JP2017500880A5

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Publication number: JP2017500880A5
Application number: JP2016544159A
Authority: JP
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2017-12-28
Anticipated expiration: 2034-12-05

Claims

グラム陽性菌細胞からの目的のタンパク質の発現を増加させる方法であって、
ａ）目的のタンパク質を産生可能な改変グラム陽性菌細胞を得る工程であって、前記改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現を減少させ、及び／又は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、工程と、
ｂ）前記改変グラム陽性菌細胞によって前記目的のタンパク質が発現するような条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を培養する工程であって、前記改変グラム陽性菌細胞における前記目的のタンパク質の発現は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞における前記目的のタンパク質の発現と比較して増加する、工程と、を含む、方法。
前記改変グラム陽性菌細胞は、バチルス種株である、請求項１に記載の方法。
前記改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している、請求項１に記載の方法。
前記遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写のレベルの減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
前記変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こり、ここで、前記ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり得る、請求項４に記載の方法。
前記遺伝子改変は、サイレント変異である、請求項５に記載の方法。
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる、請求項５に記載の方法。
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である、請求項７記載の方法。
前記目的のタンパク質は、酵素である、請求項１に記載の方法。
前記目的のタンパク質は、プロテアーゼである、請求項９に記載の方法。
前記目的のタンパク質を回収する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
改変グラム陽性菌細胞であって、前記改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、改変グラム陽性菌細胞。
前記改変グラム陽性菌細胞は、バチルス種株である、請求項１２に記載の改変細胞。
前記改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している、請求項１２に記載の改変細胞。
前記改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している、請求項１２に記載の改変細胞。
前記遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写のレベルの減少をもたらす、請求項１２に記載の改変細胞。
前記変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる、請求項１２に記載の改変細胞。
前記ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である、請求項１７に記載の改変細胞。
前記遺伝子改変は、サイレント変異である、請求項１８に記載の改変細胞。
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる、請求項１８に記載の改変細胞。
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である、請求項２０に記載の改変細胞。
前記改変細胞は、目的のタンパク質を発現する、請求項１２に記載の改変細胞。
前記目的のタンパク質は、酵素である、請求項２２に記載の改変細胞。
前記目的のタンパク質は、プロテアーゼである、請求項２２に記載の改変細胞。
ｐｄｈＤ遺伝子由来の変異体配列を含むポリヌクレオチドであって、
前記変異体配列は、
少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、
配列番号１の全て又は一部と少なくとも６０％同一であり、
ｐｄｈＤ遺伝子内のヌクレオチド位置での少なくとも１つの変異を含み、ここで、該変異は、前記少なくとも１つの変異がグラム陽性菌細胞の内因性ｐｄｈＤ遺伝子内に存在する場合、ｐｄｈＡ遺伝子及び／又はｐｄｈＢ遺伝子の発現の減少をもたらす、
ポリヌクレオチド。
前記少なくとも１つの変異は、サイレント変異である、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
前記変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
請求項２５に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
前記ベクターは、グラム陽性菌細胞への形質転換の際、相同組換えによって、前記ポリヌクレオチド配列における前記少なくとも１つの変異を前記グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロンにおける対応する位置に導入するように設計された標的化ベクターである、請求項２９に記載のベクター。
グラム陽性菌細胞における目的のタンパク質の発現を増大させる方法であって、
ａ）請求項２９に記載のベクターで親グラム陽性菌細胞を形質転換させる工程と、
ｂ）改変グラム陽性菌細胞を作製するために、前記ベクターと、前記親グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロンにおける対応する領域とを相同組換えさせる工程と、
ｃ）前記目的のタンパク質の発現に好適な条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を増殖させる工程であって、該改変グラム陽性菌細胞における前記目的のタンパク質の産生は、前記形質転換工程前の前記グラム陽性菌細胞と比較して増加する、工程と、を含む、方法。