JP2017501692A - 治療用ペプチド - Google Patents

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Abstract

本開示は、一部において、ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）と免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物を提供する。【選択図】 なし

Description

（関連出願）
本願は、２０１３年１２月６日出願の米国仮特許出願番号第６１／９１３，１９８号および２０１４年３月１４日出願の米国仮特許出願番号第６１／９５３，５８８号（これらの全開示内容は引用により本明細書に組み込まれる）に関する利益を主張する。
（政府支援）
本発明は、国立衛生研究所による助成金番号Ｐ０１ ＡＩ０４５７５７およびＰ０１ ＣＡ７８３７８のもと、政府支援により成された。政府は、本発明において特定の権利を有する。
（技術分野）
本発明は、ヒト対象に関連した治療用組成物（例えば、ペプチド）に関する。
ある状態または疾病に曝されたヒト対象は、治療上の潜在力を有する抗体の供給源となり、そのような抗体を得るための一般的な方法は当分野では公知である。しかしながら、治療上の潜在力を有する抗体を特異的に得る方法は、一般に、そのような抗体を発現するＢ細胞の低頻度で遅い増殖率および低い抗体分泌レベルにより制限される。例えば、規定の特異性を有する記憶Ｂ細胞は、典型的には、１００万の末梢血単核細胞につき又は約１ミリリットルの血液あたりたった１つの細胞の割合に過ぎない（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９８−３０４（２００９）：Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２３７：１１７−１３９（２０１０））。治療上の潜在力を有する抗体の頻度は癌患者ではより低いようであり、高精度かつ高効率に、そのような細胞を単離することを可能にする新しいアプローチの開発が必要である。
従来の方法は、一般に、インビトロ培養による記憶Ｂ細胞から抗体分泌細胞への転換に、および／または免疫動物モデル（例えば、マウス）の使用に頼っている（Ｃｒｏｔｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４９６９−４９７３（２００３）：Ｆｅｃｔｅａｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２８：ｅ３５３−ｅ３６５（２００９）：Ｂｕｉｓｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：１７９−１８６（２００９）：Ｃｏｒｔｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，５：ｅ８８０５（２０１０））。例えば、最長１週間のインビトロ培養の後、抗体は培養上清において評価することができ、抗体分泌細胞の頻度は酵素結合免疫吸吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて評価する。そのような方法の限界が報告されている（Ｈｅｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：３１７７７−３１８７（２００９）：Ｃａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５８：５６−６５（２０１０））。例えば、記憶Ｂ細胞のインビトロ培養は、記憶Ｂ細胞の表現型を改変し、異なる機能的特性を有する形質細胞のようになる（Ｊｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２２０５−２２１３（２００７）：Ｈｕｇｇｉｎｓら、Ｂｌｏｏｄ，１０９：１６１１−１６１９（２００７）：Ｊｏｕｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ，１１４：５１７３−５１８１（２００９））。蛍光抗原ベースの方法についての限界も報告されている（Ｈｏｆｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２１１：２９５−３０２（２００６）：Ｏｄｅｎｄａｈｌら、Ｂｌｏｏｄ，１０５：１６１４−１６２１（２００５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：８２２−８２９（２００３）：Ｓｃｈｅｉｄら、Ｎａｔｕｒｅ，４５８：６３６−６４０（２００９）：Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２９：８５６−８６１（２０１０））。
Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９８−３０４（２００９） Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２３７：１１７−１３９（２０１０） Ｃｒｏｔｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４９６９−４９７３（２００３） Ｆｅｃｔｅａｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２８：ｅ３５３−ｅ３６５（２００９） Ｂｕｉｓｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：１７９−１８６（２００９） Ｃｏｒｔｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，５：ｅ８８０５（２０１０） Ｈｅｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：３１７７７−３１８７（２００９） Ｃａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５８：５６−６５（２０１０） Ｊｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２２０５−２２１３（２００７） Ｈｕｇｇｉｎｓら、Ｂｌｏｏｄ，１０９：１６１１−１６１９（２００７） Ｊｏｕｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ，１１４：５１７３−５１８１（２００９） Ｈｏｆｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２１１：２９５−３０２（２００６） Ｏｄｅｎｄａｈｌら、Ｂｌｏｏｄ，１０５：１６１４−１６２１（２００５） Ｋｕｎｋｅｌら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：８２２−８２９（２００３） Ｓｃｈｅｉｄら、Ｎａｔｕｒｅ，４５８：６３６−６４０（２００９） Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２９：８５６−８６１（２０１０）
治療上の潜在力を有する抗体を特異的に得る又は標的とする改善された方法が要求されている。
ＭＩＣＡは、ほとんどのヒトＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞上に発現しているＮＫＧ２Ｄ、Ｃタイプ・レクチン様ＩＩ型膜貫通型受容体に対するリガンドである。ライゲーションの際に、ＮＫＧ２Ｄは、アダプタータンパク質ＤＡＰ１０を通じてシグナルを送り、パーフォリン依存的細胞溶解を引き起こし、及び副刺激を与える。ヒトでは、ＮＫＧ２ＤリガンドにはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｈａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ：ＭＩＣＡ）、その近縁のＭＩＣＢ、ＵＬ−１６結合タンパク（ＵＬＢＰ）１−４およびＲＡＥ−１Ｇが含まれる。ＮＫＧ２Ｄリガンドは健常組織では通常見られないが、さまざまな形態の細胞ストレス、例えばＤＮＡ損傷により、リガンドの発現が上方調節され、結果的に、複数の固形悪性腫瘍および血液学的悪性腫瘍、例えばメラノーマにおいてそれらは高頻度に検出される。ＮＫＧ２Ｄ欠損や抗ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体で処理した野生型マウスは増強された腫瘍感受性を呈するため、リガンド陽性形質転換細胞を通じたＮＫＧ２Ｄの活性化は外因性の腫瘍抑制に寄与する。しかしながら、患者では腫瘍細胞からＮＫＧ２Ｄリガンドが脱落し、これは表面ＮＫＧ２Ｄの内面化および細胞障害性リンパ球の機能障害を起し、これによって、免疫回避が獲得され得る。可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドは、また、Ｆａｓリガンド、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを通じた抗腫瘍細胞障害性をアンタゴナイズし得る制御性ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の増殖を刺激し得る。ＭＩＣＡは、腫瘍細胞から脱落された、即ち細胞表面から周囲の媒体に放出されたＮＫＧ２Ｄリガンドであり、癌患者由来の血清は典型的には高濃度の可溶型（ｓＭＩＣＡ）を含む。ＭＩＣＡ脱落は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲｐ５との相互作用を通じて部分的に達成される。ＥＲｐ５はそのα３ドメインのアンフォールディングを結果的にもたらす重要なシステインとジスルフィド結合を形成し、ＡＤＡＭ−１０／１７およびＭＭＰ１４によるタンパク質分解に対してＭＩＣＡを感受性にさせる。
癌標的を特異的に認識して結合する、免疫ベースの癌治療としての新しい薬物を特定することに関する要求がある。そのような薬物は、診断上のスクリーニング及び腫瘍成長と関連する疾病状態における治療的介入に有用であり得る。
（概要）
本開示は、治療上の潜在力を有する抗体に関連した組成物および方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｈａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ：ＭＩＣＡ）またはそのエピトープと免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、前記組成物のペプチドは、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、そのようなペプチドは、表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨのＣＤＲ２、又は５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ２、もしくはその両方をさらに含む。いくつかの態様において、そのようなペプチドは、表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）２、又は表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ２、もしくはその両方を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨのＣＤＲ１、又は５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ１、もしくはその両方をさらに含む。いくつかの態様において、そのようなペプチドは、表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、又は表１で示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ１、もしくはその両方を含む。
いくつかの態様において、ペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：１５０または１６８と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１５０または１６８内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；および、配列番号：１５２または１７０と同一性を有するＶＬ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１５２または１７０内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１１または１２のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：１５０または１６８を含むＶＨ鎖および配列番号：１５２または１７０を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される特定の抗体によって認識されるエピトープの全部もしくは一部を含むＭＩＣＡ内のエピトープに結合する抗体または抗体断片であるペプチドを提供する。いくつかの実施例では、抗体または抗原結合断片は、ＭＩＣＡ＊００９の参照配列（配列番号：１８５）のアミノ酸１８１〜２７４に対応するＭＩＣＡα３ドメイン内の領域を認識する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：１３１を含むＶＨ鎖および配列番号：１３３を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＧＤＶＬＰＤＧＮＧＴＹＱＴＷＶＡＴＲＩＣ（配列番号：１８６）を含む又は重複するＭＩＣＡの少なくとも１つの一部の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含むエピトープを認識する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：１１３を含むＶＨ鎖および配列番号：１１５を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＮＶＥＴＥＥＷＴＶＰ（配列番号：１８７）を含む又は重複するＭＩＣＡの少なくとも１つの一部の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含むエピトープを認識する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：１５０を含むＶＨ鎖および配列番号：１５２を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＴＶＰＰＭＶＮＶＴＲ（配列番号：１８８）を含む又は重複するＭＩＣＡの少なくとも１つの一部の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含むエピトープを認識する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：１６８を含むＶＨ鎖および配列番号：１７０を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＴＣＲＡＳＳＦＹＰＲ（配列番号：１８９）を含む又は重複するＭＩＣＡの少なくとも１つの一部の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含むエピトープを認識する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：７７を含むＶＨ鎖および配列番号：７９を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：２を含むＶＨ鎖および配列番号：１１を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号：９６を含むＶＨ鎖および配列番号：９８を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。
いくつかの態様において、ペプチドに加えて、組成物は１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または２０未満）の抗癌療法をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は医薬組成物（例えば、対象への投与のための組成物）として処方される。
いくつかの実施例において、本開示は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）またはそのエピトープと免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物の核酸は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨをコードする。いくつかの態様において、組成物の核酸は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＬをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１０と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：７６と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：７８と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：９５と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：９７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：９８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１１２と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１１４と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１３０と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１３２と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１４９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１５１と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１６７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１６９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＭＩＣＡおよび細胞内Ｔ細胞ドメインと免疫特異的に結合するペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を提供する。１つの態様において、ＣＡＲに含まれるペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：２と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：２内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または配列番号：１１と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１１内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：２を含むＶＨ鎖および配列番号：１１を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
１つの態様において、ＣＡＲｓに含まれるペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：７７と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：７７内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または配列番号：７９と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ６のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：７９内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：７７を含むＶＨ鎖および配列番号：７９を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
１つの態様において、ＣＡＲｓに含まれるＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：９６と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：９６内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；および配列番号：９８と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ７のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：９８内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：９６を含むＶＨ鎖および配列番号：９８を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
１つの態様において、ＣＡＲｓに含まれるＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：１１３と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１１３内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または配列番号：１１５と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ８のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１１５内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：１１３を含むＶＨ鎖および配列番号：１１５を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
１つの態様において、ＣＡＲｓに含まれるＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：１３１と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１３１内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または配列番号：１３３と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ９のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１３３内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：１３１を含むＶＨ鎖および配列番号：１３３を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
１つの態様において、ＣＡＲｓに含まれるＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：１５０と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１５０内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または配列番号：１５２と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１５２内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：１５０を含むＶＨ鎖および配列番号：１５２を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
１つの態様において、ＣＡＲｓに含まれるＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドは、以下を含む抗体または抗体断片である：配列番号：１６８と同一性を有するＶＨ鎖、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１６８内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；または配列番号：１７０と同一性を有するＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対応する配列番号：１７０内の領域は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号：１６８を含むＶＨ鎖および配列番号：１７０を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
他の実施形態において、本開示は、ＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはポックスウイルスベクター）を提供する。１つの態様において、ベクターは、配列番号：１０、７８、９７、１１４、１３２、１５１または１６９と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１、７９、９８、１１５、１３３、１５２または１７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
他の態様において、ベクターは、配列番号：１、７６、９５、１１２、１３０、１４９または１６７と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１、１５０または１６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
他の態様において、ベクターは、配列番号：１、７６、１１２、１３０または１４９と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１または１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：１と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１０と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：７６と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：７８と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：９５と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：９７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：９８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：１１２と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１１４と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：１３０と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１３２と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：１４９と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１５１と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：１６７と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１６９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
いくつかの実施例において、本開示は、対象における癌を処置する方法を含む。いくつかの態様において、方法は、本明細書中で開示した１つまたは複数のペプチドおよび／または核酸を含む組成物を対象に投与することを含む。
また、本開示は、免疫治療の後に、癌患者からヒト抗体を単離する方法を提供する。
いくつかの実施例において、本開示は、対象から自己抗原に対する免疫細胞を得る方法であって、自己抗原に対して陽性の免疫応答を示す対象を特定すること、多重型の自己抗原を供すること、前記多重型の自己抗原を自己抗原に対して陽性の免疫応答を示す前記対象由来のサンプルと接触させること、および前記多重型の自己抗原に結合した免疫細胞を得ることを含む方法を含む。
いくつかの実施例において、本開示は、癌患者から自己抗原に対する免疫細胞を得る方法であって、自己抗原に対して陽性の免疫応答を示す対象を特定すること；多重型の自己抗原を供すること；前記多重型の自己抗原を自己抗原に対して陽性の免疫反応を示す前記対象由来のサンプルと接触させること；および前記多重型の自己抗原と結合した免疫細胞を得ることを含む方法を含む。
本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、そうでないと定義されない限り、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本発明に使用するための方法および物質を本明細書に記載するが；当分野で公知の他の適切な方法および物質を用いることもできる。物質、方法および実施例は、単なる例示であり、限定されることを意図するものではない。すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース・エントリおよび本明細書で言及される他の参考文献は、引用により完全に本明細書に組み込まれる。齟齬がある場合、定義を含め本明細書が優先される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１は、抗体ＩＤ１（抗ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：１）である。 図２は、抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号：２）である。 図３は、抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖の核酸酸配列（配列番号：１０）である。 図４は、抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１１）である。 図５Ａ〜５Ｆは、Ｂ細胞から抗体を産生する例示的な方法のイラストである。（Ａ）抗原を、蛍光標識化ストレプトアビジンによる部位特異的ビオチン化および四量体化のためのＢｉｒＡタグを含めて発現させる。（Ｂ）Ｂ細胞を四量体およびモノクローナル抗体パネルで染色する。四量体＋、クラススイッチした記憶Ｂ細胞をＰＣＲストリップに単細胞保存する。（Ｃ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡ増幅を実施する。（Ｄ）３００〜４００ｂｐのＰＣＲ産物を用いて、ＰＣＲ産物の配列決定を行う。（Ｅ）別個のベクターにクローニングされている全長ＩｇＧ１重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖配列の構築物のために、オーバーラップＰＣＲを用いる。ベクターを、完全なヒト組換え抗体の発現のためにＣＨＯ−Ｓ細胞に一過性に導入する。（Ｆ）抗体を、抗原結合性について試験して、潜在的な治療上の特徴について評価する。 図６Ａ〜６Ｂは、記憶Ｂ細胞を特定するための単量体および四量体抗原の比較を示すグラフである。（Ａ）モノビオチン化ＴＴＣＦまたはＣＤ８０抗原を、直接、Ａｌｅｘａ−４８８フルオロフォアで標識化した。未標識ストレプトアビジンを用いて、四量体を創出した。各ドナーから富化したＢ細胞を、３つの画分に分け、対照ＣＤ８０四量体、ＴＴＣＦ単量体またはＴＴＣＦ四量体を同じ総抗原濃度０．１２５μｇ／ｍＬにて用いて染色した。ＦＡＣＳのプロットは、ＣＤ１９＋ ＣＤ２７＋ ＩｇＭ−クラススイッチした記憶Ｂ細胞を示す。ゲートに近接する数値は、元のゲートに関するパーセンテージを表す。（Ｂ）３つの異なるドナーで検出された四量体＋記憶Ｂ細胞の頻度。数値は、ＣＤ１９＋記憶Ｂ細胞１×１０６個あたりの四量体＋細胞として計算される。 図７Ａ〜７Ｂは、形質芽細胞および記憶Ｂ細胞から創出された抗体によるＴＴＣＦに関する高親和性の結合を示す線グラフである。飽和結合試験を行い、組換え抗体の親和力を決定した。ＴＴＣＦ抗原を、キレート試薬と共にインキュベーとした際に６１５ｎｍで強蛍光シグナルを発するユーロピウムで標識化した。抗体を９６ウェルプレートに固相化し、ＴＴＣＦ−ユーロピウム（１００ｎＭ〜４ｐＭ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。６１５ｎｍの蛍光カウントを記録し、非線形回帰分析を用いて、ＫＤを計算した。ＣＨＯ−Ｓ細胞でも産生された対照抗体（クローン８．１８．Ｃ５）をすべての試験においてインキュベートした。（Ａ）組換えＴＴＣＦＡｂ１およびＡｂ２をＴＴＣＦ四量体＋形質芽細胞（ドナー１）から創出した。（Ｂ）ＴＴＣＦ抗体３、４および５は３つの異なるドナーのＴＴＣＦ四量体＋記憶Ｂ細胞から創出した。 図８は、ＭＩＣＡ被覆したｌｕｍｉｎｅｘビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合性を示す棒グラフである。 図９Ａ〜９Ｅは、ＭＩＣＡ被覆したビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合性を示す線グラフである。 図９Ｆ〜９Ｊは、ＭＩＣＡ被覆したビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合性を示す線グラフである。 図９Ｋ〜９Ｏは、ＭＩＣＡ被覆したビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合性を示す線グラフである。 図１０は、抗体ＩＤ６（抗ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）抗体）の可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：７６）を示す。 図１１は、抗体６（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号：７７）を示す。 図１２は、抗体ＩＤ６（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変軽鎖（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：７８）を示す。 図１３は、抗体ＩＤ６（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：７９）を示す。 図１４は、抗体ＩＤ７（抗ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）抗体）の可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：９５）を示す。 図１５は、抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号：９６）を示す。 図１６は、抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変軽鎖（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：９７）を示す。 図１７は、抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：９８）を示す。 図１８は、抗体ＩＤ８（抗ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）抗体）の可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：１１２）を示す。 図１９は、抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１１３）を示す。 図２０は、抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変軽鎖（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：１１４）を示す。 図２１は、抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１１５）を示す。 図２２は、抗体ＩＤ９（抗ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）抗体）の可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：１３０）を示す。 図２３は、抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨのアミノ酸配列（配列番号：１３１）を示す。 図２４は、抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変軽鎖（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：１３２）を示す。 図２５は、抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１３３）を示す。 図２６Ａ〜Ｇは、組換え抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡアレル特異的結合に関する評価を示す線グラフである。 図２７は、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２による自己腫瘍細胞の標識化を示す線グラフである。 図２８は、血清ＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄ調節を示す一連のＦＡＣＳプロットである。ヒトＮＫ細胞を、患者ＣＭ２４００２由来の対照血清と共に１：１０希釈で４８時間インキュベートした。表示した抗体をインキュベーション開始時に濃度１０μｇ／ｍｌで加えた。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄの発現をフローサイトメトリーにて評価した。 図２９は、組換えＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄ調節を示す一連のＦＡＣＳプロットである。ヒトＮＫ細胞を、組換えＭＩＣＡ２ｎｇ／ｍｌと共に４８時間インキュベートした。表示した抗体をインキュベーション開始時に濃度１０μｇ／ｍｌで加えた。４８時間後にＣＤ５６＋ＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄの発現をフローサイトメトリーにて評価した。 図３０は、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２による細胞媒介性細胞障害（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）の亢進を実証する線グラフである。ヒトＮＫ細胞を、表示した抗体１０μｇ／ｍｌの存在下、組換えＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍｌ）と共に４８時間インキュベートした。表示した比率でのＫ５６２標的細胞を殺傷するＮＫ細胞（エフェクター）の能力を、４時間のインキュベーション後のＬＤＨ放出を測定することにより評価した。 図３１は、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９による細胞媒介性細胞障害を実証する棒グラフである。ヒトＮＫ細胞を、表示した抗体１０μｇ／ｍｌの存在下、組換えＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍｌ）と共に４８時間インキュベートした。Ｋ５６２標的細胞を殺傷するＮＫ細胞（エフェクター）の能力を、４時間のインキュベーション後のＬＤＨ放出を測定することにより評価した。ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体またはＦｃ遮断抗体を加え、エフェクター細胞と標的細胞とを４時間インキュベートする間に、細胞媒介性細胞障害に対するＦｃ受容体およびＮＫＧ２Ｄの寄与を評価した。 図３２は、組換え抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡα３ドメインの結合を示す一連の線グラフである。組換えＭＩＣＡα３ドメインをビオチン化し、ストレプトアビジン被覆したビーズの表面に捕捉させた。表示した抗体を１０μｇ／ｍｌで各組換えタンパク質で被覆したビーズと共に１時間インキュベートした。続いて、ビーズを洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。ＦＩＴＣ蛍光をフローサイトメトリーにより定量した。 図３３は、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９による腫瘍細胞の標識化を実証する線グラフである。蛍光はフローサイトメトリーにより測定した。 図３４は、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにより決定された抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２Ａｂ２９のＭＩＣＡ対立遺伝子特異性を実証する棒グラフである。 図３５は、抗体ＩＤ１１（抗ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）抗体）の可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：１４９）を示す。 図３６は、抗体ＩＤ１１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１５０）を示す。 図３７は、抗体ＩＤ１１（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変軽鎖（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：１５１）を示す。 図３８は、抗体ＩＤ１１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１５２）を示す。 図３９は、進行性メラノーマに罹患した患者における血清ＭＩＣＡ濃度を実証する棒グラフである。血清ＭＩＣＡを、商業的に入手可能なサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いて検出した。血清は１：１０希釈で試験した。 図４０は、抗ＭＩＣＡ抗体が、メラノーマ患者血清と共にインキュベートしたＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄダウンレギュレーションを阻止することを示す表である。ＰＢＭＣを、対照血清または可溶性ＭＩＣＡ単独もしくは表示した抗体１００μｇ／ｍｌの存在下で可溶性ＭＩＣＡを含むメラノーマ患者試料と共に４８時間インキュベートした。４８時間の時点で、ＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋）上でのＮＫＧ２Ｄ発現を、フローサイトメトリーにより測定した。データは、ＮＫＧ２Ｄ陽性であるＮＫ細胞の％として示す。 図４１は、抗ＭＩＣＡ抗体が、メラノーマ患者血清と共にインキュベートしたＮＫ細胞によるＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞障害を亢進することを示す図４１〜図４３の一連のグラフの一つである。ＰＢＭＣを、対照血清または可溶性ＭＩＣＡ単独もしくは表示した抗体１００μｇ／ｍｌの存在下で可溶性ＭＩＣＡを含むメラノーマ患者試料と共に４８時間インキュベートした。４８時間の時点で、細胞を洗浄し、５１Ｃｒ標識したＫ５６２標的細胞と共に、エフェクター対標的 ２０：１の比率でインキュベートした。特異的な溶解を、４時間後にシンチレーション計数により評価した。 図４２は、抗ＭＩＣＡ抗体が、メラノーマ患者血清と共にインキュベートしたＮＫ細胞によるＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞障害を亢進することを示す図４１〜図４３の一連のグラフの一つである。 図４３は、図４１と同様、抗ＭＩＣＡ抗体が、メラノーマ患者血清と共にインキュベートしたＮＫ細胞によるＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞障害を亢進することを示す図４１〜図４３の一連のグラフの一つである。 図４４は、形質導入されてヒトＭＩＣＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞に対する抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２Ａｂ２９の結合を示すグラフである。表示した抗体を、Ｂ１６メラノーマ細胞およびヒトＭＩＣＡ１０μｇ／ｍｌを発現する形質導入したＢ１６メラノーマ細胞と共にインキュベートし、染色はフローサイトメトリーにより分析した。 図４５は、Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍が、脾臓ＮＫ細胞および腫瘍−浸潤性ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ発現をダウンレギュレートすることを実証する一連のグラフである。非腫瘍マウスの脾臓または腫瘍を有する動物の脾臓および腫瘍から単離したＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ３３５＋）におけるＮＫＧ２Ｄ発現はフローサイトメトリーにより測定した。 図４６は、抗ＭＩＣＡ抗体処置がＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスにおける血清ＭＩＣＡレベルを低下させることを実証する一連のグラフである。Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するＢ６マウスを、１週間に３回、投薬あたり１００μｇまたは２００μｇのＣＭ３３３２２Ａｂ２９を尾静脈注射した。最初の処置後１週間で採血し、血清ＭＩＣＡをＥＬＩＳＡにより測定した。 図４７は、抗ＭＩＣＡ抗体の投与がサンドウィッチＥＬＩＳＡによるＭＩＣＡ検出と干渉しないことを示すグラフである。組換えＭＩＣＡを１００倍超の抗体と共に回転させながら１８時間インキュベートした。ＭＩＣＡ濃度はサンドウィッチＥＬＩＳＡにより測定した。 図４８は、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２Ａｂ２９を用いたＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスの処置は腫瘍成長を停止させることを実証するグラフである。腫瘍が直径５ｍｍに達したら開始する投薬あたり２００μｇのマウスＩｇＧ２ａ／κアイソタイプ対照または抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２Ａｂ２９を用いて、Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスを静脈内処置した。１週間に３回投薬をし、腫瘍容積を毎日記録した。矢印は投薬を示す。 図４９は、腫瘍細胞から脱落するＭＩＣＡを低減させる抗ＭＩＣＡ抗体の能力を実証する一連のグラフである。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９またはＣＭ２４００２Ａｂ２の存在下で培養した。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡの表面発現をフローサイトメトリーにより測定し、馴化培地中にて脱落したＭＩＣＡをサンドウィッチＥＬＩＳＡにより評価した。 図５０は、抗体ＩＤ１２（ＣＭ３３３２２Ａｂ２８）（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：１６７）である。 図５１は、抗体ＩＤ１２（ＣＭ３３３２２Ａｂ２８）（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１６８）である。 図５２は、抗体ＩＤ１２（ＣＭ３３３２２Ａｂ２８）（抗ＭＩＣＡ抗体）の可変軽鎖（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：１６９）である。 図５３は、抗体ＩＤ１２（ＣＭ３３３２２Ａｂ２８）（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１７０）である。 図５４は、抗ＭＩＣＡ抗体であるＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８による細胞媒介性細胞障害を実証する棒グラフである。５１Ｃｒ標識したＫ５６２細胞を、表示した抗体の存在下で３０分間インキュベートした。３０分の時点で、全ＰＢＭＣを、エフェクター対標的 ２０：１の比率で加えた。特異的な溶解を、４時間後にシンチレーション計測により評価した。 図５５は、腫瘍細胞から脱落するＭＩＣＡを低減する抗ＭＩＣＡ抗体の能力を実証する一連のグラフである。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、アイソタイプ対照抗体、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１またはＣＭ３３３２２Ａｂ２８の存在下で培養した。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡの表面発現をフローサイトメトリーにより測定し、馴化培地中にて脱落したＭＩＣＡをサンドウィッチＥＬＩＳＡにより評価した。 図５６は、抗ＭＩＣＡ抗体が、メラノーマ患者血清と共にインキュベートしたＮＫ細胞によるＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞障害を亢進することを示す線グラフである。ＰＢＭＣを、対照血清または可溶性ＭＩＣＡ単独もしくは表示した抗体の存在下で可溶性ＭＩＣＡを含むメラノーマ患者試料と共に４８時間インキュベートした。４８時間の時点で、細胞を洗浄し、５１Ｃｒ標識したＫ５６２標的細胞と共に、エフェクター対標的 ２０：１、１０：１および５：１の比率でインキュベートした。特異的な溶解を、４時間後にシンチレーション計数により評価した。 図５７は、血清ＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄ調節を示す一連のＦＡＣＳプロットである。全ＰＢＭＣを、対照血清またはメラノーマ血清単独もしくは表示した抗体の存在下でのメラノーマ血清と共に４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄの表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。 図５８は、抗ＭＩＣＡ抗体であるＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８による細胞媒介性細胞障害を示す線グラフである。全ＰＢＭＣを、表示した抗体、陰性対照の抗体（ＴＴＣＦ特異的）または陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下、組換えＭＩＣＡ（ｒＭＩＣＡ）と共に４８時間インキュベートした。特異的な溶解を、４時間後に５１Ｃｒの放出により評価した。 図５９は、組換えＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄ調節を示す一連のＦＡＣＳプロットである。全ＰＢＭＣを、対照血清またはｒＭＩＣＡ単独をスパイクした血清もしくは表示した抗体の存在下でｒＭＩＣＡをスパイクした血清と共に４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄの表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。 図６０Ａは、ＭＩＣＡ＊００９（配列番号：１８５）のアミノ酸配列内のＣＭ３３３２２Ａｂ２９のエピトープを示す。 図６０Ｂは、ＭＩＣＡ＊００９（配列番号：１８５）のアミノ酸配列内のＣＭ３３３２２Ａｂ４のエピトープを示す。図６０Ｃは、ＭＩＣＡ＊００９（配列番号：１８５）のアミノ酸配列内のＣＭ３３３２２Ａｂ１１のエピトープを示す。図６０Ｄは、ＭＩＣＡ＊００９（配列番号：１８５）のアミノ酸配列内のＣＭ３３３２２Ａｂ２３のエピトープを示す。 図６１は、ＭＩＣＡ＊００９の参照構造におけるＣＭ３３３２２Ａｂ２９、ＣＭ３３３２２Ａｂ４およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８のエピトープのマッピングを示す。エピトープマッピングは、オーバーラップペプチドアレイを用いて実施した。各ペプチドは、各ペプチドにつき１０アミノ酸のオフセットを含む２０アミノ酸直鎖長であった。 図６２ａ〜６２ｃは、抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８がヒトの（ａ）ＮＫ細胞および（ｂ）ＣＤ８Ｔ細胞においてＮＫＧＤ受容体のダウンレギュレーションを抑止したこと；および（ｃ）ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８抗体が、ｓＭＩＣＡ（ＮＹ−ＥＳＯに特異的なクローン、５１Ｃｒ標識化Ｍｅｌ３７５細胞、２０：１ Ｅ：Ｔの比率）によるＣＤ８Ｔ細胞の細胞毒性の阻害を抑止したことを示す一連の棒グラフである。データは、少なくとも３回の独立した試験の代表値である。 図６３ａ〜６３ｃは、（ａ）ＥＬＩＳＡ測定により測定されるように、ＭＩＣＡ抗体がＭＩＣＡα３ドメインに結合すること；（ｂ）ＭＩＣＡα３ドメイン特異抗体が４８時間のインキュベーションの間にＲＰＭＩ−８２２６細胞上のＭＩＣＡ表面レベルを増大させたこと；および（ｃ）ＭＩＣＡの脱落が、Ａ３７５細胞によって４８時間のインキュベーションの間に阻止されたこと（ｓＭＩＣＡに関する上清のＥＬＩＳＡ）、を示す一連のグラフである。データは、少なくとも３回の独立した試験の代表値である。 図６４ａ〜６４ｂは、ヒトＵ９３７腫瘍細胞を移植したＳＣＩＤマウスにおける１週間のＭＩＣＡ抗体による処置（１週あたり３×１００μｇ Ａｂ）が、（ａ）腫瘍ホモジネート中のｓＭＩＣＡを低減させ（腫瘍容積について規格化した）；および（ｂ）腫瘍細胞表面においてＭＩＣＡ発現を増大させた（フローサイトメトリー）。データは、３回の独立した試験の合成数（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）を表す。 図６５ａ〜６５ｆは、ＭＩＣＡｍＡｂｓ（３×１００μｇ）で１週間処置したＵ９３７腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＮＫ細胞機能の評価を示す一連のグラフである。抗体処置は、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ（ａ）およびＮＫｐ４６（ｂ）の表面レベルを増大させ、並びに、腫瘍におけるＮＫ細胞の蓄積を誘導した（ｃ）（１×１０５ＣＤ４５＋細胞について規格化した）。処置は、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞によるＩＦＮγ（ｄ）およびパーフォリン（ｅ）発現を増大させた。（ｆ）３つのヒトＭＩＣＡ抗体はすべて脾臓細胞による５１Ｃｒ標識化ＹＡＣ−１細胞のエクスビボ殺傷を増進させた。
本開示は、ある疾病において重要な治療標的に対する抗体が、前記疾病に曝されたヒト対象から目的とする抗原の四量体形でＢ細胞を標識化することで得ることができるという観測結果に、部分的に、基づく。上のバックグラウンドのセクションで記載したように、以前の方法では、少なくともヒト対象にて適切なＢ細胞を特定する効率が悪い点で、および／または、捕捉したＢ細胞が誘導されて表現型変化を受け、それらの有用性を低下させるために制限される。対照に、特定の疾病関連の抗原に対する希少な記憶Ｂ細胞の捕捉を可能にする方法を本文中に記載する。下記するように、本方法は疾病関連の抗原の四量体化を必要とし、当該プロセスは、下記の実施例で実際に示されるように、適切な記憶Ｂ細胞の特定を向上させる。具体的には、本明細書中の方法は、対象の抗原への最初の曝露後の増加された期間、適切な記憶Ｂ細胞のより効率的な捕捉を可能にする。また、本明細書中の方法は、本明細書中で開示される方法を用いて捕捉した記憶Ｂ細胞から得られる遺伝物質を用いて創出された抗体（および、該抗体の配列から創出されたペプチド）を含む。
ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）に対するヒト抗体が、本明細書中で記載される。ＭＩＣＡに対するこれらのヒト抗体は、細胞ベースの癌ワクチン（ＧＭ−ＣＳＦを形質導入した自家腫瘍細胞）を受けた患者から、四量体抗原の使用を伴う方法によって特定された。
いくつかの例において、本開示は、選抜したヒト対象から治療上の潜在力を有する抗体を特異的に取得または標的化する方法、およびその結果得られる治療用組成物を提供する。これらの方法は、ヒト対象における免疫細胞を取得または標的化すること（ここで、免疫細胞は限定するものではないが、例えばＢ細胞および／または記憶Ｂ細胞を含む）、取得または標的化した免疫細胞から遺伝物質（例えばＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を単離または精製すること、および単離または精製した遺伝物質を治療用組成物、例えば本明細書に開示する治療用組成物を製造するために使用することを含んでよい。前記方法のさらなる詳細は、以下に記載の表題“方法”の項で記載する。
いくつかの例において、本開示は、健康状態または疾患を有した若しくは有し、前記健康状態または疾患に対して陽性の免疫応答を示した対象に存在する抗体に関連する治療用組成物（例えば、治療用ペプチドを含み、抗体、抗体断片、抗体誘導体、および／または抗体コンジュゲートを含む）を提供する。
治療用組成物
いくつかの例において、本明細書中の治療用組成物は疾病または状態に関連した結合パートナー（例えば、免疫原、抗原および／またはエピトープ）と相互作用（例えば、結合、特異的に結合および／または免疫特異的に結合）することができ、ここで、治療用組成物と結合パートナーとの間の相互作用は、前記状態または疾病に対して前向きな免疫応答（例えば、対象における疾病またはその症状のレベルでの減少）という結果になる。
いくつかの例において、治療用組成物は可変重鎖（ＶＨ）の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５および／または６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）および／または表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９１１または１２の可変軽鎖（ＶＬ）を含む（例えば、含む、本質的に含む又はから成る）ペプチドを含んでもよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２の可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５および／または６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し（例えば、含み、本質的に含み又はから成り）、かつ、ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ（例えば、ＵｎｉＧｅｎｅ Ｈｓ．１３０８３８））（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ））、例えばそのエピトープと相互作用する（例えば、結合する、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ペプチドを含んでもよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでいてよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合する（例えば、特異的に結合するおよび／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも２つのＣＤＲを含んでいてよく、ここで、前記少なくとも２つのＣＤＲは異なる抗体について表１で示されたＣＤＲである。換言すれば、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２に関して表１で示されたＣＤＲ（および、ＦＲおよび／またはＡＡ配列）は相互に交換可能であり、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合する（例えば、特異的に結合するおよび／または免疫特異的に結合する）限り、それらを組み合わせてペプチドを創出してもよい。いくつかの例に、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９および／または１１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２とを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１、１５０または１６８の１つ、および／または配列番号：１１、７９、９８、１１５、１３３、１５２または１７０の１つを含む。各々の例に、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡとの間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、例えば約１０ｎＭであってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２とを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：２および／または配列番号：１１を含む。各々の例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡとの間の結合親和性は、０．１ｎＭ〜約１μＭの間、例えば約１０ｎＭであってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでいてよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ６のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：７７および／または配列番号：７９を含む。各例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡと間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの間、または１ｎＭ〜２０ｎＭの間、例えば、５００ｎＭまたはそれ未満、４００ｎＭまたはそれ未満、３００ｎＭまたはそれ未満、２００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満、０．４ｎＭまたはそれ未満、０．３ｎＭまたはそれ未満、０．２ｎＭまたはそれ未満、または０．１０ｎＭまたはそれ未満であってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：９６および／または配列番号：９８を含む。各例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡと間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの間、または１ｎＭ〜２０ｎＭの間、例えば、５００ｎＭまたはそれ未満、４００ｎＭまたはそれ未満、３００ｎＭまたはそれ未満、２００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満、０．４ｎＭまたはそれ未満、０．３ｎＭまたはそれ未満、０．２ｎＭまたはそれ未満、または０．１０ｎＭまたはそれ未満であってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１やＣＤＲ２を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：１１３および／または配列番号：１１５を含む。各例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡと間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの間、または１ｎＭ〜２０ｎＭの間、例えば、５００ｎＭまたはそれ未満、４００ｎＭまたはそれ未満、３００ｎＭまたはそれ未満、２００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満、０．４ｎＭまたはそれ未満、０．３ｎＭまたはそれ未満、０．２ｎＭまたはそれ未満、または０．１０ｎＭまたはそれ未満であってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２とを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：１３１および／または配列番号：１３３を含む。各例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡと間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの間、または１ｎＭ〜２０ｎＭの間、例えば、５００ｎＭまたはそれ未満、４００ｎＭまたはそれ未満、３００ｎＭまたはそれ未満、２００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満、０．４ｎＭまたはそれ未満、０．３ｎＭまたはそれ未満、０．２ｎＭまたはそれ未満、または０．１０ｎＭまたはそれ未満であってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ１１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２とを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：１５０および／または配列番号：１５２を含む。各例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡと間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの間、または１ｎＭ〜２０ｎＭの間、例えば、５００ｎＭまたはそれ未満、４００ｎＭまたはそれ未満、３００ｎＭまたはそれ未満、２００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満、０．４ｎＭまたはそれ未満、０．３ｎＭまたはそれ未満、０．２ｎＭまたはそれ未満、または０．１０ｎＭまたはそれ未満であってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含んでよく、ここで、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ１２のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、抗体ＩＤ１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、表１に示される、抗体ＩＤ１２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１２のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の少なくとも１つとを含む。いくつかの例において、そのようなペプチドは、配列番号：１６８および／または配列番号：１７０を含む。各例において、前記ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性のＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））と結合する（例えば、特異的に結合する、および／または免疫特異的に結合する）ことができる。いくつかの例において、ペプチドとＭＩＣＡと間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの間、または１ｎＭ〜２０ｎＭの間、例えば、５００ｎＭまたはそれ未満、４００ｎＭまたはそれ未満、３００ｎＭまたはそれ未満、２００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満、０．４ｎＭまたはそれ未満、０．３ｎＭまたはそれ未満、０．２ｎＭまたはそれ未満、または０．１０ｎＭまたはそれ未満であってよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、配列番号：２および／または配列番号：１１；配列番号：７７および／または配列番号：７９；配列番号：９６および／または配列番号：９８；配列番号：１１３および／または配列番号：１１５；配列番号：１３１および／または配列番号：１３３；配列番号：１５０および／または配列番号：１５２、および配列番号：１６８および／または１７０含むペプチドを含んでよい。
Figure 2017501692
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＊ 配列は、表示した配列、またはその配列と（例えば少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％，および／または１００％の配列同一性を有するバリアントを含む。
＊＊ 配列は、１個、２個、３個、４個、５個、５個未満または１０個未満の保存的アミノ酸置換を含んでよい。
＃ 配列は、表示した配列、またはその配列と、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４に対応する領域内に示される配列と（例えば少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，および／または１００％の配列同一性を有する、および／またはＣＤＲ１、２および／または３に対応する領域内に１個、２個、３個、４個、５個、５個未満または１０個未満の保存的アミノ酸修飾を有するバリアントを含む。
＃＃ 配列は、表示した配列、またはその配列と（例えば少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％，および／または１００％の配列同一性を有するバリアントを含み、前記配列が対応するＡＡをコードする。
Ａ．Ａ．＃は、ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列を示す。
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ＃＃は、ＶＨまたはＶＬの核酸配列を示す。
ＣＤＲおよびＦＲ領域を以上で示したが、そのような領域はＫａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１））に従って規定されてもよい。抗体または抗原結合断片のアミノ酸番号付けも、Ｋａｂａｔの番号付けに従う。
「ペプチド」は、連続して連結された少なくとも２個のアミノ酸残基を含む鎖を示し、鎖長に上限はない。タンパク質中の１個以上のアミノ酸残基が、限定するものではないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの修飾を含んでもよい。用語「ペプチド」は、本明細書において「ポリペプチド」および「タンパク質」と交換可能に用いられる。
いくつかの例において、治療用組成物は、ペプチド、例えば抗体（例えば、全長および／または完全な抗体）または抗体断片を含んでよい。「抗体」は、標的（例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に、その可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられるように、用語「抗体」は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、いずれかの抗原結合断片（即ち「抗原結合部分」）またはその一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のいずれかの他の修飾構造物（modified configuration）を包含する。抗体は、いずれかのクラスの抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（もしくはそのサブクラス）、およびいずれかの特定のクラスである必要のない抗体を含む。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは別のクラスに割り当てられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。これらの幾つかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。重鎖の定常領域は免疫グロブリンの種々のクラスに対応し、該定常領域はアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
例示的な抗体および抗体断片は、限定するものではないが、モノクローナル抗体（例えば全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多重特異的抗体（multispecific antibody）（例えば、二重特異的抗体）、ラクダ化抗体（camelised antibodies）、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、細胞内抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。抗体または抗体断片は、ヒトまたはヒト化されていてよい。特定の実施形態において、抗体は非天然抗体、例えば天然の抗体に対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の相違（例えば、置換、不可または欠失）を含む抗体である。１個以上のアミノ酸の相違が軽鎖および／または重鎖にあってよく、１つ以上のＣＤＲにあってよく、フレームワーク領域、もしくは定常領域内、例えばＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３にあってもよい。
抗体は、典型的には、１０−５〜１０−１１Ｍまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）を反映した高親和性でもって同起源の抗原と特異的に結合する。約１０−４Ｍ超のいずれかのＫＤは、一般的には、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書中で用いられるように、抗原に「特異的に結合する」抗体は、その抗原および実質的に同一の抗原と、高親和性（ＫＤが１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下、および最も好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍの間もしくはそれ未満）でもって結合するが、無関係の抗原とは高親和性でもって結合しない抗体を示す。所定の抗原と高い配列同一性を示す場合、例えば、所定の抗原と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す場合、それは、所定の抗原と「実質的に同一な」抗原である。例示を目的として、ヒトＭＩＣＡに特異的に結合する抗体は、特定の霊長類種由来のＭＩＣＡ抗原（例えば、カニクイザルＭＩＣＡ）とも交差反応するが、他の種由来のＭＩＣＡ抗原またはＭＩＣＡ以外の抗原とは交差反応し得ない。
抗体断片は、それらがその抗原結合部分を含み、かつ全長の抗体が有する所望の親和性および特異性を維持する限り、提供する方法での使用に適している。用語、抗体の「抗原結合部分」（または、単純に「抗体部分」）は、本明細書中で用いられるように、抗原（例えば、ヒトＭＩＣＡ）に特異的に結合する能力を維持した抗体の１つまたは複数の断片を示す。そのような「断片」は、例えば、約８〜約１５００アミノ酸長であり、好ましくは約８〜約７４５アミノ酸長、好ましくは約８〜約３００、例えば約８〜約２００アミノ酸、または約１０〜約５０もしくは１００アミノ酸長である。かくして、抗ＭＩＣＡ抗体の断片は、ＭＩＣＡに結合する能力をそのＦｖ部分に、樹状細胞、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞上のＦｃ受容体に結合する能力をそのＦｃ部分に、それぞれ維持し得る。そのような断片は、対応する全長の抗ＭＩＣＡ抗体に類似する特性により特徴づけられ、即ち、該断片は、ヒトの細胞表面で発現するヒトＭＩＣＡ抗原、または培地中に脱落した対応するｓＭＩＣＡ抗原を、それぞれ結合し得る。
抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片により実行し得ることが示された。用語、抗体の「抗原結合部分」に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一方の腕のＶＬおよびＶＨからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）二以上の単離されたＣＤＲの組合せであって、場合により合成リンカーにより連結されていてよい組合せを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子にコードされているが、それらは組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が一対となって一価の分子を形成して単一タンパク質の鎖となるように合成リンカーにより連結されてもよい（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖抗体もまた、用語、抗体の「抗原結合部分」に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者には既知の従来技術を用いて得られ、断片は完全な抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により産生され、または完全な免疫グロブリンの酵素もしくは化学分解により産生される。
Ｆｖ断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、例えばｓｃＦｖにおける本質的に共有結合であり得る、強く会合した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの２量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。６つのＣＤＲまたはそのサブセットは、全体として、抗体の抗原特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（即ち、Ｆｖの半分であって、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む）は、完全な結合部位よりも通常低い親和性であっても、抗原を認識して結合する能力を有し得る。
一本鎖Ｆｖ、すなわち（ｓｃＦｖ）抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、該リンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする。
Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、Ｆａｂ断片とＦａｂ断片との間のヒンジのシステインによりそれらのカルボキシル末端付近で一般的に共有結合している一対のＦａｂ断片を含む。抗体断片の他の化学的カップリングも当該分野で既知である。
「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖のペアおよび２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、様々な方法、例えばハイブリドーマ融合またはＦａｂ’断片の連結により創出することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、その断片は同一ポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内でＶＬに連結されたＶＨを含む。同一鎖上での２つのドメイン間で対となることを可能にするには短すぎるリンカーを用いることで、該ドメインは他の鎖の相補的ドメインと対を形成するようになり、それで２つの抗原結合部位が創出される。
リニア抗体は一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する。リニア抗体は、二重特異的または単一特異的であってよい。
本開示の抗体および抗体断片は、所望のエフェクター機能または血清半減期を与えるようにＦｃ領域が改変されてもよい。いくつかの例において、Ｆｃ領域は血清半減期を増加させるＰＥＧまたはアルブミンとコンジュゲートされていてよく、結果的に所望の効果が得られる他のコンジュゲートがなされてもよい。別には、エフェクター機能を消去または低減させ、それにより副作用または治療の複雑さを最小限にすることが望まれる場合、特定の他のＦｃ領域を用いることができる。
ヒト抗体およびヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する（または、それらから得られたものと同じアミノ酸配列を有する）抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異導入または部位特異的変異導入により、あるいはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を、例えば、ＣＤＲに、特にＣＤＲ３に含んでもよい。用語「組換えヒト抗体」は、本明細書中で用いられるように、組換え技術により調製、発現、創出または単離されるすべてのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）動物（例えばマウス）又はそれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現させるために形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）コンビナトリアル・ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他のいずれかの方法により調製、発現、創出または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を利用し、生殖細胞系列遺伝子にコードされる可変領域および定常領域を含み、後に生じる再構成および突然変異、例えば抗体成熟（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の間に生じる再構成および突然変異も含む。当該分野で既知なように（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１１７−１１２５）、可変領域は抗原結合ドメインを含み、該ドメインは再構成して、外来抗原に特異的な抗体を形成する様々な遺伝子にコードされる。再構成に加えて、可変領域は、さらに、複数回の単一アミノ酸交換（体細胞変異または超変異とも称される）によりさらに改変され、当該外来抗原に対する抗体の親和性が向上し得る。定常領域が変化して、さらに抗原に応答するようになり得る（即ち、アイソタイプスイッチ）。従って、抗原に応答する軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再構成された及び体細胞変異した核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有さないが、代わりに、実質的に同一または類似し得る（即ち、少なくとも８０％の同一性を有する）。
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークとＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を示す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異またはインビボでの体細胞変異により導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で用いられるように、他の哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列にグラフトした抗体を含むことを意図していない。用語「ヒト」抗体および「完全なヒト」抗体は、同意義に用いられる。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の幾つか、ほとんど又は全てをヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸に置換した抗体を示す。ヒト化形態の抗体に関する１つの実施形態において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の幾つか、ほとんど又は全てをヒト免疫グロブリンのアミノ酸と置換するが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の幾つか、ほとんど又は全てのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の少ない付加、欠失、挿入、置換または改変は、それらが特定の抗原に結合する抗体の能力を損なわない限り、許容される。「ヒト化」抗体は元の抗体の抗原特異性と同様の抗原特異性を保持する。
「キメラ抗体」は、その可変領域がある種に由来し、且つその定常領域が他の種に由来する抗体、例えば、その可変領域がマウス抗体に由来し、且つその定常領域がヒト抗体に由来する抗体を示す。
用語「エピトープ」は、本明細書で用いられるように、抗体に結合することができるタンパク質の決定因子を示す。エピトープは、通常、分子のうち化学的に活性な表面の基、例えばアミノ酸または糖側鎖から構成され、通常、特異的な三次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置される不連続アミノ酸から形成されるもの（例えば、立体構造エピトープ）、または連続するアミノ酸から形成されるもの（例えば、非立体構造エピトープ）の双方いずれであってもよい。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下では前者に対する結合は消失するが後者に対する結合は消失しないという点において、区別される。エピトープは、典型的には、特有の空間配置において少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。所定の抗体により結合されるエピトープがいずれであるかを決定する方法（例えばエピトープマッピング）は当該分野で周知であり、例えば、免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイが挙げられ、重複または隣接ペプチド（例えば、ＭＩＣＡ由来）を、所定の抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体）との反応性について試験される。エピトープの空間配置を決定する方法としては、当該分野での技術および本明細書に記載の方法、例えば、ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる（例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと）。
用語「エピトープマッピング」は、抗体−抗原認識に関する分子決定基を特定する工程を示す。
抗体または抗体断片に関連する用語「エピトープに結合する」または「エピトープを認識する」は、抗原内のアミノ酸の連続セグメントまたは不連続セグメントを示す。当業者は、前記用語が抗体または抗体断片がエピトープ配列内のアミノ酸のそれぞれと直接接触することを必ずしも意味しないと理解する。
２以上の抗体に関連する用語「同一のエピトープに結合する」は、該抗体がアミノ酸の連続もしくは不連続セグメントと同じ、重複する若しくは包含するセグメントに結合することを意味する。当業者は、成句「同一のエピトープに結合する」が、該抗体が同一のアミノ酸と正確に結合または接触することを必ずしも意味しないと理解する。抗体が接触する正確なアミノ酸は異なっていてもよい。例えば、第一の抗体は、第二の抗体が結合するアミノ酸セグメントを完全に包含するアミノ酸セグメントに結合してよい。他の例では、第一の抗体は、第二の抗体が結合する一以上のセグメントと顕著に重複する一以上のアミノ酸セグメントに結合する。本明細書の目的に関して、そのような抗体は、「同一のエピトープに結合する」とみなされる。
従って、本発明は、本明細書に記載の特定の抗体が認識するエピトープの全部または一部（例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０個の、連続する又は不連続なアミノ酸）を含むＭＩＣＡ上のエピトープ（同一もしくは重複する領域または領域間もしくは領域を跨ぐ領域）に結合する抗体を包含する。
本明細書に記載の抗体と「ＭＩＣＡ上の同一のエピトープ」に結合する抗体を決定する技術には、例えばエピトープマッピング法、例えばエピトープの原子レベル分解能を与える抗原：抗体複合体のｘ線結晶構造解析が挙げられる。抗原断片または抗原の変異バリアントに対する抗体の結合をモニタする他の方法において、抗原配列内のアミノ酸残基の改変のために結合が消失する場合、それはエピトープ成分の指標であるとしばしば考えられる。これらの方法は、コンビナトリアル・ファージディスプレイ・ペプチドライブラリー由来の特異的な短いペプチドを親和力で単離する、興味対象の抗体の能力に依存する。該ペプチドを、次いで、ペプチドライブラリーをスクリーニングするのに用いた抗体に対応するエピトープを規定するためのリードとみなす。エピトープマッピングに関して、不連続立体構造エピトープをマッピングする計算アルゴリズムが示されている。
また、本発明はまた、本明細書に記載の抗体とＭＩＣＡ結合に関して競合する抗体を包含する。同一のエピトープを認識する抗体または結合の際に競合する抗体は、従来技術を用いて特定することができる。そのような技術には、例えば、ある抗体が標的抗原に対する他の抗体の結合を阻止する能力を示す免疫アッセイ、即ち競合結合アッセイが挙げられる。競合結合は、免疫グロブリンが、試験下、参照抗体の共通する抗原、例えばＭＩＣＡとの特異的な結合を阻止するアッセイで決定される。多くのタイプの競合結合アッセイが知られており、例えば、直接または間接固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相ダイレクト又はインダイレクト酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドウィッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２（１９８３）参照のこと）；固相ダイレクトビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４（１９８６）参照のこと）；固相ダイレクト標識化アッセイ、固相ダイレクト標識化サンドウィッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照のこと）；Ｉ−１２５標識を用いる固相ダイレクト標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７（１９８８）参照のこと）；固相ダイレクトビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６（１９９０））；およびダイレクト標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７（１９９０））が挙げられる。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製された抗原またはそれらのいずれかを保有する細胞、未標識試験免疫グロブリンおよび標識化参照免疫グロブリンの使用を含む。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下、固相表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰量存在する。競合抗体が過剰量存在する場合、通常、参照抗体の共通する抗原に対する特異的な結合は、少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％もしくはそれ以上に阻止される。
本明細書中で用いられるように、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを示す。典型的には、抗体は、組換えＭＩＣＡをアナライトとして用い、抗体をリガンドとして用いるＢＩＡＣＯＲＥ２０００装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定される場合、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満もしくはそれ未満の平衡解離定数でもって結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性でもって結合する。したがって、「ヒトＭＩＣＡに特異的に結合する」抗体は、１０−７Ｍまたはそれ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍまたはそれ未満のＫＤでもってヒトＭＩＣＡと結合する抗体を示す。「カニクイザルＭＩＣＡと交差反応する」抗体は、１０−７Ｍまたはそれ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍまたはそれ未満のＫＤでもってカニクイザルＭＩＣＡに結合する抗体を示す。特定の実施形態において、ヒト以外の種のＭＩＣＡと交差反応しない抗体は、本質的に、標準的な結合アッセイでこれらのタンパク質に対する検出可能な結合は示さない。
用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」は、本明細書中で用いられるように、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を示すことを意図し、一方、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、本明細書中で用いられるように、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すことを意図する。用語「ＫＤ」は、本明細書中で用いられるように、解離定数を示すことを意図し、それはｋｄのｋａに対する比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）により得られ、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫＤ値は、当該分野の慣用方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用する方法、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する方法である。
本明細書中で用いられるように、ＩｇＧ抗体に関する用語「高親和性」は、抗体が標的抗原に対して１０−８Ｍまたはそれ未満、より好ましくは１０−９Ｍまたはそれ未満、さらにより好ましくは１０−１０またはそれ未満のＫＤを有する抗体を示す。しかしながら、「高親和性」の結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに関して「高親和性」は、１０−７Ｍまたはそれ未満、より好ましくは１０−８Ｍまたはそれ未満のＫＤを有する抗体を示す。
用語「ＥＣ５０」は、本明細書中で用いられるように、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大応答の５０％の応答、即ち最大応答とベースラインとの間の中間の応答を誘発する抗体またはその抗原結合部分の濃度を示す。
用語「固相化したＭＩＣＡに対する結合」は、本発明の抗体が、例えば細胞表面に発現した又は固体支持体に付着されたＭＩＣＡに結合する能力を示す。
用語「交差反応」は、本明細書中で用いられるように、本発明の抗体が他の種のＭＩＣＡに結合する能力を示す。例えば、ヒトＭＩＣＡに結合する本発明の抗体は、他の種のＭＩＣＡ（例えば、カニクイザルＭＩＣＡ）に結合してもよい。本明細書中で用いられるように、交差反応は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）において精製した抗原との特異的な反応性、または細胞生理学的に発現するＭＩＣＡとの結合、或いはその他の機能的相互作用を検出することにより測定される。交差反応を決定する方法には、本明細書に記載の標準的な結合アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００ ＳＰＲ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，ウプサラ、スウェーデン）を用いるＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、フローサイトメトリー技術による方法が挙げられる。
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義との組合せ、ＡｂＭ定義、コンタクト定義、および／またはコンフォメンショナル定義または当該分野で周知のＣＤＲ決定法のいずれかに従って定義される超可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．を参照のこと）により最初に定義された超可変領域と同一であってもよい。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａなど（例えばＣｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３を参照のこと）により最初に説明された立体的なループ構造と同一であってもよい。ＣＤＲ特定に関する他のアプローチに、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義との折衷案であり、オックスフォード・モレキュラーＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ：現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を用いて導出される「ＡｂＭ定義」、または観察した抗原の接触（コンタクト）に基づき、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５に記載のＣＤＲの「コンタクト定義」が挙げられる。本明細書においてＣＤＲの「コンフォメンショナル定義」と称する他のアプローチでは、ＣＤＲの配置は、エンタルピー上、抗原結合に寄与する残基として定義される（例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６−１１６６を参照のこと）。さらなる他のＣＤＲ境界定義（ｂｏｕｎｄａｒｙ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）は、上記アプローチのいずれかに厳格に従わないものであってよく、予測または特定の残基または残基群もしくは完全なＣＤＲが抗原結合に有意に影響を及ぼさないとの試験的知見に鑑みて、それらは短くても又は長くてもよいが、それでも少なくともＫａｂａｔのＣＤＲの一部と重複するであろう。本明細書中で用いられるように、ＣＤＲは、当該分野で既知のアプローチ、それらの組合せを含むアプローチのいずれにより定義される。本明細書で使用される方法は、これらアプローチのいずれかによって定義されるＣＤＲを利用してもよい。１つ以上のＣＤＲを含有する所定の実施形態に関して、ＣＤＲはＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、拡張された定義、ＡｂＭ定義、コンタクト定義および／またはコンフォメンショナル定義のいずれに従って定義されてよい。
いくつかの例において、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドバリアント（例えば、本明細書に開示されるペプチドに対して既定の配列相同性を有するペプチド）を創出するために、例えば、該ペプチドバリアントの抗原結合特性が未修飾ペプチドと比べて維持されている若しくは改善されている限り（いずれかの改変ペプチドの抗原結合特性は、本明細書に記載のインビトロおよび／またはインビボアッセイ、および／または当該分野で公知の技術を用いて評価することができる）、修飾および改変されてよい。
ペプチドバリアントは、アミノ酸レベルで一般的に観察および議論されるが、実際の改変は、典型的には、核酸レベルで導入または実施される。例えば、表１に示すペプチドと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するバリアントは、当該分野で公知の技術（例えばクローニング技術）および／または本明細書に開示した技術を用いて、配列番号：１、１０、７６、７８、９５、９７、１１２、１１４、１３０、１３２、１４９、１５１、１６７および／または１６９をコードする核酸、もしくはその一部／断片を改変することにより創出し得る。
アミノ酸配列の改変は、典型的には、置換、挿入または欠失の改変の３つの種類の１つまたは複数に入る。挿入は、単独または複数のアミノ酸残基のアミノ末端融合および／または末端融合、ならびに内部配列への挿入を含む。挿入は、一般的に、例えば１〜４残基のオーダーでのアミノまたはカルボキシル末端融合よりも小規模の挿入であってよい。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。典型的には、タンパク質分子内のいずれかの部位で約２〜６残基を超えない残基が失われる。アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基であるが、多くの異なる箇所で一時に生じてもよく、挿入は、通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、欠失は、約１〜３０残基の範囲であろう。欠失または挿入は、隣接する対で、即ち２残基の欠失または２残基の挿入が生じ得る。置換、欠失、挿入、またはそれらのいずれかの組合せが組み合せられ、最終の構築物が形成されてよい。突然変異は、リーディングフレーム外の配列では生じず、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補領域を創出しない。置換改変は、少なくとも１つの残基が除去され、その箇所に異なる残基が挿入されることである。いくつかの例において、置換は、保存的アミノ酸置換であってよい。いくつかの例において、本明細書中のペプチドは、表１に示すペプチドに対して１つまた２以上の保存的アミノ酸置換を含んでよい。例えば、バリアントは、表１に示すペプチドに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０の保存的アミノ酸置換を含んでよい。別には、バリアントは、表１に示すペプチドに対して５０またはそれ未満、４０またはそれ未満、３０またはそれ未満、２０またはそれ未満、１０またはそれ未満、９またはそれ未満、８またはそれ未満、７またはそれ未満、６またはそれ未満、５またはそれ未満、４またはそれ未満、３またはそれ未満、２またはそれ未満の保存的アミノ酸置換を含んでよい。そのような置換は、一般に以下の表２に従って作製され、保存的置換と称される。タンパク質改変に対する耐性を予測する方法は当該分野において公知である（例えば、Ｇｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５−９２１０（２００４）を参照のこと）。
表２：保存的アミノ酸置換
Figure 2017501692
いくつかの例において、置換は保存的ではない。例えば、表１に示すペプチドにおいてアミノ酸が、ペプチドのある程度の特性又は態様を変更し得るアミノ酸で置換されてもよい。いくつかの例において、非保存的アミノ酸置換が生じて、例えば、ペプチドの構造を変化させ得る、ペプチドの結合特性を変化させ得る（例えば、抗原に対するペプチドの結合親和性を増大もしくは減少させる、および／または抗原に対するペプチドの結合特異性を増大もしくは低下させる）。
いくつかの例において、ペプチドおよび／またはペプチドバリアントは、表１で示されるペプチド断片であってよく、または含んでよい。そのような断片は、例えば、該断片が全長ペプチドの結合特性の少なくとも一部（例えば、全長ペプチドの結合特性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）を少なくとも維持する限り、例えば、表１で示すＣＤＲ、ＦＲおよび／またはＡＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０〜１００、１０１〜１５０個少ないアミノ酸を含んでよい。切断は、本明細書のペプチドのアミノ末端で、カルボキシ末端で、および／またはペプチド内で生じてもよい。
いくつかの例において、ペプチドバリアントの相互作用面は、未修飾ペプチドに対して該ペプチドバリアントの結合特性を改変（例えば増大または減少）、保存または維持するために、未修飾ペプチドと同じ（例えば、実質的に同じ）であってよい。ペプチドの相互作用面を特定する方法は、当該分野において公知である（Ｇｏｎｇら、ＢＭＣ：Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６：１４７１−２１０５（２００７）；ＡｎｄｒａｄｅおよびＷｅｉら、ＰｕｒｅおよびＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１１）：１７７７−１７８１（１９９２）；Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、およびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７７（１）：１４−２５（２００９）；Ｐａｒｋら、ＢＭＣ：およびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１０：１４７１−２１０５（２００９）。
当業者は、２つのポリペプチド（例えば、未修飾ペプチドとペプチドバリアント）の同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、もっとも高いレベルで同一となるように２つの配列を整列させた後に計算してよい。他の同一性の計算方法は、公表されたアルゴリズムにより実施することができる。比較のための最適な配列アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，２：４８２（１９８１）のローカルアイデンティティー・アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアイデンティティーアライメント・アルゴリズム（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法のためのサーチにより、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、あるいは、検査により実施することができる。
同種の同一性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−１０（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６（１９８９）（これらの文献は、少なくとも核酸アルゴリズムに関する内容に関して、引用により本明細書中に組み込まれる）に開示されるアルゴリズムにより、核酸について得ることができる。典型的には、該方法のいずれを用いてもよく、特定の例において、これら変法の結果、異なっていてもよいことは理解され、当業者であれば、これらの方法の少なくとも１つを用いて同一性が見いだされた場合、その配列は本明細書に記載の同一性を有すると言え、その配列は本明細書に開示されていると言える。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために投入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して、２つの配列により共有される同一部分の数の関数である（即ち、ホモロジー（％）＝同一部位の数（＃）／部位の総数（＃）×１００）。２つの配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、以下の比制限的な実施例に記載されるように、数学アルゴリズムを用いて実施することができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップの重みづけ、および１、２、３、４、５または６の鎖長の重みづけを用いて決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムをＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込み、ＰＡＭ１２０重みづけ残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いる前記アルゴリズムを用いて決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを、ＧＣＧソフトウェアパッケージｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込み、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけおよび１、２、３、４、５または６の鎖長の重みづけを用いて決定することができる。
本発明の核酸およびタンパク質配列は、さらに、公知のデータベースに対する検索を実施するための、例えば、関連する配列を特定するための「クエリー配列」として用いることができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子に対するヌクレオチド配列ホモロジーを得ることができる。ＢＬＡＳＴプロテイン検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３用いて、本発明のアミノ酸配列ホモロジーを得ることができる。比較のためのギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）に関するデフォルトのパラメーターを用いることができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
いくつかの例では、以下の方法の項目のもとでより詳細に記載されるように、本明細書に開示される治療用組成物は、本明細書に開示された方法を用いて得られた免疫細胞（例えば記憶Ｂ細胞を含むＢ細胞）から単離および／または精製された遺伝物質（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を用いて製造することができる。そのような遺伝物質が得られると、本明細書中で開示される治療用組成物を製造するためにそれを使用するための方法は、当分野において公知であり、および／または以下で概説される。
いくつかの例において、ペプチドは、検出可能な標識を含んでもよい。本明細書中で用いられるように、「標識」は、そこに導入された少なくとも１つのエレメント、同位元素、または官能基を有する構成部分であって、それが結合したペプチドの検出を可能にする構成部分を示す。標識は、直接（即ち、結合を介して）結合させてよく、または、リンカー（例えば、リンカーを構成し得る、環式もしくは非環式、分枝もしくは非分枝、飽和もしくは不飽和アルキレン；環式もしくは非環式、分枝もしくは非分枝、飽和もしくは不飽和アルケニレン；環式もしくは非環式、分枝もしくは非分枝、飽和もしくは不飽和アルキニレン；環式もしくは非環式、分枝もしくは非分枝、飽和もしくは不飽和ヘテロアルキレン；環式もしくは非環式、分枝もしくは非分枝、飽和もしくは不飽和ヘテロアルケニレン；環式もしくは非環式、分枝もしくは非分枝、飽和もしくは不飽和ヘテロアルキニレン；飽和もしくは不飽和アリレン（ａｒｙｌｅｎｅ）；飽和もしくは不飽和ヘテロアリレン（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌｅｎｅ）；または飽和もしくは不飽和アシレン（ａｃｙｌｅｎｅ）、またはそれらの組合せ）により結合されてもよい。標識は、検出される本発明のペプチドの生物学的活性または特徴に干渉しない、いずれかの部位でペプチドに結合させることができる。
標識としては、限定するものではないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅを含む放射活性もしくは重同位元素であってよい同位元素構成部分を含む標識；免疫もしくは免疫活性な構成部分、例えば、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ）が結合していてよい、抗体または抗原を含む標識；発色性、発光性、リン光性の標識、または蛍光分子（例えば、蛍光標識ＦＩＴＣ）を含む標識；１つまたは複数の光親和性部分を有する標識；１つまたは複数の公知の結合パートナーとリガンド部分とを有する標識（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰなど）が挙げられ得る。
いくつかの例において、標識は、生物系での分子間相互作用の直接的な解明のための１つまたは複数の光親和性部分を含んでもよい。公知の様々な発光器を用いることができ、そのほとんどがジアゾ化合物、アジドもしくはジアジリンのナイトレンまたはカルベンへの光変換（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）に拠っている（例えば、Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｉｎ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、その全内容は引用により本明細書に組み込まれる。）。本発明の特定の実施形態において、用いられる光親和性標識は、１つまたは複数のハロゲン部分で置換されたｏ−、ｍ−およびｐ−アジドベンゾイル、例えば、限定するものではないが、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸である。
標識は、イメージング試薬であってよく、またはイメージング試薬として提供され得る。例示的なイメージング試薬は、限定するものではないが、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影、ｘ線、蛍光顕微鏡および核磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）；静吐薬；および造影剤を含む。例示的な診断薬は、限定するものではないが、蛍光部分、発光部分、磁気部分；ガドリニウムキレート剤（gadolinium chelate）（例えば、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＴＡおよびＨＰ−ＤＯ３Ａを含むガドリニウムキレート剤）、鉄キレート剤、マグネシウムキレート剤、マンガンキレート剤、銅キレート剤、クロムキレート剤、ＣＡＴおよびｘ線イメージングに有用なヨウ素ベースの物質、および放射性の核種を含む。適切な放射性の核種は、限定するものではないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、４７Ｓｃ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９０Ｙ、８８Ｙ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５０、３２Ｐ、３３Ｐ、および１８Ｆを含む。
蛍光性部分および発光性部分は、限定するものではないが、「色素」、「標識」または「指示薬」とも一般に称される多種多様な有機または無機小分子を含む。例としては、限定するものではないが、フルオロセイン、ローダミン、アクリジン色素、Ａｌｅｘａ色素、シアニン色素などが挙げられる。蛍光性部分および発光性部分は、様々な天然のタンパク質およびその誘導体、例えば遺伝子工学によるバリアントを含み得る。例えば、蛍光性タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、改変されたＧＦＰ、赤色、青色、黄色、試案およびサファイヤ蛍光タンパク質、サンゴ由来の蛍光タンパク質などが挙げられる。蛍光性タンパク質としては、ルシフェラーゼ、エクオリンおよびその誘導体が挙げられる。多くの蛍光性および発光性色素およびタンパク質が、当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公報２００４／００６７５０３；Ｖａｌｅｕｒ，Ｂ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」 Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，２００２；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２を参照のこと）。
用語「精製した」または「単離した」は、本明細書中で用いられるように、その天然環境から成分を特定および分離および／または回収した他の分子、例えばポリペプチド、核酸分子を示す。このように、１つの実施形態において、本発明の抗体は、その天然環境の１つまたは複数の成分から分離されて、精製された抗体である。
核酸組成物
いくつかの例において、本開示は、開示した（例えば、表１に開示した）ペプチドに対応する（コードする）核酸配列を提供する。これらの配列は、開示されたペプチドに関連したすべての縮重配列、即ち１つの特定のペプチド、及びそのバリアントおよび誘導体をコードする配列を有するすべての核酸を含む。かくして、それぞれの特定の核酸配列が本明細書中で書き出されている訳ではないが、各々すべての配列が、実際には、開示したポリペプチド配列を通じて、本明細書中に開示され、記載されていると理解される。
いくつかの例において、開示するものの核酸は、発現ベクターを含み得る。適切なベクターの例は、限定するものではないが、プラスミド、人工染色体（例えばＢＡＣ、ＹＡＣまたはＰＡＣ）およびウイルスベクターを含む。
また、提供されるベクターは、例えば、複製オリジンおよび／またはマーカーを含んでもよい。マーカー遺伝子は、細胞に選択可能な表現型（例えば、抗生抵抗）を与え得る。マーカー産物は、ベクターが細胞に提供され、かつ提供されて発現されているかどうかを決定するために使用される。哺乳動物細胞のための選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびブラストサイジンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞にうまくトランスファーされると、選択圧下に置いた場合にトランスファーされた哺乳動物宿主細胞は生き残ることができる。他のマーカーの例としては、例えば大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびルシフェラーゼが挙げられる。加えて、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するために設計されたタグ配列を含んでよい。タグ配列（例えばＧＦＰ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニンまたはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ；Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）配列は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、ポリペプチドの範囲内でいずれの個所（カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに含む）に挿入することができる。
いくつかの例において、本開示は、本明細書中で開示される核酸（例えば、ベクター）および／またはペプチドを含む細胞を含む。細胞は、例えば、真核生物および／または原核細胞を含み得る。概して、本明細書中で用いられ得る細胞は商業的に入手可能であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１０８）から入手可能である。また、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ，（１９９８）を参照のこと。本明細書中で開示された細胞の創出に有用な形質転換方法およびトランスフェクション方法は、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ，（１９９８）に記載されている。
ベクター媒介型の遺伝子導入は、抗体の標的化された送達を生じさせることが示された（Ｂａｌａｚｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ３０；４８１（７３７９）：８１−４）。したがって、１つの態様において、本開示は、目的とするＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的細胞にウイルスを用いて送達するための方法および組成物を提供する。遺伝子治療の関係で、ＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸配列は、ベクター（例えば、限定するものではないが、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノ随伴ウィルスを含むウイルスベクター）を通じて、細胞に送達されてもよい。遺伝子治療の関係で、ＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸配列は、ベクター（例えば、限定するものではないが、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノ随伴ウィルスを含むウイルスベクター）を通じて、細胞に送達されてもよい。さらに、ウイルスを改変して、前記ウイルスが特定の細胞（例えば癌細胞）のいで機能することを可能にする核酸配列（例えばプロモーター）を含めてもよい。
いくつかの例において、開示された治療用組成物は、ＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター、アデノ随伴ウィルス・ベクター）を含んでよい。１つの態様において、ＭＩＣＡと免疫特異的に結合するペプチドは、ＭＩＣＡと免疫特異的に結合する抗体または抗体断片である。本明細書中で開示されるように、抗体および抗体断片は、限定するものではないが、モノクローナル抗体（例えば全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、細胞内抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。
従って、１つの態様において、本開示は、配列番号：１、７６、９５、１１２、１３０、１４９または１６７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターおよび細胞を提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１、１５０または１６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、ベクターは、配列番号：１０、７８、９７、１１４、１３２、１５１または１６９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号：１１、７９、９８、１１５、１３３、１５２または１６９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）またはそのエピトープと免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物の核酸は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨをコードする。いくつかの態様において、組成物の核酸は、５個以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＬをコードする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のペプチド、例えば抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸は、非天然の核酸である。非天然の核酸は、例えば、天然の核酸と比較して多くとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のヌクレオチドとの差異（例えば、置換、付加または欠失）を含んでもよい。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１０と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：７６と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：７８と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：９５と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：９７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：９８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１１２と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１１４と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１３０と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１３２と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１４９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１５１と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
１つの態様において、本開示は、配列番号：１６７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の態様において、本開示は、配列番号：１６９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離した核酸を提供する。いくつかの態様において、単離した核酸配列は、配列番号：１７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
用語「核酸」または「核酸分子」は、本明細書中で用いられるように、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
単離された核酸は、例えば、ＤＮＡ分子であってよく、但し、その核酸配列の１つは、通常、天然の染色体から取り出され又は欠失する際にそのＤＮＡ分子に隣接して見いだされるものであってよい。かくして、単離された核酸は、限定するものではなく、他の配列から独立した別個の分子（例えば、化学合成核酸、ｃＤＮＡ、ＰＣＲもしくは制限酵素処理により産生されたゲノムＤＮＡ断片）として、並びにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイル）または原核もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれたＤＮＡとして存在するＤＮＡを含む。加えて、単離された核酸は、人工的に生成した核酸、例えばハイブリッドもしくは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー、もしくはゲノムＤＮＡ制限酵素消化産物を含有するゲルスライス内の何百から何百万の他の核酸中に存在する核酸は、単離された核酸と考慮されない。
配列同一性パーセントを計算するにあたって、２つの配列を整列させ、前記２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する。その完全な一致の数を、整列した領域の長さ（即ち、整列したヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で除し、１００を乗じることで、配列同一性パーセント値が得られる。整列した領域の長さは、一方または両方の配列の一部であってよく、最大その最短の配列の全長サイズであり得ることは認識される。単一の配列を２以上の他の配列に対して整列させ、整列した領域それぞれに対して個々の配列同一性パーセント値があり得ることも認識される。同一性パーセント値は通常最も近い整数に四捨五入されることに留意すべきである。例えば、７８．１％、７８．２％、７８．３％および７８．４％は切り捨てられて７８％とされ、一方、７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％および７８．９％は切り上げられ７９％とされる。整列した領域の長さは常に整数であることにも留意すべきである。
本明細書中で用いられるように、用語「配列同一性パーセント」は、所定のいずれかのクエリー配列と対象配列との間の同一性の程度を示す。いずれかのクエリー核酸配列またはアミノ酸配列に関する同一性パーセント、例えば、他の対象核酸配列またはアミノ酸配列に関連する転写因子は、以下のように決定することができる。
核酸は、細胞全体に、細胞溶解物に、または部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在してよい。核酸は、他の細胞性成分または他の夾雑物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパク質から、標準的な技術（例えばアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該分野で周知の他の技術（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）により分けて精製される場合、「単離された」または「実質的に純粋にされた」ものである。
天然の配列（改変された制限酵素認識部位およびその他を除く）にしばしば存在するが、ｃＤＮＡ、染色体もしくはそれらの混合物由来の本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を与える標準的な技術に従って、変異導入されていてもよい。コード配列に関して、これらの突然変異は、所望のアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書中に記載の他のそのような配列と実質的に相同な又は誘導されたＤＮＡ配列が考えられる（「誘導された」は、ある配列が他の配列と同一または改変されていることを示す。）。
核酸は、他の核酸配列と機能的に関連して配置された場合、作動可能に連結されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがあるコード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのプロモーターまたはエンハンサーはそのコード配列と作動可能に連結されている。転写調節配列に関して、作動可能に連結は、連結されているＤＮＡ配列が近接している、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、近接し、リーディングフレーム内に存在する。スイッチ配列に関して、作動可能に連結されているは、配列がスイッチ組換えに影響を及ぼすことができることを示す。
用語「ベクター」は、本明細書中で用いられるように、核酸配列を宿主細胞にトランスファーするのに用いられるいずれかの分子を示す。いくつかの態様において、発現ベクターが利用される。発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に適した核酸分子であり、トランスファーされた核酸配列の発現を指示するおよび／または調節する核酸配列を含む。発現は、限定するものではないが、転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合にはスプライシングなどの工程を含む。いくつかの態様において、ウイルスベクターが利用される（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルス、他のもの）。当該分野において、多くのそのようなウイルスベクターが利用可能であることは理解される。さらなる他の態様において、非ウイルスプラスミドベクターも本発明を実施するにあたって好ましい場合がある。本発明のベクターは、当業者には広く利用可能な標準的な組み換え技術を用いて構築することができる。そのような技術は、一般的な分子生物参考書、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）１９８９）において見出すことができる。
用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、本明細書中で用いられるように、組換え発現ベクターが導入された細胞を示すことを意図する。そのような用語は、特定の対象細胞のみを指すのではなく、そのような細胞の娘細胞も指すことが意図されることは理解されるべきである。特定の改変が、突然変異または環境の影響により、世代継代において生じ得て、そのような娘細胞は、実際には、親細胞と同一ではないが、本明細書で用いられるように用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
キメラ抗原受容体
いくつかの例において、本発明は、ＭＩＣＡおよび細胞内Ｔ細胞受容体シグナリングドメイン（Ｋａｌｏｓ Ｍら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１１ Ａｕｇ１０；３（９５））と免疫特異的に結合するペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＭＩＣＡ、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメインおよび細胞内Ｔ細胞受容体シグナリングドメインと免疫特異的に結合するペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、関連核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体またはその抗原結合部分、および本発明のＣＡＲに関連する医薬組成物を提供する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、人工的に構築された、Ｔ細胞シグナリングドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を含むハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである（Ｋａｌｏｓ Ｍら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１１Ａｕｇ１０；３（９５））。Ｋａｌｏｓらは、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲＴ細胞の作出を記載し、そのＣＡＲ改変Ｔ細胞が慢性リンパ性白血病患者に潜在的な抗腫瘍作用を媒介したことを実証している。人工的に作り出したＣＡＲに関するＴ細胞特徴は、ＭＨＣ非制限的様式で選択した標的に対するＴ細胞特異性および反応性を向け直させる能力を含み、モノクローナル抗体の抗原結合特性を拡張するものである。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、生体内で複製し、長期間残留する潜在力を有し、これは、持続した腫瘍制御、および抗体輸注を繰り返す必要性を取り除くことを可能にする（Ｋａｌｏｓ Ｍら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１１Ａｕｇ１０；３（９５））。ＭＨＣ非制限的抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に抗原処理から独立して抗原を認識する能力を与え、かくして、腫瘍エスケープの主たる機序を回避する。さらにＣＡＲをＴ細胞に発現させた場合、ＣＡＲは、有利なことに、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖およびベータ鎖と二量体を形成しない。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、米国特許出願公開第２００３／０２２４５０号および第２０１０／０２６１２６９号に、ならびにＭｉｌｏｎｅら、２００９ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３に詳細に記載されている。
医薬製剤
いくつかの例において、本明細書中で開示される治療用組成物は、癌の処置に使用される他の化合物、薬物および／または試薬を含んでよい。そのような化合物、薬物および／または試薬には、例えば、所定の癌に対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が含まれ得る。いくつかの例において、治療用組成物には、例えば、本明細書中で開示される１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはペプチド、抗ＰＤ−１抗体またはペプチド、抗ＰＤＬ−１抗体またはペプチド、抗ＯＸ４０（別名、ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌ）抗体またはペプチド、抗ＧＩＴＲ（別名、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲおよび／またはＣＤ３５７）抗体またはペプチド、抗ＬＡＧ−３抗体またはペプチド、および／または抗ＴＩＭ−３抗体またはペプチドが含まれ得る。例えば、いくつかの例において、本明細書中で開示される治療用組成物は、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５または１０未満）化合物と組み合わせることができる。
いくつかの例において、本明細書中で開示される治療用組成物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（「ＨＤＡＣ」）阻害剤を含む他の化合物を含んでよい。ＨＤＡＣ阻害剤の例には、例えば、ヒドロキサム酸、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（Ｚｏｌｉｎｚａ）；ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ）（Ｍｅｒｃｋ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＬＡＱ８２４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）（ＣｕｒａＧｅｎ）、ＩＴＦ２３５７イタルファルマコＳｐＡ（Ｃｉｎｉｓｅｌｌｏ）、環式テトラペプチド；デプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ２２８）（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ベンズアミド；エンチノスタット（ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５）（Ｓｙｎｄａｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＧＣＤ０１０３（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、短鎖脂肪酸、バルプロ酸 、フェニルブチレート、ＡＮ−９、ピバネックス（ｐｉｖａｎｅｘ）（Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＨＲ−３９９６（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）およびＣＨＲ−２８４５（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が含まれる。
いくつかの例において、本明細書中で開示される治療用組成物は、プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＮＰＩ−００５２（Ｎｅｒｅｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カルフィルゾミブ（ＰＲ−１７１）（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＥＰ１８７７０及びＭＬＮ９７０８を含む他の化合物を含んでもよい。いくつかの例において、本明細書中で開示される治療用組成物はメルファラン（mephalan）などのアルキル化剤およびアドリアマイシン（ドキソルビシン）などのトポイソメラーゼ阻害剤を含んでよく、それらは、ＭＩＣＡ発現を高め、抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体の効能を高めることができたことが示された。
いくつかの例において、治療用組成物は、例えば、本明細書中で開示される１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数の別の試薬（例えば化学療法、放射線療法、サイトカイン、ケモカインおよび他の生物学的シグナル伝達分子、腫瘍特異ワクチン、細胞癌ワクチン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入癌細胞）、腫瘍特異モノクローナル抗体、自家および他家幹細胞レスキュー（例えば、移植片対腫瘍効果を増大させる）、他の治療抗体、分子標的療法、抗脈管形成療法、治療を意図した感染試薬（例えば細菌が局在する腫瘍）および遺伝子治療）を含み得る。
いくつかの例において、治療用組成物は、本明細書中で記載されるように医薬上許容される担体と共に処方された、抗ＭＩＣＡ抗体またはその抗原結合部分の１つまたはそれらの組合せ含んでよい。そのような組成物は、ＭＩＣＡに結合するペプチド、抗体、抗原結合性部分、免疫複合体または二重特異性分子の１つまたはそれら（例えば、異なる２つまたは３以上）の組合せを含んでもよい。
例えば、医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する、または相補性活性を有する抗体（または、免疫複合体または２重特異性）の組合せを含んでもよい。いくつかの例において、そのような組成物は、ＭＩＣＡ＊００９配列（配列番号：１８５）内のアミノ酸２２９〜２４８を含む又は重複するエピトープと相互作用する１つまたは複数の抗体または抗体断片、ＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内のアミノ酸１７９〜１８８を含む又は重複するエピトープと相互作用する抗体または抗体断片、ＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内のアミノ酸１１９〜１２８を含む又は重複するエピトープと相互作用する抗体または抗体断片、および／またはＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内のアミノ酸１９９〜２０８を含む又は重複するエピトープと相互作用する抗体または抗体断片を含んでもよい。
いくつかの例において、治療用組成物は、ＭＩＣＡに結合し、ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および／またはＣＭ３３３２２ｍＡｂ４のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むペプチド、抗体または抗体断片と、抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および／または抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む１つまたは複数のペプチド、抗体または抗原結合断片とを組み合せて、含んでもよい。いくつかの例において、治療用組成物は、ＭＩＣＡに結合し、ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／またはＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むペプチド、抗体または抗体断片と、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む１つまたは複数のペプチド、抗体または抗原結合断片とを組み合せて、含んでもよい。
いくつかの例において、本明細書中に開示される治療用組成物は、医薬組成物として又は医薬組成物に使用するために処方されてよい。そのような組成物は、任意の経路、例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された経路のいずれかを通じて対象に投与するために処方または構成され得る。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲデータ標準マニュアル、バージョン００４（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍで入手可能）に記載されている。
単回投与形態を産生するための担体物質と組合せられ得る活性成分の量は、処置される対象および特定の投与形式に応じて異なり得る。単回投与形態を生産するための担体物質と組合せられ得る活性物質の量は、一般に、治療効果を奏する組成物のその量であろう。該して、１００％に関しては、この量は、医薬上許容される担体と組み合せて、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲であろう。
いくつかの例において、医薬組成物は、有効量の１つまたは複数のペプチドを含んでもよい。用語「有効量」および「処置に効果的」は、本明細書中で用いられるように、意図した効果または生理学的結果を生じさせる投与内容の範囲内で効果的な期間の間（急性または慢性投与および定期的または連続的投与を含む）、１つまたは複数のペプチド（例えば、ＭＩＣＡに結合する抗体または抗体断片）の量または濃度を意味する。
いくつかの例において、医薬組成物は、１つまたは複数のペプチドおよびいずれか医薬上許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含んでもよい。いくつかの例において、医薬は、さらに１つまたは複数の追加の治療薬を、疾患または疾患症状の調節を達成するのに効果的な量で含んでもよい。
用語「医薬上許容される担体またはアジュバント」は、患者に、本発明のペプチドと共に投与することができ、その医薬活性を失わせず、組成物の治療量を送達するのに十分な投薬量を投与した場合に無毒である担体またはアジュバントを意味する。
本発明の医薬組成物において使用されてもよい医薬上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルは、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型（self-emulsifying）薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、例えばｄ−Ｉ−トコフェロールポリエチレングリコール１０００、医薬投薬形態に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎまたは他の類似の重合性送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含む。シクロデクストリン、例えばＩ−、Ｊ−およびＫ−シクロデクストリンも、本明細書中に記載される式の化合物の送達を高めるのに有利に使用することができる。
本発明の医薬組成物は、いずれかの慣用の非中毒性医薬的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでもよい。いくつかの場合において、配合物のｐＨは、処方された化合物またはその送達形態の安定性を高めるために、医薬上許容される酸、基剤またはバッファーで調整されてもよい。本明細書で用いられる用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、腱滑液鞘内、胸骨内（intrasternal）、クモ膜下腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む
医薬組成物は、吸入および／または鼻腔投与のための溶液または粉末の形態であってよい。そのような組成物は、当分野の公知の技術に従い、適切な分散剤または湿潤剤（例えばＴｗｅｅｎ８０）および懸濁剤を用いて処方され得る。無菌の注射可能調合物は、また、無毒な非経口的に許容される希釈剤または溶媒における無菌の注射可能な液剤または懸濁剤、例えば１，３−ブタンジオールにおける液剤であってよい。とりわけ使用可能な許容されるビヒクルおよび溶剤は、マンニトール、水、リンガー溶液および生理食塩液はある。加えて、無菌の固定油は、溶剤または懸濁媒（suspending medium）として慣用されている。この目的に関して、いずれの無菌性の固定油、例えば合成モノ−またはジグリセリドが用いられてもよい。それらが、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンにおいて、天然の医薬的に許容される油、例えばオリーブ油またはヒマシ油であるため、脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体が注射可能な薬物調合物に有用である。これらの油溶剤または懸濁剤はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤またはカルボキシメチルセルロース、もしくは医薬上許容される投薬形態の配合物に一般的に用いられる類似の分散助剤、例えばエマルジョンおよびまたは懸濁剤を含んでもよい。他の一般に用いられる界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎまたはＳｐａｎｓおよび／または医薬上許容される固体、液体、または他の投薬形態の製造に一般的に用いられる他の類似の乳化剤またはバイオアベイラビリティーエンハンサーも、配合物の目的に関して用いることができる。
医薬組成物は、いずれかの経口摂取可能な投与形態で、限定するものではないが、例えばカプセル剤、錠剤、エマルジョンおよび水性懸濁剤、分散剤および液剤で経口投与することができる。経口摂取に使用する錠剤の場合、通常用いられる担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的に添加される。カプセル形態の経口投与に関しては、有用な希釈剤として、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁剤および／またはエマルジョンを経口投与する場合、活性成分は、油相中に乳化剤および／または懸濁剤と組み合せて懸濁または溶解され得る。必要に応じて、特定の甘味料および／または香味料および／または着色料が添加され得る。
別には、又は加えて、医薬組成物は、点鼻エアロゾルまたは吸入により投与されてよい。そのような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当分野で公知の他の可溶化剤または分散剤を用いて、塩水における液剤として調製され得る。
いくつかの実施形態、本開示は、本明細書に、以下の方法にて、開示するいずれか１つまたは複数のペプチドまたは医薬組成物（以下、「Ｘ」という。）を使用する方法を提供する：
本明細書に開示される１つまたは複数の疾患または状態（例えば、癌（以下の例では「Ｙ」という。）の処置において医薬として使用するための物質Ｘ。
Ｙの処置のための医薬の製造のための物質Ｘの使用；および
Ｙの処置に使用するための物質Ｘ。
いくつかの例において、本明細書中に開示される治療用組成物は、米国にて販売するために、米国に輸入するために、および／または米国から輸出するために処方され得る。
方法
いくつかの例において、方法は、状態または疾患を有する又は有したヒト対象および状態または疾患に対して陽性の免疫応答を示す又は示したヒト対象を選抜することを含んでよい。いくつかの例において、適切な対象は、例えば、状態もしくは疾患を有する対象、または該状態もしくは疾患を有したが前記疾患もしくはその態様が解消した対象（例えば、同じ状態もしくは疾患を有する他の対象（例えば、大部分の対象）と比較して）、および／または前記状態または疾患を有しつつも延長された期間、例えば無症状の状態で（前記状態もしくは疾患を有する他の対象（例えば、大部分の対象）と比較して）生存する対象（例えば、同じ状態もしくは疾患を有する他の対象（例えば、大部分の対象）と比較して）を含む。いくつかの例において、対象は、状態または疾患に対するワクチン接種を受けた（例えば、以前にワクチン接種されたおよび／またはワクチン接種され、再ワクチン接種された（例えば、追加ワクチン接種を受けた）場合に選抜され得る。
用語「対象」は、本明細書中で用いられるように、いずれかの動物を示す。いくつかの例において、対象は哺乳動物である。いくつかの例において、用語「対象」は、本明細書中で用いられるように、ヒト（例えば、男性、女性または子供）を示す。本方法に使用するための試料としては、血清試料、例えば、選抜された対象から採取されたものが挙げられる。
いくつかの例において、対象の選抜は、対象（例えば、候補対象）から試料を採取すること、およびその対象が選抜に適することの指標に関して、該試料を試験することを含み得る。いくつかの例において、対象は、例えば、ヘルスケアの専門家により、状態または疾患を有していた又は有すると確認または特定され得る。いくつかの例において、状態または疾患に対して陽性の免疫応答の表示は、患者の記録、家族の病歴および／または陽性免疫応答の兆候の検出から行うことができる。いくつかの例において、複数の団体を対象選抜に含めてもよい。例えば、第一の団体は候補対象から試料を入手し、第二の団体はその試料を試験してよい。いくつかの例において、対象は選抜され、および／または医師（例えば、一般開業医）による照会が行われてよい。いくつかの例において、対象選抜は、選抜された対象から試料を採取すること、および該試料を保存すること、および／または本明細書に開示される方法に該試料を使用することを含み得る。試料は、例えば、細胞または細胞集団を含み得る。
いくつかの例において、免疫細胞を採取または標的とすることは、例えば、標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）し得る四量体免疫原を得ること又は提供すること；前記四量体免疫原を試料と接触させること；前記四量体免疫原を検出すること；前記四量体免疫原が標的免疫細胞に結合したか否かを決定すること；および前記四量体免疫原が標的免疫細胞に結合している場合、その標的免疫細胞を得ること、の１つまたは複数および／またはそれらの組合せを含んでよい。
四量体免疫原は、状態または疾患に関係し、および／または標的免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）する免疫原を含んでよく、前記標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関係する。状態または疾患に関連する免疫原および標的免疫細胞としては、例えば、前記状態または疾患を有する対象に存在するが特定の状態または疾患を有さない対象には存在しない免疫原または免疫細胞；および／または特定の状態または疾患を有さない対象に比べて、前記状態または疾患を有する対象において異なるレベル（例えば増大したレベル）で存在する免疫原または免疫細胞が挙げられる。いくつかの例において、免疫原または免疫細胞は、癌特異的であってよい。免疫原は可溶性であってよい。四量体免疫原は、四量体（例えば、四量体化された単量体、二量体および／または三量体抗原免疫原（例えば抗原および／またはエピトープ）を含む）を含んでよい。いくつかの例において、四量体免疫原は、四量体形態ではない形態の免疫原と細胞との間の結合性と比べて、同様の条件下で、その細胞に対して増大した結合性を有する。いくつかの例において、四量体抗原は、検出可能な部分、例えばストレプトアビジン部分を含む。四量体化の方法は、当分野で公知であり、本明細書において開示される。
四量体免疫原を検出すること、および／または四量体免疫原が標的細胞に結合したか否かを決定することは、当分野で公知の方法および／または本明細書で開示される方法を用いて実施することができる。例えば、該方法は、フローサイトメトリーを含み得る。フローメトリーの最適な方法、例えばソーティング方法およびゲーティング方法は、当分野で公知であり、および／または本明細書に開示される。いくつかの例において、該方法は、四量体免疫原の標的免疫細胞に対する結合レベル、結合親和性および／または結合特異性の分析を含み得る。例えば、標的免疫細胞は、四量体免疫原と標的免疫細胞との間で所定のレベルの結合が測定された場合（例えば、その場合のみ）、標的免疫細胞を得ることができる。所定レベルの結合は、特異的なレベルであってよく、および／または相対的なレベルであってよい。標的免疫細胞を得ることは、標的免疫細胞を採取、提供、同定、選択、精製および／または単離することを含み得る。そのような方法は、例えば、細胞ソーティング方法、細胞富化、および／またはバックグラウンド低減を含み得る。
いくつかの例において、自己抗原に対する免疫細胞を得ることは、自己抗原に対して陽性の免疫応答を示す対象を特定すること；多量体形態の前記自己抗原を得ること又は提供すること；前記多量体形態の自己抗原を、前記自己抗原に対して陽性の免疫応答を示す対象由来の試料と接触させること；前記多量体形態の自己抗原に結合した免疫細胞を得ること、の１つまたは複数、および／またはその組み合わせを含んでよい。
いくつかの例において、該方法は、自己抗原に対する免疫細胞を癌患者から得ることを含んでよく、例えば、前記自己抗原に対する陽性の免疫応答を示す対象を特定すること；多量体形態の前記自己抗原を提供すること；前記多量体形態の自己抗原を、前記自己抗原に対して陽性の免疫応答を示す対象由来の試料と接触させること；および、前記多量体形態の自己抗原に結合した免疫細胞を得ること、の１つまたは複数、および／またはその組み合わせを含んでよい。
多量体形態の自己抗原は、状態または疾患に関連し、および／または標的免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）する自己抗原を含んでよく、例えば、前記標的免疫細胞は、選択した状態または疾患に関連する。状態または疾患に関連した自己抗原および標的免疫細胞は、例えば、特定の状態または疾患を有する対象に存在するが、前記状態または疾患を有さない対象には存在しない抗原または免疫細胞；および／または特定の状態または疾患を有さない対象に比べて前記状態または疾患を有する対象において改変されたレベル（即ち、増大したレベル）で存在する免疫原または免疫細胞を含む。いくつかの例において、状態または疾患は癌であってよい。いくつかの実施形態において、癌は、メラノーマ、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、すい臓癌、胃癌、グリア芽腫、肝臓癌、および結腸癌、リンパ腫もしくは白血病である。いくつかの例において、自己抗原または免疫細胞は、癌特異的であってよい。自己抗原は可溶性であってよい。多量体形態の自己抗原は、四量体形態（例えば、四量体化された単量体、二量体および／または三量体抗原を含む）の自己抗原（例えば抗原および／またはエピトープ）を含んでよい。いくつかの例において、多重形態の自己抗原は、検出可能な部分（例えば、ストレプトアビジン部分）を含む。多量体化の方法は、当分野で公知であり、本明細書において開示される。
遺伝物質（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を得られた標的免疫細胞から単離または精製する方法は、当分野で公知であり、本明細書中で例示される。そのような遺伝物質が取得された場合に、本明細書中に開示される治療用組成物を製造するために前記遺伝物質を使用する方法は、当分野で公知であり、および／または以下に概略される。上記したように、遺伝物質は、当分野で公知の技術を用いて改変し、本明細書で開示されるペプチドバリアントを作り出すことができる。
標的細胞内に含まれる又は標的細胞から得られる核酸（例えばｃＤＮＡ）からペプチドを生成することは、例えば、分析、例えば標的免疫細胞（例えば、単一または単離し特定された標的免疫細胞）由来の重鎖および軽鎖可変ドメインを配列決定することを含み得る。いくつかの例において、該方法は、完全なヒト抗体、またはその断片（例えば、上記開示のもの）を生成すること、および非ヒト抗体のヒト化を含む。ＤＮＡは、得られた免疫細胞から、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および／または配列決定することができる。
ＤＮＡは単離されると、発現ベクターに配することができ、次いで、それを宿主細胞（例えば、これをしなければ抗体タンパク質を産生しない大腸菌、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞）にトランスフェクトし、前記組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成物を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組換え発現に関するレビュー文献として、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
抗体またはそのバリアントの組換え発現は、一般に、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明は、かくして、抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体またはその一部の重鎖もしくは軽鎖可変部分、または重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードし、プロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（米国特許第５，９８１，２１６号；第５，５９１，６３９号；第５，６５８，７５９号および第５，１２２，４６４号）を含んでもよく、および抗体の可変部分ドメインは、完全な重鎖、完全な軽鎖、または完全な重鎖と軽鎖の両方を発現するためのベクターにクローニングされてよい。発現ベクターが従来技術により宿主細胞へトランスファーされたら、次に、トランスフェクトしたその細胞を従来技術により培養し、抗体を産生させる。かくして、本発明は、本発明に係る抗体またはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖、あるいはその部分、または本発明の一本鎖抗体をコードし、異種起源のプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現に関する特定の実施形態において、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、完全な免疫グロブリン分子の発現のために、下記するように宿主細胞に共発現させてよい。
組換え抗体発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当分野で周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を含み、例えば、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビー・ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞および他の細胞系が挙げられる。異なる宿主細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系が、その発現される抗体またはタンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確保するために選ぶことができる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写産物、グリコシル化およびリン酸化の適当なプロセッシングのための細胞機構を備えている真核生物宿主細胞が用いられ得る。そのような哺乳動物宿主細胞は、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いずれの機能的免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないネズミ骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。１つの実施形態において、ヒトリンパ球を不死化することによって開発されたヒト細胞系が、モノクローナル抗体を組み換え技術により産生するのに用いることができる。１つの実施形態において、ヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、モノクローナル抗体を組み換え技術により産生するのに用いることができる。
いくつかの例において、本明細書中で開示されるペプチドは、合成して生成することができる。本明細書中に記載されるペプチドを合成するのに有用な合成化学形質転換および保護基の方法論（保護および脱保護）は、当分野において既知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよｂＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ，ＦｉｅｓｅｒおよびＦｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅおよびＳｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９５）、およびその続編に記載のものを含む。
ペプチドも、化学合成方法によって作り出すことができ、その方法は当業者には周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｃｈａｐｔｅｒ ３ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２，ｐ．７７を参照のこと）。かくして、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａまたは４３１における側鎖保護されたアミノ酸を用いるｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかによりα−ＮＨ２保護する、固相合成のオートメーション化メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）技術を用いて合成することができる。
本明細書中に記載されるペプチドを製造する１つの様式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いる。Ｃ末端アミノ酸が、リンカー分子を用いた酸変性容易な接合材を介して架橋ポリスチレン樹脂に繋がれる。この樹脂は合成に用いられる溶剤に不溶性であり、過剰量の試薬および副産物を洗浄することを比較的単純化し、迅速化する。Ｎ末端を、酸に安定であるが塩基により除去可能なＦｍｏｃ基で保護する。いずれかの側鎖の官能基は塩基に安定で、酸に不安定な基で保護される。
より長いペプチドは、天然の化学ライゲーションを用いて個々の合成ペプチドを連結することによって製造し得る。別には、より長い合成ペプチドを周知の組換えＤＮＡ技術によって合成できる。そのような技術は、詳細なプロトコルを含み、周知の標準的なマニュアルにて提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆転写して、好ましくは該遺伝子が発現される生物に適したコドンの、該アミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的に前記ペプチド、および必要に応じて任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製する。その合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、該ペプチドを、選択した発現系と宿主に適した適切な条件下発現させる。該ペプチドを標準的な方法により精製し、特徴を調べる。
ペプチドはハイスループット、コンビナトリアル様式で製造してよく、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループット・多チャンネル・コンビナトリアル合成装置を用いて製造してよい。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を高めるために、以下のものにより置き換えてもよい：レトロ・インベルソ結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元アミド結合（ｒｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン（ｔｈｉｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン（ｏｘｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス・オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換トランスオレフィン（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＨＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲがＨまたはＣＨ３である）；およびフルオロ・ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒは、ＨまたはＦまたはＣＨ３である）。ペプチドは、以下によってさらに改変されてよい：アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化（ｃｉｎｎａｍｏｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｉｏｎ）、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（セリン、チロシンまたはスレオニン）、ステアロイル化（ｓｔｅａｒｏｙｌａｔｉｏｎ）、サクシニル化およびスルフリル化（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｔｉｏｎ）。上記されるように、ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１−Ｃ２０直鎖または分枝鎖アルキル基）；脂肪酸基；およびそれらの組合せにコンジュゲートされてよい。
いくつかの例において、ペプチドは、免疫グロブリン分子の精製について当分野で既知のいずれかの方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的な抗原であるプロテインＡまたはプロテインＧに関する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィーによって）、遠心分離、示差可溶性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質精製に関する他の標準的な技術のいずれかによって精製されてよい。さらに、本発明の抗体またはその断片は、上記した或いは精製を促進するのに当分野で公知の異種起源のポリペプチド配列（本明細書中、「タグ」という）と融合されてよい。
例示的、非限定的方法の概要を図５Ａ〜５Ｆに示す。順序を示すものではない。
いくつかの例において、本開示はまた、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列に相同性があるアミノ酸配列を有し、所望の機能的ＭＩＣＡ結合特性を維持する、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有する抗体または抗体断片を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、上記配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％でまたは９９％同一なＶＨおよび／またはＶＬを含み得る。配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１、１５０または１６８および１１、７９、９８、１１５、１３３、１５２または１７０のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％またはそれを超える）ホモロジーを有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体または抗体断片は、それぞれ、配列番号：７７、９６、１１３、１３１、１５０または１６８や７９、９８、１１５、１３３、１５２または１７０をコードする核酸分子の突然変異生成（例えば、部位特異的またはＰＣＲによる突然変異生成）によって得ることができ、続いて、コードされる改変抗体を維持された機能（即ち、１つまたは複数の機能、例えば、ＭＩＣＡのアルファ３ドメインに結合すること；ＭＩＣＡの脱落を阻止すること；ＭＩＣＡに結合するＮＧＫＤの結合を阻止しない；ＮＧＫＤダウンレギュレーションを誘導する可溶性ＭＩＣＡを阻止する、およびＮＫ細胞媒介性細胞障害性を減少させる）を、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験する。
ＭＩＣＡに対する結合と競争する（例えば、クロス競争（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する）抗体および抗体断片、本明細書中に記載の特定の抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１および１２）も提供される。そのような競争性の抗体は、標準的なＭＩＣＡにおいてＭＩＣＡの抗体への結合を競争的に阻止する能力に基づいて特定することができる。例えば、組換えヒトＭＩＣＡタンパク質をプレート上に固定し、一方の抗体を蛍光標識し、前記標識抗体が結合することから競争する非標識抗体の能力を評価する標準的なＥＬＩＳＡアッセイを、用いることができる。加えて又は別に、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて、クロス競争する抗体の能力を評価することができる。ＭＩＣＡに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を阻止する被験抗体の能力は、被験抗体がＭＩＣＡに結合する抗体と競合し得ることを実際に示す。
したがって、１つの実施形態において、本開示は、本明細書中で記載される抗ＭＩＣＡ抗の活性化Ｔ細胞上のＭＩＣＡに対する結合を、ＦＡＣＳで測定した場合に、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％阻害する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。例えば、候補競合性抗ＭＩＣＡ抗体による抗ＭＩＣＡ抗体の結合の阻害は、実施例に記載の条件下で評価することができる。
いくつかの例において、本開示は、本明細書中に記載の抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、抗体ＩＤ８、９、１１および１２）と同じエピトープに結合する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。実施例１４においてさらに述べるように、抗体ＩＤ８（ＣＭ３３３２２ｍＡｂ１１）はＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内の残基１１９〜１２８を含むエピトープと結合する；抗体ＩＤ９（ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２９）はＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内の残基２２９〜２４８を含むエピトープと結合する；抗体ＩＤ１１（ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４）はＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内の残基１７９〜１８８を含むエピトープと結合する；および抗体ＩＤ１２（ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８）はＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１８５）内の残基１９９〜２０８を含むエピトープと結合する。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、ＭＩＣＡ＊００９のアミノ酸１８１〜２７４に対応するα３領域内のアミノ酸残基に結合する抗ＭＩＣＡ抗体または抗体断片を提供する。
本明細書に記載の抗体と「ＭＩＣＡ上の同一のエピトープ」に結合する抗体を決定する技術には、例えばエピトープマッピング法、例えばエピトープの原子レベル分解能を与える抗原：抗体複合体のｘ線結晶構造解析が挙げられる。抗原断片または抗原の変異バリアントに対する抗体の結合をモニタする他の方法において、抗原配列内のアミノ酸残基の改変のために結合が消失する場合、それはエピトープ成分の指標であるとしばしば考えられる。加えて、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル手法も用いることができる。これらの方法は、組合せのファージディスプレイ・ペプチドライブラリー由来の特異的な短いペプチドを親和性で単離する、興味対象の抗体の能力に依存する。該ペプチドを、次いで、ペプチドライブラリーをスクリーニングするのに用いた抗体に対応するエピトープを規定するためのリードとみなす。エピトープマッピングに関して、不連続立体構造エピトープをマッピングする計算アルゴリズムが示されている。
例えば、マウスを、本明細書中に記載のヒトＭＩＣＡを用いて免疫し、ハイブリドーマを産生し、結果的に得られるモノクローナル抗体を、ＭＩＣＡに結合するｍＡｂ４またはｍＡｂ２８と競争するその能力についてスクリーニングする。また、マウスを、ｍＡｂ４モノクローナル抗体が結合するエピトープを含むＭＩＣＡの小断片を用いて免疫してもよい。同一のエピトープを有し、それ故に元のモノクローナル抗体と類似する特徴を有するモノクローナル抗体の選抜を誘導するために、例えばＪｅｓｐｅｒｓら、１２：８９９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４の方法を用いることができる。ファージディスプレイを用いて、まず、元の抗体の重鎖を（好ましくはヒトの）軽鎖レパートリーと対を形成させて、ＭＩＣＡ−結合モノクローナル抗体を選択し、次いで、その新たな軽鎖を（好ましくはヒトの）重鎖レパートリーと対を形成させて、元のモノクローナル抗体と同じエピトープを有するＭＩＣＡ−結合モノクローナル抗体を選択する。別には、元のモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ４、ＩＤ１１またはｍＡｂ２８、ＩＤ１２）のバリアントは、該抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡに関する突然変異生成によって得ることができる。
例えばＣｈａｍｐｅら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されるエピトープマッピングを実施して、抗体が興味対象のエピトープに結合するか否かを決定することができる。また、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５に記載される「アラニンスキャニング突然変異生成」またはＭＩＣＡもしくはＭＩＣＢにおけるアミノ酸残基の点突然変異生成に関するいくつかの他の形態を用いて、本発明の抗ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ抗体の機能的エピトープを決定することができる。しかしながら、突然変異生成の研究は、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの全体的な３次元構造に重要なアミノ酸残基を明らかにするが、それらは、抗体−抗原接触に直接関与せず、かくして、この方法を用いて決定された機能的エピトープを確認するために、他の方法が必要とされ得る。
抗体競合アッセイは、本明細書中に記載されるように、ある抗体が、他の抗体と「同じエピトープに結合する」か否かを決定するために用いることができる。典型的に、第２の抗体が過剰量で存在し、第１の抗体がすべての部位を飽和させる状況下、その第２の抗体によって、エピトープと相互作用することが知られている抗体が５０％またはそれを超えて、６０％またはそれを超えて、７０％またはそれを超えて、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超えて競合されることが、該抗体が「同一のエピトープに結合する」ことの指標である。２つの抗体間での競合レベルを評価するために、例えば、抗体のための他の標識を用いる標識免疫検定法またはアッセイを用いてもよい。例えば、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ抗原を、標識化合物（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、ビオチンまたはルビジウム）とコンジュゲートした飽和量の第一の抗ＭＩＣＡ抗体またはその抗原結合断片と共に、同一量の第２の未標識抗ＭＩＣＡ抗体の存在下、インキュベートさせてよい。次いで、未標識の遮断抗体の存在下、抗原と結合する標識化抗体の量を評価し、未標識遮断抗体の非存在下での結合と比較する。競合は、未標識遮断抗体の存在下での結合シグナルを前記遮断抗体非存在下と比べた変化％により決定される。かくして、標識化抗体の結合が、前記遮断抗体の非存在下での結合と比較して、遮断抗体の存在下で５０％阻害される場合、それで、該２つの抗体５０％間で競合がある。かくして、第一の抗体と第二の抗体との間の、５０％またはそれを超える、６０％またはそれを超える、７０％またはそれを超える、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える競合に関する言及は、第一の抗体が、第二の抗体のその抗原に対する結合を（前記第二の抗体の前記第一の抗体の非存在下での抗原への結合と比較して）５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超えて阻害することを意味する。かくして、第二の抗体による、第一の抗体のその抗原に対する結合の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える阻害は、該２つの抗体が同じエピトープに結合することを示す。
天然の抗体と比較して、多くとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸の相違（例えば、置換、付加または欠失）を含む、遺伝子工学による組換え抗体も提供される。１個または複数のアミノ酸の相違が軽鎖および／または重鎖にあってよく、１個または複数のＣＤＲにあってもよく、フレームワーク領域、もしくは定常領域内、例えばＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３にあってもよい。例えば、（１）本明細書中に記載の１つまたは複数のＶＨＣＤＲ領域を含むＶＨ配列と、本明細書中に記載の１つまたは複数のＶＬＣＤＲ領域を含むＶＬ配列と、および（２）異種起源のフレームワーク領域を含む遺伝子工学による組換え抗体が提供される。異種起源のフレームワーク領域は、そのＣＤＲ領域の本来の供給源ではない抗体、細胞またはヒトに由来してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、同一のＣＤＲを含む抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ６のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ７のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ８のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ９のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１１由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１２由来ではないフレームワーク領域とを含んでよい。
また、（１）本明細書中に記載の１つまたは複数のＶＨＣＤＲ領域を含むＶＨ配列と、本明細書中に記載の１つまたは複数のＶＬＣＤＲ領域を含むＶＬ配列と、および（２）異種起源の定常領域を含む遺伝子工学による組換え抗体が提供される。異種起源の定常領域は、そのＣＤＲ領域の本来の供給源ではない抗体、細胞またはヒトに由来してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、そのＣＤＲを得たヒト以外のヒト由来の定常領域を含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１由来ではない定常領域とを含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ６のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６由来ではない定常領域とを含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ７のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７由来ではない定常領域とを含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ８のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８由来ではない定常領域とを含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ９のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９由来ではない定常領域とを含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１１由来ではない定常領域とを含んでよい。いくつかの実施形態に、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１２のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１２由来ではない定常領域とを含んでよい。また、（１）本明細書中に記載の１つまたは複数のＶＨＣＤＲ領域を含むＶＨ配列と、本明細書中に記載の１つまたは複数のＶＬＣＤＲ領域を含むＶＬ配列と、および（２）異種起源のFc領域を含む遺伝子工学による組換え抗体が提供される。異種起源のFc領域は、そのＣＤＲ領域の本来の供給源ではない抗体、細胞またはヒトに由来してもよい。
また、本明細書に記載の１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を、改変抗体を作り出すための出発物質として用いて調製でき、その出発抗体から改変された特性を有し得る遺伝子工学による改変抗体も提供される。抗体は、１つまたは複数の可変領域（即ち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つまたは複数ＣＤＲ領域内および／または１つまたは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することによって作り出すことができる。加えて又は別に、抗体は、定常領域（複数の領域）内の残基を、例えば、抗体のエフェクター機能（複数の機能）を改変するために、修飾することによって作り出すことができる。
実施し得る可変領域の遺伝子工学による作製の１つの形態はＣＤＲ移植（グラフティング）である。抗体は、主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間で、ＣＤＲ外の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が抗体−抗原相互作用の大部分を担うため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然の抗体からＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、その特定の天然の抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることは可能画である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号、及びＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照のこと）。
したがって、本発明の他の実施形態は、配列番号：４、８１、１００、１１７、１３５、１５４および１７２、配列番号：８４、１０２、１１９、１３７、１５６および１７４および配列番号：８、８６、１０３、１２１、１３９、１５８および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：１３、８８、１０６、１２４、１４２、１６１および１７９、配列番号：９０、１０８、１２６、１４４、１６３および１８１、および配列番号：１７、９２、１１０、１２８、１４６、１６５および１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列とを含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部位に関する。かくして、そのような抗体は、表１に示されるモノクローナル抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含んでもよい。
そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から入手できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系のＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖細胞系配列データベース インターネットｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにて利用可能である）、並びに、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍら、（１９９２）「Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨＳｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨＳｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ」 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；およびＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌら、（１９９４）「Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ＶＨＳｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６において見出すことができる（これらの刊行物の各々の内容は引用により本明細書に明示的に組み込まれる）。
本発明の抗体に使用する例示したフレームワーク配列は、本明細書中に記載の抗体に使用されるフレームワーク配列に構造的に類似しているものを含む。ＶＨＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列を誘導する生殖細胞系の免疫グロブリン遺伝子に見られる配列と同じ配列を有するフレームワーク領域に移植してもよく、あるいは、該ＣＤＲ配列を生殖細胞系の配列と比較して１つまたは複数の変異を含むフレームワーク領域に移植してもよい。例えば、特定の例において、抗体の抗原結合能を維持する又は高めるように、フレームワーク領域内の残基を変異させる利益が見出された（例えば、Ｑｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号）。
他のタイプの可変領域改変では、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ１，ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３内のアミノ酸残基を変異させ、それによって、興味対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善させる。それによって、利益の抗体の特性（例えば、親和性）を結合している１つまたは複数を改善するためにＶＨやＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２やＣＤＲ３領域の中でアミノ酸残基を変異させることである。部位特異的突然変異またはＰＣＲにより媒介される突然変異生成を行って変異（複数の変異）を導入し、抗体結合性または興味ある他の機能的特徴に対する作用を、本明細書に記載の、および実施例で提供するインビトロまたはインビボアッセイにて評価することができる。好ましくは、保存的改変（上記した）が導入される。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であってよいが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個または５個以下の残基が改変される。
したがって、他の実施形態において、本発明は、以下の重鎖可変領域を含む単離された抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：（ａ）配列番号：４、８１、１００、１１７、１３５、１５４および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：４、８１、１００、１１７、１３５、１５４および１７２と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号：６、８４、１０２、１１９、１３７、１５６および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：６、８４、１０２、１１９、１３７，１５６および１７４と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは、５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号：８、８６、１０３、１２１、１３９、１５８および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：８、８６、１０３、１２１、１３９、１５８および１７６と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは、５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号：１３、８８、１０６、１２４、１４２、１６１および１７９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：１３、８８、１０６、１２４、１４２、１６１および１７９と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号：１５、９０、１０８、１２６、１４４、１６３および１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：１５、９０、１０８、１２６、１４４，１６３および１８１と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは、５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；および（ｆ）配列番号：１７、９２、１１０、１２８、１４６、１６５および１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：１７、９２、１１０、１２８、１４６、１６５および１８３と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは、５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域。
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基を酸化し、結果的に抗体の潜在力において潜在的な化学分解およびそれに伴う低下をもたらす。したがって、本発明は、また、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおいて１つまたは複数のメチオニン残基を、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換した抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。１つの実施形態において、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換されている。
本発明の作り出された抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内でフレームワーク残基に修飾が施された抗体を含む。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、対応する生殖細胞系の配列に対して１つまたは複数のフレームワーク残基を「戻し突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳しくは、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体を得た生殖細胞系の配列と異なるフレームワーク残基を含んでもよい。そのような残基は、抗体フレームワーク配列と、抗体を得た生殖細胞系の配列と比較することによって特定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系の配置に戻すために、該体細胞突然変異を、たとえば、部位特異的突然変異またはＰＣＲによる突然変異生成によって、生殖細胞系の配列に「戻し突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させてもよい。そのように「戻し突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させた抗体も本発明に包含されることを意図する。
他のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内の、または１つまたは複数のＣＤＲ領域内でも、１つまたは複数の残基を変異させ、それによって、Ｔ細胞エピトープを取り除き、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、Ｃａｒｒら、に対する米国特許出願公報第２００３０１５３０４３号にさらに詳述されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で施される修飾に加えて又はとは別に、本発明の抗体は、典型的に抗体の１つまたは複数の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存的細胞障害活性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように作ることができる。さらに、本発明の抗体を化学的に修飾するか（例えば、１つまたは複数の化学的構成部分を抗体に結合させてよい）、またはその糖付加を改変するために修飾して、抗体の１つまたは複数の機能的特性をさらに改変させてもよい。機能的特性を改変するために、化学的にモディファイされてもよくて（例えば、１つまたは複数の化学部分は、抗体に添付されることができる）、または、そのグリコシル化を改変するためにモディファイされてもよい。これらの実施形態の各々を以下にさらに詳述する。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。
Ｆｃは、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリン、例えば断片、アナログ、バリアント、変異体または定常領域の誘導体の定常領域から誘導されるドメインを包含する。適切な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および他のクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。免疫グロブリンの定常領域は、天然の又は合成されたポリペプチドであってもよく、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを、別個に又は組み合わせて含んでもよい。
免疫グロブリンの定常領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合および補体結合を含む重要な抗体機能の多くを担っている。重鎖定常領域には、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭと分類される５つの主要なクラスがあり、その各々は、アイソタイプによって示される特徴的エフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として知られる４つのサブクラスに分けられる。本明細書中で参照されるFcは、いずれのクラスもしくはサブクラスの重鎖定常領域を含んでもよい。
Ｉｇ分子は、細胞受容体の複数の種類と相互作用する。例えば、ＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体、即ちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩに特異的なＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の３つのクラスと相互作用する。ＩｇＧがＦｃγＲ受容体に結合するのに重要な配列が、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに配されていることが報告された。抗体の血清半減期は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体の能力に影響される。同様に、ＩｇＦｃの血清半減期は、また、そのような受容体に結合するその能力に影響される（Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｓ Ｄら、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２１５９−６６）。本明細書中で言及するＦｃは、これらの受容体の１つまたは複数と結合し得る。
本明細書中で開示される抗体は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端の少なくとも一部を含むＦｃを含み得る。例えば、Ｆｃは以下を含む：ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ヒング−ＣＨ２−ＣＨ４ドメインまたはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメイン。Ｆｃドメインは、いずれかの免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭまたはＩｇＧ抗体サブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）のいずれかに属する抗体から得ることができる。Ｆｃドメインは、天然のＦｃ配列、例えば、天然の対立遺伝子またはスプライスバリアントであってもよい。Ｆｃドメインは、２つまたはそれを超える異なるＩｇアイソタイプ由来のＦｃドメインの一部を含むハイブリッドドメイン、例えばＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃドメインであってもよい。例示的な実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリン分子由来である。Ｆｃドメインは、非ヒト動物、例えば、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダおよびサル由来のＦｃドメインのヒト化または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された形態であってもよい。
特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、バリアントＦｃ配列、例えば、望ましい構造上の特徴および／または生物活性を与えるために親のＦｃ配列（例えば、バリアントを作り出すために後に修飾される未修飾Ｆｃポリペプチド）に比べて改変されたＦｃ配列（例えば、例えば、アミノ酸置換、欠失や挿入によって）である。
例えば、１つには、（ａ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を高め又は減じたＦｃバリアント、（ｂ）補体媒介性細胞障害（ＣＤＣ）を高め又は減じたＦｃバリアント、（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性を高め又は減じたＦｃバリアント、および／または（ｄ）親Ｆｃと比べてＦｃ受容体に対する親和性を高め又は減じたＦｃバリアント、を作り出すためにＦｃ領域にて修飾を施すことができる。そのようなＦｃ領域バリアントは、一般に、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることが、特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、例えば本明細書中で特定された特定のＦｃ領域部分のうち、２個、３個、４個、５個等の置換を含んでもよい。
バリアントFcドメインは、ジスルフィド結合形成に関与する部位が取り除かれた配列改変を含んでもよい。そのような除去により、本発明の分子を産生するために使用される宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を避けることができる。この目的のための、Ｎ末端基のシステイン含有セグメントを切断してもよく、または、システイン残基を欠失させ、または他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換してもよい。システイン残基を除去した場合であっても、一本鎖Ｆｃドメインは依然として、共に非共有結合にて二量体Ｆｃドメインを形成し得る。他の実施形態において、天然のＦｃドメインは、選択した宿主細胞とより適合させるために修飾されてもよい。例えば、１つには、プロリンイミノペプチダーゼなどの大腸菌中の消化酵素によって認識される、典型的な天然のＦｃのＮ末端基近くのＰＡ配列を除去してもよい。他の実施形態において、Fcドメイン内の１つまたは複数のグリコシル化部位を除去してもよい。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は細胞溶解応答を与え得る。そのような残基は、除去してもよく、またはグリコシル化されない残基（例えばアラニン）で置換してもよい。他の実施形態において、補体との相互作用に関与する部位、例えばＣ１ｑ結合部位をＦｃドメインから除去してもよい。例えば、１つには、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失または置換してもよい。特定の実施形態において、Ｆｃ受容体に結合に影響を及ぼす部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位を除去してもよい。他の実施形態において、Ｆｃドメインを修飾してＡＤＣＣ部位を除去してもよい。ＡＤＣＣ部位は当分野において既知である：例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関してはＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照のこと。バリアントＦｃドメインの具体的な例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８において開示されている。
１つの実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更、例えば増加または減少させるように改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ等による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記述されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変し、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にする、または、抗体の安定性を増大もしくは減少させる。
他の実施形態において、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異される。より具体的には、抗体が天然のＦｃヒンジドメイン・ブドウ球菌タンパク質Ａ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ：ＳｐＡ）結合性と比較して、損なわれたＳｐＡを有するように、１つまたは複数のアミノ酸変異がＣＨ２−ＣＨ３ドメイン・インターフェース領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄ等による米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳述される。
他の実施形態において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の突然変異の１つまたは複数を導入してもよい：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。別には、生物学的半減期を増大させるために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａ等による米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変することができる。
特定の実施形態において、Ｆｃは、以下に示すヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む：ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：１７１）。その両端のグリシンおよびリジンは随意であることは理解されるべきである。特定の実施形態において、Ｆｃは、少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性（配列番号：１７１）があるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｆｃは、（配列番号：１７１）の少なくとも５０、１００または１５０の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｆｃは、（配列番号：１７１）の５０〜１００、５０〜１５０または１００〜１５０の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｆｃは、１−５、１−１０、１−１５、１−２０または１−２５の置換または保存的置換を有する（配列番号：１７１）を含むアミノ酸配列を含む。ヒト野生型１定常領域配列は、Ｌｅｒｏｙ ＨｏｏｄグループのＥｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１（１９８２）にて初めて記載された。ＥＵインデックス位置３５６、３５８および４３１はＧ１ｍ γ１ハロタイプを定義する。
追加のＦｃバリアントを下記する。本開示のＦｃ領域は、Ｋａｂａｔら（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）におけるようにＥＵインデックス従って、番号付けスキームを含むものと理解される。
本開示は、抗体のエフェクター機能（複数の機能）を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって改変されるＦｃ領域を有するペプチドを包含する。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに関する改変された親和性を有するが親抗体の抗原結合性能力を維持するよう、異なるアミノ酸残基で置換されてもよい。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１構成部分であってよい。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒ等による米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にてさらに詳細に記載されている。
他の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数アミノ酸は、抗体が改変されたＣ１ｑ結合性および／または低下もしくは損なわれた補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換されてもよい。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ等による米国特許第６，１９４，５５１号にてさらに詳細に記載されている。
他の例において、アミノ酸部位２３１および２３９内の１つまたは複数アミノ酸残基を改変し、それによって、補体を固定する抗体の能力を改変する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ等によるＰＣＴ国際公報ＷＯ９４／２９３５１にてさらに記載されている。
さらなる他の例において、抗体依存的細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させるために、および／またはＦｃγレセプターに関する抗体の親和性を増大させるために、Ｆｃ領域を、以下の部位で１つまたは複数のアミノ酸を改変することによって改変する：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公報ＷＯ００／４２０７２においてさらに記載される。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに関するヒトＩｇＧ１上の結合部位をマッピングし、改善された結合性を有するバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌら、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照のこと）。部位２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の突然変異がＦｃγＲＩＩＩに結合を改善することが示された。加えて、以下の組合せ変異体がＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。例示的な置換は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅを含む。例示的なバリアントは、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。ＦｃｙＲと補体相互作用を高める他の修飾は、限定するものではないが、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７１、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５１および３９６Ｌを含む。これらおよび他の改変は、Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５−６９１にて概説される。
Ｆｃガンマ受容体に対する結合を増大させるＦｃ修飾は、Ｆｃ領域のアミノ酸部位２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２４、３２７、３２９、３３０、３３５、３３７、３３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９のいずれか１つまたは複数の部位でのアミノ酸修飾を含み、ここで、該Ｆｃ領域における残基の番号付けはＫａｂａｔ（ＷＯ００／４２０７２）のようにＥＵインデックスの番号付けである。
Ｆｃを作製できる他のＦｃ修飾は、ＦｃｙＲｓおよび／または補体タンパク質への結合を低下または除去する修飾であり、これによって、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを低下または除去し得る。例示的な修飾は、限定するものではないが、部位２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５および３２８（番号付けはＥＵインデックスに従う）での置換、挿入および欠失を含む。例示的な置換は、限定するものではないが、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒ（番号付けはＥＵインデックスに従う）を含む。Ｆｃバリアントは、２３６Ｒ／３２８Ｒを含んでもよい。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低下させる他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖ、ならびに変異導入もしくは酵素的手段による部位２９７のグリコシル化の除去、またはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物内での生産を含む。これらおよび他の改変は、Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５−６９１にて概説される。
場合により、Ｆｃ領域は、当業者には既知の付加的および／または代替部位で、非天然のアミノ酸残基を含めてもよい（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；第６，２７７，３７５号；第６，７３７，０５６号；第６，１９４，５５１号；第７，３１７，０９１号；第８，１０１，７２０号；ＰＣＴ国際公開ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０２／０６９１９；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４を参照のこと）。
また、抑制受容体ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を高めるＦｃバリアントを使用してもよい。当該バリアントは、ＦｃにＦｃｙＲｌ ｌｂ＋細胞、例えばＢ細胞および単球に関連した免疫調節性活性を与え得る。１つの実施形態において、該Ｆｃバリアントは、１つまたは複数の活性化受容体と比較して、ＦｃｙＲｌ ｌｂに対する増強された親和性を選択的に与える。ＦｃｙＲｌ ｌｂへの結合を改変する修飾は、ＥＵインデックスに従って、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される部位に１つまたは複数の修飾を含む。ＦｃｙＲｌ １ｂ親和性を高める例示的な置換は、限定するものではないが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含む。例示的な置換は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃｙＲｌ ｌｂに対する結合を高める他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。
Ｆｃ領域のそのリガンドに関する親和性および結合特性は、当分野で公知の様々なインビトロ方法（生化学、または、免疫学的ベースのアッセイ）によって、例えば、限定するものではないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または放射性免疫測定法（ＲＩＡ））または、キネティックス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析）、および他の方法（例えば間接的な結合アッセイ、競争阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過））によって決定され得る。これらおよび他の方法は、１つまたは複数の調べられる構成部分に対する標識を利用してもよく、および／または限定するものではないが、発色性、蛍光性、発光性またはアイソトープ標識を含む様々な検出方法を実施してもよい。結合親和性およびキネティックスの詳細は、抗体−免疫原相互作用に重点を置いたＰａｕｌ，Ｗ．Ｅ（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）にて見出すことができる。
Ｆｃはまた、抗体の血清半減期を延ばし得る。例えば、これは、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を高めることによって実施し得る。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、１つまたは複数の以下の残基に変異導入することができる：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。
ＦｃＲｎに対する結合を増大させる、および／または薬物動態特性を改善する他の例示的なＦｃバリアントは、部位２５９、３０８、４２８および４３４での置換を含み、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍが挙げられる。ＦｃＲｎに対するＦｃ結合を高める他のバリアントは、以下を含む：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎら、２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６，Ｈｉｎｔｏｎら、２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６−３５６），２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１ １Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２７６（９）：６５９１−６６０４），２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１ １ Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ Ａｃｑｕａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，１６９：５１７１−５１８０，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：２３５１４−２３５２４）。ＦｃＲｎ結合を改変する他の修飾は、Ｙｅｕｎｇら、２０１０，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２：７６６３−７６７１に記載されている。
特定の実施形態において、特定の生物学的特徴を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプを用いてもよい。例えば、ｌｇＧ１／ｌｇＧ３ハイブリッドバリアントは、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域内のＩｇＧ１部位を、２つのアイソタイプが異なる部位でｌｇＧ３由来のアミノ酸と置換することにより構築することができる。かくして、１つまたは複数の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒ、および４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築されてもよい。本発明の他の実施形態において、ｌｇＧ１／ｌｇＧ２ハイブリッドバリアントは、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域内のＩｇＧ２部位を、２つのアイソタイプが異なる部位でｌｇＧ１由来のアミノ酸と置換することにより構築することができる。かくして、１つまたは複数の置換、例えば、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（部位２３６でのグリシン挿入を示す）および３２７Ａを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築されてもよい。
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、脱グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体を作製することができる（即ち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を改変して、例えば、抗体の抗原に対する親和性を高めることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって行い得る。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換を行って、１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を失わせ、それにより、該部位でのグリコシル化を失わせることができる。そのような脱グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、抗体の抗原に関する親和性を高め得る。そのようなアプローチは、Ｃｏ等による米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号に詳述されている。別には、Ｆｃに共有結合しているオリゴ糖を、例えば遺伝子工学的に作出された又はその他の様々な生物または細胞株（たとえばＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現させることによって、グリコシル化経路に関与する酵素（例えばＦＵＴ８［ａ１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによって、ＩｇＧ発現後に炭水化物（複数の炭水化物）を改変することによって、或いは、酵素阻害剤としてのフコースアナログの存在下でＦｃ融合タンパク質を発現することによって、変更させてもよい。Ｆｃの糖型を改変する他の方法は、糖鎖工学により作出された株の酵母（Ｌｉら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５）、コケ（Ｎｅｃｈａｎｓｋｙら、２００７、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｊｏｌ ４４（７）：１８２６−８）および植物（Ｃｏｘら、２００６、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１２）：１５９１−７）用いることを含む。
１つの実施態様において、Ｆｃ融合体はシアリル化レベルを改変するために、糖鎖工学により作り出される。Ｆｃ分子におけるシアル酸付加Ｆｃグリカンのより高い濃度は、機能に負の影響を及ぼし（Ｓｃａｌｌｏｎら、２００７、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（７）：１５２４−３４）、Ｆｃシアリル化レベルの相違は結果的に改変された抗炎症性活性をもたらし得る（Ｋａｎｅｋｏら、２００６、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３：６７０−６７３）。
また、Ｆｃ分子のグリコシル化レベルは、特定の突然変異によって改変し得る。例えば、アミノ酸部位２９７または２９９の突然変異により、部位２９７での糖鎖付加が除去され得る。使用し得る他のＦｃ修飾は、ＷＯ８８／０７０５４、ＷＯ８８／０７０８９、米国特許第６，２７７，３７５号、ＷＯ９９／０５１６４２、ＷＯ０１／０５８９５７、ＷＯ２００３／０７４６７９、ＷＯ２００４／０２９２０７、米国特許第７，３１７，０９１号およびＷＯ２００４／０９９２４９に記載のものを含む。
加えて又は別に、グリコシル化の形態を改変させた抗体、例えばフコシル残基の量を減らした低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または分岐したＧｌｃＮａｃ構造を増やした抗体を調製してもよい。そのような改変グリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増強されることが実証された。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で該抗体を発現させることによって、実施することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として用いることができる。例えば、Ｈａｎａｉ等による欧州特許第１，１７６，１９５号は、その細胞系で発現される抗体が低フコシル化を示すようにフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系を記載する。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０３５８３５は、Ａｓｎ（２９７）関連炭水化物にフコースを結合させる能力が減じ、また、その宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化の結果となるバリアントＣＨＯ細胞系のＬｅｃ１３細胞を記載する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照のこと）。Ｕｍａｎａ等によるＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／５４３４２は、その作り出された細胞系で発現される抗体が増大した分岐したＧｌｃＮａｃ構造を示し、その結果、該抗体の増大したＡＤＣＣ活性をもたらすように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように作り出した細胞系を記載する（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照のこと）。
さらに、特定のＦｃバリアントは、γ１ヒンジ領域を含むが、クローニングを容易にするためにＢｇ１ＩＩ制限酵素認識配列を含めるためにＡｒｇ２１８がそのヒンジ領域に導入され、対合しないスルフヒドリル基が潜在的に存在することによる悪影響を防ぐためにＳｅｒをＣｙｓ残基に換えて含む。Ｆｃ４のＣＨ２領域はγ１ＣＨ２に基づき、Ｆｃγ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ）結合を低下させる３つのアミノ酸置換を含む。それらは、ＥＵインデックス部位２３４、２３５および２３７における置換である。これらの置換はＧｒｅｇ ＷｉｎｔｅｒグループのＤｕｎｃａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：５６３（１９８８））にて記載され、ＦｃＲＩに対する結合を低下させることがその論文にて示された。加えて、補体の固定を低下させるために、補体Ｃ１ｑ結合部位に２つのアミノ酸置換が導入された。これらは、ＥＵインデックス部位３３０および３３１での置換である。補体Ｃ１ｑ結合（または、補体固定または活性化の欠如）における部位３３０および３３１の、重要性または関連は、Ｓｈｅｒｉｅ ＭｏｒｒｉｓｏｎグルプープのＴａｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）、ならびにＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）に記載されている。Ｆｃ４バリアントにおけるＣＨ３領域は、野生型γ１Ｆｃと同じのままである。
Ｆｃ５は、ヒンジ領域のＡｒｇ２１８置換をその野生型のＬｙｓ２１８残基に戻したＦｃ４バリアントである。また、Ｆｃ５は、Ｆｃ４と同じくＣｙｓ２２０へのセリン置換および野生型γ１Ｆｃと同一のＣＨ２領域との同じＣＨ２置換を含む。Ｆｃ６バリアントは、Ｆｃ５と同じヒンジ領域置換を含み、Ｆｃ４と同じＣＨ２置換を含む。Ｆｃ６ ＣＨ３領域はカルボキシ末端のリジン残基を含まない。この特定のＬｙｓ残基は、割り当てられたＥＵインデックスを有さない。このリジンは、成熟免疫グロブリンから様々な程度で取り除かれ、したがって、循環抗体では大部分で見出されない。組換えＦｃでのこの残基の欠如は、より均一な産物をもたらし得る。Ｆｃ７バリアントは、ヒンジ領域において野生型γ１Ｆｃと同一である。そのＣＨ２領域はγ１ＣＨ２に基づくが、脱グリコシルＦｃを産生するために、残基Ａｓｎ−２９７のＮ結合型の炭水化物結合部位がＧｌｎに変更されている（例えば、ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５−２６０１を参照のこと）。ＣＨ３領域は、野生型γ１Ｆｃと同一である。Ｆｃ８バリアントはＦｃ４と同一のヒンジ領域を有し、ＣＨ２領域とＣＨ３領域の両方とも対応する野生型γ１Ｆｃ領域と同一である。Ｆｃ９バリアントは、軽鎖に対するジスルフィド結合に関与するＣｙｓ残基のちょうどカルボキシ末端のＡｓｐ残基から始まる短縮型のγ１ヒンジを含む。残りのヒンジ配列は、野生型γ１のヒンジと同一である。ＣＨ２領域配列とＣＨ３領域配列の両方とも、野生型γ１Ｆｃの対応する領域と同一である。Ｆｃ１０バリアントは、Ｆｃ５と同じヒンジ領域置換を含む。ＣＨ２領域配列とＣＨ３領域配列の両方とも、野生型γ１Ｆｃの対応する領域と同一である。Ｆｃ１１バリアントは、Ｆｃ５と同じヒンジ領域置換を含む。そのＣＨ２ドメインはγ１ＣＨ２に基づくが、Ｆｃγ受容体結合を低下させるための置換（ＥＵインデックス部位２３４、２３５および２３７での置換）を含む。Ｆｃ１１は、Ｃ１ｑ結合および補体固定に関して野生型である。Ｆｃ１１のＣＨ３ドメインは、野生型γ１ＣＨ３と同一である。Ｆｃ１２バリアントは、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６ＳｅｒおよびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ５と同じＣＨ２ドメインを有し、そして野生型γ１ＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１３バリアントは、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６ＳｅｒおよびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１のヒンジを含み、Ｆｃ５と同じＣＨ２ドメインを有し、そしてＴｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有する野生型γ１ＣＨ３を有する。Ｆｃ１４バリアントは、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６Ｓｅｒ、およびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、野生型γ１ＣＨ２を有し、そして、Ｔｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有する野生型γ１ＣＨ３を有する。Ｆｃ１５バリアントは、ＩｇＧ４「Ｆａｂ交換」を低くするためのＳｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を有するγ４ヒンジを含み、そして野生型γ４ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１６バリアントは、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を含むγ１ヒンジを含み、γ１ＣＨ２と同じＣＨ２ドメインを有し、そして野生型γ４ＣＨ３と同じＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１７バリアントはＣｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｐｈｅ２４３Ａｌａ置換を有するγ１ＣＨ２ドメインを有し、そして野生型γ１ＣＨ３と同じＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１８バリアントは、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、野生型γ１ＣＨ２と同じγ１ＣＨ２ドメインを有し、そしてＨｉｓ４３５Ａｌａ置換を有するγ１ＣＨ３を含む。Ｆｃ１９バリアントは、脱グリコシル化Ｆｃを産生するために残基Ａｓｎ−２９７のＮ結合型の炭水化物結合部位がＧｌｎに置き換えられており、野生型γ１ＣＨ３と同じＣＨ３ドメインを有することを除いて、Ｆｃ５と同じヒンジを含み、Ｆｃ５と同じＣＨ２ドメインを有する。Ｆｃ２１バリアントはＣｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６ＳｅｒおよびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ５と同じＣＨ２ドメインを有し、そしてＰｈｅ４０５ＡｌａおよびＴｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有するγ１ＣＨ３を有する。Ｆｃ２２バリアントはＣｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６ＳｅｒおよびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ１と同じＣＨ２ドメインを有し、そしてＰｈｅ４０５ＡｌａおよびＴｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有するγ１ＣＨ３を有する。Ｆｃ２３バリアントはＣｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ置換を有するγ１ＣＨ２ドメインを有し、そして野生型γ１Ｆｃと同じＣＨ３ドメインを有する
本発明により考えられる本明細書中の抗体の他の修飾は、ペグ化である。抗体をペグ化することで、例えば、その抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増やすことができる。抗体をペグ化するために、その抗体またはその断片は、典型的には、１つまたは複数ＰＥＧ基が該抗体または抗体断片に結合する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を通して行われる。本明細書中で用いられる用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドを誘導体化するために用いられたいずれのＰＥＧ形態も包含することを意図する。特定の実施形態において、ペグ化する抗体は脱グリコシル化された抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野にて既知であり、本発明の抗体に適用し得る。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等によるＥＰ ０ １５４ ３１６およびＩｓｈｉｋａｗａ等によるＥＰ ０ ４０１ ３８４を参照のこと。
使用方法
いくつかの例において、本開示は、本明細書中に開示される組成物を対象に投与することを含む処置方法を提供する。対象における癌または癌の症状を処置および／または予防する方法であって、前記対象にＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合するペプチドを含む治療上有効な量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは、５個またはそれ未満の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５個またはそれ未満の保存的アミノ酸置換を有する表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９、１１または１２のＶＬのＣＤＲ３とを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、癌はＭＩＣＡの過剰発現と関連する癌である。いくつかの実施形態に、癌は、メラノーマ、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、すい臓癌、胃癌、結腸癌、リンパ腫または白血病である。いくつかの実施形態において、癌はメラノーマである。いくつかの実施形態に、癌は形質細胞悪性腫瘍であり、例えば多発性骨髄腫（ＭＭ）またはプラズマ細胞の前悪性の状態である。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有していると、又は癌体質であると診断されている。
いくつかの例において、本開示は、対象における癌または癌の症状を処置および／または予防する方法であって、前記対象にＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）に特異的に結合する単離された抗体を含む治療上有効な量の組成物を投与することを含み、前記抗体は、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１、１５０または１６８の重鎖可変領域（ＶＨ）配列に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域と、配列番号：１１、７９、９８、１１３、１３３、１５２または１７０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３とを含む、方法を提供する。
癌の症状は、当業者に周知であり、限定するものではないが、異常なほくろ形質、ほくろの外見（非対称、境界、色および／または直径を含む）における変化、新たに色素沈着した皮膚領域、異常なほくろ、爪下の黒い領域、乳房のしこり、乳首変化、乳房嚢胞、乳房痛、死、重量損失、衰弱、過労、食事困難、食欲の喪失、慢性咳、悪化する息切れ、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫脹、腹膜腔中の体液、膣出血、便秘、腹部膨満、結腸のパーフォレーション、急性腹膜炎（感染症、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸癌転移、肺転移、膀胱癌転移、肝転移、骨転移、腎転移および膵転移、嚥下障害およびその他の類似症状を含む。
本明細書中に開示される方法は、広域にわたる種、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えばサル）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、エルク、ヤギ、イヌ、ネコ、イタチ、ウサギ、テンジクネズミ、ハムスター、ラットおよびマウスに適用できる。
用語「処置する」または「処置すること」は、本明細書中で用いられるように、対象が苦しむ疾患または状態の少なくとも１つの症状または生物学的兆候の発症、進行または再発を、部分的または完全に緩和、阻害、改善および／または緩和することを示す。いくつかの例において、処置は、対象が苦しむ疾患または状態の継続的な不存在の結果をもたらし得る。
用語「有効量」または「有効な投薬量」は、所望の作用を達成または少なくとも部分的に達成すのに十分な量と定義される。用語「治療上有効量」は、すでに疾患を患っている患者において、その疾患または合併症を治癒または少なくとも部分的に抑えるのに十分な量と定義される。この使用に有効な量は、処置される障害の重症度および患者自身の免疫系の一般的な状態に依存し得る。
薬物または治療剤、例えば本発明のＦｃ融合タンパク質の「治療上有効量」または「治療上有効な投薬量」は、単独または他の治療上薬と組合せて用いた場合に、疾患症状の重症度の低下、疾患症状がない期間の頻度および長さの増加、または疾患苦悩による減損または不能の予防によって明示される疾患の退行を促進する前記薬物のいずれかの量である。薬物の治療上の有効量または投薬量は「予防上の有効量」または「予防的に有効な投薬量」を含み、それは、単独または他の治療上薬と組合せて疾患を発症する又は疾患の再発で苦しむリスクのある対象に投与した場合に、前記疾患の発症または再発を阻止する前記薬物のいずれかの量である。疾患の退行を助成し、または、疾患の発症または再発を阻止する治療薬の能力は、当業者には既知の様々な方法を用いて、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトでの効能を予測する動物モデル系において、または、インビトロにて該薬物の活性を評価することによって評価することができる。
例として、抗癌剤は対象において癌退行を助成する。好ましい実施形態において、治療上有効な量の薬物は、癌を排除する程度まで癌退行を助成する。「癌退行を促進する」は、その薬物の有効量を単独または抗悪性腫瘍薬と組合せて投与することが、結果的に、腫瘍増殖またはサイズの低下、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度において低下、疾患症状のない期間の頻度および長さの増加、疾患苦悩による減損または不能の予防、そうでない場合には患者の疾患症状の改善となることを意味する。加えて、処置に関する用語「有効」および「効果的」は、薬理学的効果および生理的安全の両方を含む。薬理学的効果は、患者において癌の退行を助成する薬物の能力を示す。生理的安全は、薬物投与の結果としての毒性レベルまたは細胞、器官および／または生物レベルでの不都合な生理的作用（副作用）を示す。
腫瘍処置に関する例として、薬物の治療上の有効量または投薬量は、未処置の対象と比べて、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％まで、細胞増殖または腫瘍増殖を好ましくは阻害する。最も好ましい実施形態において、薬物の治療上の有効量または投薬量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害、すなわち好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。腫瘍増殖を妨げる化合物の能力は、下記アッセイを用いて評価することができる。別には、組成物のこの特性は、細胞増殖を阻害する化合物の能力を調べることによって評価でき、そのような阻害は当業者には既知のアッセイによってインビトロにて測定できるような。本発明の他の好ましい実施形態において、腫瘍退行は、少なくとも約２０日、好ましくは少なくとも４０日、またはさらにより好ましくは少なくとも６０日の期間、観察され、続き得る。
一般に、本方法は、状態または疾患のリスクがある、または罹患している対象を選抜することを含む。いくつかの例において、対象の状態または疾患は、本明細書中に開示される医薬組成物で処置され得る。例えば、いくつかの例において、本方法は、癌を有する対象を選択することを含み、例えば、前記対象の癌がＭＩＣＡおよび／またはアンジオポイエチン−２の一方または両方を標的化することにより処置し得る。
いくつかの例において、処置方法は、対象が苦しむ疾患または状態の予防または処置の必要に応じて単回投与、複数回投与および反復投与を含んでよい。いくつかの例において、処置方法は、処置前、処置中および／または処置後の対象における疾患レベルを評価することを含んでよい。いくつかの例において、処置は、対象で疾患レベルの低減が検出されるまで続行してよい。用語は「投与する」、「投与すること」または「投与」は、本明細書中で使用されるように、形態に関わらず本発明のペプチドを、移植し、吸収させ、摂取させ、注射し、または吸入させることを示す。いくつかの例において、本明細書中に開示される１つまたは複数のペプチドは、対象に局所（例えば、経鼻）および／または経口投与してよい。例えば、本明細書の方法は、所望のまたは所定の作用を達成するのに有効な量の化合物または化合物組成物の投与を含む。いずれかの特定の患者用の具体的な投薬量および処置レジメンは、様々な要因、例えば、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与期間、排出率、薬物組合せ、疾患の重症度および過程、状態または症状、疾患に対する患者の感情、状態または症状、および主治医の判断に依存し得る。
例えば、投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療反応）を与えるために調整される。単回ボーラス投与してもよく、複数回に分けた服用量を時間をかけて投与してもよく、或いは、投薬量を治療状況の緊急性で示されるのに比例して服用量を増減させてよい。投与の容易さ及び投薬の均質性のため、投薬単位形の非経口組成物を処方することは特に有利である。本明細書で用いる「投薬単位形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）」は処置される対象の一体型剤形（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅ）に適した物理的に分離した単位を示し、各単位は、必要な医薬担体と関連して、所望の治療効果を奏するように計算した所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形の詳細は、（ａ）活性化合物および達成されるべき特定の治療効果に関する特有の特徴、および（ｂ）個人の過敏症に関する処置用の当該活性化合物を合成する分野に内在する制限により指示され、また、それらに直接依存する。
抗ＭＩＣＡ抗体または抗体断片の投与に関して、投薬量は、宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、より一般的には０．０１〜５ｍｇの範囲にある。例えば、投薬量は体重１ｋｇあたり０．３ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇであってよく、または体重１ｋｇあたり１〜１０ｍｇの範囲であってよい。例示的な処置レジメンは、１週間に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、１ヵ月に１回、３ヵ月毎に１回または３〜６ヵ月毎に１回を必要とする。本発明の抗ＭＩＣＡ抗体の好ましい投薬レジメンは、体重１ｋｇあたり１ｍｇまたは３ｍｇを静脈内投与にて、以下の投薬スケジュールのいずれかを用いて与えることを含む：（ｉ）４週毎に６回の投薬、次いで３カ月毎；（ｉｉ）３週毎；（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重ｋｇを１回、続いて３週毎に３ｍｇ／体重ｋｇ。
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つまたはそれを超えるモノクローナル抗体は同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は指示された範囲内にある。抗体は、通常、複数機会に投与される。単回投薬の間隔は、例えば、毎週、毎月、3ヵ月毎または毎年であってよい。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより指示されて、変則的であってもよい。いくつかの方法において、投薬量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、いくつかの方法において、約２５〜３００μｇ／ｍｌに調整される。
別には、医薬組成物は、より頻度の少ない投与が要求される場合、徐放配合物として投与されてよい。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト以外の抗体が続く。投与の投薬量および頻度は、処置が予防目的であるか又は治療目的であるかに依存して異なり得る。予防適用では、比較的低い投薬量を長期間かけて比較的低頻度で投与される。患者の幾らかは、残りの人生の間処置を受けることを継続する。治療適用では、疾患の進行が低下もしくは停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、時として、比較的高い投薬量が比較的短い間隔で要求される。その後、該患者は予防レジメンが投与されてもよい。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、投与の特定の患者、組成物および投与形態に関して、前記患者に対して毒性を示さず、所望の治療反応を達成するのに効果的な活性成分の量を得るために可変し得る。選択された投薬レベルは、様々な薬物動態学的要因、例えば用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出率、処置期間、用いられる特定の組成物と組合される他の薬物、化合物および／または物質、年齢、性別、重量、状態、一般的な健康状態、および処置される患者の以前の医療歴、および医薬分野で公知の類似の要因に依存し得る。
投与後に、対象を評価し、それらの疾患レベルを検出、評価または決定してもよい。いくつかの例において、処置は、対象の疾患レベルに変化（例えば、低下）が検出されるまで、継続することができる。
患者の状態の改善（例えば、対象の疾患レベルに変化（例えば、低下））した際、必要に応じて、この発明の化合物、組成物または組合せに関する維持量を投与してもよい。その後、投与の投薬量または頻度は、もしくはその両方は、症状に応じて、改善された状態が維持されるレベルまで、低減されてもよい。しかしながら、患者は、いずれかの疾患症状の再発に関して長期の断続的処置を必要とし得る。
いくつかの例において、本開示は、ヒト対象から、免疫細胞、例えばＢ細胞および／または記憶Ｂ細胞を検出する方法を提供する。該方法を用いて、例えば、免疫細胞、例えばＢ細胞および／または記憶Ｂ細胞のレベルをヒト対象においてモニタすることができる。例示的な事象としては、限定するものではないが、疾患、感染の検出；本明細書に開示される治療用組成物の糖よ、治療薬または治療レジメンの投与、ワクチン投与、免疫応答の誘導が挙げられる。そのような方法は、臨床上および／または研究用に用いることができる。
（実施例）
本発明は、以下の実施例においてさらに詳述されるが、実施例は特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
本明細書において、限られた量の末梢血から所定の抗原特異性を有する稀な記憶Ｂ細胞を感度よく、特異的に且つ信頼性をもって検出することを可能にする方法を記載する。本方法は、抗原が除去された後、数か月から数年、記憶Ｂ細胞の可視化および単離を可能にした。
本明細書に記載の方法の原理の検証は、Ｆｒａｎｚら、（Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８−３５７（２０１１））（この引例は引用により完全に本明細書中に組み込まれる）で詳細に報告されたように、破傷風毒素Ｃフラグメント（ＴＴＣＦ）の四量体を用いて行われた。
モデル抗原としてＴＴＣＦ（即ち、５２ｋＤａのＴＴＣＦの無毒なＣ末端）を選択した。これは、大部分の個体が破傷風トキソイドによるワクチン接種を受けており、ワクチンにより持続性のＩｇＧ抗体力価が誘導されているためである（Ａｍａｎｎａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５７：１９０３−１９１５，２００７）。したがって、ＴＴＣＦの使用により大規模な対象が提供され、本明細書に開示する方法が検証され得た。しかしながら、当業者は通常の能力を用い、本方法がいずれの疾患関連抗原を含めて適用できると認識し得る。以下の実施例で実証されるように、そのような適用は、癌関連抗原であるＭＩＣＡおよびアンジオポイエチン−２に対する抗体の獲得を通じて示されている。
実施例１：抗原発現および四量体形成
以下にさらに詳細に記載するように、ＴＴＣＦを大腸菌に発現させ、ＢｉｒＡ酵素による部位特異的モノビオチン化のために、ＢｉｒＡ部位をＮ末端に付加した。タンパク質とビオチン化部位との間に、フレキシブルリンカーを配し、抗体結合の立体障害を抑制する。ＴＴＣＦを、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＢｉｒＡによりビオチン化し、遊離ビオチンとＢｉｒＡとをゲルろ過クロマトグラフィーにより分離した。ＴＴＣＦ四量体は、蛍光標識化ストレプトアビジンとビオチン化したＴＴＣＦ抗原とをモル比１：４でインキュベートすることで調製した。次いで、これらの四量体を、破傷風トキソイド特異記憶Ｂ細胞の同定のために、ｍＡｂパネルと共に用いた。
ＴＴＣＦを、ｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。タンパク質の発現を、２８℃で４時間、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌にて誘導した。細胞を洗浄し、溶菌して得られた上清を回収した。ＴＴＣＦをＨＩＳセレクト・アフィニティーカラム（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製した。Ｈｉｓタグをタンパク質分解により除去した。マウスＣＤ８０の膜近傍のドメイン（membrane proximal domain）を同様の方法を用いて産生した。タンパク質をモノビオチン化した。特定の試験のために、Ａｌｅｘａ４８８染色分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）をビオチン化ＴＴＣＦまたはＣＤ８０の一級アミンに連結した。
抗原の四量体は、ビオチン化抗原を特級グレード（ｐｒｅｍｉｕｍ ｇｒａｄｅ）のＰＥ標識化ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に４：１のモル比で少なくとも２０分間氷上でインキュベートすることで調製した。使用前に、四量体調製物を遠心分離して凝集塊を除去した。いくつかの試験において、四量体は、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−４８８標識化抗原および非蛍光ストレプトアビジンと共に４：１の比で形成させた。
実施例２：同定方法
Ｆｒａｎｚら、Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８−３５７（２０１１）に記載されたように方法を実施した。細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩセルソーターにて選別した。細胞は単細胞選別された。サンプルを、まず、排除マーカー（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）パネル（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７ＡＡＤ）が陰性のＣＤ１９＋細胞に関してゲーティングし、次いで、高レベルのＣＤ２７および中レベルのＣＤ１９発現により同定された形質芽球に関してゲーティングし、最後に、四量体＋ＣＤ１９＋細胞に関してゲーティングした。
記憶Ｂ細胞の頻度が低いために、可能な限り慎重にバックグラウンドを低下させる必要があった。Ｂ細胞を、まず、前記四量体に対して特異的に結合できない大部分の細胞を除去するためのネガティブ選択（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびグリコホリンＡに対する抗体のカクテル）により富化した。富化した細胞を均等に分け、ＴＴＣＦまたは対照の四量体で染色し、次いで、クラススイッチした記憶Ｂ細胞を特異的に選択するためにＣＤ１９、ＣＤ２７およびＩｇＭで標識化した。ゲーティングストラテジーは、ＣＤ１９発現、排除マーカーパネル（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７ＡＡＤ）による標識の欠如、記憶マーカーＣＤ２７の発現、およびクラススイッチングの証拠としてのＩｇＭ発現の欠如を考慮した。四量体染色は、目的の抗原特異性を有する記憶Ｂ細胞の可視化のために、ＣＤ２７染色に対してプロットした。四量体陽性Ｂ細胞を、３μｌのｍＲＮＡ抽出緩衝液を含有するＰＣＲストリップに直接選別した。
選別の間、チューブを冷却したままで維持し、選別した細胞を凍結し、−３０℃で保存した。ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＭ−Ｂ細胞を陽性対照として用いた。
既報のネストＰＣＲプロトコルを用いて、重鎖および軽鎖可変セグメントを増幅した（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２４４：２１７−２２５，２０００）。混入を最小限にするのに適した条件下で、ｍＲＮＡ増幅を行った。
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ（配列番号：１９）；
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ（配列番号：２０）；
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣ（配列番号：２１）。
Ｆｒａｎｚら、Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８−３５７（２０１１）に記載されたように、ネステッドＲＴ−ＰＣＲを実施した。
混入を監視し、且つ混入を防ぐために、陰性対照を含めた。ＴＴＣＦ四量体で標識化された総数３５の単細胞から３２の重鎖セグメントおよび３０の軽鎖セグメントが増幅され、ゲル精製されたＰＣＲ産物由来の直接的な配列は、全体的なＰＣＲ効率８９％に相当した。配列分析は、ＴＴＣＦ四量体＋細胞が１つの特定の遺伝子セグメント優位性ではなく、様々な種類のＶＨＤ−ＪＨ遺伝子セグメントを採用していたことを明らかにした。観察された配列は、それらのクローンが体細胞超変異により多様化した細胞群を代表することを支持した。
抗体産生および精製は、重鎖および軽鎖可変ドメインＤＮＡを、ウシ・プロラクチン・シグナルペプチド配列および全長のＩｇＧ１重鎖もしくはカッパ軽鎖定常ドメインを含有するｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターに個別にクローニングすることを含んだ。抗体は、１００ｍｌのスピナーフラスコ（sinner flask）において８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＣＨＯ−Ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、８％ＣＯ２にて発現させた。トランスフェクションの１日前に、細胞を６×１０５細胞／ｍｌに分けた。トランスフェクションの１日前に、細胞を調整し、６×１０５細胞／ｍｌに分けることが必要であった。２５μｇの重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを、ＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて同時トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を６〜８日間培養した。プロテインＧセファロース・ビーズを用いてタンパク質を得て、抗体を１００ｍＭ グリシン（ｐＨ２．５）を用いて溶出し、Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管を用いてビーズから分離した。精製した抗体は、ＭｉｃｒｏＢｉｏスピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いてリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換した。タンパク質濃度を吸光度２８０ｎｍにて評価した。
飽和結合アッセイのために、非ビオチン化ＭｏｎｏＱ精製したＴＴＣＦをユーロピウムで標識化し、遊離形態のユーロピウムを除去した。９６ウェル平底プレートの１ウェルあたり１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中の抗体２０ｎｇで一晩被覆した。ブロッキングは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびウシ・ガンマグロブリンを補充したアッセイ緩衝液を用いて実施した。ＴＴＣＦ−ユーロピウムをアッセイ緩衝液中に希釈し（１００ｎＭ〜４ｐＭ）、１ウェルあたり２００μｌをトリプリケートで加えた。プレートを２時間３７℃でインキュベートし、２００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。１００μｌのエンハンス溶液（enhancement solution）を各ウェルに加えて、蛍光数をＶｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（６１５ｎｍ）にて測定した。
重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱｕｅｓｔおよびＪＩＯＮＳＯＬＶＥＲソフトウェアを用いて分析した。フローサイトメトリーデータはＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを用いて評価した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを用い、対応のないｔ検定にて行った。抗体のＫＤ値を決定するために、飽和結合データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを用い、非線形回帰分析にてフィッティングした。
実施例３：多重化は記憶Ｂ細胞の同定を向上させた
四量体と単量体ＴＴＣＦを比較した。ＴＴＣＦをＡｌｅｘａ−４８８で蛍光標識し、次いで、それを単量体の形態で用いる又は未標識ストレプトアビジン（上述）を用いて四量体に変えた。富化されたＢ細胞を、次いで、同じ濃度の四量体または単量体ＴＴＣＦ−Ａｌｅｘａ−４８８と共にインキュベートした。対照タンパク質（ＣＤ８０膜近傍ドメイン）を同じ方法で標識化し、四量体としても用いた。
図６Ａおよび６Ｂで示すように、ＴＴＣＦはいくつかの記憶Ｂ細胞を標識化したが、四量体でもって同定された頻度は、３名のドナー由来の細胞を用いて、実質的に幅があった（１．６〜７．３倍）。３名のドナーのうち１名で、ＴＴＣＦ特異記憶Ｂ細胞が四量体により検出できたが、単量体では検出できなかった。
これらの結果は、抗原の四量体は、記憶Ｂ細胞が末梢血中で非常に稀であっても、それらのＢＣＲの抗原特異性に基づいて、該記憶Ｂ細胞の感度の良い検出を可能にすることを実証する。クラススイッチしたＴＴＣＦに特異的な記憶Ｂ細胞は、適切な四量体ＴＴＤＦ抗原により明るく標識化される一方で、対照の四量体で標識化するバックグラウンドは常に低かった。
実施例４：方法／抗体の検証
完全にヒト抗体を、オーバーラップＰＣＲを介してＩｇＧ重鎖およびカッパ鎖の定常領域を単離した可変セグメントに連結することにより、創出した。抗体を、６〜８日間、ＣＨＯ−Ｓ細胞を用いて、一過性に無血清哺乳動物発現系にて発現させた。抗体はプロテインＧおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。
図７Ａ〜７Ｂで示されるように、ＴＴＣＦ特異的な形質芽球から単離した抗体はＴＴＣＦ抗原に対して高い結合親和性、ＫＤ ２．２ｎＭ（ＴＴＣＦ Ａｂ１）および３２３ｐＭ（ＴＴＣＦ Ａｂ２）（図７Ｂ）を示した。記憶Ｂ細胞から単離した抗体も、高い結合親和性を示し、他の抗体（ＴＴＣＦ Ａｂ３、４および５）に関して、ＫＤ ３８２ｐＭ、２２８ｐＭおよび１．４ｎＭを示した（図７Ｂ）。
これらのデータは、本明細書に開示した方法の特異性を支持する。さらに、本明細書中の方法の特異性は、３名の異なるドナー由来の５つの抗ＴＴＣＦ抗体の構築物がすべて高親和性でもってＴＴＣＦに結合したことにより実証される。
本明細書中のデータは、また、宿主からの抗原除去後の長きにわたって、抗原の四量体が記憶Ｂ細胞の感度の良い検出を可能にすることを実証する。
実施例５：抗ＭＩＣＡ抗体を得る
ＭＩＣＡに免疫特異的に結合する抗体を、本明細書の方法を用いて開発した。
簡潔には、ＭＩＣＡ抗原（ＵｎｉＧｅｎｅ Ｈｓ．１３０８３８）を、該抗原のモノビオチン化を可能にするＣ末端ＢｉｒＡタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号：１４８））を付して発現させた。抗原を、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）で標識化したストレプトアビジン（ＳＡ）をモル比４（ＭＩＣＡ）：１（ＳＡ）で用いて四量体化した。末梢血単核球を、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）を用いて形質導入された自己腫瘍細胞によりワクチン接種された進行期のメラノーマ患者から得て（ＰＮＡＳ １０３：９１９０，２００６）、続いて、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（ＹＥＲＶＯＹ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂから入手可能））を用いて処理した。末梢血単核球を迅速に融解し、洗浄して、２％ウシ胎児血清が補充されたリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中で５×１０６に再懸濁し、約０．１μｇ／ｍｌの四量体を用いて３０分間氷上で染色した。抗体を加えて、クラススイッチした記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、およびＩｇＭ−）を同定した。Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび死細胞を標識する排除抗体パネルを含めて、バックグラウンドの四量体染色（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７−ＡＡＤ）を低減させた。ＭＩＣＡ四量体に結合した単一種のＢ細胞を８チューブのＰＣＲストリップにてＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩを用いて選別した。Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）ｍＲＮＡを、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号：ＭＢＣＬ９０３１０）の商用キットを下記する遺伝子特異プライマーと用いて増幅した。
ｍＲＮＡ増幅
ＩｇＧ−Ｔ７：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ
（配列番号：２２）
Ｋａｐｐａ−Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ
（配列番号：２３）
Ｌａｍｂｄａ−Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣ
（配列番号：２４）
ＰＣＲ−１
ＶＨＬ−１：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＣＣＴＧＧＡ（配列番号：２５）
ＶＨＬ−２：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＣＡＣ（配列番号：２６）
ＶＨＬ−３：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ（配列番号：２７）
ＶＨＬ−４：ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ（配列番号：２８）
ＶＨＬ−５：ＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴ（配列番号：２９）
ＶＨＬ−６：ＡＣＡＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴ（配列番号：３０）
ＶｋＬ−１：ＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号：３１）
ＶｋＬ−２：ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＧ（配列番号：３２）
ＶｋＬ−３：ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣ（配列番号：３３）
ＶｋＬ−４：ＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＴ（配列番号：３４）
ＶｌＬ−１：ＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴ（配列番号：３５）
ＶｌＬ−２：ＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡ（配列番号：３６）
ＶｌＬ−３：ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）Ｃ（Ｃ／Ｇ）ＣＴＣＴＣＣ（配列番号：３７）
ＣｇＩＩ：ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＡＴＧ（配列番号：３８）
ＣｋＩＩ：ＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号：３９）
ＣｌＩＩ：ＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＧ（配列番号：４０）
ＰＣＲ−２
ＶＨ−１：ＣＡＧＧＴ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧＣＴＧＧＴ（Ｇ／Ａ）ＣＡＧＴＣ（配列番号：４１）
ＶＨ−２：ＣＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４２）
ＶＨ−３：（Ｇ／Ｃ）ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４３）
ＶＨ−４：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４４）
ＶＨ−５：ＧＡ（Ｇ／Ａ）ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：４５）
ＶＨ−６：ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ（配列番号：４６）
Ｖｋ−１：ＣＧ（Ａ／Ｃ）ＣＡＴＣＣ（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ａ／Ｔ）ＴＧＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号：４７）
Ｖｋ−２：ＣＧＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧ（配列番号：４８）
Ｖｋ−３：ＣＧＡＡＡＴ（Ｔ／Ａ）ＧＴＧ（Ｔ／Ａ）ＴＧＡＣ（Ｇ／Ａ）ＣＡＧＴＣＴ（配列番号：４９）
Ｖｋ−４：ＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号：５０）
Ｖｌ−１：ＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣ（配列番号：５１）
Ｖｌ−２：ＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣ（配列番号：５２）
Ｖｌ−３：ＣＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣ（Ｔ／Ａ）ＣＡＧＣ（配列番号：５３）
ＣｇＩＩＩ：ＧＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡ（配列番号：５３）
ＣｋＩＩＩ：ＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣ（配列番号：５５）
ＣｌＩＩＩ：ＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧ（配列番号：５６）
ＰＣＲ−１およびＰＣＲ−２に用いたプライマーおよびＰＣＲサイクルの条件は、ＷａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒら、（ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００）に基づいた。
上記プライマーセットに十分ではないが潜在的にカバーされる重鎖可変領域配列をカバーする別の重鎖可変領域フォワードプライマーセットを開発した。以下の代替プライマーを作り出した。
ＰＣＲ−１
ＶＨＬ１−５８：ＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡ（配列番号：５７）
ＶＨＬ２−５：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣＴＴＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＣＡＣ（配列番号：５８）
ＶＨＬ３−７：ＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＣ（配列番号：５９）
ＶＨＬ３−１１：ＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＡＴＡＧＡＴＣ（配列番号：６０）
ＶＨＬ３−１３．１：ＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴ（配列番号：６１）
ＶＨＬ３−１３．２：ＡＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＣＧＣＡＧＡ（配列番号：６２）
ＶＨＬ３−２３：ＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡ（配列番号：６３）
ＶＨＬ４−３９：ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ（配列番号：６４）
ＶＨＬ４−６１：ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣ（配列番号：６５）
ＶＨＬ−９：ＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣ（配列番号：６６）
ＰＣＲ−２
ＶＨ１−３／１８：ＣＡＧＧＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧＣＴ（Ｔ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：６７）
ＶＨ１−４５／５８：ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：６８）
ＶＨ２−５：ＣＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣＣＴＴＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴ（配列番号：６９）
ＶＨ３−９／２３／４３：ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＧＣＴＧ（Ｔ／Ｇ）ＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７０）
ＶＨ３−１６：ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７１）
ＶＨ３−４７：ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７２）
Ｖ４−３４：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧ（配列番号：７２）
Ｖ４−３０−２／３９：ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７４）
ＶＨ７−４−１：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣ（配列番号：７５）
簡潔には、ｍＲＮＡ増幅を介して創出された２μｌのｃＤＮＡを、以下のサイクル条件にて、第１ラウンドのＰＣＲの鋳型として使用した：３サイクルのプレ増幅（９４℃／４５秒、４５℃／４５秒、７２℃／１０５秒）；３０サイクルの増幅（９４℃／４５秒、５０℃／４５秒、７２℃／１０５秒）；１０分、７２℃の最後の伸長。
第１ラウンドのＰＣＲ産物３μｌを、ネステッドＰＣＲの第２ラウンドの鋳型として用いた。同一のサイクル条件を、そのＰＣＲの第１ラウンドに用いたが、プレ増幅の３サイクルは省略した。両方のＰＣＲ工程は、クローン化されたＰｆｕポリメラーゼＡＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて分離し、３００〜４００ヌクレオチド・サイズの産物をズィモクリーン（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ）ＤＮＡゲル・リカバリーキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて単離した。配列決定は、第２ラウンドのネステッドＰＣＲに用いたフォワードおよびリバースプライマーを用いて実施した。２ステップ・ネステッドＰＣＲは、重鎖および軽鎖（上記参照）のＢＣＲ可変部分ドメインを増幅する。末梢血単核球は、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）（ＰＮＡＳ１０３：９１９０，２００６）を用いて形質導入された自己腫瘍細胞によりワクチン接種された進行期のメラノーマ患者から得た。抗体は、一過性のＣＨＯ−Ｓ発現システムにて全長ＩｇＧ１抗体として発現された。
ＭＩＣＡに結合する抗ＭＩＣＡ抗体の確認は、２つの独立したビーズ・ベースのアッセイを用いて実施した。第一のアッセイは、様々なＭＩＣＡ対立遺伝子（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ、カタログ番号ＬＳＭＩＣＡ００１）に対して反応性の抗ＭＩＣＡ抗体の検出のために設計された市販の溶液ベースのビーズアッセイキットを用いた。様々な濃度のＭＩＣＡ抗体をビーズと共にインキュベートし、次いで洗浄し、そして、フィコエリトリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。第２の洗浄工程後に、ビーズをＬｕｍｉｎｅｘ機にて分析した。陰性対照は、フィコエリトリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体のみ（抗ＭＩＣＡ抗体は用いない）と共にビーズをインキュベーションすることから成った。陽性対照は、フィコエリトリンに直接コンジュゲートされた市販の抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢモノクローナル抗体（クローン６Ｄ４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ＃３２０９０６）と共にビーズをインキュベーションすることから成った。第２のアッセイは、ストレプトアビジンとコンジュゲートしたポリスチレンビーズを用いて内部的に開発した。ビーズをモノビオチン化したＭＩＣＡタンパク質で被覆して、様々な濃度の、フィコエリトリンに直接コンジュゲートした抗ＭＩＣＡ抗体、抗ＴＴＣＦ抗体（アイソタイプ陰性対照）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（陽性対照）と共にインキュベートした。抗ＭＩＣＡ抗体または抗ＴＴＣＦ抗体と共にインキュベートしたビーズを洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。ビーズに対するバックグラウンド結合を決定するために、比較用のＭＩＣＡタンパク質で被覆していないストレプトアビジンコンジュゲートビーズを用いて、同一のインキュベーションを実施した。ビーズを、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターにて抗体に対する結合に関して分析した。図８および図９Ａ−９Ｏで示されるように、抗ＭＩＣＡ抗体（ＭＩＣＡ−Ａｂ１２およびＭＩＣＡ−Ａｂ２０）はＭＩＣＡと高い親和性でもって結合する。ＭＩＣＡ−Ａｂ２０は、表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１に対応する。
実施例６：抗ＭＩＣＡ抗体
臨床上関連した生物学的特徴を有する追加の抗ＭＩＣＡ抗体を、本明細書に記載の方法を用いて開発した。共通の対立遺伝子に反応性のＭＩＣＡ特異的抗体を、細胞性癌ワクチン（ＧＭ−ＣＳＦ形質導入癌細胞、ＧＶＡＸと称する）およびＴ細胞イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂから入手可能））上の阻害性ＣＴＬＡ−４受容体を遮断する抗体を受けた患者において同定した。次いで、ＭＩＣＡ四量体を用いて、最も高い血清ＭＩＣＡ反応性を示した患者の末梢血単核球からＢ細胞を単離した。実施例５に概括したように、重鎖および軽鎖配列を、これらのＢ細胞から単細胞ＰＣＲにより決定した。この努力は、北アメリカ人集団に共通する対立遺伝子を認識する抗体の同定をもたらした。
ＣＭ２４００２Ａｂ２（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−６）は、ＧＶＡＸ＋イピリムマブ併用療法に有意な臨床反応を実際に示し、且つその血漿がＭＩＣＡと強く反応した急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者から単離した抗体である。ＣＭ２４００２Ａｂ２の軽鎖（図１２および１３）および重鎖（図１０および１１）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に下線を付して示される。強い結合性を有する追加の抗体が、同一の患者から得られ、ＣＭ２４００２Ａｂ４（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−７）とした。ＣＭ２４００２Ａｂ４の軽鎖（図１６および１７）および重鎖（図１５および１４）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に下線を付して示される。
ＣＭ３３３２２Ａｂ１１（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−８）、ＣＭ３３３２２Ａｂ４（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１１）およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１２）は、ＧＶＡＸ＋イピリムマブ併用療法に対して長期間の応答者である転移性黒色腫患者から単離した抗体である。ＣＭ３３３２２Ａｂ１１の軽鎖（図２０および２１）および重鎖（図１８および１９）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に下線を付して示される。ＣＭ３３３２２Ａｂ２９の軽鎖（図２４および２５）および重鎖（図２２および２３）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に下線を付して示される。ＣＭ３３３２２Ａｂ４軽鎖（図３７および３８）および重鎖（図３５および３６）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に下線を付して示される。ＣＭ３３３２２Ａｂ２８の軽鎖（図５２および５３）および重鎖（図５０および５１）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に下線を付して示される。この患者の長期間に亘る臨床反応のために、これらの抗体は特に興味深い。
興味対象の抗体の最初の同定、クローニング、発現の後、種々のＭＩＣＡ対立遺伝子に関するこれらの抗体の特異性を、サイトメトリック・ビーズアッセイ（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｓｓａｙ）を用いて決定した。簡潔には、単一のＢｉｒＡビオチン化部位を有する、可溶性の組換えＭＩＣＡ対立遺伝子００２、００８、００９およびＭＩＣＢを発現させ、精製し、ストレプトアビジンビーズにて捕捉した。示した抗ＭＩＣＡ抗体を、次いで、組換えＭＩＣＡで被覆したビーズと共に種々の濃度で１時間インキュベートし、次いで、洗浄し、ＦＩＴＣ標識化抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。第２の洗浄工程に続いて、ビーズに結合したＦＩＴＣ蛍光の定量を、フローサイトメトリーにより行った。ＭＩＣＡ対立遺伝子００２、００８、００９ならびに関連するＭＩＣＢタンパク質を、北アメリカ人集団におけるそれらの有病率に基づいて選択した（図２６Ａ−Ｇ）。重要なことに、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９は、すべてのＭＩＣＡ対立遺伝子およびＭＩＣＢに強く結合した。他の２つの抗体は、対立遺伝子のサブセットに結合した：ＣＭ２４００２Ａｂ４はＭＩＣＡ＊００９およびＭＩＣＢに強く結合し、およびＣＭ３３３２２Ａｂ１１はＭＩＣＡ＊００２、ＭＩＣＡ＊００８およびＭＩＣＢに強く結合した（図２６Ａ−Ｇ）。特異性は、同一の技術を用いて創出した陰性対照ヒト抗体（破傷風トキソイドＣ末端断片、ＴＴＣＦに特異的）の使用、およびＭＩＣＡに対する陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製の、ＭＩＣＡに対する商用のネズミ抗体）の使用により裏付けられた。これらの試験は、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９を臨床応用に潜在力を有する候補物質と特定した。
ＣＭ３３３２２Ａｂ２８の結合性を、３つの共通する対立遺伝子（ＭＩＣＡ＊００２、ＭＩＣＡ＊００８、ＭＩＣＡ＊００９）によりコードされた組換えＭＩＣＡに対して、２点の抗体濃度（５００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）にてＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ読出し）により試験した。結果は、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８は３つの対立遺伝子の全てに結合することを実証し、これは、この抗体もまた臨床応用の候補物質であることを示す。
実施例７：抗ＭＩＣＡ抗体の自己腫瘍細胞に対する結合
単離した抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２の自己腫瘍細胞に結合する能力を、フローサイトメトリーにより試験した（図２７）。骨髄を患者ＣＭ２４００２から採取し、ＣＭ２４００２Ａｂ２による腫瘍細胞に対する結合性を試験した。腫瘍細胞を、次いで、前記骨髄試料からＣＤ３３＋ ＣＤ３４＋細胞として同定した。その腫瘍細胞を、次いで、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２、陽性対照の商用ＭＩＣＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または陰性対照の抗体（ＴＴＣＦ特異的）の１０μｇ／ｍｌを用いて染色した。図２７で示されるように、ＣＭ２４００２Ａｂ２は、これらの細胞に強く結合した。ＣＭ２４００２Ａｂ２は、非腫瘍細胞（ＣＤ１６＋およびＣＤ３＋細胞）に対する結合は示さず、ＣＤ１４＋細胞に対してはバックグラウンドの結合性を示すのみで、これは抗腫瘍特異性を実証するものである（データは示さず）。
実施例８：ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の抗ＭＩＣＡ抗体阻害
単離した抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２がその同起源受容体ＮＫＧ２Ｄを可溶性ＭＩＣＡ媒介性ダウンレギュレートする能力を試験した。患者ＣＭ２４００２由来の血清を１：１０希釈で用いて、ヒトＮＫ細胞と共に４８時間インキュベートした。ＣＭ２４００２Ａｂ２（濃度１０μｇ／ｍｌ）、陽性対照の商用ＭＩＣＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ)または陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的)をこれらの培養物へ添加した。ＮＫＧ２Ｄ発現は、フローサイトメトリーにより４８時間の時点で評価した（図２８）。患者ＣＭ２４００２由来の血清は、ＮＫＧ２Ｄ発現を強くダウンレグレートした（かくして、この受容体を機能しなくする）。ＣＭ２４００２Ａｂ２およびこの陽性対照ＭＩＣＡ抗体は、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄの表面発現を部分的に回復させた。特異性を実証するために、我々は、細胞を患者の血清に代えて２ｎｇ／ｍｌの組換えＭＩＣＡと共にインキュベートすることにより、上記試験を繰り返した（図２９）。ＣＭ２４００２Ａｂ２は、ＭＩＣＡ媒介性ＮＫＧ２Ｄ発現のダウンレギュレーションを完全に抑制した一方で、陰性対照の抗体（ＴＴＣＦに特異的）は効果を示さなかった（図２９）。これらのデータは、ヒトＭＩＣＡ抗体がヒトＮＫ細胞上の重要なＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害を抑制し得ることを実証する。
単離した抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫＧ２Ｄの可溶性ＭＩＣＡ媒介性ダウンレギュレーションを抑制する能力をさらに試験するために、上記試験を、複数の血清試料および追加の単離した抗ＭＩＣＡ抗体を用いて繰り返した。図２９に示すように、進行性のメラノーマ患者由来の２０の血清試料のうち１５の試料が、有意なレベルの脱落したＭＩＣＡを含んだ。ＰＢＭＣを、対照の血清または可溶性ＭＩＣＡ単独を含有するもしくは表示した抗体１００μｇ／ｍｌの存在下でＭＩＣＡを含有する選択したメラノーマ患者試料と共に４８時間インキュベートした。４８時間の時点で、ＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋）上のＮＫＧ２Ｄ発現を、フローサイトメトリーにより決定した（図４０；データはＮＫＧ２Ｄ陽性のＮＫ細胞に関する％として表す）。これらのデータは、ヒトＭＩＣＡ抗体が、血清試料中でＮＫＧ２Ｄのダウンレギュレーションを阻止し、試験した血清試料のすべてでＮＫＧ２Ｄ媒介性細胞障害を回復したこと、およびヒトＮＫ細胞上の重要なＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害を抑制できることをさらに実証する。
単離した抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫＧ２Ｄの可溶性ＭＩＣＡ媒介性ダウンレギュレーションを抑制する能力をさらに試験するために、上記試験を、追加の単離した抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１またはＣＭ３３３２２Ａｂ２８）を用いて繰り返した。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。図５９で示されるように、いくつかの抗ＭＩＣＡは、ｒＭＩＣＡ誘導性のＮＫＧ２Ｄダウンレギュレーションを阻止する。
単離した抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫＧ２Ｄのメラノーマ血清誘導型ダウンレギュレーションを抑制する能力を試験するために、上記試験を、複数の血清使用および追加の単離した抗ＭＩＣＡ抗体を用いて繰り返した。全ＰＢＭＣを、対照血清またはメラノーマ血清単独もしくは表示した抗体を含むメラノーマ血清と共に４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。図５７で示されるように、いくつかの抗ＭＩＣＡ抗体は、メラノーマ血清誘導型ＮＫＧ２Ｄのダウンレギュレーションを阻止する。
実施例９：抗ＭＩＣＡ抗体の細胞性細胞障害
ＣＭ２４００２Ａｂ２が細胞媒介性細胞障害を可能にするかどうかを決定するために、ヒトＮＫ細胞（エフェクター細胞）を４８時間、ＣＭ２４００２Ａｂ２、陰性対照の抗体（ＴＴＣＦ特異的）または陽性対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（すべて１０μｇ／ｍｌ）の存在下、組換えＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。４８時間後に、細胞を洗浄し、Ｋ５６２腫瘍細胞と２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：標的の比で４時間インキュベートした。ＮＫ細胞による標的細胞の特異的な溶解を、Ｋ５６２腫瘍細胞からのサイトゾルタンパク質（ＬＤＨ）の放出により決定した。ＭＩＣＡ抗体が存在しない場合、ＮＫ細胞によるＫ５６２腫瘍細胞の殺傷はなかった。しかしながら、ＣＭ２４００２Ａｂ２は、陽性対照のマウスＭＩＣＡ抗体よりも、すべてのエフェクター：対照の比で、Ｋ５６２腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介性の溶解を大幅に増強した（図３０）。Ｋ５６２腫瘍細胞の殺傷が本当にＮＫＧ２Ｄ経路により（Ｆｃ受容体よりも）媒介されることがさらに実証された。上記試験を、さらに２つの実験群（ＮＫＧ２Ｄ用の遮断抗体およびヒトＦｃブロック用の遮断抗体）を用いて繰り返した。加えて、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９も試験した。データは、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９の添加が、ＮＫ細胞媒介性細胞障害を増強したことを示す。ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体を添加した場合、Ｋ５６２細胞の殺傷は生じなかったが、一方で、Ｆｃ遮断試薬はほとんど効果がなかった（図３１）。これらのデータは、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９が、ＮＫＧ２Ｄ経路の抗腫瘍機能を回復することを示す。
追加の単離した抗ＭＩＣＡが細胞媒介性細胞障害を可能にするか否かを決定するために、全ＰＢＭＣを、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８、陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）または陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下、組換えＭＩＣＡ（ｒＭＩＣＡ）と共に４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を洗浄し、５１Ｃｒ標識化Ｋ５６２標的細胞と共に２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：標的の比率で４時間インキュベートした。特異的な溶解を、４時間後に５１Ｃｒの放出により評価した。図５８で実証されるように、ＮＫ細胞の殺傷活性は、組換えｓＭＩＣＡの存在下、抗ＭＩＣＡ抗体により増強される。単離した抗ＭＩＣＡ抗体が細胞媒介性細胞障害を可能にするか否かをさらに確認するために、ヒトＮＫ細胞（エフェクター細胞）をメラノーマ患者血清と共に４８時間インキュベートした。ＰＢＭＣを、対照血清または可溶性ＭＩＣＡ単独を含有するメラノーマ患者試料もしくは表示した抗体１００μｇ／ｍｌの存在下で可溶性ＭＩＣＡを含有するメラノーマ患者試料とともに４８時間インキュベートした（陰性アイソタイプ対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）または陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））。４８時間の時点で、細胞を洗浄し、２０：１のエフェクター対標的の比率で５１Ｃｒ標識化Ｋ５６２標的細胞と共にインキュベートした。特異的な溶解を、４時間後にシンチレーション計数により評価した（図４１〜４３および６２）。これらのデータは、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９、ＣＭ３３３２２Ａｂ４およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８が、ＮＫＧ２Ｄ経路の抗腫瘍機能を回復するさらに示す。
全ＰＢＭＣを、対照血清またはメラノーマ血清単独もしくはＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８の存在下のメラノーマ血清と共に４８時間インキュベートした（図５６）。４８時間後に、細胞を洗浄し、５１Ｃｒ標識化Ｋ５６２腫瘍細胞と共に表示のエフェクターの標的に対する比率でインキュベートした。特異的な溶解を、４時間後に５１Ｃｒの放出により評価した。図５６で実証されるように、ＮＫ細胞殺傷活性は、メラノーマ血清の存在下、抗ＭＩＣＡ抗体により増強される。
さらなる実施例において、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８は、Ｋ５６２腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を大幅に増強し、且つすべてのエフェクター：標的の比率で陽性対照のマウスＭＩＣＡ抗体よりもより効果的であった（図５４）。
さらなる実験において、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９は、ｓＭＩＣＡ＋患者の血清を用いた４８時間のインキュベーションの間に、ＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のダウンレギュレーションを抑制した（図６２Ａ〜Ｂ）。これらのＭＩＣＡ抗体はまた、ｓＭＩＣＡによるＣＤ８ Ｔ細胞の細胞障害の阻止を抑制することを示した（ＮＹ−ＥＳＯに特異的なクローン、５１Ｃｒ標識化Ｍｅｌ３７５細胞、２０：１ Ｅ：Ｔ比率）（図６２Ｃ）。
実施例１０：アルファ３ＭＩＣＡドメインに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合性
ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＭＩＣＡのトップのアルファ１およびアルファ２ドメインに結合するため、同一部位に結合する抗体はＮＫＧ２Ｄ受容体と競合することができ、それによって、ＮＫ細胞による腫瘍細胞の殺傷を阻止できる。ＮＫＧ２Ｄ受容体の結合を阻止できないために、アルファ３ドメインに結合する抗体が特に興味深い。同時に、そのような抗体は、腫瘍細胞表面からのＭＩＣＡのタンパク質分解的切断に干渉し得る。ＭＩＣＡα３ドメインに対する抗ＭＩＣＡ抗体の能力は、記述のサイトメトリック・ビーズアッセイを用いて評価した。ビオチン化組換えタンパク質を、ストレプトアビジンビーズ上に捕捉した。ビーズを、次いで、１０μｇ／ｍｌの抗体ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ２４００２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９、陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）または陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートし、続いて、ＦＩＴＣ標識化抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによりビーズに結合したＦＩＴＣ蛍光の定量を行った（図３２）。図３２に示されるように、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９は、ＭＩＣＡアルファ３ドメインに結合し、それ故に、治療応用に非常に興味深い。
他の試験において、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ２４００２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８は、ＥＬＩＳＡにより測定されたように、組換えＭＩＣＡα３ドメインに結合した（図６３ａ）。ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８は、４８時間のインキュベーションの間に、ＲＰＭＩ−８２２６細胞上のＭＩＣＡ表面レベルを増大させたことをさらに示す。
実施例１１：抗ＭＩＣＡ抗体の腫瘍細胞に対する結合性
広範囲の癌を標的とし、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９を用いてそれらの潜在的能力を評価した。多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６およびＸｇ−１）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ３）、急性骨髄性白血病（Ｕ９３７）、メラノーマ（Ｋ０２８）、肺癌（１７９２および８２７）、および乳癌（ＭＣＦ７）細胞を、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９による標識化に関して試験した。腫瘍細胞を、１％ＢＳＡが補充されたＰＢＳ中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９、並びに陽性対照および陰性対照（それぞれマウスＭＩＣＡ抗体およびＴＴＣＦ特異抗体）（直接コンジュゲートした）濃度１０μｇ／ｍｌを、４℃で１時間用いて染色した（図３３）。ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９は両方とも試験した腫瘍細胞タイプのそれぞれに結合し、試験した細胞株の大部分で商用の陽性対照よりもより強く標識化する。Ｍｅｌ５２６、Ｋ０２９、ＲＰＭＩ−８２２６およびＭＣＦ−７腫瘍細胞系に対して試験した場合、ＣＭ３３３２Ａｂ２８はまた、腫瘍細胞上でＭＩＣＡを検出する能力を実証した。
実施例１２：抗ＭＩＣＡ抗体のＭＩＣＡ対立遺伝子特異性
ＣＭ３３３２２Ａｂ２９の対立遺伝子特異性を、商業的に利用可能なＬｕｍｉｎｅｘアッセイを用いて評価した。商用の試験キットは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに直接コンジュゲートされた組換えＭＩＣＡ対立遺伝子（ＭＩＣＡ＊００１、＊００２、＊００７、＊０１２、＊０１７、＊０１８、＊０２７、＊００４、＊００９、および＊０１５）を含み、その各々は単一試料中で結合を評価することを可能にする固有の蛍光特性を有する。表示したＭＩＣＡ対立遺伝子で被覆したＬｕｍｉｎｅｘビーズを、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ陽性対照および陰性対照（ＴＴＣＦ）と共に、１０μｇ／ｍｌにて１時間インキュベートし、続いて、ＰＥコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。表示した抗体との６０分間のインキュベーションに続き、抗ヒトＰＥコンジュ―ゲート二次抗体とのインキュベーション後に、蛍光を、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００機器を用いて測定した（図３４）。ＣＭ３３３２２Ａｂ２９は、商用のアッセイに存在する対立遺伝子の全てに結合することができ、これは、ＭＩＣＡの遺伝子型に関係なく患者に使用できることを示唆する。
これらのデータは、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９の高い生物活性および腫瘍細胞に関するＮＫ細胞媒介性溶解を回復させるそれらの能力を実証する。これらのデータは、免疫療法に応答した癌患者が、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を回復するＭＩＣＡ抗体を産生したことを実証する。併せれば、これらの結果は、癌患者において、免疫抑制に打ち勝ち、腫瘍の崩壊を促進する抗ＭＩＣＡ抗体の治療上の潜在力を強調する。
実施例１３：インビトロおよびインビボでの抗ＭＩＣＡ抗体の生物活性
腫瘍成長に対する抗ＭＩＣＡ抗体の直接的な影響を試験するために、インビトロおよびインビボでの抗ＭＩＣＡ抗体の生物活性を、ネズミＢ１６を用いて評価した。この試験のために、Ｂ１６ネズミメラノーマ細胞を形質導入し、ヒトＭＩＣＡを発現させた。フローサイトメトリーを用いて、細胞Ｂ１６表面のＭＩＣＡ発現を検出した（図４４）。
図４５は、Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍が、脾臓ＮＫ細胞および腫瘍−浸潤性ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ発現をダウンレギュレートすることを実証する一連のグラフである。非腫瘍マウスの脾臓または腫瘍を有する動物の脾臓および腫瘍から単離したＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ３３５＋）におけるＮＫＧ２Ｄ発現はフローサイトメトリーにより測定した。
図４６は、抗ＭＩＣＡ抗体処置がＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスにおける血清ＭＩＣＡレベルを低下させることを示す。Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するＢ６マウスを、１週間に３回、投薬あたり１００μｇまたは２００μｇのＣＭ３３３２２Ａｂ２９を尾静脈注射した。最初の処置後１週間目に、採血し、血清ＭＩＣＡをＥＬＩＳＡにより測定した。図４７は、抗ＭＩＣＡ抗体の投与がサンドウィッチＥＬＩＳＡによるＭＩＣＡ検出と干渉しないことを示す。組換えＭＩＣＡを１００倍超の抗体と共に回転させながら１８時間インキュベートした。ＭＩＣＡ濃度はサンドウィッチＥＬＩＳＡにより測定した。
腫瘍成長に対する抗ＭＩＣＡ抗体の影響を直接試験するために、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２Ａｂ２９をＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍保有マウスに投与した。腫瘍が直径５ｍｍに達したら開始する投薬あたり２００μｇのマウスＩｇＧ２ａ／κアイソタイプ対照または抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２Ａｂ２９を静脈注射にて用いて、マウスを処置した。１週間あたり３回投薬し、腫瘍容積を毎日記録した。図４８に示されるように、Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍保有マウスでの抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２ＡＢ２９処置は、腫瘍成長を停止させるこれらのデータは、インビトロおよびインビボ両方での、メラノーマ細胞の成長阻止を示し、そして、抗ＭＩＣＡ抗体処置が、宿主の抗腫瘍応答および腫瘍細胞の直接的な殺傷の結果として、潜在力を有する治療上の戦略であり得ることを示す。
実施例１４：抗ＭＩＣＡ抗体は、腫瘍細胞からのＭＩＣＡ脱落を低下させる
腫瘍細胞からのＭＩＣＡの脱落を低減するＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９の潜在力を試験した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体（ＴＴＣＦ−Ｓ１Ｃ１）、ＣＭ３３３２２Ａｂ２９、またはＣＭ２４００２Ａｂ２の存在下で培養した。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡ表面の発現をフローサイトメトリーにより測定した。図４９で実証されるように、ＣＭ２４００２Ａｂ２およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９は、ＭＩＣＡ脱落ＲＰＭＩ−８２２６細胞を低減させた。
さらなる実施例において、腫瘍細胞からのＭＩＣＡの脱落を低減するＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８の潜在力を試験した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、アイソタイプ対照抗体（ＴＴＣＦ−Ｓ１Ｃ１）およびＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１またはＣＭ３３３２２Ａｂ２８の存在下で培養した。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡ表面の発現をフローサイトメトリーにより測定した。図５５で実証されるように、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ４、ＣＭ３３３２２Ａｂ１１およびＣＭ３３３２２Ａｂ２８は、ＭＩＣＡ脱落ＲＰＭＩ−８２２６細胞を低減させた。
さらなる実施例において、ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９は、腫瘍細胞上清中にｓＭＩＣＡが存在する状況下、ＥＬＩＳＡにより測定されたように、４８時間のインキュベーションの間に、Ａ３７５によるＭＩＣＡの脱落を阻止した（図６３ａ）。
実施例１５：ヒト抗ＭＩＣＡ抗体の治療活性
ヒトＵ９３７腫瘍細胞を移植されたＳＣＩＤマウスをＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８およびＣＭ３３３２２Ａｂ２９（１週あたり３×１００μｇＡｂ）を用いて処置した。処置の１週間後に、３種類の抗体のすべてが、ＥＬＩＳＡにより測定されたように腫瘍ホモジネートにおけるｓＭＩＣＡを有意に低減させ（腫瘍容積に対して規格化した）、及び、フローサイトメーターにより測定されたように腫瘍ホモジネートにおける腫瘍細胞表面上でのＭＩＣＡ発現を増加させた（図６４ａ〜ｂ）。
処置マウスにおけるＮＫ細胞機能もまた評価した。ＣＭ２４００２Ａｂ２、ＣＭ３３３２２Ａｂ２８またはＣＭ３３３２２Ａｂ２９による処置は、腫瘍−浸潤性のＣＤ４５＋ ＮＫ１．１＋ ＮＫ細胞によるＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４６の表面レベルを増加させ、腫瘍におけるＮＫ細胞の蓄積を誘導した（１×１０５ ＣＤ４５＋細胞に対して規格化した）。処置は、腫瘍浸潤性のＣＤ４５＋ ＮＫ１．１＋ ＮＫ細胞によるＩＦＮγおよびパーフォリン発現も増大させた。加えて、３つのヒトＭＩＣＡ抗体のすべてが、脾細胞による５１Ｃｒ標識化ＹＡＣ−１細胞のエクスビボ殺傷を増強した（図６５ａ〜ｆ）。
実施例１６：抗ＭＩＣＡ抗体のエピトープマッピング
ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２９、ＣＭ３３３２２ １１、ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４およびＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８のエピトープ配列を決定するための試験を行った。簡潔には、ＭＩＣＡ＊００９細胞外ドメインの全長に及ぶ一連の重複ペプチドを含むペプチドアレイにより、エピトープマッピングを行った。前記アレイにおける各ペプチドは、ＭＩＣＡ＊００９参照配列（配列番号：１８５）由来の２０アミノ酸直鎖配列長であり、各々の次の配列は前の配列と１０アミノ酸重複している（２０ａａペプチドは１０ａａのオフセットを有する）。これらのペプチドを、フレキシブルリンカーを使用してスライドガラスに結合させた。抗体を前記スライドと共にインキュベートし、ペプチド断片に結合した抗体をＣｙ５コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。アレイスポットに対する結合は、ＧｅｎｅＰｉｘマイクロアレイ・スキャナーにより評価した。結果は、抗体ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２９、ＣＭ３３３２２ １１、ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４およびＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８が、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢのアルファ３領域に結合することを示す。
結果は、３つの抗体すべてがヒトＭＩＣＡαＦ３領域内の、明らかに異なる連続するアミノ酸配列を含む、エピトープと相互作用することを示す。ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２９、ＣＭ３３３２２ １１、ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４およびＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８の、ＭＩＣＡ＊００９内のエピトープのアミノ酸配列を図６０Ａ〜６０Ｄに示す。ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２９、ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４およびＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８のエピトープの、ＭＩＣＡの三次元構造内の配置も図６１に示す。
結果は、抗体ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２９により認識されるエピトープは、連続アミノ酸配列ＧＤＶＬＰＤＧＮＧＴＹＱＴＷＶＡＴＲＩＣ（配列番号：１８６）を含むことを示し（図６０Ａ）、その配列はヒトＭＩＣＡのアミノ酸残基２２９〜２４８（配列番号：１８５）に対応する。抗体ＣＭ３３３２２ｍＡｂ１１により認識されるエピトープは、連続するアミノ酸配列：ＮＶＥＴＥＥＷＴＰ（配列番号：１８７）を含み（図６０Ｂ）、その配列はヒトＭＩＣＡのアミノ酸残基１１９〜１２８（配列番号：１８５）に対応する。抗体ＣＭ３３３２２ｍＡｂ４により認識されるエピトープは、連続するアミノ酸残基：ＴＶＰＰＭＶＮＶＴＲ（配列番号：１８８）を含み（図６０Ｃ）、その配列はヒトＭＩＣＡのアミノ酸残基１７９〜１８８（配列番号：１８５）に対応する。抗体ＣＭ３３３２２ｍＡｂ２８により認識されるエピトープは、連続するアミノ酸配列ＴＣＲＡＳＳＦＹＰＲ（配列番号：１８９）を含み、その配列はヒトＭＩＣＡのアミノ酸残基１９９〜２０８（配列番号：１８５）に対応する。
実施形態
１．ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）と免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号：１７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および配列番号：１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、組成物。
２．前記ペプチドが配列番号：１７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および配列番号：１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む、実施形態１の組成物。
３．前記ペプチドが配列番号：１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、または配列番号：１８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、もしくはその両方を含む、実施形態１または２の組成物。
４．前記ペプチドが配列番号：１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ２、または配列番号：１８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、もしくはその両方を含む、実施形態３の組成物。
５．前記ペプチドが配列番号：１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、または配列番号：１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、もしくはその両方を含む、実施形態１〜４のいずれかの組成物。
６．前記ペプチドが配列番号：１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ１、または配列番号：１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、もしくはその両方を含む、実施形態５の組成物。
７．ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）と免疫特異的に結合するペプチドを含むキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：ＣＡＲ）であって、前記ペプチドが配列番号：１７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および配列番号：１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、キメラ抗原受容体。
８．前記ペプチドが配列番号：１７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および配列番号：１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む、実施形態７のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
９．前記ペプチドが配列番号：１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、または配列番号：１８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、もしくはその両方を含む、実施形態７または８のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１０．前記ペプチドが配列番号：１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ２、または配列番号：１８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、もしくはその両方を含む、実施形態９のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１１．前記ペプチドが配列番号：１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、または配列番号：１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、もしくはその両方を含む、実施形態８〜１０のいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１２．前記ペプチドが配列番号：１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ１、または配列番号：１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、もしくはその両方を含む、実施形態１１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１３．前記ペプチドが、配列番号：１６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖、またはそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有し、かつ配列番号：１６８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域を含むそのバリアント；および配列番号：１７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ鎖、またはそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有し、かつ配列番号：１７０のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４を含むそのバリアント、を含む抗体または抗体断片である、実施形態７〜１２のいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１４．前記ペプチドが、配列番号：１６８を含むＶＨ鎖および配列番号：１７０を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片である、実施形態１３のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１５．細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞受容体シグナリングドメインをさらに含む、実施形態７〜１４のいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１６．前記ペプチドがＣＤ１３７（４−ＩＢＢ）シグナリングドメインおよびＣＤ３−ζ鎖を含む、実施形態７〜１５のいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１７．実施形態７〜１６のいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子。
１８．実施形態１８の核酸分子を保有するヒトＴ細胞。
１９．対象における癌を処置する方法であって、実施形態１８を前記対象のＴ細胞に投与することを含み、前記Ｔ細胞が前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された自己Ｔ細胞である、方法。
２０．ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合するペプチドまたはそのエピトープをコードする核酸を含む組成物であって、前記核酸が配列番号：１６７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、組成物。
２１．ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合するペプチドまたはそのエピトープをコードする核酸を含む組成物であって、前記核酸が配列番号：１６９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える配列同一性、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、組成物。
２２．配列番号：１７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および配列番号：１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含むペプチドをコードするベクター。
２３．前記ペプチドが、配列番号：１７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および配列番号：１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む、実施形態２２のベクター。
２４．前記ペプチドが、配列番号：１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）２もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、または配列番号：１８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、実施形態２２または２３のベクター。
２５．前記ペプチドが、配列番号：１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ２、または配列番号：１８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、もしくはその両方を含む、実施形態２４のベクター。
２６．前記ペプチドが、配列番号：１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、または配列番号：１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、もしくはその両方を含む、実施形態２２〜２５のいずれかのベクター。
２７．前記ペプチドが、配列番号：１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ１、または配列番号：１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、もしくはその両方を含む、実施形態２６のベクター。
２８．前記ペプチドが配列番号：１６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖、またはそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有し、かつ配列番号：１６８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域を含むそのバリアント；および配列番号：１７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ鎖、またはそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有し、かつ配列番号：１７０のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４を含むそのバリアント、を含む抗体または抗体断片である、実施形態２２〜２７のいずれかのベクター。
２９．前記ペプチドが、配列番号：１６８を含むＶＨ鎖および配列番号：１７０を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片である、実施形態２８のベクター。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と組合せて記載されるが、前述の記載内容は例示を目的とするものであり、添付する特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。他の態様、利点および改変は、以下の請求項の範囲内にある。

Claims (30)

  1. ＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）と免疫特異的に結合する抗体または抗体断片であって、配列番号：１６８の配列の重鎖可変領域（ＶＨ）に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨ、またはＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、抗体もしくは抗体断片。
  2. 配列番号：１７０の配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）に示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬ、またはＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に５個以下の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項１に記載の抗体もしくは抗体断片。
  3. 配列番号：１６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域、またはそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有し、配列番号：１６８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域を含むそのバリアント；および、
    配列番号：１７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域、またはそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内に５個以下の保存的アミノ酸置換を有し、配列番号：１７０のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４を含むそのバリアントを含む、
    請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
  4. 配列番号：１６８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  5. 配列番号：１７０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  6. 前記ＶＨ領域が、配列番号：１７２を含むＶＨＣＤＲ１；
    配列番号：１７４を含むＶＨＣＤＲ２；および、
    配列番号：１７６を含むＶＨＣＤＲ３を含む、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  7. 配列番号：１７９を含むＶＬＣＤＲ１、
    配列番号：１８１を含むＶＬＣＤＲ２、および
    配列番号：１８３を含むＶＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  8. 前記ＶＨ領域が配列番号：１６８に示されるアミノ酸配列を含む、またはＣＤＲ範囲外の残基に５個以下の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片、
  9. 配列番号：１７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域、またはＣＤＲ範囲外の残基に５個以下の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  10. 配列番号：１８５に示されるアミノ酸配列を含むヒトＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）のアミノ酸１９９〜２０８に対応する、配列ＴＣＲＡＳＳＦＹＰＲ（配列番号：１８９）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはそれを超えるアミンの酸に結合する、抗体または抗体断片。
  11. アミノ酸配列ＴＣＲＡＳＳＦＹＰＲ（配列番号：１８９）を含むヒトＭＨＣクラスＩポリペプチド・リレイティッド・シークエンスＡ（ＭＩＣＡ）のエピトープに結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  12. （ａ）ＭＩＣＡα３ドメインに結合する；
    （ｂ）ｓＭＩＣＡレベルを低下させる；
    （ｃ）腫瘍細胞からＭＩＣＡの脱落を阻害する；
    （ｄ）ＮＫ細胞上のＮＫＧ２ＤレセプターのｓＭＩＣＡ媒介性ダウンレギュレーションを阻害する；
    （ｅ）腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介性細胞溶解を増加させる；または
    （ｆ）（ａ）〜（ｅ）の１つまたは複数の組合せの、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  13. 配列番号：１６８のアミノ酸配列を含むＶＨ；および、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  14. ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を含む医薬組成物。
  16. 抗癌治療をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. ヒドロキサム酸、ボリノスタット、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＩＴＦ２３５７イタルファルマコＳｐＡ、環状テトラペプチド、デプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ２２８）、ベンズアミド；エンチノスタット（ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、酪酸フェニル、ＡＮ−９、ピバネックス（ｐｉｖａｎｅｘ）、ＣＨＲ−３９９６およびＣＨＲ−２８４５からなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ）をさらに含む、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  18. ボルテゾミブ、ＮＰＩ−００５２、カルフィルゾミブ（ＰＲ−１７１）、ＣＥＰ１８７７０およびＭＬＮ９７０８からなる群より選択されるプロテアソーム阻害剤をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 抗ＣＴＬＡ−４抗体またはペプチド、抗ＰＤ−１抗体またはペプチド、抗ＰＤＬ−１抗体またはペプチド、抗ＯＸ４０抗体またはペプチド、抗ＧＩＴＲ抗体またはペプチド、抗ＬＡＧ−３抗体またはペプチド、および抗ＴＩＭ−３抗体またはペプチドからなる群より選択される１つまたは複数の付加的な試薬をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 化学療法、放射線療法、サイトカイン、ケモカインおよび他の生物学的シグナル伝達分子、腫瘍特異的ワクチン、細胞癌ワクチン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入癌細胞）、腫瘍特異的モノクローナル抗体、自家および他家幹細胞レスキュー（例えば、移植片対腫瘍効果を増大させるためのもの）、分子標的療法、抗脈管形成療法および遺伝子治療からなる群より選択される癌の処置に使用される１つまたは複数の付加的な試薬と共に投与するために処方された、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片のＶＨ領域をコードする単離された核酸。
  22. 配列番号：１６７と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２１の単離された核酸。
  23. 配列番号：１６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  24. 請求項２〜１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片のＶＬ領域をコードする単離された核酸。
  25. 配列番号：１６９と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２４の単離された核酸。
  26. 配列番号：１７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  27. 請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  28. プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項２７に記載のベクター。
  29. 前記ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウィルスからなる群より選択される、請求項２８に記載のベクター。
  30. 対象における癌の処置に使用するための、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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