JP2017197501A

JP2017197501A - セマフォリン３ａ発現亢進剤

Info

Publication number: JP2017197501A
Application number: JP2016091429A
Authority: JP
Inventors: 向井　克之; Katsuyuki Mukai; 克之向井; 靖之五十嵐; Yasuyuki Igarashi; 靖剛臼杵; Yasutake Usuki; 田村　具博; Tomohiro Tamura; 具博田村; 建二 ▲高▼森; Kenji Takamori; 弥生鎌田; Yayoi Kamata; 光俊冨永; Mitsutoshi Tominaga; 浩則松田; Hironori Matsuda
Original assignee: Daicel Corp; Hokkaido University NUC; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Juntendo University
Current assignee: Daicel Corp; Hokkaido University NUC; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Juntendo University
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2017-11-02

Abstract

【課題】本発明の目的は、優れたセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）発現亢進作用を有し、安全性が高く、簡便に使用できるセマフォリン３Ａ発現亢進剤を提供することである。【解決手段】植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドを有効成分とするセマフォリン３Ａ発現亢進剤。【選択図】なし

Description

本発明は、セマフォリン３Ａ発現亢進剤に関する。

セマフォリンは、セマドメインという共通のアミノ酸配列をもち、構造の違いにより、７つのサブファミリーに分類されるタンパク質である。なかでも、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ：Ｓｅｍａ３Ａ）は、これまで最もよく研究されており、生体内において、神経軸索ガイダンス、血管新生、免疫応答、骨代謝などの様々な生体機能に幅広く関与していることが知られている。

例えば、セマフォリン３Ａが存在すると神経軸索の伸長が阻害されることが知られている。セマフォリン３Ａのそのような作用を利用して、例えば、皮膚組織でのそう痒を抑制する方法が提案されている（特許文献１）。また、セマフォリン３Ａが、骨吸収の阻害と骨形成の促進とを同時に行うことによって、強い骨保護作用を発揮することが知られている（特許文献２）。

このようにセマフォリン３Ａは生体内において、種々の重要な役割を果たしており、生体内でのセマフォリン３Ａの発現亢進は、前述のような痒みの抑制や骨代謝の改善・向上をはじめとした種々の効果をもたらすと考えられる。そのため、生体内のセマフォリン３Ａ発現を調整し得る薬剤の開発が期待されている。例えば、特許文献３には、転写因子を利用したセマフォリン３Ａの発現を増強又は抑制する剤、及び特定の転写因子の阻害又は促進を指標として、セマフォリン３Ａの発現を増強又は抑制する化合物のスクリーニング方法が開示されている。

ところで、セラミドは、細胞間脂質の重要な成分であり、優れた保湿性、皮膚保護作用を有することが知られている。例えば、特許文献４には、セラミド２、植物セラミド、アミノセラミド、トリメチルグリシン、ヒドロキシプロリンを含むことにより、セラミドの溶解性、安定性、組成物の安定性、保湿性、皮膚保護作用などに優れる皮膚外用剤が開示されている。また、例えば、特許文献５には、麹を用いた発酵製品製造の際の副産物である発酵粕から抽出精製されたものであって、遊離セラミドを複数含有し、遊離セラミドの含有量が５％以上である発酵粕由来スフィンゴ脂質が、保湿剤、アトピー性皮膚炎等の治癒に有用であることが開示されている。また、例えば、特許文献６には、皮膚傷、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、皮膚萎縮を含む皮膚疾患の治療に有効な非天然セラミド化合物が開示されている。

このようにセラミドが、保湿性、皮膚保護作用に優れることは知られている。しかしながら、セラミドとセマフォリン３Ａとの関係については、これまでに知られていない。

特開２００８−２９７２４３号公報国際公開第２０１３／１２９６２０号パンフレット国際公開第２０１４／１７８４２７号パンフレット特開２０１０−６７８６号公報特開２０１２−１２６９１０号公報特表２００８−５１８９０８号公報

本発明は、上記現状に鑑みて、優れたセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）発現亢進作用を有し、安全性が高く、簡便に使用できるセマフォリン３Ａ発現亢進剤を提供することを課題とする。

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドがセマフォリン３Ａの発現を亢進し得ることを見出した。また、本発明者は、植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドとして、コンニャク（コンニャク芋）由来のものが、より優れたセマフォリン３Ａ発現亢進作用を有することを見出した。また、本発明者は、植物由来のスフィンゴ糖脂質が体内で代謝されて生成されるセラミドが、より一層優れたセマフォリン３Ａ発現亢進作用を有することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドを有効成分とするセマフォリン３Ａ発現亢進剤。
項２．植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドが、コンニャク由来である項１に記載のセマフォリン３Ａ発現亢進剤。
項３．項１又は２に記載のセマフォリン３Ａ発現亢進剤を含有するセマフォリン３Ａ発現亢進用の皮膚外用剤。

本発明によれば、優れたセマフォリン３Ａ発現亢進作用を有し、安全性が高く、簡便に使用できるセマフォリン３Ａ発現亢進剤を提供することができる。本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、セマフォリン３Ａの発現を亢進することができるので、そう痒抑制や骨代謝改善等の、セマフォリン３Ａの発現を亢進することにより改善される疾患の治療又は予防用途に適用することができる。

実験例１の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）におけるセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）発現に対するコンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）の作用を示す。図１Ａは、ｋＣｅｒ添加４８時間後のＮＨＥＫのヒトＳｅｍａ３Ａの相対ｍＲＮＡ発現量を示す。図１Ｂは、ＮＨＥＫにｋＣｅｒ添加４８時間後の培養上清中に分泌されたＳｅｍａ３Ａ量を示す。実験例１のＮＨＥＫにおける神経成長因子（ＮＧＦ）発現に対するｋＣｅｒの作用を示す。ＮＨＥＫにｋＣｅｒ添加４８時間後のヒトＮＧＦの相対ｍＲＮＡ発現量を示す。実験例２のＮＨＥＫに対するｋＣｅｒの細胞毒性を示す。図３Ａは、ＮＨＥＫに対するｋＣｅｒ添加２時間後の急性毒性を解析するためにＬＤＨアッセイを行った場合の細胞生存率を示す。図３Ｂは、ＮＨＥＫに対するｋＣｅｒ添加４８時間後の亜急性毒性を解析するためＭＴＴアッセイを行った場合の細胞生存率を示す。実験例３のドライスキンモデルマウスの病変にｋＣｅｒを塗布した場合の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ値）を示す。図４Ａは、ＴＥＷＬ値の経時的変化を示す。図４Ｂは、アセトン処理４時間後のＴＥＷＬ値を示す。値はアセトン処理前（０ｈ）のＴＥＷＬ値を１とした時の相対比である。実験例３のアセトン処理４８時間後の表皮中のＳｅｍａ３Ａ転写レベルを示す。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドを有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤について詳述する。

有効成分
本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドを有効成分とする。

スフィンゴ糖脂質
スフィンゴ糖脂質とは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造のセラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質は、植物由来である。本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質の由来植物としては、具体的には、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマチャ、アマチャヅル、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カリン、ガルシニア、カルダモン、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク（コンニャク芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、ゼニアオイ、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンジン、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ヘチマ、ベニバナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マタタビ、マリーゴールド、マンゴー、ミツバ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類由来、更に好ましくはコンニャクが挙げられる。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において、スフィンゴイド部分の構造については、特に限定されないが、具体的には、４−スフィンゲニン（スフィンゴシン）、４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、４−ヒドロキシ−トランス−８−スフィンゲニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、スフィンガニン、トランス−８−スフィンゲニン、シス−８−スフィンゲニン、トランス−４−スフィンゲニン、トランス−４，トランス−８−スフィンガジエニン、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、コンニャク由来のスフィンゴ糖脂質を構成しているスフィンゴイド、具体的にはトランス−４，シス−８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニンが挙げられる。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に制限されないが、２〜３０、好ましくは１４〜２６、更に好ましくは１８〜２４が挙げられる。また、当該脂肪酸は、飽和脂肪酸、炭素−炭素二重結合及び／又は炭素−炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα−ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサデカン酸（Ｃ１６：０）、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ヘネイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラドコサン酸（Ｃ２４：０）、ペンタコサン酸（Ｃ２５：０）、ヘキサドコサン酸（Ｃ２６：０）、ヘプタコサン酸（Ｃ２７：０）、オクタドコサン酸（２８：０）、シス−９−オクタデセン酸（Ｃ１８：１）等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「ＣＸ：Ｙ」において、ＣＸは１分子当たりの炭素数を示し、Ｙは１分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「Ｃ１６：０」とは炭素数１６且つ不飽和結合数が０の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくは、コンニャク由来のスフィンゴ糖脂質を構成している脂肪酸、具体的にはオクタデカン酸、ドコサン酸、イコサン酸が挙げられる。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質に結合している糖部分の構造については、特に制限されず、単糖又は糖鎖であればよい。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において糖部分が単糖である場合、その構成糖の種類については、特に制限されないが、具体的には、グルコース、ガラクトースが挙げられる。これらの単糖の中でも、好ましくはグルコースが挙げられる。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において糖部分が糖鎖である場合、その構成糖鎖の種類については、特に制限されず、例えば、当該糖鎖のセラミド側末端がグルコース残基で構成されている糖鎖であればよく、具体的には、ラクトース、糖鎖−セラミド間が結合によって結合している、Galα1-4Gal単位を有するグロボ系、Galα1-3Gal単位を有するイソグロボ系、Galβ1-3GlcNAc単位を有するラクト系、Galβ1-4GlcNAc単位を有するネオラクト系、シアル酸残基又はGalNAcβ1-4Gal単位を有するガングリオ系等が挙げられる。

本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質について糖部分の構造に応じて分類すると、具体的には、Glcβ1-1Cer（グルコシルセラミド）、Galβ1-1Cer（ガラクトシルセラミド）等のセレブロシド；Galβ1-4Glcβ1-1Cer（ラクトシルセラミド）；Galα1-4Galβ1-1Cer、Galβ1-6Galβ1-6Galβ1-1Cer、HSO3-Galβ1-1Cer（スルファチド）等のガラ系スフィンゴ糖脂質；Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-3Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcα-1-3GalNAcβ1-3Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のグロボ系スフィンゴ糖脂質；GalNAcβ1-3Galα-1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のイソグロボ系スフィンゴ糖脂質；GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer、Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のラクト系スフィンゴ糖脂質；Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のネオラクト系スフィンゴ糖脂質；NeuAcα-2-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-4(NeuAcα-2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galbe-ta1-4Glcbe-ta1-1Cer、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-4(NeuAcα-2-8NeuAcα-2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、NeuAcα-2-8NeuAcα-2-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer、Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のガングリオ系スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。なお、本明細書において、「Cer」はセラミド、「Glc」はグルコース、「Gal」はガラクトース、「GlcNAc」はＮ−アセチルグルコサミン、「GalNAc」はＮ−アセチルガラクトサミン、「NeuAc」はシアル酸の略記である。

これらの中でも、セマフォリン３Ａ発現亢進作用により一層優れるという観点から、好ましくはグルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、更に好ましくはグルコシルセラミドが挙げられる。グルコシドセラミドは、コンニャク由来のスフィンゴ糖脂質に多く含まれているセレブロシドである。

スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤において、スフィンゴ糖脂質は、１種の構造又は由来のものを単独で使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。

セラミド
セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する。本発明において使用されるセラミドとしては、前述した植物由来のセラミドであることを限度として特に限定されず、スフィンゴイドの構造、結合している脂肪酸の構造等については、前記スフィンゴ糖脂質の欄で例示したものと同様である。

セラミドは、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、セラミドは、前記スフィンゴ糖脂質の酵素処理物として得られたものであってもよい。また、セラミドは商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

前記スフィンゴ糖脂質の酵素処理物としては、前述の由来植物の抽出液、その濃縮液、又は前記濃縮液を精製処理した精製物の酵素処理物などが挙げられる。酵素処理に使用する酵素としては、スフィンゴ糖脂質の糖鎖−セラミド間の結合を加水分解する酵素であれば特に限定されず、例えば、エンドグリコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）が挙げられる。

ＥＧＣａｓｅは、等電点及び分子量が異なる３つの分子種（ＥＧＣａｓｅＩ、ＥＧＣａｓｅＩＩ、及びＥＧＣａｓｅＩＩＩ）が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。使用するＥＧＣａｓｅの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質の場合であれば、ＥＧＣａｓｅＩが好適に使用される。酵素処理の条件は、所望の酵素反応が行われるよう適宜選択するとよい。

前記抽出液の濃縮方法としては、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いた公知の濃縮方法が挙げられる。また精製方法としては、アルカリ処理、溶媒分画、シリカゲルクトマトグラフィーなどの公知の精製方法が挙げられる。

酵素処理後、酵素処理物そのままを用いてもよいし、酵素処理物を固液分離した残渣、固液分離した残渣を乾燥させたもの、反応物そのままを乾燥させたもの等を用いてもよい。また、酵素処理物を固液分離し、更に水を添加した後、再度固液分離することにより酵素処理物を洗浄して不純物を除去したものでもよい。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤において、セラミドは、１種の構造又は由来のものを単独して使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。

添加成分
本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、前述した植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤の剤型などに応じて適宜設定される。

剤型・用途・製剤形態
本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、当該セマフォリン３Ａ発現亢進剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、セマフォリン３Ａの発現を亢進し得るので、セマフォリン３Ａの発現亢進により症状が改善され得る疾患の治療又は予防目的で使用することができる。セマフォリン３Ａの発現亢進により症状が改善され得る疾患としては、特に限定されず、例えば、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、汗疱などのそう痒性皮膚疾患、骨粗鬆症、原発性副甲状腺機能亢進症、骨軟化症、くる病、骨形成不全症、軟骨無形成症、大理石骨病などの骨代謝低下による骨関連疾患などが挙げられる。従って、本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、そう痒抑用途、骨代謝改善用途などの目的で使用することができる。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、経口、経腸、経皮、皮下、注射等、任意の投与形態で使用できるが、投与が容易であり、かつ効果が高い点で、経皮投与が好ましい。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤の製剤形態については、特に限定されず、投与形態に応じて適宜選択すればよい。例えば、本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤の投与形態が経皮投与である場合は、経皮投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、化粧料、外用医薬品などの皮膚外用剤が挙げられる。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤を化粧料に使用する場合、本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような化粧料の形態としては、特に限定されないが、具体的には、クリーム剤、乳液、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）などが挙げられる。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤を外用医薬品に使用する場合、本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような外用医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤などの経皮投与製剤などが挙げられる。

本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤の使用量については、特に限定されず、製剤形態、用途などに応じて適宜設定されるが、例えば、皮膚外用剤である場合、使用量としては、植物由来セラミド換算で、表皮単位面積（１ｃｍ²）あたり、好ましくは０．００１〜１６．７μｇ／（ｃｍ²・ｄａｙ）である。

このように本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、セマフォリン３Ａの発現亢進効果に優れる。本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、セマフォリン３Ａの発現が亢進されることによって症状が改善される疾患の予防又は治療用途に使用することができる。具体的には、本発明のセマフォリン３Ａ発現亢進剤は、そう痒抑制、骨代謝改善に好適に適用することができる。

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。

１．コンニャク由来セラミドの調製
コンニャク由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）（ＮＳ１７０３０２Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｆｒｏｍＫｏｎｊａｃ，純度≧９９％（ＴＬＣ）（株）長良サイエンス）に、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉＭ−７５０株由来のＥＧＣａｓｅＩを用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を得た。

実験例１
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）における軸索ガイダンス分子の発現に対するコンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）の作用
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、Ｌｏｎｚａ社のプロトコルに従い、６ウェル組織培養プレート内で培養した。その後、前記１．で得られたコンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を最終濃度０、２５、５０、又は１００μＭとなるよう添加し、添加して４８時間後にｔｏｔａｌＲＮＡ及び培養上清を回収し、ヒトＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現量と、培養上清中に分泌されたＳｅｍａ３Ａ量の測定を行った。
ＴｏｔａｌＲＮＡは、製造業者の取扱説明書に従って、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて培養細胞から抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写し、定量リアルタイムＰＣＲによりヒトＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡの発現量を測定した。定量リアルタイムＰＣＲは製造業者の取扱説明書に従い、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００ＨＴＦａｓｔＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により実施した。使用したプライマーに関する情報を表１に示す。リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）を基準遺伝子として使用した。ｍＲＮＡ量は、ＲＰＳ１８のｍＲＮＡ量に対して標準化し、そして最終的に未処理対照（ｋＣｅｒの添加量が０μＭのもの）のｍＲＮＡに対する比として示した。
ＥＬＩＳＡは製造業者の取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＡｋｉｔｆｏｒｈｕｍａｎｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ（Ｕｓｃｎ，Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ）を用いて行った。

また、ｋＣｅｒ添加４８時間後のＮＨＥＫにおける神経成長因子（ＮＧＦ）のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ＴｏｔａｌＲＮＡの抽出、及び定量リアルタイムＰＣＲは、表２に示すプライマーを用いたこと以外は、前述のＳｅｍａ３Ａと同様の方法で行い、ｍＲＮＡ量を未処理対照のｍＲＮＡに対する比として示した。

得られたデータについて、統計ソフトＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による有意差検定による解析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差有りとした。

ＮＨＥＫにｋＣｅｒを作用させて４８時間後のＳｅｍａ３Ａ転写レベルを図１Ａに、培養上清中へのＳｅｍａ３Ａ分泌量を図１Ｂに示す。ｋＣｅｒ無添加群（０μＭ）と比較してｋＣｅｒ添加群（２５，５０，１００μＭ）でＳｅｍａ３Ａ転写レベルは有意に（^***Ｐ＜０．００１）増加した。同様に、培養上清中へのＳｅｍａ３Ａの分泌量もｋＣｅｒ添加群（２５，５０，１００μＭ）で有意に（^**Ｐ＜０．０１，^*Ｐ＜０．０５）増加した。これらの結果はｋＣｅｒがＳｅｍａ３Ａ発現亢進剤として応用できる可能性を示唆した。図２に、ｋＣｅｒ添加４８時間後の神経成長因子（ＮＧＦ）転写レベルを示す。ｋＣｅｒ無添加群と比較して、ＮＧＦ転写レベルは有意に（^***Ｐ＜０．００１）抑制された。

実験例２
ＮＨＥＫに対するｋＣｅｒの細胞毒性試験
実験例１と同条件でＮＨＥＫを９６ウェル組織培養プレート内で培養し、最終濃度０、２５、５０、１００μＭのｋＣｅｒを添加後、一定時間経過後（ＬＤＨアッセイは２時間後、ＭＴＴアッセイは４８時間後）に、急性毒性の評価として乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ、亜急性毒性の評価としてＭＴＴアッセイを行った。
ＬＤＨアッセイは製造業者の取扱説明書に従って、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔＰＬＵＳ（ＬＤＨ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。ｋＣｅｒ添加２時間後に培養上清を回収し、それらを反応溶液と３０分間反応後、停止溶液を添加し、波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞障害率（％）を「（ｋＣｅｒ添加群の平均値／溶媒対照群の吸光度の平均値）×１００」の式から求め、細胞生存率（％）を「１００−細胞障害率」の式によって求めた。
ＭＴＴアッセイは製造業者の取扱説明書に従って、Ｃｅｌｌ−ｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。ｋＣｅｒ添加４８時間後にＣｅｌｌ−ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８溶液を細胞に添加し、一定時間経過後に波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。生細胞率（％）は「各ウェルの吸光度／溶媒対照群の吸光度の平均値×１００」の式により求めた。
得られたデータについて、実験例１と同様に、統計ソフトＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による有意差検定による解析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差有りとした。

ＮＨＥＫにｋＣｅｒを作用させて２時間後の細胞生存率を図３Ａに、４８時間後の細胞生存率を図３Ｂに示す。ｋＣｅｒ添加２時間後の細胞生存率は、２５及び５０μＭ添加群で９０％以上だったが、１００μＭ添加群では有意に（^***Ｐ＜０．００１）細胞生存率が減少した（図３Ａ）。ｋＣｅｒ添加４８時間後の細胞生存率はｋＣｅｒの濃度依存的に有意に（^***Ｐ＜０．００１）減少した（図３Ｂ）。

実験例３
ドライスキンモデルマウスの病変部に対するｋＣｅｒの作用
ドライスキンモデルマウスの病変部にｋＣｅｒ溶液を外用する実験を行った。ＩＣＲマウス（１０週齢）の除毛した腰背部にアセトン溶液を浸した脱脂綿を５分間静置することで、急性ドライスキンモデルを作成した。マウスは（ｉ）未処置、（ｉｉ）アセトン処理後すぐに溶媒のエタノールのみ塗布、（ｉｉｉ）アセトン処理後すぐに０．１％ｋＣｅｒ塗布の３群（各群６匹）に分類した。各試料の塗布はアセトン処理後１回のみとした。ドライスキン誘発前後で経時的に経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定を行った。アセトン処理の４８時間後に皮膚を摘出し、０．０２％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液に一晩浸漬後、表皮を剥離して、ＲＮＡを抽出した。その後、定量リアルタイムＰＣＲで表皮におけるＳｅｍａ３ＡｍＲＮＡの発現量を解析した。使用したプライマーを表３に示す。

得られたデータについて、実験例１と同様に、統計ソフトＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による有意差検定による解析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差有りとした。

図４Ａに、アセトン処理後の相対ＴＥＷＬ値の経時的変化を示す。図４Ｂに、各群のアセトン処理４時間後における相対ＴＥＷＬ値を示す。いずれもアセトン処理前のＴＥＷＬ値を１とした相対値で示す。アセトン処理の４時間後（図４Ｂ）には、未処理群と比較して０．１％ｋＣｅｒ溶液を外用した群で有意に（^*Ｐ＜０．０５）ＴＥＷＬが抑制された。この結果は、ｋＣｅｒ塗布が皮膚バリア機能の改善に効果的であることを示唆する。
また、図５に、アセトン処理４８時間後の表皮中のＳｅｍａ３Ａ転写レベルを示す。０．１％ｋＣｅｒ塗布群は、未処理群及びエタノール塗布群と比較して、表皮のＳｅｍａ３Ａ転写レベルは有意に（^*Ｐ＜０．０５，^***Ｐ＜０．００１）促進された。この結果は、ｋＣｅｒがＳｅｍａ３Ａの発現を亢進し得ることを示唆する。

Claims

植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドを有効成分とするセマフォリン３Ａ発現亢進剤。
植物由来スフィンゴ糖脂質及び／又はセラミドが、コンニャク由来である請求項１に記載のセマフォリン３Ａ発現亢進剤。
請求項１又は２に記載のセマフォリン３Ａ発現亢進剤を含有するセマフォリン３Ａ発現亢進用の皮膚外用剤。