KR101429946B1

KR101429946B1 - 브로콜리 추출수를 함유하는 천연비누 및 화장료 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101429946B1
Application number: KR1020120088885A
Authority: KR
Inventors: 박주연; 이호용
Original assignee: 주식회사 오감바이오; 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2014-08-18
Also published as: KR20140022601A

Abstract

본 발명은 브로콜리(Brassica oleracea)를 물에 넣고 가열하여 수증기를 수득하는 단계(a1) 또는 수증기가 브로콜리를 통과하게 하는 단계(a2); 및 상기 단계에서 수득된 수증기를 응축시키는 단계(b)를 통해 얻어진 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는, 우수한 보습효과 및 아토피 피부 개선효과를 나타내는 브로콜리 추출수의 제조방법 및 그 제조방법으로 제조된 브로콜리 추출수를 함유하는 보습 및 아토피 피부 개선용 천연비누 및 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 브로콜리 추출수 중에는 유효성분의 함량이 높고, 세포 독성이 거의 없으며, NO 소거활성이 우수하고, DPPH 라디칼 소거활성이 우수하며, β-헥소아미니다아제 저해효과가 우수하고, 염증성 사이토카인인 TNF-α 수준을 현저히 감소시키는 것으로 나타났을 뿐만 아니라, 경표피 수분손실을 효과적으로 방어하고, 각질층 보습도를 유지시켜주는 것으로 나타나, 피부 건조 및 가려움증을 완화시키는 활성을 갖는 천연비누 및 화장품 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

Description

브로콜리 추출수를 함유하는 천연비누 및 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Natural Soap and cosmetic composition comprising broccoli water extract and preparation method thereof}

본 발명은 브로콜리(Brassica oleracea)를 물에 넣고 가열하여 수증기를 수득하는 단계(a1) 또는 수증기가 브로콜리를 통과하게 하는 단계(a2); 및 상기 단계에서 수득된 수증기를 응축시키는 단계(b)를 통해 얻어진 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는, 우수한 보습효과 및 아토피 피부 개선효과를 나타내는 브로콜리 추출수의 제조방법 및 그 제조방법으로 제조된 브로콜리 추출수를 함유하는 보습 및 아토피 피부 개선용 천연비누 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

브로콜리(영어: broccoli, 학명: Brassica oleracea)는 배추속의 한 종류인 브라시카 올레라케아에 속하는 채소의 일종이다. 브로콜리에는 비타민 C가 풍부하며 항암 물질을 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 브로콜리를 조리해서 섭취할 때 30mg 이상의 비타민 C가 나온다고 알려져 있으며, 섭취시 발생하는 3,3-디인돌리메탄은 브로콜리가 함유하고 있는 면역물질을 소화체계에서 분비함으로써 항암 치료를 돕는 역할을 한다고 한다. 또한, 브로콜리 중에는 글루코사민이 함유되어 있어, 설포라판이라는 항암 물질을 끌어내는 역할을 하지만 10분 넘게 끓이게 되면 모든 영양소가 파괴된다.

한편 천연 추출물을 제조하기 위해서 초음파 추출법, 가열가압추출법 및 용매를 이용한 추출법 등을 고려할 수 있다. 그러나, 초음파 추출법이나 가열가압추출법을 사용하는 경우, 생즙 또는 분말 형태로 수득되는데 이는 비누나 화장품 제조 시 정제수를 대신하여 넣을 수 없고 첨가물로 소량이 함유될 수 밖에 없는 단점이 있으며, 생즙의 경우 부패 가능성이 크고 유통과정에서 변질이 우려된다는 문제가 있다.

용매를 이용한 추출법을 사용하는 경우, 활성 성분을 고순도로 추출할 수 있으나 보통 사용되는 유기용매의 경우 극미량이 남아있다 하더라도 화장품으로 사용시 피부에 자극을 줄 수 있어 바람직하지 않다.

상기한 바와 같이, 기존의 추출방법을 브로콜리에 적용하는 경우, 활성 성분이 파괴되거나, 매우 소량만이 수득되어 원하는 효과를 나타내지 않게 되는 문제점이 있었고, 화장품을 만드는데 부적합한 수득물이 생성되는 문제가 존재하였다. 이에 본 발명의 발명자는 활성 성분을 다량 함유하면서도 화장품 원료로서 적합한 추출수를 제조할 수 있는 방법을 연구하던 중 브로콜리를 물에 넣고 가열하여 수득된 수증기를 응축시키거나, 수증기를 브로콜리에 통과시켜 얻어진 것을 응축시키는 방법으로 브로콜리 추출수를 제조함으로써, 유효성분의 함량이 높으면서도 화장품의 제조에 적합한 브로콜리 추출수를 얻을 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 브로콜리(Brassica oleracea)를 물에 넣고 가열하여 수증기를 수득하는 단계(a1) 또는 수증기가 브로콜리를 통과하게 하는 단계(a2); 및 상기 단계에서 수득된 수증기를 응축시키는 단계(b)를 통해 얻어진 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함으로써, 더욱 우수한 보습효과 및 아토피 피부 개선효과를 나타내는 브로콜리 추출수를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 더욱 우수한 보습효과 및 아토피 피부 개선효과를 나타내는 브로콜리 추출수를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 제조된 브로콜리 추출수를 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하며, 보다 구체적으로는 브로콜리 추출수를 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 비누를 제공한다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 브로콜리 추출수의 경우, 다른 방법에 따라 제조된 추출물에 비하여 유효성분의 함량이 높고, 세포 독성이 거의 없으며, NO 소거활성이 우수하고, DPPH 라디칼 소거활성이 우수하며, β-헥소아미니다아제 저해효과가 우수하고, 염증성 사이토카인인 TNF-α 수준을 현저히 감소시키는 것으로 나타났을 뿐만 아니라, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 브로콜리 추출수를 함유하는 비누를 사용하는 경우, 경표피 수분손실을 효과적으로 방어하고, 각질층 보습도를 유지시켜주는 것으로 나타나, 피부 건조 및 가려움증을 완화시키는 활성을 갖는 천연비누 및 화장품 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

도 1은 브로콜리 추출수와 꽃 추출수의 농도별 세포독성을 나타낸 것이다.
도 2는 각 제조방법에 따른 추출수/추출물의 세포 생존도를 측정한 결과이다.
도 3은 LPS와 각 제조방법에 따른 추출수/추출물의 NO 소거활성 측정 결과를 도시한 것이다.
도 4는 LPS와 본 발명의 추출수를 농도별로 처리하였을 때 NO 소거활성을 측정한 결과이다.
도 5는 각 제조방법에 따른 추출수/추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 측정 결과를 도시한 것으로서 DPPH 라디칼 50% 소거능을 보이는 농도를 y축에 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 추출수를 농도별로 처리하였을 때 DPPH 라디칼 소거활성 측정 결과를 도시한 것으로서 DPPH 라디칼 50% 소거능을 보이는 농도를 y축에 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 추출수를 농도별로 처리하였을 때 베타-헥소아미니다아제 방출정도를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 8 내지 도 10은 브로콜리 추출수를 처리하였을 때 염증성 사이토카인인 쑬-알파 수준을 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 도 8은 브로콜리 추출수 20% 농도를 시간별로 처리시의 결과이고, 도 9는 브로콜리 추출수를 농도별로 처리하였을 때의 결과이며, 도 10은 LPS와 브로콜리 추출수를 함께 처리하였을 때의 결과이다.
도 11은 각 제조방법에 따른 추출수/추출물을 함유하는 비누의 경표피수분 손실량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 각 제조방법에 따른 추출수/추출물을 함유하는 비누의 각질층 보습도를 측정한 결과를 도시한 것이다.

본 발명은 브로콜리(Brassica oleracea)를 물에 넣고 가열하여 수증기를 수득하는 단계(a1) 또는 수증기가 브로콜리를 통과하게 하는 단계(a2); 및 상기 단계에서 수득된 수증기를 응축시키는 단계(b)를 포함하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 브로콜리로는 브로콜리의 잎, 줄기 및 대가지를 사용하거나, 브로콜리 꽃을 사용할 수 있다. 즉 브로콜리 전체 부위를 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계(a1) 및 단계(a2)에서 브로콜리 및 물의 배합비는 1:1 내지 5, 보다 구체적으로 1:1 내지 2로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계(a1)에서 100 내지 120℃로, 보다 구체적으로는 100 내지 110℃로, 보다 더 구체적으로는 105℃로 가열할 수 있다. 상기 온도 범위로 가열하는 경우 유효성분의 함량을 다량 함유하는 브로콜리 추출수를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 유효성분의 열에 의한 파괴를 최소화할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계(a2)에서 수증기는 100 내지 140℃의 스팀기, 보다 구체적으로는 110 내지 130℃의 스팀기, 보다 더 구체적으로는 120℃의 스팀기로부터 유래할 수 있다. 상기 온도 범위로 가열하는 경우 유효성분의 함량을 다량 함유하는 브로콜리 추출수를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 유효성분의 열에 의한 파괴를 최소화할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계(a1) 및 단계(a2)에서 추출시 압력은 1 내지 1.5bar, 보다 구체적으로 1.3bar로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계(b)에서는 0 내지 20℃의 냉각기에서 응축시킬 수 있으며, 구체적으로는 수증기 응축 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 기재된 방법으로 제조된 보습용 또는 아토피 피부 개선용 브로콜리 추출수 및 브로콜리 추출수를 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장품이 제공된다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 피부에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 리포좀의 형태로 제공될 수 있다. 또한 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물은 비누, 아스트린젠트, 스킨(화장수), 로션, 크림, 에센스, 유액, 팩, 파운데이션, 메이크업 베이스, 파우더, 미용액, 세정제, 아이크림, 마사지 크림, 바디크림, 핸드크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 바디 클렌저, 샴푸, 린스, 헤어트리트먼트, 베이비 스킨, 베이비 로션, 베이비 크림, 베이비 바디로션, 베이비 바디크림, 베이비 바디 클렌저 등의 제형으로 제조될 수 있고, 보다 구체적으로 천연 비누로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 브로콜리 추출수와 함께, 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 보조제 성분을 배합하여도 무방하다. 이러한 성분들로는 예를 들면, 유지류, 보습성분, 에몰리엔트제, 계면활성제, 안료, 유기성 분체, 보존제, 살균제, 산화방지제, 천연물 추출물, pH 조절제, 천연색소, 향료, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 본 발명의 화장료 조성물은 보습 및 아토피 피부 개선용으로 사용되기 때문에 피부에 자극을 줄 수 있는 화학적 성분 등은 사용하지 않는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예, 제조예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 범주가 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이를 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

실시예 1. 브로콜리 추출수의 제조

브로콜리 잎, 줄기 및 대가지(브로콜리 전체)를 5cm정도의 크기로 분쇄하여 18kg을 물 30L에 넣었다. 그 후 가열로에 넣고 120℃로 180분간 1.3bar의 압력 조건하에 가열하였다. 그 후 수득된 수증기를 10℃의 조건에서 냉각기 중에서 응축시켰다. 이로써 수득된 브로콜리 추출수는 21L였다.

실시예 2. 브로콜리 추출수의 제조

브로콜리 잎, 줄기 및 대가지(브로콜리 전체)를 5cm정도의 크기로 분쇄한 것18kg을 스팀기에 넣고, 수증기를 발생시켜 180분간 두었다. 그 후 수득된 수증기를 10℃의 조건에서 냉각기 중에서 응축시켰다. 이로써 수득된 브로콜리 추출수는 약 20L였다.

실시예 3. 브로콜리 꽃 추출수의 제조

브로콜리 꽃 18kg을 실시예 1의 방법에 따라 추출하여 브로콜리 꽃 추출수를 제조하였다. 이로써 수득된 브로콜리 추출수는 17L였다.

실시예 4. 브로콜리 꽃 추출수의 제조

브로콜리 꽃 18kg을 실시예 2의 방법에 따라 추출하여 브로콜리 꽃 추출수를 제조하였다. 이로써 수득된 브로콜리 꽃 추출수는 약 16L였다.

비교예 1. 브로콜리 초음파 추출수의 제조

브로콜리 잎, 줄기 및 대가지 (브로콜리 전체)를 5cm정도의 크기로 분쇄하여 3kg을 물 30L에 넣었다. 그 후 추출기에 넣고 70℃로 180분간 40~120 kHz 초음파로 병합추출하였다. 이로써 수득된 브로콜리 초음파 추출수는 15L였다.

비교예 2. 브로콜리 가열가압 추출수의 제조

브로콜리 잎, 줄기 및 대가지 (브로콜리 전체)를 5cm정도의 크기로 분쇄하여 3kg을 물 30L에 넣었다. 그 후 가열로에 넣고 120℃로 180분간 1.5bar의 압력 조건하에 가열하였다. 이로써 수득된 브로콜리 가열가압 추출수는 17L였다.

비교예 3. 브로콜리 생즙의 제조

브로콜리 잎, 줄기 및 대가지 (브로콜리 전체)를 아주 잘게 분쇄하여 3kg을 물 10L에 넣었다. 이로써 수득된 브로콜리 생즙은 7L였다.

비료예 4. 브로콜리 가루의 제조

브로콜리를 분쇄한 후 40도에서 서서히 수분을 날려 건조 후 분쇄기로 분쇄하여 가루를 낸다.

제조예. 비누의 제조

코코넛오일, 팜유, 피마자유, 미강유와 올리브유를 혼합하여 80℃에 맞추어서 1차 가열 혼합하고, 45-50℃ 온도로 저온화하여 가성가리와 브로콜리 추출수를 역시 45-50℃까지 저온화 한 것 서서히 교반시켜주고, 이 과정에서 젤 상태가 될 때까지 저어준 후 트레이시가 일어나면 에센셜 오일을 소량 첨가하여 함께 저어서 교반 후 성형틀에 충진하여 24시간 보온 시킨 다음 비누의 크기로 절단하여 4주간 숙성 건조시켜서 제조한다,

본 발명에 따른 브로콜리 추출수, 본 발명에 따른 브로콜리 꽃 추출수, 초음파 추출물, 가열가압 추출물, 생즙 및 가루를 함유하는 비누를 상기한 과정에 따라 제조하였고, 각 성분의 함유량은 다음 표 1에 기재한 바와 같다:

비누의 조성

	제조예1	제조예2	비교제조예1	비교제조예2	비교제조예3	비교제조예4
주요성분 (함량)	추출수 214g	꽃 추출수 214g	초음파 추출물 40g	가열가압 추출물 40g	생즙 40g	가루 20g
코코넛유	400	400	400	400	400	400
팜유	100	100	100	100	100	100
피마자	50	50	50	50	50	50
미강유	50	50	50	50	50	50
올리브유	50	50	50	50	50	50

실험예 1. 세포 생존도(Cell viability) 실험

세포 생존도(Cell viability)를 측정하는 실험을 수행하였다. 황색 테트라졸리움 염 MTT(yellow tetrazolium salt MTT)는 살아있는 세포에서 물에 녹지 않는 포르마잔 결정(formazan crystal)으로 환원되는데, 이 결정을 나중에 DMSO로 녹여서 생성된 크리스탈의 양을 분광학적인 방법(Spectroscopic method)으로 측정하였다. 결국, 살아있는 세포의 수가 많을수록 이 결정의 생성도 많아지므로 이러한 방법을 통해 세포의 생존도를 쉽게 측정할 수 있다.

우선, HaCaT (Keratinocyte) 세포를 6-웰 플레이트에 2 X 10⁵로 깔아놓은 후 각 웰에 MTT 용액 400ul를 넣고 37 ℃ CO₂ 인큐베이터에서 24시간을 두었다 (브로콜리 추출수는 농도별로 실험하였고, 처리시료가 다를 시 농도는 10%로 처리하였다). 그 후, 배지를 제거하고 여기에 DMSO를 500 ul 넣었다. 파이펫팅으로 잘 섞어준 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같다. 도 1을 보면, 브로콜리 추출수 및 꽃 추출수의 경우 아무 처리도 하지 않은 대조군과 같이 세포독성이 거의 없다는 점을 알 수 있다. 또한, 도 2를 보면, 브로콜리를 초음파법 또는 가열가압법 또는 착즙 방법으로 추출한 추출수에 비하여 본 발명의 방법으로 추출한 추출수의 경우 세포 독성이 현저히 낮다는 점을 알 수 있다.

실험예 2. NO(Nitric Oxide) 소거활성 측정

브로콜리 추출물들의 NO 소거활성을 측정하기 위해 Sutherland H et al.(A fluorescence-based method for measuring nitric oxide in extracts of skeletal muscle. Nitric Oxide, 5, pp475-481, 2001)에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

1 mg의 DAF-2를 0.55 ml의 DMSO에 용해시키고, 이를 다시 50 mM 포스페이트 완충액(phosphate buffer)을 사용하여 400배 (v/v)로 희석해서 DAF-2 용액을 준비해 놓았다. 시료 10 μl를 50 mM 포스페이트 완충액(pH 7.4) 130 μl와 혼합한 다음, 40 mM SIN-1 10 μl 및 DAF-2 용액 50 μl를 첨가하였다. 반응용액을 실온에서 10분간 배양한 다음, DAF-2와 NO의 반응에 의해 생성되는 트리아졸로플루오레세인(triazolofluorescein)의 형광강도를 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescence microplate reader, GENios-basic, TECAN, Austria)를 사용하여, 여기(excitation) 파장 495 nm 및 방출(emission) 파장 515 nm에서 측정하였다. 양성 대조군 및 NO 유발 물질로는 100ng/ml의 LPS를 처리하였다. 실험결과는 도 3 및 도 4에 나타냈다.

실험결과, 브로콜리 추출수가 우수한 NO 소거활성을 지님을 확인하였다. 그리고 브로콜리 추출수의 농도가 높아짐에 따라 우수한 NO 소거활성을 지님을 확인하였다.

실험예 3. DPPH 라디칼(radical) 소거활성 측정

브로콜리 추출물들의 DPPH 라디칼의 소거활성을 측정하기 위해 Gyamfi MA et al.(Free-radical scavenging action of medicinal herbs from Ghana. Gen. Pharmacol., 32, pp661-667, 1999)에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

시료 50 μl에 0.1 mM DPPH 용액 1 ml 및 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4) 450 μl를 가하여 잘 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 30분간 정치한 다음, 마이크로플레이트 리더(micro plate reader, VersaMax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 파장 517nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼의 소거활성은 50%의 소거능을 보이는 농도(IC₅₀)로 표시하였다. 실험결과는 도 5 및 도 6에 도시하였다. (모든 추출물을 동일하게 10%로 넣어서 실험하였음). 그 결과, 초음파 추출수등 비교예의 추출물에서는 독성이 확인되었다.

실험결과, 처리농도 10%(세포배양의 총량이 1ml일 경우 배지를 900ul+추출수를 100ul 넣은 것을 의미함)에서 브로콜리 추출수가 우수한 전자공여능을 지님을 확인하였고, 브로콜리 추출수의 농도가 높아짐에 따라 우수한 전자공여능을 지님을 확인하였다.

그러므로 비누 등과 같은 화장료 제조시 브코롤리 추출수를 고농도로 첨가하는 것이 보습과 아토피 및 염증에 효과적임을 알 수 있다.

실험예 4. 항아토피 실험: β-헥소아미니다아제 저해효과 측정

브로콜리 추출수 5, 10, 25, 50, 100 %을 샘플로 하여 β-헥소아미니다아제　저해 효과를 다음과 같이 확인하였다.

세포에 β-헥소아미니다아제 유도제인 A23187을 처리하면 세포 안으로 칼슘이온이 들어오게 되고, 세포 내에서 β-헥소아미니다아제가 배지로 분비된다. P-NAG 기질을 처리하여 분비된 β-헥소아미니다아제 효소와 결합하도록 하였다. 종결 버퍼(Na₂CO₃ 또는 NaHCO₃) 0.1 mole 헥사아미드 효소반응으로 1시간 처리 후 ELISA로 400 nm에서 흡광도를 측정하였다 실험 결과는 도 7에 나타낸 바와 같다.

실험 결과, 브로콜리 추출수의 경우 50%에서 β-헥소아미니다아제 방출이 50% 이상 감소하는 것으로 나타났다. 이로써, 브로콜리 추출수가 건조함을 막고 건조함에서 기인한 가려움증을 완화함으로써 아토피나 악건성에 효과적임을 알 수 있다.

실험예 5: Real-time PCR을 이용한 브로콜리 추출물의 TNF-α 저해능 시험

5-1. 인간피부 각질형성세포주 HaCaT 세포 배양

피부에서 발생되는 TNF-α의 생산을 감소시킬 수 있는 브로콜리 추출물의 탐색 시험을 수행하기 위하여, 인간피부의 구성 세포주인 각질형성세포 HaCaT 세포주(CLC Cell line serveice, Germany)를 사용하였다. HaCaT 세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco BRL, USA)과 항생제가 들어있는 DMEM 배양액 (Gibco BRL, USA)을 사용하여 배양하였다. 배양 용기는 75T-플라스크와 6 웰 플레이트를 사용하였으며 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3~4일마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대배양 하였다. 브로콜리 추출물의 처리 시험은 적정한 계대 수의 HaCaT 세포가 6 웰 플레이트에서 배양용기 면적의 90%이상 증식 시, 배양 배지 3ml의 20% 비율인 상기 실시예 1에서 수득된 추출물 0.6ml을 처리하였으며, 추가적으로 0h, 6h, 12h, 24h (도 8) 배양 또는 브로콜리 추출수 10, 20, 30, 40%의 비율로 처리하였으며 추가적으로 48시간 배양 (도 9) 후 총 RNA의 분리와 cDNA 합성을 수행하였다.

5-2. Total RNA 분리와 cDNA 합성

Real-time PCR에 사용될 cDNA는 천연물 열수 추출물의 처리 시간 후 총RNA를 추출하여 합성하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트 당 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 1ml을 이용하여 총 RNA를 추출하였다.

총 RNA를 이용한 cDNA합성을 수행하기 위하여 전체 반응액 20㎕를 아래의 조성들로 구성하였다. 5X PrimeScript Buffer(Kit code RR037A, Lot A1201-1) 4㎕와 PrimeScript RT Enzyme Mix(Kit code RR037A, LotA1201-1) 1㎕와 올리고 dT 프라이머(50㎕M)(Kit code RR037A, Lot A1201-1) 1㎕와 Random 6mers(100㎕M)(Kitcode RR037A, Lot A1201-1) 4㎕를 혼합하여 튜브에 넣은 후 얼음에 보관하였다. 이 튜브에 총 RNA를 10㎕씩 첨가하여 전체 반응액이 20㎕가 되게 한 다음, 마일드 볼텍싱(vortexing) 3회로 충분히 섞은 후 다시 얼음에 보관하였다. 이것을 PCR 기계를 사용하여 37℃에서 15분간 반응 시킨 후 85℃에서 5초가 반응하고 4℃로 처리하였다. 처리가 끝난 cDNA는 하기 방식으로 real-time PCR 분석에 사용되었다.

5-3. 브로콜리 추출물＼수의 TNF-α 저해능 시험

상기 실시예 1의 브로콜리 추출수가 인간 각질형성세포 HaCaT의 TNF-α 발현에 미치는 감소 효과를 확인하기 위하여, 상기 cDNA real-time(실시간) PCR을 이용한 Taqman 방법을 실행하였다. 1 μg/μL 농도의 cDNA 주형 1μL에 해당 TNF-α에 특이적인 Taqman Primer & Probe (HS00263639, AB Applied Biosystems, USA)와 Taqman Gene Expression Master Mix를 사용하여 반응을 수행하였다. 최종 반응 샘플들을 조제한 후, Applied Biosystems ABI 7500 Real-time PCR system(AB Applied Biosystems, USA)을 이용하여 측정하였다.

좀 더 상세히 설명하면, real-time PCR을 수행하기 위한 GAPDH 분석용 반응액 프리믹스(premix)를 만들었다. GAPDH 분석을 위한 반응액 프리믹스는 GAPDH(Hs99999905, Lot 682967) 1㎕와 D.W 5㎕와 Master Mix(2X)(TaqMan Gene Expression Master Mix L/N 0810037, P/N 4369016) 10㎕와 cDNA 4㎕를 잘 혼합하여 만들었다. 만들어진 상기 반응액 프리믹스들을 real-time PCR 반응용 플레이트 (optical 96-well Reaction Plate with Barcode, part No.4306737)에 16㎕씩을 넣었다. 동일한 플레이트에 표준곡선 제조에 사용할 HaCaT cDNA 2㎕와 Easy Dilution (Kit code RR037A, Lot A1201-1)로 X10, X100배 희석한 cDNA를 2㎕ 씩 첨가한다. 상기에 제조된 cDNA 4㎕씩을 플레이트에 넣어져 있는 16㎕ 씩의 반응액에 넣고 real-time PCR Cycles로 반응시킨다. Real-time PCR 반응은 먼저 샘플들을 초기 변성을 위해 94℃, 10분 동안 반응시킨 후 전체 60 사이클을 증폭시켰다. 각 사이클에 관한 시간과 온도는 94℃ 에 10초, 60℃에 10초, 25℃에 30초로 이루어졌다. 표적유전자에 관한 발현은 Ct(threshold cycle) 방법에 의한 내부 대조 유전자 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 보정 정량화를 통한 상대적인 값으로 비교되었다.

그 결과, 브로콜리 추출수 20%를 샘플로 하여 0h, 6h, 12h, 24h 시간 별로 측정하였을 때, TNF-α가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다.

브로콜리 추출수 10, 20, 30, 40%의 농도로 처리하였을 때, 30% 농도에서 대조군에 비하여 현저히 TNF-α 수치가 감소하는 것으로 나타났다. 그 결과는 도 9에 도시하였다.

브로콜리 추출수 20%를 샘플로 하여 LPS로 염증 유도후 브로콜리 추출수를 같이 처리했을 때 TNF-α가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 그 결과는 도 10에 나타냈다.

실험예 6. 설포라판(Sulforaphane) 함유량 측정

설포라판은 이미 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 성분이다. 브로콜리 각 추출물 및 추출수에서 설포라판의 함량을 측정해 본 결과는 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

다른 추출방법을 사용한 것에 비하여, 브로콜리 전체(잎 줄기 전체 사용)를 통과한 수증기를 응축시켜서 얻는 본 발명에 따른 브로콜리 추출수 중의 설포라판 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.

설포라판 함량분석

처리군	설포라판 함량 (ng/ml)
가열가압 추출물	0.605
초음파 추출물	3.27
추출수*	5.56

실험예 7: 정제수 대신 브로콜리 추출수 100%로 만든 비누의 피부 수분 투과 촉진 작용의 검토

정제수 대신 브로콜리 추출수 100%로 만든 비누의 피부 수분 투과 촉진 작용을 검토할 목적으로 행하였다.

본 실험예에서, 아토피 및 가려움증이 있는 건조피부를 갖는 사람 20명을 대상으로 하여 행하였다. 구체적으로는, 경표피 수분 손실도(transepidermal water loss, TEWL) 및 각질층 보습도(stratum corneum (SC) hydration)을 측정하였다.

TEWL값(g/m2/h)은 증발계(Evaporimeter) 시험기(VapoMeter SWL2g; Delfin Technologies Ltd, Finland)를 이용하여 첨부 설명서에 따라 측정하였다. 각 대상체의 TEWL의 평균치를 산출하였다.

또한, 각질층 보습도에 대해서는 유수분측정기(Corneometer) CM 825시험기(Courage Khazaka Electronic GmbH, Germany)을 이용하여 Corneometer CM 825시험기의 첨부 설명서에 따라 측정하고, 이를 각질층 보습도의 지표로 하였다.

아침저녁 세안에 사용하고 30일간 사용을 하고 난 후 표피 수분 손실도(transepidermal water loss, TEWL) 및 각질층 보습도(stratum corneum (SC) hydration)을 측정하였다.

그 결과는 도 11에 나타낸 바와 같다. 실험 결과, 본 발명의 방법에 따라 제조된 브로콜리 추출수를 함유하는 비누를 적용한 대상군의 경우 경표피수분손실량이 현저하게 낮아진 것으로 나타났다.

그 결과는 도 12에 나타낸 바와 같다. 실험 결과, 본 발명의 방법에 따라 제조된 브로콜리 추출수를 함유하는 비누를 적용한 대상군의 경우 경표피수분손실량이 현저하게 낮아진 것으로 나타났다.

Claims

브로콜리(Brassica oleracea)를 물에 넣고 가열하여 수증기를 수득하는 단계(a1) 또는 수증기가 브로콜리를 통과하게 하는 단계(a2); 및
상기 단계에서 수득된 수증기를 응축시키는 단계(b)를 포함하는,
브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 브로콜리로 브로콜리의 잎, 줄기 및 대가지; 또는
브로콜리 꽃을 사용하는 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a1) 및 단계(a2)에서 브로콜리 및 물의 배합비가 1:1 내지 5인 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a1) 및 단계(a2)에서 브로콜리 및 물의 배합비가 1:1 내지 2인 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a1)에서 100 내지 120℃로 가열하는 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a1)에서 100 내지 110℃로 가열하는 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a2)에서 수증기는 100 내지 140℃의 스팀기로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a2)에서 수증기는 110 내지 130℃의 스팀기로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a1) 및 단계(a2)에서 추출시 압력이 1 내지 1.5bar인 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(b)는 0 내지 20℃의 냉각기에서 응축시키는 것을 특징으로 하는, 브로콜리 추출수를 유효성분으로 함유하는 보습용 또는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
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