JP2017509628A - リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、FGF21ポリペプチドもしくはFGF21タンパク質、またはこれらの突然変異体、変異体、および融合体について、例えば、インスリンシグナル伝達の欠損と関連した代謝性疾患(例えば、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)および/または自己免疫性インスリン受容体障害(B型インスリン抵抗性))、1型糖尿病、混合型脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)など、インスリン産生の欠損と関連した代謝性疾患、および他の代謝性障害、ならびにHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーなど、多様なリポジストロフィーを処置し、重病患者の死亡率および罹患率を低減する上での、新たな治療法の同定に関する。

Description

本発明は、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患、具体的には、インスリン受容体内の突然変異(例えば、A型インスリン抵抗性、ラブソン−メンデンホール症候群およびドナヒュー症候群)および自己免疫性インスリン抵抗性(B型インスリン抵抗性としてもまた公知である)から生じるものを含むインスリン受容体障害(INSR障害またはIR障害);家族性部分型リポジストロフィー障害、後天性部分型リポジストロフィー障害、およびHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィー障害により引き起こされるインスリン抵抗性および関連する混合型脂質異常症を処置し、これらの患者の死亡率および罹患率を低減する方法に関する。本発明はまた、1型糖尿病を患う患者など、インスリン産生が欠損した患者を処置する方法にも関する。
線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーは、22の、遺伝子的には顕著に異なるが、相同なリガンドを特徴とし、7つのサブファミリーに群分けされる。公表された文献に従うと、FGFファミリーは、現在のところ、FGF−1〜FGF−23の、少なくとも23のメンバーからなる(Reuss et al. (2003) Cell Tissue Res. 313:139-157)。
FGF−21は、マウス胚から単離されたものであり、FGF−19およびFGF−23と近縁である。このFGFサブファミリーは、古典的FGFでは一般的でない多様な生理学的過程、すなわち、エネルギーホメオスタシスおよび胆汁酸ホメオスタシス、グルコース代謝および脂質代謝、ならびにリン酸ホメオスタシスのほか、ビタミンDホメオスタシスも調節する。さらに、古典的FGFと異なり、このサブファミリーは、内分泌によっても作用する(Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8)。線維芽細胞増殖因子21(FGF21)は、肝臓内で優先的に発現することが報告されており(Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206, (2000);国際特許公開第01/36640号パンフレット;および国際特許公開第01/18172号パンフレット)、虚血性血管疾患、創傷治癒、および肺細胞機能、気管支細胞機能、または肺胞細胞機能の喪失ならびに他の多数の障害と関連する疾患のための処置として記載されている。
FGF21は、強力な代謝性調節因子として同定されている。FGF21の、食餌誘導性肥満または遺伝性肥満および糖尿病を伴う齧歯動物およびアカゲザルへの全身投与は、強力な血圧降下効果およびトリグリセリド低下効果を及ぼし、体重の低減をもたらす(Coskun, T, et al. (2008) Endocrinology 149:6018-6027; Kharitonenkov, A, et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635; Kharitonenkov, A, et al. (2007) Endocrinology 148:774-781; Xu, J, et al. (2009) Diabetes 58:250-259)。FGF21は、28アミノ酸のリーダー配列を含有する、209アミノ酸のポリペプチドである。ヒトFGF21は、マウスFGF21に対する約79%のアミノ酸同一性と、ラットFGF21に対する約80%のアミノ酸同一性とを有する。
FGF−21は、FGF受容体、ならびにFRS2aおよびERKを含む下流のシグナル伝達分子を活性化させるが、FGFR単独とFGF−21との直接的相互作用は検出されていない。さらに、多くの細胞型は、複数のFGFRアイソフォームを発現させるが、FGF−21に応答しない。これらのデータの全ては、共因子が、FGFRを介するFGF−21シグナル伝達を媒介しているに違いないことを示唆する。近年の研究では、FGF−21に対する細胞応答の決定基として、肝臓内、脂肪細胞内、および膵臓内で高度に発現するβ−クロトーが同定されている(Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95)。β−クロトーは、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、およびFGFR4に優先的に結合する。β−クロトー−FGFR複合体は、in vitroにおいて、FGF−21に結合するが、FGFR単独は、FGF−21に結合しない(Kharitonenkov, A. et al. (2008) J Cell Physiol 215, 1-7)。同様の機構は、FGF−23−クロトー−FGFR系においても同定されている(Urakawa, I. et al. (2006) Nature 444, 770-4)。
FGF−21の生体活性は、マウス3T3−L1脂肪細胞グルコース取込みアッセイにおいて、最初に同定された(Kharitonenkov, A. et al. (2005) J Clin Invest 115, 1627-35)。その後、FGF−21は、インスリン非依存性のグルコース取込みおよびGLUT1の発現を誘導することが示された。FGF−21はまた、糖尿病齧歯動物モデルの範囲内で高血糖症を改善することも示されている。加えて、FGF−21を過剰発現させるトランスジェニックマウスは、体重および脂肪量の減少、ならびにインスリン感受性の増強を含む、食餌誘導性代謝異常に対して抵抗性であることが見出された(Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37)。FGF−21の、糖尿病性非ヒト霊長動物への投与は、空腹時血漿グルコースレベル、空腹時血漿トリグリセリドレベル、空腹時血漿インスリンレベル、および空腹時血漿グルカゴンレベルの低下を引き起こし、HDLコレステロールのほぼ80%の増大を含む、リポタンパク質プロファイルの顕著な改善をもたらした(Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81)。重要なことは、このNHP研究中のいかなる時点においても、低血糖症が観察されなかったことである。さらに、近年の研究では、FGF−21が、空腹状態への適合を制御する一助となる、重要な内分泌ホルモンとして同定されている。これにより、かつては欠落していた連関であり、肝臓が、エネルギーホメオスタシスの生体反応の調節において、体内の残余部分と生体情報をやり取りする場である、PPARαの下流部分が充当された。
FGF21ポリペプチドおよびFGF21タンパク質のほか、これらの変異体および突然変異体も、それらの、肥満および2型糖尿病(T2D)に対する代謝効果について評価されている。しかし、FGF21の、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)およびリポジストロフィーと関連する多様な代謝の状態に対する効果は立証されていない。本出願では、FGF21の、T1D、インスリン受容体突然変異、または自己免疫性障害(INSR障害)およびHIV/HAART(Highly Active Anti-Retroviral Therapy(HIV感染を伴う患者を処置するのに使用される))誘導性部分型リポジストロフィーに対する効果について記載するが、本発明の方法は、T2DMおよびインスリン抵抗性と関連する公知の疾患に加えて、前記代謝性疾患の処置にも有用である。
本発明は、これらの変異体および突然変異体を含む、線維芽細胞増殖因子21(FGF21)タンパク質およびFGF21ポリペプチド、ならびにこれらを含む医薬組成物について、新たな治療機能、すなわち、インスリン受容体(INSR)突然変異と関連する代謝の状態を含む、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患を処置する薬剤としての新たな治療機能の同定に関する。
一部の実施形態では、本発明の方法は、例えば、NCBI参照配列番号をNP_061986.1とし、NCBI参照配列番号をNM_019113.2とするポリヌクレオチド配列によりコードされ、例えば、Chiron Corporationに移譲された米国特許第6,716,626B1号明細書などの交付済み特許において見出される、野生型FGF21タンパク質を含む。
一部の実施形態では、本発明の方法は、FGF21タンパク質配列の変異体、例えば、生物学的に活性のFGF21変異体を含み、FGF21タンパク質の切断型(C末端領域および/またはN末端領域に由来する残基を消失させ、これにより、タンパク質を短縮/切断する)のほか、目的の位置における、アミノ酸の、1または複数の点置換および/または部位特異的組込みを伴う(例えば、保存的アミノ酸残基、非保存的残基、またはピロリシンなどの非天然アミノ酸残基を伴う)変異体も含みうる。
前記変異体の代表例は、例えば、PCT国際公開第2012/066075号パンフレット(2012年5月24日に、Novartis AGにより出願された)において記載されている。好ましい実施形態は、PCT国際公開第2012/066075号パンフレットおよび本明細書において、「変異体76」、「FGF21 V76」、「V76」などと記載されているもので、9つの点突然変異を含む177アミノ酸残基を伴う、遺伝子操作されたFGF21変異体である。別の好ましい実施形態は、PCT国際公開第2013/049247号パンフレットおよび本明細書において、「変異体101」、「FGF21(v101)」、「V101」などと記載されているもので、2つのアミノ酸リンカーにより、9つの点突然変異を伴う、遺伝子操作されたFGF21変異体に連結されたFc融合タンパク質である。好ましい実施形態は、以下の表(表1):
に見出すことができる。
本発明の方法において使用される、FGF21の前記修飾は、野生型FGF21タンパク質と比べた変異体の生物学的特性を増強するようにデザインされるほか、場合によって、例えば、標識およびタンパク質半減期延長剤を付加する点として用いられ、前記変異体を、固体支持体の表面に固定する目的でも用いられる。
多様な実施形態では、本明細書で開示される前記ポリペプチド変異体およびタンパク質変異体は、(a)8アミノ酸残基を超えないアミノ末端切断型であって、ポリペプチドにより、哺乳動物における血中グルコースを低下させることが可能なアミノ末端切断型;(b)12アミノ酸残基を超えないカルボキシル末端切断型であって、ポリペプチドにより、哺乳動物における血中グルコースを低下させることが可能なカルボキシル末端切断型;または(c)8アミノ酸残基を超えないアミノ末端切断型および12アミノ酸残基を超えないカルボキシル末端切断型であって、ポリペプチドにより、哺乳動物における血中グルコースを低下させることが可能なアミノ末端切断型およびカルボキシル末端切断型を含みうる。
さらに他の実施形態では、本発明の方法は、例えば、
交付済みの米国特許第7,491,697号明細書;米国特許第8,541,369号明細書;米国特許第8,012,931号明細書;米国特許第8,383,365号明細書;
公開済みの米国特許出願およびPCT特許出願である、米国特許出願公開第2011/0195895号明細書;米国特許出願公開第2012/0052069号明細書;米国特許出願公開第2010/0216715号明細書;米国特許出願公開第2009/0118190号明細書;米国特許出願公開第2012/0264683号明細書;国際公開第10/084169号パンフレット;国際公開第10/142665号パンフレット;米国特許出願公開第2008/0176790号明細書;国際公開第11/089203号パンフレット;国際公開第11/020319号パンフレット;国際公開第12/062078号パンフレット;米国特許出願公開第2010/0285131号明細書;国際公開第10/042747号パンフレット;および米国特許出願公開第2011/0135657号明細書
に記載されている変異体のほか、任意の関連出願、交付済みの特許に記載されている変異体など、FGF21タンパク質配列の変異体、ならびに米国および他の諸国の両方における任意の関連出願、交付済みの特許に記載されている、上記のファミリーメンバーも含む。
さらに他の実施形態では、本発明の方法は、例えばシステイン残基を加えることによりジスルフィド結合が生じるように操作された、FGF21タンパク質配列の変異体を含む。前記変異体は、位置について上記で列挙されているジスルフィド結合が生じるように操作された任意の変異体と共に、例えばPCT国際公開第12/066075号パンフレットにおいて見出すことができる。
一部の実施形態では、本発明の方法は、PEG化されるかまたは他の形で半減期を延長されたFGF21ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、野生型FGF21、またはその突然変異体もしくは変異体を含む。
一部の実施形態では、本発明の方法は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリシアル酸など、1または複数のポリマーであって、野生型FGF21と比べて施された部位特異的アミノ酸修飾の位置におけるものであれ、野生型FGF21と共有されるアミノ酸の位置におけるものであれ、1または複数のポリマーに共有結合的に連結されたポリペプチド変異体およびタンパク質変異体を含む。
一部の実施形態では、本発明の方法は、Fc融合体など、FGF21融合タンパク質を含む。前記融合体は、野生型FGF21またはその突然変異体もしくは変異体を含みうる。一部の実施形態では、本発明の方法は、任意選択で、GSまたはGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号10)などのリンカーを介して、異種アミノ酸配列に融合しうるポリペプチドを含む。異種アミノ酸配列は、IgG定常ドメインまたはその断片(例えば、Fc領域)の場合もあり、ヒト血清アルブミン(HSA)の場合もあり、アルブミン結合性ポリペプチドの場合もある。このような方法は、前記融合ポリペプチドの多量体を含みうる。一部の実施形態では、本発明の方法は、異種アミノ酸配列(例えば、HSA、Fcなど)を、FGF21タンパク質または記載されている突然変異体もしくは変異体のアミノ末端に融合した融合タンパク質を含み、他の実施形態では、融合は、FGF21タンパク質または突然変異体もしくは変異体のカルボキシル末端において生じる。
本発明はまた、本明細書で開示されるポリペプチド変異体およびタンパク質変異体と、薬学的に許容される製剤化剤とを含む、医薬組成物を含む処置法も提供する。このような医薬組成物は、代謝性障害を処置するための方法において使用することができ、本方法は、それを必要とするヒト患者に、本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。処置されうる代謝性障害の非限定的な例は、1型糖尿病およびINSR突然変異障害を含む。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本発明についての、以下の詳細な記載において解明されるであろう。
STZマウスに、野生型FGF21(図1A)および変異体76(Cmpd−A)(図1B)を投与する場合の、グルコースレベルの変化を示すグラフ表示である[STZとは、ベータ細胞毒素である、ストレプトゾトシンである]。野生型FGF21(1kg当たり3mgずつ、毎日1回投与)は、STZマウスにおけるグルコースを、5日目(D5)から減少させた。変異体76(Cmpd−Aと称する)(1kg当たり1または3mgずつ、毎週2回投与)は、STZマウスにおけるグルコースを、1kg当たり3mgの用量では、2日目(D2)から、1kg当たり1mgの用量では、11日目(D11)から減少させた。 HbA1cレベルの変化を示すグラフ表示である。変異体76(Cmpd−Aと称する)を、1kg当たり1mgの用量および1kg当たり3mgの用量の両方で投与したところ、HbA1cレベルの低減を示した。 STZマウスに、野生型FGF21(図3A)および変異体76(図3B)を投与する場合の、呼吸交換比(RER)レベルの変化を示すグラフ表示である。野生型FGF21(1kg当たり3mgずつ、毎日1回投与)は、STZマウスにおけるRERを増大させ、変異体76(Cmpd−Aと称する)(1kg当たり1または3mgずつ、毎週2回投与)は、STZマウスにおけるグルコース利用量を増大させた。 STZマウスに、野生型FGF21(図4A)および変異体76(図4B)を投与する場合の、エネルギー消費量レベルの変化を示すグラフ表示である。野生型FGF21(1kg当たり3mgずつ、毎日1回投与)は、STZマウスにおけるエネルギー消費量を増大させ、変異体76(Cmpd−Aと称する)(1kg当たり1または3mgずつ、毎週2回投与)も、STZマウスにおけるエネルギー消費量を増大させた。 STZマウスに、野生型FGF21(図5A)および変異体76(Cmpd−A)(図5B)を投与する場合の、食物摂取量の変化を示すグラフ表示である。野生型FGF21(1kg当たり3mgずつ、毎日1回投与)および変異体76(1kg当たり1または3mgずつ、毎週2回投与)のいずれも、STZマウスにおける累積食物摂取量を減少させた。 STZマウスに、野生型FGF21(図6A)および変異体76(Cmpd−Aと称する)(図6B)を投与する場合の、ケトン生成量の変化を示すグラフ表示である。野生型FGF21(1kg当たり3mgずつ、毎日1回投与)および変異体76(1kg当たり1または3mgずつ、毎週2回投与)のいずれも、STZマウスにおけるケトン生成量を減少させた。 STZマウスに、野生型FGF21(図7A)および変異体76(Cmpd−Aと称する)(図7B)を投与する場合の、副睾丸脂肪量の変化を示すグラフ表示である。野生型FGF21(1kg当たり3mgずつ、毎日1回投与)は、STZマウスにおける脂肪組織の減少を低減し、変異体76(1kg当たり1または3mgずつ、毎週2回投与)は、STZマウスにおける脂肪組織によるケトン生成量の減少を低減した。 インスリン受容体に対する阻害性モノクローナル抗体の投与を介するインスリン受容体(INSR)の遮断は、過剰量のインスリン(100nM)の存在下で、分化させたヒト脂肪細胞による、インスリン依存性グルコース取込みを完全に遮断する(図8A)が;100nMのFGF21は、最大10nMの抗INSR Abの存在下で、グルコース取込みを促進することがなおも可能である(図8B)ことから、FGF21治療は、B型インスリン抵抗性(自己免疫性インスリン抵抗性)において有益であることが可能であり、この延長線上でまた、一般に欠損性の(すなわち、突然変異させた)インスリン受容体の存在下における、インスリン非依存性グルコース取込みも促進しうることを示す図である。 HIVプロテアーゼ阻害剤であるリトナビルによる処置の、マウスにおける、体重増加、体脂肪増加、および血漿トリグリセリドのそれぞれに対する影響を示す図である。 FGF21 v76を伴うかまたは伴わない、リトナビルの影響を、全ての場合に、疾患状態を誘導するように、リトナビルで51日間にわたりあらかじめ処置され、次いで、疾患状態を処置するように、FGF21およびリトナビルの両方で23日間にわたり処置されるマウスにおいて、以下のリードアウト:体重(図10A);および白色脂肪組織(WAT)重量(図10B)に従い、標準固形飼料を施され、PBSで処置される対照マウスと比較して示す図である。 FGF21 v76を伴うかまたは伴わない、リトナビルの影響を、全ての場合に、疾患状態を誘導するように、リトナビルで51日間にわたりあらかじめ処置され、次いで、疾患状態を処置するように、FGF21およびリトナビルの両方で23日間にわたり処置されるマウスにおいて、以下のリードアウト:血漿グルコース(経口糖負荷試験(OGTT)時の)(図10C);およびホメオスタシスモデルにより評価されたインスリン抵抗性(HOMA−IR)(図10D)に従い、標準固形飼料を施され、PBSで処置される対照マウスと比較して示す図である。 FGF21 v76を伴うかまたは伴わない、リトナビルの影響を、全ての場合に、疾患状態を誘導するように、リトナビルで51日間にわたりあらかじめ処置され、次いで、疾患状態を処置するように、FGF21およびリトナビルの両方で23日間にわたり処置されるマウスにおいて、以下のリードアウト:肝臓脂質含量(図10E)に従い、標準固形飼料を施され、PBSで処置される対照マウスと比較して示す図である。 マウスの飼料中の0.6% t10,c12共役リノール酸(t10,c12 CLA)の、脂肪体重量(下記でより詳細に説明される通り、リポジストロフィーを誘導すると考えられる)に対する効果のプロファイルを、標準固形飼料と対比して、時間の関数として示す図である。図11Bは、研究の終了時における前記効果を示す図である。 図12AおよびBは、「予防」モードまたは「処置」モード(本明細書で記載される用語)で投与されたFGF21(v101)、および処置モードで投与されたレプチンはいずれも、マウスの飼料中の0.6% t10,c12共役リノール酸(t10,c12 CLA)により誘導される、肝臓重量の増大(図12A)、および肝臓脂肪含量の増大(図12B)のそれぞれを反転することを示す図である。 図12CおよびDは、「予防」モードまたは「処置」モード(本明細書で記載される用語)で投与されたFGF21(v101)、および処置モードで投与されたレプチンはいずれも、マウスの飼料中の0.6% t10,c12共役リノール酸(t10,c12 CLA)により誘導される、高血糖症(図12C)、および高インスリン血症(図12D)のそれぞれを反転することを示す図である。 図12Eは、OGTTを使用して測定される通り、同じ条件下で、予防モードまたは処置モードで投与されたFGF21(v101)は、前記誘導された耐糖能異常を反転しうるが、処置モードで投与されたレプチンは、これを反転しえないことを示す図である。
本発明の方法は、1型糖尿病およびインスリン抵抗性と関連する代謝性疾患、例えば、インスリン受容体(IR)突然変異と関連する障害またはリポジストロフィーに罹患する対象のための、改善された治療的処置の発見に基づく。
表現型を変化させる、INSRの複数の不活化突然変異が記載されている。患者は、思春期において高血糖症へと進行するインスリンの作用に対する重度の抵抗性を提示することが典型的である。現行の標準治療は、対象が高血糖性となる場合に、極めて高量のインスリン投与を伴う処置であるが、これは、高血糖症をコントロールするのに不十分なことが典型的である。現行の処置が収めた成功は、限定的なものである。
FGF21ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらの変異体、融合体、および突然変異は、かねてより、肥満および2型糖尿病(T2D)に対する代謝効果があることが認識されていた。しかし、FGF21の、1型糖尿病(T1D)、インスリン受容体突然変異障害、およびリポジストロフィーに対する効果については、本発明の本方法が得られるまでは、裏付けは得られていなかった。本出願では、FGF21の、T1Dおよびインスリン受容体突然変異障害およびリポジストロフィーに対する効果について記載するが、特許請求される本発明の方法は、前記インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患、例えば、1型DM、B型インスリン抵抗性を含むインスリン受容体障害(INSR障害)、およびHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーの処置のために援用することができる。
本明細書においてさらに記載される通り、高用量ストレプトゾトシン(STZ)処置マウスは、高血糖症、インスリン減少症、過剰な脂質利用およびケトン生成のほか、過食症も呈する、1型糖尿病(T1D)の齧歯動物モデルとして一般に使用されている[STZとは、例えば、T1D様症状を伴うマウスモデルの創出において、ベータ細胞を破壊するように投与されるベータ細胞毒素である]。野生型FGF21の毎日1回投与、または半減期延長型FGF21の毎週2回投与による処置は、STZマウスにおける全般的な疾患状態を改善し、高血糖症の軽減、過剰な食物摂取、およびケトン体の蓄積、ならびに炭水化物利用量およびエネルギー消費量の増大をもたらすのに効果的であった。
変異体76による処置は、STZ処置動物におけるインスリン分泌を回復させなかった。FGF21は、インスリンの非存在下で、脂肪細胞内のグルコース取込みを誘導しうるという初期の観察にも拘らず、本発明者らは、in vivoにおけるこの効果を提起する最初のものであり、これらのSTZデータは、in vivoにおけるこの効果を確立し、FGF21処置が、T1D状況において働きうることを裏付ける最初のものである。したがって、野生型FGF21ポリペプチドおよびFGF21タンパク質、またはこれらの変異体、融合体、もしくは突然変異体の投与、T1Dの処置における治療的価値をもたらしうる。
インスリン分泌の増大の非存在下にあるSTZモデルにおいてFGF21の効果が裏付けられたために、本発明者らは、FGF21類似体を、INSR自体の機能不全により(INSR内の突然変異により、またはINSRに対する中和性自己抗体により)引き起こされる、インスリンシグナル伝達の機能障害による疾患を処置するのに使用しうることを提起する。しかし、INSR KOマウスは、生存不可能であり、生後死亡するので、ヒト状態と等価の動物モデルは、現行では存在しない。さらに、マウスにおけるインスリン受容体の組織特異的KOは、INSR内の突然変異またはINSRに対する自己抗体を伴うヒトにおいて見られる多様な疾患状態を完全に再現できていない。したがって、本発明者らは、インスリンによるグルコース取込みが、Ab(10nMのAb)により完全に遮断された条件下で、FGF21は、これらの細胞内の顕著なグルコース取込みをなおも促進しうることを示すために、抗ヒトINSR抗体を使用した。これらのデータは、突然変異により、または抗インスリン受容体抗体により引き起こされる、INSR内の欠損を伴う患者における、FGF21治療の新規の使用を支持する。
かねてより、FGF21類似体は、糖尿病性レプチン欠損性ob/obマウスにおける高血糖症、インスリン抵抗性、肥満、および脂質異常症を処置するのに使用しうることが確立されている(Kharitonenkov, A, et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115)。これらのマウスの共通の特性は、肝臓脂肪の顕著な蓄積である。これらの動物における肝臓脂肪は、FGF21処置により、急速かつ用量依存的に低減される。肝臓脂肪の顕著な増大はまた、先天性全身型リポジストロフィーまたは家族性部分型リポジストロフィー、後天性全身型リポジストロフィーまたは後天性部分型リポジストロフィー、HIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーおよび/または脂肪肥大症により引き起こされるインスリン抵抗性および関連する混合型脂質異常症、ならびにHAARTにより引き起こされる他の脂質代謝機能不全の種類とも関連する。本明細書では、本発明者らは、化学的に(c10−t12リノール酸およびHIVプロテアーゼ阻害剤であるリトナビルにより)誘導される2つのリポジストロフィーに対する新規の処置法であって、FGF21類似体を使用する処置法を示す。これらの例では、リポジストロフィーの誘導の正確な機構が異なり、したがって、これらのデータは、インスリン抵抗性および脂質異常症をもたらす、末梢脂肪の減少および肝臓脂肪の蓄積と関連する任意のリポジストロフィーの、FGF21類似体を使用する処置へと拡張されるはずである。
本発明の方法は、野生型FGF21ポリペプチドおよび野生型FGF21タンパク質、その融合体、および変異体、および突然変異体を含む。FGF21野生型配列は、NCBI参照配列番号をNP_061986.1とし、NCBI参照配列番号をNM_019113.2とするポリヌクレオチド配列によりコードされ、例えば、Chiron Corporationに移譲された米国特許第6,716,626B1号明細書などの交付済み特許において見出される。
成熟FGF21配列は、リーダー配列を欠き、また、アミノ末端(リーダー配列を伴うかまたは伴わない)および/またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、大型の前駆体からの小型のポリペプチドの切断、N結合型グリコシル化および/またはO結合型グリコシル化、ならびに当業者により理解される他の翻訳後修飾など、ポリペプチドの他の修飾も含みうる。
タンパク質発現の当業者は、大腸菌(E. coli)内の発現のために、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列を、FGF21タンパク質変異体のうちのいずれかのN末端に導入することができ、これは、本発明の方法の文脈内でも想定されることを認識するであろう。
「FGF21タンパク質変異体」、「ヒトFGF21変異体」、「FGF21ポリペプチドまたはFGF21タンパク質変異体」、「変異体」、「FGF21突然変異体」という用語、または任意の類似の用語は、自然発生の(すなわち、野生型の)FGF21アミノ酸配列が、修飾されている、例えば、野生型タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換され、かつ/または除去されているヒトFGF21を含むものとして定義される。加えて、変異体は、野生型FGF21タンパク質と比べたN末端切断型および/またはC末端切断型も含みうる。一般的に述べると、変異体は、野生型タンパク質の、一部の構造的または機能的な特性が改変されている。例えば、変異体は、濃縮溶液中の物理的安定性が増強または改善されている(例えば、疎水性に媒介される凝集度が小さい)場合もあり、血漿と共にインキュベートされたときの、血漿中の安定性が増強または改善されている場合もあり、好適な生体活性プロファイルを維持しながら、生体活性が増強または改善されている場合もある。
本発明の方法によるFGF21ポリペプチドおよびFGF21タンパク質の変異体および突然変異体と、野生型FGF21との差違を構成する、許容可能なアミノ酸置換およびアミノ酸修飾は、非自然発生のアミノ酸類似体による置換を含む、1または複数のアミノ酸置換、および切断を含むがこれらに限定されない。したがって、FGF21タンパク質変異体は、本明細書で記載される、部位指向性FGF21突然変異体、切断型FGF21ポリペプチド、タンパク質分解抵抗型FGF21突然変異体、凝集低減型FGF21突然変異体、FGF21の組合せによる突然変異体、およびFGF21融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。
変異体は、医薬保存剤(例えば、m−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール)との適合性を増大させており、これにより、保存時におけるタンパク質の物理化学的特性および生体活性を維持する、保存用医薬製剤の調製を可能とする場合もある。したがって、医薬としての安定性を、野生型FGF21と比べて増強した変異体は、生理学的条件下および保存用医薬製剤条件下のいずれにおいても、生物学的効力を維持しながら、濃縮溶液中の物理的安定性が改善されている。非限定的な例を目的として述べると、本発明の変異体は、タンパク質分解および酵素的分解に対する抵抗性が大きい可能性があり、安定性が改善されている可能性があり、それらの野生型対応物より凝集しにくい可能性がある。本明細書で使用されるこれらの用語は、相互に除外的または限定的なものではなく、所与の変異体では、野生型タンパク質の1または複数の特性が改変されていることが完全に可能である。
定義
本文書を通して、多様な定義が使用される。大半の語は、当業者によりこれらの語に帰せられる意味を有する。下記で、または本文書の別の個所で具体的に定義される語は、全体としての本発明の文脈で与えられ、当業者により典型的に理解される意味を有する。
本明細書で使用される「FGF21」という用語は、線維芽細胞増殖因子(FGF)タンパク質ファミリーのメンバーを指し、GenBank受託番号を、NP_061986.1とし(その対応するポリヌクレオチド配列は、NCBI参照配列番号を、NM_019113.2とする)、例えば、Chiron Corporationに移譲されている、米国特許第6,716,626B1号明細書など、交付済み特許において見出すことができる。
本明細書で使用される「FGF21受容体」という用語は、FGF21の受容体(Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,H, et al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Y, et al. (2007) PNAS 104:7432-7437)を指す。
「FGF21ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現する自然発生のポリペプチドを指す。本開示の目的では、「FGF21ポリペプチド」という用語は、任意の全長FGF21ポリペプチドであって、209アミノ酸残基からなり、そのポリペプチドの任意の成熟形態が、181アミノ酸残基からなり、全長FGF21ポリペプチドのアミノ末端における28アミノ酸残基(すなわち、シグナルペプチドを構成する)が除去されているポリペプチド、およびその変異体を指すように、互換的に使用することができる。
「単離核酸分子」という用語は、本発明の核酸分子であって、(1)全核酸を供給源細胞から単離する場合に、それと共に天然で見出される、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質のうちの少なくとも約50パーセントから分離されているか、(2)「単離核酸分子」が天然で連結されているポリヌクレオチドの全部または一部に連結されていないか、(3)天然では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、または(4)天然では、大型のポリヌクレオチド配列の一部として生じない核酸分子を指す。本発明の単離核酸分子は、その天然環境で見出される、他の任意の夾雑核酸分子または他の夾雑物質であって、ポリペプチドの作製におけるその使用、またはその治療的使用、診断的使用、予防的使用、もしくは研究的使用に干渉する、夾雑核酸分子または夾雑物質を実質的に含まないことが好ましい。
「単離ポリペプチド」という用語は、供給源細胞から単離する場合に、それと共に天然で見出される、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、または他の物質のうちの少なくとも約50パーセントから分離されているポリペプチド(例えば、本明細書で提示される、FGF21ポリペプチドまたは変異体FGF21ポリペプチド)を指す。単離ポリペプチドは、その天然環境で見出される、他の任意の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物質であって、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する、夾雑ポリペプチドまたは夾雑物質を実質的に含まないことが好ましい。
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に導入するのに使用される、任意の分子(例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス)を指すのに使用される。
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適し、挿入される異種核酸配列の発現を方向付け、かつ/または制御する核酸配列を含有するベクターを指す。発現は、転写、翻訳、および、イントロンが存在する場合は、RNAスプライシングなどの過程を含むがこれらに限定されない。
本明細書では、「作動可能に連結された」という用語は、フランキング配列の配置を指すのに使用され、この場合、そのように記載されるフランキング配列とは、それらの通例の機能を果たすように、構成またはアセンブルされている。したがって、コード配列に作動可能に連結されたフランキング配列は、コード配列の複製、転写、および/または翻訳を実現することが可能でありうる。例えば、プロモーターが、そのコード配列の転写を方向付けることが可能である場合、コード配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。フランキング配列は、それが適正に機能する限りにおいて、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、プロモーター配列とコード配列との間には、翻訳されないが転写される介在配列が存在する場合もあるが、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結され」ているとなおも考えることができる。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されているか、または核酸配列で形質転換され、次いで、選択される目的の遺伝子を発現させることが可能な細胞を指すのに使用される。用語は、後代が、形態または遺伝子組成において、元の親細胞と同一であれ、同一でないのであれ、選択される遺伝子が存在する限りにおいて、親細胞の後代を含む。
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸、自然発生のアミノ酸と類似の様式で機能する非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣体であって、それらの構造がそのような立体異性形態を可能とする場合には全てD立体異性体およびL立体異性体である非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣体を指す。本明細書では、アミノ酸に、それらの名称で、それらの一般に公知の3文字記号で、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字記号で言及する。
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生体物質との関連で使用される場合の「自然発生の」という用語は、天然で見出され、人為によりされていない物質を指す。同様に、本明細書で使用される「非自然発生の」とは、天然で見出されないか、または人為により構造的に修飾されているか、もしくは合成されている物質を指す。ヌクレオチドとの関連で使用される場合、「自然発生の」という用語は、塩基である、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)を指す。アミノ酸との関連で使用される場合、「自然発生の」という用語は、従来の20のアミノ酸(すなわち、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リシン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、およびチロシン(Y))のほか、セレノシステイン、ピロリシン(PYL)、およびピロリン−カルボキシ−リシン(PCL)を指す。
ピロリシン(PYL)とは、メタノサルキナ(Methanosarcina)属のメタン生成古細菌のメチルアミンメチルトランスフェラーゼ内において天然で見出されたアミノ酸である。ピロリシンとは、それぞれのmRNA内の、インフレームのUAGコドンに共翻訳的に組み込まれるリシン類似体であり、22番目の天然アミノ酸と考えられている。
少なくとも、PCT国際特許公開第2010/48582号パンフレット(出願者:IRM,LLC)において記載されている通り、大腸菌(E. coli)内でピロリシン(PYL)を生合成しようとする試みは、本明細書ではピロリン−カルボキシ−リシンまたはPCLと称する、「脱メチル化ピロリシン」の形成を結果としてもたらす。本明細書で使用される「PCL」とは、PCL−AまたはPCL−Bを指す。
本明細書で使用される「非天然(non-natural)アミノ酸」および「非天然(unnatural)アミノ酸」という用語は、同じ生物であれ、異なる生物であれ、任意の生物に由来する非修飾遺伝子または修飾遺伝子を使用する、任意の生物における生合成では作り出すことのできないアミノ酸構造を互換的に表すように意図する。用語は、自然発生(野生型)のFGF21タンパク質配列中にも、本発明のFGF21変異体の配列中にも存在しないアミノ酸残基を指す。これらは、自然発生の20のアミノ酸、セレノシステイン、ピロリシン(PYL)、もしくはピロリン−カルボキシ−リシン(PCL)のうちの1つではない、修飾アミノ酸および/またはアミノ酸類似体を含むがこれらに限定されない。このような非天然アミノ酸残基は、自然発生のアミノ酸の置換により導入することもでき、かつ/または非天然アミノ酸の、自然発生(野生型)のFGF21タンパク質配列もしくは本発明のFGF21変異体の配列への挿入により導入することもできる。非天然アミノ酸残基はまた、所望の機能性、例えば、機能的部分(例えば、PEG)を連結する能力を、FGF21分子に付与するように組み込むこともできる。
加えて、このような「非天然アミノ酸」とは、タンパク質への組込みのために、修飾tRNAおよび修飾tRNAシンターゼ(RS)を要請することが理解される。これらの「選択された」直交tRNA/RS対は、Schultz et al.により開発された選択過程またはランダム突然変異もしくはターゲティング突然変異により作り出す。例として述べると、ピロリン−カルボキシ−リシンは、1つの生物から宿主細胞に導入される遺伝子を介して、生合成により作り出され、天然のtRNAおよびtRNAシンターゼ遺伝子を使用することによりタンパク質に組み込まれるので、「天然アミノ酸」であるのに対し、p−アミノフェニルアラニン(Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9を参照されたい)は、生合成により作り出されるが、「選択された」直交tRNA/tRNAシンターゼ対によりタンパク質に組み込まれるため、「非天然アミノ酸」である。
修飾コードアミノ酸は、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、O−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、2−アミノアジピン酸、3−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、2−アミノ酪酸、4−アミノ酪酸、6−アミノカプロン酸、2−アミノヘプタン酸、2−アミノイソ酪酸、3−アミノイソ酪酸、2−アミノピメリン酸、三級ブチルグリシン、2,4−ジアミノイソ酪酸、デモシン、2,2’−ジアミノピメリン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸、N−エチルグリシン、N−メチルグリシン、N−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、allo−ヒドロキシリシン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン、イソデモシン、allo−イソロイシン、N−メチルアラニン、N−メチルグリシン、N−メチルイソロイシン、N−メチルペンチルグリシン、N−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンを含むがこれらに限定されない。「アミノ酸」という用語はまた、ある特定の生物における代謝物であるが、タンパク質への組込みのための遺伝子コードによりコードされない自然発生のアミノ酸も含む。このようなアミノ酸は、オルニチン、D−オルニチン、およびD−アルギニンを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「アミノ酸類似体」という用語は、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、例だけを目的として述べると、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合するα−炭素を指す。アミノ酸類似体は、可逆的もしくは不可逆的に化学保護されるか、またはそれらのC末端カルボキシ基、それらのN末端アミノ基、および/もしくはそれらの側鎖官能基が化学修飾された天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。このような類似体は、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、S−(カルボキシメチル)−システイン、S−(カルボキシメチル)−システインスルホキシド、S−(カルボキシメチル)−システインスルホン、アスパラギン酸−(ベータ−メチルエステル)、N−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「アミノ酸模倣体」という用語は、アミノ酸の一般的化学構造と異なるが、自然発生のアミノ酸と類似の様式で機能する構造を有する化合物を指す。
「生物学的に活性のFGF21変異体」という用語は、本明細書で記載される任意のFGF21ポリペプチド変異体であって、FGF21ポリペプチド変異体に導入された修飾の種類または数に関わらず、血中グルコース、血中インスリン、血中トリグリセリド、または血中コレステロールを低下させる能力;体重を低減する能力;および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を改善する能力など、野生型FGF21ポリペプチドの活性を保有する変異体を指す。しかしながら、野生型FGF21ポリペプチドと比べて、レベルをある程度低下させたFGF21活性を保有するFGF21ポリペプチド変異体も、生物学的に活性のFGF21ポリペプチド変異体と考えることができる。
「有効量」および「治療有効量」という用語は各々、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロールレベルを低下させる能力;肝臓トリグリセリドレベルまたは脂質レベルを低減する能力;体重を低減する能力;または耐糖能、エネルギー消費量、もしくはインスリン感受性を改善する能力など、観察可能なレベルの、野生型FGF21ポリペプチドの1または複数の生体活性を裏付けるのに使用される、FGF21タンパク質変異体の量を指す。例えば、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患(1型糖尿病もしくは2型糖尿病、肥満、またはメタボリック症候群など)を呈するか、患うか、または患う傾向がある患者に投与される「治療有効量」とは、病理学的症状、疾患の進行、関連する生理学的状態、または前述の障害に陥ることに対する抵抗性の向上を誘導するか、改善するか、またはそうでなければ引き起こすような量である。本発明の目的では、「対象」または「患者」とは、好ましくは、ヒトであるが、また、動物、より具体的には、愛玩動物(例えば、イヌ、ネコなど)、農場動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど)、および実験動物(例えば、ラット、マウス、モルモットなど)でもありうる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、FGF21タンパク質、融合、または変異体の送達を達成するかまたは増強するのに適する、1または複数の製剤材料を指す。
「抗原」という用語は、抗体が結合することが可能であり、加えて、その抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を産生する動物において使用することも可能な分子または分子の一部を指す。抗原は、1または複数のエピトープを有しうる。
「天然Fc」という用語は、単量体形態であれ、多量体形態であれ、全抗体の消化から生じるか、または他の手段により産生される、非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指し、ヒンジ領域を含有しうる。天然Fcの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくは、ヒト由来であり、免疫グロブリンのうちのいずれでもありうるが、IgG1およびIgG2が好ましい。天然Fc分子は、共有結合的会合(すなわち、ジスルフィド結合)および非共有結合的会合により、二量体形態または多量体形態に連結されうる単量体ポリペプチドから構成される。天然Fc分子の単量体サブユニットの間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス(例えば、IgG、IgA、およびIgE)またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、およびIgGA2)に応じて、1〜4の範囲である。天然Fcの一例は、IgGのパパイン消化から生じる、ジスルフィド結合による二量体である(Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9を参照されたい)。本明細書で使用される「天然Fc」という用語は、単量体形態、二量体形態、および多量体形態に総称的である。「Fc変異体」という用語は、天然Fcから修飾されているが、なおも、サルベージ受容体である、FcRn(胎児性Fc受容体)に対する結合性部位を含む分子または配列を指す。国際公開第97/34631号パンフレットおよび国際公開第96/32478号パンフレットは、例示的なFc変異体のほか、サルベージ受容体との相互作用についても記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、「Fc変異体」という用語は、非ヒト天然Fcからヒト化された分子または配列を含みうる。さらに、天然Fcは、それらが、本発明のFGF21突然変異体の融合分子に要請されない構造的特徴または生体活性を提示するため、除去しうる領域を含む。したがって、「Fc変異体」という用語は、(1)ジスルフィド結合の形成、(2)選択された宿主細胞との不適合性、(3)選択された宿主細胞内で発現させたときのN末端の不均一性、(4)グリコシル化、(5)補体との相互作用、(6)サルベージ受容体以外のFc受容体への結合、または(7)抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)に影響を及ぼすか、もしくはこれらに関与する、1もしくは複数の天然Fc部位もしくは天然Fc残基を欠く分子もしくは配列、またはこれらに影響を及ぼすか、もしくはこれらに関与する1もしくは複数のFc部位もしくはFc残基が修飾されている分子もしくは配列を含む。Fc変異体については、本明細書の以下においてさらに詳細に記載する。
「Fcドメイン」という用語は、天然FcおよびFc変異体、ならびに上記で規定された配列を包含する。Fc変異体分子および天然Fc分子と同様に、「Fcドメイン」という用語は、全抗体から消化されたのであれ、他の手段で産生されたのであれ、単量体形態または多量体形態の分子を含む。本発明の一部の実施形態では、Fcドメインは、例えば、FcドメインとFGF21配列と共有結合を介して、FGF21またはFGF21突然変異体(FGF21またはFGF21突然変異体の切断形態を含む)に融合することができる。このような融合タンパク質は、Fcドメインの会合を介して多量体を形成することが可能であり、これらの融合タンパク質およびそれらの多量体のいずれも、本発明の態様である。
「ポリエチレングリコール」または「PEG」という用語は、カップリング剤またはカップリング部分もしくは活性化部分による誘導体化を伴うかまたは伴わない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を指す。
「インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患」という用語、および本明細書で同様に使用される用語は、1型糖尿病、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)、混合型脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、インスリン抵抗性、およびリポジストロフィーを含むがこれらに限定されない。
「インスリン受容体障害(INSR障害)」、「インスリン受容体内の重度の不活化突然変異と関連する障害」、「インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患」という用語、および本明細書で同様に使用される用語は、重度のインスリン抵抗性を引き起こすが、2型糖尿病に一般的な肥満を伴わずに見られることが多い、インスリン受容体(または、おそらく、そのすぐ下流のタンパク質、例えば、IRS1およびIRS2)内の突然変異に罹患する対象における状態について記載する。これらに罹患する対象は、おおまかに重症度の昇順で、A型インスリン抵抗性、C型インスリン抵抗性(HAIR−AN症候群としてもまた公知である)、ラブソン−メンデンホール症候群、および、最重症のドナヒュー症候群またはレプレコーニズムを含む複数の類型へと分けられる。B型インスリン抵抗性はまた、「インスリン受容体障害」という一般的用語にも含まれ、不活化突然変異ではなく、これと対比される、インスリン受容体に対する中和性自己抗体により引き起こされることを除き、本明細書において概観されるインスリン抵抗性の遺伝形態と類似の表現型を有する。
これらの障害は、極めて高い内因性インスリンレベルと関連し、高血糖症と関連することが極めて多い。これらに罹患する対象はまた、高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS:インスリン受容体突然変異の発生率の増大を特徴とする)、多毛症、および皮膚のひだにおける黒色表皮症(過剰な増殖および色素沈着)を含む「インスリン毒性」と関連する、多様な臨床特徴も提示する。
「2型糖尿病」とは、インスリンのアベイラビリティーに反する、過剰なグルコース産生量を特徴とする状態であり、グルコースクリアランス(インスリン作用)が不十分な結果として、循環グルコースレベルが、過剰な高レベルを維持する。
「1型糖尿病」とは、インスリンの完全な欠如により引き起こされる、高血中グルコースレベルを特徴とする状態である。これは、体内の免疫系が、膵臓内のインスリン産生ベータ細胞を攻撃し、それらを破壊する場合に生じる。このため、膵臓は、インスリンをほとんど産生しないか、または全く産生しない。また、膵臓摘出または膵疾患も、インスリン産生ベータ細胞の減少をもたらす。
「脂質異常症」とは、リポタンパク質の過剰産生または欠損を含む、リポタンパク質代謝の障害である。脂質異常症は、血中の総コレステロール濃度、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール濃度、およびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに高密度リポタンパク質(HDL)コレステロール濃度の低下により顕在化しうる。
「耐糖能異常」または耐糖能障害(IGT)とは、心血管病態の危険性の増大と関連する、前糖尿病性の血糖異常状態である。前糖尿病性状態は、対象が、グルコースを、細胞へと効率的に送り込み、効率的な燃料供給源として活用することを妨げ、血中グルコースレベルの上昇と、何らかの程度のインスリン抵抗性をもたらす。
「HAART」(Highly Active Anti−Retroviral Therapy)は、HIV感染を伴う患者を処置するのに使用される。
「HIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィー」とは、インスリン抵抗性、脂質異常症、リポジストロフィー、HAARTで処置されたHIV患者における心血管疾患の危険性の増大に寄与する、内臓脂肪症の増大を特徴とする、代謝調節異常および体脂肪蓄積の変化を含む有害作用である。
「高血糖症」とは、血中の糖(グルコース)の過剰として定義される。
低血糖ともまた呼ばれる「低血糖症」は、血中グルコースレベルが、正常な身体機能を維持するのに十分なエネルギーを供給するには余りに低く降下する場合に生じる。
「高インスリン血症」とは、血中インスリンレベルが、正常レベルより高い状態として定義される。
「インスリン抵抗性」とは、正常量のインスリンにより、正常未満の生物学的応答がもたらされる状態として定義される。
ヒト成人対象に関する「肥満」とは、30kg/mを超える体格指数(BMI)として定義することができる。
「メタボリック症候群」とは、以下の徴候:腹部脂肪(男性:腰回りが40インチを超え、女性:腰回りが35インチを超える);空腹時高血糖(1デシリットル当たり少なくとも100ミリグラム(mg/dL));高トリグリセリド(血流中に少なくとも150mg/dL;低HDL(男性で40mg/dL未満であり、女性で50mg/dL未満である;および130/85mmHgまたはこれを超える血圧のうちの少なくとも3つによるクラスターとして定義することができる。
「高血圧症」または高血圧とは、全身動脈血圧の、心血管損傷または他の有害な帰結を誘導する可能性が高いレベルへの一過性または持続性の上昇である。高血圧症は、任意に、140mmHgを上回る収縮期血圧または90mmHgを上回る拡張期血圧として定義されている。
「心血管疾患」とは、心臓または血管と関連する疾患である。
「アテローム性動脈硬化」とは、大サイズの動脈および中サイズの動脈の内膜内のプラークと呼ばれる、不規則に分布した脂質沈着であって、動脈内腔の狭窄を引き起こし、線維症および石灰化へと進行しうる脂質沈着を特徴とする血管疾患である。病変は通例、限局性であり、緩徐かつ間欠的に進行する。場合によって、プラークの破裂が生じ、血流の閉塞をもたらし、閉塞に対して遠位の組織の死滅を結果としてもたらす。血流の制限は、大半の臨床症状の原因となり、臨床症状は、閉塞の分布および重症度と共に変化する。
「脳卒中」とは、24時間を超えて続く、大脳循環の機能障害と関連する、任意の急性臨床事象である。脳卒中は、不可逆性の脳損傷を伴い、症状の種類および重症度は、その循環が損なわれた脳組織の位置および広がりに依存する。
うっ血性心不全ともまた呼ばれる「心不全」とは、心臓が、体内の他の部分へと、要求を満たすのに十分な血液を、もはや駆出できない状態である。
冠動脈疾患ともまた呼ばれる「冠動脈性心疾患」とは、血液および酸素を心臓に供給する小血管の狭窄を引き起こしうる、冠動脈内のアテローム性動脈硬化性病変またはアテローム性動脈硬化性プラークを指す。
「腎疾患」または腎症とは、腎臓の任意の疾患である。糖尿病性腎症は、1型糖尿病患者または2型糖尿病患者における罹患率および死亡率の主要な原因である。
「糖尿病性合併症」とは、高血中グルコースレベルにより引き起こされる問題であって、腎臓、神経(神経障害)、脚部(脚部潰瘍および循環の低下)および眼(例えば、網膜症)など、他の身体機能に関する問題である。糖尿病はまた、心疾患ならびに骨関節障害に対する危険性も増大させる。糖尿病の、他の長期にわたる合併症は、皮膚問題、消化器問題、性機能不全、ならびに歯牙および歯茎に関する問題を含む。
「神経障害」とは、頭蓋神経または末梢神経系または自律神経系に関与する任意の疾患である。
「胃不全麻痺」とは、胃内容排出の遅延を結果としてもたらす、胃の蠕動の減退である。
本明細書で使用される、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、内容により、そうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、複数形の指示物を含む。したがって、例えば、「抗体」に対する言及は、2つまたはこれを超えるこのような抗体の混合物を含む。
本明細書で使用される「約」という用語は、値の±20%、±10%、または±5%を指す。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態であって、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたアミノ酸、または誘導体化されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含みうるポリマー形態を指す。用語は、融合タンパク質、を含むがこれらに限定されない、異種アミノ酸配列との融合タンパク質;N末端メチオニン残基を伴うかまたは伴わない、異種リーダー配列および同種リーダー配列との融合体;免疫的にタグ付けされたタンパク質などを含む。
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望される任意の対象、特に、ヒトを指す。他の対象は、畜牛、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含みうる。一部の好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で使用される「試料」という用語は、患者に由来する生体物質を指す。本発明でアッセイされる試料は、いかなる特定の種類にも限定されない。試料は、非限定的な例として、単一の細胞、複数の細胞、組織、腫瘍、体液、生物学的分子、または前出のうちのいずれかの上清もしくは抽出物を含む。例は、生検のために摘出される組織、切除時に摘出される組織試料、血液試料、尿試料、リンパ組織試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、粘液試料、および糞便試料を含む。使用される試料は、アッセイフォーマット、検出法、およびアッセイされる腫瘍、組織、細胞、または抽出物の性質に基づき変化するであろう。当技術分野では、試料を調製するための方法が周知であり、活用される方法に適合する試料を得るために、たやすく適合させることができる。
本明細書で使用される「生物学的分子」という用語は、ポリペプチド、核酸、および糖類を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「〜をモジュレートすること」という用語は、遺伝子、タンパク質、または細胞の内部、外部、または表面上に存在する任意の分子の質または量の変化を指す。変化は、分子の発現またはレベルの増大または減少でありうる。「〜をモジュレートする」という用語はまた、限定なしに述べると、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロールレベルを低下させる能力;肝臓脂質レベルまたは肝臓トリグリセリドレベルを低減する能力;体重を低減する能力;および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を改善する能力を含む生物学的機能/活性の質または量を変化させることも含む。
本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、1型糖尿病など、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患、または肥満などの代謝の状態と関連する1または複数の生理学的事象または生化学的事象をモジュレートする組成物を指す。前記事象は、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロールレベルを低下させる能力;肝臓脂質レベルまたは肝臓トリグリセリドレベルを低減する能力;体重を低減する能力;および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を改善する能力を含むがこれらに限定されない。
「遺伝子産物」とは、遺伝子を介して発現するかまたは産生される生体ポリマー産物である。遺伝子産物は、例えば、スプライシングされていないRNA、mRNA、スプライス変異体mRNA、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライス変異体ポリペプチドなどでありうる。この用語にはまた、RNA遺伝子産物を鋳型として使用して作り出される生体ポリマー産物(すなわち、RNAのcDNA)も包含される。遺伝子産物は、酵素的に、組換えにより、化学的に、または遺伝子が天然である細胞内で作製することができる。一部の実施形態では、遺伝子産物がタンパク質性である場合、それは、生体活性を呈する。一部の実施形態では、遺伝子産物が核酸である場合、それは、生体活性を呈するタンパク質性遺伝子産物へと翻訳することができる。
本明細書で使用される「FGF21活性のモジュレーション」とは、FGF21活性の増大または減少であって、例えば、薬剤の、FGF21ポリヌクレオチドまたはFGF21ポリペプチドとの相互作用、FGF21の転写および/または翻訳の阻害(例えば、アンチセンスRNAまたはsiRNAの、FGF21遺伝子またはFGF21転写物との相互作用を介して、FGF21の発現を促進する転写因子のモジュレーションを介して)などの結果でありうる増大または減少を指す。例えば、生体活性のモジュレーションは、生体活性の増大または減少を指す。FGF21活性は、限定なしに述べると、対象における血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロールレベルをアッセイすること、FGF21のポリペプチドレベルを評価すること、またはFGF21の転写レベルを評価することを含む手段により評価することができる。FGF21活性の比較はまた、例えば、FGF21下流のバイオマーカーレベルを測定し、FGF21シグナル伝達の増大を測定することによっても達成することができる。FGF21活性はまた、細胞シグナル伝達;キナーゼ活性;脂肪細胞へのグルコース取込み;血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、もしくは血中コレステロールレベルの変動;肝臓脂質レベルもしくは肝臓トリグリセリドレベルの変化;FGF21とFGF21受容体との間の相互作用;またはFGF21受容体のリン酸化を測定することによっても評価することができる。一部の実施形態では、FGF21受容体のリン酸化は、チロシンのリン酸化でありうる。一部の実施形態では、FGF21活性のモジュレーションは、FGF21に関連する表現型のモジュレーションを引き起こしうる。
本明細書で使用される「FGF21下流のバイオマーカー」とは、遺伝子もしくは遺伝子産物、または遺伝子もしくは遺伝子産物の測定可能な指標である。一部の実施形態では、FGF21の下流のマーカーである遺伝子または活性は、血管組織内で、発現レベルの変化を呈する。一部の実施形態では、下流マーカーの活性は、FGF21モジュレーターの存在下で変化する。一部の実施形態では、下流マーカーは、FGF21が、本発明のFGF21モジュレーターにより攪乱されると、発現レベルの変化を呈する。FGF21下流マーカーは、限定なしに述べると、グルコースまたは2−デオキシ−グルコースの取込み、pERKレベルおよび他のリン酸化タンパク質レベルもしくはアセチル化タンパク質タンパク質レベルまたはNADレベルを含む。
本明細書で使用される「〜を上方調節する」という用語は、活性または量の増大、活性化、または刺激を指す。例えば、本発明の文脈では、FGF21モジュレーターは、FGF21受容体の活性を増大させうる。一実施形態では、FGFR−1c、FGFR−2c、FGFR−3c、またはB−クロトーのうちの1または複数は、FGF21モジュレーターに応答して上方調節されうる。上方調節とはまた、例えば、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロールレベルを低下させる能力;肝臓脂質レベルまたは肝臓トリグリセリドレベルを低減する能力;体重を低減する能力;耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を改善する能力;またはFGF21受容体のリン酸化を引き起こす能力;またはFGF21下流マーカーを増大させる能力など、FGF21に関連する活性も指す。FGFR21受容体は、FGFR−1c、FGFR−2c、FGFR−3c、またはB−クロトーのうちの1または複数でありうる。上方調節は、対照と比較して、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも400%、または少なくとも500%でありうる。
本明細書で使用される「N末端」という用語は、タンパク質の少なくとも最初の10アミノ酸を指す。
本明細書で使用される「N末端ドメイン」および「N末端領域」という用語は、互換的に使用され、タンパク質の最初のアミノ酸で始まり、タンパク質のN末端側の任意のアミノ酸で終わる、タンパク質の断片を指す。例えば、FGF21のN末端ドメインは、野生型FGF21のアミノ酸1〜野生型FGF21のアミノ酸約10〜105の間の任意のアミノ酸である。
本明細書で使用される「C末端」という用語は、タンパク質の少なくとも最後の10アミノ酸を指す。
本明細書で使用される「C末端ドメイン」および「C末端領域」という用語は、互換的に使用され、タンパク質のC末端側の任意のアミノ酸で始まり、タンパク質の最後のアミノ酸で終わる、タンパク質の断片を指す。例えば、FGF21のC末端ドメインは、野生型FGF21のアミノ酸105〜アミノ酸約200の任意のアミノ酸で始まり、野生型FGF21のアミノ酸209で終わる。
本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、生体分子の公知の機能または生体分子に推測される機能に寄与する、生体分子の構造的部分を指す。ドメインは、その領域または部分と同一の広がりを示しうるが、また、その領域の全部または一部に加えて、特定の領域と顕著に異なる、生体分子の一部も組み込む場合がある。
本明細書で使用される「シグナルドメイン」という用語(「シグナル配列」または「シグナルペプチド」ともまた呼ばれる)は、前駆体タンパク質(膜結合型タンパク質または分泌型タンパク質であることが多い)のN末端領域におけるアミノ酸配列の連続的連なりの中に存在し、翻訳後タンパク質の輸送に関与するペプチドドメインを指す。多くの場合、シグナルドメインは、分取工程が完了した後で、特化したシグナルペプチダーゼにより、全長タンパク質から除去される。各シグナルドメインは、前駆体タンパク質について、細胞内の特定の輸送先を指定する。FGF21のシグナルドメインは、アミノ酸1〜28である。
本明細書で使用される「受容体結合性ドメイン」という用語は、膜結合型受容体タンパク質に接触する結果として、シグナル伝達イベントなどの細胞応答をもたらす、タンパク質の任意の部分または領域を指す。
本明細書で使用される「リガンド結合性ドメイン」という用語は、FGF21の対応する天然配列の、少なくとも1つの定性的結合活性を保持するタンパク質の任意の部分または領域を指す。
「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的連続部分を指す。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分により規定される。一部の実施形態では、「領域」は、生体分子の機能と関連する。
本明細書で使用される「断片」という用語は、生体分子の一次構造の物理的連続部分を指す。タンパク質の場合、部分は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分により規定され、少なくとも3〜5アミノ酸、少なくとも8〜10アミノ酸、少なくとも11〜15アミノ酸、少なくとも17〜24アミノ酸、少なくとも25〜30アミノ酸、および少なくとも30〜45アミノ酸を指す。オリゴヌクレオチドの場合、部分は、そのオリゴヌクレオチドの核酸配列の連続部分により規定され、少なくとも9〜15ヌクレオチド、少なくとも18〜30ヌクレオチド、少なくとも33〜45ヌクレオチド、少なくとも48〜72ヌクレオチド、少なくとも75〜90ヌクレオチド、および少なくとも90〜130ヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、生体分子の部分は、生体活性を有する。
「天然配列」のポリペプチドとは、自然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然配列のポリペプチドは、自然から単離することもでき、組換え手段または合成手段により作製することもできる。したがって、天然配列のポリペプチドは、自然発生のヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または他の任意の哺乳動物種に由来するポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
本明細書で使用される「〜を混合すること」という用語は、1または複数の化合物、細胞、分子などを、同じ領域内で一体に組み合わせる工程を指す。これは、例えば、1または複数の化合物、細胞、または分子の混合を可能とする、試験管内、ペトリディッシュ内、または任意の容器内で実施することができる。
本明細書で使用される「実質的に精製された」という用語は、その天然環境から取り出され、それが天然で会合する他の成分を、少なくとも60%含まず、少なくとも75%含まず、少なくとも90%含まない化合物(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体)を指す。
「薬学的に許容される担体」という用語は、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤などの治療剤を投与するための担体を指す。用語は、それ自体では組成物を施される個体に有害な抗体の産生を誘導せず、不要な毒性を伴わずに投与されうる、任意の医薬担体を指す。適切な担体は、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸のコポリマー、脂質凝集物、および不活性のウイルス粒子など、大型で代謝が緩徐な高分子でありうる。当業者には、このような担体が周知である。治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩液、グリセロール、およびエタノールなどの液体を含みうる。また、保湿剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質も、このような媒体中に存在させることができる。
システイン残基によりもたらされる、自然発生のジスルフィド結合は一般に、タンパク質の熱力学的安定性を増大させる。融点の上昇により測定される、熱力学的安定性の増大の成功例は、酵素である、T4リゾチーム(Matsumura, et al., PNAS 86:6562-6566 (1989))およびバルナーゼ(Johnson et al., J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997))の、複数のジスルフィド結合を施した突然変異体である。本発明のある態様は、保存剤の存在下における、FGF21の物理的安定性の増強であって、変異体内のジスルフィド結合であり、野生型FGF21の可撓性を制約し、これにより、保存剤の、タンパク質の疎水性コアへの接近を制限する、ジスルフィド結合の存在により達成される増強である。
本発明は、例えば、システイン残基を、野生型FGF21タンパク質または本発明のポリペプチド変異体およびタンパク質変異体に組み込むか、またはこれらにシステイン残基の置換を施すことを介してさらなるジスルフィド結合を組み込むことにより作り出される、医薬としての安定性を増強した、野生型ヒトFGF21の変異体もしくは突然変異体、またはその生物学的に活性のペプチドを含む処置法を提供する。当業者は、本明細書において記載され、示唆される実施形態、および文献中で示唆される実施形態に加えて、天然システインである、システイン103およびシステイン121を、特性の改善を付与しうる新規のジスルフィド結合を導入する遺伝子座として活用しうることを認識するであろう。
本発明の方法は、一般に意図される目的:2型糖尿病、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、ならびに家族性部分型リポジストロフィーおよびHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーを含む部分型リポジストロフィーの多様な形態のほか、インスリン産生と関連する疾患(すなわち、1型糖尿病)など、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患の処置を達成する任意の手段により投与されうる医薬組成物を含む。本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内注射および注入、筋内注射および注入、腹腔内注射および注入、胸骨下注射および注入、皮下注射および注入、ならびに関節内注射および注入を含む投与方式を指す。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、施される場合は、併用処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存するであろう。FGF21ポリペプチドもしくはFGF21タンパク質、またはその融合体、突然変異体、もしくは変異体が、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患の処置のために、所望の医学的効果を達成するのに有効な量で存在する、全ての組成物が含まれる。個別の必要は、患者によって変化するが、全ての成分の有効量の最適範囲の決定は、臨床従事者学分野の当業者の能力の範囲内にある。
本発明の方法を構成するFGF21の変異体は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法に従い製剤化することができる。所望の製剤は、任意選択の、薬学的に許容される担体、保存剤、賦形剤、または安定化剤を伴う、高純度の適切な希釈剤または水溶液で再構成される、安定的な凍結乾燥生成物である製剤であろう[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]。許容可能な安定性と、投与に許容可能なpHとをもたらすように、本発明の変異体を、薬学的に許容される緩衝液と組み合わせ、pH調整することができる。
一実施形態では、非経口投与のために、FGF21変異体を、一般に、それらのうちの1または複数を、注射用単位剤形(溶液、懸濁液、またはエマルジョン)中に、所望の純度で、薬学的に許容される担体、すなわち、援用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性である担体と混合することにより製剤化する。1または複数の薬学的に許容される抗微生物剤を添加しうることが好ましい。フェノール、m−クレゾール、およびベンジルアルコールは、好ましい、薬学的に許容される抗微生物剤である。
任意選択で、1または複数の薬学的に許容される塩を添加して、イオン強度または張性を調整することができる。1または複数の賦形剤を添加して、製剤の等張性をさらに調整することができる。グリセリン、塩化ナトリウム、およびマンニトールは、等張性調整賦形剤の例である。
当業者は、FGF21変異体を含む治療用組成物、「適正な医療の原則」(Good Medical Practice)および個々の患者の臨床状態により決定される通り、薬学的有効投与量および投与レジメンをたやすく最適化することができる。本発明のFGF21変異体のための典型的な用量範囲は、成人では、1日当たり約0.01mg〜1日当たり約1000mg(または毎週1回投与される、1週間当たり約0.07mg〜1週間当たり約7000mg)の範囲にわたるであろう。投与量は、1日当たり約0.1mg〜1日当たり約100mg(または毎週1回投与される、1週間当たり約0.7mg〜1週間当たり約700mg)、より好ましくは、1日当たり約1.0mg〜1日当たり約10mg(または毎週1回投与される、1週間当たり約7mg〜1週間当たり約70mg)の範囲にわたることが好ましい。最も好ましくは、投与量は、1日当たり約1〜5mg(または毎週1回投与される、1週間当たり約7mg〜1週間当たり約35mg)である。特許請求される本発明の方法に従い投与されるFGF21変異体の適切な用量は、代謝プロファイルを改善し、例えば、血中グルコースレベルを低下させ、エネルギー消費量を増大させ、かつ/またはより効率的なグルコース利用を促進し、したがって、2型糖尿病、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、ならびに家族性部分型リポジストロフィーおよびHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーを含む部分型リポジストロフィーの多様な形態のほか、インスリン産生と関連する疾患(1型糖尿病)など、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患を処置するために有用である。
加えて、高血糖症およびインスリン抵抗性は、栄養補給を施される重病患者において一般的であるため、一部のICUでは、補給を受ける重病患者における過剰な高血糖を処置するのに、インスリンを投与する。実際、近年の研究は、1デシリットル当たり110mgを超えないレベルに血中グルコースを維持する、外因性インスリンの使用により、外科集中治療室内の重病患者における罹患率および死亡率が、患者らが糖尿病の病歴を有するのかどうかに関わらず、低減されることについて記録している(Van den Berghe, et al. N Engl J Med., 345(19):1359, (2001))。したがって、本発明の方法は、代謝的に不安定的な重病患者における代謝安定性を回復させる一助となるのに独自に適する。
本発明の別の態様では、2型糖尿病、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、ならびに家族性部分型リポジストロフィーおよびHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーを含む部分型リポジストロフィーの多様な形態のほか、インスリン産生と関連する疾患(1型糖尿病)など、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患の処置のための医薬としての使用のためのFGF21の変異体、ならびに重病患者の死亡率および罹患率の低減における使用のためのFGF21の変異体が提供される。
本発明について今や詳細に記載したので、例示だけを目的として含まれるものであり、本発明について限定的であることを意図するものではない、以下の例を参照することにより、本発明はより明らかに理解されるであろう。
本発明の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の範囲内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法が援用されよう。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)を参照されたい。
部位特異的FGF21突然変異体
「部位特異的FGF21突然変異体」または「置換FGF21突然変異体」という用語は、例えば、NCBI参照配列番号を、NP_061986.1とする、自然発生のFGF21ポリペプチド配列のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、FGF21突然変異体ポリペプチド、およびその変異体を指す。部位特異的FGF21突然変異体は、FGF21ポリペプチドの特定の位置において、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を導入し、自然発生のアミノ酸または非自然発生のアミノ酸を使用することにより作り出すことができる。
「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響がほとんどまたは全く生じないような、天然のアミノ酸残基(すなわち、野生型FGF21ポリペプチド配列の所与の位置において見出される残基)の、非天然残基(すなわち、野生型FGF21ポリペプチド配列の所与の位置には見出されない残基)による置換を伴いうる。保存的アミノ酸置換はまた、生体系内の合成によるのではなく、化学的ペプチド合成により組み込まれることが典型的な、非自然発生のアミノ酸残基も包含する。これらは、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の、他の反転形態または逆位形態を含む。
自然発生の残基は、共通の側鎖特性に基づき、
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向性に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe;ならびに
(7)セレノシステイン、ピロリシン(PYL)、およびピロリン−カルボキシ−リシン(PCL)
のクラスへと分けることができる。
保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、同じクラスの別のメンバーとの交換を伴いうる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、別のクラスに由来するメンバーとの交換を伴いうる。
所望のアミノ酸置換(保存的であれ、非保存的であれ)は、このような置換が所望される場合に、当業者により決定されうる。
切断型FGF21ポリペプチド
本発明の一実施形態は、成熟FGF21ポリペプチドの切断形態を含む処置法を対象とする。本発明のこの実施形態は、成熟FGF21ポリペプチドの非切断形態と同様な活性であり、場合によって、これより優れた活性をもたらすことが可能な、切断型FGF21ポリペプチドを同定する試みに由来する。
本明細書で使用される「切断型FGF21ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が、FGF21ポリペプチドのアミノ末端(またはN末端)末端から除去されているか、アミノ酸残基が、FGF21ポリペプチドのカルボキシル末端(またはC末端の)末端から除去されているか、またはアミノ酸残基が、FGF21ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から除去されている、FGF21ポリペプチドを指す。本明細書で開示される多様な切断型は、本明細書で記載される通りに調製した。
N末端切断型FGF21ポリペプチドおよびC末端切断型FGF21ポリペプチドの活性は、in vitroホスホERKアッセイを使用してアッセイすることができる。切断型FGF21ポリペプチドの活性を検討するのに使用しうるin vitroアッセイの具体的な詳細については、実施例において見出すことができる。
本発明の切断型FGF21ポリペプチドの活性はまた、ob/obマウスなどのin vivoアッセイでも評価することができる。一般に、切断型FGF21ポリペプチドのin vivo活性を評価するために、切断型FGF21ポリペプチドを、被験動物に、腹腔内投与することができる。所望のインキュベーション時間(例えば、1時間またはこれを超える)の後で、血液試料を採取し、血中グルコースレベルを測定することができる。
a.N末端切断型
本発明の方法の一部の実施形態は、成熟FGF21ポリペプチドのN末端に由来する1、2、3、4、5、6、7、または8アミノ酸残基を伴うN末端切断型を含む。9アミノ酸残基未満のN末端切断型を有する、切断型FGF21ポリペプチドは、成熟FGF21ポリペプチドの、個体における血中グルコースを低下させる能力を保持する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、1、2、3、4、5、6、7、または8アミノ酸残基のN末端切断型を有する、成熟FGF21ポリペプチドの切断形態またはFGF21タンパク質変異体を包含する。
b.C末端切断型
本発明の方法の一部の実施形態は、成熟FGF21ポリペプチドのC末端に由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基を伴うC末端切断型を含む。13アミノ酸残基未満のC末端切断型を有する、切断型FGF21ポリペプチドは、in vitro ELK−ルシフェラーゼアッセイにおいて、野生型FGF21の有効性の少なくとも50%の有効性を呈した(Yie J. et al. FEBS Letts 583:19-24 (2009))ことから、これらのFGF21突然変異体は、成熟FGF21ポリペプチドの、個体における血中グルコースを低下させる能力を保持することが指し示される。したがって、特定の実施形態では、本発明は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基のC末端切断型を有する、成熟FGF21ポリペプチドの切断形態またはFGF21タンパク質変異体を包含する。
c.N末端切断型およびC末端切断型
本発明の方法の一部の実施形態は、N末端切断型とC末端切断型との組合せを伴う切断型FGF21ポリペプチドを含む。N末端切断型とC末端切断型との組合せを有する切断型FGF21ポリペプチドは、N末端切断型またはC末端切断型単独を有する、対応する切断型FGF21ポリペプチドの活性を共有する。言い換えれば、9アミノ酸残基未満のN末端切断型および13アミノ酸残基未満のC末端切断型の両方を有する切断型FGF21ポリペプチドは、9アミノ酸残基未満のN末端切断型を有する、切断型FGF21ポリペプチド、または13アミノ酸残基未満のC末端切断型を有する、切断型FGF21ポリペプチドと同様であるかまたはこれを超える血中グルコース低下活性を保有する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、1、2、3、4、5、6、7、または8アミノ酸残基のN末端切断型、および1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基のC末端切断型の両方を有する、成熟FGF21ポリペプチドの切断形態またはFGF21タンパク質変異体を包含する。
本発明の方法による全てのFGF21変異体と同様に、切断型FGF21ポリペプチドは、任意選択で、指向性突然変異により、または細菌による発現過程の結果として導入されうる、アミノ末端メチオニン残基を含みうる。
本発明の方法を構成する切断型FGF21ポリペプチドは、本明細書で記載される実施例で記載される通りに調製することができる。標準的な分子生物学法に精通した当業者は、その知見を、本開示と組み合わせて援用して、本発明の切断型FGF21ポリペプチドを作製し、使用することができる。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換(例えば、電気穿孔、リポフェクション)のための標準的技法を使用することができる。例えば、任意の目的で、参照により本明細書に組み込まれる、上記Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manualを参照されたい。酵素反応および精製法は、当技術分野で一般に達成される通り、または本明細書で記載される通り、製造元の規格に従い実施することができる。具体的定義が提示されない限りにおいて、本明細書で記載される、分析化学、有機合成化学、ならびに創薬化学および医薬化学との関連で活用される用語法、ならびにこれらの実験手順および技法は、周知の用語法ならびに実験手順および技法であり、当技術分野で一般に使用されている。標準的技法は、化学合成;化学分析;医薬の調製、処方、および送達;ならびに患者の処置のために使用することができる。
本発明の方法の切断型FGF21ポリペプチドはまた、切断型FGF21ポリペプチドにさらなる特性を付与する別の実体に融合することもできる。本発明の一実施形態では、切断型FGF21ポリペプチドは、IgG定常ドメインまたはその断片(例えば、Fc領域)、ヒト血清アルブミン(HSA)、またはアルブミン結合性ポリペプチドに融合することができる。このような融合は、公知の分子生物学的方法および/または本明細書で提示される指針を使用して達成することができる。このような融合ポリペプチド、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法の利益は、本明細書でより詳細に論じられる。
FGF21融合タンパク質
本明細書で使用される「FGF21融合ポリペプチド」または「FGF21融合タンパク質」という用語は、本明細書で記載される任意のFGF21タンパク質変異体のN末端またはC末端における、1または複数のアミノ酸残基(異種タンパク質または異種ペプチドなど)の融合体を指す。
異種ペプチドおよび異種ポリペプチドは、FGF21タンパク質変異体の検出および/または単離を可能とするエピトープ;細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインなど、膜貫通受容体タンパク質またはその一部;膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部;触媒的に活性である酵素またはその一部;ロイシンジッパードメインなど、オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド;免疫グロブリン定常領域など、安定性を増大させるポリペプチドまたはペプチド;機能的抗体もしくは非機能的抗体またはその重鎖もしくは軽鎖;ならびに本発明のFGF21タンパク質変異体と異なる治療的活性などの活性を有するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。本発明にはまた、ヒト血清アルブミン(HSA)に融合したFGF21突然変異体も包含される。
FGF21融合タンパク質は、FGF21タンパク質変異体のN末端またはC末端において、異種配列を融合することにより作製することができる。本明細書で記載される通り、異種配列は、アミノ酸配列またはアミノ酸非含有ポリマーでありうる。異種配列は、FGF21タンパク質変異体に直接融合することもでき、リンカー分子またはアダプター分子を介して融合することもできる。リンカー分子またはアダプター分子は、1または複数のアミノ酸残基(または1または複数マー)、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9残基(または1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9マー)、好ましくは、10〜50アミノ酸残基(または10〜50マー)、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、または50残基(または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、もしくは50マー)であることが可能であり、より好ましくは、15〜35アミノ酸残基(または15〜35マー)でありうる。リンカー分子またはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能とするように、DNA制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼの切断部位と共にデザインすることもできる。
a.Fc融合体
本発明の一実施形態では、FGF21タンパク質変異体を、ヒトIgGのFc領域の1または複数のドメインに融合する。抗体は、抗原に結合する、「Fab」として公知の可変ドメインと、補体の活性化および食細胞による攻撃などのエフェクター機能に関与する、「Fc」として公知の定常ドメインとの、2つの機能的に独立した部分を含む。Fcは、血清半減期が長いが、Fabは、短命である(Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31)。治療的タンパク質と一緒に連結すると、Fcドメインは、半減期の延長をもたらす場合もあり、Fc受容体への結合、プロテインAへの結合、補体への結合などの機能を組み込み、おそらくは、胎盤通過などの機能さえ組み込む場合もある(Capon et al., 1989)。
in vivoにおける薬物動態解析により、マウスにおけるヒトFGF21の半減期は、急速なクリアランスおよびin vivoにおける分解のために、約0.5〜1時間と短くなることが指し示された。したがって、FGF21の半減期を延長するために、Fc配列を、FGF21ポリペプチドのN末端またはC末端に融合した。Fc領域の、野生型FGF21への融合、特に、Fcの、野生型FGF21のN末端への融合により、予測される半減期の延長はなされなかったが、in vivoにおけるFGF21のタンパク質分解の探索、およびこのような分解に対して抵抗性であるFGF21突然変異体の同定がもたらされた。
本開示を通して、Fc−FGF21とは、Fc配列を、FGF21のN末端に融合した、融合タンパク質を指す。同様に、本開示を通して、FGF21−Fcとは、Fc配列を、FGF21のC末端に融合した、融合タンパク質を指す。
結果として得られるFGF21融合タンパク質は、例えば、プロテインAアフィニティーカラムの使用により精製することができる。Fc領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より、実質的に長いin vivo半減期を呈することが見出されている。また、Fc領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化/多量体化も可能とする。Fc領域は、自然発生のFc領域の場合もあり、治療上の品質、循環時間、または凝集の低減など、ある特定の品質を改善するように変化させる場合もある。
抗体の「Fc」ドメインとの融合による、タンパク質治療剤の有用な修飾は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第00/024782号パンフレットにおいて、詳細に論じられている。本文書でも、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、またはFc領域など、「媒体」への連結について論じる。
b.融合タンパク質のリンカー
本発明の融合タンパク質を形成する場合、リンカーを援用することは、可能ではあるが必要ではない。存在する場合、リンカーは、主にスペーサーとして用いられるので、リンカーの化学構造は肝要ではない。リンカーは、ペプチド結合により一体に連結されたアミノ酸から構成することができる。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合により連結された1〜20アミノ酸から構成され、この場合、アミノ酸は、自然発生の20のアミノ酸から選択される。多様な実施形態では、1〜20アミノ酸は、アミノ酸である、グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなど、立体障害型でない大半のアミノ酸から構成される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンとの組合せ(ポリ(Gly−Ala)など)、またはグリシンとセリンとの組合せ(ポリ(Gly−Ser)など)である。FGF21融合タンパク質では、15アミノ酸残基のリンカーが、特に良好に働くことが見出されているが、本発明では、任意の長さまたは組成のリンカーを想定する。
本明細書で記載されるリンカーは、例示的なものであり、本発明では、はるかに長いリンカー、および、他の残基を含むリンカーも想定される。本発明では、非ペプチドリンカーもまた、想定される。例えば、アルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル(例えば、C1〜C6)、低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、またはフェニルを含むがこれらに限定されない、任意の非立体障害基により、さらに置換することができる。例示的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカーであり、この場合、リンカーの分子量は、100〜5000kD、例えば、100〜500kDである。
化学修飾FGF21突然変異体
当業者は、本明細書で記載される本開示を踏まえ、本明細書で記載されるFGF21タンパク質変異体の化学修飾形態であって、本明細書で記載されるFGF21の切断形態を含む化学修飾形態を調製することができる。このような化学修飾FGF21突然変異体は、FGF21突然変異体に天然で付加される分子の種類または位置が化学修飾FGF21突然変異体では非修飾FGF21突然変異体と異なるように変化している。化学修飾FGF21突然変異体は、1または複数の、天然で付加される化学基の欠失により形成される分子を含みうる。
一実施形態では、本発明のFGF21タンパク質変異体は、1または複数のポリマーの共有結合的に付加することにより修飾することができる。例えば、選択されるポリマーは、それを付加したタンパク質が、生体環境など、水性環境内で沈殿しないように、水溶性であることが典型的である。適切なポリマーの範囲内には、ポリマーの混合物が含まれる。最終生成物である調製物の治療的使用のために、ポリマーは、薬学的に許容されることが好ましい。また、本発明のFGF21タンパク質変異体にコンジュゲートさせた非水溶性ポリマーも、本発明の態様を形成する。
例示的なポリマーの各々は、任意の分子量であることが可能であり、分枝状の場合もあり、非分枝状の場合もある。ポリマーの各々の平均分子量は、約2kDa〜約100kDaの間であることが典型的である(「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製物中で、一部の分子の分子量は、言明された分子量より大きく、一部の分子の分子量は、言明された分子量より小さいことを指し示す)。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約5kDa〜約50kDaの間、より好ましくは、約12kDa〜約40kDaの間であり、最も好ましくは、約20kDa〜約35kDaの間である。
適切な水溶性ポリマーまたはそれらの混合物は、N結合型炭水化物またはO結合型炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール(PEG)(タンパク質を誘導体化するのに使用されているPEGの形態であって、モノエチレングリコール(C1〜C10を含む)、アルコキシポリエチレングリコール、またはアリールオキシポリエチレングリコールを含む形態)、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン(例えば、約6kDの低分子量デキストランなど)、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−(N−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリ酸化プロピレン/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、およびポリビニルアルコールを含むがこれらに限定されない。本発明にはまた、共有結合的に付加した、FGF21タンパク質変異体の多量体を調製するのに使用しうる二官能性架橋分子も包含される。本発明にはまた、ポリシアル酸に共有結合的に付加したFGF21突然変異体も包含される。
本発明の一部の実施形態では、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない、1または複数の水溶性ポリマーを含むように、FGF21突然変異体を、共有結合的または化学的に修飾する。例えば、米国特許第4,640,835号明細書;同第4,496,689号明細書;同第4,301,144号明細書;同第4,670,417号明細書;同第4,791,192号明細書;および同第4,179,337号明細書を参照されたい。本発明の一部の実施形態では、FGF21突然変異体は、1または複数のポリマー、を含むがこれらに限定されない、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−(N−ビニルピロリドン)−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリ酸化プロピレン/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、またはこのようなポリマーの混合物を含む。
本発明の一部の実施形態では、FGF21突然変異体を、PEGサブユニットで共有結合的に修飾する。一部の実施形態では、1または複数の水溶性ポリマーを、FGF21突然変異体の1または複数の特異的位置(例えば、N末端)において結合させる。一部の実施形態では、1または複数の水溶性ポリマーを、FGF21突然変異体の1または複数の側鎖にランダムに付加する。一部の実施形態では、PEGを使用して、FGF21突然変異体の治療能を改善する。ある特定のこのような方法については、例えば、任意の目的で、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,133,426号明細書において論じられている。
ポリマーが、PEGである、本発明の実施形態では、PEG基は、任意の好適な分子量であることが可能であり、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もある。PEG基の平均分子量は、好ましくは、約2kDa〜約100kDa、より好ましくは、約5kDa〜約50kDa、例えば、10、20、30、40、または50kDaの範囲である。PEG基は一般に、PEG部分(例えば、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、またはエステル基)上の反応性基から、FGF21突然変異体(例えば、アルデヒド基、アミノ基、またはエステル基)上の反応性基へのアシル化または還元的アルキル化を介して、FGF21突然変異体に付加する。
「Y字型」PEG誘導体としてもまた公知の、分枝状PEG誘導体は、中心コアに付加した2つの直鎖状メトキシPEG鎖を含有する。これらの「Y字型」PEG誘導体の立体バルク構造は、修飾分子の単一点における付加を容易とするであろう。例を目的として述べると、3種類の「Y字型」PEG誘導体は、Y−NHS−40K(アミンPEG化に有用な);Y−MAL−40K(チオールPEG化に有用な);およびY−ALD−40K(例えば、Y−AALD−40KおよびY−PALD−40K)(N末端PEG化に有用な)である。アミンPEG化では、「Y字型」NHSエステルは、生体活性分子中のリシンのアミノ基またはN末端アミンと反応して、安定的なアミド連結をもたらすであろう。このNHSエステルは、ターゲティングされる分子と、pH7〜8でカップリングするであろう。チオールPEG化では、「Y字型」マレイミドは、生体活性分子中のチオール基と反応して、安定的な3−チオスクシンイミジルエーテル連結を生成させるであろう。このマレイミドは、ターゲティングされる分子と、他の官能基の存在下、pH5.0〜6.5でカップリングするであろう。N末端PEG化では、「Y字型」アルデヒドは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬の存在下で、生体活性分子中のN末端アミンと反応して、安定的なアミン連結をもたらすことが好ましいであろう。このアルデヒドは、ターゲティングされる分子のN末端アミンと、pH5〜8でカップリングするであろう。分枝状PEG化を実施するための試薬は、例えば、JenKem Technologyにより市販されている。
本発明のFGF21突然変異体を含むポリペプチドのPEG化は、具体的に、当技術分野で公知のPEG化反応のうちのいずれかを使用して実行することができる。このような反応は、例えば、以下の参考文献:Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10;欧州特許第0154316号明細書および同第0401384号明細書;ならびに米国特許第4,179,337号明細書において記載されている。例えば、PEG化は、本明細書で記載される、反応性ポリエチレングリコール分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行することができる。アシル化反応では、選択されたポリマーは、単一の反応性のエステル基を有するものとする。還元的アルキル化では、選択されたポリマーは、単一の反応性のアルデヒド基を有するものとする。反応性アルデヒドは、例えば、水中で安定的なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノC1〜C10アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である(例えば、米国特許第5,252,714号明細書を参照されたい)。
本発明の一部の実施形態では、PEG基の、ポリペプチドへの付加に有用な戦略は、溶液中でコンジュゲート連結を形成することによって、各々が他方に対して相互に反応性である特別な官能性を保有するペプチドとPEG部分とを組み合わせるステップを伴う。ペプチドは、従来の固相合成により容易に調製することができる。ペプチドは、特異的な部位において、適切な官能基により、「あらかじめ活性化させ」る。前駆体を精製し、完全に特徴づけてから、PEG部分と反応させる。ペプチドの、PEGとのライゲーションは通例、水性相中でなされ、逆相解析用HPLCにより容易にモニタリングすることができる。PEG化ペプチドは、調製用HPLCにより容易に精製することができ、解析用HPLC、アミノ酸解析、およびレーザー脱着質量分析により特徴づけることができる。
多糖ポリマーは、タンパク質修飾に使用されうる、別種の水溶性ポリマーである。したがって、多糖ポリマーに融合した、本発明のFGF21突然変異体は、本発明の実施形態を形成する。デキストランは、主にアルファ1−6連結により連結された、個々のグルコースサブユニットを含む多糖ポリマーである。デキストランはそれ自体、多くの分子量範囲で入手可能であり、約1kD〜約70kDの分子量でたやすく入手可能である。デキストランは、それ自体での媒体としての使用に適する水溶性ポリマー、または別の媒体(例えば、Fc)と組み合わせた使用に適する水溶性ポリマーである。例えば、国際公開第96/11953号パンフレットを参照されたい。治療用免疫グロブリンまたは診断用免疫グロブリンにコンジュゲートさせたデキストランの使用については、報告されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許公開第0315456号明細書を参照されたい。本発明はまた、約1kD〜約20kDのデキストランの使用も包含する。
一般に、化学修飾は、タンパク質を、活性化ポリマー分子と反応させるのに使用される、任意の適切な状態下で実施することができる。化学修飾ポリペプチドを調製するための方法は一般に、(a)FGF21タンパク質変異体を、1または複数のポリマー分子に付加する条件下で、ポリペプチドを、活性化ポリマー分子(ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など)と反応させるステップと、(b)反応産物を得るステップとを含む。最適な反応状態は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づき決定されるであろう。例えば、ポリマー分子の、タンパク質に対する比が大きいほど、付加を受けるポリマー分子の割合が大きくなる。本発明の一実施形態では、化学修飾FGF21突然変異体は、アミノ末端において単一のポリマー分子部分を有しうる(例えば、米国特許第5,234,784号明細書を参照されたい)。
本発明の別の実施形態では、FGF21タンパク質変異体は、ビオチンに化学的にカップリングさせることができる。次いで、ビオチン/FGF21タンパク質変異体を、アビジンに結合させる結果として、四価のアビジン/ビオチン/FGF21タンパク質変異体をもたらす。FGF21タンパク質変異体はまた、ジニトロフェノール(DNP)またはトリニトロフェノール(TNP)に共有結合的にカップリングさせ、結果として得られるコンジュゲートを、抗DNP−IgMまたは抗TNP−IgMにより沈殿させて、価数を10とする十量体コンジュゲートを形成することもできる。
一般に、本化学修飾FGF21突然変異体の投与により緩和またはモジュレートされうる状態は、FGF21タンパク質変異体について本明細書で記載される状態を含む。しかし、本明細書で開示される化学修飾FGF21突然変異体は、さらなる活性、生体活性の増強もしくは低減、または、非修飾FGF21突然変異体と比較した、半減期の延長もしくは短縮など、他の特徴を有しうる。
FGF21突然変異体の治療用組成物およびその投与
FGF21突然変異体を含む治療用組成物は、本発明の方法の範囲内にあり、特性の増強を呈する、複数の突然変異体FGF21配列の同定に照らして、具体的に想定される。このようなFGF21突然変異体の医薬組成物は、投与方式との適性について選択される薬学的または生理学的に許容される製剤と混合された治療有効量のFGF21タンパク質変異体を含みうる。
許容可能な製剤材料は、援用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。
医薬組成物は、例えば、組成物のpH、浸透圧、粘稠度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を修飾するか、維持するか、または保存するための製剤材料を含有しうる。適切な製剤材料は、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど)、抗微生物剤、抗酸化剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど)、緩衝液(ホウ酸、重炭酸、トリス−HCl、クエン酸、リン酸、または他の有機酸など)、増量剤(マンニトールまたはグリシンなど)、キレート化剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)など)、複合体化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど)、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリンなど)、タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど)、着色剤、芳香剤、および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンなど)、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン(ナトリウムなど)、保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェンエチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など)、溶剤(グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど)、糖アルコール(マンニトールまたはソルビトールなど)、懸濁剤、界面活性剤、または保湿剤(Pluronic;PEG;ソルビタンエステル;ポリソルベート20またはポリソルベート80などのポリソルベート;Triton;トロメタミン;レシチン;コレステロールまたはTyloxapolなど)、安定性増強剤(スクロースまたはソルビトールなど)、張性増強剤(アルカリ金属ハロゲン化物;好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム;またはマンニトール、ソルビトールなど)、送達媒体、希釈剤、賦形剤、および/または医薬アジュバント(例えば、任意の目的で、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)、および同書の後続の版を参照されたい)を含むがこれらに限定されない。
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達フォーマット、および所望の投与量に応じて、当業者により決定されるであろう(例えば、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照されたい)。このような組成物は、FGF21タンパク質変異体の物理的状態、安定性、in vivoにおける放出速度、およびin vivoにおけるクリアランス速度に影響を及ぼしうる。
医薬組成物中の一次媒体または担体は、天然で水性の場合もあり、非水性の場合もある。例えば、注射に適する媒体または担体は、水、生理食塩液、または、おそらく、非経口投与用の組成物に共通の他の材料を補充した、人工脳脊髄液でありうる。中性緩衝生理食塩液または血清アルブミンと混合された生理食塩液は、さらなる例示的な媒体である。他の例示的な医薬組成物は、pH約7.0〜8.5のトリス緩衝液、またはpH約4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、これらはさらに、ソルビトールまたは適切な代替物を含みうる。本発明の一実施形態では、FGF21タンパク質変異体組成物は、所望の純度を有する、選択される組成物を、任意選択の製剤と、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することにより、保存用に調製することができる(上記Remington's Pharmaceutical Sciences)。さらに、FGF21タンパク質変異体生成物は、スクロースなど、適切な賦形剤を使用して、乾燥凍結物としても製剤化することができる。
FGF21タンパク質変異体による医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。代替的に、組成物は、吸入用に選択することもでき、経口送達など、消化管を介する送達用に選択することもできる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当技術分野の範囲内にある。
製剤成分は、投与部位において許容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、組成物を、生理学的pHまたはこれよりやや小さなpH、典型的には、約5〜約8のpH範囲内に維持するのに使用される。
非経口投与を想定する場合、本発明における使用のための治療用組成物は、発熱物質非含有であり、非経口的に許容可能な水溶液であって、薬学的に許容される媒体中に所望のFGF21タンパク質変異体を含む水溶液の形態でありうる。非経口注射に特に適する媒体は、FGF21タンパク質変異体が、その中で、滅菌の等張性溶液として製剤化され、適正に保存される、滅菌蒸留水である。さらに別の調製物は、所望の分子の製剤を、生成物の制御放出または持続放出をもたらす、注射用マイクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物(ポリ乳酸またはポリグリコール酸など)、ビーズ、またはリポソームなどの薬剤と共に伴うことが可能であり、次いで、デポ注射を介して送達することができる。また、ヒアルロン酸も、使用することができ、これは、循環中の持続的存続時間を延長する効果を有しうる。所望の分子の導入に適する他の手段は、植込み型薬物送達デバイスを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化することができる。例えば、FGF21タンパク質変異体は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。FGF21タンパク質変異体の吸入用溶液はまた、エアゾール送達用の高圧ガスと共に製剤化することもできる。さらに別の実施形態では、溶液は、噴霧化することができる。肺内投与は、化学修飾タンパク質の肺内送達について記載する、国際公開第94/20069号パンフレットにおいてさらに記載されている。
また、ある特定の製剤は、経口投与されうることも想定される。本発明の一実施形態では、この様式で投与されるFGF21タンパク質変異体は、錠剤およびカプセルなど、固体剤形を配合するときに通常使用される担体を伴うかまたは伴わずに製剤化することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、かつ、プレシステミックの分解が最小化される消化管内の時点において、製剤の活性部分を放出するようにデザインすることができる。FGF21タンパク質変異体の吸収を容易とするように、さらなる薬剤を組み入れることもできる。また、希釈剤、芳香剤、低融点蝋、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も、援用することができる。
別の医薬組成物は、有効量のFGF21タンパク質変異体を、錠剤の製造に適する非毒性賦形剤との混合物中に伴う場合がある。錠剤を滅菌水中、または別の適切な媒体中に溶解させることにより、溶液を、単位剤形で調製することができる。適切な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤;あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシアなどの結合剤;あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石などの滑沢剤を含むがこれらに限定されない。
当業者には、持続送達製剤中または制御送達製剤中にFGF21タンパク質変異体を伴う製剤を含む、さらなるFGF21タンパク質変異体による医薬組成物が明らかであろう。当業者にはまた、リポソーム担体、生体分解性マイクロ粒子または多孔性ビーズ、およびデポ注射剤など、他の様々な持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための技法も公知である(例えば、医薬組成物を送達するための、多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する、国際公開第93/15722号パンフレット、ならびにマイクロスフェア調製物/マイクロ粒子調製物およびこれらの使用について論じる、Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J Pharm. 364: 298-327、およびFreiberg & Zhu, 2004, Int. J Pharm. 282: 1-18を参照されたい)。
持続放出調製物のさらなる例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態における、半透性ポリマーマトリックスの成型品を含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号明細書および欧州特許第0058481号明細書)、L−グルタミン酸とガンマエチル−L−グルタミン酸とのコポリマー(Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56)、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105)、エチレン酢酸ビニル(上記Langer et al.)またはポリ−D−3−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第0133988号明細書)を含みうる。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知の複数の方法のうちのいずれかにより調製しうるリポソームも含みうる。例えば、Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92;および欧州特許第0036676号明細書、同第0088046号明細書、および同第0143949号明細書を参照されたい。
FGF21タンパク質変異体による医薬組成物であって、in vivo投与のために使用される医薬組成物は、典型的に、滅菌医薬組成物でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により達成することができる。組成物を凍結乾燥させる場合、この方法を使用する滅菌処理は、凍結乾燥および再構成の前または後に実行することができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で保存することもでき、溶液中に保存することもできる。加えて、非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穿刺可能な止栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れる。
医薬組成物を製剤化したら、滅菌バイアル内に、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として保存することもでき、脱水粉末または凍結乾燥粉末として保存することもできる。このような製剤は、使用準備のできた形態で保存することもでき、投与前の再構成を要請する形態(例えば、凍結乾燥形態)で保存することもできる。
具体的な実施形態では、本発明は、単回投与用の投与単位を作製するためのキットを対象とする。キットは、各々が、乾燥タンパク質を有する第1の容器および水性製剤を有する第2の容器の両方を含有しうる。本発明の範囲内にはまた、シングルチャンバー型プレフィルドシリンジおよびマルチチャンバー型プレフィルドシリンジ(例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ)を含有するキットも含まれる。
治療用に援用される、FGF21タンパク質変異体による医薬組成物の有効量は、例えば、治療的文脈および治療目的に依存するであろう。したがって、当業者は、処置に適する投与量レベルが、部分的に、送達される分子、FGF21タンパク質変異体が使用される適応、投与経路、ならびに患者のサイズ(体重、体表面積、または臓器サイズ)および状態(年齢および全般的な健康状態)に応じて変化することを察知するであろう。したがって、臨床従事者は、投与量を滴定し、投与経路を変更して、最適な治療効果を得ることができる。典型的な投与量は、上述の因子に応じて、1kg当たり約0.1μg〜1kg当たり最大約100mgまたはこれを超える範囲にわたりうる。他の実施形態では、投与量は、1kg当たり0.1μg〜1kg当たり最大約100mg;または1kg当たり1μg〜1kg当たり最大約100mg;または1kg当たり5μg、1kg当たり10μg、1kg当たり15μg、1kg当たり20μg、1kg当たり25μg、1kg当たり30μg、1kg当たり35μg、1kg当たり40μg、1kg当たり45μg、1kg当たり50μg、1kg当たり55μg、1kg当たり60μg、1kg当たり65μg、1kg当たり70μg、1kg当たり75μg〜1kg当たり最大約100mgの範囲にわたりうる。さらに他の実施形態では、投与量は、1kg当たり50μg、1kg当たり100μg、1kg当たり150μg、1kg当たり200μg、1kg当たり250μg、1kg当たり300μg、1kg当たり350μg、1kg当たり400μg、1kg当たり450μg、1kg当たり500μg、1kg当たり550μg、1kg当たり600μg、1kg当たり650μg、1kg当たり700μg、1kg当たり750μg、1kg当たり800μg、1kg当たり850μg、1kg当たり900μg、1kg当たり950μg、1kg当たり100μg、1kg当たり200μg、1kg当たり300μg、1kg当たり400μg、1kg当たり500μg、1kg当たり600μg、1kg当たり700μg、1kg当たり800μg、1kg当たり900μg、1kg当たり1000μg、1kg当たり2000μg、1kg当たり3000μg、1kg当たり4000μg、1kg当たり5000μg、1kg当たり6000μg、1kg当たり7000μg、1kg当たり8000μg、1kg当たり9000μg、または1kg当たり10mgでありうる。
投与頻度は、使用される製剤中のFGF21タンパク質変異体の薬物動態パラメータに依存するであろう。臨床従事者は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで、組成物を投与することが典型的であろう。したがって、組成物は、単回投与として投与することもでき、ある時間にわたる、2回またはこれを超える投与(同じ量の所望の分子を含有する場合もあり、これを含有しない場合もある)として投与することもでき、植込みデバイスまたはカテーテルを介する連続注入として投与することもできる。適切な投与量のさらなる精緻化は、当業者により日常的になされるものであり、当業者により日常的に実施される業務の範囲内にある。適切な投与量は、適切な用量反応データの使用により確認することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法、例えば、経口法;静脈内経路、腹腔内経路、脳内(脳実質内)経路、脳室内経路、筋内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路、または病変内経路による注射による方法;持続放出系(また、注射もされうる)による方法;または植込みデバイスによる方法に従う。所望の場合、組成物は、ボーラス注射により投与することもでき、注入により連続的に投与することもでき、植込みデバイスにより投与することもできる。
代替的に、または加えて、組成物は、所望の分子を吸収または封入させた、膜、スポンジ、または他の適切な材料の植込みを介して局所投与することもできる。植込みデバイスを使用する場合、デバイスは、任意の適切な組織または臓器に植え込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放ボーラス、または連続投与を介しうる。
FGF21の治療的使用
FGF21ポリペプチドもしくはFGF21タンパク質、またはこれらの突然変異体、変異体、および融合体は、2型糖尿病、インスリン受容体突然変異障害(INSR障害)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、ならびに家族性部分型リポジストロフィーおよびHIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーを含む部分型リポジストロフィーの多様な形態のほか、インスリン産生と関連する疾患(1型糖尿病)など、インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患を含むがこれらに限定されない、多数の疾患、障害、または状態を処置するか、診断するか、改善するか、または予防し、重病患者の死亡率および罹患率を低減するのに使用することができる。
1型糖尿病またはインスリン受容体突然変異障害など、障害または状態は、FGF21ポリペプチドもしくはFGF21タンパク質、またはその突然変異体、変異体、もしくは融合体を、それを必要とする患者に、治療有効用量で投与することにより処置することができる。投与は、IV注射、腹腔内注射、筋内注射、または錠剤もしくは液剤の形態における経口投与を介するなど、本明細書で記載される通りに実施することができる。大半の状況では、所望の投与量は、本明細書で記載される通り、臨床従事者により決定され、FGF21の治療有効用量を表しうる。当業者には、FGF21の治療有効用量は、とりわけ、投与スケジュール、他の治療剤と組み合わせて、核酸分子を投与するのであれ、ポリペプチドを投与するのであれ、投与される抗原の単位用量、レシピエントの免疫状態および健康状態に依存することが明らかであろう。本明細書で使用される「治療有効用量」という用語は、研究者、医師、または他の臨床従事者により探索される、組織系、動物、またはヒトにおける生体応答または医薬応答であって、処置される疾患または障害の症状の緩和を含む生体応答または医薬応答を誘発する、FGF21突然変異体ポリペプチドの量を意味する。
医薬組成物
本発明はまた、本明細書で記載される、FGF21ポリペプチドもしくはFGF21タンパク質、またはこれらの突然変異体、変異体、および融合体のうちの1または複数と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を含む方法も提供する。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液または懸濁液としての注射剤として調製するが、また、注射の前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適する固体形態を調製することもできる。リポソームは、薬学的に許容される担体の定義内に含まれる。また、薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱物酸塩;および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩も、医薬組成物中に存在させることができる。薬学的に許容される賦形剤についての完全な議論は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkinsにおいて入手可能である。
融合タンパク質およびFGF21由来のペプチド化合物
別の実施形態では、本発明の方法は、FGF21のアミノ酸配列に由来する融合タンパク質またはペプチド化合物にすることができるFGF21タンパク質、FGF21変異体、またはFGF21突然変異体を含む。このような融合タンパク質およびペプチド化合物は、当技術分野で公知の標準的な技法を使用して作製することができる。例えば、ペプチド化合物は、標準的なペプチド合成法を使用する化学合成により作製し、次いで、ペプチドを細胞(例えば、リポソームなど)に導入するための、当技術分野で公知の様々な手段により、細胞に導入することができる。
本発明の融合タンパク質またはペプチド化合物のin vivoにおける半減期は、FGF21タンパク質、FGF21変異体、またはFGF21突然変異体にN結合型グリコシル化部位を加えるなどのペプチド修飾を施すことにより改善することもでき、例えば、リシン−モノPEG化またはシステイン−モノPEG化を介して、FGF21タンパク質、FGF21変異体、またはFGF21突然変異体を、ポリ(エチレングリコール)(PEG)にコンジュゲートさせる(PEG化)により改善することもできる。このような技法は、治療用タンパク質薬物の半減期を延長するのに有益であることが分かっている。本発明の方法を構成するFGF21タンパク質、FGF21変異体、またはFGF21突然変異体のPEG化も、医薬として同様の利点を結果としてもたらしうることが予測される。
加えて、PEG化は、非天然アミノ酸の導入により、本発明の方法を構成するFGF21タンパク質、FGF21変異体、またはFGF21突然変異体のうちの任意の部分において達成することができる。ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第7,083,970号明細書において記載されている技術により導入することができる。略述すると、これらの発現系の一部は、アンバー(TAG)などのナンセンスコドンを、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入する部位指向性突然変異誘発を伴う。次いで、このような発現ベクターを、導入されるナンセンスコドンに特異的で、選択した非天然アミノ酸を担うtRNAを活用しうる宿主に導入する。部分を、本発明のポリペプチドにコンジュゲートさせる目的で有益な、特定の非天然アミノ酸は、アセチレン側鎖およびアジド側鎖を伴う非天然アミノ酸を含む。次いで、本発明の方法を構成するFGF21タンパク質、FGF21変異体、またはFGF21突然変異体であって、これらの新規のアミノ酸を含有するタンパク質、変異体、または突然変異体を、タンパク質内のこれらの選択された部位において、PEG化することができる。
1型糖尿病マウスモデルにおける、FGF21のin vivo投与
ヒト1型糖尿病(T1D)は、膵臓β細胞が、インスリンを産生および分泌することができないために、高血漿グルコースレベルおよび低インスリンレベルを呈する。循環中のインスリンレベルが極めて低いことの帰結として、T1D患者は、炭水化物利用量が低減され、脂質利用量が増大することから、体脂肪貯蔵の減少およびケトーシスがもたらされる。
高投与量のβ細胞毒素であるストレプトゾシン(STZ)は、重度のインスリン欠損、ならびにケトーシスおよび過食症を伴うT1Dを誘導する。高用量のSTZを、成体動物に注射すると、β細胞の再生が減殺され、動物は、T1D状態にとどまる。
糖尿病は、1日当たり1kg当たり70mgで、連続3日間にわたる、STZの腹腔内注射を介して、22週齢の雄C57BLマウスにおいて誘導した。完全に糖尿病性となった(初回のSTZ注射から12〜19日後)ら、2つの別個の研究において、マウスに、媒体(PBS)もしくは野生型FGF21(1日当たり1kg当たり3mg、皮下注射)を12日間にわたり施すか、または媒体もしくは変異体76を、毎週2回(1kg当たり1mgまたは3mg、毎週2回、皮下注射)ずつ、26日間にわたり施した。非STZマウスによる1つの群を、各研究のための正常対照として使用した。全ての動物を、RERおよびエネルギー消費量を測定する前に、少なくとも24時間にわたり、TSEシステム内で馴致した。
研究1におけるマウス群は、正常:媒体(n=6);STZ:媒体(n=6);STZ:野生型FGF21(n=6)であった。研究2におけるマウス群は、正常:媒体(n=8);STZ:媒体(n=8);STZ:1kg当たり1mgのCmpd A(n=8);STZ:1kg当たり3mgのCmpd A(n=8)であった。グルコース、インスリン、HbA1c、呼吸交換比(RER)、エネルギー消費量、食物摂取量、体重、副睾丸脂肪量、およびケトン体レベルの測定を行った。下記の表1および2に見られる通り、STZ処置マウスは、高血糖性および低インスリン血性となる。
表2および3ならびに図1〜7に見られる通り、野生型FGF21および半減期延長型FGF21(変異体76)を投与した後で、以下が観察された:インスリン分泌の回復を伴わない、STZ誘導性T1Dマウスにおける高血糖症の減少(図1ならびに表2および3)。変異体76はまた、研究時におけるHbA1cレベルも低下させた(図2)。野生型FGF21および変異体76のいずれも、炭水化物利用量(図3に見られる)およびエネルギー消費量(図4に見られる)を増大させ、過食症(図5に見られる)、ケトン生成量(図6に見られる)および脂肪量の減少(図7に見られる)を低減した。
B型インスリン抵抗性:FGF21は、抗インスリン受容体モノクローナル抗体の存在下における、ヒト脂肪細胞内のグルコース取込みを刺激する
INSRノックアウトマウスは、生存不可能であり、生後数日間で死亡することが典型的である。マウスにおけるINSRの組織特異的ノックアウトは忍容されるが、INSR突然変異を伴う患者において見られる症状のスペクトルの全体が、これらの動物において再現されるわけではない。したがって、FGF21は、INSR不活化の文脈でも役割を果たしうるという臨床仮説をさらに検証するため、本発明者らは、FGF21が、抗INSR中和抗体の存在下という、インスリンシグナル伝達が顕著に損なわれる条件下で、ヒト脂肪細胞内のグルコース取込みを促進する能力を測定した。この実験は、INSRに対する中和性自己抗体の発生により引き起こされる、B型インスリン抵抗性(自己免疫性インスリン抵抗性)の表現型を効果的に再現する。
分化したヒト脂肪細胞内のグルコース取込みの測定は、生理学的に関与性のリードアウトとして広く使用されている。FGF21は、ヒト脂肪細胞内の、インスリン非依存的な様式でのグルコース取込みを呈する。INSR機能不全状態についてin vitroで研究するために、本発明者らは、抗INSRモノクローナル抗体(Millipore型番MAB1137)の非存在下および存在下でグルコース取込みを刺激する、インスリンおよびFGF21の活性について調べた。
初代ヒト脂肪細胞を、96ウェルコラーゲンコーティングプレートに、ウェル1つ当たりの細胞15,000個で播種し、脂肪細胞分化培地(Cell Application)中で、12日間にわたり分化させ、次いで、脂肪細胞維持培地(Cell Application)で3日間にわたり処理した。グルコース取込みの測定のために、脂肪細胞を、100nMのインスリンで、30分間にわたり処理するか、または100nMのFGF21で、37℃、24時間にわたり処理した。脂肪細胞を、クレブスリンゲルリン酸(KRP)緩衝液で洗浄し、0.05μCiの2−デオキシ−D−[3H]グルコース(2−DOG)を含有するKRPで、37℃、1時間にわたり処理した。細胞を溶解させ、MicroBetaカウンター(Perkin Elmer)を使用して、グルコース取込みを測定した。抗INSR抗体の存在下で、インスリンまたはFGF21によるグルコース取込みの刺激について研究するため、インスリン処理またはFGF21処置の前に、脂肪細胞を、0.1nM、10nM、および100nMの抗体で、37℃、1時間にわたり前処理した。
図8Aにおいて示される通り、100nMのインスリンは、それ自体では、ヒト脂肪細胞内の頑健なグルコース取込み応答を刺激した。0.1nMの抗INSR抗体の存在下では、インスリンにより刺激されるグルコース取込みは、変化しなかった。しかし、10nMおよび100nMの抗INSR抗体による前処理は、インスリンにより刺激されるグルコース取込みを消失させた。しかし、図8Bにおいて示される通り、100nMのFGF21は、抗INSR抗体の非存在下で、グルコース取込みを刺激した。0.1nMおよび10nMの抗INSR抗体による前処理も、FGF21によるグルコース取込みの刺激をそれほど低減しなかった(それぞれ、10%および12%)。FGF21活性は、100nMで投与される、高濃度の抗INSR抗体の存在下でだけ消失した。
これらのデータは、B型インスリン抵抗性(自己免疫性インスリン抵抗性)を伴う患者におけるFGF21類似体の使用のほか、他のインスリン受容体欠損(例えば、A型インスリン抵抗性、ラブソン−メンデンホール症候群およびドナヒュー症候群など、インスリン受容体内の突然変異により引き起こされる)を伴う任意の患者におけるFGF21類似体の使用も支持する。
HIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィー
HIV/HAART(highly active antiretroviral therapy)により誘導されるリポジストロフィーについてのモデルにおけるFGF21の効果について研究するため、12週齢のC57BLマウス(Taconic)に、Research Dietsにより、0.1または0.2%のHIVプロテアーゼ阻害剤であるリトナビルと共に製剤化された、PicoLabマウス飼料#5058(脂肪含量を10%とする)を施した。リトナビルによる処置の50日後、マウスは、リポジストロフィーを発症し、これを、2つのサブグループへと分け、FGF21 V76(1kg当たり5mg、s.c.)またはPBS媒体を、毎週2回ずつ4週間にわたり施した。体重、体脂肪量%、血漿グルコース、インスリン、およびTGは、研究期間中に測定した。経口糖負荷試験(OGTT)は、処置の23日目に評価した。肝臓脂質含量は、研究終了時に測定した。
V76処置の前に、リトナビルと混合された飼料を施されたマウスは、対照飼料を施されたマウスと比べて、体重増加(図9A)および脂肪含量(図9B)の有意な低減のほか、血漿トリグリセリドレベルの上昇(図9C)を発症した。
体重は、FGF21 v76処置により有意に低減された(図10A)。脂肪量もまた、FGF21 v76処置により有意に低減された(図10B)。FGF21 v76で処置されたマウスでは、OGTT時におけるグルコースエクスカーションが有意に改善された(図10C)。リトナビルによる処置は、HOMA−IRおよび肝臓脂質含量の増大を結果としてもたらす。FGF21 v76による処置は、0.1%リトナビル群および0.2%リトナビル群の両方において、HOMA−IR(図10D)および肝臓脂肪症(図10E)を完全に正常化した。
HIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーマウスモデルでは、FGF21 v76による25日間にわたる(1kg当たり5mg、毎週2回)処置は、75日間にわたる、リトナビルを伴う飼料混合物により誘導された、インスリン抵抗性および肝臓脂肪症を完全に緩和した。前臨床データは、HIVプロテアーゼ阻害剤によりリポジストロフィーを発症した患者における、FGF21治療の新規の手法を支持する。
t10,c12共役リノール酸誘導性リポジストロフィー:
第2のより重度のリポジストロフィーモデルにおけるFGF21 V101の効果について研究するため、マウスに、0.6%のt10,c12共役リノール酸(t10,c12 CLA)を含有する飼料を施した。マウスを、1)給餌開始の1週間後(「予防」モード)、または2)給餌開始の3週間後(「反転」モード)に開始するFGF21 V101で処置した。また、組換えマウスレプチンの効果についても、「反転」モードにおいて、陽性対照として調べた。体重、肝臓脂肪、脂肪量、グルコース、インスリン、および血漿中脂質が、一次リードアウトであった。
動物:
C57B6J雄マウスを、個別に飼育し、6週間にわたり標準固形飼料で施設に馴致してから、18週齢時に特殊飼料を開始した。マウスは、下記の表5に列挙される類型へと群分けした。
飼料:
精製t10,c12 CLAは、Matreya,LLCで合成され、Research Diets,Incへと送付された。精製特注飼料は、Research Diets,Incにより毎週新たに調製される。t10,c12 CLA飼料は、0.6%のt10,c12 CLAを含有した。毎日の配分量を、バッグに入れ、窒素でパージし、真空で密封し、−20℃で保存し、毎日マウスに施す。飼料成分を、下記の表4に列挙する。
2週間にわたる施設への馴致の後、マウスを、0.6%のt10,c12 CLA飼料または対照飼料へと切り換えた。標準固形飼料を施される1つの群のマウス(群11(この群および他の群の詳細については、表4を参照されたい))は、0日目における肝臓脂肪および脂肪量の測定のために、研究開始時に屠殺した。加えて、t10,c12 CLA飼料を施される群のマウス(群9)および対照飼料を施される群のマウス(群10)も、給餌の1週間後に、また、給餌の3週間後にも(群7および8)、さらなる処置を伴わずに屠殺した。群7〜10のデータは、FGF21 v101処置またはレプチン処置の前に肝臓脂肪および脂肪量を確立するのに使用する。別の群(群6)には、研究終了時点のための正常対照として用いられるよう、研究終了時まで対照飼料を施すように維持した。
マウスの1つの群(群1)では、t10,c12 CLA飼料を施した1週間後にFGF21 v101処置を開始して、FGF21が、リポジストロフィーの進行「を予防し」うるのかどうかについて評価した。マウスの別の群(群2)では、t10,c12 CLA飼料を施した3週間後にFGF21 v101処置を開始して、FGF21 v101が、疾患「を反転し」うるのかどうかについて評価した。FGF21 v101の対照群(群3)には、t10,c12 CLA飼料を施した3週間後に開始するPBS注射を施した。その後、群1〜3に、PBSまたはFGF21の皮下注射を、毎週1回施した。飼料を施した3週間後に、群4および5には、レプチンまたは生理食塩液をそれぞれ、連続的に送達する、Alzet浸透圧式ミニポンプを皮下に植え込んだ。その後、体重、血中グルコース、血漿インスリン、および血漿脂質(尾静脈採血)を、群1〜5について毎週測定した。
飼料を施した5週間後に、群1〜6に、経口糖負荷試験(OGTT)(1kg当たり2gのグルコース)を施し、グルコース負荷の0、10、20、40、および90分後に、グルコースを測定した。飼料を施した6週間後に、体重、血中グルコース、血漿インスリン、および血漿脂質(尾静脈採血)を、屠殺の前に、群1〜6について測定した。屠殺時に、肝臓、脂肪貯蔵部分(副睾丸、後腹膜、および鼠蹊部)、筋肉(ヒラメ筋およびTA)、および血漿用の血液(心臓スティック(cadiac stick))を回収した。肝臓および脂肪貯蔵部分を秤量した。Bruker minispectrophotometerを使用して、肝臓および筋肉組織を、脂肪含量について解析した。総肝臓脂肪(g)は、(肝臓重量×(%肝臓脂肪/100))として計算する。
用量の投与:
FGF21 V101は、PBS中の溶液として与えた。1kg当たり1mgを毎週1回皮下投与した(0.25mg/mlのFGF21 V101溶液を使用して)。
大腸菌(E.coli)内で組換え発現させ、PBS中に溶解させた凍結乾燥粉末である、マウスレプチン(Sigma製、型番L3772、ロット番号081M1287V)は、Alzet浸透圧式ミニポンプによる連続皮下注入を介して、1日当たり1kg当たり1mgの投与量で投与した。
脂肪貯蔵部分
脂肪量減少の時間経過を、図11Aに描示する。脂肪貯蔵部分の重量(図11B)は、副睾丸脂肪、後腹膜脂肪、および皮下鼠蹊部脂肪の合計として測定した。本発明者らは、低脂肪含量の飼料(脂肪に由来するkcalを10%とする)を施された正常マウスを使用したので、検出される実質的貯蔵部分は、これらの3つの貯蔵部分だけであった。t10,c12 CLA飼料を施された(そしてPBS処置された)マウスは、6週間にわたる研究中に、対照飼料を施されたマウスと比較して、それらの脂肪量のうちの約85%を喪失した(対照飼料の1.6gに対する、CLA飼料の0.27g)。
「予防」モードでは、FGF21 v101で処置されたマウスは、さらなる0.15gの脂肪量(一元ANOVAによるP<0.05)を喪失した。「反転」モードでは、FGF21 v101で処置されたマウスは、さらなる0.1gの脂肪量(統計学的に有意でない)を喪失した。同様に、レプチンで処置されたマウスは、さらなる0.1gの脂肪量(統計学的に有意でない)を喪失した。予測される通り、FGF21 v101処置も、レプチン処置も、末梢における脂肪量を回復させなかった。
肝臓脂肪
屠殺時において、肝臓の重量を測定した(図12A)。肝臓の小片(約40mg)を、Bruker minispectrophotometer組織組成分析器を使用する、肝臓脂肪の割合(パーセント)の測定のためにサンプリングした。総肝臓脂肪(g)は、(肝臓重量×(%肝臓脂肪/100))として計算した(図12B)。t10,c12 CLA飼料を施された(そしてPBS処置された)マウスは、6週間にわたる研究中、それらの肝臓内に、対照飼料を施されたマウスと比較して、12倍の脂肪を蓄積した(対照飼料の0.06gに対する、CLA飼料の0.75g、一元ANOVAによるP<0.05)。FGF21で処置されたマウスでは、肝臓脂肪の蓄積は、半分に低減された(PBS処置群の0.75g、FGF21 v101による「予防」群の0.34g、FGF21 v101による「反転」群の0.36g)。同様に、レプチンで処置されたマウスでも、肝臓脂肪の蓄積は低減された(PBS処置群の0.75g、レプチン群の0.48g)。肝臓脂肪の全ての低減は、PBS処置群と対比して、統計学的に有意であった(一元ANOVAによるP<0.05)。FGF21処置群における低減は、レプチン処置群における低減と有意に異ならなかった。
食後血中グルコースおよび食後血漿インスリン
研究の6週目に、t10,c12 CLA飼料を施され、PBSで処置されたマウスは、食後血中グルコースが40%増大し(一元ANOVAによるP<0.05)、食後血漿インスリンが20倍に増大し(一元ANOVAによるp<0.05)、t10,c12 CLA飼料により誘導された、顕著なインスリン抵抗性および耐糖能異常、ならびにリポジストロフィーと符合した。
しかし、CLA飼料を施され、FGF21 v101で処置されたマウスでは、「処置」モードであれ、「予防」モードであれ、血中グルコースは上昇しなかった。CLA飼料を施されたマウスであって、レプチンで処置されたマウスでは、血中グルコースは、部分的に上昇した(CLA飼料を施されたPBS処置群の230mg/dL、CLA飼料を施されたFGF21による「予防」群の165mg/dL、CLA飼料を施されたFGF21による「反転」群の163mg/dL、CLA飼料を施されたレプチン群の203mg/dL、対照飼料を施されたマウスの167mg/dL)(図12C)。
同様に、CLA飼料を施されたマウスであって、FGF21で処置されたマウスでは、「処置」モードであれ、「予防」モードであれ、血漿インスリンの増大は、顕著に鈍化し、レプチンで処置されたマウスでも、血漿インスリンの増大は、顕著に鈍化した(CLA飼料を施されたPBS処置群の6.7〜8.7ng/mL、CLA飼料を施されたFGF21による「予防」群の1.8ng/mL、CLA飼料を施されたFGF21による「反転」群の2.2ng/mL、CLA飼料を施されたレプチン群の2.4ng/mL、対照飼料を施されたマウスの0.3ng/ml)(図12D)。
まとめると、CLA飼料から生じた、血中グルコースおよび血漿インスリンの上昇は、CLAが、インスリン抵抗性を促進したことを指し示す。CLA飼料を施されたマウスにおける、血中グルコースおよび血漿インスリンの低減であって、FGF21による処置(「処置」または「予防」における)およびレプチンによる処置から生じた低減は、これらの処置が、CLA誘導性インスリン抵抗性を予防および/または反転したことを指し示す。
経口糖負荷試験
研究の5週目、5時間にわたる空腹後において、OGTTを実施した。マウスに、グルコースを経口投与した(2g/kg、8ml/kg)。血中グルコースは、グルコース投与の前、ならびにグルコース投与の10、20、40、および90分後に測定し、血中グルコースAUC0〜90を計算した(図12E)。
t10,c12 CLA飼料を施された(PBS処置された)マウスでは、血中グルコースAUC0〜90は、対照飼料を施されたマウスと比較して30%大きかった。対照マウスにおける血中グルコースAUCは、CLA飼料を施されたPBS処置群と比較して低減され、CLA飼料を施されたマウスであって、FGF21で処置されたマウスでも、「処置」モードであれ、「予防」モードであれ、血中グルコースAUCは、CLA飼料を施されたPBS処置群と比較して低減された。
要約:
FGF21 V101(1週間当たり1kg当たり1mg)は、0.6%のt10,c12共役リノール酸を施されたマウスを使用するリポジストロフィーモデルにおいて、肝臓脂質の蓄積およびインスリン抵抗性を予防および反転した。これらのデータは、FGF21類似体が、顕著な脂肪減少(リポジストロフィー)により誘導されるインスリン抵抗性および/または高血糖症の処置に有用でありうることを示唆する。
FGF21融合タンパク質V103の、リポジストロフィーマウスモデルにおける効果
方法
動物
20週齢の雄C57BLマウス(Taconic、Germantown、NY)を、ケージ1つ当たり4匹ずつ、光周期が平常の(午前6:00〜午後6:00において点灯)室内に、食物および水を不断に施して飼育した。リポジストロフィーは、マウスに、PicoLabマウス飼料20#5058(脂肪に由来するkcalを21.6%とする)中にリトナビル(0.2%w/w)を含有する、特別に製剤化された飼料を施すことにより誘導した。対照群内のマウスには、リトナビルを伴わない飼料20#5058を施した。リトナビル飼料を施されたマウスが、リポジストロフィー性(給餌の50日目における、血漿トリグリセリドレベルの上昇および体重減少により定義される)となったら、マウスに、PBS(リン酸緩衝生理食塩液)媒体または本明細書で記載されるFGF21融合タンパク質V103(1kg当たり1mg、皮下注射)を、処置の1、8、および17日目に施される、のべ3回の注射にわたり施した。また、リトナビル飼料を施されないマウスにも、研究期間中にPBSを注射した。研究によるのべの処置期間の長さは、25日間であった。
実験は、承認済みのInstitutional Animal Care and Use Committeeプロトコール第12CVM043号下で実行した。この研究における全ての手順は、Animal Welfare Act Regulations 9 CFR Parts 1、2、および3、ならびに他のガイドラインに準拠した。
測定
体重および食物摂取量は、研究を通して測定した。血漿グルコース濃度、血漿インスリン濃度、血漿トリグリセリド(TG)濃度、および血漿遊離脂肪酸(FFA)濃度は、食後状態または空腹状態において測定した。インスリン支援型糖負荷試験(IFGTT;1kg当たり1gのグルコースと、1kg当たり0.5Uのインスリンとの混合物の腹腔内(i.p.)注射による)は、5時間にわたる空腹後17日目に施した。血漿グルコースレベルは、IFGTT前およびIFGTT中に測定した。経口糖負荷試験(OGTT;経口用量を、1kg当たり1gのグルコースとする)は、一晩にわたる空腹後24日目に施した。血漿グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルは、OGTT前およびOGTT中に測定した。身体組成は、Echo MRIにより、リトナビル飼料による誘導の前後、およびV103処置の終了時において(24日目において)決定した。研究の終了時において、肝臓、副睾丸脂肪、および鼠蹊部脂肪を回収し、秤量した。研究の終了時において回収された肝臓およびヒラメ筋は、組織の脂質含量について解析した。
グルコースは、グルコースメーター(Embrace、Omnis Health、Natick、MA)を使用して測定した。インスリンは、超高感度マウスインスリン酵素免疫測定アッセイ(ELISA)キット(Crystal Chem,Inc.、Chicago、IL、型番90080)を使用して測定した。TGおよびFFAは、Amplex(登録商標)Redが過酸化水素によってレゾルフィンへと、西洋ワサビペルオキシダーゼの触媒で酸化されることに基づく高感度蛍光アッセイを使用して測定した。身体組成は、EchoMRI−100(Echo Medical Systems、Huston、TX)を使用して測定した。肝臓脂質含量および筋肉脂質含量は、NMR Mq−60組織脂肪分析器(BRUKER Optics Inc.、The Woodlands.、TX)を使用して測定した。
データ解析
統計学的解析は、GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して実施した。経時解析は、各時点について、二元分散分析(ANOVA)に続く、ボンフェローニ法を使用する事後検定により実施した。時間経過を伴わない3群間の解析は、一元ANOVAに続く、ダネット検定を使用して実行した。また、2つのリトナビル群間の解析も、対応のないスチューデントの両側t検定を使用して実施した。データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として提示した。統計学的有意性の水準は、p<0.05に設定した。
結果
リトナビルの、体重および脂肪量の割合(パーセント)に対する影響
リトナビルで8週間にわたり処置されたマウスは、顕著な体重減少および脂肪量の軽度の低減を示す。対照飼料中およびリトナビル飼料中の両方における高脂肪含量のために、脂肪量は、飼料による処置の終了時に、いずれの飼料群においても2倍を超えて増大した。
リトナビルの、血漿脂質、血漿グルコース、および血漿インスリンに対する影響
リトナビル飼料を施した後には、血漿トリグリセリド(TG)および血漿遊離脂肪酸(FFA)の両方の顕著な増大が見られた。血漿グルコースおよび血漿インスリンは、リトナビルによる処置の影響を受けなかったが、いずれの群におけるインスリンレベルも、50日目には、1日目における値と比較して大幅に上昇したことから、飼料の高脂肪含量が、両方の群におけるインスリン抵抗性をもたらしたことが示唆される。
V103の、体重および脂肪量の割合(パーセント)に対する効果
V103による処置は、体重(BW)および脂肪量の割合(パーセント)を有意に低減した。食物摂取は、処置の影響を受けなかった(データは示さない)。体重は、V103処置時に測定し、脂肪量の割合(パーセント)は、処置の終了時(24日目)に測定した。V103処置は、有意な体重減少のほか、脂肪量の低減ももたらした。対照−媒体群と比較した二元ANOVAによるp<0.05であり、リトナビル−媒体群と比較した二元ANOVA(BW)または一元ANOVA(脂肪量)によるp<0.05である。
V103の、血漿脂質、血漿グルコース、および血漿インスリンに対する効果
V103による処置は、リトナビル処置マウスにおける血漿TGおよび血漿FFAの、対照飼料群で見られるレベルと同様のレベルへの、有意な低減をもたらした。V103で処置されたマウスでは、血漿グルコースおよび血漿インスリンのいずれも、有意に低減された。対照飼料群におけるインスリンレベルは、研究期間中に上昇したことから、飼料中の高脂肪含量の結果としてのインスリン抵抗性が指し示される。標準固形飼料を施されたマウスでは、血漿インスリン濃度は、約1ng/ml(RD−2005−50000)で正常である。
データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。血漿TGおよび血漿FFAは、処置の終了時(25日目)の食後状態において測定した。V103処置は、血漿TGレベルおよび血漿FFAレベルを有意に低減した。対照−媒体群と比較した一元ANOVAによるp<0.05であり、リトナビル−媒体群と比較した一元ANOVAによるp<0.05である。
データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。血漿グルコースおよび血漿インスリンは、V103処置中の食後状態において測定した。V103処置は、血漿グルコースおよび血漿インスリンのいずれも有意に低減した。対照−媒体群と比較した二元ANOVAによるp<0.05であり、リトナビル−媒体群と比較した二元ANOVAによるp<0.05である。
V103の、インスリン感受性およびグルコース利用量に対する効果
インスリン感受性およびグルコース利用量は、17日目におけるIFGTTおよび24日目におけるOGTTを使用して評価した。V103処置は、外因性インスリンを、グルコースと共に投与するIFGTT中における、グルコースエクスカーションの大幅な抑制により指し示される通り、インスリン感受性の有意な改善をもたらした。データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。血漿グルコースは、IFGTT中の空腹状態において測定した。V103処置群におけるグルコースレベルは、媒体で処置されたマウスより有意に低下した。リトナビル−媒体群と比較した二元ANOVAによるp<0.05である。
同様に、V103による処置は、OGTT時の耐糖能を、血漿グルコースおよび血漿インスリンのいずれにおいても有意に改善した。データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。血漿グルコースおよび血漿インスリンは、OGTT中の空腹状態において測定した。V103処置群におけるグルコースレベルおよびインスリンレベルのいずれも、媒体で処置されたマウスより有意に低下した。リトナビル−媒体群と比較した二元ANOVAによるp<0.05である。
加えて、V103で処置されたマウスでは、HOMA−IR(ホメオスタシスモデルによる評価−インスリン抵抗性指数、空腹時グルコースレベルおよび空腹時インスリンレベルに基づき計算される)も、有意に改善された。したがって、V103は、リトナビルで処置されたマウスにおけるインスリン感受性の改善において高度に効果的であった。データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。空腹時血漿グルコースおよび血漿インスリンは、一晩にわたる空腹後24日目に測定した。V103処置群におけるHOMA−IRは、媒体で処置されたマウスより有意に低下した。リトナビル−媒体群と比較した一元ANOVAによるp<0.05である。
V103の、肝臓脂質含量および筋肉脂質含量および組織重量に対する効果
V103処置は、肝臓内および筋肉内の両方における脂質含量の有意な低減を結果としてもたらす。データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。肝臓およびヒラメ筋の脂質含量は、処置の終了時(25日目)に測定した。V103処置は、肝臓内およびヒラメ筋内のいずれにおける脂質含量も有意に低減した。ヒラメ筋内の脂質含量はまた、リトナビル−媒体群でも低下した。対照−媒体群と比較した一元ANOVAによるp<0.05であり、リトナビル−媒体群と比較した一元ANOVA(肝臓脂質含量)またはスチューデントt検定(ヒラメ筋脂質含量)によるp<0.05である。
リトナビルによる処置は、肝臓重量の増大と共に皮下脂肪萎縮を結果としてもたらす。リトナビル処置により、肝臓重量が有意に増大する一方で、白色脂肪体重量は減少した。V103処置は、肝臓重量の正常化を結果としてもたらすが、脂肪体重量のさらなる低減も結果としてもたらす。
データは、平均±SEM(群1つ当たりのN=7〜8)である。肝臓、副睾丸脂肪、および鼠蹊部脂肪の組織重量は、処置の終了時(25日目)に測定した。指し示される通り、リトナビル−媒体群では、肝臓内の組織重量は有意に増大したが、副睾丸脂肪は減少し、V103処置は、3つの組織全ての重量を有意に低減した。対照−媒体群と比較した一元ANOVAによるp<0.05であり、リトナビル−媒体群と比較した一元ANOVAによるp<0.05である。
研究期間中におけるV103の血漿レベル
V103の血漿レベルは、初回投与から間を置かずに(投与の4および24時間後)、ならびに2回目の投与から間を置いて(投与の9日後)、および3回目の投与から間を置いて(投与の8日後)測定した。V103の血漿レベルは、研究期間中、良好に維持された。データは、平均±SEMである(群1つ当たりのN=8)。血漿V103レベルは、初回投与の4および24時間後、2回目投与の9日後、ならびに3回目投与の8日後に測定した。
考察
本発明者らは、HIVプロテイナーゼ阻害剤誘導性リポジストロフィーマウスモデルにおけるV103の効果について評価した。飼料中で長期にわたり毎日施されたリトナビル処置により、マウスは、血漿TGレベルおよび血漿FFAレベルの上昇、肝臓脂質含量の増大、ならびに脂肪量および体重の低減などのリポジストロフィー状態を発症した。標準固形飼料を施された非肥満マウスは、低脂肪量および低体重を維持するので、リトナビル処理により、脂肪組織から肝臓への再分配に十分な量の脂肪を供給するために、飼料20#5058を、リトナビルの添加を伴うかまたは伴わずに(対照群の場合)使用した。マウス飼育の目的で使用された飼料は、標準固形飼料と比較して、2倍量の脂肪を含有する。この飼料を使用することの欠点は、その高脂肪含量のためにインスリン抵抗性を引き起こしうることである。実際、この研究では、本発明者らは、対照飼料を施されたマウスにおける血漿インスリンレベルおよび体脂肪量の割合(パーセント)の増加も観察した。
25日間中でわずか3回の投与にわたるV103処置により、脂質異常性状態は、効果的に改善され、血漿TGレベルおよび血漿FFAレベルのほか、肝臓内および筋肉内の脂質含量も有意に低減された。加えて、V103処置は、IFGTT時およびOGTT時の両方におけるグルコースエクスカーションの抑制により例示される通り、インスリン感受性およびグルコース利用量を有意に増強したほか、HOMA−IRも改善した。
本研究による結果は、V103が、リポジストロフィー患者を処置するための治療法をもたらしうることを示した。V103の、体重減少および脂質低減に対する大きな効果は、肥満および脂肪肝疾患を処置するための、その貴重な潜在的可能性を示唆する。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される科学技術用語は、本開示が属する分野に精通した専門家により通例理解される意味と同じ意味を有する。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、詳細に具体的には記載されていない方法、ステップ、技法、および操作の全ては、当業者に明らかな通り、それら自体公知の様式で実施することができ、実施されている。ここでもまた、例えば、本明細書で言及される、標準的なハンドブックおよび一般的な背景技術、ならびにそれらの中で引用されているさらなる参考文献を参照する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で引用される参考文献の各々は、参照によりその全体において組み込まれる。
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的なものであり、下記に提示される。
本明細書では、特定の態様および特許請求の範囲について詳細に開示してきたが、これは、例として、例示だけを目的としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、または任意の対応する将来の出願の特許請求の範囲の対象物の範囲に関して限定的であることを意図するものではない。他の態様、利点、および変更も、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。当業者は、日常的な実験だけを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的態様の多くの均等物を認識または確認することが可能であろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。後日になされる、対応する出願において、特許請求の範囲が、多様な国の特許法による制約を受ける場合もあるが、本特許請求の範囲の対象物を放棄するものとして解釈すべきではない。

Claims (15)

  1. インスリン受容体障害(INSR障害)を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の(a)単離ヒトFGF21ポリペプチド;または(b)FGF21タンパク質変異体を投与するステップを含む方法。
  2. 前記INSR障害が、1型糖尿病である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記INSR障害が、脂質異常症である、請求項1に記載の方法。
  4. 前記INSR障害が、高血糖症である、請求項1に記載の方法。
  5. 前記INSR障害が、低血糖症である、請求項1に記載の方法。
  6. 前記INSR障害が、耐糖能異常である、請求項1に記載の方法。
  7. 前記INSR障害が、HIV/HAART誘導性部分型リポジストロフィーである、請求項1に記載の方法。
  8. 前記INSR障害が、メタボリック症候群である、請求項1に記載の方法。
  9. 前記INSR障害が、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)である、請求項1に記載の方法。
  10. 前記FGF21タンパク質変異体が、変異体76である、請求項1に記載の方法。
  11. 前記FGF21タンパク質変異体が、Fc融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
  12. 前記Fc融合タンパク質が、表1から選択される、請求項11に記載の方法。
  13. 前記Fc融合タンパク質が、変異体101である、請求項11に記載の方法。
  14. インスリン受容体障害(INSR障害)を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のFGF21タンパク質変異体を投与するステップを含み、前記FGF21タンパク質変異体を、投与方式との適性について選択される薬学的または生理学的に許容される製剤と混合された治療有効量のFGF21タンパク質変異体を含む医薬組成物の形態で投与する方法。
  15. インスリン受容体障害(INSR障害)を処置する方法であって、それを必要とする対象に、1または複数のPEGサブユニットで共有結合的に修飾された治療有効量のFGF21タンパク質変異体を投与するステップを含む方法。
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