JP2017514486A - 組換えボツリヌス菌神経毒の生産 - Google Patents

組換えボツリヌス菌神経毒の生産 Download PDF

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Abstract

本発明は、可溶性二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法を提供する。

Description

本発明は、血清型Aの組換えボツリヌス菌(Clostridium botulinum)(C. botulinum)神経毒(BoNT/A)を生産する方法に関する。
ボツリヌス神経毒(BoNT)は、BoNT自体と複合体を形成しているいくつかのアクセサリータンパク質からなる大きなタンパク質複合体の形態でボツリヌス菌(C. botulinum)によって生産される。現在、少なくとも7種の異なるクラスのボツリヌス神経毒、すなわち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびGがあり、そのすべてが、同様の構造および作用様式を共有する。8番目の血清型の可能性がある、Hが最近報告されたが、その配列はまだ公開されていない。異なるBoNT血清型は、特異的な中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、血清型によるこのような分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性百分率と相関している。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸配列同一性百分率に基づいて異なるサブタイプにさらに分けられる。
BoNTは、公知の最も強力な毒素であり、マウスの半致死量(median lethal dose, LD50)値は、血清型に応じて0.5〜5ng/kgの範囲である。BoNTは、胃腸管において吸着され、全身循環に侵入した後に、コリン作動性神経終末のシナプス前膜と結合し、神経伝達物質アセチルコリンの放出を防止する。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/FおよびBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞結合膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C、BoNT/AおよびBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/Cは、シンタキシンを切断する。
本来、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、これが、タンパク質切断事象によって翻訳後に修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に連結されている2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基の間に位置する特定の切断部位で起こり、活性化部位と呼ばれることが多い。毒素の活性形態は、この二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖またはLC)と呼ばれる。H鎖は、C末端ターゲッティング成分(HCドメイン)およびN末端転位置成分(HNドメイン)を含む。切断部位は、L鎖と転位置成分の間の露出されるループ領域中に位置している(表1を参照のこと)。HCドメインのその標的ニューロンとの結合およびエンドソームによる結合している毒素の細胞への内部移行後、HNドメインがL鎖をエンドソーム膜を横断してサイトゾル中に転位置し、L鎖が、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシン)として知られる細胞内輸送タンパク質をタンパク分解性に切断することによって作用する-(非特許文献1)を参照のこと。頭字語SNAREは、可溶性NSF付着受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)に由来し、ここで、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)を意味する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞融合に不可欠であり、従って、細胞からの小胞輸送による分子の分泌に不可欠である。プロテアーゼ機能は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質に対して高い基質特異性を示す。したがって、非細胞傷害性プロテアーゼは、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、標的細胞からの細胞分泌を阻害可能である。クロストリジウム神経毒のL鎖プロテアーゼは、SNAREタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼである。
ボツリヌス神経毒は、弛緩性の筋肉麻痺を引き起こす能力についてよく知られている。前記筋肉弛緩薬特性は、ボツリヌス神経毒(BoNT/Aなど)が、眉間のしわまたは過収縮の顔のしわ、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の活動亢進、発汗過多、鼻唇のしわ、頸部ジストニア、眼瞼痙攣および痙縮の治療を含め、種々の医学的および美容的手順において使用されることにつながった。
伝統的に、BoNTの生産は、ボツリヌス菌(C. botulinum)細菌の培養と、それに続く、ボツリヌス神経毒複合体の単離および精製によって実施された。しかし、この方法でのBoNTの生産は、非効率的であり、低いタンパク質収率を提供する。さらに、ボツリヌス菌(C. botulinum)は、芽胞形成菌であり、従って、大腸菌(E. coli)などの細菌の培養には必要ではない専門的な培養装置および施設が必要である。BoNTの使用の増大は、BoNTを生産および精製するための代替法の開発につながった。特に、大腸菌(E. coli)を使用してBoNTを生産する方法が開発された。
発酵溶液からのCNTの精製(ボツリヌス菌(C. botulinum)または大腸菌(E. coli)を使用するかに関わらず)は、神経毒が、プロセシングされていない、部分的にプロセシングされた、完全にプロセシングされたポリペプチドの混合物としてその溶液中に含有され、それらのすべてが極めて類似した生化学的および物理的特性を有するので、特別な課題である。部分的にプロセシングされた神経毒は、通常、細胞内タンパク質分解活性が、軽鎖とループ間のペプチド結合を加水分解し、ループと重鎖のN末端間のペプチド結合が依然として無傷である場合に生じる。さらに、部分的にプロセシングされた神経毒はまた、細胞内タンパク質分解活性が、重鎖からループペプチドを放出し、ループペプチドと軽鎖のC末端間のペプチド結合がまだ加水分解されていない場合にも生じ得る。発酵の条件および神経毒の種類に応じて、ループペプチドを欠く完全にプロセシングされたポリペプチドに、5％〜90％の間の部分的にプロセシングされたまたはプロセシングされていないポリペプチドが大幅に混入している場合がある。いくつかの場合には、神経毒は、大部分がプロセシングされておらず、治療的使用に先立って、エンドペプチダーゼで処理されて、生物学的に活性になる必要がある。
先行技術には、プロセシングされていない、または部分的にプロセシングされた前駆体タンパク質の量を低減するために、異種プロテアーゼを用いてクロストリジウム神経毒を処理する種々の試みが記載されている。クロストリジウム神経毒の活性化のために最も広く使用されるプロテアーゼ、トリプシンは、血清型B(BoNT/B)およびE(BoNT/E)のクロストリジウム神経毒を活性化するのに有用であるが、おそらくは、BoNT/Aの重鎖サブユニットのC末端付近のタンパク質分解作用によって二次生成物をもたらすと思われ、したがって、その細胞受容体との毒素結合を破壊すると思われる。BoNT/Aを生産するボツリヌス菌(C. botulinum)などの天然宿主から単離された内因性プロテアーゼから、より特異的な切断産物が理論的に予期される。
本発明者らは、ボツリヌス菌(C. botulinum)由来の内因性プロテアーゼおよびプロテアーゼエンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)(市販されており、リソバクター・エンジモゲネス(Lysobacter enzymogenes)から単離され得る)を含めた外因性プロテアーゼなどの種々のプロテアーゼをこれまでに同定している。しかし、このエンドプロテアーゼによる組換えBoNT/Aの切断は、天然切断を正確に反映するが、Lys-Cの使用は、新しい実施上の検討事項を浮かび上がらせる。特に、Lys-Cは、組換えBoNT/Aの切断後、反応混合物中で数日間、活性のままであり得る。したがって、最終生成物中のLys-Cの量を低減し、それによって、神経毒調製物の質を改善するための手段および方法が、高度に望まれるが、未だ利用可能ではない。
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、前記の必要性に応じることによる、神経毒ポリペプチドの生産を改善するための手段および方法の提供と見ることができる。具体的には、組換えBoNT、特に活性化された二本鎖組換えBoNT/Aを生産するための改善された方法が当技術分野には必要である。
技術的課題は、特許請求の範囲において、および本明細書において以下に特徴づけられる実施形態によって解決される。
Gerald K(2002年「Cell and Molecular Biology」(第4版)John Wiley & Sons、Inc
組換えBoNT/A亜血清型の生産は、本明細書において単鎖BoNT/Aタンパク質と呼ばれる単一ポリペプチドとして大腸菌における発現によって達成することができる。高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によってこの単鎖タンパク質を単離する際、単鎖タンパク質が切断されて、単一のジスルフィド結合によって一緒に連結された二本鎖タンパク質である活性毒素を形成しなければならない。
本発明者らは、組換え単鎖BoNT/A亜血清型を、プロテアーゼエンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)を使用して切断し、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質神経毒、すなわち、BoNT/A軽鎖および重鎖のヘテロ二量体を生産できることをこれまでに見出した。Lys-C切断部位は、N末端配列決定および質量分析によって内因性タンパク質と同一であると決定された。したがって、Lys-Cを使用する活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質の生産は、真正の活性な二本鎖BoNT/A、すなわち、天然の活性な二本鎖BoNT/Aと本質的に同一である二本鎖BoNT/Aの生成をもたらすので有利である。対照的に、活性な二本鎖BoNTタンパク質を生産するために使用される別の一般的なプロテアーゼのトリプシンは、BoNT/A単鎖配列内の少なくとも1つのさらなる部位を切断する。このさらなる切断は、生成される活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質の効力を低減する。
単鎖BoNT/Aタンパク質が、Lys-Cによって切断された後、最終的な純粋な生成物を生産するために、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質は、任意の残存する宿主細胞タンパク質およびLys-Cプロテアーゼを除去するための精製を必要とする。
特に、エンドプロテアーゼLys-C切断試験から、本発明者らは、Lys-Cは、極めて低濃度で組換えBoNT/A1(rBoNT/A1)を切断し、数日間にわたって活性のままであることを見出した。結果的に、活性化された毒素からこのプロテアーゼを精製除去できる方法を開発することが重要である。
本発明者らは、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用することによって活性化後に、BoNT/Aから活性化Lys-Cプロテアーゼおよび宿主細胞タンパク質を除去するための効率的な方法を開発した。本発明者らは、驚くべきことに、HICが精製において回収される活性な二本鎖BoNT/Aの量だけでなく、Lys-C分離、すなわち、Lys-Cプロテアーゼの除去も大幅に改善することを見出した。BoNT/AおよびLys-Cの等電点(pI)および正味電荷に基づいてLys-CおよびrBoNT/Aの生物物理学的特徴を考慮すると、HICよりもむしろイオン交換クロマトグラフィー(IEX)が、2種のタンパク質を分解すると予測され、HICの有利な特性は、反直観的である。
本発明は、特許請求の範囲において明記されるような方法を提供することによって1つ以上の上記の問題を解決する。
したがって、本発明は、可溶性二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法であって、
a)可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を提供するステップと、
b)溶液中で、前記BoNT/Aタンパク質を、エンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)と接触させるステップと、
c)可溶性BoNT/Aタンパク質およびLys-Cを含有する溶液を、疎水性表面と接触させ、ここで、可溶性BoNT/Aタンパク質が疎水性表面と優先的に結合することによって、Lys-Cから可溶性BoNT/Aタンパク質を分離するステップと、
を含む前記方法を提供する。
可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質は、発現系において前記単鎖BoNT/Aタンパク質をコードする核酸を発現させることによって宿主細胞において生産することができ、ここで、随意で、発現系は、細菌発現系であり、好ましくは、細菌発現系は、大腸菌(E. coli)発現系であり、宿主細胞は、大腸菌(E. coli)細胞である。前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質は、前記宿主細胞の細胞質において、または無細胞系において発現させることができる。可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質は、少なくとも5mg/(1Lの培養物)のレベルで発現させることができる。前記方法は、前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を含有する宿主細胞ホモジネートを提供するために、宿主細胞の溶解を含み得る(好ましくは、可溶性単鎖BoNT/Aは、少なくとも5mg/(1Lの宿主細胞ホモジネート)の濃度で存在する)。
本発明の方法において使用される疎水性表面は、アリールまたはアルキル基からなるリガンドが結合される、不活性マトリックスであり得、ここで、随意で、リガンドは、ブチル、フェニルまたはオクチルリガンドからなる群から選択される。一実施形態では、高性能疎水性表面が使用される。
本発明はまた、本発明の方法によって得られる活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質を提供する。
本発明はさらに、本発明の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質を含む組成物を提供し、ここで、前記組成物は、エンドプロテアーゼLys-Cを実質的に含まない。好ましくは、前記組成物は、100ng BoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のエンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)または100ng BoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-Cを含有する。このような組成物は、治療的および美容的処置において使用するのに適している。
本発明はまた、本発明の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質、界面活性剤である非タンパク質安定化剤および水を含む液体医薬組成物を提供し、ここで、前記液体医薬組成物は、タンパク質安定化剤を含まず、前記液体医薬組成物は、エンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)を実質的に含まない。好ましくは、前記液体医薬組成物は、100ng BoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-Cまたは100ng BoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-Cを含有する。前記液体医薬組成物は、塩化ナトリウム、5.5から7.5の間のpHを維持するための緩衝剤および二糖をさらに含み得、ここで、水は滅菌水である。
本発明はまた、治療において使用するための、本発明の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質、組成物または液体医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、医薬の生産における、本発明の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質、組成物または液体医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、本発明の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質、組成物または液体医薬組成物の、それを必要とする患者への投与を含む治療の方法を提供する。
ボツリヌス毒素血清型A(BoNT/A)
用語「BoNT」は、ボツリヌス神経毒を意味し、血清型A、B、C1、D、E、FまたはGのBoNTなどのボツリヌス菌(C. botulinum)から得られる神経毒を指す。また、用語「CNT」および「BoNT」によって、化学的修飾または遺伝的修飾を含めた1つ以上の修飾を含む組換えおよび改変神経毒が包含される。用語「遺伝的修飾」とは、1つ以上のアミノ酸塩基の欠失、置換もしくは付加をもたらす1つ以上の核酸残基の欠失、置換もしくは付加または前記の1つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加を意味する。
BoNT/A血清型は、少なくとも8種の亜血清型(サブタイプとしても知られる)、BoNT/A1〜BoNT/A8に分けられ、これらは、少なくとも84％、最大98％のアミノ酸配列同一性を共有し、所与のサブタイプ内のBoNT/Aタンパク質は、より高いアミノ酸百分率配列同一性を共有する。表1(以下)は、前駆体、BoNT/Aサブタイプの天然の二本鎖神経毒を示し、Lys-Cによって切断されるアミノ酸配列を含む露出されたループ(活性化ループ)を同定する。
表1を参照すると、LC、HN、HCNおよびHCC領域に対して示されるアミノ酸位置(残基)は、全長BoNT/Aタンパク質配列中の前記領域に対するアミノ酸位置に対応する。表1に示されるUniProt受託番号は、種々のBoNT/A亜血清型の例である。したがって、一実施形態では、表1に示されるLC、HN、HCNおよびHCC領域のアミノ酸位置は、受託番号によって同定される全長BoNT/Aタンパク質配列におけるアミノ酸位置に対応する。
本発明の方法を使用すると、プロセシングされていない、または部分的にプロセシングされたBoNT/Aが、二本鎖BoNT/Aに効率的にプロセシングされるので、それらの混入物があまり大幅には混入していないBoNT/A二本鎖組成物を得ることが現在可能である。本発明の方法はまた、単鎖BoNT/Aタンパク質を活性な二本鎖にプロセシングするために使用されるLys-C酵素の有効な除去を可能にする。一態様では、二本鎖BoNT/Aは、天然二本鎖神経毒であり、ここで、軽鎖のC末端および重鎖のN末端は、野生型クロストリジウム属から単離された対応する完全にプロセシングされた二本鎖BoNT/Aと同一である。
本発明によれば、組換えBoNT/A二本鎖を含めた活性なBoNT/A二本鎖は、単鎖ポリペプチドとして生産され得、これが切断されて活性な二本鎖形態のタンパク質を形成する。
本方法は、例えば、配列番号1のポリペプチドおよびその誘導体を含めた、任意のBoNT/Aサブタイプまたはそのホモログまたは誘導体の二本鎖を生産するために使用され得る。本発明のこの態様およびその他の態様に関して使用される用語「誘導体」は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換、欠失または短縮型などのアミノ酸突然変異を含む。
BoNT/A単鎖タンパク質は、GenBank番号:CBZ04958.1、YP_002805603.1、ZP_02994746.1、YP_001788403.1、YP_001782718.1、ZP_02616437.1、ZP_02614241.1、YP_001392361.1、YP_001255575.1で示されるようなポリペプチド配列を含み得る。BoNT/A単鎖タンパク質は、以下に示されるようなポリペプチド配列を含み得る:
・A1亜血清型:UniParc受託番号UPI0000ED909E(UniProt受託番号P10845、バージョン159)、UniParc受託番号UPI0000EF85BD(UniProt受託番号S8B1U4、バージョン3またはUniProt受託番号A2I2R4、バージョン41)、UniParc受託番号UPI0001A954C8(UniProt受託番号C6K838、バージョン11)、UniParc受託番号UPI0000001386(UniProt受託番号A5HZZ9、バージョン57)、UniParc受託番号UPI000003409D(UniProt受託番号A2I2U2、バージョン36)、UniParc受託番号UPI00016529B7(UniProt受託番号B1A2D5、バージョン21)、UniParc受託番号UPI00027EE164(UniProt受託番号J7FGZ9、バージョン6);
・A2亜血清型:UniParc受託番号UPI0000EF84BD(UniProt受託番号A2I2R5、バージョン28)、UniParc受託番号UPI0001C0B376(UniProt受託番号D2KCK3、バージョン15)、UniParc受託番号UPI0001C32E84(UniProt受託番号D3IV23、バージョン10)、UniParc受託番号UPI0001F3B30D(UniProt受託番号E5F1I1、バージョン11)、UniParc受託番号UPI000016EA88(UniProt受託番号Q45894、バージョン116またはUniProt受託番号Q58GH1、バージョン51)、UniParc受託番号UPI000067C53E(UniProt受託番号Q2PPK6、バージョン33)、UniParc受託番号UPI000290BEB1(UniProt受託番号K4GGE0、バージョン6);
・A3亜血清型:UniParc受託番号UPI00005B712C(UniProt受託番号 Q3LRX9、バージョン38)、UniParc受託番号UPI00016DBC11(UniProt受託番号 B1L2G5、バージョン38またはUniProt受託番号D3IV24、バージョン11)、UniParc受託番号UPI000290C3D0(UniProt受託番号K4G3L3、バージョン7);
・A4亜血清型:UniParc受託番号UPI00005B712D(UniProt受託番号Q3LRX8、バージョン35)、UniParc受託番号UPI00019DB885(UniProt受託番号C3KS13、バージョン29);
・A5亜血清型:UniParc受託番号UPI0001AE7D6A(UniProt受託番号C7BEA8、バージョン14)、UniParc受託番号UPI000198BDAE(UniProt受託番号E8ZMW0、バージョン18またはUniProt受託番号C1IPK2、バージョン20);または
・A6亜血清型:UniParc受託番号UPI0001B7D251(UniProt受託番号C9WWY7、バージョン13)、
・A7亜血清型:UniParc受託番号UPI000290B995(UniProt受託番号K4LN57)、
・A8亜血清型:UniParc受託番号UPI000559A469(UniProt受託番号A0A0A7PDB7)、UniParc受託番号UPI0003C9D2A1(UniProt受託番号 V5N8R1)。
BoNT/A単鎖タンパク質は、上記のBoNT/Aポリペプチド配列のうち1種に対して少なくとも50％の配列同一性を有するホモログまたは誘導体であるポリペプチド配列を含み得る。
一態様では、前記BoNT/A単鎖タンパク質のポリペプチド鎖は、配列番号2〜7または13または14のいずれか1種から選択される配列を含む。より詳しい一態様では、前記BoNT/A単鎖タンパク質のポリペプチド鎖は、配列番号2〜7または13または14のうちいずれか1種から選択される配列を含み、第2のポリペプチドは、配列番号2〜7または13または14のいずれか1種の前記配列内の塩基性アミノ酸残基のC末端側で切断される。前記配列は、本発明のBoNT/A単鎖タンパク質の公知の基質のアミノ酸配列を表す。
BoNT/A単鎖タンパク質は、配列に含有される塩基性アミノ酸残基のC末端側で切断される(表1、列LCおよびHNを比較されたい)。好ましい態様では、前記BoNT/A単鎖タンパク質は、配列番号2〜7および13〜14から選択される配列(例えば、血清型BoNT/A1、配列番号2)を含む。
BoNT/A単鎖タンパク質は、配列番号2〜7もしくは13もしくは14のいずれか1種の、または配列番号1の誘導体、または本明細書において同定される受託番号に対応するポリペプチド配列のうち1種を含み得、ここで、前記誘導体は、1つ以上の点突然変異および/または1つ以上のさらなるアミノ酸残基を有する。別の態様では、前記誘導体は、最大1、最大2、最大3、最大4、最大5、最大6、最大7、最大8、最大9、最大10、最大15の点突然変異を有する。本明細書において記載されるような、プロテアーゼ活性を決定するための活性アッセイを使用することによって、当業者は、所与の誘導体が、Lys-Cによってプロセシングされるか否かを決定できる。
誘導体は、塩基性アミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基に変更する点突然変異を含有し得る。誘導体は、配列番号2〜7または13または14のうちいずれか1種、配列番号1または本明細書において同定される受託番号に対応するポリペプチド配列のうちの1種と少なくとも50％の配列同一性を有し得る。前記誘導体または誘導体を含むポリペプチドは、Lys-Cの基質であり得、Lys-Cによってタンパク分解性に切断されうる。代表例として、例えば、軽鎖または重鎖において1つ以上の点突然変異を含む配列番号1の誘導体がある。
前記BoNT/A単鎖タンパク質は、(a)配列番号1の配列(ATCC3502、Genbank受託AAA23262のBoNT/A)と、または本明細書において同定される受託番号に対応するポリペプチド配列のうち1種と、少なくとも30％の配列同一性、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上を有するポリペプチド配列を含み得る。BoNT/A単鎖タンパク質は、配列番号15のポリペプチド配列または配列番号15の配列と少なくとも30％の配列同一性、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上を有するポリペプチド配列を含み得る。
用語「配列同一性」とは、本明細書において、参照アミノ酸配列とクエリー配列間の同一性の決定を指し、ここで、配列は、最高次元のマッチが得られるようアラインされ、例えば、BLASTP、BLASTN、FASTAなどのコンピュータプログラムにおいてコードされた公開された技術または方法を使用して計算することができる(Altschul 1990年、J MoI Biol 第215巻:403頁)。同一性パーセント値は、全アミノ酸配列にわたって計算される場合も、アミノ酸配列の領域にわたって計算される場合もある。例えば、単鎖BoNT/Aタンパク質について、配列同一性は、最大50個のアミノ酸(aa)残基、最大100aa、最大150aa、最大250aa、300aa、350aa、400aa、450aa、500aa、550aa、600aa、650aa、700aa、750aa、800aa、850aa、900aa、950aa、1000aa、1050aa、1100aa、1150aa、1200aa、1250aaまたはそれ以上の残基、最大で全長単鎖BoNT/Aタンパク質配列の配列長にわたって計算することができる。配列同一性は、少なくとも50aa残基、少なくとも100aa、少なくとも150aaまたは少なくとも250aaの残基にわたって計算することができる。
種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、種々の配列を比較するために当業者に利用可能である。これに関連して、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムは、特に信頼できる結果をもたらす。本明細書に列挙された配列アライメントを実施し、配列同一性値を計算するために、アルゴリズムClustal Wに基づく市販のプログラムDNASTAR Lasergene MegAlignバージョン7.1.0を、以下の設定を用いて全配列領域にわたって使用した:特に断りのない限り、配列アライメントの標準設定として常に使用されなければならない、ペアワイズアライメントパラメータ:ギャップペナルティー:10.00、ギャップ長ペナルティー:0.10、タンパク質重み行列Gonnet250。
少なくとも30％とは、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％を意味する。配列番号1の配列と少なくとも50％の配列同一性を有する前記BoNT/A単鎖タンパク質配列の配列同一性は、配列番号1のアミノ酸位置420〜466に基づいて決定することができるか、または前記配列同一性は、配列番号2〜7または13または14のいずれか1種に基づいて決定することができる。言い換えれば、BoNT/A単鎖タンパク質は、例えば、BoNT/A単鎖タンパク質のアミノ酸位置420〜466の間に見られるポリペプチド配列に対して少なくとも30％の配列同一性、または本明細書において同定される受託番号に対応するポリペプチド配列のいずれか1種を含めたBoNT/A単鎖タンパク質のいずれか1種のポリペプチド配列に対して少なくとも30％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。この定義に従うポリペプチドは、例えば、ボツリヌス菌(C. botulinum)、C.テタニ(tetani)またはC.スポロゲネス(sporogenes)から得ることができる。前記BoNT/A単鎖タンパク質は、例えば、天然に存在する神経毒または1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換、欠失もしくは短縮型などの1つ以上のアミノ酸突然変異を含むその誘導体であり得る。例えば、天然神経毒HCドメインもしくはその一部を欠く誘導体または神経毒HCドメインと置き換わるその他のアミノ酸残基を有する誘導体ならびにさらなる軽鎖またはBoNTの軽鎖とN末端で融合している別のタンパク質性カーゴ分子を有する誘導体が包含される。
BoNT/A単鎖タンパク質は、NまたはC末端に、または内部位置にさらなるアミノ酸残基を含有し得る。さらなるアミノ酸残基は、1つ以上のプロテアーゼ切断部位が両端に位置し得る。さらなるアミノ酸配列は、検出可能なタグとして機能し得、および/または固相支持体との結合を可能にする。一例として、HisタグまたはGSTタグがある。別の例として、好ましくは、C末端に付加されたStreptagを含有するアミノ酸配列VPPTPGSAWSHPQFEK(配列番号12)がある。
別の態様では、前記BoNT/A単鎖タンパク質の生物活性は、タンパク質切断によって調節され得る。多数のポリペプチドの機能が、タンパク質プロセシングによって調節され得るということは当業者に周知である。「調節された」とは、本明細書において、増大または低減される、活性化または不活化されるを意味する。例えば、多数のクロストリジウム神経毒の生物活性は、単鎖神経毒の二本鎖神経毒へのタンパク分解性プロセシングによって増大される、または引き起こされ、ここで、二本鎖神経毒は、軽鎖および重鎖ポリペプチドから構成され、これらはジスルフィド橋によって共有結合によって連結している。神経毒の生物活性は、少なくとも3種の別個の活性を包含する:第1の活性は、神経毒の軽鎖にある「タンパク質分解活性」であり、細胞膜融合の調節に関わる1つ以上のポリペプチドのペプチド結合の加水分解に関与している。第2の活性は、プロセシングされた神経毒の重鎖のN末端にある「転位置活性」であり、リソソーム膜を横断して細胞質への軽鎖の輸送に関わっている。第3の活性は、プロセシングされた神経毒の重鎖のC末端にある「受容体結合活性」であり、標的細胞への神経毒の結合および取り込みに関わっている。好ましい態様では、用語生物活性とは、本明細書において、タンパク質分解活性を意味する。より好ましい態様では、この用語は、増大されたタンパク質分解活性を意味する。
クロストリジウム神経毒の生物活性は、種々の試験によって測定することができ、それらのすべてが当業者には公知である。これらの試験によって、上記の1種以上の活性を決定することが可能となる。例えば、Pearceら、1994年(Pearce LB、Borodic GE、First ER、MacCallum RD(1994年)、Toxicol Appl Pharmacol第128巻:69〜77頁)およびHabermannら、1980年(Habermann E、Dreyer F、Bigalke H.(1980年)、Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.第311巻:33〜40頁)によって記載されるような、マウスLD50アッセイまたはex vivoマウス横隔神経片側横隔膜(mouse phrenic nerve hemidiaphragm, MPN)アッセイによって、生物または単離された神経筋調製物に対する所与の神経毒調製物の毒性効果を決定することが可能となる。LD50アッセイにおいて毒性効果を確立するために、神経毒は、上記の前記3種の活性の各々において生物学的に活性でなくてはならない。さらに、種々のその他のアッセイが利用可能であり、例えば、神経毒または神経毒の軽鎖がタンパク分解性に活性であるか否かを決定することが可能である。このようなアッセイは、例えば、BoNT/AをSNAP-25と接触させることに基づいている。あるいは、SNAP-25の切断部位に相当するペプチドが使用されてもよく、これでは、検出を容易にするためにペプチドが標識され得る。好ましい態様では、生物活性は、上記で本明細書において記載される上記のMPNアッセイを使用することによって決定される。
本発明に従って、前記BoNT/A単鎖タンパク質をコードする核酸分子が使用され得る。前記核酸分子は、随意で、調節エレメントを含み得る。用語「調節エレメント」とは、本明細書において、転写および翻訳を含めた遺伝子発現の調節エレメントを指し、tataボックス、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列、IRES領域、ポリアデニル化シグナル、末端キャッピング構造などといったエレメントを含む。前記調節エレメントは、1つ以上の異種調節エレメントまたは1つ以上の同族調節エレメントを含み得る。「同族調節エレメント」は、野生型細胞における核酸分子またはポリペプチドの遺伝子発現の調節に関わっている、核酸分子が由来する前記野生型細胞の調節エレメントである。「異種調節エレメント」は、前記野生型細胞における核酸分子またはポリペプチドの遺伝子発現の調節に関わっていない調節エレメントである。誘導性プロモーターなどの誘導可能な発現のための調節エレメントも使用され得る。
核酸分子は、例えば、hnRNA、mRNA、RNA、DNA、PNA、LNAおよび/または修飾された核酸分子であり得る。核酸分子は、環状、線形、ゲノムに組み込まれるか、またはエピソーム性であり得る。また、3、4、5、6、7、8、9または10種のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするコンカテマーが包含される。さらに、核酸分子は、細胞内コンパートメントへの輸送のための、または細胞膜を横断する輸送のためのシグナルなどの細胞内輸送のためのシグナル配列をコードする配列を含有し得る。
本発明によれば、BoNT/Aをコードする核酸分子は、有利なことに、宿主細胞、特に、細菌宿主細胞、好ましくは、大腸菌(E. coli)細胞において高レベルの発現を提供するよう設計できる。宿主細胞、特に、細菌宿主細胞、好ましくは、大腸菌(E. coli)細胞においてタンパク質発現を増大するよう核酸分子を設計する方法は、当技術分野で公知であり、コード化核酸配列において「遅いコドン」の頻度(出現数)を低減することが挙げられる。
一態様では、単鎖BoNT/Aタンパク質は、前記単鎖BoNT/Aタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを使用して生産される。ベクターは、前記単鎖BoNT/Aタンパク質のin vitroおよび/またはin vivo発現にとって適したものであり得る。ベクターは、一過性および/または安定な遺伝子発現のためのベクターであり得る。ベクターは、調節エレメントおよび/または選択マーカーをさらに含み得る。前記ベクターは、ウイルス起源のもの、ファージ起源のものまたは細菌起源のものであり得る。例えば、前記発現ベクターは、pET-26b(+)ベクターであり得る。
BoNT/A単鎖タンパク質をコードする核酸分子または発現ベクターは、本発明の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に含まれ得る。用語「宿主細胞」とは、本明細書において、前記核酸分子または前記ベクター、特に、BoNT/A単鎖タンパク質を翻訳するのに適した原核および/または真核細胞を包含する。前記宿主細胞は、BoNT/A単鎖タンパク質またはそのホモログを発現しない宿主細胞であり得る。用語「ホモログ」とは、本明細書において、BoNT/A配列、例えば、配列番号1のBoNT/A配列と、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを指す。しかし、また、BoNT/A単鎖タンパク質またはそのホモログを発現する野生型細胞などの宿主細胞も包含される。例えば、宿主細胞は、血清型A、BまたはFのボツリヌス菌(C. botulinum)などのボツリヌス菌(C. botulinum)、C.ブチリカム(butyricum)、C.バラティ(baratii)およびC.テタニ(tetani)から選択され得る。宿主細胞は、ボツリヌス菌(C. botulinum)のHall株(ATCC3502)、ボツリヌス菌(C. botulinum)のNCTC4587およびNCTC7272としても知られるBoNT/A産生株ATCC19397;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/A産生株NCTC2916;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/A2産生株Kyoto-Fまたはモーリシャス/NCTC9837;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/A3産生株A254マリー湖/NCTC2012;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/A4およびB産生株CDC657;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/A5およびB3'産生株H04402065;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/B1産生株Okra/NCTC7273;ボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/BおよびF産生株CDC4013/NCTC12265;またはボツリヌス菌(C. botulinum)のBoNT/F1産生株ランゲランド/NCTC10281であり得る。前記宿主細胞は、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、B.セレウス(cereus)、B.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、B.ミコイジス(mycoidis)、B.サーモプロテオリティクス(thermoproteolyticus)、炭疽菌(B. anthracis)、B.メガテリウム(megaterium)、枯草菌(B. subtilis)、大腸菌(E. coli)または酵母細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌(E. coli)宿主細胞、特に、大腸菌(E. coli)BL21(DE3)またはBLR(DE3)細胞であり得る。
一態様では、BoNT/A単鎖タンパク質は、宿主細胞内で修飾される(すなわち、グリコシル化される、リン酸化される、プロテアーゼによってプロセシングされるなど)。修飾はまた、金属イオンを含めた非タンパク質性補助因子の付加も含む。宿主細胞は、BoNT/A単鎖タンパク質の発現のインデューサーを含み得る。このような発現のインデューサーは、宿主細胞培養物またはその可溶化液中のBoNT/A単鎖タンパク質の量を増大する効果を有する、核酸分子またはポリペプチドまたは小さい化学的実体を含めた化学的実体であり得る。発現のインデューサーは、例えば、BoNT/A単鎖タンパク質をコードする核酸分子の転写または翻訳を増大し得る。インデューサーは、例えば、当業者に公知の組換え手段によって発現させることができる。あるいは、インデューサーは、細胞、例えば、クロストリジウムの細胞から単離することができる。
単鎖BoNT/Aタンパク質は、本明細書に記載されるような発現ベクターを前記宿主細胞に導入するステップおよび前記宿主細胞において前記の単鎖BoNT/Aタンパク質を発現させるステップを含む方法によって生産することができる。単鎖BoNT/Aタンパク質は、前記単鎖BoNT/Aタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を提供することおよび前記宿主細胞において前記単鎖BoNT/Aタンパク質を発現させることによって生産することができる。通常、宿主細胞は、細菌細胞、好ましくは、大腸菌(E. coli)細胞である。大腸菌(E. coli)宿主細胞は、大腸菌(E. coli)BL21(DE3)またはBLR(DE3)細胞であり得る。
好ましくは、BoNT/A単鎖タンパク質は、細胞において翻訳される。細胞は、原核または真核細胞であり得る。一態様では、細胞は、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)または酵母から選択され;大腸菌(E. coli)は、高度に好ましい宿主細胞である。また、野生型細胞、すなわち、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリクム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・バラティ(Clostridium baratii)およびクロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)の任意の公知の単離菌などの自然から単離された細胞におけるBoNT/A単鎖タンパク質の翻訳も本発明によって包含される。本明細書に記載されるような任意の適した宿主細胞を、本発明に従って使用してもよい。
核酸分子またはベクターを宿主細胞中に入れるために、また細胞において組換えタンパク質としてBoNT/A単鎖タンパク質を発現させるために、種々の標準手段および方法が当業者に利用可能である。さらに、当業者は、細胞または細胞可溶化液からタンパク質およびポリペプチドを抽出するための多数の標準技術を承知している(例えば、Recombinant DNA Principles and Methodologies、J. Green、Marcel Dekker Inc.、1998年;The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory、2006年; Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory、2000年)。これらの手段および方法のいずれも、本発明の方法において使用され得る。
宿主細胞または宿主細胞可溶化液からタンパク質を抽出する通常の方法として、細胞可溶化液の遠心分離(清澄化)、タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿、タンパク質の再懸濁、再懸濁されたタンパク質の遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが挙げられる。さまざまな順序でのこのようなステップのいくつかの組合せが、BoNT/A単鎖タンパク質を精製するために、本発明に従って有用であり得る。
以下により詳細に記載されるように、BoNT/A単鎖タンパク質を、Lys-Cと接触させて、活性BoNT/A二本鎖を生産することができる。本発明者らは、ここで、BoNT/AおよびLys-Cの反応混合物からBoNT/A二本鎖を精製するための有利な方法を開発した。
エンドプロテアーゼLys-C
本明細書に記載されるように、単鎖BoNT/Aタンパク質は、エンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)を使用して切断されて、BoNT/Aタンパク質の活性な二本鎖形態を形成する。用語「Lys-C」とは、リジンとのペプチド結合をC末端で特異的に切断する、リソバクター・エンジモゲネス(Lysobacter enzymogenes)由来の33kDaのセリンエンドプロテアーゼLys-C(Lysylエンドペプチダーゼ、LeK、Genbank受託Q7M135)または少なくとも50％の配列同一性を有するそのホモログを指す。一実施形態では、Lys-Cに対して少なくとも50％の配列同一性を有するそのホモログは、Lys-Cの機能性(すなわち、タンパク質分解活性)を保持する。
本発明によれば、Lys-C酵素は、配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、またはからなり得る、タンパク分解性活性ポリペプチドである。一態様では、本発明に従って使用されるLys-C酵素は、配列番号8に示されるようなポリペプチド配列からなるタンパク分解性活性ポリペプチドである。
通常、Lys-Cのホモログは、単鎖ボツリヌス神経毒(例えば、血清型A(BoNT/A))を加水分解して、二本鎖ボツリヌス神経毒(例えば、血清型A(BoNT/A))を生産可能である。一実施形態では、用語「Lys-C」はまた、Lys-Cと同一の切断配列を認識し、Lysのカルボキシル側で加水分解するプロテアーゼなどの機能的に同等なプロテアーゼを包含する。また、少なくとも60％の配列同一性を有する前記プロテアーゼのホモログもこの用語によって包含される。
用語「タンパク分解性活性ポリペプチド」とは、本明細書において、ポリペプチドの触媒機能を指し、ポリペプチドが、ペプチド結合を加水分解可能であることを意味する。一態様では、「タンパク分解性活性ポリペプチド」とは、配列番号1〜7のいずれか1種から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを加水分解可能であるポリペプチドを指す。
用語「タンパク分解性に不活性なポリペプチド」とは、本明細書において、ポリペプチドの触媒機能を指し、ポリペプチドが、ペプチド結合を加水分解不可能であることを意味する。
当業者は、前記ポリペプチドのタンパク質分解活性を試験することによって、本明細書に記載される配列定義に従うLys-Cポリペプチドが、本発明に従って使用するためのポリペプチドであるか否かを決定することができる。タンパク質分解活性を決定するためのアッセイまたは試験系は、配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むLys-Cポリペプチドを、試験基質を接触させることを含む。
試験基質は、通常、Lys-Cによって切断されうると知られているポリペプチドである。好ましくは、試験基質は、BoNTまたはその断片などのクロストリジウム神経毒(CNT)である。試験基質は、例えば、単鎖BoNT(scBoNT)と本明細書において呼ばれる、切断されていない/プロセシングされていないBoNTであり得、例えば、血清型A、B、C1、D、E、FまたはGのもの(例えば、scBoNT/A、scBoNT/Bなど)であり得、または試験基質は、破傷風神経毒(TNT)であり得る。あるいは、試験基質は、クロストリジウム神経毒の断片であり得、前記断片は、配列番号1〜7のいずれか1種から選択されるアミノ酸配列を含む。断片は、50個以上のアミノ酸残基のポリペプチドまたは最大49個のアミノ酸残基のペプチドであり得る。本明細書を通じて使用されるように、用語「ポリペプチド」とは、50個以上のアミノ酸残基を有する分子を指すのに対し、用語「ペプチド」とは、2〜49個のアミノ酸残基を有する分子を指す。
試験基質は、軽鎖ポリペプチド、露出されたループペプチド領域および重鎖ポリペプチドのN末端側の半分、転位置ドメインHNを含むLHNと呼ばれる可溶性神経毒断片であり得る。試験基質は、配列番号2〜8のいずれか1種から選択されるペプチドであり得る、または含み得る(表1を参照のこと)。試験基質は、2種以上の血清型に由来するアミノ酸残基を含むキメラ神経毒であり得る。
Lys-C酵素、そのホモログまたは誘導体のタンパク質分解活性を決定するためのアッセイは、通常、試験基質の、その切断産物(単数または複数)への変換の程度を決定するステップを含む。ポリペプチドを試験基質と接触させた後に生じた1種以上の切断産物の観察または切断産物(単数または複数)の量の増大の観察は、ポリペプチドのタンパク質分解活性を示す。前記の決定するステップは、基質および切断産物を比較するステップを含み得る。前記比較は、基質の量および/または1種以上の切断産物の量を決定することを含み得、また、基質および切断産物(単数または複数)の比を計算するステップを含み得る。さらに、タンパク質分解活性を決定するためのアッセイは、試験サンプルを、参照サンプルと比較するステップを含み得、ここで、参照サンプルは、通常、(a)配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、タンパク分解性に活性であると知られているポリペプチドと、(b)(a)のポリペプチドによって切断されうると知られている試験基質を含む。
タンパク質分解活性を決定するためのアッセイは、電気泳動によって、またはカラムクロマトグラフィーおよび随意で、分光測定分析によって、基質(例えば、BoNT/A単鎖タンパク質)および切断産物(単数または複数)(例えば、活性なBoNT/A二本鎖)を分離するステップを含み得る。試験基質の低減および/または生成物(単数または複数)の増大をより容易に検出するために、試験基質を1種以上の標識を用いて標識することが好都合である場合がある。用語「標識」とは、本明細書において、検出可能なマーカーを意味し、例えば、放射性標識、抗体および/または蛍光標識が挙げられる。試験基質および/または切断産物の量は、例えば、少なくとも2種の標識間のエネルギー共鳴移動に基づく方法を含めた、オートラジオグラフィーまたは分光法の方法によって決定することができる。あるいは、ウエスタンブロットまたはELISAなどの免疫学的方法が、検出のために使用され得る。
好ましい態様では、ポリペプチドは、100mM Tris-HCl、pH8.0またはPBS(50mM Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.4)から選択される緩衝剤を使用して37℃120分で、試験基質の20％超、好ましくは、95％超が、軽鎖および重鎖などの切断産物に変換される場合に、タンパク分解性に活性である。試験基質が、全長BoNT/Aではなく、代わりに、例えば、全長BoNT/Aの断片またはBoNT/Aの誘導体である場合に、同一条件が当てはまる。この場合には切断産物が異なることは明らかである。しかし、当業者は、対応する切断産物を定量化できる。
通常、アッセイにおいて、100ngのタンパク分解性に活性なLys-Cポリペプチドおよび基質に関して1:100のモル比が使用される。
触媒活性を経時的にたどるために、サンプルを間隔をおいて採取することができる。
アッセイは、例えば、複数量のタンパク分解性に活性なLys-Cポリペプチドを使用することによって改変することができる。
配列番号9は、581残基のアミノ酸長を有する、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)株ATCC3502、GenBank受託番号CAL82988.1に由来するタンパク分解性に不活性なポリペプチドのポリペプチド配列を示す。配列番号8は、配列番号9のアミノ酸残基1〜248を欠く、配列番号9のタンパク分解性に活性な誘導体を示す。
用語「配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチド」とは、配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチドを指す。さらに、この用語は、配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドは、例えば、配列番号8において示される配列の内部位置に、またはNもしくはC末端に、あるいは配列番号8の配列と少なくとも50％同一であるアミノ酸配列の内部位置に、またはNもしくはC末端にさらなるアミノ酸を有し得、ここで、メチオニンは、ポリペプチドのN末端に存在し得る。さらに、この用語は、例えば、配列番号8において示される配列の内部位置で、またはNもしくはC末端で、あるいは配列番号8の配列と少なくとも50％同一であるアミノ酸配列の内部位置で、もしくはNもしくはC末端で1つ以上のアミノ酸残基を欠くポリペプチドを指す。用語「配列同一性」および配列同一性を計算する手段は、BoNT/Aに関連して本明細書において定義され、同一定義および手段がまた、Lys-Cの考察に当てはまる。
通常、Lys-C酵素の配列同一性は、配列番号8または9の全長にわたって、すわなち、それぞれ333aaまたは581aaの長さにわたって決定される。用語「少なくとも50％の配列同一性」とは、本明細書において、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または100％の配列同一性を意味する。
タンパク分解性に活性なLys-Cポリペプチドは、配列番号8に示されるような参照ポリペプチド配列と同一数のアミノ酸を有し得る。あるいは、ポリペプチドは、さらなるアミノ酸残基またはより少ないアミノ酸残基を有し得る。例えば、本発明のタンパク分解性活性ポリペプチドは、配列番号8もしくは9の、または配列番号8もしくは9の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチドの短縮型突然変異体からなる、またはこれを含み得る。配列番号9の短縮型突然変異体は、例えば、アミノ酸位置249のN末端側で1つ以上のアミノ酸残基を欠く場合がある。短縮型突然変異体は、NもしくはC末端短縮型突然変異体および/またはタンパク分解性に活性である内部短縮型突然変異体であり得る。配列番号9の短縮型突然変異体は、配列番号9のアミノ酸位置1〜248を欠く場合がある。あるいは、配列番号9の短縮型突然変異体は、C末端短縮型突然変異体であり得る。短縮型突然変異体は、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、100、150または最大170個の連続するアミノ酸残基を欠く場合がある。タンパク分解性活性ポリペプチドは、少なくとも200個のアミノ酸(aa)残基の、少なくとも250aa残基の、少なくとも300aa残基の、または少なくとも333aa残基のアミノ酸長を有し得る。あるいは、タンパク分解性活性ポリペプチドは、最大333aaの残基、最大350aaの残基、最大573個の残基、最大581aaの残基、最大592aaの残基、最大600aaまたは最大617aaの残基を有し得る。
タンパク分解性活性ポリペプチドは、配列番号8の、または配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列のポリペプチド鎖のNまたはC末端に、および/または内部位置にさらなるアミノ酸残基を含むポリペプチドを包含し得る。これらのさらなるアミノ酸残基は、最大5、最大10またはさらに最大200、300または最大400の連続するアミノ酸残基を含み得る。さらなるアミノ酸残基は、タンパク質分解活性の阻害剤として機能し得る。これらのさらなるアミノ酸残基は、プロテアーゼによって除去され得る。あるいは、ポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害するさらなる残基は排除される。さらなるアミノ酸残基は、1つ以上のプロテアーゼ切断部位が両端に位置し得る。別の態様では、さらなるアミノ酸配列は、検出可能なタグとして機能する、および/または固相支持体との結合を可能にする。
別の態様では、配列番号8の、または配列番号8の配列と少なくとも50％の配列同一性を有するポリペプチド配列のポリペプチド鎖は、1つ以上のアミノ酸残基を交換することによって修飾される。用語「交換」とは、本明細書において、アミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する。例えば、ポリペプチド配列内で最大1個のアミノ酸(aa)、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、15aa、20aaまたは最大50aaが置き換えられ得る。交換は、例えば、ポリペプチドの基質結合またはタンパク質分解活性を増大または低減する目的で、連続的なまたは非連続的なアミノ酸の変更を含み得る。
通常、タンパク分解性活性ポリペプチドは、基質(例えば、単鎖BoNT/Aタンパク質)を2つ以上の天然切断産物に加水分解できるポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドは、基質を、天然切断産物と同一であるか、または異なる2つ以上の切断産物に加水分解し得る。切断産物は、天然切断産物と同一であることが好ましい。
用語「天然切断産物」または「天然生成物」とは、本明細書において、基質が起源とする野生型細胞培養物において同一基質から生じた生成物と比較した場合にアミノ酸配列において同一である生成物を指す。好ましい実施形態では、切断産物は、ボツリヌス神経毒の、または破傷風神経毒の二本鎖神経毒である。より好ましい実施形態では、二本鎖神経毒は、血清型A、B、C1、D、E、FまたはGのボツリヌス菌(C. botulinum)から単離された神経毒である。さらに別の態様では、前記二本鎖神経毒は、天然二本鎖BoNT/A神経毒である。
上記および下記で行われる用語の定義および説明は、特に断りのない限り、変更すべきところは変更して、本明細書に記載されるすべての態様に当てはまるということは理解されなければならない。
BoNT生産方法
本発明は、ポリペプチド、具体的には、BoNT/A単鎖タンパク質をタンパク分解性にプロセシングするための方法におけるLys-Cの使用および疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用して、Lys-Cから生成した活性なBoNT/A二本鎖を精製する手段に関する。一態様では、本発明は、(a)Lys-Cを、(b)BoNT/A単鎖タンパク質と接触させるステップであって、前記BoNT/A単鎖タンパク質が、Lys-Cによるタンパク質分解に対して感受性であり、前記接触が、前記BoNT/A単鎖タンパク質の(好ましくは、活性なBoNT/A二本鎖を含む)少なくとも2つの切断産物へのタンパク質プロセシングをもたらすステップと、HICを使用して前記の活性な二本鎖を精製するステップとを含む、活性なBoNT/A二本鎖を生産するための方法に関する。
本発明の方法は、タンパク分解性にプロセシングされたクロストリジウム神経毒(CNT)またはボツリヌス神経毒(BoNT)、具体的には、タンパク分解性にプロセシングされたBoNT/A、すなわち、本明細書に記載されるような活性なBoNT/A二本鎖を生産するために使用することができる。本発明の方法を使用すると、プロセシングされていない、または部分的にプロセシングされたBoNT/Aが、二本鎖BoNT/Aに効率的にプロセシングされるので、それらの混入物があまり大幅には混入していない活性なBoNT/A二本鎖組成物を得ることが現在可能である。本発明の方法はまた、単鎖BoNT/Aタンパク質を活性な二本鎖にプロセシングするために使用されるLys-C酵素の有効な除去、すなわち、活性なBoNT/A二本鎖の改善された精製を可能にする。
したがって、本発明は、Lys-CからのBoNT/A二本鎖の精製(分離)に関し、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分離を含む。したがって、本発明は、単鎖BoNT/Aタンパク質を提供するステップ、溶液において前記BoNT/Aタンパク質をエンドプロテアーゼLys-Cと接触させるステップおよびBoNT/Aタンパク質およびLys-Cを含有する溶液を疎水性表面と接触させ、ここで、BoNT/Aタンパク質が、疎水性表面と優先的に結合することによって、Lys-CからBoNT/Aタンパク質を分離するステップを含む、二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法を提供する。通常、単鎖BoNT/Aタンパク質を、Lys-Cと接触させるステップは、単鎖BoNT/Aタンパク質を可溶性の二本鎖形態に切断することをもたらす。好ましくは、Lys-Cによる単鎖BoNT/Aタンパク質の切断産物は、天然BoNT/A切断産物と同一である。通常、BoNT/Aの単鎖および二本鎖形態の両方が可溶性である。
クロマトグラフィーカラムから回収される1つ以上の画分は、例えば、沈殿または限外濾過によって濃縮することができる。
本発明が、可溶性二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法(上記のような)を提供する一実施形態では、可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質が、宿主細胞、好ましくは、細菌宿主細胞、最も好ましくは、大腸菌(E. coli)宿主細胞において可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための上記のような方法によって提供される。
可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を生産するために、任意の適した発現系を使用することができる。本発明の発現系は、in vivoまたはin vitro(細胞不含)発現系であり得る。適したin vivoおよびin vitro発現系の例は、当技術分野で公知である。本明細書において定義されるように、発現系は、前記宿主細胞において使用するための適した宿主細胞および/または適した発現ベクターを含み得る。例えば、適した発現系は、前記細菌宿主細胞において可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を発現させるのに適した細菌宿主細胞および/または発現ベクターを含み得る。
単鎖BoNT/Aタンパク質は、細菌細胞などの本明細書において記載されるような任意の適した宿主細胞において生産することができる。通常、大腸菌(E.coli)宿主細胞が使用される。単鎖BoNT/Aタンパク質は、宿主細胞(例えば、大腸菌(E. coli)細胞)発現系において核酸配列を発現させるステップを含む方法によって生産することができる。このような発現は、前記単鎖BoNT/Aタンパク質をコードする核酸分子を前記宿主細胞中に導入するステップと、前記核酸分子を翻訳して単鎖BoNT/Aタンパク質を生産するステップとを含み得る。大腸菌(E. coli)発現系を含めた発現系において異種タンパク質を発現するために使用される方法および技術は、当技術分野で周知である。
通常、前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質は、前記大腸菌(E. coli)宿主細胞の細胞質において発現される。
可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質は、少なくとも5mg/L(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、25、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500mg/L、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mLまたはそれ以上)のレベル(濃度)で発現させることができる。通常、単鎖BoNT/Aタンパク質の発現レベルは、細胞培養物中の単鎖BoNT/Aのレベルを指す。一実施形態では、前記発現レベルは、単鎖BoNT/Aタンパク質を発現させるために使用される粗宿主細胞(例えば、細菌宿主細胞)ホモジネート、すなわち、宿主細胞(例えば、細菌宿主細胞)の粗ホモジネートを指す。したがって、一実施形態では、粗宿主細胞ホモジネート、例えば、粗細菌宿主細胞ホモジネート中の単鎖BoNT/Aタンパク質の発現レベルは、少なくとも5mg/Lである(本明細書において定義されるような)。
上記のような可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法は、前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を含有する、宿主細胞ホモジネート、より好ましくは、細菌宿主細胞ホモジネート、最も好ましくは、大腸菌(E. coli)宿主細胞ホモジネートを提供するための、宿主細胞、好ましくは、細菌宿主細胞、最も好ましくは、大腸菌(E. coli)宿主細胞の溶解を含み得る。細菌細胞、特に、大腸菌(E. coli)宿主細胞などの宿主細胞を溶解するために使用される方法および技術は、当技術分野で公知である。例として、超音波処理またはフレンチプレスの使用が挙げられる。
ボツリヌス菌(C. botulinum)または大腸菌(E. coli)によって発現されたBoNT/A単鎖タンパク質の精製は、例えば、先行技術(DasGupta 1984年、Toxicon第22巻、415;Sathyamoorthy 1985年、J Biol Chemistry第260巻、10461)に本質的に記載されるように行うことができる。特に、神経毒の精製は、1回以上の沈殿および抽出ステップ、1回以上の濃縮ステップおよびさらに別個のクロマトグラフィーステップを含有し得る。組換え単鎖BoNT/Aおよびその精製は、先行技術(Rummelら、2004年、Mol Microbiol.第51巻:631〜43頁)に記載されている。
BoNT/A単鎖タンパク質またはその誘導体を生産するために使用される細菌宿主細胞は、ボツリヌス菌(C. botulinum)または大腸菌(E. coli)であり得る。発酵のために、Toxicon、第22巻、第3号、414〜424頁、1984年においてDasGupta B. R.らによって記載されるプロセスを使用してもよい。したがって、2％のN-Z-アミンタイプA培地に0.5％酵母抽出物および0.6％オートクレーブ処理した酵母ペーストを添加し、4M NaOHを用いて7.2のpHに調整し、このような方法で調製した培地を、その後オートクレーブ処理する。この培地に、別個にオートクレーブ処理したグルコース(20重量/体積％)を、培地中、0.5％のグルコースの最終濃度となるよう添加してもよい。インキュベーションは、例えば、37℃で撹拌せずに行ってもよく、ここで、発酵を、例えば、96時間後に終える。バッチ発酵、セミバッチ発酵、反復バッチ発酵または連続発酵を使用してもよい。
実際の発酵および細胞からの発酵培地の分離後、発酵培地を、大きなタンパク質を回収することを目的に最初の沈殿に付してもよい。沈殿は、好ましくは、酸沈殿である。このような酸沈殿の反応条件は、当業者に公知である。通常、上清を3.5のpHに酸性化するために1.5M H2SO4が使用され得る。遠心分離は、普通、4℃、2400×gで20分間行われる。遠心分離によって受け取られるペレットは、水を用いて、好ましくは反復して、洗浄してもよい。その後、ペレットを、0.1Mのクエン酸-クエン酸三ナトリウム緩衝液、pH5.5を用いて、例えば、1時間抽出してもよい。その後、さらなる遠心分離ステップを、例えば、4℃、9800×gで20分間実施してもよい。そのように得られたペレットを、次いで、随意で、上記のように再度抽出してもよい。次いで、抽出の上清および抽出の反復の場合には両上清を、硫酸プロタミン沈殿に付してもよい。沈殿は、例えば、8℃で一晩継続してもよい。その後、沈殿物を、例えば、4℃および12,000×gで20分間遠心分離してもよい。遠心分離の上清を、その他の大きなタンパク質が回収され得る硫酸アンモニウムなどの沈殿に付してもよい。硫酸アンモニウム沈殿ステップ後、別の遠心分離ステップを付加してもよく、その後、そのように得られたペレットを再溶解してもよく、随意で、透析に付してもよい。好ましくは、再度透析され、遠心分離された抽出物を、神経毒の精製を目的として連続したクロマトグラフィーステップに付すことができる。クロマトグラフィーステップの各々は、硫酸プロタミン、残存DNA、小さめのタンパク質および中程度の大きさのタンパク質の一部ならびにボツリヌス神経毒タンパク質複合体の赤血球凝集素などの混入物を除去するように働く。好ましい実施形態では、この目的のために、1つ以上のクロマトグラフィーステップが使用されてもよい。随意で、例えば、微生物を除去するために、最後のクロマトグラフィーステップの溶出液を濾過してもよい。随意で、溶出液を希釈し、その後、濾過することができ、適したアジュバントを添加することができる。さらなるステップの間に、アジュバントの添加後に別の滅菌濾過を実施してもよい。一態様では、濾過は反応容器中で実施され、これが次いで、凍結乾燥のステップに付されてもよい。
BoNT/A単鎖タンパク質を、宿主細胞または宿主細胞可溶化液から単離した後にLys-Cと接触させ、次いで、本発明の方法に付してもよい。
本発明の単鎖BoNT/Aタンパク質が、Lys-Cと接触されると、Lys-Cのタンパク質分解作用が、L鎖プロテアーゼ成分と転位置成分の間の部位で単鎖タンパク質を切断して、2つの鎖がジスルフィド橋によって連結している二本鎖タンパク質を生産する。例えば、活性化部位での単鎖BoNT/A1、A2およびA4〜A6の切断後に形成される2つの鎖は、アミノ酸残基1〜438の第1の鎖およびアミノ酸残基449〜1296の第2の鎖であり(第2の鎖がアミノ酸残基449〜1297を有するA6においてを除き)、残基439〜447は切断事象によって除去される。活性化部位での単鎖BoNT/A3の切断後に形成される2つの鎖は、アミノ酸残基1〜434の第1の鎖およびアミノ酸残基445〜1292の第2の鎖であり、残基435〜444は切断事象によって除去される。したがって、単鎖ポリペプチドを活性な二本鎖形態に変換することによって活性化するために、Lys-Cを使用することができる。したがって、Lys-Cの使用は、外因性(非天然)切断部位をBoNT/A中に遺伝子操作で入れることが必要ではないことを意味し、また、天然BoNT/A二本鎖の生産も可能にし、有利である。
一実施形態では、Lys-Cへの言及は、本明細書において記載されるようなLys-Cと同一のプロテアーゼ切断部位で切断する、Lys-C様の酵素および変異体酵素を含む。
用語「接触させること」とは、本明細書において、少なくとも2種の異なる成分を、前記化合物の物理的および/または化学的相互作用を可能にするような物理的近接にすることを指す。本発明の方法にしたがって、前記の2種の異なる化合物は、溶液中に含まれている、BoNT/A単鎖タンパク質およびLys-Cである。接触させることは、BoNT/A単鎖タンパク質およびLys-Cの相互作用を可能にするのに十分である条件下および時間で実施される。
用語「タンパク質分解に対して感受性である」とは、BoNT/A単鎖タンパク質の特徴または必要条件を指し、前記BoNT/A単鎖タンパク質が、Lys-Cによってタンパク分解性に切断されうることを意味するよう本明細書において使用される。言い換えれば、用語「タンパク質分解に対して感受性である」とは、BoNT/A単鎖タンパク質が、Lys-Cの基質として機能することを可能にする、プロテアーゼ認識および切断部位を含むことを意味する。本明細書において記載されるように、BoNT/A単鎖タンパク質は、Lys-Cの基質であり、2つ以上の切断産物(好ましくは、ペプチド-ジスルフィド結合によって一緒に連結されている、ちょうど2つのL鎖またはその断片およびH鎖またはその断片)にタンパク分解性にプロセシングされる。上記で本明細書において記載されるアッセイを使用すると、当業者は、所与のBoNT/A単鎖タンパク質が、第1のポリペプチドの基質、したがって、本発明の定義に従う「第2のポリペプチド」であるか否かを試験できる。用語「少なくとも2つの切断産物」は、例えば、最大2、3、4、5および最大6の切断産物を含む。
この方法は、例えば、BoNT/A二本鎖を含む医薬組成物を調製するために、または質量分析法において使用されるポリペプチド断片を作製するために使用することができる。BoNT/A二本鎖の生産プロセスにおいて種々のステップで、Lys-CおよびBoNT/A単鎖タンパク質を接触させることができる。例えば、Lys-CおよびBoNT/A単鎖タンパク質を接触させるステップは、前記細胞におけるLys-CおよびBoNT/A単鎖タンパク質の発現によってなど、細胞内であり得る。
あるいは、前記の接触させるステップは、細胞可溶化液において、または精製された細胞可溶化液において行われる。これは、溶解物または精製された溶解物にLys-Cを添加することを包含する。Lys-Cは、細胞可溶化液からのBoNT/A単鎖タンパク質の精製の間に種々のステップで添加することができる。例えば、Lys-Cは、タンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーの前後に添加することができる。
接触させるステップは、Lys-CがBoNT/A単鎖タンパク質を切断するのに十分な条件および時間でのインキュベーションを必要とする。例示的条件は、100mM Tris-HCl、pH8.0またはPBS(50mM Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.4)からなる群から選択される緩衝剤を添加することを含み得る。好ましい緩衝液条件として、100mM Tris-HCl、pH8.0が挙げられる。「切断するのに十分な時間」は、上記で本明細書において記載されたアッセイを使用して決定することができる。一態様では、前記の「切断するのに十分な時間」は、タンパク分解性にプロセシングされたポリペプチドまたはそれを含む組成物が有さなくてはならない切断の程度に応じて変わる。一態様では、方法は、Lys-CおよびBoNT/A単鎖タンパク質を少なくとも30分、60分、120分または少なくとも240分間インキュベートするステップを含む。別の態様では、Lys-CおよびBoNT/A単鎖タンパク質は、最大30分、60分、120分、240分、480分または最大600分間インキュベートされる。別の態様では、方法は、4℃でまたは37℃でLys-CおよびBoNT/A単鎖タンパク質をインキュベートするステップを含む。別の態様では、方法は、最大1時間、最大2時間、4時間、6時間、10時間または最大16時間インキュベートするステップを含む。
本発明が、可溶性二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法(上記のような)を提供する一実施形態では、方法は、可溶性BoNT/Aタンパク質およびLys-Cを含有する溶液を、疎水性表面と接触させ、ここで、可溶性BoNT/Lys-Cタンパク質が疎水性表面と優先的に結合することによって、Lys-Cから可溶性BoNT/Aタンパク質を分離することを含む。
本発明者らは、活性化された二本鎖BoNT/Aタンパク質の高収率が、Lys-Cから活性化された二本鎖ポリペプチドを分離するために疎水性精製のプロセスを使用することによって得ることができることを見出した。驚くべきことに、このプロセスは、本発明者らが、Lys-Cから活性化された二本鎖ポリペプチドを分離するのにあまり有効ではないと見出したイオン交換クロマトグラフィーを使用する標準精製よりも優れた精製を提供する。さらに、プロセスは、全体的な精製プロセスの一部として、活性化プロテアーゼを含まず、従って、療法において使用するのに適している、活性化された二本鎖BoNT/Aタンパク質を提供することが有利である。
本明細書において記載されるように、活性な組換えBoNT/Aの生産は、分子を活性な二本鎖形態に切断するタンパク質分解ステップを必要とする。この切断は、エンドプロテアーゼLys-Cを使用するin vitro活性化ステップによって活性化され得る。活性化ステップ後、最終生成物からLys-Cを除去することが重要であり、これはまた、BoNT/Aの任意のさらなる非特異的切断を防ぐ。
以下の表2に示されるように、Lys-CおよびBoNT/Aの計算された等電点(pI)は、それぞれ、6.70および6.05であり、これは、2種の分子間の電荷差を利用するイオン交換(IEX)クロマトグラフィーによって、2種のタンパク質の分離が達成されるはずであることを示す。タンパク質の正味電荷は、周囲の環境のpHによって影響を受け、水素イオンを獲得するか、喪失するかに応じて、より正電荷を有するまたは負電荷を有するようになる。pIは、分子が電荷を保持しない、従って、電荷を有するIEX媒体と相互作用しないpH値である。これは、タンパク質がそのpIを上回るpHにある場合に、正味の負の電荷を保持し、陰イオン交換体などの正電荷を有する媒体と結合することを意味する。同様に、緩衝液pHが、pIよりも低い場合には、タンパク質は、正味の正電荷を保持し、陰イオン交換体と結合しない。
さらに、表2に例示されるように、BoNT/AおよびLys-Cは、pH4.5および8.0で同様の平均疎水性親水性指標(mean hydropathicities)を有するが、大きな電荷差を有する。この原理に基づいて、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)を使用して、BoNT/AおよびLys-Cを分解(分離)できると予測される。IEXは、沈殿によるタンパク質喪失につながり得る、カラムにロードされたタンパク質が高塩緩衝液中にあることを必要としないので単純な、安価なクロマトグラフィー法である。
本発明者らは、pH8で架橋されたアガロースビーズに結合している強いおよび弱い官能基の両方を使用して、種々の陰イオン交換カラムを試験した。BoNT/Aの溶出と比較すると、予期しないことに、Lys-Cは、同様のイオン強度で溶出することを見出し(表3;図7〜10)、これは、Lys-Cが予測されたようには分離されず、最終の精製されたBoNT/A生成物中に存在し、さらなるBoNT/A分解のさらなる可能性を有するであろうことを示した。
本発明者らは、上記の問題を解決した。より詳細には、本発明者らは、驚くべきことに、最適Lys-C-BoNT/A分離が、疎水性分離表面の使用によって(例えば、これらのタンパク質とHICマトリックス/樹脂の疎水性表面間の可逆性相互作用を使用することによって、表面疎水性の相違に従ってタンパク質を分離する疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって)達成されることを同定した。
通常、活性なBoNT/A二本鎖は、疎水性表面とのLys-C結合と比較して、HIC樹脂/マトリックス(これらの用語は、本明細書において交換可能に使用される)の疎水性表面と優先的に結合する。「優先的」結合は、疎水性表面とのLys-Cの結合と比較した、疎水性表面との活性なBoNT/A二本鎖の増大された、または改善された結合として定義され得る。例えば、活性なBoNT/A二本鎖は、疎水性表面とのLys-Cの少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍またはそれ以上の親和性で疎水性表面と結合し得る。好ましい実施形態では、活性なBoNT/A二本鎖は、疎水性表面とのLys-Cの少なくとも5倍または少なくとも10倍の親和性で疎水性表面と結合する。
一実施形態では、疎水性表面は、アリールまたはアルキル基を含む、またはからなるリガンドが結合される不活性マトリックス/樹脂である。
用語「アリール」とは、芳香族基、例えば、フェニル、ナフチル、チエニルおよびインドリルを指す。
用語「アルキル」とは、直鎖、分岐鎖、環状基およびそれらの組合せを含む脂肪族基を指す。アルキル基は、1〜12個の炭素原子を有し得る。アルキル基の例として、それだけには限らないが、メチル、エチル、プロピル(例えば、n-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えば、n-ブチル、イソブチル、s-ブチル、t-ブチル)、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチルなどの基が挙げられる。
一実施形態では、疎水性表面は、ブチル、フェニルまたはオクチルリガンドからなる群から選択される1種以上のリガンドを含む。
一実施形態では、疎水性表面は、ブチルリガンドを含む。一実施形態では、疎水性表面は、フェニルリガンドを含む。一実施形態では、疎水性表面は、オクチルリガンドを含む。
疎水性表面は、適当な疎水性リガンドが結合している、任意の適した不活性マトリックス/樹脂を含有し得る。例えば、不活性マトリックス/樹脂は、シリカ、架橋デキストラン、架橋ポリアクリルアミドまたは架橋アガロースなどから選択され得る。特に、ポリペプチド、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩およびマグネタイトも含まれる。不活性マトリックスとして、例えば、セファロース、セファデックス、アガロース、セファセル、マイクロセルロースおよびアルギネートビーズからなる群から選択される多糖マトリックスがある。別の態様では、前記不活性マトリックス/樹脂は、ガラスビーズおよび/またはポリペプチドマトリックスからなり得る。
不活性マトリックス/樹脂は、任意の適した構造的立体配置または配置を有し得る。例えば、マトリックス/樹脂は、ビーズ中のように球状または試験管の内表面もしくは棒の外表面におけるように円柱状であり得る。あるいは、マトリックスは、不規則またはシートもしくは試験ストリップなどの平面であり得る。
本発明者らは、架橋アガロースまたはポリスチレンビーズなどの不活性マトリックス/樹脂に結合している、アルキルまたはアリール基、例えば、ブチル、フェニルおよびオクチルリガンドを含有するクロマトグラフィーマトリックス/樹脂を使用するHICを用いて、BoNT/AからLys-Cを分離するための特に好ましい結果が得られることを発見した(表4;図1〜3)。
HICの使用は、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)と比較して、活性なBoNT/A二本鎖からのLys-Cの改善された分離を提供する。
「ファストフロー」HICクロマトグラフィー樹脂/マトリックスを、本発明に従って使用してもよい。「ファストフロー」樹脂/マトリックスは、標準HIC樹脂/マトリックスよりも均一な平均粒径を有する樹脂/マトリックスとして定義され得、より小さい粒子を使用する。具体的には、「ファストフロー」樹脂/マトリックスは、より狭い範囲のより小さい粒径を有する。粒径は、例えば、平均粒径の点で、当技術分野で公知の任意の適当な方法で定量化することができる。通常、「ファストフロー」樹脂/マトリックスは、100μm未満、95μm未満、90μm未満またはそれより小さい平均直径の粒子(例えば、ビーズ)を含む。好ましい実施形態では、「ファストフロー」樹脂/マトリックスの平均直径は、90μm未満である。通常、「ファストフロー」樹脂/マトリックスの平均の粒子の広がりは、約20〜約180μm、約30〜約170μm、約40〜約170μm、約40〜約165μmとなる。好ましい実施形態では、「ファストフロー」樹脂/マトリックスの平均の粒子の広がりは、約44〜約165μmである。
好ましい実施形態では、フェニル高性能(PhHP)またはブチル高性能(BuHP)樹脂などの高性能HIC樹脂が使用される。このような高性能HICマトリックス/樹脂は、第四級アミン高性能(QHP)マトリックス/樹脂などの高性能IEXマトリックス/樹脂が使用される場合でさえ、通常、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)と比較して、活性なBoNT/A二本鎖からのLys-Cの改善された分離を提供する。本明細書において論じられるように、高性能樹脂/マトリックスとその他のものの間の大きな相違は、平均粒径(やはり、これは、当技術分野で公知の任意の適当な方法、例えば、平均粒径で定量化することができる)がより小さく(34μm対90μm)、より均一であり(24〜44μm対44〜165μm)、改善された分離をもたらすという点である。
高性能HIC樹脂/マトリックスは、通常、標準HIC樹脂/マトリックスまたはさらには本明細書において定義されるような「ファストフロー」樹脂/マトリックスよりも均一な平均粒径を有し、より小さな粒子を使用する。具体的には、高性能HIC樹脂/マトリックスは、標準HIC樹脂/マトリックスまたはさらには本明細書において定義されるような「ファストフロー」樹脂/マトリックスよりも、より狭い範囲のより小さい粒径を有する。
したがって、本発明は、高性能HIC樹脂/マトリックスの使用を提供する。通常、高性能HIC樹脂/マトリックスは、70μm未満、60μm未満、50μm未満、40μm未満、30μm未満またはそれより小さい平均粒子直径を有する。好ましい実施形態では、高性能HIC樹脂/マトリックスは、40μm未満、より好ましくは、35μm未満、例えば、34μmの平均粒子直径を有する。
通常、高性能HIC樹脂/マトリックスの平均の粒子の広がりは、約10〜約60μm、約10〜約50μm、約20〜約50μm、約20〜約44μmとなる。好ましい実施形態では、高性能樹脂/マトリックスの平均の粒子の広がりは、約22〜約44μmである。
通常、Lys-Cから活性化された二本鎖BoNT/Aタンパク質を分離するための疎水性精製のプロセスは、Lys-Cの濃度を、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍、少なくとも40倍、少なくとも45倍または少なくとも50倍低下させる。好ましい実施形態では、Lys-Cから活性化された二本鎖BoNT/Aタンパク質を分離するための疎水性精製のプロセスは、Lys-Cの濃度を、少なくとも10倍低下させる。
Lys-Cから活性化された二本鎖BoNT/Aを分離する疎水性精製の能力はまた、疎水性精製ステップ後に残存する、活性化された二本鎖BoNT/AおよびLys-Cを含む出発溶液中に含有されるLys-Cの百分率の点で定量化してもよい。通常、80％未満、70％、60％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、19％未満、18％未満、17％未満、16％未満、15％未満、14％未満、13％未満、12％未満、11％未満、10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満または0％を含めたそれより少ないLys-Cが、疎水性精製ステップ後にBoNT/A二本鎖生成物中に残存する。好ましくは、50％未満、より好ましくは、25％未満、さらにより好ましくは、10％未満のLys-Cが、疎水性精製ステップ後にBoNT/A二本鎖生成物中に残存する。
関連する態様では、本発明は、可溶性二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法(上記のような)によって得ることができる活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質を提供する。
一態様では、本発明は、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質(上記のような)を含む組成物を提供し、ここで、前記組成物は、Lys-Cを実質的に含まない。
したがって、組成物は、Lys-Cプロテアーゼ(活性な二本鎖形態に変換することによって単鎖ポリペプチドを活性化するために使用される)を実質的に含まず、従って、BoNT/Aタンパク質の不要な非特異的切断を防ぐことが有利である。
組成物(上記のような)が、Lys-Cを実質的に含まない場合には、組成物は、通常、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400ピコグラム(pg)未満のLys-C、例えば、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、5、4、3、2、1pgまたはそれより少ないLys-Cを含有する。一実施形態では、組成物(上記のような)は、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり350pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり250pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり150pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり40pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり30pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり14pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり13pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり12pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり11pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり9pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり8pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり7pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり6pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり5pg未満のLys-Cまたはそれ以下を含有する。好ましい実施形態では、組成物(上記のような)は、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-Cを含有する。
組成物中のLys-Cの濃度を決定するための方法は、当技術分野で公知である。例として、本明細書に記載されるような、サンドイッチELISA(酵素結合免疫吸着測定法)または比色アッセイを使用して、本発明の組成物中のLys-Cの濃度を決定することができる。
医薬組成物および治療指標
本発明はまた、BoNT/A二本鎖の生産のための本発明の方法によって得ることができる組成物に関する。一態様では、前記組成物は、プロセシングされた(二本鎖)およびプロセシングされていない(単鎖)BoNT/Aの混合物を含み、ここで、前記混合物は、5％、4％、3％、2％未満または1％未満のプロセシングされていない(単鎖)BoNT/Aを含有し得る。前記組成物の一態様では、BoNT/Aへの言及は、本明細書において定義されるようなその誘導体を包含する。組成物は、例えば、液体または固体組成物であり得、1種以上の担体、アジュバントおよび/または賦形剤を含有し得る。
別の態様では、本発明はまた、前記の方法のステップおよび精製された二本鎖BoNT/Aを医薬として製剤化するさらなるステップを含む、医薬、すなわち、医薬組成物の生産のための方法に関する。通常、前記医薬は、プロセシングされた(二本鎖)およびプロセシングされていない(単鎖)BoNT/Aの混合物を含み、ここで、前記混合物は、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満またはそれ以下のプロセシングされていない(単鎖)BoNT/Aを含有する。好ましい実施形態では、混合物は、5％未満のプロセシングされていない(単鎖)BoNT/A、例えば、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満または1％未満のプロセシングされていない(単鎖)BoNT/Aを含有する。
本発明はまた、本明細書において開示される化合物および組成物の種々の医学的および審美的(美容的)使用に関する。したがって、本発明は、医薬としてまたは医薬組成物において使用するための、本発明に従う、活性なBoNT/A二本鎖または活性なBoNT/A二本鎖を含む組成物に関する。本発明はまた、医薬の生産における、本発明の、活性なBoNT/A二本鎖または活性なBoNT/A二本鎖を含む組成物の使用に関する。本発明はまた、療法によるヒトまたは動物身体の治療の方法において使用するための、本発明の、活性なBoNT/A二本鎖または活性なBoNT/A二本鎖を含む組成物に関する。本発明はまた、本発明の、活性なBoNT/A二本鎖または活性なBoNT/A二本鎖を含む組成物の、それを必要とする患者への投与を含む治療の方法に関する。
用語「組成物」とは、本明細書において、固体、液体、エアロゾル(またはガス状)形態などに製剤化された任意の組成物を指す。前記組成物は、例えば、本発明の治療上活性な化合物を、随意で、希釈剤または担体またはさらなる成分などの適した補助的化合物と一緒に含む。一態様では、治療上活性な化合物は、本発明の活性なBonT/A二本鎖である。本発明の組成物、特に、医薬組成物は、通常、本明細書において定義されるようなLys-Cを実質的に含まない。
したがって、本発明は、
(a)上記のような活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質と、
(b)安定化剤と
を含む、固体または液体医薬組成物を提供する。
一実施形態では、組成物(上記のような)は、Lys-Cを実質的に含まない。例えば、組成物(上記のような)は、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-Cを含有し得る。
本発明に従う組成物において使用することができる安定化剤として、アルブミン、特に、ヒト血清アルブミン(HSA)などのタンパク質安定化剤および非タンパク質安定化剤が挙げられる。
本発明に従う組成物において使用することができる非タンパク質安定化剤として、界面活性剤、特に、非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤の例として、ポリソルベート20またはポリソルベート80などのポリソルベートおよびポロキサマー(すなわち、ポリエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー)などのブロックコポリマーが挙げられる。
特定の実施形態では、組成物は、安定化剤としてタンパク質を含まない。
本発明の特定の実施形態によれば、医薬組成物は、
(a)上記のような、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質と、
(b)界面活性剤である非タンパク質安定化剤と、
(c)水と
を含む液体医薬組成物であり、
ここで、前記液体医薬組成物は、タンパク質安定化剤を含まず、
前記液体医薬組成物は、Lys-Cを実質的に含まず、「Lys-Cを実質的に含まない」とは、本明細書において定義される通りである(例えば、前記液体医薬組成物は、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-Cを含有する)。
一実施形態では、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質は、1〜1000ng/ml以上の濃度で組成物(上記のような)中に存在する。したがって、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質は、約1〜500ng/mL、例えば、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950または1000ng/mLまたはそれ以上の濃度で組成物(上記のような)中に存在し得る。好ましい実施形態では、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質は、約100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mLまたは700ng/mLの濃度で存在する。
一実施形態では、界面活性剤(上記のような)は、20〜100モノマー単位の範囲の平均重合度を有するポリソルベートなどのポリソルベートであり、例えば、ポリソルベート80であり得る。好ましい実施形態では、ポリソルベートは、植物由来である。界面活性剤の濃度は、ポリソルベート80の場合には、好ましくは、1％ v/v未満、例えば、約0.005％〜0.02％ v/vである。
本発明の医薬組成物はまた、結晶性薬剤を含み得る。
結晶性薬剤とは、とりわけ、凍結乾燥したボツリヌス神経毒複合体(A、B、C1、D、E、FまたはG型)または高純度ボツリヌス神経毒(A、B、C1、D、E、FまたはG型)に対して機械的に強力なケーキ構造を維持する薬剤を意味する。固体製剤中に含まれる場合には、結晶性薬剤はまた、膨化効果も有する。結晶性薬剤として、塩化ナトリウムが特に挙げられる。結晶性薬剤の濃度は、例えば、0.1〜0.5M、好ましくは、0.1〜0.4M、特に、約0.15〜0.3Mであり得る。
本発明の医薬組成物はまた、pHを5.5〜7.5の間または6.0〜7.0の間に含まれるレベルに維持するために緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、適切なpHを維持できる任意の緩衝剤であり得る。例えば、本発明の組成物の緩衝剤は、コハク酸、リン酸二ナトリウム/クエン酸およびヒスチジンなどのアミノ酸からなる群から選択され得る。緩衝剤の濃度は、例えば、1〜50mM、好ましくは、5〜20mM、好ましくは、約10mMであり得る。
本発明の医薬組成物はまた、二糖を含み得る。
本発明の組成物において使用される二糖は、スクロース、トレハロース、マンニトールおよびラクトースからなる群から選択され得る。特定の実施形態では、二糖は、スクロースである。二糖の濃度は、例えば、5〜50mM、好ましくは、5〜25mM、より好ましくは、10〜20mM、最も好ましくは、約11.7mMであり得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、
(a)上記のような、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質と、
(b)界面活性剤である非タンパク質安定化剤と、
(c)塩化ナトリウムと
(d)5.5〜7.5の間のpHを維持するための緩衝剤と、
(e)二糖と
(f)滅菌水と
を含む液体医薬組成物であり、
ここで、前記液体医薬組成物は、タンパク質安定化剤を含まず、
前記液体医薬組成物は、Lys-Cを実質的に含まず、「Lys-Cを実質的に含まない」とは、本明細書において定義される通りである(例えば、前記液体医薬組成物は、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-Cを含有する)。
特定の実施形態によれば、液体形態の本発明の医薬組成物は、バイアル中またはシリンジなどのすぐに使える装置中に密閉され、液体/ガス状界面を有さず、23〜27℃で少なくとも3ヶ月または少なくとも6ヶ月間および2〜8℃で少なくとも12か月間安定である。本発明の例示的医薬組成物は、実施例に記載されている。
本発明の医薬組成物または製剤の月分解率は、12週間にわたって月あたり5％未満であり得、これは、組成物または製剤の二本鎖BoNTプロテアーゼ機能が、25℃で少なくとも12週間安定なままであることを意味する。
本発明の医薬組成物は、真空圧力下、容器中で凍結乾燥された、真空乾燥された形態で、または安定な液体として保存することができる。凍結乾燥に先立って、活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質を、薬学的に許容される賦形剤、安定化剤および/またはアルブミンなどの担体と組み合わせることができる。患者に投与されるべき活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質を含有する溶液または組成物を作製するために、凍結乾燥された材料を生理食塩水または水を用いて再構成することができる。
これに関連して、本発明について、補助的化合物、すなわち、その所望の目的のための組成物の適用の際に本発明の化合物によって誘発される効果に寄与しない化合物と、さらなる成分、すなわち、さらなる効果に寄与するか、または本発明の化合物の効果を調節する化合物は区別される。適した希釈剤および/または担体は、組成物が使用される目的およびその他の成分に応じて変わる。当業者ならば、このような適した希釈剤および/または担体を造作なく決定できる。
担体(単数または複数)は、製剤のその他の成分と適合している、およびそのレシピエントにとって有害なではないという意味で許容されなければならない。使用される医薬担体は、固体、ゲルまたは液体を含み得る。固体担体の例示として、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などがある。液体担体の例示として、リン酸緩衝生理食塩水溶液、シロップ、オイル、水、エマルジョン、種々の種類の湿潤剤などがある。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの当技術分野で周知の時間遅延材料を単独またはワックスとともに含み得る。前記の適した担体は、上記のものおよび当技術分野で周知のその他のものを含む、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvaniaを参照のこと。
希釈剤(単数または複数)は、組合せの生物活性に影響を及ぼさないよう選択される。このような希釈剤の例として、蒸留水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液があり、さらに、医薬組成物または製剤はまた、その他の担体、アジュバントまたは非毒性、非治療的、非免疫原性安定化剤などを含み得る。
一態様では、医薬組成物は、本明細書において、本発明の方法によって得られる生物学的に活性な神経毒(すなわち、活性BoNT/A二本鎖)、随意で、1種以上の薬学的に許容される担体を含む。活性な神経毒は、液体または凍結乾燥形態で存在し得る。一態様では、前記化合物は、グリセロール、タンパク質安定化剤(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA))またはポリビニルピロリドンもしくはヒアルロン酸などの非タンパク質性安定化剤と一緒に存在し得る。医薬組成物は、一態様では、局所投与される。従来使用される薬物投与は、筋肉内または皮下(通常、皮脂腺付近)投与によってである。しかし、化合物の性質および作用様式に応じて、医薬組成物は、その他の経路によって同様に投与されてもよい。二本鎖神経毒ポリペプチドは、組成物の有効成分であり、一態様では、従来手順に従って薬物を標準医薬担体と組み合わせることによって調製された従来投与形で投与される。これらの手順は、所望の調製物に応じて適切に成分を混合すること、造粒することおよび圧縮することまたは溶解することを含み得る。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、組み合わされるべき有効成分の量、投与経路およびその他の周知の変数によって決定されるということは認められよう。
治療上有効な用量とは、本明細書において言及される疾患または状態に付随する症状を予防、寛解または治療する本発明の医薬組成物において使用されるべき化合物、神経毒の量を指す。化合物の治療効力および毒性、例えば、ED50(集団の50％において治療上有効な用量)およびLD50(集団の50％において致死的な用量)は、細胞培養物または実験動物において標準医薬手順によって決定することができる。治療および毒性効果間の用量比は、治療係数であり、比、LD50/ED50として表され得る。
投与計画は、主治医およびその他の臨床因子によって決定される。医学の技術分野では周知であるように、任意のある患者の投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康および現在投与されているその他の薬物を含めた多数の因子に応じて変わる。進捗は、周期的評価によってモニタリングできる。本明細書において言及される医薬組成物および製剤は、本明細書において列挙される疾患または状態を治療または寛解または予防するために少なくとも1回投与される。しかし、前記医薬組成物は、2回以上投与されてもよい。
本明細書において記載されるように、本発明の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質およびその組成物および液体医薬組成物を、療法において使用することができる。適した療法として、美容的処置および医学的治療の方法を挙げることができる。
本発明のさらなる態様において、前記の組成物は、医薬または美容組成物である。一態様では、生物学的に活性な神経毒(すなわち、活性なBoNT/A二本鎖)を含む前記医薬を、以下の疾患および障害:随意筋強度、頸部、頭部ジストニアを含めた局所性ジストニアおよび良性本態性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣および局所性痙縮、胃腸障害、発汗過多および美容的しわ取り、さらなる態様においてまた、眼瞼痙攣、口顎部ジストニア、開口型、閉口型、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼の失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈(antecollis)、頸部後屈(retrocollis)、頸部側屈(laterocollis)、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、痙攣性発声障害/内転筋型、痙攣性発声障害/外転筋型、痙攣性呼吸困難、四肢ジストニア、上肢ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家痙攣、ゴルファー痙攣、下肢ジストニア、大腿内転、大腿外転膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、変形足ジストニア、線条体足指、足指屈曲、足指伸展、体幹ジストニア、ピサ(pisa)症候群、バレエダンサージストニア、分節性ジストニア、ヘミジストニア、全身性ジストニア、ルバグ(lubag)におけるジストニア、皮質基底核変性症におけるジストニア、ルバグ(lubag)におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調症におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン舞踏病におけるジストニア、ハラーホルデン・スパッツ症候群におけるジストニア、ドパ誘導性ジスキネジア/ドパ誘導性ジストニア、遅発性ジスキネジア/遅発性ジストニア、発作性ジスキネジア/ジストニア、運動誘発性、非運動誘発性作用誘導性口蓋ミオクロヌス、ミオクロヌスミオキミア、硬直、良性筋肉痙攣、遺伝性下顎振戦、奇異性顎筋肉活性、片側咀嚼筋痙攣、肥大性鰓弓筋疾患、咬筋(maseteric)肥大、前脛骨肥大、眼振、動揺視核上性注視麻痺、持続性部分てんかん(epilepsia, partialis continua)、痙性斜頚手術の計画、外転筋声帯麻痺、不応性の突然変異性身体違和感、上部食道括約筋機能不全、声帯ヒダ肉芽腫、吃音ジル・ド・ラ・トゥーレット症候群、中耳ミオクロヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭摘出後発語不全、防御性眼瞼下垂、眼瞼内反括約筋オディ(Odii)機能不全、偽性アカラシア(pseudoachalasia)、非アラカシア、食道運動障害、腟痙、術後固定振戦、膀胱機能不全、排尿筋括約筋協調障害、膀胱括約筋痙攣、片側顔面痙攣、神経再支配ジスキネジア、美容的使用目じりのしわ、渋面顔面非対照、頤の凹み、全身硬直症候群、破傷風前立腺肥大症、肥満症、治療脳性小児麻痺斜視、混合性麻痺性随伴性、網膜剥離手術後の、白内障手術後の、無水晶体症における筋炎性斜視、ミオパチー性斜視、交代性上斜位、斜視手術の付属物として、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺活動亢進、フライ症候群、ワニの涙症候群、発汗過多、腋窩手掌足底鼻漏、卒中における、パーキンソンにおける、筋萎縮性側索硬化症痙性状態における、脳炎および脊髄炎自己免疫プロセスにおける関連唾液分泌過多、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、真菌感染症、遺伝性痙攣性不全対麻痺卒中後症候群半球状梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞における、片頭痛、中枢神経系外傷、半球状損傷、脳幹損傷、脊髄損傷における、中枢神経系出血、脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、脊髄内出血における、腫瘍、半球状腫瘍、脳幹腫瘍、脊髄腫瘍における、いびき(WO2000/033863)のうち少なくとも1種の予防および/または治療のために使用することができる。詳細および症状については、例えば、Jost 2007年、Drugs 第67巻(5)、669頁またはBotulinum Toxin Therapy、Thieme Verlag、Stuttgart、New YorkにおけるDressler 2000年を参照のこと。
本発明の別の態様では、組成物は、上記の医薬組成物について記載されるように製剤化され得る美容組成物である。美容組成物のために、同様に、本発明の化合物が、一態様では、実質的に純粋な形態で使用されることが予想される。美容組成物は、さらなる態様では、筋肉内適用されるべきである。本発明のなおさらなる態様では、神経毒を含む美容組成物は、抗しわ溶液として製剤化され得る。
本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全開示内容および本明細書において具体的に記載された開示内容に関して、参照により本明細書にともに組み込まれる。
配列番号の要点
配列番号1:ATCC3502、Genbank受託「AAA23262」のBoNT/A
配列番号2:BoNT/A1の活性化ループ
配列番号3:BoNT/A2/A6の活性化ループ
配列番号4:BoNT/A3の活性化ループ
配列番号5:BoNT/A3の活性化ループ
配列番号6:BoNT/A4の活性化ループ
配列番号7:BoNT/A5の活性化ループ
配列番号8:248個のN末端アミノ酸残基を欠く、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)株ATCC3502、GenBank受託番号:「CAL82988.1」に由来するタンパク分解性活性ポリペプチド
配列番号9:ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)株ATCC3502、GenBank受託番号:「CAL82988.1」に由来するタンパク分解性に不活性なポリペプチド
配列番号10:配列番号8をコードする核酸配列
配列番号11:配列番号9をコードする核酸配列
配列番号12:「Streptag」アミノ酸配列
配列番号13:BoNT/A7の活性化ループ
配列番号14:BoNT/A8の活性化ループ
配列番号15:単鎖、組換え、カチオン性、ボツリヌス神経毒亜血清型A1誘導体(mrBoNT/A1)のアミノ酸配列
図1は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたフェニル高性能(PhHP)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図2は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたフェニルファストフロー高置換(PhFF-Hi)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図3は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたブチル高性能(BuHP)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図4は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたスルホプロピル高性能(SPHP)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図5は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたスルホプロピルファストフロー(SPFF)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図6は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたカルボキシメチルファストフロー(CMFF)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図7は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価された第四級アミン高性能(QHP)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図8は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価された第四級アミンファストフロー(QFF)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図9は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたジエチルアミノプロピル(DEAP、「ANX」)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図10は、BoNT/AからのLys-C(A405-棒)の分離が評価されたジエチルアミノエチル(DEAE)カラムからの溶出プロファイル(A280-点線)を示す図である。 図11は、フェニルHP HICによるrBoNT/A1からのLys-Cの除去を示す図である。PhHP HICポリッシングステップから取り出された画分を、SDS-PAGEによって分析した(上部)。組換えBoNT/A1は、約149キロダルトン(kDa)の分子量を有し、分子量マーカー(ベンチマーク)は、kDaで表示されている。同一画分のサンプルをまた、基質の切断が黄色発色団(黒色四角中)を放出する比色Lys-Cアッセイ(下部)において試験した。 図12は、フェニルHP HICによるrBoNT/A2(0)からのLys-Cの除去を示す図である。フェニルHP HICポリッシングステップから取り出された画分を、SDS-PAGEによって分析した(上部)。組換えBoNT/A1は、約149kDaの分子量を有し、分子量マーカー(ベンチマーク)は、kDaで表示されている。同一画分のサンプルをまた、基質の切断が黄色発色団(黒色四角中)を放出する比色Lys-Cアッセイ(下部)において試験した。 図13は、フェニルHP HICによるrBoNT/A5(0)からのLys-Cの除去を示す図である。フェニルHP HICポリッシングステップから取り出された画分を、SDS-PAGEによって分析した(上部)。組換えBoNT/A5(0)は、約149kDaの分子量を有し、分子量マーカー(ベンチマーク)は、kDaで表示されている。同一画分のサンプルをまた、基質の切断が黄色発色団(黒色四角中)を放出する比色Lys-Cアッセイ(下部)において試験した。 図14は、フェニルHP HICによるrBoNT/A6(0)からのLys-Cの除去を示す図である。フェニルHP HICポリッシングステップから取り出された画分を、SDS-PAGEによって分析した(上部)。組換えBoNT/A6(0)は、約149kDaの分子量を有し、分子量マーカー(ベンチマーク)は、kDaで表示されている。同一画分のサンプルをまた、基質の切断が黄色発色団(黒色四角中)を放出する比色Lys-Cアッセイ(下部)において試験した。 図15は、ブチルHP HICによるmrBoNT/A1からのLys-Cの除去を示す図である。ブチルHP HICポリッシングステップから取り出された画分を、SDS-PAGEによって分析した(上部)。組換えmrBoNT/A1は、約149kDaの分子量を有し、分子量マーカー(ベンチマーク)は、kDaで表示されている。同一画分のサンプルをまた、基質の切断が黄色発色団(黒色四角中)を放出する比色Lys-Cアッセイ(下部)において試験した。
[実施例1] 宿主の培養および可溶性rBoNT/Aタンパク質の発現
BoNT/Aで形質転換されたBLR(DE3)細胞のシングルコロニーを使用して、0.2％グルコサミンおよび30μg/mLカナマイシンを補給した、100mLの改変テリフィック(Terrific)培養液(mTB)を含有する250mL三角フラスコに播種した。この方法は、Microbankビーズまたはグリセロールストック(10〜100μL)を使用した場合に、フラスコに播種するために同等に適用可能である。
フラスコを、250RPMで振盪しながら37℃で16時間インキュベートする。10mLのこのスターター培養物を使用して、0.2％のグルコサミンおよび30μg/mLのカナマイシンを補給した、各々1Lを含有する2Lの三角フラスコに播種する。細胞を、0.5のOD600が到達されるまで225RPMで37℃で2時間増殖させる。この時点で、培養温度を16℃に低下させる。1時間後、細胞を、1mMのIPTGを20時間添加することによってBoNT/Aを発現するよう誘導する。細胞を4℃で20分間の遠心分離によって回収し、秤量し、次いで、-20℃で保存する。
[実施例2] 宿主からのBoNT/Aタンパク質の抽出および発現レベルの分析
rBoNT/Aの発現細胞ペーストを室温で解凍し、10μLのベンゾナーゼを補給した、細胞1gあたり3mLのTris-NaCl再懸濁緩衝液中でピペッティングすることによって再懸濁する。100W-10×30秒オン+45秒オフでの超音波処理によって細胞を溶解する。可溶化液を4℃、4000×gで1時間遠心分離して、上清中に可溶性rBoNT/Aを得る。
調製された可溶化液の総タンパク質濃度を決定するためのブラッドフォードアッセイ
希釈したrBoNT/A可溶化液またはBSA標準のいずれかのサンプル(50μL)を、1mLの使い捨てキュベットに添加する。各キュベットに450μLのクマシーブラッドフォードアッセイ試薬を添加し、室温で10分間インキュベートさせ、その後、A600を読み取る。BSA標準について得られた値を使用して、可溶化液サンプル中のタンパク質の量を決定する。
半定量的ウエスタンブロット解析
Metabiologicsから購入したBoNT/Aタンパク質の市販のサンプルを使用して、SDS-PAGE標準を作製する。次いで、発現された細胞培養物から可溶化液サンプルのSDS-PAGEサンプルを、既知総タンパク質濃度に調製する。これらのサンプルを、ポリアクリルアミドゲルにロードし、200Vで50分間流す。タンパク質バンドを、メタノール不含ブロッティング緩衝液中、0.4mAで1時間、ニトロセルロースメンブレン上にエレクトロブロッティングする。メンブレンを、PBS-0.1％ Tween 20中、0.5％ BSAを用いて1時間ブロッキングし、次いで、BoNT/Aに対する抗体を用いて1時間プロービングする。ブロットを、HRPがコンジュゲートしている二次抗体を用いてさらにプロービングし、SuperSignal DuraWest基質を用いて発現させ、Syngene Imaging Instrumentを使用して像を得る。
[実施例3] Lys-Cによるボツリヌス神経毒A(BoNT/A)の活性化
緩衝液(50mM Tris/HCl pH8.0、125mM NaCl)に溶解した単鎖組換えBoNT/A1(0.5mg/mL)を、2〜20時間の期間にわたって37℃または4℃でLys-C(1:500〜1:2500酵素:基質比の)によってタンパク分解性に活性化し、その後、0.4μM AEBSF(4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド(特異的セリンプロテアーゼ阻害剤))を用いて反応を阻害した。これによって、重鎖が、単一ジスルフィド結合によって軽鎖に連結している(示されていないデータ)BoNT/A1の成熟した二本鎖形態が得られる。
N末端配列決定および質量分析によって、切断部位は、内因性タンパク質と同一であると決定され、Lys-Cが第一選択の活性化酵素であると確認された(示されていないデータ)。
エンドプロテアーゼLys-C切断試験によって、Lys-Cが、極めて低濃度でrBoNT/A1を切断し、数日の期間にわたって活性なままであることが実証された(示されていないデータ)。
[実施例4] 活性化プロテアーゼを含まない標的BoNT/Aタンパク質の精製
BoNT/A一次タンパク質配列を使用して、BoNT/AおよびLys-Cの特性を調べた(表2を参照のこと)。予測される特性から、Lys-CおよびBoNT/Aの両方が、同様の平均疎水性親水性指標(mean hydropathicity, GRAVY値)を有するが、pH4.5および8.0で大きな電荷差を有すると示唆された(表2を参照のこと)。
この情報単独に基づいて、イオン交換(IEX)クロマトグラフィーがBoNT/AからLys-Cを分離すると予測された。したがって、IEXクロマトグラフィーを含めた精製の種々のクロマトグラフィー手段を調べた(以下を参照のこと)。
[実施例5] BoNT/AからLys-Cを分離するための高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)カラムのスクリーニング
FPLC精製
Lys-Cを用いるBoNT/A1活性化後に、ポリッシングおよびLys-Cの除去について、いくつかのFPLCカラムを試験した:
・3種の疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラム:フェニル高性能(PhHP)、フェニルファストフロー高置換(PhFF-Hi)およびブチルHP(BuHP)を、Tris pH8を用いて試験した、
・3種の陽イオン交換クロマトグラフィー(CEC)カラム:スルホプロピル高性能(SPHP)、スルホプロピルファストフロー(SPFF)およびカルボキシメチルファストフロー(CMFF)を、酢酸ナトリウムpH4.5を用いて試験した、
・4種の陰イオン交換クロマトグラフィー(AEC)カラム:第四級アミン高性能(QHP)、第四級アミンファストフロー(QFF)、ジエチルアミノプロピル(DEAP、「ANX」)およびジエチルアミノエチル(DEAE))を、Tris pH8を用いて試験した。
サンプルをカラムにロードし、緩衝液を用いてカラムを洗浄して、任意の非特異的に結合している分子を除去し、その後、漸増または漸減濃度の塩の直線溶出勾配を適用した(それぞれ、HICおよびCEC/AEC)。
反応条件および精製実施は、異なるカラムの種類間で変わる(以下の表3を参照のこと)。
図1〜10は、種々のクロマトグラフィーカラムからのBoNT/A1タンパク質の溶出プロファイル(A280)を示す(点線)。種々のカラムのために使用される種々の反応条件および精製実施が、使用される種々のスケールを説明する。
溶出勾配の間に集められた画分を、比色アッセイを用いて分析し、Lys-C活性を評価した。
Lys-C活性比色アッセイ
このアッセイは、無色の基質を切断して、405nmの光の吸収(A405)によって測光的に検出され得る黄色発色団を生成することを含む。したがって、このアッセイは、各画分中にLys-Cが存在するか否かを決定するための簡単な方法を提供した。
前記の比色Lys-C活性アッセイおよび測定されたA405nmを使用して、各溶出画分を分析した。
溶出画分の各々におけるLys-Cの量(A405の点で測定された)は、図1〜10において棒として示されている。
結果
A405およびA280データを比較することによって(図1〜10のグラフにおける)、どのカラムが、BoNT/AからのLys-Cの最良の分離を提供するかを推定することが可能であった。
使用した3種のHICカラムの異なるアルキル/アリール基(BuおよびPh)は、種々のタンパク質が疎水性効果によって相互作用し得る異なるリガンドを提供する。この相互作用は、これらの疎水基の密度(置換度(高/低)およびビーズの大きさ(FF/HP))によってさらに影響を受ける。CECカラムについて、サンプルのpHは、標的タンパク質pIのものよりも低く調整し、その結果、全体的な正味の正の電荷を達成し、従って、カラムと結合できる。各種類のカラム上に存在する異なるリガンドは、異なる電荷密度を提供し、異なるタンパク質との相互作用はまた、リガンド密度によっても影響を受ける。これらの変数は、同様に、異なる化学基が異なる電荷密度を示すAECカラムに当てはまる。この場合には、サンプルのpHを標的タンパク質pIのものよりも高く調整し、その結果、全体的な正味の負の電荷を達成する。
図1〜10から得られる図によるデータは、表4に定性的に要約されている。
各カラム種類からの溶出後のLys-Cの回収百分率および精製
各画分における総Lys-Cシグナルを、クロマトグラフィーステップの最後の5画分から得た平均A405値に対して正規化した。これから、溶出画分に基づいてタンパク質からのLys-Cの分離度を示すために、タンパク質ピーク画分中に存在するLys-C百分率を計算した(表5、タンパク質ピーク画分中のLysCの百分率(正規化された))。
標的タンパク質に関しては、BoNT/A分子のすべてが、主要なピークの下で溶出する(すなわち、回収率100％)と仮定され、したがって、精製度は、主要なピークにおいて回収されないロードされた総タンパク質の百分率として表すことができる(表5、精製の百分率)。
BoNT/AからのLys-Cの良好な分離は、タンパク質ピーク画分におけるLysCの百分率について低い値が得られたものとなる。これから、CECは、BoNT/A1からLys-Cを分離できないようである。高性能AECカラム、QHPは、BoNT/A1からLys-Cを分離する幾分かの能力を示した。しかし、2種の高性能HICカラムよりも大幅に有効ではない。したがって、結果は、同一条件のもので(すなわち、標準性能対標準性能および高性能対高性能)比較して、HICカラムは、CECまたはAECカラムのいずれかよりも、BonT/A1からのLys-Cの改善された分離を示したことを実証する。
2つの最も有望な候補は、HIC-PhHPおよびBuHPを含む。興味深いことに、これらのカラムは両方とも、高性能ビーズを使用する。
高性能媒体とその他のものの間の主要な相違は、平均粒径がより小さく(34μm対90μm)、より均一である(24〜44μm対44〜165μm)という点である。これは、より小さい径のビーズ(平均の大きさ3〜30μmの間)を使用する分析カラムを用いた場合の報告された性能の改善と一致する(GE Healthcare handbooks 11-0004-21&11-0012-69およびデータファイル18-1172-87 AE&18-1172-88 AD)。
BoNT/AからLys-Cを分離除去するための最終ポリッシングステップとして、PhHP HICを選択した(以下の実施例6を参照のこと)。
[実施例6] 組換えボツリヌス神経毒亜血清型A1(rBoNT/A1)の活性化および最終精製
捕獲のための高性能ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(ブチルHP HIC)を使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)と、それに続く、高性能第四級アンモニウムセファロース陰イオン交換クロマトグラフィー(Q HP AEC)を用いる中間精製ステップによって単鎖rBoNT/A1を精製した。次いで、この分子を、37℃で2時間0.4μg/mL Lys-Cとともにインキュベートして、活性な二本鎖を得た。
高性能フェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(PhHP HIC)を使用して、活性化されたrBoNT/A1からLys-Cを分離した。これは、高塩Tris緩衝液を用いて反応混合物を調整し、その後、PhHPカラムにロードすることと、それに続いて、高塩洗浄およびその後の低塩Tris緩衝液への直線勾配を用いるタンパク質溶出を含んでいた。溶出画分を、変性ゲル電気泳動(SDS-PAGE-図11上部)および比色Lys-C活性アッセイ(図11下部)によって分析した。Lys-Cは、勾配において早期に(黒色四角で強調された、F16〜F21)、活性化されたBoNT分子(F21〜F29)より前に溶出すると実証された。したがって、これは、rBoNT/A1からのLys-Cの良好な分離を示す。画分の最大強度は、30ng/mL Lys-Cと同様であると思われ、これは、rBoNT/A1画分中に存在する任意の残存するLys-Cは、この濃度よりも少ないことを示唆する。
[実施例7] 組換えエンドペプチダーゼ陰性ボツリヌス神経毒亜血清型A2(rBoNT/A2(0))の活性化および最終精製
捕獲のための高性能ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(ブチルHP HIC)を使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)と、それに続く、高性能第四級アンモニウムセファロース陰イオン交換クロマトグラフィー(Q HP AEC)を用いる中間精製ステップによって単鎖rBoNT/A2(0)を精製した。次いで、この分子を、37℃で2時間4μg/mL Lys-Cとともにインキュベートして、活性な二本鎖を得た。
高性能フェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(PhHP HIC)を使用して、活性化されたrBoNT/A2(0)からLys-Cを分離した。これは、高塩Tris緩衝液を用いて反応混合物を調整し、その後、フェニルHPカラムにロードすることと、それに続いて、高塩洗浄およびその後の低塩Tris緩衝液への直線勾配を用いるタンパク質溶出を含んでいた。溶出画分を、変性ゲル電気泳動(SDS-PAGE)および比色Lys-C活性アッセイ(図12)によって分析し、これは、Lys-Cは、勾配において早期に(F5〜F11)、活性化されたBoNT分子(F12〜F15)の直前に溶出することを示した。したがって、このカラムは、rBoNT/A2(0)からのLys-Cの良好な分離を示す。
[実施例8] 組換えエンドペプチダーゼ陰性ボツリヌス神経毒亜血清型A5(rBoNT/A5(0))の活性化および最終精製
捕獲のための高性能ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(ブチルHP HIC)を使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)と、それに続く、高性能第四級アンモニウムセファロース陰イオン交換クロマトグラフィー(Q HP AEC)を用いる中間精製ステップによって単鎖rBoNT/A5(0)を精製した。次いで、この分子を、37℃で2時間2.5μg/mL Lys-Cとともにインキュベートして、活性な二本鎖を得た。高性能フェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニルHP HIC)を使用して、活性化されたrBoNT/A5(0)からLys-Cを分離した。これは、高塩Tris 緩衝液を用いて反応混合物を調整し、その後、フェニルHPカラムにロードすることと、それに続いて、高塩洗浄およびその後の低塩Tris緩衝液への直線勾配を用いるタンパク質溶出を含んでいた。溶出画分を、変性ゲル電気泳動(SDS-PAGE)および比色Lys-C活性アッセイ(図13)によって分析し、これは、Lys-Cは、勾配において早期に(F10〜F39)、活性化されたBoNT分子(F51〜F65)の前に溶出することを示した。したがって、このカラムは、rBoNT/A5(0)からのLys-Cの良好な分離を示す。
[実施例9] 組換えエンドペプチダーゼ陰性ボツリヌス神経毒亜血清型A6(rBoNT/A6(0))の活性化および最終精製
高性能スルホプロピルセファロース陽イオン交換クロマトグラフィー(SP HP CEC)を使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を用いる捕獲と、それに続く、pH8のTris緩衝液への緩衝液交換の前に、硫酸ナトリウム沈殿および酢酸ナトリウムへの再可溶化によって、単鎖rBoNT/A6(0)をまず精製した。次いで、この分子を、37℃で2時間0.3μg/mL Lys-Cとともにインキュベートして、活性な二本鎖を得た。高性能フェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニルHP HIC)を使用して、活性化されたrBoNT/A6(0)からLys-Cを分離した。これは、高塩Tris緩衝液を用いて反応混合物を調整し、その後、フェニルHPカラムにロードすることと、それに続いて、高塩洗浄およびその後の低塩Tris緩衝液への直線勾配を用いるタンパク質溶出を含んでいた。溶出画分を、変性ゲル電気泳動(SDS-PAGE)および比色Lys-C活性アッセイ(図14)によって分析し、これは、Lys-Cは、勾配において早期に(F6〜F13)、活性化されたBoNT分子(F16〜F27)の前に溶出することを示した。これは、rBoNT/A6(0)からのLys-Cの優れた分離を示す。
[実施例10] 単鎖、組換え、カチオン性ボツリヌス神経毒亜血清型A1誘導体(mrBoNT/A1)の精製
捕獲のために高性能スルホプロピルセファロース陽イオン交換クロマトグラフィー(SPHP CEX)を使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によって、単鎖mrBoNT/A1(配列番号15)を精製した。宿主細胞タンパク質をさらに除去するために、高性能ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(BuHP HIC)を使用する中間精製ステップを使用した。SDS-PAGEによってBuHP溶出画分を分析し、単鎖mrBoNT/A1を含有するものを、精製された単鎖mrBoNT/A1としてプールした。
[実施例11] 組換え、カチオン性、ボツリヌス神経毒亜血清型A1誘導体(mrBoNT/A1)の活性化および最終精製
単鎖mrBoNT/A1(配列番号15)を、37℃で2時間0.4μg/mL Lys-Cとともにインキュベートして、活性な二本鎖を得た。高性能ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(BuHP HIC)を使用して、活性化されたmrBoNT/A1からLys-Cを分離した。これは、高塩Bis-Tris緩衝液を用いて反応混合物を調整し、その後、BuHPカラムにロードすることと、それに続いて、高塩洗浄およびその後の低塩Bis-Tris緩衝液への直線勾配を用いるタンパク質溶出を含んでいた。溶出画分を、SDS-PAGE(図15上部)および比色Lys-C活性アッセイ(図15下部)によって分析した。Lys-Cは、カラムフロースルー中に、勾配において早期に(黒色四角において強調されたF1〜F6、図15下部)、活性化されたBoNT分子(F10〜F12)の前に溶出した。したがって、これは、mrBoNT/A1からのLys-Cの良好な分離を示す。
[実施例12] Lys-Cを実質的に含まない活性な二本鎖BoNT/Aを含む製剤
活性な二本鎖BoNT/Aを含む以下の6種の液体組成物を調製した(表6)。
6種の組成物すべてを、25℃で12週間保存する。二本鎖BoNT/Aプロテアーゼ機能の安定性は、細胞不含エンドペプチダーゼアッセイを使用してこの期間の間評価される。
[実施例13] 高感受性Lys-C活性アッセイ
蛍光ペプチド基質の切断を測定することによって、精製されたBoNT/Aサンプル中の最終Lys-C濃度の定量的決定を行った。蛍光基質(Tos-GPK-AMCとも呼ばれる、Tos-GPK-7-アミノ-4-トリフルオロアセテート塩)を、DMSOで再構成し、20mg/ml(32.7mM)ストックを得た。これを、水を用いてさらに10mMに希釈し、アリコートを調製し、-20℃で保存した。アッセイの当日、適当な量の基質をとり、25mM Tris pH8、125mM NaClを用いてさらに希釈し、0.5mM Lys-C作業溶液を得、次いで、作業溶液をアッセイ緩衝液(25mM Tris、125mM NaCl、0.1mg/ml BSA、pH8)で希釈することによって、Lys-C標準(既知濃度)を調製した。標準、ブランク(アッセイ緩衝液のみ)および試験サンプル(精製されたrBoNT/Aのバッチ)を、黒色OptiPlateプレートに3連で分配し(ウェルあたり180μl)、37℃で10〜15分間平衡化した。次いで、20μlの基質を添加し、プレートを、動力学的読み取り値がとられるプレートリーダーに直ちに移した。プレートを37℃で、20分毎に5時間、励起/発光フィルター-360/40および485/20を使用して読み取った。データを、吸光度/蛍光(y軸)に対する分での時間(x軸)としてプロットした。各Lys-C濃度の勾配値を使用して、Lys-C濃度の標準曲線を作製した。精製されたrBoNT/Aのサンプルを同様の方法で処理し、各rBoNT/Aサンプル中のLys-C濃度を標準曲線から内挿した。4種の独立バッチまたはrBoNT/Aの分析に基づいて、本発明者らは、最終材料中の平均Lys-C濃度を100ng/BoNT/Aあたり7.3±1.5pg Lys-Cであると測定した。
[図1〜10]
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for PhHP: PhHPのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for PhFF-Hi: PhFF-Hiのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for BuHP: BuHPのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for SPHP: SPHPのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for SPFF: SPFFのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for CMFF: CMFFのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for QHP: QHPのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for QFF: QFFのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for ANX: ANXのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
Elution profiles of BoNT/A1 and Lys-C for DEAE: DEAEのための、BoNT/A1およびLys-Cの溶出プロファイル
280nm Absorption: 280nm吸収
Fraction: 画分
405nm Absorption: 405nm吸収
[図11〜15]
Benchmark: ベンチマーク
Load: ロード
Wash: 洗浄

Claims (20)

  1. 可溶性二本鎖BoNT/Aタンパク質を生産するための方法であって、
    a)可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を提供するステップと、
    b)溶液中で前記BoNT/Aタンパク質を、エンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)と接触させるステップと、
    c)可溶性BoNT/Aタンパク質およびLys-Cを含有する溶液を、疎水性表面と接触させ、ここで、可溶性BoNT/Aタンパク質が疎水性表面と優先的に結合することによって、Lys-Cから可溶性BoNT/Aタンパク質を分離するステップと
    を含む、方法。
  2. 可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質が、(i)前記単鎖BoNT/Aタンパク質をコードする核酸を発現系において発現させることによって宿主細胞において、または(ii)in vitro発現系において生産される、請求項1に記載の方法。
  3. 宿主細胞が、細菌宿主細胞であり、発現系が、細菌発現系である、請求項2に記載の方法。
  4. 細菌発現系が、大腸菌(E. coli)発現系であり、宿主細胞が、大腸菌(E. coli)細胞である、請求項3に記載の方法。
  5. 前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質が、前記宿主細胞の細胞質において発現される、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質が、少なくとも5mg/Lのレベルで発現される、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記可溶性単鎖BoNT/Aタンパク質を含有する、細菌または大腸菌(E. coli)宿主細胞ホモジネートを提供するための、細菌または大腸菌(E. coli)宿主細胞の溶解を含む、請求項2から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 疎水性表面が、アリールまたはアルキル基からなるリガンドが結合される不活性マトリックスである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. リガンドが、ブチル、フェニルまたはオクチルリガンドからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
  10. 高性能疎水性表面が使用される、請求項9に記載の方法。
  11. 請求項1から10のいずれかに記載の方法によって得ることができる活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質。
  12. エンドプロテアーゼLys-Cを実質的に含まない、請求項11に記載の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質を含む組成物。
  13. 5％未満の単鎖BoNT/Aまたは2％未満の単鎖BoNT/Aを含む、請求項12に記載の組成物。
  14. 100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のエンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-Cを含有する、請求項12または13に記載の組成物。
  15. 請求項11に記載の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質と、
    界面活性剤である非タンパク質安定化剤と、
    水と
    を含む液体医薬組成物であって、
    タンパク質安定化剤を含まない、および
    エンドプロテアーゼLys-C(Lys-C)を実質的に含まない、液体医薬組成物。
  16. 100ngのBoNT/Aタンパク質あたり400pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり300pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり200pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり100pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり50pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり20pg未満のLys-C、100ngのBoNT/Aタンパク質あたり15pg未満のLys-Cまたは100ngのBoNT/Aタンパク質あたり10pg未満のLys-Cを含有する、請求項15に記載の液体医薬組成物。
  17. 塩化ナトリウムと、
    5.5から7.5の間のpHを維持するための緩衝剤と、
    二糖と
    をさらに含み、
    水が、滅菌水である、請求項15または16に記載の液体医薬組成物。
  18. 治療において使用するための、請求項11に記載の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質または請求項12から14のいずれか一項に記載の組成物または請求項15から17のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  19. 医薬の生産における、請求項11に記載の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質または請求項12から14のいずれか一項に記載の組成物または請求項15から17のいずれか一項に記載の液体医薬組成物の使用。
  20. 請求項11に記載の活性な二本鎖BoNT/Aタンパク質または請求項12から14のいずれか一項に記載の組成物または請求項15から17のいずれか一項に記載の液体医薬組成物の、それを必要とする患者への投与を含む治療の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020536899A (ja) * 2017-10-13 2020-12-17 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション ボツリヌス神経毒素ａサブタイプ６および薬理学的使用方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8168206B1 (en) 2005-10-06 2012-05-01 Allergan, Inc. Animal protein-free pharmaceutical compositions
CN102869373B (zh) * 2009-06-25 2017-05-10 雷文斯治疗公司 不含白蛋白的肉毒杆菌毒素制剂
PT2490986T (pt) * 2009-10-21 2018-11-13 Revance Therapeutics Inc Métodos e sistemas para purificar neurotoxina botulínica não complexada
GB201219602D0 (en) * 2012-10-31 2012-12-12 Syntaxin Ltd Recombinant clostridium botulinum neurotoxins
JP6156954B2 (ja) * 2012-11-21 2017-07-05 イプセン バイオイノベーション リミテッド タンパク分解性にプロセシングされたポリペプチドの製造方法
GB201312317D0 (en) * 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US11753633B2 (en) 2015-08-27 2023-09-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for treatment of pain
GB201517450D0 (en) * 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
GB201607901D0 (en) * 2016-05-05 2016-06-22 Ipsen Biopharm Ltd Chimeric neurotoxins
UA123679C2 (uk) * 2016-05-27 2021-05-12 Іпсен Біофарм Лімітед Рідка композиція нейротоксину, стабілізована триптофаном або тирозином
HRP20191966T4 (hr) 2016-09-13 2022-09-16 Allergan, Inc. Stabilizirani neproteinski klostridijalni pripravci toksina
EP3752128A1 (de) * 2018-02-16 2020-12-23 Bontana Therapies Gmbh Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung
US20220016221A1 (en) 2018-12-05 2022-01-20 Ipsen Biopharm Limited Treatment of symptoms of traumatic brain injury
KR102485146B1 (ko) 2019-04-15 2023-01-06 (주)제테마 보툴리눔 독소의 제조방법
KR102516203B1 (ko) 2019-04-15 2023-03-30 (주)제테마 보툴리눔 독소의 제조방법
GB202003813D0 (en) 2020-03-16 2020-04-29 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of upper facial lines
US20230248811A1 (en) 2020-03-16 2023-08-10 Ipsen Biopharm Limited Treatment of Limb Spasticity
CN114958887A (zh) * 2021-02-26 2022-08-30 重庆誉颜制药有限公司 一种经修饰的毒素多肽的制备方法
AU2022348206A1 (en) 2021-09-16 2024-03-28 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of cervical dystonia
KR20240067100A (ko) 2021-09-23 2024-05-16 입센 바이오팜 리미티드 대상체의 안검 근육에 이환된 장애의 치료에 사용하기 위한 변형된 bont/a
GB202113602D0 (en) 2021-09-23 2021-11-10 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004512004A (ja) * 1999-05-12 2004-04-22 ユナイテッド　ステイツ　アーミー　メディカル　リサーチ　アンド　マテリエル　シーエムディー ボツリヌス神経毒に対する組換えワクチン
JP2008505961A (ja) * 2004-07-12 2008-02-28 イプセン リミティド ボツリヌス神経毒を含む医薬組成物
JP2008531046A (ja) * 2005-03-03 2008-08-14 アラーガン、インコーポレイテッド 動物由来産物不含方法およびボツリヌス毒素を精製するための方法
EP2524963A1 (en) * 2011-05-19 2012-11-21 Toxogen GmbH Methods for the manufacture of proteolytically processed polypeptides
JP2012532932A (ja) * 2009-07-13 2012-12-20 アラーガン、インコーポレイテッド ボツリヌス神経毒素を得るためのプロセスおよびシステム

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996005222A1 (en) * 1994-08-08 1996-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Purification and pharmaceutical compositions containing type g botulinum neurotoxin
DE19856897A1 (de) 1998-12-10 2000-06-15 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Therapeutikum zur Unterdrückung von Schnarchgeräuschen
US7452697B2 (en) * 2003-09-25 2008-11-18 Allergan, Inc. Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin
DK1926744T4 (en) * 2005-09-19 2019-01-28 Allergan Inc CLOSTRIDIUM TOXIN-ACTIVABLE CLOSTRIDIAL TOXINES
CN101175478A (zh) * 2005-10-06 2008-05-07 阿勒根公司 非蛋白稳定的梭菌毒素药物组合物
US8137677B2 (en) * 2005-10-06 2012-03-20 Allergan, Inc. Non-protein stabilized clostridial toxin pharmaceutical compositions
PT2490986T (pt) * 2009-10-21 2018-11-13 Revance Therapeutics Inc Métodos e sistemas para purificar neurotoxina botulínica não complexada
JP6156954B2 (ja) 2012-11-21 2017-07-05 イプセン バイオイノベーション リミテッド タンパク分解性にプロセシングされたポリペプチドの製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004512004A (ja) * 1999-05-12 2004-04-22 ユナイテッド　ステイツ　アーミー　メディカル　リサーチ　アンド　マテリエル　シーエムディー ボツリヌス神経毒に対する組換えワクチン
JP2008505961A (ja) * 2004-07-12 2008-02-28 イプセン リミティド ボツリヌス神経毒を含む医薬組成物
JP2008531046A (ja) * 2005-03-03 2008-08-14 アラーガン、インコーポレイテッド 動物由来産物不含方法およびボツリヌス毒素を精製するための方法
JP2012532932A (ja) * 2009-07-13 2012-12-20 アラーガン、インコーポレイテッド ボツリヌス神経毒素を得るためのプロセスおよびシステム
EP2524963A1 (en) * 2011-05-19 2012-11-21 Toxogen GmbH Methods for the manufacture of proteolytically processed polypeptides

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020536899A (ja) * 2017-10-13 2020-12-17 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション ボツリヌス神経毒素ａサブタイプ６および薬理学的使用方法

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