸は、ＧＡＴＡ−１プロモーターなどの赤血球系特異的プロモーターの制御下にあり得る（例えば、Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１４０：２３０を参照）。抗原をコードする組換え核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法で、例えばプラスミドＤＮＡ、ウイルス、又はｍＲＮＡとして導入することができる。核酸導入は、種々の標準方法、例えば、トランスフェクション、形質導入、又は電気穿孔によって達成することができる。
血小板誘導及び成熟
具体的な実施形態において、本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣは、血小板を抗原と接触させることによって作成し得る。成人ヒトは、毎日２×１０１１個の赤血球、及び約半分の数の白血球及び血小板を産生する。ヒトでは略全ての血液細胞産生が赤色髄で起こり、赤色髄は、各系統に関係した造血幹細胞、中間レベルの前駆体及び成熟細胞を含む階層的な発生系に相当する。
主要な血液細胞型はいずれも、それらの初期発生段階を通じて同様の形態であるが、血小板産生に関係する細胞である巨核球は、他の多くの骨髄及び血液細胞の直径の１０倍のサイズに成長し、且つ通常の染色体補体の最大１２８倍を含有する、芽細胞の分化レベルを超えた明らかな構造的及び機能的逸脱によって特徴付けられ、これらの細胞は血小板を生じる。一連の通常の細胞分裂を経た後、発生中の巨核球前駆体は、短時間（約１時間）のＧ１期と、典型的な（７時間）Ｓ期と、極めて短時間（約４５分）のＧ２期と、続く核内有糸分裂期（中断するＭ期）とによって特徴付けられるユニークな細胞周期に入る。細胞に高倍数性の核が発達すると、細胞にはまた、細胞質の断片化に必要な分画膜も発達する。このイベントには、糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ（血小板フィブリノゲン受容体；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４：６６０−９，１９９６）及びＧＰＩｂ（フォン・ヴィリブランド（Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ）因子受容体；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６８−５７１，１９９４）、顆粒であって、ＡＤＰ、セロトニン、−トロンボグロブリンを含有する顆粒、及び成熟血小板機能に不可欠な他の物質の発現が付随する。最後に、高倍数性の巨核球が細胞質の分割を起こし、数千個の血小板が放出される（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８５：４０２−４１３，１９９５；Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８９：２３３６−２３４６，１９９７）。
全ての血液細胞前駆体と同様に、巨核球は、広範な自己複製能又は血液のあらゆる成分への分化能を保持している多能性骨髄幹細胞から生じる。血小板産生は、一部には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）とその細胞受容体ＴＰＯＲ／ＭＰＵｃ−ＭＰＬとが相互作用して誘導されるシグナル伝達機構によって調節される。
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、巨核球形成及び血小板産生の刺激に関与する造血成長因子である。ＴＰＯは肝臓及び腎臓で発現し、血小板要求量に応じて骨髄微小環境でその発現が下方調節され得る（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１６：３２２−３２８，１９９８；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８６：３６６８−３６７５，１９９５）。ＴＰＯ発現は主として構成的であるため、ＴＰＯレベルは血小板による隔絶によって調節されると考えられる（Ｆｉｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：２１５４，１９９６）。
ＴＰＯをコードする遺伝子はクローニングされ、特徴付けられている（Ｋｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１１０４−１１１０８，１９９４；Ｂａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７７：１１１７−１１２４，１９９４；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６８−５７１，１９９４；Ｗｅｎｄｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５７１−５７４，１９９４、及びｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５３３−５３８，１９９４）。ヒトＴＰＯ（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡは３５３アミノ酸長のポリペプチドをコードする。シグナルペプチドの切断後に哺乳類細胞から分泌される完成長ｈＴＰＯは、３３２アミノ酸からなる。このタンパク質の予測分子質量は３８ｋＤａであるが、組換え細胞からの血清中又は培養液中の材料の計測から報告されている分子質量は１８ｋＤ〜８５ｋＤで異なる（グリコシル化、及び翻訳後タンパク質分解プロセシング）。
ＴＰＯ（ＴＰＯＲ／ＭＰＬ／ｃ−ＭＰＬ）に対する細胞表面受容体は、汎骨髄性障害を引き起こすことが示されている骨髄増殖性白血病ウイルス（ＭＰＬＶ）のエンベロープタンパク質ｖ−ｍｐｌの相同体である癌原遺伝子ｃ−ｍｐｌの産物である（Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，Ｖｉｒｏｌ．，１４９：２４２−２４６，１９８６）。ヒトｃ−ｍｐｌ遺伝子は、７１ｋＤの予測分子量を有する６３５アミノ酸のタンパク質をコードする（Ｖｉｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５６４０−４４，１９９２；Ｍｉｇｎｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０：５−１２，１９９４）。
ＴＰＯ又はその受容体（ＴＰＯＲ／ＭＰＬ／ｃ−ＭＰＬ）のいずれかの発現をヌルにされたマウスは、重度の血小板減少性の表現型を示す（Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１４４５，１９９４；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：１６８３，１９９５；ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：６５１，１９９６）。
複数のサイトカイン（例えば、幹細胞因子［ＳＣＦ］、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、白血病抑制因子［ＬＩＦ］、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｋｉｔリガンド、及び−インターフェロン）が、血小板新生活性を有することが示されている。
血小板活性化
得られる血小板は小さい円盤形の細胞断片であり、これは血管損傷部位に遭遇すると急速な形質転換を起こす。血小板はより球状になり、偽足を突き出し、そのフィブリノゲン受容体が活性されて凝集が起こると共に、血小板はその顆粒含有物を放出し、最終的には一次止血に関与する血栓を形成する（Ｓｉｅｓｓ，Ｗ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：５８−１７８，１９８９）。血小板の活性化はまた、不安定狭心症、心筋梗塞及び脳卒中の病因に関与するともされている（Ｐａｃｋｈａｍ，Ｍ．Ａ．，Ｃａｎ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２：２７８−２８４）。
血小板の活性化には、内皮下表面に露出しているコラーゲン、凝固カスケードによって生成されるトロンビン、並びに活性化した血小板から放出されるトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）及びＡＤＰなどの幾つかの生理的物質が関わる。コラーゲンは、インテグリンα２β１を含む幾つかの血小板膜タンパク質に結合して、ＴＸＡ２及びＡＤＰの放出による血小板の活性化をもたらす（Ｓｈａｔｔｉｌ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：６９５−７０４，１９９４）。対照的に、トロンビン、ＴＸＡ２、及びＡＤＰはＧタンパク質共役受容体を直接活性化し、血小板凝集及び顆粒放出を誘導する（Ｈｏｕｒａｎｉ，Ｓ．Ｍ，ａｎｄ Ｃｕｓａｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２４３−２９８，１９９１）。血小板活性化に関わる主要なイベントは、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）のβ−アイソフォームが活性化する結果であると考えられ、これはイノシトール１，４，５三リン酸及びジアシルグリセロールの生成をもたらす。血小板は主に２つのアイソフォーム、ＰＬＣ−β２及びＰＬＣ−β３を含む。
血小板粘着及び凝集を媒介する血小板受容体は、２つの主要な血小板表面糖タンパク質複合体上に位置する。これらの複合体は、糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ複合体（これはフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）との結合によって血小板粘着を促進する）、及び糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体（これはフィブリノゲンに結合することによって血小板を連結して凝集体となる）である。先天性出血性障害であるベルナール・スーリエ症候群の患者は、ｖＷＦを結合する糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ複合体の欠損に起因する不十分な血小板粘着、軽度血小板減少症、及び大型リンパ様血小板を示す。
糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）は、主要な（約１２，０００分子／血小板）、高度にグリコシル化された血小板膜タンパク質（分子量８２，０００）である。血小板がトロンビンに曝露されると、ＧＰＶｆｌと呼ばれる６９ｋＤａの可溶性断片が遊離する。ＧＰＶはＧＰＩｂ−ＩＸ複合体（ＧＰＩｂ（１４５ｋＤａのタンパク質ＧＰＩｂαが２４ｋＤａのタンパク質ＧＰＩｂβとジスルフィド結合したものからなる）とＧＰＩＸ（２２ｋＤａのタンパク質）との非共有結合性の会合によって形成される複合体）と非共有結合的に相互作用することができる。ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体上のフォン・ヴィレブランド因子の結合部位及びトロンビンの結合部位の位置がＧＰＩｂα上に特定されている。ここでトロンビンは、Ｇタンパク質共役受容体であるトロンビン受容体（Ｖｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６４：１０５７−１０６８（１９９０））を切断することによって血小板を活性化することが分かっているため、トロンビンがＧＰＶを切断するのはトロンビンがＧＰＩｂαに結合する結果として偶発的であるのかどうか、又はこの切断に生理学的役割があるのかどうかは不明である。ＧＰＩＢα、ＧＰＩＢβ、及びＧＰＩＸは１つ以上の相同な２４アミノ酸ロイシンリッチドメインを含む。これらのドメインはまた、大型のロイシンリッチ糖タンパク質（ＬＲＧ）ファミリーにも見られる。
ＧＰＶは、巨核球細胞系統のマーカーである。ＧＰＶに特異的なモノクローナル抗体（ＳＷ１６）は、赤血球、白血球、内皮細胞、又は血小板巨核球マーカーを発現することが知られるＨＥＬ又はＭＥＧ−０１などの細胞株には結合しない。
成熟ＧＰＶは、単一の膜貫通ドメインと、短い細胞質ドメイン（１６残基）と、８個の潜在的なＮ−グリコシル化部位を有する大きい細胞外ドメインとを含有する５４３アミノ酸を含む。細胞外ドメインの分析から、ＧＰＩｂαと相同性を有する２４アミノ酸の１５個のタンデムなＬｅｕリッチリピートの存在が明らかにされ、フィブリノゲンのＡα鎖と相同性を有するＣ末端近傍のトロンビンの切断部位が同定された。
培養条件
本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣを作成するための供給源には、ＥＨＣなどの循環細胞が含まれる。好適な細胞供給源は、本明細書に記載するとおり対象から単離するか、患者由来の造血前駆細胞又は赤血球系前駆細胞からか、不死化ＥＨＣ株から誘導するか、又は人工多能性幹細胞から誘導し、任意選択で培養して分化させ得る。細胞培養技法を用いて赤血球を生成する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３，ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３、又はＫｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８：ｅ５９８９０）。プロトコルは、成長因子、出発細胞株、培養期間、及び得られる細胞を特徴付ける形態学的形質に応じて異なる。ドナー輸血の代用となり得る血液製造用の培養システムもまた確立されている（Ｆｉｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｂｌｏｏｄ ７３：１００）。最近では、ＣＤ３４＋細胞が網赤血球段階に分化されており、続くヒト対象への輸血が成功した（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１）。
本明細書には、ＥＨＣの培養方法及びＥＨＣから誘導される外因性抗原発現ＥＨＣが提供される。ＥＨＣは、造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１）、人工多能性幹細胞（Ｋｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８：ｅ５９８９０）、及び胚性幹細胞（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １：４９９）から培養することができる。前駆細胞の拡大及び分化に好適な成長及び分化因子のカクテルは、当該技術分野において公知である。好適な拡大及び分化因子の例としては、限定はされないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ２、ＰＩＸＹ ３２１、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられる。
ＥＨＣは、ＣＤ３４＋細胞などの造血前駆細胞から、多段階培養プロセスで前駆細胞を定義付けられた因子と接触させることにより培養し得る。例えば、ＥＨＣは、造血前駆細胞から三段階プロセスで培養することができる。
第１のステップは、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）、及び０．１〜１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３（ＩＬ−３）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。この第１のステップは、任意選択で、核ホルモン受容体、例えば、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、又はプレグナンＸ受容体と結合してそれを活性化するリガンドを培養下の細胞に接触させることを含む。これらの受容体に対するリガンドとしては、例えば、コルチコステロイド、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのデキサメタゾン又は１０ｎＭ〜１００μＭのヒドロコルチゾン；エストロゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのβ−エストラジオール；プロゲストーゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭのヒドロキシプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭの５ａ−ジヒドロプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭの１１−デオキシコルチコステロン、又は合成プロゲスチン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭの酢酸クロルマジノン；アンドロゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのテストステロン、１０ｎＭ〜１００μＭのジヒドロテストステロン又は１０ｎＭ〜１００μＭのアンドロステンジオン；又はプレグナンＸ受容体リガンド、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのリファンピシン、１０ｎＭ〜１００μＭのハイパフォリン、１０ｎＭ〜１００μＭのセイヨウオトギリソウ（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ Ｗｏｒｔ）（ヒペリシン）、又はビタミンＥ様分子、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのトコフェロールが挙げられる。第１のステップはまた、任意選択で、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、又は１〜５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子を培養下の細胞に接触させることも含み得る。さらに第１のステップは、任意選択で、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを培養下の細胞に接触させることを含み得る。
第１のステップは、任意選択で、１つ以上のインターロイキン（ＩＬ）又は成長因子、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−Ｂ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−Ａ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及びＦｌｔ３リガンドを培養下の細胞に接触させることを含み得る。各インターロイキン又は成長因子は、典型的には０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給し得る。第１のステップはまた、任意選択で、血清タンパク質又は非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラスマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、又はヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）を培養下の細胞に接触させることも含み得る。
第２のステップは、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）及び１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。この第２のステップはまた、任意選択で、インスリン様分子、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、又は１〜５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子を培養下の細胞に接触させることも含み得る。第２のステップは、任意選択で、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを培養下の細胞に接触させることをさらに含み得る。第２のステップはまた、任意選択で、血清タンパク質又は非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラスマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、又はヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）を培養下の細胞に接触させることも含み得る。
第３のステップは、１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。この第３のステップは、任意選択で、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。第３のステップは、任意選択で、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、又は１〜５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子を培養下の細胞に接触させることをさらに含み得る。第３のステップはまた、任意選択で、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを培養下の細胞に接触させることも含み得る。第３のステップはまた、任意選択で、血清タンパク質又は非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラスマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、又はヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）を培養下の細胞に接触させることも含み得る。
この培養プロセスは、任意選択で、当該技術分野において公知の方法によって、１つ以上の遺伝子を活性化又はノックダウンする分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ホルモン、又は小分子を細胞に接触させることを含み得る。標的遺伝子としては、例えば、転写因子、成長因子、又は成長因子受容体をコードする遺伝子を挙げることができ、限定はされないが、例えば、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＭｙｃ、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３、ＥＰＯ、ＳＣＦ、インスリン、ＥＰＯ−Ｒ、ＳＣＦ−Ｒ、トランスフェリン−Ｒ、インスリン−Ｒが挙げられる。
一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、種々の量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びエリスロポエチンを含有する培養液中に、３つの別個の分化段階で合計２２日間置かれる。
一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、種々の量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びトロンボポエチンを含有する培養液中に、３つの別個の分化段階で合計１４日間置かれる。
一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、種々の量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びＧＣＳＦを含有する培養液中に、３つの別個の分化段階で合計１５日間置かれる。
特定の実施形態において、目的の外因性抗原を含む細胞は、限定はされないが、表Ａに列挙されるものを含めた複数の循環細胞を含むか又はそれから誘導され得る。好ましい実施形態では、本発明の循環細胞はＥＨＣ、例えば有核赤血球、赤血球前駆体又は除核赤血球などである。例えば、ＥＨＣは、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、骨髄球系共通前駆（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー形成細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤芽球系前駆（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、網赤血球、赤血球、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、又は表Ａ１に列挙されるもの、又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、ＥＨＣは不死細胞又は不死化細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞のレトロウイルス形質導入によりＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃが発現し、及びＴＰ５３が抑制されるように作成した不死化赤芽球細胞である（例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３，ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３）。
本明細書には赤血球組成物が提供され、ここでは複数の赤血球が目的の外因性抗原又はその断片を発現する。細胞は、患者由来の造血又は赤血球系前駆細胞から培養されるか、不死化ＥＨＣ株から誘導されるか、又は人工多能性幹細胞から誘導され得る。細胞培養で赤血球を作成する方法は、当該技術分野において、例えば、Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３、又はＫｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８：ｅ５９８９０に公知である。外因性抗原は、単一又は複数の遺伝子コピーのトランスフェクション、ウイルスによる形質導入、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの存在下における電気穿孔によって導入することができる。哺乳類細胞において外因性タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、造血細胞における外因性第ＩＸ因子の発現が、ＣＤ３４＋前駆細胞のウイルス形質導入によって誘導される（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６，２４：１０１７を参照）。
本明細書に記載される赤血球組成物は以下の方法で作成し得る。初めに、赤血球系前駆細胞を単離する。これらの細胞は、或いは患者の自己細胞であっても、又は実質的に万能なドナー血液由来であってもよい。例えば、細胞は、ＡＢＯ式Ｏ型、リーサス因子Ｒｈ ｒ／ｒ、ダッフィ−／−、及び大型ケル抗原Ｋ１陰性であってもよい。赤血球系前駆細胞からＥＨＣへの分化の過程で、外因性抗原をコードする核酸が導入される。この外因性抗原をコードする核酸は、ＧＡＴＡ−１プロモーターなどの赤血球系特異的プロモーターの制御下にあり得る（例えば、Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１４０：２３０を参照）。外因性抗原をコードする核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法で、例えば、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、又はｍＲＮＡとして導入することができる。核酸導入は、種々の標準方法、例えば、トランスフェクション、形質導入、又は電気穿孔によって達成することができる。
前駆細胞の修飾。目的の抗原を作製するためのＤＮＡ発現ベクター又はｍＲＮＡなどの核酸が前駆細胞に導入されてもよく、これは元の供給源から単離するか、又は上記の拡大したものから本明細書に提供されるとおりのルーチンの組換え技術によって得ることができる。場合によっては、発現ベクターは、当該技術分野において公知の方法による相同組換え又は非相同組換えによって細胞のゲノムに組み込まれ得るように設計し得る。
場合によっては、ゲノムを選択的に標的化して切断することのできるポリペプチド、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸を使用して、発現ベクターの核酸ペイロードの挿入が特定のゲノム位置、例えばＣＲ１遺伝子座（１ｑ３２．２）、ヘモグロビン遺伝子座（１１ｐ１５．４）、又は限定はされないが、表Ｃに列挙されるものを含めた別の赤血球関連タンパク質に向けられる。
場合によっては、核酸は、標的遺伝子の発現をサイレンシング又は抑制するＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子である。例えば、この分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ分子、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子であり得る。
前駆細胞に発現ベクターを移入させる方法としては、限定はされないが、ウイルス媒介性遺伝子移入、リポソーム媒介性移入、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクション及び形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスをベースとするベクター、並びにレトロウイルスベースのベクターの使用など、ウイルス媒介性遺伝子移入が挙げられる。遺伝子移入方法の例には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、及び細胞マイクロインジェクションが含まれる。
本明細書に記載される遺伝子修飾前駆細胞のいずれも、成熟除核赤血球への分化を可能にする好適な条件下、例えば本明細書に記載されるインビトロ培養プロセスで培養することができる。得られる除核赤血球は成熟赤血球に関連するタンパク質、例えば、ヘモグロビン、グリコホリンＡを提示して発現し、これは標準方法（例えば、ウエスタンブロッティング又はＦＡＣＳ分析）によってバリデートし及び定量化することができる。
外因性抗原発現戦略
本明細書には、外因性抗原発現ＥＨＣによって呈示される抗原が提供される。一部の実施形態において、抗原は標的との相互作用能を有し、例えば標的と会合又は結合する。抗原はポリペプチドを含むことができ、又はそれから本質的になり得る。一部の実施形態において、抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、小分子、又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、抗原は標的と相互作用せず、外因性抗原発現ＥＨＣによって細胞、組織又は対象の体内の他の部位に送達されるペイロードとしての役割を果たす。
抗原ポリペプチド、キメラ及び融合物
一部の実施形態において、抗原はポリペプチドを含む。レシバー（ｒｅｃｉｖｅｒ）ポリペプチドはサイズが６アミノ酸〜３０００アミノ酸の範囲であってもよく、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００アミノ酸超であり得るか、又は５００アミノ酸超であり得る。レシバー（ｒｅｃｉｖｅｒ）ポリペプチドはサイズが約２０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５００アミノ酸、又は約４０アミノ酸〜約５００アミノ酸の範囲であってもよい。
一部の実施形態において、抗原ポリペプチドは、２つ以上の個別的なタンパク質ドメインを含み得るキメラ又は融合タンパク質を含む。これらのキメラ抗原は、種々のドメインが異なる供給源に由来し、従って天然で一緒に見られることはないという意味で異種又は外因性であり、例えば組換え核酸によってコードされ得る。抗原ポリペプチドは幾つかの方法によって作製することができ、その多くは当該技術分野で周知であり、また本明細書にも記載される。例えば、抗原ポリペプチドは、抽出によるか（例えば、単離細胞から）、抗原ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によるか、又は化学合成によって得ることができる。抗原ポリペプチドは、例えば、組換え技術によって、及びポリペプチドをコードする発現ベクターを、コードされる抗原ポリペプチドの発現用宿主細胞に（例えば形質転換又はトランスフェクションによって）導入することにより作製し得る。
活性を変えることなく一般にアミノ酸配列に加え得る種々の保存的な変化がある。これらの変化は保存的置換又は突然変異と称される；即ち、特定のサイズ、電荷又は他の特性を有するアミノ酸分類に属するアミノ酸によって別のアミノ酸を置換することができる。アミノ酸配列の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。かかる改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は等電点によって決定するときの見かけの分子量に実質的に影響を及ぼさないものと思われる。保存的置換はまた、配列の光学異性体による他の光学異性体の置換、具体的には配列の１つ以上の残基に関するＤアミノ酸によるＬアミノ酸の置換も含む。さらに、配列中の全てのアミノ酸がＤ異性体からＬ異性体への置換を受けてもよい。例示的な保存的置換としては、限定はされないが、正電荷を維持するＡｒｇに対するＬｙｓ及びその逆；負電荷を維持するＡｓｐに対するＧｌｕ及びその逆；遊離〜ＯＨを維持するためのＴｈｒに対するＳｅｒ；及び遊離ＮＨ２を維持するＡｓｎに対するＧｌｎが挙げられる。さらに、ポリペプチド配列又は対応する核酸配列の点突然変異、欠失、及び挿入が、ある場合には、そのポリペプチド又は核酸断片の機能喪失なく作製されてもよい。置換は、例えば、１個、２個、３個、又はそれを超える残基を含み得る。具体的なアミノ酸配列又はポリペプチドをコードする組換え核酸の任意の教示又はそれらの名称の名称の教示には、ポリペプチド又は核酸断片の機能喪失なく作製することのできる、それらのポリペプチド配列又は対応する核酸配列並びにそのタンパク質又は遺伝子についてデータベースに寄託された任意の配列の任意の保存的置換、点突然変異、欠失、及び挿入が含まれる。
一部の実施形態において、抗原ポリペプチドは外因性抗原発現ＥＨＣの膜と会合している。他の実施形態において、抗原ポリペプチドは外因性抗原発現ＥＨＣの膜と会合していない。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣ中の脂質と抗原との質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、約１，０００，０００：１、約１０，０００，０００：１、約１００，０００，０００：１、約１，０００，０００，０００：１、又は約１，０００，０００，０００：１超である。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣ中の非外因性抗原ポリペプチドと抗原との質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、約１，０００，０００：１、約１０，０００，０００：１、約１００，０００，０００：１、約１，０００，０００，０００：１、又は約１，０００，０００，０００：１超である。
特定の実施形態において、ポリペプチド抗原は外因性抗原発現ＥＨＣの表面上に位置し、その周りの環境に露出している。一部の実施形態において、ポリペプチド抗原は外因性抗原発現ＥＨＣの内部に位置し、その非露出側に向いている。
特定の実施形態において、ポリペプチド抗原は以下のドメイン、即ち、Ｓドメイン（表面）、Ａドメイン（アンカー）、及び／又はＵドメイン（非露出）のうちの少なくとも１つを含み、ここでＳドメインは外因性抗原発現ＥＨＣの周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは外因性抗原発現ＥＨＣの内部に位置し及び／又はその非露出側に向いている。
任意選択で抗原ポリペプチドは、ｉ）Ｓ’ドメインと称される１つ以上の追加的なＳドメイン、又はｉｉ）Ｕ’ドメインと称される１つ以上の追加的なＵドメインを含む。
一部の実施形態において、ＳドメインとＡドメインとは、同じポリペプチド鎖の一部を形成する。
一部の実施形態において、ＡドメインとＵドメインとは、同じポリペプチド鎖の一部を形成する。
一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上は外因性抗原発現ＥＨＣに外部的に加えられる。
一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上は外因性抗原発現ＥＨＣ内で作製される。
一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上はポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上はポリペプチドでない。
外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上にある抗原の例示的構造の概略図を図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１３Ｃに示す。
Ａドメイン
特定の実施形態において、Ａドメインは膜ポリペプチドである。Ａドメインは、例えば、内在性膜ポリペプチド又は膜結合ポリペプチドであり得る。
Ａドメインは、以下のクラス、限定はされないが、例えば、αヘリックスバイトピック、αヘリックスポリトピック、βバレル膜貫通、全αモノトピック／末梢、全βモノトピック／末梢、α／βモノトピック／末梢、α＋βモノトピック／末梢、αヘリックスペプチド、βヘアピンペプチド、βヘリックスペプチド、１型膜貫通タンパク質（Ｎ末端細胞外）、２型膜貫通タンパク質（Ｎ末端細胞内）、３型膜貫通タンパク質、４Ａ型膜貫通タンパク質、４Ｂ型膜貫通タンパク質、脂質アンカー型タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質、プレニル鎖アンカー型タンパク質、又は非定型構造のペプチドの１つから選択され得る。
特定の実施形態において、Ａドメインは内因性であり、例えば、ＥＨＣ、血小板、又は造血細胞にとって内因性である。一部の実施形態において、Ａドメインは哺乳類細胞にとって内因性である。
特定の実施形態において、Ａドメインは外因性であり、例えば、ＥＨＣ、血小板、又は造血細胞にとって外因性である。一部の実施形態において、Ａドメインは哺乳類細胞にとって外因性である。
Ａドメインは、以下の分子又はその断片、例えば限定はされないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗ１８６、ＣＤ１９５、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２０９、ＣＤ２０２ａ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ２７９、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９、ＣＤ３２６、Ｒａｓ関連タンパク質１Ａ、セマポリン７Ａ（ｓｅｍａｐｏｒｉｎ ７Ａ）前駆体、カルシウム及びインテグリン結合タンパク質１、５５ｋＤａ赤血球膜タンパク質、フロチリン−１、フロチリン−２、赤血球系膜結合タンパク質、真核生物翻訳開始因子２Ｃ ２、シトクロムｂ５レダクターゼ、細胞分裂制御タンパク質４２ホモログ、ＫＩＡＡ１３６３タンパク質、バンド３、アネキシンＶＩＩ、アクアポリン、エクトＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ４、ケル、ＬＦＡ−３、溶質キャリアファミリー２メンバー１、ＬＧＡＬＳ３タンパク質、尿素輸送体、Ｒｈ血液型ＣＥ抗原ポイペプチド（ｐｏｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｒｈ関連糖タンパク質、デマチン、ＡＢＯ血液型、アクアポリン３、オベルジェ、バンド３、ベイシジン、Ｃ４１、ＣＤ４４、シスＡＢ、コルトン抗原、補体成分４、ＣＲ１、ＤＡＦ、ディエゴ、ダッフィ、Ｈｈ／ボンベイ抗原、ｉｉ抗原、インディアン血液型、ケル、キッド、ルイス抗原、ルセラン抗原、ＭＮＳ抗原系、コスト（Ｃｏｓｔ）型、Ｅｒ型、デマチン、ストマチン、トロポミオシン、グルコース輸送体、アデュシン、ラブフィリン、Ｃ１テトラヒドロ葉酸シンターゼ、ヴェル（Ｖｅｌ）型、Ｌａｎ抗原、Ａｔ抗原、Ｊｒ抗原、ＡｎＷｊ抗原、Ｓｄ抗原、バッティ（Ｂａｔｔｙ）、ビルケス（Ｂｉｌｋｅｓ）、ボックス（Ｂｏｘ）、クリスチャンセン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ）、ＨＪＫ、ＨＯＦＭ、ＪＦＶ、ＪＯＮＥｓ、イェンゼン（Ｊｅｎｓｅｎ）、カタギリ（Ｋａｔａｇｉｒｉ）、リブセイ（Ｌｉｖｅｓａｙ）、ミルン（Ｍｉｌｎｅ）、オルデイド（Ｏｌｄｅｉｄｅ）、ピータース（Ｐｅｔｅｒｓ）、ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、リード（Ｒｅｉｄ）、ＲＥＩＴ、ＳＡＲＡ、リーサス血液型Ｄ、アルドラーゼ、トロポモジュリン、アルギナーゼ、クレアチンキナーゼ、Ｂ−Ｃａｍタンパク質、Ｒａｐ１Ａ、ベネット−グッドスピード（Ｂｅｎｎｅｔｔ−Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ）、Ｐ抗原系、Ｒｈ血液型Ｘｇ抗原系、ＸＫタンパク質、Ｙｔ／カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）抗原系、ＣＤ５８、Ｒｈ、シアンナ（Ｓｃｉａｎｎａ）、ラディン（Ｒａｄｉｎ）、ＤＡＲＣ（ダッフィ）、ＣＲ１クノップス−マコイ（Ｋｎｏｐｓ−ＭｃＣｏｙ）、ＤＡＦクローマー（Ｃｒｏｍｅｒ）、ゲルビッヒ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）（ＧＹＰＣ）、ＣＤ４７、グリコホリンＡ、バンド３（ＡＥ３）、ＧＹＰＢ Ｓｓ、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂチド（Ｃｈｉｄｏ）、ロジャース（Ｒｏｄｇｅｒｓ）Ｃ４補体成分、ＨＬＡ Ｂｇ ＨＬＡクラスＩ、ＲＨＡＧ Ｒｈ関連アンモニウム輸送体、糖タンパク質、コルトン（Ｃｏ）ウォーターチャネルタンパク質、ＡＣＨＥカートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）（Ｙｔ）アセチルコリンエステラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、グリコホリンＣ、アクアポリン、赤芽球関連膜タンパク質、ＣＤ４４、シナプトブレビン２、リボヌクレアーゼ、十二指腸シトクロムＢ、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＤ５９、ＣＤ４４インディアン（Ｉｎ）、ＡｎＷｊ接着受容体、ＭＥＲ２、ＤＯＫドンブロックＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ、ＳＥＭＡ７Ａ ＪＭＨ推定接着受容体、ＵＭＯＤ Ｓｄａタム−ホースフォール（Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ）タンパク質（ウロモジュリン）、ディエゴ（Ｄｉ）、ライト（Ｗｒ）アニオンチャネルタンパク質（バンド３、ＡＥ１）、キッド（Ｊｋ）尿素輸送体、ＦＵＴ３ルイス（Ｌｅ）α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、ＯＫ Ｏｋａニューロテリン、推定接着分子、ＬＷ接着受容体、ＦＵＴ２分泌型（Ｓｅ）α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ、ＦＵＴ１ Ｈｈ α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ、ＬＵ ルセラン（Ｌｕ）接着受容体、Ｐ１グリコシルトランスフェラーゼ、ＸＫ Ｋｘ推定神経伝達物質輸送体、ＸＧ Ｘｇ 旧称ＰＢＤＸ、ＭＩＣ２、ヘモグロビン、アンキリン、スペクトリン、ＫＥＬ ケル（フォームＫ、ｋ、Ｋｐ、Ｊｓ）メタロプロテイナーゼ、トルキルドセン抗原、補酵素Ｑ１０、Ｒａｂ ３５、Ｒａｌ Ａ結合タンパク質、透明帯結合タンパク質、Ｌｙｎ Ｂタンパク質、ＫＩａａ１７４１タンパク質、ＤＣ３８、カルシウム輸送ＡＴＰアーゼ、ＧＰＩＸ、ＧＰＩｂａ、ＧＰＩｂｂ、ＧＰＶ、ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ、ＧＰＶＩ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＶ／ＩＩａから選択され得る。
Ｓドメイン
一部の実施形態において、Ｓドメインはタンパク質又はポリペプチドである。他の実施形態において、Ｓドメインは核酸である。一部の実施形態において、Ｓドメインは化学物質である。特定の実施形態において、Ｓドメインは小分子である。
一部の実施形態において、Ｓドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、可動性リンカー、エピトープタグ、酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、抗原、抗体様分子、抗体のリガンド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、成長因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、酵素認識配列、トランスペプチダーゼ認識配列、プロテアーゼ認識配列、切断可能ドメイン、インテイン、ＤＮＡ結合タンパク質、及びＲＮＡ結合タンパク質、補体調節分子、補体カスケード分子、凝固カスケード分子、キレーター、補体調節ドメイン、ＳＣＲドメイン、ＣＣＰドメイン、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメイン、アルマジロリピート、ロイシンジッパー、デルス（ｄｅａｌｔｈ）エフェクタードメイン、カドヘレイン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）リピート、ＥＦハンド、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同性ドメイン、ＳＣＲ相同性２ドメイン、ジンクフィンガードメイン、環状ペプチド、細胞透過性ペプチドから選択されるか、又はそれに由来するポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｓドメインは非ポリペプチド分子、例えば核酸、炭水化物、又は小分子である。一部の実施形態において、Ｓドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡプローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、ｍＲＮＡ、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドから選択される核酸である。一部の実施形態において、Ｓドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、キレーター、ＤＯＴＡ、放射性核種、同位体、造影剤、蛍光分子、化学発光分子、気体から選択される小分子である。
Ｕドメイン
一部の実施形態において、Ｕドメインはタンパク質又はポリペプチドである。他の実施形態において、Ｕドメインは核酸である。一部の実施形態において、Ｕドメインは化学物質である。特定の実施形態において、Ｕドメインは小分子である。
一部の実施形態において、Ｕドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、可動性リンカー、エピトープタグ、酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、抗原、抗体様分子、抗体のリガンド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、成長因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、酵素認識配列、トランスペプチダーゼ認識配列、プロテアーゼ認識配列、切断可能ドメイン、インテイン、ＤＮＡ結合タンパク質、及びＲＮＡ結合タンパク質、補体調節分子、補体カスケード分子、凝固カスケード分子、キレーター、補体調節ドメイン、ＳＣＲドメイン、ＣＣＰドメイン、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメイン、アルマジロリピート、ロイシンジッパー、デルス（ｄｅａｌｔｈ）エフェクタードメイン、カドヘレイン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）リピート、ＥＦハンド、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同性ドメイン、ＳＣＲ相同性２ドメイン、ジンクフィンガードメイン、環状ペプチド、細胞透過性ペプチド、キナーゼドメイン、ホスファターゼドメイン、細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質と相互作用するタンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ、ＩＴＩＭドメイン、ＩＴＡＭドメインから選択されるか、又はそれに由来するポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｕドメインは非ポリペプチド分子、例えば核酸、炭水化物、又は小分子である。一部の実施形態において、Ｕドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡプローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、ｍＲＮＡ、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドから選択される核酸である。一部の実施形態において、Ｕドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、キレーター、ＤＯＴＡ、放射性核種、同位体、造影剤、蛍光分子、化学発光分子、気体から選択される小分子である。
抗原ポリペプチドの例
抗原ポリペプチドの例としては、以下が挙げられる：ポリペプチド抗原は、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡを含む；ポリペプチド抗原は、グリコホリンＡのリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、及びグリコホリンＡの本体配列を含む；ポリペプチド抗原は、補体受容体１（ＣＲ１）を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＲ１のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、ＣＲ１の本体配列を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＲ１のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、ＣＲ１のＬＨＲ−Ａ及びＬＨＲ−Ｂの６つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜貫通領域、及びＣＲ１の細胞内領域を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＲ１のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、ＣＲ１のＬＨＲ−Ａ及びＬＨＲ−Ｂ及びＬＨＲ−Ｃの９つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜貫通領域、及びＣＲ１の細胞内領域を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＲ１のリーダー配列、ＣＲ１のＬＨＲ−Ａ、ＣＲ１のＬＨＲ−Ｂ、ＣＲ１のＬＨＲ−Ｃ、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜貫通領域、及びＣＲ１の細胞内領域を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＲ１のリーダー配列、ＣＲ１のＬＨＲ−Ａ、ＣＲ１のＬＨＲ−Ｂ、ＣＲ１のＬＨＲ−Ｃ、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、グリコホリンＡの膜貫通領域及び細胞内領域を含む；ポリペプチド抗原は、グリコホリンＡのリーダー配列、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ＨＡエピトープタグ、及びグリコホリンＡの本体を含む；ポリペプチド抗原は、ケル、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ＨＡエピトープタグ、及びｓｃＦｖを含む；ポリペプチド抗原は、ケル及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ケルの７１アミノ酸Ｎ末端断片及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ケルの７１アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ケルの７９アミノ酸Ｎ末端断片及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ケルの７９アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ケルの７１アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ｓｃＦｖ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ケルの７９アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ｓｃＦｖ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、ＣＤ５５のリーダー配列、ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５５の末端３７アミノ酸を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＤ５５のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５５の本体を含む。一実施形態において、ポリペプチド抗原は、ＣＤ５９のリーダー配列、ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５９の本体を含む；ポリペプチド抗原は、ＣＤ５９のリーダー配列、及びＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５９の本体を含む；ポリペプチド抗原は、アデノシンデアミナーゼ及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、アデノシンデアミナーゼ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、グリコホリンＡ、細胞質Ｃ末端のアデノシンデアミナーゼ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチド抗原は、グリコホリンＡ、細胞質Ｃ末端のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びＨＡエピトープタグを含む。
特定の実施形態において、抗原はマクロファージとの相互作用能を有する。抗原ポリペプチドは以下の１つ以上を含み得る：補体受容体（Ｒｉｅｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：２０８１−２０９１（１９９４））、スカベンジャー受容体（Ｂｒａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６９：３４５−３５２（１９９９））、トランスフェリン受容体（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９：４８２−４８９（１９９８）；Ｈａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２６：４５５６（１９９４））；Ｆｃ受容体（Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１７３１−１７３３（１９９４））；及びマンノース受容体（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３００：２５１−２５８（１９９７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３７：３５８−３６４（１９９０））。
マクロファージとの相互作用能を有する他の抗原には、以下が含まれる：低密度リポタンパク質（Ｍａｎｋｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４０：１１２−１１５（１９９７）；ｖｏｎ Ｂａｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３１：３８２−３８６（１９９３））、超低密度リポタンパク質（Ｔａｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５：１５４７−１５６０（１９９１））、マンノース残基及び他の炭水化物部分（Ｐｉｔｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２：３５５−３６５（１９９５））、ポリカチオン性分子、例えばポリ−Ｌ−リジン（Ｈａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２６：４５−５６（１９９４））、リポソーム（Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．２：３６３−３７１（１９９４）；Βｅｔａｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：４８−５３（１９９３））及び２−マクログロブリン（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１５３８−１５４５（１９９４））。
本明細書には、ｉ）同じ系統の天然ＥＨＣに存在しないか、又はｉｉ）抗原を含むＥＨＣと比較したとき低下したレベル又は低下した活性レベルで同じ系統の天然ＥＨＣに存在するかのいずれかである機能活性を有する抗原を含むＥＨＣを含有する組成物が提供される。かかる機能活性には、補体阻害、免疫複合体クリアランス、人工抗原提示、凝固カスケードのモジュレーション、酸素移動、薬物送達、細胞毒吸着、食作用の回避、及び循環時間の延長が含まれる。
一部の実施形態において、ＥＨＣは、ＣＲ−１抗原を含むため、同じ系統の天然ＥＨＣと比べてより高いレベルの補体受容体ポリペプチド、例えばＣＲ１を有する。代替的実施形態において、抗原を含むＥＨＣは、限定はされないが、表６及び表８に列挙されるポリペプチドを含めた、同じ系統の天然ＥＨＣと比べてより高いレベルの補体受容体アゴニストポリペプチド又は補体関連ポリペプチドを有する。補体受容体抗原ポリペプチドは、ヒト補体受容体１（ＣＲ１）ポリペプチド、その変異体、又は機能断片を含む。ＣＲ１抗原ポリペプチドはＣＲ１の天然アレル、例えば、Ａアレル（Ｆアレル又はＣＲ１＊１アレルとも称される）、Ｂアレル（Ｓアレル又はＣＲ１＊２アレルとも称される）、Ｃアレル（Ｆ’アレル又はＣＲ１＊３アレルとも称される）、又はＤアレル（ＣＲ１＊４アレルとも称される）の１つ又は２つ以上に由来し得る。これらの天然型の配列及びデータベース受託番号は、表３に提供される。一部の実施形態において、ＣＲ１抗原ポリペプチドは、ＣＲ１ポリペプチドのドメインを含有する。例えば、ＣＲ１ポリペプチドは、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール又はＳｕｓｈｉドメインとも称される１つ以上のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメイン、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＶ６５５７７．１を含み得る。一実施形態において、ＣＲ１抗原ポリペプチドは、１個以上のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４個又は４４個超のＳＣＲを含む。別の実施形態において、ＣＲ１抗原ポリペプチドは、ＣＲ１の１個以上のロング相同リピート（ＬＨＲ）単位、例えば、ＬＨＲ−Ａ、ＬＨＲ−Ｂ、ＬＨＲ−Ｃ、又はＬＨＲ−Ｄ、例えば、１、２、３、４、５、６個又は６個超のＬＨＲドメインを含む。別の実施形態において、ＣＲ１抗原ポリペプチドは、別の細胞膜タンパク質、例えば、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、グリコホリンＤ、ケル、バンド３、アクアポリン１、ｇｌｕｔ １、キッド抗原タンパク質、リーサス抗原、例えば、限定はされないが、表１及び表６に列挙される細胞表面部分に融合したＣＲ１の１つ又は２つ以上の細胞外ドメインを含み得る。
一部の実施形態において、ＥＨＣは、補体受容体抗原ポリペプチド、又はそれに代えて又は組み合わせで、限定はされないが、表８に列挙されるポリペプチド、及びそれらのポリペプチドに対するアゴニストを含めた、補体受容体アゴニスト抗原ポリペプチド又は補体関連抗原ポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する。一部の実施形態において、ＥＨＣは、外因性崩壊促進因子（ＣＤ５９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＧ４６５２３．１）ポリペプチド、又は外因性膜補因子（ＣＤ４６、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１２２２４．１）ポリペプチド、又はその変異体若しくは機能断片、又はそれらの組み合わせをさらに含有する。
ＣＲ１活性には、Ｃ３ｂ含有免疫複合体との結合及び循環から細網内皮系の肝臓及び脾臓マクロファージへのそれらの免疫複合体のシャトリングが含まれる。細網内皮系の細胞と遭遇すると、免疫複合体は食細胞によってエンドサイトーシスで取り込まれるが、赤血球は回避して循環し続ける。免疫複合体の除去により、時にＣＲ１が赤血球の表面からタンパク質分解によって切断されることもある。結合活性を計測するには、ＥＨＣと免疫複合体との間のインビトロ結合アッセイを実施することができる。ＥＨＣの回避を計測するには、食細胞及び免疫複合体が負荷されたＥＨＣによるインビトロ食作用アッセイを実施することができる。肝臓への循環免疫複合体のインビボクリアランスを計測するには、放射性標識免疫複合体を使用してクリアランス及び体内分布アッセイを実施することができる。
抗原ポリペプチドを含まない同じ系統の造血細胞より高いレベルで天然ポリペプチドを含む抗原を含有するＥＨＣを含有する組成物が提供される。例えば、ＥＨＣの集団は、ＣＲ１抗原ポリペプチドを欠く同じ系統の対応する造血細胞より少なくとも約１．１、例えば、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００倍、又は１００００倍超高い抗原、例えば補体受容体１レベルを含む。網赤血球及び赤血球のＣＲ１レベルは、典型的には細胞当たり５０〜２０００個の分子である（Ｌａｃｈ−Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１６２：７５４９）。ＣＲ１レベルが細胞当たり少なくとも約２５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００個、又は１００００００個超の分子であるＥＨＣの集団を含有する組成物が提供される。野生型及び外因性抗原発現ＥＨＣのＣＲ１レベルは、例えば、ＣＲ１に特異的な抗体によるフローサイトメトリーによって計測及び定量化することができる。
本明細書には、一部の実施形態において、抗原を含むＥＨＣ、抗原を含むＥＨＣの集団、及び抗原を含むＥＨＣの組成物が提供される。一部の実施形態において、抗原は循環病原体、例えばウイルス又は細菌と相互作用する。一部の実施形態において、ＥＨＣは、循環病原体に特異的な抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディをコードする組換え遺伝子を発現する。抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディ抗原又は循環病原体に対して親和性を有する別の抗原がＥＨＣ内又はその上に負荷される。抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディ抗原又は循環病原体に対して親和性を有する他の抗原は細胞内又は細胞外に局在し得る。一部の実施形態において、抗原は、表面抗原、エンベロープ抗原又はカプシド抗原などのウイルス抗原又は細菌抗原に特異的である。
本明細書には、特定の実施形態において、抗原を含むＥＨＣ、抗原を含むＥＨＣの集団、及び抗原を含むＥＨＣの組成物が提供される。一部の実施形態において、抗原は、毒素、好ましくは病原体に由来するか又は他に環境に由来するなどの外来性毒素と相互作用する。一部の実施形態において、ＥＨＣは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、アミロイドＰ成分、又はカチオン性タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む抗原をコードする組換え遺伝子を発現する。毒素結合抗原は融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、毒素結合抗原はＥＨＣ内又はその上に負荷され得る。毒素結合抗原は細胞内又は細胞外に局在し得る。一部の実施形態において、毒素結合抗原はボツリヌス又は炭疽などの細菌性毒素に特異的である。
さらに、外因性抗原発現ＥＨＣは、標的を隔絶するその能力を増進する能力を有する抗原を発現し得る。潜在的な隔絶増進抗原には、限定はされないが表１にあるものを含めた、ポリペプチド輸送体が含まれる。
一実施形態において、抗原は、ダッフィ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、ＥＨＣは、ダッフィ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）に由来するアミノ酸配列をコードする組換え遺伝子を発現する。ＤＡＲＣ抗原は完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。ＤＡＲＣは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、ＤＡＲＣタンパク質はＥＨＣ内又はその上に負荷される。一部の実施形態において、負荷されたＤＡＲＣはさらに機能化されるか、又は他の方法で修飾される。ＤＡＲＣ抗原分子は細胞内又は細胞外に局在し得る。
ＤＡＲＣは、強力なマルチリガンドケモカイン受容体として同定された。ＤＡＲＣはロドプシン様７本ヘリックス膜貫通タンパク質ファミリーに属する。赤血球に加えて、ＤＡＲＣは、多くの組織における白血球遊出の原発部位である後毛細管細静脈内皮細胞で発現する。ＤＡＲＣは、ＣＣ及びＣＸＣケモカインの両方に対する高度に特異的な結合部位を提供する。ＤＡＲＣは、ＥＬＲモチーフＣＸＣケモカインに対してより高い親和性を有すると考えられている。ＣＸＣケモカインは好中球化学誘引物質であり、潜在的に血管新生促進性であり得る。
ＤＡＲＣとＣＸＣＬ８との間の相互作用では、５ｎｍｏｌ／Ｌの解離定数（Ｋｄ）及び赤血球当たり１０００〜９０００個と推定される受容体結合部位が示されている（Ｈａｄｌｅｙ，Ｂｌｏｏｄ，１９９７）。他の７回膜貫通型ケモカイン受容体と異なり、ＤＡＲＣは、２番目の細胞質ループに位置する高度に保存されたＧタンパク質共役モチーフを欠いている（Ｍｅｎｙ，Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１０）。ＤＡＲＣはＧタンパク質共役型ではなく、既知の選択的シグナル伝達機構を有しない。ＤＡＲＣの生物学的な役割は完全には解明されていない。ＤＡＲＣは、ａ）多重特異的であり；ｂ）細胞内シグナルを惹起する能力を有しないと考えられており、及びｃ）赤血球表面に結合したケモカインにその通常の標的炎症細胞は到達できないと考えられる（Ｎｅｏｔｅ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９３）。赤血球は炎症過程の調節においてＤＡＲＣの存在を用いて役割を果たし得る。
サイトカインなどの炎症シグナル伝達分子は、高濃度で存在するとき、局所的及び全身的な組織損傷を引き起こし得る。サイトカインのバーストは、細菌性敗血症、関節リウマチ、及び他の幾つかの炎症性疾患の病因に結び付けられている。天然サイトカイン受容体又は合成抗体様受容体模倣体を外因的に発現する修飾ＥＨＣは、炎症性サイトカインを隔絶することができる。例示的ケモカイン受容体はＤＡＲＣである。本明細書には、限定はされないがＤＡＲＣを含めた、サイトカイン受容体又はケモカイン受容体である抗原を含むＥＨＣが提供される。例えば、ＤＡＲＣ抗原を発現する（それにより天然赤血球上に存在する量を増加させる）ＥＨＣを使用して、循環中及び／又は体の末梢組織内のケモカインレベルをモジュレートし得る。ＤＡＲＣ抗原を含むＥＨＣは、破壊を特徴とし得るか、或いは炎症性メディエーターを緩徐に放出して循環中に、但し低い拡散濃度で戻し得る。ケモカイン又はサイトカイン受容体を含む抗原を含むＥＨＣは、シグナル伝達ペプチドのリザーバとして機能し得る。
一実施形態において、抗原は、抗体に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、ＥＨＣは、抗体に由来するアミノ酸配列をコードする組換え遺伝子を発現する。抗体抗原は完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。抗体は融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、抗体タンパク質はＥＨＣ内又はその上に負荷される。一部の実施形態において、負荷された抗体はさらに機能化されるか、又は他の方法で修飾される。抗体抗原は細胞内又は細胞外に局在し得る。一実施形態において、抗原は、所望の標的に特異的な抗体アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗体はｓｃＦｖである。他の実施形態において、抗体はナノボディである。
特定の実施形態において、ＥＨＣは、標的に特異的な抗体又はその断片を含み且つ細胞表面上に位置する抗原を含む。例えば、ボツリヌス毒素結合に特異的な抗体の可変断片（Ｆｖ）がＥＨＣの表面上で発現する。ボツリヌス毒素結合抗体は当該技術分野において公知であり（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｉｎｆ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７）、抗体のＦｖ部分の発現も同様に公知である（Ｈｏｅｄｅｍａｅｋｅｒ，Ｊｏｕｒｎ ｏｆ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７）。結合すると、毒素はＦｖ領域を介してＥＨＣに保持され、隔絶され、体からのクリアランスのために循環系を通じて肝臓へとシャトルされる。
一実施形態において、抗原は、ｓｃＦｖ抗体に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、ＥＨＣは、ｓｃＦｖ抗体に由来するアミノ酸配列をコードする組換え遺伝子を発現する。ｓｃＦｖ抗体抗原は完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。ｓｃＦｖ抗体は融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、ｓｃＦｖタンパク質はＥＨＣ内又はその上に負荷される。ＥＨＣによって発現され得る好適なｓｃＦｖ抗原ポリペプチドとしては、限定はされないが、表６に列挙されるものが挙げられる
ｓｃＦｖ抗体は、主にハイブリドーマ、免疫化マウス由来の脾臓細胞、及びヒト由来Ｂリンパ球から構築されている。抗体の可変領域はＶ（Ｈ）及びＶ（Ｌ）ドメインの可変ドメインの非共有結合性ヘテロ二量体によって形成され、これが次には組換えｓｃＦｖ抗体の構築に用いられ得る。
ｓｃＦｖの作製は当該技術分野において公知であり、ｍＲＮＡを初めにハイブリドーマから（或いはまた、脾臓、リンパ球、及び骨髄から）単離し、続いて抗体遺伝子増幅（ＰＣＲ）の鋳型として機能するようにｃＤＮＡに逆転写する必要がある。この方法によれば、抗体由来のｓｃＦｖの多様な集合（ｓｃＦｖがモデル化された元の抗体と同等の集合）を有する大規模ライブラリを作成することができる。
ｓｃＦｖ抗原は、限定はされないが表４にあるものを含めた、任意の標的分子に特異的にすることができる。
一例において、ＥＨＣ上で炭疽毒素に特異的なｓｃＦｖ抗原を発現させ得る。それを必要としている対象に投与すると、炭疽毒素に特異的な抗原分子を含むＥＨＣの集団の有効用量を使用して炭疽毒素を捕捉し、隔絶することができる。ＥＨＣは肝臓に遊走し、そこでクリアランスが起こる。
特定の実施形態において、赤血球は、細胞の表面上で発現するラクダ科動物由来のナノボディを含む抗原を含む。ナノボディは通常１２〜１５ｋＤａである。ナノボディは抗体及びｓｃＦｖと比べてかなり小さい。従ってナノボディはトランスフェクトし易く、ナノボディ抗原はＥＨＣにおいてより容易に発現し、翻訳され及び／又は細胞表面に輸送されることになる。特定の実施形態において、ナノボディ抗原を用いることにより、特定の抗原によって引き起こされる免疫原性効果が最小限に抑えられる。ナノボディは、そのサイズが小さいため、潜在的な免疫原性の低下をもたらし得る。特定の実施形態において、抗原ナノボディは、それがＥＨＣの原形質膜の機械的及び形態学的挙動の変化を抑えることが理由で用いられる。これにより、ＥＨＣが通常の循環赤血球の挙動を呈することが可能となり得る。特定の実施形態において、抗原ナノボディは、標準的な抗体と比較して隠れた又はまれなエピトープを認識する能力が高いことが理由で用いられる。例えば、抗原ナノボディは、標的の小さい酵素キャビティに結合し、標的の分子挙動をモジュレートすることができる。
特定の実施形態において、ＥＨＣは、ヒト補体系の分子の標的エピトープに対して特異性を有する抗原ナノボディを含む。かかるＥＨＣは、それを必要としている対象に投与されると、補体系の１つ以上の過活性因子を選択的に枯渇させ得る。例えば、Ｃ５は、対象への細胞の投与時に、Ｃ５の標的エピトープに対して特異性を有する抗原ナノボディを含むＥＨＣによって標的化され、ＥＨＣによってその系から除去され得る。この手法は、例えば発作性夜間ヘモグロビン尿症などの補体障害に対して治療効果をもたらすのに好適である。特定の実施形態において、ＥＨＣは、限定はされないが表４に列挙されるものを含めた、分子の標的エピトープに対して特異性を有する抗原ナノボディを含む。
一部の実施形態において、抗原は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ（スクラーゼ）又はヒドロラーゼ（ＤＮアーゼ、リパーゼ）のうちの１つに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、ＥＨＣは、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ（スクラーゼ）又はヒドロラーゼ（ＤＮアーゼ、リパーゼ）のうちの１つに由来するアミノ酸配列をコードする組換え遺伝子を発現する。抗原プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ及びヒドロラーゼは完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。抗原プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ及びヒドロラーゼは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、抗原プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼはＥＨＣ内又はその上に負荷される。一部の実施形態において、負荷された抗原プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼはさらに機能化されるか、又は他の方法で修飾される。抗原プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼ抗原分子は細胞内又は細胞外に局在し得る。
特定の実施形態において、ＥＨＣは、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼを含む抗原を含む。プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼ抗原を含むＥＨＣは、例えば肝臓のマクロファージによる循環クリアランスとは無関係にＥＨＣ上の標的を分解する能力を有する。特定の実施形態において、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼを含む抗原を含むＥＨＣがそれを必要としている対象に投与され、癌細胞成長に必須の代謝産物の選択的な分解によって癌が治療され得る。例えば、アスパラギナーゼを使用して局所アスパラギンレベルを低下させることにより、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病が治療される。好適な抗原には、例えば、標的分子の分解能を有する２つの主要な酵素クラス、リアーゼ及びヒドロラーゼの一方又は両方が含まれ得る。特定の実施形態において、限定はされないが表６に列挙されるものを含めた分子を含む抗原を含むＥＨＣが提供される。
特定の実施形態において、赤血球は、リアーゼを含む抗原を含む。一実施形態において、リアーゼはバリンデカルボキシラーゼである。バリンデカルボキシラーゼ抗原はＥＨＣの細胞内空間内で発現し得る。バリンデカルボキシラーゼ抗原を含むＥＨＣがそれを必要としている対象に投与され、血中のバリンレベルがモジュレートされ得る。バリンデカルボキシラーゼ抗原を含むＥＨＣは、血中のアミノ酸バリンレベルが増加する遺伝性障害であるバリン血症の治療に好適である。罹患者は、典型的には嘔吐、成長障害、知的障害、及び疲労を発症する。バリン血症はバリントランスアミナーゼ酵素の欠損によって引き起こされ、常染色体劣性遺伝パターンを有する。
特定の実施形態において、赤血球は、ヒドロラーゼを含む抗原を含む。一実施形態において、ヒドロラーゼはデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）である。ＤＮアーゼＩ抗原はＥＨＣの表面上で発現し得る。ＤＮアーゼＩ抗原を含むＥＨＣがそれを必要としている対象に投与されると、ピリミジンヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合で循環ＤＮＡが優先的に切断され、３’位に遊離ヒドロキシル基を有する５’−リン酸末端ポリヌクレオチドが生じる。平均してテトラヌクレオチドが産生される。ＤＮアーゼＩ抗原を含むＥＨＣは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの、循環中の高レベルの免疫原性ＤＮＡによって増悪する病態の治療に好適である。
特定の実施形態において、抗原は、例えばリガンドとの結合時又は刺激との接触時に外部刺激に応答する能力を有し、ここで応答は、例えば、移動、再折り畳み、コンホメーションの変化、二量体の形成、ホモ二量体の形成、ヘテロ二量体の形成、多量体の形成、シグナル伝達、検出可能な形態のエネルギー（例えば蛍光）の放出、別の抗原との機能的相互作用、又は非外因性抗原ポリペプチドとの機能的相互作用を伴う。
標的
本明細書には、標的との相互作用能を有する外因性抗原ポリペプチドを含む外因性抗原発現ＥＨＣが提供される。本明細書にはさらに、標的との相互作用能を有する非ポリペプチド外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣが提供される。外因性抗原発現ＥＨＣは、対象の循環系に滞留する標的の量又は濃度をモジュレートするため、それを必要としている対象に投与され得る。好適な外因性抗原は、特定の標的と相互作用するように選択され得る。好適な標的には、特定の疾患、障害、又は病態に関連する実体が含まれる。しかしながら、標的はまた、特定の疾患、障害、又は病態とは無関係に選択されてもよい。
一部の実施形態において、標的は抗体又は抗体様分子、例えば自己免疫性抗体又は自己抗体、又は外来抗体、又は治療用抗体であり、限定はされないが、例えば、β−２グリコプロテイン１に対する抗体、Ｉ／ｉ抗原に対する抗体、コラーゲンａ３（ＩＶ）のＮＣ１ドメインに対する抗体、血小板糖タンパク質に対する抗体、ホスホリパーゼＡ２受容体に対する抗体、赤血球グリコホリンＡ、Ｂ、若しくはＣに対する抗体、又は赤血球Ｒｈ抗原に対する抗体が挙げられる。
一部の実施形態において、標的は補体カスケードの分子、例えば、Ｃ１、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ３ｂＢｂ３ｂ、Ｃ４ｂ２ｂ、Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ポリＣ９、膜侵襲複合体、Ｂ因子、Ｄ因子、プロパージン、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄｋ、Ｃ３ｅ、Ｂｂ、Ｉ因子、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２、Ｃ４ｂｐ、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ１（ＭＡＳＰ１）、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｃ３ａＲ、Ｃ３ｅＲ、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、ＣＤ５９、Ｃ３β鎖受容体、Ｃ１インヒビター、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、Ｈ因子である。
一部の実施形態において、標的は免疫複合体、例えばＩｇＧ免疫複合体、ＩｇＡ免疫複合体、ＩｇＭ免疫複合体である。
一部の実施形態において、標的は、アミロイド斑、例えばβアミロイド、ＩＡＰＰ（アミリン）、α−シヌクレイン、ＰｒＰｓｃ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メジン（ｍｅｄｉｎ）、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピテリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、Ｓ−ＩＢＭを含む斑である。
一部の実施形態において、標的は細菌、例えばエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、又はマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）である。菌血症がある程度報告されている他の病原体としては、以下が挙げられる：リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クラミジア属（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；赤痢菌属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）；蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）；ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
一部の実施形態において、標的はウイルスであり、限定はされないが、その感染に細胞表面受容体との結合時における宿主細胞への遺伝物質の注入が関わるもの、その感染が細胞表面受容体によって媒介されるウイルスが挙げられる。これらのウイルスの非限定的な例は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルス又はルブラウイルス）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノウイルス）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどのアレナウイルス）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス又はウマ動脈炎ウイルス）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、フレボウイルス又はハンタウイルス）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ノーウォークウイルス）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス又はトロウイルス）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラ様ウイルス）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ヘパシウイルス又はフラビウイルス）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、又はリンホクリプトウイルス）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス又はトゴトウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パルボウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エンテロウイルス又はヘパトウイルス）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、又はレポリポックスウイルス）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レンチウイルス又はスプーマウイルス）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ロタウイルス）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、又はベシクロウイルス）、及びトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アルファウイルス又はルビウイルス）から選択することができる。これらのウイルスの具体的な例としては、ヒト呼吸器コロナウイルス、Ａ型〜Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１〜９型が挙げられる。
一部の実施形態において、標的は寄生虫であり、限定はされないが、例えば、腸内寄生虫又は血液感染性の寄生虫、原虫、トリパノソーマ；マラリアを引き起こす能力を有する血液原虫及び寄生虫；腸内条虫及びテニア科条虫を含めた全身性条虫；腸内コクシジウム；腸内鞭毛原虫；糸状線虫；胃腸管線虫並びに全身性線虫及び鉤虫が挙げられる。
一部の実施形態において、標的は真菌であり、限定はされないが、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｔ．グラブラタ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、及びＣ．パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）が挙げられる。
一部の実施形態において、標的は細菌性毒素であり、限定はされないが、例えば、ＡＢ毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、バクテリオシン、ボツリヌス毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｃ３毒素、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）エンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）アルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ベータ毒素、コードファクター、Ｃｒｙ１Ａｃ、クリプトフィシン、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシンＢ型、発赤毒素、表皮剥脱素、ヘモリシンＥ、易熱性エンテロトキシン、耐熱性エンテロトキシン、溶血素、ロイコシジン、リポ多糖、リステリオリシンＯ、ミクロシン、パントン−バレンタインロイコシジン、病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、ポア形成毒素、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ＲＴＸ毒素、サカシン（ｓａｋａｃｉｎ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）アルファ毒素、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ベータ毒素、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）デルタ毒素、ストレプトリジン、シンプロカミドＡ（Ｓｙｍｐｌｏｃａｍｉｄｅ Ａ）、タブトキシン、テタノリジン、テタノスパスミン、チオール活性化細胞溶解素、トラアシン、毒素性ショック症候群毒素、トキソフラビン、トレハロースジミコレート、ベロ毒素、及びビブリオシンが挙げられる。
一部の実施形態において、標的はプリオンタンパク質であり、限定はされないが、例えば、ＰＲＰ、ＰＲＰｃ、ＰｒＰｓｃ、ＰＲＰｒｅｓが挙げられる。
一部の実施形態において、標的はサイトカイン又はケモカイン又は成長因子であり、限定はされないが、例えば、アシル化刺激タンパク質、アディポカイン、アルブインターフェロン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、コロニー刺激因子、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、エリスロポエチン、Ｇｃ−ＭＡＦ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ＩＬ １０ファミリー、ＩＬ １７ファミリー、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、インターフェロン、インターフェロンβ １ａ、インターフェロンβ １ｂ、インターフェロンγ、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン１ファミリー、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターロイキン１２サブユニットβ、インターロイキン１３、インターロイキン１６、インターロイキン２、インターロイキン２３、インターロイキン２３サブユニットα、インターロイキン３４、インターロイキン３５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン−３６、白血病抑制因子、白血球促進因子、リンホカイン、リンホトキシン、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性タンパク質、マクロファージ活性化因子、モノカイン、ミオカイン、ミオネクチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ、オプレルベキン、血小板第４因子、炎症誘発性サイトカイン、プロメガポエチン、ＲＡＮＫＬ、ストロマ細胞由来因子１、タリモジーンラハーパレプベック（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子類、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、アンギオポエチン、塩基性線維芽細胞成長因子、ベータセルリン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＣＣＮ細胞間シグナル伝達タンパク質、ＣＴＧＦ、ダルベポエチンα、エンドグリン、上皮成長因子、エポエチンα、エポエチンβ、エリスロポエチン、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１５／１９、線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子２３、フィルグラスチム、グリア成熟因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長分化因子−９、ヘバープロットＰ（ｈｅｂｅｒｐｒｏｔ−Ｐ）、造血成長因子、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２、ケラチノサイト成長因子、ミオスタチン、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコモジュリン、骨新生促進剤（ｏｓｔｅｏｐｒｏｍｏｔｉｖｅ）、パリフェルミン、ＰＤＧＦＢ、胎盤成長因子、血小板アルファ顆粒、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子受容体、増殖指数、トロンボポエチン、形質転換成長因子、血管内皮増殖因子が挙げられる。
一部の実施形態において、標的は小分子、例えば、化学物質、アミノ酸、原子、元素、有機酸、＜２０００Ｄａ、＜１０００Ｄａ、＜５００Ｄａであり、限定はされないが、例えば、鉄、銅、カルシウム、カリウム、エタノール、メタノール、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
一部の実施形態において、標的は、脂質、脂質複合体、プロテオリピド複合体、又はコレステロールであり、限定はされないが、例えば、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬ、ＨＤＬ２Ｂ、トリグリセリド類、ＬＰ（ａ）、コレステロールが挙げられる。
一部の実施形態において、標的は哺乳類細胞であり、限定はされないが、例えば、ヒト細胞、循環細胞、免疫細胞、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、γ−δＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、クッパー細胞、樹状細胞、癌細胞、癌幹細胞、循環腫瘍細胞、以下に挙げる癌、即ち、限定はされないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、原発不明癌、骨転移癌、脳転移癌、肝転移癌、肺転移癌、カルチノイド、子宮頸癌、絨毛癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、妊娠性絨毛性腫瘍（ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、メラノーマ性皮膚癌、中皮腫、男性癌、奇胎妊娠、口腔・中咽頭癌、骨髄腫、鼻腔・副鼻腔癌、鼻咽腔癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、前立腺癌、希少癌、直腸癌、唾液腺癌、二次癌、皮膚癌（非メラノーマ性）、軟部組織肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、原発不明癌、子宮癌、腟癌、及び外陰癌のうちの１つからの癌細胞が挙げられる。
抗原発現、コンジュゲーション、負荷
特定の実施形態において、ポリペプチド抗原は外因性抗原発現ＥＨＣ内で発現する。ポリペプチド抗原は外因性抗原発現ＥＨＣの表面上に呈示されてもよく、又は外因性抗原発現ＥＨＣ内にあってもよい。
特定の実施形態において、ポリペプチド抗原は外因性抗原発現ＥＨＣとコンジュゲートされる。ポリペプチド抗原は、通常、外因性抗原発現ＥＨＣの表面にコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、当該技術分野において公知の方法及び本明細書に記載される方法によって化学的又は酵素的に実現し得る。非ポリペプチド抗原もまた外因性抗原発現ＥＨＣにコンジュゲートされ得る。一部の実施形態において、抗原は外因性抗原発現ＥＨＣにコンジュゲートされない。
特定の実施形態において、ポリペプチド抗原は外因性抗原発現ＥＨＣ中に負荷される。非ポリペプチド抗原もまた外因性抗原発現ＥＨＣ内に負荷され得る。一部の実施形態において、抗原は外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上に負荷されない。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、任意選択で組換え核酸から発現する抗原、ＥＨＣにコンジュゲートされる抗原、ＥＨＣ内又はその上に負荷される抗原、及びそれらの任意の組み合わせを含む。任意選択で、外因性抗原発現ＥＨＣは治療剤又は他のペイロードを含む。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、好適な単離細胞、例えば、ＥＨＣ、網赤血球、ＥＨＣ前駆体、血小板、又は血小板前駆体を、抗原ポリペプチドをコードする組換え核酸と接触させることによって作成される。一部の実施形態において、抗原ポリペプチドはＤＮＡによってコードされ、ＤＮＡが有核赤血球系前駆細胞又は有核血小板前駆細胞に接触する。一部の実施形態において、抗原ポリペプチドはＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡが血小板、有核ＥＨＣ、有核血小板前駆細胞、又は網赤血球に接触する。一部の実施形態において、抗原はポリペプチドであり、ポリペプチドが初代血小板、有核ＥＨＣ、有核血小板前駆細胞、網赤血球、又は赤血球に接触する。
抗原ポリペプチドは、電気穿孔、化学的又は重合的トランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊、又は他の方法によってＥＨＣに導入されたトランス遺伝子から発現し得る；電気穿孔、化学的又は重合的トランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊、又は他の方法によって細胞に導入されるｍＲＮＡから発現する抗原ポリペプチド；外部因子、例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、又は分泌経路エンハンサーの導入によって天然遺伝子座から過剰発現する抗原ポリペプチド；及び／又は産生細胞又は他の外部システムから合成されるか、抽出されるか、又は産生され、且つＥＨＣに導入される抗原ポリペプチド。
一部の実施形態において、抗原は完全長タンパク質である。一部の実施形態において、抗原は、約７アミノ酸より長い任意の長さの、完全長タンパク質内に含まれる１つ以上のポリペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２０アミノ酸超、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１００アミノ酸超であり得る。抗原を含むポリペプチドは、立体エピトープであってもよく、又は線状エピトープであってもよい１つ以上の免疫学的エピトープを含み得る。抗原は、１つ以上の異なるタンパク質由来の１つ以上のポリペプチドを含み得る。
目的の抗原は、限定はされないが、表Ｂ及び表Ｃに列挙されるものを含めた内因性細胞タンパク質との融合によって循環細胞で発現させることができる。自然の分化及び除核過程でＥＨＣは、例えばｃ−Ｋｉｔ（ＳＣＦ受容体）及びトランスフェリンなどの、赤血球新生には必要であるが成熟赤血球機能には不要の内因性タンパク質の多くをシェディングして捨てると考えられているため、内因性タンパク質との融合は必須であり得る。例えば、Ｋｅｅｒｔｈｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１１；Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２０１０を参照されたい。保持されるタンパク質には、ある種の膜タンパク質、例えばグリコホリンＡ、バンド３、及びアクアポリンなど；ある種の細胞質タンパク質、例えばヘモグロビンα、ヘモグロビンβ、及びアデノシンデアミナーゼなど；及び細胞骨格タンパク質が含まれる。
目的の抗原は、トランス遺伝子の直接発現、内因性細胞内タンパク質、例えばヘモグロビンとの融合、内因性細胞表面タンパク質、例えばバンド３、グリコホリンＡ、ケルの細胞内ドメインとの融合、又は赤血球系細胞骨格の構造成分との融合を含めた幾つもの方法によってＥＨＣの細胞内空間で発現させることができる。
目的の抗原は、膜貫通ドメイン又は他の膜結合ドメインを含有する場合にトランス遺伝子の直接発現、例えば、バンド３、グリコホリンＡ、又はケルなどの内因性赤血球膜タンパク質との融合、又は前記タンパク質の膜貫通ドメインとの融合；又は内因性赤血球ＧＰＩ結合型細胞表面タンパク質、例えば、アセチルコリンエステラーゼ、ＣＤ５５、ＣＤ５８又はＣＤ５９などのＧＰＩ−リンカーアクセプターペプチドとの融合を含めた幾つもの方法によってＥＨＣの細胞外表面上に発現させることができる（例えば、Ｋｏｏｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５を参照）。
目的の抗原は、限定はされないが、表Ｄ、表Ｄ１、及び表Ｅに列挙されるものを含めた様々な化学的及び酵素的手段によって培養ＥＨＣの表面にコンジュゲートすることができる。これらの方法には、例えば、第一級アミン基を還元チオール基に結合させるＮＨＳエステル−マレイミドヘテロ二官能性クロスリンカーなどの二官能性架橋剤による化学的コンジュゲーションが含まれる。これらの方法にはまた、例えば、アクセプター配列ＬＰＸＴＧ又はＬＰＸＴＡを含有するあるポリペプチドを、Ｎ末端ドナー配列ＧＧＧを含有するポリペプチドに結合させるソルターゼ酵素によって媒介されるトランスペプチダーゼ反応などの酵素的戦略も含まれる（例えば、Ｓｗｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３を参照）。これらの方法にはまた、例えば抗原上及び細胞上のクリックケミストリーハンドル（それぞれアジド及びアルキン）のソルターゼ媒介性コンジュゲーションと、続く抗原を細胞に化学的に結合する環化付加反応など、組み合わせの方法も含まれる（例えば、Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３を参照）。
必要であれば、ＥＨＣ上又はＥＨＣ内において触媒的結合形成ポリペプチドドメインを細胞内で、或いは細胞外で発現させることができる。多くの触媒的結合形成ポリペプチドが存在し、トランスペプチダーゼ、ソルターゼ、及びイソペプチダーゼ、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から分離されたタンパク質であるＳｐｙ０１２８に由来するものが挙げられる。
Ｓｐｙ０１２８の自己触媒的イソペプチド結合形成サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）を分割すると、互いに対して特異性を有する触媒活性を保持した２つの個別的なポリペプチドが生じることが実証されている。このシステムのポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称される。混合すると、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒはＳｐｙＴａｇ上のＡｓｐ１１７とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ上のＬｙｓ３１との間でイソペプチド結合形成を起こす（Ｚａｋｅｒｉ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｔｈ，ＪＡＣＳ ２０１０，１３２：４５２６）。この反応は細胞環境と適合性があり、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに高度に特異的である（Ｚａｋｅｒｉ，Ｂ．；Ｆｉｅｒｅｒ，Ｊ．Ｏ．；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．；Ｃｈｉｔｔｏｃｋ，Ｅ．Ｃ．；Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｌｉｎｅｋ，Ｕ．；Ｍｏｙ，Ｖ．Ｔ．；Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１２，１０９，Ｅ６９０−Ｅ６９７）。ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、エラスチン様タンパク質における翻訳後のトポロジー修飾を誘導することが示されている。例えば、ＳｐｙＴａｇをＮ末端に置き、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＣ末端に置くと、環状エラスチン様タンパク質の形成が誘導される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１３）。
構成要素ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは互換することができ、従って分子ＡがＳｐｙＴａｇに融合して且つ分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合するシステムは、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合して且つ分子ＢがＳｐｙＴａｇに融合するシステムと機能的に均等である。本明細書の目的上、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが使用されるとき、その相補的分子を代わりに置き換え得ることが理解されるべきである。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムなどの触媒的結合形成ポリペプチドを使用して、目的の外因性抗原をＥＨＣの表面に結合させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、ＥＨＣの細胞外表面上に発現し得る。ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、例えば、１型又は３型膜貫通タンパク質、例えばグリコホリンＡのＮ末端に融合するか、２型膜貫通タンパク質、例えばケルのＣ末端に融合するか、複数回膜貫通タンパク質、例えばバンド３の細胞外末端又は細胞外ループにインフレームで挿入するか、ＧＰＩ−アクセプターポリペプチド、例えばＣＤ５５又はＣＤ５９に融合するか、脂質鎖アンカー型ポリペプチドに融合するか、又は末梢膜タンパク質に融合することができる。ＳｐｙＴａｇ融合物をコードする核酸配列は、ＥＨＣ内で発現し得る。目的の外因性抗原はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現するのと同じＥＨＣで発現し、分泌され得る。或いは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列は、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳類、又は無細胞産生システムで外因的に産生されてもよい。ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると、目的の外因性抗原をＥＨＣの表面に結び付ける共有結合が形成される。
一実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドがＥＨＣにおいてＧａｔａ１プロモーターの制御下でグリコホリンＡのＮ末端に対する融合物として発現し得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合した目的の外因性抗原、例えば表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ及び表Ｊに列挙される外因性抗原が、同じＥＨＣにおいてＧａｔａ１プロモーターの制御下で発現し得る。両方の融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド間にイソペプチド結合が形成されて、ＥＨＣ表面と目的の外因性抗原との間に共有結合が形成される。
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドがＥＨＣにおいてＧａｔａ１プロモーター制御下でグリコホリンＡのＮ末端に対する融合物として発現し得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合した目的の外因性抗原、例えば表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ及び表Ｊに列挙される外因性抗原が、好適な哺乳類細胞発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞で発現し得る。ＥＨＣ上でＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドが発現したところで、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドを細胞と接触させ得る。好適な反応条件下では、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド間にイソペプチド結合が形成されて、ＥＨＣ表面と目的の外因性抗原との間に共有結合が形成される。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムなどの触媒的結合形成ポリペプチドを使用して、目的の外因性抗原をＥＨＣの細胞内空間にアンカリングすることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、トランス遺伝子の直接的な発現、内因性細胞内タンパク質、例えばヘモグロビンとの融合、内因性細胞表面タンパク質、例えば、バンド３、グリコホリンＡ、ケルの細胞内ドメインとの融合、又は赤血球系細胞骨格の構造成分との融合を含めた幾つもの方法によってＥＨＣの細胞内空間で発現させることができる。ＳｐｙＴａｇ配列はポリペプチド末端に限定されず、ポリペプチド翻訳及び局在化が妨害されることのないように内因性ポリペプチドの内部配列内に組み込まれてもよい。目的の外因性抗原はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現するのと同じＥＨＣ内で発現することができる。ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると共有結合が形成され、これがＥＨＣの細胞内空間に目的の抗原をアンカリングする役割を果たす。
一実施形態では、ＥＨＣは、細胞内でヘモグロビンβに融合したＳｐｙＴａｇを発現し得る。ＥＨＣは、翻訳時に細胞内βグロビンがそのＣ末端でＳｐｙＴａｇに融合するように、ヘモグロビンプロモーター、βグロビン遺伝子及びＳｐｙＴａｇ配列を含む遺伝子配列で遺伝子修飾され得る。加えて、ＥＨＣは、翻訳時に細胞内フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）がそのＮ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合するように、ＰＡＨ発現を駆動するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをコードするＧａｔａ１プロモーター誘導遺伝子を発現する。両方の融合タンパク質の発現により、ＳｐｙＴａｇ結合βグロビンが細胞内空間でイソペプチド結合を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合ＰＡＨに連結され、βグロビンに対するＰＡＨのアンカリング及び成熟中の保持が可能となる。
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドがＥＨＣ内で目的の外因性抗原に対する融合物として発現し得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが、同じＥＨＣ内でグリコホリンＡのＣ末端（細胞内）に対する融合物として発現し得る。両方の融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド間にイソペプチド結合が形成されて、膜アンカー型内因性赤血球ポリペプチドと目的の外因性抗原との間に共有結合が形成される。
別の例では、目的の外因性抗原は、ＥＨＣ膜に導入された細孔から外因性抗原が拡散する浸透圧負荷又は低張−高張サイクル（例えば、Ｃｒｅｍｅｌ ａｎｄ Ｇｏｄｆｒｉｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０１３を参照）及び細菌毒素に由来するものなどの細胞透過性ペプチドとの融合（例えば、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ ２００９を参照）を含めた幾つもの方法によって、（発現させるのとは対照的に）培養ＥＨＣに物理的に負荷され得る。
目的の外因性抗原は、電気穿孔、化学的又は重合的トランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊、又は他の方法によってＥＨＣに導入されたトランス遺伝子から発現させ得る；電気穿孔、化学的又は重合的トランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊、又は他の方法によって細胞に導入されるｍＲＮＡから発現する外因性抗原；外部因子、例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、又は分泌経路エンハンサーの導入によって天然遺伝子座から過剰発現する外因性抗原；産生細胞又は他の外部システムから合成されるか、抽出されるか、又は産生され、且つＥＨＣに導入される外因性抗原。
本発明のＥＨＣには、任意選択で、材料を細胞の内部（例えば細胞質）に送達することができるように細胞膜に摂動を生じさせるため、細胞に対して制御された傷害を所定の時間だけ加えることにより、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、及び他の巨大分子などの材料（ペイロード）を負荷し得る。
好ましい実施形態において、ＥＨＣは網赤血球である。例えば、制御された細胞傷害によって、外因性抗原をコードするｍＲＮＡを網赤血球に負荷し得る。ｍＲＮＡは、必要に応じてネイキッドであっても、又は修飾されていてもよい。ｍＲＮＡ安定性を改善し及び／又は免疫原性を低下させるｍＲＮＡ修飾としては、例えば、ＡＲＣＡ：抗リバースキャップ類似体（ｍ２ ７．３’−ＯＧＰ３Ｇ）、ＧＰ３Ｇ（非メチル化キャップ類似体）、ｍ７ＧＰ３Ｇ（モノメチル化キャップ類似体）、ｍ３ ２．２．７ＧＰ３Ｇ（トリメチル化キャップ類似体）、ｍ５ＣＴＰ（５’−メチルシチジン三リン酸）、ｍ６ＡＴＰ（Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸）、ｓ２ＵＴＰ（２−チオウリジン三リン酸）、及びΨ（プソイドウリジン三リン酸）が挙げられる。
別の実施形態において、ＥＨＣは赤血球である。例えば、制御された細胞傷害によって赤血球に外因性抗原を負荷し得る。細胞傷害は、例えば、機械的歪み又はせん断力によって生じる圧力によるか、細胞を変形、狭窄、急激な延伸、急激な圧縮、又は高せん断速度のパルスに供することによって生じさせ得る。制御された細胞傷害により、材料（ペイロード）が周囲の細胞培地から細胞の細胞質に取り込まれる。
制御された細胞変形（例えば、細胞が狭窄部を通過することに伴う細胞の機械的変形）に基づく制御された細胞傷害を使用すると、材料（ペイロード）は、エンドサイトーシスよりむしろ、拡散によって取り込まれる。材料（ペイロード）は、制御された傷害に伴い細胞に取り込まれた後にはエンドソームよりむしろ細胞質に存在し、従って細胞にとってその材料が容易に利用可能になる。例えば制御された変形による制御された細胞傷害は、細胞の生存率を維持する（例えば、５０％超、７０％、又は９０％超）。特定の実施形態において、例えば制御された変形による制御された細胞傷害は、細胞分化及び活性の状態を維持する。必要であれば、処理の組み合わせ、例えば、変形による制御された傷害と、それに続く又はそれに先行する例えば電気穿孔又は別の細胞膜透過性増加方法が用いられる。任意選択で、界面活性剤が用いられてもよい。
機械的変形方法は、他の膜透過性増加方法を十分に耐容しない細胞、例えば、かかる方法の実施後に生存率の低下又は異なる分化状態を示す細胞に特に好適である。機械的変形方法はまた、他の膜透過性増加方法を十分に耐容しない材料（ペイロード）にも好適である。それに代えて又は加えて、ペイロードは、例えば、ペイロードの例えば電荷、疎水性、又はサイズが原因で、代替的方法を用いると細胞に十分に導入されないこともある。
変形による制御された傷害の１つの例示的な方法及びかかる方法に好適な装置が、例えば、国際公開第２０１３０５９３４３号パンフレット「ＩＮＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＥＬＩＶＥＲＹ」（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
具体的な実施形態において、制御された変形による制御された細胞傷害に供された網赤血球の集団が提供される。細胞は、例えば、個々の網赤血球より小さい直径を有するマイクロチャネルに通過させることにより圧縮して変形させ、それにより細胞膜に摂動を生じさせて膜を多孔質にし得る。細胞は、加えられる圧力によってチャネル又は導管を通じて進み、例えば押し通される。ペイロード、例えば外因性ポリペプチド又はオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を含む送達媒体中で圧縮及び変形が起こる。例えば、送達媒体は、表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ及び表Ｊに列挙される外因性抗原又はそのコードｍＲＮＡを含み得る。変形すると、網赤血球は外因性材料を取り込み、保持する。狭窄、延伸、及び／又は高せん断速度のパルスで細胞に制御された傷害を与えた後、任意選択で、材料（ペイロード）を含有する送達媒体中において細胞をインキュベートする。細胞を送達媒体中に数分間維持し、狭窄部を通過して生じた傷害を回復させ、例えば閉鎖し得る。これは室温で行い得る。
本明細書で使用されるとき、制御された細胞傷害には、ｉ）ウイルス媒介性トランスフェクション（例えば、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、又はシンドビスウイルス）、ｉｉ）化学的に媒介されるトランスフェクション、例えば、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、ポリマー、及びナノ粒子、例えば、シクロデキストリン、リポソーム、カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリブレン、リン酸カルシウム、リポフェクチン、ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン、ＣＴＡＢ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ；及びｉｉｉ）マイクロニードル、ナノニードル、フェムトシリンジ、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）ティップ、遺伝子銃（例えば、金ナノ粒子）、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、光トランスフェクション（多光子レーザー）、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、及びマグネトフェクションによって例示されるとおりの、物理的に媒介されるトランスフェクション、例えば直接注入、微粒子銃粒子送達、電気穿孔、レーザー照射、ソノポレーション、磁気ナノ粒子、及び制御された変形（例えば、細胞の締め付け）、並びに当該技術分野において公知の他の好適な方法が含まれる。任意の好適な方法を使用して、１つ以上の所望のＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又は抗原を含むポリペプチドを含む本明細書に記載されるＥＨＣを得ることができる。
目的の外因性抗原は本発明のＥＨＣ上に検出することができる。外因性抗原の存在は、標準的な分子生物学的方法、例えば、ウエスタンブロッティング又はＦＡＣＳ分析を用いて確認し、定量化することができる。細胞内環境に存在する外因性抗原は、細胞溶解時に又は蛍光検出を用いて定量化し得る。
製造
一部の実施形態において、ＥＨＣは、前駆体造血細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、赤血球、血小板、巨核球、又は好中球を供給源として使用して作成される。一部の実施形態において、前駆体造血細胞はＧＭＰに準拠した方法によってヒトドナーから単離される。一部の実施形態において、出発細胞は自己ドナーから供給される。一部の実施形態において、出発細胞は同種ドナーから供給される。ドナーは血液細胞抗原多型についてタイピングされてもよく、及び／又はドナーは血液細胞抗原について遺伝子型が同定される。ドナーは万能血液ドナーであってもよい。一部の実施形態において、ドナーはボンベイ表現型を有し、即ちＨ抗原を発現しない。一部の実施形態において、ドナーはＡＢＯ血液型Ｏを有し、且つＲｈ陰性である。
一部の実施形態において、ＥＨＣは、出発物質の供給源としてＣＤ３４＋造血前駆細胞、動員末梢ＣＤ３４＋細胞、又は骨髄由来ＣＤ３４＋細胞を使用して作成される。一部の実施形態において、出発細胞は臍帯血に由来するか、人工多能性幹細胞であるか、又は胚性幹細胞である。
外因性抗原発現ＥＨＣは培養されてもよい。培養ＥＨＣは卓上スケールからバイオリアクタースケールにスケールアップすることができる。例えば、ＥＨＣは、それが飽和密度、例えば１ｍｌ当たり１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、又は１×１０７個超のＥＨＣに達するまで培養される。任意選択で、飽和密度に達した後、ＥＨＣを大容積の新鮮培地に移してもよい。外因性抗原発現ＥＨＣはバイオリアクター、例えばＷａｖｅ型バイオリアクター、撹拌槽型バイオリアクターで培養し得る。様々な構成のバイオリアクターが当該技術分野において公知であり、必要に応じて好適な構成を選択し得る。外因性抗原発現ＥＨＣの集団の培養及び／又は拡大に好適な構成は、当業者であれば過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。バイオリアクターには酸素を送り込むことができる。バイオリアクターは、任意選択で、１つ以上のインペラ、再循環流、培地注入流、並びに培地及び栄養素の流入を調節するか、又は培地、栄養素、及び廃棄物の流出を調節する制御構成要素を含み得る。
一部の実施形態において、バイオリアクターは、培養プロセスの間にその細胞内ＤＮＡをシェディングする外因性抗原を含むヒトＥＨＣの集団を含み得る。例えば、バイオリアクターは、培養後にヒトＥＨＣ、除核ＥＨＣ、及びピレノサイト（ｐｙｒｅｎｏｃｙｔｅ）の集団を含み得る。具体的な実施形態において、ヒトＥＨＣ及び除核ＥＨＣは外因性抗原を含み、外因性抗原は除核ＥＨＣによって保持されるが、一方、外因性抗原をコードする組換え核酸は除核細胞によっては保持されない。特定の実施形態において、外因性抗原を含む除核ＥＨＣは、対応する単離非修飾非培養ＥＨＣと実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。
一実施形態において、バイオリアクターでＥＨＣ又はＥＨＣ前駆体から作成される外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、１４日間以上で２０，０００倍超の総拡大を起こす。一部の実施形態において、外因性抗原は、培養された又は新鮮に単離されたＥＨＣ前駆体に導入され、及び外因性抗原をコードする組換え核酸の導入後、バイオリアクターでＥＨＣ前駆体から作成される外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、バイオリアクターで前駆細胞から２０，０００倍超拡大する。
一部の実施形態において、バイオリアクターはＷａｖｅバイオリアクター又はインペラ駆動撹拌機である。バイオリアクターはスパージャを用いて曝気され得る。一実施形態において、バイオリアクターは使い捨てである。一実施形態において、バイオリアクターはＣＩＰ（定置洗浄）である。本明細書に記載するとおりのバイオリアクター設定で得られ得る外因性抗原発現ＥＨＣの最終的な数は、１０９個超、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個又は１０１３個超のＥＨＣであり得る。培養中、血球計のカウント又は６００ｎｍの光学濃度の読取りによって細胞密度を計測することにより、外因性抗原発現ＥＨＣの密度をモニタし得る。任意選択で、培養プロセスは、ｐＨレベル、酸素化、撹拌速度、及び／又は再循環速度に関してモニタされる。
方法及び特性
外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティはインビトロアッセイによって評価することができる。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、集団中のＥＨＣの数を、例えば顕微鏡法によるか、フローサイトメトリーによるか、又は血球計算によって計数して評価する。それに代えて又は加えて、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えばフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、質量分析法、又は吸光度分光法によってＥＨＣのタンパク質含量を分析して評価する。一実施形態において、アッセイするタンパク質含量は、非表面タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質、ヘモグロビン、成人ヘモグロビン、胎児ヘモグロビン、胚ヘモグロビン、細胞骨格タンパク質である。一実施形態において、アッセイするタンパク質含量は、表面タンパク質、例えば、分化マーカー、受容体、共受容体、輸送体、糖タンパク質である。一実施形態において、表面タンパク質は、限定はされないが、グリコホリンＡ、ＣＫＩＴ、トランスフェリン受容体、バンド３、ケル、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＲ１を含むリストから選択される。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えばフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、質量分析法、又は吸光度分光法によってＥＨＣの外因性抗原含量を分析して評価する。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えばＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー、又はノーザンブロットによってＥＨＣのｍＲＮＡ含量で評価することができる。外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えば核染色又は核酸プローブを使用した、例えばフローサイトメトリー、顕微鏡法、又はサザンブロットによって核物質含量で評価することができる。それに代えて又は加えて、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えばフローサイトメトリー、液体クロマトグラフィーによるか、又は質量分析法によってＥＨＣの脂質含量で評価する。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えば質量分析法、化学発光、蛍光分光法、吸光度分光法によってＥＨＣの代謝活性で評価する。代謝活性はＡＴＰ消費速度によって評価することができ、及び／又は代謝活性は、外因性抗原発現ＥＨＣ中の２，３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）レベルを計測して評価する。代謝活性は、以下に挙げるもの、即ち、限定はされないが、アセチルサリチル酸、Ｎ−アセチルシステイン、４−アミノフェノール、アザチオプリン、ブノロール、カプトプリル、クロルプロマジン、ダプソーン、ダウノルビシン、デヒドロエピアンドロステロン、ジダノシン、ドーパミン、エピネフリン、エスモロール、エストラジオール、エストロン、エトポシド、ハロペリドール、ヘロイン、インスリン、イソプロテレノール、硝酸イソソルビド、ＬＹ ２１７８９６、６−メルカプトプリン、ミソニダゾール、ニトログリセリン、ノルエピネフリン、パラアミノ安息香酸のうちの１つの代謝速度として評価することができる。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣのアイデンティティは、例えば質量分析法、化学発光、蛍光分光法、又は吸光度分光法によって、基質をＥＨＣで分配して評価する。基質は、以下に挙げるもの、即ち、限定はされないが、アセタゾラミド、アルブチン、ブメタミド（Ｂｕｍｅｔａｍｉｄｅ）、クレアチニン、ダルスチン（Ｄａｒｓｔｉｎｅ）、デスエチルドルゾラミド、ジゴキシゲニンジギトキソシド、ジゴキシン−１６’−グルクロニド、エピネフリン、ゲンタマイシン、馬尿酸、メトホルミン、ノルエピネフリン、ｐ−アミノ馬尿酸、パパベリン、ペニシリンＧ、フェノールレッド、セロトニン、スルホサリチル酸、タクロリムス、テトラサイクリン、ツカレソール、及びバンコマイシンのうちの１つであり得る。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は前駆体細胞から分化させる。この実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の分化状態はインビトロアッセイによって評価される。インビトロアッセイには、限定はされないが、拡大速度、数、タンパク質含量又は発現レベル、ｍＲＮＡ含量又は発現レベル、脂質含量、基質の分配、触媒活性、又は代謝活性を含めた、ＥＨＣのアイデンティティの評価に関して本明細書に記載されるものが含まれる。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは培養され、培養プロセスの過程にわたって複数の時点でＥＨＣの分化状態が評価される。
外因性抗原発現ＥＨＣは、出発物質の供給源として網赤血球を使用して作成し得る。顕微鏡法を用いて単離網赤血球の純度を評価してもよく、ここで網赤血球は、ニューメチレンブルー又はブリリアントクレシルブルーなどの特定の染色によって顕微鏡下で可視化されるリボソームＲＮＡの網状（メッシュ様）ネットワークによって特徴付けられる。トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の表面発現もまた網赤血球上で高く、赤血球に成熟するに従い減少するため、抗ＣＤ７１抗体を使用した網赤血球集団の濃縮及び分析が可能である（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ７１マイクロビーズ、製品添付文書番号１３０−０４６−２０１を参照）。或いは、クレアチン及びヘモグロビンＡ１Ｃ含量及びピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素活性の分析を用いて、成熟赤血球に対する単離網赤血球の特性を評価してもよい（例えば、Ｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７６：２３９７−２４０３（１９９０）を参照）。例えば、成熟赤血球と比べて網赤血球ではポルホビリノーゲンデアミナーゼの活性が約９倍高く、一方、ヘモグロビンＡ１Ｃ含量は約１０分の１である。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの作成に好適な細胞は、１つ以上の幹細胞からエキソビボ及び／又はインビボで分化させるものである。一実施形態において、１つ以上の幹細胞は１つ以上の造血幹細胞である。培養造血幹細胞がエキソビボで網赤血球及び赤血球に分化したことは、例えば、顕微鏡法、血液学、フローサイトメトリー、変形能計測、酵素活性、及びヘモグロビン分析及び機能特性を含め、様々なアッセイを実施して確認し得る（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９−７４（２００５））。培養造血幹細胞の表現型は、例えばクレシルブリリアントブルーで染色した細胞の顕微鏡法を用いて評価し得る。例えば、網赤血球はこれらの染色条件下でリボソームＲＮＡの網状ネットワークを呈するが、一方、赤血球には染色がない。除核細胞もまた、例えばＸＥ２１００オートマット（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、平均赤血球容積（ＭＣＶ；フェムトリットル（ｆＬ））、平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ；％）及び平均赤血球血色素量（ＭＣＨ；ｐｇ／細胞）を含めた標準的な血液学的変数に関してモニタし得る。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、それらの基本的な物理的特性、例えば、サイズ、質量、容積、直径、浮力、密度、及び膜特性、例えば、粘度、変形能の変動、及び流動性に関して評価される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの直径は、顕微鏡法によるか、又は自動計測手段、例えば血液分析機器によって計測される。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの直径は約１〜２０ミクロンである。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの直径は少なくとも１つの寸法において約１〜２０ミクロンである。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの直径は約１ミクロン未満である。一実施形態において、１つの寸法におけるＥＨＣの直径は約２０ミクロン超である。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの直径は、約１ミクロン〜約２０ミクロン、約２ミクロン〜約２０ミクロン、約３ミクロン〜約２０ミクロン、約４ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約２０ミクロン、約６ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約１５ミクロン、又は約１０ミクロン〜約３０ミクロンである。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの平均赤血球容積は血液分析機器を使用して計測される。一実施形態において、ＥＨＣの平均赤血球容積の容積は１０ｆＬ超、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、又は１５０ｆＬ超である。一実施形態において、ＥＨＣの平均赤血球容積は３０ｆＬ未満、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ、又は２００ｆＬ未満である。一実施形態において、ＥＨＣの平均赤血球容積は８０〜１００フェムトリットル（ｆＬ）である。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの平均浮遊質量（ｐｇ／細胞）は、懸濁マイクロチャネル共振器又は二重懸濁マイクロチャネル共振器を使用して計測される（例えば、Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２０１３ １１０（１９）：７５８０及びＢｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１４ １４（３）：５６９を参照）。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの乾燥密度はＨ２Ｏ−Ｄ２Ｏ交換アッセイで浮遊質量によって計測される（例えば、Ｆｅｉｊｏ Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８（７）：ｅ６７５９０を参照）。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、空間光干渉顕微鏡法（ＳＬＩＭ）によって計測するとき、１０ｍｒａｄ超、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍｒａｄ又は１００ｍｒａｄ超の標準偏差の平均膜変形能変動を有する（例えば、Ｂｈａｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：６２１１を参照）。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の平均膜粘度は、粘度依存性量子収量フルオロフォアと共にインキュベートしたときの平均蛍光の検出によって計測される（例えば、Ｈａｉｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ ２００１ ８（２）：１２３を参照）。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの膜流動性は、例えば、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダーを用いた蛍光偏光によって計測される。
例えば、変形能を計測するには、培養１５日目に網赤血球を例えば白血球除去フィルタ（例えばＬｅｕｃｏｌａｂ ＬＣＧ２、Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）に通過させて有核細胞と分離し、続いてエクタサイトメトリーを使用してアッセイし得る。除核細胞を４％ポリビニルピロリドン溶液に懸濁し、次に６０から４５０ｍｏｓＭへの漸増浸透圧勾配に曝露する。細胞のレーザー回折パターン（変形能指数）の変化が容量オスモル濃度の関数として記録され、それにより細胞膜の動的変形能を評価する。生理学的に有意味な容量オスモル濃度で達成された最大変形能指数が、赤血球の平均表面積と関係付けられる。
一部の実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣがヘモグロビン含量に関して分析される。ヘモグロビンのアッセイを用いて分化細胞の表現型を評価し得る（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９−７４（２００５））。例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｖａｒｉａｎｔ ＩＩ Ｈｂアナライザー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて種々のヘモグロビン画分の割合を評価し得る。酸素平衡は、二波長分光光度計（例えば、Ｈｅｍｏｘアナライザー、ＴＣＳ）による連続的な方法を用いて計測し得る。ヘモグロビンの結合特性は、閃光光分解を用いて評価し得る。この方法では、５３２ｎｍの１０ナノ秒パルスによる光分解後、ＣＯと細胞内ヘモグロビン四量体の再結合が４３６ｎｍで分析される。
本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣは、必要であれば製造後に精製することができる。多くの好適な精製方法が当該技術分野において公知である。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣは、遠心、磁気泳動、照射、音響泳動、及び化学的又は物理的除核によって精製される。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、例えば間質細胞共培養によるエキソビボ成熟によって精製される。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＥＨＣの化学処理又は酵素処理、例えば脱グリコシル化酵素で処理することによって精製される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、外因性抗原発現ＥＨＣの任意の残存する複製能を無能化することにより精製される。一実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣが放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線、β粒子、α粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝され、残存する複製コンピテントの核酸に損傷が与えられる。
電離放射線は、Ｘ線、ガンマ線、β粒子（高速電子）、α粒子（ヘリウム原子の核）、中性子、陽子、及び他の重イオン、例えば、アルゴン、窒素、炭素、及び他の元素の核によって伝達されるエネルギーである。Ｘ線及びガンマ線は光と同様に電磁波であるが、そのエネルギーは光と比べてはるかに高い（その波長がはるかに短い）。紫外（ＵＶ）光は、細胞に損傷を与えることのできる中間エネルギーの放射線であるが、紫外光は原子又は分子に電離（電子の喪失）を生じさせるのでなく、むしろ励起（電子のエネルギーレベルの変化）を生じさせる点で上述の電磁放射線の形態とは異なる。他の形態の放射線−粒子−は、負電荷であるか（電子）、正電荷であるか（陽子、α線、及び他の重イオン）、又は電気的に中性である（中性子）かのいずれかである。
放射線誘発性の電離は、細胞成分分子に直接作用するか、又は水分子に間接的に作用して、水由来のラジカルを生じさせる。ラジカルは極めて短時間で隣接分子と反応し、影響を受けた分子に化学結合の切断又は酸化（酸素原子の付加）をもたらす。細胞における主な効果は、ＤＮＡ切断である。ＤＮＡは一対の相補的な二本鎖からなるため、単一の鎖或いは両鎖の切断が起こり得る。しかしながら、両鎖の切断は生物学的に一層重要であると考えられる。ほとんどの一本鎖切断は、通常はＤＮＡ分子の二本鎖の性質のために修復され得る（それらの２本の鎖が互いを補完し合い、そのためインタクトな鎖がその損傷を受けた逆鎖を修復するための鋳型として機能し得る）。しかしながら二本鎖切断の場合、修復はより困難であり、切断された末端の誤った再結合が起こり得る。こうしたいわゆる修復誤りは、突然変異、染色体異常、又は細胞死が誘導される原因となる。
ＤＮＡセグメントの欠失は、照射を生き残った細胞における放射線損傷の主要な形態である。これは、（１）２つの外側端の結合及び切断間の断片の喪失を伴うＤＮＡ分子における２つの別個の二本鎖切断の修復誤り、又は（２）１つの二本鎖切断を修復する再結合前の切断端のクリーニングプロセス（ヌクレオチド（ＤＮＡの構成要素分子）の酵素消化）によって引き起こされ得る。
放射線はその構成物（電子、陽子、中性子等）が異なるのみならず、そのエネルギーもまた異なる。飛跡に沿って高密度電離を発生させる放射線（中性子など）は高線エネルギー付与（高ＬＥＴ）放射線と称され、これは、飛跡の単位長さ当たりに放出される平均エネルギーを記述する物理的パラメータである（添付の図を参照）。低ＬＥＴ放射線は、その飛跡に沿ってあくまでも粗い密度で、ひいては細胞内で略均一に電離を発生させる。放射線量は、生物学的材料の単位当たりのエネルギーの量（例えば、１細胞当たりの電離の数）である。従って、高ＬＥＴ放射線は低ＬＥＴ放射線−Ｘ線及びガンマ線など−と比べて生物学的材料を破壊する能力が高く、なぜなら同じ線量では、低ＬＥＴ放射線は細胞内で同数のラジカルをより粗い密度で生じさせる一方、高ＬＥＴ放射線−中性子及びα粒子など−は、そのエネルギーのほとんどを細胞の小さい領域に付与するためである。高ＬＥＴ放射線からの高密度電離によって生じる限局的なＤＮＡ損傷は、低ＬＥＴ放射線からの粗い密度の電離によって生じる拡散したＤＮＡ損傷と比べて修復が困難である。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、１ｋＧｙ超、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｋＧｙ、又は１００ｋＧｙ超の照射線量を使用するγ線照射に供される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、０．１ｍＳｖ超、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００ｍＳｖ、又は１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用するＸ線照射に供される。
外因性抗原発現ＥＨＣの集団の純度は、集団の均一性を計測することによって評価し得る。一実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣの平均分布幅が血液分析機器で計測される。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、１０超、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、又は１０６超の網赤血球対非網赤血球比を有する。外因性抗原発現ＥＨＣの集団の均一性は、集団の間質細胞含量を計測することによって評価し得る。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は１ｐｐｂ未満の間質細胞を有する。それに代えて又は加えて、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の均一性は、集団のウイルス価及び／又は細菌コロニー形成能を計測することによって評価される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の均一性はインビトロアッセイによって評価される。インビトロアッセイには、限定はされないが、拡大速度、数、タンパク質含量又は発現レベル、ｍＲＮＡ含量又は発現レベル、脂質含量、基質の分配、触媒活性、又は代謝活性を含めた、ＥＨＣのアイデンティティの評価に関して本明細書に記載されるものが含まれる。
外因性抗原発現ＥＨＣの作成に使用される成熟赤血球は、様々な方法、例えば、細胞洗浄機、連続フローセルセパレーター、密度勾配分離法、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫磁気除去法（ＭＡＣＳ）、又はこれらの方法の組み合わせを用いて単離し得る（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１０８１−１０８２（１９８７）；Ｂａｒ−Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７７１９−１７７２３（１９８７）；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３２：１４７０−１４７６（２００７）を参照）。
赤血球は、単純な遠心によって全血から単離してもよい（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１０８１−１０８２（１９８７）を参照）。例えば、ＥＤＴＡ抗凝固処理全血を８００×ｇ、４℃で１０分間遠心してもよい。多血小板血漿及びバフィーコートを除去し、赤血球を等張食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）で３回洗浄する。
或いは、赤血球は、様々な分離媒体、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ、又はそれらの組み合わせなどによる密度勾配遠心法を用いて単離してもよい。例えば、所定容積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を等容積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９の上に層状に重ねる。そのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅの上に等容積の等張食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）中に１：１希釈したＥＤＴＡ抗凝固処理全血を層状に重ね、この試料を７００×ｇ、室温で３０分間遠心する。これらの条件下では、顆粒球が１０７７／１１１９界面に移動し、リンパ球、他の単核細胞及び血小板が血漿／１０７７界面に留まり、及び赤血球がペレット化される。赤血球を等張食塩水で２回洗浄する。
或いは、赤血球は、Ｐｅｒｃｏｌｌステップ勾配を用いて遠心により単離してもよい（例えば、Ｂａｒ−Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７７１９−１７７２３（１９８７）を参照）。例えば、７５ｍＭクエン酸ナトリウム及び３８ｍＭクエン酸を含有する抗凝固薬溶液を新鮮な血液と混合し、細胞をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で素早く洗浄する。α−セルロース及びＳｉｇｍａｃｅｌｌ（１：１）の混合物で吸着して白血球及び血小板を取り除く。Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターにおける２５００ｒｐｍで１０分間の４５／７５％Ｐｅｒｃｏｌｌステップ勾配での遠心によって、赤血球を網赤血球及び残留白血球からさらに単離する。赤血球はペレットとして回収され、一方、網赤血球バンドが４５／７５％界面にあり、及び残留白血球バンドが０／４５％界面にある。Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で数回洗浄することにより、赤血球からＰｅｒｃｏｌｌを取り除く。赤血球を単離するための密度勾配の作成に使用し得る他の材料としては、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）、水中６０％イオジキサノール溶液（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄから）が挙げられる。
赤血球は、例えばフローサイトメトリーを用いて網赤血球と分離してもよい（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｌ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３２：１４７０−１４７６（２００７）を参照）。この場合、全血を遠心して（５５０×ｇ、２０分、２５℃）、細胞を血漿と分離する。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水溶液に再懸濁し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（１．０７７密度）で例えば遠心によって（４００×ｇ、３０分、２５℃）さらに分画して赤血球を白血球と分離する。得られた細胞ペレットは、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩに再懸濁し、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）などのＦＡＣＳ機器でサイズ及び粒度に基づき選別する。
赤血球は、免疫磁気除去法によって単離してもよい（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ，ｅｌ ａｌ．，（２００７）Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３２：１４７０−１４７６を参照）。この場合、細胞型特異抗体を有する磁気ビーズを使用して非赤血球を除去する。例えば、本明細書に記載されるとおりの密度勾配を用いて赤血球を他の血液成分の大部分から単離し、続いて残留する任意の網赤血球を免疫磁気除去する。細胞はヒト抗体血清によって２５℃で２０分間前処理し、次に網赤血球特異的抗原に対する抗体、例えばＣＤ７１及びＣＤ３６で処理する。抗体は磁気ビーズに直接結合させてもよく、又は例えば抗ＰＥ抗体を有する磁気ビーズが反応し得るＰＥにコンジュゲートしてもよい。この抗体−磁気ビーズ複合体は、残留網赤血球を例えば赤血球集団から選択的に抽出することが可能である。
赤血球はまた、アフェレーシスを用いて単離してもよい。アフェレーシスのプロセスは、患者又はドナーから全血を取り出し、遠心又は細胞選別を用いて血液成分を分離し、分離された部分の１つ以上を抜き取り、残りの成分を患者又はドナーに輸血し戻すことを伴う。現在、例えばＢａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）のＡｍｉｃｕｓ及びＡｌｙｘ機器、Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）のＴｒｉｍａ Ａｃｃｅｌ機器、及びＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）のＭＣＳ＋９０００機器など、この目的のために幾つもの機器が使用されている。適切な細胞純度を達成するには、さらなる精製方法が必要となり得る。
一部の実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣは１つ以上の網赤血球からエキソビボ及び／又はインビボで分化させる。網赤血球は、外因性抗原発現ＥＨＣの作成に使用し得る。網赤血球は未成熟赤血球であり、人体における赤血球の約１％を占める。網赤血球は骨髄で発達して成熟する。循環中に放出されると、網赤血球は急速に最終分化を起こして成熟赤血球となる。成熟赤血球と同様に、網赤血球は細胞核を有しない。成熟赤血球とは異なり、網赤血球はタンパク質合成を行う能力を維持している。一部の実施形態では、外因性抗原をコードする組換え核酸（ｍＲＮＡなど）を網赤血球に導入して外因性抗原発現ＥＨＣを作成する。
網赤血球の成熟に伴う細胞密度の違いに基づき、種々の成熟度の網赤血球を末梢血から単離し得る。網赤血球は末梢血から、様々な密度勾配での分画遠心法を用いて単離し得る。例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いて網赤血球を単離し得る（例えば、Ｎｏｂｌｅ ｅｌ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７４：４７５−４８１（１９８９）を参照）。Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を１０ｍＭトリエタノールアミン、１１７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、及び１．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の終濃度となるように希釈して、密度１．０９６及び１．０５８ｇ／ｍｌの滅菌等張Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を作製する。これらの溶液は容量オスモル濃度が２９５〜３１０ｍＯｓｍである。例えば５ミリリットルの第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０９６）を滅菌１５ｍｌコニカル遠心管に加える。例えば２ミリリットルの第２のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０５８）を、より高密度の第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液の上に層状に重ねる。２〜４ミリリットルの全血をチューブの上部に層状に重ねる。このチューブを、スイングアウト型チューブホルダを備えた冷却遠心機において２５０×ｇで３０分間遠心する。網赤血球及び一部の白血球が２つのＰｅｒｃｏｌｌ層の間の界面に移動する。界面にある細胞を新しいチューブに移し、５ｍＭグルコース、０．０３ｍＭナトリウムアジド及び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。残留白血球をサイズ排除カラムでＰＢＳ中におけるクロマトグラフィーによって除去する。
或いは、網赤血球は、免疫磁気分離手法を用いたポジティブ選択によって単離してもよい（例えば、Ｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７６：２３９７−２４０３（１９９０）を参照）。この手法は、成熟前に赤血球と比べて網赤血球の表面上で発現する多数のトランスフェリン受容体を利用するものである。トランスフェリン受容体に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して、混合血液細胞集団から網赤血球を選択的に単離し得る。ヒトを含めた種々の哺乳類種のトランスフェリン受容体に対する抗体が、商業的供給元から入手可能である（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）。トランスフェリン抗体は磁気ビーズに直接結合し得る。或いは、トランスフェリン抗体は、二次抗体を介して磁気ビーズに間接的に結合してもよい。例えば、ヒトトランスフェリンに対するマウスモノクローナル抗体１０Ｄ２（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧでコーティングされた免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）と混合し得る。次に免疫磁気ビーズを白血球枯渇赤血球画分とインキュベートする。ビーズ及び赤血球は２２℃で穏やかに混合しながら６０〜９０分間インキュベートし、続いて網赤血球が結合しているビーズを磁場を用いて単離する。単離網赤血球は、例えばＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ（登録商標）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して磁気ビーズから取り外し得る。或いは、網赤血球は、本明細書に記載される方法を用いてＣＤ３４＋造血幹細胞のインビトロ成長及び成熟から単離してもよい。
最終分化した除核赤血球は、そのＤＮＡ含量に基づき他の細胞と分離することができる。非限定的な例において、初めに細胞をバイタルＤＮＡ染色色素、例えばヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で標識する。ヘキスト３３３４２は、二本鎖ＤＮＡに結合すると青色蛍光を発する細胞透過性核対比染色剤である。培養物中の未分化前駆細胞、マクロファージ又は他の有核細胞はヘキスト３３３４２によって染色されるが、一方、除核赤血球はヘキスト陰性である。ヘキスト陽性細胞は、蛍光活性化セルソーター又は他の細胞選別技法を用いて除核赤血球と分離することができる。ヘキスト色素は、透析又は他の好適な方法によって単離赤血球から除去することができる。
外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、ＥＨＣの集団の核物質含量を減少させることによって精製し得る。例えば、ＥＨＣの集団中の除核率を増加させ、及び／又は除核された外因性抗原発現ＥＨＣの数を増加させ又は濃縮する。
外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、小分子、例えばアクチン阻害薬、例えばサイトカラシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｊと共にインキュベートし、次に遠心によって核物質を取り除くことができる。それに代えて又は加えて、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、漸減するサイズ制限フィルタに通過させて機械的に操作することにより核物質を取り除くことができる。外因性抗原発現ＥＨＣの集団はまた、核物質の除去を増加させるため、フィブロネクチンでコーティングされたプラスチック表面上でインキュベートし得る。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、核物質の除去を増加させるため、間質細胞、例えばマクロファージとの共培養でインキュベートされる。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は９９．９％超が除核されている。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは支持細胞、例えば付着間質細胞層とは共培養されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、ＥＨＣを外因性抗原と接触させ且つＥＨＣを分化させて外因性抗原を含む除核細胞の集団を得ることにより作成される。外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、除核細胞を選択するための濃縮ステップ、例えば、重力分離、磁気又は蛍光選別、照射、有核細胞の中毒化などを用いずに得られる。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、本明細書に記載されるものなどの核物質の検出アッセイによって評価するとき、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は９９．９％超が核物質を欠く外因性抗原発現ＥＨＣで構成される。
一部の実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣによって呈示される外因性抗原ポリペプチドなどの外因性抗原の存在、生物学的活性及び／又は機能が評価される。多くの好適なアッセイが利用可能であり、当該技術分野において公知である。
一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの表面上のポリペプチドである。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、クームスロゼット形成（Ｃｏｏｍｂｓ ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの内部にあるポリペプチドである。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、ウエスタンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、サザンブロッティング、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。
一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの表面上の核酸である。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、相同蛍光プローブによるフローサイトメトリー、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＰＣＲを含むアッセイによって評価することができる。一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの内部にある核酸である。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＰＣＲを含むアッセイによって評価することができる。
一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの表面上の小分子である。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの内部にある小分子である。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、質量分析法、蛍光分光法を含むアッセイによって評価することができる。
一実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣの膜にある脂質である。この外因性抗原の存在は、限定はされないが、質量分析法、フローサイトメトリー、膜溶解度、蛍光偏光、空間光干渉顕微鏡法を含むアッセイによって評価することができる。
一実施形態において、外因性抗原は蛍光性であるか、又は蛍光分子に融合しているか、又は組換え核酸（例えばベクター中の）からＧＦＰなどの蛍光レポータータンパク質と共発現する。外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上にある外因性抗原の存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、蛍光分光法、吸光度分光法を含むアッセイによって評価することができる。
一実施形態において、外因性抗原はガス状分子である。外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上にある外因性抗原の存在は、限定はされないが、化学発光アッセイ、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。
外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上にある外因性抗原の存在は、個々のＥＨＣ上の外因性抗原の数を定量化する市販のサイトメトリーキャリブレーションビーズなどのキャリブレーションビーズを使用する定量的形式のフローサイトメトリーによって評価することができる。それに代えて又は加えて、外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上にある外因性抗原の存在は、外因性抗原と同じ検出試薬を使用して検出可能な既知の濃度の標準を使用する定量的形式のウエスタンブロットによって評価することができ、このようにして個々のＥＨＣ上の外因性抗原の数を定量化し得る。
一部の実施形態において、２つ以上の異なる外因性抗原の存在が、同じ又は異なる方法で、同時に、逐次的に、或いは並行して評価され得る。例えば、一実施形態において、表面上のある外因性抗原を、その外因性抗原に特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価することができ、及び表面上にない、蛍光性の別の外因性抗原を、フローサイトメトリーにおいて別のチャネルを使用する蛍光シグナルによって評価することができる。別の例では、表面上の外因性抗原をフローサイトメトリーによって評価することができ、表面上にない別の外因性抗原をウエスタンブロットによって評価することができる。
具体的な実施形態において、外因性抗原は、細胞供給源の最終分化後も外因性抗原発現ＥＨＣに保持されている。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣが培養ＥＨＣから作成され、細胞の最終分化後に外因性抗原の発現又は存在が、好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、サザンブロット、ノーザンブロット、又は吸光度分光法によって評価される。
具体的な実施形態において、外因性抗原は、外因性抗原発現ＥＨＣを対象に投与した後にインビボで循環した後にも外因性抗原発現ＥＨＣに保持されている。外因性抗原発現ＥＨＣは、マウスなどの実験動物又は動物モデルに例えば尾静脈から静脈内注射することができ、又はヒトに静脈内注射される。次に血液が採取され、外因性抗原発現ＥＨＣにおける外因性抗原の存在が好適なアッセイ、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、サザンブロット、ノーザンブロット、又は吸光度分光法によって評価される。
一部の実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣ内又はその上の外因性抗原の生物学的活性、ＥＨＣの全体的な生物学的活性、及びＥＨＣの集団の全体的な活性が、インビトロアッセイによって評価され得る。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの活性は、モデル細胞株を使用して速やかに繰り返される。例えば、好適な外因性抗原のライブラリをモデル細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｔ又はＫ５６２で発現させて、好適なアッセイにより活性を評価する；次に最良の外因性抗原候補、例えば好適なアッセイにおいて最も高いレベルで発現するもの又は最も高い活性を示すものを、例えば培養ＥＨＣで発現させて、外因性抗原発現ＥＨＣを作成する。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの活性は、培養マウスモデルを使用して速やかに繰り返される。例えば、好適な外因性抗原のライブラリを培養マウスＥＨＣで発現させて；好適なマウス疾患モデル又は活性を評価するのに好適なマウスモデルシステムで活性を評価し；次に、最良の外因性抗原候補、例えば好適なアッセイにおいて最も高いレベルで発現するもの又は最も高い活性を示すものを、例えば培養ＥＨＣで発現させて、外因性抗原発現ＥＨＣを作成する。
場合によっては、外因性抗原は酵素であり、外因性抗原の活性は、特定の基質分子の消失を検出するか、又は特定の産物分子の出現を検出する酵素アッセイによって評価することができる。かかるアッセイには、限定はされないが、比色アッセイ、質量分析法、ＨＰＬＣ、蛍光アッセイが含まれる。
例えば、ａ）外因性抗原はアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）であり、酵素アッセイではアデノシンからイノシンへの変換が検出される；ｂ）外因性抗原はフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）であり、アッセイではフェニルアラニンからチロシンへの変換が検出される；ｃ）外因性抗原はフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）であり、アッセイではフェニルアラニンからトランスケイ皮酸への変換が検出される；ｄ）外因性抗原はチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）であり、アッセイではチミジンからチミン及び２−デオキシ−リボースへの変換が検出される；ｅ）外因性抗原はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）であり、アッセイではイノシンからヒポキサンチンへの変換、アデノシンからアデニンへの変換、及びグアノシンからグアニンへの変換が検出される；ｆ）外因性抗原はホモゲンチジン酸１，２−ジオキシゲナーゼ（ＨＤＧ）であり、アッセイではホモゲンチジン酸からマレイルアセト酢酸への変換が検出される；ｇ）外因性抗原はシスタチオニンβシンターゼであり、アッセイではセリン及びホモシステインからシスタチオニンへの変換が検出される；ｈ）外因性抗原はシュウ酸オキシダーゼであり、アッセイではシュウ酸塩の酸化が検出される。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの活性は、疾患、例えば代謝疾患又は酵素欠損症の動物モデル、例えばマウスモデル、及び免疫不全マウス、又はＮＳＧマウス、又は外因性抗原発現ＥＨＣの効果を実証し得るもの、例えば基質が注入され且つ外因性抗原媒介性変換産物が計測されるマウスで評価される。
一実施形態において、外因性抗原は、補体受容体１（ＣＲ１）ポリペプチド、その誘導体又は機能断片である。ＣＲ１外因性抗原の活性は、例えば、ＣＲ１外因性抗原による免疫複合体の特異的捕捉、マクロファージへの免疫複合体の効率的なトランスファー、又はマウスからの免疫複合体のインビボクリアランスを含め、幾つかの方法で評価することができる。
ＣＲ１外因性抗原を過剰発現するＥＨＣの機能性は、以下の１つ以上のプロセスによって評価し得る：ＣＲ１外因性抗原を含むＥＨＣ表面上への免疫複合体の捕捉、ＣＲ１外因性抗原を含むＥＨＣは保持しておく一方でのマクロファージに対する免疫複合体の放出、及びＣＲ１外因性抗原を含むＥＨＣの適切な循環。これらの３つのパラメータはインビトロで評価することができる。免疫複合体捕捉アッセイは、当該技術分野において、例えばＯｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００及びＳｃｈｉｆｆｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１に記載されている。例えば、天然ＣＲ１又はＣＲ１外因性抗原ポリペプチド又はその断片を発現するＥＨＣと共に標識免疫複合体をインキュベートし、ＥＨＣによって捕捉される免疫複合体の数をフローサイトメトリーによってアッセイする。マクロファージトランスファーアッセイは、当該技術分野において、例えば、Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８に記載されている。例えば、天然ＣＲ１又はＣＲ１外因性抗原ポリペプチド又はその断片を発現する赤血球に負荷された標識免疫複合体をマクロファージと共にインキュベートする。赤血球表面からマクロファージへの免疫複合体のトランスファー、及びマクロファージによる赤血球の消費又は回避をフローサイトメトリーによって計測することができる。適切な循環は、ＥＨＣの形態及び変形能を分析することによって予測し得る。天然ＣＲ１又はＣＲ１外因性抗原ポリペプチド又はその断片を発現するＥＨＣの形態は、例えばＧｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１及びＲｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５によって記載されるとおり、標準的な顕微鏡技法を用いて目測で評価することができる。天然ＣＲ１又はＣＲ１外因性抗原ポリペプチド又はその断片を発現するＥＨＣの変形能は、例えばＧｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１に記載されるとおり、レーザー支援旋光細胞分析（ｌａｓｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＬＯＲＣＡ）としても知られるエクタサイトメトリーによって評価することができる。
例えば、外因性ＣＲ１抗原発現ＥＨＣ（このＥＨＣはＣＲ１ポリペプチド外因性抗原を含む）が免疫複合体、例えばインビトロで作成された免疫複合体又は患者に由来する免疫複合体と共にインキュベートされる。ＣＲ１外因性抗原による免疫複合体の捕捉が、例えば、免疫複合体中の蛍光マーカーを使用するフローサイトメトリーによるか又は免疫複合体のエレメントに対する二次検出剤を使用するフローサイトメトリーによって評価される。
一実施形態では、初めに外因性ＣＲ１抗原発現ＥＨＣが免疫複合体と共にインキュベートされ、次にマクロファージ、例えば、初代マクロファージ、初代単球、培養マクロファージ、培養単球、Ｕ９３７細胞、ＰＭＡ活性化Ｕ９３７細胞、ＡＡ９細胞、ＲＡＷ ２６４．７細胞、Ｊ７７４細胞、ＴＨＰ１細胞、ＫＧ−１細胞、ＮＲ８３８３細胞、ＭＶ−４−１１細胞、３Ｄ４／３１細胞、ＭＤ細胞、Ｆｃｗｆ−４細胞、ＤＨ８２細胞と共にインキュベートされる。外因性ＣＲ１抗原発現ＥＨＣによってトランスファーされた免疫複合体の存在に関して、マクロファージが例えばフローサイトメトリー又はＸ線撮影によって評価される。培養ＥＨＣからマクロファージへの捕捉免疫複合体のトランスファーは、当該技術分野の標準アッセイである。例えば：Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：２３０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７８（７）：３１２９を参照されたい。
一実施形態において、外因性ＣＲ１抗原発現ＥＨＣの活性は動物モデルで評価される。例えば、免疫不全マウス、又はＮＳＧマウスなどの好適なマウスモデルを使用し得る。マウス疾患モデルは、例えばループスなどの免疫複合体病であってもよい。マウスモデルには、ＮＺＢＷＦ１／Ｊ、ＭＲＬ／ＭｐＪ、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓ（ｌｐｒ）、Ｓｍｎ．Ｃ３−Ｆａｓｌ／Ｊ、ＮＺＭ２４１０／Ａｅｇ、１２９Ｓ４−Ｃｄ４８、Ｃｇ−Ｓｌｅ１、ＮＺＭ−Ｓｌｅ１ Ｓｌｅ２ Ｓｌｅ３／ＬｍｏＪ、及びＢＸＳＢ．１２９Ｐ２が含まれる。それに代えて又は加えて、例えば免疫複合体の注入により、マウスに疾患表現型が導入されてもよい。外因性ＣＲ１抗原発現ＥＨＣを任意の好適なマウス（又は他の動物モデル）に注入して、ＥＨＣの１つ以上の生物学的作用、例えば外因性ＣＲ１抗原発現ＥＨＣによる注入された免疫複合体のクリアランスを試験し得る。
一実施形態において、外因性抗原は補体調節分子であり、又は補体調節活性を有する。外因性抗原のこの活性は、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方で評価することができる。例えば、外因性抗原の活性は、インビトロ補体活性化アッセイ、例えば感作ヒツジ赤血球の補体媒介性溶解を計測するＣＨ５０アッセイ、又は非感作ウサギ赤血球の第二経路補体媒介性溶解を計測するＡＨ５０アッセイにおいて低下を計測することによって評価し得る。或いは、外因性抗原の活性は、限定はされないが、例えば、組換えＣ２からＣ２ａ及びＣ２ｂへの切断、Ｂ因子からＢａ因子及びＢｂ因子への切断、Ｃ３ｂ因子からｉＣ３ｂＨ及びｉＣ３ｂＬへの切断、Ｃ３ｂＢｂからＣ３ｂ及びＢｂへの切断、Ｃ４ｂＢｂからＣ４ｂ及びＢｂへの切断、又はＣ４ｂ因子からｉＣ４ｂＨ及びｉＣ４ｂＬへの切断を含めた、外因性抗原と共にインキュベートされた組換え補体成分の切断又は切断が存在しないこと（ネオエピトープに曝露されても又は曝露されなくてもよい）を検出して評価し得る。好適な組換え補体成分の切断又は切断が存在しないことは、限定はされないが、例えば、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、及びウエスタンブロッティングを含めた当該技術分野において公知のタンパク質分析方法によって評価することができる。外因性抗原活性に好適なインビボアッセイは、動物、例えばマウスへの外因性抗原発現ＥＨＣの注入、及び組織染色法による補体因子、例えば膜侵襲複合体の沈着の調査を含む。
一実施形態において、外因性抗原は標的を結合又は捕捉する能力を有し、外因性抗原の活性は、インビトロ又はインビボで外因性抗原に捕捉された標的を検出することによって評価し得る。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて外因性抗原による標的の捕捉が検出される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、オプソニン化外因性抗原発現ＥＨＣのマクロファージ消費アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、Ｂ細胞刺激アッセイ、マスト細胞脱顆粒アッセイ、感染性潜在能力アッセイを含めたインビトロ共培養アッセイを用いて外因性抗原による標的の捕捉が検出される。
ある実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて捕捉された標的の放出速度又はオフ速度が計測される。
外因性抗原発現ＥＨＣによる標的の捕捉は、例えば、標的がマウスに天然に存在するマウス疾患モデルを含めた動物において、インビボアッセイでアッセイすることができる。好適な疾患としては、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、免疫複合体病、自己抗体疾患、高脂血症、高血糖症が挙げられる。他のマウスモデルでは、標的がマウスに外部から、例えば注射によるか又は摂餌によって投与される。これらのアッセイでは、外因性抗原発現ＥＨＣによる標的捕捉のアッセイは、動物、例えば血漿、組織を標的の減少又は保持に関して調べることによるか、或いは動物から、例えば血液、血漿、組織から外因性抗原発現ＥＨＣを単離又は採取し、且つ限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて外因性抗原上の標的の存在をアッセイすることにより行われる。
一部の実施形態において、外因性抗原は標的を結合又は捕捉してインビボでの標的のクリアランスを実質的に増加させる能力、又は循環中の標的の濃度を実質的に低減する能力を有する。外因性抗原発現ＥＨＣ上の外因性抗原の活性は、インビトロ又はインビボでの標的のクリアランスの亢進を検出することによって評価し得る。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて外因性抗原による標的の捕捉が検出される。続いて、外因性抗原発現ＥＨＣは、クリアランスを促進することが知られている細胞、例えばマクロファージ又は単球と共に共培養アッセイでインキュベートされ、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法によって標的及び外因性抗原発現ＥＨＣのクリアランスが評価される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて外因性抗原による標的の捕捉が検出される。続いて、外因性抗原発現ＥＨＣは、インビボでのＥＨＣのクリアランス機構を模倣する物理的システム、例えば人工脾臓、マイクロチャネル、充填カラム、樹脂、組織外植片、遠心機においてインキュベートされ、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法によって標的及び外因性抗原発現ＥＨＣのクリアランスが評価される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣによる標的のクリアランスは、例えば、標的がマウスに天然に存在する、疾患、例えば細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、免疫複合体病、自己抗体疾患、高脂血症、高血糖症のマウスモデル、又は例えば、標的がマウスに外部から、例えば注射によるか又は摂餌によって投与されるマウスモデルを例えば含めた動物におけるインビボアッセイでアッセイされる。これらのアッセイでは、外因性抗原発現ＥＨＣによる標的クリアランスのアッセイが、動物、例えば血漿、組織を標的の減少に関して調べることによるか、或いは動物から、例えば血液、血漿、組織から外因性抗原発現ＥＨＣを単離又は採取し、且つ限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて外因性抗原上の標的の存在をアッセイすることにより行われる。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、好適な外因性抗原を特定の細胞内コンパートメント、例えばリソソームに送達する能力を有する。
例えば、外因性抗原は、標的細胞、例えばマクロファージのリソソームコンパートメントに送達され得る。標的細胞のリソソームコンパートメントへの外因性抗原の送達の成功は、顕微鏡法及び蛍光外因性抗原又は蛍光外因性抗原検出剤に対応する点状スポットの検出によって評価される。それに代えて又は加えて、標的細胞のリソソームコンパートメントへの外因性抗原の送達の成功は、顕微鏡法及び蛍光外因性抗原検出剤と既知のリソソームマーカー、例えばリソトラッカー（ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ）ＬＡＭＰ−１に対する蛍光検出剤との共局在によって評価される。
一部の実施形態において、外因性抗原は、リソソーム蓄積症の遺伝子型又は表現型を呈する細胞又はリソソーム蓄積症患者に由来する細胞のリソソームに蓄積した毒性成分を分解することのできる酵素である。例えば、外因性抗原は、細胞内に蓄積した毒性物質を分解して細胞表現型をレスキューし、例えば細胞死を防ぐ能力を有する。
外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、ＥＨＣが複製不能であること、ＥＨＣが血管系を通じて安全に循環可能であること、及びＥＨＣに免疫原性がないことに関して評価し得る。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の安全性は、好適なインビトロ又はインビボアッセイを用いてＥＨＣの集団の複製能力を計測することにより評価される。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣの実質的な自己複製不能性の試験は、ａ）免疫不全マウスへの注入時に実質的に腫瘍を形成不能であること；ｂ）軟寒天での培養時に実質的にコロニーを形成不能であること；ｃ）チミジン取込みアッセイにおいて実質的にチミジンを取り込み不能であること；ｄ）蛍光レポーターをコードするＤＮＡをトランスフェクトしたときに実質的に陽性シグナルがない、例えば、１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、１００ｐｐｔ、１０ｐｐｔ、１ｐｐｔ、又は１ｐｐｔ未満の陽性シグナルであること；ｅ）核色素で染色したときに実質的に陽性シグナルがない、例えば、１０％未満、１％、０．１％、０．０１％；及び０．００１％、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、１００ｐｐｔ、１０ｐｐｔ、１ｐｐｔ、又は１ｐｐｔ未満の陽性シグナルであること；ｆ）血液系悪性腫瘍の細胞マーカー、例えば、ＣＫＩＴ、ＣＤ３４、ＥｐＣａｍで染色したときに実質的に陽性シグナルがない、例えば、１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、１００ｐｐｔ、１０ｐｐｔ、１ｐｐｔ、又は１ｐｐｔ未満の陽性シグナルであることを含む。特定の実施形態において、実質的な量の複製核酸を含有しない外因性抗原発現ＥＨＣが提供される。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の安全性は、投与されたＥＨＣが実質的な血管閉塞又は凝固カスケードの誘導を引き起こすことなくインビボで（対象の循環系において）循環する能力を計測することにより評価される。任意選択で、外因性抗原発現ＥＨＣの循環薬物動態が評価されてもよい。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの循環薬物動態は、マウスなどの動物にＥＨＣを静脈内注射することによって評価される。マウスはＮＳＧ（ｎｏｄ−ＳＣＩＤ−γ）免疫不全マウスであってもよい。マウスには、マクロファージを枯渇させた後、例えばヒト赤血球の腹腔内注射によるか、又はクロドロネートリポソームの静脈内注射によってＥＨＣを注射する。外因性抗原発現ＥＨＣは、蛍光色素、例えばＣＦＳＥで標識することができる。ＥＨＣの注射後、血液を採取し、残存する外因性抗原発現ＥＨＣの数を、例えばフローサイトメトリー、ウエスタンブロットによって評価し、これらのデータから外因性抗原発現ＥＨＣのクリアランス速度を推定する。外因性抗原発現ＥＨＣと同じ動物モデルにヒト赤血球を注射することができ、ＥＨＣ及びヒト赤血球のクリアランス速度を比較する。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣによる凝固カスケードの活性化リスクがインビトロアッセイで評価される。一実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣをヒト血液とインキュベートし、カオリン、負電荷リン脂質、及びカルシウムの存在下で凝固に要する時間を計測することによるか（活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験）（例えば、Ｅｘｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｃｋａｒｄ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７７ ２７（２）：６２を参照）、又はトロンボプラスチン及びカルシウムの存在下で凝固に要する時間を計測することによって（プロトロンビン時間（ＰＴ）試験）（例えば、Ｊａｑｕｅｓ ａｎｄ Ｄｕｎｌｏｐ １９４５，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １４５：６７を参照）凝固カスケード活性化を評価する。ａＰＴＴ試験の正常範囲は約２５〜３８秒である。ＰＴ試験の正常範囲は約１０〜１２秒である。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣによって引き起こされる任意の有害事象が、動物にＥＨＣを静脈内注射し、及び凝固カスケードの活性化を評価することによって評価される。凝固カスケードの誘導レベルの評価は、血液を採取し、血漿中の凝固カスケード成分のレベルを例えばウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡで評価することによって行われる。凝固カスケード成分は、典型的にはフィブリノゲン崩壊産物、例えばフィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢである。例えば、凝固カスケード誘導レベルの評価は、血液を採取し、血小板活性化アッセイによって血漿中の凝血活性レベルを評価すること、例えば、血漿を血小板と共にインキュベートし、及び例えば活性化マーカーの染色、例えばＰＡＣ−１、ＣＤ６２ｐ、又はＣＤ４０Ｌの染色によるフローサイトメトリーで血小板の活性化を評価することによって行われる。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣによって引き起こされる任意の有害事象が、動物にＥＨＣを静脈内注射し、炎症経路の活性化を評価することによって評価される。炎症レベルの評価は、血液を採取し、及び血漿中の炎症性サイトカインレベルを例えばウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡで評価することによって行われ得る。一実施形態において、炎症性シトカイン（ｃｉｔｏｋｉｎｅ）は、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、又はＩＬ−１２断片ｐ７０である。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣによって引き起こされる任意の有害事象が、動物にＥＨＣを静脈内注射し、組織、例えば、肝臓、脾臓、心臓、肺、脳、皮膚、腎臓の状態を評価することによって評価される。組織の状態は、肉眼的剖検、組織解剖、組織染色、及び顕微鏡画像法によって評価することができる。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣが実質的な血管閉塞又は凝固カスケードの活性化を引き起こすことなくインビボで循環する能力は、ＥＨＣの変形能を計測することによって評価される。外因性抗原発現ＥＨＣの変形能はインビトロアッセイを用いて評価する。例えば、このアッセイは、浸透圧脆弱性アッセイである。外因性抗原発現ＥＨＣの機械的脆弱性は、クエット型せん断システムにおいてずり応力に応答した構造的完全性を計測することによって評価し得る。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの変形能はエクタサイトメーターを使用して評価する。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの変形能は、レーザー支援旋光セルアナライザー（ＬＯＲＣＡ）機器を使用してレーザー回折で限定圧力における伸び指数を計測することによって評価する。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの変形能は、マイクロ流体装置において一定圧力で限定寸法の一連のミクロンスケール狭窄部を通り抜ける通過時間を計測することによって評価する。一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの変形能は、マイクロ流体装置において一定圧力で限定寸法の一連のミクロンスケール狭窄部を通過することによる生存率を計測することによって評価する。マイクロ流体装置は、以下に挙げるもの、即ち、限定はされないが、ミクロンスケール狭窄部を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップ（例えば、Ｈｏｅｌｚｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１４ ９１：ｅ５１４７４）；漏斗形狭窄部を有するチップ（例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２ １２：１１４３）；ピラーを有するＰＤＭＳチップ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１２ １０９（４６）：１８７０７）；又はインビトロ人工脾臓マイクロビーズ充填カラム（Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ ＤｅＰｌａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１７（８））のうちの１つから選択することができる。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣが実質的な血管閉塞又は凝固カスケードの活性化を引き起こすことなくインビボで循環する能力は、ＥＨＣの血管閉塞を計測することにより評価される。外因性抗原発現ＥＨＣの血管閉塞はインビトロアッセイを用いて評価することができる。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣの血管閉塞はエキソビボアッセイを用いて評価される。外因性抗原発現ＥＨＣを基準ヒト赤血球と１：１比でインキュベートし、Ｒｈ不適合血液による基準アッセイと比較した多細胞ロゼットの誘導を光学顕微鏡法によって評価する。外因性抗原発現ＥＨＣの血管閉塞は、流動条件下におけるヒト血管内皮細胞に対するＥＨＣの付着を計測することによって評価される。例えば、Ｋａｕｌ ＤＫ，Ｆｉｎｎｅｇａｎ Ｅ，ａｎｄ Ｂａｒａｂｉｎｏ ＧＡ（２００９）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １６（１）：９７−１１１を参照されたい。それに代えて又は加えて、血管閉塞は、ラット血管内皮のエキソビボ灌流アッセイにおける末梢抵抗単位（ＰＲＵ）の増加を計測することによって評価される。例えば、Ｋａｕｌ，Ｆａｂｒｙ ａｎｄ Ｎａｇｅｌ，ＰＮＡＳ １９８９，８６：３３５６を参照されたい。さらに、血管閉塞は、生体内顕微鏡法によって評価される。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｂｌｏｏｄ １１０（７）：２７０８を参照されたい。血管閉塞はまた、インビトロで段階的な高さの流動チャンバにおけるＥＨＣの流量及び付着を計測することによって評価されてもよい。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４（１２）：３７７４を参照されたい。
一部の実施形態では、外因性抗原発現ＥＨＣの集団の安全性が、好適なインビトロ又はインビボアッセイを用いてＥＨＣの集団の免疫原性を計測することによって評価される。
例えば、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、ａ）意図されるレシピエント対象の血清を使用したクームス試験において凝集を生じさせず、又はｂ）ヒトプール血清を使用したクームス試験において凝集を生じさせない。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、優勢な血液型抗原に関して遺伝子型を同定してレシピエントの血液型抗原遺伝子型に適合させた前駆細胞に由来する。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、インシリコＴ細胞エピトープ予測アルゴリズムによって予測されるＴ細胞反応性が１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又は０．００１％未満である外因性抗原又は他の外因性タンパク質を含む。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、インビトロＴ細胞活性化アッセイ、例えば、Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｉｎｃ．ＥｐｉＳｃｒｅｅｎアッセイにおける反応性が１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又は０．００１％未満である外因性抗原又は他の外因性タンパク質を含む。
例えば、赤血球から誘導される外因性抗原発現ＥＨＣは、それを必要としている対象に注入するため、遠心し、適切な溶液（例えば、標準ＡＳ−３溶液）に再懸濁することができる。一部の実施形態において、注入される外因性抗原発現ＥＨＣはレシピエントと同じＡＢＯ型を有し、注入に伴う免疫反応のリスクが最小限に抑えられる。外因性抗原発現ＥＨＣはまた、前処理して血液型特異的抗原を除去するか、又は他の方法で抗原性を低下させることもできる。このために好適な方法としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２００１０００６７７２号明細書及び同第２００３０２０７２４７号明細書に記載されるものが挙げられる。
治療組成物
有効レベルの目的の外因性抗原を有するＥＨＣを含有する組成物が提供される。かかる組成物は、複数のＥＨＣ、例えば、１×１０３個の細胞、又は１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２個、又は１×１０１２個超の細胞を含有する。本発明のＥＨＣは、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％超の質量対体積比（％ｍ／ｖ）の濃度の生理食塩水中の濃厚赤血球として投与することができる。患者への投与時間は１０分〜４時間の範囲であるか、又はそれを上回ってもよい。
本発明の培養ＥＨＣは、適切な緩衝液、例えば、抗凝固クエン酸デキストロースＡ（ＡＣＤ−Ａ）、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸リン酸デキストロースデキストロース（ＣＰ２Ｄ）、又はクエン酸リン酸デキストロースアデニン（ＣＰＤＡ−１）などのＦＤＡ承認済みの抗凝固保存溶液中に保存することができる。本組成物は最長２１日間保存し得る。
或いは、本発明の培養ＥＨＣは、認可された添加剤溶液、例えば、ＡＳ−１（Ａｄｓｏｌ）、ＡＳ−３（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ）、ＡＳ−５（Ｏｐｔｉｓｏｌ）、又はＡＳ−７（ＳＯＬＸ）中に保存することができる。
或いは、本発明の培養ＥＨＣは、グリセロール凍結保護溶液中に保存することができる。組成物は凍結して最長１０年間保存し得る。凍結細胞は使用前に解凍し、例えば０．９％塩化ナトリウムによる連続洗浄ステップによって脱グリセロール化し得る。
ヒト及びマウス赤血球の寿命（それぞれ１２０日及び５０日（例えば、Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００７を参照）を考えると、人工赤血球の加齢を刺激して抗原提示細胞による食作用を増加させることが有利であり得る。循環からの赤血球除去の最も重要な生理学的機構は、それぞれカルシウムイオノフォア又はＢＳ３化学処理によって人工的に誘導されるホスファチジルセリンの外在化（Ｓｃｈｒｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８５）又はバンド３タンパク質クラスター形成（Ｋａｙ，ＰＮＡＳ １９７５；Ｔｕｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９１）など、ＲＢＣ細胞表面上の新規抗原部位に曝露された後に免疫が介在するものである（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９８６）。
本発明の培養ＥＨＣは、例えばカルシウムイオノフォア又はＢＳ３などの食作用誘導剤で処理し得る。本発明の複数の培養ＥＨＣは、例えばカルシウムイオノフォア又はＢＳ３などの食作用誘導剤で処理されたＥＨＣを含んでもよく、それにより、対象への投与時に本発明の複数の培養ＥＨＣがボーラスとしてでなく例えば１日又は数日の間に連続的に異なる速度で取り込まれるように、時間の長さを異ならせることができる。
本明細書には、目的の外因性抗原を含む複数の培養ＥＨＣを含む組成物及び医薬組成物が提供される。本組成物及び医薬組成物は、例えば抗凝固クエン酸デキストロースＡなどの適切な保存緩衝剤の溶液を含み得る。目的の外因性抗原を含む複数の培養ＥＨＣを含む組成物及び医薬組成物は、例えばＡｄｓｏｌなどの認可された添加剤をさらに含み得る。目的の外因性抗原を含む複数の培養ＥＨＣを含む組成物及び医薬組成物は、凍結保存用にグリセロール凍結保護溶液をさらに含み得る。
本明細書には、表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ及び表Ｊの抗原の１つ以上から選択される目的の外因性抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、フラジェリン、グルテン、２Ｓアルブミン、ヒアラウロニダーゼ（ｈｙａｌａｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び抗ＴＮＦａ、アデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、抗胸腺細胞グロブリン、Ｌ−アルギナーゼ、Ｌ−メチオナーゼ、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリン、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＩＡ−２、ΙＡ−２β、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイロトロピン受容体、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、アセチルコリン受容体、マトリックスメタロプロテイン１及び３、分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン−１、ＰＤＧＦ受容体ａ、ＰＤＧＦ受容体β、核タンパク質ＳＳ−Ａ、コンアラキン（Ａｒａ ｈ １）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ ２）、アラキス凝集素（Ａｒａ ｈ ６）、ａ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン、グルテン、低分子量グルテン、ａ−グリアジン、γ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニン及びそれらの組み合わせなどを含むＥＨＣが提供される。目的の外因性抗原を含む複数のＥＨＣは、組成物又は医薬組成物として提供され得る。
本明細書には、任意選択で表Ｃの内因性赤血球タンパク質の１つに融合した、表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ及び表Ｊの１つ以上の抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、フラジェリン、グルテン、Ａｒａ ｈ２、２Ｓアルブミン、ヒアラウロニダーゼ（ｈｙａｌａｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び抗ＴＮＦａなどをコードする発現ベクターが提供される。
本明細書には、対象への投与に好適である、外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、概して外因性抗原発現ＥＨＣの集団と薬学的に許容可能な担体とを対象への投与に好適な形態で含む。薬学的に許容可能な担体は、一部には、投与される詳細な組成物によって決まると共に、組成物の投与に用いられる詳細な方法によっても決まる。従って、外因性抗原発現ＥＨＣの集団を含む医薬組成物の好適な製剤は多種多様である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照）。本医薬組成物は、概して、無菌で実質的に等張性の、且つ米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の全ての規則に完全に準拠したものとして製剤化される。
薬学的に許容可能な賦形剤には、動物への使用並びにヒト医薬品としての使用が許容される賦形剤を含めた、概して安全で非毒性の望ましい賦形剤が含まれる。かかる賦形剤は固体、液体、半固体であってもよく、又はエアロゾル組成物の場合には気体であってもよい。
担体又は希釈剤の例としては、限定はされないが、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。薬学的に活性な物質におけるかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は化合物が本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣと不適合である場合を除き、組成物中におけるその使用が企図される。組成物中には補助的治療剤もまた配合され得る。典型的には、医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。外因性抗原発現ＥＨＣは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内；筋肉内経路によるか又は吸入薬として投与することができる。外因性抗原発現ＥＨＣは、任意選択で、外因性抗原発現ＥＨＣが対象とする疾患、障害又は病態の治療に少なくとも部分的に有効な他の治療剤と併用して投与することができる。
非経口、皮内、又は皮下適用に用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌化合物；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調整化合物。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数用量バイアルに封入することができる。
注射剤としての使用に好適な医薬組成物は、滅菌注射用溶液又は分散液を即時調合するための滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、且つ容易な通針性が存在する程度に流体でなければならない。組成物は製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、且つ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用し、分散液の場合には要求される粒度を維持し、及び界面活性剤を使用することによって維持し得る。微生物作用の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現し得る。多くの場合、組成物中に等張化合物、例えば、糖類、多価アルコール類、例えばマニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて本明細書に列挙される成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒中に有効量の外因性抗原発現ＥＨＣを配合することによって調製し得る。概して、塩基性分散媒及び他の任意の所望の成分を含有する無菌媒体中に外因性抗原発現ＥＨＣを配合することにより、分散液が調製される。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、活性成分に任意の追加的な所望の成分が加わった粉末が、その予め滅菌ろ過した溶液から生じる。外因性抗原発現ＥＨＣは、外因性抗原発現ＥＨＣ、その１つ又は複数の外因性抗原及び／又はその任意選択の１つ又は複数のペイロードの持続放出又はパルス放出が可能となるように製剤化し得るデポー注射又は植込み製剤の形態で投与することができる。
経口組成物は、概して不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口組成物はゼラチンカプセルに封入してもよく、又は錠剤に圧縮してもよい。経口治療薬の投与には、外因性抗原発現ＥＨＣは賦形剤と配合して、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤としての使用向けに流体担体を使用して調製することもでき、ここで流体担体中の化合物は口内に適用され、うがいされて吐き出されるか、又は飲み込まれる。組成物の一部として、薬剤適合性を有する結合化合物、及び／又は補助材料を含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分の任意のもの、又は類似した性質の化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、又はコーンスターチなどの崩壊化合物；ステアリン酸マグネシウム又はステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味化合物；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料などの香味化合物。
吸入による投与には、外因性抗原発現ＥＨＣは、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器若しくはディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
外因性抗原発現ＥＨＣを含む組成物の全身投与もまた、経粘膜的又は経皮的手段によることができる。経粘膜又は経皮投与については、製剤中に、透過を図る関門に適切な浸透剤が使用される。かかる浸透剤は概して当該技術分野において公知であり、例えば経粘膜投与に関して、デタージェント、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔内スプレー又は坐薬を使用して達成することができる。経皮投与には、修飾赤血球は概して当該技術分野において公知のとおり軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、又はクリームに製剤化される。
外因性抗原発現ＥＨＣはまた、直腸送達用の坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリド類などの従来の坐剤基剤を含む）又は停留浣腸の形態の医薬組成物として調製することもできる。
一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、外因性抗原発現ＥＨＣが対象の体から排出される速度を低下させ得る担体と共に調製される。例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含め、制御放出製剤が好適である。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、及びポリ乳酸など、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品を入手することもできる。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物は、その医薬組成物の利益を受け得る対象に静脈内投与される。他の実施形態において、本組成物は、例えばリンパ内注射、又は節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８を参照）、又は筋肉内注射、皮下投与、胸腺内若しくは肝臓内への直接の注射によってリンパ系に投与される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物は液体懸濁物として投与される。一実施形態において、本医薬組成物は、投与後にデポーを形成する能力を有し、且つ好ましい実施形態では外因性抗原発現ＥＨＣを循環中にゆっくりと放出するか、又は好ましい実施形態ではデポー形態のまま留まる凝固製剤（ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として投与される。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物は、外因性抗原発現ＥＨＣの生存能を維持可能な方法及び緩衝組成物を用いて保存される。例えば、嫌気状態を維持するための保存前の酸素除去、ｐＨの操作、代謝前駆体の補充、浸透圧平衡の操作、懸濁媒の容積の増量、及び／又は保護分子を加えることによる酸化的ストレスの低減を用いて、外因性抗原発現ＥＨＣの生存能を維持することができる。これらの戦略の組み合わせを用いた幾つかの研究において、赤血球の生存能の維持によって６週間を超える保存の延長が可能となったことが報告されている（例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ，Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ ２０１０ ８：２２０を参照）。
本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣの送達には、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤が用いられ得る。賦形剤とは、希釈剤又は媒体として使用される不活性物質を指す。薬学的に許容可能な担体は、一般には、化合物を治療に有用なもの又は製品として有用なものにするため化合物と共に使用される。一般に、任意の物質について、薬学的に許容可能な担体は、対象に送達する物質と組み合わされる材料である。従来の医薬担体、水性、粉末状又は油性基剤、増粘剤などが、必要なもの又は望ましいものであり得る。ある場合には、担体は、例えば不溶性化合物を液体送達用に可溶化するため送達に不可欠である；その活性が保たれるように物質のｐＨを制御する緩衝剤；又は保存容器内における物質の損失を防ぐ希釈剤。しかしながら、他の場合には、担体は利便性を図るものであり、例えば、投与の利便性を高める液体である。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者に公知の方法に従い合成し得る。
典型的には、薬学的に許容可能な組成物は夾雑物を含まないように高度に精製され、生体適合性且つ非毒性であり、及び対象への投与に適している。水が担体の一構成成分である場合、その水は、夾雑物、例えばエンドトキシンを含まないように高度な精製及び処理を受ける。
薬学的に許容可能な担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／又は鉱油であり得るが、これらに限定されない。本医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／又は保存剤をさらに含み得る。
有効レベルの外因性抗原を有する外因性抗原発現ＥＨＣを含有する医薬組成物が提供される。かかる組成物は、複数の外因性抗原発現ＥＨＣ、例えば、１×１０３個のＥＨＣ、又は１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２個、又は１×１０１２個超のＥＨＣを含有する。具体的な例では、ＥＨＣから作成される外因性抗原発現ＥＨＣは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％超の質量対体積比（％ｍ／ｖ）の濃度の生理食塩水中の濃厚赤血球として投与することができる。患者への投与時間は１０分〜４時間の範囲であるか、又はそれを上回ってもよい。
具体的な例では、ＥＨＣから作成される外因性抗原発現ＥＨＣは、適切な緩衝液、例えば、抗凝固クエン酸デキストロースＡ（ＡＣＤ−Ａ）、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸リン酸デキストロースデキストロース（ＣＰ２Ｄ）、又はクエン酸リン酸デキストロースアデニン（ＣＰＤＡ−１）などのＦＤＡ承認済みの抗凝固保存溶液中に保存することができる。本組成物は最長２１日間保存し得る。
或いは、ＥＨＣから作成される外因性抗原発現ＥＨＣは、認可された添加剤溶液、例えば、ＡＳ−１（Ａｄｓｏｌ）、ＡＳ−３（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ）、ＡＳ−５（Ｏｐｔｉｓｏｌ）、又はＡＳ−７（ＳＯＬＸ）中に保存することができる。
或いは、ＥＨＣから作成される外因性抗原発現ＥＨＣは、グリセロール凍結保護溶液中に保存することができる。組成物は凍結して最長１０年間保存し得る。凍結細胞は使用前に解凍し、例えば０．９％塩化ナトリウムによる連続洗浄ステップによって脱グリセロール化し得る。
本明細書には、外因性抗原を含む複数の培養ＥＨＣを含む組成物及び医薬組成物が提供される。本組成物及び医薬組成物は、例えば抗凝固クエン酸デキストロースＡなどの適切な保存緩衝剤の溶液を含み得る。外因性抗原を含む複数の培養ＥＨＣを含む組成物及び医薬組成物は、例えばＡｄｓｏｌなどの認可された添加剤をさらに含み得る。外因性抗原を含む複数の培養ＥＨＣを含む組成物及び医薬組成物は、凍結保存用にグリセロール凍結保護溶液をさらに含み得る。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、別の外因性抗原発現ＥＨＣと多複合体凝集物、例えば、二量体、三量体、多量体を形成することが可能である。
一実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、循環系の構成要素、例えば、赤血球、網赤血球、血小板、マクロファージ、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞と多複合体凝集物、例えば、二量体、三量体、多量体を形成することが可能である。
外因性抗原発現ＥＨＣ及びその医薬組成物の投与の投薬量及び頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び食事、任意の炎症の重症度、投与時間、及び他の臨床学的要因など、様々な要因に基づき主治医が決定し得る。一例において、静脈内投与は最低限有効な用量で開始し、好ましい効果が観察されるまで、予め選択された時間経過にわたり用量を増加させる。続いて、現れ得る任意の有害作用を考慮しながら、対応する効果の増加が生じるレベルに限定して投薬量を漸増させる。
好適な投薬量の非限定的な例は、例えば、１×１０３〜１×１０１４、１×１０３〜１×１０７、１×１０５〜１×１０６、１×１０７〜１×１０１１、１×１０８〜１×１０９、１×１０１０〜１×１０１４、１×１０１１〜１×１０１３、又は５×１０１１〜５×１０１２個の外因性抗原発現ＥＨＣの範囲であり得る。具体的な例としては、約１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２個、又はそれを超える外因性抗原発現ＥＨＣが挙げられる。外因性抗原発現ＥＨＣの各用量は、１日１回、週１回、週２回、月１回、又は月２回などの間隔で投与することができる。各ＥＨＣは、例えば、約１００〜１０７、又は約１０３〜１０６個の、様々な範囲の抗原分子を発現し得る。具体的な例としては、ＥＨＣ当たり約１０００、３０００、５０００、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７個、又はそれを超える外因性抗原分子が挙げられる。
「ＥＨＣ基準の比例投薬量」は、循環実体の天然に存在する量に対する相対的な用量として投与される外因性抗原発現ＥＨＣの数である。循環実体は、細胞、例えば、赤血球、網赤血球、又はリンパ球、又は標的、例えば、抗原、抗体、ウイルス、毒素、サイトカイン等であり得る。単位は循環実体当たりの外因性抗原発現ＥＨＣ、即ちＳＣＭＲＣ／ＣＥとして定義される。この投薬量単位には、１０−７、１０−６、１０−５、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１、１、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９が含まれ得る。
本明細書に記載される医薬組成物は、外因性抗原発現ＥＨＣと任意選択で薬学的に活性な薬剤又は治療剤とを含む。治療剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤であり得る。
本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物を含む剤形が提供される。一部の実施形態において、剤形は静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化される。
本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物を保持する容器と対象への医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具が提供される。
本明細書に記載される外因性抗原発現ＥＨＣを含む医薬組成物と対象への医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キットが提供される。
外因性抗原発現ＥＨＣの薬学的に許容可能な懸濁液は、好ましくは約１０〜約２５０ｍｌの容積で包装される。包装材料はシリンジ又は輸液に好適なＩＶバッグであってもよい。懸濁液の投与は、任意選択でＩＶバッグなどからの点滴を使用して例えば静脈内又は動脈内注入によって行われる。投与は典型的には腕に又は中枢カテーテルを介して静脈内に行われる。５０ｍｌを超える投与には、点滴の使用が好ましい。
疾患の治療
免疫トレランスを誘導する方法が提供される。本方法は、免疫トレランスの誘導を必要としている対象に対し、本明細書に提供される目的の外因性抗原を含む赤血球細胞の医薬組成物を、対象において免疫トレランスを誘導するのに十分な量及び／又は投与頻度で投与するステップを含む。
本発明の医薬組成物は、免疫トレランスを促進又は増強するのに有用である、目的の外因性抗原を含む赤血球細胞を提供する。免疫トレランスを用いて、免疫活性化に関連する疾患、障害、又は病態を治療するか、予防するか、又はその重症度を低減し得る。
免疫活性化疾患には、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、及び膜性腎炎など、及び表Ｆに列挙されるものが含まれる。免疫活性化疾患にはまた、炎症性疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は他の特発性炎症性腸疾患など、及び表Ｇに列挙されるものも含まれる。免疫活性化疾患にはまた、アレルギー性疾患、例えば、喘息、ピーナッツアレルギー、甲殻類アレルギー、花粉アレルギー、乳タンパク質アレルギー、虫刺されアレルギー、及びラテックスアレルギーなど、及び表Ｈに列挙されるものも含まれる。免疫活性化疾患にはまた、原発疾患の治療のために投与される治療用タンパク質に応答した、治療用タンパク質、例えば、血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ凝固因子、血友病Ｂにおける第ＩＸ凝固因子、関節リウマチ及び他の炎症性疾患における抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）抗体、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるアスパラギナーゼ、並びに表Ｉ、表Ｊ、表５、及び表７に列挙されるものの有効性を低下させる免疫活性化も含まれる。
さらに、免疫活性化疾患の治療方法が提供される。本方法は、治療の誘導を必要としている対象に対し、本明細書に提供される目的の外因性抗原を含む赤血球細胞の医薬組成物を免疫活性化疾患の治療に十分な量で投与するステップを含む。例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患又はアレルギー性疾患などの免疫活性化疾患に罹っているか、又はそれに罹っている疑いがある対象には、提供される本治療方法が有効であり得る。
一部の実施形態において、患者は自己免疫疾患若しくは病態又は自己抗体媒介性疾患若しくは病態に罹患しており、ここでは患者の免疫系が内因性分子、例えばタンパク質抗原に対して活性化し、従って免疫系が内因性分子を攻撃し、炎症を生じさせ、組織に損傷を与え、及び他に自己免疫又は自己抗体疾患又は病態の症状を引き起こす。免疫反応は内因性分子に結合する抗体によって駆動され得るか、又は内因性分子を発現する細胞を攻撃する過活性のＴ細胞によって駆動され得るか、又は調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＢ細胞などの他の免疫細胞によって駆動され得る。これらの実施形態において、抗原タンパク質又はその断片は本発明の除核造血細胞上で発現し得る。これらの細胞の集団は、こうした疾患又は病態に罹患している患者に１回又はそれを超えて投与するとき、抗原タンパク質に対するトレランスを誘導してもはや免疫系の活性化が生じないようにするのに十分であり、ひいては根底にある疾患又は病態の症状が治療又は改善され得る。
例えば、後天性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）に罹患している患者は異常な自己抗体媒介性疾患を有し、ここでは内因性ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に対する抗体が産生されて、ＡＤＡＭＴＳ１３がそのフォン・ヴィレブランド因子切断活性を発揮できなくなり、それにより血管系全体にわたって微小血栓が形成される結果、血小板減少症が起こる。この実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原が除核造血細胞上で発現し、ＴＴＰに罹患している患者に対し、ＡＤＡＭＴＳ１３に対するトレランスを誘導するのに十分な有効な量で投与され、従って循環中にある阻害性抗ＡＤＡＭＴＳ１３自己抗体の量が減少し、フォン・ヴィレブランド因子を切断する体の能力が回復するため、従って疾患の症状が低減する。好ましい実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の抗原断片のみが除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長ＡＤＡＭＴＳ１３が除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長ＡＤＡＭＴＳ１３が除核造血細胞上で発現し、酵素的に活性であり、従って投与された細胞生成物は、トレランスの誘導と、またフォン・ヴィレブランド因子の治療的切断との両方を行うことが可能である。
別の例では、非典型溶血性貧血症候群（ａＨＵＳ）に罹患している患者は、内因性タンパク質補体因子Ｈ（ＣＦＨ）に対する異常な自己抗体反応を有し、ＣＦＨがその補体調節機能を果たすことができない。結果として、血管系において補体の過剰な活性化が起こり、血管内溶血につながる。この実施形態では、ＣＦＨ抗原が除核造血細胞上で発現し、ａＨＵＳに罹患している患者に対し、ＣＦＨに対するトレランスを誘導するのに有効な量で投与され、従って循環中の阻害性抗ＣＦＨ自己抗体の量が減少し、補体を阻害する体の能力が回復するため、従って疾患の症状が低減する。好ましい実施形態では、ＣＦＨの抗原断片のみが除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長ＣＦＨが除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長ＣＦＨが除核造血細胞上で発現し、治療的に活性であり、従って投与された細胞生成物は、トレランスの誘導と、また補体調節の治療的促進との両方を行うことが可能である。
別の例では、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患している患者は、ニューロンを包むポリペプチドミエリンに対する自己免疫反応を有する。結果として、Ｔ細胞がミエリンを攻撃し、それによって生じる炎症が神経線維の脱髄を引き起こし、神経に沿って電気信号が送られる能力が障害され、多発性硬化症の症状につながる。この実施形態では、ミエリン抗原が除核造血細胞上で発現し、ＭＳに罹患している患者に対し、ミエリン抗原に対するトレランスを誘導するのに有効な量で投与され、従って抗ミエリン免疫反応が減少し、有髄神経線維へと電気インパルスを送る体の能力が回復するため、従って疾患の症状が低減する。好ましい実施形態では、ミエリンの１つ以上の抗原断片のみが除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長ミエリンタンパク質が除核造血細胞上で発現する。
別の例では、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に罹患している患者は、膵臓のβ膵島細胞に対する自己免疫反応を有する。結果として、Ｔ細胞がβ膵島細胞を死滅させ、インスリンを産生して分泌する膵臓の能力が低下又は消失することで、Ｔ１Ｄの症状及び病理学につながる。この実施形態では、β細胞抗原が除核造血細胞上で発現し、Ｔ１Ｄに罹患している患者に対し、β細胞抗原に対するトレランスを誘導するのに有効な量で投与され、従って抗β細胞免疫反応が減少し、インスリンを産生して分泌する膵臓の能力が回復するため、従って疾患の症状が低減する。好ましい実施形態では、β細胞抗原の１つ以上の抗原断片のみが除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長β細胞タンパク質が除核造血細胞上で発現する。
さらに、治療用タンパク質治療レジメンに応答した免疫活性化を低減又は軽減する方法が提供される。本方法は、治療用タンパク質治療レジメンに応答した免疫活性化の低減又は軽減を必要としている対象に対し、本明細書に提供される目的の外因性抗原を含む赤血球細胞の医薬組成物を、治療用タンパク質治療レジメンに応答した免疫活性化を低減又は軽減するのに十分な量で投与するステップを含む。
一部の実施形態では、患者は、疾患又は病態の症状を治療又は改善するために治療用タンパク質を投与し得る疾患又は病態に罹患しているが、その治療用タンパク質が免疫原性であるため、患者が治療用タンパク質に対して免疫反応を生じ、治療用タンパク質がもはや原疾患の治療又は改善に有効ではなくなる。例えば、免疫原性治療用タンパク質は、非ヒト供給源、例えば、ウシ、ブタ、又は非ヒト霊長類に由来するか、又は非哺乳類供給源に由来し、例えば、細菌、真菌、又は植物由来であってもよく、又は免疫原性治療用タンパク質はヒト供給源に由来してもよく、但し反復曝露及び投与が免疫原性の誘導に十分となり得るものである。免疫反応は、免疫原性治療用タンパク質に結合してその機能を阻害する抗体（中和抗体）又は免疫原性治療用タンパク質に結合して他の免疫細胞によるそのクリアランスを惹起する抗体（オプソニン化抗体）によって駆動され得る。これらの実施形態では、免疫原性治療用タンパク質又はその抗原断片が本発明の除核造血細胞上で発現し得る。これらの細胞の集団は、疾患に罹患している患者に１回又はそれを超えて投与されるとき、もはや免疫系によって中和又はオプソニン化されないように免疫原性治療用タンパク質に対するトレランスを誘導するのに十分であり得る。好ましい一実施形態において、本発明の除核造血細胞の表面上で発現する免疫原性治療用タンパク質は、循環中の細胞上で治療的に活性であり、従って細胞及びタンパク質の組成物は、患者への投与時にトレランスの誘導と、根底にある疾患又は病態の症状の治療又は改善との両方を行うことが可能である。別の好ましい実施形態において、本発明の除核造血細胞の表面上で発現する免疫原性治療用タンパク質の抗原断片は循環中の細胞上で治療活性を有さず、従って細胞及びタンパク質の組成物は患者への投与時にトレランスを誘導することが可能であり、しかし根底にある疾患又は病態の症状の治療又は改善には免疫原性治療用タンパク質の別個の製剤が投与される。
例えば、血友病Ａに罹患している患者は、適切な凝固を回復するため第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ）を輸注する必要がある。しかしながら、ＦＶＩＩＩがヒト由来であるにも関わらず、多くの患者がＦＶＩＩＩに対する中和抗体を生じ、それにより治療が無効となり、生命を脅かす出血リスクにつながり得る。一実施形態では、血友病Ａに罹患している患者に対し、外因性ＦＶＩＩＩを発現する除核造血細胞が投与され、それにより（１）循環活性ＦＶＩＩＩレベルが症状の改善及び制御されない重度の出血の予防に必要なレベルまで回復され、及び（２）ＦＶＩＩＩに対するトレランスが誘導される。
別の例では、関節リウマチに罹患している患者は、その疾患に関連する炎症を低減するため抗ＴＮＦａ抗体を注射する必要がある。しかしながら、患者は抗ＴＮＦａ抗体に対する中和抗体を生じ、それにより治療用抗体が無効となり得る。この場合、患者は典型的には症状の悪化を起こし、抗ＴＮＦａ抗体の用量を増加しなければならないか、又は別のアミノ酸コード配列を有する別の抗ＴＮＦａ抗体に切り換えなければならないかのいずれかである。この実施形態では、抗ＴＮＦａ抗体に対する中和抗体を生じた関節リウマチ患者に、抗ＴＮＦａの抗原断片を発現する除核造血細胞が投与される。組成物は、抗ＴＮＦａ抗体に対するトレランスを誘導するのに十分な用量で投与され、循環ＴＮＦａレベルを低減し、ひいては患者における関節リウマチの症状を低減するための抗ＴＮＦａの有効な投与が可能となる。
別の例では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している患者は、非ヒト酵素のペグ化フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）で治療される。この患者は、この治療用タンパク質の投与時にアレルギー反応もまた誘発するＰＡＬに対してオプソニン化抗体及び中和抗体を生じる。この免疫反応はＰＡＬを無効にするのみならず、患者の健康もまた脅かす。一実施形態において、ＰＫＵに罹患している患者に対し、ＰＡＬに対するトレランスを誘導するのに十分な量で外因性ＰＡＬを発現する除核造血細胞が投与される。好ましい実施形態では、細胞が発現するＰＡＬは細胞上で活性であり、組成物は、ＰＡＬに対する危険な免疫反応を予防することに加えて、循環フェニルアラニンレベルを低減し、フェニルケトン尿症の症状を治療又は改善することが可能である。別の好ましい実施形態では、ＰＡＬの抗原断片が除核造血細胞上で発現し、この細胞発現断片は治療活性を有さず、そのため、フェニルケトン尿症の症状を治療又は改善するため患者に別個のＰＡＬ製剤が投与される。トレランスを誘導する細胞組成物は、ＰＡＬ治療製剤を投与する前に投与することができ、又はトレランスを誘導する細胞組成物は、ＰＡＬ治療製剤の投与と同時に投与することができる。
一部の実施形態では、患者は、アレルギー性疾患、例えば、動物の鱗屑、クログルミ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、チリダニ、卵、ペルシャグルミ、魚、ヘーゼルナッツ、昆虫毒、ラテックス、牛乳、カビ、ピーナッツ類、花粉、草、甲殻類、大豆、堅果類、又はコムギに対するアレルギーに罹患している。アレルギーに罹患している患者は、例えば食事、皮膚接触、注射、又は環境曝露によるアレルゲンの抗原断片との接触時に免疫反応を生じ得る。免疫反応には、ＩｇＥ抗体、感作肥満細胞、脱顆粒、ヒスタミン遊離、及びアナフィラキシー、並びにＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞，調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好中球、及びＮＫＴ細胞などのカノニカルな免疫細胞が関わり得る。アレルギー反応は不快感を引き起こすこともあれば、又は死亡を引き起こすほど重症であることもあり、従って患者側でも、並びにその患者の家族及び介護者側でも常に警戒する必要がある。これらの実施形態では、抗原タンパク質又はその断片が本発明の除核造血細胞上で発現し得る。これらの細胞の集団は、アレルギー性疾患又は病態に罹患している患者に１回又はそれを超えて投与されるとき、抗原タンパク質に対するトレランスを誘導してもはや曝露時の免疫系の活性化が誘導されないようにするのに十分であり得ると共に、ひいては根底にあるアレルギー性疾患又は病態の症状を治療又は改善し得る。
一例において、ピーナッツアレルギーに罹患している患者は、ピーナッツ抗原ＡｒａＨ１に曝露すると免疫反応を有する。この実施形態では、ＡｒａＨ１が除核造血細胞上で発現し、ピーナッツアレルギーに罹患している患者に対し、ＡｒａＨ１抗原に対するトレランスを誘導するのに有効な量で投与され、従ってアレルギー性免疫反応が減少し、ピーナッツを安全に摂取する個体の能力が回復するため、従って疾患の症状が低減する。好ましい実施形態では、ＡｒａＨ１の１つ以上の抗原断片のみが除核造血細胞上で発現する。好ましい実施形態では、完全長ＡｒａＨ１タンパク質が除核造血細胞上で発現する。
本発明の特定の態様は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合媒介性疾患、例えば、移植片対宿主病又は移植臓器拒絶反応などにおいて免疫細胞によって認識される抗原を含むＥＨＣに関する。
一部の実施形態において、患者は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合の疾患又は病態に罹患しており、ここでは組織上のＨＬＡ抗原に対して免疫細胞が活性化され、その組織を攻撃する。これは完全には適合しないドナーからの臓器又は組織の同種移植後によく起こり、移植片拒絶反応の医学的状態につながり、ここでは患者の免疫系が外来性組織又は臓器を攻撃し、移植臓器又は組織の死を引き起こす。別のよく見られるＨＬＡ不適合病態は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であり、ここで患者は完全には適合しないドナーから同種骨髄移植を受けており、移植免疫細胞（移植片）が活性化して、外来性と認識されるレシピエント臓器（宿主）を攻撃するため、宿主組織及び臓器に損傷が引き起こされ、死亡を含めた重篤な結果につながる。ＨＬＡ不適合免疫活性化は、典型的にはＴ細胞によって媒介されるが、調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、抗体、樹状細胞、単球、マクロファージ、及び好中球もまた関わり得る。これらの実施形態では、抗原性ＨＬＡ分子又はその断片が本発明の除核造血細胞上で発現し得る。これらの細胞の集団は、ＨＬＡ不適合疾患又は病態に罹患している患者に１回又はそれを超えて投与されるとき、抗原性ＨＬＡ分子に対するトレランスを誘導し、もはや免疫系の活性化が誘導されないようにするのに十分であり、従って根底にあるＨＬＡ不適合疾患又は病態の症状、例えば移植臓器の生存又は患者の生存が治療又は改善され得る。好ましい実施形態では、細胞の表面上で発現するＨＬＡ分子はまた、ＨＬＡ分子に負荷されたペプチドも含有する。
本明細書に記載される方法に使用される外因性抗原を含む赤血球細胞は自己由来、即ち同じ対象に由来してもよく、又は同種由来、即ち異なる細胞ドナーに由来してもよい。
医薬組成物は、例えば静脈内輸液又は筋肉内注射によって対象に投与され得る。
他の実施形態
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的システムに限定されず、それらは当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語法は特定の態様を説明することを目的にしているに過ぎず、限定する意図はないことも理解されるべきである。
本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ、均等な、又は類似した目的を果たす代替的な特徴に置き換えることができる。従って、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の均等な又は類似した特徴の一例に過ぎない。
一部の実施形態において、ＣＲ１外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣはマウスでは作成されず、及び／又はマウス赤血球系細胞からは作成されない。一部の実施形態において、ＣＲ１外因性抗原を含む外因性抗原発現ＥＨＣは実験動物では作成されず、及び／又は実験動物に由来する赤血球系細胞からは作成されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは巨核球又は血小板から作成される。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、赤血球系細胞、例えば赤血球又は網赤血球から作成される。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、好中球、好酸球、又は好塩基球からは作成されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、単球又はマクロファージからは作成されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋造血幹細胞又はＣＤ３４＋Ｌｉｎ−又はＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞がエンリッチされた細胞集団からは作成されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＨＩＶ共受容体の細胞外ドメインを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ウイルスとの結合能を有する外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＣＤ４を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＨＩＶ共受容体を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ６、ＧＰＲ１５、ＡＰＪ、ＣＭＫＬＲ１、又はＣＸ３ＣＲ１又はそれらの任意の組み合わせを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、アデノシンデアミナーゼ外因性抗原をコードする外因性核酸を含有しない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、癌遺伝子をコードする外因性核酸を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、癌遺伝子を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ｃｄｘ１、ｃｄｘ２、又はｃｄｘ４をコードする外因性核酸を含有しない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ｃｄｘ１、ｃｄｘ２、又はｃｄｘ４、又はそれらの任意の組み合わせを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、リガンド結合ドメインを含むキメラポリペプチドを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、リガンドとの結合能を有するＳドメインを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１１受容体、ＩＬ−１３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、オンコスタチンＭ受容体、ＴＧＦ−β受容体、ＥＧＦ受容体、ＡＴＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｃ−ｅｒｂＢ−３、Ｘｍｒｋ、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＩＲＲ、ＰＤＧＦ受容体、ＣＳＦ−１受容体、ｃ−ｋｉｔ、ＳＴＫ−１／ｆｌｋ−２、ＦＧＦ受容体、ｆｌｇ、ｂｅｋ、ＮＧＦ受容体、Ｒｏｒ１及びＲｏｒ２又はそれらの任意の組み合わせを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ヒトパピローマウイルスのＥ６又はＥ７遺伝子を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、腫瘍抗原を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、グルコセレブロシダーゼを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、アスパラギナーゼを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、アルギニンデイミナーゼを含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ｉ）外因性抗原とは異なる標的細胞、及び／又はｉｉ）外因性抗原とは無関係に機能する標的細胞（ここで外因性抗原は標的との相互作用能を有する）と外因性抗原発現ＥＨＣとの融合を促進する能力を有する融合分子を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、シンシチン−１を含む外因性抗原を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、例えば光子又は消光性化合物によって活性化され得る化合物などの感光性合成化合物を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、検出可能な反応を生じる能力を有する活性化可能分子検出剤を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは診断用化合物を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはウイルス又は細菌を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは自己ＣＤ３４＋細胞からは作成されず、又はそれを含まない。一部の実施形態において、本明細書に記載される赤血球系細胞から作成される外因性抗原発現ＥＨＣを使用した治療及び予防方法は、インビボで例えば赤血球系細胞と会合した検出剤によって赤血球系細胞を検出するステップを含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはヒトドナー多能性造血幹細胞からは作成されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣの集団はバイオリアクターでは拡大されない。一部の実施形態において、拡大及び／又は分化後の外因性抗原発現ＥＨＣの集団は、分化したヒト血液細胞の単一の種を含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、分化した成熟ヒト血液細胞ではない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、万能ドナー、例えば血液型Ｏ、Ｒｈ因子陰性に由来する血液細胞からは作成されない。一部の実施形態において、外因性ＡＤＡポリペプチド抗原発現ＥＨＣは重症複合型免疫不全症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）の治療には使用されない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣを拡大し及び分化させる方法は、骨髄増殖性受容体（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｍｐｌ）リガンドを含む培地で外因性抗原発現ＥＨＣを培養することを含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、合成三リン酸化ヌクレオシド類似体を含むペイロードを含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、２’，３’−ジデオキシシチジン−５’−三リン酸（ｄｄＣＴＰ）及び／又は３’−アジド−３’−デオキシチミジン−５’−三リン酸（ＡＺＴ−ＴＰ）を含むペイロードを含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、ビスホスホネートを含むペイロードを含まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、細胞を溶解させたり及び再密閉したりすることなく赤血球系細胞を外因性抗原及び任意選択でペイロードと接触させて外因性抗原及び／又はペイロードを取り込ませることにより作成される。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、赤血球系細胞を外因性抗原及び任意選択でペイロードと接触させることにより作成され、ここで接触には低張透析は含まれない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、赤血球系細胞を外因性抗原及び任意選択でペイロードと接触させることにより作成され、ここで接触には、赤血球系細胞内又はその上に外因性抗原及び／又はペイロードを負荷することは含まれない。一部の実施形態において、外因性抗原は、接触させる赤血球系細胞でない実体に作成され、及び／又は外因性抗原は、接触させる赤血球系細胞を含まない試料から単離される。例えば、ポリペプチド外因性抗原について、好適な実体には、細胞株、インビトロ発現系、細菌発現系等が含まれる。
一部の実施形態において、ＥＨＣが発現する外因性抗原ポリペプチドはＥＨＣの表面上に存在するが、ＥＨＣの表面に非共有結合的に結合はしていない。一部の実施形態において、ＥＨＣの表面に対する抗原の非共有結合は、抗体、抗体断片、抗体様ポリペプチド、又は非抗体ポリペプチド結合足場によっては媒介されない。一部の実施形態において、ＥＨＣの表面に対する外因性抗原の非共有結合は、赤血球系細胞抗原、例えば、バンド３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、キッド抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、ケル（ＣＤ２３８）、ダッフィ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲｌ（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧｌ／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロテリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）、ドンブロック、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、シアンナ（Ｓｃｉａｎｎａ）、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−ｌ（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、及びＨ抗原（ＣＤ１７３）、又は別の赤血球結合部分を対象とするものではない。
一部の実施形態において、外因性抗原ポリペプチドは、ＥＨＣと別に作成されて次にＥＨＣにコンジュゲートされるものではない。一部の実施形態において、外因性抗原ポリペプチドは、例えばトランスペプチダーゼ、ソルターゼ、及び／又はイソペプチダーゼによって行われるような、例えば自己触媒イソペプチド結合形成反応を介して酵素的にコンジュゲートされるものではない。一実施形態において、外因性抗原ポリペプチドは、ソルターゼを使用して酵素的にコンジュゲートされるものではない。
一部の実施形態において、外因性抗原ポリペプチドは、例えばカルボジイミド（ソルターゼ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を含む）などの架橋剤を介して化学的にコンジュゲートされるものではない。
一実施形態において、外因性抗原は、ＥＨＣと別に作成されて次にＥＨＣに封入されるものではない。一実施形態において、外因性抗原の封入は、外因性抗原の存在下におけるＥＨＣの低張透析によって媒介されるものではない。
前述の説明及び関連する図面に提供される教示を利用して、これらの発明が関係する技術分野の当業者には、本明細書に示される発明の多くの変形形態及び他の実施形態が容易に想起されるであろう。従って、本発明は開示される具体的な実施形態に限定されないこと、並びに変形形態及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれるものと意図されることが理解されるべきである。本明細書では特定の用語が用いられているが、それらは一般的且つ説明的な意味で用いられているに過ぎず、限定を目的とするものではない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容上特に明確に指示されない限り複数形の参照を含む。
選択肢（例えば、「又は」）の使用は、それらの選択肢の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されなければならない。
用語「約」は、本明細書で使用されるとき、量、時間的な持続期間などの計測可能な値を参照する場合に、指定された値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、及びなおもより好ましくは±０．１％の変動を包含するように意図され、従って変動は本開示の方法を実施するのに妥当である。
本明細書で使用されるとき、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、又は整数範囲は、特に指示されない限り、記載される範囲内にある任意の整数の値、及び適切な場合にはその分率（整数の１０分の１及び１００分の１）を含むものと理解されるべきである。
「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、本明細書で使用されるとき、「〜を備える（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を備えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を備える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「〜を含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義語であり、次に続くもの、例えば構成要素の存在を特定し、且つ当該技術分野において公知の又はそこに開示されている追加的な記載されていない構成要素、特徴、要素、メンバー、ステップの存在を排除又は除外しない包括的な又はオープンエンド形式の用語である。
本明細書で使用されるとき、用語「など」、「例えば」等は、例示的実施形態を指し、本開示の範囲を限定しないことが意図される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明を試験するための実施においては、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な任意の方法及び材料を使用し得るが、本明細書には好ましい材料及び方法が記載される。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、個別の刊行物又は特許出願がそれぞれあらゆる目的で参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとして、本明細書においてあらゆる目的で全体として参照により援用される。本明細書で考察される刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる事項も、先行発明であることに基づき又は任意の他の理由で本明細書に記載される本発明者らにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されてはならない。
定義
「投与」、「投与する」及びそれらの変形は、組成物、例えば外因性抗原発現ＥＨＣ、又は薬剤を対象に導入することを意味し、組成物又は薬剤の同時の及び逐次的な導入が含まれる。対象への組成物又は薬剤の導入は、経口、経肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、経直腸、リンパ内、又は局所を含めた任意の好適な経路による。投与には、自己投与及び他人による投与が含まれる。投与経路が好適であれば、組成物又は薬剤はその意図された機能を果たすことができる。例えば、好適な経路が静脈内である場合、対象の静脈中に組成物又は薬剤を導入することによって組成物が投与される。投与は任意の好適な経路によって実施することができる。
「アンカー」又は「アンカードメイン」又は「Ａドメイン」は、融合又はキメラ外因性抗原ポリペプチドを含めた外因性抗原ポリペプチドのうち、ＥＨＣの細胞膜と接触している一部分を指して使用される。外因性抗原ポリペプチドは、リン脂質テール挿入、脂質層構成物との共有結合、イオン結合、水素結合を介するか、或いは脂質細胞膜層の１つ以上を通過する１回又は複数回膜貫通ポリペプチドドメインを介して脂質細胞膜層と相互作用し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、天然か、それとも一部若しくは全てが合成的に産生されるかに関わらず、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質も含む。これらのタンパク質は天然の供給源に由来してもよく、又は一部若しくは全てが合成的に産生されてもよい。「抗体」には、抗原に特異的に結合してそれを認識する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチド又はその断片がさらに含まれる。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含み、さらに、一本鎖抗体、ヒト化抗体；マウス抗体；キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片など、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドを含むことが意図される。抗体には、所望の生物学的活性又は機能を呈する限りにおいて二重特異性抗体及び多重特異性抗体が含まれる。
本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、インタクトな免疫グロブリンの断片、及び抗原との特異的結合能を有する抗原結合領域を含むポリペプチドの任意の一部を指す。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片であってもよく、しかしこれらに限定されるものではない。Ｆａｂ断片は１つの抗原結合部位を有し、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、並びに重鎖の第１定常領域ＣＨ１を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と比べて、Ｆａｂ’断片が重鎖ＣＨ１領域のＣ末端にある少なくとも１つのシステイン残基を含む重鎖のヒンジ領域をさらに含む点で異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片のシステイン残基がヒンジ領域でジスルフィド結合によってつなぎ合わされて作製される。Ｆｖ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小抗体断片であり、Ｆｖ断片を作製する組換え技術は当該技術分野において周知されている。二重鎖Ｆｖ断片は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と非共有結合によって連結された構造を有し得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は概して二重鎖Ｆｖ断片にあるような二量体構造を有し、ここでは重鎖可変領域がペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合的に結合しているか、又は重鎖及び軽鎖可変領域がそれらのＣ末端で互いに直接連結している。抗原結合断片はプロテアーゼを使用して得られてもよく（例えば、全抗体がパパインで消化されることによりＦａｂ断片が得られ、及びペプシンで消化されることによりＦ（ａｂ’）２断片が得られる）、及び遺伝子組換え技術によって調製されてもよい。ｄＡｂ断片はＶＨドメインからなる。一本鎖抗体分子は複数の個別分子を含むポリマー、例えば、二量体、三量体又は他のポリマーを含み得る。
「アプリケーター」は、対象につなぐために使用される任意の装置を指す。これには、例えば、針、カニューレ、カテーテル、及びチュービングが含まれる。
「〜と会合する」は、複数の化合物又は分子の間の関係を記載するために使用されるとき、例えば、外因性抗原と標的との間又は外因性抗原発現ＥＨＣと標的との間の任意の相互作用などを包含する。これには、酵素的相互作用、イオン結合、共有結合、非共有結合、水素結合、ロンドン力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、親油性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが含まれる。
「〜に関連する」は、標的、実体、化合物、薬剤、又は分子と、疾患、障害、病態、症状又は表現型との間の関係を記載するために使用されるとき、疾患、障害、病態、症状又は表現型の原因となるか否かに関わらず、因果的関連付け、又は統計的に有意な関連付け、実験的に確立された関連付け、示唆される関連付けを含めた、それらの間に妥当に設けられ得る任意の関連付けである。
「自己免疫障害」は、概して、対象の免疫系が体自体の細胞を攻撃して組織破壊を引き起こす病態である。自己免疫障害は、血液検査、脳脊髄液分析、筋電図（筋機能を計測する）、及び脳の磁気共鳴画像法を用いて診断することができ、しかし血中の自己抗体（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）（又は自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））についての抗体検査が特に有用である。通常、自己免疫疾患にはＩｇＧクラス抗体が関連する。
「結合する」は、化合物又は分子の間、例えば、外因性抗原と標的との間又は外因性抗原発現ＥＨＣと標的との間の、イオン結合、静電相互作用、水素結合、ロンドン力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、親油性相互作用などを含めた共有結合又は非共有結合によって生じる相互作用を表す。
「ポリペプチドの生物学的活性」は、ポリペプチド、例えば外因性抗原ポリペプチドによって生じる任意の分子活性又は表現型（例えば、結合、シグナル伝達、触媒等）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「生物学的試料」は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、及びタンパク質を含めた、対象から単離された生物学的起源の任意のタイプの材料を指す。用語「生物学的試料」には、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体が含まれる。生物学的試料には、例えば、限定はされないが、全血、血漿、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、口腔液、皮膚、脳脊髄液、骨髄、胆汁、毛髪、筋肉生検、臓器組織又は当業者に公知の生物学的起源の他の材料が含まれる。生物学的試料は、例えば内臓器官の生検から、又は癌から得ることができる。生物学的試料は診断若しくは研究用に対象から得ることができ、又は対照として若しくは基礎研究のため、健常対象から得ることができる。
「クリアランス速度」は、本明細書で使用されるとき、例えば、対象の循環系に残る外因性抗原、標的−外因性抗原、又は外因性抗原発現ＥＨＣの量又は濃度を経時的に計測することによって計算される。例えば、第１の試料中に検出される標的の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％が、１時間、５時間、１０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、３週間、４週間、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、２年、３年、４年、又は５年後に採取した第２の試料中になおも検出され得る。クリアランス速度は、或いは単位時間当たり（例えば１日当たり）の実体（例えば、標的／外因性抗原）の数として表されてもよい。クリアランス速度の増加は、未治療の又は健常な好適な対照対象で示された速度を上回る速度である。クリアランス速度の低下は、未治療の又は健常な好適な対照対象で示された速度未満の速度である。この増加又は低下は、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％であってもよく、又は１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍であってもよい。
「開裂する」は、本明細書で使用されるとき、標的、例えばポリペプチド又は核に存在する結合相互作用を分断させるプロセスであって、例えばそれにより、開裂後に互いに分離し得る２つ以上の実体が生じるプロセスである。分離には、例えば、イオン結合、共有結合、極性共有結合、非極性共有結合、又は金属結合を分断させることが関与し得る。開裂がポリペプチド標的に適用されるとき、開裂には、１つ以上のペプチド結合の破壊が関与し得る。開裂が小分子標的に適用されるとき、開裂には、１つ以上の炭素結合又はスルフィド結合の破壊が関与し得る。開裂がヌクレオチド配列に適用されるとき、開裂には、１つ以上のリン酸ジエステル結合の破壊が関与し得る。開裂が微生物、例えば、細菌、真菌、又はウイルスに適用されるとき、開裂には、膜又はカプシド構造の溶解が関与し得る。開裂は、酵素、例えば触媒活性外因性抗原ポリペプチドによって行われ得る。外因性抗原は、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、又はプロテアーゼ活性を含み得る。
「対象の循環系」は、本明細書で使用されるとき、血漿及び全ての循環細胞及び分子を含め、ヒトにおいて全血及び任意選択でリンパ系によって占有される、且つあらゆる組織の動脈、静脈、毛細血管、及びリンパ管全体にわたって分布する空間を包含する。「循環濃度」は、循環系として定義される空間にある標的、例えば、細胞、ポリペプチド（抗体、病原性抗原など）、治療剤、小分子、代謝産物又は他の実体、外因性抗原又は外因性抗原発現ＥＨＣの濃度である。特定の実施形態において、濃度は、所与の容積中にある遊離（未結合）実体の数として定義され得る。他の実施形態において、濃度は、所与の容積中にある実体の総数として定義され得る。
本明細書で使用される用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の可変領域に見られるアミノ酸配列を指す。ＣＤＲは抗体の特異性を決定し、抗原の特定のエピトープに結合するための接触残基を提供し得る。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３、並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）を含み得る。ＣＤＲと比べてより高度に保存されたアミノ酸配列を有する４つのフレームワーク領域が、ＶＨ又はＶＬにおいてＣＤＲ領域を分けている。
「複合体」は、本明細書で使用されるとき、２つ以上の実体が結び付いたものを含む。複合体は、１つ以上のポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、無機化合物、有機化合物などを含み得る。複合体は機能性（マルチユニットポリペプチド）又は非機能性（例えば、凝集物又は沈殿物）であってもよく、有益又は有害な特性を有し得る（例えば、免疫複合体）。複合体は天然に存在するものであってもよく、又は人工若しくは合成のものであってもよい。合成複合体には、それが合成化合物又は分子を含む場合には、高次の実体、例えば細胞内構造及び細胞が含まれる。
アミノ酸配列に関して、コード配列における単一のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を改変するか、付加するか、又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、改変が化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらす場合に「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者であれば認識するであろう。本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の群の各々の範囲内におけるアミノ酸間の置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びスレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リジン、アルギニン及びヒスチジン。
「低下する」は、治療される疾患、障害又は病態の症状との関連では、症状として現れる疾患又は病態に関連する計測可能又は伝達可能なパラメータの減少を指す。計測可能なパラメータの例は、対象の体温の減少、対象から採取された試料中の標的濃度の減少、炎症の強度又は炎症範囲のサイズの減少、浸潤細胞数の減少、疾患、障害又は病態に関連するエピソード数の減少、臓器サイズの増加／低下、体重増加／減少等である。伝達可能なパラメータの例は、例えば、対象によるウェルビーイング及びクオリティオブライフの自己評価である。例えば、自己抗体媒介性疾患について、低下は以下のパラメータの１つ、又はそれらの組み合わせとして定量化され得る：炎症減少、突然の再発の減少、疲労減少、血液凝固減少、腫脹減少、エネルギー増加、又は発毛増加等。定量化され得るパラメータは、治療下の特定の疾患、障害又は病態を評価するのに適切なものである。遅延は、治療される疾患、障害又は病態の症状との関連では、本来増悪するようになり得る管理可能な健康状態を治療を用いて大幅に延長することを指す。
「分解する」は、標的が直接、或いは間接的に、減少し、不活性化され、分割され、解体され、溶解され、溶け、壊れ、少なくなり、損なわれ、弱まり、劣化し、小さくなり、又は分配されるプロセスとして定義される。
「異なるポリペプチド由来」は、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、ポリペプチド、又はその一部分の供給源となる生物又は種を指す。特定の実施形態において、異なるポリペプチド由来のポリペプチドを含む融合物は、ヒトアデノシンデアミナーゼの遺伝子配列及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のフェニルアラニンヒドロキシラーゼの遺伝子配列によってコードされる外因性抗原ポリペプチドを含み得る。
「ドメイン」は、ポリペプチド、例えば外因性抗原ポリペプチドのうちの、概して三次元構造を有し、且つ個別的な活性、機能、例えば、触媒的、酵素的、構造的役割、又は結合機能を呈し得る一部である。
「濃厚細胞集団」とは、実質的に特定の目的細胞を含む細胞の集団を意味する。濃厚集団では、集団中の細胞の５０％以上、例えば、集団中の細胞の５０％、６０％、７０％、通例では８０％、８５％、９０％、より通例では９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、ときには１００％が目的細胞である。細胞の複合混合物又は不均一培養物からの目的細胞の分離は、当該技術分野において公知の任意の好都合な手段、例えば、アフィニティー試薬でコーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、又は固体マトリックス、例えばプレートに付着させたアフィニティー試薬による「パニング」などのアフィニティー分離技術、又は他の好都合な技術によって行われ得る。正確な分離を提供する他の技術としては、マルチカラーチャネル、小角及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等、精巧さの程度が様々であり得る蛍光活性化セルソーターが挙げられる。細胞は、死細胞に関連する色素を用いることにより、死細胞に対して選択され得る。所望の細胞の生存能に過度に有害でない任意の技術が用いられ得る。
「除核」は、核の不活性化又は除去のいずれかによって細胞を非複製状態にすることである。
「エピトープ」は、抗体又は他のリガンド又は結合分子が結合する抗原上の任意のセグメントを含む。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有し得る。一部の実施形態において、外因性抗原は特定のエピトープを含む。一部の実施形態において、標的は特定のエピトープを含む。
「赤血球系細胞」は、本明細書で使用されるとき、有核赤血球、赤血球前駆体、及び除核赤血球並びに表Ａ１に列挙されるものを含む。例えば、赤血球系細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、骨髄球系共通前駆（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー形成細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤芽球系前駆（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、網赤血球、赤血球、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、赤血球系細胞は不死細胞又は不死化細胞である。例えば、不死化赤芽球細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞のレトロウイルス形質導入によりＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現させ、及びＴＰ５３を抑制することにより作成し得る（例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３，ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３に記載されるとおり）。加えて、細胞は自己使用が意図され、又は同種血輸血源を提供し得る。赤血球系細胞を外因性抗原と接触させることにより外因性抗原発現ＥＨＣを作成することができる。外因性抗原を含む赤血球系細胞は、外因性抗原発現ＥＨＣの一例である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は培養される。一部の実施形態では、赤血球系前駆細胞を外因性抗原と接触させることにより外因性抗原発現ＥＨＣが作成される。
本明細書で使用されるとき、用語「血小板系細胞」は、例えば巨核球及び血小板を含めた幹細胞−巨核球−血小板系統の細胞、又はトロンボポエチンによって分化が誘導される細胞、又はこの系統に関連する表面マーカー、例えば、ＣＤ４１（ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂ）、及びＣＤ６１（ａｖｂ３、ビトロネクチン受容体）、ＰＡＣ−１（活性化ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）及びＣＤ６３を発現する細胞を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「除核造血細胞」（ＥＨＣ）は、本明細書に定義するとおり除核されるか又は除核された状態にされているヒト又は非ヒト造血細胞を指す。この定義は、本明細書に定義するとおりの「赤血球系細胞」及び「血小板系細胞」の両方を包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに促進するため医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及び各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、抗凝固薬、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
用語「外因性」は、本明細書で使用されるとき、天然では細胞内に見られない炭水化物、多糖、脂質、オリゴヌクレオチド又はポリペプチドによって生じる細胞成分又は機能、或いは例えば外因性ポリペプチド抗原と内因性タンパク質又はその機能断片とを含む融合タンパク質を含めた、細胞にとって内因性の細胞成分又は機能の増強又は操作を意味する。外因性抗原は、外因性抗原ポリペプチドを含め、「外因性」又は「異種」であり、従って外因性抗原は、異なるポリペプチド又は種由来のドメインを含む融合物又はキメラなど、天然に存在しないものであり得るか、非修飾赤血球又は血小板など、天然に存在する細胞中に天然に存在しないものであり得るか、天然に存在するポリペプチドが機能するのと同じようには機能しないものであり得るか、或いは、例えば非修飾細胞における天然に存在するポリペプチドの発現と比較したとき外因性抗原が過剰発現する実施形態において、外因性抗原ポリペプチドが存在する量では天然に存在しないものであり得る。一部の実施形態において、ポリペプチド外因性抗原は外因性核酸から発現する。一部の実施形態において、外因性抗原は供給源から単離され、外因性抗原発現ＥＨＣに負荷されるか、又はそれとコンジュゲートされる。用語「外因性」は、核酸との関連で使用されるとき、トランス遺伝子及び組換え核酸を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「発現」又は「発現する」は、転写及び翻訳を含めた、ポリペプチド、例えば外因性抗原ポリペプチドが産生されるプロセスを指す。発現は、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、遺伝子の転写を（遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くなどして）増加させること、遺伝子の翻訳を増加させること、競合遺伝子をノックアウトすること、又はこれらの組み合わせ及び／又は他の手法を含め、幾つかの手法によって増加させ得る。用語「発現」又は「発現する」にはまた、一度ＥＨＣによって活性に発現されたが、それ以降、活性発現（転写及び翻訳として定義される）が止んでいる外因性ポリペプチドを含むＥＨＣも含まれる。例えば、外因性抗原ポリペプチドは、除核イベントの前にＥＨＣによって活性に発現した（即ち転写及び翻訳された）と共に、除核後も抗原ポリペプチドがＥＨＣによって保持されているが、例えばコード核酸を欠くため、もはや活性に発現することはない。例えば、ＥＨＣは、外因性核酸によってコードされる外因性抗原ポリペプチドを含み得る。除核中、外因性抗原ポリペプチドはＥＨＣによって保持され、一方、外因性核酸は保持されず、かかるＥＨＣは、抗原ポリペプチドの活性発現（転写及び翻訳）が事実上終了し、及び／又はＥＨＣが実質的な量の複製核酸を含まない場合であっても、「抗原発現の」又は「抗原を発現する」と言われる。
「機能性」外因性抗原又は外因性抗原発現ＥＨＣは、酵素活性、触媒活性又は代謝活性、構造的完全性、免疫原性の補完性、標的結合、及び正しい局在化を含めた所望の又は指定の活性又は特性を呈するか、或いは所望の又は指定の効果又は表現型を促進する能力を有する。
「融合物又はキメラ」は、天然では一緒に見られることのない２つ以上の配列の組み合わせから誘導されるポリペプチド配列、又は対応するコードヌクレオチド配列である。これは、同じゲノム内の別個の遺伝子に由来するか、又は明確に異なる種のゲノムに由来する異種遺伝子に由来する別個の配列の組み合わせであり得る。
「遺伝物質」は、遺伝子をコードする能力を有するアデノシン、チミン、ウラシル、シトシン、及びグアニンのヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される用語「重鎖」は、抗原に対する特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＨ）と、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する定常領域とを含む完全長重鎖、及びその断片を含むものと理解される。加えて、本明細書で使用される用語「軽鎖」は、抗原に対する特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＬ）と定常領域（ＣＬ）とを含む完全長軽鎖、及びその断片を含むものと理解される。
用語「相同体」は、その一次、二次又は三次構造において対応する位置に同じ又は保存された残基を有する外因性抗原ポリペプチドを含めたポリペプチドを示す。機能的相同体には、同様の機能及び／又は（例えば特定の標的に対する）特異性を呈する外因性抗原及び他のポリペプチドが含まれる。
天然に存在するインタクトな抗体、又は免疫グロブリンは、４つのポリペプチド、即ち２つの完全長軽鎖及び２つの完全長重鎖を含み、ここで各軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖と連結している。各重鎖は定常領域と可変領域とを有する。同様に、各軽鎖が定常領域と可変領域とを有する。５つの重鎖クラス（アイソタイプ）、即ちガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、又はイプシロン（ε）があり、さらに幾つかのサブクラス、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）がある。軽鎖定常領域はカッパ（κ）型又はラムダ（λ）型のいずれかであり得る。可変領域は抗体間で配列が異なり、所与の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられる。
本明細書で使用されるとき、用語「増加させる」、「増強する」、「刺激する」、及び／又は「誘導する」（及び類似の用語）は、概して、天然、予想、若しくは平均と比べて、又は対照条件と比べて濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を直接的又は間接的に改善するか、又は増加させる行為を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「阻害する」、「抑制する」、「低下させる」、「妨害する」、及び／又は「低減する」（及び類似の用語）は、概して、天然、予想、若しくは平均と比べて、又は対照条件と比べて濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を直接、或いは間接的に低減する行為を指す。
「ライブラリ」は、本明細書で使用されるとき、多様な核酸配列を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のコレクション、遺伝的に多様なクローンコレクション、多様なポリペプチドのコレクション、ＥＨＣなどの細胞の多様なコレクション等を含む。
本明細書で使用されるとき、「哺乳類対象」には、あらゆる哺乳動物、例えば限定されることなく、ヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコなど）、農業動物（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が含まれる。用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書では同義的に使用され、診断、処置、又は治療が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される方法はヒト治療及び獣医学適用の両方に適用可能である。一部の実施形態において、対象は哺乳動物であり、他の実施形態では対象はヒトである。
「医療器具」は、所定用量の外因性抗原発現ＥＨＣ及び／又は治療剤の送達に用いられる任意の装置、器具又は機械を指す。これには、容器、ボトル、バイアル、シリンジ、バッグ、カートリッジ、カセット、マガジン、シリンダ、又はキャニスターが含まれる。
「医療用キット」は、医療器具又はアプリケーター、任意選択で治療剤を含む外因性抗原発現ＥＨＣの適切な投薬量、並びに関連する表示及び説明書を含む包装されたユニットを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「モジュレートする」、「モジュレートしている」、「修飾する」、及び／又は「モジュレーター」は、概して、特定の濃度、レベル、発現、機能又は挙動を増加又は低下により、例えば、直接又は間接的に促進／刺激／上方制御するか、又は妨害／阻害／下方制御することにより改変する能力、例えば拮抗薬又は作動薬として作用する能力を指す。場合によっては、モジュレーターは、対照と比べて、又は一般に予想され得る平均活性レベルと比べて、又は対照活性レベルと比べて特定の濃度、レベル、活性又は機能を増加及び／又は低下させ得る。
「膜」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の生物学的化合物、典型的には脂質と、任意選択でポリペプチドとを含む、内部空間を外部空間と分ける境界層である。膜は脂質二重層であってもよい。特定の実施形態において、膜は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸の１つ以上を含む。一部の実施形態において、膜は、アンキリン及び補酵素Ｑ１０などの１つ以上のポリペプチドを含む。膜の定義には、例えばリン脂質二重層及び細胞膜結合ポリペプチドを含む細胞膜が含まれる。
語句「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを指す。核酸分子には、組換えであってもよい、且つ核酸が細胞に導入されたときにそこから外因性ポリペプチドが発現し得る染色体ＤＮＡ及び自己複製プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が含まれる。
オルソログは、共通の先祖遺伝子から種分化によって進化した異なる種の遺伝子として定義される。
用語「薬学的に許容可能な」及びその文法上の変化形は、組成物の投与が禁忌となり得る程の望ましくない生理学的作用を生じることのない、対象に対して又は対象上に投与可能な組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す。例えば、「薬学的に許容可能な賦形剤」には、概して安全で非毒性の、且つ望ましい医薬組成物の調製において有用な賦形剤が含まれ、及び動物への使用並びにヒト医薬品への使用が許容される賦形剤が含まれる。かかる賦形剤は、固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション、例えば油／水又は水／油、及び各種の湿潤剤などの任意の標準医薬担体を含む。この用語はまた、ヒトを含む動物での使用に関して米国連邦政府の規制当局によって承認されているか又は米国薬局方に掲載されている任意の薬剤、並びに対象に重大な刺激作用を引き起こさず、且つ投与化合物の生物学的活性及び特性を消失させることのない任意の担体又は希釈剤も包含する。
一部の薬剤は、例えば無機酸及び有機酸から調製される「薬学的に許容可能な塩」として投与され得る。無機酸から誘導される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。塩はまた、無機塩基及び有機塩基から調製することもできる。無機塩基から誘導される塩には、単に例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、限定はされないが、第一級、第二級及び第三級アミンの塩が含まれる。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、本発明の実施に適した薬学的に許容可能な担体、その薬学的に許容可能な塩をどのように選択するべきかは分かるであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、例えば、１つ以上の他の化学成分、例えば生理学的に許容可能な担体及び賦形剤と混合されるか若しくは混ぜ合わされるか、又はそれに懸濁される外因性抗原発現ＥＨＣなどの、本明細書に記載される化合物の１つ以上を指す。医薬組成物の１つの目的は、対象への化合物の投与を促進することである。
特定の実施形態は、所望の機能又は活性に関連する配列を有する様々なポリペプチド分子、例えば外因性抗原ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、リン酸化又はグリコシル化）及び／又はさらなるポリペプチドとの複合体形成、核酸及び／又は炭水化物、又は他の分子とのマルチサブユニット複合体への合成に関わらず、アミノ酸残基の鎖を指す用語である。従ってプロテオグリカンもまた、本明細書ではポリペプチドと称される。特定の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣはポリペプチド外因性抗原を含む。特定の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、任意選択で膜結合性の、１つ以上の非外因性抗原ポリペプチドを含む。
用語「薬学的に活性な薬剤」又は「医薬品」は、対象への投与時に対象に対して計測可能又は伝達可能な効果を有する任意の化合物、例えば、小分子薬物、又は生物製剤（例えば、ポリペプチド薬物又は核酸薬物）として定義され、例えばそれは、疾患、障害又は病態の症状を緩和又は軽減する。一部の実施形態において、医薬品は外因性抗原発現ＥＨＣの送達前に、その送達と組み合わせて、又はその送達後に投与され得る。一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は外因性抗原発現ＥＨＣとの相乗的治療効果を及ぼす。一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は外因性抗原発現ＥＨＣとの相加的治療効果を及ぼす。
「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸の転写を指図する一連の核酸制御配列として定義される。プロモーターには転写開始部位近傍の必須核酸配列が含まれる。プロモーターにはまた、任意選択で、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも含まれる。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境及び発生条件下で活性を有するプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は発生調節下で活性を有するプロモーターである。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモーター、又は一連の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列との間の機能的連結を指し、ここで発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指図する。
「外因性抗原」は、本明細書で使用されるとき、標的との相互作用能を有して、例えば標的と会合するか、又はそれに結合する実体である。外因性抗原はポリペプチドを含むか、又は本質的にポリペプチドからなり得る。一部の実施形態において、外因性抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、小分子、又はそれらの組み合わせを含む。外因性抗原が天然に存在する化合物又は分子である実施形態において、その抗原は、ＥＨＣにおけるその存在に関してそれが外因性又は異種化合物又は分子であるという意味において「外因性」である。他の実施形態では、抗原は、それが人工化合物又は分子、例えば融合物又はキメラ、天然に存在しないポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、又はそれらの組み合わせ、又は人工小分子又は他の治療剤であるという意味において「外因性」である。例えば、外因性抗原は、Ｓドメイン、Ａドメイン及びＵドメインのうちの１つ以上を含む融合物又はキメラを含み得る。Ｓドメインは、対象の循環系など、ＥＨＣの周りの環境に露出した表面ドメインである。Ａドメインは、ＳドメインをＥＨＣの細胞膜に取り付けるアンカードメインである。ＵドメインはＥＨＣの非露出側に向いているか、又はその中（即ちその細胞内空間）に位置している。いかなるドメインとも無関係に、外因性抗原は外因性抗原発現ＥＨＣの表面上に位置してもよく、又はＥＨＣ内に位置してもよい。外因性抗原は外因性抗原発現ＥＨＣの膜と会合してもよく、例えば外因性抗原は膜にアンカリングするか、コンジュゲートするか、又は他の方法で結合する。一部の実施形態において、外因性抗原は化学的又は酵素的コンジュゲーションによって外因性抗原発現ＥＨＣの膜にコンジュゲートし得る。他の実施形態において、外因性抗原は膜にコンジュゲートしない。一部の実施形態において、外因性抗原は外因性抗原発現ＥＨＣの膜と会合せず、ＥＨＣの膜に囲まれた細胞内空間内に位置する。一部の実施形態において、ＥＨＣの細胞内空間内に位置する外因性抗原は実質的にＥＨＣから拡散して出ることはなく、及び／又は膜を透過しないこともある。他の実施形態において、外因性抗原は実質的にＥＨＣから拡散して出ることもあり、及び／又は膜を透過することもある。一部の実施形態において、外因性抗原はＥＨＣに負荷され、例えばそれに導入されるか、又はそこに置かれる。負荷される外因性抗原は外因性抗原発現ＥＨＣによって生物学的に合成されるものではない。負荷に好適な外因性抗原は、例えば、細胞ベースの発現系において産生されるか、生物学的試料から単離されるか、又は化学的若しくは酵素的に合成され、次にＥＨＣ内に、又はその上に負荷され得る。一部の実施形態において、外因性抗原は負荷後に外因性抗原発現ＥＨＣによってさらに修飾され得る。他の実施形態において、外因性抗原は負荷後に修飾されない。一部の実施形態において、外因性抗原ポリペプチドはＥＨＣ上又はその中に負荷されない。一部の実施形態において、外因性抗原は外因性抗原発現ＥＨＣによって作られ、例えば生物学的に合成される。典型的には、外因性抗原ポリペプチドは、ＥＨＣに導入された外因性核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）から外因性抗原発現ＥＨＣによって発現される。外因性抗原は、ＥＨＣ上で抗原が発現したときにも保持される生物学的機能を有し得る。外因性抗原は標的に結合し、及び／又は標的を隔絶し得る。それに代えて又は加えて、外因性抗原は標的に対して触媒活性を呈してもよく、例えば外因性抗原は標的を変換若しくは修飾してもよく、又は標的を分解してもよい。次には任意選択で外因性抗原から産物が放出され得る。
外因性抗原発現ＥＨＣの「滞留性」は、それが生理学的位置で費やす期間を指す。外因性抗原発現ＥＨＣの具体的な位置は、その寿命中に変化することもあり、「滞留性」は、血管循環、末梢組織、毛細血管、消化器系、肺系統、鼻組織、表皮表面、及び間質組織を含めた様々な環境で費やされる期間に適用される。具体的な実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは対象の循環系に滞留する。
「複製核酸」は、ＤＮＡのコピー数を増加させることに特化した酵素によってコピーされることが可能なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指す。通常、ＤＮＡ複製は、１つの元のＤＮＡ分子から２つの同一の複製物の産生をもたらす。ＤＮＡ複製は、鋳型鎖に適合するＤＮＡポリメラーゼによってリン酸ジエステル結合の作成を介して成長するＤＮＡ鎖にヌクレオチドが１つずつ取り込まれることを含む。
「隔絶する」は、標的を閉じ込めること、塞ぐこと、分離すること、隔離すること、隠すこと、遮断すること、又は孤立させること、及び標的がその環境と自由に相互作用するのを阻止することとして定義される。
「特異的に結合する」又は「特異的に相互作用する」は、本明細書で使用されるとき、これらの用語が化学及び生化学技術分野の当業者によって理解されるとおり、可飽和であり、多くの場合に可逆的であり、従って競合的である、２つの実体（例えば、標的と外因性抗原、例えば、抗体と抗原、受容体とリガンド、酵素と基質、ビオチンとアビジン等）の間の任意の相互作用を記載する。例えば、生体分子、例えばタンパク質、ペプチド及び核酸などが関与する特異的結合は、結合対の一方のメンバーが、その部位とのコグネイトリガンドの相互作用が有利なエネルギー論（即ち、負の結合自由エネルギー）によって特徴付けられるような荷電、極性、又は疎水性部分の形状及び分布を備える部位を有するときに起こる。相互作用の特異性は結合定数（Ｋｄ）として計測又は表現され得る。Ｋｄは、ｐＭ範囲、μＭ範囲及びｎＭ範囲を含め、ｍＭ範囲〜ｆＭ範囲の範囲であってもよい。典型的なＫｄ値は、約１０−６Ｍ未満、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満、及び一部の実施形態では約１０−９Ｍ未満である。
本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」又は「実質的な」は、例えば、特定の空間にある実体の存在、レベル、又は濃度、１つの実体がもう１つの実体に及ぼす効果、又は治療の効果を指す。例えば、実体の活性、レベル又は濃度は、増加がベースラインと比べて２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、又は１０００倍である場合に実質的に増加する。実体の活性、レベル又は濃度はまた、増加がベースラインと比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、又は５００％である場合に実質的に増加する。実体は、それを当該技術分野において公知の方法によって検出することができる場合に特定の空間に実質的に存在し得る。実体は、それが当該技術分野において公知のアッセイ及び方法の検出限界未満のレベルで存在する場合、特定の空間に実質的に存在しないとし得る。一部の実施形態において、実体は、それがほとんど検出不能であるが、表現型を生じさせたり又はそれを変化させたりすることのない非機能的な量又は微量であれば検出可能である場合、特定の空間に実質的に存在しないとし得る。他の実施形態において、実体は、それが集団を構成する構成成分の少数、例えば、集団の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満又は１％、０．５％、０．１％未満の構成成分のみに存在し、検出することができる場合、特定の集団に実質的に存在しないとし得る。例えば、外因性核酸は除核時に保持されないこともあり、細胞が非複製にされ、及び除核細胞は、その外因性核酸によってコードされる外因性抗原ポリペプチドを継続的に発現する能力を有しない。細胞が外因性ポリペプチドを有意に翻訳し続ける能力を失うと、タンパク質発現は「事実上終結する」。特定の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは、実質的に自己複製能、例えば核酸の複製能を有しない。例えば、外因性抗原発現ＥＨＣは、取込みアッセイで標識ヌクレオシド、例えばチミジンと接触させた場合に実質的にヌクレオシドを取り込まない。一部の実施形態において、外因性抗原発現ＥＨＣは実質的な量の自己複製核酸を含まない。ポリヌクレオチド又は核酸配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも２５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。或いは、同一性パーセントは２５％〜１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態は、本明細書に記載されるプログラム、好ましくは標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴを使用して参照配列と比較して少なくとも：２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を含む。
「合成」は、人工の、或いは天然に存在しない化合物又は分子、又はそれが天然に存在する場合、自然には存在しないコンテクスト又は位置に置かれているか、又はそれがそのコンテクスト又は位置に自然に存在する場合、自然にはそのコンテクスト又は位置に存在しない純度状態であるか、又はそのような量、濃度又は数で存在する化合物又は分子を指す。合成実体は、任意選択でその自然状態から化学的又は酵素的に修飾されている単離又は精製化合物、外因性核酸、外因性（異種）外因性抗原などであってもよい。本明細書に定義するとおりの、任意の実体における合成化合物又は分子の存在は、実体全体を「合成」にする。例えば、外因性抗原を含む細胞は、合成細胞である。
「標的」は、本明細書で使用されるとき、外因性抗原との相互作用能を有して、例えば外因性抗原と会合するか、又はそれに結合する実体である。「標的」には、限定はされないが、ポリペプチド（例えば、抗体又は抗体関連ポリペプチド、補体構成成分、アミロイドタンパク質、病原体、毒素、プリオン）、分子（例えば、代謝産物、ステロイド、ホルモン、炭水化物；オリゴ糖；化学物質；多糖、ＤＮＡ；ＲＮＡ；脂質、アミノ酸、エレメント、毒素又は病原体）、複合体（例えば、免疫複合体）、又は細胞（例えば、癌細胞、マクロファージ、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫）が含まれる。標的は、本明細書に提供される方法によって検出されるか、診断されるか、損なわれるか、破壊されるか、又は改変される（例えば、機能的に補完される）ことが意図される。特定の標的は遊離して存在してもよく、又は対象の循環系における他の実体と会合している。
「標的自己抗体」は、本明細書で使用されるとき、自己免疫疾患に関連する自己抗体である。かかる自己抗体は、対象の抗体を対象自体の組織、通常は甲状腺、胃、肝臓、及び腎臓組織の試料と接触させることを含む抗体結合試験を用いて検出及び分析され得る。「自己」組織（自己抗原を含む）に結合する抗体は、自己免疫障害の指標である。
「トランス遺伝子」又は「外因性核酸」は、ＥＨＣに導入される外来性又は天然ヌクレオチド配列を指す。トランス遺伝子と外因性核酸とは本明細書では同義的に使用され、組換え核酸を包含する。
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療している」、及び／又は「治療」は、有益な又は所望の臨床結果、薬理的及び／又は生理的効果、例えば、症状の緩和を達成し、前記症状を予防又は解消するための手法であり、特定の疾患、障害又は病態の療法的治療及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療の両方を指す。有益な又は所望の臨床結果、薬理的及び／又は生理的効果としては、限定はされないが、疾患、障害又は病態に罹り易いこともあるが、未だ疾患の症状を起こしていない又は呈していない対象における疾患、障害又は病態の発生の防止（予防的治療）、疾患、障害又は病態の症状の緩和、疾患、障害又は病態の程度の縮小、疾患、障害又は病態の安定化（即ち、悪化させないこと）、疾患、障害又は病態が広がることの防止、疾患、障害又は病態の進行の遅延又は緩徐化、疾患、障害又は病態の改善又は寛解、及びそれらの組み合わせ、並びに治療を受けない場合の予想生存時間と比較した生存時間の延長が挙げられる。
「治療剤」又は「治療用分子」は、化合物又は分子であって、有効量で存在するとき、それを必要としている対象に所望の治療効果、薬理的及び／又は生理的効果を生じる化合物又は分子を含む。
用語「治療有効量」又は「有効量」は、有益な又は所望の臨床結果、薬理的及び／又は生理的効果を生じさせるのに十分である、対象に投与される薬剤の量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。有効量は、典型的には、病状の進行を緩和するか、改善するか、安定化させるか、逆転させるか、緩徐化するか、又は遅延させるのに十分である。従って有効量とは、所望の治療的及び／又は予防的効果を妥当に実現するのに十分な薬剤の量又は薬剤の特定の量の投与頻度を指す。例えば、有効量は、治療下の疾患又は病態、例えば、免疫トレランスが望ましい自己免疫反応、過活性の免疫活性化、又は阻害抗体産生に関連する疾患又は医学的状態、又は標的ポリペプチドに関連する疾患又は医学的病態に関連する症状の予防、治療、又は低下をもたらす量を含み得る。対象に投与される治療組成物の量は、疾患のタイプ及び重症度並びに個体の特徴、例えば、全般的な健康、病状、食事、年齢、性別、体重及び薬物に対する忍容性に依存し得る。その量はまた、疾患の程度、重症度及びタイプにも依存し得る。さらに、有効量は、用いられる製剤化及び投与方法、例えば、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感受性に依存し得る。当業者は、これら及び他の要因に応じて適切な投薬量を決定することができるであろう。組成物はまた、１つ以上のさらなる治療化合物と組み合わせて投与することもできる。医薬組成物の望ましい投薬量は、成人について約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。一例において、静脈内投与は最低限有効な用量で開始し、好ましい効果が観察されるまで、予め選択された時間経過にわたり用量を増加させる。続いて、現れ得る任意の有害作用を考慮しながら、対応する効果の増加が生じるレベルに限定して投薬量を漸増させる。好適な投薬量の非限定的な例は、例えば、１×１０１０〜１×１０１４、１×１０１１〜１×１０１３、又は５×１０１１〜５×１０１２個の本発明の外因性抗原発現ＥＨＣの範囲であり得る。具体的な例としては、約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２個、又はそれを超える本発明の外因性抗原発現ＥＨＣが挙げられる。外因性抗原発現ＥＨＣの各用量は、１日１回、週１回、週２回、月１回、又は月２回などの間隔で投与することができる。
「未結合」は、外因性抗原が相互作用することが可能な標的の状態を指す。未結合標的は、別の実体又は外因性抗原と会合していない。未結合外因性抗原は別の実体又は標的と会合していない。標的は、それが外因性抗原又は別の実体と会合した時点で「結合している」と見なされる。未結合標的は、循環中の可溶性形態の標的を含む。結合標的は、循環又は末梢組織中の実体に埋め込まれるか、それと会合するか、それに連結するか、又は他にそれと相互作用している標的を含む。標的が相互作用し得る実体には、循環細胞、末梢内皮組織、免疫複合体、糖脂質、微生物、免疫グロブリン、血清アルブミン、凝固因子、リポタンパク質、及び電解質が含まれる。
「変異体」は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は他の修飾だけ元のタンパク質と異なるポリペプチドである。これらの修飾は、元のタンパク質の生物学的活性を大きく変化させることはない。多くの場合に、変異体は元のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％を保持している。変異体の生物学的活性はまた、元のタンパク質より高くてもよい。変異体は、アレル変異又は多型などによる天然に存在するものであってもよく、又は意図的に操作されてもよい。
変異体のアミノ酸配列は元のタンパク質と実質的に同一である。多くの実施形態において、変異体は元のタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれを超える大域的配列同一性又は類似性を共有する。配列同一性又は類似性は、ベーシックローカルアラインメントツール（ＢＬＡＳＴ）、ドットマトリクス解析、又は動的計画法などの、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて決定することができる。一例において、配列同一性又は類似性は、ジェネティクスコンピュータグループ（ＧＣＧ）プログラムＧＡＰ（ニードルマン−ブンシュアルゴリズム）を使用して決定される。変異体及び元のタンパク質のアミノ酸配列は１つ以上の範囲で実質的に同一であり、しかし他の領域では相違があり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、挿入された核酸分子、例えばトランス遺伝子又は外因性核酸を宿主細胞に及び／又はそれらの間で移動させ及び／又は複製する核酸分子、好ましくは自己複製核酸分子である。ベクターには、そのゲノムに組換えＤＮＡの断片が挿入された、且つＥＨＣへの組換えＤＮＡ又はトランス遺伝子の導入に用いられるプラスミド又はウイルス染色体が含まれる。
以下の例は限定としてではなく、例示として提供される。
実施例１：異種遺伝子発現を有する赤血球系細胞の培養
Ｍｉｎｉ−ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；９４％±３％純度）の使用による超磁気マイクロビーズ選択法により、末梢血からＣＤ３４細胞を単離する。細胞は、安定化グルタミン、３３０ｕｇ／ｍＬホロヒトトランスフェリン、１０ｕｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン、２ＩＵ／ｍＬヘパリン、及び５％溶剤／界面活性剤ウイルス不活化血漿を補充したＩＭＤＭをベースとする赤血球分化培地（ＥＤＭ）で培養する。拡大手順には３つのステップが含まれる。第１のステップでは（０日目〜７日目）、ＥＤＭ中、１ｕＭヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３、及び３ＩＵ／ｍＬ Ｅｐｏの存在下で１０４個／ｍＬのＣＤ３４細胞を培養する。４日目に、ＳＣＦ、ＩＬ−３、Ｅｐｏ、及びヒドロコルチゾンを含有する４容積の新鮮培地中に１容積の細胞培養物を希釈する。第２のステップでは（７日目〜１１日目）、ＳＣＦ及びＥｐｏを補充したＥＤＭ中に１０５個／ｍＬで細胞を再懸濁する。第３のステップでは（１１日目〜１８日目）、Ｅｐｏのみを補充したＥＤＭ中で細胞を培養する。細胞数は１１日目及び１５日目にそれぞれ７．５×１０５〜１×１０６及び５〜１０×１０６細胞／ｍＬとなるように調整する。１８日目を過ぎたら、Ｅｐｏを含有する培養培地を週２回取り替える。培養物は５％ＣＯ２の空気中３７℃に維持する。
目的の抗原のコード配列を赤血球特異的プロモーター、例えばＧＡＴＡ−１の制御下に置き、ポリ−Ａテールを終端とする（例えば、Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１４０：２３０を参照）。この配列はレンチウイルスベクター（例えばＥＦ１、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）にコードされる。このベクターは２９３Ｔ細胞から標準方法によって作製する。レンチウイルスベクターは、例えばＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６，２４：１０１７により記載されるとおり、培養１〜４日目の間にヒト造血前駆細胞、例えばＣＤ３４＋細胞又は不死化赤芽球又はｉＰＳ細胞に形質導入する。続く拡大及び分化段階は上記に記載したとおり行う。
実施例２：低張／高張サイクルによる赤血球系細胞へのタンパク質の負荷
抗原、この場合ＯＶＡを、７０％のヘマトクリット（Ｈｃｔ）として０．５又は５ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＲＢＣ懸濁液に加える。低張透析プロセス（５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）の後、高張液（１９００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）を３７℃で３０分間加えることによりＲＢＣを遊離させる。ＯＶＡが負荷されたＲＢＣを０．９％ＮａＣｌ＋０．２％グルコース溶液で４回洗浄し、１０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、血漿又は緩衝液で５０％のＨｃｔに調整する。
実施例３：ヘテロ二官能性クロスリンカーによる細胞表面標識
５ｍＭ ＴＣＥＰと共にインキュベートすることにより、露出した還元チオール基を有する抗原（抗原−ＳＨ）を調製する。サイズ排除クロマトグラフィーによって還元剤を取り除いた後、コンジュゲーションを行う。細胞をマレイミド−ＰＥＧ−ＮＨＳクロスリンカー、例えばＳＭ（ＰＥＧ）ｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３０分間インキュベートする。ＮＨＳ基が細胞表面抗原上の遊離アミン基と反応する。反応した細胞をＰＢＳ中で洗浄して過剰なクロスリンカーを取り除く。細胞＋クロスリンカー溶液に抗原−ＳＨ溶液を導入し、マレイミド−ＳＨ反応を３０分間進行させる。細胞をペレット化し、洗浄して未結合の抗原を取り除く。
実施例４：ソルターゼによる細胞表面標識
５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２からなる反応緩衝液中において、ソルターゼＡアクセプター配列、ＬＰＸＴＧを含有する表面タンパク質を発現する細胞を１００ｕＭソルターゼＡと共に３７℃で４時間インキュベートする。１０倍モル過剰の求核剤、ＧＧＧ−抗原を導入し、反応を室温で一晩進行させる。この反応後、細胞をペレット化して洗浄することにより、過剰のソルターゼ及び未反応の求核剤を取り除く。
実施例５：クリックケミストリーによる細胞表面標識
製造者の指示に従い（例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、細胞をアルキン−ＮＨＳエステルと反応させて、アルキン基を細胞表面上の露出した第一級アミンとコンジュゲートする。細胞をペレット化して洗浄することにより、過剰なアルキン−ＮＨＳエステルを取り除く。製造者の指示に従い（例えばＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗原をアジド−ＮＨＳエステルと反応させて、アジド基を抗原上の露出した第一級アミンとコンジュゲートする。サイズ排除クロマトグラフィーによって過剰なアジド−ＮＨＳエステルを取り除く。室温での銅触媒付加環化によってアルキン−細胞及びアジド−抗原を反応させる。
実施例６：マウスにおけるＴ細胞増殖の計測
ＣＤ８磁気ビーズネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示どおり使用して、ＯＴＩ（ＣＤ４５．２＋）マウス脾臓からＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する。新鮮に単離したＣＤ８＋ ＯＴＩ細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、１μＭ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって室温で６分間標識し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する等容積のイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で反応を１分間クエンチする。細胞を洗浄し、カウントし、純粋ＩＭＤＭ中に再懸濁した後、注射する。合計３×１０６個のＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋ ＯＴＩ細胞をレシピエントＣＤ４５．１＋マウスの尾静脈に静脈内注射する。短期増殖研究のため、養子移入２４時間後にＯＶＡを含む赤血球系細胞を注射する。抗原投与５日後に脾細胞を回収し、フローサイトメトリーによる分析用に染色する。
実施例７：マウスにおけるＯＶＡ抗原チャレンジモデル
合計３×１０５個のＣＦＳＥ標識ＯＴＩ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を上記に記載したとおりＣＤ４５．１＋レシピエントマウスに注射する。養子移入の１日後及び６日後、マウスの尾静脈にＯＶＡを含む赤血球系細胞１００μＬを静脈内投与する。養子移入の１５日後、マウスの各後肢足蹠に２５μＬの生理食塩水中５μｇのＯＶＡ及び２５ｎｇの超高純度大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を皮内注射して攻撃誘発する（ホック（Ｈｏｃｋ）法：総用量１０μｇのＯＶＡ及び５０ｎｇのＬＰＳ）。抗原特異的Ｂ及びＴ細胞及び血清抗体力価の定量化は以下に記載する。
実施例８：マウスにおける抗原特異的Ｂ及びＴ細胞の定量化
上記に記載したＯＶＡチャレンジの４日後にマウスを殺処分し、再刺激用に脾臓及び流入領域リンパ節細胞を単離する。細胞内サイトカインのフローサイトメトリー解析のため、１ｍｇ／ｍＬ ＯＶＡ又は１μｇ／ｍＬ ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の存在下で細胞を３時間再刺激する。ブレフェルジン−Ａ（５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を加えて再刺激をさらに３時間再開した後、染色及びフローサイトメトリー解析を行う。分泌された因子のＥＬＩＳＡ計測のため、１００μｇ／ｍＬ ＯＶＡ又は１μｇ／ｍＬ ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの存在下で細胞を４日間再刺激する。細胞をスピンし、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０ Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の指示どおり使用したＥＬＩＳＡ分析用に培地を回収する。
実施例９：循環抗体力価の定量化
ＯＶＡをコーティングしたプレート上で種々の希釈度のマウス血清をインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に最終インキュベーションを行うことにより、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧを検出する。
実施例１０：細胞外ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒトレランス誘導
ケル及びＳｐｙＴａｇのコード配列を含有する発現カセットを合成し、レンチウイルスベクターＥＦ１に挿入する。ＣＤ３４＋細胞の集団をこのベクターで形質転換する。ケル−ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現はＦＡＣＳによって定量化する。次に、ケル−ＳｐｙＴａｇを細胞外発現する細胞を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列及びｃＭｙｃタグと融合したＡｒａ ｈ（１−６）ペプチドの溶液中に置く。インキュベーション後、ＦＡＣｓを使用して細胞を選別し、ケル−ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＡｒａｈＸ−ｃＭｙｃとの共有結合性のイソペプチドコンジュゲーションを定量化する。細胞はまた、低張溶解させて、ケル−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＡｒａｈＸ−ｃＭｙｃの存在をウエスタンブロットによって定量化する。
実施例１１：遺伝子アセンブリ
以下の遺伝子をコードするＤＮＡ−グリコホリンＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０２７２４）、Ｋｅｌｌ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２３２７６）、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体ｓｃＦｖ（Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０（９）：６１７、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＪ５４９５０１．１）、アデノシンデアミナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ００８１３）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１４６７１１．１）、補体受容体１（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１７９２７）、ＣＤ４６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１２２２４．１）、ＣＤ５５（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０８１７４）、ＣＤ５９（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１３９８７）、緑色蛍光タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４２２１２）、チミジンホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１９９７１）、グルコセレブロシダーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０４０６２）、β２グリコプロテイン１（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０２７４９）、ホスホリパーゼａ２受容体（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１３０１８）、コラーゲンα３（ＩＶ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０１９５５）、血清アミロイドＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０２７４３）、リポタンパク質リパーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０６８５８）、アスパラギナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ００８０５）、第ＩＸ因子（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｆ２ＲＭ３５）、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ７６ＬＸ８）−をｃＤＮＡとしてＤｈａｒｍａｃｏｎ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入するか、又はＤＮＡ２．０及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔでデノボ合成した。
１．単一遺伝子クローニング（ＣＲ１）
当該技術分野において公知の標準的な分子生物学的方法によって遺伝子をアセンブルし、発現ベクターにした。補体受容体１（ＣＲ１）の遺伝子は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。このｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した：上流オリゴは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＣＲ１の始端に相同の２５ｎｔとからなった；下流オリゴは、下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＣＲ１の終端に相同の２５ｎｔとからなった。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾−尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるギブソンアセンブリにより、ＣＲ１アンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。
２．２つの遺伝子の融合（膜Ｋｅｌｌ−ｓｃＦｖ）
Ｋｅｌｌの遺伝子はｃＤＮＡとして購入し、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。これらのｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した。Ｋｅｌｌは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ、及びｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。ｓｃＦｖは、Ｋｅｌｌ挿入部位の３’末端に相同の２５ｎｔとｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ、及び下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとｓｃＦｖの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾−尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるワンポットギブソンアセンブリにより、Ｋｅｌｌ及びｓｃＦｖアンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。
３．遺伝子間のリンカーアセンブリ（Ｋｅｌｌ−ｓｃｆｖ）
Ｋｅｌｌの遺伝子はｃＤＮＡとして購入し、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。これらのｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した。Ｋｅｌｌは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及びｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとＫｅｌｌの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。ｓｃＦｖは、Ｋｅｌｌ挿入部位の３’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及び下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとｓｃＦｖの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾−尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるワンポットギブソンアセンブリにより、Ｋｅｌｌ及びｓｃＦｖアンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。
４．エピトープタグの付加（Ｋｅｌｌ−ｓｃＦｖ）
Ｋｅｌｌの遺伝子はｃＤＮＡとして購入し、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。これらのｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した。Ｋｅｌｌは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及びｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとＫｅｌｌの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。ｓｃＦｖは、Ｋｅｌｌ挿入部位の３’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及び下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＨＡエピトープタグをコードする２７ｎｔ配列ｔａｃｃｃｃｔａｔｇａｃｇｔｇｃｃｃｇａｃｔａｔｇｃｃ（配列番号８）とｓｃＦｖの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾−尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化した。下流プライマーには、ＨＡエピトープタグをコードする２７ｎｔ配列ｔａｃｃｃｃｔａｔｇａｃｇｔｇｃｃｃｇａｃｔａｔｇｃｃ（配列番号８）がさらに含まれた。線状化したベクターをＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるワンポットギブソンアセンブリにより、Ｋｅｌｌ及びｓｃＦｖアンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。
５．２つの遺伝子の融合（レポーターアセンブリ）（ＧＰＡ−ＨＡ）
補体受容体１（ＣＲ１）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。このｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＣＲ１遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した：上流オリゴは上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＣＲ１の始端に相同の２５ｎｔとからなった；下流オリゴはウイルス由来のＴ２Ａ配列ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号７）に相同の５４ｎｔからなった。ｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＧＦＰ遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した：上流オリゴは、ウイルス由来のＴ２Ａ配列ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号７）に相同の５４ｎｔとＧＦＰの始端に相同の２５ｎｔとからなった；下流オリゴは、下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＧＦＰの終端に相同の２５ｎｔとからなった。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾−尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるギブソンアセンブリにより、ＣＲ１及びＧＦＰアンプリコンを共に線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。
実施例１２：ｍＲＮＡアセンブリ
標準的な分子生物学的方法を用いて目的の遺伝子をｐＳＰ６４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の多重クローニング部位にクローニングする。ベクターをＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で消化して、ＳＰ６プロモーターと目的の遺伝子と３０ヌクレオチド長のポリＡテールとを含む線状化ｄｓＤＮＡベクターを作成する。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との反応によって、キャップ付加ｍＲＮＡ転写物を合成するための５’キャップ類似体（ＡＲＣＡ）の推奨濃度を含めて製造者の指示に従いｍＲＮＡを合成する。次に反応混合物をＤＮアーゼで処理して鋳型ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａのリボプローブ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ））を消化し、ＥＺＮＡ ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｏｍｅｇａ）を使用してｍＲＮＡを精製する。
実施例１３：細胞培養
１．ヒト赤血球（ＲＢＣ）
Ｍｉｎｉ−ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；９４％±３％純度）の使用による超磁気マイクロビーズ選択法により、末梢血からＣＤ３４細胞を単離する。細胞は、安定化グルタミン、３３０μｇ／ｍＬホロヒトトランスフェリン、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン、２ＩＵ／ｍＬヘパリン、及び５％溶剤／界面活性剤ウイルス不活化血漿を補充したＩＭＤＭをベースとする赤血球分化培地（ＥＤＭ）で培養する。拡大手順には３つのステップが含まれる。第１のステップでは（０日目〜７日目）、ＥＤＭ中、１μＭヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３、及び３ＩＵ／ｍＬ ＥＰＯの存在下で１０４個／ｍＬのＣＤ３４＋細胞を培養する。４日目に、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＥＰＯ、及びヒドロコルチゾンを含有する４容積の新鮮培地中に１容積の細胞培養物を希釈する。第２のステップでは（７日目〜１１日目）、ＳＣＦ及びＥＰＯを補充したＥＤＭ中に１０５個／ｍＬで細胞を再懸濁する。第３のステップでは（１１日目〜１８日目）、ＥＰＯのみを補充したＥＤＭ中で細胞を培養する。細胞数は１１日目及び１５日目にそれぞれ７．５×１０５〜１×１０６及び５〜１０×１０６細胞／ｍＬに調整する。１８日目を過ぎたら、ＥＰＯを含有する培養培地を週２回取り替える。培養物は５％ＣＯ２の空気中３７℃に維持する。
２．マウス赤血球
マウス胎仔肝赤血球前駆体からマウス赤血球系細胞を培養する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４，ＰＮＡＳ ２０１４ １１１（２８）：１０１３１を参照されたい。
胎仔肝からマウス赤血球前駆体を単離する。胎仔肝はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓから購入する。肝臓を氷上の１ｍｌ ＰＢＳ中に入れる。ピペットを上下させて単一細胞懸濁溶液を得て、７０ｕｍストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ３５−２２３５）に通す。そのメッシュを１ｍｌのＰＢＳでリンスする。素通り画分を合わせる（１つの胚当たり１ｍｌ）。細胞を１．５ｋ ＲＰＭ、５分間でペレット化し、赤血球溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌの塩化アンモニウム溶液）で再懸濁し、及び氷上で１０分間インキュベートする。細胞を１．５ｋ ＲＰＭ、５分間でペレット化し、溶解緩衝液を除去し、及び１０ｍｌ ＰＢＳ−２％ＦＢＳで再懸濁する。ｃｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃０１２−０００−００３）を５０ｕｌ／マウスで加え、４℃で５分間インキュベートする。ビオチン化抗マウスＴＥＲ１１９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５３６７２）を（１ｕｌ／１×１０６細胞）で加え、４℃で１５分間インキュベートする。細胞にＭｓ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｐａｎｅｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃ＢＤＢ５５９９７１）を（２ｕｌ／１×１０６細胞）で加え、４℃で１５分間インキュベートする。１０倍容積のＰＢＳで１回洗浄し、細胞を４℃、１．５ｋ ＲＰＭで５分間スピンさせる。ストレプトアビジン粒子Ｐｌｕｓ−ＤＭ（磁気ビーズ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、＃５５７８１２）（５ｕｌ／１×１０６細胞）を加え、４℃で３０分間インキュベートする。磁気ホルダ上に２〜４本のＦＡＣＳチューブを準備する。２ｍｌの細胞のアリコートを各チューブに取り分け（合計４ｍｌ）、磁気スティックビーズを破壊しないようにしながらチューブから細胞を慎重に取り出して反対側にある他方のチューブに入れる。同じ手順を繰り返し、Ｔｅｒ１１９陰性細胞及びリンケージ陰性細胞を新しいチューブに取る。細胞を濃縮し、それらの細胞を５０〜１００ｕｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で再懸濁する。
精製した赤血球前駆体は、（４０ｍＬに対して）：ＩＭＤＭ：２９ｍｌ、ＦＢＳ（幹細胞）：６ｍｌ（最終１５％）、ＩＭＤＭ中１０％ＢＳＡ（幹細胞）：４ｍｌ（最終１％）、１０ｍｇ／ｍｌホロトランスフェリン：２０００ｕｌ（最終：５００ｕｇ／ｍｌ）、１００×Ｌ−グルタミン：４００ｕｌ、１００×ペニシリンストレプトマイシン：４００ｕｌ、１０Ｕ／ｕｌ Ｅｐｏ：２ｕｌ（最終：０．５Ｕ／ｍｌ）、１０ｍｇ／ｍｌインスリン：４０ｕｌ（最終：１０ｕｇ／ｍｌ）を含む分化培地で培養する。２×１０５細胞／ｍｌを２４ウェルプレートの分化培地中３７℃で培養する。合計４４〜４８時間培養した後、例えば本明細書で実施されるとおりフローサイトメトリーによって分析を実施する。分化プロファイル分析のため、（ヘキスト染色）を使用して除核赤血球をゲーティングする。培養が成功すれば、１６倍の増加が得られる。
３．血小板
Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから、提供されたＣＤ３４＋細胞を入手する。ＣＤ３４＋濃縮細胞を２〜４×１０４細胞／ｍＬで無血清培地にプレーティングし、４日目に等容積の培地を加えて培地のリフレッシュを行う。６日目、細胞をカウントして分析する：１．５×１０５細胞を洗浄し、ＴＰＯ ３０ｎｇ／ｍＬ、ＳＣＦ １ｎｇ／ｍＬ、インターロイキン（ＩＬ）−６ ７．５ｎｇ／ｍＬ及びＩＬ−９ １３．５ｎｇ／ｍＬ］からなるサイトカインカクテルを補充した１ｍＬの同じ培地に入れて巨核球分化を誘導する。１０日目に１／２〜１／４の浮遊培養液を新鮮培地に交換する。サイトカインは全て、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入する。加湿雰囲気中（１０％ＣＯ２）、培養の最初の６日間は３９℃で及び最後の８日間は３７℃で培養物をインキュベートする。血球計算器（０．４％トリパンブルー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，カナダ）で生存有核細胞をカウントする。
骨髄ＣＰＣについてはＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３６及び巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｍｋ）についてはＭｅｇａＣｕｌｔ−Ｃを使用して、製造者の指示（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，カナダ）に従いクローン原性前駆細胞（ＣＰＣ）をアッセイする。分化を評価するため、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用したフローサイトメトリーにより、ＣＤ６１ｍ ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、及びＣＤ４９ｂに対する抗体で細胞を染色する。細胞周期分析のため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、ホルムアルデヒド２％（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で５分間固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で透過処理する。次に細胞をｍＡｂ−Ｋｉ−６７−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識し、洗浄し、製造者の指示（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い０．５ｍＬ ＰＢＳ−１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）−０．０１％アジド７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）中に再懸濁する。
実施例１４：細胞単離
１．初代ＲＢＣ
無菌法を用いて、低分子量ヘパリン、ダルテパリンナトリウム（９単位／ｍＬ血液）が入ったチューブに全血を収集する。血液を５０００×ｇで５分間遠心し、血漿及びバフィーコートを除去した後（両方とも後に使用するため取り置かれ得る）、赤血球を冷（４℃）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で遠心して２回洗浄する。得られた赤血球集団は、長期保存のためにＣＰＤＡ−１抗凝固剤又はグリセロール溶液中４℃で保存する。
２．初代血小板
適切なＩＲＢプロトコルに基づき健常人から全血（４０ｍｌ）を３．８％クエン酸ナトリウム（１：９クエン酸塩対血液ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に収集する。血液を２００ｇで１５分間遠心して多血小板血漿（ＰＲＰ）を単離する。次に、１μＭプロスタグランジンＩ２の存在下、変性タイロード緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭ デキストロース、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ ＫＣｌ２、０．３６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ含有、ｐＨ７．４）中で血小板を洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁する。
実施例１５：初代細胞又は培養細胞の照射
外因性抗原発現ＥＨＣの集団の照射を実施して、それらが複製不能であることを確実にし得る。かかるプロトコルは、細胞、例えば初代赤血球の照射について当該技術分野で公知のものと同様である。簡潔に言えば、１単位（３５０ｍｌ）の全血を取り、各１７５ｍｌの２つのアリコートに分け、従ってかかる１０単位を２０のアリコートに分ける。各単位血液の一方のアリコート（１７５ｍｌ）を、自蔵式ガンマ線細胞照射器（ＧａｍｍａＣｅｌｌ １０００、Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ）によって２５Ｇｙの、但し５０Ｇｙ以下のγ線照射に供する。次に血液を従来の血液貯蔵条件下に４℃で保存する。これらの１０個の照射済み血液バッグ及び１０個の非照射血液バッグから、０、７、１４、及び２１日目にサンプリングサイトカプラー（Ｆｅｎｗａｌ、ＵＳＡ）を用いてサンプリングを行う。潜在的な有糸分裂能を定量化するチミジン取込みアッセイを含め、細胞増殖試験を実施する。遊離ヘモグロビンに関しては吸光度分光法、及び遊離乳酸デヒドロゲナーゼに関しては比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で上清をアッセイし、細胞溶解レベルを評価する。
実施例１６：赤血球系細胞の除核
コラーゲンでコーティングした直径１２ｍｍのカバーガラス上で、１００単位／ｍｉのペニシリン及び１００単位／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ培地中において赤血球系細胞をセミコンフルエンス（１〜４×１０４細胞毎ｃｍ２）になるまで成長させる。コラーゲンは、遠心中に全細胞がカバーガラスから落ちることを防止するために必要である。細胞を同じ培地中か又は１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地中においてカバーガラス上に単層（５×１０４細胞毎ｃｍ２）に成長させる。この細胞カバーガラスをコラーゲンでコーティングする必要はない。細胞を除核するため、カバーガラスを反転させ（細胞側を下にして）、１０ｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む２〜５ｍｌの培地が入った１５ｍｌ Ｃｏｒｅｘ遠心管の底に置く。このカバーガラスが入った遠心管を直ちに、（ＳＳ ３４）ローターをヘッドを所定位置にして１０，０００ｒｐｍで約１時間スピンさせることにより３７℃に加温したＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−２遠心機に置く（温度調節装置は３７〜３９度に設定）。遠心の時間の長さ及び速度は除核の成功に重大な要素である。細胞を３７±２０で９０００ｒｐｍで１時間スピンし、及び細胞を３７±−２０で６５００ｒｐｍで５０分間スピンする。遠心後、遠心機からカバーガラスを取り出し、３ｍｌのサイトカラシンＢ不含培地が入った３５ｍｍ（Ｆａｌｃｏｎ）組織培養皿（Ｂｉｏｌｑｕｅｓｔ）に細胞側を上にして置く。３７０で３０〜６０分以内に細胞は形態学的に正常となり、９０〜９９％が核を欠く。トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．）で処理することによりカバーガラスから除核細胞を取り外し、通常の培地に細胞を懸濁する。次に３５ｍｍ組織培養皿に保持した２２ｍｍ２カバーガラスに除核細胞を小滴で再度プレーティングし、インキュベーターに置く。再度プレーティングした後時間間隔を置いてスライド（１２）上にカバーガラスをマウントし、Ｚｅｉｓｓ位相コントラスト、偏光、及びノマルスキー光学系で除核物の観察を行う。
実施例１７：細胞の接触
１．核酸 − トランスフェクション
目的の核酸をスケールアップして、負荷する１０５個のＥＨＣ、例えば細胞、赤血球系細胞、血小板、又は造血前駆細胞当たり約５ｕｇの核酸を提供する。核酸はＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１ｕｇ対５０ｕＬ培地の比で希釈する。次に希釈した核をトランスフェクション試薬（ＤＮＡについてはＴｒａｎｓ−ＩＴ、ｍＲＮＡについてはＴｒａｎｓ−ＩＴ ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡについてはＴｒａｎｓ−ＩＴ ｓｉＲＮＡ、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）と１：１容積比で合わせ、室温で５分間複合体を形成させる。この核酸複合体を細胞に１２〜２４時間加える。任意選択で、この時間が経った後、トランスフェクション試薬がもはや存在することのないよう、培地を新鮮培地に交換してもよい。
２．核酸 − ウイルス形質導入
目的の遺伝子をＳｙｓｔｅｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭＳＣＶプロモーター配列と共にレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。
レンチウイルスは、２９３Ｔ細胞にリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）をトランスフェクトすることにより２９３Ｔ細胞で産生される。トランスフェクションの前日に５×１０６個の２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ ２９３Ｔ細胞株、Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３２１８０）をＰ１０ペトリ皿にプレーティングする。細胞コンフルエンシーは約７０％でなければならない。１つのコンストラクトにつき１つのプレートをトランスフェクトする。２０μｌ（１０μｇ）ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）プラスミドミックス＋２μｇレンチコンストラクト＋２０μｌ Ｐｌｕｓ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１５１４−０１５）を４００μｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ中に合わせ、室温で１５分間インキュベートする。３０μｌのＬＦ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８−０１９）を４００μｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ中に希釈し、ＤＮＡ混合物に滴下して加え、室温で１５分間インキュベートする。ＤＮＡ混合物を細胞に加える（細胞は９ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ中にある）。細胞を６時間インキュベートし、次に培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに交換する。トランスフェクション後４８時間に１，５００ｒｐｍで５分間遠心してウイルス上清を回収する。この上清を回収し、１ｍｌアリコートとして−８０℃で凍結する。
本明細書に記載される培養プロセスの３〜７日目に標的細胞を形質導入する。５×１０５個の培養細胞を２４ウェルプレート中の２０μｇ／ｍＬポリブレンを含有する５００μＬの培地にプレーティングする。細胞は各ウイルスにつきトリプリケートのウェルで形質導入する。ウイルス上清を別の５００μＬの培地に加え、ピペッティングによって試料を混合する。感染は、プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間スピンする遠心接種によって達成する。遠心接種後、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、翌日、適切なサイトカインを含有する１ｍＬの新鮮ＩＭＤＭ培地を加える。
３．核酸 − カチオン性ポリマー
目的のトランス遺伝子をコードする、且つ上流プロモーター配列及び下流ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、複数の商業的供給業者（例えば、ＩＤＴ−ＤＮＡ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）から購入することができる。ＲＮＡトランスフェクションは、ＲＮＡＩＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）又はＴＲＡＮＳＩＴ−ｍＲＮＡ（Ｍｉｍｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）カチオン性脂質送達媒体を使用して行う。ＲＮＡ及び試薬は、初めにＯｐｔｉ−ＭＥＭ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）に希釈する。１００ｎｇ／ｕＬ ＲＮＡを５倍希釈し、ＲＮＡ１μｇ当たり５μＬのＲＮＡＩＭａｘを１０倍希釈する。希釈した構成成分をプールし、室温で１５分間インキュベートした後、それらを培養培地に分注する。ＴＲＡＮＳＩＴ−ｍＲＮＡトランスフェクションについては、１００ｎｇ／ｕＬ ＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に１０倍希釈し、ブースト試薬を（ＲＮＡ１μｇ当たり２μＬの濃度で）加え、ＴＲＡＮＳＩＴ−ｍＲＮＡを（ＲＮＡ１μｇ当たり２μＬの濃度で）加え、次に、室温で２分間インキュベートした後、このＲＮＡ−脂質複合体を培養培地に供給する。ＲＮＡトランスフェクションは、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ異物不含ｈＥＳ培地（ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）又は２％ＦＢＳ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで実施する。宿主細胞へのｍＲＮＡ転写物の導入の成功は、蛍光標識又はレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など、様々な公知の方法を用いてモニタすることができる。修飾ｍＲＮＡのトランスフェクションの成功はまた、標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを例えばウエスタンブロッティング又は免疫細胞化学で計測することによっても判断し得る。同様のＲＮＡ−脂質複合体比に従うマルチリットル（５〜１０，０００Ｌ）培養フォーマットへの大容積スケールアップについても、同様の方法に従い得る。
４．核酸 − 電気穿孔
目的のトランス遺伝子をコードする、且つ上流プロモーター配列及び下流ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、複数の商業的供給業者（例えば、ＩＤＴ−ＤＮＡ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）から購入することができる。赤血球系統細胞をｍＲＮＡ転写物でトランスフェクトし、及び外因性転写物を特異的に検出するように設計されたプライマーによる定量的ＲＴ−ＰＣＲによってトランスフェクション効率を計測することにより、電気穿孔パラメータを最適化する。ある種の細胞の調製には、２ｍｍ間隙の標準電気穿孔キュベット内において５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）中に懸濁した２．５×１０６細胞に１５０ｕＦキャパシタンスを放電することが、検量線法を用いて判断するとき、高い生存能（＞７０％）を維持しながら１細胞当たり１０，０００コピーを上回る修飾ｍＲＮＡ転写物を繰り返し送達するのに十分である。細胞密度は１×１０６細胞／５０μｌ〜２．５×１０６細胞／５００の密度で様々であり、１細胞当たりの転写物コピー数で計測して同程度の効率で細胞をトランスフェクトするためには１１０Ｖ〜１４５Ｖが必要である。上述の制約を伴い記載される方法と同様の大容積流動電気穿孔戦略と同様に、大量マルチリットル（５〜１０，０００Ｌ）電気穿孔を実施し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
５．ポリペプチド − リポソーム
細胞は、初代最終分化細胞、例えば赤血球を含め、その表面上及びその細胞質に外因性タンパク質を負荷することができる。タンパク質の負荷はリポソームを使用して実施することができる。
有機溶媒中の脂質（Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ）をガラスシンチレーションバイアルにおいて窒素下で乾燥させて薄膜にした。１０５細胞につき約２ｕＬの脂質を使用した。ポリクローナルマウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ−６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造者の指示に従い標識した。この乾燥脂質混合物にＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を加えた。この溶液を数回ピペッティングし、室温で５分間インキュベートし、次に激しくボルテックスして封入リポソームを作成した。無血清培地を加えて総容積を１０５細胞当たり５００ｕＬにした。次にこのリポソーム混合物を細胞と共に３７℃で３〜４時間インキュベートした。
図１は、リポソームによる初代赤血球への外因性タンパク質、この場合には蛍光標識ＩｇＧの負荷を示す。負荷はフローサイトメトリーによって計測される。リポソームがない場合には細胞の０．０６％が蛍光であり、低リポソーム用量では細胞の約６０％が蛍光であり、及び高リポソーム用量では細胞の約８５％が蛍光であるとおり、負荷は用量依存性である。図１のデータは、リポソームで外因性タンパク質を赤血球系細胞に負荷し得ることの強力な証拠である。
６．ポリペプチド − 機械的破壊
細胞は、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ幅のチャネルを含むマイクロ流体装置を使用して負荷してもよく、チャネルが細胞を一過性に穿孔して、細胞がそのシステムに押し通されるときにペイロードが侵入することを可能にする。
マサチューセッツ工科大学（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の微細加工施設において、フォトリソグラフィ及び深堀り反応性イオンエッチング技法を用いてシリコンベースの装置を作製する。このプロセスでは、４５０μｍ厚の６インチシリコンウエハをヘキサメチルジシラザンで処理し、フォトレジスト（ＯＣＧ９３４；ＦｕｊｉＦｉｌｍ）によって３，０００ｒｐｍで６０秒間スピンコーティングし、狭窄チャネル設計を有するクロムマスクを通じて紫外光（ＥＶ１；ＥＶＧ）に露光し、及びＡＺ４０５（ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）溶液で１００秒間現像する。９０℃で２０分間焼成した後、ウエハを深堀り反応性イオンエッチング（ＳＰＴＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって所望の深さ（典型的には１５μｍ）にエッチングする。このプロセスをウエハの反対側（即ち、エッチングされたチャネルを有しない側）で別のマスク（これはアクセスホールパターンを含む）を使用して、且つより厚いフォトレジストＡＺ９２６０（ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を使用して繰り返す。次に湿式酸化を用いて１００〜２００ｎｍの酸化ケイ素を成長させた後、そのウエハをＰｙｒｅｘ（登録商標）ウエハに陽極接合し、個々の装置にダイスカットする。各実験前に装置は目視検査し、入口及び出口リザーバを備えるホルダに取り付ける（全てインハウスで設計され、Ｆｉｒｓｔｃｕｔによって製造される）。これらのリザーバはブナＮＯリング（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）を使用して装置と接合し、適切な封止を設ける。材料を装置に押し通すのに必要な推進力が提供されるように、入口リザーバはＴｅｆｌｏｎチュービングを用いて自家製圧力調整システムに接続する。初めに赤血球系細胞の集団を所望の送達緩衝液［成長培地、ＰＢＳ、又は３％ＦＢＳ及び１％Ｆ−６８ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＰＢＳ］に懸濁し、所望の送達材料と混合して、装置の入口リザーバに置く。このリザーバは、調整器によって制御される圧縮空気ラインに接続し、選択圧力（０〜７０ｐｓｉ）を用いて装置中に流体が押し進められる。次に処理された細胞を出口リザーバから回収する。細胞は処理後に送達溶液中室温で５〜２０分間インキュベートして孔を確実に塞いだ後、任意のさらなる処理に供する。蛍光標識フェニルアラニンアンモニアヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を送達するため、送達緩衝液が０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬのＰＡＨを含有したように上記に記載したとおり実験を行う。ＧＦＰノックダウンは、未処理対照と比べた細胞集団の平均蛍光強度の低下パーセンテージとして計測する。
７．ポリペプチド − 表面コンジュゲーション
細胞表面をトラウト試薬（２−イミノチオランＨＣｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）で処理して第一級アミンをチオール化する。ＥＤＴＡ含有トリス緩衝液ｐＨ８にトラウト試薬を溶解し、スルフヒドリルの酸化を防止する。約１ｐｍｏｌのトラウト試薬を使用して１０６細胞を処理する。トラウト試薬を細胞と共に室温で１時間インキュベートする。過剰の又は未反応の試薬を遠心によって除去して細胞を洗浄する。利用可能なスルフヒドリル基の数は、エルマン試薬を使用して計測することができる。その一方で、好適な外因性抗原ポリペプチドをＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）などのアミン−スルフヒドリルクロスリンカーで製造者の指示に従い処理する。過剰の架橋結合試薬を脱塩によって除去する。次にマレイミド官能化タンパク質をチオール化した細胞と共に数時間インキュベートする。コンジュゲート細胞から遠心及び洗浄によって未反応のタンパク質を分離する。
８．ポリペプチド − 非共有結合性表面付加
哺乳類発現ベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）において、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）を６−ヒスチジンアフィニティータグと、マウスグリコホリンＡに結合するポリペプチド配列、ＨＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤＧＧＳＧＣＲＧをコードする遺伝子とに融合する。標準方法を使用したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって完全融合タンパク質を作製し、製造者の指示に従いＮｉ−ＮＴＡアフィニティー樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製する。精製した融合タンパク質を１００ｎＭ超の濃度のマウス赤血球と共にインキュベートし、迅速な平衡化及びペプチドとグリコホリンＡの結合を可能にする。
９．ポリペプチド − 膜への脂質挿入
製造者のプロトコルに従いトラウト試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してアミン含有の好適な外因性抗原ポリペプチド分子にスルフヒドリル基を作成する。反応混合物を振盪機において室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、製造者の指示に従いスピン脱塩カラム（Ｚｅｂａ、ＭＷＣＯ ７Ｋ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通して洗浄して未反応のトラウト試薬を除去する。修飾ポリペプチドへのスルフヒドリル基の作成は、製造者のプロトコルに基づきエルマン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量化する。
脱塩したポリペプチド溶液にＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ｍａｌ（ＰＢＳ、４μＬ中１×１０−３Ｍ、脂質：ポリペプチドモル比＝１：１）（全ての脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入し、アルゴン下−２０℃でクロロホルム溶液として保存する）を加え、振盪機においてＲＴでインキュベートする。１時間後、遠心ろ過装置（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）を使用して試料溶液を４℃、１４ ０００ｇで１５分間ろ過することにより小分子を除去し、６００μＬ ＰＢＳ（１ｍｇ／ｍＬポリペプチド）に懸濁する。
２００μＬの全血を１０００μＬ ＰＢＳ中に懸濁して１５００ｇで３０秒間スピンし、これを４回繰り返す。最後に、ＲＢＣを８００μＬ ＰＢＳ中に懸濁する。ＲＢＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ポリペプチドのコンジュゲーションは、上記のＲＢＣ懸濁液及び様々な量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ポリペプチド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を混合した後、続いて３７℃で１５〜３０分間インキュベートすることにより調製する。混合物を室温に５分間置いておき、次にＰＢＳで３回洗浄し、５×１０８個／ｍＬの最終ＲＢＣ濃度となるように再懸濁する。自動細胞計数器（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞濃度を計測する。
１０．ポリペプチド − 低張負荷
好適な外因性抗原ポリペプチド、この場合マウスＩｇＧをＡｂｃａｍから購入し、７０％のヘマトクリット（Ｈｃｔ）の等張液中のＲＢＣ懸濁液に０．２５ｍｇ／ｍＬで加えた。この懸濁液を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、及び２０ｍＭグルコースを含有する２５０ｍＬの低張液に透析し、４℃、１５ｒｐｍで１時間撹拌した。次に、５ｍＭアデニン、１００ｍＭイノシン、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭグルコース、１２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の１／１０容積の再密閉溶液を加えることにより、細胞を等張的に再密閉した。次に細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。
１１．ポリペプチド − 細胞透過性ペプチド
プロタミンコンジュゲートポリペプチドの製造は当該技術分野において公知である。例えば、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ １３９（３）：１８２を参照されたい。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中５ｍｇ／ｍｌの低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）をヘテロ二官能性架橋剤３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＰＤＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と１：１０モル比でＤＭＳＯ中に混合し、室温で１時間振盪する。次にこの反応混合物を５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、チオール化したＬＭＷＰをヘパリンアフィニティーカラムでのＨＰＬＣによって精製する。生成物を限外ろ過によって回収し、凍結乾燥し、後に使用するまで−２０℃で保存する。
コンジュゲーションのため、５ｍｇ／ｍｌの好適な外因性抗原ポリペプチドをリン酸緩衝液中のＳＰＤＰ（１ｍｌタンパク質溶液に対してエタノール中４０μｌの０．１Ｍ ＳＰＤＰ）と混合し、室温で１時間撹拌する。急速な脱塩及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でのＦＰＬＣによる緩衝液交換によって未反応ＳＰＤＰを除去する。次に活性化ポリペプチドを１０倍モル過剰の上記で調製したＬＭＷＰ−ＳＨと４℃で２４時間コンジュゲートする。ヘパリンアフィニティーカラムを使用したイオン交換クロマトグラフィーと、続く５ラウンドの遠心ろ過（分子量カットオフ：５，０００Ｄａ）によってＬＭＷＰ−ポリペプチドコンジュゲートを単離する。プールされたＬＭＷＰ−ポリペプチドコンジュゲートを濃縮し、コンジュゲーションの程度をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって決定する。
取込み実験のため、新鮮ヒツジ赤血球（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に５×１０８細胞／ｍｌの密度で懸濁し、次にＬＭＷＰ−ポリペプチドコンジュゲートの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液と共に穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートする。次にＲＢＣをＨＢＳＳで洗浄し、２〜８℃で保存する。
１２．ポリペプチド − 化学的透過性
３×１０８個のＲＢＣをリンゲル溶液中２００μＭのクロルプロマジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３０分間プレインキュベートした。その後、好適な外因性抗原ポリペプチドをリンゲル溶液に（１〜４μＭ）最終容積が４００μｌとなるように加え、穏やかな撹拌下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、リンゲルに再懸濁し、分析用に回収した。
１３．ポリペプチド − 酵素的コンジュゲーション
ソルターゼによる酵素的細胞表面コンジュゲーションは当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２０１４ １１１（２８）：１０１３１を参照されたい。ＧＰＡ Ｎ末端をポリペプチドで標識するため、３０ｕＬの５００ｕＭ黄色ブドウ球菌（Ｓ ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼ及びＣ末端にＬＰＥＴＧＧを有する１ｍＭポリペプチドを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、氷上で１５分間プレインキュベートし、ＤＭＥＭ中５×１０７個のＲＢＣに加える。このソルターゼと細胞との混合物を時折穏やかに混合しながら氷上で３０分間インキュベートし、次に４℃、５００×ｇで２分間スピンして緩衝液／ＤＭＥＭを除去し、次に１ｍＬの氷冷ＰＢＳで３回洗浄する。
実施例１８：ポリペプチドの存在の評価
１．蛍光トランス遺伝子
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端上のＨＡタグがウイルス性Ｔ２Ａペプチドの介在を伴いＧＦＰに融合したグリコホリンＡをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びフローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。形質導入効率は、集団中におけるＧＦＰ陽性細胞の割合として評価した。
２．細胞表面タンパク質
細胞表面タンパク質について、タンパク質発現レベルは、タンパク質又は共発現するエピトープタグに特異的な抗体によるフローサイトメトリーによって、早くもトランスフェクションの２日後には検出することができる。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｎ末端にＨＡタグを有するグリコホリンＡをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びマウス抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）の１：５０希釈物で１時間染色した。細胞を洗浄し、次にａｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１００希釈物によって氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。形質導入効率は、集団中におけるａｌｅｘａ ４８８陽性細胞の割合として評価した。
３．細胞内タンパク質
細胞内タンパク質について、タンパク質発現レベルは、ウエスタンブロットによって早くもトランスフェクションの８〜１２時間後には検出することができる。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させた。細胞溶解物を１００ｍＭ ＤＴＴ中で煮沸することにより変性させ、次にＮｕＰａｇｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャストゲル上にロードした。電気泳動及びニトロセルロース膜への転写後、マウス抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）の１：５０００希釈物、続いてヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１：５０００希釈物で染色することによりタンパク質バンドを発色させ、続いてＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）で処理した。Ａｍｅｒｓｈａｍイメージャ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して画像を取得した。
実施例１９：細胞を化学修飾剤と接触させる
抗原提示細胞の食作用を増加させ、且つ肝臓ターゲティングを促進するため、本明細書に記載する細胞組成物を３７℃で０．１５μＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によるか、又は室温（ＲＴ）で５ｍＭのＢＳ３（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）によって３０分間処理する。この処理後、最終生成物は好適な緩衝液中に２〜８℃で保存する。
実施例２０：発現及び活性の評価
培養細胞内及びその上での外因性タンパク質の発現は、フローサイトメトリーによるか（タンパク質が表面上で発現する場合）又はウエスタンブロットによって（細胞質内で発現するタンパク質用）、定量的に評価することができる。
１．定量的フローサイトメトリー
抗マウスＦｃ結合定量的フローサイトメトリービーズ（Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）はＢａｎｇｓ Ｌａｂｓから購入した。関連性のある細胞表面受容体−グリコホリンＡ、Ｃｋｉｔ、及びトランスフェリン受容体−に対する蛍光標識マウス抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。ＨＡエピトープタグに対する蛍光標識マウス抗体はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｎ末端にＨＡタグを有するグリコホリンＡをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の少なくとも２日後、２×１０５細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及び上記に挙げた抗体のうちの１つの１：１００希釈物で１時間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。上記に挙げる４つの抗体の各々について、このプロトコルを繰り返した。製造者の指示に従い定量化を実施した。簡潔に言えば、５つのビーズ試料の各々の一滴を、上記に挙げた抗体の１：１００希釈物とインキュベートした。ビーズを１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、及びフローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。上記に挙げる４つの抗体の各々について、このプロトコルを繰り返した。製造者提供のｅｘｃｅｌスプレッドシートを使用して検量線をフィットし、そこから細胞ベースシグナルの蛍光強度の定量化を導出した。
２．定量的ウエスタンブロット
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解させた。
リポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランス遺伝子を導入した。細胞を１週間培養し、上清を回収した。組換えタンパク質をＨＡアフィニティーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造者の指示に従い精製した。２８０ｎｍの吸光度によってタンパク質濃度を評価した。
本明細書に記載されるとおりウエスタンブロッティングを実施した。細胞溶解物試料に加え、同じゲル上で既知量の組換えアデノシンデアミナーゼのランを行った。画像収集後、組換えバンドの強度を使用して検量線を作成し、細胞試料中に存在するタンパク質の量を定量化した。
トランス遺伝子の高レベルでのロバストな発現は、最終的な細胞集団の治療能力にとって重要な意味を有する。図２は、分化の指標となる３つの表面タンパク質及び１つの外因性トランス遺伝子の発現を定量的フローサイトメトリーによって定量化し、トランス遺伝子が高レベルでロバストに発現することを実証する。
培養下の赤血球系細胞を四段階インビトロ分化プロセスの間に７時点で採取した。最初の時点（「拡大 Ｄ６」）で細胞は有核造血前駆体である。最後の時点（「分化３ Ｄ８」）までに細胞は主として除核赤血球系細胞になる。赤血球系細胞の標準マーカーであるＧＰＡ（塗り潰した三角形）は、前駆細胞では低値で始まり、急激に１細胞当たり＞１×１０６コピーに達する。幹細胞因子の受容体であるＣＫＩＴ（破線上の四角形）は高値で始まり、次に分化が続いて起こるに従い１細胞当たり＜１×１０４コピーに下がる。赤血球系細胞への鉄の輸送に必要なＴＲ（点線上の菱形）は、最初は増加し、次に１細胞当たり＜１×１０５コピーまで徐々に低下する。第２の分化段階（「分化１」）の終わりにトランス遺伝子（白色の丸）が導入され、これは分化全体を通して１細胞当たり約１×１０５コピーで一定に発現する。上記のデータは、培養細胞でトランス遺伝子がロバストに発現することを実証している。
培養細胞内及びその上での外因性タンパク質の発現は、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによるか（タンパク質が表面上で発現する場合）又は本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって（細胞質内で発現するタンパク質用）、評価することができる。下流蛍光レポータータンパク質を含む単一の転写物コンストラクト内に外因性遺伝子がある例では、レポータータンパク質の蛍光を上流遺伝子の発現の代用として使用し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価することができる。
図３Ａ〜図３Ｓは、除核培養赤血球系細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。上記のデータは、複数のタンパク質クラスが（過剰発現し、及びデノボ発現する、Ｉ型膜タンパク質との細胞質の、表面の、インタクトな融合物、ＩＩ型膜タンパク質との融合物、ＧＰＩ結合型膜タンパク質との融合物、細胞内融合物を含めて）、培養除核赤血球系細胞、培養有核赤血球系前駆細胞、及びＫ５６２赤白血病細胞を含む複数の細胞型で発現し得ることを決定的に実証している。
図３Ｂ及び図３Ｆは、除核培養細胞における２つの外因性タンパク質の同時発現を実証する。
図３Ｂでは、本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、ＨＡエピトープタグ、グリコホリンＡコード配列、ウイルスＴ２Ａ切断可能配列及びＧＦＰをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。両方のトランス遺伝子の発現を検出するため蛍光抗ＨＡ抗体及びＧＦＰ蛍光を使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって細胞を分析した。
図３Ｆでは、本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、グリコホリンＡコード配列、ウイルスＴ２Ａ切断可能配列及びＧＦＰをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。両方のトランス遺伝子の発現を検出するため蛍光抗ＨＡ抗体及びＧＦＰ蛍光を使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって細胞を分析した。
実施例２１：血小板におけるｍＲＮＡからのタンパク質の発現
外因性トランスフェクトｍＲＮＡから翻訳される外因性タンパク質の血小板における発現を、フローサイトメトリーによって計測した。端的には、多血小板血清を１９０ｇで１５分間遠心して赤血球及び白血球を除去した。次に上清を２５００ｇでさらに５分間スピンして血小板をペレット化した。血小板を５ｍＬの１ｕＭプロスタグランジン含有タイロード緩衝液に再懸濁し、洗浄し、７５０ｕＬの１ｕＭプロスタグランジン含有タイロード緩衝液に再懸濁した。目的の遺伝子、この例ではＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、リポフェクタミンと１：１ｍｇ／ｍＬ比で混合した。この混合物を５分間インキュベートし、次に洗浄した血小板集団に加えた。この混合物をゆっくりと揺らしながら室温で２４時間インキュベートした。トランス遺伝子の血小板発現を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ蛍光を計測してアッセイした。表面タンパク質もまたフローサイトメトリーによってアッセイすることができる。細胞質タンパク質又は他の細胞内発現したタンパク質はまた、ウエスタンブロットによってもアッセイすることができる。
外因性タンパク質を血小板中及びその上に導入することには、治療上意味がある。血小板は核又はＲＮＡ転写機構を有しないため、ＤＮＡトランスフェクションは、血小板に外因性タンパク質発現を導入する実行可能な手段ではない。しかしながら、ｍＲＮＡトランスフェクション及び翻訳は、外因性タンパク質を細胞に導入する一方法である。血小板はｍＲＮＡ翻訳機構を含むと考えられているが、しかしこれまで、血小板が外因性ｍＲＮＡを受け入れてタンパク質に翻訳することが可能かどうかは分からなかった。
図４は、トランス遺伝子、この場合ＧＦＰをコードする外因性ｍＲＮＡの、血小板による翻訳を実証する一連のフローサイトメトリープロットである。ＧＦＰは、４８８ｎｍレーザーで励起した後のＦＬ１チャネル内の蛍光によって検出される。（４Ａ）非トランスフェクト血小板（１．７％ＧＦＰ＋）。（４Ｂ）３ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板（８．６％ＧＦＰ＋）。（４Ｃ）６．８ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板（３．３％ＧＦＰ＋）。
これらのデータは、初めて、血小板により外因性ｍＲＮＡが外因性タンパク質に翻訳されることを決定的に実証している。
実施例２２：酵素の活性
図５は、赤血球系細胞に含まれる酵素の活性を実証する。分化の過程にわたるタンパク質の保持について、細胞質酵素の生化学的活性をウエスタンブロットによって評価した。細胞質酵素の生物学的活性はインビトロ酵素活性アッセイによって評価した。
図５は、培養赤血球系細胞で発現する２つの異なる細胞内酵素の活性を示す。
１．アデノシンデアミナーゼ
Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりリポフェクタミントランスフェクション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に導入した。酵素活性は、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ２０１２，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８２３（１０）：１９６７に基づくプロトコルを用いてアッセイされ、このプロトコルでは、特定の酵素混合物がプリンを尿酸及びＨ２Ｏ２に変換した後、続いて生成されたＨ２Ｏ２を蛍光定量的に検出する。端的には、トランスフェクションの２日後、細胞を回収し、培地を吸引し、細胞にクレブス・リンゲルリン酸グルコース（ＫＲＰＧ；含有物：１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５．７ｍＭリン酸ナトリウム、４．８６ｍＭ ＫＣｌ、０．５４ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２２ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び５．５ｍＭグルコース；ｐＨ７．３５）を２×１０５細胞／ｍＬで加えた。アデノシンを５０ｕＭで加えた。６時間反応させた後、上清を回収し、６０℃で５分間熱失活させた。上清のアリコートを、０．２５Ｕ／ｍｌ細菌性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）及び０．１５Ｕ／ｍｌ微生物性キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）（いずれもＳｉｇｍａから）が入った白色９６ウェルマイクロプレートのウェルに移した。室温で２０分間インキュベートした後、マイクロウェルにＨＲＰ（最終濃度１Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）及びＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬（６０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する３０μｌのＨ２Ｏ２検出混合物を加え、続いてそれぞれ５４５及び５９０ｎｍの発光波長及び励起波長で蛍光強度を計測した（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）。
２．フェニルアラニンヒドロキシラーゼ
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端にＨＡタグを有するフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解させた。細胞溶解物（６４ｕｇ総タンパク質）を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭフェニルアラニン、３３μｇカタラーゼ、及び０．４ｍＭ ＤＭＰＨ４（全てＳｉｇｍａ）を含有する１ｍＬ反応緩衝液に加えた。反応を３７℃で一晩実行した。インキュベーション後、試料をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルタ１０ＫＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＦＣ８０１０２４）において３７００ｒｐｍで１０分間スピンさせて遠心ろ過することにより脱タンパク質化した。試料を回収し、チロシン濃度に関して５４０ｎｍの吸光度によってアッセイした。
これらの外因性タンパク質は両方とも最終分化の終わりまで保持されたが、当該技術分野では、赤血球系細胞が基本機能に不要なタンパク質の厳しい除去プログラムを受けることが周知である点を考えれば、これは軽視できない成果である（Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１０）：２０２１−２０２７，Ｌｏｄｉｓｈ ＨＦ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７（１）：５９）。図５Ａにおいては、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたる種々の時点で、外因的に過剰発現したタンパク質アデノシンデアミナーゼが抗ＨＡウエスタンブロットによって検出される。図５Ｃにおいては、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたる種々の時点で、外因的に発現した微生物タンパク質フェニルアラニンヒドロキシラーゼが抗ＨＡウエスタンブロットによって検出される。
加えて、これらの酵素はいずれも、基質を産物に酵素的に変換するそれらの能力を維持した。図５Ｂは、インタクトなアデノシンデアミナーゼ発現２９３Ｔ細胞によるアデノシンからイノシンへの酵素変換を示す。図５Ｄは、培養フェニルアラニンヒドロキシラーゼ発現除核赤血球系細胞のライセートによるフェニルアラニンからチロシンへの酵素変換を示す。
これらのデータは、培養プロセス全体を通して赤血球系細胞で外因性酵素が保持されること、及びそれらの外因性酵素が赤血球系細胞において酵素的に活性であることを決定的に実証しており、これは治療上、深い意味を有する。
実施例２３：ＣＲ１の活性
図６は、培養赤血球系細胞の表面上で過剰発現した補体受容体１（ＣＲ１）の生化学的活性及び生物学的活性の両方を示す。ＣＲ１の生化学的活性は、免疫複合体との結合に関してフローサイトメトリーによって評価した。ＣＲ１の生物学的活性は、共培養アッセイにおけるマクロファージへの免疫複合体のトランスファーによって評価した。
１．ＣＲ１発現細胞の免疫複合体結合
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。補体受容体１（ＣＲ１）をコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。トランス遺伝子発現レベルは、抗ＣＲ１抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。
Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−６５０）を、抗体過剰のポリクローナルウサギ抗ＢＳＡ（Ａｂｃａｍ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次にこの複合体をヒト血清と１：１容積比で３７℃で３０分間混合した。対照複合体は、ヒト血清と混合しないか、又は熱失活したヒト血清と混合するかのいずれかであった。
複合体をＣＲ１発現細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することにより免疫複合体の捕捉に関して分析した。
２．マクロファージへの免疫複合体トランスファー
１００ｎＭホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）と共に３７℃で２４時間インキュベートすることにより、培養Ｕ９３７単球を活性化した。免疫複合体で被覆された細胞（上記参照）を活性化Ｕ９３７マクロファージと共に３７℃で３０分間インキュベートした。この共培養物をフローサイトメトリーによって分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングによってマクロファージを同定した。マクロファージ集団のＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することにより、マクロファージにおける免疫複合体の存在を分析した。
図６は、培養赤血球系細胞で外因的に過剰発現する補体受容体１（ＣＲ１）の生化学的活性及び生物学的活性を示す。
図６Ａは、インビトロでの免疫複合体の捕捉として定義されるＣＲ１の生化学的活性を示す。黒色のヒストグラムは、培養赤血球系細胞で過剰発現したＣＲ１によるＢＳＡベースの免疫複合体の捕捉を示す。網掛けのヒストグラムは、ヒト補体を欠くＢＳＡ及びＩｇＧの複合体との最小バックグラウンド結合を示し、結合イベントがＣＲ１媒介性であることを実証している。
図６Ｂは、培養赤血球系細胞からマクロファージへの捕捉された免疫複合体のトランスファーとして定義されるＣＲ１の生物学的活性を示す。これは、当該技術分野における標準アッセイであり、以下を参照されたい：Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：２３０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７８（７）：３１２９。トランスファーはフローサイトメトリーによって評価され、マクロファージにおける標識された免疫複合体から生じる蛍光の強度として計測される。このアッセイでは、免疫複合体無しにインキュベートされるマクロファージ（黒色のバー）は蛍光にならない。補体を欠く（従ってＣＲ１に結合しない）ＢＳＡ及びＩｇＧの複合体と共にインキュベートするマクロファージは、培養ＣＲ１過剰発現赤血球系細胞の存在とは無関係に、少量の免疫複合体のみを取り込む（塗り潰した灰色のバー）。この取込みは、Ｕ９３７細胞のＦｃ−γ受容体がＩｇＧ分子のＦｃ領域と相互作用することに起因する可能性が高い。ＣＲ１過剰発現細胞の非存在下で免疫複合体（ＢＳＡ＋ＩｇＧ＋補体）と共にインキュベートされるマクロファージは（網掛けのバー、左）、恐らくは同じＦｃ−γの媒介による方法によって補体の非存在下と同じ量の免疫複合体を取り込む。しかしながら、ＣＲ１過剰発現細胞の存在下で免疫複合体と共にインキュベートされるマクロファージ（網掛けのバー、右）は、蛍光によって計測するとき略２倍の数の免疫複合体を取り込む。
これらのデータは、培養赤血球系細胞におけるＣＲ１過剰発現が前記赤血球系細胞上の免疫複合体の捕捉を可能にし、赤血球系細胞からマクロファージへの免疫複合体のトランスファーを促進し、マクロファージによって取り込まれる免疫複合体の速度及び数を大幅に増加させることを決定的に実証している。
実施例２４：ｓｃＦｖの活性
図７は、膜貫通タンパク質ＧＰＡとの融合物として培養赤血球系細胞の表面上で外因的に発現する抗体ｓｃＦｖの生化学的活性及び生物学的活性を示す。
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡのリーダー配列、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）、ＨＡエピトープタグ、［Ｇｌｙ−３−Ｓｅｒ］２可動性リンカー、及びグリコホリンＡの本体をコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。トランス遺伝子発現を、抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。抗体ｓｃＦｖの生化学的活性は、標的タンパク質、この場合Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）との結合に関してフローサイトメトリーによって評価した。組換えＨＢｓＡｇタンパク質（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ−６５０フルオロフォア（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識した。ｓｃＦｖ発現細胞を１００ｎＭの標識タンパク質とインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光に関して本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。
抗体ｓｃＦｖの生物学的活性は、フローサイトメトリーによって検出されるＨＢｓＡｇのインビボ捕捉によって評価した。組換えＨＢｓＡｇタンパク質（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ−６５０フルオロフォア（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識した。ｓｃＦｖ発現細胞をＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ）で蛍光標識した。免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）に約４００ｐｍｏｌの標識ＨＢｓＡｇを尾静脈注射した。数分後、同じマウスに２×１０７個のｓｃＦｖ発現細胞を注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。採取した血液細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞はＣＦＳＥ陽性であると特定された。ヒト細胞におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光としてＨＢｓＡｇの捕捉を検出した。
図７Ａ〜図７Ｂは、その同種抗原、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の結合として定義される抗体ｓｃＦｖの生化学的活性を示す。図７Ａにおいては、抗体ｓｃＦｖを発現する細胞（黒色）又はそれを発現しない細胞（灰色網掛け）を４５０ｎＭ ＨＢｓＡｇと共にインキュベートし、ビオチン化抗ＨＢｓＡｇ抗体及び蛍光ストレプトアビジンで染色する。抗体ｓｃＦｖを発現する細胞（この培養物中の細胞の約４５％）は抗原と結合する。図７Ｂにおいては、抗体ｓｃＦｖを発現する細胞を様々な濃度のＨＢｓＡｇと共にインキュベートして上記のとおり染色し、結合イベントが用量依存性であって、親和性が約１０ｎＭであることが示される。
図７Ｃ〜図７Ｄは、マウスにおいて循環中にある間の同種抗原ＨＢｓＡｇの捕捉として定義される抗体ｓｃＦｖの生物学的活性を示す。この実験では、免疫不全ＮＳＧマウスに約４００ｐｍｏｌの蛍光標識ＨＢｓＡｇを尾静脈注射した。５分後、培養除核赤血球系細胞（７Ｃ）又は外因性抗体ｓｃＦｖを発現する培養除核赤血球系細胞（７Ｄ）を尾静脈注射した。注射前、全ての培養細胞をＣＦＳＥ蛍光色素で標識した。６時間後に血液を採取し、フローサイトメーターで分析し、ＣＦＳＥ＋ヒト細胞でゲーティングした。裸の培養細胞はＨＢｓＡｇに結合しなかったが（７Ｃ）、一方、抗体ｓｃＦｖ発現細胞はＨＢｓＡｇに結合する（７Ｄ）。生化学的活性実験と一致して、この培養物中の細胞の約４５％が抗体−ｓｃＦｖを発現する。
これらのデータは、抗体ｓｃＦｖが培養赤血球系細胞の表面上で発現するとき生化学的活性であること、及び赤血球系細胞上の抗体ｓｃＦｖがインビボで循環中にあるときその標的に結合可能であることを実証している。これは、循環中の物質の捕捉、隔絶、及びクリアランスが所望される治療手法にとって深い意味を有する。
実施例２５：活性 − 循環クリアランス
図８は、標的の循環クリアランスに使用される表面分子捕捉剤の生化学的活性及び生物学的活性の両方を示す。
捕捉剤、この場合ＨＡポリペプチド及びビオチンの生化学的活性は、標的タンパク質、この場合抗ＨＡ抗体及び抗ビオチン抗体との結合に関してフローサイトメトリーによって評価した。捕捉剤の生物学的活性は、フローサイトメトリー及び血漿タンパク質定量化により検出するときの標的タンパク質のインビボ捕捉及びクリアランスによって評価した。
１．化学的に修飾された細胞による抗ビオチン抗体の捕捉
正常ヒトドナー由来の赤血球を購入した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）。細胞をＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ）によって製造者の指示に従い３７℃で２０分間標識した。次に、０．０２容積の２ｍＭストックビオチン試薬を使用して細胞を製造者の指示に従いＮＨＳ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）で室温で３０分間ビオチン化した。抗ビオチン抗体（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）で蛍光標識した。標識抗ビオチン抗体及びＣＦＳＥ蛍光を検出マーカーとして使用してフローサイトメトリーによって細胞の標識効率を評価した。２５０ｕｇの標識抗体をＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から静脈内注射した。４時間後、１×１０８個のビオチン化細胞を尾静脈から静脈内注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。採取した血液細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞はＣＦＳＥ陽性であると特定された。ヒト細胞におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光として抗ビオチン抗体の捕捉を検出した。採血からの血漿をＥＬＩＳＡによってビオチン被覆マイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者の指示に従い分析し、循環中の抗体レベルを検出した。
２．トランスジェニック培養細胞による抗ＨＡ抗体の捕捉
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、ＨＡエピトープタグ、グリコホリンＡコード配列、ウイルスＴ２Ａ切断可能配列及びＧＦＰをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）及びＧＦＰ蛍光で蛍光標識した抗ＨＡ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって細胞を分析し、両方のトランス遺伝子の発現を検出した。２５０ｕｇの標識抗ＨＡ抗体をＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から静脈内注射した。４時間後、１×１０８個の培養細胞を尾静脈から静脈内注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。採取した血液細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞はＣＦＳＥ陽性であると特定された。ヒト細胞におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光として抗ＨＡ抗体の捕捉を検出した。採血からの血漿をＥＬＩＳＡによってＨＡペプチド被覆マイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者の指示に従い分析し、循環中の抗体レベルを検出した。
図８は、（８Ａ〜８Ｂ）ＧＰＡとの融合物として培養赤血球系細胞の表面上で発現するポルペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）ＨＡ、及び（８Ｃ〜８Ｄ）初代赤血球の表面に化学的にコンジュゲートしたビオチンの生化学的活性及び生物学的活性を示す。生化学的活性は、インビトロでの標的タンパク質の捕捉として定義される。生物学的活性は、インビトロでの標的タンパク質のクリアランスの亢進として定義される。
図８Ａにおいては、ＧＰＡのＮ末端との融合物として発現するＨＡポリペプチドが、インビボでマウス抗ＨＡ抗体を捕捉する。ＮＳＧマウスに蛍光標識マウス抗ＨＡ抗体を注射し、続いて表面上にＧＰＡとの融合物としてＨＡエピトープタグを発現しない（上）、或いは発現する（下）培養ヒト赤血球系細胞を注射した。血液を採取し、細胞をフローサイトメーターで分析した。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ＨＡ抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を表す。両方の試料でＣＦＳＥ陽性培養ヒト赤血球が観察されるが、ＨＡエピトープタグを発現する細胞のみが、循環抗ＨＡ抗体を捕捉することが可能である。
図８Ｂにおいては、マウスに抗ＨＡ抗体を注射し、次に任意選択で、その表面上にＧＰＡとの融合物としてＨＡペプチドを発現しない、或いは発現する培養ヒト赤血球系細胞を注射した。複数の時点で血漿を採取し、血漿中の抗ＨＡ抗体レベルを、ＨＡペプチド被覆プレートを基質として使用してＥＬＩＳＡによって評価した。抗ＨＡ抗体のみ（白色の丸、実線−このマウスは１２０分後に治療とは無関係な原因によって死亡した）又は抗ＨＡ抗体と、続いてその表面上にＨＡペプチドを発現しない細胞（破線）を注射したマウスは、細胞の注射後２４時間まで循環中に有意な抗体を有する。対照的に、抗ＨＡ抗体と、続いてその表面上にＨＡペプチドを発現する細胞を注射したマウスは、数分以内に標的抗体が枯渇する。このデータは、その表面上に外因性抗原ポリペプチドを発現する培養赤血球系細胞によって標的抗体が循環から急速且つ特異的に除去されることを決定的に実証している。
図８Ｃにおいては、アミン官能化化学によって赤血球系細胞の表面にコンジュゲートしたビオチン分子が、マウス抗ビオチン抗体を捕捉する。これらの例のいずれにおいても、捕捉はフローサイトメトリーによって評価した。ＣＦＳＥ標識され且つビオチン化された細胞は、蛍光抗ビオチン抗体で染色したときダブルポジティブとして現れ（下側のドットプロット）、一方、ビオチン化されていないＣＦＳＥ標識細胞は、シングルポジティブとして現れるのみである（上側のドットプロット）。
図８Ｄにおいては、マウスに抗ビオチン抗体を注射し、次に任意選択で、その表面上でビオチンにコンジュゲートされていない、又はコンジュゲートされている培養ヒト赤血球系細胞を注射した。複数の時点で血漿を採取し、血漿中の抗ビオチン抗体レベルを、ビオチン被覆プレートを基質として使用してＥＬＩＳＡによって評価した。抗ビオチン抗体のみ（白色の丸、実線）又は抗ビオチン抗体と、続いてその表面上でビオチンにコンジュゲートされていない細胞（破線）を注射したマウスは、細胞の注射後２４時間まで循環中に有意な抗体を有する。対照的に、抗ビオチン抗体と、続いてその表面上でビオチンにコンジュゲートされている細胞を注射したマウスは、数分以内に標的抗体が枯渇する。このデータは、その表面上に外因性抗原ポリペプチドを含む培養赤血球系細胞によって標的抗体が循環から急速且つ特異的に除去されることを決定的に実証している。
総合して、これらのデータは、外因性抗原発現ＥＨＣ上の好適な外因性抗原が循環中にあるときインビボでその標的分子を結合して標的分子の急速な循環クリアランスを媒介し得ることを決定的に実証しており、これは治療上、深い意味を有する。
実施例２６：補体調節因子の活性
外因性抗原発現ＥＨＣの補体調節活性は、当該技術分野において公知の標準ＣＨ５０及びＡＨ５０アッセイによって評価する（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９６１ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｐｐ．１３３−２３９及びＰｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．１９７４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１３：３４８を参照）。
簡潔に言えば、ＣＨ５０アッセイは標的細胞としてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を利用する。簡潔に言えば、ＧＶＢ（２＋）緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有ゼラチン／ベロナール緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．３５に１×１０９個のＳＲＢＣ／ｍｌを含有する懸濁液を調製する。溶血素（ウサギ抗ヒツジ抗血清）を力価測定して、ＳＲＢＣを感作するのに最適な希釈を決定する。希釈した溶血素（１：８００）を等容積のＳＲＢＣ（１×１０９ＳＲＢＣ／）と混合し、全てを３７℃で１５分間インキュベートする。これにより５×１０８／ｍｌの抗体被覆赤血球（ＥＡ）が得られる。ＥＡ（１００μｌ）を、正常ヒト血清（ＮＨＳ）の１００μｌの５つの段階２倍希釈物（１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、及び１：３２０）又はＮＨＳと外因性抗原発現ＥＨＣとの混合物の同様の希釈物と共に３７℃で１時間インキュベートする。ＧＶＢ２＋緩衝液とインキュベートするＮＨＳを対照として使用する。ＥＡを緩衝液単独（血清を加えない）と共にインキュベートすることによりバックグラウンド対照を得て、ＥＡに蒸留水を加えることにより総溶解（１００％溶血）を決定する。１．２ｍｌの氷冷０．１５Ｍ ＮａＣｌを使用して反応を停止させ、混合物をスピンして非溶解細胞をペレット化し、上清の光学濃度を分光光度法（４１２ｎｍ）で決定する。１００％溶解対照と比べた溶血パーセンテージを決定する。アッセイ混合物中の細胞の５０％を溶解させるために必要な血清希釈度を決定することにより、補体活性を定量化する。結果は、この希釈度の逆数としてＣＨ５０単位／ｍｌ血清単位で表す。
簡潔に言えば、ＡＨ５０アッセイは、第二経路の活性化によるヒト血清による非感作ウサギ赤血球（Ｅｒａｂ）の溶解に依存する。アッセイ緩衝液にカルシウムキレーターエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を加えることによりカルシウム依存性古典経路の活性化を阻止し、及びこの緩衝液に、両方の経路に必要なマグネシウムを加える。簡潔に言えば、ＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液にウサギＲＢＣ（２×１０８細胞／ｍｌ）の細胞懸濁液を調製する。正常ヒト血清（ＮＨＳ）の段階１．５倍希釈物（１：４、１：６、１：９、１：１３．５、及び１：２０．２５）又はＮＨＳと外因性抗原発現ＥＨＣとの混合物の同様の希釈物をＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液に調製し、１００μｌの各血清希釈物を５０μｌの標準化Ｅｒａｂに加える。ＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液とインキュベートしたＮＨＳを対照として使用する。次にこの混合物を、振盪水浴中で細胞を懸濁下に保ちながら３７℃で６０分インキュベートし、１．２ｍｌの氷冷ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）を使用して反応を停止させる。チューブを１２５０ｇ、４℃で１０分間スピンして細胞をペレット化し、上清の光学濃度を分光光度法（４１２ｎｍ）で決定する。バックグラウンド対照は１００μｌのＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液、及び５０μｌのＥｒａｂを有し、１０％の総溶解を超えない。総溶解物対照チューブにおいて５０μｌ Ｅｒａｂ懸濁液に１００μｌの蒸留水を加え、１００％溶解対照と比べた溶血のパーセンテージを決定する。アッセイの結果を計算し、アッセイ混合物中の細胞の５０％を溶解させるために必要な血清希釈度を決定することにより、補体活性を定量化する。結果は、この希釈度の逆数としてＡＨ５０単位／ｍｌ血清単位で表す。
実施例２７：血小板に負荷したチミジンホスホリラーゼの活性
Ｃ末端にＨＡタグを有するチミジンホスホリラーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築する。本明細書に記載されるとおり前駆細胞から血小板を培養する。本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によってトランス遺伝子を培養血小板前駆細胞に導入する。培養血小板内でのチミジンホスホリラーゼの発現を、本明細書に記載されるとおり、抗ＨＡ検出抗体を使用してウエスタンブロッティングにより評価する。
チミジンからチミンへの変換率を定量化することにより、血小板試料においてチミジンホスホリラーゼ活性を決定する。予備実験を行って、時間及び酵素希釈度に対する線形代謝産物形成動態を決定する；この方法は、４．０〜７１９ｎｍｏｌ／分／ｍｌのチミンホスホリラーゼ範囲（１０〜９０８８の試料希釈度範囲に対応する）に対し、１６分まで線形であることが示される。解凍した試料を１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１：７１０希釈することにより、透析前試料培養血小板及び対照血小板試料のライセートを調製する。次に２５ｕｌの血小板溶解物を１００ｕｌリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．５）及び２５ｕｌチミジン標準（１０ｍＭ）に加え、混合し、３７℃で１０分間インキュベートする。この反応は２５ｕｌの４０％ＴＣＡで停止させる。血小板溶解物を加える前にＴＣＡをリン酸ナトリウム緩衝液／チミジンインキュベーション混合物に加えることにより、アッセイブランクを調製する。試料を１３，４００×ｇで２分間遠心し、上清を振盪機において水飽和ジエチルエーテルで２分、２回洗浄して、ＴＣＡを抽出する。エーテルがＨＰＬＣ分離を妨害しないように、マトリックスを５分間曝気してエーテルを蒸発させることにより、有効な除去を達成する。ＨＰＬＣに１０ｕｌの試料容積を投入する。
基質及び生成物のクロマトグラフ分離は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ２７９５システムを使用した均一濃度溶離による逆相クロマトグラフィーを用いて達成する。予め充填されたＣ１８カラム（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ １２５ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ、５ｕｍ粒度、Ｗａｔｅｒｓ）を固定相として使用した。ＨＣｌでｐＨ２．７０に調整したイオン対生成剤硫酸水素テトラブチルアンモニウム（５ｍＭ）を含有する酢酸アンモニウム（４０ｍＭ）の移動相を使用して、１．０ｍｌ／分の流量で送り、８分のラン時間で分析物を溶離させる。ＵＶ検出は２５４ｎｍ及び０．１吸光度単位フルスケールである。スペクトルを純粋標準と比較して代謝産物を同定する。
実施例２８：血小板によって提示されるグッドパスチャー抗原の活性
介在するＨＡタグを有してＣＤ４２ｂ（ＧＰ１Ｂ、ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＨ２７９５５．１）のＮ末端に融合したコラーゲンα３（ＩＶ）（ＣＯＬ４Ａ３）ＮＣ１ドメイン抗原をコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築する。血小板を本明細書に記載されるとおり前駆細胞から培養する。本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によってトランス遺伝子を培養血小板前駆細胞に導入する。培養血小板における外因性抗原の発現を、本明細書に記載されるとおり抗ＨＡ検出抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価する。
グッドパスチャー症候群に罹患している患者から血清を採取し、その血清を市販のＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＣＯＬ４Ａ３ ＥＬＩＳＡキット）によって抗ＣＯＬ４Ａ３抗体に関して試験する。この抗ＣＯＬ４Ａ３血清を一次検出抗体として使用し、及び蛍光抗ヒトＩｇＧを二次検出抗体として使用して、抗原を発現する血小板の結合能を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。
この抗原を発現する血小板を使用して、インビボでの血小板によって促進される循環抗原のクリアランスをマウスにモデル化する。ＮＳＧマウスに、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０色素で蛍光標識した１００ｕＬのマウス抗ヒトＣＯＬ４Ａ３抗体（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ）を注射する。次に外因性抗原を発現するＣＦＳＥ標識培養血小板（１マウス当たり１０８）を尾静脈から注射する。１０分、３０分、２時間、１２時間、及び２４時間で顎下部位から血液を採取する。血液を遠心して多血小板画分を収集し、次にそれを染色して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析する。ＣＦＳＥ−Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０ダブルポジティブ集団をトラッキングすることにより、血小板による抗体捕捉を決定する。
実施例２９：インビボ活性（マウス）
本明細書に記載されるとおりマウス赤血球系細胞を培養する。赤血球系前駆細胞に、本明細書に記載されるとおりレンチウイルスを使用して、好適である、例えば補体受容体１（ＣＲ１）をコードする外因性抗原ポリペプチドトランス遺伝子を形質導入する。本明細書に記載されるとおり細胞を培養して最終分化させる。細胞における外因性タンパク質の存在を、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。細胞の検出を促進するため、細胞を蛍光色素、例えばＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で製造者の指示に従い標識する。ループスのＮＺＢＷＦ１／Ｊマウスモデル、又は好適な外因性抗原ポリペプチドに対応する他の適切な疾患若しくは活性モデルに細胞を注射し、約１×１０８個の細胞を尾静脈から注射する。複数の時点で顎下穿刺によって血液を採取する。ラジ細胞アッセイによって血漿中の免疫複合体レベルを検出する。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．９７６，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５７（１）：１６９を参照されたい。採取した血液試料中のＣＦＳＥ蛍光細胞の割合をトラッキングすることにより、培養細胞の薬物動態を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。マウスの全般的な健康を、免疫複合体沈着及び炎症媒介性の損傷をトラッキングするための腎組織の組織学を含め、肉眼的剖検によって評価する。
実施例３０：迅速スクリーニング
細胞株、例えば２９３Ｔ及びＫ５６２は、発現及び培養サイクル（約１日）が培養赤血球系細胞（数日〜数週間）と比較して短い。これらの細胞株を使用して、好適な外因性抗原ポリペプチドをコードする遺伝子ライブラリを高速で繰り返し適用し、最も高い発現又は活性を有する外因性抗原ポリペプチドを同定することができる。
好適な外因性抗原ポリペプチドトランス遺伝子、例えば補体受容体１（ＣＲ１）の完全長及びより短い変異体のライブラリを、本明細書に記載されるとおりポリメラーゼ連鎖反応及びギブソンアセンブリによって構築する。このトランス遺伝子のライブラリを、本明細書に記載されるとおりリポフェクタミンを使用してマイクロタイタープレートにおいて並行方式でＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、本明細書に記載されるとおりレンチウイルスを使用してＫ５６２細胞に形質導入する。２４〜４８時間後に外因性抗原の発現を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される蛍光免疫複合体の捕捉により、及び本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される培養単球への蛍光免疫複合体のトランスファーにより、ライブラリ中の外因性抗原の各々の活性を評価する。次にライブラリからの最も機能性である（例えば、最も高度に発現する、最も多く免疫複合体を捕捉する、又は免疫複合体を単球に最良にトランスファーする）外因性抗原を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルスを使用して本明細書に記載されるとおり並行赤血球系細胞培養物に個々に形質導入する。培養赤血球系細胞における各外因性抗原の発現は、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。培養赤血球系細胞における各外因性抗原の活性は、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される蛍光免疫複合体の捕捉により、及び本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される培養単球への蛍光免疫複合体のトランスファーによって評価する。
実施例３１：インビボでのＲＢＣのクリアランス速度の評価
免疫不全マウスモデルにおいてインビボで赤血球系細胞のクリアランス速度を評価した。−１日目にＮＳＧマウスを１００ｕＬのクロルドネートリポソーム（ｃｌｏｒｄｏｎａｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（Ｃｌｏｄｒｏｓｏｍｅｓ．ｃｏｍ）溶液で処置し、マクロファージを選択的に枯渇させた。細胞を蛍光タグＣＦＳＥで標識し、約１×１０８個の細胞を各マウスに尾静脈から注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取し、血液細胞を回収した。細胞を抗ヒトＧＰＡ抗体で共染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒト赤血球系細胞は、ＣＦＳＥシグナルによって、及びヒトＧＰＡシグナルによってマウス赤血球系細胞と区別された。
治療上の適用には、培養赤血球系細胞、及び細胞内か或いは表面上に外因性タンパク質を含有する培養赤血球系細胞が、生体内で正常に循環することが重要である。これは、標準的な免疫不全マウスモデルを使用して図９に示される。図９Ａにおいては、注射したマウスから採取した血液をフローサイトメーターで分析する。培養ヒト赤血球系細胞は、プロットの右上の象限に、ＣＦＳＥ及びヒト−ＧＰＡがダブルポジティブと同定される。図９Ｂにおいては、マウスにヒト赤血球（塗り潰しの丸）、培養除核赤血球系細胞（破線上の菱形）、細胞内外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（点線上の四角形）及び表面外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（白色の三角形）を注射した。ヒト細胞のクリアランス速度は、最初の時点（注射後２０分）に対してスケーリングした時間に対する残存ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージとして計測される。４つの試料間にクリアランス速度の有意な差はない。
これらのデータは、培養除核赤血球系細胞の循環が正常ヒト赤血球と実質的に同様であることを明らかに実証している。さらに、細胞内空間又は細胞の表面上のいずれで発現する外因性タンパク質も、これらの細胞の循環挙動に実質的に影響を及ぼさない。これは、この技術の治療的解釈にとって重要な結果である。
実施例３２：有害循環事象の評価
循環中の培養赤血球系細胞によって引き起こされる有害事象の発生を、培養赤血球系細胞を注射した動物における血中のフィブリノゲン崩壊産物の検出及び組織学によって評価した。
フィブリノゲン崩壊産物の検出。本明細書に記載されるとおりマウスに培養赤血球系細胞を注射した。マウスから血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。遠心によって細胞を分離し、血漿を収集した。マウス血漿中のフィブリノゲン崩壊産物フィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢのレベルをＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ）によって製造者の指示に従い計測した。
組織学。同じマウスの組織試料を死体解剖後に採取した。組織をトリミングし、パラフィンワックスに包埋して切片化した。組織切片をＨ＆Ｅ染色及びトリクロム染色によって染色した。１０倍及び２０倍の拡大率で顕微鏡像を撮った。
治療上の適用には、培養赤血球系細胞及び外因性タンパク質を（細胞内又は表面上のいずれかに）含む培養赤血球系細胞が凝固カスケードの活性化及び組織血栓形成などの有害事象を誘導しないことが重要である。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、（１）ヒト赤血球、（２）培養除核赤血球系細胞、（３）細胞内外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞、（４）表面外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞、及び（５）組換えタンパク質単独を注射したマウスに関するマウス血漿中のフィブリノペプチドＡ及びＢのレベルを示す。凝固カスケードのフィブリノゲン崩壊及び活性化マーカーであるフィブリノペプチドＡ及びＢのレベルは、全ての試料で実質的に同程度である。
図１０Ｃ及び図１０Ｄは、培養除核赤血球系細胞（１０Ｃ）及び組換えタンパク質（１０Ｄ）を注射したマウスに関する脾臓の組織染色切片を示す。組織間に実質的な差はなく、試料のいずれの間においても、脾臓、肝臓、肺、脳、心臓、及び腎臓に同定可能な組織損傷は観察されなかった。
これらのデータは、外因性タンパク質を含む又は含まない培養赤血球系細胞が、マウスにおいて循環中にある間にいかなる有害事象も誘導しないことを決定的に実証している。
実施例３３：循環中における外因性タンパク質保持の評価
培養除核赤血球系細胞内及びその上での外因性タンパク質の保持をフローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによって評価した。
１．フローサイトメトリーによって評価した外因性タンパク質の保持
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、及びグリコホリンＡコード配列をコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した（１マウス当たり１×１０８細胞）。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。採取した細胞を蛍光抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞をＣＦＳＥ＋細胞と同定し、エピトープタグに関しても陽性染色されたＣＦＳＥ＋細胞の画分によって外因性タンパク質保持を評価した。
２．ウエスタンブロットによって評価した外因性タンパク質の保持
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。アデノシンデアミナーゼ及びＨＡエピトープタグをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した（１マウス当たり１×１０８細胞）。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。採取した細胞を洗浄し、溶解し、ＨＡエピトープタグに対する検出抗体で本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析した。
治療上の適用には、細胞内或いは表面上に外因性タンパク質を含む培養赤血球系細胞が循環中にある間にこれらのトランス遺伝子を保持することが重要である。当該技術分野においては、赤血球系細胞が循環中にあるとき、成熟し及び成熟するに従い基本的な機能に不要なタンパク質を除去する厳密なプログラムを受けることが広く仮定されている点を考えると、これは軽視できない成果である（Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１０）：２０２１−２０２７，Ｌｏｄｉｓｈ ＨＦ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７（１）：５９）。
図１１は、培養除核赤血球系細胞内及びその上で発現する外因性タンパク質が循環中に保持されたことを示す。図１１Ａでは、マウスに、抗体ｓｃＦｖを表面上に発現する培養除核赤血球系細胞を注射した。抗体ｓｃＦｖ陽性細胞の割合は約５０％で始まり、複数日の循環試験の継続期間中そのまま一定に保たれた。図１１Ｂでは、マウスに、ＨＡタグを有する細胞質酵素を発現する培養除核赤血球系細胞又はＨＡタグを有する組換え酵素のいずれかを注射した。ウエスタンブロットで分析したとき、実験の継続期間にわたり酵素が培養細胞内に保持されたことは明らかである。バンド強度の低下は実験中の細胞のクリアランスに起因し、前記細胞から外因性酵素が外れたことによるものではない。
これらのデータは、培養除核赤血球系細胞内及びその上で発現する外因性タンパク質が循環中において細胞内及びその上に保持されることを明らかに実証しており、これは治療上の関連性に大きい且つ前例のない意味を有する。
実施例３４：インビボでの半減期延長の評価
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。アデノシンデアミナーゼ及びＨＡエピトープタグをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した（１マウス当たり１×１０８細胞）。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。採取した細胞を洗浄し、溶解し、ＨＡエピトープタグに対する検出抗体で本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析した。
Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりリポフェクタミントランスフェクション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に導入した。７日後にＨＡアフィニティー樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者の指示に従い細胞培養上清からタンパク質を精製した。タンパク質濃度は２８０ｎｍの光の吸光度によって評価した。タンパク質（４０ｕｇ）を免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。血漿をＨＡエピトープタグに対する検出抗体で本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析した。
図１１Ｂでは、マウスに、ＨＡタグを有する細胞質酵素を発現する培養除核赤血球系細胞又はＨＡタグを有する組換え酵素を注入した。ウエスタンブロットで分析したとき、可溶性形態で注入したときと比較して、循環細胞内で発現したときには酵素の循環半減期が有意に延長されることは明らかである。
実施例３５：インビボでのクリアランス速度の評価 − 血小板
外因性チミジンホスホリラーゼを発現する血小板の集団を、本明細書に詳説される手順を用いて培養し、ＣＦＳＥで標識し、ＮＳＧマウスに尾静脈から注射する。ヒト供給源の天然血小板の集団を同様にＣＦＳＥで標識し、別のマウスに注射する。両方のマウスから１０分、１時間、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間の時点で試料を採取し、フローサイトメトリーを用いて血小板循環レベルを定量化する。天然血小板と培養血小板の半減期を比較する。
実施例３６：有害循環事象の評価 − 血小板
治療上の適用には、培養血小板及び外因性タンパク質を（細胞内又は表面上のいずれかに）含む培養血小板が凝固カスケードの活性化及び組織血栓形成などの有害事象を誘導しないことが重要である。培養血小板をＮＳＧマウスに尾静脈から注射した後、ＥＬＩＳＡによって製造者のプロトコルに従い（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ）マウス血漿中のフィブリノゲン崩壊産物フィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢを検出する。死体解剖後、ＮＳＧマウスの組織試料を採取する。組織はトリミングし、パラフィンワックスに包埋して切片化する。組織切片をＨ＆Ｅ染色及びトリクロム染色によって染色する。１０倍及び２０倍の拡大率で顕微鏡像を撮り、病原性の特徴について熟練の病理学者が評価する。
実施例３７：循環中における外因性タンパク質保持の評価 − 血小板
培養血小板内及びその上における外因性タンパク質の保持を、フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによって評価する。
細胞内外因性タンパク質を含むＣＦＳＥ標識血小板をマウスに尾静脈から注射する。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取する。血液を遠心して多血小板血漿を単離し、次にそれを溶解して、外因性タンパク質に存在するエピトープタグを染色してウエスタンブロットで分析する。
実施例３８：生成用ドナー細胞の入手
インフォームドコンセントを得た後、健康ＣＤ３４＋幹細胞ドナーが末梢血幹細胞動員のためにｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ又はＮｅｕｐｏｇｅｎ）、１０ｕｇ／ｋｇ／日ｓ．ｃ．を５日間受け、次に２日連続でアフェレーシスを受けて、動員されたＣＤ３４＋ＨＳＣが収集される。動員された末梢血からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によって単核細胞（ＭＮＣ）を単離し、２部に分ける。１部は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉプロトコルに関連して、抗ＣＤ３４被覆磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したＣＤ３４＋細胞の精製に使用する。ＣＤ３４＋画分の純度を制御する。次にＣＤ３４＋濃縮ＨＳＣを二段階培養法で直ちに使用するか、又は一段階培養法における使用時まで凍結する。
使用する完全培地（ＣＭ）は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）及び１０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）である。拡大には、１０％熱失活ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）を使用する。組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、胎児肝チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αは、Ｒ＆Ｄシステム（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から購入する。
実施例３９：生成用のスケールアップ
静置培養で細胞を１×１０５〜２×１０６細胞／ｍＬの密度に維持して、赤血球系細胞の容積を漸進的にスケールアップする。拡大段階は１０５／ｍｌで播種し、３〜７回の漸進的な容積替えを含む；１００ｍｌ、５００ｍｌ、１Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１００Ｌ。生成の過程において、細胞培地はＩＭＤＭ、ＦＢＳ、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、グルタミン、デキサメタゾン、βエストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びエリスロポエチンの組み合わせを含む。細胞が生成バイオリアクターに播種するのに適切な容積に達したところで、最終的なスケールアップ及び分化のために細胞を生成バイオリアクターに移し替える。
実施例４０：バイオリアクターでの細胞の培養（Ｗａｖｅ）
ＷＡＶＥバイオリアクター２／１０システムを操作マニュアルに従いセットアップする。端的には、Ｃｅｌｌｂａｇをロッキングユニットに組み付け、それを灌流モジュールに置く。このバッグを空気で膨張させた後、ウエイトをゼロに設定する。続いてバッグに適切な量の培養培地を充填し、少なくとも２時間インキュベートして培地を３７℃に到達させる。２つのポートを有する特別な設計のＤＵＲＡＮガラスボトルであるトランスファーフラスコでこのバッグに培地及び細胞を移し替える。フラスコの上部においてポートにフィルタを接続する。フラスコの底の近くの他方のポートにはチューブを組み付ける。トランスファーフラスコのチューブをＣｅｌｌｂａｇの供給接続部と結合する。トランスファーフラスコはＬＡＦフード内に維持し、汚染のリスクを低下させる。
灌流開始前、回収及び供給用のチュービング及び容器をＣｅｌｌｂａｇに接続する。チュービングは以下のとおり調製する；それぞれ３．２ｍｍ、６．４ｍｍの内径及び外径を有する５０又は７０ｃｍ長さのＳａｎｉｆｌｅｘ ＡＳＴＰ−ＥＬＰシリコーンチュービング（Ｇｏｒｅ／Ｓａｎｉｆｌｅｘ ＡＢ）は、両端に雄型ルアーロック接続部を備える。シリコーンチュービングを雌型ルアーロックを介してＣ−Ｆｌｅｘチューブの一端に接続する。Ｃ−Ｆｌｅｘチューブの他端に雄型ルアーロックを組み付け、その後チュービングをオートクレーブ処理する。全てのチューブ上にルアーロックをジップタイで適所に保持する。灌流に先立ち、供給及び回収の両方のため、シリコーン部品をＣｅｌｌｂａｇに接続し、Ｃ−Ｆｌｅｘ部品を５Ｌ容器（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｔａｉｎｅｒ）に接続する。全ての接続は層流キャビネット内で行う。
環境要因及び代謝要因を制御すると、培養下の赤血球系細胞の転写因子及び遺伝子調節タンパク質の発現又は活性を変えることができる。例えば、Ｃｓａｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０３（２）：４０２；Ｃｓａｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０（２）：２１８を参照されたい。反応器の入出力の制御をもたらすため微量送達システムを作成し、その主要構成要素は、内径が１００ｕｍの６０〜８０ｃｍ長さの溶融石英毛細管（＃ＴＳＰ１００３７５、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。入力端で、毛細管には、ＰＥＥＫルアーを介してＭｉｃｒｏＴｉｇｈｔアダプター（＃Ｐ−６６２、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続したｌｕｅｒ−ｌｏｋ先端ストックシリンジ（＃３０９５８５ ＢＤ）を送り込む。ストックシリンジはモデル３３ Ｔｗｉｎシリンジポンプ（＃５５３３３３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に装填し、４℃の冷蔵庫に保管する。出力端で、毛細管はバイオリアクターに入る：２ポートＦＥＰ細胞培養バッグ（＃２ＰＦ−０００２、ＶｕｅＬｉｆｅ）を３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーター内のオービタルシェーカーに置く。毛細管を針でセルフシールゴム隔膜（＃Ｂ−ＩＩＳ、ＩｎｔｅｒＬｉｎｋ）に通し、バイオリアクターの中間点まで送り込む。バイオリアクターの反対側のコネクタは、別のセルフシールゴム隔膜に交換する。ストックシリンジ及び送達毛細管は、使用前に、シリンジ及び毛細管壁にタンパク質が付着することを防ぐため１０％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ溶液で一晩ブロックする。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬａｂＶＩＥＷ ７．１を使用してプログラムを作成し、シリンジポンプの注入を制御する。このプログラムの基本的な投与戦略は、初回注射で濃度Ｌ１にし、待機時間ｔ１が続き、次に各々濃度Ｌ２にする注射と、続く待機時間ｔ２をｎ回繰り返すものである。使用者が、流量、ストック濃度、初期培養容積、注射後の所望の濃度、注射間の時間、及び総注射回数を入力する。
実施例４１：免疫原性及びトレランス誘導の評価
１．マウスにおけるトレランス誘導
マウスにおいて、抗原タンパク質、この例ではオボアルブミン（ＯＶＡ）を含む本発明の細胞組成物を逐次的に３回静脈内注射することにより、トレランスを誘導し得る。−７日目、−３日目及び−１日目、未処置マウスに遊離ＯＶＡ又は本発明の細胞組成物中で発現するＯＶＡ（細胞−ＯＶＡ）のいずれかを注射する。次に、強力な免疫反応を誘導するためポリＩ：Ｃアジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と混合した抗原を２回注射して、マウスをＯＶＡに対して免疫化する。
２．抗体力価の評価
マウス血清中のＩｇＧレベルを標準ＥＬＩＳＡによって判定する。簡潔に言えば、抗原タンパク質、例えばオボアルブミン（ＯＶＡ）を含む本発明の細胞組成物を注射したマウス、及び遊離又は組換えＯＶＡを注射したマウスの血液試料から種々の時点で血清を得る。抗原としてＯＶＡ（５０ｍＭ炭酸塩緩衝液中１μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．７）をアッセイプレート上に吸着させた標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いる。治療前又は未治療血清については１：５０〜１：２００の範囲、及び治療後血清については１：４００〜１：５００，０００の範囲で血清試料を段階希釈し、デュプリケートで試験する。吸着した組換えＯＶＡに対する血清中の抗ＯＶＡ抗体の結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗マウス免疫グロブリンを続いて発色基質で処理して比色分析によって検出する。
３．Ｔ細胞応答の分析
本明細書に記載するとおり抗原タンパク質ＯＶＡに対してトレランスが誘導される。ＯＶＡの免疫フェーズ注射の２回目の投与から７日後にマウスを安楽死させ、それらの脾臓を採取する。０．８％塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍ−Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、フランス）によるＲＢＣ溶解後に７０ミクロン細胞ストレーナーで臓器を濾すことにより、脾臓細胞懸濁液を得る。試料は全て、抗Ｆｃ受容体抗体（精製抗ＣＤ１６／３２、Ｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共にインキュベートして非特異的結合を妨げてから、分析用抗体と共にインキュベートする。脾臓細胞染色には、以下のモノクローナル抗体（Ａｂ）を使用する：ＰＣ５−抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ１４）及びＰＣ７−抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）。ＯＶＡペプチド−ＭＨＣ四量体（ＰＥ−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体）はＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから購入する。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより、抗ＣＤ８及びＯＶＡペプチド−ＭＣＨ四量体での染色によってダブルポジティブの細胞として同定する。この細胞集団のうち、活性化されるＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを、抗ＣＤ６２Ｌ抗体染色が陽性の細胞の割合によって決定する。
４．インビボＴ細胞溶解アッセイ
１０マイクログラム／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって未処理脾臓細胞に３７℃で１時間パルスを与え、次に、０．４μＭ ＣＦＳＥで標識する（ＣＦＳＥ低）。未処理脾細胞の対照集団は４μＭ ＣＦＳＥで標識する（ＣＦＳＥ高）。ＣＦＳＥ低及びＣＦＳＥ高細胞を１：１の比で組み合わせ、予め本明細書に記載するとおりＯＶＡ抗原に対して寛容化したマウス又は本明細書に記載するとおりＯＶＡ抗原で免疫化したマウスに対し、マウス当たり１×１０７個の細胞を静脈内経路で注射する。１６時間後、本明細書に記載するとおり脾臓単一細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーを用いて分析することにより、ＣＦＳＥ低／ＣＦＳＥ高細胞比を決定する。
実施例４２：培養赤血球系細胞の拡大及び分化を評価する
インビトロ分化細胞の拡大、分化、及び除核を評価して、トランス遺伝子の導入が培養下の細胞の品質に悪影響を及ぼさないよう確実にすることは重要である。拡大は、細胞計数によって評価する。分化は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、及びＲＴ−ＰＣＲによって評価する。除核は、フローサイトメトリーによって評価する。
細胞計数による拡大速度の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンター機器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してカウントする。細胞の拡大速度は、時間に伴う細胞数の増加によって決定する。
フローサイトメトリーによる分化の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、細胞表面マーカーＧＰＡ（ＣＤ２３５ａ）、ＣＫＩＴ（ＣＤ１１７）、及びＴＲ（ＣＤ７１）に対する蛍光抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）の１：１００希釈物で染色する。標識した細胞を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析する。
ウエスタンブロットによる分化の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、分化マーカーＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、バンド３、ＣＤ４４、及びアクチンに対する抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して、本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析する。
フローサイトメトリーによる除核の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、グリコホリンＡに対する蛍光抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び核酸染色剤ＤＲＡＱ５（Ｐｉｅｒｃｅ）により製造者の推奨する希釈度で染色し、本明細書に記載されるとおりＡｔｔｕｎｅフローサイトメーターで分析する。
顕微鏡法（ベンジジン−ギムザ）による除核の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してスライド上でスピンした。細胞は、ｃｙｔｏｓｐｉｎ後に−２０℃のメタノールによって室温で２分間固定し、水でリンスして風乾した。ベンジジン錠（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５９０５）を１０ｍＬ ＰＢＳで溶解し、そこに１０μＬのＨ２Ｏ２を加えた。この溶液を０．２２ｕｍシリンジフィルタでろ過した。スライド上の細胞スポットを３００〜５００ｕＬのベンジジン溶液で被覆し、室温で１時間インキュベートし、次に水で洗浄した。ギムザ染色液を水で１：２０希釈した（Ｓｉｇｍａ＃ＧＳ５００）。スライド上の細胞スポットを３００〜５００ｕＬのギムザ溶液で被覆し、室温で４０分間インキュベートし、水で洗浄して風乾した。次にスライドをマウントし、シールした後、顕微鏡でイメージングした。
図１２Ａは、トランス遺伝子を含む細胞（破線及び点線）及びトランス遺伝子を含まない細胞（実線）に関する７日間の拡大及び分化ウィンドウにおける培養下赤血球系細胞の拡大速度を示す。注目すべきことに、トランス遺伝子を含む培養細胞の拡大速度は、トランス遺伝子を含まない細胞の拡大速度と区別がつかない。
図１２Ｂは、細胞表面分化マーカーＧＰＡ及びＣＫＩＴに対する抗体で染色した細胞の一連のフローサイトメトリープロットである。この特定の分化段階では、細胞が最終的な成熟に近付くにつれ培養物はそのＣＫＩＴ発現を失い、且つそのＧＰＡ発現を増加させている。注目すべきことに、トランス遺伝子を含む培養細胞をこの分化尺度によってトランス遺伝子を含まない培養細胞と区別することはできない。
図１２Ｃは、表面マーカーＧＰＡに対する抗体及び蛍光ＤＮＡ染色剤で染色した細胞の一連のフローサイトメトリープロットである。３つの細胞集団が明らかである：（１）ＧＰＡ−高及びＤＮＡ−低の細胞、除核赤血球系細胞が含まれる；（２）ＧＰＡ−高及びＤＮＡ−高の細胞、遺伝物質をなおも含む赤血球系細胞が含まれる；及び（３）ＧＰＡ−低及びＤＮＡ−高の細胞、ピレノサイト、即ち除核細胞から放出された膜に囲まれた核が含まれる。注目すべきことに、トランス遺伝子を含む培養細胞をこの除核尺度によってトランス遺伝子を含まない培養細胞と区別することはできない。
細胞培養物へのトランス遺伝子の導入は、培養下の細胞の拡大速度、分化、又は除核速度に特に著しい影響を及ぼさない。
実施例４３：ヘモグロビン含量を評価する
１．全ヘモグロビン
赤血球ヘモグロビン含量をドラブキン試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品Ｄ５９４１）によって製造者の指示に従い決定した。簡潔に言えば、血液細胞をこの試薬と水性緩衝液中に合わせ、徹底的に混合し、標準的な分光光度計を使用して波長５４０ｎｍの光の吸光度を計測した。可溶性ヘモグロビン検量線を使用して細胞中のヘモグロビン含量を定量化した。
２．ＲＴ−ＰＣＲによるヘモグロビンタイピング
細胞を溶解したと共に、全ＲＮＡを回収する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ用第一鎖合成システム（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって製造者のプロトコルに従い逆転写を実施した。簡潔に言えば、全ＲＮＡ（５ｕｇ）を１０ｕＬ Ｈ２Ｏ中の１５０ｎｇランダムヘキサマープライマー及び１０ｎｍｏｌ ｄＮＴＰミックスと共に６５℃で５分間、次に氷上で１分間インキュベートした。反応マスター混合物を、２ｕＬ １０×ＲＴ緩衝液、４ｕＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｕＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、及び１ｕＬのＲＮＡｓｅＯＵＴと共に調製した。この反応混合物をＲＮＡ／プライマー混合物に加え、素早く混合し、次に室温に２分間置いた。各チューブに１ｕＬ（５０単位）のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを加え、混合し、２５℃で１０分間インキュベートした。この反応物を４２℃で５０分間インキュベートし、７０℃で１５分間熱失活させ、次に氷上で保存した。１ｕＬのＲＮアーゼＨを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。次にこの反応産物、第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ反応に必要になるまで−２０℃で保存した。
種々のヘモグロビン遺伝子及び対照遺伝子を増幅するためのプライマーは、ＩＤＴ−ＤＮＡから購入した。プライマーは以下のとおりであった：ｈＨＢＢ＿Ｆ − ｔｃｃｔｇａｇｇａｇａａｇｔｃｔｇｃｃｇｔ（配列番号９）；ｈＨＢＢ＿Ｒ − ｇｇａｇｔｇｇａｃａｇａｔｃｃｃｃａａａｇ（配列番号１０）；ｈＨＢＡ＿Ｆ１ − ｔｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｃａａｇａｃｃａａ（配列番号１１）；ｈＨＢＡ＿Ｒ１ − ｇｃａｇｔｇｇｃｔｔａｇｃｔｔｇａａｇｔｔｇ（配列番号１２）；ｈＨＢＡ＿Ｆ２ − ｃａａｃｔｔｃａａｇｃｔａａｇｃｃａｃｔｇｃ（配列番号１３）；ｈＨＢＡ＿Ｒ２ − ｃｇｇｔｇｃｔｃａｃａｇａａｇｃｃａｇ（配列番号１４）；ｈＨＢＤ＿Ｆ − ｇａｃｔｇｃｔｇｔｃａａｔｇｃｃｃｔｇｔ（配列番号１５）；ｈＨＢＤ＿Ｒ − ａａａｇｇｃａｃｃｔａｇｃａｃｃｔｔｃｔｔ（配列番号１６）；ｈＨＢＧ２＿Ｆ − ｃａｃｔｇｇａｇｃｔａｃａｇａｃａａｇａａｇｇｔｇ（配列番号１７）；ｈＨＢＧ２＿Ｒ − ｔｃｔｃｃｃａｃｃａｔａｇａａｇａｔａｃｃａｇｇ（配列番号１８）；ｈＨＢＥ＿Ｆ − ａａｇａｇｃｃｔｃａｇｇａｔｃｃａｇｃａｃ（配列番号１９）；ｈＨＢＥ＿Ｒ − ｔｃａｇｃａｇｔｇａｔｇｇａｔｇｇａｃａｃ（配列番号２０）；ｈ１８Ｓ−ＲＮＡ−Ｆ − ｃｇｃａｇｃｔａｇｇａａｔａａｔｇｇａａｔａｇｇ（配列番号２１）；ｈ１８Ｓ−ＲＮＡ−Ｒ − ｃａｔｇｇｃｃｔｃａｇｔｔｃｃｇａａａ（配列番号２２）。
２５ｕＬ ＳＹＢＲグリーンミックス（２ｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５ｕＬ 第１鎖ｃＤＮＡ、２ｕＬ フォワード／リバースプライマーペアミックス（各プライマー５ｐｍｏｌ／ｕＬ）と共に、５０ｕＬ Ｈ２Ｏの総容積でＲＴ ＰＣＲ反応混合物を調製した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＳＤＳ ７０００機器（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で以下の増幅サイクルを用いて反応を実行した：５０℃２分、１サイクル；９５℃１０分、１サイクル；９５℃１５秒−＞６０℃３０秒−＞７２℃３０秒、４０サイクル；７２℃１０分、１サイクル。解離曲線分析及びＲＴ−ＰＣＲ結果はＳＤＳ ７０００機器で行った。
実施例４４：培養血小板の評価分化 − ＦＡＣＳ
培養下の血小板の分化状態は、フローサイトメトリーによって評価することができる。巨核球（ＭＫ）は、最終的な血小板分化に先行する特徴的な細胞形態を表す。ＭＫに向かう成熟の程度を決定するため、１×１０６個の培養細胞（ＬＡＭＡ−８４及びＣＤ３４＋細胞）を洗浄し、次に（ａ）抗ＣＤ４１−ＦＩＴＣ（ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）又は抗ＣＤ７１−ＦＩＴＣ又は（ｂ）抗ＣＤ３３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４１−ＰＥ、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣｐ及びＣＤ３４−ＡＰＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識し、作成されたＣＤ４１細胞のパーセンテージを分析する。
倍数性の大きさを決定するため、分化型ＬＡＭＡ−８４細胞を４℃の７５％エタノール中に一晩固定し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５０μｇ／ｍｌ）で標識し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析する一方、１４日目の分化型ＣＤ３４＋細胞をメイ・グルンワルド／ギムザ染色後に、この染色で１細胞当たりの核の数及びＭＫの特異的形態を定量化することによって顕微鏡下で定量的に分析する。ＭＫ形態を有する細胞のみを分析する。ｃｙｔｏｓｐｉｎ調製物における多核細胞の存在が、倍数体ＭＫの存在の指標となる。分化型ＣＤ３４＋細胞を多核成熟ＭＫの存在に関して形態によって評価する。
実施例４５：培養血小板の評価分化 − ｑＰＣＲ
培養下の血小板の分化状態は、定量的ＰＣＲによって評価することができる。血小板ＲＮＡを抽出して培養細胞をさらに特徴付ける。全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出する。各血小板調製物の純度は血小板（ＧＰＩＩＩａ）及び白血球（ＣＤ４５）マーカーのＰＣＲ解析によって評価する。さらなる分析の前に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して血小板ＲＮＡの完全性を評価する。
細胞溶解物から全ＲＮＡを回収し、市販の合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡライブラリを作成する。標識したｃＤＮＡをＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量化し、３ｐＭに希釈してシングルレーンにロードし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ １Ｇゲノムアナライザー（Ｓｏｌｅｘａ）でシーケンシングする。
未加工配列を一連の品質管理基準でフィルタリングする。第一に、少なくとも６ｎｔの３’Ｓｏｌｅｘａアダプターが存在することを確認する。この基準に適合しなかった配列リードを破棄し、一方、残りをトリミングして、３’末端にあるアダプター配列を除去する。残りのタグを、その長さ（＞１０ｎｔ）、コピー数（＞４リード）及び可読性（＜９の同定されないヌクレオチド、アノテートされたＮ）に関してさらにフィルタリングする。続いてこれらの基準全てに適合するリードを有効なリードとして定義する。
有効なリードを全て、ｍｉＲＢａｓｅデータベースから抽出したプレマイクロＲＮＡに対してアラインメントする。２つ以上の前駆体と完全にマッチする配列タグをそれらの間に均等に分布させる。ドローシャ及びダイサーの不完全な切断を考慮するため、参照成熟マイクロＲＮＡ位置と比較したとき最大４ｎｔのシフトを許容して成熟マイクロＲＮＡ領域におけるプレマイクロＲＮＡと完全にマッチした任意の配列タグが、成熟マイクロＲＮＡと見なされる。マイクロＲＮＡ発現レベルは、小さいＲＮＡの総数が不変であることを考えると、有効なリードの総数に対して正規化した各成熟マイクロＲＮＡをマッピングするリードの数として定義される。各マイクロＲＮＡの相対的存在量は、成熟マイクロＲＮＡをマッピングするリードの総数と比較した各マイクロＲＮＡをマッピングするリードの数として定義される。
実施例４６：遠心による精製
培養細胞画分は遠心によって精製し、核及び夾雑代替密度細胞型（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ）から分離することができる。細胞を２００ｇで１５分間遠心して赤血球及び網赤血球リッチ画分を単離する。上清をピペットで取り除き、次に望ましい細胞画分を、１μＭプロスタグランジンＩ２の存在下で変性タイロード緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭデキストロース、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ ＫＣｌ２、０．３６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ含有、ｐＨ７．４）で洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁する。
実施例４７：化学的除核による精製
培養細胞の除核は、培養物に対する化学添加剤によって刺激することができ、これは精製前に細胞の除核画分の増加を促進し得る。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。回収の４８時間前、細胞を２１０ｍＭ Ｍｅ２ＳＯと共にインキュベートする。次に３５０×ｇ、室温で５分間遠心することによって細胞を回収し、２１０ｍＭ Ｍｅ２ＳＯ及び５ｕｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（又は他のアクチン又は核操作分子、即ちｐ３８ ＭＡＰＫ、ソラレン）を含有する新鮮培地に３×１０５細胞／ｍｌのレベルで再懸濁し、３７℃でインキュベートする。核のない細胞の割合を、ＤＲＡＱ５を核酸染色剤及びグリコホリンＡに対する抗体を赤血球表面分化マーカーとして使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。
実施例４８：音響泳動による精製
幾つかの機械的分離システムを使用して一様な細胞集団を得ることができる。フリーフロー音響泳動は、１つの機械的分離方法に相当する（Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ ２００７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）。ＣｓＣｌ（０．２２ｇ／ｍＬ）を含めて、栄養素添加剤と共に生理食塩水（０．９ｍｇ／ｍＬ）中に懸濁しながら、生理食塩水に加える。培養赤血球系細胞を含有する試料懸濁液を、２つの能動的出口（１つの出口につき流量０．１０ｍＬ／分）を有する音響泳動チップ（Ｃｅｌｌ−Ｃａｒｅ）を使用して処理する。
シリンジポンプ（ＷＰＩ ＳＰ２６０Ｐ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用してチップの流量を制御する。出口は全て、Ｔｅｆｌｏｎチュービングを使用した注入器を介して精密ガラスシリンジ（１００５ ＴＬＬ及び１０１０ ＴＬＬ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｂｏｎａｄｕｚ、スイス）に個々に接続しており、出口流量の独立した制御が可能である。クリーン流体入口はシリンジポンプに接続し、及び細胞懸濁液入口はＴｅｆｌｏｎチュービング（０．３ｍｍ内径）の５０ｍｍ長さ部品に接続し、このチュービングの他端はビーカーに浸されており、そのビーカーから試料懸濁液が、正味の出口流量とクリーン流体入口流量との差によって定義される速度で吸引される。
分離チャネルの壁間に定在波を生じさせるために使用される超音波は、チップの裏面に取り付けられた２０×２０ｍｍの圧電セラミック（Ｐｚ２６、Ｆｅｒｒｏｐｅｒｍ Ｐｉｅｚｏｃｅｒａｍｉｃｓ ＡＳ、Ｋｖｉｓｔｇａｒｄ、デンマーク）を使用して生成する。超音波ゲル（Ａｑｕａｓｏｎｉｃ Ｃｌｅａｒ、Ｐａｒｋｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ）が、両者の間の良好な音響結合を確実にする。圧電セラミックは、関数発生器（ＨＰ ３３２５Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に接続された電力増幅器（モデル７５Ａ２５０、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｄｅｒｔｏｎ、ＰＡ）によって作動する。音波が裏側からチップに入るとしても、結晶構造の３軸に沿って機械的振動が結合する結果として、分離チャネルの側壁間に定在波が誘導される。
この分離プロセスは、標準的な顕微鏡及び電力計（４３ Ｔｈｒｕｌｉｎｅ電力計、Ｂｉｒｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｒｐ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用してモニタする。続いてこのプロセスは、信号周波数、作動出力、及び流量を調整することにより制御できる。
試料中の細胞サイズ分布はコールターカウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して分析する。各試料を電解質（Ｉｓｏｔｏｎ ＩＩ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）と混合し、１００ｕｍアパチャーを使用して分析する。溶血レベル、即ち損傷を受けた赤血球からの遊離ヘモグロビンの濃度を光度計（血漿／低ＨＢ光度計、ＨｅｍｏＣｕｅ ＡＢ、Ａｎｇｅｌｈｏｌｍ、スウェーデン）を使用して計測する。
実施例４９：エキソビボ成熟による精製
完全には成熟していない赤血球系細胞は、天然のインビボ成熟トリガーを模倣するシステムにおいてエキソビボでインキュベートすることにより、成熟に至るよう促進することができる。
１．間質細胞との共培養
培養の最終段階において、赤血球系細胞をサイトカイン不含の新鮮培地中の付着間質細胞層上で培養する。培養物は３７℃で５％ＣＯ２空気中に維持する。付着細胞層は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、正常成人全骨髄から樹立されたＭＳ−５間質細胞株又は間葉間質細胞（ＭＳＣ）のいずれかからなる（Ｐｒｏｃｋｏｐ，ＤＪ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７１を参照）。付着ＭＳＣは、共培養で使用する前に、少なくとも２代の連続継代で拡大及び精製する。
２．フィブロネクチン被覆プレートにおける培養
培養の最終段階において、ヒトフィブロネクチンを吸着させたプレートで赤血球系細胞を培養する。このようなプレートを作製するには、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＬ滅菌Ｈ２Ｏ／ｍｇタンパク質で再構成し、３７℃で少なくとも３０分間溶解させる。少量の不溶材料が残り得る。これが産物のパフォーマンスに影響を与えることはない。フィブロネクチン溶液を滅菌平衡塩類溶液中に１００倍希釈し、最少容積で培養表面に加える。培養表面を室温で少なくとも４５分間風乾させる。過剰のフィブロネクチンを吸引によって取り除く。
実施例５０：磁気泳動による精製
赤血球系細胞を磁気泳動によって分離し、濃縮し、及び／又は精製する戦略は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｚｂｏｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８４（４）２６３８及びＪｉｎ＆Ｃｈａｌｍｅｒｓ ２０１２，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１２ ７（８）：ｅ３９４９１を参照されたい。市販の磁気分離システム（４つのＭｉｄｉＭＡＣＳ（商標）分離ユニット及びＬＤカラムを組み合わせるＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）セパレーター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用してＨＳＣ由来の赤血球培養物から赤血球を磁気的に濃縮する。窒素（Ｍｅｄｉｐｕｒｅ（商標）窒素、濃度＞９９％、Ｐｒａｘａｉｒ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を充満させたＧｌｏｖｅ−Ｂａｇ（商標）膨張式グローブチャンバ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）において細胞を脱酸素化する。脱酸素化前に全ての材料及び機器を、分離システム、脱気した滅菌緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ＢＳＡ）、及び滅菌コレクションチューブを含めてグローブバッグに置き、次にバッグをきつく密閉する。Ｎ２ガスを充満させた膨張式グローブチャンバの内部で酸素欠乏条件下に保たれているＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）セパレーターに置かれたＭＡＣＳ（登録商標）ＬＤカラムに、脱酸素化培養物を直接ロードする。磁石内に入ったカラムを通り抜ける細胞は陰性画分と分類され、これは「非磁性」と予想され、ＨＳＣ及び最終的な成熟前の赤血球系細胞が含まれる。分離カラムに保持される細胞は陽性画分と分類され、これは「磁性」であり、機能性ヘモグロビンで略充満した成熟ＲＢＣ様細胞からなる。これらの細胞は、ＬＤカラムを磁石から取り外した後にそこから溶出する。分離終了後、回収された細胞を曝気することにより、酸素化した細胞が可逆的に回復する。
実施例５１：ＦＡＣＳによる精製
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｒｉａ ＩＩｕセルソーターを使用して赤血球培養細胞の集団を選別する。選別前に細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、グリコホリンＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する蛍光抗体及び核酸染色剤ＤＲＡＱ５（Ｐｉｅｒｃｅ）によって製造者の推奨する希釈度で染色する。２８，０００滴／秒の滴下駆動周波数で１００μｍノズルを使用する。試料閾値速度は約４０００イベント／秒である。全選別時間にわたり温度制御オプションを使用して試料及びコレクションチューブを４℃に維持する。加えて、選別の間中試料撹拌機能を２００ｒｐｍで使用して、試料の沈降を防止する。試料は、シリンジから分注される約７５０μのアリコートに選別される。一方、これらの中断中はコレクションチューブを４℃に保ち、遮光し、穏やかに混合した後に選別を再開する。選別した試料は、１０％ＦＣＳを補充した２５０μｌ ＤＭＥＭが入った１２×７５ｍｍホウケイ酸ガラスコレクションチューブに回収する。
実施例５１：細胞の酵素処理による精製
同種赤血球を供給源とするにおいては、Ａ及びＢ抗原を除去して万能に適合する産物を生成することが有益であり得る。これは、ガラクトース基を選択的に切断して赤血球系細胞を免疫原性の点でより有利なものにする能力を有する一組の酵素によって促進し得る。
エンド−β−ガラクトシダーゼの２種類の組換えタンパク質（当初はクロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）から同定されている）を、標準的なクローニング方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１で産生する。Ａ／Ｂ Ａｇを遊離させるためのＡＢアーゼ及び異種移植において高度に免疫原性であることが知られ、且つＡ／Ｂ Ａｇと似た糖鎖構造を有するＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ Ａｇ）を遊離させるためのエンド−β−ガラクトシダーゼＣ（ＥｎｄｏＧａｌＣ）を調製する。ＡＢアーゼは血液型Ａ［ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ］及び血液型Ｂ［Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ］においてＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合を切断する。
簡潔に言えば、ＡＢアーゼのクローニング後、シグナルペプチドを有しないｐＥＴ−１５ｂベクターｅａｂＣに、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する発現プラスミドを構築する。この外因性遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１細胞に形質転換する。細胞で可溶性タンパク質画分として産生される酵素をニッケル−ニトリロ三酢酸カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製する。最後に、３．６ｍｇ／ｍＬの濃度で比活性が１５００Ｕ／ｍｇの５ｍＬの精製組換えＡＢアーゼが得られる。酵素活性の１単位は、毎分１μｍｏｌの基質を加水分解するために必要な酵素の量として定義される。
Ａｇの存在、Ａｂ結合及び補体活性化に対するＡＢアーゼ処理の効果を調べる。ヒトＡ／Ｂ ＲＢＣをＡＢアーゼで消化し、交差反応性を有する（それぞれＢ型、Ａ型又はＯ型を含む抗Ａ又は抗Ｂ又は抗Ａ及びＢ）ヒト血清と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析に供する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して血液型Ａ、Ｂ及びＧａｌ Ａｇの発現レベルを定量化する。消化レベルは、ＡＢアーゼの非存在下でインキュベートした後にＲＢＣ上で発現する血液型Ａ又はＢ Ａｇに対するパーセンテージとして表される。
３人の健常ヒトボランティアから新鮮血液型Ｏ血清をプールし、−８０℃で凍結して、使用時まで内因性補体活性を維持する。熱失活させた（５６℃で３０分間）血清を使用してＡｂ結合を分析する。酵素（ＡＢアーゼ）消化を伴う又は伴わないＲＢＣを、０．２％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈した５０％血液型Ｏ血清（１００μＬ）と共に３７℃で３０分間インキュベートする。洗浄後、ＲＢＣをＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）（×３０、１００μＬ）と４℃で３０分間反応させて、次にフローサイトメトリー分析に供する。
補体活性化に対する酵素処理の阻害効果もまた、Ｃ３ｄ沈着の変化によって評価する。ＲＢＣを補体活性の存在下において５０％ヒト血清と共に３７℃で１５分間インキュベートした後、ＲＢＣをＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＣ３ｄ Ａｂ（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）（×１００、１００μＬ）と４℃で３０分間反応させ、次にフローサイトメトリー分析にかける。対照レベル（酵素の非存在下）のパーセンテージをＭＦＩに基づき計算し、Ａｂ結合及びＣ３ｄ沈着に対する酵素処理の阻害効果を評価する。
実施例５２：遠心による血小板の精製
血小板は、混合細胞懸濁液から遠心によって精製することができる。約４０ｍｌの全血を、抗凝固薬として使用される３．２％のクエン酸ナトリウムと共に採血チューブに分配する。このチューブを４００×ｇで１０分間遠心する。この段階後、３層の境界が明確に画定される：血漿、赤血球、及び中間域。血漿が上にあり、血小板、赤血球は密度が高いため、下にある；及び微細な白みがかった中間域は、より大きい血小板及び白血球からなり、バフィーコートと呼ばれる。Ｊｅｌｃｏ １８Ｇ針を使用して、血小板を含む血漿の上部を抜き取り、バフィーコートを、ここでは添加剤無しに２本の別のチューブに入れる：一方のチューブは血漿を作製するため（Ｐチューブ）及び他方はトロンビンを作製するため（Ｔチューブ）である。僅か１．５ｍｌの血漿のみを使用してトロンビンを作製し、そこに１０％で０．５ｍｌのグルコン酸カルシウムを加え、３７℃で１５分間ダブルボイラーに置く。次に２本のチューブを、ここでは８００×ｇで、同じ長さの時間にわたり（Ｔ＝１０分）再度遠心する。この最後の遠心後、Ｔチューブにはトロンビンリッチの液体が含まれ、一方、Ｐチューブには血小板沈渣及びいくらかの赤血球（赤血球−血小板凝集塊）が含まれる。この段階で、総血漿容積の３分の２を取り除いて容積を減らす。取り除く部分は乏血小板性であり、一方、沈降した血小板（撹拌することによって容易に分散し得る）を含む残りの部分は多血小板性である。
実施例５３：チミジン取込み
細胞集団の自己複製能力は、当該技術分野において公知のチミジン取込みアッセイを用いて評価することができる。例えば、Ｈａｒｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １８６Ｌ２８８及びＴａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．１９９２ ＰＮＡＳ ８９：８９２８を参照されたい。
簡潔に言えば、均一に１３Ｃ及び１５Ｎ濃縮したチミジン［Ｕ−１３Ｃ，１５Ｎ−ＴｄＲ］をＭａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）から入手し、及び３Ｈ−ＴｄＲ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から購入する。培地及び緩衝液はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から入手する。ホスホジエステラーゼを除く全ての酵素はＢｏｅｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からのものである。ホスホジエステラーゼＩＩはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）から入手する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）溶媒はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）からのものであり、含まれる蒸発残留物質は＜０．１ｐｐｍの蒸発残留物質であった。
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。培養後、チミジン取込みアッセイで使用するため細胞を回収する。
最終チミジン濃度が１μＭに達するように非濃縮チミジンを添加して、細胞を１．６μｇ／ｍｌの［Ｕ−１３Ｃ，１５Ｎ］−ＴｄＲで１８時間標識する。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、補足ＤＭＥＭで６時間以上培養してから３Ｈ−ＴｄＲを指示濃度（０．１〜１０μＣｉ／ｍｌ）で加え、さらに１８時間インキュベートする。この試料に非標識チミジンを加えて最終チミジン濃度を０．１３μＭにする（これは、１０μＣｉ放射性標識／ｍｌを受ける試料中の３Ｈ−ＴｄＲ濃度と均等である）。３Ｈ−ＴｄＲの除去後、補足ＤＭＥＭ中で細胞をさらに６〜５４時間インキュベートした後、ＤＮＡを単離する。
ＤＮＡは、改良Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して抽出する。試料中の細胞の数に基づき、スケールアップ／スケールダウン手順を用いて添加試薬容積を決定する。例えば、１×１０７個の細胞を使用する場合、３２８μｇのプロテイナーゼＫを含有する２１μｌが３ｍｌの細胞溶解物溶液に加えられる。混合後、試料を室温に一晩放置する。翌日、１０μｇのＲＮアーゼを加え、試料を混合し、３７℃で２時間インキュベートする。タンパク質沈殿溶液（１ｍｌ）を加え、試料を氷上で５分間インキュベートする。２０００ｇで１０分間遠心した後、ＤＮＡを含有する上清を３ｍｌの１００％２−プロパノールと混合し、５０回、又はＤＮＡの白色の糸が見えるようになるまで、穏やかに反転させる。次に試料を２０００ｇで５分間遠心する。得られたＤＮＡペレットを５分間乾燥させた後、３ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、再び２０００ｇで５分間遠心する。この最終ペレットを風乾させ、次に脱イオン化Ｈ２Ｏで再水和さて、２６０ｎｍの吸光によって定量化する。複製対照として、ＣＤ３４＋幹細胞に同じ手順を適用する。
３分間煮沸することによりＤＮＡを全て変性させて、次に氷上で急速に冷却する。０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度で酵素加水分解手順を実施する。以下のプロトコルは、ＤＮＡ溶液１ミリリットル当たりに加える試薬容積を記載する。ＤＮＡは、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＺｎＣｌ２、及び１Ｍトリスを含有する１０μｌの緩衝液、ｐＨ７．２中の１０μｌのヌクレアーゼＰ１（０．５Ｕ／μｌ）及び５μｌのＤＮアーゼＩ（４Ｕ／μｌ）によって４５℃で２時間加水分解し、続いて２０μｌホスホジエステラーゼ（４ｍＵ／μｌ）を加え、３７℃で２時間さらにインキュベートする。最後に、５μｌの１０Ｍ 酢酸アンモニウム（ｐＨ９．０）及び１０μｌのアルカリホスファターゼ（１Ｕ／μｌ）を加え、試料を３７℃でさらに２時間インキュベートする。
消化したＤＮＡ試料を０．２２μｍナイロンフィルタでろ過する。この試料をＨＰＬＣ／ＣＲＩ／ＩＲＭＳシステムで、４．６×２５０ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−１８−Ｓ ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を使用して分析する。同じ溶媒系を１ｍｌ／分及び５％〜２５％ Ｂの直線勾配で１５分間使用する。
ＨＰＬＣによって分離した後、化学反応界面質量分析法（ＣＲＩＭＳ）を用いてデオキシヌクレオシドを分析する。この方法では、ヘリウム流によって駆動される噴霧及び脱溶媒和系にデオキシヌクレオシドが流れ込み、そこでデオキシヌクレオシドは乾燥粒子ビームとして現れる。このインライン生成されたＣＯ２からの１３ＣＯ２／１２ＣＯ２存在量が、Ｆｉｎｎｉｇａｎ／ＭＡＴ Ｄｅｌｔａ Ｓ同位体比質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及びそれに付属するＩｓｏｄａｔデータシステムで決定される。５−フルオロデオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）が内部同位体比標準として使用される。
各試料から３個のヌクレオシド：Ｔ、ｄＡ、及びｄＧの同位体比（以下の式中ではＩＲ）を得る。各ＤＮＡ由来デオキシヌクレオシドから生じるＣＯ２濃縮は、式（１３）ＣＯ２（１ｍｉｌ当たり）＝１０００×（ＩＲ実験−ＩＲ標準）／ＩＲ標準によって計算される。最も高いレベルの内部均一性を維持し、且ついかなる実験間のずれも回避するため、全ての実験についてＴの同位体比からｄＧの同位体比を減じる。安定同位体標識期間の終わり（０日目）からウォッシアウトの終わり（３日目）までのデータを評価する。
実施例５４：核物質の定量化
ＤＮＡを含有する混合集団中の細胞の数を、ＤＮＡ染色剤ＤＲＡＱ５（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用したフローサイトメトリーによって評価する。細胞を染色剤と共に製造者の指示に従いインキュベートし、フローサイトメーター、例えばＡｔｔｕｎｅサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析する。所定の核物質含量閾値を上回る細胞の割合を定量化する。
実施例５５：インビトロ腫瘍原性アッセイ
細胞の複製能を評価するには、軟寒天コロニー形成アッセイを実施することができる。端的には、０．５％寒天＋１×ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ溶液を作ることによって基本寒天層が作り、全成分を４０℃に加温し、１．５ｍＬのこの溶液を３５ｍｍペトリ皿に加える。使用前にこの寒天を室温で３０分間凝固させる。
０．７％アガロースを電子レンジで融解させて４０℃に冷却することにより、上層アガロースを調製する。２×ＲＰＭＩ＋２０％ＦＣＳ溶液を４０℃に加熱する。細胞をカウントし、２００，０００細胞／ｍＬの密度で１プレート当たり５０００細胞でプレーティングするように調製する。１０ｍＬチューブに０．１ｍＬの細胞懸濁液を加え、続いて３ｍＬの温かい０．７％アガロース及び３ｍＬの温かいＲＰＭＩ／ＦＣＳ溶液を加える。この溶液を静かにかき回して混合し、３つ又は４つのレプリケート基本寒天プレートの各々に加える（１．５ｍＬ）。
プレートを加湿インキュベーターにおいて３７℃で１０〜３０日間インキュベートする。週１〜２回、細胞に０．７５ｍＬ／プレートの細胞培養培地を供給する。
コロニー形成を評価するため、プレートを０．５ｍＬの０．００５％クリスタルバイオレットで１時間超染色する。解剖顕微鏡を使用してコロニーをカウントする。
実施例５６：インビボ腫瘍原性アッセイ
最終分化した培養赤血球系細胞を様々な動物モデルに移植して潜在的な腫瘍原性を評価する。様々なモデルから幾つかの組織を採取し、組織学的、免疫化学的、及び蛍光アッセイで分析して腫瘍原性を定量化する。
動物には、移植２日前から開始して毎日ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｏｖａｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ、Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ）の腹腔内注射を投与する。ＮＫ細胞を枯渇させるため、一部のラットには、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣｓＡ腹腔内注射に加え、抗ＮＫＲ−Ｐ１Ａ（クローン１０／７８、マウスＩｇＧ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はそれぞれのアイソタイプ対照（クローンＰＰＶ−０６、マウスＩｇＧ１、Ｅｘｂｉｏ、Ｐｒａｇｕｅ、チェコ共和国）を投与する。抗ＮＫＲ−Ｐ１Ａ ｍＡｂ（クローン１０／７８）はｍＡｂ（クローン３．２．３）と同じエピトープを標的にする。赤血球系細胞の注射前日に１ｍｇのそれぞれの抗体を投与し、続いて細胞移植後４日目に０．５ｍｇを投与する。
これらの実験の開始前、赤血球系細胞移植後０日目及び４日目、及び剖検時（９２日目）に血液試料を採取し、フローサイトメトリーによって血中のＮＫ細胞の割合を決定する。皮下腫瘍成長の分析のため、１００μｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の赤血球系細胞を動物の側腹部に注射する。腫瘍成長を触診によって１日おきにモニタし、直尺ノギスを使用してサイズを記録する。１００日目より前にマウスで１ｃｍ３及びラットで５ｃｍ３の腫瘍容積に達した場合、１０％より多い体重減少が生じた場合、又は任意の疼痛又は苦痛の行動的徴候が観察された場合には、動物を犠牲にする。全ての動物の剖検を実施する。
注射部位近傍のマウス組織を液体窒素で直ちに凍結するか、又はリン酸緩衝４％ホルマリン中に１６時間置き、次にパラフィンに包埋する。続く免疫学的分析のため、脾臓及びリンパ節を摘出する。片側性６−ＯＨＤＡ病変ラットの線条体への赤血球系細胞の移植を実施する。これらの動物は移植後６週間で犠牲にする。
動物組織をフローサイトメトリーによって分析する。切除した組織試料に、ＣＤ１３３、ＣＤ３、ＣＤ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ２４、及びＣＤ１３３の確立された癌細胞バイオマーカーに対する適切な蛍光抗体及びＰＥコンジュゲート抗体を加え、分析して潜在的な腫瘍原性を定量化する。
実施例５７：ＥＫＴＡによる変形能
本明細書に記載されるとおり培養した赤血球系細胞を、変形能特性に関してエクタサイトメトリーによって天然赤血球試料と比べて評価する。
エクタサイトメーターは、２つのシリンダ間にある粘性流体中に懸濁された赤血球の回折像を生じさせるために使用されるヘリウム−ネオンレーザーと組み合わされたクエット型粘度計からなる。粘度計が回転すると、正常な赤血球はせん断場で伸長し、そのため回折像が楕円になる。回折パターンの長軸（Ａ）及び短軸（Ｂ）に沿った光の強度を定量化し、且つそれを比（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）、変形能指数（ＤＩ）又は伸び指数（ＥＩ）として表すことにより、この像の楕円率が計測される。媒体の粘度は、最も高密度の赤血球系細胞の内部粘度より高くなるように選択される。蒸留水中のＫ２ＨＰ０４及びＫＨ２Ｐ０４で構成される０．０４Ｍのリン酸緩衝液中のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ｍｗ＝３６０，０００の３１ｇ／リットル溶液は、２５℃で０．２０ポアズ及び３７℃で１２ポアズの粘度を生じる。
容量オスモル濃度はＮａＣｌで所望のレベルに調整し、ローブリング凝固点浸透圧計で計測する。最終的なｐＨは、ＮａＯＨ及びＨＣＩの１Ｍ溶液を少量加えることにより変更し、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ ＢＧ Ｉ１血液ガスアナライザーで計測する。ストック溶液に保存剤としてナトリウムアジドを０．４ｇ／ｌとなるように加える。
エクタサイトメーターは赤血球系細胞試料から３つの主要な尺度；重量オスモル濃度最小値（Ｏｍｉｎ）、変形能指数（Ｄｉｍａｘ）、及びＤＩがその最大値の半分に達する重量オスモル濃度（Ｏｈｙｐ）を収集し、それらを天然赤血球と比較する。
Ｏｍｉｎは、細胞の表面積対容積比に関係し、古典的浸透圧脆弱性試験における５０％溶血点に等しいことが分かっている。
Ｄｉｍａｘは、変形能指数の最大値であり、通常２９０ミリオスモル（生理学的重量オスモル濃度値）で達する。これはずり応力下の細胞の最大変形能を示し、多くの因子、例えば、表面積、容積、内部粘度、及び細胞膜の機械的特性に関係する。
Ｏｈｙｐは、ＤＩがその最大値の半分に達するときの重量オスモル濃度である。これは曲線の高浸透圧部の位置の指標を提供し、これは細胞の内部粘度並びに膜の機械的特性、例えば膜が力を受けてどの程度曲がるか（剛性）に関係する。
培養赤血球系細胞に関して得られるパラメータを、初代赤血球系細胞の同じ値と比較する。
実施例５８：ＬＯＲＣＡによる変形能
精製ｃＲＢＣ集団の変形能をレーザー回折法（ＬＯＲＣＡ、レーザー支援旋光セルアナライザー、Ｒ＆Ｒ Ｍｅｃｈａｎｏｔｒｉｃｓ）によって計測する。端的には、細胞の高度希釈懸濁液を、２つのシリンダ間が０．３ｍｍ間隙の、シリンダの一方が回転してずり応力を生じさせることが可能なクエットシステムでせん断する。レーザービームが懸濁液を通過し、３７℃で回折パターンが計測される。低ずり応力では細胞は円板であるが、一方、高ずり応力では細胞は楕円になる。細胞変形能は伸び指数（ＥＩ）を単位として表され、ＥＩは変形細胞の楕円率に依存する。１２．５ｕＬのペレット化したＲＢＣペレットを含有するアリコートを５ｍＬのポリビニルピロリドン溶液（分子量３６００００）に希釈する。種々のずり応力における試料間での比較を容易にするため、３０ＰａにおけるＥＩ値（ＥＩｍａｘと称される）及び３ＰａにおけるＥＩ値が変形能の代表値として選択される。
実施例５９：血管閉塞の評価 − エキソビボラット血管系
赤血球系細胞の血管閉塞の可能性は、当該技術分野において公知の方法を用いて単離人工灌流ラット血管系で評価することができる。例えば、Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７２：２２を参照されたい。簡潔に言えば、ウィスター系の麻酔下（ペントバルビトール（ｐｅｎｔａｂａｒｂｉｔｏｌ）ナトリウム３０ｍｇ／ｋｇ）ラット、１２０〜１５０ｇにおいて、右回結腸動脈及び静脈を、回結腸接合部から３ｃｍ離れた部位でヘパリン添加（１００ｕＬ／ｍＬ）シラスティックチュービングによってカニューレ挿入する。１％ウシ血清アルブミンを含有するリンゲル液による定常状態の灌流下で、上行結腸及び回腸末端（各３ｃｍ）を結紮間で区切る。全ての血管接続部の止血結紮を達成した後、組織を単離する。顕微鏡ステージ上の光学的に透明なルーサイトブロックに単離虫垂間膜を穏やかに広げる。カニューレの出口及び顕微鏡対物レンズを除き、調製物全体をプラスチックサランラップ（登録商標）で被覆する。
対照動脈灌流圧力（Ｐｐａ）及び静脈流出圧力（Ｐｖ）はそれぞれ８０及び３．８ｍｍＨｇに一定に保ち、Ｓｔａｔｈａｍ−Ｇｏｕｌｄ Ｐ−５０圧力トランスデューサー（Ｓｔａｔｈａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｏｘｎａｒｄ ＣＡ）によってモニタする。静脈流出量（Ｆｖ）は光電式滴数計を使用してモニタし、ｍＬ／分単位で表す。１０〜１２分の経過によって組織を平衡させ、Ｆｖを安定化させる。宿主血液細胞を含まない、且つ４．６±０．５（平均値±ＳＤ）の一定のＦｖを有する虫垂間膜微小血管系を呈する調製物のみを使用する。実験は３７℃で行う。
赤血球系細胞を本明細書に記載されるとおり単離する。Ｐｐａ及びＦｖの対照計測後、動脈カニューレ挿入部位より１５ｃｍ遠位の注入ポートから赤血球系細胞（０．２ｍＬ、Ｈｃｔ３０％）を穏やかに送り込み、Ｐｐａ及びＦｖの変化をＧｒａｓｓポリグラフ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ，Ｑｕｉｎｃｙ ＭＡ）のストリップチャートに記録する。組織調製物は試料注入前にリンゲル溶液で１０〜１５分間灌流して組織を安定させ、血管系から宿主動物の残存血液細胞を取り除く。細胞の注入後に生じた閉塞は、血管系を高圧（１００ｍｍＨｇ）の完全酸素化リンゲル溶液で短時間（２〜３分）灌流することによって除去し、流れを回復させ得る。
各実験の終わりに組織調製物の全体（カニューレ及び管腔内容物は含まない）を秤量する。末梢抵抗単位（ＰＲＵ）を計算し、ＰＲＵ＝ΔＰ／Ｑ＝ｍｍＨｇ／ｍＬ／（分−ｇ）（式中、ΔＰ（ｍｍＨｇ）は動静脈圧力差であり、及びＱ（ｍＬ／分−ｇ）は組織１グラム当たりの静脈流出量である）として表す。
各実験において、試料のボーラス注入後に圧力流回復時間（Ｔｐｆ）を決定する。Ｔｐｆは、所与の試料の送達後にＰｐａ及びＦｖがベースライン値に戻るまでにかかる時間（秒）として定義され、全虫垂間膜血管系にわたる総通過時間に相当する。培養赤血球系細胞について得られるパラメータ値を初代赤血球系細胞について得られる値を比較する。
実施例６０：血管閉塞の評価 − インビトロフローチャンバ
漸進的高さのインビトロフローチャンバを使用して赤血球系細胞の血管閉塞を評価する方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４（１２）：３７７４を参照されたい。
簡潔に言えば、漸進的高さのフローチャンバを使用して内皮細胞（ＥＣ）に対する赤血球系細胞の付着を定量化する。ＥＣで被覆されたスライドを、予め３７℃に加温した１．２６ｍＭ Ｃａ２＋、０．９ｍＭ Ｍｇ２＋含有ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で洗浄し、次に可変高さのフローチャンバに入れる。フローチャンバを、３７℃に設定したサーモプレート（ｔｈｅｒｍｏｐｌａｔｅ）（東海ヒット、富士宮市、日本）に接続した倒立位相差顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ；Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）のステージにマウントする。顕微鏡に取り付け、且つＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４コンピュータ（Ａｐｐｌｅ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）に接続したビデオカメラ（ＲＳ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を使用して、細胞を観察する。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養し、蛍光色素ＰＫＨ ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ）で製造者の指示に従い標識する。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋含有ＨＢＳＳ中に０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で懸濁した細胞（３ｍＬ）をフローチャンバに注入し、フロー無しで１５分間スライドに付着させる。フローに曝露する前に、フローの行く手に垂直な方向の線に沿った７つの異なる位置の各々にある最低３つのフィールドについて、蛍光細胞の総数を調べる。次に目盛り付きシリンジポンプを使用して流体フロー（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋含有ＨＢＳＳ）を開始する。フローに曝露した後、フィールドを再び調べ、付着細胞の数をカウントする。付着細胞の割合は以下のとおり表される：フローへの曝露後に付着した細胞の数／フロー前に各フィールドに存在した細胞。壁ずり応力は以下のとおり計算される：τｗ＝（６μＱ）／（ｗＨ［ｘ］２）、式中、τｗは壁ずり応力（ダイン／ｃｍ２）を示し；Ｑ、体積流量（ｃｍ３／ｓ）；μ、媒体粘度；ｗ、フローチャネルの幅；及びＨ（ｘ）、顕微鏡スライドに沿った位置の関数としてのフローチャンバの高さを示す。
実施例６１：血管閉塞の評価 − 生体顕微鏡法
生体顕微鏡法を使用して赤血球系細胞の血管閉塞を評価する方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｂｌｏｏｄ １１０（７）：２７０８を参照されたい。
簡潔に言えば、１００ｍｇ／ｋｇケタミン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジン（Ｂａｙｅｒ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）の腹腔内注射によって被験動物の全身麻酔を得る。層流フードを使用して無菌条件下で両面チタンフレームウィンドウチャンバを背面皮下脂肪に外科的に植え込む。手術には、背面皮下脂肪の片側の表皮層及び真皮層を慎重に取り除くこと、反対側の皮下脂肪の横紋筋に隣接する皮下組織の血管を露出させること、次にチャンバの２つのサイドをステンレス鋼ネジ及び縫合糸を使用して皮膚に固定することが含まれる。チャンバにガラスウィンドウを置いて露出した組織を覆い、スナップリングで固定する。続いて、手術の３日後にインビボ研究を実施するまで、動物を３２℃〜３４℃に保つ。
ウィンドウチャンバを有する麻酔下の動物をＡｘｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）のステージに置く；体温はサーモスタット制御式加熱パッドを使用して３７℃に維持する。全ての注入は背側尾静脈からとする。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。次に細胞をＤｉｌ又はＤｉＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）色素で製造者の指示に従い標識する。標識した細胞（３００μＬ；Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有ＰＢＳ中ヘマトクリット［Ｈｃｔ］０．５０［５０％］）を注入し、ＬＤ Ａｃｈｒｏｐｌａｎ ２０×／０．４０Ｋｏｒｒ及びＦｌｕａｒ ５×／０．２５対物レンズを使用して皮下血管のＲＢＣ付着及び血流動態を少なくとも３０分間観察する。デジタルビデオカメラＣ２４００（浜松ホトニクス株式会社、浜松市、日本）に接続したＴｒｉｎｉｔｒｏｎカラービデオモニタ（ＰＶＭ−１３５３ＭＤ；ソニー、東京、日本）及びＪＶＣビデオカセットレコーダー（ＢＲ−Ｓ３７８４；ＶＣＲ Ｋｉｎｇ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用して微小循環イベント及び細胞付着を同時に記録する。各条件セットについて細静脈の３０区間を調べる。細動脈と細静脈の区別は、（１）狭まる流れとは対照的な広がる流れの観察；（２）細動脈血管平滑筋に特有の、透光法を使用したときの血管壁の複屈折像；及び（３）明らかな蛇行のない比較的直線的な血管軌道に基づき行われる。
赤血球流束及び付着の計測は、２０倍の拡大率を使用して作成したビデオテープ調べることによって実施する。細胞付着は、血管壁に付着して１分間動かない細胞を考慮して定量化する。ＳＳ ＲＢＣによって占有される、最大２５μｍ又は２５μｍより大きい直径の血管の長さの割合は、以下のとおり定量化する：ＳＳ ＲＢＣによって占有される％細静脈長さ＝（付着細胞を有する血管壁の長さ／分析する血管区間の全長）×１００。ＲＢＣ流束の変化は、以下のとおり計算する：流束＝直径５０μｍ未満の血管上に印された単一の点を通る毎分循環蛍光ヒトＲＢＣの数。
実施例６２：血管閉塞の評価 − 血小板
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して血小板の血管閉塞を評価する方法は、赤血球に関する同様の方法を適用することができる。簡潔に言えば、２ｍＬ容積の０．０５％ヘマトクリット懸濁液を組織培養ペトリ皿上のコンフルエントなＨＵＶＥＣに加える。血小板を加えて１分以内にコーンアンドプレート器具を組み立て、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ倒立位相差顕微鏡（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）に置く。モータを始動させてコーンを回転させ、０．１又は１ダイン／ｃｍ２のずり応力で３０分間、付着を継続的にモニタする。温度は、付着器具に吹き付けるエアカーテンインキュベーター（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって３７℃に一定に維持する。血小板付着を可視化し、５分毎に、各時点各視野につき８つの異なる視野に２０秒間焦点を合わせることにより記録する。実験全体はＣＣＤ−７２シリーズカメラ（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ、ＩＮ）によって４００倍の総倍率下で観察し、ＳＶＯ ２０００ビデオカセットレコーダー（Ｓｏｎｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でビデオテープに記録する。各実験終了時に、記録したビデオ画像を手動再生する間に個々の付着細胞をカウントすることにより、付着をオフラインで定量化する。各時点につき８つの視野の細胞数を平均し、内皮１平方ミリメートル当たりの付着赤血球に対して正規化する。
実施例６３：共振器による質量／容積／密度の評価
Ｂｒｙａｎ ｅｔ ａｌ，ＬａｂＣｈｉｐ，２０１４に基づきデュアル懸濁マイクロチャネル共振器（ＳＭＲ）システムを使用して最終分化型赤血球系細胞集団の質量、容積、及び密度を特徴付ける。細胞密度計測の開始時、初めにシステムをＰｅｒｃｏｌｌろ過媒体でフラッシュし、これが高密度流体としての役割を果たす。次に、試料バイパスに希釈細胞試料を充填し、試料入口及び出口のバイアル高さを調整して流体フローが最初のＳＭＲに入るように導く。高密度流体入口の圧力が流体２の密度を設定するために使用され、廃棄物出口の圧力が装置における全体の流速を制御する。より重い細胞が試料バイアル又はチュービングの底に沈降することに起因してサイズバイアスがかかる可能性を最小限に抑えるため、一定の間隔で試料バイパスチャネルをフラッシュすることにより、新鮮な試料を導入する。ＬａｂＶＩＥＷによってデータを取得し、ＭＡＴＬＡＢで処理する。
コールターカウンターを使用して細胞濃度をモニタする。５×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌに成長させた培養物で細胞計測を実施する。第２のＳＭＲに計測用に導入される高密度流体は、５０％（ｖ／ｖ）Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）、１．３８％（ｗ／ｖ）粉末状Ｌ１５媒体（Ｓｉｇｍａ）、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース、１００ＩＵペニシリン、及び１００μｇｍＬ−１ストレプトマイシンの溶液として配合する。媒体のｐＨを７．２に調整する。このＰｅｒｃｏｌｌ媒体は４℃に保存し、使用直前にデュアルＳＭＲでろ過する。
実施例６４：アネキシンＶによるホスファチジルセリン含量の評価
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するリンゲル溶液中で５０μＬ細胞懸濁液を洗浄し、次にこの溶液中のアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（１：２００希釈；ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって遮光下３７℃で２０分間染色する。細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって染色し、４８８ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長でアネキシン−Ｖ蛍光強度を計測する。アネキシン−Ｖ蛍光から相対ホスファチジルセリン露出を評価する。
実施例６５：クロマトグラフィーによる脂質含量の評価
抗酸化剤ＢＨＴ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、室温でメタノール−クロロホルム１：１によって３回抽出することにより、洗浄した外因性抗原発現ＥＨＣから脂質を抽出する。プールした抽出物を、Ｆｏｌｃｈ，Ｌｅｅｓ ａｎｄ Ｓｌｏａｎｅ Ｓｔａｎｌｅｙ１９５７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２２６：４９７の方法において０．０５Ｍ ＫＣｌで洗浄する。簡潔に言えば、最初の抽出については、遠心管内の洗浄した複合体に０．０５ｍｇ／ｍＬ ＢＨＴ含有１５ｍＬメタノールを加え、沈降物を散らせるため時折撹拌しながら３０分間静置する。次に１５ｍＬのクロロホルムを加え、凝集塊を散らせるため時折撹拌しながら混合物を３０分間静置する。チューブを１５００ｇで５分間遠心し、上清画分をＴｅｆｌｏｎ活栓付きの分液漏斗にデカントする。２回目及び３回目の抽出も同様に、１５ｍＬのメタノール−ＢＨＴを残渣に加え、続いて１５ｍＬのクロロホルムを加えて実施し、但し毎回加えた後に抽出物は時折撹拌しながら１０分間だけ静置する。遠心後、上清画分を分液漏斗にプールし、次に４８ｍＬのクロロホルム及び２８ｍＬの０．０５Ｍ ＫＣｌを加え、混合する。この混合物を４℃で一晩暗所に静置して相分離させる。再び室温に加温した後、２つクリアな相の下の方を回収し、ロータリー真空エバポレーターにおいて真空中４０℃で蒸発乾固させる。脂質をクロロホルムと共に定量的に１０ｍＬメスフラスコに移し、−２２℃で保存する。
脂質抽出物中の遊離コレステロールの濃度は以下のとおり決定する。ヘキサン−ジエチルエーテル−氷酢酸８０：２０：１中のシリカゲルＨＲ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｎ．Ｙ．）の０．５ｍｍ層で脂質抽出物をクロマトグラフ処理し、２，７−ジクロロフルオレセイン溶液（下記参照）をスプレーすることによりＴＬＣプレートを染色し、遊離コレステロールスポットをコニカル遠心管に剥がし取り、２．０ｍｌのクロロホルムで１回及び１．０ｍｌのクロロホルムで３回抽出し、抽出物をロータリー真空エバポレーターにおいて真空中４０℃で蒸発乾固させ、鹸化を含まないＭａｎｎ １９６１ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ７：２７５の塩化第二鉄方法によってコレステロールを推定する。二臭化物誘導体を用いた単離（例えば、Ｆｉｅｓｅｒ Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９５３ ７５：５４２１を参照）によって市販の認可試薬グレード材料から調製した遊離コレステロール標準をクロマトグラフ手順で取り、一組の決定毎に推定する。遊離コレステロール値は、標準の回収率（これは平均して９５％である）に対して決定毎に補正する。ＴＬＣはＢＨＴを取り除く必要があり、取り除かない場合にはＢＨＴが５６０ｎｍを吸収する褐色の産物を生じて塩化第二鉄方法を妨害する。
クロマトグラフィー中の自動酸化を防止するため５０ｍｇ／１００ｍｌの濃度のＢＨＴを加えたクロロホルムメタノール−氷酢酸−水２５：１５：４：２中、シリカゲルＨＲ、０．５ｍｍ厚上４℃の全脂質抽出物のアリコートのＴＬＣによってリン脂質分布をトリプリケートで決定する；このＴＬＣプレートを水で調製する（「中性」プレート）。「くさび形先端法」を用いてプレートの基点に脂質試料を適用すると（Ｓｔａｈｌ １９６５ Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．を参照）、個々のリン脂質の優れた分離がもたらされる。詳細には、この方法は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、レシチン、及びスフィンゴミエリンの間の完全な分離をもたらす；ある特徴的なスポットがＰＳとレシチンとの間に移動し、これがホスファチジルイノシトール（ＰＩ）として同定される。これらのスポットは、２，７−ジクロロフルオレセインの溶液（３３．３ｍｇ／１００ｍｌの２ｍＭ ＮａＯＨ水溶液）をスプレーすることにより紫外光下で可視化され、次にＫｒａｍｅｒ−Ｇｉｔｔｌｅｍａｎチューブに直接剥がし取り、ここでリン脂質を１．０ｍｌの７０％過塩素酸によって１９０℃で６０分間消化する。残りの手順を上記に記載したとおり実施し、但し発色後、３０００ｇで５分間遠心することによりシリカゲルは取り除き、澄明な上清溶液で吸光度を決定する。ブランクレーンの対応する領域の吸光度に対して補正を行う。
Ｇａｓ−Ｃｈｒｏｍ Ｐ、１００−１２０メッシュ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）上のＥＧＳＳ−Ｘ（シリコーンと組み合わせたコハク酸エチレングリコールポリエステル）８％の対の８ｆｔカラム及びデュアル水素炎イオン化検出器を備えたＢａｒｂｅｒ−Ｃｏｌｍａｎ機器、モデル５０００によって、ヘキサン溶解試料でガス−液体クロマトグラフィーを実施する。窒素流量は入口で５０ｍｌ／分である。カラム温度は試料注入後１６５℃に１０分間維持し、次に２℃／分で２００℃まで増加させる。
実施例６６：膜粘度の評価
細胞の集団の膜粘度は、蛍光退色アッセイによって評価することができる。赤血球系細胞の０．５ｍｌ試料を収集し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１３２ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に調整）で１回洗浄する。次にこの濃厚血球を１４５ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５で１回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ ＤＴＡＦ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏから入手）を含有する同じ緩衝液に再懸濁する。細胞を氷上で１時間インキュベートし、次に５０ｍＭグリシン−９５ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５で２回洗浄して、タンパク質に共有結合的に結合しなかった色素を全て取り除く。最後に、細胞を２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン含有ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中の−２％ヘマトクリットに再懸濁する。対照陰性赤血球にも同じ処理を適用する。
落射式蛍光顕微鏡法用に装備されたＬｅｉｔｚ Ｄｉａｖｅｒｔ（Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ、ＮＪ）倒立顕微鏡のステージにフローチャンバをマウントする。ダイクロイックミラー及び励起／発光フィルタは、励起波長が範囲４５０〜４９０ｎｍの、フルオレセイン色素（Ｌｅｉｔｚ記号１２）で使用される標準的な組み合わせである。対物レンズは１００倍倍率及び１．２５開口数の油浸型である。適切な動力源及びハウジング（Ｏｒｉｅｌ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を有する１００ワット高圧水銀アークランプ（Ｏｓｒａｍ、Ｍｕｎｉｃｈ）が蛍光励起源としての役割を果たす。
コンピュータ制御式電子シャッター（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）が曝露時間を制限し、蛍光強度の計測用光子計数電子システムと同期する。入射光イルミネーターの視野絞りを使用して励起を直径２０〜４０ｕｍの円形範囲に制限する。一定の間隔で、コンピュータからの出力パルスが２０ｍｓの典型的な持続時間にわたりシャッターを開放する。短時間蛍光像からの光は一連のプリズムで分割され、従って光の半分は低光量ＳＩＴビデオカメラ（モデル６６−ＳＩＴ、Ｄａｇｅ−ＭＴＩ、ＭｉｃｈｉｇａｎＣｉｔｙ、ＩＮ）に送られ、及び半分は周囲温度ハウジングに囲まれた光電子増倍管（モデル８８５０、ＲＣＡ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ、ＮＪ）に送られる。電子シャッターが開放している時間中、ビデオ画像プロセッサ（モデル７９４、ＨｕｇｈｅｓＡｉｒｃｒａｆｔ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が作動して蛍光像を取得し、ビデオスナップショットが提供され、それをモニタすることにより、対象に焦点が合ったままであり、視野に異物が侵入していないことを確認し得る。ビデオキャリパーでビデオスクリーン上の距離を計測し、ステージマイクロメートルのビデオ画像との比較によってキャリブレーションする。シャッターが開放している時間中はまた、光電子増倍管信号が光子計数法で処理される。増幅器／弁別器（モデルＡＤ６、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）が所与の大きさを上回る各信号パルスのデジタル論理パルスを生成し、それらのデジタルパルスを１００ＭＨｚゲートカウンター（モデル７７０、ＥＧ＆Ｇ Ｏｒｔｅｃ、ＯａｋＲｉｄｇｅ、ＴＮ）でカウントする。マイクロコンピュータが光子カウントのゲーティング、リセット、及び記録を制御する。
典型的な実験は、励起光の短時間（２０ミリ秒）パルスの間に行われる複数回の予備的蛍光計測と、続いて試料細胞を退色させる長い照射期間（典型的には３０秒）と、続いて１５〜３０秒毎の、蛍光が回復し終えたように見えるまでのさらなる一連の短時間曝露とからなる。
培養赤血球系細胞について得られる回復時間及び他のパラメータ値を、初代赤血球系細胞について得られる同じ値と比較する。
実施例６７：Ａｄｖｉａ血液アナライザーによる平均赤血球容積の評価
Ａｄｖｉａ １２０血液アナライザー（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において電気インピーダンスを使用して培養赤血球系細胞の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を計測する。その結果を天然ヒト赤血球と比較する。
実施例６８：培養赤血球系細胞の病原体検査
ＲＴ−ＰＣＲを用いて培養赤血球系細胞集団における外来性ウイルスの存在を定量化し、非汚染を確認する（アッセイ番号００３０００．ＢＳＶ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ）。未処理バルク及び最終バルク、最終バイアル、貯蔵前細胞、並びに細胞及びウイルスバンクの無菌検査を、それぞれ好気性及び嫌気性細菌の成長を支持する２つの異なる種類の培地に赤血球集団を直接接種することにより実施する。試料を１４日間インキュベートし、続いてＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ無菌試験プロトコルＵＳＰ ７１に従い汚染微生物に関して試験する。
実施例６９：浸透圧脆弱性の評価
低張液に曝露されたときの赤血球系細胞の溶解に対する抵抗性を計測するため、浸透圧脆弱性を評価する。０％〜１％にわたる濃度でＮａＣｌ水溶液を作製した。これらの塩溶液の各々で細胞を１５分間インキュベートした。試料を遠心してインタクトな細胞をペレット化した。分光光度計を使用して５４０ｎｍの光の吸収によるヘモグロビン含量に関して上清をアッセイした。５０％溶血が起こる点を計算し、初代赤血球について得られる値と比較する。
実施例７０：ロゼット形成／免疫原性の評価
クームス試験としても知られる直接抗グロブリン試験は、血清のポリクローナル抗体が細胞の表面抗原に結合することにより引き起こされる赤血球系細胞の凝集又はロゼット形成を評価する。これは、一般的な同種免疫原性評価のためのヒトプール血清で行うか、又は特定の免疫原性予測のための意図されるレシピエントの血清で行うことができる。
端的には、ＥＤＴＡチューブに保存された細胞１〜２滴を反応チューブに加える。このチューブを等張生理食塩水で３回洗浄する。３回目の洗浄後、洗浄した細胞から３％懸濁液を調製する。２本のチューブ名をＡ及びＢとする。洗浄した３％懸濁液の１滴を各チューブに加える。これらのチューブをもう１回洗浄する。デカントするとき、細胞ボタン（ｃｅｌｌ ｂｕｔｔｏｎ）が上になるようにチューブを位置決めする。これにより洗浄プロセスで細胞が過剰に多く失われることが防止される。ウェルを排水し、バイオワイプで拭き取って乾燥させる。直ちに両方のチューブに１滴のヒト被検血清を加え、振盪して混合する。Ｂチューブを室温で５分間インキュベートしておく。セロフュージでのクームススピン用にキャリブレーションした時間にわたりＡチューブを遠心する。直ちに穏やかに再懸濁し、ライト付き凝集観察器（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して凝集を調べる。Ａチューブが陽性である場合、Ｂチューブを読む必要はなく、またＡチューブを顕微鏡で調べる必要もない。Ａチューブがライト付き凝集観察器によって陰性である場合、顕微鏡下で凝集に関して調べる。顕微鏡の読み取りでＡチューブが陰性である場合、Ｂチューブをそのインキュベーション期間後に遠心し、Ｂチューブ試料でステップ２〜４を繰り返す。さらにＢチューブも陰性である場合、チューブに１滴のＩｇＧ被覆クームス対照細胞（チェック細胞）を加えて遠心する。凝集を調べる。この段階で凝集が存在するはずであり、さもなければ試験は無効である。
チェック細胞（ｃｃｃ）を加える前にどの段階にも凝集がない場合、試験は陰性と解釈される。チェック細胞を加える前の任意の段階で凝集が観察される場合、試験は陽性と解釈される。
実施例７１：酸素結合能の評価
１ｃｍ経路長キュベットに連結したトノメーターにおいて３７℃での平衡酸素結合曲線を決定する。分光光度計（Ｃａｒｙ ５０；Ｖａｒｉａｎｔ Ｉｎｃ）でスペクトル計測を実施し、ペルチェモジュールで温度を制御する。分析は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭグルコースを含有する５０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．２）中で実施する。窒素下で完全に脱酸素化した後、既知の容積の純酸素をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジでゴムキャップを介してトノメーターに注入することにより、赤血球懸濁液を種々の酸素分圧で平衡化する。最小二乗回帰によってＲＢＣ懸濁液の完全脱酸素化及び酸素化スペクトルの一次結合として可視及びソーレー領域における吸収スペクトルをシミュレーションすることにより、飽和度を推定する。
実施例７２：細胞の代謝状態の評価
赤血球系細胞集団は、種々の異なる酵素ベースのアッセイを用いて重要な代謝最終産物を定量化して、代謝的に活性であると確かめ得る。能動的解糖は、評価するのに決定的な代謝経路であり、以下のアッセイ（解糖細胞ベースのアッセイキット、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、品目６００４５０）で計測し得る。
４５０ｕｌのアッセイ緩衝液、続いて５０ｕＬのＬ−乳酸標準を試験管にアリコートに分け、完全に混合する。１ｍＭ希釈から開始して乳酸濃度標準を用いて滴定曲線を作成する。
９６ウェルプレートに細胞を加え、１０００ＲＰＭで５分間遠心する。１００ｕＬの標準を別個の９６ウェルプレートに移す。次に各ウェルに９０ｕＬのアッセイ緩衝液を加える。次に各細胞ウェル中の１０ｕｌの上清を対応する新しいウェルに移す。反復ピペッターを使用して各ウェルに１００ｕｌの反応液を加える。次にプレートをオービタルシェーカーにおいて室温で３０分間インキュベートする。プレートリーダーによって４９０ｎｍで吸光度を読み取る。結果を天然細胞と比較して任意の代謝の違いを同定する。
実施例７３：血小板凝集の評価
培養又は初代供給源の血小板の凝集傾向をモニタすることができる。血小板を光源の前で振盪することにより血小板をスワーリング分析にかけ、結果は複屈折の存在又は非存在として表す。５０〜７０ｍＬの容積で生じる濃縮血小板の単位を１時間静置しておき、２２±２℃（７１．６±３．６°Ｆ）の制御された温度で７０ｒｐｍの直線振盪機（Ｃ−Ｍａｒ（登録商標））に置く。
処理後１日目、３日目及び５日目に濃縮血小板の試験（血小板数、血小板凝集及びｐＨ）を実施する；白血球数は１日目のみ実施し、微生物制御は保存５日目のみ実施する。濃縮血小板の試料からアリコートを得るため、滅菌接続（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標））を使用して環境の完全性を確実にする。血液採取から４時間以内にデュアルチャネルＣｈｒｏｎｏｌｏｇ（Ｃｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））を使用した比濁凝集法を用いて血小板凝集を達成する。このため、初めに１０００ｒｐｍで５分間軽く遠心することによって細胞を得て、次に３０００ｒｐｍで１５分間遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標））。試料を自動カウンター（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｕｎｔ（登録商標））で血小板計数に供する。
血小板濃度の調整後、種々の濃度の誘導作動薬：コラーゲン２．０μｇ／ｍＬ及びＡＤＰ７．０μｇ／ｍＬ（Ｃｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））を使用して凝集を評価する。自発的な凝集を待った後、各試験につき４００μＬのＰＲＰ及び４００μＬのＰＰＰを使用する（各々が異なるキュベットにある）。作動薬を誘導することによる刺激の５分後に凝集曲線を観察し、直後に凝集を計測して、試験中に形成される曲線に従いパーセンテージとして表す。試験の結果は通常、試験溶液を透過する光の量による凝集のパーセンテージとして表す；凝集は、正常、低又は高に分類する。
実施例７４：自家培養プロセス
自家供給源の前駆体ＣＤ３４＋細胞を使用した赤血球系細胞の培養を行い、患者に対する細胞免疫適合性を最適化する。患者において本明細書に記載されるとおりＧＭ−ＣＳＦを使用して骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を末梢に動員する。１０６〜１０８個のＣＤ３４＋細胞を採取し、限定培地を使用する前述の２２日間プロトコルを用いて培養する。４日目の間に、治療剤の発現をコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする。培養プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。次にこの細胞を、最初のＣＤ３４＋細胞を提供したのと同じ患者に注入する。
実施例７５：自家負荷プロセス
好適な外因性抗原が負荷された治療用赤血球系細胞を調製するため、自家供給源の赤血球を使用して患者に対する細胞免疫適合性を最適化することができる。患者から血液を採取し、５０００ｇで２０分間遠心する。バフィーコートを取り除き、残りの赤血球を抗凝固薬緩衝液中に１０８細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、合計１０１０細胞とする。上記に記載される方法の１つによって細胞に目的の治療用外因性抗原を負荷する。負荷プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。この細胞を、最初の赤血球を提供したのと同じ患者に注入する。
実施例７６：同種培養プロセス
拡張性のある万能な治療薬を作るため、同種供給源から赤血球系細胞を培養することができる。同種供給源の前駆体ＣＤ３４＋細胞を使用した赤血球系細胞の培養を行い、プロセスを合理化して、規模を拡大して患者を治療する能力を有するある容積の治療薬を培養する。ドナーのＡ、Ｂ、Ｒｈを含めた主要血液抗原の血液型を決定し、万能ドナー（例えば、Ｏ Ｒｈ−又はボンベイＲｈ−）を同定する。好適なドナーにおいて本明細書に記載されるとおりＧＭ−ＣＳＦを使用して骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を末梢に動員する。１０６〜１０８個のＣＤ３４＋細胞を採取し、限定培地を使用する前述の２２日間プロトコルを用いて培養する。４日目の間に、治療剤の発現をコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする。培養プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。次にこの細胞を患者に対し、その主要血液型とは無関係に注入する。
実施例７７：同種負荷プロセス
同種供給源の前駆体ＣＤ３４＋細胞を使用した赤血球系細胞の培養を行い、規模を拡大して患者を治療する能力を有するより大容積の治療用細胞の調製方法を合理化する。ドナーのＡ、Ｂ、Ｒｈを含めた主要血液抗原の血液型を決定し、万能ドナー（例えば、Ｏ Ｒｈ−又はボンベイＲｈ−）を同定する。上記に記載される方法の１つによって細胞に目的の治療用外因性抗原を負荷する。負荷プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。次にこの細胞を患者に対し、その主要血液型とは無関係に注入する。
実施例７８：保存
１．冷蔵緩衝溶液中での保存
赤血球の標準保存プロトコルは当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｅｒｙｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ １９８６，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２６（６）：５００を参照されたい。赤血球の標準保存プロトコル（最長４２日間）は、抗凝固薬溶液（クエン酸−デキストロース−リン酸）への採血である。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。遠心によって血漿を取り除くことにより、濃縮赤血球を調製する。細胞をやや高張の添加剤溶液、ＳＡＧＭ（ナトリウム、アデニン、グルコース、マンニトール、３７６ｍＯｓｍ／Ｌ）中に４±２℃で保存する。
２．凍結緩衝溶液中での保存
赤血球系細胞のグリセロール処理、凍結、及び解凍方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｅｒｙｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ １９７７ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ １７（５）：４３４８を参照されたい。採取から４日以内にクエン酸リン酸デキストロース中のヒト血液をグリセロール処理し、凍結する。グリセロール処理ＲＢＣの調製には、初めに約１０ｍＬの全血を１，４００ｇで１０〜１５分遠心し、血漿を取り除く。次に得られた濃厚血球に、以下の組成のグリセロール水溶液を使用して２段階でグリセロール処理する：５７．１ｇグリセロール、０．０３ｇ塩化カリウム、０．０８５ｇ塩化マグネシウム六水和物、０．０８ｇリン酸二ナトリウム、及び１．６ｇ乳酸ナトリウム、総容積１００ｍＬ中、ｐＨは６．８に調整４２。第１のステップでは、濃厚血球に１．５ｍＬのこのグリセロール溶液を穏やかに撹拌しながら３分間かけて滴下して加える。次に混合物を少なくとも５分間そのままにして平衡化させる。第２のグリセロール処理ステップでは、混合物を穏やかに撹拌しながら３分間かけて５ｍＬのグリセロール溶液を滴下して加え、約４０％ｗ／ｖの最終グリセロール組成物を得る。グリセロール処理プロセス全体は室温で行う。次にグリセロール処理ＲＢＣを低温用バイアルに０．６〜１．１ｍＬのアリコートに分け、ＮａｌｇｅｎｅＶＲ Ｃｒｙｏ「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」凍結容器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＣ）に入れ、−８０℃のフリーザーに少なくとも１２時間、最長１０年保存する。凍結ＲＢＣは、低温用バイアルを３７℃の水浴中に１分間置くことにより解凍する。全てのグリセロール処理血液試料は解凍後２時間以内に脱グリセロール化実験で使用する。
３．シリンジとしての製剤化
細胞集団はシリンジによって静脈内投与し得る。１００ｍｌの容積、又は１０９細胞が送達されるように、３７℃の標準生理食塩緩衝液を使用して治療用細胞を１０７細胞／ｍｌの密度に希釈する。細胞溶液を１５０ｃｃシリンジ、２０ゲージ針に装填し、尺側皮静脈から５ｃｃ／分で患者に注射する。注射中、免疫原性反応又は凝固反応がないか患者のバイタルをモニタする。
４．バッグとしての製剤化
細胞集団は、バッグ及び点滴チャンバに接続したシリンジによって静脈内投与し得る（即ちＩＶ点滴）。１００ｍｌの容積、又は１０９細胞が送達されるように、３７℃の標準生理食塩緩衝液を使用して治療用細胞を１０７細胞／ｍｌの密度に希釈する。細胞溶液を１Ｌプラスチックバッグに装填し、カテーテルに接続し、重力によって尺側皮静脈から患者体内に送液する。注入中、免疫原性反応又は凝固反応がないか患者のバイタルをモニタする。
実施例７９：疾患の治療
１．血友病
血友病Ａに罹患している患者を診断する。外因性ＦＶＩＩＩを発現する除核造血細胞の組成物を本明細書に記載するとおり調製する。１０９個の細胞を患者に静脈内投与する。当該技術分野において公知の標準インビトロ凝固時間アッセイによって凝固速度を評価する。血清中におけるＦＶＩＩＩに対する循環抗体を本明細書に記載するとおり検出する。循環抗体レベルを評価して免疫トレランス誘導の有効性を追跡する。凝固カスケード活性が健常な凝固を確実にするのに不十分である場合、血友病Ａの症状を低減するため、同時に組換え又は単離ＦＶＩＩＩを静脈内投与する。
２．非典型溶血性尿毒症症候群
非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）に罹患している患者を診断する。外因性ＣＦＨを発現する除核造血細胞の組成物を本明細書に記載するとおり調製する。１０９個の細胞を患者に静脈内投与する。当該技術分野において公知の標準尿溶血アッセイによって症候性溶血率を評価する。血清中におけるＣＦＨに対する循環抗体を本明細書に記載するとおり検出する。循環抗体レベルを評価して免疫トレランス誘導の有効性を追跡する。患者には、本明細書に記載されるアッセイを用いて疾患の症状に改善が見られるまで治療を投与する。
３．多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）患者が、本明細書に記載するとおり作製及び製剤化された抗原ポリペプチドミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現する１×１０９個の抗原発現除核造血細胞の単回注入を受ける。治験薬投与の当日、第１相入院患者ユニットにおいて患者を２４時間モニタする。３ヵ月の時点で主要転帰の計測を実施し、６ヵ月まで継続的な臨床検査、ＭＲＩ検査、及び全身の身体検査並びに臨床分析及び検査室分析でさらなる安全性経過観察を実施して、有害事象を評価し、ＭＳ疾患活動性をモニタする。トレランスが誘導されて患者においてＭＳの症状が改善するまでこの手順を繰り返す。例えば、Ａｎｄｒｅａｓ Ｌｕｔｔｅｒｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８８ｒａ７５（２０１３）を参照されたい。
全血（ＥＤＴＡ管）において、以下の抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによって種々の細胞サブセットの頻度を分析する：免疫細胞サブセットに関して（顆粒球、好酸球、単球、及びＢ、Ｔ、ＮＫ、及びＮＫ Ｔ細胞）−抗ＣＤ４５（ＰＥ−Ｃｙ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ１６（ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１９［フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＢＤ］、抗ＣＤ１４（Ｖ４５０、ＢＤ）、抗ＣＤ３［ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＢＤ］、及び抗ＣＤ５６［フィコエリトリン（ＰＥ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ］；ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ、調節性ＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＩＬＴ２＋、及び炎症誘発性ＣＤ８＋ＣＤ１６１ｈｉｇｈ Ｔ細胞を含むＴ細胞サブセットに関して−抗ＣＤ３（ＰＥ−Ｃｙ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ４（ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ８［パシフィックブルー（ＰＢ）、Ｄａｋｏ−Ｂｉｏｚｏｌ］、抗ＦｏｘＰ３（ＰＥ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＣＤ２５（ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ５７（ＦＩＴＣ、ＢＤ）、抗ＩＬＴ２（ＰＥ、Ｂｅｃｋｍａｎ）、及び抗ＣＤ１６１（ＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）。全ての染色に、対応するアイソタイプ対照を含める。細胞はＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で分析する。
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法（ＰＡＡ）によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、以下のとおりの細胞内サイトカイン染色によってＴ細胞の機能表現型を判定する：５×１０５個の新鮮に単離したＰＢＭＣを滅菌ＦＡＣＳチューブにおいて２００ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）中で一晩インキュベートする。翌日、ブレフェルジンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下においてホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）及びイオノマイシン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で細胞を５時間刺激する。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞をＬｉｖｅＤｅａｄキット（ＡｍＣｙａｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、固定し、透過処理し、及び種々の抗体：抗ＩＬ−１７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＩＬ−４（ＰＥ−Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＩＦＮ−ｇ（ＦＩＴＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＩＬ−１０（ＰＥ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３（ＰＥ、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、抗ＣＤ４（ＰＢ、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、及び抗ＣＤ８（ＰＢ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又は対応するアイソタイプ対照で染色する。
寛容化手順を行う前、及び３ヵ月後に、新鮮に単離したＰＢＭＣにおいてこの試験で使用するミエリンペプチドに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を計測する。抗原特異的Ｔ細胞応答は、チミジン取込みを用いた増殖アッセイによって分析する。簡潔に言えば、９６ウェルプレートにおける１ｍＭのペプチドを含有するＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中に、ウェル当たり１．５×１０５ＰＢＭＣで単離ＰＢＭＣを播種する。抗原当たり４８ウェルを播種し、各プレートにおいて６ウェルは陰性対照として培地のみを含む。ＴＴｘ（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を陽性対照として使用する。７日目、１ｍＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ）と共にプレートを１５時間インキュベートする。［３Ｈ］チミジンによってパルスしたプレートをシンチレーションｂカウンター（Ｗａｌｌａｃ １４５０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で分析する。各ウェルのシンチレーションカウント（ＣＰＭ）を計測する。非刺激ウェルの平均値＋３ＳＤより高いＣＰＭを示すウェルを陽性と見なす。
前述の説明及び関連する図面に提供される教示を利用して、これらの発明が関係する技術分野の当業者には、本明細書に示される発明の多くの変形形態及び他の実施形態が想起されるであろう。従って、本発明は開示される具体的な実施形態に限定されないこと、並びに変形形態及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれるものと意図されることが理解されるべきである。本明細書では特定の用語が用いられているが、それらは一般的且つ説明的な意味で用いられているに過ぎず、限定を目的とするものではない。
本明細書で言及する全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の水準を示すものである。全ての刊行物及び特許出願が、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ具体的に且つ個別的に参照によって援用されることが示されたものと見なすのと同程度に本明細書において参照により援用される。

Claims (121)

  1. 免疫トレランスを誘導する方法であって、自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記自己免疫疾患、障害又は病態を媒介する前記抗原に対して前記対象において免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される、方法。
  2. 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、１型糖尿病、及び表Ｆに列挙されるものからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記自己免疫疾患、障害又は病態が治療されるか、又はその症状が軽減されるように、前記医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記自己免疫疾患、障害又は病態が予防されるように、前記医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 抗原特異的免疫細胞の割合が治療期間中に実質的に低下するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記免疫細胞がＢ細胞である、請求項５に記載の方法。
  8. 抗原特異的免疫細胞の濃度の低下が、前記対象から採取された生物学的試料からフローサイトメトリーによって計測される、請求項５に記載の方法。
  9. 前記生物学的試料が、リンパ節生検、脾臓試料、又は末梢血である、請求項８に記載の方法。
  10. 抗原特異的免疫細胞の濃度が、前記治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  11. 抗原特異的免疫細胞の濃度が、前記投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  12. 抗原特異的免疫細胞の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、前記医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  13. 少なくとも治療期間中である期間にわたり抗原特異的免疫細胞の濃度が実質的に低下するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  14. 循環中の抗原特異的抗体の濃度が治療期間中に実質的に低下するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  15. 循環中の抗原特異的抗体の濃度がＥＬＩＳＡによって計測される、請求項１４に記載の方法。
  16. 抗原特異的循環抗体の濃度が、前記治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する、請求項１４に記載の方法。
  17. 抗原特異的抗体の濃度が、前記投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する、請求項１４に記載の方法。
  18. 抗原特異的循環抗体の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、前記医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
  19. 少なくとも治療期間中である期間にわたり抗原特異的循環抗体の濃度が実質的に低下するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
  20. 抗原特異的調節性Ｔ細胞の割合が治療期間中に実質的に増加するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  21. 抗原特異的免疫細胞の濃度の低下が、前記対象から採取された生物学的試料からフローサイトメトリーによって計測される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記生物学的試料が、リンパ節生検、脾臓試料、又は末梢血である、請求項２１に記載の方法。
  23. 抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度が、前記治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超増加する、請求項２０に記載の方法。
  24. 抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度が、前記投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超増加する、請求項２０に記載の方法。
  25. 抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に増加するように、前記医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
  26. 少なくとも治療期間中である期間にわたり抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度が実質的に増加するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
  27. 前記自己免疫疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防されるか、軽減されるか、又は遅延するように、前記医薬組成物が治療期間にわたって十分な回数投与される、請求項５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記治療期間が、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記治療期間内における投与間の時間間隔が、前記投与される医薬組成物中に存在する外因性抗原を発現する除核造血細胞の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満にまで外因性抗原を発現する除核造血細胞の数が減少する期間以下である、請求項３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 投与頻度が、抗原特異的免疫細胞の濃度を自己免疫疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  31. 投与頻度が、抗原特異的循環抗体の濃度を自己免疫疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である、請求項１４に記載の方法。
  32. 投与頻度が、抗原特異的調節性Ｔ細胞の濃度を自己免疫疾患、障害又は病態の症状に関連する閾値レベルより高く有効に増加させるのに十分である、請求項２０に記載の方法。
  33. 前記除核造血細胞が、赤血球系細胞、血小板系細胞、又はそれらの前駆体である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記赤血球系細胞が赤血球又は網赤血球である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記血小板系細胞が血小板である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記除核造血細胞がドナーから単離される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記除核造血細胞が前記対象から自己細胞によって誘導される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記除核造血細胞が同種細胞によって誘導される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記除核造血細胞が異種細胞によって誘導される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記除核造血細胞が、有核前駆細胞から、その核の排出を生じさせる培養に基づくプロセスによって誘導される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記除核造血細胞が、有核前駆細胞であって、その核を取り除く化学的又は物理的操作を受ける有核前駆細胞から作成される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記除核造血細胞が、有核前駆細胞の核の照射又は化学的破壊によって作成される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  43. 化学的破壊がサイトカラシンＢによって行われる、請求項４２に記載の方法。
  44. 照射が、少なくとも５Ｇｙ、７Ｇｙ、１０Ｇｙ、１５Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、４０Ｇｙ又は少なくとも５０Ｇｙで行われる、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記外因性抗原が、外因性核酸によってコードされるポリペプチドである、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記外因性抗原が前記除核造血細胞の細胞膜に会合している、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記外因性抗原が融合物又はキメラポリペプチドである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記融合物又はキメラが、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含み、前記Ｓドメインが前記除核造血細胞上の表面ドメインであり、前記Ａドメインが前記細胞膜内又は前記細胞膜上のアンカーであり、前記Ｕドメインが前記除核造血細胞の細胞内の非露出側に向いており、前記Ｓドメイン、前記Ａドメイン、及び／又は前記Ｕドメインが異なるポリペプチド由来である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記Ｓドメイン及び／又は前記Ａドメインが、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、又は少なくとも５００アミノ酸を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記Ｓドメイン及び／又はＡドメインが、少なくとも５００、７５０、又は少なくとも１，０００アミノ酸を含む、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記外因性抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、並びに表Ｆ、表６、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記除核造血細胞が、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、５００，０００コピー、１，０００，０００コピー、又は２，０００，０００コピーの前記外因性抗原を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記医薬組成物が薬学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 薬学的に活性な薬剤を投与するステップをさらに含み、前記薬学的に活性な薬剤が前記医薬組成物の前に、その後に、又はそれと同時に投与される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記医薬組成物が静脈内投与される、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記薬学的に活性な薬剤が、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される、請求項５４又は５５に記載の方法。
  57. 前記医薬組成物が薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 血栓性血小板減少性紫斑病、ＣＡＰＳ、ＡＰＳ、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、膜性腎炎、１型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、又は表Ｆ及び表Ｇに列挙されるものからなる群から選択される自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物の有効量の投与が、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法による投与を受ける、自己免疫疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象において免疫トレランスを誘導する能力を有する、医薬組成物。
  60. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５９に記載の医薬組成物。
  61. 外因性抗原を発現する造血細胞の集団を含む、請求項５９又は６０に記載の医薬組成物。
  62. 外因性抗原を発現する少なくとも１×１０３個の造血細胞を含む、請求項６１に記載の医薬組成物。
  63. 外因性抗原を発現する前記造血細胞が、約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で提供される、請求項６２に記載の医薬組成物。
  64. 外因性抗原を発現する前記造血細胞が、約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で提供される、請求項６２に記載の医薬組成物。
  65. 長期保存用に製剤化される、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  66. 凍結される、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  67. 薬学的に活性な薬剤を含む、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  68. 前記薬学的に活性な薬剤が、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される、請求項６７に記載の医薬組成物。
  69. 静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化された請求項５９〜６５、６７又は６８のいずれか一項に記載の組成物を含む剤形。
  70. 請求項５９〜６９のいずれか一項に記載の医薬組成物を保持する容器と、前記対象への前記医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具。
  71. 請求項５９〜６９のいずれか一項に記載の医薬組成物と、前記対象への前記医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キット。
  72. 請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法によって投与される前記医薬組成物の外因性抗原を発現する造血細胞。
  73. 請求項７２に記載の外因性抗原を発現する造血細胞の集団。
  74. 液体として製剤化された請求項７３に記載の外因性抗原を発現する造血細胞の集団。
  75. 凍結される、請求項７３に記載の外因性抗原を発現する造血細胞の集団。
  76. 請求項７３に記載の造血細胞集団によって発現される単離抗原。
  77. 請求項７３に記載の外因性抗原をコードする外因性核酸。
  78. Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含む外因性抗原を含む除核造血細胞であって、前記Ｓドメインが細胞外表面ドメインであり、前記Ａドメインがアンカーであり、及び前記Ｕドメインが細胞内に局在し、前記除核造血細胞が対象への投与時に免疫トレランスを誘導する能力を有する、除核造血細胞。
  79. 前記外因性抗原が融合物又はキメラポリペプチドである、請求項７８に記載の除核造血細胞。
  80. 前記Ｓドメイン、前記Ａドメイン、及び／又は前記Ｕドメインが異なるポリペプチド由来である、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  81. 前記Ｓドメイン及び／又は前記Ａドメインが、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、又は少なくとも５００アミノ酸を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  82. 前記Ｓドメイン及び／又はＡドメインが、少なくとも５００、７５０、又は少なくとも１，０００アミノ酸を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  83. 前記外因性抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、並びに表Ｆ、表６、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  84. 前記除核造血細胞が、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、５００，０００コピー、１，０００，０００コピー、又は２，０００，０００コピーの前記外因性抗原を含む、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  85. 前記除核造血細胞が、赤血球系細胞、血小板系細胞、又はそれらの前駆体である、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  86. 前記赤血球系細胞が赤血球又は網赤血球である、請求項８５に記載の除核造血細胞。
  87. 前記血小板系細胞が血小板である、請求項８５に記載の除核造血細胞。
  88. 前記除核造血細胞がドナーから単離される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  89. 前記除核造血細胞が前記対象から自己細胞によって誘導される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  90. 前記除核造血細胞が同種細胞によって誘導される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  91. 前記除核造血細胞が異種細胞によって誘導される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  92. 前記除核造血細胞が、有核前駆細胞から、その核の排出を生じさせる培養に基づくプロセスによって誘導される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  93. 前記除核造血細胞が、有核前駆細胞であって、その核を取り除く化学的又は物理的操作を受ける有核前駆細胞から作成される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  94. 前記除核造血細胞が、有核前駆細胞の核の照射又は化学的破壊によって作成される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  95. 化学的破壊がサイトカラシンＢによって行われる、請求項９４に記載の方法。
  96. 照射が、少なくとも５Ｇｙ、７Ｇｙ、１０Ｇｙ、１５Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、４０Ｇｙ又は少なくとも５０Ｇｙで行われる、請求項９４に記載の方法。
  97. 前記外因性抗原が、外因性核酸によってコードされるポリペプチドである、請求項７８〜９６のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  98. ヒト供給源から誘導される、請求項７８〜９７のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  99. ブタ、チンパンジー、マカク、非ヒト霊長類、及び非霊長類哺乳動物からなる群から選択される非ヒト供給源から誘導される、請求項７８〜９７のいずれか一項に記載の除核造血細胞。
  100. 前記ポリペプチド抗原が細胞内に局在する、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  101. 前記ポリペプチド抗原が前記細胞の表面上において細胞外に局在する、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  102. 前記ポリペプチド抗原が内因性細胞タンパク質に融合している、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  103. 前記ポリペプチド抗原が内因性膜貫通タンパク質の細胞内領域に融合している、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  104. 前記ポリペプチド抗原が内因性膜貫通タンパク質の細胞外領域に融合している、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  105. 前記ポリペプチド抗原がグリコシルホスファチジルイニソトール（ＧＰＩ）アンカリングタンパク質に融合している、請求項７９に記載の除核造血細胞。
  106. 請求項７８〜１０５のいずれか一項に記載の除核造血細胞を含む組織培養バッチ。
  107. 請求項７８〜１０５のいずれか一項に記載の除核造血細胞の集団。
  108. 請求項１０７に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
  109. 免疫トレランスを誘導する方法であって、それを必要としている対象に対し、請求項１０８に記載の医薬組成物を、前記対象において免疫トレランスを誘導するのに十分な量及び／又は頻度で投与するステップを含む方法。
  110. 免疫活性化疾患を治療する方法であって、それを必要としている対象に対し、請求項１０８に記載の医薬組成物を、前記免疫活性化疾患を治療するのに十分な量及び／又は頻度で投与するステップを含む方法。
  111. 前記疾患が、自己抗体媒介性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、ＨＬＡ不適合媒介性疾患、及び免疫原性治療用タンパク質によって治療可能な疾患からなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
  112. 治療用タンパク質治療レジメンに応答した免疫活性化を低減又は軽減する方法であって、それを必要としている対象に対し、請求項１０８に記載の医薬組成物を、前記免疫活性化を実質的に低減又は軽減するのに十分な量及び／又は頻度で投与するステップを含む方法。
  113. 前記治療用タンパク質が、表Ｉ、表Ｊ、及び表７に列挙されるものからなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
  114. 表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ、表Ｊ、表６、表７、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリペプチド抗原と融合した内因性赤血球系細胞タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
  115. 表Ｆ、表Ｇ、表Ｈ、表Ｉ、表Ｊ、表６、表７、及び表８に列挙されるものからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリペプチド抗原と融合した内因性赤血球系細胞タンパク質をコードする核酸配列を含むメッセンジャーＲＮＡ。
  116. 免疫トレランスを誘導する方法であって、アレルゲン媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記疾患、障害又は病態を媒介するアレルゲンに対して前記対象において免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される、方法。
  117. 前記外因性抗原が、Ａｒａ ｈ２、２Ｓアルブミン、ヒアラウロニダーゼ、及び表Ｈに列挙されるものからなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記アレルゲン媒介性疾患、障害又は病態が、ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、昆虫毒アレルギー、及び表Ｈに列挙されるものからなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
  119. 免疫トレランスを誘導する方法であって、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記疾患、障害又は病態を媒介するＨＬＡに対して前記対象において免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される、方法。
  120. 免疫トレランスを誘導する方法であって、免疫原性治療用分子によって治療され得る疾患、障害又は病態に罹患しているか又はその発症リスクがあるヒト対象に対し、外因性抗原を発現する除核造血細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記疾患、障害又は病態の治療に使用される前記免疫原性治療用分子に対して前記対象において免疫トレランスを誘導するのに有効な量で投与される、方法。
  121. 前記治療用分子が、組換え（第ＶＩＩＩ因子）、ベネフィックス（第ＩＸ因子）、ヒュミラ（抗ＴＮＦα）、並びに表Ｉ、表Ｊ、及び表７に列挙されるものからなる群から選択される、請求項１２０に記載の方法。
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