JP2017218410A - 糖尿病の予防または治療用組成物およびインスリン抵抗性の改善用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
体重170〜210gの7週目の雄Wistarラットは、日本エスエルシー株式会社から入手した。ラットは、病原体フリーの温度(25℃)および湿度がコントロールされた部屋で、12時間明/12時間暗サイクル(午前7時に点灯)にて、個別に収容した。ラットは、餌および水道水を自由にとることができた。
1型様糖尿病は、動物を48時間絶食させた後、クエン酸バッファー(10mM、pH4.5)に溶解してすぐのストレプトゾシン(STZ:streptozocin)(65mg/kg; Sigma-Aldrich、USA)を腹腔内に単回投与して誘発させた。STZ投与後7日目に、血糖メーターを用いて、尾から得た血液試料における血糖値を測定した。基底の血糖値が300mg/dLを超えるラットのみを糖尿病とみなした。
一旦高血糖(HG)を達成すると、ラットは作業群(n=8)に割り当てられ、各群には7日間指定用量のロズマリン酸(RA)を処理した。ロズマリン酸(≧98%、HPLC;Sigma-Aldrich、USA)は、生理食塩水に溶解させ、1日1回7日間腹腔内注射によって投与した。対照群には、生理食塩水を投与した。また、ロズマリン酸の慢性的な効果を調べるため、高血糖を示したさらなるSTZ群およびHFD群に、28日間指定用量のロズマリン酸を処理した。そして、28日目に、体重の変化と、日々の餌および水の摂取の変化とを評価し、1日目のロズマリン酸処理前の値と比較した。なお、ロズマリン酸処理の間、注入関連の副作用は観察されなかった。
ロズマリン酸の低血糖活性を調整する効果を異なる用量で研究するため、STZラットにおいてロズマリン酸処理期間、毎日、摂取後の血糖(PGT)を算定した。絶食したラット(8時間)にグルコースのボーラス(180mg/dL)を与え、2時間後に血液を抜いて、グルコース濃度を測定した。
PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase)およびGLUT4(glucose transporter type 4)の発現は、ウェスタンブロット解析を用いて同定した。凍結した筋肉試料(100mg)を1ml溶解バッファーでホモジナイズした。ホモジネートを1000×gで5分遠心し、核および不溶性物質をペレット化した。上清を新しいチューブに移し、100,000×gでさらに遠心して膜をペレット化した。この工程での上清は、解析に用いるサイトゾル画分として回収した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質定量法(Thermo Fisher Scientific社、USA)を用いて測定した。タンパク質試料を濾過し、BioRad Trans-BlotシステムにおいてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)(10%アクリルアミドゲル)により膜に転写した。膜は、ほぼ1時間、0.1%Tween20を含むTris-緩衝食塩水(TBS-T)中の5%脱脂乳に浸漬した。次いでTBS-Tで洗浄し、1次抗体(TBSで希釈した)と16時間ハイブリダイズした。以下の特異抗体を用いてタンパク質発現を同定した:PEPCK(抗ウサギ、1/1000希釈)(Santa Cruz Biotechnology、USA)およびGLUT4(抗マウス、1:1000希釈)(Abcam plc、UK)。加えて、膜は、内部標準としてβ-アクチンに対する抗体(Sigma-Aldrich、USA)(1:5000希釈)とともにインキュベートした。二次抗体とのインキュベーションおよび抗原抗体複合体検出は、ECLキット(Thermo Fisher Scientific社、USA)を使用して行った。PEPCK(62kDa)、GLUT4(30kDa)およびβ-アクチン(42kDa)に対する免疫ブロットは、内部標準として用いた抗β-アクチン(1:1,000;Santa Cruz Biotechnology)に対する免疫ブロットと比較した。
統計解析は、SPSSソフトウェア(SPSS社、USA)を用いて行った。グループ間の違いは、一元配置分散分析法(ANOVA)を用いて分析し、その後Dunnett法またはTukey-Kramer法による多重比較試験を行った。事後の最小有意差(LSD)試験を用いてインスリンおよびHOMA-IRを分析した。OGTT反応は、反復測定ANOVAを用いて分析した。結果は、平均±SEMとして記録し、p<0.05にて有意であるとみなした。
図1は、STZラットにおける血漿グルコースレベルに対するRAの用量依存的な効果を示す。STZラットに、腹腔内注射により生理食塩水またはRA(120、160または200mg/kg)を処理した。血漿グルコースレベルは、RA処理120分後に決定した。値は、平均±平均値の標準誤差を表す。データは、平均値±SE(n=8)として表される。「**」は、p<0.01を表し、それぞれ生理食塩水を投与したSTZラット(対照)における値とは有意に異なることを意味する(Dunnett法)。
血漿グルコースレベルおよびインスリンレベルを測定して、HFDで生育させたラットにおけるインスリン感受性に対するRAの効果を調べた。RA投与前に、すべての群におけるラットが著しく高血糖性、すなわち空腹時血漿グルコースレベル>130mg/dLであることを確認した。RA処理の7日後のインスリンレベルおよび血漿グルコースレベルは、対照群におけるレベルより著しく低かった(インスリン537.76±20.71対409.79±26.49pmol/L、空腹時血漿グルコース133±3.61対120±2.41mg/dL、どちらもRA処理前対RA処理7日後を示す;p<0.05)。一旦高血糖状態を確認すると、インスリン耐性試験(ITT)を行い、インスリン感受性に対するRAの効果を調べた。固形試料を摂取した群と比較して、HFDで生育させたラットは、インスリン抵抗性だった。HFD群において、RAを投与した群(160mg/kg、200mg/kg)における血糖値は、インスリン注入後、有意差があり、15分および30分の時点で、糖尿病のラットにおけるレベルより低いままだった(図3)。7日の実験期間後の実験した群における分析パラメータ(血糖、インスリン、HOMA-IR)の平均値を表1に示す。値は、平均±S.D.(n=8)として示される。一方向のANOVAの後、post hoc test(LSD)を行った。これらのデータは、RAが糖尿病のラットにおけるインスリン感受性を強化したことを示す。インスリン感受性に対するRAの効果は、高用量にてより大きかった
PEPCKおよびGLUT4のタンパク質発現レベルは、STZによって誘発された糖尿病のラットおよびHFDで生育させた糖尿病のラットにおいて、ウェスタンブロット解析を用いて分析した。
糖尿病のラットにおけるRAの長期間の効果を調査するために、体重並びに一日の食物および水の摂取における変化を、STZ群およびHFD群において測定した。その結果を表2に示す。データは、平均±平均値の標準誤差(n=8)として提示される。統計解析は、独立したスチューデントのt検定を使用して実行した。無処理群(溶媒)と比較して、「*」はp<0.05を表す。28日間のRAの投与(120、160または200mg/kg)は、HFD群において体重の顕著な減少を引き起こしたが、一日の食物または水の摂取については有意差が見られなかった。さらにまた、RAは、正常(対照)群およびSTZ群では、体重または一日の食物もしくは水の摂取に対する顕著な効果を有しなかった
Claims (5)
- ロズマリン酸を有効成分として含有する、糖尿病の予防または治療用組成物。
- 前記ロズマリン酸がシソ科の植物として含有される、請求項1に記載の糖尿病の予防または治療用組成物。
- 医薬品の形態である、請求項1または2に記載の糖尿病の予防または治療用組成物。
- 食品の形態である、請求項1または2に記載の糖尿病の予防または治療用組成物。
- ロズマリン酸を有効成分として含有する、インスリン抵抗性の改善用組成物。
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JP2016113807A JP2017218410A (ja) | 2016-06-07 | 2016-06-07 | 糖尿病の予防または治療用組成物およびインスリン抵抗性の改善用組成物 |
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Citations (1)
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